CN110038120B - 豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用，属于治疗肿瘤的融合蛋白技术领域。本发明中豹蛙抗瘤酶融合蛋白是由重组豹蛙抗瘤酶和9个精氨酸的穿膜肽融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，具有良好的肿瘤穿透能力和肿瘤杀伤作用，并且活性显著提高。

Description

豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明属于治疗肿瘤的融合蛋白技术领域，具体涉及豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用。
背景技术
肿瘤是一种多因素、多阶段和多基因变异累积的的复杂疾病，其死亡率在全球范围内高居榜首，虽然全世界每年用于肿瘤治疗的费用高达上万亿美元，但疗效高且特异性强的抗肿瘤药物仍然十分缺乏。一般的肿瘤治疗（化学药物治疗和放射治疗）对快速分裂生长的细胞发挥破坏和杀伤作用，对非肿瘤细胞（分裂期的正常细胞）的毒副作用大，而且长期化疗易产生抗药性，使治疗效果下降。生物制药技术的发展为开发疗效高的抗肿瘤药物提供了良好的发展前景。
豹蛙抗瘤酶（Onconase, ONC）是Mikulski等（Mikulski SM, et al. Strikingincrease of survival of mice bearing M109 Madison carcinoma treated with anovel protein from amphibian embryos. J Natl Cancer Inst, 1990. 82: 151-3）于1990年在北极豹蛙早期胚胎中首次发现的，Ardelt等（Ardelt W, et al. Onconase andamphinase, the antitumor ribonucleases from Rana pipiens oocytes. Curr PharmBiotechnol, 2008. 9: 215-25）测出了其全部序列，并根据oncology和ribonuclease将它命名为Onconase。ONC由104个氨基酸组成，分子量为11.8 kD，是RNase A家族中最小的单结构域蛋白，含2个β折叠片层结构和3个α螺旋结构。ONC是一种新型的抗癌药物，对多种实体瘤具有很强的杀伤作用，是第一个进入抗肿瘤临床试验的核糖核酸酶，也是当前全球重点研究的100种新药之一（Costanzi J SD, et al. Ribonucleases as a novel pro-apoptotic anticancer strategy: Review of the preclinical and clinical datafor ranpirnase. Cancer Invest, 2005. 23: 643-50）。ONC在有效作用剂量下，主要作用于对数生长期的肿瘤细胞，而对正常细胞没有明显作用（Grabarek J, et al. Activationof caspases and serine proteases during apoptosis induced by onconase(Ranpirnase). Exp Cell Res, 2002. 278: 61-71），同时，它还具有机体不良反应少、免疫原性低、不易产生耐药性等优点，是一种极具潜力的抗肿瘤药物。
一般认为，ONC发挥细胞毒性的过程分为ONC被转运至胞液和催化降解RNA两个阶段（Rodriguez M, et al. Intracellular pathway of Onconase that enables itsdelivery to the cytosol. J Cell Sci, 2007. 120: 1405-11. Benito A, et al. Onthe track of antitumour ribonucleases. Mol Biosyst, 2005. 1: 294-302）。ONC进入胞液的第一步是结合在细胞表面。但至今尚未发现细胞表面存在ONC受体，ONC结合到细胞表面后，通过内吞作用进入细胞质，然后被运送至核内体。增加核内体的pH值（至中性）可以提高入核率，阻断从反式高尔基体运输到内质网的药物能增强ONC的细胞毒性，说明这条途径不是ONC进入细胞的有效途径。最近一些研究表明，ONC进入细胞核与AP2网格蛋白有关（Haigis MC,et al. Secretory ribonucleases are internalized by a dynamin-independent endocytic pathway. J Cell Sci, 2003. 116: 313-24）。Wu等把ONC直接注射进入细胞，通过脂质体转染和特定抗体转运等方法可以增强ONC的细胞毒性（Wu Y,Mikulski SM, Ardelt W, et al. A cytotoxic ribonuclease. Study of themechanism of onconase cytotoxicity. J Biol Chem, 1993. 268:10686-93），说明内吞是ONC细胞毒性的限制因素。
细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides, CPPs）是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖于经典的胞吞作用（Ren J, et al. Development ofcell-penetrating peptides as vectors for drug delivery. Acta Pharm Sin, 2010,45(1):17−25）。CPPs根据来源可以分为天然存在的和人工合成的两种，天然的细胞穿膜肽来源于天然蛋白质的多肽区域，主要负责将蛋白质向细胞内转运，包括TAT-PTD、Penetration和VP22（Green M, et al. Autonomous functional domains of chemicallysynthesized human immunodeficiency virus Tat trans-activator protein. Cell,1988, 55(6): 1179−1188. Frankel AD, et al. Cellular uptake of the tat proteinfrom human immunodeficiency virus. Cell, 1988, 55(6): 1189−1193）。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的、长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性，人工合成具有穿膜能力的多聚精氨酸和多聚赖氨酸的穿膜短肽，将生物分子带入细胞内发生作用，是一种细胞渗透性多肽，具有广泛的组织相容性、稳定性、低毒性和低免疫原性、具有特异的组织及细胞递送功能、可人工合成及程序简单等优点（Matsuzaki K, et al. Interactions of an antimicrobial peptide, magainin 2,with ipopolysaccharide-containing liposomes as a model for outer membranes ofgram-negative bacteria. FEBS Lett, 1999, 449(2/3): 221−224）。其中9个精氨酸（9R）是一类含有大量正电荷的碱性氨基酸，其作为一个蛋白转运结构域来使用，它的碱性氨基酸残基靠近细胞膜表面，然后CPPs发生旋转使其疏水性氨基酸与细胞膜的疏水核心区相互作用，最后，细胞膜中的磷脂发生轻微断裂，以使CPPs穿透细胞膜（Nakase I, et al.Cell-surface accumulation of flock house virus-derived peptide leads toefficient internalization via macro pinocytosis, Mol Ther, 2009, 17(11): 1868−1876）。
内吞是ONC细胞毒性的限制因素。为了提高ONC进入肿瘤细胞的效率，本发明将其与9R连接成融合蛋白的形式来提高ONC的穿透能力，为以后ONC的肿瘤治疗提供了重要的技术帮助。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用，该豹蛙抗瘤酶融合蛋白由重组豹蛙抗瘤酶和9个精氨酸的穿膜肽融合而成，其具有良好的肿瘤穿透能力和肿瘤杀伤作用。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用，其中豹蛙抗瘤酶融合蛋白是由重组豹蛙抗瘤酶和9个精氨酸的穿膜肽融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因由重组豹蛙抗瘤酶核苷酸序列与穿膜肽基因片段通过连接肽连接而成，具有良好的肿瘤细胞穿透能力和肿瘤细胞杀伤作用。
优选的，所述连接肽为GS linker（(Gly4Ser)3）。
优选的，所述肿瘤细胞为HepG2细胞或Hela细胞。
优选的，含有豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的表达载体为pET27b（+），含有豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的宿主细胞为Rossetta（DE3）。
优选的，所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白的具体制备过程为：将编码豹蛙抗瘤酶融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将重组表达载体转化宿主细胞；筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到豹蛙抗瘤酶融合蛋白。
优选的，将重组表达载体分别转化表达菌株Rosseta（DE3），转化后的单菌落分别接种至20 mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养8 h，以体积比1:100接种于另一20mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养，当A600在0.35时，在温度为37℃、IPTG终浓度为0.25 mmol/L、转速为80 r/min的条件下诱导6 h，在此条件下进行表达豹蛙抗瘤酶融合蛋白时，能够显著提高融合蛋白的表达水平。
优选的，将重组表达载体转化宿主细胞，筛选高表达阳性克隆，培养并诱导表达融合蛋白9R-rONC，通过中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集，破碎，离心，上清液调pH值至6.0利用SP Sepharose 6 FF亲和层析，Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到豹蛙抗瘤酶融合蛋白。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明的细胞试验结果表明融合蛋白9R-rONC相比于ONC，活性显著提高，具有良好的肿瘤穿透能力，能够更加有效杀伤多种肿瘤细胞。
附图说明
图1是融合蛋白9R-rONC在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳分析；
图2是纯化后融合蛋白9R-rONC的SDS-PAGE电泳分析；
图3是融合蛋白9R-rONC的体外细胞活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
说明：本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆、表达载体的构建、核酸提取、测序和鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行（参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
9R-rONC表达载体的构建
根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出1组基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1（9R-rONC）所示。将基因送至上海捷瑞生物公司合成，同时在各基因两端设计Nco I与BamH I两酶切位点。
将合成的含有目的基因片段的载体和表达载体pET27b（+）分别用Nco I与BamH I双酶切，酶切完毕后，胶回收需要的目标片段。使用T4 DNA连接酶将目的片段分别与原核表达载体pET27b（+）连接，连接反应体系为10 µL，混匀，4℃连接过夜，然后转化至大肠杆菌DH5a中。挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到重组质粒pET27b-9R-rONC。
实施例2
9R-rONC融合蛋白的表达及纯化
（1）转化、培养并诱导表达
将含有正确序列的重组质粒pET27b-9R-rONC转化至表达菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD801）。转化后的单菌落分别接种至20 mL含Kan（50ug/mL）的LB培养基中，于37℃培养8 h，以体积比1:100接种于另一20 mL含Kan（50 ug/mL）的LB培养基中，于37℃培养，当A600在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25 mmol/L进行诱导，诱导温度为37℃，5 h后收获菌体，用Binding buffer（20 mmol/L Na3PO4，pH 7.0）重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12% SDS-PAGE电泳分析。结果显示9R-rONC的融合蛋白大部分以包涵体形式表达，如图1所示，泳道1：蛋白标准分子量Marker；2：未诱导的全菌；3、4、5：9R-rONC诱导后的全菌、菌体沉淀、菌体上清。
（2）蛋白纯化
向菌体中加入一定浓度溶菌酶（1 mg/mL），冰上放置30 min，超声波细胞破碎菌体细胞（工作1 s，间隔1 s，4 min/次，共3次循环）。菌体破碎彻底后，利用QuixStand预处理系统（750 kD超滤中空纤维柱）处理细胞破碎液，富集包涵体，弃去膜透过端液体。当总体积约为60 mL时，加入100 mL wash buffer（20 mmol/L Tris，2 mol/L Urea，150 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗涤包涵体。当溶液体积为50 mL，再向其中加入洗涤液100 mL，重复上述实验4次。
洗涤完毕后，当溶液体积为50 mL，关闭透过端，向洗涤后的包涵体中加入150 mL的变性液（20 mmol/L Tris，10 mol/L Urea，150 mmol/L NaCl，pH 8.0），循环变性2 h。打开透过端，膜透过端收集液即为9R-rONC变性液。用5KD中空纤维柱对变性后的9R-rONC进行浓缩，至体积80 mL后进行复性，将装有复性液（20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl，pH 8.0）的容器用胶皮管与中空纤维柱的储液器连接。储液器密封后，透过端流出液体后，由于储存器中产生负压，使复性液以一定的速度滴加至变性液中，缓慢匀速复性。当加入复性液体积为变性液6倍时，即复性完毕，复性后溶液调pH至6.0，8000 rpm/min，于4℃离心20 min，收集上清。
上清液过0.22 μm滤膜澄清后，通过泵进入AKTA purifier 100系统，与2-3倍柱体积Binding buffer（PBS, PH6.0）平衡好的SP Sepharose 6FF柱（装于XK16/20空柱，柱高10cm，流速100 cm/h）完全结合后，用4-5倍柱体积的binding buffer冲洗杂蛋白；当紫外曲线达到稳定的基线时，用Wash buffer（20 mmol/L Na3PO4，200 mmol/L NaCl，pH 7.0）冲洗至基线稳定，再用2-3倍柱体积Elution buffer（20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L NaCl，pH7.0）洗脱目的蛋白，把结合在填料上的融合蛋白洗脱下来并收集到试管中。
把Superdex 75凝胶过滤柱（装于Column XK26/70空柱中，柱体积340 mL，流速2mL/min）接到AKTA purifier 100系统中，先用2倍柱体积的蒸馏水替换其保护液（体积分数为20%乙醇），再用2倍柱体积的Desalting buffer（20 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH7.0）平衡柱子，然后将亲和层析洗脱液通过Superloop进样。收集各洗脱峰，并进行15%SDS-PAGE电泳分析，结果显示经纯化过后，融合蛋白的纯度在95%以上，如图2所示，泳道1：蛋白标准分子量Marker；2：纯化后的9R-rONC融合蛋白。
实施例3
融合蛋白9R-rONC的体外细胞活性检测
分别将HepG2和Hela细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，10wt% FBS+90wt% 1640培养至对数生长期。分别向两种细胞中加入不同浓度rONC和9R-rONC，设置无药物的阴性对照组和仅含培养基的调零组。药物处理细胞后48 h，加入MTT，继续培养4 h，吸取上清后，每孔加入150 μL DMSO待完全溶解后，读取570 nm下OD值。计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率%=(1-实验组A570nm/对照组A570nm)×100 %。
结果如图3所示，rONC、9R-rONC对两种肿瘤细胞都有杀伤作用，与rONC 相比，豹蛙抗瘤酶融合蛋白9R-rONC的杀伤作用更强。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用
<130> 2019
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
agaaggcgta gaagaaggag aaggagaggt ggcggtggct ccggcggtgg tgggtcgggt 60
ggcggcggat ctcaagactg gttgaccttc caaaagaagc acatcaccaa caccagagac 120
gtcgactgtg acaacatcat gtccaccaac ttgttccact gtaaggacaa gaacaccttc 180
atctactccc gtccagagcc agtcaaggct atctgcaagg gtatcatcgc ttccaagaac 240
gtccttacca cctccgagtt ctacttgtcc gactgtaacg ttaccagtag accatgcaag 300
tacaagttga agaagtccac caacaagttc tgcgtcacct gtgagaacca agctccagtt 360
cacttcgttg gcgtcggtag ttgttaa 387
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp 40
Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe 60
Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn 80
Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys 100
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<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp
20 25 30
Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
Val Gly Val Gly Ser Cys
130
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用
<130> 2019
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
agaaggcgta gaagaaggag aaggagaggt ggcggtggct ccggcggtgg tgggtcgggt 60
ggcggcggat ctcaagactg gttgaccttc caaaagaagc acatcaccaa caccagagac 120
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gtccttacca cctccgagtt ctacttgtcc gactgtaacg ttaccagtag accatgcaag 300
tacaagttga agaagtccac caacaagttc tgcgtcacct gtgagaacca agctccagtt 360
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<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp 40
Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe 60
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<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
Ser Glu Gln Ile Asp Asn Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp
20 25 30
Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp
35 40 45
Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn
50 55 60
Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly
65 70 75 80
Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser
85 90 95
Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser
100 105 110
Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe
115 120 125
Val Gly Val Gly Ser Cys
130

Claims (9)

1.豹蛙抗瘤酶融合蛋白在制备治疗肿瘤药物的应用，其中豹蛙抗瘤酶融合蛋白是由重组豹蛙抗瘤酶和9个精氨酸的穿膜肽融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因由重组豹蛙抗瘤酶核苷酸序列与穿膜肽基因片段通过连接肽连接而成，具有良好的肿瘤细胞穿透能力和肿瘤细胞杀伤作用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述连接肽为(Gly4Ser)3。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为HepG2细胞或Hela细胞。
6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：含有豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的表达载体为pET27b（+），含有豹蛙抗瘤酶融合蛋白编码基因的宿主细胞为Rossetta DE3。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述豹蛙抗瘤酶融合蛋白的具体制备过程为：将编码豹蛙抗瘤酶融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将重组表达载体转化宿主细胞；筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到豹蛙抗瘤酶融合蛋白。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将重组表达载体分别转化表达菌株Rosseta DE3，转化后的单菌落分别接种至20 mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养8 h，以体积比1:100接种于另一20 mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养，当A600在0.35时，在温度为37℃、IPTG终浓度为0.25 mmol/L、转速为80 r/min的条件下诱导6 h，在此条件下进行表达豹蛙抗瘤酶融合蛋白时，能够显著提高融合蛋白的表达水平。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将重组表达载体转化宿主细胞，筛选高表达阳性克隆，培养并诱导表达融合蛋白9R-rONC，通过中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集，破碎，离心，上清液调pH值至6.0利用SP Sepharose 6 FF亲和层析，Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到豹蛙抗瘤酶融合蛋白。
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