KR100612673B1

KR100612673B1 - 세포도입성 보톡신 융합단백질

Info

Publication number: KR100612673B1
Application number: KR1020040066003A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 박진서; 최진희; 정광회; 김대원; 음원식
Original assignee: (주)바이오버드; 최진희
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2006-08-14
Also published as: KR20060017348A

Abstract

본 발명은 보톡신과 단백질 수송도메인이 공유결합된 보톡신 융합단백질을 형성함으로써 피부 표면에 적용시킬 때 용이하게 진피 내로 또는 세포 내로 침투(penetrate) 가능한 보톡신 융합단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군 보톡신과 비교할 때 원활히 세포 내로 농도의존적, 시간의존적으로 침투하며, 세포 내에서 36시간 이상 지속되었다.

보톡신, 세포도입, 융합단백질, 피부

Description

세포도입성 보톡신 융합단백질{Cell-transducing botoxin fusion protein}

도 1은 PEP-1-보톡신 융합단백질의 발현벡터를 나타낸다. (a) pET-15b벡터에 기반한 PEP-1-보톡신 발현벡터의 구축. 합성 PEP-1 올리고머는 NdeⅠ, XhoⅠ 제한부위 내로 클론된다. 그리고 보톡신 cDNA는 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위로 클론된다. (b) 발현된 대조군 보톡신과 PEP-1-보톡신 융합단백질의 다이어그램. 보톡신의 코딩프레임은 6His와 PEP-1 펩타이드에 이어 오픈박스로 나타내었다. 그 결과로 얻어진 벡터는 pPEP-1-보톡신(pPEP-1- Botoxin)이라 명명하였다. 발현은 IPTG를 가하여 유도되었다.

도 2는 PEP-1-보톡신의 발현, 정제 및 세포 내 분포(localization)에 관한 것이다. 세포의 단백질 추출물과 정제된 융합단백질은 15% SDS-PAGE로 분석되었고(A)(B), 항래빗 폴리히스티딘 항체(anti-rabbit polyhistidine antibody)로 웨스턴블랏 분석되었다(C). A, B와 C의 레인은 각각 다음과 같다:

레인 1, 유도되지 않은 (non-induced) pPEP-1- 보톡신;

레인 2, 유도된(induced) pPEP-1-보톡신;

레인 3, 정제된 pPEP-1-보톡신.

HeLa cells이 파라포름알데히드로 고정되었을 때 세포도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 면역형광 및 분포(D). HeLa 세포는 2μM PEP-1-보톡신 융합단백질로 30분간 처리되어 항래빗 폴리히스티딘(anti-rabbit polyhistidine)(1:400)과 함께 배양되었고 Cy-3 콘쥬게이션된 항체(1:1000)와 한시간동안 배양되었다.

PEP-1-보톡신이 없는 대조군 세포 자체(C-왼쪽),

PEP-1-보톡신으로 처리된 세포(C-오른쪽).

도 3. PEP-1-보톡신 융합단백질의 배양된 HeLa 세포로의 도입. (a) 0.25-2μM의 PEP-1-보톡신 융합단백질과 대조군 보톡신이 배양배지에 30분간 가해졌다. (b) 2μM의 PEP-1-보톡신과 대조군 보톡신이 각각 10-60분간 배양배지에 가해졌다. 세포내 도입된 PEP-1-보톡신은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었다.

도 4. 배양된 HeLa 세포 내로 도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 안정성

2μM PEP-1-보톡신에 의하여 침투당한 세포가 다양한 시간간격(1-48h)동안 배양되었다. 세포 내로 도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었다.

도 5. PEP-1-보톡신 융합단백질이 도입된 동물피부의 조직화학적 분석.

50μg의 PEP-1-보톡신 융합단백질이 마우스 등 피부의 면도한 부위에 60분간 국부적으로 적용되었다. 피부 조직의 냉동한 절편이 래빗 항히스티딘(rabbit anti- histidine) IgG(1:400)로 면역염색되고 바이오틴 결합된 고우트 항래빗 IgG (1:200)로 염색되었다. 절편은 3,3'-다이아미노벤지딘으로 시각화되어 액시오스코프 현미경 하에서 관찰되었다.

보톨리눔 톡신(Botulinum toxin; 이하 "보톡신" 또는 "BTX"로 혼용함)은 썩은 통조림이나 썩은 고기에서 자라는 세균인 혐기성 박테리아인 클로스트리디움 보톨리눔(Clostridium botulinum))에서 생산되는 신경독으로서 A, B, C1, C2, D, E, F 그리고 G 타입으로 지정된다. 이들 중 A, B, E 타입은 사람의 질병과, C, D 타입은 가축 및 기타 동물의 질병과 연관이 있다. 이들 7개의 항원형은 모두 유사한 구조와 분자량을 갖는다. 분자량이 10만인 헤비체인과 5만인 라이트 체인이 이황화물 결합에 의하여 연결된다. 라이트 체인은 신경단백질을 분리하는 아연 의존성 엔도펩티다제 활성을 가지는 것으로 사료된다.

또한, 보톡신은 운동신경과 근육이 만나는 곳에서 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 분비를 막아 근육을 마비시키며, 시냅스 전달이 보톡신에 의하여 저해된 후 근육은 약해지고 위축된다. 이렇게 영향을 받은 신경말단은 퇴화되지 않고 신경전달 물질의 분비의 방해는 비가역적이다. 그러므로 신경말단의 성장과 새로운 시냅스의 접촉 형성에 의하여 그 기능이 회복된다. 보톡신은 신경근육 접합부위에서 알파 모터 뉴런의 전달을 방해시킴에 의하여 근섬유의 약화를 유도한다. 따라서, 근육의 과활성화 상태에 사용할 수 있다.

따라서, 인체에 전혀 영향을 주지 않는 용량 이하를 주사약으로 사용하면 주사 부위의 근육만 부분적으로 마비시킬 수 있는 원리를 이용해 1980년대 초에 미국식품의약국(FDA)으로부터 사람에게 사용해도 좋다는 허가를 받아 신경질환이나 근질환 등의 치료약으로 사용되기 시작하였다. 이후 안면경련·눈꺼풀경련·사경(斜頸:목이 뒤틀려 머리가 한쪽으로 기울어지는 병증) 등 각종 근육질환의 치료법으로 이용되다가, 1990년대 이후부터는 주름살 치료약으로 널리 이용되기 시작하였다. 즉 클로스트리디움 보톨리눔의 독소를 이용해 눈가나 미간·이마 등에 주름살을 만드는 근육을 마비 또는 악화시킴으로써 주름이 펴지게 하는 방법을 이용한 것이다.

보톡신, 특히 보톡신 타입 A는 예컨대 사시(strabismus), 안검경련(blepharospasm), 경부 근긴장 이상증(spasmodictorticollis, cervical dystonia), 인두중앙부 근긴장 이상증(oromandibular dystonia), 경련성 발성장애(spasmodic dysphonia)와 같은 신경근육의 이상증세를 치료하는데 이용되어 오고 있고, 최근에는 다한증(hyperhidrosis), 편두통을 완화시키는 기능도 알려져 있다.

상기와 같은 작용에 대하여 보톡신 관련 3단계의 메카니즘이 제시되고 있다. 첫째로 헤비체인을 매개로하여 아직 확인되지 않은 세포막 수용체과 BTX의 결합, 둘째로 헤비체인과 라이트 체인의 내부화, 셋째로 라이트 체인의 분리와 아세틸콜린의 분비 저해에 의한 목표단백질의 절단으로 구성된다.

현재 보톡신은 DYSPORT(영국의 Porton Products Ltd.), BOTOX(미국의 Allergan, Inc., Irvine, Calif. ) 등의 상표명으로 시판되고 있다.

시판되는 보톡신 제품들은 주사제 제형으로 신경과, 안과, 정형외과 등 전문의의 진단 하에 근육에 주사된다.

그러나, 주사는 바르는 피부외용제에 비하여 그 사용이 불편하다.

본 발명은 보톡신을 단백질 수송도메인에 공유결합시킴으로써 피부 표면에 적용시킬 때 용이하게 진피 내로 또는 세포 내로 침투(penetrate) 가능한 보톡신 융합단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있다. 이 단백질 수송 도메인이 세포 내로 운반시키고자 하는 단백질("목표 단백질")의 말단과 공유결합된 형태의 융합단백질을 화학적 방법으로 또는 유전자 차원에서 제조하여 세포 내로 또는 피부 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.

최근, PEP-1 펩타이드가 Tat 단백질처럼 이형 단백질을 자연상태 그대로 세포 내로 이동시키는데 운반체로서 이용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 아직까지 PEP-1 펩타이드를 이용한 실험은 거의 전무한 실정이다.

펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 다른 화합물에 비하여 특정 생리작용에 대한 선택성 및 효능성이 탁월함에도 불구하고 그 크기나 여러 생화학적 성질로 인 하여 세포막을 통과하기가 매우 힘들어 세포 내부로 직접 전달될 수 없는 약점 때문에 효과적인 치료제 및 기초 연구 수단으로서의 실용화가 현실적으로 어려운 실정이다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다(Schwartze et al., 1999; Van de Waterbeemd et al., 1998).

단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 세포내로 전달하기 위하여 많은 방법이 시도되어 왔다. 이들 방법에는 다음과 같은 방법이 포함된다. 물리적인 처리 방법 (즉, 마이크로인젝션(microinjection), 스크레이프 로딩(scrape loading), 전기천공(electroporation)과 바이오리스틱(biolistics)), 화학적이나 생물학적으로 세포에 포어(pore)를 형성시키는 방법 (디지토닌(digitonin), 포어 형성 단백질(pore-forming proteins)과 ATP 처리), 변형된 단백질이나 단백질 운반체(carriers)를 이용한 방법(지방이 결합된 단백질(lipidated proteins)과 이뮤노톡신 및 관련 바이오콘쥬게이트(immunotoxins/related bioconjugates)) 그리고 입자 흡입이나 융합 방법(리포조옴(liposomes), 세포-세포 융합(cell-cell fusion), 바이러스 유사체(virus mimics)와 유도된 피노사이토시스(induced pinocytosis)) 등이 포함된다(Fernandez and Bayley, 1998). 위에서 언급한 방법들은 다음의 문제점들이 있다. 예를 들어 마이크로인젝션(microinjection)은 하나의 세포나 소수의 세포를 연구할 때에만 효율적이고, 이뮤노톡신(immunotoxins)은 보통 단백질을 높은 농도로 세포에 전달하지 못할 뿐만 아니라, 치명적인 활성을 가진 단백질이 이용될 때 목표세포를 죽이기도 한다. 또한 이 방법들은 단백질의 세포내 전달 효율, 세포의 손상 여부, 목표 단백질의 도달 여부, 재현성의 여부 등의 문제점을 안고 있다.

또한, 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 갖고 있다(Verma, I.M. and Somia, N. (1997) Nature 389, 239-242).

사람 면역결핍 바이러스 단백질의 일종인 Tat 단백질의 형질도입 부위 (PTD; protein transduction domain)의 특성으로 효율적으로 세포막을 통과하는 것이 밝혀지면서, 최근 많은 이형단백질을 Tat 단백질과 융합시켜 세포 내로 운반되는 것을 보여주었다(Fawell, S. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 664-668., Schwartze,S.R. et al.(1999) Science. 285, 1569-1572, Watson, K. and Edward, R.J(1999) Biochem. Pharmacol. 58, 1521-1528). 또한, 본 연구실에서도 Tat 단백질과 융합시킨 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 카탈레이즈가 생물학적인 활성을 지니며 효율적으로 세포 내로 운반되는 것을 보여주었다(Kwon, H.Y.et al. (2000) FEBS Letter. 485, 163-167, Eum, W.S. et al.(2002) Mol. Cells. 13, 334-340, Jin, L.H. et al.(2001) Free Radic. Biol. Med. 31, 1509-1519).

그러나, Tat-융합단백질은 자연상태에서는 세포 내로 운반이 되지 않고, 변성상태에서 세포 내로 운반된 다음 세포 내에서 단백질의 재폴딩(refolding)이 일어나 활성을 갖는 것으로 이해되고 있다. 따라서, 이러한 Tat 융합단백질의 안정성 및 세포 내에서의 지속성이 자연상태보다는 효율적으로 나타나지 않는 것으로 사료 된다(Schwartze, S.R. et al. (2000) trends in CELL BIOLOGY. 10, 290-295).

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 Tat 단백질보다 더욱 효과적인 방법인 PEP-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형단백질을 세포 내로 운반하는 방법이 밝혀졌다(Morris, M.C. et al.(2001) Nat. Biotech. 19, 1173-1176). PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(서열번호 3)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 공유결합시키지 않고 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것만 밝혀져 있다. 또한, PEP-1 펩타이드는 Tat 단백질에 비해 단백질 치료제로서의 여러 가지 장점 즉, 매우 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시키고, 생리학적인 완충액에서 안정하며, 독성이 결여되어 있으며, 혈청에 대한 민감성이 결여되어 있다는 등의 장점을 가지고 있다. 그러나, PEP-1 펩타이드는 외부 단백질 예컨대 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP) 베타 갈락토시데이즈(β-galactosidase, β-Gal) 등과 일정한 비율(대략 PEP-1과 단백질≒30:1)로 맞추어 투여해야만 세포 내에 효과적으로 단백질이 운반되므로 고가의 PEP-1 펩타이드를 과량 가해주어야 하는 단점이 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 보톡신의 세포침투성(cell penatration ability)을 높인 보톡신 융합단백질을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 주사방법이 아닌 간편하게 바르는 방법으로 보톡신을 이용할 수 있는 제형을 개발하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 PEP-1을 포함하여 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인을 보톡신의 적어도 일측 말단과 공유결합시킴으로써 보톡신의 세포침투성 및 피부침투성을 극대화하려는 것이다.

본 발명자들은 보톡신의 라이트 체인과 헤비 체인 중 보톡신의 기능을 나타내는 부위(catalytic site)가 라이트 체인에 존재함을 밝혀내고, 보톡신 라이트체인의 말단에 단백질 수송도메인 PEP-1을 공유결합시킨 보톡신 융합단백질을 제조하였다. 본 발명자들은 먼저 보톡신 라이트 체인을 코딩하는 유전자에 PEP-1을 코딩하는 유전자와 6His 발현 뉴클레오타이드를 결합시킨 다음 벡터에 넣어 대장균에서 과대발현시켰다.

본 발명자들은 자연상태의 보톡신 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 보톡신에 융합(공유결합)시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography)로 쉽고 편리하게 정제하였다. 또한, 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 HeLa 세포 및 동 물실험을 통하여 확인하였다.

본 연구를 하기 위해 먼저, PEP-1-BTX 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEP-BTX 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 보톡신 cDNA, PEP 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘(histidine)이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PEP-BTX 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni²⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. PEP-BTX의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 웨스턴 블랏으로 배양된 HeLa 세포에 정제된 PEP-BTX 융합단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 PEP-BTX는 최소 세포 내에서 36시간 이상 지속적으로 유지되었다. 배양된 세포뿐 아니라, 마우스의 피부조직에도 PEP-BTX는 투과되었다.

이러한 결과는 PEP-BTX가 자연상태 그대로 세포 내로 투과가 잘 일어남들 말한다. 따라서, 이러한 PEP-BTX 융합단백질이 효과적으로 세포 내로의 운반 기술 연구 및 보톡신과 관련된 것으로 알려진 근육질환 등의 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

PEP-1-보톡신 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 보톡신 융합단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 PEP-BTX 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

본 발명자들은 PEP-BTX 융합 단백질을 마우스의 피부에 침투실험한 결과 진피층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 보톡신 융합 단백질을 약제 조성물 및/또는 도포제(본 명세서에서 "피부외용제"와 동일한 의미로 사용함) 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 분자량 5만 Dalton의 보톡신 라이트 체인을 세포 내 또는 피부 내 부로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 보톡신 단백질 분자의 세포내 전달은 보톡신 단백질에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 PEP-1 보톡신 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 피부 외용제 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"PEP-1-보톡신 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 보톡신 라이트 체인 부분을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-보톡신", "보톡신 융합단백질" 또는 "PEP-BTX"와 혼용하였다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 PEP-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것 에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 보톡신 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) 보톡신 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 보톡신 융합단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포도입성 보톡신 융합단백질이 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 보톡신 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포도입성(cell-transducing) 보톡신 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 세포도입성 보톡신 융합단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 보톡신 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 보톡신 융합단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포도입성 보톡신 융합단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

아래에서는 본 발명의 구성을 구체적인 실시예를 들어 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PEP-1- 보톡신의 발현과 정제

보톡신과 융합된 PEP-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) 펩타이드를 발현시키기 위하여 PEP-1-보톡신 발현벡터가 제조되었다.

첫 번째, 두 개의 올리고뉴클레오타이드 위쪽사슬(top strand) 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'과 아래쪽 사슬(bottom strand) 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGA-GACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'이 합성되어 어닐되어 PEP-1 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드를 만들었다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 NdeⅠ-XhoⅠ으로 잘린 pET-15b벡터 안으로 직접 연결되었다(ligate).

다음으로, 보톡신의 cDNA 서열에 기초하여 두 개의 개시체가 합성되었다. 센스 개시체 5'-ACACTCGAGATGCAATTTGTTAATAAACAATTTAATT-3'는 XhoⅠ제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-TGTGGATCCTGACTTATTGTATCCTTTATCTAATGATT-3'는 BamHⅠ제한효소 절단부위를 가진다. 중합효소 체인반응(PCR)이 수행되고 중합효소 체인반응 생성물이 XhoⅠ과 BamHⅠ으로 잘리고, 일류션되고(Invitek, Berlin, German), T4 DNA 리가아제(Takaka, Otsu, Shiga, Japan) 를 이용하여 TA-클로닝 벡터와 pPEP-1 벡터에 연결되고, E. coli DH5 세포에 클론되었다.

PEP-1-보톡신 융합단백질을 생산하기 위하여 플라스미드가 E. coli BL21세포 내로 형질전환되었다. 형질전환된 박테리아 세포는 37℃에서 100ml의 LB 배지에서 D ₆₀₀값이 0.5~1.0가 될 때까지 배양하였고, 30℃에서 0.5mM IPTG를 도입하여 16시간 동안 배양하였다. 하비스트한 세포는 결합완충액(5mM 이미다졸(imidazole), 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9) 내에서 4℃로 초음파를 이용하여 용균하였고 형성된 재조합 PEP-1- 보톡신이 정제되었다. Briefly, 분리된 세포 추출물은 Ni²⁺-니트릴로아세트산 세파로즈 친화컬럼(nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column)(Qiagen, Valencia, CA, USA) 에 변성되지 않은 채로 로딩되었다. 컬럼이 10배의 결합 완충액과 6배의 세척완충액(60mM 이미다졸, 500mM NaCl, 및 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척된 후 융합단백질이 일루션 완충액(1M 이미다졸, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)을 이용하여 일루션되었다. 융합단백질을 함유하는 분획들은 모아서 PD-10 컬럼(Amersham, Braunschweig, Germany)을 이용하여 염을 제거하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 스탠다드로 하여 브래드포드법(Bradford procedure)으로 예측하였다.

실시예 2: 포유동물 세포로의 PEP-1- 보톡신 융합단백질의 도입

PEP-1-보톡신 융합단백질을 도입하기 위하여 HeLa 세포를 6 웰 플레이트에서 4-6시간동안 배양하였다. 그 후 배양배지를 1ml의 신선한 배지로 교체하였다. HeLa 세포를 다양한 농도의 PEP-1-보톡신으로 30분동안 처리한 후 세포를 트립신-EDTA(Gibco, Grand Island, NY, USA)로 처리하고 인산완충액 함유 생리식염수(PBS)로 세척하였다. 세포는 하비스트하여 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)을 수행하기 위해 세포 추출물을 제조하였다.

세포도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 세포내 안정성은 다음과 같이 확인하였다: HeLa 세포를 2μM의 변성되지 않은(native) PEP-1-보톡신으로 1시간동안 처리한 후 그 세포를 세척하고 신선한 배양배지로 옮겨 세포도입되지 않은 PEP-1- 보톡신을 제거하였다. 그리고 나서 세포는 48시간 더 배양하였고,웨스턴블랏 분석을 위해 세포 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 면역형광분석 및 형광분석( Immunofluorescecnce and fluorescence analysis)

면역형광분석(Immunofluorescence assay)은 콘쥬게이션된 Cy-3 항체를 이용하여 수행되었다. 간략히 말하면, HeLa 세포는 유리 커버슬립 상에서 배양되어 PEP-1- 보톡신 융합단백질로 처리되었다. 37℃에서 30분동안 배양한 후 세포는 트립신-EDTA와 PBS로 두 번 세척하고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 함유한 0.5ml의 PBS로 10분동안 실온에서 고정되었다. 세포는 PBS로 세척된 후 폴리히스티딘 항체(polyhistidine antibody)와 함께 배양하였고, 한시간동안 Cy-3 항체(1:1000)를 함유한 PBS와 인큐베이션하였다. 형광의 분포는 형광 현미경(Carl Zeiss, EL-Einsatz, German)으로 분석하였다.

실시예 4: 마우스 피부에 PEP-1- 보톡신 융합단백질 도입

PEP-1-보톡신 융합단백질의 마우스 피부에의 도입을 연구하기 위하여 웅성(male) ICR 마우스 몸무게 약 30g을 이용하였다. 이 실험에 사용된 동물은 실험동 물 관리준칙(Principles of Laboratory Animal Care)(NIH publication No. 86-23)에 따라 처리되었다. 동물은 3% 이소플루란스(isoflurance)가 함유된 질소와 산소로 마취시키고, 50g의 대조군(control) 보톡신과 PEP-1-보톡신 융합단백질을 다양한 시간 간격으로 동물 피부의 면도한 부위에 적용하였다. 그리고 나서, 얼린 조직 조각이 제조되고 4% 파라포름알데히드로 10분동안 고정시켰다. 비특이적 면역반응을 제거하기 위하여 free-floating sections는 0.3% 트리톤(Triton) X-100과 10% 일반 염소 혈청 함유 PBS로 한시간동안 실온에서 배양하였다. 그리고나서 래빗 항히스티딘 IgG (1:500)로 24시간동안 실온에서 배양하였다. PBS로 10분간 세 번 세척한 후 절편들은 한시간동안 바이오틴 결합된 염소 항래빗 IgG(dilution 1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 배양하였다. 이후 젤라틴 코팅된 슬라이드 상의 3,3-다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)(40mg DAB/0.045% H₂O₂ in 100ml PBS)로 시각화(visualize)되었다. 면역반응은 액시오스코프 현미경(Axioscope microscope)(Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 하에서 관찰되었다.

결과

생물학적 활성이 있는 PEP-1- 보톡신 융합단백질 생성

세포 침투성 발현벡터인 PEP-1-보톡신 벡터를 만들기 위하여 보톡신 cDNA가 pET-15b 플라스미드 내로 서브클론되었다. 형성된 PEP-1-보톡신 발현벡터는 보톡신 을 코딩하는 cDNA 서열을 함유하고 있고, PEP-1 단백질(21개의 아미노산)과 아미노 말단에 여섯 개의 히스티딘 잔기를 함유하고 있다. 또한 본 발명자들은 PEP-1 도입 펩타이드가 없는 대조군 보톡신 단백질을 생산하기 위하여 보톡신 발현벡터(p 보톡신)를 구축하였다(도 1).

PEP-1- 보톡신 융합단백질의 발현과 정제

발현 유도이후 PEP-1-보톡신과 대조군 보톡신 융합단백질이 정제되었다. 즉, 융합단백질이 E. coli에서 발현되고 분리된 세포추출물이 변성되지 않은 조건 하에서 Ni2+-니트릴로아세트산 세파로즈 친화 컬럼 상에 로딩되었다. 융합단백질 함유 분획들은 혼합되어 PD-10 컬럼을 이용하여 염이 제거되었다. E. coli에서 얻은 세포 조추출물(crude cell extracts)과 정제된 PEP-1-보톡신 융합단백질은 15% SDS-PAGE로 전기이동(electrophoresis)되었다. 발현과 정제의 결과는 도 2A와 2B에 나타내었다. 레인 2와 레인 3의 밴드는 단백질이 고도로 발현되었고, 전체 수용성 단백질 중의 주요 요소(major component)임을 보여준다. 뿐만 아니라, 정제된 융합단백질의 회수율(yields)은 약 45mg/L였다. 발현되고 정제된 단백질은 항-래빗 폴리히스티딘 항체(anti-rabbit polyhistidine antibody)를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 확인되었다. PEP-1-보톡신은 도 2C의 해당 밴드에서 확인되었다.

HeLa 세포로의 PEP-1- 보톡신 융합단백질의 도입( transduction )

PEP-1- 보톡신 융합단백질이 세포 내로 도입되는 능력을 연구하기 위하여 PEP-1- 보톡신 융합단백질을 Cy-3 플루오레신(1:1000)과 콘쥬게이션시키고 면역형광 현미경법(immunofluorescence microscopy)으로 분석하였다(도 2D). 도 2D에서 나타나는 바와 같이, 변성되지 않은(native) PEP-1-보톡신 융합단백질은 성공적으로 세포 내로 도입되었고, 반면 대조군 보톡신은 세포 내로 도입되지 않았다. 이러한 결과는 PEP-1 펩타이드가 HIV-1 Tat 단백질, 안테나피디아의 호메오도메인(homeodomain of Antennapedia), 허피스 심플렉스 바이러스 VP22 단백질(herpes simplex virus VP22 protein)과 유사한 기능과 메커니즘을 가짐을 나타낸다.

PEP-1-보톡신 융합단백질의 세포도입능을 측정하기 위하여 양의 변화에 따른 PEP-1-보톡신 융합단백질 세포도입을 분석하였다. 다양한 농도(0.25-2μM)의 PEP-1-보톡신 융합단백질을 배양배지 내의 HeLa세포에 가하여 30분간 방치하였고, 세포도입된 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다(도 3A). HeLa 세포 내로 도입된 단백질의 양은 배양배지 내의 융합단백질의 양이 증가됨에 따라 농도의존적으로(concentration- dependently) 증가하였다. 변성되지 않은 상태에서 정제된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 세포도입은 2μM 농도로 다양한 시간동안(10-60 min) HeLa 배양배지에 융합단백질을 가하여 실시하였고, 웨스턴 블랏팅으로 세포도입된 단백질 수준을 분석하였다. 세포 내로 도입된 PEP-1-보톡신의 세포내 농도는 10분 이내에 확인되었고 60분까지 점차 증가하였다(도 3B).

HeLa 세포 내로 도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 세포내 안정성은 도 4에 나타내었다. PEP-1-보톡신 융합단백질은 HeLa 세포 배양배지에 2μM 농도로 다양한 시간동안 가하여 세포도입된 단백질의 수준은 웨스턴 블랏팅으로 분석되었다. 도 4에 나타난 바와 같이 세포 내로 도입된 PEP-1-보톡신 융합단백질의 세포내 수준은 한시간후 처음 탐지되어 그 후 관찰기간동안 계속하여 감소하였다. 그러나, 세포도입된 보톡신은 HELa 세포에서 현저한 수준으로 36시간동안 유지되었다.

마우스 피부로의 PEP-1- 보톡신 융합단백질의 침투(Penetration of PEP-1-Botoxin fusion protein into mice skin)

본 발명자들은 PEP-1-보톡신 융합단백질이 마우스 피부로 세포도입되는 능력을 평가하였다. 융합단백질은 한시간동안 마우스 피부 상에 스프레이 도포되었고, 융합단백질의 침투정도는 면역조직화학적 방법으로 분석되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 세포도입 신호는 PEP-1-보톡신 융합단백질로 처리된 피부의 진피(dermis)에서 현저하게 탐지되었다. PEP-1-보톡신 융합단백질과는 달리 대조군 보톡신은 피부 내로 도입될 수 없었다. 이러한 결과는 PEP-1-보톡신 융합단백질이 배양세포 내로 도입될 뿐만 아니라 살아 있는 동물 피부에도 침투(penetrate)할 수 있음을 말해준다.

본 발명은 주사제 제형으로만 사용되던 보톡신을 피부도포형으로 사용 가능하도록 하였다.

또한, 본 발명은 보톡신을 자연형태(native form)로 단백질 수송도메인과 공 유결합하여 세포 및 피부세포 내로 원활히 형질도입되도록 하였다.

또한, 본 발명의 보톡신 융합단백질은 배양세포 뿐만 아니라 살아있는 동물의 피부세포 내로도 원활히 침투 가능하여 피부외용제로서 적용이 가능하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 단백질 수송 도메인이 보톡신 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) 보톡신 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 보톡신 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포도입성 보톡신 융합단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보톡신 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 양측에 단백질 수송도메인이 공유결합된 것을 특징으로 하는 세포도입성 보톡신 융합단백질.
제1항 또는 제2항의 세포도입성 보톡신 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항의 세포도입성 보톡신 융합단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경(斜頸), 사시, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 다한증, 편두통 및 주름살 예방·치료·완화용 약제학적 조성물.
보톡신 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항 또는 제2항의 세포도입성 보톡신 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서 상기 보톡신 cDNA는 서열번호 6번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포도입성 보톡신 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
상기 제1항 또는 제2항의 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 제6항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포도입성 보톡신 융합단백질을 발현시키는 벡터.