JP6243577B2 - 新規な細胞透過性ペプチド及びこれとボツリヌストキシン結合体、およびこれらの用途 - Google Patents
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Description
1)13個のアミノ酸で構成されており;
2)分子量が約1537Daであり;
3)Theoretical pIは9.31で解析することができ;
4)断片の疎水性アミノ酸の構成が60%以上である両親媒性ペプチドであり;
5)ProtParamプログラム(http://web.expacy.org/protparam参照)を用いて解析されたinstability indexが49.65の値で配列の安定性が評価されて、
6)Aliphatic indexが97.69の値で全体の分子のサイズが評価されて;
7)GRAVY(Grand Average of Hydropathicity)が0と評価されてペプチドの凝集(aggregation)が改善され;
8)サポートベクターマシン(Support Vector Machine、SVM)分類アルゴリズムに基づいて、細胞透過性ペプチドを予測する解析では、SVMの値が−0.15で評価された特性を有する配列である。
ボツリヌストキシンの軽鎖の経皮伝達を実現させることができる新規の皮膚透過性及び細胞透過性ペプチドを開発した。まず、ボツリヌストキシンの重鎖と軽鎖の構造と機能を解析し、ボツリヌストキシンA型の神経細胞透過に重鎖が重要な役割をするという点に着目して、これを基に配列を選別した。また、従来の巨大分子の細胞内伝送ドメインMTDの配列と比較解析して、両親媒性で極性アミノ酸の配置で細胞膜アクセシビリティを増加させ、物性と可用性を改善させて、非極性アミノ酸の追加で細胞膜透過に適した疎水性を付与するプロセスを経て、配列番号1のアミノ酸配列からなる新規の細胞透過性ペプチドを設計した。上記のように設計された細胞透過性ペプチドをTD1と命名し、これの特性と構造をProtParamプログラム(http://web.expacy.org/protparam)で解析し、その結果を図1および図2に示した。
上記の実施例1により作製された新規の細胞透過性ペプチドTD1の皮膚細胞及び神経細胞の透過能を確認するためにフローサイトメトリー測定(Flow Cytometry)を用いて実験を実施した。TD1の細胞透過性を比較するために、従来に開発された細胞透過性ペプチドであるkFGF4と、代表的なタンパク質伝送配列PTD(protein translocation domain)であるHIV−Tatを対照MTDで用いて、各ペプチド試料は、FITCで蛍光標識し、ペプチド合成の専門機関(GL Biochem Ltd.(Sanghai、China)を介して合成して備えた。
皮膚の角質形成細胞であるHaCaT cellにおける細胞透過能を確認するために、DMEM complete media(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、HaCaT cellを培養した。フローサイトメトリー測定のために、12 well plateで置き換え、16〜24時間の追加培養し、各試料は、FBSが添加されていない非血清培地(serum free medium)で1時間(処理濃度5μM、10μM)と3時間(処理濃度2.5μM、5μM、10μM)の間に処理した。反応時間が終了した後、DPBSで2回洗浄して残余分の試料を除去し、0.05%トリプシン−EDTAを処理、光を遮断したまま、10分間反応させた後、完全培地(complete media)を用いて、トリプシン-EDTAを不活性化させた。 その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液3mLを加えて、2,000rpmで3分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのFACSチューブにリン酸緩衝溶液200μLを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。実験グループには、Cell onlyおよびFITC only、Scramble peptide、HIV−Tat、kFGF4由来のペプチドを用いて、細胞透過能がないと思われるScramble peptideに備えて、HIV−Tat、kFGF4由来のペプチド及びTD1の伝送能を決定した。その結果、図3a及び図3bに示すように、TD1が対照群に比べて、角質形成細胞で顕著に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。
神経細胞株であるSiMa cellに対する細胞透過能を確認した。SiMa cellは培養プレートに対する細胞付着能が弱いので、gelatin(sigma、G2500)をコーティングした培養プレートを用いるが、0.1%gelatin溶液を培養プレートにコーティングして、室温で1時間の後、溶液を除去し、乾燥した状態で用いた。Complete mediaは、RPMI1640(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、80%以上のconfluencyで継代培養した。細胞は、繰り返して継代培養で安定化させた後、100mm培養プレート当たり5X105/wellで細胞を接種し、37℃の5%CO2の条件の培養器(incubator)でovernight培養した後、実験した。
神経細胞(U−87 MG cell)で細胞透過能を確認するために、MEM complete media(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて細胞を培養した。フローサイトメトリー測定のために、12 well plateで細胞を接種して、16〜24時の間に培養して、各試料(対照物質:cell only、FITC only、scramble peptide、比較物質:kFGF4由来のペプチド、実験材料:TD1)は、FBSが添加されていない非血清培地(serum free medium)で各1時間と6時間の間、5μM、10μMの濃度で処理した。反応が終わった後、DPBSで2回洗浄して残余分の試料を除去し、0.05%トリプシン−EDTAを処理、光を遮断したまま、10分間反応させた後、complete mediaを用いて、トリプシン−EDTAを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液3mLを加えて、2,000rpmで3分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのFACSチューブにリン酸緩衝溶液200μLを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。 細胞内に透過されたFITCレベルの測定のために、FL−1の波長を用いて、測定されたFl−1のgeo.mean値で試料の蛍光値を補正するためにscramble peptideの値に基づいて伝送能を決定した。その結果、図3dに示すように、TD1が従来に知られている細胞透過性ペプチドであるkFGF4由来のペプチドと比べて、神経細胞(U−87 MG cell)で優れた細胞透過性を示すことが確認できた。
HeLa cell(Human cervix adenocarcinoma cell)で細胞透過能を確認するために、MEM complete media(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて細胞を培養した。フローサイトメトリー測定のために、12 well plateで置き換え、16〜24時間の追加培養し、各試料は、FBSが添加されていない非血清培地(serum free medium)で各時間と処理濃度に応じて反応させた。反応時間が終了した後、DPBSで2回洗浄して残余分の試料を除去し、0.05%トリプシン−EDTAを処理した後、光を遮断したまま、10分間反応させ、完全培地(complete media)を用いて、トリプシン−EDTAを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液3mLを加え2,000rpmで3分間遠心分離した。 上澄み液を除去した後、それぞれのFACSチューブにリン酸緩衝溶液200μLを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。実験グループでは、TD1、HIV−Tat及びkFGF4由来のペプチドを用いて、測定されたFl−1のgeo.meanの値で、各時間別、濃度別の伝送能を決定した。その結果、図3eに示すように、TD1はHeLa cellで12時間以内に濃度依存的に細胞内に流入されることを知ることができた。HIV−TatおよびkFGF4由来のペプチドは、ほとんど5μM以上の濃度で、細胞内に流入されるが、透過量はTD1に比べて、かなり微弱であることを知ることができる。このようにTD1が対照群に比べて、HeLa cellで非常に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。
3‐1.皮膚の角質形成細胞(HaCaT cell)での定性的な細胞透過能の確認
皮膚の角質形成細胞株であるHaCaT細胞で細胞透過能を確認するためにDMEM complete media(10%FBS、1%penicillin /streptomycin)を用いて細胞を培養した。顕微鏡解析のために12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellに1つずつ入れてHaCaT細胞を接種して、16〜24時間培養した。試料(対照物質:Vehicle、比較物質:HIV−Tat、kFGF4由来のペプチド、実験材料:TD1)は、FBSが添加されていない無血清培地で1時間と3時間の間、3μM、5μMの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器(suction)を介して完全に削除し、リン酸緩衝溶液を入れ、軽く振って2回を繰り返して洗浄し、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間、弱く攪拌し、細胞を固定した。 細胞の固定の後、固定液を除去し、10分間2回、リン酸緩衝液で洗浄した。その後、HoechstとDAPI染色溶液を用いて遮光した状態で10分間、室温で対照染色を行い、反応の後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で2回洗浄した。その後、cover glass(カバーグラス)は回収して、mounting溶液が点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないように徐々に下ろして、mountingした(覆い被せた)。遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図4aに示すように、HIV−Tat、kFGF4由来のペプチドとくらべて、TD1の優れた細胞透過性を角質形成細胞で確認することができた。
神経細胞株であるSiMa cellに対する細胞透過能を確認するために、complete mediaはRPMI1640(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、80%以上のconfluencyで細胞を培養した。細胞は、繰り返した継代培養で安定化させた後、顕微鏡解析のために12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellにcover galss(カバーグラス)1つずつ入れてSiMa cellを接種して、16〜24時間培養した。各試料(HIV−Tat、kFGF4由来のペプチド、TD1)は、FBSが添加されていない非血清培地で6時間、5μMの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器(suction)を介して完全に削除した後、リン酸緩衝溶液を入れ、軽く振って2回繰り返して洗浄し、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間弱く攪拌し、細胞を固定した。 細胞の固定の後、固定液を除去し、10分間2回、リン酸緩衝液で洗浄した。その後、遮光した状態で10分間、室温で対照染色を行い、反応の後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で2回洗浄した。その後cover glass(カバーグラス)は回収して、mounting溶液が点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないように徐々に下ろして、mountingした(覆い被せた)。遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図4bに示すようにkFGF4由来のペプチドと比べて、TD1の優れた細胞透過性を神経細胞でも確認できた。
神経細胞株であるU−87 MG細胞で細胞透過能を確認するためにDMEM complete media(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、U−87 MG細胞を培養した。蛍光顕微鏡の観察のために、12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellに1つずつ入れて細胞を接種して、16〜24時間培養した。各試料(kFGF4由来のペプチド、TD1)は、FBSが添加されていない無血清培地で6時間、5μMの濃度で処理した。反応が終わった後、処理した試料を除去し、PBSで2回繰り返して洗浄した後、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間、細胞を固定した。その後、固定液を除去し、PBSで10分間2回洗浄した後、遮光した状態で、HoechstとDAPI染色溶液を用いて10分間室温で細胞を染色した。染色した後、溶液は除去し、PBSで2回洗浄した後、cover glass(カバーグラス)を回収してmounting solution が点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないように mountingした(覆い被せた)。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図4cに示すように、神経細胞U−87 MG cellでもTD1がkFGF4由来のペプチドと比べて、優れた細胞透過性を示すことを視覚的に確認することができた。
HeLa cell(Human cervix adenocarcinoma cell)で細胞透過能を確認するために、MEM complete media(10%FBS、1%penicillin / streptomycin)を用いて細胞を培養した。蛍光顕微鏡の観察のために、12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellに1つずつ入れて細胞を接種して、16〜24時間培養した。各試料(HIV−Tat、kFGF4由来のペプチド、TD1)は、FBSが添加されていない非血清培地(serum free medium)で5μMの濃度で、6時間と24時間の間に反応させた。反応が終わった後、処理した試料を除去し、PBSで2回繰り返して洗浄した後、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間、細胞を固定した。その後、固定液を除去し、PBSで10分間2回洗浄した後、遮光した状態で、HoechstとDAPI染色溶液を用いて10分間室温で細胞を染色した。染色した後、溶液は除去し、PBSで2回洗浄した後、cover glass(カバーグラス)を回収してmounting solutionが点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないようにmountingした(覆い被せた)。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図4dに示すように、TD1が対照群に比べて、HeLa cellでも非常に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。
ボツリヌストキシンA型の軽鎖タンパク質(Lc)とMTD(TD1)とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質(Lc)を結合した組換えタンパク質の発現コンストラクトを作製した。まず、バイオニア社で合成したコドン最適化(codon optimization)されたボツリヌス神経毒素A型(botulinum neurotoxin type A)の軽鎖(Lc; light chain)の配列を鋳型として、それぞれに対して特異的に考案されたプライマー(primer)ペアと重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。この際に、それぞれのプライマーの配列情報は、下記の表1に示した。
本発明による組換えタンパク質の発現菌株培養および精製プロセスを下記のように行っており、これに対する概略的な模式図を図5に示した。
大腸菌BL21(DE3)RIL−CodonPlusに上記で得た組換え発現ベクターpET21b(+)−Lc、pET21b(+)−TD1−Lcのそれぞれを熱ショック(heat shock)方法で形質転換させた後、50μg/mLのアンピシリン(ampicillin)が含有されたLB培地で培養した。その後、上記の組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を25mL LB培地に接種し、37℃でovernight培養した後、この1次培養液を再び9L LB培地に接種し、37℃でOD600(Optical density at 600nm)が0.4ないし0.8に達するまで培養した。その後、培養液にタンパク質発現の誘導剤である1mMのIPTGを添加して、18℃でovernightに追加培養した後、培養液を4℃で8,000rpm、10分間遠心分離して上澄み液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体は、リン酸緩衝液に懸濁し、lysozyme(リゾチーム)を処理した後、ソニーケータ(sonicator)を用いて細胞を破砕し、これを13,000rpmで30分間遠心分離して溶解性分画を得た。
上記の実施例5-1で得られた溶解性分画を高速タンパク質液体クロマトグラフィー(Fast Protein Liquid Chromatography:FPLC、Bio−rad)を用いて精製を行った。溶解性分画をFPLCに流しながら アフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)カラムに結合させ、洗浄緩衝液(washing buffer)を流して洗浄した。その後、imidazole濃度を段階的に増加させて精製試料を得て、リン酸緩衝溶液またはPBSで透析膜(dialysis membrane)を用いて、4℃の条件で16〜20時間、撹拌しながら透析した。
6‐1.蛍光標識タンパク質の製作
細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質(TD1−Lc)のin vitro細胞透過能を評価するために、FITCが標識されたタンパク質を製造した。遮光した状態で、50mM Boric酸と0.1ng/mL FITC、そして、それぞれ0.5μg/mLのタンパク質を混合して、10mLのタンパク質懸濁液を作って、4℃で8時間反応させた。反応が終わった後、タンパク質懸濁液を透析チューブに入れ、遮光した状態の4℃で3日間、4時間−4時間−16時間の間隔でDPBSで交換しながら透析を行った。透析が終了した後、FITC標識タンパク質を0.2μm syringe filterを用いてろ過し、得られたタンパク質は、Bradford解析法で定量し、必要濃度に応じて選択的に濃縮した。測定された濃度の中で一番低い濃度のタンパク質に合わせて希釈して蛍光強度(fluorescence intensity、RFU)を測定した。測定されたRFUに基づいて検証に用いたFITC融合タンパク質の蛍光強度を比較した。
神経細胞株であるSiMa cellに対する細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質(TD1−Lc)の細胞透過能を評価した。SiMa cellは培養プレートに対する細胞付着能が弱いので、gelatin(sigma、G2500)をコーティングした培養プレートを用いるが、0.1% gelatin溶液を培養プレートにコーティングして、室温で1時間の後、溶液を除去し、乾燥した状態で用いた。Complete mediaは、RPMI1640(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、80%以上のconfluencyで継代培養した。細胞は、繰り返した継代培養で安定化させた後、100mm培養パレート当たり5X105/wellで細胞を接種し、37℃の5%CO2の条件の培養器(incubator)で16〜20時間培養した後、実験に用いた。
神経細胞株であるSiMa cellに対する細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質(TD1−Lc)の細胞透過能を確認するために、complete mediaはRPMI1640(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて、80%以上のconfluencyで細胞を培養した。細胞は、繰り返する継代培養で安定化させた後、顕微鏡解析のために12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellにcover glass(カバーグラス)1つずつ入れてSiMa cellを接種して、16〜24時間培養した。各試料(vehicle、Lc、TD1−Lc)は、FBSが添加されていない無血清培地で3時間5μg/mLの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器を介して完全に削除した後、リン酸緩衝溶液で2回繰り返して洗浄し、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間、細胞を固定した。細胞の固定の後、固定液は除去し、リン酸緩衝液で10分間2回洗浄した。その後、遮光した状態で10分間、室温で対照染色を行ったあと、染色溶液を除去し、リン酸緩衝液で2回洗浄した。細胞の観察のためにcover glass(カバーグラス)は回収して、mounting溶液が点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないように徐々に下ろして、mountingした(覆い被せた)。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図7bに示すように、Lcタンパク質と比べて、細胞透過性ペプチドが結合されたTD1−Lc組換えタンパク質が神経細胞で顕著に優れた細胞透過性を示すことを視覚的にも確認することができた。
皮膚の角質形成細胞株であるHaCaT細胞の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質(TD1−Lc)の細胞透過能を確認するためにDMEM complete media(10%FBS、1%penicillin/streptomycin)を用いて細胞を培養した。顕微鏡解析のために12mm cover glass(カバーグラス)を火炎滅菌した後、24 well plateのそれぞれのwellに1つずつ入れてHaCaT細胞を接種して、16〜24時間培養した。各試料(Vehicle、Lc、TD1−Lc)は、FBSが添加されていない無血清培地で1時間、3時間および6時間の間、5μMの濃度で処理した。反応が終わった後、各wellの培地は除去し、リン酸緩衝溶液で2回繰り返して洗浄した後、各wellに10%ホルマリン溶液を200μLずつ入れ、遮光して10分間、細胞を固定した。細胞の固定の後、固定液は除去し、リン酸緩衝液で10分間2回洗浄した後、遮光した状態で、HoechstとDAPI染色溶液を用いて10分間、室温で対照染色を行った。染色した後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で2回洗浄した後、細胞観察のためにcover glass(カバーグラス)を回収して、mounting溶液が点滴されたslide glass(スライドグラス)に気泡が入らないように徐々に下ろして、mountingした(覆い被せた)。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、confocal microscope(Zeiss LSM700)を用いて細胞を観察した。その結果、図7cに示すようにLcタンパク質と比べて、細胞透過性ペプチドが結合されたTD1−Lc組換えタンパク質が角質形成細胞でも顕著に優れた細胞透過性を示すことを視覚的に確認した。
細胞透過性ペプチド(TD1)とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質(Lc)を結合した組換えタンパク質(TD1−Lc)の皮膚障壁の透過効能を評価するために、皮膚模写人工膜(Start−M)に対する自動皮膚透過器(MicroettePlus)を用いて、皮膚透過効能を確認した。皮膚模写人工膜は吸収を阻害する上層のPES(polyether sulfone)と多孔質構造の生成で吸収に差別性を与えることができる下層のpolyolefinで構成されており、保管が容易で前処理プロセスなしにすぐにシステムに適用することができるメリットがある。また、実際の皮膚で測定することが難しい透過量を皮膚と同じような条件で定量することができ、広く用いられている。用意された皮膚模写人工膜での透過効能を評価するために、vertical cellの下部にPBSを入れ、真ん中に緩衝溶液と皮膚模写人工膜が空いているスペースがないように結合させた後、vertical cellの上に試料を入れて準備した。下部の緩衝溶液を時間が経ることに応じて、10%の量を採取した後、同じ量の緩衝溶液を入れて、これを繰り返した。採取した試料は、実験が終わった後、ELISA解析法を用いて、量を測定した。その結果、図8に示すように、新規の細胞透過性ペプチドMTDが結合されたTD1−Lcがボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質Lcに比べて、皮膚模写人工膜で透過能が約20%以上、優れていることが確認できた。時間に応じた皮膚模写膜の透過度は、6時間までは同様に見えるが、12時間の後から24時間までにはTD1−Lcタンパク質の透過能がより優れていることを確認することができる。
SNAP25タンパク質は、SNARE proteinの一種でボツリヌストキシンA型の軽鎖が切るタンパク質で、一般的にボツリヌストキシンの活性を見るために、試験管でSNAP25 cleavage assay方法を用いる。本実施例でもボツリヌストキシンの軽鎖(BoNT/A Light chain(Lc))の活性を確認するために、cleavage assayを行った。2μgのGST−SNAP25−EGFP融合タンパク質に2μlのcleavage assay buffer(10mM DTT、10mM HEPES、10mM NaCl及び20uM ZnCl2)を入れて、組換えタンパク質TD1−Lcをそれぞれの濃度10、30、90、270、810ngの濃度で添加した後、37℃で4時間反応させた。陽性対照群には、270ngのボツリヌストキシン混合体(BoNT/A complex)を添加し、3次蒸留水で全体の容量を20μlに合わせて同じ条件で反応させた。上記の反応が終了した混合液は、5X reduced bufferを添加して、100℃で10分間加熱した後、12% SDS−PAGE gelを用いて、80V 20分、120V 1時間の電気泳動を行った。SDS−PAGE gelはstaining buffer(0.25% coomassie brilliant blue、45% methnaol、10% acetic acid)で染色した後、destaining buffer(30% methanol、10% acetic acid))で脱色してタンパク質のパターンを確認した。その結果、図8に示すように、TD1−Lcの組換えタンパク質でもボツリヌストキシンの活性が維持されていることを確認することができた。上記の結果から、TD1−Lcの組換えタンパク質がボツリヌストキシンと同じ機能をすることを予想することができた。
9‐1.ヒト角質形成細胞(HaCaT cell)でのSNAP25 cleavageの確認
角質形成細胞(HaCaT cell)での組換えタンパク質TD1−Lcの皮膚透過および効能を評価するために、SNAP25タンパク質の切断の可否を介して効能を確認することができるSNAP25 cleavage assayをwestern blot方法で行った。角質形成細胞(HaCaT cell)は、24 well plateに1X104/wellの細胞数で24時間培養した後、pcDNA3.1−SNAP25 plasmidをtransfectionし、陽性対照群としてpcDNA3.1−Lc plasmidをcotransfectionした。16時間培養を介してSNAP25を過発現させた後、FBSのない培地に交換し、TD1−Lcタンパク質の処理の後には、48時間後に培地を除去し、PBSで洗浄した。その後、各wellにRIPA buffer(intron)200μlずつ入れて細胞を溶解させた後、4℃ 8,000rpmで10分間遠心分離して、上澄み液を得た。得た各試料は、5X reducing sample bufferと混合した後、100℃で10分間加熱して、15%SDS−PAGE gelに80Vで20分、120Vで1時間の電気泳動を行った。電気泳動が終わったgelはPVDF membrane(Millipore、IPVH00010)で90Vで1時間10分間の転写(transfer)させて、転写されたmembraneは5% BSAを入れて2時間blockingした。その後、Primary antibody(Covance、SMI−81)を1:1000に5% BSAで希釈して入れ、4℃で16時間反応させた。反応が終わったmembraneはPBSTを用いて、10分間隔で3回以上洗浄するプロセスを経て、second antibody(Millipore、AP192P)を1:2500に5% BSAで希釈して入れ、再び1時間室温で反応させた。2次反応が終了したmembraneはPBSTで10分間隔で3回以上洗浄し、ECL solutionを処理して、追加の反応をさせてカセットに移した後、暗室でX−ray filmに感光させて確認した。その結果、図10aに示すように、plasmid状態でLcを内部で発現した場合とタンパク質を外部で処理した場合、すべてのSNAP25の切断を確認することができた。これは、外部からの処理したTD1−Lcのタンパク質が皮膚細胞を透過して内部で発現されたSNAP25を切断したことを意味する。したがって、組換えタンパク質TD1−Lcが優れた皮膚細胞透過性と活性を有していることを確認することができた。
ヒト神経細胞(Human neuroblastoma cell)であるSiMa cellでの組換えタンパク質TD1−Lcの皮膚透過および効能を評価するために、SNAP25タンパク質の切断の可否を介して効能を確認することができるSNAP25 cleavage assayをwestern blot方法で行った。
10‐1.ヒト角質形成細胞(HaCaT cell)での細胞毒性の評価
組換えタンパク質TD1−Lcのヒトの皮膚細胞の細胞毒性を評価するために、細胞の生存率を測定するMTT assayを行った。まず、角質形成細胞(HaCaT cell)を24 well plateに1X104/wellの細胞数で培養して、組換えタンパク質TD1−Lcを処理する4時間の前にFBSのない培地に交換した。タンパク質は、0.625μg/mLで40μg/mLの濃度まで処理し、48時間反応させた後、5mg/mLのMTT(sigma)を各10μlずつ添加して、さらに4時間反応させた。反応が終わった培養液は捨てて、各試料に100μlのDMSOを添加して、室温で10分間反応させた後、OD570で吸光度(absorbance)を測定した。上記の実験の対照群では、細胞透過性ペプチドTD1が結合されていないボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質(Lc)を一緒に実験した。その結果、図11aに示すように、組換えタンパク質TD1−Lcが角質形成細胞(HaCaT cell)に対して40μg/mLの高い濃度でも細胞の生存率が維持されることにより、細胞毒性が表さないことを確認することができた。
組換えタンパク質TD1−Lcのヒト神経細胞(SiMa cell)に対する細胞毒性を評価するために、細胞生存率を測定するMTT assayを行った。ヒト神経細胞(SiMa cell)を24 well plateに5X105/wellの細胞数で培養して、神経細胞分化の方法によって分化を誘導した。最後の分化培地に交換し、4時間の後、組換えタンパク質TD1−Lcを処理した。タンパク質は、0.625μg/mLで40μg/mLの濃度まで処理し、48時間反応させた後、5mg/mLのMTT(sigma)を各10μlずつ添加して、さらに4時間反応させた。反応が終わった培養液は捨てて、各試料に100μlのDMSOを添加して、室温で10分間反応させた後、OD570で吸光度(absorbance)を測定した。上記の実験の対照群では、細胞透過性ペプチドTD1が結合されていないボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質(Lc)を一緒に実験した。その結果、図11bに示すように、組換えタンパク質TD1−Lcを処理したヒト神経細胞(SiMa cell)の細胞生存率が維持されることにより、高濃度でも組換えタンパク質TD1−Lcによる細胞毒性が表さないことを確認することができた。
ボツリヌストキシンの軽鎖は、精製の後、二つの軽鎖タンパク質がdimerを形成し、形成された軽鎖dimerはself−cleavage activityを有し、保管条件に応じて、self−cleavage activityの活性に差を見せる。そして、組換えタンパク質TD1−Lcの保管期間に応じた安定性を確認するために、各期間別のタンパク質のパターンの変化をSDS−PAGE電気泳動で確認した。組換えタンパク質TD1−Lcは定量して10μgずつ、それぞれのチューブに分注して−80℃の超低温冷凍庫に保管した。保管してから1月、3月、6月が経過した後、その後、各期間の経過に応じて、それぞれの組換えタンパク質TD1−Lcを溶かして12% SDS−PAGE gelに電気泳動を行い、タンパク質の純度およびパターンの変化があるかを確認した。その結果、図12に示すように、6月が経過しても、タンパク質のパターンの変化がなく、組換えタンパク質が安定に維持されていることを確認することができた。
組換えタンパク質TD1−Lcの臨床試験のために、H&A pharmachem社にリポソーム化を委託して加工した後、化粧品原料と2次加工して、化粧品組成物として作製した。
組換えタンパク質TD1−Lcのシワ改善効能の評価のために専門の臨床試験代行機関(CRO)であるアイイシコリア(株)(韓国)に依頼して、臨床試験を実施した。試験は、30歳から59歳までのほうれい線を持つ韓国人の大人の女性被験者22人を対象に、試料1種を1日2回、4週間の間、被験者自ら自宅で使用するようにした後、皮膚ほうれい線の粗さと皮膚の弾力を測定し、臨床写真撮影と皮膚科専門医のほうれい線の肉眼評価を並行して組換えタンパク質TD1−Lcの皮膚のシワの改善の効能を評価した。ほうれい線の粗さは、PRIMOS Systemを用いて測定し、皮膚の弾力は、Cutometer MPA580を用いて測定した。
- 試験中の試験責任者と試験担当者は、被験者の安全に最善を尽くさなければならなく、すべての皮膚の異常症状の発生の際に迅速かつ適切な措置を取り、その反応を最小限に抑えなければならない。
- 試験中、被験者は、試料によって皮膚刺激または異常症状の事例を報告する場合には、すぐに使用された試料を拭き取り、症状が好転しない場合の試験責任者による皮膚科的な評価と適切な治療を受ける。
- 通常の試験プロセスにもかかわらず、皮膚に異常の症状が発生した場合、適切な皮膚科的な評価と治療を受けるようにする。
- その他の異常な皮膚反応が発生した場合、試験責任者と試験担当者は、皮膚科的な評価と一緒に適切な措置を取り、症例および状況について詳細に記録をする。
- 結果の測定は、被験者が実験室を訪問して恒温恒湿室(22±2℃、50±5%)で15分以上待機して、皮膚の安定を取るようにした後、測定および評価を実施した。
- Ra:arithmetic average(平均の粗さ)
- Rmax:Maximum peak to vally roughness(最大の粗さ)
- R3z:Arithmetic mean third height
- Rt:distance between the highest and the lowest point
- Rz:Average maximum height(10 point height)
- R5:Net elasticity of the skin without viscous deformation
- R7:Portion of the elasticity compared to the complete curve
Claims (21)
- 生物学的な活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドとして、上記のペプチドが配列番号1のアミノ酸配列からなる、細胞透過性のペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
- 上記のポリヌクレオチドが配列番号2の塩基配列からなることを特徴とする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- ボツリヌストキシンの軽鎖の一側または両側末端に、配列番号1のアミノ酸配列からなる細胞透過性のペプチドが融合された、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記のボツリヌストキシン組換えタンパク質は、配列番号31ないし配列番号58からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、配列番号3ないし配列番号9からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、一側末端にヘキサヒスチジン(hexahistidine)タグ(tag)をさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、ボツリヌストキシン血清型(serotype)A、B、C、D、E、FおよびGからなる群より選択されることを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記の融合は、上記のボツリヌストキシンの軽鎖のカルボキシ末端、アミノ末端またはこれらの両方に上記の細胞透過性ペプチドが融合されることを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 上記の融合は、ペプチド結合または共有結合によりなることを特徴とする、請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。
- 請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
- 上記のポリヌクレオチドが配列番号59ないし配列番号86からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 上記の組換え発現ベクターは、His、HAT、FLAG、c−myc、SBP、Chitin−binding domain、Glutathione−S transferaseおよびMaltose−binding proteinからなる群より選択される親和性標識(affinity tag)を含むことを特徴とする、請求項13に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項13に記載の組換え発現ベクターで形質転換された細菌。
- 請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療用の薬剤学的組成物。
- 上記の薬剤学的組成物は、経皮投与用であることを特徴とする、請求項16に記載の組成物。
- 請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、皮膚外用剤組成物。
- 請求項4に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、化粧料組成物。
- 上記の組成物は、シワ、四角い顎およびつきだしてる顎、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドの症状を改善させるのに適用されることを特徴とする、請求項18または請求項19に記載の組成物。
- 請求項15に記載の形質転換細菌を培養する段階を含む、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の生産方法。
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