CN116715777A - 局部组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供嵌合多肽，其包括一个或多个融合在治疗肽，如肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)中的锌指模体。所述锌指模体可位于BoNT的C端，所述嵌合多肽可选地包含两个或多个此类锌指模体。结果表明，本公开的嵌合多肽可以有效地经皮传递给受试者。

Description

局部组合物及用途
本申请是申请日为2018年07月20日申请号为201880048885.9、发明创造名称为“局部组合物及用途”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种局部组合物及用途。
背景技术
肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)是由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和相关物种产生的天然神经毒素。人们已知有七种BoNTs血清型，A、B、C1、D、E、F和G。BoNTs以单条多肽链形式从细菌中释放出来，然后自切为通过单个二硫键连接的一个100kDa重链和一个50kDa轻链。该重链将肉毒杆菌毒素引导至前突触神经终末，并介导该轻链内化进入细胞质。肉毒杆菌的轻链是一种金属蛋白酶，其特异地切割SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感融合附着蛋白受体)复合蛋白。
SNARE是一个大型蛋白质超级家族，其在哺乳动物细胞中由60多个成员组成。核心SNARE复合体是4-α-螺旋束，其包括小突触小泡蛋白(synaptobrevin)(也称为囊泡相关膜蛋白，VAMP)的一个螺旋，突触融合蛋白1(syntaxin-1)的一个螺旋和突触小体相关蛋白25(SNAP-25)的两个螺旋。这些SNARE蛋白质的四个螺旋相互包裹，组装成一个卷曲螺旋的四元结构。突触融合蛋白1与SNAP-25的N端螺旋结合，而小突触小泡蛋白螺旋与SNAP-25的C端螺旋结合。SNARE复合体的主要作用是介导囊泡融合，例如在神经元中突触囊泡与前突触膜的融合。
BoNTs特异地切割三个核心SNARE蛋白质小突触小泡蛋白、突触融合蛋白1或SNAP-25中的一个。这三种蛋白质中任一种的失活都会破坏核心SNARE复合体的形成，或核心SNARE复合体与SNARE超复合体中其他组分的相互作用。SNARE超复合体功能的阻断可阻止囊泡与细胞膜融合，从而阻止从轴突末梢释放神经递质乙酰胆碱，导致肌肉麻痹。
BoNTs是地球上最强效的天然毒素，其在人类中物质含量仅50ng则引起肉毒杆菌中毒。在自然界中，BoNTs主要感染野生动物和驯养动物，并通过无脊椎动物传播。根据毒素的来源，人类肉毒杆菌中毒分为五类：食源性肉毒杆菌中毒、婴儿肉毒杆菌中毒、吸入性肉毒杆菌中毒、医源性肉毒杆菌中毒(由过量的临床BoNTs剂量引起)和伤口性肉毒杆菌中毒(主要由药物注射引起)。前两种是最常见的人类肉毒杆菌中毒。
BoNTs的治疗性用途最早是由Alan B.Scott在20世纪60年代末提出的，并在1977年对患有斜视的儿童进行了临床实践。BoNTs非凡的特异性使其成为以神经终末的过度活跃为特征的人类疾病的有效药剂。BoNTs的治疗性用途最大占比是用于神经系统疾病，例如肌张力障碍、痉挛、面部痉挛、多汗症(出汗过多)和唾液分泌过多症(唾液过多)。BoNTs的另一个重要用途是治疗泌尿系统疾病，例如逼尿肌括约肌协同失调、特发性逼尿肌过度活跃、神经源性逼尿肌过度活跃、尿滞留、肛裂和良性前列腺增生。虽然很少见，但BoNTs可用于治疗胃肠病和耳鼻喉科疾病。BoNTA于2002年获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，用于治疗65岁或以下的成年患者的中度至重度抬头纹。从2005年开始，BoNTA已成为使用最广泛的非侵入性的、医生辅助的美容方法。虽然患者总体满意度高于80％，但注射BoNTA面临许多缺点，例如疼痛、针痕、压痛、出血和淤青。尤其地，在鱼尾纹或外眦区域注射BoNTA可能由于皮肤薄和表面血管而与导致淤青的高风险相关。对于某些治疗，需要多次注射才能达到最大效果。
发明内容
本公开在一个实施方案中提供了一种嵌合多肽，其包含(a)肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链和(b)第一锌指模体，所述第一锌指模体位于所述BoNT轻链的C端或BoNT重链的C端，所述BoNT重链位于所述BoNT轻链的C端或通过二硫键与所述BoNT轻链结合。在一些实施方案中，所述嵌合多肽不包含2000个以上氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述BoNT轻链和所述第一锌指模体在同一肽链上。在一些实施方案中，所述BoNT轻链和所述第一锌指模体在不同肽链上。
在一些实施方案中，所述嵌合多肽还包含位于所述BoNT轻链的N端的第二锌指模体。在一些实施方案中，所述第一锌指模体和所述第二锌指模体的至少一个串联到至少另外一个锌指模体。在一些实施方案中，所述锌指模体的至少一个为Cys2-His2型锌指模体。在一些实施方案中，所述锌指模体在所述锌指模体α螺旋片段的残基-1、2、3或6处包含至少一个丙氨酸。
在一个实施例的实施方案中，提供了一种双链多肽，其包含(a)第一链，所述第一链包含肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链和三个位于所述BoNT轻链的N端的锌指模体，和(b)第二链，所述第二链包含BoNT重链和三个位于所述BoNT重链的C端的锌指模体，所述BoNT轻链通过二硫键与所述BoNT轻链结合。相似地，在一个实施方案中，提供了一种嵌合多肽，其包含，从N端到C端，三个锌指模体、肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链、BoNT重链和另外三个锌指模体。
在一些实施方案中，所述锌指模体的至少一个包含选自由SEQ ID NO：1和5～7组成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述锌指模体包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一锌指模体离所述BoNT轻链或所述BoNT重链的C端不超过200个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述BoNT选自BoNTA、B、C、D、E、F或G或与其具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施方案中，所述BoNT选自亚型BoNTA1-A10、B1-B8、E1-E9和F1-F7。在一些实施方案中，所述BoNT为BoNT A。在一些实施方案中，所述BoNT轻链包含如SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述BoNT重链包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列与SEQ ID NO：9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含单链多肽，所述单链多肽含选自由SEQ IDNO：10～17组成的群组的氨基酸序列；或由所述氨基酸序列加工成的双链多肽。
在一个实施方案中，还提供了一种嵌合多肽，其包含肉毒杆菌(BoNT)轻链和至少一个锌指模体。在一些实施方案中，所述嵌合多肽不包含2000以上氨基酸残基。在一些实施方案中，所述锌指模体位于所述BoNT轻链的C端且距离所述BoNT轻链不超过200个氨基酸残基。
本发明另一个实施方案提供了一种嵌合多肽，其包含治疗肽和至少一个位于所述治疗肽的C端的锌指模体，其中所述锌指模体的N端离所述治疗肽的C端不超过100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述治疗肽选自由表皮生长因子(EGF)和超氧化物歧化酶(SOD)组成的群组。
本发明还提供了制药用途和治疗方法。在一些实施方案中，提供了一种对哺乳动物受试者施用BoNT轻链的方法，其包括局部应用一种制剂，所述制剂包含本发明的所述嵌合BoNT多肽。在一些实施方案中，所述施用也可以在肌肉内。
在一些实施方案中，所述局部应用是在眼睛、耳朵、鼻子、嘴、唇、尿道开口、肛门或舌头的皮肤或粘膜上。在一些实施方案中，所述局部应用是在已被破坏的皮肤的角质层上。在一些实施方案中，所述破坏使用用于输送所述制剂的针或微针进行。在一些实施方案中，所述局部应用是在所述受试者的面部或颈部皮肤上。在一些实施方案中，所述制剂包括乳霜、凝胶或喷雾剂。
在一些实施方案中，所述受试者需要治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面部痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。
在特定实施方案中，还提供了编码本发明的所述嵌合多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸和/或所述多肽的细胞以及包含所述多肽的配方。
附图说明
图1显示所述实施例中试验的各种BoNTA融合蛋白的结构。
图2中的图A和B示出了从大肠杆菌表达的BoNTA-CPP重组融合蛋白的纯化结果。(A)TAT和Pep-1蛋白质表达和纯化的效果不良。(B)BoNTA-ZFP(Protein ID：6)蛋白质表达和纯化的效果良好。
图3显示穿透细胞的BoNTA蛋白质的体外活性的SNAPtide测定结果。阳性对照是市售的重组BoNTA轻链(BoNTA-LC，R&D Systems)。空白对照(Mock)是SNAPtide单独的反应。
图4显示经穿透细胞的BoNTA蛋白质处理的人类皮肤成纤维细胞的细胞溶解的SNAPtide测定结果。阴性对照是市售的重组BONTA-LC(R&D Systems)。
图5显示穿透细胞的BoNTA蛋白质的体内效应的代表性图像。
图6显示经穿透细胞的BoNTA蛋白质处理的小鼠的趾外展(digitabduction)的散点图。A，用0.9％NaCl生理盐水溶液处理。B，注射BOTOX。C，用微针预处理，然后用BOTOX处理。D，用微针预处理，然后用穿透细胞的BoNTA-ZFP(Protein ID 6)处理。E，不用微针预处理，用穿透细胞的BoNTA-ZFP(Protein ID 6)处理。
图7显示昆虫细胞中BoNTA-ZFP(ProteinID6)的表达。M，蛋白分子量标准(marker)。T，总细胞溶解物。S，可溶性部分。+，上样内参。
图8显示分析BoNTA-ZFP的肌肉麻痹活动的踏步机研究的试验结果。
图9显示分析BoNTA-ZFP的肌肉麻痹活动的平衡木研究的试验结果。
图10显示分析BoNTA-ZFP的肌肉麻痹活动的足迹研究的试验结果。
具体实施方式
定义
应当注意的是，术语“一种(个)”实体是指一种(个)或多种(个)该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种(个)或多种(个)”和“至少一种(个)”可以在本发明中互换使用。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术生产，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可以通过任何方式生产，包括通过化学合成。
本发明中关于细胞、核酸(例如DNA或RNA)所使用的术语“分离的”是指分别与其他存在于大分子的天然来源中的DNA或RNA分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞物质、病毒材料或培养基的核酸或肽，或通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”旨在包括不以片段形式天然存在的和不会在天然状态下存在的片段。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽旨在包括纯化的和重组的多肽。
在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸，其意指天然不存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性的实施例可通过组合通常不会同时存在的多核苷酸或多肽产生。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。
术语“等价的核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补物的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补物杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价的多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。
杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×SSC或相同等离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×SSC中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×SSC中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的一个非限制性实施例指通常在同一个细胞中存在的温度、离子强度、pH和Mg2+浓度。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多于一种形式的基因或其一部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本发明的任何多核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。
在本发明中使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二个硫醇基形成二硫键或盐桥的硫醇基。
在本发明中，术语“治疗”是指治疗和预防或预防措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不想要的生理变化或疾病，例如不想要的皱纹。有益的或想要的临床结果包括但不限于：减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病发展、改善或姑息疾病状态和缓解(无论是局部还是总的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也意味着与如果不接受治疗的预期生存时间相比，延长生存时间。需要治疗的人包括那些已经患有这种疾病的人，以及那些容易患有这种疾病的人，或者那些需要预防这种疾病的人。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，尤其是指哺乳动物受试者，其需要诊断、预后或治疗。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农场动物、动物园动物、运动场动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
在本发明中，诸如“对需要治疗的病人”或“需要治疗的人”等短语包括受试者，例如哺乳动物受试者，这些受试者将受益于抗体或本发明的组合物的给药，例如用于检测、诊断方法和/或治疗。
含锌指模体的嵌合多肽
市场上存在经皮递送BoNT蛋白质的需求。蛋白质的经皮递送实质上是困难的，尤其是在皮肤上。皮肤由两层细胞组成，称为表皮和真皮。表皮是皮肤的最上层，是由基底和分化的角质细胞组成的复层扁平上皮。角质细胞是表皮的主要细胞类型。基底层的角质细胞可以通过有丝分裂增殖且经历多个细胞分化阶段而成为无核细胞。无核或分化的角质细胞是高度组织的组织结构，其分泌提供抵御入侵物质(如病原体)保护屏障的角蛋白和脂质。
在开发经皮BoNT组合物方面还没有获得成功。然而，本发明表明，BoNT多肽与一个或多个锌指模体(或锌指蛋白结构域或ZFP)的融合可以使BoNT穿透皮肤。锌指蛋白是天然存在的转录因子，并可以被重编程以识别靶标基因组位点。含有N端ZFP结构域和C端FokI核酸内切酶结构域的锌指核酸酶-嵌合蛋白已被证明具有内在细胞渗透性。一些ZFP包括Cys2-His2 ZFP结构域。Cys2-His2 ZFP由大约30个具有ββα结构的氨基酸组成。
这个发现是令人惊讶和预料不到的，其至少出于以下原因。首先，在动物皮肤上高效递送大型蛋白质的能力本身是令人惊讶和预料不到的；尤其地，众所周知，ZFP的细胞穿透活性是依赖能量的，这意味着在角质层(由死去的角化细胞形成的最外层的皮肤)上可以预期会有极有限的效能(如果有的话)，即使被物理或化学手段破坏，仍然构成对典型生物分子的不可逾越的障碍。
其次，ZFPs是依赖锌的金属蛋白酶，而且众所周知，肉毒杆菌毒素的活性需要锌，因为它可以通过蛋白酶抑制剂和锌螯合剂来抑制。由于ZFPs和BoNT都需要锌离子的结合，因此在融合蛋白中同时存在ZFP和BoNT会导致它们彼此干扰而导致活性下降甚至失活受到过质疑。
在此背景下，发明者即时设想，将ZFP在BoNT的C端方向融合可以避免或减少此类干扰。此外，或者，使用双支(串联)ZFP可以确保ZFP的活性得以保持。
再次，如实验的实施例所示，BoNT-ZFP融合蛋白在细菌细胞中高表达，其远远比当BoNT与TAT或Pep-1融合时要高得多，TAT、Pep-1是两种常用于研究的细胞渗透肽。过去还没有过对此效果的启示，因此这也是预料不到的。
最后，表达的BoNT-ZFP融合蛋白不仅表现出高酶活性(参见，例如图3)，还在穿过细胞膜进入胞内空间后仍保留这种活性(参见，例如图4)。进一步地，当在体内环境中使用时，局部应用的，优选地在微针处理的动物皮肤上应用的BoNTA-ZFP融合蛋白，正如注射的BoNTA，导致肌肉麻痹。还令人惊讶的是，本领域没有预料到这种治疗效果可以通过局部配方来实现。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种嵌合(或融合)多肽，其包含(a)肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链和(b)位于BoNT轻链C端的锌指模体。
在一个实施方案中，还提供了一种嵌合(或融合)多肽，其包含(a)肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链，(b)BoNT重链和(c)位于BoNT重链C端的锌指模体。在一些实施方案中，所述轻链和所述重链在同一肽链上。在一些实施方案中，所述轻链在所述重链的N端侧。在一些实施方案中，所述轻链在所述重链的C端侧。在一些实施方案中，所述轻链和所述重链在不同肽链上并通过二硫键连接。
在一些实施方案中，还提供了嵌合多肽，其包含肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链和至少一个锌指模体。在一个实施方案中，所述嵌合多肽还包含BoNT重链。
在一些实施方案中，所述嵌合多肽的总大小不大于5000个氨基酸残基，或者不大于4000个氨基酸残基，不大于3000个氨基酸残基，不大于2000个氨基酸残基，不大于1800个氨基酸残基，不大于1600个氨基酸残基，不大于1500个氨基酸残基，不大于1400个氨基酸残基，不大于1300个氨基酸残基，不大于1200个氨基酸残基，不大于1100个氨基酸残基，不大于1000个氨基酸残基，不大于900个氨基酸残基，不大于800个氨基酸残基，不大于700个氨基酸残基，不大于600个氨基酸残基，不大于500个氨基酸残基，不大于450个氨基酸残基，不大于400个氨基酸残基，不大于350个氨基酸残基，不大于300个氨基酸残基，不大于250个氨基酸残基，或不大于200个氨基酸残基。
肉毒杆菌毒素至少有七种类型，称为A-G型。A型和B型能够在人类中引起疾病，并且还用于商业和医学领域。C-G型不太常见。A型和B型肉毒杆菌毒素在医学上用于治疗各种肌肉痉挛和以肌肉过度活跃为特征的疾病。每个BoNT血清型还可以具有亚型。例如，已知以下亚型：BoNTA1-A10、B1-B8、E1-E9和F1-F7。
术语BoNT或其特殊类型或亚型也涵盖其等同的多核苷酸，例如具有一定程度(例如，至少85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性的那些或用一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代修饰的那些。在一些实施方案中，所述取代是保守氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，多肽中的非必需氨基酸残基优选地取代为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用侧链家族成员中顺序和/或组成不同的、结构相似的一串氨基酸取代。
下表中提供了保守氨基酸取代的非限制实施例，其中相似性分数为0或更高表明了两个氨基酸之间的保守取代。
表1A.氨基酸相似性矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
表1B.保守氨基酸取代
在一些实施方案中，BoNT肽包含来自天然BoNT肽的不大于1个、不大于2个或不大于3个的以上取代。
BoNT轻链的非限制性实施例包含SEQ ID NO：8(BoNT A轻链)和与SEQ ID NO：8具有至少90％(或至少95％、至少98％或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。BoNT重链的非限制性实施例包含SEQ ID NO：9(BoNT A重链)和与SEQ ID NO：9具有至少90％(或至少95％、至少98％或至少99％)序列同一性的氨基酸序列。以下表2提供了SEQ ID NO：8和9的氨基酸序列。
表2.代表性的BoNT序列
“锌指模体”是小型蛋白质结构模体，其特征在于配位一个或多个锌离子以稳定折叠。通常地，锌指通过半胱氨酸和组氨酸残基的组合来配位锌离子。这些残基的数量和顺序可用于分类不同类型的锌指(例如Cys2His2、Cys4和Cys6)。另一方法是基于折叠结构域中蛋白质骨架的总体形状将锌指蛋白分类为折叠群。锌指最常见的折叠群是Cys2His2型锌指(经典的锌指)，高音谱号锌指、带状锌指、塞结状锌指(gagknuckle)、Zn2/Cys6型和类TAZ2结构域型锌指。
Cys2His2折叠群采用简单的ββα折叠且具有如下氨基酸序列模体：
X2-Cys-X2，4-Cys-X12-His-X3，4，5-His。
单个锌指结构域可以以两个、三个或多个指结构的串联重复序列形式出现，所述指结构包含蛋白的DNA结合结构域。
锌指模体可以被修饰以去除或降低其与DNA结合的能力。例如，修饰过的Cys2His2在锌指模体中的α-螺旋片段的残基-1、2、3或6上包含至少一个丙氨酸。锌指模体的非限制性实施例显示在下表3中。表3中的一些序列，SEQ ID NO：1和5～7是单个锌指模体，而另一些序列(锌指模体的串联序列)SEQ ID NO：2～4包含多个串联的锌指模体。当两个或多个锌指串联使用时，它们可以彼此相邻或通过肽接头连接，即长度为1、2或3个氨基酸到2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的短肽。修饰过的SEQ ID NO：1的丙氨酸残基加下划线并加粗。
表3.锌指模体(ZFP)的实施例
在一些实施方案中，所述嵌合多肽还包含位于所述BoNT轻链的N端侧的锌指模体。在一些实施方案中，所述嵌合多肽还包含位于所述BoNT重链的N端侧的锌指模体。在一些实施方案中，所述嵌合多肽为双链多肽且包含位于BoNT轻链C端侧的锌指模体(或两个锌指或三个锌指的串联)。在一些实施方案中，所述嵌合多肽为双链多肽且包含位于BoNT轻链C端侧的锌指模体(或两个锌指或三个锌指的串联)和位于BoNT重链的N端侧的锌指模体(或两个锌指或三个锌指的串联)。
在一些实施方案中，至少所述锌指模体之一与至少一个或两个以上锌指模体连接以形成双支或三支锌指模体(例如，串联锌指模体)。在一些实施方案中，串联锌指模体之间具有零个、一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。
BoNT轻链、重链和锌指模体之间的距离可以根据偏好和需求进行调整。在一些实施方案中，锌指离相邻的BoNT轻链或重链的N-或C-端不超过200个氨基酸残基。在一些实施例中，所述距离是0到约150个氨基酸、5～100个氨基酸、10～75个氨基酸、10～50个氨基酸、10～40个氨基酸、10～30个氨基酸、10～20个氨基酸、20～150个氨基酸、20～100个氨基酸、20～50个氨基酸、50～100个氨基酸。在一些实施方案中，通过插入间隔序列(例如，丙氨酸、甘氨酸或其组合)来提供距离。
SEQ ID NO：10～17(表3)中提供了嵌合多肽序列的非限制性实施例。这些序列中的一些既包括BoNT轻链又包括BoNT重链，并且这些序列包括未切割的单链形式和切割的双链形式。
表4.代表性的嵌合多肽序列
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进一步可预期的，本明的技术也可无限制地应用于其他治疗肽，例如表皮生长因子(EGF)和超氧化物歧化酶(SOD)。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含治疗肽和至少一个锌指模体的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述锌指模体位于治疗肽的C-末端侧。在一些实施方案中，所述锌指模体离所述治疗肽不超过100个氨基酸残基(或不超过90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个氨基酸残基)。在一些实施方案中，所述锌指模体与另一个锌指模体连接以形成双支(bipartite)锌指模体。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在所述治疗肽的N-端侧和C-端侧均包含锌指模体(或双支锌指模体)。
在一些实施方案中，所述治疗肽选自EGF和SOD，所述治疗肽的实例序列如表5所示。本发明还描述了锌指模体的实施例，锌指模体之间的间隔序列和距离的实施例。
表5.代表性的治疗肽序列
在一些实施方案中，所述多肽可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药剂或PEG缀合。所述多肽可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可以包括可检测的标记物，例如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，所述细胞毒性剂可以是药物或毒素、超声增强剂、非放射性标记、其组合以及本领域已知的其他此类试剂。
所述多肽可以通过将其偶联至化学发光化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实施例是鲁米诺、异鲁米诺、热稳定的吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
所述多肽还可以使用荧光发射金属(例如152Eu或镧系元素的其他金属)可检测地标记多肽。可使用诸如二乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将这些金属连接至抗体。
本发明还提供了编码本发明的多肽、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本发明的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在分开的多核苷酸分子上编码多肽、其变体或衍生物的整个重链和轻链。另外，本发明的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在分开的多核苷酸分子上编码多肽、其变体或衍生物的重链和轻链的一部分。
可以将编码融合多肽或其结构域的多核苷酸插入“表达载体”。术语“表达载体”是指可被改造使其含有编码本发明多肽的多核苷酸的遗传构建体，例如质粒、病毒或本领域已知的其他载体。此类表达载体通常是包含促进宿主细胞中插入的遗传序列转录的启动子序列的质粒。表达载体通常包含复制起点、启动子以及允许对转化细胞进行表型筛选的基因(例如抗生素抗性基因)。在本发明中可以使用各种启动子，包括诱导型和组成型启动子。通常地，表达载体包含复制子位点和源自与宿主细胞相容的物种的控制序列。
可以使用本领域技术人员熟知的常规技术通过多核苷酸转化或转染宿主细胞。例如，在宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)的情况下，可以使用本领域已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。或者，可以使用物理手段，例如电穿孔或显微注射。电穿孔允许通过高压电脉冲将多核苷酸转移到细胞中。另外，可以使用本领域熟知的方法通过原生质体融合将多核苷酸引入宿主细胞。还已知用于转化真核细胞的合适方法，例如电穿孔和脂转染。
本发明涵盖的术语“宿主细胞”是这样的任何细胞，在其中所述多核苷酸可用于表达所述融合多肽或其功能结构域。所述术语还包括宿主细胞的任何后代。有用的宿主细胞包括细菌细胞(例如Clostridium botulinum)、真菌细胞(例如酵母细胞)、昆虫细胞(例如Spodoptera)、植物细胞和动物细胞。本发明的融合多肽可以在原核生物中通过表达编码融合多肽的多核苷酸来生产。这些包括但不限于微生物，例如用编码本发明的融合多肽的重组噬菌体DNA、质粒DNA或质粒DNA表达载体转化的细菌。可以通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将构建体引入宿主细胞。
所述构建体可以在BoNT蛋白天然产生的肉毒杆菌中表达。本发明的令人惊讶的发现是，可以在昆虫细胞(例如，Spodoptera frugiperda Sf9)中有效地产生所述含有BoNT轻链和/或重链的嵌合蛋白。因此，在一个实施方案中，所述宿主细胞可以是昆虫细胞，例如鳞翅目细胞、夜蛾科细胞、灰翅夜蛾属细胞和草地贪夜蛾细胞。
为了长期高产量地生产重组蛋白，通常使用稳定的表达。可以使用编码由适当表达控制元件(例如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的本发明的融合多肽的cDNA和筛选标记转化宿主细胞，而不是使用包含病毒复制起点的表达载体。筛选标记具有对选择性杀伤剂的抗性，并且在异源多核苷酸的稳定整合后，允许抗性细胞的生长。这种抗性细胞生长形成灶，然后可以将其克隆并扩增成细胞系。
治疗方法和用途
在本发明中，本发明的含所述锌指模体的嵌合(融合)多肽可以有效地经皮传递。因此，所述嵌合多肽具有取决于融合的治疗蛋白的治疗用途。
包含BoNT轻链，可选地还包含BoNT重链的嵌合多肽具有广泛的美容和治疗应用。对于化妆品应用，此类嵌合多肽可用于治疗皱纹，调整嘴角或上唇的线条。在治疗中，所述嵌合多肽可用于治疗神经系统疾病，例如肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症(出汗过多)、唾液分泌过多症(唾液过多)。所述嵌合多肽也可用于泌尿系统疾病，例如逼尿肌括约肌协同失调、特发性逼尿肌过度活跃、神经源性逼尿肌过度活跃、尿滞留、肛裂、良性前列腺增生。其他适应症还有肠胃病、耳鼻喉科疾病或其他医学上的病况。在一些实施方案中，所述嵌合多肽用于治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面肌痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。
在另一个实施例中，含EGF的嵌合多肽可用于治疗诸如糖尿病足溃疡之类的疾病，或用于一般伤口愈合。在另一个实施例中，含SOD肽的嵌合多肽可用于减少自由基对皮肤的损害，例如减少乳腺癌放疗后的纤维化。
所述嵌合多肽的局部应用可以在受试者的真皮位置上进行，例如在眼睛、耳朵、鼻子、嘴、唇、尿道开口、肛门或舌头的皮肤或粘膜上。位置的具体实施例包括但不限于面部、颈部、头部、腿部、肩膀、背部、手掌、脚、腹股沟、腋窝、肘、手臂、膝盖、臀部、躯干和骨盆。同样地，所述嵌合多肽还可以在该位置的肌内施用。
因此，在一些实施方案中，提供了一种对哺乳动物受试者施用治疗肽(例如BoNT、EGF或SOD)的方法，其包括局部或肌内施用含嵌合多肽的制剂，所述嵌合多肽包含锌指模体和针对哺乳动物受试者的治疗肽。
在一些实施方案中，当局部施用在皮肤的角质层上时，优选地破坏所述角质层。所述角质层的破坏可以用针，例如用实验实施例中所示的微针来进行。或者，所述应用可以是肌肉内的。
用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定多肽、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食以及给药时间、排泄率、药物组合以及所治疗特定疾病的严重程度。医疗护理人员在本领域普通技术范围内对这些因素进行判断。剂量还取决于要被治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重程度以及所期望的效果。可以通过本领域公知的药理和药代动力学原理来确定使用剂量。
组合物
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含有效量的嵌合多肽和可接受的载体。
在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于动物尤其是人类的药物。此外，“药学上可接受的载体”通常是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。
术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物于静脉内施用时，水是优选的载体。生理盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、碳酸钙(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂，例如苯甲醇或羟苯甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；并且还预期了用于调节肌肉张力的药剂，例如氯化钠或右旋糖。这些组合物可以采取凝胶剂、乳膏剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。所述组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酸酯)一起配制成栓剂。
在一些实施方案中，还提供了试剂盒，其包括嵌合多肽或其组合物或制剂，以及使用所述嵌合多肽、组合物或制剂的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于传递所述嵌合多肽、组合物或制剂的针或微针。如上所述，所述微针可用于破坏皮肤的角质层，从而改善递送。
动物试验方法
目前，大鼠趾外展得分(DAS)分析是评估BoNT诱导的骨骼肌麻痹的主要生理模型。该分析法不是完全客观的，并且容易出错。在一些实施方案中，本公开描述了定量地测量在动物中BoNT诱导的骨骼肌麻痹的新方法。
在一个实施例中，所述动物，在接受试验药剂之前或之后，被放置于踏步机上。只要所述动物体力上能跑最长30分钟，当踏步机启动时，所述动物就被迫运动。运动的持续时间、距离或时间可以定量地反映试验药剂的效果(使用适当的对照，例如不提供试验药剂的动物)。
在另一个实施例中，将所述动物放置在平衡木上，在所述平衡木上，所述动物被指示行走至所述平衡木的另一端。导致保持平衡能力下降的肌肉麻痹将通过所述动物穿越所述平衡木所花费的时间反映出来。
在另外一个实施例中，在站立或行走时(例如，在踏步机上)测量所述动物的足迹。足迹的大小也可以定量地测量麻痹的程度。
实施例
实施例1.从大肠杆菌中表达及纯化BoNTA-CPP融合蛋白
这个实验证明，BoNTA-CPP(细胞穿透肽)融合蛋白可以从大肠杆菌细胞中表达和纯化。
方法
蛋白表达
将含有不同BoNTA构建体的pET28b载体(Protein ID：1-8；图1)转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。SEQ ID NO：10～17中提供了这些构建体的序列。His6：组氨酸标签；BoNTA-LC：BoNT A轻链；BoNTA-HC：BoNT A重链；ZFP2：串联锌指肽(SEQ ID NO：1)；TAT：转录肽的反式激活因子Pep-1：pep-1肽。TAT和Pep-1是已知的细胞穿透肽(CPP)。
从琼脂平板中挑出单个菌落，并在加有50μg/mL卡那霉素和90μM ZnCl2的10mL溶菌培养基(LB)中于37℃培养过夜。第二天，将10mL的发酵剂接种到加有50μg/mL卡那霉素和90μM ZnCl2的1升LB培养基中，并培养至OD600为0.8。在25℃下用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，持续4h。在5,000rpm下持续离心10min获得细胞沉淀物。
蛋白纯化
将来自2升培养物(约30克)的细胞沉淀物重悬于200mL BoNTA裂解缓冲液[20mMHEPES、pH 7.0，500mM NaCl，0.01％Triton X-100，1×蛋白酶混合物(Roche)和10％甘油]，在冰上超声处理3次。将裂解的细胞在25,000g下于4℃离心，持续1h，然后将上清液转移至新试管中。在上清液中加入1mL(设定体积)平衡Ni-NTA树脂(Qiagen)。使含His6标签的BoNTA蛋白与树脂旋转结合30分钟。将树脂转移到柱上，并弃去流穿物。用50mL BoNTA洗涤缓冲液(20mM HEPES、pH 7.0，500mM NaCl和10％甘油，20mM咪唑)洗涤树脂，然后用50mLBoNTA洗脱缓冲液(20mM HEPES、pH 7.0，500mM NaCl和10％甘油，300mM咪唑)洗脱树脂。然后浓缩洗脱部分，后使用起始缓冲液(20mM TrisHCl、pH 8.5)和终止缓冲液(20mMTrisHCl、pH 8.5，1M NaCl)通过离子交换进一步纯化。合并具有最佳纯度的部分，通过旋转浓缩进行浓缩，加入10％的甘油，然后在-80℃下保存以备进一步使用。
结果和数据分析
一步亲和提纯化产生仅具有中等纯度的蛋白质。经过第二步离子交换后，纯度大大提高。总产量估计为每升培养物0.1mg，并且最终产物的纯度为90％(图2A-B)。令人惊讶地，与含细胞渗透肽的融合蛋白(TAT和Pep-1、图2A)相比，含ZFP的融合蛋白具有更高的蛋白表达和纯化产率。
该实施例显示，BoNTA-CPP融合蛋白可以从大肠杆菌中表达为重组蛋白，并通过亲和纯化然后再通过离子交换进行纯化。
实施例2.通过BoNTA-CPP融合蛋白切割肉毒杆菌底物
这个实验证明，表达的BoNTA-CPP融合蛋白对BoNT底物SNAP-25具有活性。
使用SNAPtideTM进行肉毒杆菌活性测定
用反应缓冲液(20mM、pH 7.4，0.25mM ZnCl2，5mM DTT，0.05％Tween-20)将SNAPtide(Millipore，Cat.No.567333-200NMOL)稀释至5μM。将各重组BoNTA-ZFP融合蛋白(200nM；Protein ID：1～8)添加到含有SNAPtide的反应缓冲液中。反应在37℃下孵育40分钟。使用平板读取器以320nm的激发波长和420nm的发射波长记录荧光度。SNAPtide是衍生自SNAP-25(BoNTA的胞内底物)的短肽。SNAPtide包含BoNTA的切割位点以及荧光团和淬灭基团。肽的切割释放荧光团并激活荧光。反应的阳性对照市售可得，为购自R&D Systems(Cat.No.4489-ZN-010)的重组BoNTA轻链(BoNTA-LC)蛋白。所有数据采自三次重复。
结果和数据分析
图3中的数据表示为平均值±标准差，并通过单尾T(Student’s t)检验进行了分析。所有试验的样品，包括市售的BoNTA-LC的信号都显著高于SNAPtide对照组(p＜0.05)。如图3所示，ZFP的单端和双端融合都保留了BoNTA在源自SNAP-25的肽底物上的活性。
实施例3.BoNTA-ZFP融合蛋白的细胞穿透活性测定
这个实验证明，选择的BoNTA-ZFP融合蛋白可以有效地穿透人真皮成纤维细胞(hDF)。
含重组BoNTA-ZFP融合蛋白的hDF细胞的转导
将hDF细胞接种到预先用聚赖氨酸包被的6孔板上。接种后24小时，将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次。用DMEM无血清培养基稀释BoNTA-ZFP蛋白(Protein ID 5和6)和对照蛋白(R&D BoNTA-LC，即来自R&D Systems的市售可得的BoNTA的轻链)。在37℃下用BoNTA-ZFP蛋白(0.15μM)和BoNTA-LC(0.5μM)处理细胞，持续2小时。然后将细胞用加有0.5mg/mL肝素的PBS洗涤3次，以去除表面结合的蛋白质，然后通过胰蛋白酶处理获得。通过超声处理溶解收集到的细胞，并如上所述测定BoNTA活性。
结果和数据分析
如图4所示的数据表示为平均值±标准差，并通过单尾T(Student’s t)检验进行了分析。用BoNTA-ZFP蛋白(Protein ID 5和6)处理的hDF细胞表现明显的BoNTA活性，其信号显著高于对照组(p<0.05)。这表明BoNTA-ZFP蛋白可以有效地穿透细胞。
实施例4.BoNTA-ZFP蛋白在小鼠中的体内活性
这个实验证明，当应用于完整的或经微针处理的小鼠皮肤时，BoNTA-ZFP融合蛋白可引起特征在于趾外展的肌肉麻痹。
趾外展实验
将15只体重约36g的C57雌性小鼠随机分为5组(n＝3)。在所有小鼠中，未经治疗的左腿作为对照，并用不同的药物治疗右腿。在治疗前将小鼠麻醉。在空白对照组(A)中，给小鼠施用储备液(20mM HEPES、pH7.0，300mMNaCl和10％甘油)。在BOTOX(Allergan)注射组(B)中，按照指示用0.9％NaCl盐水复溶BOTOX，并向右腿注射5μL 45U/mL溶液。在C组中，小鼠的腿和脚用微针滚轮(RoHS MR20，0.2mm，家用)进行预处理，然后局部应用60μL的45U/mLBOTOX。在D组中，小鼠的腿和脚用微针滚轮(RoHS MR20，0.2mm，家用)进行预处理，然后局部应用60μL浓度为0.05mg/mL的、储备液(20mM HEPES、pH 7.0，300mM NaCl和10％甘油)中的BoNTA-ZFP蛋白(Protein ID 6)。在E组中，局部应用60μL浓度为0.05mg/mL的、储备液(20mMHEPES、pH7.0、300mM NaCl和10％甘油)中的BoNTA-ZFP蛋白。通过在腿和脚上滚动三遍来进行微针滚轮治疗。局部应用时，将物质均匀分散在腿和脚上、进行按摩、然后风干，重复多次，直到所有溶液都用尽为止。在第0天小鼠醒来后记录趾外展情况，然后在接下来的四天内每天记录一次。
结果和数据分析
含微针预处理的BOTOX和BoNTA-ZFP注射均表现出明显的趾外展(图5)，其趾外展得分显著高于对照组A(p＜0.05；T检验)。BoNTA-ZFP的直接施用产生最小的效果。由三位独立研究人员盲评了趾外展得分(DAS)。DAS在第2天达到峰值(图6)。因此，这个实施例表明，当应用于小鼠皮肤时，穿透细胞的BoNTA-ZFP可引起肌肉麻痹，其表明SNAP-25裂解的体内活性。
实施例5.在昆虫细胞中的表达
这个实验证明，BoNTA-ZFP融合蛋白可以在昆虫细胞中高表达。考虑到天然BoNT是由细菌肉毒杆菌(原核生物)产生的，从昆虫细胞(真核生物)中大量产生BoNTA确实令人惊讶。
方法
将含Protein ID 6(SEQ ID NO：15)的pFastBac载体包装到杆状病毒(BV)中。使用含重组Protein ID 6蛋白的BV感染草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞。当细胞活力低于60％时收获细胞。将约1mL的培养物离心以收集细胞。将这些细胞重悬于1mL PBS缓冲液中并进行超声处理。在SDS-PAGE上分离出约10μL细胞裂解液。使用抗His抗体检测蛋白质并成像。
结果和数据分析
可溶性BoNTA-ZF接近总蛋白量的100％(图7)。与上样内参(5μg蛋白质)相比，蛋白质的量被定量为1μg(图7)。因此，经计算表达产量为100mg每升培养物。
实施例6.肌内注射引起肌肉麻痹
方法
使用汉密尔顿(Hamilton)进样针将不同剂量的BoNTA-ZFP肌内注射到右腓肠肌中。如实施例4中所述监测肌肉麻痹。
结果和数据分析
肌内注射1或3ng的BoNTA-ZFP(Protein ID 6)导致明显的趾外展。所有小鼠的得分均达到4(每组n＝3)。
实施例7.踏步机试验
这个实施例试验了测量药剂的肌肉麻痹活性的方法。与自发跑步研究相比，该方法可以客观地反映穿透细胞的BoNTA-ZFP的肌肉麻痹活性。
方法
如实施例4中所述，在CJ57雌性小鼠上局部应用BoNTA-ZFP。对小鼠进行以下角度和速度设置：0°/5m/min、3°/8m/min、6°/11m/min、9°/14m/min、12°/17m/min、12°/20m/min。小鼠在每个步骤维持5min。计算总距离。
结果和数据分析
与缓冲盐溶液相比，经Botox注射或BoNTA-ZFP局部处理的小鼠在踏步机研究中表现出降低的运动能力(图8)。
实施例8.平衡木试验
这个实施例试验了另一种测量药剂的肌肉麻痹活性的方法。
方法
如实施例4中所述，在CJ57雌性小鼠上局部应用BoNTA-ZFP。对小鼠进行平衡木研究。计算小鼠穿过平衡木的时间。
结果和数据分析
与缓冲盐溶液相比，经Botox注射或BoNTA-ZFP局部处理的小鼠在平衡木研究中表现出降低的运动能力(图9)。
实施例9.足迹试验
这个实施例试验了另一种测量药剂的肌肉麻痹活性的方法。
方法
如实施例4中所述，在CJ57雌性小鼠上局部应用BoNTA-ZFP。对小鼠进行足迹分析研究。记录足迹的宽度。
结果和数据分析
与缓冲盐溶液相比，经Botox注射或BoNTA-ZFP局部处理的小鼠在足迹分析中表现出减小的接触面积(图10)。
实施例8～10证明了这些用于测量试验药剂的肌肉麻痹活性的试验的有效性和定量性质。
本发明不受限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本发明的各个方面和本发明范围内功能上等同的任何组合物或方法的单个说明。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的实质或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内，旨在本发明涵盖本发明的修改和变化。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就如每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指明通过引用并入。

Claims (29)

1.一种嵌合多肽，其包含(a)肉毒杆菌毒素(BoNT)轻链、(b)BoNT重链、和(c)细胞穿透肽(CPP)，所述细胞穿透肽位于所述BoNT轻链的C端或所述BoNT重链的C端，所述BoNT重链位于所述BoNT轻链的C端或通过二硫键与所述BoNT轻链结合。
2.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含2000个以上氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述BoNT轻链和所述细胞穿透肽在同一肽链上。
4.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述BoNT轻链和所述细胞穿透肽在不同肽链上。
5.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述细胞穿透肽为转录肽的反式激活因子(TAT)。
6.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述细胞穿透肽为pep-1肽。
7.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述细胞穿透肽距离所述BoNT轻链或所述BoNT重链的C端不超过200个氨基酸残基。
8.如以上任一项权利要求所述的嵌合多肽，其中所述BoNT选自BoNT A、B、C、D、E、F或G。
9.如权利要求8所述的嵌合多肽，其中所述BoNT选自亚型BoNTAl-A10、B1-B8、E1-E9和F1-F7。
10.如权利要求8所述的嵌合多肽，其中所述BoNT为BoNTA。
11.如权利要求8所述的嵌合多肽，其中所述BoNT轻链包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的嵌合多肽，其中所述BoNT重链包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含单链多肽，所述单链多肽含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；或由所述氨基酸序列加工成的双链多肽。
14.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含单链多肽，所述单链多肽含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；或由所述氨基酸序列加工成的双链多肽。
15.一种包含如权利要求1～14任一项所述的嵌合多肽的局部应用或肌肉内应用的制剂，在制备用于预防和/或治疗神经终末的过度活跃的药物中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其中所述局部应用是在眼睛、耳朵、鼻子、嘴、唇、尿道开口、肛门或舌头的皮肤或粘膜上。
17.如权利要求15所述的应用，其中所述局部应用是在已被破坏的皮肤的角质层上。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述破坏使用用于输送所述制剂的针或微针进行。
19.如权利要求15～18任一项所述的应用，其中所述局部应用是在所述哺乳动物的面部或颈部皮肤上。
20.如权利要求15～18任一项所述的应用，其中所述制剂包括乳霜、凝胶或喷雾剂。
21.如权利要求15～18任一项所述的应用，其中所述哺乳动物需要治疗面部皱纹、肌张力障碍、痉挛、面部痉挛、多汗症或唾液分泌过多症。
22.一种编码如权利要求1～14任一项所述的嵌合多肽的多核苷酸。
23.一种包含如权利要求22所述的多核苷酸的细胞。
24.如权利要求23所述的细胞，其中所述细胞为细菌细胞。
25.如权利要求24所述的细胞，其中所述细菌细胞为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)细胞。
26.如权利要求23所述的细胞，其中所述细胞为昆虫细胞。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述昆虫细胞为灰翅夜蛾属(Spodoptera)细胞。
28.一种生产蛋白质的方法，其包括在允许表达由所述多核苷酸编码的蛋白质的条件下培养如权利要求23～27任一项所述的细胞。
29.一种包含如权利要求1～14任一项所述的嵌合多肽和药学上适合的载体的制剂。
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