ES2873479T3 - Neurotoxinas catiónicas - Google Patents

Abstract

Una toxina clostridial manipulada, en la que dicha toxina clostridial manipulada es una neurotoxina botulínica A manipulada (BoNT/A) que comprende: al menos una modificación de aminoácidos, en la que dicha al menos una modificación de aminoácidos comprende la sustitución de al menos un aminoácido seleccionado de: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, 1831, T847 e I849 por lisina o arginina, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,2 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido, y en la que dicha al menos una modificación de aminoácido no está localizada en el dominio de unión de la toxina clostridial (dominio HC); y un pI de al menos 6,6; y en la que dicha toxina clostridial manipulada: a. está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6; y/o b. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Neurotoxinas catiónicas

La presente divulgación se refiere a toxinas clostridiales manipuladas que comprenden al menos una modificación de aminoácido y al uso de tales toxinas clostridiales manipuladas en medicina y terapia.

Las bacterias del género Clostridia producen toxinas proteicas muy potentes y específicas, que pueden envenenar las neuronas y otras células a las que se suministren. Los ejemplos de tales toxinas clostridiales incluyen las neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT) de serotipos A-G, así como las producidas por C. baratiiy C. butyricum.

Entre las toxinas clostridiales están algunas de las toxinas más potentes conocidas. A modo de ejemplo, las neurotoxinas botulínicas tienen valores de dosis letal media (DL⁵⁰) para ratones que oscilan entre 0,5 y 5 ng/kg, dependiendo del serotipo. Tanto las toxinas tetánicas como las botulínicas actúan inhibiendo la función de las neuronas afectadas, específicamente la liberación de neurotransmisores. Mientras que la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular e inhibe la transmisión colinérgica en el sistema nervioso periférico, la toxina tetánica actúa en el sistema nervioso central.

En la naturaleza, las toxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido monocatenario que se modifica postraduccionalmente mediante un evento de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. La escisión se produce en un sitio de escisión específico, a menudo denominado sitio de activación, que se encuentra entre los residuos de cisteína que proporcionan el enlace disulfuro entre cadenas. Es esta forma bicatenaria la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de translocación N-terminal (dominio Hⁿ) y un componente de orientación C-terminal (dominio H^c ). El sitio de escisión se encuentra entre la cadena L y los componentes del dominio de translocación. Tras la unión del dominio H^c a su neurona diana y la internalización de la toxina unida en la célula a través de un endosoma, el dominio Hⁿ transloca la cadena L a través de la membrana endosomal y hacia el citosol, y la cadena L proporciona una función de proteasa (también conocida como proteasa no citotóxica).

Las proteasas no citotóxicas actúan escindiendo proteolíticamente proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (p. ej., SNAP-25, VAMP o sintaxina) - véase Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término Soluble NSF Attachment Receptor (receptor soluble de unión a NSF), donde NSF significa N-ethylmaleimide-Sensitive Factor (factor sensible a N-etilmaleimida). Las proteínas SNARE son parte integral de la fusión de vesículas intracelulares y, por tanto, de la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. La función proteasa es una actividad endopeptidasa dependiente de zinc y exhibe una alta especificidad de sustrato por las proteínas SNARE. Por consiguiente, una vez suministrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular de la célula diana. Las proteasas de la cadena L de las toxinas clostridiales son proteasas no citotóxicas que escinden las proteínas SNARE.

En vista de la naturaleza ubicua de las proteínas SNARE, las toxinas clostridiales tales como la toxina botulínica se han empleado con éxito en un amplio intervalo de terapias.

A modo de ejemplo, se refiere William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004), que describe el uso de toxinas clostridiales, tales como las neurotoxinas botulínicas (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cⁱ , BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y la neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal en una serie de aplicaciones terapéuticas y cosméticas o estéticas; por ejemplo, los productos de toxina botulínica comercializados actualmente están aprobados como agentes terapéuticos para indicaciones que incluyen espasticidad focal, espasticidad de miembros superiores, espasticidad de miembros inferiores, distonía cervical, blefaroespasmo, espasmo hemifacial, hiperhidrosis de las axilas, migraña crónica, hiperactividad neurogénica del detrusor, líneas glabelares y líneas cantales laterales graves. Además, se describen terapias con toxina clostridial para tratar trastornos neuromusculares (véase el documento US 6.872.397); para el tratamiento de trastornos uterinos (véase el documento US 2004/0175399); para el tratamiento de úlceras y enfermedad por reflujo gastroesofágico (véase el documento US 2004/0086531); para el tratamiento de la distonía (véase el documento US 6.319.505); para el tratamiento de trastornos oculares (véase el documento US 2004/0234532); para el tratamiento del blefaroespasmo (véase el documento US 2004/0151740); para el tratamiento del estrabismo (véase el documento US 2004/0126396); para el tratamiento del dolor (véanse los documentos US 6.869.610, US 6.641.820, US 6.464.986 y US 6.113.915); para el tratamiento de la fibromialgia (véanse los documentos US 6.623.742, US 2004/0062776); para el tratamiento del dolor lumbar (véase el documento US 2004/0037852); para el tratamiento de lesiones musculares (véase el documento US 6.423.319); para el tratamiento de la cefalea sinusal (véase el documento US 6.838.434); para el tratamiento de la cefalea tensional (véase el documento US 6.776.992); para el tratamiento de la cefalea (véase el documento US 6.458.365); para la reducción del dolor de cabeza por migraña (véase el documento US 5.714.469); para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (véase el documento US 6.767.544); para el tratamiento de trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Parkinson (véanse los documentos US 6.620.415, US 6.306.403); para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos (véanse los documentos US 2004/0180061, US 2003/0211121); para el tratamiento de trastornos endocrinos (véase el documento US 6,827,931); para el tratamiento de trastornos de la tiroides (véase el documento US 6.740.321); para el tratamiento de trastornos de las glándulas sudoríparas con influencia colinérgica (véase el documento US 6.683.049); para el tratamiento de la diabetes (véanse los documentos US 6.337.075, US 6.416.765); para el tratamiento de un trastorno pancreático (véanse los documentos US 6.261.572, US 6.143.306); para el tratamiento de cánceres tales como los tumores óseos (véanse los documentos US 6.565.870, US 6.368.605, US 6.139.845, US 2005/0031648); para el tratamiento de trastornos óticos (véanse los documentos US 6.358.926, US 6.265.379); para el tratamiento de trastornos autonómicos tales como trastornos de los músculos gastrointestinales y otras disfunciones del músculo liso (véase el documento US 5.437.291); para el tratamiento de lesiones cutáneas asociadas con trastornos proliferativos de células cutáneas (véase el documento US 5.670.484); para la gestión de trastornos inflamatorios neurogénicos (véase el documento US 6.063.768); para reducir la caída del cabello y estimular su crecimiento (véase el documento US 6.299.893); para el tratamiento de la boca caída (véase el documento US 6.358.917); para reducir el apetito (véase el documento US 2004/40253274); para tratamientos y procedimientos dentales (véase el documento US 2004/0115139); para el tratamiento de trastornos y afecciones neuromusculares (véase el documento US 2002/0010138); para el tratamiento de diversos trastornos y afecciones y el dolor asociado (véase el documento US 2004/0013692); para el tratamiento de afecciones resultantes de la hipersecreción de moco tales como el asma y la EPOC (véase el documento WO 00/10598); y para el tratamiento de afecciones no neuronales tales como inflamación, afecciones endocrinas, afecciones exocrinas, afecciones inmunológicas, afecciones cardiovasculares, afecciones óseas (véase el documento WO 01/21213).

Byrne et al (1998), Infection & Immunity, 66, 10, 4817-4822 describe la purificación, potencia y eficacia del dominio de unión de neurotoxina botulínica tipo A de Pichia pastoris como candidato a vacuna recombinante. El documento WO 00/67700 A2 describe una vacuna recombinante contra la neurotoxina botulínica. El documento WO 2013/068476 A1 describe neurotoxinas que exhiben una actividad biológica acortada. El documento US 2014/242110 A1 describe la dosis, localización y formulación de toxinas botulínicas en piel y músculo. El documento WO 2006/094263 A2 describe composiciones y métodos para la aplicación tópica y el suministro transdérmico de toxinas botulínicas. El documento WO 97/32599 A1 describe la toxina clostridial modificada químicamente con propiedades supuestamente mejoradas. Lacy et al. (1999), J Mol Biol, 291, 1091-1104 describe la homología de secuencia y el análisis estructural de las neurotoxinas clostridiales. El documento WO 2015/004461 A1 describe neurotoxinas catiónicas. El documento WO 2010/094905 A1 describe proteasas no citotóxicas modificadas. El número de acceso de UniProt K4LN57 describe una neurotoxina botulínica. Mazuet et al (2012), J Clinical Microbiology, 50, 12, 4091-4094 describe la detección de toxinas en el suero de los pacientes mediante espectrometría de masas durante dos brotes de botulismo de tipo A en Francia.

Se prevé que se expandirá el uso de proteasas no citotóxicas tales como las toxinas clostridiales (por ejemplo, BoNT y TeNT) en tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros mamíferos a un intervalo cada vez mayor de enfermedades y dolencias que puedan beneficiarse de las propiedades de estas toxinas.

Para evitar efectos neurológicos sistémicos, muchas terapias con toxina clostridial utilizan la administración directa del agente terapéutico de toxina clostridial a un sitio diana determinado (tal como un tejido diana). Un problema cuando se administran agentes terapéuticos basados en toxina clostridial de esta manera es la extensión de la toxina fuera del sitio de administración y hacia el tejido circundante o la circulación sistémica. Se cree que la difusión de la toxina fuera del tejido diana es responsable de efectos secundarios indeseables que, en casos extremos, pueden poner en peligro la vida. Esto puede ser una preocupación particular cuando se usan agentes terapéuticos de toxina clostridial (tales como agentes terapéuticos de BoNT) en dosis, concentraciones y volúmenes de inyección altos. Los efectos adversos asociados con este problema que se han reseñado para los agentes terapéuticos comerciales de BoNT/A incluyen astenia, debilidad muscular generalizada, diplopía, ptosis, disfagia, disfonía, disartria, incontinencia urinaria y dificultades respiratorias. Las dificultades para tragar y respirar pueden poner en peligro la vida y se han reseñado muertes relacionadas con la extensión de los efectos de las toxinas.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de toxinas clostridiales que tengan propiedades de mayor retención tisular en el sitio de administración y que, por consiguiente, exhiban una reducción en la difusión fuera del sitio de administración, en comparación con las toxinas clostridiales conocidas.

La presente invención resuelve el problema anterior proporcionando toxinas clostridiales manipuladas, como se especifica en las reivindicaciones.

En un aspecto, la invención proporciona una toxina clostridial manipulada, en la que dicha toxina clostridial manipulada es una neurotoxina botulínica A (BoNT/A) manipulada que comprende:

al menos una modificación de aminoácido, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido comprende la sustitución de al menos un aminoácido seleccionado de: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, I831, T847 e I849 por lisina o arginina, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,2 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido, y en la que dicha al menos una modificación de aminoácido no está localizada en el dominio de unión de la toxina clostridial (dominio HC); y

un pI de al menos 6,6; y

en la que dicha toxina clostridial manipulada:

a. está codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6; y/o

b. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la invención no comprenden modificaciones de aminoácidos localizadas en el dominio Hc de la toxina clostridial. Por tanto, en una toxina clostridial manipulada de la invención, dicha al menos una modificación de aminoácido no se localiza en el dominio Hc de la toxina clostridial.

En una realización, en la que la toxina clostridial manipulada es una toxina clostridial manipulada como se describe anteriormente, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,4 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido. En una realización, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,5 unidades pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido. En una realización, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,6 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido. En una realización, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,8 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido. En una realización, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 1 unidad de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

En ciertas realizaciones, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 modificaciones de aminoácidos.

En ciertas realizaciones, dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 2, 3, 4 o 5 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

En ciertas realizaciones, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 3 modificaciones de aminoácidos, y dichas al menos 3 modificaciones de aminoácidos aumentan el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,2 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dichas al menos 3 modificaciones de aminoácidos.

En ciertas realizaciones, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 5 modificaciones de aminoácidos, y dichas al menos 5 modificaciones de aminoácidos aumentan el pI de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,5 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dichas al menos 5 modificaciones de aminoácidos.

Los presentes inventores han encontrado que aumentando el pI de una toxina clostridial, por ejemplo, en al menos 0,2 unidades de pI, o 0,5 unidades de pI, o una unidad de pI (mediante la introducción en la proteína toxina clostridial de al menos una modificación de aminoácido como se reivindica), la toxina clostridial manipulada resultante demuestra ventajosamente propiedades de retención tisular aumentada y difusión reducida lejos de los sitios de administración, mientras que retiene las capacidades de unión a célula diana, translocación y escisión de proteína o proteínas SNARE diana. Por tanto, la extensión de la toxina clostridial desde el sitio de administración se reduce significativamente, en comparación con una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la invención son adecuadas para su uso en cualquiera de las terapias descritas anteriormente y, de manera ventajosa, pueden demostrar una reducción o ausencia de efectos secundarios en comparación con el uso de agentes terapéuticos de toxinas clostridiales conocidos. El aumento de las propiedades de retención tisular de las toxinas clostridiales manipuladas de la invención también proporciona una mayor potencia y/o duración de la acción, y puede permitir el uso de dosis reducidas en comparación con los agentes terapéuticos de toxinas clostridiales conocidos (o dosificaciones aumentadas sin ningún efecto adverso adicional), proporcionando así más ventajas.

Por tanto, en una realización, una toxina clostridial manipulada de la invención tiene una potencia aumentada, una retención tisular aumentada y/o una duración de acción aumentada, en comparación con la toxina clostridial no modificada correspondiente.

Como se discute a continuación con más detalle, el aumento de pI proporcionado por la al menos una modificación de aminoácido como se reivindica significa que una toxina clostridial manipulada de la invención tiene, a un pH dado, una carga neta que es más positiva que la carga neta en una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, los presentes inventores creen que esta carga positiva aumentada permite que las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención presenten tiempos de retención tisular más largos en el sitio de administración debido a interacciones electrostáticas favorables entre la toxina clostridial manipulada y componentes extracelulares aniónicos (tales como membranas celulares y proteoglicanos de sulfato de heparina) en el sitio de administración. Estas interacciones electrostáticas mejoradas sirven para reducir la difusión de la toxina clostridial manipulada fuera del sitio de administración, mejorando así la retención tisular.

A modo de ejemplo, las propiedades de retención tisular mejoradas de una toxina clostridial manipulada de la invención pueden permitir (i) dosis más altas en músculos individuales, tales como el esternocleidomastoideo, sin extenderse a los músculos cercanos en el cuello para causar dificultad para tragar, y (ii) dosis totales más elevadas (a todos los músculos) en un solo tratamiento, sin extenderse a la circulación y provocar efectos sistémicos tales como dificultad para respirar. Las ventajas para los pacientes pueden incluir un tratamiento más eficaz de los músculos grandes, tales como el músculo esternocleidomastoideo, una mayor oportunidad de inyectar varios músculos diferentes durante cada tratamiento y una posible mayor duración del tratamiento eficaz (más tiempo antes de que sea necesario repetir el tratamiento) debido a una dosificación más alta.

En una realización, una toxina clostridial manipulada de la invención tiene, en uso, una carga neta positiva (por ejemplo, cuando la toxina clostridial manipulada, en uso, se localiza en un sitio de administración deseado en un tejido).

El punto isoeléctrico (pI) es una propiedad específica de una proteína dada. Como es bien conocido en la técnica, las proteínas se elaboran a partir de una secuencia específica de aminoácidos (también denominados cuando están en una proteína como residuos de aminoácidos). Cada aminoácido del conjunto estándar de veinte tiene una cadena lateral diferente (o grupo R), lo que significa que cada residuo de aminoácido en una proteína presenta diferentes propiedades químicas, tales como carga e hidrofobicidad. Estas propiedades pueden verse influenciadas por el entorno químico circundante, tal como la temperatura y el pH. Las características químicas globales de una proteína dependerán de la suma de estos diversos factores.

Ciertos residuos de aminoácidos (que se detallan a continuación) poseen cadenas laterales ionizables que pueden presentar una carga eléctrica dependiendo del pH circundante. Que dicha cadena lateral está cargada o no a un pH dado depende del pKa del resto ionizable relevante, en el que pKa es el logaritmo negativo de la constante de disociación ácida (Ka) para un protón específico de una base conjugada.

Por ejemplo, los residuos ácidos tales como el ácido aspártico y el ácido glutámico tienen grupos de ácido carboxílico de cadena lateral con valores de pKa de aproximadamente 4,1 (los valores de pKa precisos pueden depender de la temperatura, la fuerza iónica y el microambiente del grupo ionizable). Por tanto, estas cadenas laterales exhiben una carga negativa a un pH de 7,4 (a menudo denominado "pH fisiológico"). A valores de pH bajos, estas cadenas laterales se protonarán y perderán su carga.

Por el contrario, los residuos básicos tales como la lisina y la arginina tienen grupos de cadena lateral que contienen nitrógeno con valores de pKa de aproximadamente 10-12. Por lo tanto, estas cadenas laterales exhiben una carga positiva a un pH de 7,4. Estas cadenas laterales se desprotonarán y perderán su carga a valores de pH altos.

Por lo tanto, la carga global (neta) de una molécula de proteína depende del número de residuos ácidos y básicos presentes en la proteína (y su grado de exposición superficial) y del pH circundante. Cambiar el pH circundante cambia la carga global de la proteína. Por consiguiente, para cada proteína hay un pH dado en el que el número de cargas positivas y negativas es igual y la proteína no presenta carga neta global. Este punto se conoce como punto isoeléctrico (pI). El punto isoeléctrico es un concepto estándar en bioquímica de proteínas con el que el experto estaría familiarizada.

Por lo tanto, el punto isoeléctrico (pI) se define como el valor de pH en el que una proteína presenta una carga neta de cero. Un aumento de pI significa que se requiere un valor de pH más alto para que la proteína presente una carga neta de cero. Por tanto, un aumento de pI representa un aumento de la carga positiva neta de una proteína a un pH determinado. Por el contrario, una disminución de pI significa que se requiere un valor de pH más bajo para que la proteína presente una carga neta de cero. Por tanto, una disminución de pI representa una disminución de la carga positiva neta de una proteína a un pH dado.

Los métodos para determinar el pI de una proteína son conocidos en la técnica y resultarán familiares para un experto. A modo de ejemplo, el pI de una proteína se puede calcular a partir de los valores medios de pKa de cada aminoácido presente en la proteína ("pI calculado"). Tales cálculos se pueden realizar utilizando programas informáticos conocidos en la técnica; los programas informáticos de ejemplo preferidos para calcular los valores de pI incluyen Protein Calculator del Scripps Research Institute y Compute pI/MW Tool de ExPASy. Las comparaciones de los valores de pI entre diferentes moléculas deben realizarse usando la misma técnica/programa de cálculo.

Cuando sea apropiado, el pI calculado de una proteína se puede confirmar experimentalmente usando la técnica de enfoque isoeléctrico ("pI observado"). Esta técnica usa electroforesis para separar proteínas según su pI. El enfoque isoeléctrico se realiza típicamente usando un gel que tiene un gradiente de pH inmovilizado. Cuando se aplica un campo eléctrico, la proteína migra a través del gradiente de pH hasta alcanzar el pH en el que tiene carga neta cero, siendo este punto el pI de la proteína. Los resultados proporcionados por el enfoque isoeléctrico son típicamente de naturaleza de resolución relativamente baja y, por tanto, los presentes inventores creen que los resultados proporcionados por el pI calculado (como se describe anteriormente) son más apropiados de usar.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, "pI" significa "pI calculado" a menos que se indique lo contrario.

El pI de una proteína puede aumentarse o disminuirse alterando el número de grupos básicos y/o ácidos presentados en su superficie. Esto se puede lograr modificando uno o más aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, se puede proporcionar un aumento de pI reduciendo el número de residuos ácidos o aumentando el número de residuos básicos. Tales modificaciones de aminoácidos se discuten con más detalle a continuación.

Las toxinas clostridiales nativas (no modificadas) tienen un pI de aproximadamente 5-6. Por tanto, a un pH de 7,4, las toxinas botulínicas nativas poseen una carga neta negativa. A modo de ejemplo, el pI de BoNT/A es 6,4 y una molécula de BoNT/A tiene una carga neta a pH 7,4 de -8. Estos valores de pI se calculan como se describe anteriormente.

TABLA 1:

Como se describe anteriormente, una toxina clostridial manipulada de la presente invención comprende al menos una modificación de aminoácido como se reivindica, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,2 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

Por tanto, en el contexto de la presente invención, un aumento de pI de 0,2 unidades en el contexto de una toxina clostridial BoNT/A manipulada sería un aumento de pI de 6,4 a 6,6.

Como se describe anteriormente, en una realización, una toxina clostridial manipulada de la presente invención comprende al menos una modificación de aminoácido, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es en al menos una unidad de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

Por tanto, en el contexto de la presente invención, un aumento de pI de 1 unidad en el contexto de una toxina clostridial BoNT/A manipulada sería un aumento de pI de 6,4 a 7,4.

En una realización, la toxina clostridial manipulada tiene un pI de al menos 7, al menos 8 o al menos 9.

En una realización, la toxina clostridial manipulada tiene un pI de al menos 7.

Como se discute anteriormente, las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención tienen propiedades de retención tisular aumentadas que también proporcionan una mayor potencia y/o duración de la acción, y pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas en comparación con los agentes terapéuticos de toxina clostridial conocidos (o dosificaciones aumentadas sin efectos adicionales). Una forma en la que se pueden definir estas propiedades ventajosas (que representan un aumento en el índice terapéutico) es en términos de la relación de seguridad de la toxina clostridial manipulada. En este sentido, los efectos indeseados de una toxina clostridial (causados por la difusión de la toxina fuera del lugar de administración) se pueden evaluar experimentalmente midiendo el porcentaje de pérdida de peso corporal en un modelo animal relevante (por ejemplo, un ratón, donde se detecta pérdida de peso corporal en siete días de administración). Por el contrario, los efectos específicos deseados de una toxina clostridial pueden evaluarse experimentalmente mediante el ensayo de puntuación de abducción digital (DAS), una medida de la parálisis muscular. El ensayo de DAS se puede realizar mediante la inyección de 20 gl de toxina clostridial, formulada en tampón de fosfato de gelatina, en el complejo gastrocnemio/sóleo de ratón, seguido de la evaluación de la puntuación de abducción digital usando el método de Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). En el ensayo de DAS, los ratones se suspenden brevemente por la cola para provocar una respuesta de sobresalto característica en la que el ratón extiende sus extremidades traseras y abduce sus dedos traseros. Después de la inyección de toxina clostridial, los diversos grados de abducción de los dedos se puntúan en una escala de cinco puntos (0 = normal a 4 = reducción máxima en la abducción de los dedos y la extensión de la pata).

La relación de seguridad de una toxina clostridial se puede expresar entonces como la relación entre la cantidad de toxina requerida para una caída del 10 % en el peso corporal (medida en el efecto máximo dentro de los primeros siete días después de la dosificación en un ratón) y la cantidad de toxina requerida para una puntuación DAS de 2. Por lo tanto, se desean puntuaciones de relación de seguridad altas, e indican una toxina que es capaz de paralizar eficazmente un músculo diana con pocos efectos inespecíficos indeseados. Una toxina manipulada de la presente invención tiene una relación de seguridad que es más alta que la relación de seguridad de una toxina botulínica no modificada (nativa) equivalente.

Por tanto, en una realización, una toxina clostridial manipulada de la presente invención tiene una relación de seguridad de al menos 8 (por ejemplo, al menos 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50), en la que la relación de seguridad se calcula como: dosis de toxina requerida para un cambio de peso corporal de -10 % (pg/ratón) dividida por DAS de DE⁵⁰ (pg/ratón) [DE⁵⁰ = dosis requerida para producir una puntuación DAS de 2].

En una realización, una toxina clostridial manipulada de la presente invención tiene una relación de seguridad de al menos 10. En una realización, una toxina clostridial manipulada de la presente invención tiene una relación de seguridad de al menos 15.

Una toxina clostridial manipulada de la presente invención comprende al menos una modificación de aminoácido como se reivindica. Dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el pl de la toxina clostridial, como se discute anteriormente. En el contexto de la presente invención, una modificación de aminoácido es una modificación de la secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial.

Tal modificación se efectúa reemplazando un aminoácido en la secuencia por otro (es decir, una sustitución).

Los aminoácidos incorporados en una secuencia de aminoácidos en una proteína también se denominan residuos de aminoácidos.

Los 20 aminoácidos estándar que se encuentran en las proteínas son los siguientes:

TABLA 2:

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos cargados: ácido aspártico (negativo), ácido glutámico (negativo), arginina (positivo) y lisina (positivo).

A un pH de 7,4, las cadenas laterales de ácido aspártico (pKa 3,1) y ácido glutámico (pKa 4,1) tienen carga negativa, mientras que las cadenas laterales de arginina (pKa 12,5) y lisina (pKa 10,8) tienen carga positiva. El ácido aspártico y el ácido glutámico se denominan residuos de aminoácidos ácidos. La arginina y la lisina se denominan residuos de aminoácidos básicos.

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos polares no cargados (lo que significa que pueden participar en el enlace de hidrógeno): asparagina, glutamina, histidina, serina, treonina, tirosina, cisteína, metionina, triptófano.

Los siguientes aminoácidos se consideran aminoácidos hidrófobos sin carga: alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina y glicina.

Puede efectuarse un aumento en el pI de una toxina clostridial introduciendo en la toxina clostridial una o más modificaciones de aminoácidos que aumenten la relación de cargas positivas a negativas en la toxina clostridial.

En una sustitución de aminoácidos, un residuo de aminoácido que forma parte de la secuencia de aminoácidos de la toxina clostridial se reemplaza por un residuo de aminoácido diferente como se reivindica.

Se conocen en la técnica métodos para modificar proteínas mediante sustitución, inserción o deleción de residuos de aminoácidos. A modo de ejemplo, se pueden introducir modificaciones de aminoácidos mediante la modificación de una secuencia de ADN que codifica una toxina clostridial. Esto se puede lograr usando técnicas estándar de clonación molecular, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio donde se usan cadenas cortas de ADN (oligonucleótidos) que codifican el aminoácido o aminoácidos deseados para reemplazar la secuencia codificante original usando una enzima polimerasa, o insertando/eliminando partes del gen con diversas enzimas (p. ej., ligasas y endonucleasas de restricción). Como alternativa, se puede sintetizar químicamente una secuencia genética modificada.

En una realización preferida, la al menos una modificación de aminoácido es una sustitución, que mantiene ventajosamente el mismo número de residuos de aminoácidos en la toxina clostridial.

Una toxina clostridial manipulada de la invención puede comprender más de una modificación de aminoácido. Así, en una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 1 y 90 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, entre 1 y 80, entre 1 y 70, entre 1 y 60, entre 1 y 50, entre 1 y 40, entre 1 y 30, entre 1 y 20, entre 1 y 10, entre 3 y 50, entre 3 y 40, entre 3 y 30, entre 4 y 40, entre 4 y 30, entre 5 y 40, entre 5 y 30, o entre 10 y 25 modificaciones de aminoácidos). En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 1 y 20 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 1 y 10 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 2 y 20 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 2 y 15 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 2 y 10 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 3 y 20 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 3 y 15 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 3 y 10 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) comprende entre 4 y 40 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 modificaciones de aminoácidos. En una realización, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 3 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, al menos 3 sustituciones de aminoácidos). En una realización, la toxina clostridial manipulada comprende al menos 4 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, al menos 4 sustituciones de aminoácidos). Cada una de dichas modificaciones de aminoácidos es una modificación de aminoácido como se describe anteriormente. Por tanto, cada una de dichas modificaciones de aminoácidos contribuye al aumento de pI de la toxina clostridial manipulada (en comparación con el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dichas modificaciones de aminoácidos).

Los aminoácidos diana preferidos pueden poseer ciertas cualidades. A modo de ejemplo, un aminoácido diana preferido puede ser: (i) un aminoácido expuesto a la superficie; (ii) localizado fuera de una estructura secundaria de proteína de toxina clostridial; (iii) localizado en una región de la proteína toxina clostridial que no es esencial para la función de la proteína; (iv) un aminoácido cuya identidad no se conserva entre los tipos, subtipos o serotipos de toxinas clostridiales; (iv) un aminoácido cuya modificación no crea un sitio de ubiquitinación previsto; o (v) cualquier combinación de los anteriores.

Como se describe anteriormente, las toxinas clostridiales manipuladas de la invención cuentan con una o más modificaciones de aminoácidos localizadas en el dominio de translocación Hⁿ de la toxina clostridial.

Los ejemplos de secuencias de referencia de cadena ligera de toxina clostridial incluyen:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos 1-448

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos 1 -440

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos 1 -441

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos 1-445

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos 1-422

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos 1-439

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos 1-441

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos 1-457

Los ejemplos de secuencias de referencia de dominio Hⁿ de toxina clostridial incluyen:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos 449-871

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos 443-862

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos 450-866

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos 449-871

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos 455-845

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos 450-864

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos 449-871

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos 456-879

Los ejemplos de secuencias de referencia de dominio He de toxina clostridial incluyen:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos 872-1278

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos 863-1291

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos 867-1291

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos 872-1276

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos 846-1252

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos 865-1278

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos 872-1297

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos 880-1315

Las secuencias de referencia identificadas anteriormente deben considerarse una guía, ya que pueden aparecer ligeras variaciones según los subserotipos. A modo de ejemplo, el documento US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:

Cadena ligera:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos M1-K448

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos M1-K441

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos M1-K449

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos M1-R445

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos M1-R422

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos M1-K439

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos M1-K446

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos M1-A457

Dominio HN:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos A449-K871

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos A442-S858

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos T450-N866

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos D446-N862

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos K423-K845

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos A440-K864

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos S447-S863

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos S458-V879

Dominio H^c :

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos N872-L1296

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos E859-E1291

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos N867-E1291

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos S863-E1276

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos R846-K1252

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos K865-E1274

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos N864-E1297

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos I880-D1315

Dicha al menos una modificación de aminoácido reivindicada no se localiza en la región del cinturón de toxinas clostridiales. La región del cinturón de toxina clostridial (determinada por inspección visual de estructuras y modelos) se define de la siguiente manera:

Neurotoxina botulínica de tipo A: residuos de aminoácidos 492-545

Neurotoxina botulínica de tipo B: residuos de aminoácidos 472-532

Neurotoxina botulínica de tipo C¹: residuos de aminoácidos 494-543

Neurotoxina botulínica de tipo D: residuos de aminoácidos 489-539

Neurotoxina botulínica de tipo E: residuos de aminoácidos 466-515

Neurotoxina botulínica de tipo F: residuos de aminoácidos 485-536

Neurotoxina botulínica de tipo G: residuos de aminoácidos 489-538

Neurotoxina tetánica: residuos de aminoácidos 506-556

La al menos una modificación de aminoácido (como se reivindica) es una modificación de un residuo de aminoácido expuesto en la superficie. Los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie son los presentes en el exterior de una proteína plegada y así accesibles al disolvente circundante, en contraste con los residuos de aminoácidos que se localizan en el interior de una proteína plegada. El grado de exposición superficial de un residuo de aminoácido y, por tanto, su exposición al disolvente circundante depende de su posición dentro de la proteína plegada y también de la conformación adoptada por la proteína. Por lo tanto, la modificación de un residuo de aminoácido con un alto grado de exposición superficial puede tener un efecto mayor en el punto isoeléctrico de la proteína que la modificación de un residuo de aminoácido con un grado bajo de exposición superficial. Se conocen en la técnica métodos para determinar el grado de exposición superficial de un residuo de aminoácido. A modo de ejemplo, el programa informático AreaIMol (parte del conjunto de programas informáticos CCP4) se puede utilizar para calcular el grado de exposición superficial de los residuos de aminoácidos en una proteína dada. Los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie también pueden identificarse mediante inspección visual de la estructura cristalina de una proteína (tal como la proporciona la cristalografía de rayos X). En una realización, un residuo de aminoácido expuesto en la superficie tiene un valor de AreaIMol suma de al menos 40.

La toxina clostridial manipulada es una BoNT/A. Una secuencia de BoNT/A de referencia tiene el número de acceso a UniProtKB P10845. En una realización en la que la toxina clostridial manipulada es una BoNT/A, la toxina clostridial manipulada es una BoNT/A1.

Los presentes inventores han identificado ciertos aminoácidos que representan dianas preferidas para la modificación de aminoácidos en un dominio Hⁿ de toxina clostridial BoNT.

La toxina clostridial manipulada es una BoNT/A, y dicha BoNT/A manipulada como se reivindica comprende una modificación de al menos uno (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o todos los 17) aminoácidos seleccionada de: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, I831, T847 e I849; y dicha modificación o modificaciones de aminoácidos aumentan el punto isoeléctrico (pI) de la BoNT/A manipulada a un valor que es al menos 0,2 (por ejemplo, al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1) unidades de pI más alto que el pI de una BoNT/A por lo demás idéntica que carece de dicha modificación o modificaciones de aminoácidos. Dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina o un residuo de arginina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de arginina.

En una realización, dicha BoNT/A manipulada como se reivindica comprende una modificación de al menos uno (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o los 6) aminoácidos seleccionada de: S564, L647, D650, D651, T847 y I849; y dicha modificación o modificaciones de aminoácidos aumentan el punto isoeléctrico (pI) de la BoNT/A manipulada a un valor que es al menos 0,2 (por ejemplo, al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1) unidades de pI más alto que el pI de una BoNT/A por lo demás idéntica que carece de dicha modificación o modificaciones de aminoácidos. Dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina o un residuo de arginina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de arginina.

En una realización, dicha BoNT/A manipulada como se reivindica comprende una modificación de al menos uno (por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5 o los 6) aminoácidos seleccionada de: N476, N763, N687, E599, I831 y N761; y dicha modificación o modificaciones de aminoácidos aumentan el punto isoeléctrico (pI) de la BoNT/A manipulada a un valor que es al menos 0,2 (por ejemplo, al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1) unidades de pI más alto que el pI de una BoNT/A por lo demás idéntica que carece de dicha modificación o modificaciones de aminoácidos. Dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina o un residuo de arginina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de arginina.

En una realización, dicha BoNT/A manipulada como se reivindica comprende una modificación de al menos un (por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4 o los 5) aminoácidos seleccionada de: N578, V675, I685, T755 y E757; y dicha modificación o modificaciones de aminoácidos aumentan el punto isoeléctrico (pI) de la BoNT/A manipulada a un valor que es al menos 0,2 (por ejemplo, al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1) unidades de pI más alto que el pI de una BoNT/A por lo demás idéntica que carece de dicha modificación o modificaciones de aminoácidos. Dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina o un residuo de arginina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de lisina. En una realización, dicha modificación comprende la sustitución del aminoácido por un residuo de arginina.

Una secuencia de referencia de BoNT/B tiene el número de acceso a UniProtKB P10844.

Una secuencia de referencia de BoNT/C¹ tiene el número de acceso a UniProtKB P18640.

Una secuencia de referencia de BoNT/D tiene el número de acceso a UniProtKB P19321.

Una secuencia de referencia de BoNT/E tiene el número de acceso a UniProtKB Q00496.

Una secuencia de referencia de BoNT/F tiene el número de acceso a UniProtKB YP_001390123.

Una secuencia de referencia de BoNT/G tiene el número de acceso a UniProtKB Q60393.

Una secuencia de referencia de TeNT tiene el número de acceso a UniProtKB P04958.

En el contexto de la presente divulgación, la expresión "toxina clostridial" abarca las toxinas producidas por C. botulinum (serotipos A, B, C¹, D, E, F y G de neurotoxina botulínica), C. tetani (neurotoxina tetánica), C. butyricum (neurotoxina botulínica de serotipo E), y C. baratii (neurotoxina botulínica de serotipo F), así como toxinas clostridiales modificadas o derivadas de cualquiera de las anteriores. La expresión "toxina clostridial" también abarca el serotipo H de neurotoxina botulínica.

La neurotoxina botulínica (BoNT) es producida por C. botulinum en forma de un gran complejo de proteínas, que consiste en la propia BoNT complejada con una serie de proteínas accesorias. En la actualidad existen ocho clases diferentes de neurotoxina botulínica, a saber: neurotoxina botulínica de serotipos A, B, C¹, D, E, F, G y H, todos los cuales comparten estructuras y modos de acción similares. Se pueden distinguir diferentes serotipos de BoNT basándose en la inactivación por antisueros neutralizantes específicos, correlacionándose tal clasificación por serotipo con el porcentaje de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las proteínas BoNT de un serotipo dado se dividen además en diferentes subtipos basándose en el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos.

Las BoNT se absorben en el tracto gastrointestinal y, después de entrar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de las terminales nerviosas colinérgicas y evitan la liberación de su neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden la proteína de membrana asociada a vesículas/sinaptobrevina (VAMP); BoNT/C¹, BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) y BoNT/C¹ escinde la sintaxina.

La toxina tetánica se produce en un solo serotipo por C. tetani, C. butyricum produce BoNT/E, mientras que C. baratii produce BoNT/F.

La expresión "toxina clostridial" también pretende abarcar toxinas clostridiales modificadas y derivados de las mismas, que incluyen, pero sin limitación, las descritas a continuación. Una toxina clostridial modificada o un derivado puede contener uno o más aminoácidos que se han modificado en comparación con la forma nativa (no modificada) de la toxina clostridial, o puede contener uno o más aminoácidos insertados que no están presentes en la forma nativa (sin modificar) de la toxina clostridial. A modo de ejemplo, una toxina clostridial modificada puede tener secuencias de aminoácidos modificadas en uno o más dominios con respecto a la secuencia de toxina clostridial nativa (no modificada). Tales modificaciones pueden modificar aspectos funcionales de la toxina, por ejemplo, actividad biológica o persistencia. Por tanto, en el presente documento se describe una toxina clostridial modificada manipulada, o un derivado de toxina clostridial modificada manipulada, o un derivado de toxina clostridial manipulado.

Una toxina clostridial modificada puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (tal como un dominio H^c modificado), en la que dicha cadena pesada modificada se une a las células nerviosas diana con una afinidad mayor o menor que la toxina clostridial nativa (no modificada). Tales modificaciones en el dominio H^c pueden incluir la modificación de residuos en el sitio de unión de gangliósido del dominio H^c o en el sitio de unión de la proteína (SV2 o sinaptotagmina) que alteran la unión al receptor de gangliósido y/o al receptor de proteína de la célula nerviosa diana. Se describen ejemplos de tales toxinas clostridiales modificadas en los documentos WO 2006/027207 y WO 2006/114308.

Una toxina clostridial modificada puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, por ejemplo modificaciones en la unión del sustrato o dominio catalítico que pueden alterar o modificar la especificidad de la proteína SNARE de la LC modificada. Se describen ejemplos de tales toxinas clostridiales modificadas en los documentos WO 2010/120766 y US 2011/0318385.

Una toxina clostridial modificada puede comprender una o más modificaciones que aumentan o disminuyen la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la toxina clostridial modificada. Por ejemplo, una toxina clostridial modificada puede comprender un motivo basado en leucina o tirosina, en la que dicho motivo aumenta o disminuye la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la toxina clostridial modificada. Los motivos basados en leucina adecuados incluyen xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL y xExxxLM (en los que x es cualquier aminoácido). Los motivos basados en tirosina adecuados incluyen Y-x-x-Hy (en los que Hy es un aminoácido hidrófobo). Se describen ejemplos de toxinas clostridiales modificadas que comprenden motivos basados en leucina y tirosina en el documento WO 2002/08268.

La expresión "toxina clostridial" pretende abarcar toxinas clostridiales híbridas y quiméricas. Una toxina clostridial híbrida comprende al menos una porción de una cadena ligera de una toxina clostridial o subtipo de la misma, y al menos una porción de una cadena pesada de otra toxina clostridial o subtipo de toxina clostridial. En el presente documento se describe una toxina clostridial híbrida que contiene la cadena ligera completa de un subtipo de toxina clostridial y la cadena pesada de otro subtipo de toxina clostridial. En el presente documento se describe una toxina clostridial quimérica que contiene una porción (por ejemplo, el dominio de unión) de la cadena pesada de un subtipo de toxina clostridial, siendo otra porción de la cadena pesada de otro subtipo de toxina clostridial. De forma similar o alternativa, el elemento terapéutico puede comprender porciones de cadena ligera de diferentes toxinas clostridiales. Tales toxinas clostridiales híbridas o quiméricas son útiles, por ejemplo, como un medio para suministrar los beneficios terapéuticos de tales toxinas clostridiales a pacientes que son inmunológicamente resistentes a un subtipo de toxina clostridial dado, a pacientes que pueden tener una concentración de receptores para un dominio de unión a la cadena pesada de toxina clostridial dado menor que la media, o a pacientes que pueden tener una variante resistente a proteasa del sustrato de la toxina de membrana o de vesícula (por ejemplo, SNAP-25, VAMP y sintaxina). Las toxinas clostridiales híbridas y quiméricas se describen en el documento US 8.071.110. Por tanto, en el presente documento se describe una toxina clostridial híbrida manipulada o una toxina clostridial quimérica manipulada.

La expresión "toxina clostridial" pretende abarcar toxinas clostridiales reorientadas. En una toxina clostridial reorientada, la toxina clostridial se modifica para incluir un ligando exógeno conocido como Targeting Moiety (TM) (resto orientador). El TM se selecciona para proporcionar especificidad de unión para una célula diana deseada, y como parte del proceso de reorientación, la porción de unión nativa de la toxina clostridial (por ejemplo, el dominio H^c , o el dominio H^{c c} ) puede retirarse. La tecnología de reorientación se describe, por ejemplo, en los documentos: EP-B-0689459; WO 1994/021300; EP-B-0939818; US 6.461.617; US 7.192.596; WO 1998/007864; EP-B-0826051; US 5.989.545; US 6.395.513; US 6.962.703; WO 1996/033273; EP-B-0996468; US 7.052.702; WO 1999/017806; EP-B-1107794; US 6.632.440; WO 2000/010598; WO 2001/21213; WO 2006/059093; WO 2000/62814; WO 2000/04926; WO 1993/15766; WO 2000/61192 y WO 1999/58571. Por tanto, en el presente documento se describe una toxina clostridial reorientada manipulada.

La presente invención también abarca toxinas clostridiales que tienen un sitio de escisión de proteasa no nativo. En tales toxinas clostridiales, el sitio de escisión de proteasa nativo (también conocido como sitio de activación, como se describe anteriormente) se modifica o reemplaza con un sitio de escisión de proteasa que no es nativo de esa toxina clostridial (es decir, un sitio de escisión exógeno). Tal sitio requerirá una proteasa exógena para la escisión, lo que permite un mejor control sobre el momento y la localización de los eventos de escisión. Los sitios de escisión de proteasa no nativos que pueden emplearse en toxinas clostridiales incluyen:

Enterocinasa (DDDDK|)

Factor Xa (IEGR|/IDGR|)

TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQ|G)

Trombina (LVPR|GS)

PreScission (LEVLFQ|GP).

Los sitios de escisión de proteasa adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que son escindidas por una proteasa no citotóxica, por ejemplo, por la cadena ligera de una neurotoxina clostridial. Estos incluyen las secuencias de reconocimiento de proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sintaxina, VAMP) que son escindidas por proteasas no citotóxicas tales como la cadena ligera de una neurotoxina clostridial. Se describen toxinas clostridiales que comprenden sitios de escisión de proteasa no nativos en los documentos US 7.132.259, EP 1206554-B2 y US 2007/0166332. La expresión sitio de escisión de proteasa también abarca un interno, que es una secuencia de autoescisión. La reacción de autocorte y empalme es controlable, por ejemplo, variando la concentración de agente reductor presente.

La presente invención también abarca toxinas clostridiales que comprenden un "sitio de escisión destructiva". En dichas toxinas clostridiales, se incorpora un sitio de escisión de proteasa no nativo en la toxina clostridial, en una localización elegida de tal manera que la escisión en dicho sitio disminuya la actividad de, o inactive, la toxina clostridial. El sitio de escisión de proteasa destructiva puede ser susceptible de escisión por una proteasa local, en el caso de que la toxina clostridial, después de la administración, migre a una localización no diana. Los sitios de escisión de proteasa no nativos adecuados incluyen los descritos anteriormente. Se describen toxinas clostridiales que comprenden un sitio de escisión destructiva en los documentos WO 2010/094905 y WO 2002/044199.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención, especialmente el componente de cadena ligera de las mismas, pueden PEGilarse; esto puede ayudar a aumentar la estabilidad, por ejemplo, la duración de la acción del componente de cadena ligera. La PEGilación es particularmente preferida cuando la cadena ligera comprende una proteasa BoNT/A, B o C¹. La PEGilación incluye preferiblemente la adición de PEG al extremo N-terminal del componente de cadena ligera. A modo de ejemplo, el extremo N-terminal de una cadena ligera puede extenderse con uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, cisteína), que pueden ser iguales o diferentes. Uno o más de dichos residuos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (por ejemplo, unida covalentemente) al mismo. Se describe un ejemplo de esta tecnología en el documento WO2007/104567.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención pueden estar libres de las proteínas complejantes que están presentes en un complejo de toxina clostridial de origen natural.

Una toxina clostridial manipulada de la presente invención también puede comprender un número limitado de aminoácidos no estándares. Por tanto, además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil-lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metilserina) pueden sustituir a residuos de aminoácidos de las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden sustituir a residuos de aminoácidos del polipéptido clostridial. Las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos de origen no natural.

Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios métodos en la técnica para incorporar residuos de aminoácidos de origen no natural en proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Se conocen en la técnica métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto S30 de E. coli y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 90: 10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que debe reemplazarse (p. ej., fenilalanina) y en presencia del aminoácido o aminoácidos de origen no natural deseados (p. ej., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido de origen no natural se incorpora al polipéptido en lugar de su contraparte natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención se pueden producir usando tecnologías de ácidos nucleicos recombinantes. Por tanto, en una realización, una toxina clostridial manipulada (como se describe anteriormente) es una toxina clostridial manipulada recombinante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico (por ejemplo, un ADN) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una toxina clostridial manipulada como se reivindica. En una realización, la secuencia de ácido nucleico se prepara como parte de un vector de ADN que comprende un promotor y un terminador.

En una realización preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de:

Promotor Agente de inducción Condición típica de inducción

Tac (híbrido) IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

AraBAD L-arabinosa 0,2 % (0,002-0,4 %)

Promotor Agente de inducción Condición típica de inducción

Operador T7-lac IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

En otra realización preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de:

Promotor Agente de inducción Condición típica de inducción

Tac (híbrido) IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

AraBAD L-arabinosa 0,2 % (0,002-0,4%)

Operador T7-lac IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

Operador T5-lac IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden elaborar usando cualquier proceso adecuado conocido en la técnica. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico se pueden elaborar usando técnicas de síntesis química. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden elaborar usando técnicas de biología molecular.

El constructo de ADN de la presente invención se diseña preferiblemente in silico, y luego se sintetiza mediante técnicas convencionales de síntesis de ADN.

La información de la secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente se modifica opcionalmente para el sesgo de codones según el sistema de expresión de la célula hospedadora final (p. ej. E. coli) que se vaya a emplear.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica una toxina clostridial manipulada como se describe anteriormente es una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6.

La presente invención también proporciona polipéptidos codificados por secuencias de ácido nucleico como se describe anteriormente. Por tanto, la presente invención proporciona un polipéptido como se reivindica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1,3 y 5.

En una realización, la toxina clostridial manipulada de la invención es una BoNT/A manipulada como se describe anteriormente, y dicha BoNT/A manipulada comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95, 97, 98, 99, 99,5 o 99,9 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1,3 y 5.

En una realización, la toxina clostridial manipulada de la invención es una BoNT/A manipulada como se describe anteriormente, y dicha BoNT/A manipulada comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5.

En una realización, el ácido nucleico comprende (o consiste en) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

La "identidad de secuencia porcentual" entre dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Por tanto, el % de identidad puede calcularse como el número de nucleótidos/aminoácidos idénticos dividido por el número total de nucleótidos/aminoácidos, multiplicado por 100. Los cálculos del % de identidad de secuencia también pueden tener en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para optimizar el alineamiento de dos o más secuencias. Las comparaciones de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos o más secuencias se pueden llevar a cabo usando algoritmos matemáticos específicos, tales como BLAST, que resultarán familiares para un experto.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína toxina clostridial monocatenaria como se reivindica que tiene una cadena ligera y una cadena pesada, comprendiendo el método expresar un ácido nucleico (siendo dicho ácido nucleico como se reivindica) en una célula hospedadora adecuada, lisar la célula hospedadora para proporcionar un homogeneizado de célula hospedadora que contiene la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada y aislar la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para activar una toxina clostridial manipulada, comprendiendo el método proporcionar una proteína toxina clostridial manipulada monocatenaria que se puede obtener mediante el método de producción de una proteína toxina clostridial manipulada monocatenaria como se reivindica, poner en contacto el polipéptido con una proteasa que escinde el polipéptido en un sitio de reconocimiento (sitio de escisión) localizado entre la cadena ligera y la cadena pesada, convirtiendo así el polipéptido en un polipéptido bicatenario en el que la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por un enlace disulfuro.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la invención pueden usarse para prevenir o tratar ciertas enfermedades y afecciones médicas o cosméticas. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una toxina clostridial manipulada como se describe anteriormente, para uso en medicina.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una toxina clostridial manipulada como se describe anteriormente, para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada de: estrabismo, blefaroespasmo, bizqueo, distonía (p. ej., distonía espasmódica, distonía bucomandibular, distonía focal, distonía tardía, distonía laríngea, distonía de las extremidades, distonía cervical), tortícolis (p. ej., tortícolis espasmódica), aplicaciones de terapia de belleza (cosmética) que se benefician de la incapacidad celular/muscular (a través de la regulación negativa o inactivación de SNARE), trastorno neuromuscular o afección de la motilidad ocular (p. ej., estrabismo concomitante, estrabismo vertical, parálisis del recto lateral, nistagmo, miopatía distiroidea), calambre del escritor, bruxismo, enfermedad de Wilson, temblor, tics, mioclono segmentario, espasmos, espasticidad debida a esclerosis múltiple crónica, espasticidad que provoca un control anormal de la vejiga, disinergia defecatoria, espasmo de espalda, calambre muscular, cefaleas tensionales, síndrome del elevador pélvico, espina bífida, discinesia tardía, enfermedad de Parkinson, tartamudeo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, fisura anal, acalasia, disfagia, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, dolor muscular (p. ej., dolor por espasmos musculares), cefalea (p. ej., cefalea tensional), surcos de entrecejo, arrugas de la piel, cáncer, trastornos uterinos, trastornos urogenitales, trastornos urogenitales-neurológicos, inflamación neurogénica crónica y un trastorno del músculo liso.

En uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica, que comprende una toxina clostridial manipulada, junto con al menos un componente seleccionado de un portador, excipiente, adyuvante, propulsor y/o sal farmacéuticamente aceptables.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención pueden formularse para infusión oral, parenteral, continua, inhalación o aplicación tópica. Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso.

En el caso de una toxina clostridial manipulada que se va a administrar por vía local, la toxina clostridial manipulada se puede formular como una crema (p. ej., para aplicación tópica) o para inyección subdérmica.

Los medios de suministro local pueden incluir un aerosol u otro pulverizador (p. ej., un nebulizador). A este respecto, una formulación en aerosol de una toxina clostridial manipulada permite el suministro a los pulmones y/u otros conductos nasales y/o bronquiales o de las vías respiratorias.

Las toxinas clostridiales manipuladas de la invención pueden administrarse a un paciente mediante inyección intratecal o epidural en la columna vertebral al nivel del segmento espinal implicado en la inervación de un órgano afectado.

Una vía de administración preferida es mediante inyección laparoscópica y/o localizada, particularmente intramuscular.

Los intervalos de dosificación para la administración de las toxinas clostridiales manipuladas de la presente invención son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa de la composición o toxina clostridial manipulada, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, extensión o gravedad de la afección del paciente, contraindicaciones, si las hay, y el juicio del médico tratante. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándares para su optimización.

Las dosificaciones diarias adecuadas (por kg de peso del paciente) están en el intervalo de 0,0001-1 ng/kg, preferiblemente 0,0001-0,5 ng/kg, más preferiblemente 0,002-0,5 ng/kg y con particular preferencia 0,004-0,5 ng/kg. La dosificación unitaria puede variar desde menos de 1 picogramo hasta 30 ng, pero típicamente estará en la región de 0,01 a 1 ng por dosis, que puede administrarse diariamente o preferiblemente con menos frecuencia, tal como semanalmente o semestralmente. Un régimen de dosificación particularmente preferido se basa en 0,05 ng de toxina clostridial manipulada como dosis 1X. A este respecto, las dosis preferidas están en el intervalo 1X-100X (es decir, 0,05-5 ng).

Las formas de dosificación fluidas se preparan típicamente utilizando la toxina clostridial manipulada y un vehículo estéril libre de pirógenos. La toxina clostridial manipulada, dependiendo del vehículo y la concentración usados, puede disolverse o suspenderse en el vehículo. Al preparar soluciones, la toxina clostridial manipulada se puede disolver en el vehículo, haciéndose isotónica la solución si es necesario mediante la adición de cloruro de sodio y esterilizándose por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de rellenar viales o ampollas estériles adecuados y sellar. Como alternativa, si la estabilidad de la solución es adecuada, la solución en sus recipientes sellados puede esterilizarse en autoclave. Ventajosamente, pueden disolverse en el vehículo aditivos tales como tamponadores, solubilizantes, estabilizantes, conservantes o bactericidas, agentes de suspensión o emulsionantes y/o agentes anestésicos locales.

Los polvos secos, que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso, se pueden preparar rellenando ingredientes preesterilizados en un recipiente estéril usando una técnica aséptica en un área estéril. Como alternativa, los ingredientes se pueden disolver en recipientes adecuados usando una técnica aséptica en un área estéril. El producto se liofiliza entonces y los envases se sellan asépticamente.

Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que los componentes estériles se suspenden en el vehículo estéril, en lugar de disolverse y la esterilización no se puede lograr por filtración. Los componentes se pueden aislar en un estado estéril o como alternativa se pueden esterilizar después del aislamiento, p. ej. por irradiación gamma.

Ventajosamente, se incluye un agente de suspensión, por ejemplo polivinilpirrolidona, en la composición o composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.

La administración de acuerdo con la presente invención puede aprovechar una variedad de tecnologías de suministro que incluyen encapsulación de micropartículas, sistemas de suministro vírico o impacto de aerosol a alta presión.

Leyendas de las Figuras

Figura 1. Purificación por SDS-PAGE de CatH^N_v1 (Fig. 1A), CatH^N_v2 (Fig. 1B) y CatH^N_v3 (Fig. 1C).

Figura 2. Porcentaje de escisión de SNAP-25 en neuronas de médula espinal embrionaria de rata (eSCN) para CatH^N_v1. Se cultivaron neuronas de médula espinal embrionaria de rata durante tres semanas y se trataron con CatH^N_v1 durante 24 h, antes de transferencia Western con anticuerpo específico de SNAP-25. Los datos son la media ± EEM de tres experimentos independientes por triplicado.

Figura 3. La potencia (t⁵⁰) de BoNT/A y CatH^N_v1 en el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (mPNHD). Los puntos de datos son preparaciones individuales de hemidiafragma y medias ± EEM. CatH^N_v1 era de forma estadísticamente significativa más lento que la proteína de referencia BoNT/A (List Biological Laboratories). ANOVA de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001 (ANOVA de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett).

Figura 4. Porcentaje de escisión de SNAP-25 en neuronas de médula espinal embrionaria de rata (eSCN) para CatH^N_v2. Se cultivaron neuronas de médula espinal embrionaria de rata durante tres semanas y se trataron con CatH^N_v2 durante 24 h, antes de transferencia Western con anticuerpo específico de SNAP-25. Los datos son la media ± EEM de tres experimentos independientes por triplicado.

Figura 5. La potencia (t^sü) de BoNT/A y CatH^N_v2 en el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (mPNHD). Los puntos de datos son preparaciones individuales de hemidiafragma y medias ± EEM. CatH^N_v2 es estadísticamente equivalente a la proteína de referencia BoNT/A (List Biological Laboratories). ANOVA de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001 (ANo Va de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett).

Figura 6. Porcentaje de escisión de SNAP-25 en neuronas de médula espinal embrionaria de rata (eSCN) para CatH^N_v3. Se cultivaron neuronas de médula espinal embrionaria de rata durante tres semanas y se trataron con CatH^N_v3 durante 24 h, antes de transferencia Western con anticuerpo específico de SNAP-25. Los datos son la media ± EEM de tres experimentos independientes por triplicado.

Figura 7. La potencia (t⁵⁰) de BoNT/A y CatH^N_v3 en el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (mPNHD). Los puntos de datos son preparaciones individuales de hemidiafragma y medias ± EEM. CatH^N_v3 era de forma estadísticamente significativa más lento que la proteína de referencia BoNT/A (List Biological Laboratories). ANOVA de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001 (ANOVA de 1 vía y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett).

Figura 8. Análisis de enfoque isoeléctrico. Los tres constructos de CatH^N poseen un pl observado aumentado en comparación con BoNT/A sin modificar.

Figura 9. Purificación por SDS-PAGE del constructo CatLC.

Figura 10. Actividad catalítica de CatLC en comparación con la referencia de BoNT/E LC, con valores de pCE⁵⁰ obtenidos en el kit de detección BoTest A/E BoNT (BioSentinal n.° de cat. A1004), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos muestran la media ± desviación estándar de un experimento independiente por triplicado.

Secuencias

SEQ ID NO: 1. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v1", secuencia de aminoácidos.

SEQ ID NO: 2. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v1", secuencia de ácido nucleico.

SEQ ID NO: 3. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v2", secuencia de aminoácidos.

SEQ ID NO: 4. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v2", secuencia de ácido nucleico.

SEQ ID NO: 5. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v3", secuencia de aminoácidos.

SEQ ID NO: 6. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v3", secuencia de ácido nucleico.

SEQ ID NO: 7. Cadena ligera de BoNT/E manipulada, "CatLC", secuencia de aminoácidos.

SEQ ID NO: 8. Cadena ligera de BoNT/E manipulada, "CatLC", secuencia de ácido nucleico.

SEQ ID NO: 1. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v1", secuencia de aminoácidos.

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEG

DLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRG

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KMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAA

NFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIK

VNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPE

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ATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMN

SMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSRDRPFQLSK

YVD NQ RLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIG SKVNFDPIDKN

QIQ LFNLESSKIEVILKNAIVYNSM YENFSTSFW IRIPKYFNSISLNNEYTIINCM E

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SKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIW IKYFNLFDKELNEKE

IKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR

GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINWVKNKEYRLATNA

SQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVWMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQ

FNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 2. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v1", secuencia de ácido nucleico.

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATT CAACTACAAAGACCCAGT CAACGGCGT CGACAT C

G CATACAT CAAGAT T C C GAAC G C C G G T CAAAT G CAG C C G G T TAAG G C T T T TAAGAT C

CACAACAAGAT TTGGGTTATCCCG GAG C G T GACAC C T T CAC GAAC C C G GAAGAAG G C

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TCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAAT

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SEQ ID NO: 3. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v2", secuencia de aminoácidos.

M PF V N K Q FN Y K D P V N G V D IA Y IK IP N A G Q M Q P V K A F K 1H N K IW V IP E R D T FT N PE E G

D L N PP P E A K Q V PV SY Y D ST Y L ST D N E K D N Y L K G V T K L F E R IY ST D L G R M L L T SIV R G

IP F W G G S T ID T E L K V ID T N C IN V IQ P D G S Y R S E E L N L V IIG P S A D IIQ F E C K S F G H E

V L N L T R N G Y G S T Q Y IR F SP D F T F G F E E SL E V D T N P L L G A G K F A T D P A V T L A H E L 1H A

G H R L Y G IA IN P N R V FK V N T N A Y Y E M SG L E V SFE E L R T FG G H D A K FID SL Q E N E FR L Y

Y Y N K FK D IA ST L N K A K SIV G T T A SL Q Y M K N V FK E K Y L L SE D T SG K FSV D K L K FD K L Y

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F N N IA K L V A SN W Y N R Q IE R SSR T L G C SW E FIPV D D G W G E R PL

SEQ ID NO: 4. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v2", secuencia de ácido nucleico.

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SEQ ID NO: 5. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v3", secuencia de aminoácidos.

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F N N IA K L V A SN W Y N R Q IE R SSR T L G C SW E FIPV D D G W G E R PL

SEQ ID NO: 6. BoNT/A manipulada, "CatH^N_v3", secuencia de ácido nucleico.

ATGCCATTCGTCAACAAGCAAT T CAAC TACAAAGACCCAG T CAACGGCGT C GACAT C

GCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATC

CACAACAAGAT TTGGGTTATCCCG GAG C G T GACAC C T T CAC GAAC C C G GAAGAAG G C

GATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACG

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ATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAAC

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AT CAT T G G C C C GAG C G CAGACAT TAT C CAAT T C GAG T G CAAGAG C T T T G G T CAC GAG

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GATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGT

GCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCA GGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACG AAT GCATACTAC GAGAT GAG C G G C C T G GAAG T CAG C T T C GAAGAAC TGCGCACCTTC GGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTAC TAC TATAACAAAT T CAAAGACAT T G CAAG CAC G T T GAACAAGGC CAAAAGCAT CGT T GGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTG TCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTAC AAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTG AATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCG AAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCG AAC T T TAACGGT CAGAATACGGAAAT CAACAACAT GAATT T CAC GAAGTTGAAGAAC TTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGC AAAAC CAAAAG C C T G GACAAAG G C TACAACAAG GC GC T GAAT GAC C T G T G CAT TAAG GTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTG AACAAGGGTGAAGAAAT CACCAGC gAtA C G A A TA T TGAAGCAGC GGAAGAGAATATC AG C C T G GAT C T GAT C CAG CAG TAC TATCTGACCTTTAAC T T CGACAATGAACC GGAG AAC AT T AGCAT T GAGAAT C T GAG C AG C GAC AT T AT C G G T C AG C T G GAAC T GAT G C C G AATAT C GAAC G T T T C C C GAAC G G CAAAAAGTACGAGCT GGACAAGTACAC TAT GT T C CATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAAC AGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAAaCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGAC TATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAA CAG CTGGTATATGAC T T CACGGACGAGACGAGCGAAGT GAGCAC TACCGACAAAAT T GCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATG CTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTG GAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGaaGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTAC AagGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAAT GAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAAT AC C CAGAT C GAC C T GAT C C G TAAGAAAAT GAAAGAGG C G C T G GAGAAT CAG G C G GAG G C CAC C AAAG CAAT T AT C AAC TAC C AAT AC AAC CAG T AC A a G GAAa AAGAGAAGAAT AACATTAAC T T CAATAT CGATGAT T T GAGCAGCAAGC T GAAT GAAT C TAT CAACAAA G C GAT GAT CAAT AT C AAC AAG T T T T T GAAT CAG T G T AG C G T T T C G TAC C T GAT GAAT

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SEQ ID NO: 7. Cadena ligera de BoNT/E manipulada, "CatLC", secuencia de aminoácidos.

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SEQ ID NO: 8. Cadena ligera de BoNT/E manipulada, "CatLC", secuencia de aminoácidos.

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GGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTT

GAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGC

CCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTG

TTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGG

GATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTA

TCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATC

CCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTG

CAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAG

TATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAA

GCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACC

GAT TAC T C CAT C G CAGAAG C T G C C T T TAATAAAG G C GAAACAG C GAT GAC CAT CAAC

GGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTA

CTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGT

ATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTG

CTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCG

CTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAA

AACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTAT

GCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC

C T GAAAGAC G C G CAGAC T AAT T C GAG C T C GAAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC

AAC C T C G G GAT C GAG G GAAG GAT T T CAGAAT T C G GAT C CAT G C CAAAAAT CAACAG C

T T TAAT TACAAT GAC C C T G TAAAC GAT C G TAC CAT C C TATACATAAAG CCGGGTGGG

T G T CAAGAG T T C T AC AAAT C T T T C AAT AT T AT GAAGAAT AT AT G GAT T AT AC C T GAG

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G G T GAC TCTTCCTATTACG ACCCCAATTAT C T CCAGT CGGAT GAAGAGAAGGACAGA

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T CAAAC C C T CAAC T GAAT C C G TATAAG GACATAT T C CAAGAGAAATATGGAT TAGAC

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CAAAAC G C CAAC C TAAAT C C G C G CAT CAT TAAAC C CAT CACAG GAC G G G G G T TAG T G

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CACCACCAC

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar realizaciones particulares de la invención y no limitan el alcance de la invención definida en las reivindicaciones de ninguna manera.

Ejemplo 1

Identificación de aminoácidos de toxina clostridial preferidos para modificación.

Los aminoácidos identificados como candidatos adecuados para la modificación (sitios de mutación) se seleccionaron usando una serie de criterios diferentes.

1. Localización del residuo dentro de la molécula de BoNT (dentro de Hⁿ , excluyendo la región del cinturón)

2. Localización con respecto a la estructura secundaria/terciaria;

3. Tipo de residuo;

4. Grado de exposición superficial.

Se consideraron para la selección residuos ácidos, neutros, polares e hidrófobos.

Los residuos expuestos se determinaron usando AreaIMol del paquete CCP4. Cada estructura fue analizada por AreaIMol, y se identificó que los residuos expuestos tenían un valor de suma superior a 55.

Las estructuras secundarias dentro de la Hⁿ de cada subtipo y TeNT se identificaron mediante un programa de asignación de estructura secundaria (Stride Web Interface). Las regiones asignadas como formadoras de hélice a, lámina p o hélice 310 se excluyeron de la selección.

Secuencias usadas

Números de acceso:

BoNT/A: P10845

BoNT/B: P10844

BoNT/C1: P18640

BoNT/D: P19321

BoNT/E: Q00496

BoNT/F: YP_001390123

BoNT/G: Q60393

Fuente de datos estructurales

Estructuras cristalinas de BoNT/A (3BTA.pdb), BoNT/B (1EPW) y BoNT/E (3FFZ.pdb) obtenidas de RCSB.

La modelización de homología de BoNT/C¹, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G se realizó usando LOOPP y las siguientes secuencias, respectivamente: P18640, P19321, YP_001390123 y Q60393.

Residuos de aminoácidos de la toxina clostridial preferidos para la modificación en la el dominio HN de la toxina clostridial:

BoNT/A: D474, N476, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, D546, E558, E560, H561, I566, L568, N570, S571, L577, N578, A597, E599, A601, E620, V621, T623, D625, T631, N645, L647, D650, D651, I668, E670, A672, V675, S683, I685, A686, N687, N752, Q753, T755, E756, E757, E758, N760, N761, I762, N763, I831, G832, T847, D848 y D858

BoNT/B: V443, G444, D453, S468, D533, E534, N535, T545, L548, D549, I550, D552, S557, L564, S566, N582, V584, N609, L619, N632, E633, G637, A646, I655, E657, V662, E669, S670, I672, D673, N739, I740, N748, N750, I818, G819, T834, I842, N845 y S858

BoNT/C¹: L451, D452, C453, E455, V472, T474, D475, L478, N483, E484, E485, E487, I489, L555, S556, D557, N558, E560, D561, E569, N574, S575, T584, G592, Q592, G596, D617, N640, S641, V642, G645, N646, E661, E665, T667, A670, S678, V680, Q681, E682, S750, G751, S759, Q760, V826, G827, N842, T843, N847 y N853

BoNT/D: Q469, E470, E473, N474, D479, E480, N482, V483, Q484, N485, S487, D488, S552, N553, N554, V555, E556, N557, I558, L560, T562, S563, V564, G569, S569, N572, G588, Q590, T614, D616, S619, S622, N636, S637, L639, G641, N642, E657, E661, T663, A666, V669, S674, I676, Q677, E678, S746, G747, D749, E661, N752, I753, Q756, N818, V822, G823, E837, N838, T839, N843, N849 y N850

BoNT/E: D474, N476, E479, E480, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, E492, L496, D497, Q500, Q501, L504, N507, D509, N510, N514, S516, E518, Q527, L530, N533, I534, E535, N539, Y548, I566, L568, D589, A597, E599, A601, L604, Y612, E620, N645, L647, Y648, D651, E737, E741, Y803, Y824, D825, G828, I831, G832y D835

BoNT/F: N463, E464, N468, T469, D474, D475, T476, T477, N478, N482, N485, N495, I499, Q501, I502, Q505, T506, N508, T509, V511, D513, D521, S522, S526, E527 I528, E529, V534, D535, L536, E549, G550, T552, N553, S558, E566, E567, S568, V586, H587, Q608, D613, A616, D617, S619, N630, N633, N639, E654, V656, E658, L660, T663, L665, V666, S671, I673, G674, S675, S676, E677, N678, T746, N751, L753, E754, E756, N758, I759, N760, N761, S799, S821, I822, N840, S841, E845, L846, S847, S848, T850, N851, D852, I854, L855 e I856

BoNT/G: N480, Q482, N483, N484, T485, E487, D540, N562, N570, N571, N572, T588, V589, T615, D621, N637, E638, E642, N643, I660, E662, I667, E674, S675, G678, N679, S747, N755, D757, L823, D839, I841, D844, S846 y L847

Tienda: A457, S458, L459, D461, L462, E486, E487, Q490, D491, N497, N504, D557, T571, T572, L573, Q574, N580, S581, N588, S589, T590, S598, Q605, G606, Q608, T631, I633, S640, Q655, E658, G659, N660, E675, I677, E679, T681, V684, A691, E692, S694, T695, Q696, A772, D773, E774, S862, N866, L867 y D868

Residuos de aminoácidos de toxina clostridial preferidos para la modificación en la cadena ligera de BoNT/E:

N5, N8, N10, D11, N14, D15, Q27, E28, N72, Q75, N118, D121, N122, Q123, N138, Q237, Q290, N297, N362, N365, D366, N378 y N379.

Ejemplo 2

Diseño de moléculas de BoNT/A manipuladas

Se produjeron tres ejemplos diferentes de una molécula de BoNT/A manipulada según la presente invención.

Usando el método descrito en el Ejemplo 1, se identificaron un total de 55 residuos como candidatos para la mutación en el dominio Hⁿ de BoNT/A. La idoneidad de los residuos se evaluó adicionalmente mediante inspección visual de la estructura cristalina de BoNT/A para dar una lista de 11 candidatos preferidos (N476, N763, N687, E599, I831, N761, N578, V675, I685, T755, E757). Se eligieron seis residuos adicionales basándose en datos funcionales que mostraban que estos residuos eran susceptibles de mutación sin afectar negativamente a la función de la proteína. Cuatro de estos residuos estaban dentro de la lista de candidatos (L647, D650, D651, T847) y dos no (S564, I849). Con los 11 residuos de la lista de candidatos más los seis de los datos funcionales, se seleccionaron un total de 17 residuos para la mutación.

De los 17 residuos seleccionados, se realizaron 3 constructos: CatH^N_v1, CatH^N_v2 y CatH^N_v3. Las mutaciones para los constructos de CatH^N se muestran en la Tabla 3 a continuación:

Tabla 3: Constructos de CatH^N con las mutaciones enumeradas y el pI calculado.

on

[ApI = cambio en el punto isoeléctrico]

La purificación de CatH^N_v1, CatH^N_v2 y CatH^N_v3 se muestra en la Fig. 1A, 1B y 1C, respectivamente.

Ejemplo 3

Clonación, expresión y purificación

Se sintetizaron constructos de ADN que codifican las moléculas de BoNT/A manipuladas descritas en el Ejemplo 2, se clonaron en el vector de expresión pJ401 y entonces se transformaron en BL21 (DE3) E. coli. Esto permitió la sobreexpresión soluble de las moléculas de BoNT/A manipuladas recombinantes en E. coli.

Las BoNT manipuladas recombinantes se purificaron utilizando técnicas de cromatografía clásicas a partir de lisados de E. coli. Se empleó una etapa de purificación inicial usando una resina de intercambio catiónico, seguida de una etapa de purificación intermedia usando una resina de interacción hidrófoba. La BoNT monocatenaria manipulada recombinante se escindió entonces mediante proteólisis, dando como resultado la BoNT manipulada bicatenaria activada. Se empleó entonces una etapa de purificación final para retirar los contaminantes restantes.

Ejemplo 4

Caracterización de BoNT manipuladas purificadas

Las BoNT manipuladas descritas en el Ejemplo 2 anterior se caracterizaron experimentalmente.

Se evaluó la capacidad de las BoNT manipuladas para entrar en neuronas y escindir SNAP-25 (la diana de BoNT/A) usando neuronas de médula espinal embrionaria de rata (eSCN). Se evaluó adicionalmente La potencia de las BoNT manipuladas usando el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (mPNHD).

CatH ^N_ v1:

El primer conjunto de mutaciones que se añadieron eran sustituciones de arginina: S564R, L647R, D650R, D651R, T847R, I849REl

La molécula CatH^N_v1 se probó en el ensayo de escisión de SNAP-25 de neuronas de médula espinal embrionaria de rata (eSCN) y se encontró que era equipotente a BoNT/A (BoNT/A) (Figura 2). También se demostró un resultado positivo en el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (mPNHD) (Figura 3).

CatH ^N_ v2:

El segundo conjunto de mutaciones eran sustituciones de lisina: N476K, N763K, N687K, E599K, I831K, N761K

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una toxina clostridial manipulada, en la que dicha toxina clostridial manipulada es una neurotoxina botulínica A manipulada (BoNT/A) que comprende:

al menos una modificación de aminoácidos, en la que dicha al menos una modificación de aminoácidos comprende la sustitución de al menos un aminoácido seleccionado de: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, 1831, T847 e I849 por lisina o arginina, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,2 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido, y en la que dicha al menos una modificación de aminoácido no está localizada en el dominio de unión de la toxina clostridial (dominio Hc); y

un pI de al menos 6,6; y

en la que dicha toxina clostridial manipulada:

a. está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las s Eq ID NO: 2, 4 y 6; y/o

b. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

2. La toxina clostridial manipulada según la reivindicación 1, en la que la toxina clostridial manipulada:

a. está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEq ID NO: 2, 4 y 6; y/o

b. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1,3 y 5.

3. La toxina clostridial manipulada según la reivindicación 1 o 2, en la que la toxina clostridial modificada:

a. está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEq ID NO: 2, 4 y 6; y/o

b. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1,3 y 5.

4. La toxina clostridial modificada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la toxina clostridial manipulada:

a. está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 4 y 6; y/o

b. comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

5. La toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos 0,5 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido, o en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos una unidad de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido, o en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es al menos dos unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

6. La toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha al menos una modificación de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la toxina clostridial manipulada a un valor que es entre 2 y 5 unidades de pI más alto que el pI de una toxina clostridial por lo demás idéntica que carece de dicha al menos una modificación de aminoácido.

7. La toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la toxina clostridial modificada comprende entre 1 y 90 modificaciones de aminoácidos o entre 4 y 40 modificaciones de aminoácidos.

8. La toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la toxina clostridial manipulada comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos.

9. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un método para producir una proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que tiene una cadena ligera y una cadena pesada, comprendiendo el método expresar el ácido nucleico según la reivindicación 9 en una célula hospedadora adecuada, lisar la célula hospedadora para proporcionar un homogeneizado de célula hospedadora que contiene la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada y aislar la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada.

11. El método según la reivindicación 10, que comprende además poner en contacto la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada con una proteasa que escinde la proteína toxina clostridial de monocatenaria manipulada en un sitio de reconocimiento (sitio de escisión) localizado entre la cadena ligera y la cadena pesada, y convertir la proteína toxina clostridial monocatenaria manipulada en un polipéptido bicatenario en el que la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por un enlace disulfuro.

12. Una toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 11, para uso en medicina.

13. Una toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 11, para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada de: estrabismo, blefaroespasmo, bizquera, distonía, tortícolis, trastorno neuromuscular o afección de la motilidad ocular, calambre del escritor, bruxismo, enfermedad de Wilson, temblor, tics, mioclonías segmentarias, espasmos, espasticidad debida a esclerosis múltiple crónica, espasticidad que provoca un control anormal de la vejiga, discinesia defecatoria, espasmo de espalda, calambre muscular, cefaleas tensionales, síndrome del elevador pélvico, espina bífida, discinesia tardía, enfermedad de Parkinson, tartamudeo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, fisura anal, acalasia, disfagia, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales, dolor muscular, cefalea, cáncer, trastornos uterinos, trastornos urogenitales, trastornos urogenitales-neurológicos, inflamación neurogénica crónica y un trastorno del músculo liso.

14. La toxina clostridial manipulada para uso según la reivindicación 13, en la que:

la distonía es distonía espasmódica, distonía bucomandibular, distonía focal, distonía tardía, distonía laríngea, distonía de las extremidades o distonía cervical; o

la tortícolis es una tortícolis espasmódica; o

el trastorno neuromuscular o afección de la motilidad ocular es estrabismo concomitante, estrabismo vertical, parálisis del recto lateral, nistagmo o miopatía distiroidea; o

el dolor muscular es un dolor causado por espasmos musculares.

15. Un método para el tratamiento cosmético que se beneficia de la incapacitación celular/muscular, comprendiendo el método el uso de la toxina clostridial manipulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 11, opcionalmente para tratar los surcos de entrecejo y las arrugas de la piel.