RU2733493C2 - Катионные нейротоксины - Google Patents
Катионные нейротоксины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733493C2 RU2733493C2 RU2017128211A RU2017128211A RU2733493C2 RU 2733493 C2 RU2733493 C2 RU 2733493C2 RU 2017128211 A RU2017128211 A RU 2017128211A RU 2017128211 A RU2017128211 A RU 2017128211A RU 2733493 C2 RU2733493 C2 RU 2733493C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bont
- amino acid
- acid sequence
- engineered
- clostridial toxin
- Prior art date
Links
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title description 4
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 title 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims abstract description 344
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 337
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 68
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 64
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 37
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 33
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 27
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 27
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 18
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 18
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 claims description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 claims description 15
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 claims description 13
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 claims description 13
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 claims description 10
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000018197 inherited torticollis Diseases 0.000 claims description 10
- 108010069023 botulinum toxin type E Proteins 0.000 claims description 9
- 239000010451 perlite Substances 0.000 claims description 9
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 7
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 6
- 208000036496 Pelvic floor dyssynergia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010043118 Tardive Dyskinesia Diseases 0.000 claims description 6
- 201000002898 anismus Diseases 0.000 claims description 6
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 claims description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 6
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 claims description 6
- 206010023644 Lacrimation increased Diseases 0.000 claims description 5
- 206010043269 Tension headache Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008548 Tension-Type Headache Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004317 lacrimation Effects 0.000 claims description 5
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 claims description 4
- 208000016599 Uterine disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006514 bruxism Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029728 Eyelid disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007920 Neurogenic Inflammation Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000693 Neurogenic Urinary Bladder Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029279 Neurogenic bladder Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010040954 Skin wrinkling Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067672 Spasmodic dysphonia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 claims description 3
- 208000025609 Urogenital disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 3
- 201000002904 focal dystonia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029864 nystagmus Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002851 oromandibular dystonia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 201000002849 spasmodic dystonia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims 1
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 abstract description 324
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 282
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 282
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 abstract description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 19
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 337
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 328
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 253
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 125
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 60
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 14
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 12
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- -1 SNAP-25 Proteins 0.000 description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 9
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 8
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710117523 Botulinum neurotoxin type C Proteins 0.000 description 7
- 101710117518 Botulinum neurotoxin type D Proteins 0.000 description 7
- 101710117520 Botulinum neurotoxin type F Proteins 0.000 description 7
- 101710117519 Botulinum neurotoxin type G Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 101710117524 Botulinum neurotoxin type B Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000003105 phrenic nerve Anatomy 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 239000001836 Dioctyl sodium sulphosuccinate Substances 0.000 description 4
- 239000004144 Ethoxylated Mono- and Di-Glyceride Substances 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004111 Potassium silicate Substances 0.000 description 4
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101100052669 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) N118 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000001587 sorbitan monostearate Substances 0.000 description 4
- 235000011076 sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 3
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 3
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 3
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 3
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 3
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-2-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=N1 PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CN=C1 DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-pyridin-4-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=NC=C1 FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004140 Calcium stearoyl fumarate Substances 0.000 description 2
- 239000001884 Cassia gum Substances 0.000 description 2
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000002656 Distearyl thiodipropionate Substances 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 239000004118 Natrolite-phonolite Substances 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004139 Sodium stearoyl fumarate Substances 0.000 description 2
- 239000004138 Stearyl citrate Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000404 calcium aluminium silicate Substances 0.000 description 2
- 239000004197 calcium inosinate Substances 0.000 description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N cis-4-Hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 2
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000264 sodium ferrocyanide Substances 0.000 description 2
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 2
- 239000001589 sorbitan tristearate Substances 0.000 description 2
- 235000011078 sorbitan tristearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000001959 sucrose esters of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 235000010965 sucrose esters of fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(2-hydroxyethylamino)-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound OCCN[C@H](C(O)=O)CCS UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N (2s)-5-amino-2-nitramido-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)N[N+]([O-])=O FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N (2s,3s)-3-methylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C[C@H]1CCN[C@@H]1C(O)=O CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 2-methyl-L-serine Chemical compound OC[C@@]([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 1
- 239000001878 Bakers yeast glycan Substances 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100457461 Caenorhabditis elegans mnm-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001736 Calcium glycerylphosphate Substances 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- 206010013952 Dysphonia Diseases 0.000 description 1
- 102100035493 E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like Human genes 0.000 description 1
- 101710155393 E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like Proteins 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 239000004230 Fast Yellow AB Substances 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N Homoglutamine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)=O YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical class NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 1
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004396 Octenyl succinic acid modified gum arabic Substances 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Chemical class OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004237 Ponceau 6R Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 206010040744 Sinus headache Diseases 0.000 description 1
- 102000006384 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010019040 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001882 Soybean hemicellulose Substances 0.000 description 1
- 201000010829 Spina bifida Diseases 0.000 description 1
- 208000006097 Spinal Dysraphism Diseases 0.000 description 1
- 102000016253 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050004777 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 102000036861 Zinc-dependent endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091006982 Zinc-dependent endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N alpha-methylserine Natural products OCC([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 239000000728 ammonium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010407 ammonium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036617 axillary hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- XNBJHKABANTVCP-REOHCLBHSA-N beta-guanidino-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CN=C(N)N XNBJHKABANTVCP-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000001679 citrus red 2 Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000004120 green S Substances 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N hydroxyethylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCCO MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N isovaline Chemical compound CCC(C)(N)C(O)=O GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000231 karaya gum Substances 0.000 description 1
- 235000010494 karaya gum Nutrition 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 1
- 235000010420 locust bean gum Nutrition 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000004237 neck muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000004175 ponceau 4R Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 230000007319 proteasomal degradation pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 208000026451 salivation Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 1
- 235000019317 soybean hemicellulose Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000024188 startle response Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000016978 synaptic transmission, cholinergic Effects 0.000 description 1
- 102000003137 synaptotagmin Human genes 0.000 description 1
- 108060008004 synaptotagmin Proteins 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 108010040544 threonyl-seryl-phenylalanyl-alanyl-glutamyl-tyrosyl-tryptophyl-asparagyl-leucyl-leucyl-seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/06—Antimigraine agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Birds (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Psychology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению сконструированных ботулинических токсинов, содержащих по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного немодифицированного ботулинического токсина, и может быть использовано в медицине. Полученные токсины могут быть эффективно использованы в лечении заболеваний, при которых показана терапия ботулиническим токсином. 12 н. и 20 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к сконструированным клостридиальным токсинам, содержащим по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, и применению таких сконструированных клостридиальных токсинов в медицине и терапии.
Бактерии рода Clostridia продуцируют сильнодействующие и специфические белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, к которым они доставляются. Примеры таких клостридиальных токсинов включают нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипов A-G, а также продуцируемые C. baratii и C. butyricum.
Среди клостридиальных токсинов есть некоторые из наиболее сильных известных токсинов. В качестве примера, ботулинические нейротоксины имеют значения средней летальной дозы (LD50) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг в зависимости от серотипа. Столбнячный и ботулинические токсины действуют, ингибируя функцию пораженных нейронов, в частности, высвобождение нейромедиаторов. В то время как ботулинический токсин действует на нейромышечное соединение и ингибирует холинергическую передачу в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.
В природе клостридиальные токсины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, посттрансляционно модифицируемого посредством протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. Расщепление происходит по конкретному участку расщепления, часто обозначаемому как участок активации, локализующемуся между остатками цистеина, обеспечивающими образование межцепочечной дисульфидной связи. Это представляет собой двухцепочечную форму, являющуюся активной формой токсина. Две цепи обозначают как тяжелую цепь (H-цепь), имеющую молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкую цепь (L-цепь), имеющую молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой компонент транслокации (домен HN) и C-концевой направляющий компонент (HC домен). Участок расщепления локализован между L-цепью и компонентами транслокационного домена. После связывания домена HC с нейроном-мишенью и интернализации связанного токсина в клетку с помощью эндосомы домен HN транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану и в цитозоль, и L-цепь выполняет функцию протеазы (также известной как нецитотоксическая протеаза).
Нецитотоксические протеазы действуют, протеолитически расщепляя внутриклеточные транспортные белки, известные как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин) -см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE происходит от термина "растворимый рецептор прикрепления NSF", где "NSF" означает N-этилмалеинимид-чувствительный фактор. Белки SNARE важны для слияния внутриклеточных везикул и, таким образом, для секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки. Протеазная функция является цинк-зависимой эндопептидазной активностью и демонстрирует высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Таким образом, после доставки в желаемую клетку-мишень нецитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. Протеазы L-цепи клостридиальных токсинов являются нецитотоксическими протеазами, расщепляющими белки SNARE.
В свете распространенной природы белков SNARE, клостридиальные токсины, такие как ботулинический токсин, успешно используют в широком спектре терапевтических средств.
В качестве примера, авторы настоящего изобретения ссылаются на William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004), где описывают использование клостридиальных токсинов, таких как ботулинические нейротоксины (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G и столбнячный нейротоксин (TeNT), для ингибирования нейронной передачи при терапевтическом и косметическом или эстетическом применении, например, продаваемые продукты ботулинического токсина в настоящее время одобрены в качестве терапевтических средств по показаниям, включающим фокальную спастичность, спастичность верхней конечности, спастичность нижней конечности, спастическую кривошею, блефароспазм, гемифациальный спазм, гипергидроз подмышек, хроническую мигрень, нейрогенную гиперактивность детрузора, глабеллярные морщины и тяжелые боковые периорбитальные морщины. Кроме того, терапевтические средства на основе клостридиального токсина описывают для лечения нервно-мышечных нарушений (см. US 6872397); для лечения нарушений матки (см. US 2004/0175399); для лечения язвы и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (см. US 2004/0086531); для лечения дистонии (см. US 6319505); для лечения глазных нарушений (см. US 2004/0234532); для лечения блефароспазма (см. US 2004/0151740); для лечения косоглазия (см. US 2004/0126396); для лечения боли (см. US 6869610, US 6641820, US 6464986 и US 6113915); для лечения фибромиалгии (см. US 6623742, US 2004/0062776); для лечения боли в нижних отделах позвоночника (см. US 2004/0037852); для лечения мышечных повреждений (см. US 6423319); для лечения синусовой головной боли (см. US 6838434); для лечения головной боли напряжения (см. US 6776992); для лечения головной боли (см. US 6458365); для уменьшения мигренозной головной боли (см. US 5714469); для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (см. US 6767544); для лечения неврологических нарушений, таких как болезнь Паркинсона (см. US 6620415, US 6306403); для лечения психоневрологических нарушений (см. US 2004/0180061, US 2003/0211121); для лечения эндокринных нарушений (см. US 6827931); для лечения нарушений щитовидной железы (см. US 6740321); для лечения нарушений потовых желез под влиянием холинергической передачи сигнала (см. US 6683049); для лечения диабета (см. US 6337075, US 6416765); для лечения нарушений поджелудочной железы (см. US 6261572, US 6143306); для лечения злокачественных новообразований, таких как опухоли костей (см. US 6565870, US 6368605, US 6139845, US 2005/0031648); для лечения ушных нарушений (см. US 6358926, US 6265379); для лечения вегетативных нарушений, таких как нарушения мышц желудочно-кишечного тракта и дисфункция других гладких мышц (см. US 5437291); для лечения кожных повреждений, связанных с пролиферативными нарушениями клеток кожи (см. US 5670484); для лечения нейрогенных воспалительных нарушений (см. US 6063768); для снижения выпадения волос и стимуляции роста волос (см. US 6299893); для лечения опущенных углов рта (см. US 6358917); для снижения аппетита (см. US 2004/40253274); для стоматологических терапевтических средств и процедур (см. US 2004/0115139); для лечения нервно-мышечных нарушений и состояний (см. US 2002/0010138); для лечения различных нарушений и состояний и связанной с ними боли (см. US 2004/0013692); для лечения состояний, являющихся результатом гиперсекреции слизи, таких как астма и COPD (см. WO 00/10598); и для лечения не-нервных состояний, таких как воспаления, эндокринные состояния, экзокринные состояния, иммунологические состояния, сердечно-сосудистые состояния, состояния костной ткани (см. WO 01/21213). Все из указанных выше публикаций включены, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Ожидают, что использование нецитотоксических протеаз, таких как клостридиальные токсины (например, BoNT и TeNT), в терапевтическом и косметическом лечении людей и других млекопитающих распространится на постоянно расширяющийся диапазон заболеваний, при которых можно получать пользу из свойств этих токсинов.
Для избежания системных неврологических эффектов в случае многих терапевтических средств на основе клостридиальных токсинов используют прямое введение терапевтического средства на основе клостридиального токсина в указанный целевой участок (такой как ткань-мишень). Проблемой при введении терапевтических средств на основе клостридиальных токсинов таким способом является распространение токсина из участка введения в окружающую ткань или системный кровоток. Считают, что диффузия токсина из ткани-мишени отвечает за нежелательные побочные эффекты, которые в крайних случаях могут угрожать жизни. Это может быть особой проблемой при использовании терапевтических средств на основе клостридиальных токсинов (таких как терапевтические средства на основе BoNT) в высоких дозах, концентрациях и объемах инъекции. Побочные эффекты, ассоциированные с этой проблемой, о которых сообщают в случае коммерческих терапевтических средств на основе BoNT/A, включают астению, общую мышечную слабость, диплопию, птоз, дисфагию, дисфонию, дизартрию, недержание мочи и затруднения дыхания. Затруднения глотания и дыхания могут угрожать жизни, и есть сообщения о смертях, связанных с эффектами распространения токсина.
Таким образом, в этой области существует потребность в клостридиальных токсинах, обладающих свойствами повышенного удержания в ткани в участке введения и, таким образом, демонстрирующих снижение диффузии из участка введения по сравнению с известными клостридиальными токсинами.
Настоящее изобретение решает указанную выше проблему посредством предоставления сконструированных клостридиальных токсинов, указанных в формуле изобретения.
В одном из аспектов изобретение относится к сконструированному клостридиальному токсину, содержащему по меньшей мере одну (например, по меньшей мере одну, две или три) модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не локализуется в связывающем домене клостридиального токсина (домене HC).
В одном из вариантов осуществления термин "не локализуется в связывающем домене клостридиального токсина (HC)" означает, что указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в домене HN клостридиального токсина или в легкой цепи клостридиального токсина.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к сконструированному клостридиальному токсину, содержащему по меньшей мере одну (например, по меньшей мере одну, две или три) модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI выше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в транслокационном домене клостридиального токсина (домене HN).
В другом варианте осуществления изобретение относится к сконструированному клостридиальному токсину, содержащему по меньшей мере одну (например, по меньшей мере одну, две или три) модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI выше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина.
В одном из вариантов осуществления, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не приводит к встраиванию в легкую цепь клостридиального токсина мотива распознавания лигазы E3. Таким образом, в одном из вариантов осуществления легкая цепь сконструированного клостридиального токсина по изобретению не содержит мотив распознавания лигазы E3.
Как указано выше, термин "мотив распознавания лигазы E3" относится к модификации легкой цепи, приводящей к ускоренной деградации полипептида нейротоксина с помощью эндогенных протеасомных путей деградации, присутствующих у индивидуума, которому вводят нейротоксин. Мотив "распознавания лигазы E3" является структурным мотивом, делающим возможным распознавание мотива и связывание с мотивом лигазы E3 (также известной как убиквитинлигаза E3; таким образом, "мотив распознавания лигазы E3" также можно обозначать как "мотив распознавания убиквитинлигазы E3"). Мотивы распознавания лигазы E3 известны специалисту в этой области.
Примеры мотивов распознавания лигазы E3 включают следующие последовательности (где "X" может представлять собой любую из природных аминокислот):
| Убиквитинлигаза E3 | Мотив распознавания (консенсусный) |
| VBCCul2 | ALAPYIP (SEQ ID NO: 9) |
| MDM2 | XXFXXXWXXLXX (SEQ ID NO: 10) |
| MNM2 | RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 11) FXXXLWXXL (SEQ ID NO: 12) |
| Smurf2 | ELESPPPPYSRYPM (SEQ ID NO: 13) |
| RN181 | KVGFFKR (SEQ ID NO: 14) |
| E3alpha | LLVRGRTLVV (SEQ ID NO: 15) |
| SCF | DRHDSGLDSM (SEQ ID NO: 16) |
| Siah | PXAXVXP (SEQ ID NO: 17) |
| Itch | PPXYXXM (SEQ ID NO:18) |
| Nedd4-2 | PPXY (SEQ ID NO:19) |
Дополнительные примеры мотивов распознавания лигазы E3 включают: ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO:20), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 21), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 22), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 23), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 24), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 25), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 26), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 27), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 28), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 30), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 32), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 33), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 34), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 35), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 36) и LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 37).
В одном из вариантов осуществления, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не приводит к встраиванию в легкую цепь клостридиального токсина мотива распознавания лигазы MDM2 E3. Таким образом, в одном из вариантов осуществления легкая цепь сконструированного клостридиального токсина по изобретению не содержит мотив распознавания лигазы MDM2 E3.
В одном из вариантов осуществления, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, сконструированный клостридиальный токсин не содержит модификацию аминокислоты на N-концевом пролине.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанный сконструированный BoNT/E не содержит замену лизином в любом из следующих положений аминокислот: Q53, N72, N378, N379, R394, T400.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанный сконструированный BoNT/E не содержит замену лизином в любом из следующих положений аминокислот: Q53, N72, N378, N379, T400.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанный сконструированный BoNT/E не содержит замену лизином в любых трех из следующих положений аминокислот: Q53, N72, N378, N379, R394, T400.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, и где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанный сконструированный BoNT/E не содержит замену лизином в любых трех из следующих положений аминокислот: Q53, N72, N378, N379, T400.
В одном из вариантов осуществления необязательно, где по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, сконструированный клостридиальный токсин не является BoNT/E.
Сконструированные клостридиальные токсины по изобретению не содержат какие-либо модификации аминокислот, локализованные в домене HC клостридиального токсина. Таким образом, в сконструированном клостридиальном токсине по изобретению, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не локализуется в домене HC клостридиального токсина.
В одном из вариантов осуществления, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в легкой цепи клостридиального токсина, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не содержит замену аминокислотного остатка остатком лизина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является сконструированным клостридиальным токсином, как описано выше, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты содержит замену кислого аминокислотного остатка или незаряженного аминокислотного остатка остатком лизина или аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является сконструированным клостридиальным токсином, как описано выше, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты содержит замену кислого аминокислотного остатка или незаряженного аминокислотного остатка остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является сконструированным клостридиальным токсином, как описано выше, указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,4 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты. В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,5 единицы pI выше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты. В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,6 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты. В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,8 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты. В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 1 единицу pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
В определенных вариантах осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 модификаций аминокислот.
В определенных вариантах осуществления указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 2, 3, 4 или 5 единиц pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
В определенных вариантах осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит по меньшей мере 3 модификации аминокислот, и указанные по меньшей мере 3 модификации аминокислот повышают pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствуют указанные по меньшей мере 3 модификации аминокислот.
В определенных вариантах осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит по меньшей мере 5 модификаций аминокислот, и указанные по меньшей мере 5 модификаций аминокислот повышают pI сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,5 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствуют указанные по меньшей мере 5 модификации аминокислот.
Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что при повышении pI клостридиального токсина, например, по меньшей мере на 0,2 единицы pI, или 0,5 единицы pI или одну единицу pI (встраивая в белок клостридиального токсина по меньшей мере одну модификацию аминокислоты), полученный сконструированный клостридиальный токсин преимущественно проявляется свойства повышенного удержания в ткани и сниженную диффузию из участков введения, одновременно сохраняя способности к связыванию клетки-мишени, транслокации и расщеплению белков-мишеней SNARE. Таким образом, значительно снижают распространение клостридиального токсина из участка введения по сравнению с в других отношениях идентичным клостридиальным токсином, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
Сконструированные клостридиальные токсины по изобретению пригодны для использования в любой терапии, описываемой выше, и преимущественно могут демонстрировать снижение или отсутствие побочных эффектов по сравнению с использованием известных терапевтических средств на основе клостридиальных токсинов. Свойства повышенного удержания в ткани сконструированных клостридиальных токсинов по изобретению также обеспечивают повышенную активность и/или длительность действия и могут сделать возможным снижение доз, подлежащих использованию, по сравнению с известными терапевтическими средствами на основе клостридиальных токсинов (или повышение доз без каких-либо дополнительных побочных эффектов), таким образом, обеспечивая дополнительные преимущества.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению имеет повышенную активность, повышенное удержание в ткани и/или повышенную длительность действия, по сравнению с соответствующим немодифицированным клостридиальным токсином.
Как более подробно описано ниже, повышение pI, обеспечиваемое посредством по меньшей мере одной модификации аминокислоты, означает, что сконструированный клостридиальный токсин по изобретению имеет при указанном pH суммарный заряд, более положительный, чем суммарный заряд на в других отношениях идентичном клостридиальном токсине, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что этот повышенный положительный заряд позволяет сконструированным клостридиальным токсинам по настоящему изобретению проявлять большее время удержания в ткани в участке введения в результате благоприятных электростатических взаимодействий между сконструированным клостридиальным токсином и анионными внеклеточными компонентами (такими как клеточные мембраны и гепарансульфатные протеогликаны) в участке введения. Эти улучшенные электростатические взаимодействия служат для снижения диффузии сконструированного клостридиального токсина из участка введения, таким образом, улучшая удержание в ткани.
В качестве примера, свойства улучшенного удержания в ткани сконструированного клостридиального токсина по изобретению могут делать возможными (i) более высокие дозы в отдельных мышцах, таких как грудинно-ключично-сосцевидная мышца, без распространения в близлежащие мышцы шеи с вызыванием затруднений глотания, и (ii) более высокие общие дозы (во всех мышцах) при однократном введении без распространения в кровоток и вызывания системных эффектов, таких как затруднения дыхания. Преимущества для пациентов могут включать более эффективное лечение крупных мышц, таких как грудинно-ключично-сосцевидная мышца, повышение возможности инъецирования в несколько отдельных мышц при каждом введении и возможно большая длительность эффективного лечения (больший период времени перед тем, как потребуется повторное лечение) по причине более высоких доз.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению при использовании имеет положительный суммарный заряд (например, если сконструированный клостридиальный токсин при использовании локализуется в желаемом участке введения в ткани).
Изоэлектрическая точка (pI) является специфическим свойством указанного белка. Как хорошо известно в этой области, белки состоят из конкретной последовательности аминокислот (также обозначаемых в белке как аминокислотные остатки). Каждая аминокислота из стандартного набора из двадцати имеет разную боковую цепь (или R-группу), что означает, что каждый аминокислотный остаток в белке проявляет разные химические свойства, такие как заряд и гидрофобность. На эти свойства может влиять химическая среда, например, температура и pH. Общие химические характеристики белка будут зависеть от суммы этих различных факторов.
Конкретные аминокислотные остатки (подробно описанные ниже) обладают ионизируемыми боковыми цепями, которые могут проявлять электрический заряд, зависящий от pH окружающей среды. Является ли такая боковая цепь заряженной или нет при указанном pH, зависит от pKa соответствующего ионизируемого остатка, где pKa является отрицательным логарифмом кислой константы диссоциации (Ka) для определенного протона из сопряженного основания.
Например, кислые остатки, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, имеют группы боковой цепи карбоновых кислот со значениями pKa приблизительно 4,1 (точные значения pKa могут зависеть от температуры, ионной силы и микроокружения ионизируемой группы). Таким образом, эти боковые цепи проявляют отрицательный заряд при pH 7,4 (часто обозначаемом как "физиологический pH"). При низких значениях pH эти боковые цепи протонируются и теряют свой заряд.
И наоборот, основные остатки, такие как лизин и аргинин, имеют азотосодержащие группы боковой цепи со значениями pKa приблизительно 10-12. Таким образом, эти боковые цепи проявляют положительный заряд при pH 7,4. Эти боковые цепи депротонируются и теряют свой заряд при высоких значениях pH.
Таким образом, общий (суммарный) заряд молекулы белка зависит от количества кислых и основных остатков, присутствующих в белке (и их степени экспонирования на поверхности), и pH окружающей среды. Изменения pH окружающей среды изменяют общий заряд на белке. Таким образом, для каждого белка есть определенный pH, при котором количество положительных и отрицательных зарядов является равным, и белок демонстрирует отсутствие общего суммарного заряда. Эта точка известна как изоэлектрическая точка (pI). Изоэлектрическая точка является стандартной концепцией в биохимии белка, которая будет знакома специалисту в этой области.
Изоэлектрическую точку (pI), таким образом, определяют как значение pH, при котором белок проявляет нулевой суммарный заряд. Повышение pI означает, что необходимо более высокое значение pH, чтобы белок проявлял нулевой суммарный заряд. Таким образом, повышение pI представляет собой повышение суммарного положительного заряда белка при определенном pH. И наоборот, снижение pI означает, что необходимо более низкое значение pH, чтобы белок проявлял нулевой суммарный заряд. Таким образом, снижение pI представляет собой снижение суммарного положительного заряда белка при определенном pH.
Способы определения pI белка известны в этой области и будут знакомы специалисту в этой области. В качестве примера, pI белка можно вычислять из средних значений pKa каждой аминокислоты в белке ("вычисленная pI"). Такие вычисления можно осуществлять с использованием компьютерных программ, известных в этой области; предпочтительный пример компьютерных программ для вычисления значений pI включает Protein Calculator от Scripps Research Institute и Compute pI/MW Tool от ExPASy. Сравнения значений pI между разными молекулами следует осуществлять с использованием одного и того же способа вычисления/программы.
При необходимости, вычисленную pI белка можно подтверждать экспериментально способом изоэлектрофокусирования ("наблюдаемая pI"). В этом способе используют электрофорез для разделения белков по их pI. Изоэлектрофокусирование, как правило, осуществляют с использованием геля с иммобилизованным градиентом pH. При использовании электрического поля белок мигрирует через градиент pH до достижения pH, при котором он имеет нулевой суммарный заряд, эта точка представляет собой pI белка. Результаты, полученные при изоэлектрофокусировании, как правило, имеют относительно низкое разрешение по своей природе, и, таким образом, авторы настоящего изобретения считают, что результаты, полученные с помощью вычисленной pI (как описано выше) больше подходят для использования.
На всем протяжении настоящего описания "pI" означает "вычисленную pI", если не указано иначе.
Можно повышать или снижать pI белка, изменяя количество основных и/или кислых групп, экспонируемых на его поверхности. Этого можно достигать, модифицируя одну или более аминокислот белка. Например, можно обеспечивать повышение pI, снижая количество кислых остатков или повышая количество основных остатков. Такие модификации аминокислот более подробно описаны ниже.
Нативные (немодифицированные) клостридиальные токсины имеют pI приблизительно 5-6. Таким образом, при pH 7,4 нативные ботулинические токсины обладают отрицательным суммарным зарядом. В качестве примера, pI BoNT/A составляет 6,4, и молекула BoNT/A имеет суммарный заряд -8 при pH 7,4. Эти значения pI вычисляют как описано выше.
ТАБЛИЦА 1:
| КЛОСТРИДИАЛЬНЫЙ ТОКСИН | pI |
| BoNT/A | 6,4 |
| BoNT/B | 5,3 |
| BoNT/C1 | 5,5 |
| BoNT/D | 5,5 |
| BoNT/E | 6,0 |
| BoNT/F | 5,6 |
| BoNT/G | 5,2 |
| TeNT | 5,8 |
Как описано выше, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
Таким образом, в контексте настоящего изобретения повышение pI на 0,2 единицы в отношении сконструированного клостридиального токсина BoNT/A будет являться повышением pI с 6,4 до 6,6.
Как описано выше, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного клостридиального токсина до значения, составляющего по меньшей мере на одну единицу pI больше, чем pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствует указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
Таким образом, в контексте настоящего изобретения повышение pI на 1 единицу в отношении сконструированного клостридиального токсина BoNT/A будет являться повышением pI с 6,4 до 7,4.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин имеет pI по меньшей мере 5,5.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин имеет pI по меньшей мере 6 (например, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9).
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин имеет pI по меньшей мере 6,5.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин имеет pI по меньшей мере 7.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин имеет pI от 6,5 до 9,5 (например, pI от 6,5 до 7,5).
Как указано выше, сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению имеют свойства повышенного удержания в ткани, также обеспечивающие повышенную активность и/или длительность действия, и могут позволять снижать дозы, подлежащие использованию, по сравнению с известными терапевтическими средствами на основе клостридиальных токсинов (или повышать дозы без каких-либо дополнительных эффектов). Один из путей, которым можно определять эти предпочтительные свойства (представляющие повышение терапевтического индекса), относится к соотношению безопасности сконструированного клостридиального токсина. В связи с этим, нежелательные эффекты клостридиального токсина (вызываемые диффузией токсина из участка введения) можно оценивать экспериментально посредством измерения процента потери массы тела в соответствующей модели на животных (например, мыши, где потерю массы тела определяют в течение семи дней после введения). И наоборот, желаемые точные эффекты клостридиального токсина можно оценивать экспериментально посредством анализа Digital Abduction Score (DAS), измерения паралича мышц. Анализ DAS можно осуществлять посредством инъекции 20 мкл клостридиального токсина, составленного в желатиновом фосфатном буфере, в комплекс икроножной/камбаловидной мышцы мыши с последующей оценкой Digital Abduction Score с использованием способа Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). В анализе DAS мышей ненадолго подвешивали для вызывания характерной реакции испуга, при которой мышь вытягивает свои задние конечности и отводит пальцы задних конечностей. После инъекции клостридиального токсина различные степени отведения пальцев оценивают по пятибалльной шкале (от 0=норма до 4=максимальное снижение отведения пальцев и вытягивания ног).
Затем Соотношение безопасности клостридиального токсина можно выражать как соотношение количества токсина, необходимого для 10%-ного снижения массы тела (измеряемого как пик-эффект в первые семь дней после введения дозы мыши), и количества токсина, необходимого для 2 баллов по DAS. Таким образом, желательными являются высокие баллы соотношения безопасности, и они означают, что токсин способен эффективно парализовать целевую мышцу с небольшими нежелательными побочными эффектами. Сконструированный токсин по настоящему изобретению имеет соотношение безопасности, более высокое, чем соотношение безопасности эквивалентного немодифицированного (нативного) ботулинического токсина.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению имеет соотношение безопасности по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50), где соотношение безопасности вычисляют следующим образом: доза токсина, необходимая для изменения массы тела на -10% (пг/мышь), разделенная на DAS ED50 (пг/мышь) [ED50=доза, необходимая для достижения 2 баллов по DAS].
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению имеет соотношение безопасности по меньшей мере 10. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению имеет соотношение безопасности по меньшей мере 15.
Сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты. Указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты повышает pI клостридиального токсина, как указано выше. В контексте настоящего изобретения модификация аминокислоты является модификацией аминокислотной последовательности клостридиального токсина. Такую модификацию можно осуществлять, заменяя одну аминокислоту в последовательности другой (т.е. осуществляя замену), осуществляя инсерцию новой аминокислоты в последовательность или делецию аминокислоты из последовательности. Аминокислоты, встроенные в аминокислотную последовательность белка, также обозначают как аминокислотные остатки.
20 стандартных аминокислот, обнаруживаемых в белках, являются следующими:
ТАБЛИЦА 2:
| АМИНОКИСЛОТА | БОКОВАЯ ЦЕПЬ | ||
| Аспарагиновая кислота | Asp | D | Заряженная (кислая) |
| Глутаминовая кислота | Glu | E | Заряженная (кислая) |
| Аргинин | Arg | R | Заряженная (основная) |
| Лизин | Lys | K | Заряженная (основная) |
| Гистидин | His | H | Незаряженная (полярная) |
| Аспарагин | Asn | N | Незаряженная (полярная) |
| Глутамин | Gln | Q | Незаряженная (полярная) |
| Серин | Ser | S | Незаряженная (полярная) |
| Треонин | Thr | T | Незаряженная (полярная) |
| Тирозин | Tyr | Y | Незаряженная (полярная) |
| Метионин | Met | M | Незаряженная (полярная) |
| Триптофан | Trp | W | Незаряженная (полярная) |
| Цистеин | Cys | C | Незаряженная (полярная) |
| Аланин | Ala | A | Незаряженная (гидрофобная) |
| Глицин | Gly | G | Незаряженная (гидрофобная) |
| Валин | Val | V | Незаряженная (гидрофобная) |
| Лейцин | Leu | L | Незаряженная (гидрофобная) |
| Изолейцин | Ile | I | Незаряженная (гидрофобная) |
| Пролин | Pro | P | Незаряженная (гидрофобная) |
| Фенилаланин | Phe | F | Незаряженная (гидрофобная) |
Следующие аминокислоты считают заряженными аминокислотами: аспарагиновая кислота (отрицательная), глутаминовая кислота (отрицательная), аргинин (положительная) и лизин (положительная).
При pH 7,4 боковые цепи аспарагиновой кислоты (pKa 3,1) и глутаминовой кислоты (pKa 4,1) имеют отрицательный заряд, в то время как боковые цепи аргинина (pKa 12,5) и лизина (pKa 10,8) имеют положительный заряд. Аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту обозначают как кислые аминокислотные остатки. Аргинин и лизин обозначают как основные аминокислотные остатки.
Следующие аминокислоты считают незаряженными, полярными аминокислотами (что означает, что они могут участвовать в образовании водородных связей): аспарагин, глутамин, гистидин, серин, треонин, тирозин, цистеин, метионин, триптофан.
Следующие аминокислоты считают незаряженными, гидрофобными аминокислотами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, пролин и глицин.
Повышение pI клостридиального токсина можно осуществлять посредством включения в клостридиальный токсин одной или более модификаций аминокислот, повышающих соотношение положительного и отрицательного зарядов в клостридиальном токсине.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты выбрана из: замены аминокислоты, инсерции аминокислоты и делеции аминокислоты.
При замене аминокислоты, аминокислотный остаток, образующий часть аминокислотной последовательности клостридиального токсина, заменяют другим аминокислотным остатком. Заменителем аминокислотного остатка может являться одна из 20 стандартных аминокислот, как описано выше.
Альтернативно, заменитель аминокислоты при замене аминокислоты может являться нестандартной аминокислотой (аминокислотой, не являющейся частью стандартного набора из 20, описываемых выше). В качестве примера, заменителем аминокислоты может являться основная нестандартная аминокислота, например, L-орнитин, L-2-амино-3-гуанидинопропионовая кислота или D-изомеры лизина, аргинина и орнитина. Способы включения нестандартных аминокислот в белки известны в этой области и включают синтез рекомбинантного белка с использованием ауксотрофного экспрессирующего хозяина E. coli.
При инсерции аминокислоты дополнительный аминокислотный остаток (не присутствующий в норме) включают в аминокислотную последовательность клостридиального токсина, таким образом, повышая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности. При делеции аминокислоты аминокислотный остаток удаляют из аминокислотной последовательности клостридиального токсина, таким образом, снижая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности.
Способы модификации белков посредством замены, инсерции или делеции аминокислотных остатков известны в этой области. В качестве примера, модификации аминокислот можно включать посредством модификации последовательности ДНК, кодирующей клостридиальный токсин. Этого можно достигать стандартными способами молекулярного клонирования, например, посредством сайт-специфического мутагенеза, при котором короткие цепи ДНК (олигонуклеотиды), кодирующие желаемые аминокислоты, используют для замены исходной кодирующей последовательности с использованием фермента полимеразы, или посредством инсерции/делеции частей гена с помощью различных ферментов (например, лигазы и рестрикционных эндонуклеаз). Альтернативно модифицированные последовательности генов можно модифицировать химически.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; замены кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; инсерции основного аминокислотного остатка и делеции кислого аминокислотного остатка.
В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты является заменой, при которой преимущественно сохраняется то же количество аминокислотных остатков в клостридиальном токсине. В одном из вариантов осуществления замена выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком, замены кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком и замены незаряженного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком. В одном из вариантов осуществления основный аминокислотный остаток является остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления основный аминокислотный остаток является остатком лизина. В одном из вариантов осуществления основный аминокислотный остаток является остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления, где замена является заменой кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком, кислый аминокислотный остаток заменяют соответствующим ему незаряженным амидным аминокислотным остатком (т.е. аспарагиновую кислоту заменяют аспарагином и глутаминовую кислоту заменяют глутамином).
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты является заменой кислого аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком или заменой незаряженного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком. В одном из вариантов осуществления основный аминокислотный остаток является остатком лизина. В одном из вариантов осуществления основный аминокислотный остаток является остатком аргинина.
Сконструированный клостридиальный токсин по изобретению может содержать несколько модификаций аминокислот. Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 1 до 90 модификаций аминокислот (например, от 1 до 80, от 1 до 70, от 1 до 60, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 3 до 50, от 3 до 40, от 3 до 30, от 4 до 40, от 4 до 30, от 5 до 40, от 5 до 30 или от 10 до 25 модификаций аминокислот). В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 1 до 20 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 1 до 10 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 2 до 20 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 2 до 15 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 2 до 10 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 3 до 20 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 3 до 15 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 3 до 10 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) содержит от 4 до 40 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 модификаций аминокислот. В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит, по меньшей мере 3 модификации аминокислот (например, по меньшей мере 3 замены аминокислот). В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин содержит по меньшей мере 4 модификации аминокислот (например, по меньшей мере 4 замены аминокислот). Каждая из указанных модификаций аминокислот является модификацией аминокислоты, как описано выше. Таким образом, каждая из указанных модификаций аминокислот вносит вклад в повышение pI сконструированного клостридиального токсина (по сравнению с pI в других отношениях идентичного клостридиального токсина, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот).
Любую аминокислоту клостридиального токсина (т.е. аминокислотный остаток), не локализующуюся в связывающем домене клостридиального токсина (домене HC) можно модифицировать, как описано выше, при условии, что исходом указанной модификации является повышение pI клостридиального токсина (как описано выше). Однако авторы настоящего изобретения идентифицировали подгруппы аминокислот клостридиального токсина, являющихся особенно подходящими мишенями модификации.
Предпочтительные целевые аминокислоты могут обладать конкретными качествами. В качестве примера, предпочтительная целевая аминокислота может являться: (i) поверхностной аминокислотой; (ii) аминокислотой, локализованной вне вторичной структуры белка клостридиального токсина; (iii) локализованной в области белка клостридиального токсина, не важной для функции белка; (iv) аминокислотой, не являющейся консервативной среди типов, подтипов или серотипов клостридиальных токсинов; (iv) аминокислотой, модификация которой не приводит к образованию предполагаемого участка убиквитинилирования; или (v) любой комбинацией указанного выше.
Как описано выше, сконструированные клостридиальные токсины по изобретению имеют одну или более модификаций аминокислот, локализованных в транслокационном домене HN клостридиального токсина или легкой цепи клостридиального токсина.
Примеры референсных последовательностей легкой цепи клостридиального токсина включают:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки 1-448
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки 1-440
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки 1-441
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки 1-445
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки 1-422
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки 1-439
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки 1-441
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки 1-457
Примеры референсных последовательностей домена HN клостридиального токсина включают:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки 449-871
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки 443-862
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки 450-866
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки 449-871
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки 455-845
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки 450-864
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки 449-871
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки 456-879
Примеры референсных последовательностей домена HC клостридиального токсина включают:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки 872-1278
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки 863-1291
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки 867-1291
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки 872-1276
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки 846-1252
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки 865-1278
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки 872-1297
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки 880-1315
Указанные выше референсные последовательности следует считать руководством, т.к. в подсеротипах могут иметь место небольшие изменения. В качестве примера, в US 2007/0166332 (включенном, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) цитируют немного другие клостридиальные последовательности:
Легкая цепь:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки M1-K448
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки M1-K441
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки M1-K449
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки M1-R445
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки M1-R422
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки M1-K439
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки M1-K446
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки M1-A457
Домен HN:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки A449-K871
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки A442-S858
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки T450-N866
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки D446-N862
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки K423-K845
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки A440-K864
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки S447-S863
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки S458-V879
Домен HC:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки N872-L1296
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки E859-E1291
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки N867-E1291
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки S863-E1276
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки R846-K1252
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки K865-E1274
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки N864-E1297
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки I880-D1315
В одном из вариантов осуществления, где указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты локализуется в транслокационном домене клостридиального токсина (домене HN), указанная по меньшей мере одна модификация аминокислоты не локализуется в поясной области клостридиального токсина. Поясную область клостридиального токсина (определяемую посредством визуального осмотра структур и моделей) определяют следующим образом:
Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки 492-545
Ботулинический нейротоксин типа B: аминокислотные остатки 472-532
Ботулинический нейротоксин типа C1: аминокислотные остатки 494-543
Ботулинический нейротоксин типа D: аминокислотные остатки 489-539
Ботулинический нейротоксин типа E: аминокислотные остатки 466-515
Ботулинический нейротоксин типа F: аминокислотные остатки 485-536
Ботулинический нейротоксин типа G: аминокислотные остатки 489-538
Столбнячный нейротоксин: аминокислотные остатки 506-556
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты (как описано выше) является модификацией поверхностного аминокислотного остатка. Поверхностные аминокислотные остатки являются аминокислотными остатками, присутствующими на внешней части свернутого белка и, таким образом, доступными для окружающего растворителя, в отличие от аминокислотных остатков, локализующихся внутри свернутого белка. Степень экспонирования аминокислотного остатка на поверхности и, таким образом, воздействия на него окружающего растворителя зависит от его положения в свернутом белке, а также от конформации, принимаемой белком. Модификация аминокислотного остатка с высокой степенью экспонирования на поверхности, таким образом, может иметь более значительный эффект в отношении изоэлектрической точки белка, чем модификация аминокислотного остатка с низкой степенью экспонирования на поверхности. В этой области известны способы определения экспонирования аминокислотного остатка на поверхности. В качестве примера, для вычисления степени экспонирования аминокислотных остатков на поверхности в указанном белке можно использовать компьютерную программу AreaIMol (часть пакета программ CCP4). Экспонируемые на поверхности аминокислотные остатки также можно определять посредством визуального осмотра кристаллической структуры белка (например, полученной посредством рентгеноструктурной кристаллографии). В одном из вариантов осуществления экспонируемый на поверхности аминокислотный остаток имеет суммарное значение AreaIMol по меньшей мере 40.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты включает модификацию аминокислотного остатка, выбранного из: остатка аспарагиновой кислоты, остатка глутаминовой кислоты, остатка гистидина, остатка аспарагина, остатка глутамина, остатка серина, остатка треонина, остатка аланина, остатка глицина, остатка валина, остатка лейцина и остатка изолейцина. Авторы настоящего изобретения определяли, что аминокислотные остатки из этой группы представляют собой особенно подходящие мишени для модификации по настоящему изобретению.
В одном из вариантов осуществления, где модификация аминокислоты включает модификацию аминокислотного остатка, выбранного из остатка аспарагиновой кислоты, остатка глутаминовой кислоты, остатка гистидина, остатка аспарагина, остатка глутамина, остатка серина, остатка треонина, остатка аланина, остатка глицина, остатка валина, остатка лейцина и остатка изолейцина (как описано выше), аминокислотный остаток заменяют остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток заменяют остатком аргинина. Таким образом, в одном из вариантов осуществления отрицательно заряженный остаток, полярный остаток или незаряженный остаток заменяют положительно заряженным остатком, таким образом, повышая соотношение положительного и отрицательного заряда и повышая pI клостридиального токсина.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна модификация аминокислоты (как описано выше) включает модификацию аминокислотного остатка аспарагина или аминокислотного остатка глутамина (незаряженные, полярные остатки). В одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток аспарагина или глутамина заменяют остатком лизина или остатком аргинина (положительно заряженные остатки). В одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток аспарагина или глутамина заменяют остатком лизина. В одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток аспарагина или глутамина заменяют остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A. Референсная последовательность BoNT/A имеет регистрационный номер UniProtKB P10845. В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A1.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/A.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или всех 55) аминокислоты, выбранной из:
D474, N476, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, D546, E558, E560, H561, I566, L568, N570, S571, L577, N578, A597, E599, A601, E620, V621, T623, D625, T631, N645, L647, D650, D651, I668, E670, A672, V675, S683, I685, A686, N687, N752, Q753, T755, E756, E757, E758, N760, N761, I762, N763, D825, I831, G832, T847, D848 и D858; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или всех 17) аминокислоты, выбранной из: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, I831, T847 и I849; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6) аминокислоты, выбранной из: S564, L647, D650, D651, T847 и I849; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6) аминокислоты, выбранной из: N476, N763, N687, E599, I831 и N761; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или всех 5) аминокислоты, выбранной из: N578, V675, I685, T755 и E757; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/B. Референсная последовательность BoNT/B имеет регистрационный номер UniProtKB P10844.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/B.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/B, указанный сконструированный BoNT/B содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или всех 40) аминокислоты, выбранной из: V443, G444, D453, S468, D533, E534, N535, T545, L548, D549, I550, D552, S557, L564, S566, N582, V584, N609, L619, N632, E633, G637, A646, I655, E657, V662, E669, S670, I672, D673, N739, I740, N748, N750, I818, G819, T834, I842, N845 и S858; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/B до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/B, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/C1. Референсная последовательность BoNT/C1 имеет регистрационный номер UniProtKB P18640.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/C1.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/C1, указанный сконструированный BoNT/C1 содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или всех 50) аминокислоты, выбранной из: L451, D452, C453, E455, V472, T474, D475, L478, N483, E484, E485, E487, I489, L555, S556, D557, N558, E560, D561, E569, N574, S575, T584, G592, Q594, G596, D617, N640, S641, V642, G645, N646, E661, E665, T667, A670, S678, V680, Q681, E682, S750, G751, S759, Q760, V826, G827, N842, T843, N847 и N853; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/C1 до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/C1, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/D. Референсная последовательность BoNT/D имеет регистрационный номер UniProtKB P19321.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/D.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/D, указанный сконструированный BoNT/D содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или всех 62) аминокислоты, выбранной из: Q469, E470, E473, N474, D479, E480, N482, V483, Q484, N485, S487, D488, S552, N553, N554, V555, E556, N557, I558, L560, T562, S563, V564, G569, S571, N572, G588, Q590, T614, D616, S619, S622, N636, S637, L639, G641, N642, E657, E661, T663, A666, V669, S674, I676, Q677, E678, S746, G747, D749, E751, N752, I753, Q756, N818, V822, G823, E837, N838, T839, N843, N849 и N850; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/D до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/B, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E. Референсная последовательность BoNT/E имеет регистрационный номер UniProtKB Q00496. В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E3.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/E.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или всех 52) аминокислоты, выбранной из: D474, N476, E479, E480, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, E492, L496, D497, Q500, Q501, L504, N507, D509, N510, N514, S516, E518, Q527, L530, N533, I534, E535, N539, Y548, I566, L568, D589, A597, E599, A601, L604, Y612, E620, N645, L647, Y648, D651, E737, E741, Y803, Y824, D825, G828, I831, G832 и D835; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/F. Референсная последовательность BoNT/F имеет регистрационный номер UniProtKB YP_001390123.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/F.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/F, указанный сконструированный BoNT/F содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или всех 86) аминокислоты, выбранной из: N463, E464, N468, T469, D474, D475, T476, T477, N478, N482, N485, N495, I499, Q501, I502, Q505, T506, N508, T509, V511, D513, D521, S522, S526, E527, I528, E529, V534, D535, L536, E549, G550, T552, N553, S558, E566, E567, S568, V586, H587, Q608, D613, A616, D617, S619, N630, N633, N639, E654, V656, E658, L660, T663, L665, V666, S671, I673, G674, S675, S676, E677, N678, T746, N751, L753, E754, E756, N758, I759, N760, N761, S799, S821, I822, N840, S841, E845, L846, S847, S848, T850, N851, D852, I854, L855 и I856; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/F до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/F в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/G. Референсная последовательность BoNT/G имеет регистрационный номер UniProtKB Q60393.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина BoNT/G.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/G, указанный сконструированный BoNT/G содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или всех 36) аминокислоты, выбранной из: N480, Q482, N483, N484, T485, E487, D540, N562, N570, N571, N572, T588, V589, T615, D621, N637, E638, E642, N643, I660, E662, I667, E674, S675, V677, G678, N679, S747, N755, D757, L823, D839, I841, D844, S846 и L847; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/G до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/G, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин является TeNT. Референсная последовательность TeNT имеет регистрационный номер UniProtKB P04958.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в домене HN клостридиального токсина TeNT.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является TeNT, указанный сконструированный TeNT содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или всех 49) аминокислоты, выбранной из: A457, S458, L459, D461, L462, E486, E487, Q490, D491, N497, N504, D557, T571, T572, L573, Q574, N580, S581, N588, S589, T590, S598, Q605, G606, Q608, T631, I633, S640, Q655, E658, G659, N660, E675, I677, E679, T681, V684, A691, E692, S694, T695, Q696, A772, D773, E774, S862, N866, L867 и D868; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного TeNT до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного TeNT в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/A.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/A, указанный сконструированный BoNT/A содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 или всех 28) аминокислоты, выбранной из: N5, Q7, N9, D12, N15, Q31, D58, N60, D74, N82, T122, D124, E126, Q139, D141, E281, L284, S295, Q311, D326, D334, N377, TYR387, N394, N396, N410, M411 и N418; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/B.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/B, указанный сконструированный BoNT/B содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или всех 41, аминокислоты, выбранной из: N6, N7, N9, N11, D12, N16, N17, N18, D41, E48, E57, N60, D75, D77, N80, E127, N130, N144, E147, E149, E185, N216, D245, E253, N316, D333, E335, D341, N385, D388, N389, E390, E395, E396, D402, D404, E406, E408, Q419, E423 и E427; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/B до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/B, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/C1.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/C1, указанный сконструированный BoNT/C1 содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 или всех 41) аминокислоты, выбранной из: N6, N7, N9, D12, D15, N18, N31, E32, N55, N59, N75, N120, N121, N125, D128, Q142, N145, N177, N178, Q183, E184, D208, E211, Q247, N255, N311, E335, E339, N343, N368, N386, D389, D390, N391, Q396, N405, N407, N425, E427, D442 и N448; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/C1 до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/C1, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/D.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/D, указанный сконструированный BoNT/D содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 или всех 34) аминокислоты, выбранной из: D7, N9, D12, N15, D16, N17, D53, D73, D119, E124, E139, E142, N143, Q177, Q178, N180, E184, E255, N308, D335, N336, N339, N343, N368, N386, D389, D390, N391, D397, N403, N407, E409, E416 и N443; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/D до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/D, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/E.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 35 или всех 37) аминокислоты, выбранной из: N5, N8, N10, D11, N14, D15, Q27, E28, Q53, N72, Q75, D117, N118, D121, N122, Q123, N138, N169, N170, N195, Q237, ILE244, Q290, N293, N297, D312, Q344, N362, N365, D366, N370, E373, N378, N379, N383, N390 и T397; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20) аминокислоты, выбранной из: N5, N8, N10, D11, N14, D15, Q27, E28, N72, Q75, N118, D121, N122, Q123, N138, Q237, Q290, N297, N362, N365, D366, N378 и N379; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или всех 19) аминокислоты, выбранной из: N5, N8, N10, D11, N14, D15, N72, Q75, N118, N122, Q123, N138, Q237, Q290, Q297, N362, D366, N378 и N379; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6) аминокислоты, выбранной из: N8, N10, Q75, Q123, N138 и Q237; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/E, указанный сконструированный BoNT/E содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2 или всех 3) аминокислоты, выбранной из: Q123, N138 и Q237; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/E, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/F.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/F, указанный сконструированный BoNT/F содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, или всех 35) аминокислоты, выбранной из: N6, N9, N11, D12, N15, D16, D17, E28, D55, D60, D74, N76, E105, E121, N126, E127, N144, D185, N211, Q252, N305, E310, D312, N314, N329, D331, N379, D382, D383, D384, E390, N396, N400, D414 и D418; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/F до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/F, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи клостридиального токсина BoNT/G.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является BoNT/G, указанный сконструированный BoNT/G содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 35 или всех 38) аминокислоты, выбранной из: N4, N7, N9, N11, D12, N15, D17, E48, Q55, D57, N60, D75, D127, Q144, E148, D149, Q150, N178, E185, E208, D211, E255, D315, D332, N334, D340, E383, D387, N388, Q393, N394, E395, N403, E407, E418, E422, E426 и N443; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/G до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/G, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали конкретные аминокислоты, представляющие собой предпочтительные мишени для модификации аминокислоты в легкой цепи TeNT.
В одном из вариантов осуществления, где сконструированный клостридиальный токсин является TeNT, указанный сконструированный TeNT содержит модификацию по меньшей мере одной (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 35 или всех 36) аминокислоты, выбранной из: N6, N7, N15, N16, D17, D31, E51, E57, N60, N76, N101, D126, D143, N167, D179, N180, E251, Q257, N313, N316, D318, D335, N337, Q339, N368, N387, D390, D391, N395, D396, E403, D406, E410, N421, D427 и E450; и указанные модификации аминокислот повышают изоэлектрическую точку (pI) сконструированного TeNT до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 (например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1) единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного TeNT, в котором отсутствуют указанные модификации аминокислот. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина или остатком аргинина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком лизина. В одном из вариантов осуществления указанная модификация включает замену аминокислоты остатком аргинина.
Настоящее изобретение подходит для использования по отношению ко многим разновидностям клостридиального токсина. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин "клостридиальный токсин" включает токсины, продуцируемые C. botulinum (ботулинический нейротоксин серотипов A, B, C1, D, E, F и G), C. tetani (столбнячный нейротоксин), C. butyricum (ботулинический нейротоксин серотипа E) и C. baratii (ботулинический нейротоксин серотипа F), а также модифицированные клостридиальные токсины или производные, полученные из любых из изложенных выше. Термин "клостридиальный токсин" также включает ботулинический нейротоксин серотипа H.
Ботулинический нейротоксин (BoNT) продуцируется C. botulinum в форме крупного белкового комплекса, состоящего из самого BoNT, в комплексе с рядом акцессорных белков. В настоящее время существует восемь различных классов ботулинического нейротоксина, а именно: ботулинический нейротоксин серотипов A, B, C1, D, E, F, G и H, все из которых обладают схожими структурами и механизмами действия. Различные серотипы BoNT можно различать с учетом инактивации специфическими нейтрализующими антисыворотками, при этом такая классификация по серотипу коррелирует с процентом идентичности последовательности на уровне аминокислот. Белки BoNT указанного серотипа дополнительно разделяют на различные подтипы с учетом процента идентичности аминокислотной последовательности.
BoNT абсорбируются в желудочно-кишечном тракте, после поступления в общий кровоток связываются с пресинаптической мембраной окончаний холинергических нервов и предотвращают высвобождение их нейромедиатора ацетилхолина. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G расщепляют синаптобревин/везикуло-ассоциированный мембранный белок (VAMP); BoNT/C1, BoNT/A и BoNT/E расщепляют синаптосомально-ассоциированный белок массой 25 кДа (SNAP-25); и BoNT/C1 расщепляет синтаксин.
Столбнячный токсин продуцируется одним серотипом C. tetani. C. butyricum продуцирует BoNT/E, в то время как C. baratii продуцирует BoNT/F.
Термин "клостридиальный токсин" также предназначен для включения модифицированных клостридиальных токсинов и их производных, включая, в качестве неограничивающих примеров, описываемые ниже. Модифицированный клостридиальный токсин или производное может содержать одну или более аминокислот, модифицированных по сравнению с нативной (немодифицированной) формой клостридиального токсина или может содержать одну или более встроенных аминокислот, не присутствующих в нативной (немодифицированной) форме клостридиального токсина. В качестве примера, модифицированный клостридиальный токсин может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или более доменах относительно нативной (немодифицированной) последовательности клостридиального токсина. С помощью таких модификаций можно модифицировать функциональные аспекты токсина, например, биологическую активность или устойчивость. Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным модифицированным клостридиальным токсином, или производным сконструированного модифицированного клостридиального токсина, или производным сконструированного клостридиального токсина.
Модифицированный клостридиальный токсин может иметь одну или более модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (такой как модифицированный домен HC), где указанная модифицированная тяжелая цепь связывается с нейронами-мишенями с более высокой или более низкой аффинностью, чем нативный (немодифицированный) клостридиальный токсин. Такие модификации в домене HC могут включать модифицированные остатки в участке связывания ганглиозида домена HC или участке связывания белка (SV2 или синаптотагмина), изменяющие связывание с рецептором ганглиозида и/или рецептором белка нейрона-мишени. Примеры таких модифицированных клостридиальных токсинов описывают в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Модифицированный клостридиальный токсин может иметь одну или более модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например, модификации в связывающем субстрат или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность модифицированной LC в отношении белка SNARE. Примеры таких модифицированных клостридиальных токсинов описывают в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Модифицированный клостридиальный токсин может содержать одну или более модификаций, повышающих или снижающих биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного клостридиального токсина. Например, модифицированный клостридиальный токсин может содержат лейциновый или тирозиновый мотив, где указанный мотив повышает или снижает биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного клостридиального токсина. Подходящие лейциновые мотивы включают xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL и xExxxLM (где x является любой аминокислотой). Подходящие тирозиновые мотивы включают Y-x-x-Hy (где Hy является гидрофобной аминокислотой). Примеры модифицированных клостридиальных токсинов, содержащих лейциновые и тирозиновые мотивы, описывают в WO 2002/08268, таким образом, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Термин "клостридиальный токсин" предназначен для включения гибридных и химерных клостридиальных токсинов. Гибридный клостридиальный токсин содержит, по меньшей мере, часть легкой цепи из одного клостридиального токсина или его подтипа и, по меньшей мере, часть тяжелой цепи из другого клостридиального токсина или подтипа клостридиального токсина. В одном из вариантов осуществления гибридный клостридиальный токсин может содержать целую легкую цепь из одного подтипа клостридиального токсина и тяжелую цепь из другого подтипа клостридиального токсина. В другом варианте осуществления химерный клостридиальный токсин может содержать часть (например, связывающий домен) тяжелой цепи одного подтипа клостридиального токсина с другой частью тяжелой цепи из другого подтипа клостридиального токсина. Аналогично или альтернативно, терапевтический элемент может содержать части легкой цепи из разных клостридиальных токсинов. Такие гибридные или химерные клостридиальные токсины применимы, например, в качестве средств достижения терапевтических благоприятных эффектов таких клостридиальных токсинов у пациентов, иммунологически резистентных к указанному подтипу клостридиального токсина, пациентов, которые могут иметь концентрацию рецепторов к указанному связывающему домену тяжелой цепи клостридиального токсина ниже средней, или пациентов, которые могут иметь протеаза-резистентный вариант мембранного или везикулярного субстрата токсина (например, SNAP-25, VAMP и синтаксина). Гибридные и химерные клостридиальные токсины описывают в US 8071110, включенном, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным гибридным клостридиальным токсином или сконструированным химерным клостридиальным токсином.
Термин "клостридиальный токсин" предназначен для включения перенаправленных клостридиальных токсинов. В перенаправленном клостридиальном токсине клостридиальный токсин модифицируют так, чтобы он включал экзогенный лиганд, известный как направляющий фрагмент (TM). TM выбирают так, чтобы он обеспечивал специфичность связывания для желаемой клетки-мишени, и в качестве части процесса перенаправления можно удалять нативную связывающую часть клостридиального токсина (например, домен HC или домен HCC). Технологию перенаправления описывают, например, в: EP-B-0689459; WO 1994/021300; EP-B-0939818; US 6461617; US 7192596; WO 1998/007864; EP-B-0826051; US 5989545; US 6395513; US 6962703; WO 1996/033273; EP-B-0996468; US 7052702; WO 1999/017806; EP-B-1107794; US 6632440; WO 2000/010598; WO 2001/21213; WO 2006/059093; WO 2000/62814; WO 2000/04926; WO 1993/15766; WO 2000/61192 и WO 1999/58571; все из которых включены, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным перенаправленным клостридиальным токсином.
Настоящее изобретение также включает клостридиальные токсины, имеющие ненативный участок расщепления протеазой. В таких клостридиальных токсинах нативный участок расщепления протеазой (также известный как участок активации, как описано выше) модифицируют или заменяют участком расщепления протеазой, не являющимся нативными для этого клостридиального токсина (т.е. экзогенным участком расщепления). Для такого участка потребуется экзогенная протеаза для расщепления, что делает возможным улучшенный контроль времени и локализации расщепления. Ненативные участки расщепления протеазой, которые можно использовать в клостридиальных токсинах, включают:
Энтерокиназа (DDDDK↓)
Фактор Xa (IEGR↓/IDGR↓)
TEV (Вирус гравировки табака) (ENLYFQ↓G)
Тромбин (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP).
Дополнительные участки расщепления протеазой включают последовательности распознавания, расщепляемые нецитотоксической протеазой, например, легкой цепью клостридиального нейротоксина. Они включают последовательности распознавания белка SNARE (например, SNAP-25, синтаксина, VAMP), расщепляемые нецитотоксическими протеазами, такими как легкая цепь клостридиального нейротоксина. Клостридиальные токсины, содержащие ненативные участки расщепления протеазой, описывают в US 7132259, EP 1206554-B2 и US 2007/0166332, все из которых включены, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Термин "участок расщепления протеазой" также включает интеин, являющийся саморасщепляющейся последовательностью. Реакция автономного сплайсинга является контролируемой, например, посредством варьирования концентрации присутствующего восстановителя.
Настоящее изобретение также включает клостридиальные токсины, содержащие "деструктивный участок расщепления". В указанных клостридиальных токсинах ненативный участок расщепления протеазой встраивают в клостридиальный токсин в место, выбранное таким образом, что расщепление в указанном участке будет снижать активность или инактивировать клостридиальный токсин. Деструктивный участок расщепления протеазой может быть восприимчивым к расщеплению локальной протеазой в случае, если клостридиальный токсин после введения мигрирует в нецелевой участок. Подходящие ненативные участки расщепления протеазой включают описываемые выше. Клостридиальные токсины, содержащие деструктивный участок расщепления, описывают в WO 2010/094905 и WO 2002/044199, включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению, в частности, их компонент легкой цепи, можно пегилировать, это может способствовать повышению стабильности, например, длительности действия компонента легкой цепи. Пегилирование является особенно предпочтительным, если легкая цепь содержит протеазу BoNT/A, B или C1. Пегилирование, предпочтительно, включает добавление PEG на N-конец компонента легкой цепи. В качестве примера, N-конец легкой цепи можно удлинять на один или более аминокислотных остатков (например, цистеина), которые могут быть одинаковыми или разными. Один или более указанных аминокислотных остатков могут иметь свою собственную молекулу PEG, прикрепленную к нему (например, ковалентно прикрепленную). Пример этой технологии описывают в WO2007/104567, таким образом, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению могут не содержать комплексированные белки, присутствующие в природном комплексе клостридиального токсина.
Сконструированный клостридиальный токсин по настоящему изобретению также может содержать ограниченное количество нестандартных аминокислот. Таким образом, в дополнение к 20 стандартным аминокислотам, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) можно заменять аминокислотными остатками сконструированных клостридиальных токсинов по настоящему изобретению. Аминокислотные остатки клостридиального полипептида можно заменять ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, не кодируемых генетическим кодом, и неприродных аминокислот. Сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению также могут содержать неприродные аминокислотные остатки.
Неприродные аминокислоты включают, в качестве неограничивающих примеров, транс-3-метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В этой области известно несколько способов включения неприродных аминокислотных остатков в белки. Например, можно использовать систему in vitro, где нонсенс-мутации супрессируют с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. В этой области известны способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, осуществляют в бесклеточной системе, содержащей экстракт E. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают посредством хроматографии. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию осуществляют в ооцитах Xenopus посредством микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем способе клетки E. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, подлежащей замене (например, фенилаланина), и в присутствие желаемых неприродных аминокислот (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Неприродная аминокислота встраивается в полипептид вместо природной. См., Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994.
Сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению можно получать с использованием технологий рекомбинантных нуклеиновых кислот. Таким образом, в одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин (как описано выше) является рекомбинантным сконструированным клостридиальным токсином.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте (например, ДНК), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированный клостридиальный токсин, как описано выше. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты получают как часть ДНК-вектора, содержащего промотор и терминатор.
В предпочтительном варианте осуществления вектор имеет промотор, выбранный из:
| Промотор | Средство индукции | Типичные условия индукции |
| Tac (гибридный) | IPTG | 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) |
| AraBAD | L-арабиноза | 0,2% (0,002-0,4%) |
| Оператор T7-lac | IPTG | 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) |
В другом предпочтительном варианте осуществления вектор имеет промотор, выбранный из:
| Промотор | Средство индукции | Типичные условия индукции |
| Tac (гибридный) | IPTG | 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) |
| AraBAD | L-арабиноза | 0,2% (0,002-0,4%) |
| Оператор T7-lac | IPTG | 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) |
| Оператор T5-lac | IPTG | 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) |
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным в этой области. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты можно получать способами химического синтеза. Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно получать способами молекулярной биологии.
Конструкцию ДНК по настоящему изобретению, предпочтительно, конструируют in silico, а затем синтезируют общепринятыми способами синтеза ДНК.
Указанную выше информацию о последовательности нуклеиновой кислоты, необязательно, модифицируют в зависимости от отклонения от равномерности использования кодона с учетом конечной системы экспрессии клетки-хозяина (например, E. coli), подлежащей использованию.
В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сконструированный клостридиальный токсин, как описано выше, является последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99%) идентичности последовательности по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6.
Настоящее изобретение также относится к полипептидам, кодируемым последовательностями нуклеиновой кислоты, как описано выше. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99%) идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным BoNT/A, как описано выше, и указанный сконструированный BoNT/A содержит (или состоит из) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 99,9%) идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным BoNT/A, как описано выше, и указанный сконструированный BoNT/A содержит (или состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 3 или 5.
В одном из аспектов изобретение относится к полипептиду, содержащему (или состоящему из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 3 или 5.
В одном из аспектов изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей сконструированный клостридиальный токсин, как описано выше, где указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 99,9%) идентичности последовательности по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит (или состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, 4 или 6.
В одном из аспектов изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей (или состоящей из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, 4 или 6.
В одном из вариантов осуществления сконструированный клостридиальный токсин по изобретению является сконструированным BoNT/E, как описано выше, и указанный сконструированный BoNT/E содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 99,9%) идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 7.
В одном из аспектов изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей сконструированный клостридиальный токсин, как описано выше, где указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 99,9%) идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 8.
"Процент идентичность последовательности" между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности можно вычислять как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, разделенное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При вычислениях % идентичности последовательности также можно принимать во внимание количество пропусков и длину каждого пропуска, который необходимо включать для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнения последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями можно осуществлять с использованием специальных математических алгоритмов, таких как BLAST, известных специалисту в этой области.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения одноцепочечного белка сконструированного клостридиального токсина, имеющего легкую цепь и тяжелую цепь, включающему экспрессию нуклеиновой кислоты (указанной нуклеиновой кислоты, описываемой выше) в подходящей клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина для получения гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный белок сконструированного клостридиального токсина, и выделение одноцепочечного белка сконструированного клостридиального токсина.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу активации сконструированного клостридиального токсина, включающему получение одноцепочечного белка сконструированного клостридиального токсина, получаемого способом получения одноцепочечного белка сконструированного клостридиального токсина, как описано выше, приведение полипептида в контакт с протеазой, расщепляющей полипептид по участку распознавания (участку расщепления), локализованному между легкой цепью и тяжелой цепью, таким образом, преобразование полипептида в двухцепочечный полипептид, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены дисульфидной связью.
Сконструированные клостридиальные токсины по изобретению можно использовать для профилактики или лечения конкретного медицинских или косметических заболеваний и состояний. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к сконструированному клостридиальному токсину, как описано выше, для применения в медицине.
В связанном аспекте настоящее изобретение относится к сконструированному клостридиальному токсину, как описано выше, для применения в профилактике или лечении заболевания или состояния, выбранного из: косоглазия, блефароспазма, косоглазия, дистонии (например, спастической дистонии, оромандибулярной дистонии, фокальной дистонии, тардивной дистонии, ларингеальной дистонии, дистонии конечностей, спастической кривошеи), кривошеи (например, спастической кривошеи), в косметологии, когда будут получать пользу от ограничения способностей клеток/мышц (посредством отрицательной регуляции или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, содружественного косоглазия, вертикального косоглазия, паралича латеральной прямой мышцы, нистагма, дистироидной миопатии), писчего спазма, блефароспазма, бруксизма, болезни Вильсона-Коновалова, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности по причине хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушениям контроля мочевого пузыря, анизмуса, спазма спины, спазма конечности, головных болей напряжения, синдрома мышцы levator ani, расщепления позвоночника, тардивной дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, нарушения век, церебрального паралича, фокальной спастичности, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечности, тиков, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, обильного слюноотделения, избыточной желудочно-кишечной секреции, мышечной боли (например, боли при мышечных спазмах), головной боли (например, головной боли напряжения), межбровной складки, морщин, злокачественного новообразования, нарушений матки, урогенитальных нарушений, урогенитальных неврологических нарушений, хронического нейрогенного воспаления и нарушений гладких мышц.
При применении в настоящем изобретении используют фармацевтическую композицию, содержащую сконструированный клостридиальный токсин по меньшей мере с одним компонентом, выбранным из фармацевтически приемлемого носителя, эксципиента, вспомогательного вещества, пропеллента и/или соли.
Сконструированные клостридиальные токсины по настоящему изобретению можно составлять для перорального, парентерального введения, непрерывной инфузии, ингаляции или местного введения. Композиции, подходящие для инъекции, могут находиться в форме растворов, суспензий или эмульсий или сухих порошков, растворяемых или суспендируемых в подходящем наполнителе перед использованием.
В случае сконструированного клостридиального токсина, подлежащего местному введению, сконструированный клостридиальный токсин можно составлять в виде крема (например, для местного введения) или для подкожной инъекции.
Средства для местного введения могут включать аэрозоль или другой спрей (например, небулайзер). В связи с этим, аэрозольный состав сконструированного клостридиального токсина делает возможным введение в легкие и/или другие назальные, и/или бронхиальные, или дыхательные пути.
Сконструированные клостридиальные токсины по изобретению можно вводить пациенту посредством интратрахеальной или эпидуральной инъекции в позвоночник на уровне сегмента спинного мозга, участвующего в иннервации пораженного органа.
Предпочтительным путем введения является лапароскопическая и/или локализованная, в частности внутримышечная, инъекция.
Диапазоны доз для введения сконструированных клостридиальных токсинов по настоящему изобретению являются такими, чтобы достигать желаемого терапевтического эффекта. Следует понимать, что необходимый диапазон доз зависит от конкретной природы сконструированного клостридиального токсина или композиции, пути введения, природы состава, возраста пациента, природы, степени или тяжести состояния пациента, противопоказаний, если такие есть, и решения лечащего врача. Варианты этих уровней доз можно корректировать с использованием стандартных эмпирических способов оптимизации.
Подходящие суточные дозы (на кг массы пациента) находятся в диапазоне 0,0001-1 нг/кг, предпочтительно - 0,0001-0,5 нг/кг, более предпочтительно - 0,002-0,5 нг/кг, и особенно предпочтительно - 0,004-0,5 нг/кг. Единица дозирования может варьироваться от менее 1 пикограмм на 30 нг, но, как правило, будет находиться в диапазоне от 0,01 до 1 нг на дозу, которую можно вводить ежедневно или, предпочтительно, реже, например, еженедельно или раз в шесть месяцев.
Особенно предпочтительная схема дозирования основана на 0,05 нг сконструированного клостридиального токсина в виде однократной дозы. В связи с этим предпочтительные дозы находятся в диапазоне 1-100-кратной дозы (т.е. 0,05-5 нг).
Жидкие лекарственные формы, как правило, получают с использованием сконструированного клостридиального токсина и стерильного наполнителя, не содержащего пирогены. Сконструированный клостридиальный токсин, в зависимости от используемого наполнителя и концентрации, можно растворять или суспендировать в наполнителе. При получении растворов сконструированный клостридиальный токсин можно растворять в наполнителе, растворе, сделанном изотоническим, при необходимости, посредством добавления хлорида натрия и стерилизованном посредством фильтрации через стерильный фильтр асептическими способами перед наполнением подходящих стерильных сосудов или ампул и запаиванием. Альтернативно, если стабильность раствора является подходящей, раствор в закрытых контейнерах можно стерилизовать посредством автоклавирования. Преимущественно, в наполнителе можно растворять добавки, такие как буфер, солюбилизатор, стабилизатор, консервант или бактерицидное средство, суспендирующее средство или эмульгаторы и/или местные анестетики.
Сухие порошки, растворяемые или суспендируемые в подходящем наполнителе перед использованием, можно получать посредством наполнения стерильного контейнера предварительно стерилизованными ингредиентами асептическим способом в стерильной зоне. Альтернативно, ингредиенты можно растворять в подходящих контейнерах асептическим способом в стерильной зоне. Затем продукт лиофилизируют и контейнеры асептически закрывают.
Парентеральные суспензии, подходящие для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции, получают, по существу, тем же образом, за исключением того, что стерильные компоненты суспендируют в стерильном наполнителе вместо растворения, и стерилизацию нельзя осуществлять посредством фильтрации. Компоненты можно выделять в стерильном состоянии, или, альтернативно, их можно стерилизовать после выделения, например, посредством гамма-облучения.
Преимущественно, суспендирующее средство например, поливинилпирролидон включают в композиции для облегчения однородного распределения компонентов.
Введение по настоящему изобретению может обладать преимуществом разнообразия технологий введения, включая инкапсуляцию микрочастиц, вирусные системы доставки или использование аэрозоля высокого давления.
Краткое описание чертежей
Фигура 1.
Очистка CatHN_v1 (фиг. 1A), CatHN_v2 (фиг. 1B) и CatHN_v3 (фиг. 1C) с помощью SDS-PAGE.
Фигура 2.
Процентная доля расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга крысы (eSCN) в случае CatHN_v1. Эмбриональные нейроны спинного мозга крысы культивировали в течение трех недель и обрабатывали CatHN_v1 в течение 24 ч. перед вестерн-блоттингом с SNAP-25-специфическим антителом. Данные представляют собой среднее ±SEM для трех независимых экспериментов в трех параллелях.
Фигура 3.
Активность (t50) BoNT/A и CatHN_v1 в анализе диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD). Точки данных представляют собой отдельные препараты купола диафрагмы и среднее ± SEM. CatHN_v1 был статистически значимо более медленным, чем референсный белок BoNT/A (List Biological Laboratories). Односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета. ** p<0,01, *** p<0,001, **** p<0,0001 (односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета).
Фигура 4.
Процентная доля расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга крысы (eSCN) в случае CatHN_v2. Эмбриональные нейроны спинного мозга крысы культивировали в течение трех недель и обрабатывали CatHN_v2 в течение 24 ч. перед вестерн-блоттингом с SNAP-25-специфическим антителом. Данные представляют собой среднее ±SEM для трех независимых экспериментов в трех параллелях.
Фигура 5.
Активность (t50) BoNT/A и CatHN_v2 в анализе диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD). Точки данных представляют собой отдельные препараты купола диафрагмы и среднее ± SEM. CatHN_v2 являлся статистически эквивалентным референсному белку BoNT/A (List Biological Laboratories). Односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета. ** p<0,01, *** p<0,001, **** p<0,0001 (Односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета).
Фигура 6.
Процентная доля расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга крысы (eSCN) в случае CatHN_v3. Эмбриональные нейроны спинного мозга крысы культивировали в течение трех недель и обрабатывали CatHN_v3 в течение 24 ч. перед вестерн-блоттингом с SNAP-25-специфическим антителом. Данные представляют собой среднее ±SEM для трех независимых экспериментов в трех параллелях.
Фигура 7.
Активность (t50) BoNT/A и CatHN_v3 в анализе диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD). Точки данных представляют собой отдельные препараты купола диафрагмы и среднее ± SEM. CatHN_v3 был статистически значимо более медленным, чем референсный белок BoNT/A (List Biological Laboratories). Односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета. ** p<0,01, *** p<0,001, **** p<0,0001 (Односторонний ANOVA и критерий множественного сравнения Даннета).
Фигура 8.
Анализ изоэлектрофокусирования. Все три конструкции CatHN обладали повышенной наблюдаемой pI по сравнению с немодифицированным BoNT/A.
Фигура 9.
Очистка конструкции CatLC посредством SDS-PAGE.
Фигура 10.
Каталитическая активность CatLC по сравнению с референсном LC BoNT/E, при этом значения pEC50 получали с помощью набора для детекции BoTest A/E BoNT (BioSentinal кат. № A1004) по инструкциям производителя. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение для одного независимого эксперимента в трех параллелях.
Последовательности
SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v1".
SEQ ID NO: 2. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v1".
SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v2".
SEQ ID NO: 4. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v2".
SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v3".
SEQ ID NO: 6. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v3".
SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность сконструированного легкой цепи BoNT/E "CatLC".
SEQ ID NO: 8. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного легкой цепи BoNT/E "CatLC".
SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v1".
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDL NPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTI DTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIR FSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYY EMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKN VFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIV PKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLD KGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFN FDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKRRIALTNS VNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIP YIGPALNIGNMRYKRRFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNAL SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNIN FNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLКДАLLKYIYDNR GTLIGQVDRLKDKVNNTLSRDRPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDL SRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNS ISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTI TNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKE IKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTN IYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEI PDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSS RTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 2. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v1".
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGC ATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAG ATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCAC CGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAA AGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGC ATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAAC TGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGA GCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGT CACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGG ATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAA ATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTAC GGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCG GCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAG CTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTG AACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAG AGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAA ACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTG AATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGA ACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCA GAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTC TATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACA ACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGA AGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCA GCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATG AACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCC GAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTAC CTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAcgtCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGG CCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAA AGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAG ACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTC CGGCACTGAACATTGGCAACATGCgtTACAAAcgtcgTTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGG TGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTG GTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTA ATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCA GATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCA ATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCG ATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTT GAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAG GACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGA TTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCcgtGACcgtCCATTTCA ACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATC ATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATG CAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCT GTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATG TACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGA ACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTA TGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTAC TCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACC GTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCT GGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGT TATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATT TGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGA TAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGT ATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGA ACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAA CATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTG GCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCG GTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAA GATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAAT ATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGG GCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v2".
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDL NPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTI DTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIR FSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYY EMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKN VFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIV PKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLD KGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLKKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFN FDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNS VNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATKAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIP YIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIAKKVLTVQTIDNAL SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNKIK FNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLКДАLLKYIYDNR GTLKGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDL SRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNS ISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTI TNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKE IKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTN IYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEI PDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSS RTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 4. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v2".
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGC ATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAG ATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCAC CGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAA AGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGC ATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAAC TGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGA GCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGT CACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGG ATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAA ATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTAC GGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCG GCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAG CTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTG AACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAG AGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAA ACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTG AATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGA ACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCA GAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTC TATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACA ACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGA AGATAATTTTACCAACGACCTGAAgAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCA GCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATG AACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCC GAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTAC CTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGG CCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAA AGCCACTaAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAG ACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTC CGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGG TGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTG GTGTCCTACATCGCGAAgAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTA ATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCA GATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCA ATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAAgATTAAgTTCAATATCG ATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTT GAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAG GACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGA agGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCA ACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATC ATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATG CAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCT GTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATG TACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGA ACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTA TGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTAC TCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACC GTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCT GGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGT TATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATT TGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGA TAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGT ATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGA ACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAA CATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTG GCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCG GTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAA GATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAAT ATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGG GCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность сконструированного BoNT/A "CatHN_v3".
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDL NPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTI DTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIR FSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYY EMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKN VFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIV PKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLD KGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFN FDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNS VNEALLKPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIP YIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPKLGTFALVSYKANKVLTVQTIDNAL SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYKEKEKNNIN FNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLКДАLLKYIYDNR GTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDL SRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNS ISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTI TNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKE IKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTN IYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEI PDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSS RTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 6. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного BoNT/A "CatHN_v3".
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGC ATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAG ATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCAC CGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAA AGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGC ATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAAC TGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGA GCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGT CACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGG ATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAA ATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTAC GGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCG GCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAG CTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTG AACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAG AGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAA ACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTG AATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGA ACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCA GAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTC TATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACA ACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGA AGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCgAtACGAATATTGAAGCA GCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATG AACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCC GAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTAC CTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGG CCCTGCTGAAaCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAA AGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAG ACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTC CGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGG TGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGaaGTTGGGTACCTTCGCGCTG GTGTCCTACAagGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTA ATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCA GATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCA ATTATCAACTACCAATACAACCAGTACAaGGAAaAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCG ATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTT GAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAG GACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGA TTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCA ACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATC ATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATG CAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCT GTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATG TACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGA ACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTA TGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTAC TCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACC GTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCT GGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGT TATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATT TGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGA TAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGT ATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGA ACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAA CATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTG GCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCG GTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAA GATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAAT ATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGG GCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность сконструированного легкой цепи BoNT/E "CatLC".
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPD IIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLL PNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNA GAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTF KGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKD PRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALКДАQTNSSSNNNNNNNN NNLGIEGRISEFGSMPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGT TPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYL GNDNTPDNKFHIGDASAVEIKFSKGSQHILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGF GSIAIVTFSPEYSFRFNDNSINEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTTCIITQQKNPLIT NRKGINIEEFLTFGGNDLNIITVAQYNDIYTNLLNDYRKIASKLSKVQVSNPQLNPYKDIFQEK YGLDКДАSGIYSVNINKFDDILKKLYSFTEFDLATKFQVKCRETYIGQYKYFKLSNLLNDSIYN ISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIIKPITGRGLVKKIIRFAVDKLAAALEHHHHHH
SEQ ID NO: 8. Последовательность нуклеиновой кислоты сконструированного легкой цепи BoNT/E "CatLC".
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGG TCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCG GATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCT GGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAA AGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATT GCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGC CAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCT GATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCG TTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAG CGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTC CATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGG TCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAAC CATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCT GGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGAC AAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTG CCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTT CTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC CTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCG GGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCATGCCAAAAATCAACAGCTTTAATTACAATGA CCCTGTAAACGATCGTACCATCCTATACATAAAGCCGGGTGGGTGTCAAGAGTTCTACAAATCT TTCAATATTATGAAGAATATATGGATTATACCTGAGCGTAACGTTATTGGTACGACACCGCAAG ATTTTCATCCACCTACTTCGTTGAAGAACGGTGACTCTTCCTATTACGACCCCAATTATCTCCA GTCGGATGAAGAGAAGGACAGATTCCTTAAAATAGTAACCAAAATCTTTAACAGGATTAATAAC AATCTATCCGGAGGTATTTTGCTTGAAGAGCTTAGTAAAGCTAATCCTTACCTAGGTAACGATA ATACACCAGACAACAAGTTTCATATAGGCGATGCATCCGCCGTGGAAATCAAATTTAGCAAGGG ATCACAGCATATTCTCTTGCCCAACGTTATTATAATGGGGGCGGAACCAGATTTATTTGAAACA AATTCGAGTAATATTAGCCTGAGAAATAACTATATGCCGTCAAACCATGGGTTCGGTAGCATAG CGATCGTTACTTTTTCTCCCGAATACAGTTTTCGCTTCAATGATAATAGTATAAATGAGTTTAT CCAAGACCCCGCACTCACGCTTATGCACGAACTCATACACTCTTTACACGGCCTGTATGGCGCT AAGGGGATAACCACTACGTGTATCATTACTCAGCAAAAGAACCCATTGATAACGAACAGGAAGG GCATTAACATCGAGGAATTTCTTACATTTGGAGGCAACGATCTGAACATTATAACTGTCGCACA GTACAATGACATCTATACCAACTTACTAAATGATTATAGAAAAATCGCTTCTAAGTTATCCAAG GTTCAAGTCTCAAACCCTCAACTGAATCCGTATAAGGACATATTCCAAGAGAAATATGGATTAG ACAAAGACGCGTCAGGAATCTATTCGGTAAACATTAACAAATTCGACGATATTTTGAAGAAACT TTACAGCTTCACGGAGTTCGACTTGGCCACCAAATTCCAGGTCAAATGCCGAGAGACATACATC GGACAGTATAAGTATTTCAAGCTGTCGAATCTCCTGAATGATTCCATATACAACATTAGTGAGG GTTACAATATAAATAACCTAAAGGTGAATTTCCGAGGCCAAAACGCCAACCTAAATCCGCGCAT CATTAAACCCATCACAGGACGGGGGTTAGTGAAGAAAATAATCCGGTTTGCGGTCGACAAGCTT GCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCAC
Примеры
Следующие примеры служат для иллюстрирования конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничивают объем изобретения, определенный в формуле изобретения, каким-либо образом.
Пример 1
Идентификация предпочтительных аминокислот клостридиального токсина для модификации.
Аминокислоты, идентифицированные в качестве подходящих кандидатов для модификации (участки мутаций), выбирали с использованием ряда различных критериев.
1. Локализация остатка в молекуле BoNT (в HN, за исключением поясной области)
2. Локализация с учетом вторичной/третичной структуры;
3. Тип остатка;
4. Степень экспонирования на поверхности.
При селекции рассматривали кислые, нейтральные, полярные и гидрофобные остатки.
Экспонируемые остатки определяли с использованием AreaIMol из пакета CCP4. Каждую структуру анализировали с помощью AreaIMol, и экспонируемые остатки идентифицировали как имеющие суммарное значение выше 55.
Вторичные структуры в HN каждого подтипа и TeNT идентифицировали с использованием программы для определения вторичной структуры (Stride Web Interface). Области, описываемые как образующие α-спираль, β-тяж или 310-спираль, исключали.
Используемые последовательности
Регистрационные номера:
BoNT/A: P10845
BoNT/B: P10844
BoNT/C1: P18640
BoNT/D: P19321
BoNT/E: Q00496
BoNT/F: YP_001390123
BoNT/G: Q60393
Источник структурных данных
Кристаллические структуры BoNT/A (3BTA.pdb), BoNT/B (1EPW) и BoNT/E (3FFZ.pdb) получали из RCSB.
Моделирование гомологии BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G осуществляли с использованием LOOPP и следующих последовательностей, соответственно: P18640, P19321, YP_001390123, и Q60393.
Предпочтительные аминокислотные остатки клостридиального токсина для модификации в домене HN клостридиального токсина:
BoNT/A:
D474, N476, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, D546, E558, E560, H561, I566, L568, N570, S571, L577, N578, A597, E599, A601, E620, V621, T623, D625, T631, N645, L647, D650, D651, I668, E670, A672, V675, S683, I685, A686, N687, N752, Q753, T755, E756, E757, E758, N760, N761, I762, N763, D825, I831, G832, T847, D848 и D858
BoNT/B:
V443, G444, D453, S468, D533, E534, N535, T545, L548, D549, I550, D552, S557, L564, S566, N582, V584, N609, L619, N632, E633, G637, A646, I655, E657, V662, E669, S670, I672, D673, N739, I740, N748, N750, I818, G819, T834, I842, N845 и S858
BoNT/C1:
L451, D452, C453, E455, V472, T474, D475, L478, N483, E484, E485, E487, I489, L555, S556, D557, N558, E560, D561, E569, N574, S575, T584, G592, Q594, G596, D617, N640, S641, V642, G645, N646, E661, E665, T667, A670, S678, V680, Q681, E682, S750, G751, S759, Q760, V826, G827, N842, T843, N847 и N853
BoNT/D:
Q469, E470, E473, N474, D479, E480, N482, V483, Q484, N485, S487, D488, S552, N553, N554, V555, E556, N557, I558, L560, T562, S563, V564, G569, S571, N572, G588, Q590, T614, D616, S619, S622, N636, S637, L639, G641, N642, E657, E661, T663, A666, V669, S674, I676, Q677, E678, S746, G747, D749, E751, N752, I753, Q756, N818, V822, G823, E837, N838, T839, N843, N849 и N850
BoNT/E:
D474, N476, E479, E480, D484, N486, I487, E488, A489, A490, E491, E492, L496, D497, Q500, Q501, L504, N507, D509, N510, N514, S516, E518, Q527, L530, N533, I534, E535, N539, Y548, I566, L568, D589, A597, E599, A601, L604, Y612, E620, N645, L647, Y648, D651, E737, E741, Y803, Y824, D825, G828, I831, G832 и D835
BoNT/F:
N463, E464, N468, T469, D474, D475, T476, T477, N478, N482, N485, N495, I499, Q501, I502, Q505, T506, N508, T509, V511, D513, D521, S522, S526, E527, I528, E529, V534, D535, L536, E549, G550, T552, N553, S558, E566, E567, S568, V586, H587, Q608, D613, A616, D617, S619, N630, N633, N639, E654, V656, E658, L660, T663, L665, V666, S671, I673, G674, S675, S676, E677, N678, T746, N751, L753, E754, E756, N758, I759, N760, N761, S799, S821, I822, N840, S841, E845, L846, S847, S848, T850, N851, D852, I854, L855 и I856
BoNT/G:
N480, Q482, N483, N484, T485, E487, D540, N562, N570, N571, N572, T588, V589, T615, D621, N637, E638, E642, N643, I660, E662, I667, E674, S675, V677, G678, N679, S747, N755, D757, L823, D839, I841, D844, S846 и L847
TeNT:
A457, S458, L459, D461, L462, E486, E487, Q490, D491, N497, N504, D557, T571, T572, L573, Q574, N580, S581, N588, S589, T590, S598, Q605, G606, Q608, T631, I633, S640, Q655, E658, G659, N660, E675, I677, E679, T681, V684, A691, E692, S694, T695, Q696, A772, D773, E774, S862, N866, L867 и D868
Предпочтительные аминокислотные остатки клостридиального токсина для модификации в легкой цепи BoNT/E:
N5, N8, N10, D11, N14, D15, Q27, E28, N72, Q75, N118, D121, N122, Q123, N138, Q237, Q290, N297, N362, N365, D366, N378 и N379.
Пример 2
Дизайн сконструированных молекул BoNT/A
Получали три различных примера сконструированной молекулы BoNT/A по настоящему изобретению.
Используя способ, описываемый в примере 1, всего 55 остатков идентифицировали в качестве кандидатов для мутации в домене HN BoNT/A. Пригодность остатков дополнительно оценивали посредством визуального осмотра кристаллической структуры BoNT/A для получения списка из 11 предпочтительных кандидатов (N476, N763, N687, E599, I831, N761, N578, V675, I685, T755, E757). Дополнительные шесть остатков выбирали с учетом функциональных данных, свидетельствующих о том, что эти остатки поддаются мутации без неблагоприятного воздействия на функцию белка. Четыре из этих остатков находились в списке кандидатов (L647, D650, D651, T847), а два - нет (S564, I849). Учитывая 11 остатков из списка кандидатов и шесть из функциональных данных, всего для мутации выбирали 17 остатков.
Учитывая выбранные 17 остатков, получали 3 конструкции: CatHN_v1, CatHN_v2 и CatHN_v3. Мутации для конструкций CatHN представлены в таблице 3 ниже:
Таблица 3: Конструкции CatHN с указанными мутациями и вычисленной pI.
| Мутации | Количество мутаций | Вычисленная pI | Вычисленная ΔpI относительно BoNT/A (pI 6,4) | |
| CatHN_v1 | S564R, L647R, D650R, D651R, T847R, I849R |
6 | 7,4 | 1,0 |
| CatHN_v2 | N476K, N763K, N687K, E599K, I831K, N761K |
6 | 7,3 | 0,9 |
| CatHN_v3 | N578K, V675K, I685K, T755K, E757K | 5 | 7,1 | 0,7 |
[ΔpI=изменение изоэлектрической точки]
Очистка CatHN_v1, CatHN_v2 и CatHN_v3 представлена на фиг. 1A, 1B и 1C, соответственно.
Пример 3
Клонирование, экспрессия и очистка
Конструкции ДНК, кодирующие сконструированные молекулы BoNT/A, описываемые в примере 2, синтезировали, клонировали в экспрессирующий вектор pJ401, а затем трансформировали в BL21 (DE3) E. coli. Это делало возможной гиперэкспрессию растворимой формы рекомбинантных сконструированных молекул BoNT/A в E. coli.
Рекомбинантные сконструированные BoNT очищали классическими способами хроматография из лизатов E. coli. Использовали исходную стадию очистки с использованием катионообменной смолы, а затем промежуточную стадию очистки с использованием смолы с гидрофобными взаимодействиями. Затем рекомбинантный сконструированный одноцепочечный BoNT расщепляли посредством протеолиза, получая активированный двухцепочечный сконструированный BoNT. Затем использовали конечную стадию очистки для удаления оставшихся загрязнений.
Пример 4
Характеризация очищенных сконструированных BoNT
Сконструированные BoNT, описываемые в примере 2 выше, охарактеризовывали экспериментально.
Способность сконструированных BoNT проникать в нейроны и расщеплять SNAP-25 (мишень BoNT/A) оценивали с использованием эмбриональных нейронов спинного мозга крысы (eSCN). Активность сконструированных BoNT дополнительно оценивали с использованием анализа диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD).
CatH
N
_v1:
Первым набором добавляемых мутаций являлись замены аргинином:
S564R, L647R, D650R, D651R, T847R, I849R
Молекулу CatHN_v1 тестировали в анализе расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга крысы (eSCN) и обнаруживали, что она имеет активность, равносильную BoNT/A (BoNT/A) (фигура 2).
Положительный результат также получен в анализе диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD) (фигура 3).
CatH
N
_v2:
Вторым набором добавляемых мутаций являлись замены лизином:
N476K, N763K, N687K, E599K, I831K, N761K
Белок CatHN_v2 тестировали в анализе расщепления SNAP-25 eSCN и обнаруживали, что он сохранял способность проникать в клетки и расщеплять SNAP-25. В анализе mPNHD CatHN_v2 имел активность, равносильную BoNT/A (фигуры 4 и 5).
CatH
N
_v3:
Третьим набором добавляемых мутаций являлись замены лизином:
N578K, V675K, I685K, T755K, E757K
Молекулу CatHN_v3 тестировали в анализе расщепления SNAP-25 eSCN и обнаруживали, что она сохраняла способность проникать в клетки и расщеплять SNAP-25. Аналогично, в анализе mPNHD также получали положительный результат (фигуры 6 и 7).
Изоэлектрофокусирование
Все три конструкции CatHN обладали повышенной pI по сравнению с немодифицированным BoNT/A (фигура 8).
Пример 5
Модификации легкой цепи BoNT/E
По причине модульной организации ботулинического токсина конструкцию легкой цепи BoNT/E с N-концевой меткой мальтозо-связывающего белка (MBP) и C-концевой 6-гистидиновой меткой (6HT) использовали в качестве суррогата для анализа активности BoNT/E в случае мутации и его характеризации.
Получали конструкцию легкой цепи BoNT/E ("CatLC"), имеющую мутации, представленные в таблице ниже.
Таблица 4: Конструкция с указанными мутациями, вычисленной pI и вычисленной ΔpI.
| Мутации | Количество мутаций | Вычисленная pI | Вычисленная ΔpI относительно MBP-LC/E (pI 6,3) | |
| CatLC | Q123K N138K Q237K |
3 | 6,6 | 0,3 |
Конструкцию экспрессировали в клетках BL21 DE3 и очищали с использованием аффинной хроматографии. Очистка представлена на фигуре 9.
Оценка конструкции на каталитическую активность показала, что модифицированная легкая цепь сохраняла каталитическую активность немодифицированной легкой цепи (фигура 10).
Claims (71)
1. Способ получения модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), включающий замену аминокислоты BoNT/A лизином или аргинином с получением модифицированного BoNT/A, где указанная аминокислота выбрана из: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, I831, T847 и I849;
где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем указанная pI указанного BoNT/A, и
где указанный модифицированный BoNT/A, полученный указанным способом, сохраняет способности указанного BoNT/A, где указанными способностями являются связывание клетки-мишени, транслокация и расщепление целевых белков SNARE, и
где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
2. Способ по п.1, где указанная замена аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,5 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
3. Способ по п.1 или 2, где указанная замена аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на одну единицу pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная замена аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на две единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная замена аминокислоты повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/A до значения, составляющего на 2-5 единиц pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где модифицированный BoNT/A содержит по меньшей мере три замены аминокислот.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 95% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 98% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 99% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
11. Сконструированный ботулинический нейротоксин A (BoNT/A), содержащий:
замену аминокислоты, выбранной из: N476, S564, N578, E599, L647, D650, D651, V675, I685, N687, T755, E757, N761, N763, I831, T847 и I849 лизином или аргинином;
где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем pI BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена; и
pI по меньшей мере 6,6; и
где указанный сконструированный BoNT/A сохраняет способности указанного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена, где указанными способностями являются связывание клетки-мишени, транслокация и расщепление целевых белков SNARE; и
где указанный модифицированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
12. Сконструированный BoNT/A по п.11, где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на 0,5 единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
13. Сконструированный BoNT/A по п.11 или 12, где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на одну единицу pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
14. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-13, где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего по меньшей мере на две единицы pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
15. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-14, где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/A до значения, составляющего на 2-5 единиц pI больше, чем pI в других отношениях идентичного BoNT/A, в котором отсутствует указанная замена.
16. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-15, где сконструированный BoNT/A содержит по меньшей мере три замены аминокислот.
17. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-16, где указанный сконструированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 95% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
18. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-17, где указанный сконструированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 98% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
19. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-18, где указанный сконструированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 99% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
20. Сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-19, где указанный сконструированный BoNT/A:
a. кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 2, 4 и 6; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
21. Нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный BoNT/A по любому из пп.11-20 или получаемый способом по любому из пп.1-10.
22. Способ получения одноцепочечного белка сконструированного BoNT/A, содержащего легкую цепь и тяжелую цепь, включающий экспрессию нуклеиновой кислоты по п.21, содержащейся в ДНК-векторе в подходящей клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина для получения гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный белок сконструированного BoNT/A, и выделение одноцепочечного белка сконструированного BoNT/A, где указанная клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.
23. Способ активации сконструированного BoNT/A, включающий получение одноцепочечного белка сконструированного BoNT/A, получаемого способом по п.22, приведение полипептида в контакт с протеазой, расщепляющей полипептид по участку распознавания (участку расщепления), находящемуся между легкой цепью и тяжелой цепью, и преобразование полипептида в двухцепочечный полипептид, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены дисульфидной связью.
24. Применение сконструированного BoNT/A по любому из пп.11-20 или получаемого способом по любому из пп.1-10 или 23 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания или состояния, при которых показана терапия ботулиническим токсином.
25. Применение по п.24, где заболевание или состояние выбраны из: косоглазия, блефароспазма, косоглазия, дистонии (например, спастической дистонии, оромандибулярной дистонии, фокальной дистонии, тардивной дистонии, ларингеальной дистонии, дистонии конечности, спастической кривошеи), кривошеи (например, спастической кривошеи), в косметологии, когда будут получать пользу от ограничения способностей клеток/мышц (посредством отрицательной регуляции или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, содружественного косоглазия, вертикального косоглазия, паралича латеральной прямой мышцы, нистагма, дистироидной миопатии), писчего спазма, бруксизма, болезни Вильсона-Коновалова, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности по причине хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушениям контроля мочевого пузыря, анизмуса, спазма спины, спазма конечности, головных болей напряжения, синдрома мышцы levator ani, расщепления позвоночника, тардивной дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, нарушения век, церебрального паралича, фокальной спастичности, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечности, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, обильного слюноотделения, избыточной желудочно-кишечной секреции, мышечной боли (например, боли при мышечных спазмах), головной боли (например, головной боли напряжения), межбровной складки, морщин, злокачественного новообразования, нарушений матки, урогенитальных нарушений, урогенитальных неврологических нарушений, хронического нейрогенного воспаления и нарушений гладких мышц.
26. Способ получения модифицированного ботулинического нейротоксина E (BoNT/E), включающий замену аминокислоты BoNT/E лизином или аргинином с получением модифицированного BoNT/E, где указанная аминокислота выбрана из: Q123, N138 и Q237,
где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) модифицированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем указанная pI указанного BoNT/E, и
где указанный модифицированный BoNT/E, полученный указанным способом, сохраняет способности указанного BoNT/E, где указанными способностями являются связывание клетки-мишени, транслокация и расщепление целевых белков SNARE, и
где указанный модифицированный BoNT/E:
a. содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.
27. Сконструированный ботулинический нейротоксин E (BoNT/E), содержащий:
замену аминокислоты, выбранной из: Q123, N138 и Q237, лизином или аргинином;
где указанная замена повышает изоэлектрическую точку (pI) сконструированного BoNT/E до значения, составляющего по меньшей мере на 0,2 единицы pI больше, чем pI BoNT/E, в котором отсутствует указанная замена; и
pI по меньшей мере 6,2; где указанный сконструированный BoNT/E сохраняет способности указанного BoNT/E, в котором отсутствует указанная замена, где указанными способностями являются связывание клетки-мишени, транслокация и расщепление целевых белков SNARE; и
где указанный BoNT/E:
a. содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8; и/или
b. содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.
28. Нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный BoNT/E по п.27 или получаемый способом по п.26.
29. Способ получения одноцепочечного белка сконструированного BoNT/E, содержащего легкую цепь и тяжелую цепь, включающий экспрессию нуклеиновой кислоты по п.28, содержащейся в ДНК-векторе в подходящей клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина для получения гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный белок сконструированного BoNT/E, и выделение одноцепочечного белка сконструированного BoNT/E, где указанная клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.
30. Способ активации сконструированного BoNT/E, включающий получение одноцепочечного белка сконструированного BoNT/E, получаемого способом по п.29, приведение полипептида в контакт с протеазой, расщепляющей полипептид по участку распознавания (участку расщепления), находящемуся между легкой цепью и тяжелой цепью, и преобразование полипептида в двухцепочечный полипептид, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены дисульфидной связью.
31. Применение сконструированного BoNT/E по п.27, или получаемого способом по п.26 или 30, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания или состояния, при которых показана терапия ботулиническим токсином.
32. Применение по п.31, где заболевание или состояние выбраны из: косоглазия, блефароспазма, косоглазия, дистонии (например, спастической дистонии, оромандибулярной дистонии, фокальной дистонии, тардивной дистонии, ларингеальной дистонии, дистонии конечности, спастической кривошеи), кривошеи (например, спастической кривошеи), в косметологии, когда будут получать пользу от ограничения способностей клеток/мышц (посредством отрицательной регуляции или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, содружественного косоглазия, вертикального косоглазия, паралича латеральной прямой мышцы, нистагма, дистироидной миопатии), писчего спазма, бруксизма, болезни Вильсона-Коновалова, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности по причине хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушениям контроля мочевого пузыря, анизмуса, спазма спины, спазма конечности, головных болей напряжения, синдрома мышцы levator ani, расщепления позвоночника, тардивной дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, нарушения век, церебрального паралича, фокальной спастичности, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечности, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, обильного слюноотделения, избыточной желудочно-кишечной секреции, мышечной боли (например, боли при мышечных спазмах), головной боли (например, головной боли напряжения), межбровной складки, морщин, злокачественного новообразования, нарушений матки, урогенитальных нарушений, урогенитальных неврологических нарушений, хронического нейрогенного воспаления и нарушений гладких мышц.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/GB2015/050043 WO2016110662A1 (en) | 2015-01-09 | 2015-01-09 | Cationic neurotoxins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017128211A3 RU2017128211A3 (ru) | 2019-02-11 |
| RU2017128211A RU2017128211A (ru) | 2019-02-11 |
| RU2733493C2 true RU2733493C2 (ru) | 2020-10-02 |
Family
ID=52424029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128211A RU2733493C2 (ru) | 2015-01-09 | 2015-01-09 | Катионные нейротоксины |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10647750B2 (ru) |
| EP (2) | EP3242884B1 (ru) |
| JP (1) | JP6601922B2 (ru) |
| CN (2) | CN107108703B (ru) |
| DK (1) | DK3242884T3 (ru) |
| ES (1) | ES2873479T3 (ru) |
| HK (1) | HK1245292A1 (ru) |
| HU (1) | HUE053935T2 (ru) |
| PL (1) | PL3242884T3 (ru) |
| PT (1) | PT3242884T (ru) |
| RU (1) | RU2733493C2 (ru) |
| TW (1) | TWI700289B (ru) |
| WO (1) | WO2016110662A1 (ru) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201718627A (zh) * | 2015-06-11 | 2017-06-01 | 梅茲製藥有限兩合公司 | 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞 |
| GB201517450D0 (en) * | 2015-10-02 | 2015-11-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Method |
| AU2017227978B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-03-10 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Composition comprising botulinum toxin |
| GB201607901D0 (en) * | 2016-05-05 | 2016-06-22 | Ipsen Biopharm Ltd | Chimeric neurotoxins |
| US11286473B2 (en) * | 2016-07-08 | 2022-03-29 | Children's Medical Center Corporation | Botulinum neurotoxin and its derivatives |
| TW201814045A (zh) * | 2016-09-16 | 2018-04-16 | 英商艾普森生物製藥有限公司 | 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法 |
| JP2020511548A (ja) * | 2017-03-22 | 2020-04-16 | ボンチ インコーポレイテッド | 治療用のボツリヌス神経毒素 |
| WO2018233813A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM TOXINS WITH INCREASED DURATION |
| WO2019007509A1 (en) | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM NEUROTOXINS WITH INCREASED DURATION |
| GB201815817D0 (en) * | 2018-09-28 | 2018-11-14 | Ispen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop |
| US20220016221A1 (en) | 2018-12-05 | 2022-01-20 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of symptoms of traumatic brain injury |
| KR20210129682A (ko) * | 2019-02-20 | 2021-10-28 | 리그레사 메디컬, 인코포레이티드 | 조성물을 국소화시키는 방법 및 장치 |
| GB201914034D0 (en) | 2019-09-30 | 2019-11-13 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of neurological disorders |
| GB202001353D0 (en) | 2020-01-31 | 2020-03-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of skin conditions |
| GB202100566D0 (en) | 2021-01-15 | 2021-03-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of brain damage |
| WO2022208039A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Ipsen Biopharm Limited | Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders |
| CA3213914A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Mikhail KALINICHEV | Treatment of pain & inflammatory disorders |
| GB202116795D0 (en) | 2021-11-22 | 2022-01-05 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of visceral pain |
| GB202213479D0 (en) | 2022-09-14 | 2022-10-26 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-free clostridial neurotoxin assays |
| GB202404021D0 (en) | 2024-03-20 | 2024-05-01 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-based neurotoxin assay |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000067700A2 (en) * | 1999-05-12 | 2000-11-16 | United States Army Medical Research & Materiel Cmd | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
Family Cites Families (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993015766A1 (en) | 1992-02-10 | 1993-08-19 | Seragen, Inc. | Desensitization to specific allergens |
| GB9305735D0 (en) | 1993-03-19 | 1993-05-05 | North John R | Novel agent for controlling cell activity |
| EP1508336B1 (en) | 1993-06-10 | 2009-11-18 | Allergan, Inc. | Treatment of neuromuscular disorders and conditions with different botulinum serotype |
| US5437291A (en) | 1993-08-26 | 1995-08-01 | Univ Johns Hopkins | Method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction |
| US20040126396A1 (en) | 1993-12-28 | 2004-07-01 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin treatment for strabismus |
| US6974578B1 (en) | 1993-12-28 | 2005-12-13 | Allergan, Inc. | Method for treating secretions and glands using botulinum toxin |
| US5670484A (en) | 1994-05-09 | 1997-09-23 | Binder; William J. | Method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell-proliferative disorders |
| US5714469A (en) | 1994-09-01 | 1998-02-03 | Smithkline Beecham Corporation | Method of treating sepsis |
| GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
| AU4746096A (en) * | 1995-06-06 | 1996-12-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Analogs of botulinum toxin and pharmaceutical compositions o f botulinum toxin |
| AU6326896A (en) * | 1996-03-08 | 1997-09-22 | Regents Of The University Of California, The | Chemically-modified clostridiatoxin with improved properties |
| US7192596B2 (en) | 1996-08-23 | 2007-03-20 | The Health Protection Agency Ipsen Limited | Recombinant toxin fragments |
| GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
| US6063768A (en) | 1997-09-04 | 2000-05-16 | First; Eric R. | Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders |
| GB9721189D0 (en) | 1997-10-08 | 1997-12-03 | Speywood Lab The Limited | Analgesic conjugates |
| BR9910359A (pt) | 1998-05-13 | 2001-01-09 | Bietecon Ges F R Biotechnologi | Proteìna hìbrida para inibição de desgranulação de mastócitos e seu uso |
| ATE246517T1 (de) | 1998-07-22 | 2003-08-15 | Osprey Pharmaceuticals Ltd | Konjugate zur behandlung von entzündungskrankheiten und von assozierter gewebeschädigung |
| GB9818548D0 (en) | 1998-08-25 | 1998-10-21 | Microbiological Res Authority | Treatment of mucas hypersecretion |
| US6776990B2 (en) | 1999-04-08 | 2004-08-17 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for the treatment of pancreatitis |
| US6358697B2 (en) | 1999-04-21 | 2002-03-19 | Children's Hospital Medical Center | Intracellular pharmaceutical targeting |
| US6767544B2 (en) | 2002-04-01 | 2004-07-27 | Allergan, Inc. | Methods for treating cardiovascular diseases with botulinum toxin |
| US6358917B1 (en) | 1999-08-24 | 2002-03-19 | Jean D. A. Carruthers | Cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth |
| ATE348178T1 (de) | 1999-08-25 | 2007-01-15 | Allergan Inc | Aktivierbare rekombinante neurotoxine |
| GB9922554D0 (en) | 1999-09-23 | 1999-11-24 | Microbiological Res Authority | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
| US6113915A (en) | 1999-10-12 | 2000-09-05 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pain |
| US6265379B1 (en) | 1999-10-13 | 2001-07-24 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating otic disorders |
| US6139845A (en) | 1999-12-07 | 2000-10-31 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating cancer with a neurotoxin |
| US7838008B2 (en) | 1999-12-07 | 2010-11-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating diverse cancers |
| US6261572B1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-17 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating a pancreatic disorder with a neurotoxin |
| US6337075B1 (en) | 2000-01-11 | 2002-01-08 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating diabetes |
| US6143306A (en) | 2000-01-11 | 2000-11-07 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pancreatic disorders |
| US6641820B1 (en) | 2000-01-19 | 2003-11-04 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain |
| US6524580B1 (en) | 2000-02-15 | 2003-02-25 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating thyroid disorders |
| US6464986B1 (en) | 2000-04-14 | 2002-10-15 | Allegan Sales, Inc. | Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin |
| US6299893B1 (en) | 2000-04-17 | 2001-10-09 | Marvin Schwartz | Method to reduce hair loss and stimulate hair regrowth |
| US6565870B1 (en) | 2000-04-28 | 2003-05-20 | Allergan, Inc. | Methods for treating bone tumors |
| US6306403B1 (en) | 2000-06-14 | 2001-10-23 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin |
| US6903187B1 (en) | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
| US6423319B1 (en) | 2000-10-04 | 2002-07-23 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating muscle injuries |
| US6827931B1 (en) | 2000-10-20 | 2004-12-07 | Allergan, Inc. | Method for treating endocrine disorders |
| US20020127247A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-09-12 | Allergen Sales, Inc. | Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence |
| US7273722B2 (en) | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
| US6623742B2 (en) | 2001-09-17 | 2003-09-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating fibromyalgia |
| US7255866B2 (en) | 2001-09-17 | 2007-08-14 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin therapy for fibromyalgia |
| US6921538B2 (en) | 2002-05-10 | 2005-07-26 | Allergan, Inc. | Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders |
| CA2501856A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin dental therapies and procedures |
| US7238357B2 (en) | 2002-11-05 | 2007-07-03 | Allergan, Inc. | Methods for treating ulcers and gastroesophageal reflux disease |
| US8071550B2 (en) | 2003-03-03 | 2011-12-06 | Allergan, Inc. | Methods for treating uterine disorders |
| US6838434B2 (en) | 2003-05-02 | 2005-01-04 | Allergan, Inc. | Methods for treating sinus headache |
| US7220422B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-05-22 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for treating eye disorders |
| US7172764B2 (en) * | 2003-11-17 | 2007-02-06 | Allergan, Inc. | Rescue agents for treating botulinum toxin intoxications |
| JP2008508886A (ja) * | 2004-08-04 | 2008-03-27 | アラーガン、インコーポレイテッド | 活性ボツリヌス毒素ａ型の発現の最適化 |
| DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| AU2005311086B2 (en) | 2004-12-01 | 2012-03-29 | Allergan, Inc. | Fusion proteins |
| DE102005002978B4 (de) * | 2005-01-21 | 2013-04-25 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Rekombinante Expression von Proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen Form |
| JP5167473B2 (ja) * | 2005-03-03 | 2013-03-21 | コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド | 抗血管新生化合物 |
| CN102499981B (zh) * | 2005-03-03 | 2016-08-03 | 雷文斯治疗公司 | 用于局部施用和经皮肤递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法 |
| DE102005019302A1 (de) | 2005-04-26 | 2006-11-16 | Toxogen Gmbh | Carrier zum Targeting von Nervenzellen |
| DE602006013481D1 (de) | 2005-09-19 | 2010-05-20 | Allergan Inc | Mit clostriedientoxin aktivierbare clostridientoxine |
| EP1834962A1 (de) | 2006-03-15 | 2007-09-19 | Biotecon Therapeutics GmbH | PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin |
| AU2007347781B2 (en) * | 2006-07-11 | 2013-10-03 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capability and enhanced targeting activity |
| AU2007272517B2 (en) * | 2006-07-11 | 2013-09-26 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells |
| GB0903006D0 (en) * | 2009-02-23 | 2009-04-08 | Syntaxin Ltd | Modified non-cytotoxic proteases |
| AU2010236613B2 (en) | 2009-04-14 | 2016-07-07 | Mcw Research Foundation, Inc. | Engineered botulinum neurotoxin |
| MX352265B (es) | 2009-07-02 | 2017-11-16 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Neurotoxinas que exhiben actividad biologica acortada. |
| EP3034511A1 (en) | 2010-01-25 | 2016-06-22 | Allergan, Inc. | Methods of intracellular conversion of single-chain proteins into their di-chain form |
| US8853360B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-10-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity |
| EP2776457B1 (en) * | 2011-11-09 | 2017-08-02 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Neurotoxins exhibiting shortened biological activity |
| EP2948174B1 (en) * | 2013-01-28 | 2019-09-11 | New York University | Treatment methods using atoxic neurotoxin derivatives |
| US20140242110A1 (en) * | 2013-02-28 | 2014-08-28 | Dt Scimed, Llc | Dose, localization, and formulation of botulinum toxins in skin and muscle |
| GB201312317D0 (en) * | 2013-07-09 | 2013-08-21 | Syntaxin Ltd | Cationic neurotoxins |
-
2015
- 2015-01-09 ES ES15701379T patent/ES2873479T3/es active Active
- 2015-01-09 JP JP2017536513A patent/JP6601922B2/ja active Active
- 2015-01-09 PT PT157013798T patent/PT3242884T/pt unknown
- 2015-01-09 RU RU2017128211A patent/RU2733493C2/ru active
- 2015-01-09 WO PCT/GB2015/050043 patent/WO2016110662A1/en active Application Filing
- 2015-01-09 HU HUE15701379A patent/HUE053935T2/hu unknown
- 2015-01-09 CN CN201580071947.4A patent/CN107108703B/zh active Active
- 2015-01-09 EP EP15701379.8A patent/EP3242884B1/en active Active
- 2015-01-09 CN CN202211012695.6A patent/CN116333068A/zh active Pending
- 2015-01-09 EP EP20210686.0A patent/EP3822286A1/en active Pending
- 2015-01-09 US US15/540,637 patent/US10647750B2/en active Active
- 2015-01-09 PL PL15701379T patent/PL3242884T3/pl unknown
- 2015-01-09 DK DK15701379.8T patent/DK3242884T3/da active
- 2015-12-30 TW TW104144440A patent/TWI700289B/zh active
-
2018
- 2018-04-09 HK HK18104621.9A patent/HK1245292A1/zh unknown
-
2020
- 2020-02-25 US US16/800,109 patent/US11014968B2/en active Active
-
2021
- 2021-04-19 US US17/301,897 patent/US12037369B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000067700A2 (en) * | 1999-05-12 | 2000-11-16 | United States Army Medical Research & Materiel Cmd | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BYRNE M.P. et al. Purification, potency, and efficacy of the botulinum neurotoxin type A binding domain from Pichia pastoris as a recombinant vaccine candidate, Infection and immunity, 1998, V. 66, N. 10, p.4817-4822. * |
| BYRNE M.P. et al. Purification, potency, and efficacy of the botulinum neurotoxin type A binding domain from Pichia pastoris as a recombinant vaccine candidate, Infection and immunity, 1998, V. 66, N. 10, p.4817-4822. LACY D.B. et al. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins, Journal of molecular biology, 1999, V. 291, N. 5, p.1091-1104. WO 2000067700 (US ARMY MEDICAL RES & MATERIEL), 16.11.2000. СУПОТНИЦКИЙ М.В. Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и 6 модифицированных токсинов, Биопрепараты. Профилактика. Диагностика. Лечение, 2011, N. 1, с.6-15. TOKURIKI N. ET AL. Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604. * |
| LACY D.B. et al. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins, Journal of molecular biology, 1999, V. 291, N. 5, p.1091-1104. * |
| TOKURIKI N. ET AL. Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604. * |
| СУПОТНИЦКИЙ М.В. Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и 6 модифицированных токсинов, Биопрепараты. Профилактика. Диагностика. Лечение, 2011, N. 1, с.6-15. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUE053935T2 (hu) | 2021-08-30 |
| US10647750B2 (en) | 2020-05-12 |
| TWI700289B (zh) | 2020-08-01 |
| US20180141982A1 (en) | 2018-05-24 |
| US20210246175A1 (en) | 2021-08-12 |
| CN107108703A (zh) | 2017-08-29 |
| PL3242884T3 (pl) | 2021-08-16 |
| TW201629092A (zh) | 2016-08-16 |
| JP6601922B2 (ja) | 2019-11-06 |
| PT3242884T (pt) | 2021-04-22 |
| HK1245292A1 (zh) | 2018-08-24 |
| CN107108703B (zh) | 2022-09-23 |
| JP2018502580A (ja) | 2018-02-01 |
| US20200291073A1 (en) | 2020-09-17 |
| ES2873479T3 (es) | 2021-11-03 |
| EP3822286A1 (en) | 2021-05-19 |
| US12037369B2 (en) | 2024-07-16 |
| DK3242884T3 (da) | 2021-04-19 |
| RU2017128211A3 (ru) | 2019-02-11 |
| US11014968B2 (en) | 2021-05-25 |
| EP3242884A1 (en) | 2017-11-15 |
| CN116333068A (zh) | 2023-06-27 |
| RU2017128211A (ru) | 2019-02-11 |
| EP3242884B1 (en) | 2021-02-24 |
| WO2016110662A1 (en) | 2016-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2733493C2 (ru) | Катионные нейротоксины | |
| JP7434263B2 (ja) | 陽イオン性神経毒 | |
| JP6867452B2 (ja) | 陽イオン性神経毒 |