JP2008508886A - 活性ボツリヌス毒素a型の発現の最適化 - Google Patents
活性ボツリヌス毒素a型の発現の最適化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008508886A JP2008508886A JP2007525034A JP2007525034A JP2008508886A JP 2008508886 A JP2008508886 A JP 2008508886A JP 2007525034 A JP2007525034 A JP 2007525034A JP 2007525034 A JP2007525034 A JP 2007525034A JP 2008508886 A JP2008508886 A JP 2008508886A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- open reading
- reading frame
- cell
- seq
- active bont
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 773
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title description 3
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 title 1
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 title 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 741
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 512
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 503
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 503
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims abstract description 236
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 1076
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 238
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 237
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 187
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 180
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 98
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 66
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 56
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 45
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 44
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 43
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 41
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 41
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 41
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 39
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 22
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 17
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 claims description 16
- 241000219422 Urtica Species 0.000 claims description 16
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 16
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 15
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 14
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 14
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 claims description 14
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 14
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 claims description 14
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 13
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 claims description 13
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 13
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 13
- 241000010804 Caulobacter vibrioides Species 0.000 claims description 12
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 claims description 12
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 12
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 12
- 241000589323 Methylobacterium Species 0.000 claims description 11
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 10
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims description 10
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 claims description 5
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 claims description 3
- 241000589308 Methylobacterium extorquens Species 0.000 claims description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 3
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 3
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 165
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 154
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 149
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 143
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 76
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 56
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 46
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 36
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 28
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 27
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 27
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 19
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 17
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 17
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 16
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 16
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 16
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 15
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 15
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 15
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 14
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 14
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 12
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 8
- 102100031077 Calcineurin B homologous protein 3 Human genes 0.000 description 8
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101000777270 Homo sapiens Calcineurin B homologous protein 3 Proteins 0.000 description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 7
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 7
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 7
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 241000699684 Meriones unguiculatus Species 0.000 description 6
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 6
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 BoNT / A Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- 241000283087 Equus Species 0.000 description 3
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 3
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 3
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 3
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 2
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 2
- 108010043401 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002669 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 206010043269 Tension headache Diseases 0.000 description 2
- 208000008548 Tension-Type Headache Diseases 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 101710082245 Ubiquitin-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000016599 Uterine disease Diseases 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000007858 polymerase cycling assembly Methods 0.000 description 2
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 2
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.OCC(N)(CO)CO CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091324 3C proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 description 1
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical compound OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 1
- 241000464664 Clostridium botulinum G Species 0.000 description 1
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 101000596396 Dictyostelium discoideum Vesicle-fusing ATPase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 description 1
- 241000195620 Euglena Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027601 Inner ear disease Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 244000207747 Lemna gibba Species 0.000 description 1
- 235000006438 Lemna gibba Nutrition 0.000 description 1
- 208000008930 Low Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 description 1
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010040744 Sinus headache Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 description 1
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 241000269457 Xenopus tropicalis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 206010006514 bruxism Diseases 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000012361 double-strand break repair Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 201000006517 essential tremor Diseases 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004709 eyebrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000001660 hyperkinetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012804 iterative process Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002151 myoclonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108091007054 readthrough proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 108010018381 streptavidin-binding peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003568 synaptosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000013715 transcription antitermination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000012863 translational readthrough Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000011215 vesicle docking Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000001755 vocal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1.ヌクレオチド改変の手作業による選択
特定の異種細胞のコドン使用を決定し、それがボツリヌス菌に見いだされるコドン使用頻度とどのように似ているかを決定するために、ボツリヌス菌および選択した異種細胞のコドン使用頻度を、公的に維持されているコドン使用頻度データベース(URLアドレスwww.kazusa.or.jp/codon)から得られる情報を使って表にすることで、生物間の比較を容易にした(表1)。
コードされているBoNT/Aの異種細胞における発現を増加させるために配列番号2のオープンリーディングフレームを改変する目的で、公けに利用できるBacktranslate Toolバージョン2(Entelechon,GmbH,ドイツ・レーゲンスブルグ,URLアドレスentelechon.com/eng/backtranslation)を使って、各生物の同義コドン使用頻度を決定した。配列番号1の活性BoNT/Aアミノ酸配列を、このウェブベースのプログラムに投入して、期待の持てる改変オープンリーディングフレームを生成させた。次に、これらの改変配列をG+C含量について解析し、具体的異種細胞のG+C含量とより良く一致するような置換を行なった。この作業により、配列番号4〜配列番号99の改変オープンリーディングフレームを得た。これらは、それぞれ配列番号1の活性BoNT/Aをコードするが、異種細胞中で発現させるために最適化されている。表示した種のコドン表を使って、核酸分子配列・配列番号4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94および97を作成した。この場合は、核酸分子の作成に際して、各アミノ酸に関するコドン使用頻度が維持されるようにした。例えば、大腸菌で発現させるための核酸分子・配列番号4を作成する場合、アルギニンに関して選択したコドン使用頻度は、CGGが10%、CGAが6%、CGTが38%、CGCが40%、AGGが2%、そしてAGAが4%であり;アラニンに関するコドン使用頻度は、GCGが35%、GCAが21%、GCTが16%、そしてGCCが27%であり;システインに関するコドン使用頻度は、TGTが45%およびTGCが55%とした。
BoNT/Aをコードする核酸分子を、大腸菌が好む特定の同義コドンが組み入れられ、かつG+C含量が約25%から約40%に増加するように改変した。まず、あるアルゴリズムにより、配列番号1のBoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを生成させた(BlueHeron(登録商標)Biotechnology,ワシントン州ボセル)。このプログラムは、1)核酸のmRNA二次構造を減少させ(自由エネルギー計算に基づく)、2)核酸分子のオープンリーディングフレームの同義コドン使用頻度を、大腸菌が好む総コドン使用頻度に変化させた。このアルゴリズムでは、反復過程によって改善解(すなわち、代表的コドン使用頻度と、より低い自由エネルギーとの組み合わせ)を探すために、統計モデルを使用する。次に、この配列を、Allerganにおいて当業者が改変することにより、発現ベクターへのクローニングを容易にするために核酸分子の5'末端(例えばEcoRV、BamHI、EcoRI、SacIおよびNdeI)ならびに3'末端(例えばSalI、HindIII、NotI、EagI、XhoIおよびAvaI)に、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を付加し、ポリモノヌクレオチド領域を減らし、内部調節配列または内部構造部位配列を除去した。
規制と安全性を考慮して、BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含むコンストラクトの初期の発現は、酵素的に不活性なBoNT/A(iBoNT/A)を使って行なった。これら初期発現の試みにより、活性BoNT/Aをコードするコンストラクトを発現させるために必要なプロトコールおよび戦略の開発が可能になった。LC内の亜鉛結合モチーフの突然変異が酵素活性を妨害するという知見に基づいて、いくつかのiBoNT/A分子を設計した。まず最初に、BoNT/A中のヒスチジン227をチロシンで置換した(H227Y)。第2の点突然変位(グルタミンでグルタミン酸224を置き換えるもの(E224Q))も構築した。亜鉛結合残基を突然変異させたH227Y突然変異体とは異なり、H224Q突然変異では、開裂するペプチド結合に付加される求核性水分子の配位および活性化を担う残基が置き換えられる。これらの不活化突然変異はどちらも、高度に保存された亜鉛結合モチーフ内にある(表3)。
pRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)を構築するために、pUCBHB1/iBoNT/A(H227Y)コンストラクトをBamHIおよびHindIIIで消化して、iBoNT/A(H227Y)インサートをコードする断片を切り出した。得られた制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)で精製し、オープンリーディングフレーム全体を含有する断片を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindIIIで消化しておいたpRSETbベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)にサブクローニングした。断片とベクターをT4 DNAリガーゼにより16℃で終夜ライゲートすることにより、pRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)を得た。ライゲーション混合物の一部を化学的にコンピテントなTOP10細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に標準的な熱ショックプロトコールで形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させた。候補発現コンストラクトをアンピシリン耐性コロニーとして選択した。耐性コロニーを使って、100μg/mLのアンピシリンを含有するルリア-ベルターニ培地2mLに接種し、次にそれを37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。微量遠心分離によって細菌細胞を収集し、QIAGENミニプレップキット(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)を使ってプラスミドDNAを単離した。BamHIおよびPstIを使った制限消化で正しいインサート断片の存在および向きを決定することにより、候補発現コンストラクトをスクリーニングした。所望の発現コンストラクトを含有する培養物を使って、100μg/mLのアンピシリンを含有するルリア-ベルターニ培地200mLが入っている1Lバッフル付きフラスコに接種し、37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。発現コンストラクトに相当する精製プラスミドDNAを、QIAGEN Maxi-prep法(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)を使って単離し、配列決定することにより、正しい発現コンストラクトが作製されたことを検証した。このクローニング戦略により、配列番号119のアミノ末端エンテロキナーゼ切断可能ポリヒスチジンアフィニティ結合ペプチドに作動可能に連結されたiBoNT/A(H227Y)をコードする配列番号118の核酸分子を含むpRSETb発現コンストラクトを得た。
以下の実施例は、本明細書に開示する発現コンストラクトからBoNT/Aを発現させるのに役立つ手法を例示するものである。pRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)発現コンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを使って、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に導入した。その熱ショック反応を、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させた。pRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)を含有する形質転換大腸菌のアンピシリン耐性コロニーを使って、100μg/mLのアンピシリンを含有するPA-0.5G培地3.0mLが入っているバッフル付きフラスコに接種し、次にそれを37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。得られた終夜スターター培養物を使って、今度は、100μg/mLのアンピシリンを含有するZYP-5052自己誘導培地が入っている3Lバッフル付きフラスコに、1:1000の希釈率で接種した。培養体積は約600mL(フラスコ体積の20%)〜約750mL(フラスコ体積の25%)の範囲とした。これらの培養物を37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら、約5.5時間成長させた後、16℃の培養器に移し、250rpmで振とうしながら終夜発現させた。細胞を遠心分離(4,000rpm、4℃で、20〜30分)によって収集し、直ちに使用するか、必要になるまで-80℃で乾燥保存した。
以下の実施例は、本明細書に開示するBoNT/Aの精製および定量に役立つ方法を例示するものである。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)タンパク質精製のために、実施例5に記載の、His-iBoNT/A(H227Y)を発現させるために使用した大腸菌BL21(DE3)細胞ペレットを、カラム結合緩衝液(25mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;10mMイミダゾール;2×Protease Inhibitor Cocktail Set III(EMD Biosciences-Calbiochem,カリフォルニア州サンディエゴ);5単位/mLのベンゾナーゼ(Benzonase)(EMD Biosciences-Novagen,ウィスコンシン州マディソン);0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)に再懸濁し、次に冷たいオークリッジ遠心管に移した。細胞を溶解し、His-iBoNT/Aを放出させるために、細胞懸濁液を氷上で超音波処理し(Branson Digital Sonifierを使用して、40%の強度で10秒間のパルスを60秒間の冷却期間を挟んで10〜12回)、次に溶解液を清澄化するために遠心分離した(16,000rpm,4℃で20分)。TALON(商標)SuperFlow Co2+アフィニティー樹脂(BD Biosciences-Clontech,カリフォルニア州パロアルト)を充填した20mL Econo-Pacカラムサポート(Bio-Rad Laboratories,カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使って固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを調製し、次に、それを、5カラム体積の脱イオン蒸留水ですすぎ、次いで5カラム体積のカラム結合緩衝液ですすぐことによって平衡化した。清澄化した溶解液を、平衡化したカラムに、重力流によってゆっくり適用した(約0.25〜0.3mL/分)。次に、5カラム体積のカラム洗浄緩衝液(N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;10mMイミダゾール;0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)で、カラムを洗浄した。His-iBoNT/Aを、20〜30mLのカラム溶出緩衝液(25mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;500mMイミダゾール;0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)で溶出させ、およそ12個の1mL画分に集めた。各溶出画分に含まれるHis-iBoNT/A(H227Y)の量をブラッドフォード色素アッセイによって決定した。この作業では、各1.0mL画分のうち20μLを、Bio-Rad Protein Reagent(Bio-Rad Laboratories,カリフォルニア州ハーキュリーズ)200μLと混合し、脱イオン蒸留水で1対4に希釈した後、比色シグナルの強さを分光光度計を使って測定した。最も強いシグナルを持つ五つの画分を溶出ピークであるとみなして、プールした。プールしたピーク溶出画分の総タンパク質濃度を、ウシガンマグロブリン(Bio-Rad Laboratories,カリフォルニア州ハーキュリーズ)を標準に使って見積ることにより、総タンパク質収量を決定した。
pET30b/His-iBoNT/A(H227Y)を構築するために、pRSETb/iBoNT/A(H227Y)コンストラクトをBamHIおよびHindIIIで消化して、iBoNT/A(H227Y)をコードする断片を切り出した。得られた制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)で精製し、オープンリーディングフレーム全体を含有する断片を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindIIIで消化しておいたpET30bベクター(EMD Biosciences-Novagen,ウィスコンシン州マディソン)にサブクローニングした。断片とベクターをT4 DNAリガーゼにより16℃で終夜ライゲートすることにより、pET30b/His-iBoNT/A(H227Y)を得た。ライゲーション混合物の一部を化学的にコンピテントなTOP10細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に標準的な熱ショックプロトコールで形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させた。候補発現コンストラクトをカナマイシン耐性コロニーとして選択した。耐性コロニーを使って、50μg/mLのカナマイシンを含有するルリア-ベルターニ培地2mLに接種し、次にそれを37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。微量遠心分離によって細菌細胞を収集し、QIAGENミニプレップキット(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)を使ってプラスミドDNAを単離した。BamHIおよびPstIを使った制限消化で正しいインサート断片の存在および向きを決定することにより、候補発現コンストラクトをスクリーニングした。所望の発現コンストラクトを含有する培養物を使って、50μg/mLのカナマイシンを含有するルリア-ベルターニ培地200mLが入っている1Lバッフル付きフラスコに接種し、37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。発現コンストラクトに相当する精製プラスミドDNAを、QIAGEN Maxi-prep法(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)を使って単離し、配列決定することにより、正しい発現コンストラクトが作製されたことを検証した。このクローニング戦略により、配列番号119のアミノ末端エンテロキナーゼ切断可能ポリヒスチジンアフィニティ結合ペプチドに作動可能に連結されたiBoNT/A(H227Y)をコードする配列番号118の核酸分子を含むpET30b発現コンストラクトを得た。
以下の実施例は、本明細書に開示する発現コンストラクトからBoNT/Aを発現させるのに役立つ手法を例示するものである。pET30b/His-iBoNT/A(H227Y)発現コンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを使って、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に導入した。その熱ショック反応を、50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させた。pET30b/His-iBoNT/A(H227Y)を含有する形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを使って、50μg/mLのカナマイシンを含有するPA-0.5G培地3.0mLが入っているバッフル付きフラスコに接種し、次にそれを37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。得られた終夜スターター培養物を使って、今度は、50μg/mLのカナマイシンを含有するZYP-5052自己誘導培地が入っている3Lバッフル付きフラスコに、1:1000の希釈率で接種した。培養体積は約600mL(フラスコ体積の20%)〜約750mL(フラスコ体積の25%)の範囲とした。これらの培養物を37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら、約5.5時間成長させた後、16℃の培養器に移し、250rpmで振とうしながら終夜発現させた。細胞を遠心分離(4,000rpm、4℃で、20〜30分)によって収集し、直ちに使用するか、必要になるまで-80℃で乾燥保存した。
活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含むプラスミド(図2)を、pET30b/His-iBoNT/A(H227Y)の部位特異的突然変異誘発によって作製した。実施例3で述べた手法および以下の二つのオリゴヌクレオチドを用いる一段階の部位特異的突然変異誘発で不活化H227Yの修正を行なうことにより、pRSETb/His-BoNT/Aを得た:Y227Hプライマー対,センスオリゴヌクレオチド,5'-GTGACCTTGGCACATGAACTTATTCATGCCGGGCATCGCTTGTATGGAATCGCC-3'(配列番号102)およびアンチセンスオリゴヌクレオチド,5'-GGCGATTCCATACAAGCGATGCCCGGCATGAATAAGTTCATGTGCCAAGGTCAC-3(配列番号103)。アミノ酸番号は、アミノ末端ポリヒスチジンタグを持たないネイティブ配列に対応している。H227Yを修正するために変化させたヌクレオチドを太字で表し、下線を付す。この突然変異誘発により、配列番号111の活性His-BoNT/Aをコードする配列番号110の改変オープンリーディングフレームが得られた。
無改変オープンリーディングフレームと比較して、改変オープンリーディングフレームから発現される増加したBoNT/Aの量は、以下のようにして決定することができる。別々の反応で、配列番号3の改変オープンリーディングフレームを含むpET30b/His-BoNT/A発現コンストラクト、および配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含むpET30b/His-BoNT/Aコンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを使って、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に導入する。その熱ショック反応を、50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させる。両発現コンストラクトから得られるpET30b/His-BoNT/Aコンストラクトを含有する形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを使って、カナマイシン耐性選択PA-0.5G培地3.0mLが入っている別々の15mLチューブに接種し、それを37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させる。各コンストラクトから得られる終夜スターター培養物のうち約600μLを使って、カナマイシン耐性ZYP-5052自己誘導培地600mLが入っている3.0Lバッフル付きフラスコに接種する。接種した培養物を37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら約5.5時間成長させた後、16℃の培養器に移し、250rpmで振とうしながら終夜発現させる。遠心分離(4,000rpm、4℃で20〜30分)によって細胞を収集する。
pET29b/iBoNT/A-KHis(H227Y)を構築するために、三段階戦略を使用して、まず、pRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)コンストラクトのiBoNT/A(H227Y)をコードするオープンリーディングフレームから、二つの内部NdeI制限エンドヌクレアーゼ部位を除去し、次にカルボキシ末端リジン残基をiBoNT/A(H227Y)に付加し、最後にこの改変断片をpET29bベクターにサブクローニングした。iBoNT/A(H227Y)をコードするオープンリーディングフレームから、部位特異的突然変異誘発プロトコールを使って、二つの内部NdeI制限エンドヌクレアーゼ部位を除去した。テンプレートとしてのpRSETb/iBoNT/A(H227Y)発現コンストラクト、QuickChange(登録商標)II XL Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene,カリフォルニア州ラホーヤ)に含まれる試薬類、ならびに以下の四つのオリゴヌクレオチドプライマー:SL103プライマー対,センスオリゴヌクレオチド,5'-GATGAACTCGATGATCCCTTACGGTGTGAAACGTCTGG-3'(配列番号104)およびアンチセンスオリゴヌクレオチド,5'-CCAGACGTTTCACACCGTAAGGGATCATCGAGTTCATC-3'(配列番号105);ならびにSL104プライマー対,センスオリゴヌクレオチド,5'-CCAGACGTTTCACACCGTAAGGGATCATCGAGTTCATC-3'(配列番号106)およびアンチセンスオリゴヌクレオチド,5'-GATGAACTCGATGATCCCTTACGGTGTGAAACGTCTGG-3'(配列番号107)を使って、50μLの反応を組み立てた。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ミックスは、1O×緩衝液5μL、デオキシリボヌクレオチド類(dNTPs)1μL、PfuUltra(商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ(2.5単位/μL)1μL、各プライマー125ng、テンプレートDNA 50ng、および最終体積を50μLにする量のヌクレアーゼフリー水を含有した。サーモサイクラーの条件は以下のとおりとした:95℃で120秒を1サイクル;90℃で60秒、55℃で30秒、および72℃で20分を20サイクル;72℃で9分を1サイクル;および10℃で保持。サーモサイクリング後に、DpnI制限酵素1μLを反応に加え、テンプレートDNAを消化するために37℃で2時間インキュベートした。反応をQIAquickキット(QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州バレンシア)で精製し、アガロースゲル電気泳動で解析したところ、反応は完全長プラスミドをもたらしたことがわかった。突然変異誘発産物を化学的にコンピテントな大腸菌TOP10細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に熱ショック法によって形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させた。候補コンストラクトをアンピシリン耐性コロニーとして単離し、発現コンストラクトを単離するためにアルカリ溶解プラスミド少量調製法を使用し、NdeI部位を持たないインサートの存在を決定するためにNdeI制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して解析した。候補プラスミドコンストラクトのオープンリーディングフレーム全体の配列解析により、二つの内部NdeI部位の除去が確認された。このクローニング戦略により、二つの内部NdeI制限エンドヌクレアーゼ部位を欠くオープンリーディングフレームを含むpRSETb/His-iBoNT/A(H227Y)コンストラクトが得られた。
活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含むプラスミド(図4)を、pET29b/iBoNT/A-KHis(H227Y)のインビトロ部位特異的突然変異誘発によって作製した。実施例3で述べた手法および以下の二つのオリゴヌクレオチドを用いる一段階の部位特異的突然変異誘発で不活化H227Yの修正を行なうことにより、pET29b/BoNT/A-KHisを得た:Y227Hプライマー対,センスオリゴヌクレオチド,5'-GTGACCTTGGCACATGAACTTATTCATGCCGGGCATCGCTTGTATGGAATCGCC-3'(配列番号102)およびアンチセンスオリゴヌクレオチド,5'-GGCGATTCCATACAAGCGATGCCCGGCATGAATAAGTTCATGTGCCAAGGTCAC-3(配列番号103)。アミノ酸番号は、アミノ末端ポリヒスチジンタグを持たないネイティブ配列に対応している。H227Yを修正するために変化させたヌクレオチドを太字で表し、下線を付す。この突然変異誘発により、配列番号113の活性BoNT/A-KHisをコードする配列番号112の改変オープンリーディングフレームが得られた。
以下の実施例は、本明細書に開示する発現コンストラクトからBoNT/Aを発現させるのに役立つ手法を例示するものである。pET29b/BoNT/A-KHis発現コンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを使って、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に導入した。その熱ショック反応を、50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させた。pET29b/BoNT/A-KHisを含有する形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを使って、50μg/mLのカナマイシンを含有するPA-0.5G培地3.0mLが入っているバッフル付きフラスコに接種し、次にそれを37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させた。得られた終夜スターター培養物を使って、今度は、50μg/mLのカナマイシンを含有するZYP-5052自己誘導培地が入っている3Lバッフル付きフラスコに、1:1000の希釈率で接種した。培養体積は約600mL(フラスコ体積の20%)〜約750mL(フラスコ体積の25%)の範囲とした。これらの培養物を37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら、約5.5時間成長させた後、16℃の培養器に移し、250rpmで振とうしながら終夜発現させた。細胞を遠心分離(4,000rpm、4℃で、20〜30分)によって収集し、直ちに使用するか、必要になるまで-80℃で乾燥保存した。
以下の実施例は、本明細書に開示するBoNT/Aの精製および定量に役立つ方法を例示するものである。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)タンパク質精製のために、実施例8に記載の、BoNT/A-KHisを発現させるために使用した大腸菌BL21(DE3)細胞ペレットを、カラム結合緩衝液(25mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;10mMイミダゾール;2×Protease Inhibitor Cocktail Set III(EMD Biosciences-Calbiochem,カリフォルニア州サンディエゴ);5単位/mLのベンゾナーゼ(EMD Biosciences-Novagen,ウィスコンシン州マディソン);0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)に再懸濁し、次に冷たいオークリッジ遠心管に移した。細胞を溶解し、BoNT/A-KHisを放出させるために、細胞懸濁液を氷上で超音波処理し(Branson Digital Sonifierを使用して、40%の強度で10秒間のパルスを60秒間の冷却期間を挟んで10〜12回)、次に溶解液を清澄化するために遠心分離した(16,000rpm,4℃で20分)。TALON(商標)SuperFlow Co2+アフィニティー樹脂(BD Biosciences-Clontech,カリフォルニア州パロアルト)を充填した20mL Econo-Pacカラムサポート(Bio-Rad Laboratories,カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使って固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを調製し、次に、それを、5カラム体積の脱イオン蒸留水ですすぎ、次いで5カラム体積のカラム結合緩衝液ですすぐことによって平衡化した。清澄化した溶解液を、平衡化したカラムに、重力流によってゆっくり適用した(約0.25〜0.3mL/分)。次に、5カラム体積のカラム洗浄緩衝液(N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;10mMイミダゾール;0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)で、カラムを洗浄した。BoNT/A-Hisを、20〜30mLのカラム溶出緩衝液(25mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES),pH7.8;500mM塩化ナトリウム;500mMイミダゾール;0.1%(v/v)Triton-X(登録商標)100,4-オクチルフェノールポリエトキシレート;10%(v/v)グリセロール)で溶出させ、およそ12個の1mL画分に集めた。各溶出画分に含まれるBoNT/A-KHisの量をブラッドフォード色素アッセイによって決定し、最も強いシグナルを持つ五つの画分を溶出ピークであるとみなして、プールした(図6b参照)。プールしたピーク溶出画分の総タンパク質濃度を、ウシガンマグロブリン(Bio-Rad Laboratories,カリフォルニア州ハーキュリーズ)を標準に使って見積ることにより、総タンパク質収量を決定した。
無改変オープンリーディングフレームと比較して、改変オープンリーディングフレームから発現される増加したBoNT/Aの量は、以下のようにして決定することができる。別々の反応で、配列番号112の改変オープンリーディングフレームを含むpET29b/BoNT/A-KHis発現コンストラクト、および配列番号115の無改変オープンリーディングフレームを含むpET29b/BoNT/A-KHisコンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを使って、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に導入する。その熱ショック反応を、50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて、終夜成長させる。両発現コンストラクトから得られるpET29b/BoNT/A-KHisコンストラクトを含有する形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを使って、カナマイシン耐性選択PA-0.5G培地3.0mLが入っている別々の15mLチューブに接種し、それを37℃の培養器に入れて、250rpmで振とうしながら終夜成長させる。各コンストラクトから得られる終夜スターター培養物のうち約600μLを使って、カナマイシン耐性ZYP-5052自己誘導培地600mLが入っている3.0Lバッフル付きフラスコに接種する。接種した培養物を37℃の培養器中、250rpmで振とうしながら約5.5時間成長させた後、16℃の培養器に移し、250rpmで振とうしながら終夜発現させる。遠心分離(4,000rpm、4℃で20〜30分)によって細胞を収集する。
作動可能に連結された核酸分子をpRSETベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号3の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号3のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpRSETベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpRSETベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pRSET/BoNT/A-His(図7)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする原核発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpRSET発現コンストラクトを作製すると共に、配列番号4〜配列番号33の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpRSETベクターに作動可能に連結されているpRSET発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpPIC Aベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号36の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号36のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpPIC Aベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpPIC Aベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pPIC A/BoNT/A-myc-His(図8)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、25μg/mLのZeocin(商標)を含有する1.5%低塩濃度ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.5)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をZeocin(商標)耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のc-mycペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする酵母発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpPIC A発現コンストラクトを作製すると共に、配列番号34、配列番号35、配列番号37〜配列番号45の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpPIC Aベクターに作動可能に連結されているpPIC A発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpMETベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号36の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号36のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpMETベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpMETベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pMET/BoNT/A-V5-His(図9)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%低塩濃度ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.5)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のV5ペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする酵母発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpMET発現コンストラクトを作製すると共に、配列番号34、配列番号35、配列番号37〜配列番号45の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpMETベクターに作動可能に連結されているpMET発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpYES2ベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号39の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号39のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpYES2ベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpYES2ベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pYES2/BoNT/A-V5-His(図10)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%低塩濃度ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.5)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のV5ペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする酵母発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpYES2発現コンストラクトを作製すると共に、配列番号34〜配列番号38および配列番号40〜配列番号45の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpYES2ベクターに作動可能に連結されているpYES2発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpFastBacHTベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号63の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号63のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpFastBacHTベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpFastBacHTベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pFastBacHT/BoNT/A(図11)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%低塩濃度ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のTEV切断可能なポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードするバキュロウイルストランスファーコンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpFastBacHTコンストラクトを作製すると共に、配列番号58〜配列番号59、配列番号60、配列番号61または配列番号62の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpFastBacHTベクターに作動可能に連結されているpFastBacHT発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpBACgus3ベクター(EMD Biosciences-Novagen,ウィスコンシン州マディソン)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号63の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号63のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpBACgus3ベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpBACgus3ベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pBACgus3/BoNT/A-His(図12)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、アミノ末端のgp64シグナルペプチドおよびカルボキシル末端のトロンビン切断可能なポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードするバキュロウイルストランスファーコンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpBACgus3コンストラクトを作製すると共に、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61または配列番号62の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpBACgus3ベクターに作動可能に連結されているpBACgus3発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpMTベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号60の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号60のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpMTベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpMTベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pMT/BiP-BoNT/A-V5-His(図13)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のV5ペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする昆虫発現コンストラクトが得られることになる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpMTコンストラクトを作製すると共に、配列番号58、配列番号59、配列番号61、配列番号62または配列番号63の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpMTベクターに作動可能に連結されているpMT発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpQBI25ベクター(Qbiogene,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号99の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号99のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpQBI25ベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpQBI25ベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pQBI25/BoNT/A-GFP(図14)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のGFPペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする哺乳動物発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpQBI25コンストラクトを作製すると共に、配列番号76〜配列番号98の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpQBI25ベクターに作動可能に連結されているpQBI25発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpcDNA(商標)6ベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号99の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号99のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpcDNA(商標)6ベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpcDNA(商標)6ベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pcDNA(商標)6/BoNT/A-V5-His(図15)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のV5ペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする哺乳動物発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpcDNA(商標)6コンストラクトを作製すると共に、配列番号76〜配列番号98の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpcDNA(商標)6ベクターに作動可能に連結されているpcDNA(商標)6発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpSecTag2ベクター(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号99の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号99のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpSecTag2ベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpSecTag2ベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pSecTag2/BoNT/A-V5-His(図16)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のc-mycペプチドおよびポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする哺乳動物発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpSecTag2コンストラクトを作製すると共に、配列番号76〜配列番号98の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpSecTag2ベクターに作動可能に連結されているpSecTag2発現コンストラクトを作製する。
作動可能に連結された核酸分子をpIVEX2.3dベクター(Roche Applied Science,インディアナ州インディアナポリス)中にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を、改変オープンリーディングフレーム配列番号3の5'末端および3'末端に組み入れる。この核酸分子を実施例2で述べたように合成し、pUCBHB1/BoNT/Aコンストラクトを得る。このコンストラクトを、1)活性BoNT/Aをコードする配列番号3のオープンリーディングフレームを含有するインサートを切り出すと共に、2)このインサートをpIVEX2.3dベクターに作動可能に連結することを可能にするような制限酵素で、消化する。このインサートを、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化したpIVEX2.3dベクターに、T4 DNAリガーゼ法を使ってサブクローニングすることにより、pIVEX2.3d/BoNT/A-His(図17)を得る。ライゲーション混合物を、熱ショック法を使って、化学的にコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Invitrogen,Inc.,カリフォルニア州カールズバッド)に形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%ルリア-ベルターニ寒天平板(pH7.0)に播種し、37℃の培養器に入れて終夜成長させる。発現コンストラクトを含有する細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶解プラスミド少量調製法を使って候補コンストラクトを単離し、インサートの存在および向きを決定するために、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析する。このクローニング戦略により、カルボキシル末端のポリヒスチジン結合ペプチドに作動可能に連結された活性BoNT/Aをコードする原核発現コンストラクトが得られる。同様のクローニング戦略を使って、発現レベルに関する対照として用いる配列番号2の無改変オープンリーディングフレームを含有するpIVEX2.3dコンストラクトを作製すると共に、配列番号4〜配列番号33の改変オープンリーディングフレームのいずれか一つがpIVEX2.3dベクターに作動可能に連結されているpIVEX2.3d発現コンストラクトを作製する。
Claims (201)
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、原核細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの原核細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項1の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項1の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項1の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項1の分子。
- 原核細胞がバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)株、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)株、枯草菌(Bacillus subtilis)株、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)株、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridia difficile)株、ウェルシュ菌(Clostridia perfringens)株、大腸菌(Escherichia coli)株、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)株、メチロバクテリウム・エキストルクエンス(Methylobacterium extorquens)株、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)株、ナイセリア・メニンギルルス(Neisseria meningirulls)株またはネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)株を含む、請求項1の分子。
- 原核細胞が大腸菌の株である、請求項1の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項1の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項1の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項1の分子。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を原核細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの原核細胞における発現を、他の点では同一である核酸分子中の無改変オープンリーディングフレームからの原核細胞における同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項11の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項11の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項11の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項11の分子。
- 原核細胞がバクテロイデス・フラギリス株、バチルス・リケニホルミス株、枯草菌株、カウロバクター・クレセンタス株、クロストリジウム・ディフィシレ株、ウェルシュ菌株、大腸菌株、ラクトコッカス・ラクティス株、メチロバクテリウム・エキストルクエンス株、シュードモナス・フルオレッセンス株、ナイセリア・メニンギルルス株またはネズミチフス菌株を含む、請求項11の分子。
- 原核細胞が大腸菌の株である、請求項11の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項11の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項11の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項11の分子。
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号110、配列番号112、配列番号122、配列番号123、配列番号124または配列番号125を含む改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号3を含む、請求項21の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号110を含む、請求項21の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号112を含む、請求項21の分子。
- 発現コンストラクトを含む、請求項21の分子。
- 発現コンストラクトを含む原核細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、原核細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの原核細胞における発現を増加させる、
原核細胞。 - 原核細胞がバクテロイデス・フラギリス株、バチルス・リケニホルミス株、枯草菌株、カウロバクター・クレセンタス株、クロストリジウム・ディフィシレ株、ウェルシュ菌株、大腸菌株、ラクトコッカス・ラクティス株、メチロバクテリウム・エキストルクエンス株、シュードモナス・フルオレッセンス株、ナイセリア・メニンギルルス株またはネズミチフス菌株を含む、請求項26の細胞。
- 原核細胞が大腸菌の株である、請求項26の細胞。
- 発現コンストラクトが原核細胞に一過性に含有される、請求項26の細胞。
- 発現コンストラクトが原核細胞に安定に含有される、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項26の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項26の細胞。
- 発現ベクターが原核発現ベクターである、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項26の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項26の細胞。
- 発現コンストラクトを含有する原核細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を原核細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの原核細胞における発現を増加させる、
原核細胞。 - 原核細胞がバクテロイデス・フラギリス株、バチルス・リケニホルミス株、枯草菌株、カウロバクター・クレセンタス株、クロストリジウム・ディフィシレ株、ウェルシュ菌株、大腸菌株、ラクトコッカス・ラクティス株、メチロバクテリウム・エキストルクエンス株、シュードモナス・フルオレッセンス株、ナイセリア・メニンギルルス株またはネズミチフス菌株を含む、請求項39の細胞。
- 原核細胞が大腸菌の株である、請求項39の細胞。
- 発現コンストラクトが原核細胞に一過性に含有される、請求項39の細胞。
- 発現コンストラクトが原核細胞に安定に含有される、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項39の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項39の細胞。
- 発現ベクターが原核発現ベクターである、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項39の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項39の細胞。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、酵母細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの酵母細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項52の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項52の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項52の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項52の分子。
- 酵母細胞がピキア・パストリス(Pichia pastoris)株、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)株、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)株、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)株、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)株またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株を含む、請求項52の分子。
- 酵母細胞がピキア・パストリスの株である、請求項52の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項52の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項52の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項52の分子。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を酵母細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの酵母細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項62の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項62の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項62の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項62の分子。
- 酵母細胞がピキア・パストリス株、ピキア・メタノリカ株、ピキア・アングスタ株、シゾサッカロミセス・ポンベ株、サッカロミセス・セレビシェ株またはヤロウイア・リポリティカ株を含む、請求項62の分子。
- 酵母細胞がピキア・パストリスの株である、請求項62の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項62の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項62の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項62の分子。
- 配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37 配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44または配列番号45を含む改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号34を含む、請求項72の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号36を含む、請求項72の分子。
- 発現コンストラクトを含む、請求項72の分子。
- 発現コンストラクトを含む酵母細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、酵母細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの酵母細胞における発現を増加させる、
酵母細胞。 - 酵母細胞がピキア・パストリス株、ピキア・メタノリカ株、ピキア・アングスタ株、シゾサッカロミセス・ポンベ株、サッカロミセス・セレビシェ株またはヤロウイア・リポリティカ株を含む、請求項76の細胞。
- 酵母細胞がピキア・パストリスの株である、請求項76の細胞。
- 発現コンストラクトが酵母細胞に一過性に含有される、請求項76の細胞。
- 発現コンストラクトが酵母細胞に安定に含有される、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項76の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項76の細胞。
- 発現ベクターが酵母発現ベクターである、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項76の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項76の細胞。
- 発現コンストラクトを含む酵母細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を酵母細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの酵母細胞における発現を増加させる、
酵母細胞。 - 原核細胞がピキア・パストリス株、ピキア・メタノリカ株、ピキア・アングスタ株、シゾサッカロミセス・ポンベ株、サッカロミセス・セレビシェ株またはヤロウイア・リポリティカ株を含む、請求項89の細胞。
- 酵母細胞がピキア・パストリスの株である、請求項89の細胞。
- 発現コンストラクトが酵母細胞に一過性に含有される、請求項89の細胞。
- 発現コンストラクトが酵母細胞に安定に含有される、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項89の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項89の細胞。
- 発現ベクターが酵母発現ベクターである、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項89の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項89の細胞。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、昆虫細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの昆虫細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項102の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項102の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項102の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項102の分子。
- 昆虫細胞がヨトウガ(Spodoptera frugiperda)株、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)株、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)株またはタバコスズメガ(Manduca sexta)株を含む、請求項102の分子。
- 昆虫細胞がヨトウガ細胞系、イラクサギンウワバ細胞系、キイロショウジョウバエ細胞系またはタバコスズメガ細胞系を含む、請求項102の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項102の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項102の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項102の分子。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を昆虫細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの昆虫細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項112の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項112の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項112の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項112の分子。
- 昆虫細胞がヨトウガ株、イラクサギンウワバ株、キイロショウジョウバエ株またはタバコスズメガ株を含む、請求項112の分子。
- 昆虫細胞がヨトウガ細胞系、イラクサギンウワバ細胞系、キイロショウジョウバエ細胞系またはタバコスズメガ細胞系を含む、請求項112の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項112の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項112の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項112の分子。
- 配列番号58、配列番号59、配列番号60 配列番号61、配列番号62または配列番号63を含む改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号60を含む、請求項122の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号63を含む、請求項122の分子。
- 発現コンストラクトを含む、請求項122の分子。
- 発現コンストラクトを含む昆虫細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、昆虫細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの昆虫細胞における発現を増加させる、
昆虫細胞。 - 昆虫細胞がヨトウガ株、イラクサギンウワバ株、キイロショウジョウバエ株またはタバコスズメガ株を含む、請求項126の細胞。
- 昆虫細胞がヨトウガ細胞系、イラクサギンウワバ細胞系、キイロショウジョウバエ細胞系またはタバコスズメガ細胞系を含む、請求項126の細胞。
- 発現コンストラクトが昆虫細胞に一過性に含有される、請求項126の細胞。
- 発現コンストラクトが昆虫細胞に安定に含有される、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項126の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項126の細胞。
- 発現ベクターが昆虫発現ベクターである、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項126の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項126の細胞。
- 発現コンストラクトを含む昆虫細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を昆虫細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの昆虫細胞における発現を増加させる、
昆虫細胞。 - 昆虫細胞がヨトウガ株、イラクサギンウワバ株、キイロショウジョウバエ株またはタバコスズメガ株を含む、請求項139の細胞。
- 昆虫細胞がヨトウガ細胞系、イラクサギンウワバ細胞系、キイロショウジョウバエ細胞系またはタバコスズメガ細胞系を含む、請求項139の細胞。
- 発現コンストラクトが昆虫細胞に一過性に含有される、請求項139の細胞。
- 発現コンストラクトが昆虫細胞に安定に含有される、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項139の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項139の細胞。
- 発現ベクターが昆虫発現ベクターである、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項139の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項139の細胞。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、哺乳動物細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの哺乳動物細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項152の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項152の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項152の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項152の分子。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、霊長類細胞またはヒト細胞を含む、請求項152の分子。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞系、ラット細胞系、ハムスター細胞系、ブタ細胞系、ウシ細胞系、ウマ細胞系、霊長類細胞系またはヒト細胞系を含む、請求項152の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項152の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項152の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項152の分子。
- 活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を哺乳動物細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの哺乳動物細胞における発現を増加させる、
核酸分子。 - 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項162の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項162の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項162の分子。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項162の分子。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、霊長類細胞またはヒト細胞を含む、請求項162の分子。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞系、ラット細胞系、ハムスター細胞系、ブタ細胞系、ウシ細胞系、ウマ細胞系、霊長類細胞系またはヒト細胞系を含む、請求項162の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項162の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項162の分子。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項162の分子。
- 配列番号76 配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98または配列番号99を含む改変オープンリーディングフレームを含む核酸分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号78を含む、請求項172の分子。
- 改変オープンリーディングフレームが配列番号99を含む、請求項172の分子。
- 発現コンストラクトを含む、請求項172の分子。
- 発現コンストラクトを含む哺乳動物細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、哺乳動物細胞が好む同義コドンの数を増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの哺乳動物細胞における発現を増加させる、
哺乳動物細胞。 - 哺乳動物細胞がマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、霊長類細胞またはヒト細胞を含む、請求項176の細胞。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞系、ラット細胞系、ハムスター細胞系、ブタ細胞系、ウシ細胞系、ウマ細胞系、霊長類細胞系またはヒト細胞系を含む、請求項176の細胞。
- 発現コンストラクトが哺乳動物に一過性に含有される、請求項176の細胞。
- 発現コンストラクトが哺乳動物細胞に安定に含有される、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも100個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも300個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、少なくとも500個の同義コドンを変化させるヌクレオチド変化を含む、請求項176の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項176の細胞。
- 発現ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項176の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項176の細胞。
- 発現コンストラクトを含む哺乳動物細胞であって、発現コンストラクトが
i)活性BoNT/Aをコードする改変オープンリーディングフレーム、および
ii)発現ベクター
を含み、
改変オープンリーディングフレームが、同じ活性BoNT/Aをコードする無改変オープンリーディングフレームと比較して、総G+C含量を哺乳動物細胞が好むレベルまで増加させるヌクレオチド変化を含み、そして
改変オープンリーディングフレームが、コードされている活性BoNT/Aの哺乳動物細胞における発現を増加させる、
哺乳動物細胞。 - 哺乳動物細胞がマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、霊長類細胞またはヒト細胞を含む、請求項189の細胞。
- 哺乳動物細胞がマウス細胞系、ラット細胞系、ハムスター細胞系、ブタ細胞系、ウシ細胞系、ウマ細胞系、霊長類細胞系またはヒト細胞系を含む、請求項189の細胞。
- 発現コンストラクトが哺乳動物細胞に一過性に含有される、請求項189の細胞。
- 発現コンストラクトが哺乳動物細胞に安定に含有される、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも30%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも40%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームが、総G+C含量を少なくとも50%まで増加させるヌクレオチド変化を含む、請求項189の細胞。
- 活性BoNT/Aが配列番号1、配列番号111または配列番号113を含む、請求項189の細胞。
- 発現ベクターが哺乳動物発現ベクターである、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも2倍は高い、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも5倍は高い、請求項189の細胞。
- 改変オープンリーディングフレームからの活性BoNT/Aの増加した発現が、無改変オープンリーディングフレームからの同じ活性BoNT/Aの発現レベルと比較して、少なくとも10倍は高い、請求項189の細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US59912104P | 2004-08-04 | 2004-08-04 | |
PCT/US2005/027917 WO2006017749A2 (en) | 2004-08-04 | 2005-08-03 | Optimizing expression of active botulinum toxin type a |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008508886A true JP2008508886A (ja) | 2008-03-27 |
JP2008508886A5 JP2008508886A5 (ja) | 2008-09-18 |
Family
ID=35355531
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007525034A Pending JP2008508886A (ja) | 2004-08-04 | 2005-08-03 | 活性ボツリヌス毒素a型の発現の最適化 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20080057575A1 (ja) |
EP (1) | EP1773874B1 (ja) |
JP (1) | JP2008508886A (ja) |
AU (1) | AU2005271372B2 (ja) |
CA (1) | CA2575994A1 (ja) |
WO (1) | WO2006017749A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018502580A (ja) * | 2015-01-09 | 2018-02-01 | イプセン・バイオイノベーション・リミテッドIpsen Bioinnovation Limited | 陽イオン性神経毒 |
JP2021517825A (ja) * | 2018-01-30 | 2021-07-29 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーションChildren’S Medical Center Corporation | Bacillus系を用いたボツリヌスニューロトキシンの生産 |
Families Citing this family (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7514088B2 (en) | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
CA2575994A1 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-16 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active botulinum toxin type a |
CA2588758C (en) * | 2004-11-22 | 2017-01-03 | New York University | Genetically engineered clostridial genes, proteins encoded by the engineered genes, and uses thereof |
DK2154151T3 (da) | 2005-09-19 | 2011-09-05 | Allergan Inc | Clostridiumtoksinaktiverbare clostridiumtoksiner |
US8168206B1 (en) | 2005-10-06 | 2012-05-01 | Allergan, Inc. | Animal protein-free pharmaceutical compositions |
WO2007142954A2 (en) * | 2006-05-30 | 2007-12-13 | Dow Global Technologies Inc. | Codon optimization method |
CA2693958A1 (en) | 2007-06-14 | 2008-12-18 | Emergent Biosolutions, Inc. | Chemically modified peptides with improved immunogenicity |
CA2746425C (en) | 2008-12-10 | 2016-05-03 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
EP2218783A1 (en) | 2009-02-05 | 2010-08-18 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel method for the manufacturing of neurotoxins |
EP2406629B9 (en) | 2009-03-13 | 2014-03-26 | Allergan, Inc. | Immuno-based retargeted endopeptidase activity assays |
CN102753681A (zh) | 2009-12-16 | 2012-10-24 | 阿勒根公司 | 包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素 |
PT2528940E (pt) | 2010-01-25 | 2014-06-24 | Allergan Inc | Métodos de conversão intracelular de proteínas de cadeia única na sua forma de cadeia dupla |
EP2528941A4 (en) * | 2010-01-25 | 2013-05-29 | Univ New York | RECOMBINANT BOTULINUM NEUROTOXIN DERIVATIVES MODIFIED FOR TRAFFIC STUDIES AND NEURONAL DELIVERY |
EP2643457B1 (en) | 2010-11-23 | 2015-08-26 | Allergan, Inc. | Compositions and methods of producing enterokinase in yeast |
US20120244188A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-09-27 | Allergan, Inc. | Treatment of Sensory Disturbance Disorders |
US20120251575A1 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase Treatment of Involuntary Movement Disorders |
US20120251574A1 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase and Neurotoxin Combination Treatment of Multiple Medical Conditions |
US20120251573A1 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase Treatment of Neuroendocrine Disorders |
US20120251518A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase Treatment of Sexual Dysfunction Disorders |
US20120251515A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase Treatment of Cosmesis Disorders |
US20120258132A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-11 | Allergan, Inc. | Vagal Nerve-Based Disorders |
US20120251519A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase Treatment of Smooth Muscle Disorders |
US8849411B2 (en) * | 2011-05-17 | 2014-09-30 | Boston Scientific Neuromodulation Corporation | User-defined graphical shapes used as a visualization aid for stimulator programming |
WO2012174123A1 (en) | 2011-06-13 | 2012-12-20 | Allergan, Inc. | Treatment of psychological trauma |
WO2013091895A1 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel method for the manufacturing of di-chain proteins for use in humans |
US20130171122A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Allergan, Inc. | Endopeptidase and neurotoxin combination treatment of bladder disorders |
KR20180077343A (ko) | 2012-11-21 | 2018-07-06 | 입센 바이오이노베이션 리미티드 | 단백질 가수분해 처리된 폴리펩티드의 제조방법 |
US9315549B2 (en) | 2013-01-28 | 2016-04-19 | New York University | Treatment methods using atoxic neurotoxin derivatives |
KR20150127585A (ko) | 2013-03-15 | 2015-11-17 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 보툴리누스균의 혈청형으로부터의 중쇄를 사용한 1가 또는 다가 보툴리늄 신경독소 기반 백신 |
ES2704237T3 (es) | 2014-03-05 | 2019-03-15 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto |
EP3230457B1 (en) | 2014-12-09 | 2021-06-30 | New York University | Clostridial neurotoxin fusion proteins, propeptide fusions, their expression, and use |
CN107207586B (zh) | 2014-12-19 | 2021-07-13 | 莫茨药物股份两合公司 | 用于测定BoNT/E在细胞中的生物活性的装置和方法 |
TW201718627A (zh) | 2015-06-11 | 2017-06-01 | 梅茲製藥有限兩合公司 | 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞 |
WO2017125487A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect |
JP2019507118A (ja) | 2016-03-02 | 2019-03-14 | メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー | ボツリヌス毒素を含む組成物 |
EP3290437A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-07 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant clostridial neurotoxins with decreased duration of effect |
MX2019002835A (es) | 2016-09-13 | 2019-09-04 | Allergan Inc | Composiciones no proteínicas de toxina clostridial. |
EP3312193A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-25 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with accelerated onset of effect |
EP3333179A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-13 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum toxin with accelarated onset of effect |
EP3335719A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-20 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with a stabilized light chain |
WO2018233813A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM TOXINS WITH INCREASED DURATION |
ES2930237T3 (es) | 2017-07-06 | 2022-12-09 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas con mayor duración de efectos |
EP3700919A1 (en) | 2017-10-26 | 2020-09-02 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect |
US20200354706A1 (en) | 2017-11-22 | 2020-11-12 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
US11707510B2 (en) * | 2018-02-16 | 2023-07-25 | Preclinics Discovery Gmbh | Nucleic acid-based botulinum neurotoxin for therapeutic use |
EP3931319A1 (en) * | 2019-02-28 | 2022-01-05 | ProteoNic Biotechnology IP B.V. | Self-immolative plasmid backbone |
US20240158773A1 (en) * | 2021-03-15 | 2024-05-16 | Children's Medical Center Cprporation | Engineered botulinum neurotoxin a protease domain with improved efficacy |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000067700A2 (en) * | 1999-05-12 | 2000-11-16 | United States Army Medical Research & Materiel Cmd | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
JP2003137897A (ja) * | 1994-10-24 | 2003-05-14 | Promega Corp | 可溶性組換えボツリヌス毒素タンパク |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2003383A1 (en) * | 1988-11-23 | 1990-05-23 | Sushil G. Devare | Synthetic dna derived recombinant hiv antigens |
UA48104C2 (uk) * | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника |
US7214787B1 (en) * | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
US7037680B2 (en) * | 1993-09-21 | 2006-05-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy |
US6114148C1 (en) * | 1996-09-20 | 2012-05-01 | Gen Hospital Corp | High level expression of proteins |
WO1999002677A1 (fr) * | 1997-07-11 | 1999-01-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene issu de chondrocyte humain |
US6277622B1 (en) * | 1997-08-11 | 2001-08-21 | The University Of Sydney | Synthetic polynucleotides |
US6218188B1 (en) * | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
US6214602B1 (en) * | 1998-08-28 | 2001-04-10 | Promega Corporation | Host cells for expression of clostridial toxins and proteins |
US6399857B1 (en) * | 1999-09-22 | 2002-06-04 | Paradigm Genetics, Inc. | Modified nucleotide sequence encoding a LexA DNA binding domain optimized for arabidopsis species |
AU2002211524B2 (en) * | 2000-10-04 | 2007-03-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Highly expressible genes |
AU2003249208B2 (en) * | 2002-07-16 | 2010-03-04 | Vgx Pharmaceuticals, Llc | Codon optimized synthetic plasmids |
CA2575994A1 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-16 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active botulinum toxin type a |
-
2005
- 2005-08-03 CA CA002575994A patent/CA2575994A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-03 WO PCT/US2005/027917 patent/WO2006017749A2/en active Application Filing
- 2005-08-03 JP JP2007525034A patent/JP2008508886A/ja active Pending
- 2005-08-03 EP EP05778839A patent/EP1773874B1/en not_active Revoked
- 2005-08-03 AU AU2005271372A patent/AU2005271372B2/en not_active Ceased
- 2005-08-03 US US11/570,706 patent/US20080057575A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-08-15 US US12/192,873 patent/US20090023198A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003137897A (ja) * | 1994-10-24 | 2003-05-14 | Promega Corp | 可溶性組換えボツリヌス毒素タンパク |
WO2000067700A2 (en) * | 1999-05-12 | 2000-11-16 | United States Army Medical Research & Materiel Cmd | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GENE, vol. 315, JPN6011005605, 2003, pages 21 - 32, ISSN: 0001840341 * |
TOXICON, vol. 36, no. 11, JPN6011005607, 1998, pages 1539 - 1548, ISSN: 0001840342 * |
TRENDS. BIOTECHNOL., vol. 22, no. 7, JPN6011005611, July 2004 (2004-07-01), pages 346 - 353, ISSN: 0001840343 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018502580A (ja) * | 2015-01-09 | 2018-02-01 | イプセン・バイオイノベーション・リミテッドIpsen Bioinnovation Limited | 陽イオン性神経毒 |
JP2021517825A (ja) * | 2018-01-30 | 2021-07-29 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーションChildren’S Medical Center Corporation | Bacillus系を用いたボツリヌスニューロトキシンの生産 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2575994A1 (en) | 2006-02-16 |
WO2006017749A3 (en) | 2006-03-30 |
EP1773874B1 (en) | 2012-10-24 |
AU2005271372B2 (en) | 2012-05-03 |
US20080057575A1 (en) | 2008-03-06 |
US20090023198A1 (en) | 2009-01-22 |
AU2005271372A1 (en) | 2006-02-16 |
EP1773874A2 (en) | 2007-04-18 |
WO2006017749A2 (en) | 2006-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7825233B2 (en) | Optimizing expression of active Botulinum Toxin type E | |
EP1773874B1 (en) | Optimizing expression of active botulinum toxin type a | |
DK1926744T4 (en) | CLOSTRIDIUM TOXIN-ACTIVABLE CLOSTRIDIAL TOXINES | |
EP2178905B1 (en) | Methods of activiting clostridial toxins | |
EP1784420A1 (en) | Degradable clostridial toxins | |
CA2657521A1 (en) | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells | |
US20110111483A1 (en) | Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E | |
US20130245227A1 (en) | Methods of activating clostridial toxins | |
AU2013204638A1 (en) | Optimizing expression of active botulinum toxin type A | |
AU2012211346A1 (en) | Optimizing expression of active botulinum toxin type A | |
AU2012201413A1 (en) | Clostridial toxin activatable clostridial toxins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080730 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080730 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110208 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110509 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110516 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110608 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110615 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110707 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110714 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111018 |