CN102753681A - 包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素 - Google Patents

Abstract

本说明书公开经过修饰的梭菌毒素、包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的组合物、编码此类经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子和包含此类经过修饰的梭菌毒素的双链形式的组合物。

Description

包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

本申请要求2009年12月16日提交的美国临时专利申请第61/286,954号的权益，所述申请的全文以引用的方式并入本文。

梭菌毒素(诸如肉毒杆菌神经毒素(Botulinum neurotoxin；BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(Tetanus neurotoxin；TeNT))抑制神经传递的能力已在多种治疗和美容应用中得到应用，参见例如William J.Lipham，COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN(Slack，Inc.，2004)。可作为药物组合物商购得到的梭菌毒素包括BoNT/A制剂，如

(Allergan，Inc.，Irvine，CA)、

(Beaufour Ipsen，Porton Down，England)、

(Medy-Tox，Inc.，Ochang-myeon，South Korea)、BTX-A(Lanzhou Institute Biological Products，China)和(Merz Pharmaceuticals，GmbH.，Frankfurt，Germany)；以及BoNT/B制剂，如MYOBLOC^TM/NEUROBLOC^TM(Elan Pharmaceuticals，San Francisco，CA)。作为实例，当前已在一个或多个国家获得批准用于以下适应症：迟缓不能、成人痉挛状态、肛裂、背痛、眼睑痉挛、磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间纹或过动性面部皱纹、头痛、半面痉挛、膀胱过动症、多汗症、青少年大脑性瘫痪、多发性硬化症、肌阵挛性病症、鼻唇纹、痉挛性发音困难、斜视和VII神经病症。

梭菌毒素治疗通过干扰用于分泌神经递质至突触间隙中的胞外分泌过程来抑制神经递质释放。制药工业非常希望将梭菌毒素疗法的使用扩展至其当前肌肉松弛性应用以外，以治疗基于感觉神经的疾病，如各种慢性疼痛、神经性炎症和泌尿生殖器病症，以及非基于神经元的病症，如胰腺炎。当前用于扩展基于梭菌毒素的疗法的一种方法涉及修饰梭菌毒素，以使得经过修饰的毒素对非梭菌毒素靶细胞具有改变的细胞靶向能力。此再靶向能力通过将梭菌毒素的天然存在的靶向结构域置换为对存在于非梭菌毒素靶细胞中的非梭菌毒素受体显示选择性结合活性的靶向结构域来达到。对靶向结构域的所述修饰产生能够选择性结合存在于非梭菌毒素靶细胞上的非梭菌毒素受体(靶受体)的修饰毒素(再靶向)。对非梭菌毒素靶细胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素可结合存在于非梭菌毒素靶细胞上的受体，移位至细胞质中，且对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物发挥其蛋白水解作用。

对非梭菌毒素靶细胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素的非限制性实例描述于以下文献中：例如Keith A.Foster等，Clostridial ToxinDerivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions，美国专利5,989,545(1999年11月23日)；Clifford C.Shone等，RecombinantToxin Fragments，美国专利6,461,617(2002年10月8日)；Conrad P.Quinn等，Methods and Compounds for the Treatment of MucusHypersecretion，美国专利6,632,440(2003年10月14日)；Lance E.Steward等，Methods And Compositions For The Treatment OfPancreatitis，美国专利6,843,998(2005年1月18日)；Stephan Donovan，Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain，美国专利公布2002/0037833(2002年3月28日)；Keith A.Foster等，Inhibition ofSecretion from Non-neural Cells，美国专利公布2003/0180289(2003年9月25日)；J.Oliver Dolly等，Activatable Recombinant Neurotoxins，WO2001/014570(2001年3月1日)；Keith A.Foster等,Re-targeted ToxinConjugates，国际专利公布WO 2005/023309(2005年3月17日)；和Lance E.Steward等，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives andMethods of Their Use，美国专利申请No.11/376,696(2006年3月15日)。与梭菌毒素相关的再靶向治疗作用的能力已极大扩展了能够使用梭菌毒素疗法的医学应用的数量。作为非限制性实例，再靶向感觉神经元的修饰梭菌毒素适用于治疗各种慢性疼痛，如痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛和炎症性疼痛，参见例如Foster，同上，(1999)；和Donovan，同上，(2002)；和Stephan Donovan，Method For TreatingNeurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance PComponents，美国专利7,022,329(2006年4月4日)。作为另一非限制性实例，再靶向胰腺细胞的修饰梭菌毒素适用于治疗胰腺炎，参见例如Steward，同上，(2005)。

开发再靶向梭菌毒素期间揭示的一个意外发现涉及靶向部分的安置或呈现形式。如下文所进一步论述，将天然存在的梭菌毒素组织化成三个主要结构域，其按线性氨基至羧基单一多肽顺序包含酶促结构域(氨基区位置)、移位结构域(中部区位置)和结合结构域(羧基区位置)(图2)。此天然存在的顺序可称为靶向部分的羧基呈现形式，因为结合细胞表面受体所必需的结构域位于梭菌毒素的羧基区位置。然而，已证实可通过重排三个主要结构域的线性氨基至羧基单一多肽顺序并将靶向部分定位于梭菌毒素的氨基区位置(称为氨基呈现形式)以及中部区位置(称为中心呈现形式)对梭菌毒素进行修饰(图2)。虽然已证明梭菌毒素结构域的此重排和靶向部分的定位是成功的，但对于适当受体结合需要游离氨基端的一类靶向部分来说仍然存在问题。

与适当受体结合需要游离氨基端的靶向部分相关的问题起源于天然存在抑或经过修饰的梭菌毒素实际上加工成双链形式以便获得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自翻译成约150kDa的单链多肽，其随后通过天然存在的蛋白酶在二硫环内进行蛋白水解切断而裂解(图1)。此裂解发生于形成二硫桥键的两个半胱氨酸残基之间产生的离散双链环区内。此翻译后加工产生包含约50kDa轻链(LC)、包含酶促结构域和约100kDa重链(HC)、包含移位和细胞结合结构域的双链分子，所述LC和HC由单个二硫键和非共价相互作用保持在一起(图1)。重组产生的梭菌毒素通常将天然存在的双链环蛋白酶裂解位点取代为外源蛋白酶裂解位点(图2)。参见例如Dolly，J.O.等，Activatable Clostridial Toxins，美国专利No.7,419,676(2008年9月2日)，其以引用的方式并入本文。尽管再靶向梭菌毒素的总体分子量因靶向部分的大小而不同，但活化过程和其对外源裂解位点的依赖性基本上与重组产生的梭菌毒素相同。参见例如Steward，L.E.等，Activatable Clostridial Toxins，美国专利申请No.12/192,900(2008年8月15日)；Steward，L.E.等，Modified Clostridial Toxins with EnhancedTranslocation Capabilities and Altered Targeting Activity ForNon-Clostridial Toxin Target Cells，美国专利申请No.11/776,075(2007年7月11日)；Steward，L.E.等,Modified Clostridial Toxins withEnhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity forClostridial Toxin Target Cells，美国专利申请No.11/776,052(2007年7月11日)，每一文献以引用的方式并入本文。一般来说，使用外源蛋白酶将单链多肽转化成其双链形成的活化过程可用于加工具有组织化成氨基呈现形式、中心呈现形式或羧基呈现形式排列的靶向部分的再靶向梭菌毒素。这是因为对于大部分靶向部分来说，所述部分的氨基端不参与受体结合。因而，多种蛋白酶裂解位点可用于产生梭菌毒素或再靶向梭菌毒素的活性双链形式。然而，受体结合需要游离氨基端的靶向部分为此一般情况的例外，因为在此情况下，所述部分的氨基端对于适当受体结合来说必不可少。因此，不能使用可切断键不位于蛋白酶裂解位点的羧基端的蛋白酶裂解位点，因为所述位点在靶向部分的氨基端留下裂解位点的残余部分。因此，即使所述再靶向毒素将被加工成双链形式，所述毒素也将会因为靶向部分不能结合其同源受体而无活性，因为裂解位点残余部分会遮蔽靶向部分中对于受体结合功能来说必不可少的氨基端氨基酸。

举例来说，再靶向梭菌毒素按氨基至羧基线性顺序包含酶促结构域、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、结合结构域和移位结构域(中心呈现形式排列)。人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点包含共有序列P₅-P₄-L-F-Q↓-G-P-P₃'-P₄'-P₅'(SEQ ID NO:1)，其中P₅优选是D或E；P₄为G、A、V、L、I、M、S或T；且P₃'、P₄'和P₅'可为任何氨基酸。Q-G可切断键裂解后，裂解位点的GP残余部分变成含于结合结构域内的靶向部分的氨基端。一般来说，此残余部分不干扰靶向部分与其同源受体的结合。一个例外为适当受体结合需要游离氨基端的靶向部分。在此情况下，人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点的GP残余部分会遮蔽靶向部分中适当结合所必需的游离氨基端，由此使经过修饰的梭菌毒素因不能结合其受体和内化至细胞中而无活性。

迄今为止，仅发现两种蛋白酶，因子Xa和肠激酶，适用于活化具有适当受体结合需要游离氨基端的靶向部分的再靶向梭菌毒素。因子Xa裂解位点P₅-I(E/D)GR↓-P_1’-P_2’-P_3’-P_4’-P_5’(SEQ ID NO:2)(其中P₅、P_1’、P_2’、P_3’、P_4’和P_5’可为任何氨基酸)为在P₁精氨酸的羧基侧裂解的位点特异性蛋白酶裂解位点。类似地，肠激酶裂解位点DDDDK↓-P_1’-P_2’-P_3’-P_4’-P_5’(SEQ ID NO:3)(其中P_1’、P_2’、P_3’、P_4’和P_5’可为任何氨基酸)为在P₁赖氨酸的羧基侧裂解的位点特异性蛋白酶裂解位点。任一位点处的蛋白水解产生氨基端完整的靶向部分，因为其不留下裂解位点残余部分。尽管其它蛋白酶可在其裂解位点的羧基端裂解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、V8蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、CNBr、Arg-C、Glu-C、Lys-C和Tyr-C，但所述位点本身为非特异性的。因此，所述蛋白酶不适用，因为其将裂解再靶向毒素的其它区，由此使毒素失活。然而，存在与因子Xa和肠激酶相关的若干问题。关于因子Xa，此蛋白酶仅可以从血源性来源纯化的产品形式获得，当前并不存在重组产生的因子Xa可购得。因此，因子Xa因对血源性试剂的健康顾虑和使用所述产品的高成本而不适于制造药物。

类似地，肠激酶具有使得制造药物困难和成本高的若干缺点。首先，肠激酶缺乏现行药品生产管理规范(current Good ManufacturePractices；cGMP)批准且试图获得所述批准为耗时且耗费大的过程。第二，众所周知此蛋白酶难以重组产生，因为肠激酶为含有四个二硫键的26.3kDa大分子。因此，难以使用更加成本有效的基于细菌的表达系统，因为所述系统缺乏产生二硫键的能力。然而，使用基于真核生物的表达系统也具有若干缺点。一个缺点为绝大部分重组产生的肠激酶隔离于包涵体中，致使难以纯化足量的此蛋白酶。取决于所使用的真核细胞，另一缺点为在制造过程中可能需要额外纯化步骤以得到GMP批准。另一缺点为因子Xa和肠激酶均裂解底物中预定靶位点以外的位置，尤其当在高浓度下使用时。因此，所述问题对使用因子Xa或肠激酶用于商业生产包含具有游离氨基端的靶向部分的双链再靶向梭菌毒素造成明显障碍，因为其为成本高、低效且费力的过程，显著增加制造作为生物药物的所述再靶向梭菌毒素的总体成本。

本说明书公开不依赖于因子Xa或肠激酶来将毒素加工成其双链形式的包含具有游离氨基端的靶向部分的修饰梭菌毒素。此举通过将新的蛋白酶裂解位点与靶向部分整合以使得裂解后产生受体结合所必需的适当氨基端来完成。

因此，本发明的方面提供包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的修饰梭菌毒素。设想可通过并入蛋白酶裂解位点结合结构域来修饰包含适当受体结合需要游离氨基端的结合结构域的任何梭菌毒素。所述梭菌毒素描述于以下文献中：例如Steward，L.E.等，MultivalentClostridial Toxins，美国专利申请No.12/210,770(2008年9月15日)；Steward，L.E.等，Activatable Clostridial Toxins，美国专利申请No.12/192,900(2008年8月15日)；Steward，L.E.等，Modified ClostridialToxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingActivity For Non-Clostridial Toxin Target Cells，美国专利申请No.11/776，075(2007年7月11日)；Steward，L.E.等，Modified ClostridialToxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingActivity for Clostridial Toxin Target Cells，美国专利申请No.11/776,052(2007年7月11日)；Foster，K.A.等，Fusion Proteins，美国专利申请No.11/792,210(2007年5月31日)；Foster，K.A.等,Non-CytotoxicProtein Conjugates，美国专利申请No.11/791,979(2007年5月31日)；Steward，L.E.等，Activatable Clostridial Toxins，美国专利公布No.2008/0032931(2008年2月7日)；Foster，K.A.等,Non-CytotoxicProtein Conjugates，美国专利公布No.2008/0187960(2008年8月7日)；Steward，L.E.等，Degradable Clostridial Toxins，美国专利公布No.2008/0213830(2008年9月4日)；Steward，L.E.等，Modified ClostridialToxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingActivity For Clostridial Toxin Target Cells，美国专利公布No.2008/0241881(2008年10月2日)；和Dolly，J.O.等,ActivatableClostridial Toxins，美国专利No.7,419,676(2008年9月2日)，每一文献的全文以引用的方式并入本文。

本发明的其它方面提供编码包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的修饰梭菌毒素的多核苷酸分子。编码本说明书中所公开的修饰梭菌毒素的多核苷酸分子可进一步包含表达载体。

本发明的其它方面提供包含本说明书中所公开的修饰梭菌毒素的双链形式的组合物。包含本说明书中所公开的修饰梭菌毒素的双链形式的组合物可为药物组合物。所述药物组合物除本说明书中所公开的修饰梭菌毒素外，还可包含药用载体、药用组分或两者。

附图简述

图1示出天然存在的梭菌毒素的结构域组织。单链形式描绘包含酶促结构域、移位结构域和H_C结合结构域的氨基至羧基线性组织。位于移位和酶促结构域之间的双链环区由双重SS括号描绘。此区包含内源性双链环蛋白酶裂解位点，其在被天然存在的蛋白酶(如内源性梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶)蛋白水解裂解后使毒素的单链形式转化为双链形式。

图2示出以结合结构域的羧基呈现形式、结合结构域的中心呈现形式和结合结构域的氨基呈现形式排列的梭菌毒素的结构域组织。位于移位和酶促结构域之间的双链环区由双重SS括号描绘。此区包含内源性蛋白酶裂解位点，其在由其同源蛋白酶裂解后使毒素的单链形式转化为双链形式。

图3示出中枢和周边神经元中神经递质释放和梭菌毒素中毒的当前范例的示意图。图3A示出中枢和周边神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可描述为包括两个步骤：1)囊泡对接，其中含有神经递质分子的囊泡上的囊泡结合型SNARE蛋白与位于质膜上的膜结合型SNARE蛋白缔合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合且神经递质分子分泌至胞外。图3B示出中枢和周边神经元中破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的中毒机制的示意图。此中毒过程可描述为包括四个步骤：1)受体结合，其中梭菌毒素结合于梭菌毒素受体系统且启动中毒过程；2)复合物内化，其中毒素结合后，含有毒素/受体系统复合物的囊泡内吞至细胞中；3)轻链移位，其中认为发生多个事件，包括例如囊泡的内部pH值改变、形成包含梭菌毒素重链的H_N结构域的通道孔、梭菌毒素轻链与重链分离和活性轻链释放；和4)酶促标靶修饰，其中梭菌毒素的活性轻链蛋白水解裂解其标靶SNARE底物，如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡对接和神经递质释放。

由肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风芽孢梭菌(Clostridium tetani)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)产生的梭菌毒素在人和其它哺乳动物的治疗性和美容性治疗中使用最广泛。肉毒芽孢梭菌的菌株产生七种抗原性不同的肉毒杆菌毒素(BoNT)类型，其已通过研究人类(BoNT/A、/B、/E和/F)、动物(BoNT/C1和/D)中的肉毒杆菌中毒爆发得到鉴别或从土壤分离(BoNT/G)。BoNT彼此具有约35%氨基酸一致性且共享相同的功能性结构域组织和总体结构架构。本领域的技术人员已认识到，在梭菌毒素的各类型内，可存在氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸稍有不同的亚型。举例来说，当前存在四种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，其中特定亚型当与另一BoNT/A亚型相比较时显示约89%氨基酸一致性。虽然所有七种BoNT血清型都具有类似的结构和药理学性质，但各自还显示异源的细菌学特征。相比之下，破伤风毒素(TeNT)由破伤风芽孢梭菌的均一族群产生。两个其它梭菌物种巴氏梭菌和丁酸梭菌产生毒素BaNT和BuNT，其分另类似于BoNT/F和BoNT/E。

各成熟双链分子包含三个功能上不同的结构域：1)位于LC中的酶促结构域，其包括含有特异性靶向神经递质释放机构核心组分的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区；2)含于HC的氨基端部分(H_N)中的移位结构域，其促进LC从细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中；3)存在于HC的羧基端部分(H_C)中的结合结构域，其确定毒素对位于靶细胞表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性。H_C结构域包含两个大小大致相等的不同结构特征，其指定功能且称为H_CN和H_CC子结构域。表1给出示例性梭菌毒素中存在的各结构域的大致边界区。

此等三个功能性结构域的结合、移位和酶促活性对于毒性来说都是必需的。虽然并不完全了解此过程的所有细节，但梭菌毒素借以进入神经元和抑制神经递质释放的总体细胞中毒机制为类似的，而与血清型或亚型无关。尽管本申请者不希望受限于以下描述，但中毒机制可描述为包括至少四个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链移位，和4)酶促标靶修饰(图3)。当梭菌毒素的H_C结构域结合于位于靶细胞质膜表面上的毒素特异性受体系统时，所述过程被启动。认为受体复合物的结合特异性可部分由神经节苷脂与似乎明显构成各梭菌毒素受体复合物的蛋白质受体的特定组合达到。一旦结合，毒素/受体复合物就通过内吞作用内化且内化的囊泡被分选至特定细胞内途径。移位步骤似乎由囊泡隔室的酸化触发。此过程似乎启动增加疏水性和促进毒素的双链形式形成的两个重要的pH值依赖性结构重排。一旦活化，毒素的轻链内肽酶就从细胞内囊泡释放至细胞溶质中，在细胞溶质中其似乎特异性靶向神经递质释放机构的三种已知核心组分之一。所述核心蛋白囊泡相关性膜蛋白(VAMP)/突触泡蛋白(synaptobrevin)、25kDa突触相关蛋白(SNAP-25)和突触融合蛋白为突触囊泡对接和融合于神经末端所必需且构成可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子连接蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitivefactor-attachment protein-receptor；SNARE)-家族的膜。BoNT/A和BoNT/E裂解SNAP-25的羧基端区，从而分别释放9个或26个氨基酸的区段，且BoNT/C1也在SNAP-25的羧基端附近裂解。肉毒杆菌血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G和破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，且使VAMP的氨基端部分释放至细胞溶质中。BoNT/C1在接近细胞溶质膜表面的单一位点处裂解突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解在体内造成由梭菌毒素引起的神经递质释放阻断。梭菌毒素的SNARE蛋白标靶为多种非神经元类型中的胞外分泌所共有；在这些细胞中，与在神经元中一样，轻链肽酶活性抑制胞外分泌，参见例如Yann Humeau等，How Botulinum and TetanusNeurotoxins Block Neurotransmitter Release，82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等，Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure，Function and Therapeutic Utility，27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli等，The Journey of Tetanus and BotulinumNeurotoxins in Neurons，11(9)Trends Microbiol.431-437，(2003)。

在本发明的一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含单链修饰梭菌毒素和双链修饰梭菌毒素。如上文所述，天然存在抑或非天然存在的梭菌毒素最初合成为单链多肽。此单链形式随后由蛋白酶在位于在形成二硫桥键的两个半胱氨酸残基之间产生的离散双链环区内的蛋白酶裂解位点处裂解。此翻译后加工产生包含轻链(LC)和重链的双链分子。如本文所用，术语“双链环区”是指天然存在或非天然存在的梭菌毒素中由位于LC结构域与HC结构域之间的二硫桥键形成的环区。如本文所用，术语“单链修饰梭菌毒素”是指本说明书中所公开的呈单链形式的任何经过修饰的梭菌毒素，即所述毒素尚未由同源蛋白酶在位于双链环区内的蛋白酶裂解位点处裂解。如本文所用，术语“双链修饰梭菌毒素”是指本说明书中所公开的呈双链形式的任何经过修饰的梭菌毒素，即所述毒素已由同源蛋白酶在位于双链环区内的蛋白酶裂解位点处裂解。

在本发明的一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域。如本文所用，术语“整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域”是指包含蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分和结合结构域的氨基酸序列，其中来自蛋白酶裂解位点P部分的可切断键的P₁位点毗邻结合结构域的氨基端，由此形成整合型蛋白酶裂解位点，其中结合结构域的第一氨基酸充当可切断键的P₁’位点。如下文更详细描述，蛋白酶裂解位点的P部分是指取自蛋白酶裂解位点的经典共有序列(≥P₆-P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'-≥P₆'，其中P₁-P₁'为可切断键)的P部分(≥P₆-P₅-P₄-P₃-P₂-P₁)的氨基酸序列。因此，结合结构域的氨基端氨基酸同时用于形成可切断键和用作结合结构域适当结合其同源受体所必需的结合结构域的第一残基。整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的非限制性实例列于表2中。本领域中已知，当将整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域定位于经过修饰的梭菌毒素的氨基端(氨基呈现形式)时，应添加起始甲硫氨酸来最大化经过修饰的梭菌毒素的表达。另外，蛋白酶裂解位点中包括SEQ ID NO:127的可切断键的P₁位点的P部分，或蛋白酶裂解位点中包括SEQ ID NO:130的可切断键的P₁位点的P部分，可置换表2中所列的蛋白酶整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域中所存在的蛋白酶裂解位点中包括SEQ ID NO:121的可切断键的P₁位点的P部分。

设想蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的任何P部分可与结合结构域联合用于形成整合型蛋白酶裂解位点作为本发明所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的一部分，条件是所得整合型蛋白酶裂解位点由蛋白酶选择性识别，且在蛋白水解裂解后，结合结构域的所产生氨基端能够选择性结合其同源受体。如本文所用，术语“由蛋白酶选择性识别”是指蛋白酶以与完整蛋白酶裂解位点相同或实质上相同的识别程度识别整合型蛋白酶裂解位点的能力，所述完整蛋白酶裂解位点即为未被移除蛋白酶裂解位点中包括P₁'部分的P'部分的经典共有序列或蛋白酶裂解位点。在此实施方案的一方面中，当整合型蛋白酶裂解位点的蛋白酶识别为例如完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少10%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少20%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少30%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少40%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少50%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少60%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少70%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少80%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的至少95%或完整蛋白酶裂解位点的识别程度的100%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在此实施方案的另一方面中，当整合型蛋白酶裂解位点的蛋白酶识别为例如完整蛋白酶裂解位点的识别程度的10%至100%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的10%至90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的10%至80%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的10%至70%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的20%至100%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的20%至90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的20%至80%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的20%至70%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的30%至100%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的30%至90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的30%至80%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的30%至70%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的40%至100%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的40%至90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的40%至80%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的40%至70%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的50%至100%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的50%至90%、完整蛋白酶裂解位点的识别程度的50%至80%或完整蛋白酶裂解位点的识别程度的50%至70%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在另一方面，蛋白酶可以与完整蛋白酶裂解位点相同或实质上相同水平的结合亲和力识别整合型蛋白酶裂解位点，所述完整蛋白酶裂解位点即为未被移除蛋白酶裂解位点中包括P₁'部分的P'部分的经典共有序列或蛋白酶裂解位点。在此实施方案的一方面中，当蛋白酶对整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的结合亲和力为例如对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少10%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少20%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少30%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少40%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少50%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少60%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少70%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少80%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的至少95%或对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的100%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在此实施方案的另一方面中，当蛋白酶对整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的结合亲和力为例如对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的10%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的10%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的10%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的10%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的20%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的20%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的20%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的20%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的30%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的30%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的30%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的30%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的40%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的40%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的40%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的40%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的50%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的50%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的50%至80%或对完整蛋白酶裂解位点的结合亲和力的50%至70%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在另一方面，蛋白酶可以与完整蛋白酶裂解位点相同或实质上相同水平的裂解效率识别整合型蛋白酶裂解位点，所述完整蛋白酶裂解位点即为未被移除蛋白酶裂解位点中包括P₁'部分的P'部分的经典共有序列或蛋白酶裂解位点。在此实施方案的一方面中，当蛋白酶对整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的裂解效率为例如对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少10%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少20%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少30%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少40%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少50%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少60%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少70%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少80%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的至少95%或对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的100%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在此实施方案的另一方面中，当蛋白酶对整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的裂解效率为例如对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的10%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的10%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的10%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的10%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的20%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的20%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的20%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的20%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的30%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的30%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的30%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的30%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的40%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的40%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的40%至80%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的40%至70%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的50%至100%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的50%至90%、对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的50%至80%或对完整蛋白酶裂解位点的裂解效率的50%至70%时，蛋白酶选择性识别整合型蛋白酶裂解位点。

在本发明的一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分。蛋白酶裂解位点的经典共有序列可表示为≥P₆-P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'-≥P₆'，其中P₁-P₁'可切断键。如本文所用，术语“蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分”是指取自经典共有序列中包含可切断键的P₁位点的P部分(≥P₆-P₅-P₄-P₃-P₂-P₁)的氨基酸序列，例如氨基酸序列P₁、P₂-P₁、P₃-P₂-P₁、P₄-P₃-P₂-P₁或P₅-P₄-P₃-P₂-P₁。如本文所用，术语“蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁'位点的P'部分”是指取自经典共有序列中包含可切断键的P₁'位点的P’部分(P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'-≥P₆')的氨基酸序列，例如氨基酸序列P₁'、P₁'-P₂'、P₁'-P₂'-P₃'、P₁'-P₂'-P₃'-P₄'或P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'。

对于位点特异性蛋白酶，大部分存在于此P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'裂解位点序列中的氨基酸高度保守。因此，举例来说，人鼻病毒3C具有共有序列P₅-P₄-L-F-Q-G-P-P₃'-P₄'-P₅'(SEQ ID NO:1)，其中优选P₅位置为D或E；P₄位置为G、A、V、L、I、M、S或T；P₃位置为L；P₂位置为F；P₁位置为Q；P_1’位置为G；且P₂'位置为P。因为，此高度序列保守为裂解特异性或选择性所需，所以改变共有序列通常产生不能由其同源蛋白酶裂解的位点。举例来说，移除人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点(G-P-P₃'-P₄'-P₅'，SEQ ID NO:119)的可切断键的羧基端上的五个残基产生不能由此蛋白酶裂解的仅包含P₅-P₄-L-F-Q(SEQ ID NO:120)的裂解位点。本发明的一个重要方面是发现某些蛋白酶裂解位点可通过移除蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁'位点的P'部分来改造，且仍由其同源蛋白酶特异性或选择性识别。

因此，在一个实施方案中，蛋白酶裂解位点的P部分是可切断键的P₁位点。在此实施方案的方面中，蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分是例如P₂-P₁序列、P₃-P₂-P₁序列、P₄-P₃-P₂-P₁序列、P₅-P₄-P₃-P₂-P₁序列或包括P₅-P₄-P₃-P₂-P₁序列且在氨基方向上延伸超出此序列(即≥P₆)的氨基酸片段。在另一实施方案中，所移除的蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁'位点的P’部分为P₁'位点。在此实施方案的方面中，蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁'位点的P’部分是例如P₁'-P₂'序列、P₁'-P₂'-P₃'序列、P₁'-P₂'-P₃'-P₄'序列、P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'序列或包括P₁'-P₂'-P₃'-P₄'-P₅'序列且在羧基方向上延伸超出此序列(即≥P₆')的氨基酸片段。

在此实施方案的一方面中，蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分包含共有序列E-P₅-P₄-Y-P₂-Q*(SEQ ID NO:121)，其中P₂、P₄和P₅可为任何氨基酸。在所述实施方案的其它方面中，整合型蛋白酶裂解位点为SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126(表3)。在此实施方案的另一方面中，蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分包含共有序列P₅-V-R-F-Q*(SEQ ID NO:127)，其中P₅可为任何氨基酸。在所述实施方案的其它方面中，整合型蛋白酶裂解位点为SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:129(表3)。在此实施方案的另一方面中，蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分包含共有序列P₅-D-P₃-P₂-D*(SEQ ID NO:130)，其中P₅可为任何氨基酸；P₃可为任何氨基酸，优选为E；且P₂可为任何氨基酸。在所述实施方案的其它方面中，整合型蛋白酶裂解位点为SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133(表3)。

在本发明的一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含结合结构域。如本文所用，术语“结合结构域”与“靶向部分”同义，且指在生理条件下优先结合靶细胞所特有的细胞表面标记的氨基酸序列区。细胞表面标记可包含多肽、多糖、脂质、糖蛋白、脂蛋白，或可具有其中多于一种的结构特征。如本文所用，术语“优先结合”是指结合结构域结合其细胞表面标记的能力与结合结构域对任何其它细胞表面标记的结合能力相比相差至少一个数量级。在此实施方案的方面中，当解离常数(K_d)例如比结合结构域对任何其它细胞表面标记的解离常数低至少1个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的解离常数低至少2个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的解离常数低至少3个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的解离常数低至少4个数量级或比结合结构域对任何其它细胞表面标记的解离常数低至少5个数量级时，结合结构域优先结合细胞表面标记。在此实施方案的其它方面中，当解离常数(K_d)为例如至多1×10^-5 M^-1、至多1×10^-6 M^-1、至多1×10^-7 M^-1、至多1×10^-8 M^-1、至多1×10^-9 M^-1、至多1×10^-10 M^-1、至多1×10^-11 M^-1或至多1×10^-10 M^-12时，结合结构域优先结合细胞表面标记。

在此实施方案的其它方面中，当缔合常数(K_a)例如比结合结构域对任何其它细胞表面标记的缔合常数高至少1个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的缔合常数高至少2个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的缔合常数高至少3个数量级、比结合结构域对任何其它细胞表面标记的缔合常数高至少4个数量级或比结合结构域对任何其它细胞表面标记的缔合常数高至少5个数量级时，结合结构域优先结合细胞表面标记。在此实施方案的其它方面中，当缔合常数(K_a)为例如至少1×10^-5 M^-1、至少1×10^-6 M^-1、至少1×10^-7M^-1、至少1×10^-8 M^-1、至少1×10^-9 M^-1或至少1×10^-10 M^-1时，结合结构域优先结合细胞表面标记。

可设想任何结合结构域均可用作本发明所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的一部分。可用作本发明所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的一部分的受体结合需要游离氨基端的结合结构域的实例描述于以下文献中：例如Steward，美国专利申请No.12/210,770，同上，(2008)；Steward，美国专利申请No.12/192,900，同上，(2008)；Steward，美国专利申请No.11/776,075，同上，(2007)；Steward，美国专利申请No.11/776,052，同上，(2007)；Foster，美国专利申请No.11/792,210，同上，(2007)；Foster，美国专利申请No.11/791,979，同上，(2007)；Steward，美国专利公布No.2008/0032931，同上，(2008)；Foster，美国专利公布No.2008/0187960，同上，(2008)；Steward，美国专利公布No.2008/0213830，同上，(2008)；Steward，美国专利公布No.2008/0241881，同上，(2008)；和Dolly，美国专利No.7,419,676，同上，(2008)，每一文献的全文以引用的方式并入本文。所述结合结构域的非限制性实例包括阿片类，如脑啡肽、内吗啡肽、内啡肽、强啡肽(dynorphin)、痛敏肽、强啡肽B(rimorphin)或所述阿片类的功能性衍生物，和蛋白酶活化受体(PAR)配体。

在此实施方案的方面中，适用作结合结构域的脑啡肽为Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、Met-脑啡肽MRGL、Met-脑啡肽MRF或所述脑啡肽的功能性衍生物。在此实施方案的其它方面中，适用作结合结构域的BAM22为BAM22肽(1-12)、BAM22肽(6-22)、BAM22肽(8-22)、BAM22肽(1-22)或所述BAM22的功能性衍生物。在此实施方案的方面中，适用作结合结构域的内吗啡肽为内吗啡肽-1、内吗啡肽-2或所述内吗啡肽的功能性衍生物。在此实施方案的其它方面中，适用作结合结构域的内啡肽为内啡肽-α、新内啡肽-α、内啡肽-β、新内啡肽-β、内啡肽-γ或所述内啡肽的功能性衍生物。在此实施方案的其它方面中，适用作结合结构域的强啡肽为强啡肽A、强啡肽B(dynorphin B)(脑啡肽原B(leumorphin))、强啡肽B(rimorphin)或所述强啡肽的功能性衍生物。在此实施方案的其它方面中，适用作结合结构域的痛敏肽为痛敏肽RK、痛敏肽、神经肽1、神经肽2、神经肽3或所述痛敏肽的功能性衍生物。在此实施方案的其它方面中，适用作结合结构域的PAR配体为PAR1、PAR2、PAR3、PAR4或所述PAR配体的功能性衍生物。

在此实施方案的其它方面中，结合结构域为SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个。在此实施方案的其它方面中，结合结构域例如与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至少70%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至少75%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ IDNO:186中的任何一个具有至少80%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至少85%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至少90%氨基酸一致性或与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至少95%氨基酸一致性。在此实施方案的其它方面中，结合结构域例如与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多70%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多75%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多80%氨基酸一致性，与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多85%氨基酸一致性，与SEQID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多90%氨基酸一致性或与SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有至多95%氨基酸一致性。

在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个不连续氨基酸取代。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个不连续氨基酸取代。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个不连续氨基酸缺失。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个不连续氨基酸缺失。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个不连续氨基酸添加。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个不连续氨基酸添加。

在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个连续氨基酸取代。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个连续氨基酸取代。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个连续氨基酸缺失。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个连续氨基酸缺失。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186中的任何一个具有例如至少一个、两个或三个连续氨基酸添加。在此实施方案的其它方面中，结合结构域相对于SEQ ID NO:154至SEQ IDNO:186中的任何一个具有例如至多一个、两个或三个连续氨基酸添加。

在本发明的一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含梭菌毒素酶促结构域。如本文所用，术语“梭菌毒素酶促结构域”意思是可执行中毒过程的酶促标靶修饰步骤的任何梭菌毒素多肽。因此，梭菌毒素酶促结构域特异性靶向且蛋白水解裂解梭菌毒素底物，如SNARE蛋白，如SNAP-25底物、VAMP底物和突触融合蛋白底物。梭菌毒素酶促结构域的非限制性实例包括例如BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域和BuNT酶促结构域。梭菌毒素酶促结构域的其它非限制性实例包括例如SEQ ID NO:134的氨基酸1-448、SEQ IDNO:135的氨基酸1-441、SEQ ID NO:136的氨基酸1-449、SEQ ID NO:137的氨基酸1-445、SEQ ID NO:138的氨基酸1-422、SEQ ID NO:139的氨基酸1-439、SEQ ID NO:140的氨基酸1-446、SEQ ID NO:141的氨基酸1-457、SEQ ID NO:142的氨基酸1-431和SEQ ID NO:143的氨基酸1-422。

梭菌毒素酶促结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，如梭菌毒素酶促结构域同工型和梭菌毒素酶促结构域亚型；非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，如保守性梭菌毒素酶促结构域变体、非保守性梭菌毒素酶促结构域变体、梭菌毒素酶促结构域嵌合体、其活性梭菌毒素酶促结构域片段或其任何组合。

如本文所用，术语天然存在抑或非天然存在的“梭菌毒素酶促结构域变体”意思是与所公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可以与所述参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素酶促结构域。除非明确指示，否则适用于实施所公开的实施方案的梭菌毒素酶促结构域变体为执行中毒过程的酶促标靶修饰步骤的变体。作为非限制性实例，包含SEQ ID NO:134的氨基酸1-448的BoNT/A酶促结构域变体与SEQ ID NO:134的氨基酸区1-448相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:135的氨基酸1-441的BoNT/B酶促结构域变体与SEQ ID NO:135的氨基酸区1-441相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:136的氨基酸1-449的BoNT/C1酶促结构域变体与SEQ ID NO:136的氨基酸区1-449相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:137的氨基酸1-445的BoNT/D酶促结构域变体与SEQID NO:137的氨基酸区1-445相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:138的氨基酸1-422的BoNT/E酶促结构域变体与SEQ ID NO:138的氨基酸区1-422相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ IDNO:139的氨基酸1-439的BoNT/F酶促结构域变体与SEQ ID NO:139的氨基酸区1-439相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:140的氨基酸1-446的BoNT/G酶促结构域变体与SEQ ID NO:140的氨基酸区1-446相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:141的氨基酸1-457的TeNT酶促结构域变体与SEQ ID NO:141的氨基酸区1-457相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:142的氨基酸1-431的BaNT酶促结构域变体与SEQ ID NO:142的氨基酸区1-431相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；且包含SEQ ID NO:143的氨基酸1-422的BuNT酶促结构域变体与SEQ ID NO:143的氨基酸区1-422相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加。

如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体”意思是由天然存在的过程产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于由替代拼接的转录物产生的梭菌毒素酶促结构域同工型、由自发突变产生的梭菌毒素酶促结构域同工型和梭菌毒素酶促结构域亚型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体可以与所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素酶促结构域。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的非限制性实例为梭菌毒素酶促结构域同工型，如BoNT/A酶促结构域同工型、BoNT/B酶促结构域同工型、BoNT/C1酶促结构域同工型、BoNT/D酶促结构域同工型、BoNT/E酶促结构域同工型、BoNT/F酶促结构域同工型、BoNT/G酶促结构域同工型和TeNT酶促结构域同工型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的另一非限制性实例为梭菌毒素酶促结构域亚型，如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5的酶促结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B二价亚型和BoNT/B非蛋白水解性亚型的酶促结构域；来自亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2的酶促结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的酶促结构域；和来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3和BoNT/F4的酶促结构域。

如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体”意思是借助于人工操纵产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于通过基因工程改造使用随机诱变或合理设计产生的梭菌毒素酶促结构域和通过化学合成产生的梭菌毒素酶促结构域。非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的非限制性实例包括例如保守性梭菌毒素酶促结构域变体、非保守性梭菌毒素酶促结构域变体、梭菌毒素酶促结构域嵌合变体和活性梭菌毒素酶促结构域片段。非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的其它非限制性实例包括例如非天然存在的BoNT/A酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/B酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/D酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/E酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/F酶促结构域变体、非天然存在的BoNT/G酶促结构域变体、非天然存在的TeNT酶促结构域变体、非天然存在的BaNT酶促结构域变体和非天然存在的BuNT酶促结构域变体。

如本文所用，术语“保守性梭菌毒素酶促结构域变体”意思是至少一个氨基酸取代为至少一种性质与参考梭菌毒素酶促结构域序列(表1)中的原始氨基酸的性质类似的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素酶促结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守性梭菌毒素酶促结构域变体可以与所述保守性梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素酶促结构域。保守性梭菌毒素酶促结构域变体的非限制性实例包括例如保守性BoNT/A酶促结构域变体、保守性BoNT/B酶促结构域变体、保守性BoNT/C1酶促结构域变体、保守性BoNT/D酶促结构域变体、保守性BoNT/E酶促结构域变体、保守性BoNT/F酶促结构域变体、保守性BoNT/G酶促结构域变体和保守性TeNT酶促结构域变体、保守性BaNT酶促结构域变体和保守性BuNT酶促结构域变体。

如本文所用，术语“非保守性梭菌毒素酶促结构域变体”意思是一种梭菌毒素酶促结构域，其中1)至少一个氨基酸从所述非保守性梭菌毒素酶促结构域所基于的参考梭菌毒素酶促结构域缺失；2)至少一个氨基酸添加至所述非保守性梭菌毒素酶促结构域所基于的参考梭菌毒素酶促结构域；或3)至少一个氨基酸取代为不共享与参考梭菌毒素酶促结构域序列(表1)中的原始氨基酸的性质类似的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守性梭菌毒素酶促结构域变体可以与所述非保守性梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素酶促结构域。非保守性梭菌毒素酶促结构域变体的非限制性实例包括例如非保守性BoNT/A酶促结构域变体、非保守性BoNT/B酶促结构域变体、非保守性BoNT/C1酶促结构域变体、非保守性BoNT/D酶促结构域变体、非保守性BoNT/E酶促结构域变体、非保守性BoNT/F酶促结构域变体、非保守性BoNT/G酶促结构域变体和非保守性TeNT酶促结构域变体、非保守性BaNT酶促结构域变体和非保守性BuNT酶促结构域变体。

如本文所用，术语“梭菌毒素酶促结构域嵌合体”意思是包含梭菌毒素酶促结构域的至少一部分和至少一种其它多肽的至少一部分以形成具有不同于表1的参考梭菌毒素酶促结构域的至少一种性质的毒素酶促结构域的多肽，条件是此梭菌毒素酶促结构域嵌合体仍能够特异性靶向神经递质释放机构的核心组分，且因此参与执行梭菌毒素借以蛋白水解裂解底物的总体细胞机制。所述梭菌毒素酶促结构域嵌合体描述于以下文献中：例如Lance E.Steward等，Leucine-based Motifand Clostridial Toxins，美国专利公布2003/0027752(2003年2月6日)；Lance E.Steward等，Clostridial Neurotoxin Compositions and ModifiedClostridial Neurotoxins，美国专利公布2003/0219462(2003年11月27日)；和Lance E.Steward等，Clostridial Neurotoxin Compositions andModified Clostridial Neurotoxins，美国专利公布2004/0220386(2004年11月4日)，每一文献的全文以引用的方式并入本文。梭菌毒素酶促结构域嵌合体的非限制性实例包括例如BoNT/A酶促结构域嵌合体、BoNT/B酶促结构域嵌合体、BoNT/C1酶促结构域嵌合体、BoNT/D酶促结构域嵌合体、BoNT/E酶促结构域嵌合体、BoNT/F酶促结构域嵌合体、BoNT/G酶促结构域嵌合体、TeNT酶促结构域嵌合体、BaNT酶促结构域嵌合体和BuNT酶促结构域嵌合体。

如本文所用，术语“活性梭菌毒素酶促结构域片段”意思是包含可适用于本发明方面中的酶促结构域的多种梭菌毒素片段中的任何一个，条件是所述酶促结构域片段可特异性靶向神经递质释放机构的核心组分，且因此参与执行梭菌毒素借以蛋白水解裂解底物的总体细胞机制。梭菌毒素的酶促结构域长约420-460个氨基酸且包含酶促结构域(表1)。研究已显示酶促结构域的酶促活性未必需要梭菌毒素酶促结构域的全长。作为非限制性实例，酶促活性不需要BoNT/A酶促结构域的前八个氨基酸(SEQ ID NO:134的残基1-8)。作为另一非限制性实例，酶促活性不需要TeNT酶促结构域的前八个氨基酸(SEQID NO:141的残基1-8)。同样，活性未必需要酶促结构域的羧基端。作为非限制性实例，酶促活性不需要BoNT/A酶促结构域的后32个氨基酸(SEQ ID NO:134的残基417-448)。作为另一非限制性实例，酶促活性不需要TeNT酶促结构域的后31个氨基酸(SEQ ID NO:141的残基427-457)。因此，此实施方案的方面可包括包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。此实施方案的其它方面可包括包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸和至多450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。

因此，在一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体。在此实施方案的一方面中，天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为天然存在的BoNT/A酶促结构域变体，如BoNT/A同工型的酶促结构域或BoNT/A亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/B酶促结构域变体，如BoNT/B同工型的酶促结构域或BoNT/B亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体，如BoNT/C1同工型的酶促结构域或BoNT/C1亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/D酶促结构域变体，如BoNT/D同工型的酶促结构域或BoNT/D亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/E酶促结构域变体，如BoNT/E同工型的酶促结构域或BoNT/E亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/F酶促结构域变体，如BoNT/F同工型的酶促结构域或BoNT/F亚型的酶促结构域；天然存在的BoNT/G酶促结构域变体，如BoNT/G同工型的酶促结构域或BoNT/G亚型的酶促结构域；天然存在的TeNT酶促结构域变体，如TeNT同工型的酶促结构域或TeNT亚型的酶促结构域；天然存在的BaNT酶促结构域变体，如BaNT同工型的酶促结构域或BaNT亚型的酶促结构域；或天然存在的BuNT酶促结构域变体，如BuNT同工型的酶促结构域或BuNT亚型的酶促结构域。

在此实施方案的方面中，天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为与所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为与所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸一致性的多肽。

在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为例如相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加；或相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加的多肽。

在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为例如相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加；或相对于所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加的多肽。

在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体。在此实施方案的一方面中，非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为非天然存在的BoNT/A酶促结构域变体，如保守性BoNT/A酶促结构域变体、非保守性BoNT/A酶促结构域变体、BoNT/A嵌合酶促结构域或活性BoNT/A酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/B酶促结构域变体，如保守性BoNT/B酶促结构域变体、非保守性BoNT/B酶促结构域变体、BoNT/B嵌合酶促结构域或活性BoNT/B酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体，如保守性BoNT/C1酶促结构域变体、非保守性BoNT/C1酶促结构域变体、BoNT/C1嵌合酶促结构域或活性BoNT/C1酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/D酶促结构域变体，如保守性BoNT/D酶促结构域变体、非保守性BoNT/D酶促结构域变体、BoNT/D嵌合酶促结构域或活性BoNT/D酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/E酶促结构域变体，如保守性BoNT/E酶促结构域变体、非保守性BoNT/E酶促结构域变体、BoNT/E嵌合酶促结构域或活性BoNT/E酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/F酶促结构域变体，如保守性BoNT/F酶促结构域变体、非保守性BoNT/F酶促结构域变体、BoNT/F嵌合酶促结构域或活性BoNT/F酶促结构域片段；非天然存在的BoNT/G酶促结构域变体，如保守性BoNT/G酶促结构域变体、非保守性BoNT/G酶促结构域变体、BoNT/G嵌合酶促结构域或活性BoNT/G酶促结构域片段；非天然存在的TeNT酶促结构域变体，如保守性TeNT酶促结构域变体、非保守性TeNT酶促结构域变体、TeNT嵌合酶促结构域或活性TeNT酶促结构域片段；非天然存在的BaNT酶促结构域变体，如保守性BaNT酶促结构域变体、非保守性BaNT酶促结构域变体、BaNT嵌合酶促结构域或活性BaNT酶促结构域片段；或非天然存在的BuNT酶促结构域变体，如保守性BuNT酶促结构域变体、非保守性BuNT酶促结构域变体、BuNT嵌合酶促结构域或活性BuNT酶促结构域片段。

在此实施方案的方面中，非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为与所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为与所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸一致性的多肽。

在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为例如相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加；或相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加的多肽。

在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体为例如相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加；或相对于所述非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加的多肽。

在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的极性较弱或中性氨基酸可取代为另一极性较弱或中性氨基酸。极性较弱或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的小型氨基酸可取代为另一小型氨基酸。小型氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素酶促结构域变体的多肽链中一个特定位置上的C-β分支氨基酸可取代为另一C-β分支氨基酸。C-β分支氨基酸的实例包括例如I、T和V。

在本发明的另一方面中，经过修饰的梭菌毒素部分包含梭菌毒素移位结构域。如本文所用，术语“梭菌毒素移位结构域”意思是可执行中毒过程中介导梭菌毒素轻链移位的移位步骤的任何梭菌毒素多肽。“移位”意思是能够促进多肽转运通过囊泡膜，由此使多肽的一些或全部暴露于细胞质。在各种肉毒杆菌神经毒素中，认为移位涉及由内体中的pH值降低引起的重链的别构构形变化。此构形变化似乎涉及重链的N端部分且由重链的N端部分介导，且导致在囊泡膜中形成孔；此变化允许蛋白水解性轻链由内体囊泡内移动至细胞质中。参见Lacy等，Nature Struct.Biol.5:898-902(1998年10月)。因此，梭菌毒素移位结构域促进梭菌毒素轻链移动穿过细胞内囊泡的膜进入细胞的细胞质中。梭菌毒素移位结构域的非限制性实例包括例如BoNT/A移位结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/G移位结构域、TeNT移位结构域、BaNT移位结构域和BuNT移位结构域。梭菌毒素移位结构域的其它非限制性实例包括例如SEQ ID NO:134的氨基酸449-873、SEQ ID NO:135的氨基酸442-860、SEQ ID NO:136的氨基酸450-868、SEQ ID NO:137的氨基酸446-864、SEQ ID NO:138的氨基酸423-847、SEQ ID NO:139的氨基酸440-866、SEQ ID NO:140的氨基酸447-865、SEQ ID NO:141的氨基酸458-881、SEQ ID NO:142的氨基酸432-857和SEQ ID NO:143的氨基酸423-847。

梭菌毒素移位结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素移位结构域变体，如梭菌毒素移位结构域同工型和梭菌毒素移位结构域亚型；非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体，如保守性梭菌毒素移位结构域变体、非保守性梭菌毒素移位结构域变体、梭菌毒素移位结构域嵌合体、其活性梭菌毒素移位结构域片段或其任何组合。

如本文所用，术语天然存在抑或非天然存在的“梭菌毒素移位结构域变体”意思是与所公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可以与所述参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素移位结构域。除非明确指示，否则适用于实施所公开的实施方案的梭菌毒素移位结构域变体为执行中毒过程中介导梭菌毒素轻链移位的移位步骤的变体。作为非限制性实例，包含SEQ IDNO:134的氨基酸449-873的BoNT/A移位结构域变体与SEQ ID NO:134的氨基酸区449-873相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:135的氨基酸442-860的BoNT/B移位结构域变体与SEQ ID NO:135的氨基酸区442-860相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:136的氨基酸450-868的BoNT/C1移位结构域变体与SEQ ID NO:136的氨基酸区450-868相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:137的氨基酸446-864的BoNT/D移位结构域变体与SEQ ID NO:137的氨基酸区446-864相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:138的氨基酸423-847的BoNT/E移位结构域变体与SEQ ID NO:138的氨基酸区423-847相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:139的氨基酸440-866的BoNT/F移位结构域变体与SEQ ID NO:139的氨基酸区440-866相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:140的氨基酸447-865的BoNT/G移位结构域变体与SEQ ID NO:140的氨基酸区447-865相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:141的氨基酸458-881的TeNT移位结构域变体与SEQ ID NO:141的氨基酸区458-881相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；包含SEQ ID NO:142的氨基酸432-857的BaNT移位结构域变体与SEQ ID NO:142的氨基酸区432-857相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加；且包含SEQ ID NO:143的氨基酸423-847的BuNT移位结构域变体与SEQ ID NO:143的氨基酸区423-847相比将具有至少一个氨基酸差异，如氨基酸取代、缺失或添加。

如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素移位结构域变体”意思是由天然存在的过程产生的任何梭菌毒素移位结构域，包括但不限于由替代拼接的转录物产生的梭菌毒素移位结构域同工型、由自发突变产生的梭菌毒素移位结构域同工型和梭菌毒素移位结构域亚型。天然存在的梭菌毒素移位结构域变体可以与所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素移位结构域。天然存在的梭菌毒素移位结构域变体的非限制性实例为梭菌毒素移位结构域同工型，如BoNT/A移位结构域同工型、BoNT/B移位结构域同工型、BoNT/C1移位结构域同工型、BoNT/D移位结构域同工型、BoNT/E移位结构域同工型、BoNT/F移位结构域同工型、BoNT/G移位结构域同工型、TeNT移位结构域同工型、BaNT移位结构域同工型和BuNT移位结构域同工型。天然存在的梭菌毒素移位结构域变体的另一非限制性实例为梭菌毒素移位结构域亚型，如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5的移位结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B二价亚型和BoNT/B非蛋白水解性亚型的移位结构域；来自亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2的移位结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的移位结构域；和来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3和BoNT/F4的移位结构域。

如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体”意思是借助于人工操纵产生的任何梭菌毒素移位结构域，包括但不限于通过基因工程改造使用随机诱变或合理设计产生的梭菌毒素移位结构域和通过化学合成产生的梭菌毒素移位结构域。非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体的非限制性实例包括例如保守性梭菌毒素移位结构域变体、非保守性梭菌毒素移位结构域变体、梭菌毒素移位结构域嵌合变体和活性梭菌毒素移位结构域片段。非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体的非限制性实例包括例如非天然存在的BoNT/A移位结构域变体、非天然存在的BoNT/B移位结构域变体、非天然存在的BoNT/C1移位结构域变体、非天然存在的BoNT/D移位结构域变体、非天然存在的BoNT/E移位结构域变体、非天然存在的BoNT/F移位结构域变体、非天然存在的BoNT/G移位结构域变体、非天然存在的TeNT移位结构域变体、非天然存在的BaNT移位结构域变体和非天然存在的BuNT移位结构域变体。

如本文所用，术语“保守性梭菌毒素移位结构域变体”意思是至少一个氨基酸取代为至少一种性质与参考梭菌毒素移位结构域序列(表1)中的原始氨基酸的性质类似的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素移位结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守性梭菌毒素移位结构域变体可以与所述保守性梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素移位结构域。保守性梭菌毒素移位结构域变体的非限制性实例包括例如保守性BoNT/A移位结构域变体、保守性BoNT/B移位结构域变体、保守性BoNT/C1移位结构域变体、保守性BoNT/D移位结构域变体、保守性BoNT/E移位结构域变体、保守性BoNT/F移位结构域变体、保守性BoNT/G移位结构域变体和保守性TeNT移位结构域变体、保守性BaNT移位结构域变体和保守性BuNT移位结构域变体。

如本文所用，术语“非保守性梭菌毒素移位结构域变体”意思是一种梭菌毒素移位结构域，其中1)至少一个氨基酸从所述非保守性梭菌毒素移位结构域所基于的参考梭菌毒素移位结构域缺失；2)至少一个氨基酸添加至所述非保守性梭菌毒素移位结构域所基于的参考梭菌毒素移位结构域；或3)至少一个氨基酸取代为不共享与参考梭菌毒素移位结构域序列(表1)中的原始氨基酸的性质类似的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守性梭菌毒素移位结构域变体可以与所述非保守性梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域实质上相同的方式起作用，且在本发明的任何方面中可取代参考梭菌毒素移位结构域。非保守性梭菌毒素移位结构域变体的非限制性实例包括例如非保守性BoNT/A移位结构域变体、非保守性BoNT/B移位结构域变体、非保守性BoNT/C1移位结构域变体、非保守性BoNT/D移位结构域变体、非保守性BoNT/E移位结构域变体、非保守性BoNT/F移位结构域变体、非保守性BoNT/G移位结构域变体和非保守性TeNT移位结构域变体、非保守性BaNT移位结构域变体和非保守性BuNT移位结构域变体。

如本文所用，术语“梭菌毒素移位结构域嵌合体”意思是包含梭菌毒素移位结构域的至少一部分和至少一种其它多肽的至少一部分以形成具有不同于表1的参考梭菌毒素移位结构域的至少一种性质的毒素移位结构域的多肽，条件是此梭菌毒素移位结构域嵌合体仍能够特异性靶向神经递质释放机构的核心组分，且因此参与执行梭菌毒素借以蛋白水解裂解底物的总体细胞机制。梭菌毒素移位结构域嵌合体的非限制性实例包括例如BoNT/A移位结构域嵌合体、BoNT/B移位结构域嵌合体、BoNT/C1移位结构域嵌合体、BoNT/D移位结构域嵌合体、BoNT/E移位结构域嵌合体、BoNT/F移位结构域嵌合体、BoNT/G移位结构域嵌合体、TeNT移位结构域嵌合体、BaNT移位结构域嵌合体和BuNT移位结构域嵌合体。

如本文所用，术语“活性梭菌毒素移位结构域片段”意思是包含可适用于本发明方面中的移位结构域的多种梭菌毒素片段中的任何一个，条件是所述活性片段可促进LC从细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中，且因此参与执行梭菌毒素借以蛋白水解裂解底物的总体细胞机制。梭菌毒素重链的移位结构域长约410-430个氨基酸且包含移位结构域(表1)。研究已显示移位结构域的移位活性未必需要梭菌毒素重链的移位结构域的全长。因此，此实施方案的方面可包括包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸的移位结构域的梭菌毒素移位结构域。此实施方案的其它方面可包括包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸的移位结构域的梭菌毒素移位结构域。

因此，在一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含天然存在的梭菌毒素移位结构域变体。在此实施方案的一方面中，天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为天然存在的BoNT/A移位结构域变体，如BoNT/A同工型的移位结构域或BoNT/A亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/B移位结构域变体，如BoNT/B同工型的移位结构域或BoNT/B亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/C1移位结构域变体，如BoNT/C1同工型的移位结构域或BoNT/C1亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/D移位结构域变体，如BoNT/D同工型的移位结构域或BoNT/D亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/E移位结构域变体，如BoNT/E同工型的移位结构域或BoNT/E亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/F移位结构域变体，如BoNT/F同工型的移位结构域或BoNT/F亚型的移位结构域；天然存在的BoNT/G移位结构域变体，如BoNT/G同工型的移位结构域或BoNT/G亚型的移位结构域；天然存在的TeNT移位结构域变体，如TeNT同工型的移位结构域或TeNT亚型的移位结构域；天然存在的BaNT移位结构域变体，如BaNT同工型的移位结构域或BaNT亚型的移位结构域；或天然存在的BuNT移位结构域变体，如BuNT同工型的移位结构域或BuNT亚型的移位结构域。

在此实施方案的方面中，天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为与所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为与所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸一致性的多肽。

在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为例如相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加；或相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加的多肽。

在此实施方案的其它方面中，天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为例如相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加；或相对于所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加的多肽。

在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体。在此实施方案的一方面中，非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为非天然存在的BoNT/A移位结构域变体，如保守性BoNT/A移位结构域变体、非保守性BoNT/A移位结构域变体、BoNT/A嵌合移位结构域或活性BoNT/A移位结构域片段；非天然存在的BoNT/B移位结构域变体，如保守性BoNT/B移位结构域变体、非保守性BoNT/B移位结构域变体、BoNT/B嵌合移位结构域或活性BoNT/B移位结构域片段；非天然存在的BoNT/C1移位结构域变体，如保守性BoNT/C1移位结构域变体、非保守性BoNT/C1移位结构域变体、BoNT/C1嵌合移位结构域或活性BoNT/C1移位结构域片段；非天然存在的BoNT/D移位结构域变体，如保守性BoNT/D移位结构域变体、非保守性BoNT/D移位结构域变体、BoNT/D嵌合移位结构域或活性BoNT/D移位结构域片段；非天然存在的BoNT/E移位结构域变体，如保守性BoNT/E移位结构域变体、非保守性BoNT/E移位结构域变体、BoNT/E嵌合移位结构域或活性BoNT/E移位结构域片段；非天然存在的BoNT/F移位结构域变体，如保守性BoNT/F移位结构域变体、非保守性BoNT/F移位结构域变体、BoNT/F嵌合移位结构域或活性BoNT/F移位结构域片段；非天然存在的BoNT/G移位结构域变体，如保守性BoNT/G移位结构域变体、非保守性BoNT/G移位结构域变体、BoNT/G嵌合移位结构域或活性BoNT/G移位结构域片段；非天然存在的TeNT移位结构域变体，如保守性TeNT移位结构域变体、非保守性TeNT移位结构域变体、TeNT嵌合移位结构域或活性TeNT移位结构域片段；非天然存在的BaNT移位结构域变体，如保守性BaNT移位结构域变体、非保守性BaNT移位结构域变体、BaNT嵌合移位结构域或活性BaNT移位结构域片段；或非天然存在的BuNT移位结构域变体，如保守性BuNT移位结构域变体、非保守性BuNT移位结构域变体、BuNT嵌合移位结构域或活性BuNT移位结构域片段。

在此实施方案的方面中，非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为与所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为与所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸一致性的多肽。

在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为例如相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加；或相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸添加的多肽。

在此实施方案的其它方面中，非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体为例如相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸取代；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失；相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加；或相对于所述非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体所基于的参考梭菌毒素移位结构域具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸添加的多肽。

在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的极性较弱或中性氨基酸可取代为另一极性较弱或中性氨基酸。极性较弱或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的小型氨基酸可取代为另一小型氨基酸。小型氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面中，梭菌毒素移位结构域变体的多肽链中一个特定位置上的C-β分支氨基酸可取代为另一C-β分支氨基酸。C-β分支氨基酸的实例包括例如I、T和V。

多种序列比对方法中的任何一种可用于确定天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体、非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体、天然存在的梭菌毒素移位结构域变体、非天然存在的梭菌毒素移位结构域变体和结合结构域的一致性百分比，包括但不限于全体法、局部法和混合法，如区段逼近法。确定一致性百分比的方案为本领域技术人员的技能范围内和根据本文的教义可获得的常规程序。

全体法从分子的开始到结尾比对序列且通过将个别残基对的计分相加并通过施加间隙罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等，CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence AlignmentThrough Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如Osamu Gotoh，Significant Improvementin Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by IterativeRefinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J.Mol.Biol.823-838(1996)。

局部法通过鉴别由全部输入序列所共享的一个或多个保守基元来比对序列。非限制性方法包括例如火柴盒法(Match-box)，参见例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABIOS 501-509(1992)；吉布斯取样法(Gibbs sampling)，参见例如C.E.Lawrence等，Detecting Subtle Sequence Signals:A GibbsSampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van Walle等，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics，:1428-1435(2004)。

混合法组合全体与局部比对方法两者的功能性方面。非限制性方法包括例如区段间比较(segment-to-segment comparison)，参见例如Burkhard Morgenstern等，Multiple DNA and Protein SequenceAlignment Based On Segment-To-Segment Comparison，93(22)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.12098-12103(1996)；T-Coffee，参见例如CédricNotredame等，T-Coffee:A Novel Algorithm for Multiple SequenceAlignment，302(1)J.Mol.Biol.205-217(2000)；MUSCLE，参见例如Robert C.Edgar，MUSCLE:Multiple Sequence Alignment With HighScore Accuracy and High Throughput，32(5)Nucleic Acids Res.1792-1797(2004)；和DIALIGN-T，参见例如Amarendran RSubramanian等，DIALIGN-T：An Improved Algorithm for Segment-BasedMultiple Sequence Alignment，6(1)BMC Bioinformatics 66(2005)。

应了解，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可任选地进一步包含含柔性间隔子的柔性区。包含柔性间隔子的柔性区可用于调整多肽区的长度以便优化多肽的特征、属性或性质。作为非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区可用于使蛋白酶裂解位点更好地暴露，由此促进蛋白酶对所述位点的裂解。作为另一非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区可用于使整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域更好地呈现，由此促进所述结合结构域与其受体的结合。

包含肽的柔性间隔子长至少一个氨基酸且包含具有小型侧链R基团的不带电荷氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸或组氨酸。因此，在一实施方案中，柔性间隔子可具有例如至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸或至少10个氨基酸的长度。在另一实施方案中，柔性间隔子可具有例如至多1个氨基酸、至多2个氨基酸、至多3个氨基酸、至多4个氨基酸、至多5个氨基酸、至多6个氨基酸、至多7个氨基酸、至多8个氨基酸、至多9个氨基酸或至多10个氨基酸的长度。在了另一实施方案中，柔性间隔子可在例如1-3个氨基酸之间、2-4个氨基酸之间、3-5个氨基酸之间、4-6个氨基酸之间或5-7个氨基酸之间。柔性间隔子的非限制性实例包括例如G间隔子，如GGG、GGGG(SEQ ID NO:144)和GGGGS(SEQ ID NO:145)；或A间隔子，如AAA、AAAA(SEQ ID NO:146)和AAAAV(SEQ ID NO:147)。所述柔性区可操作地同框连接于经过修饰的梭菌毒素成为融合蛋白。

因此，在一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可进一步包含含柔性间隔子的柔性区。在另一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可进一步包含含多个串联的柔性间隔子的柔性区。在此实施方案的方面中，柔性区可串联包含例如至少1个G间隔子、至少2个G间隔子、至少3个G间隔子、至少4个G间隔子或至少5个G间隔子。在此实施方案的其它方面中，柔性区可串联包含例如至多1个G间隔子、至多2个G间隔子、至多3个G间隔子、至多4个G间隔子或至多5个G间隔子。在此实施方案的其它方面中，柔性区可串联包含例如至少1个A间隔子、至少2个A间隔子、至少3个A间隔子、至少4个A间隔子或至少5个A间隔子。在此实施方案的其它方面中，柔性区可串联包含例如至多1个A间隔子、至多2个A间隔子、至多3个A间隔子、至多4个A间隔子或至多5个A间隔子。在此实施方案的另一方面中，经过修饰的梭菌毒素可包含含一个或多个拷贝的相同柔性间隔子、一个或多个拷贝的不同柔性间隔子区或其任何组合的柔性区。

在此实施方案的其它方面中，包含柔性间隔子的经过修饰的梭菌毒素可为例如经过修饰的BoNT/A、经过修饰的BoNT/B、经过修饰的BoNT/C1、经过修饰的BoNT/D、经过修饰的BoNT/E、经过修饰的BoNT/F、经过修饰的BoNT/G、经过修饰的TeNT、经过修饰的BaNT或经过修饰的BuNT。

设想本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可在任何和所有位置包含柔性间隔子，条件是经过修饰的梭菌毒素能够执行中毒过程。在此实施方案的方面中，柔性间隔子例如位于酶促结构域与移位结构域之间、酶促结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，G间隔子例如位于酶促结构域与移位结构域之间、酶促结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，A间隔子例如位于酶促结构域与移位结构域之间、酶促结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。

在此实施方案的其它方面中，柔性间隔子位于例如整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与移位结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与酶促结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，G间隔子位于例如整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与移位结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与酶促结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，A间隔子位于例如整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与移位结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与酶促结构域之间、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。

在此实施方案的其它方面中，柔性间隔子例如位于移位结构域与酶促结构域之间、移位结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、移位结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，G间隔子例如位于移位结构域与酶促结构域之间、移位结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、移位结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面中，A间隔子例如位于移位结构域与酶促结构域之间、移位结构域与整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域之间、移位结构域与外源蛋白酶裂解位点之间。

设想本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可在任何和所有位置包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域，条件是经过修饰的梭菌毒素能够执行中毒过程。非限制性实例包括将整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域定位于经过修饰的梭菌毒素的氨基端；和将整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域定位于经过修饰的梭菌毒素的梭菌毒素酶促结构域与移位结构域之间。其它非限制性实例包括将整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域定位于经过修饰的梭菌毒素的梭菌毒素酶促结构域与梭菌毒素移位结构域之间。天然存在的梭菌毒素的酶促结构域含有原生起始甲硫氨酸。因此，在酶促结构域不在氨基端位置上的结构域组织中，包含起始甲硫氨酸的氨基酸序列应置于氨基端结构域的前方。同样，当整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域位于氨基端位置上时，包含起始甲硫氨酸的氨基酸序列可在整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域需要游离氨基端的情况下可操作地连接，参见例如Shengwen Li等，Degradable Clostridial Toxins，美国专利申请11/572,512(2007年1月23日)，所述文献的全文以引用的方式并入本文。另外，在本领域中已知，当添加可操作地连接于包含起始甲硫氨酸的另一多肽的氨基端的多肽时，原始甲硫氨酸残基可缺失。

因此，在一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可包含含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素移位结构域和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基单一多肽线性顺序。在另一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可包含含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素移位结构域的氨基至羧基单一多肽线性顺序。在另一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可包含含梭菌毒素酶促结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素移位结构域的氨基至羧基单一多肽线性顺序。在另一实施方案中，本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素可包含含梭菌毒素移位结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基单一多肽线性顺序。

本发明的方面部分提供多核苷酸分子。如本文所用，术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义且意思是具有任何长度的核苷酸(如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。设想本说明书中所公开的任何和所有修饰梭菌毒素都可由多核苷酸分子编码。还设想可编码本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的任何和所有多核苷酸分子都可适用，包括但不限于天然存在和非天然存在的DNA分子以及天然存在和非天然存在的RNA分子。天然存在和非天然存在的DNA分子的非限制性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。

制备编码本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子可能必需的已确立分子生物学技术包括但不限于涉及以下的程序：聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序和基于重组的技术，其为完全在本领域的技术人员的技能范围内且可根据本文的教义获得常规程序。制备编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如MOLECULAR CLONING ALABORATORY MANUAL，同上，(2001)；和CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Frederick M.Ausubel等编著，John Wiley&Sons，2004)。另外，多种适用于制备编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的可商购的产品可广泛获得。所述方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得的常规程序。

因此，在一实施方案中，多核苷酸分子编码本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素。在此实施方案的一方面中，多核苷酸分子编码包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素移位结构域和梭菌毒素酶促结构域的修饰梭菌毒素。在此实施方案的另一方面中，多核苷酸分子编码包含整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素移位结构域的修饰梭菌毒素。在此实施方案的另一方面中，多核苷酸分子编码包含梭菌毒素酶促结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素移位结构域的修饰梭菌毒素。在此实施方案的另一方面中，多核苷酸分子编码包含梭菌毒素移位结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素酶促结构域的修饰梭菌毒素。

本发明的另一方面部分提供产生本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的方法，所述方法包括在细胞中表达编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的步骤。本发明的另一方面提供产生本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的方法，所述方法包括将包含编码本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的表达构建体引入细胞中并在所述细胞中表达所述表达构建体的步骤。

本说明书中所公开的方法部分包括经过修饰的梭菌毒素。设想本说明书中所公开的任何和所有修饰梭菌毒素都可使用本说明书中所公开的方法产生。还设想编码本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的任何和所有多核苷酸分子都可适用于使用本说明书中所公开的方法产生本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素。

本说明书中所公开的方法部分包括表达构建体。表达构建体包含可操作地连接于适用于在细胞或无细胞提取物中表达本说明书中所公开的多核苷酸分子的表达载体的所述多核苷酸分子。多种表达载体可用于表达编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子，包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。应进一步了解，适用于实施所述方法的方面的表达载体可包括在组成性、组织特异性、细胞特异性或诱导性启动子元件、强化子元件或两者控制下表达经过修饰的梭菌毒素的表达载体。表达载体以及已确立的用于由所述表达载体制备和使用表达构建体的试剂和条件的非限制性实例易于从商品供应商获得，所述供应商包括但不限于BDBiosciences-Clontech，Palo Alto，CA；BD Biosciences Pharmingen，SanDiego，CA；Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA；EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI；QIAGEN，Inc.，Valencia，CA；和Stratagene，La Jolla，CA。适当表达载体的选择、制备和使用为完全在本领域的技术人员的技能范围内且可根据本文的教义获得的常规程序。

因此，此实施方案的方面包括但不限于可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的病毒表达载体；可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的原核表达载体；可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的酵母表达载体；可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的昆虫表达载体；和可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的哺乳动物表达载体。此实施方案的其它方面包括但不限于适于使用包含可操作地连接于编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的无细胞提取物表达载体的无细胞提取物来表达本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的表达构建体。

本说明书中所公开的方法部分包括细胞。设想可使用任何和所有细胞。因此，此实施方案的方面包括但不限于原核细胞，包括但不限于需氧、微量需氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，如来源于以下的菌株：例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridia perfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、Neisseria meningirulls、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和属伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；和真核细胞，包括但不限于酵母菌株，如来源于以下的菌株：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，如来源于以下者：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)；和哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪科动物、牛科动物、马科动物、灵长类动物和人的细胞系。细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物与细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)获得。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如INSECT CELL CULTUREENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编著，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELL CULTURES:FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J.M.Vlak等编著，Kluwer Academic Publishers，1996)；Maureen A.Harrison和Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(CambridgeUniversity Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORYPROCEDURES(Alan Doyle等编著，John Wiley and Sons，1998)；R.IanFreshney，CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版2000)；ANIMAL CELL CULTURE:A PRACTICALAPPROACH(JohnR.W Masters编著，Oxford University Press，第3版2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，OxfordPress，第2版2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。所述方案为在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得的常规程序。

本说明书中所公开的方法部分包括将多核苷酸分子引入细胞中。引入细胞中的多核苷酸分子可由所述细胞短暂或稳定维持。稳定维持的多核苷酸分子可在染色体外且自主复制，或其可整合至细胞的染色体物质中且非自主复制。设想可使用用于将本说明书中所公开的多核苷酸分子引入细胞中的任何和所有方法。适用于将核酸分子引入细胞中的方法包括但不限于化学介导的转染或转化，如氯化钙介导、磷酸钙介导、二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、聚乙亚胺(PEI)介导、聚赖氨酸介导和聚凝胺介导的转染或转化；物理介导的转染或转化，如生物弹粒子递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔；和病毒介导的转染，如逆转录病毒介导的转染，参见例如IntroducingCloned Genes into Cultured Mammalian Cells，第16.1-16.62页(Sambrook和Russell编著，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第3卷，第3版2001)。本领域的技术人员应了解，用于将表达构建体引入细胞中的特定方法的选择部分取决于所述细胞将短暂含有表达构建体还是所述细胞将稳定含有表达构建体。所述方案为在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得的常规程序。

在此实施方案的一方面中，称为转染的化学介导的方法用于将编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子引入细胞中。在化学介导的转染方法中，化学试剂与核酸形成促进其吸收至细胞中的复合物。所述化学试剂包括但不限于磷酸钙介导，参见例如Martin Jordan和FlorianWorm，Transfection of adherent and suspended cells by calciumphosphate，33(2)Methods 136-143(2004)；二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、阳离子性聚合物介导，如聚乙亚胺(PEI)介导和聚赖氨酸介导和聚凝胺介导，参见例如Chun Zhang等，Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells，33(2)Methods 144-150(2004)。所述化学介导的递送系统可通过标准方法制备且可购得，参见例如CellPhect转染试剂盒(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)；哺乳动物转染试剂盒，磷酸钙和DEAE葡聚糖(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)；LIPOFECTAMINE^TM转染试剂(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)；ExGen 500转染试剂盒(Fermentas，Inc.，Hanover，MD)，以及SuperFect和Effectene转染试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)。

在此实施方案的另一方面中，物理介导的方法用于将编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子引入细胞中。物理技术包括但不限于电穿孔、生物弹和显微注射。生物弹和显微注射技术在细胞壁上穿孔以将核酸分子引入细胞中，参见例如Jeike E.Biewenga等，Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique，71(1)J.Neurosci.Methods 67-75(1997)；和John O’Brien和Sarah C.R.Lummis，Biolistic and diolistic transfection:using the gene gun to deliverDNA and lipophilic dyes into mammalian cells，33(2)Methods 121-125(2004)。电穿孔(也称为电通透作用)使用短暂的高压电脉冲在膜中产生短暂的孔，核酸分子通过所述孔进入且可所述孔可有效用于稳定和短暂转染所有细胞类型，参见例如M.Golzio等，In vitro and in vivoelectric field-mediated permeabilization，gene transfer，and expression，33(2)Methods 126-135(2004)；和Oliver Gresch等，New non-viralmethod for gene transfer into primary cells，33(2)Methods 151-163(2004)。

在此实施方案的另一方面中，称为转导的病毒介导的方法用于将编码经过修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子引入细胞中。在病毒介导的短暂转导方法，对病毒粒子借以感染和在宿主细胞中复制的过程进行操纵以使用此机制将核酸分子引入细胞中。已由多种病毒开发出病毒介导的方法，所述病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、细小核糖核酸病毒、α病毒和杆状病毒，参见例如Armin Blesch，Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivoand in vivo gene transfer，33(2)Methods 164-172(2004)；和MaurizioFederico，From lentiviruses to lentivirus vectors，229 Methods Mol.Biol.3-15(2003)；E.M.Poeschla，Non-primate lentiviral vectors，5(5)Curr.Opin.Mol.Ther.529-540(2003)；Karim Benihoud等，Adenovirusvectors for gene delivery，10(5)Curr.Opin.Biotechnol.440-447(1999)；H.Bueler，Adeno-associated viral vectors for gene transfer and genetherapy，380(6)Biol.Chem.613-622(1999)；Chooi M.Lai等，Adenovirus and adeno-associated virus vectors，21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002)；Edward A.Burton等，Gene delivery using herpessimplex virus vectors，21(12)DNA Cell Biol.915-936(2002)；PaolaGrandi等，Targeting HSV amplicon vectors，33(2)Methods 179-186(2004)；Ilya Frolov等，Alphavirus-based expression vectors:strategiesand applications，93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996)；Markus U.Ehrengruber，Alphaviral gene transfer in neurobiology，59(1)Brain Res.Bull.13-22(2002)；Thomas A.Kost和J.PatrickCondreay，Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-deliveryvectors，20(4)Trends Biotechnol.173-180(2002)；和A.Huser&C.Hofmann，Baculovirus vectors:novel mammalian cell gene-deliveryvehicles and their applications，3(1)Am.J.Pharmacogenomics 53-63(2003)。

腺病毒为非包膜双链DNA病毒，其常选用于哺乳动物细胞转导，因为腺病毒可操纵约36kb的相对较大多核苷酸分子，以高效价产生，且可有效感染多种正分裂和非分裂的细胞，参见例如Wim T.J.M.C.Hermens等，Transient gene transfer to neurons and glia:analyis ofadenoviral vector performance in the CNS and PNS，71(1)J.Neurosci.Methods 85-98(1997)；和Hiroyuki Mizuguchi等，Approaches forgenerating recombinant adenovirus vectors，52(3)Adv.Drug Deliv.Rev.165-176(2001)。使用基于腺病毒的系统的转导不支持长期蛋白质表达，因为核酸分子在细胞核中由附加体承载，而非整合至宿主细胞染色体中。腺病毒载体系统和如何使用所述载体的特定方案公开于以下文献中：例如VIRAPOWER^TM腺病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和VIRAPOWER^TM腺病毒表达系统说明手册25-0543版本A，Invitrogen，Inc.，(Jul.15，2002)；和ADEASY^TM腺病毒载体系统(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)和ADEASY^TM腺病毒载体系统说明手册064004f，Stratagene，Inc.。

核酸分子递送也可使用单链RNA逆转录病毒，如致癌逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒介导的转导常产生接近100%的转导效率，可通过改变感染复数(multiplicity of infection；MOI)来容易地控制前病毒拷贝数，且可用于短暂或稳定转导细胞，参见例如Tiziana Tonini等，Transient production of retroviral-and lentiviral-based vectors for thetransduction of Mammalian cells，285 Methods Mol.Biol.141-148(2004)；Armin Blesch，Lentiviral and MLV based retroviral vectors for exvivo and in vivo gene transfer，33(2)Methods 164-172(2004)；FélixRecillas-Targa，Gene transfer and expression in mammalian cell lines andtransgenic animals，267 Methods Mol.Biol.417-433(2004)；和RolandWolkowicz等，Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammaliancells，246 Methods Mol.Biol.391-411(2004)。逆转录病毒粒子由包装于由脂质包膜围绕的蛋白质衣壳中的RNA基因组组成。逆转录病毒通过将其RNA连同逆转录酶一起注射至细胞质中来感染宿主细胞。RNA模板接着逆转录成线性双链cDNA，所述线性双链cDNA通过整合至宿主细胞基因组中来复制其自身。病毒粒子同时垂直传播(通过前病毒从亲本细胞至子代细胞)和水平传播(通过病毒颗粒从细胞至细胞)。此复制策略使得能够长期持续表达，因为相关核酸分子稳定整合至宿主细胞的染色体中，由此使得蛋白质能够长期表达。举例来说，动物研究表明，注射至多种组织中的慢病毒载体产生持续的蛋白质表达维持超过1年，参见例如Luigi Naldini等，In vivo genedelivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviralvector，272(5259)Science 263-267(1996)。致癌逆转录病毒来源的病毒系统(如莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virus；MoMLV))广泛使用且感染许多不同的非分裂细胞。慢病毒也可感染许多不同细胞类型(包括正分裂和非分裂的细胞)且具有复杂的包膜蛋白，其允许高度特异性细胞靶向。

逆转录病毒载体和如何使用所述载体的特定方案公开于以下文献中：例如Manfred Gossen和Hermann Bujard，Tight control of geneexpression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters，美国专利No.5,464,758(1995年11月7日)和Hermann Bujard和ManfredGossen，Methods for regulating gene expression，美国专利No.5,814,618(1998年9月29日)；David S.Hogness，Polynucleotidesencoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cellstransformed with same，美国专利No.5,514,578(1996年5月7日)和David S.Hogness，Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor，美国专利6,245,531(2001年6月12日)；Elisabetta Vegeto等，Progesteronereceptor having C.terminal hormone binding domain truncations，美国专利No.5,364,791(1994年11月15日)，Elisabetta Vegeto等，Mutatedsteroid hormone receptors，methods for their use and molecular switchfor gene therapy，美国专利No.5,874,534(1999年2月23日)和Elisabetta Vegeto等，Mutated steroid hormone receptors，methods fortheir use and molecular switch for gene therapy，美国专利No.5,935,934(1999年8月10日)。此外，所述病毒递送系统可通过标准方法来制备且可购得，参见例如BD^TM Tet-Off与Tet-On基因表达系统(BDBiosciences-Clonetech，Palo Alto，CA)BD^TM Tet-Off与Tet-On基因表达系统使用手册，PT3001-1，BD Biosciences Clonetech，(2003年3月14日)；GeneSwitch^TM系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和GENESWITCH^TM系统，用于哺乳动物细胞的米非司酮(Mifepristone)调控的表达系统版本D，25-0313，Invitrogen，Inc.，(2002年11月4日)；VIRAPOWER^TM慢病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和VIRAPOWER^TM慢病毒表达系统说明手册25-0501版本E，Invitrogen，Inc.，(2003年12月8日)；和COMPLETE

逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene，La Jolla，CA)和COMPLETE

逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统说明手册，064005e。

本说明书中所公开的方法部分包括由多核苷酸分子表达经过修饰的梭菌毒素。设想多种表达系统中的任何一种均可适用于由本说明书中所公开的多核苷酸分子表达经过修饰的梭菌毒素，包括但不限于基于细胞的系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。无细胞系统包括但不限于麦芽提取物、兔网状细胞提取物和大肠杆菌提取物，且通常与本文所公开的方法等效。使用表达系统表达多核苷酸分子可包括多种特征中的任何一种，所述特征包括但不限于诱导性表达、非诱导性表达、组成性表达、病毒介导的表达、稳定整合性表达和短暂表达。包括充分表征的载体、试剂、条件和细胞的表达系统已充分确立且易于从商品供应商获得，所述供应商包括但不限于Ambion，Inc.Austin，TX；BDBiosciences-Clontech，Palo Alto，CA；BD Biosciences Pharmingen，SanDiego，CA；Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA；QIAGEN，Inc.，Valencia，CA；Roche Applied Science，Indianapolis，IN；和Stratagene，La Jolla，CA。关于选择和使用适当异源表达系统的非限制性实例描述于以下文献中：例如PROTEIN EXPRESSION.A PRACTICAL APPROACH(S.J.Higgins和B.David Hames编著，Oxford University Press，1999)；Joseph M.Fernandez和James P.Hoeffler，GENE EXPRESSION SYSTEMS.USING NATURE FOR THEART OF EXPRESSION(Academic Press，1999)；和Meena Rai和Harish Padh，Expression Systems for Production of Heterologous Proteins，80(9)CURRENT SCIENCE 1121-1128，(2001)。所述方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得的常规程序。

多种基于细胞的表达程序适用于表达由本说明书中所公开的多核苷酸分子编码的经过修饰的梭菌毒素。实例包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。病毒表达系统包括但不限于VIRAPOWER^TM慢病毒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、腺病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、ADEASY^TM XL腺病毒载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)和

逆转录病毒基因表达系统(Stratagene，La Jolla，CA)。原核表达系统的非限制性实例包括CHAMPION^TM pET表达系统(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)、TRIEX^TM细菌表达系统(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)、

表达系统(QIAGEN，Inc.)和

蛋白质表达与纯化系统(Stratagene，La Jolla，CA)。酵母表达系统包括但不限于EASYSELECT^TM毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、YES-ECHO^TM表达载体试剂盒(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和SPECTRA^TM粟酒裂殖酵母表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)。杆状病毒表达系统的非限制性实例包括BaculoDirect^TM(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、

(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和BD BACULOGOLD^TM(BD Biosciences-Pharmigen，San Diego，CA)。昆虫表达系统包括但不限于果蝇表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、INSECTSELECT^TM系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)和INSECTDIRECT^TM系统(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)。哺乳动物表达系统的非限制性实例包括T-REX^TM(四环素调控的表达)系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、FLP-IN^TM T-REX^TM系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、pcDNA^TM系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、pSecTag2系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、系统、INTERPLAY^TM哺乳动物TAP系统(Stratagene，LaJolla，CA)、COMPLETE

诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene，La Jolla，CA)和

II诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene，La Jolla，CA)。

表达由本说明书中所公开的多核苷酸分子编码的经过修饰的梭菌毒素的另一程序采用无细胞表达系统，如但不限于原核提取物和真核提取物。原核细胞提取物的非限制性实例包括RTS 100大肠杆菌HY试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)、ActivePro体外翻译试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)、EcoPro^TM系统(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI)和EXPRESSWAY^TM Plus表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)。真核细胞提取物包括但不限于RTS 100麦芽CECF试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)、

偶联麦芽提取物系统(Promega Corp.，Madison，WI)、麦芽IVT^TM试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)、网状细胞溶胞物IVT^TM试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)、

II系统(Ambion，Inc.，Austin，TX)和

偶联网状细胞溶胞物系统(Promega Corp.，Madison，WI)。

本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素由细胞以单链形式产生。为达到完全活性，此单链形式须转化成其双链形式。此转化过程通过蛋白水解裂解位于整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域内的蛋白酶裂解位点来达到。此转化过程可使用标准体外蛋白水解裂解测定或在基于细胞的蛋白水解裂解系统中进行，如伴随专利申请Ghanshani等，Methods of Intracellular Conversion of Single-Chain Proteins intotheir Di-chain Form，代理人案号No.18469 PROV(BOT)中所述，所述申请的全文以引用的方式并入本文。

本发明的方面部分提供包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的组合物。适用于本发明的组合物通常以包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的药学上可接收的组合物形式施用。如本文所用，术语“药学上可接收的”意思是任何分子实体或组合物在施用至个体时不产生不良反应、过敏反应或其它意外或不当反应。如本文所用，术语“药学上可接收的组合物”与“药物组合物”同义且意思是治疗有效浓度的活性成分，如本说明书中所公开的任何经过修饰的梭菌毒素。包含经过修饰的梭菌毒素的药物组合物适用于医学和兽医学应用。药物组合物可单独或与其它补充活性成分、药剂、药物或激素组合施用于患者。药物组合物可使用多种方法中的任何一种制造，所述方法包括但不限于常规混合、溶解、粒化、造糖衣药丸、研末、乳化、囊封、封装和冻干。药物组合物可采取多种形式中的任何一种，所述形式包括但不限于无菌溶液、混悬液、乳液、冻干产物、片剂、丸剂、药丸、胶囊、散剂、糖浆、酏剂或适于施用的任何其它剂型。

还设想包含经过修饰的梭菌毒素的药物组合物可任选地包括促进活性成分加工成药学上可接收的组合物的药学上可接收的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”与“药用载体”同义且意思是施用时实质上不具有长期或持续有害作用的任何载体，且涵盖诸如“药学上可接受的媒剂、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂”等术语。所述载体通常与活性化合物混合或允许稀释或包封活性化合物且可为固体、半固体或液体药剂。应了解，活性成分可溶解或可以期望载体或稀释剂中的混悬液形式递送。可使用多种药学上可接受的载体中的任何一种，包括但不限于水性介质，如水、生理食盐水、甘油、透明质酸等；固体载体，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣；抗细菌和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其它无活性成分。药学上可接受的载体的选择可取决于施用模式。除非任何药学上可接受的载体与活性成分不相容，否则预期其在药学上可接受的组合物中的使用。所述药用载体的特定用途的非限制性实例可见于以下文献中：PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(Howard C.Ansel等编著，Lippincott Williams & Wilkins Publishers，第7版1999)；REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R.Gennaro编著，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版2000)；GOODMAN&GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G.Hardman等编著，McGraw-Hill Professional，第10版2001)；和HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Raymond C.Rowe等，APhA Publications，第4版2003)。所述方案为常规程序且任何修改完全在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得。

还设想本说明书中所公开的药物组合物可任选地包括但不限于其它药学上可接收的组分(或药用组分)，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂、生理物质、药理学物质、膨胀剂、乳化剂、湿润剂、甜味剂或调味剂等。各种缓冲剂和用于调节pH值的手段可用于制备本说明书中所公开的药物组合物，条件是所得制剂为药学上可接收的。所述缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、中性缓冲盐、磷酸盐缓冲生理食盐水和硼酸盐缓冲剂。应了解，需要时，酸或碱可用于调节组合物的pH值。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰基半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。使用防腐剂包括但不限于苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、氯丁醇、硫柳汞(thimerosal)、乙酸苯汞、硝酸苯汞、稳定化氧氯组合物(如

)和螯合剂(如DTPA或DTPA-双酰胺、DTPA钙和CaNaDTPA-双酰胺)。适用于药物组合物中的张力调节剂包括但不限于盐(如氯化钠、氯化钾)、甘露糖醇或甘油和其它药学上可接受的张力调节剂。药物组合物可以盐形式提供且可与多种酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于比相应游离碱形式更可溶于水性或其它质子性溶剂中。应了解，所述和药理学领域中已知的其它物质可包括于适用于本发明的药物组合物中。

因此，在一实施方案中，组合物包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素。在此实施方案的一方面中，药物组合物包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素和药理学载体。在此实施方案的另一方面中，药物组合物包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素和药理学组分。在此实施方案的另一方面中，药物组合物包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素、药理学载体和药理学组分。在此实施方案的其它方面中，药物组合物包含本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素和至少一种药理学载体、至少一种药用组分或至少一种药理学载体和至少一种药用组分。

本发明的方面还可描述如下：

1.一种单链修饰梭菌毒素，其包含：a)能够执行梭菌毒素中毒过程的酶促标靶修饰步骤的梭菌毒素酶促结构域；b)能够执行梭菌毒素中毒过程的移位步骤的梭菌毒素移位结构域；和c)包含蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分和结合结构域的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域，其中蛋白酶裂解位点的所述P部分的所述P₁位点毗邻结合结构域的氨基端，由此产生整合型蛋白酶裂解位点；其中所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的裂解使所述单链修饰梭菌毒素转化为双链形式，并且产生具有能够结合其同源受体的氨基端的结合结构域。

2.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述经过修饰的梭菌毒素包含以下线性氨基至羧基单一多肽顺序：1)所述梭菌毒素酶促结构域、所述梭菌毒素移位结构域和所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域，2)所述梭菌毒素酶促结构域、所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和所述梭菌毒素移位结构域，3)所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、所述梭菌毒素移位结构域和所述梭菌毒素酶促结构域，4)所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素移位结构域，或5)所述梭菌毒素移位结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。

3.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素移位结构域为BoNT/A移位结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/G移位结构域、TeNT移位结构域、BaNT移位结构域或BuNT移位结构域。

4.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。

5.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域为SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:118中的任何一个。

6.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中蛋白酶裂解位点中包括所述可切断键的所述P₁位点的所述P部分为SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:130。

7.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述结合结构域为阿片样肽。

8.如第7项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述阿片样肽为脑啡肽(enkephalin)、BAM22肽、内吗啡肽(endomorphin)、内啡肽(endorphin)、强啡肽(dynorphin)、痛敏肽(nociceptin)或强啡肽B(rimorphin)。

9.如第7项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述阿片样肽为SEQ ID NO:154至SEQ ID NO:186。

10.如第1项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述结合结构域为PAR配体。

11.如第9项中所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述PAR配体为PAR1、PAR2、PAR3或PAR4。

12.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的单链修饰梭菌毒素的双链形式和药学上可接受的载体、药学上可接受的组分或药学上可接受的载体与药学上可接受的组分两者。

13.一种多核苷酸分子，其编码如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素。

14.如第12项中所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子进一步包含表达载体。

15.一种产生经过修饰的梭菌毒素的方法，所述方法包括以下步骤：a)将如权利要求13所述的多核苷酸分子引入细胞中；和b)表达所述多核苷酸分子。

实施例

实施例1

构建具有整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于构建具有本说明书中所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的任何经过修饰的梭菌毒素。

为构建活化后具有氨基端游离靶向部分的经过修饰的梭菌毒素，修饰包含痛敏肽靶向部分的再靶向毒素以将现有肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分置换为本说明书中所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域(IPCS-BD)。包含肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分的再靶向毒素的实例公开于以下文献中：例如Steward，美国专利申请No.12/192,900，同上，(2008)；Foster，美国专利申请No.11/792,210，同上，(2007)；Foster，美国专利申请No.11/791,979，同上，(2007)；Dolly，美国专利No.7,419,676，同上，(2008)，每一文献的全文以引用的方式并入本文。举例来说，用EcoRI和XbaI消化包含多核苷酸分子SEQ IDNO:148的7.89-kb表达构建体，从而切除编码肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分的260bp多核苷酸分子，且使用凝胶纯化程序纯化所得7.63kb EcoRI-XbaI片段。使用T4DNA连接酶程序将编码SEQ IDNO:152的整合型蛋白酶裂解位点-痛敏肽的323 bp EcoRI-XbaI片段(SEQ ID NO:149)亚克隆到经过纯化的7.63kb EcoRI-XbaI片段中。使用电穿孔方法将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Edge Biosystems，Gaithersburg，MD)中，且细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH 7.0)上，且置于37°C°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的细菌鉴别为卡那霉素抗性菌落。使用碱性溶解质粒微量制备程序分离候选构建体且通过限制性核酸内切酶消化产物定位进行分析以确定插入物的存在和方向且进行DNA测序分析。此克隆策略产生包含编码SEQ ID NO:151的BoNT/A-IPCS-痛敏肽的多核苷酸分子SEQ ID NO:150的pET29表达构建体。

或者，可使用标准程序(Biotechnology，Bothell，WA)合成基于包含SEQ ID NO:152的IPCS-痛敏肽的BoNT/A-IPCS-痛敏肽(SEQ ID NO:151)的多核苷酸分子。使用标准氨基磷酸酯合成法合成长20至50个碱基的寡核苷酸。所述寡核苷酸将杂交成双链型双链体，将其连接到一起以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将此多核苷酸分子克隆到pUCBHB1载体的SmaI位点中以产生pUCBHB1/BoNT/A-AP4A-痛敏肽。使用Big Dye Terminator^TMChemistry 3.1(Applied Biosystems，Foster City，CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过测序验证所合成的多核苷酸分子。必要时，可合成表达经过优化的基于BoNT/A-IPCS-痛敏肽(SEQID NO:151)的多核苷酸分子以改良在大肠杆菌菌株中的表达。可修饰编码BoNT/A-IPCS-痛敏肽的多核苷酸分子以1)含有通常存在于大肠杆菌菌株的原生多核苷酸分子中的同义密码子；2)含有更密切匹配大肠杆菌菌株中所发现的原生多核苷酸分子的平均G+C含量的G+C含量；3)减少多核苷酸分子内所发现的聚单核苷酸区；和/或4)消除多核苷酸分子内所发现的内部调控或结构位点，参见例如Lance E.Steward等，Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A，美国专利公布2008/0057575(2008年3月6日)；和Lance E.Steward等，Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E，美国专利公布2008/0138893(2008年6月12日)。一旦完成了序列优化，就使用标准氨基磷酸酯合成法合成长20至50个碱基的寡核苷酸。使所述寡核苷酸杂交成双链型双链体，将其连接到一起以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将此多核苷酸分子克隆到pUCBHB1载体的SmaI位点中以产生pUCBHB1/BoNT/A-IPCS-痛敏肽。通过DNA测序验证所合成的多核苷酸分子。有必要时，可针对不同生物体(如酵母菌株、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系)进行表达优化，参见例如Steward，美国专利公布2008/0057575，同上，(2008)；和Steward，美国专利公布2008/0138893，同上，(2008)。

类似克隆策略将用于制备包含编码包含其它IPCS-BD的BoNT/A-IPCS-BD的多核苷酸分子的pUCBHB1克隆构建体，所述BoNT/A-IPCS-BD为如基于SEQ ID NO:4-7的BoNT/A-IPCS-脑啡肽；基于SEQ ID NO:8-27的BoNT/A-IPCS-BAM-22；基于SEQ ID NO:28-29的BoNT/A-IPCS-内吗啡肽；基于SEQ ID NO:30-35的BoNT/A-IPCS-内啡肽；基于SEQ ID NO:36-68的BoNT/A-IPCS-强啡肽；基于SEQ ID NO:69-74的BoNT/A-IPCS-强啡肽B；基于SEQ IDNO:75-84的BoNT/A-IPCS-痛敏肽；基于SEQ ID NO:85-87的BoNT/A-IPCS-神经肽；或基于SEQ  ID NO:88-118的BoNT/A-IPCS-PAR。同样，类似克隆策略可用于制备包含编码其它梭菌毒素-IPCS-BD的多核苷酸分子的pUCBHB1克隆构建体，所述梭菌毒素-IPCS-BD为如BoNT/B-IPCS-BD、BoNT/C1-IPCS-BD、BoNT/D-IPCS-BD、BoNT/E-IPCS-BD、BoNT/F-IPCS-BD、BoNT/G-IPCS-BD、TeNT-IPCS-BD、BaNT/B-IPCS-BD或BuNT/B-IPCS-BD。

为构建pET29/BoNT/A-IPCS-痛敏肽，用1)切除编码BoNT/A-IPCS-痛敏肽的开放阅读框的多核苷酸分子；且2)使得此多核苷酸分子能够可操作地连接于pET29载体(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI)的限制性核酸内切酶消化pUCBHB1/BoNT/A-IPCS-痛敏肽构建体。使用T4DNA连接酶程序将此插入物亚克隆到用适当限制性核酸内切酶消化过的pET29载体中以产生pET29/BoNT/A-IPCS-痛敏肽。使用电穿孔方法将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Edge Biosystems，Gaitherburg，MD)中，且细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH 7.0)上，且置于37°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的细菌鉴别为卡那霉素抗性菌落。使用碱性溶解质粒微量制备程序分离候选构建体且通过限制性核酸内切酶消化产物定位进行分析以确定插入物的存在和方向。此克隆策略产生包含编码BoNT/A-IPCS-痛敏肽的多核苷酸分子的pET29表达构建体。

类似克隆策略将用于制备包含编码其它BoNT/A-IPCS-BD的多核苷酸分子的pET29表达构建体，所述BoNT/A-IPCS-BD为如基于SEQ ID NO:4-7的BoNT/A-IPCS-脑啡肽；基于SEQ ID NO:8-27的BoNT/A-IPCS-BAM-22；基于SEQ ID NO:28-29的BoNT/A-IPCS-内吗啡肽；基于SEQ ID NO:30-35的BoNT/A-IPCS-内啡肽；基于SEQID NO:36-68的BoNT/A-IPCS-强啡肽；基于SEQ ID NO:69-74的BoNT/A-IPCS-强啡肽B；基于SEQ ID NO:75-84的BoNT/A-IPCS-痛敏肽；基于SEQ ID NO:85-87的BoNT/A-IPCS-神经肽；或基于SEQID NO:88-118的BoNT/A-IPCS-PAR。同样，类似克隆策略可用于制备包含编码其它梭菌毒素-IPCS-BD的多核苷酸分子的pET29表达克隆构建体，所述梭菌毒素-IPCS-BD为如BoNT/B-IPCS-BD、BoNT/C1-IPCS-BD、BoNT/D-IPCS-BD、BoNT/E-IPCS-BD、BoNT/F-IPCS-BD、BoNT/G-IPCS-BD、TeNT-IPCS-BD、BaNT/B-IPCS-BD或BuNT/B-IPCS-BD。

实施例2

表达具有整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于在细菌细胞中表达任何本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的程序。

为表达本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素，使用电穿孔方法将表达构建体(如实施例1中所述)转化至电感受态

大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Edge Biosystems，Gaithersburg，MD)中。接着将细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH7.0)上且置于37°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的转化大肠杆菌的卡那霉素抗性菌落用于接种含有3.0mL含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基的振荡三角瓶(baffled flask)，其接着置于37°C恒温箱中在250rpm振荡下生长过夜。所得过夜起始培养物用于接种250mL含有50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052自诱导培养基。所述培养物在37°C恒温箱中在250rpm振荡下生长约3.5小时，且接着转移至22°C恒温箱在250rpm振荡下再孵育16-18小时。通过离心(4°C下4,000rpm离心20-30分钟)收集细胞且立即使用，或在-80°C下储存直至需要。

实施例3

纯化具有整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于纯化和定量本说明书中所公开的任何经过修饰的梭菌毒素的方法。

为溶解含有本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的细胞离心块，将细胞离心块(如实施例2中所述)再混悬于含有

蛋白质提取试剂(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)；1×蛋白酶抑制剂混合液集合III(EMD Biosciences-Calbiochem，San Diego CA)；每毫升25单位Benzonase核酸酶(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI)；和每毫升1,000单位重组溶菌酶(rLysozyme)(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)的溶解缓冲液中。细胞混悬液在室温下在平台式振荡器上孵育20分钟，在冰上孵育15分钟以使清洁剂沉淀，接着在4°C下在30,500 rcf下离心30分钟以移除不溶性碎片。将澄清过的上清液转移至新管且立即用于IMAC纯化，或在4°C下干燥储存直至需要。

为使用固定金属亲和力色谱(IMAC)纯化本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素，将澄清过的上清液与用IMAC洗涤缓冲液(25mMN-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH 8.0；500mM氯化钠；10mM咪唑；10%(v/v)甘油)平衡的2.5-5.0mL TALON^TMSuperFlow Co²⁺亲和力树脂(BD Biosciences-Clontech，Palo Alto，CA)混合。将澄清上清液-树脂混合物在平台式振荡器上在4°C下孵育60分钟。接着将澄清上清液-树脂混合物转移至一次性聚丙烯管柱载体(Thomas Intruments Co.，Philadelphia，PA)且连接至真空歧管。管柱用五倍管柱体积的IMAC洗涤缓冲液洗涤两次。经过修饰的梭菌毒素用2倍管柱体积的IMAC洗脱缓冲液(25mMN-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH 8.0；500mM氯化钠；500mM咪唑；10%(v/v)甘油)洗脱且收集于约1mL洗脱份中。通过Bradford染料测定对含于各洗脱份中的经过修饰的梭菌毒素的量进行测定。在此程序中，将各1.0mL洗脱份的10μL等分试样与200μL用去离子蒸馏水按1比4稀释的Bio-Rad蛋白质试剂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)组合，且使用分光光度计测量比色信号的强度。具有最强信号的洗脱份视为洗脱峰且组合到一起并进行透析以调整溶液用于后续程序。经过IMAC纯化的修饰梭菌毒素的缓冲液交换通过在配备25kD MWCO膜(Harvard Apparatus)的

(Harvard Apparatus)中在4°C下透析来完成。蛋白质样品交换至适当脱盐缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)中以用于后续离子交换色谱纯化步骤。将

在恒定搅拌下置于1L脱盐缓冲液中且在4°C下孵育过夜。

为使用FPLC离子交换色谱纯化本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素，将经过修饰的梭菌毒素样品透析至50mM Tris-HCl(pH 8.0)中，使用BioLogic DuoFlow色谱系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以0.5mL/min的流速施加至用50mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的1mL UNO-Q1^TM阴离子交换管柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。结合的蛋白质如下在4°C下通过具有包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)的洗脱缓冲液；流速为1.0ml/min的1M NaCl的NaCl步进梯度进行洗脱：流速为1.0mL/min的3mL 7%洗脱缓冲液、流速为1.0mL/min的6mL 12%洗脱缓冲液和流速为1.0mL/min的10mL 12%至100%洗脱缓冲液。用QuadTec UV-Vis检测器在214nm、260nm和280nm下检测物质从管柱的洗脱，且在280nm下的吸收等于或高于0.01AU的所有峰收集于1.0mL洗脱份中。使用标准Typhoon凝胶定量(GEHealthcare，Piscataway，NJ)来测定蛋白质浓度。汇集峰洗脱份，添加5%(v/v)PEG-400，且将等分试样于液氮中冷冻并在-80°C下储存。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的表达。将使用上述程序纯化的经过修饰的梭菌毒素的样品添加至含和不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在变性条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用

Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像。为定量经过修饰的梭菌毒素产率，将不同量的经过纯化的修饰梭菌毒素样品添加至不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在非还原条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用

Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像。成像后，绘制BSA标准物的参考曲线且由此曲线内推出毒素量。通过与MagicMark^TM蛋白质分子量标准物(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)比较来测定经过修饰的梭菌毒素的大小。

还通过蛋白质印迹分析对本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的表达进行分析。将使用上述程序纯化的蛋白质样品添加至含和不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在变性还原条件下使用Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。使用

SD半干式电泳转移单元设备(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)通过蛋白质印迹将分离的多肽从凝胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)上。通过在室温下在含有25mM Tris缓冲生理食盐水(25mM 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇盐酸(Tris-HCl)(pH 7.4)、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾)、0.1%

聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、2%牛血清白蛋白、5%脱脂奶粉的溶液中孵育2小时阻断PVDF膜。阻断的膜在4°C下在含有作为探针的适当一次抗体的Tris缓冲生理食盐水(25mM Tris缓冲生理食盐水、0.1%

聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)中孵育过夜。将一次抗体探测出的印迹在Tris缓冲生理食盐水

中洗涤三次每次15分钟。经过洗涤的膜在室温下在含有作为二次抗体的与辣根过氧化物酶偶联的适当免疫球蛋白G抗体的Tris缓冲生理食盐水中孵育2小时。将二次抗体探测出的印迹在Tris缓冲生理食盐水

中洗涤三次每次15分钟。经过标记的修饰梭菌毒素的信号探测使用ECL Plus^TM蛋白质印迹探测系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)进行观测且用Typhoon 9410可变模式成像仪(GE Healthcare，Piscataway，NJ)进行成像以便定量经过修饰的梭菌毒素的表达水平。

实施例4

活化具有整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于通过使具有本说明书中所公开的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的单链形式转化成双链形式来活化任何所述毒素的方法。

为活化本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素，通过将2.5至10单位的AcTEV(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)添加至含有1.0μg经过纯化的修饰梭菌毒素(如实施例3中所述)的50mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液中来建立反应混合物。将此反应混合物在23-30°C下孵育60-180分钟。为分析单链形式向其双链形式的转化，在变性条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离含和不含DTT的反应混合物的少量等分试样。将凝胶用Ruby(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像以供定量经过修饰的梭菌毒素的单链和双链形式。通过与MagicMark^TM蛋白质分子量标准物(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)比较来测定经过修饰的梭菌毒素形式的大小和量。

结果指示在TEV在经过修饰的梭菌毒素的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域中切割后，在还原条件下检测到各约50kDa的两条条带，对应于经过修饰的毒素的双链形式。此外，当将相同样品在非还原条件下操作时，两条约50kDa的条带消失且观察到约100kDa的新条带。总而言之，这些观察结果指示在还原条件下见到的两条约50kDa条带对应于梭菌毒素酶促结构域和氨基端连接有靶向部分的梭菌毒素移位结构域。

实施例5

纯化经过活化的具有整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于用TEV活化后纯化和定量本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素的双链形式的方法。

为纯化经过活化的本说明书中所公开的经过修饰的梭菌毒素，对含有用TEV处理过的经过修饰的梭菌毒素的反应混合物(如实施例4中所述)进行阴离子交换色谱纯化程序以移除TEV蛋白酶和回收双链修饰梭菌毒素。将反应混合物以1.0mL/min的流速加载至用50mMTris-HCl(pH 8.0)平衡的1.0mL UNO-Q1^TM阴离子交换管柱(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)上。结合的蛋白质如下通过使用包含50mM Tris-HCL(pH 8.0)和1M NaCl的洗脱缓冲液的NaCl梯度进行洗脱：流速为1.0mL/min的3mL 7%洗脱缓冲液、流速为1.0mL/min的6mL 12%洗脱缓冲液和流速为1.0mL/min的10mL 12%至100%洗脱缓冲液。用QuadTec UV-Vis检测器在214nm、260nm和280nm下检测物质从管柱的洗脱，且在180nm下的吸收等于或高于0.01AU的所有峰收集于1.0mL洗脱份中。将所选洗脱份添加至含和不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在变性条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用

Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像以供定量经过纯化的活化修饰梭菌毒素。汇集峰洗脱份，添加5%PEG-400，且将经过纯化的样品在液氮中冷冻并在-80°C下储存。

实施例6

构建包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于构建包含含本说明书中所公开的整合型TEV蛋白酶裂解位点甘丙肽结合结构域的双链环的经过修饰的梭菌毒素的方法。

为构建包含整合型TEV蛋白酶裂解位点甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素，修饰包含痛敏肽靶向部分的再靶向毒素以将现有肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分置换为整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域。包含肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分的再靶向毒素的实例公开于以下文献中：例如Steward，美国专利申请No.12/192,900，同上，(2008)；Foster，美国专利申请No.11/792,210，同上，(2007)；Foster，美国专利申请No.11/791,979，同上，(2007)；Dolly，美国专利No.7,419,676，同上，(2008)，每一文献的全文以引用的方式并入本文。举例来说，用EcoRI和XbaI消化包含多核苷酸分子SEQ IDNO:148的7.89-kb表达构建体，从而切除编码肠激酶裂解位点和痛敏肽靶向部分的260bp多核苷酸分子，且使用凝胶纯化程序纯化所得7.63kb EcoRI-XbaI片段。使用T4DNA连接酶程序将编码SEQ IDNO:188的整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽的311bp EcoRI-XbaI片段(SEQ ID NO:187)亚克隆到经过纯化的7.63kb EcoRI-XbaI片段中。使用电穿孔方法将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Edge Biosystems，Gaithersburg，MD)中，且细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH 7.0)上，且置于37°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的细菌鉴别为卡那霉素抗性菌落。使用碱性溶解质粒微量制备程序分离候选构建体且通过限制性核酸内切酶消化产物定位进行分析以确定插入物的存在和方向且进行DNA测序分析。此克隆策略产生包含编码SEQ ID NO:190的BoNT/A-IPCS-甘丙肽的多核苷酸分子SEQ ID NO:189的pET29表达构建体。

或者，可使用标准程序(

Biotechnology，Bothell，WA)合成基于包含SEQ ID NO:188的IPCS-甘丙肽的BoNT/A-IPCS-甘丙肽(SEQ ID NO:190)的多核苷酸分子。使用标准氨基磷酸酯合成法合成长20至50个碱基的寡核苷酸。所述寡核苷酸将杂交成双链型双链体，将其连接到一起以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将此多核苷酸分子克隆到pUCBHB1载体的SmaI位点中以产生pUCBHB1/BoNT/A-AP4A-甘丙肽。使用Big Dye Terminator^TMChemistry 3.1(Applied Biosystems，Foster City，CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过测序验证所合成的多核苷酸分子。必要时，可合成表达经过优化的基于BoNT/A-IPCS-甘丙肽(SEQID NO:190)的多核苷酸分子以改良在大肠杆菌菌株中的表达。可修饰编码BoNT/A-IPCS-甘丙肽的多核苷酸分子以1)含有通常存在于大肠杆菌菌株的原生多核苷酸分子中的同义密码子；2)含有更密切匹配大肠杆菌菌株中所发现的原生多核苷酸分子的平均G+C含量的G+C含量；3)减少多核苷酸分子内所发现的聚单核苷酸区；和/或4)消除多核苷酸分子内所发现的内部调控或结构位点，参见例如Lance E.Steward等，Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A，美国专利公布2008/0057575(2008年3月6日)；和Lance E.Steward等，Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E，美国专利公布2008/0138893(2008年6月12日)。一旦完成了序列优化，就使用标准氨基磷酸酯合成法合成长20至50个碱基的寡核苷酸。使所述寡核苷酸杂交成双链型双链体，将其连接到一起以组装全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将此多核苷酸分子克隆到pUCBHB1载体的SmaI位点中以产生pUCBHB1/BoNT/A-IPCS-甘丙肽。通过DNA测序验证所合成的多核苷酸分子。有必要时，可针对不同生物体(如酵母菌株、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系)进行表达优化，参见例如Steward，美国专利公布2008/0057575，同上，(2008)；和Steward，美国专利公布2008/0138893，同上，(2008)。

为构建pET29/BoNT/A-IPCS-甘丙肽，用1)切除编码BoNT/A-IPCS-甘丙肽的开放阅读框的多核苷酸分子；且2)使得此多核苷酸分子能够可操作地连接于pET29载体(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI)的限制性核酸内切酶消化pUCBHB1/BoNT/A-IPCS-甘丙肽构建体。使用T4DNA连接酶程序将此插入物亚克隆到用适当限制性核酸内切酶消化过的pET29载体中以产生pET29/BoNT/A-IPCS-甘丙肽。使用电穿孔方法将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Edge Biosystems，Gaitherburg，MD)中，且细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH 7.0)上，且置于37°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的细菌鉴别为卡那霉素抗性菌落。使用碱性溶解质粒微量制备程序分离候选构建体且通过限制性核酸内切酶消化产物定位进行分析以确定插入物的存在和方向。此克隆策略产生包含编码BoNT/A-IPCS-甘丙肽的多核苷酸分子的pET29表达构建体。

实施例7

表达包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于在细菌细胞中表达包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的程序。

为表达包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的所公开的经过修饰的梭菌毒素，使用电穿孔方法将表达构建体(如实施例6中所述)转化至电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(EdgeBiosystems，Gaithersburg，MD)中。接着将细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH 7.0)上且置于37°C恒温箱中生长过夜。含有表达构建体的转化大肠杆菌的卡那霉素抗性菌落用于接种含有3.0mL含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基的振荡三角瓶，其接着置于37°C恒温箱中在250rpm振荡下生长过夜。所得过夜起始培养物用于接种250mL含有50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052自诱导培养基。所述培养物在37°C恒温箱中在250rpm振荡下生长约3.5小时，且接着转移至22°C恒温箱在250rpm振荡下再孵育16-18小时。通过离心(4°C下4,000rpm离心20-30分钟)收集细胞且立即使用，或在-80°C下储存直至需要。

实施例8

纯化包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于纯化和定量包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的方法。

为溶解含有包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的细胞离心块，将细胞离心块(如实施例7中所述)再混悬于含有

蛋白质提取试剂(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI)；1×蛋白酶抑制剂混合液集合III(EMDBiosciences-Calbiochem，San Diego CA)；每毫升25单位Benzonase核酸酶(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)；和每毫升1,000单位重组溶菌酶(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI)的溶解缓冲液中。细胞混悬液在室温下在平台式振荡器上孵育20分钟，在冰上孵育15分钟以使清洁剂沉淀，接着在4°C下在30,500rcf下离心30分钟以移除不溶性碎片。将澄清过的上清液转移至新管且立即用于IMAC纯化，或在4°C下干燥储存直至需要。

为使用固定金属亲和力色谱(IMAC)纯化包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素，将澄清过的上清液与用IMAC洗涤缓冲液(25mMN-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH 8.0；500mM氯化钠；10mM咪唑；10%(v/v)甘油)平衡的2.5-5.0mL TALON^TM SuperFlow Co²⁺亲和力树脂(BDBiosciences-Clontech，Palo Alto，CA)混合。将澄清上清液-树脂混合物在平台式振荡器上在4°C下孵育60分钟。接着将澄清上清液-树脂混合物转移至一次性聚丙烯管柱载体(Thomas Intruments Co.，Philadelphia，PA)且连接至真空歧管。管柱用五倍管柱体积的IMAC洗涤缓冲液洗涤两次。经过修饰的梭菌毒素用2倍管柱体积的IMAC洗脱缓冲液(25mMN-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH8.0；500mM氯化钠；500mM咪唑；10%(v/v)甘油)洗脱且收集于约1mL洗脱份中。通过Bradford染料测定对含于各洗脱份中的经过修饰的梭菌毒素的量进行测定。在此程序中，将各1.0mL洗脱份的10μL等分试样与200μL用去离子蒸馏水按1比4稀释的Bio-Rad蛋白质试剂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)组合，且使用分光光度计测量比色信号的强度。具有最强信号的洗脱份视为洗脱峰且组合到一起并进行透析以调整溶液用于后续程序。经过IMAC纯化的修饰梭菌毒素的缓冲液交换通过在配备25kD MWCO膜(Harvard Apparatus)的

(Harvard Apparatus)中在4°C下透析来完成。蛋白质样品交换至适当脱盐缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)中以用于后续活化步骤。将

在恒定搅拌下置于1L脱盐缓冲液中且在4°C下孵育过夜。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的表达。将使用上述程序纯化的经过修饰的梭菌毒素的样品添加至含和不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在变性条件下使用Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像。为定量经过修饰的梭菌毒素产率，将不同量的经过纯化的修饰梭菌毒素样品添加至不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在非还原条件下使用Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用

Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像。成像后，绘制BSA标准物的参考曲线且由此曲线内推出毒素量。通过与MagicMark^TM蛋白质分子量标准物(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)比较来测定经过修饰的梭菌毒素的大小。

实施例9

活化包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于通过使具有整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的单链形式转化成双链形式来活化所述蛋白质的方法。

为活化具有整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素，通过将2.5至10单位的AcTEV(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)添加至含有1.0μg经过纯化的修饰梭菌毒素(如实施例8中所述)的50mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液中来建立反应混合物。将此反应混合物在23-30°C下孵育60-180分钟。为分析单链形式向其双链形式的转化，在变性条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离含和不含DTT的反应混合物的少量等分试样。将凝胶用

Ruby(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像以供定量经过修饰的梭菌毒素的单链和双链形式。通过与MagicMark^TM蛋白质分子量标准物(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)比较来测定经过修饰的梭菌毒素的大小。

结果指示在TEV在经过修饰的梭菌毒素的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域中切割后，在还原条件下检测到各约50kDa的两条条带，对应于经过修饰的毒素的双链形式。此外，当将相同样品在非还原条件下操作时，两条约50kDa的条带消失且观察到约100kDa的新条带。总而言之，这些观察结果指示在还原条件下见到的两条约50kDa条带对应于梭菌毒素酶促结构域和氨基端连接有甘丙肽部分的梭菌毒素移位结构域。

实施例10

纯化经过活化的包含整合型TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素

以下实施例说明适用于在用TEV活化后，纯化和定量具有整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素的双链形式的方法。

为纯化经过活化的具有整合型蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的经过修饰的梭菌毒素，对含有用TEV蛋白酶处理过的经过修饰的梭菌毒素的反应混合物(如实施例9中所述)进行阴离子交换色谱纯化程序以移除TEV蛋白酶和回收双链修饰梭菌毒素。将反应混合物以1.0mL/min的流速加载至用50mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的1.0mLUNO-Q1^TM阴离子交换管柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。结合的蛋白质如下通过使用包含50mM Tris-HCL(pH 8.0)和1M NaCl的洗脱缓冲液的NaCl梯度进行洗脱：流速为1.0mL/min的3mL 7%洗脱缓冲液、流速为1.0mL/min的6mL 12%洗脱缓冲液和流速为1.0mL/min的10mL 12%至100%洗脱缓冲液。用QuadTec UV-Vis检测器在214nm、260nm和280nm下检测物质从管柱的洗脱，且在180nm下的吸收等于或高于0.01AU的所有峰收集于1.0mL洗脱份中。将所选洗脱份添加至含和不含DTT的2×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)中且在变性条件下使用

Novex 4-12%Bis-Tris预浇铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将凝胶用Ruby(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)染色且使用Fluor-S MAX多功能成像仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对分离的多肽进行成像以供定量经过纯化的活化修饰梭菌毒素。汇集峰洗脱份，添加5%PEG-400，且将经过纯化的样品于液氮中冷冻并在-80°C下储存。

尽管已参考所公开的实施方案描述了本发明的各个方面，但本领域的技术人员将显而易见，所公开的特定实施例仅说明所述方面且不以任何方式限制本发明。可在不偏离本发明的精神的情况下进行各种修改。

尽管已参考所公开的实施方案描述了本发明的各个方面，但本领域的技术人员将显而易见，所公开的特定实施例仅说明所述方面且不以任何方式限制本发明。可在不偏离本发明的精神的情况下进行各种修改。

Claims (14)

1.一种单链修饰梭菌毒素，其包含：

a)能够执行梭菌毒素中毒过程的酶促靶向修饰步骤的梭菌毒素酶促结构域；

b)能够执行梭菌毒素中毒过程的移位步骤的梭菌毒素移位结构域；和

c)包含蛋白酶裂解位点中包括可切断键的P₁位点的P部分和结合结构域的整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域，所述蛋白酶裂解位点的所述P部分的所述P₁位点毗邻所述结合结构域的氨基端，由此产生整合型蛋白酶裂解位点；

其中所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域的裂解使所述单链修饰梭菌毒素转化成双链形式，并且产生具有能够结合其同源受体的氨基端的结合结构域。

2.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述经过修饰的梭菌毒素包含以下线性氨基至羧基单一多肽顺序：1)所述梭菌毒素酶促结构域、所述梭菌毒素移位结构域和所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域，2)所述梭菌毒素酶促结构域、所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和所述梭菌毒素移位结构域，3)所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、所述梭菌毒素移位结构域和所述梭菌毒素酶促结构域，4)所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素移位结构域，或5)所述梭菌毒素移位结构域、整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。

3.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素移位结构域为BoNT/A移位结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/G移位结构域、TeNT移位结构域、BaNT移位结构域或BuNT移位结构域。

4.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。

5.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述整合型蛋白酶裂解位点-结合结构域为SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：118中的任何一个。

6.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中蛋白酶裂解位点中包括所述可切断键的所述P₁位点的所述P部分为SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：130。

7.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述结合结构域为阿片样肽。

8.如权利要求7所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述阿片样肽为脑啡肽、BAM22肽、内吗啡肽、内啡肽、强啡肽、痛敏肽或强啡肽B。

9.如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述结合结构域为PAR配体。

10.如权利要求9所述的经过修饰的梭菌毒素，其中所述PAR配体为PAR1、PAR2、PAR3或PAR4。

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的单链修饰梭菌毒素的双链形式和药学上可接受的载体、药学上可接受的组分或药学上可接受的载体与药学上可接受的组分两者。

12.一种多核苷酸分子，其编码如权利要求1所述的经过修饰的梭菌毒素。

13.如权利要求12所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子进一步包含表达载体。

14.一种产生经过修饰的梭菌毒素的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将根据权利要求13所述的多核苷酸分子引入细胞中；和

b)表达所述多核苷酸分子。

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