ES2704237T3 - Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto - Google Patents
Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto Download PDFInfo
- Publication number
- ES2704237T3 ES2704237T3 ES15707550T ES15707550T ES2704237T3 ES 2704237 T3 ES2704237 T3 ES 2704237T3 ES 15707550 T ES15707550 T ES 15707550T ES 15707550 T ES15707550 T ES 15707550T ES 2704237 T3 ES2704237 T3 ES 2704237T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- recombinant
- neurotoxin
- seq
- clostridial neurotoxin
- specifically
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title claims description 89
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title claims description 89
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 title claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 41
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 177
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 88
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims description 82
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 claims description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 49
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 claims description 46
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 41
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 206010040954 Skin wrinkling Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 claims description 4
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 claims description 2
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008930 Low Back Pain Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036617 axillary hyperhidrosis Effects 0.000 claims description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 claims description 2
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 22
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 20
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 20
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 19
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 16
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 16
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 9
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 9
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 3
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 3
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001738 temporomandibular joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 description 1
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000027109 Headache disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020853 Hypertonic bladder Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 206010028391 Musculoskeletal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000693 Neurogenic Urinary Bladder Diseases 0.000 description 1
- 206010029279 Neurogenic bladder Diseases 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 208000009722 Overactive Urinary Bladder Diseases 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 206010041235 Snoring Diseases 0.000 description 1
- 208000027520 Somatoform disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000000697 Vocal Cord Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 208000013154 Vocal cord disease Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 206010009259 cleft lip Diseases 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000009709 cytosolic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000000367 exoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 1
- 208000024765 knee pain Diseases 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001352 masseter muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010995 multi-dimensional NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 1
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 1
- 208000020629 overactive bladder Diseases 0.000 description 1
- 208000027753 pain disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000026451 salivation Diseases 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012154 short term therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001260 vocal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11013—Clostridial aminopeptidase (3.4.11.13)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un segmento de proteína que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, en donde dicho segmento de proteína consiste en residuos de alanina, serina y prolina, o en donde dicho segmento de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dichas repeticiones consisten en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos, concretamente en donde los residuos de prolina comprendidos en dicho segmento de proteína constituyen más de 4% y menos de 40% de los aminoácidos de dicho segmento de proteína, en donde dicho segmento de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, y en donde dicho segmento de proteína se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (iv) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, concretamente en el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto
Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes que presentan un aumento de la duración del efecto y a métodos para la fabricación de tales neurotoxinas clostridiales recombinantes. Estas nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes comprenden un segmento de proteína, y los métodos comprenden las etapas de inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental y expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia codificante del segmento de proteína en una célula anfitriona. La invención se refiere adicionalmente a nuevas neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes utilizadas en tales métodos, a las secuencias de ácido nucleico que codifican tales neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes, y a las composiciones farmacéuticas que comprenden la neurotoxina clostridial recombinante con un aumento de la duración del efecto.
Antecedentes de la invención
Clostridium es un género de bacterias grampositivas anaerobias, pertenecientes a los Firmicutes. Clostridium consiste en alrededor de 100 especies que incluyen bacterias de vida libre comunes, así como patógenos importantes, tales como Clostridium botulinum y Clostridium tetani. Ambas especies producen neurotoxinas, toxina botulínica y toxina tetánica, respectivamente. Estas neurotoxinas son potentes inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependiente del calcio de células neuronales y se encuentran entre las toxinas más potentes conocidas por el hombre. La dosis letal en seres humanos se encuentra entre 0,1 ng y 1 ng por kilogramo de peso corporal.
La ingestión oral de toxina botulínica a través de alimentos contaminados o la generación de toxina botulínica en las heridas pueden causar botulismo, que se caracteriza por la parálisis de diferentes músculos. La parálisis de los músculos respiratorios puede causar la muerte del individuo afectado.
Aunque tanto la neurotoxina botulínica (BoNT) como la neurotoxina tetánica (TxNT) funcionan a través de un mecanismo de acción fisiológico inicial similar, inhibiendo la liberación de neurotransmisores desde el axón de la neurona afectada a la sinapsis, difieren en su respuesta clínica. Mientras que la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular y otras sinapsis colinérgicas en el sistema nervioso periférico, inhibiendo la liberación del neurotransmisor acetilcolina y, causando de ese modo parálisis flácida, la toxina tetánica actúa principalmente en el sistema nervioso central, evitando la liberación de los neurotransmisores inhibidores GABA (ácido gammaaminobutírico) y glicina al degradar la proteína sinaptobrevina. La consiguiente sobreactividad en los músculos da como resultado contracciones generalizadas de la musculatura agonística y antagónica, denominadas espasmo tetánico (parálisis rígida).
Si bien la neurotoxina tetánica existe en un tipo inmunológicamente distinto, se sabe que las neurotoxinas botulínicas aparecen en siete tipos inmunogénicos diferentes, denominados BoNT/A a BoNT/H. La mayoría de las cepas de Clostridium botulinum producen un tipo de neurotoxina, pero también se han descrito cepas que producen múltiples toxinas.
Las neurotoxinas botulínica y tetánica tienen secuencias de aminoácidos altamente homólogas y muestran una estructura de dominio similar. Su forma biológicamente activa comprende dos cadenas peptídicas, una cadena ligera de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa, conectadas por un enlace disulfuro. Una región conectora o bucle, cuya longitud varía entre diferentes toxinas clostridiales, se encuentra entre los dos residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro. Esta región bucle es escindida proteolíticamente por una endoproteasa clostridial desconocida para obtener la toxina biológicamente activa.
El mecanismo molecular de intoxicación por TxNT y BoNT también parece ser similar: la entrada en la neurona diana está mediada por la unión de la parte C-terminal de la cadena pesada a un receptor específico de la superficie celular; la toxina es absorbida a continuación por endocitosis mediada por receptores. El bajo pH en el endosoma así formado desencadena después un cambio conformacional en la toxina clostridial que le permite integrarse en la membrana endosomal y translocarse a través de la membrana endosomal al citoplasma, donde el enlace disulfuro que une la cadena pesada y ligera es reducido. La cadena ligera puede escindir selectivamente a continuación las llamadas proteínas SNARE, que son esenciales para las diferentes etapas de la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica, p. ej. reconocimiento, acoplamiento y fusión de vesículas que contienen neurotransmisores con la membrana plasmática. TxNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G causan la escisión proteolítica de la sinaptobrevina o VAMP (proteína de membrana asociada a la vesícula), BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada a la membrana plasmática SNAP-25 y BoNT/C escinde la proteína integrante de la membrana plasmática sintaxina y SNAP-25.
Las neurotoxinas clostridiales muestran duraciones de acción variables que son específicas del serotipo. El efecto terapéutico clínico de BoNT/A dura aproximadamente 3 meses para trastornos neuromusculares y de 6 a 12 meses
para hiperhidrosis. Los efectos de BoNT/E, por otro lado, duran menos de 4 semanas. El efecto terapéutico más duradero de BoNT/A la hace preferible para uso clínico en comparación con otros serotipos, por ejemplo, serotipos B, C1, D, E, F, G y H. Una posible explicación de las duraciones de acción divergentes podrían ser las distintas localizaciones subcelulares de los serotipos de BoNT. El dominio proteasa de la cadena ligera de BoNT/A se localiza de manera puntual en la membrana plasmática de las células neuronales, co-localizándose con su sustrato SNAP-25. Por el contrario, el serotipo BoNT/E de corta duración es citoplasmático. La asociación con la membrana podría proteger a BoNT/A de los mecanismos de degradación citosólicos permitiendo una persistencia prolongada de BoNT/A en la célula neuronal.
En Clostridium botulinum, la toxina botulínica se forma como un complejo proteico que comprende el componente neurotóxico y las proteínas no tóxicas. Las proteínas accesorias incorporan el componente neurotóxico, protegiéndolo así de la degradación por las enzimas digestivas en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, las neurotoxinas botulínicas de la mayoría de los serotipos son oralmente tóxicas. Los complejos, por ejemplo, con 450 kDa o con 900 kDa se pueden obtener de cultivos de Clostridium botulinum.
En los últimos años, las neurotoxinas botulínicas se han utilizado como agentes terapéuticos en el tratamiento de las distonías y los espasmos. Las preparaciones que comprenden complejos de toxina botulínica están disponibles comercialmente, p. ej. de Ipsen Ltd (Dysport®) o Allergan Inc. (Botox®). Un componente neurotóxico de alta pureza, libre de cualquier proteína complejante, está disponible, por ejemplo, en Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt (Xeomin®).
Las neurotoxinas clostridiales se inyectan generalmente en el tejido muscular afectado, acercando el agente a la placa terminal neuromuscular, es decir, cerca del receptor celular que media su absorción en la célula nerviosa que controla dicho músculo afectado. Se han observado diversos grados de diseminación de neurotoxinas. Se cree que la diseminación de la neurotoxina depende de la cantidad inyectada y de la preparación particular de la neurotoxina. Puede provocar efectos secundarios adversos, tales como parálisis en el tejido muscular cercano, que puede evitarse en gran medida reduciendo las dosis inyectadas al nivel terapéuticamente relevante. La sobredosificación también puede hacer que el sistema inmunitario genere anticuerpos neutralizantes que inactiven la neurotoxina evitando que alivie la actividad muscular involuntaria. Se ha demostrado que la tolerancia inmunológica a la toxina botulínica se correlaciona con las dosis acumuladas.
En la actualidad, las neurotoxinas clostridiales todavía se producen predominantemente mediante procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Sin embargo, la producción industrial de neurotoxina clostridial a partir del cultivo anaeróbico de Clostridium es un procedimiento engorroso y lento. Debido a la alta toxicidad del producto final, el procedimiento debe realizarse bajo contención estricta. Durante el proceso de fermentación, los precursores de cadena sencillas son escindidos proteolíticamente por una proteasa clostridial desconocida para obtener la neurotoxina clostridial de dos cadenas biológicamente activa. El grado de activación de las neurotoxinas por escisión proteolítica varía entre diferentes cepas y serotipos de neurotoxinas, lo cual es una consideración importante para la fabricación debido a la necesidad de preparaciones de neurotoxinas con una actividad biológica bien definida. Además, durante los procesos de fermentación que utilizan cepas de Clostridium, las neurotoxinas clostridiales se producen como complejos proteicos, en los que el componente neurotóxico es integrado por proteínas accesorias. Estas proteínas accesorias no tienen un efecto beneficioso sobre la actividad biológica o la duración del efecto. Sin embargo, pueden desencadenar una reacción inmunitaria en el paciente, lo que da como resultado inmunidad contra la neurotoxina clostridial. La fabricación de neurotoxinas clostridiales recombinantes, que no son integradas por proteínas auxiliares, podría por lo tanto ser ventajosa.
Los métodos para la expresión recombinante de neurotoxinas clostridiales en E. coli son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO 00/12728, WO 01/14570 o WO 2006/076902). Además, las neurotoxinas clostridiales se han expresado en sistemas de expresión eucarióticos, tales como en Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, células de insectos y células de mamíferos (véase el documento WO 2006/017749).
Las neurotoxinas clostridiales recombinantes se pueden expresar como precursores de cadena sencilla, que posteriormente deben ser escindidos proteolíticamente para obtener la neurotoxina clostridial biológicamente activa final. Por lo tanto, las neurotoxinas clostridiales se pueden expresar con alto rendimiento en bacterias de rápido crecimiento como polipéptidos de cadena sencilla relativamente no tóxicos.
Además, podría ser ventajoso modificar las características de la neurotoxina clostridial con respecto a la actividad biológica, la especificidad celular, el potencial antigénico y la duración del efecto mediante ingeniería genética para obtener neurotoxinas recombinantes con nuevas propiedades terapéuticas en áreas clínicas específicas. La modificación genética de las neurotoxinas clostridiales podría permitir alterar el modo de acción o ampliar el rango de dianas terapéuticas.
El documento WO 96/39166 describe análogos de la toxina botulínica que comprenden residuos de aminoácido que son más resistentes a la degradación en el tejido neuromuscular.
La familia de patentes basada en el documento WO 02/08268 (incluyendo el miembro de la familia US 6.903.187)
describe una neurotoxina clostridial que comprende una modificación estructural seleccionada entre la adición o la deleción de un motivo basado en leucina, que altera la persistencia biológica de la neurotoxina (véanse también: Fernández-Salas et al., Proc. Natl Acad Sci. USA. 101 (2004) 3208-3213; Wang et al., J. Biol. Chem. 286 (2011) 6375-6385). Fernández-Salas et al. inicialmente plantearon la hipótesis de que el aumento de la persistencia se debía a las propiedades de unión a la membrana del motivo de dileucina (véase Fernandez-Salas et al., loc. cit., pág.
3211 y 3213). Wang et al. mencionan esta teoría de la membrana (véase Wang et al., loc. cit., pág. 6376, columna izquierda, último párrafo completo, y pág. 6383, primer párrafo completo de "Discussion"), pero favorece una teoría alternativa: la protección contra la degradación por proteolisis (véase Wang et al., loc. cit., pág. 6384, columna izquierda, líneas 27 y sig ).
El documento US 2002/0127247 describe neurotoxinas clostridiales que comprenden modificaciones en sitios de modificación secundaria y que muestran alteración de la persistencia biológica.
Las variantes de la toxina botulínica que muestran semividas biológicas más largas en el tejido neuromuscular que las toxinas botulínicas naturales serían ventajosas para reducir la frecuencia de administración y la incidencia de la generación de anticuerpos neutralizantes, ya que la tolerancia inmunológica a la toxina botulínica se correlaciona con las dosis acumuladas.
Además, los serotipos de BoNT que exhiben naturalmente una corta duración de acción se podrían utilizar potencialmente de manera eficaz en aplicaciones clínicas, si se pudiera mejorar su persistencia biológica. BoNT/E modificada con un aumento de la duración de la acción se podría utilizar potencialmente en pacientes que presenten una reacción inmunológica contra BoNT/A. Además, se demostró que BoNT/E induce un bloqueo más severo de la liberación del mediador del dolor de las neuronas sensoriales que BoNT/A. En aplicaciones clínicas donde BoNT/A proporciona solo alivio del dolor parcial o solo en un subconjunto de pacientes, tal como en el tratamiento de dolores de cabeza, o donde se ha encontrado que BoNT/E es más eficaz que BoNT/A, pero solo proporciona terapia a corto plazo, tal como en el tratamiento de la epilepsia, podría resultar útil BoNT/E con un aumento de la duración del efecto.
Existe una fuerte demanda para producir neurotoxinas clostridiales con un aumento de la duración del efecto, con el fin de permitir la reducción de la frecuencia de administración y la explotación del potencial terapéutico de los serotipos de BoNT, que hasta ahora se han considerado poco prácticos para la aplicación clínica debido a la corta semivida del respectivo efecto clínicamente relevante. Idealmente, la duración del efecto de una neurotoxina clostridial concreta se podría ajustar de manera personalizada para abordar cualquier característica y demanda particulares de una indicación dada, tal como la cantidad de neurotoxina que se administra, la frecuencia de administración, etc. Hasta la fecha, tales aspectos no han sido resueltos satisfactoriamente.
Objetos de la invención
Un objeto de la invención era proporcionar neurotoxinas clostridiales recombinantes que exhibieran un aumento de la duración del efecto y establecer un método fiable y preciso para fabricar y obtener tales neurotoxinas clostridiales recombinantes. Tal método y las nuevas neurotoxinas clostridiales precursoras utilizadas en tales métodos servirían para satisfacer la gran necesidad de neurotoxinas clostridiales recombinantes que exhiban un aumento de la duración del efecto.
Compendio de la invención
Los serotipos naturales de toxina botulínica presentan duraciones de efecto altamente divergentes, probablemente debido a su distinta localización subcelular. Se demostró que BoNT/A que muestra la persistencia más larga se localiza en las cercanías de la membrana plasmática de las células neuronales, mientras que el serotipo de corta duración BoNT/E es citosólico. Sin embargo, factores adicionales tales como la degradación, la difusión y/o las tasas de translocación podrían tener un impacto decisivo sobre las diferencias en la duración del efecto para los serotipos individuales de toxina botulínica.
Hasta ahora, no se dispone de ningún método de aplicación general para modificar las neurotoxinas clostridiales con el fin de aumentar la duración de su efecto. Sorprendentemente, se ha encontrado que las neurotoxinas clostridiales recombinantes que tienen tales efectos pueden obtenerse clonando una secuencia que codifica un segmento de proteína en un gen que codifica una neurotoxina clostridial parental, y mediante la expresión heteróloga subsiguiente del constructo generado en células anfitrionas recombinantes.
La presente descripción se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un dominio de bobina al azar.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un segmento de proteína que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, en donde dicho segmento de proteína consiste en residuos de alanina, serina y prolina, o en donde dicho segmento de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dichas repeticiones consisten en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos, particularmente en donde los residuos de prolina comprendidos en dicho segmento de proteína constituyen más de 4% y menos de
40% de los aminoácidos de dicho segmento de proteína, en donde dicho segmento de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, y en donde dicho segmento de proteína se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (iv) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, concretamente en el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de la composición de la presente invención para el tratamiento cosmético seleccionado entre el tratamiento de arrugas, patas de gallo y líneas de expresión.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína como se define en la Sección en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental, o en donde dicho método comprende adicionalmente la etapa de expresar heterólogamente dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula anfitriona, concretamente en una célula anfitriona bacteriana, más concretamente en una célula anfitriona de E. coli.
La presente descripción se refiere a una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante que comprende un dominio de bobina al azar.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante, que es un precursor de una neurotoxina clostridial recombinante de acuerdo con la presente invención, y que comprende adicionalmente un segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína como se define en la Sección en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula anfitriona recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención, o el vector de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico obtenible mediante el método de la presente invención, o el vector de la presente invención en una célula anfitriona recombinante, o cultivar la célula anfitriona recombinante de la presente invención en condiciones que dan como resultado la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
Figuras
Figura 1: Presentación esquemática de la toxina botulínica PASilada (PASrBoNT/A).
Figura 2: SDSPAGE de PAS-rBoNT/A purificada. Antes de aplicar las muestras al gel, se añadió p-mercaptoetanol. Calle "v.A.": PAS-rBoNT/A de cadena sencilla no activada, purificada que tiene un peso molecular (Pm) de aproximadamente 175 kDa. Las calles "n.A." (después de la activación) y "n.R." (después de la purificación) muestran la cadena ligera (PAS-Lc) y la cadena pesada (Hc) obtenidas después de la activación por trombina en condiciones reductoras. La cadena ligera migra con un Pm aparente de aproximadamente 110 kDa muy por encima del Pm teórico de aproximadamente 75 kDa.
Figura 3: Ensayo de carrera con ratón con PAS200-rBoNT/A: ■: PAS200-rBoNT/A; •: media del patrón (54 ensayos)
de Xeomin® 81208 (0,6 U).
Figura 4: Ensayo de carrera con ratón con PAS100-rBoNT/A: ■: PAS100-rBoNT/A; •: media del patrón (54 ensayos) de Xeomin® 81208 (0,6 U).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se puede entender más fácilmente mediante la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y los ejemplos incluidos en la misma.
La presente descripción se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un dominio de bobina al azar.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un segmento de proteína que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, en donde dicho segmento de proteína consiste en residuos de alanina, serina y prolina, o en donde dicho segmento de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dichas repeticiones consisten en los residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos, particularmente en donde los residuos de prolina comprendidos en dicho segmento de proteína constituyen más de 4% y menos de 40% del aminoácidos de dicho segmento de proteína, en donde dicho segmento de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, y en donde dicho segmento de proteína se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (iv) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, concretamente en el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial" se refiere a una neurotoxina natural obtenible a partir de bacterias de la clase Clostridia, incluyendo Clostridium tetani y Clostridium botulinum, o a una neurotoxina que se puede obtener de fuentes alternativas, incluyendo de tecnologías recombinantes o de modificaciones genéticas o químicas. En particular, las neurotoxinas clostridiales tienen actividad endopeptidasa. Las neurotoxinas clostridiales se producen como precursores de cadena sencilla que son escindidos proteolíticamente por una endoproteasa clostridial desconocida dentro de la región bucle para obtener la forma de dos cadenas conectada por disulfuro biológicamente activa de la neurotoxina, que comprende dos elementos de cadena, una cadena ligera funcionalmente activa y una cadena pesada funcionalmente activa, donde un extremo de la cadena ligera está conectado a un extremo de la cadena pesada no a través de un enlace peptídico, sino a través de un enlace disulfuro.
En el contexto de la presente invención, el término "cadena ligera de neurotoxina clostridial" se refiere a aquella parte de una neurotoxina clostridial que comprende una actividad endopeptidasa responsable de escindir una o más proteínas que forman parte del llamado complejo SNARE implicado en el proceso que da como resultado la liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica: en las neurotoxinas clostridiales naturales, la cadena ligera tiene un peso molecular de aprox. 50 kDa.
En el contexto de la presente invención, el término "cadena pesada de neurotoxina clostridial" se refiere a aquella parte de una neurotoxina clostridial que es responsable de la entrada de la neurotoxina en la célula neuronal: en las neurotoxinas clostridiales naturales, la cadena pesada tiene un peso molecular de aprox. 100 kDa.
En el contexto de la presente invención, el término "cadena de neurotoxina clostridial funcionalmente activa" se refiere a una cadena de neurotoxina clostridial recombinante capaz de realizar las funciones biológicas de una cadena de neurotoxina de Clostridium botulinum de origen natural a al menos aproximadamente 50%, concretamente a al menos aproximadamente 60%, a al menos aproximadamente 70%, a al menos aproximadamente 80%, y más concretamente a al menos aproximadamente 90%, donde las funciones biológicas de las cadenas de neurotoxinas clostridiales incluyen, pero no se limitan a la unión de la cadena pesada a la célula neuronal, la entrada de la neurotoxina en una célula neuronal, la liberación de la cadena ligera de la neurotoxina de dos cadenas y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera. Los métodos para determinar una actividad neurotóxica se pueden encontrar, por ejemplo, en el documento WO 95/32738, que describe la reconstitución de cadenas ligeras y pesadas obtenidas por separado de toxina tetánica y toxina botulínica.
En el contexto de la presente invención, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de 20%, alternativamente dentro de 10%, incluyendo dentro de 5% de un valor o intervalo dado. Alternativamente, especialmente en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un log (es decir, un orden de magnitud), incluido dentro de un factor de dos de un valor dado.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial recombinante" se refiere a una composición que comprende una neurotoxina clostridial que se obtiene mediante la expresión de la neurotoxina en una célula heteróloga tal como E. coli, e incluye, pero no se limita a, la materia prima obtenida de un procedimiento de fermentación (sobrenadante, composición después de la lisis celular), una fracción que comprende una neurotoxina clostridial obtenida de la separación de los ingredientes de dicha materia prima en un procedimiento de purificación, una proteína aislada y esencialmente pura y una formulación para uso farmacéutico y/o estético que comprende una neurotoxina clostridial y, adicionalmente, disolventes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En el contexto de la presente descripción, el término "neurotoxina clostridial recombinante" se refiere adicionalmente a una neurotoxina clostridial basada en una neurotoxina clostridial parental que comprende adicionalmente un dominio de bobina al azar heterólogo, es decir, un dominio de bobina al azar que no se produce naturalmente en dicha neurotoxina clostridial parental, concretamente un dominio de bobina al azar sintético, o un dominio de bobina al azar de una especie distinta de Clostridium botulinum, concretamente un dominio de bobina al azar de una proteína humana.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial recombinante" se refiere adicionalmente a una neurotoxina clostridial basada en una neurotoxina clostridial parental que comprende adicionalmente un segmento de proteína heteróloga como se define en la Sección [0026], es decir, un segmento de proteína como se define en la Sección que no se produce naturalmente en dicha neurotoxina clostridial parental, concretamente un segmento de proteína sintética como se define en la Sección [0026], o un segmento de proteína como se define en la Sección de una especie diferente a Clostridium botulinum, en particular, un segmento de proteína como se define en la Sección de una proteína humana.
En el contexto de la presente invención, el término "comprende" o "que comprende" significa "que incluye, pero no se limita a". Se pretende que el término sea abierto, para especificar la presencia de cualesquiera características, elementos, números enteros, etapas o componentes establecidos, pero no excluir la presencia o adición de una o más de otras características, elementos, números enteros, etapas, componentes, o grupos de los mismos. El término "que comprende" incluye así los términos más restrictivos "que consiste en" y "que consiste esencialmente en".
En el contexto de la presente descripción, el término "dominio de bobina al azar" se refiere a un segmento de proteína, que carece esencialmente de una estructura secundaria. Los dominios de bobina al azar se pueden detectar utilizando una variedad de métodos, incluyendo métodos espectroscópicos tales como métodos de dicroismo circular o de resonancia magnética nuclear (RMN), incluyendo experimentos multidimensionales de RMN o determinaciones de la estructura cristalográfica.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman una conformación de bobina al azar, concretamente entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más concretamente entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más concretamente entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más concretamente entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más concretamente entre 90 y 220 residuos de aminoácido, concretamente 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido, o 200 residuos de aminoácido.
En realizaciones concretas de la presente invención, el segmento de proteína como se define en la Sección consiste en entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más concretamente entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más concretamente entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más concretamente entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más concretamente entre 90 y 220 residuos de aminoácido, concretamente 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido, o 200 residuos de aminoácido.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar consiste en residuos de alanina (A), serina (S) y prolina (P). Estas secuencias llamadas "PAS" (véanse, por ejemplo, Schlapschy et al., Protein Engineering, Design and Selection 26 (2013) 489-501; documento EP 2 369 005; documento WO 2011/144756) se han desarrollado para prolongar la semivida en plasma de las proteínas farmacéuticamente activas. Se argumenta que la fusión genética con tales secuencias polipeptídicas desordenadas conformacionalmente proporciona una manera simple de anclar una cadena aleatoria solvatada con un gran volumen hidrodinámico a la pareja de fusión, por ejemplo, una proteína de interés biofarmacéutico, de modo que el tamaño de la proteína de fusión resultante sea significativamente mayor, y que de esta manera se retrase la eliminación típicamente rápida del componente biológicamente activo a través de la filtración renal en uno a dos órdenes de magnitud.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el anclaje de un segmento de proteína como se define en la Sección [0026], tal como un dominio basado en PAS, también es capaz de prolongar la duración del efecto de una proteína que es activa intracelularmente, concretamente puesto que la semivida en plasma de las toxinas botulínicas no ha sido considerada hasta ahora como de importancia crítica por la duración de su efecto. La prolongación de la duración es, además, particularmente sorprendente, ya que se ha argumentado que las cadenas laterales macromoleculares tales como las secuencias de PAS o las secuencias basadas en polietilenglicol previenen la absorción celular, de modo que esta forma de estabilización de proteínas intravasculares solo podría aplicarse a las proteínas para la intervención terapéutica con marcadores o receptores de superficie celular (A. Weber, Inhibierung
von Stat5 en Tumoren durch RNA-Interferenz und spezifische Interaktion eines Peptidaptamer-Konstruktes mit der DNA-Bindedomane, tesis doctoral, Johann-Wolfgang-Goethe Universitat, Frankfurt am Main (Alemania) 2013, pág.
220, oración completa final).
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en los residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.
En partes concretas de la descripción, los residuos de prolina comprendidos en dicho dominio de bobina al azar constituyen más de 4% y menos de 40% de los aminoácidos de dicho dominio de bobina al azar.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, concretamente (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n, siendo n (i) un número entero seleccionado entre 3 y 25 (SEC ID NO: 12), más concretamente entre 4 y 8 (s Ec ID NO: 13), más concretamente entre 5 y 10 (SEC ID No : 14), concretamente en donde n es 5 (SEC ID NO: 15) o 10 (SEC ID NO: 16); o (ii) un número entero seleccionado entre 5 y 150 (SEC ID NO: 17), más concretamente entre 6 y 20 (SEC ID NO: 18), más concretamente entre 7 y 13 (SEC ID NO: 19), más concretamente entre 8 y 12 (SEC ID NO: 20), más concretamente entre 9 y 11 (SEC ID No : 21), concretamente en donde n es 10 (SEC ID nO: 16).
En partes concretas de la descripción de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, dicho segmento de proteína comprende la secuencia de aminoácidos (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n, siendo n (i) un número entero seleccionado entre 3 y 25 (SEC ID NO: 12), más concretamente entre 4 y 8 (SEC ID NO: 13), más concretamente entre 5 y 10 (SEC ID NO: 14), concretamente en donde n es 5 (SEC ID No : 15) o 10 (SEC ID NO: 16); o (ii) un número entero seleccionado entre 5 y 150 (SEC ID NO: 17), más concretamente entre 6 y 20 (SEC ID nO: 18), más concretamente entre 7 y 13 (SEC ID NO: 19), más concretamente entre 8 y 12 (SEC ID NO: 20), más concretamente entre 9 y 11 (SEC ID No : 21), concretamente en donde n es 10 (SEC ID NO: 16).
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (iv) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, concretamente en el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
En realizaciones concretas, la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F y G, concretamente neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, concretamente neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) entre la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina de Clostridium botulinum de (i), o (iii) entre la secuencia de una neurotoxina de Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial parental.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F y G" se refiere a neurotoxinas que se encuentran y pueden obtenerse de Clostridium botulinum. Actualmente, se conocen siete tipos serológicamente distintos, los serotipos designados A, B, C, D, E, F y G, incluyendo ciertos subtipos (por ejemplo, A1, A2, A3, A4 y A5).
En realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial se selecciona entre una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, concretamente entre neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o entre una variante funcional de cualquiera de tales neurotoxinas de Clostridium botulinum.
En realizaciones concretas, dicha neurotoxina clostridial recombinante tiene una cadena ligera y una cadena pesada comprendidas en la secuencia de aminoácidos que se encuentra en SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9.
En el contexto de la presente invención, el término "variante funcional de una neurotoxina clostridial" se refiere a una neurotoxina que difiere en la secuencia de aminoácidos y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina clostridial, pero aún es funcional activa. En el contexto de la presente invención, el término "funcionalmente activa" se refiere a la propiedad de una neurotoxina clostridial recombinante de exhibir una actividad biológica de al menos aproximadamente 50%, concretamente al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, y muy concretamente al menos aproximadamente 90% de la actividad biológica de una neurotoxina clostridial parental natural, es decir, una neurotoxina clostridial parental sin dominio de bobina al azar, donde las funciones biológicas incluyen, pero no se limitan a, la unión al receptor de neurotoxina, la entrada de la neurotoxina en una célula neuronal, la liberación de la cadena ligera de la neurotoxina de dos cadenas y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera, y por lo tanto la inhibición de la liberación del neurotransmisor desde la célula nerviosa afectada.
A nivel de proteínas, una variante funcional mantendrá las características clave de la correspondiente neurotoxina clostridial, tal como los residuos clave para la actividad endopeptidasa en la cadena ligera, o los residuos clave para el anclaje a los receptores de neurotoxina o para la translocación a través de la membrana endosomal en la cadena pesada, pero puede contener una o más mutaciones que comprenden una deleción de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente, una adición de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente y/o una sustitución de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente. Concretamente, dichos aminoácidos suprimidos, añadidos y/o sustituidos son aminoácidos consecutivos. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se puede añadir, suprimir y/o sustituir cualquier número de aminoácidos, siempre que la variante funcional permanezca biológicamente activa. Por ejemplo, se pueden añadir, suprimir, y/o sustituir 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 15, hasta 25, hasta 50, hasta 100, hasta 200, hasta 400, hasta 500 aminoácidos o incluso más aminoácidos. Por consiguiente, una variante funcional de la neurotoxina puede ser un fragmento biológicamente activo de una neurotoxina natural. Este fragmento de neurotoxina puede contener una o más deleciones N-terminales, C-terminales y/o internas.
En otra realización, la variante funcional de una neurotoxina clostridial comprende adicionalmente un péptido señal. Por lo general, dicho péptido señal se ubicará en el extremo N de la neurotoxina. Muchos de estos péptidos señal son conocidos en la técnica y están comprendidos en la presente invención. En particular, el péptido señal da como resultado el transporte de la neurotoxina a través de una membrana biológica, tal como la membrana del retículo endoplásmico, la membrana de Golgi o la membrana plasmática de una célula eucariótica o procariótica. Se ha encontrado que los péptidos señal, cuando se anclan a la neurotoxina, mediarán la secreción de la neurotoxina al sobrenadante de las células. En ciertas realizaciones, el péptido señal se escindirá en el transcurso de la secreción, o posteriormente, de modo que la proteína secretada carezca del péptido señal N-terminal, esté compuesta de cadenas ligeras y pesadas separadas, que están unidas covalentemente por puentes disulfuro, y sea proteolíticamente activa.
En realizaciones concretas, la variante funcional tiene en su parte de neurotoxina de clostridium una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70% o más concretamente al menos aproximadamente 80%, y una homología de secuencia de al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o muy concretamente al menos aproximadamente 95% con respecto a la parte correspondiente en la neurotoxina clostridial parental. Los métodos y algoritmos para determinar la identidad y/o la homología de secuencia, incluyendo la comparación de variantes que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones con respecto a una secuencia parental, son bien conocidos por el experto normal en la técnica. A nivel de ADN, las secuencias de ácido nucleico que codifican el homólogo funcional y la neurotoxina clostridial parental pueden diferir en mayor medida debido a la degeneración del código genético. Se sabe que el uso de codones es diferente entre organismos procarióticos y eucarióticos. Por lo tanto, cuando se expresa una proteína procariótica tal como una neurotoxina clostridial, en un sistema de expresión eucariótico, puede ser necesario, o al menos útil, adaptar la secuencia de ácido nucleico al uso del codón de la célula anfitriona de expresión, lo que significa que la identidad o la homología de secuencia pueden ser bastante bajas a nivel de ácido nucleico.
En el contexto de la presente invención, el término "variante" se refiere a una neurotoxina que es un derivado modificado químicamente, enzimáticamente o genéticamente de una neurotoxina clostridial correspondiente, incluyendo una neurotoxina modificada químicamente o genéticamente de C. botulinum, concretamente de neurotoxina de C. botulinum de serotipo A, C o E. Un derivado modificado químicamente puede ser aquel que se modifique por piruvación, fosforilación, sulfatación, lipidación, pegilación, glicosilación y/o adición química de un aminoácido o un polipéptido que comprende entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos, incluyendo la modificación que se produce en la célula anfitriona eucariótica utilizada para expresar el derivado. Un derivado modificado enzimáticamente es aquel que se modifica por la actividad de enzimas, tales como enzimas endo o exoproteolíticas, incluyendo la modificación por enzimas de la célula anfitriona eucariótica utilizada para expresar el derivado. Como se señaló anteriormente, un derivado modificado genéticamente es aquel que se ha modificado mediante deleción o sustitución de uno o más aminoácidos contenidos en, o mediante la adición de uno o más aminoácidos (incluyendo polipéptidos que comprenden entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos) a, la secuencia de aminoácidos de dicha neurotoxina clostridial. Los métodos para diseñar y construir tales derivados modificados químicamente o genéticamente y para someter a prueba tales variantes para determinar su funcionalidad son bien conocidos por cualquier experto en la técnica.
En partes concretas de la descripción, dicha neurotoxina clostridial recombinante muestra un aumento de la duración del efecto con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin el dominio de bobina al azar.
En realizaciones concretas, dicha neurotoxina clostridial recombinante muestra un aumento de la duración del efecto con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En el contexto de la presente invención, el término "aumento de la duración del efecto" o "aumento de la duración de la acción" se refiere a una denervación de mayor duración mediada por una neurotoxina clostridial de la presente invención. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, la administración de una neurotoxina clostridial de dos cadenas unidas por disulfuro que comprende un segmento de proteína como se define en la Sección da como resultado una parálisis localizada durante un período de tiempo más largo con respecto a la administración de
una neurotoxina clostridial de dos cadenas unidas por disulfuro sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En el contexto de la presente invención, el término "aumento de la duración del efecto/acción" se define como más de aproximadamente 20%, concretamente más de aproximadamente 50%, más concretamente más de aproximadamente 90% de aumento de duración del efecto de la neurotoxina recombinante de la presente invención con respecto a la neurotoxina idéntica sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En el contexto de la presente invención, el término "denervación" se refiere a la denervación resultante de la administración de un agente de quimiodenervación, por ejemplo una neurotoxina.
En el contexto de la presente invención, el término "denervación localizada" o "parálisis localizada" se refiere a la denervación de una región anatómica concreta, generalmente un músculo o un grupo de músculos relacionados anatómicamente y/o fisiológicamente, que resulta de la administración de un agente de quimiodenervación, por ejemplo una neurotoxina, a la región anatómica concreta.
Sin desear estar limitados por la teoría, las neurotoxinas clostridiales recombinantes de la presente invención podrían mostrar un aumento de la semivida biológica, una reducción de las tasas de degradación, una disminución de las tasas de difusión, un aumento de la absorción por las células neuronales y/o una modificación de las tasas de translocación intracelular, en cada caso con respecto a una neurotoxina clostridial parental idéntica sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En realizaciones concretas, el aumento de la duración del efecto se debe a un aumento de la semivida biológica. En el contexto de la presente invención, el término "semivida biológica" especifica la vida útil de una proteína, por ejemplo, una neurotoxina clostridial, in vivo. En el contexto de la presente invención, el término "semivida biológica" se refiere al período de tiempo, por el cual se degrada la mitad de un conjunto de proteínas in vivo. Por ejemplo, se refiere al período de tiempo en que se degrada la mitad de la cantidad de neurotoxina clostridial de una dosis administrada.
En el contexto de la presente invención, el término "aumento de la semivida biológica " se define como un aumento de más de aproximadamente 20%, concretamente más de aproximadamente 50%, más concretamente más de aproximadamente 90% de la semivida biológica de la neurotoxina recombinante de la presente invención con respecto a la neurotoxina idéntica sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En el contexto de la presente invención, el término "reducción de la tasa de degradación " significa que el segmento de proteína como se define en la Sección (secuencia PAS) protege la cadena ligera contra los procesos de degradación en el citosol de la neurona tal como, por ejemplo, el ataque de proteasas o enzimas modificadoras como las ligasas E3. Debido a esta protección, la semivida de la cadena ligera en la neurona se prolonga dando como resultado un aumento de la duración del efecto terapéutico.
En realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial recombinante es para su uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere mejora de la quimiodenervación, en donde la neurotoxina clostridial recombinante causa una denervación más duradera con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin el segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En otras realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial recombinante es para su uso en el tratamiento de (a) pacientes que muestran una reacción inmunológica contra BoNT/A, o (b) cefalea o epilepsia, en donde la neurotoxina clostridial recombinante es de serotipo E.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención.
En realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección tomada de la lista de: distonía cervical (tortícolis espasmódica), blefaroespasmo, hiperhidrosis axilar primaria grave, acalasia, dolor lumbar, hipertrofia benigna de próstata, neuropatías focales crónicas dolorosas, migraña y otros trastornos con cefalea.
Las indicaciones adicionales donde el tratamiento con neurotoxinas botulínicas se encuentra actualmente bajo investigación y donde se puede utilizar la composición farmacéutica de la presente invención, incluyen incontinencia pediátrica, incontinencia debida a vejiga hiperactiva e incontinencia debida a vejiga neurogénica, fisura anal, trastornos espásticos asociados con lesión o enfermedad del sistema nervioso central, incluyendo traumatismo, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson o parálisis cerebral, distonías focales que afectan a las extremidades, cara, mandíbula o cuerdas vocales, trastornos de dolor en la articulación temporomandibular (TMJ), neuropatía diabética, cicatrización de heridas, salivación excesiva, disfunción de las cuerdas vocales, reducción del músculo masetero para disminuir el tamaño de la mandíbula inferior, tratamiento y prevención del dolor de cabeza crónico y dolor musculoesquelético crónico, tratamiento del ronquido, ayuda en la
pérdida de peso al aumentar el tiempo de vaciado gástrico.
Más recientemente, las neurotoxinas clostridiales han sido evaluadas para el tratamiento de otras nuevas indicaciones, por ejemplo, queloides dolorosos, dolor neuropático diabético, dolor de rodilla refractario, aplicación de la zona de activación de neuralgia del trigémino para controlar el dolor, cicatrización después de una cirugía de labio leporino, cáncer y depresión.
La presente descripción se refiere al uso de la composición de la presente descripción para el tratamiento cosmético. En el contexto de la presente descripción, el término "tratamiento cosmético" se refiere a usos en aplicaciones cosméticas o estéticas, tales como el tratamiento de arrugas, patas de gallo, líneas de expresión, etc.
Por lo tanto, en otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de la composición de la presente invención para el tratamiento cosmético seleccionado del tratamiento de arrugas, patas de gallo y líneas de expresión.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína como se define en la Sección en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.
En el contexto de la presente invención, el término "secuencia de ácido nucleico recombinante" se refiere a un ácido nucleico, que se ha generado uniendo material genético de dos fuentes diferentes.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla" se refiere a un precursor de cadena sencilla para una neurotoxina clostridial de dos cadenas unidas por disulfuro, que comprende una cadena ligera de neurotoxina clostridial ligada funcionalmente activa, una cadena pesada de neurotoxina funcionalmente activa, y una región bucle que une el extremo C de la cadena ligera con el extremo N de la cadena pesada.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante" se refiere a una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla que comprende un segmento de proteína heterólogo como se define en la Sección [0026], es decir, un segmento de proteína como se define en la Sección de una especie distinta de Clostridium botulinum.
En realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante comprende un sitio de escisión de proteasa en dicha región bucle.
Las neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla tienen que ser escindidas proteolíticamente para obtener las neurotoxinas clostridiales biológicamente activas finales. La escisión proteolítica puede ocurrir durante la expresión heteróloga por las enzimas de la célula anfitriona, o al añadir enzimas proteolíticas al material proteico bruto aislado después de la expresión heteróloga. Las neurotoxinas clostridiales naturales generalmente contienen una o más señales de escisión para proteasas que escinden post-traduccionalmente la molécula precursora de cadena sencilla, de modo que se puede formar el complejo di- o multimérico final. En la actualidad, las neurotoxinas clostridiales todavía se producen predominantemente por procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Durante el proceso de fermentación, los precursores de cadena sencilla se escinden proteolíticamente por una proteasa clostridial desconocida para obtener la neurotoxina clostridial de dos cadenas biológicamente activa. En los casos en que la molécula precursora de cadena sencilla es el precursor de una proteasa, se puede producir una escisión autocatalítica. Alternativamente, la proteasa puede ser una enzima no clostridial separada expresada en la misma célula. El documento WO 2006/076902 describe la escisión proteolítica de un precursor de cadena sencilla de neurotoxina clostridial recombinante en un sitio de reconocimiento y escisión heterólogo mediante incubación de producto lisado de la célula anfitriona de E. coli. La escisión proteolítica se realiza por medio de una proteasa de E. coli desconocida. En ciertas aplicaciones de expresión recombinante, se han introducido de forma recombinante sitios de escisión de proteasa modificados en la región de intercatenaria entre la cadena ligera y pesada de toxinas clostridiales, p. ej. sitios de escisión de proteasas para trombina humana o proteasas no humanas (véase el documento WO 01/14570).
En realizaciones concretas, el sitio de escisión de proteasa es un sitio que es escindido por una proteasa seleccionada de la lista de: una proteasa seleccionada de la lista de: trombina, tripsina, enteroquinasa, factor Xa, papaína vegetal, papaína de insecto, papaína de crustáceo, enteroquinasa, proteasa 3C de rinovirus humano, proteasa 3C de enterovirus humano, proteasa del virus del grabado del tabaco, virus del moteado de venas del tabaco, subtilisina y caspasa 3.
En una realización concreta, la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante comprende adicionalmente una etiqueta de unión, concretamente seleccionada del grupo que comprende: glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta His, Strep-tag®, o etiqueta FLAG.
En el contexto de la presente invención, el término "neurotoxina clostridial parental" se refiere a una neurotoxina
clostridial inicial sin un segmento de proteína heterólogo como se define en la Sección [0026], seleccionada entre una neurotoxina clostridial natural, una variante funcional de una neurotoxina clostridial natural o una neurotoxina clostridial quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial.
En realizaciones concretas, el método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención comprende adicionalmente la etapa de expresar de forma heteróloga dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula anfitriona, concretamente en una célula anfitriona bacteriana, más concretamente en una célula anfitriona de E. coli.
En ciertas realizaciones, las células de E. coli se seleccionan entre E. coli XL1-Blue, Nova Blue, TOP10, XL10-Gold, BL21 y K12.
En realizaciones concretas, el método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención comprende adicionalmente al menos una de las etapas de (i) generación de una neurotoxina clostridial recombinante de dos cadenas unidas por disulfuro que comprende un segmento de proteína como se define en la Sección causando o permitiendo el contacto de dicha neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante con una endoproteasa y (ii) purificación de dicha neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante o dicha neurotoxina clostridial recombinante de dos cadenas unidas por disulfuro mediante cromatografía.
En realizaciones concretas, la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante, o la neurotoxina clostridial de dos cadenas unida por disulfuro recombinante, se purifican después de la expresión, o en el caso de la neurotoxina clostridial de dos cadenas unida por disulfuro recombinante, después de la reacción de escisión. En tales realizaciones concretas, la proteína se purifica mediante cromatografía, concretamente mediante cromatografía de inmunoafinidad, o mediante cromatografía en una matriz de intercambio iónico, una matriz de interacción hidrófoba, o una matriz de cromatografía multimodal, concretamente una matriz de intercambio iónico fuerte, más concretamente una matriz de intercambio catiónico fuerte.
En el contexto de la presente descripción, el término "causando ... el contacto de dicha neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante ... con una endoproteasa" se refiere a una etapa activa y/o directa de poner en contacto dicha neurotoxina y dicha endoproteasa, mientras que el término "permitiendo el contacto de una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante... con una endoproteasa" se refiere a una etapa indirecta para establecer condiciones de tal manera que dicha neurotoxina y dicha endoproteasa estén en contacto entre sí.
En el contexto de la presente descripción, el término "endoproteasa" se refiere a una proteasa que rompe los enlaces peptídicos de los aminoácidos no terminales (es decir, dentro de la cadena polipeptídica). Como no atacan a los aminoácidos terminales, las endoproteasas no pueden romper los péptidos en monómeros.
En realizaciones concretas, la escisión de la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante es casi completa.
En el contexto de la presente descripción, el término "casi completa" se define como más de aproximadamente 95% de escisión, concretamente más de aproximadamente 97,5%, más concretamente más de aproximadamente 99% según lo determinado mediante SDS-PAGE y posterior Transferencia Western o Cromatografía de fase inversa. En realizaciones concretas, la escisión de la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante se produce en una señal de escisión heteróloga localizada en la región bucle de la neurotoxina clostridial precursora recombinante.
En realizaciones concretas, la reacción de escisión se realiza con productos lisados brutos de células anfitrionas que contienen dicha proteína precursora de cadena sencilla.
En otras realizaciones concretas, la proteína precursora de cadena sencilla se purifica o se purifica parcialmente, concretamente mediante una primera etapa de enriquecimiento cromatográfico, antes de la reacción de escisión. En el contexto de la presente descripción, el término "purificada" se refiere a más de aproximadamente 90% de pureza. En el contexto de la presente descripción, el término "parcialmente purificada" se refiere a una pureza de menos de aproximadamente 90% y un enriquecimiento de más de aproximadamente dos veces.
En otra parte, la descripción se refiere a una neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante, que es un precursor de una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un dominio de bobina al azar.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante, que es un precursor de una neurotoxina clostridial recombinante de acuerdo con la presente invención, y que comprende adicionalmente un segmento de proteína como se define en la Sección [0026].
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende una secuencia de aminoácidos
que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman una conformación de bobina al azar, concretamente entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más concretamente entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más concretamente entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más concretamente entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más concretamente entre 90 y 220 residuos de aminoácido, concretamente 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido, o 200 residuos de aminoácido.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar consiste en residuos de alanina, serina y prolina.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en los residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de 6 residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.
En partes concretas de la descripción, los residuos de prolina comprendidos en dicho dominio de bobina al azar constituyen más de 4% y menos de 40% de los aminoácidos de dicho dominio de bobina al azar.
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, concretamente (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n, siendo n (i) un número entero seleccionado entre 3 y 25 (SEC ID NO: 12), más concretamente entre 4 y 8 (s Ec ID NO: 13), más concretamente entre 5 y 10 (SEC ID No : 14), concretamente en donde n es 5 (SEC ID NO: 15) o 10 (SEC ID NO: 16); o (ii) un número entero seleccionado entre 5 y 150 (SEC ID NO: 17), más concretamente entre 6 y 20 (SEC ID NO: 18), más concretamente entre 7 y 13 (SEC ID NO: 19), más concretamente entre 8 y 12 (SEC ID NO: 20), más concretamente entre 9 y 11 (SEC ID No : 21), concretamente en donde n es 10 (SEC ID nO: 16).
En partes concretas de la descripción, dicho dominio de bobina al azar se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (i) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (ii) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
En realizaciones concretas, la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F y G, concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina de Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina de Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial.
En realizaciones concretas, dicha neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante tiene la secuencia de aminoácidos que se encuentra en SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9 (véase la Tabla 1).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante de la presente invención, concretamente una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 11 (véase la Tabla 1).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína como se define en la Sección en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula anfitriona recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención, o el vector de la presente invención.
En ciertas realizaciones, las células anfitrionas recombinantes se seleccionan entre E. coli XL1-Blue, Nova Blue, TOP10, XL10-Gold, BL21 y K12.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico obtenible mediante el método de la presente invención, o el vector de la presente invención en una célula anfitriona recombinante, o cultivar la célula anfitriona recombinante de la presente invención en condiciones que dan como resultado la expresión de dicha secuencia de
ácido nucleico.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación y purificación de una toxina botulínica PASilada de tipo A (PAS200-rBoNT/A)
El módulo "PAS" que comprende 200 residuos de aminoácido construidos a partir de los aminoácidos prolina, serina y alanina se produjo sintéticamente y después de la digestión con Sapl se insertó en el extremo N de BoNT/A recombinante (rBoNT/A) (Figura 1). La correcta clonación se verificó mediante secuenciación.
La expresión se realizó en la cepa de expresión. E. coli BI21. La purificación se realizó mediante una combinación de cromatografía de afinidad y de exclusión por tamaño, seguida de activación con trombina. La Figura 2 resume los resultados de la purificación y la activación.
Ejemplo 2: Medición de la actividad biológica en la prueba de hemidiafragma (prueba HDA)
Esta prueba ex vivo realiza todas las etapas necesarias para la intoxicación (unión a las células diana, internalización y translocación al citosol). Para lograr esto, una preparación de nervio-músculo murino, que comprende el hemidiafragma y el Nervus phrenicus, se estimula en un baño de órganos mediante una frecuencia continua de 1 Hz. La amplitud resultante de la contracción muscular se representa en función del tiempo. Después de la adición de la muestra de toxina al baño de órganos, se determina el tiempo requerido para una reducción de 50% de la amplitud observada sin la toxina. Este llamado tiempo para 50% de parálisis es una medida directa de la actividad biológica. En el caso de PAS200-rBoNT/A, el tiempo para 50% de parálisis fue de 157 minutos a una concentración de 0,35 ng/ml en el baño de órganos. En comparación con una curva de calibración establecida con BoNT/A de tipo salvaje, se puede calcular una actividad biológica específica de 60 pg/U.
Ejemplo 4: Duración del efecto de PAS200-rBoNT/A en un "Ensayo de carrera con ratón"
Basándose en los resultados de la actividad obtenida en la prueba DAS (véase el Ejemplo 3), se pueden calcular las dosis que son adecuadas para una comparación de la duración del efecto con un patrón (Xeomin®) ejecutado en paralelo. El objetivo es aplicar una dosis equipotente, es decir, el efecto máximo de la muestra y el patrón (Xeomin®) debe ser el mismo. Las dosis equipotentes de PAS200-rBoNT/A o Xeomin® se inyectaron en el M. gastrocnemius de cada uno de ocho ratones que habían sido entrenados en una banda continua. Utilizando estas dosis, solo se observó una parálisis sub-máxima para excluir los efectos sistémicos potenciales en la medida de lo posible, lo que puede tener un impacto en la duración del efecto. La distancia de carrera diaria en la banda continua se midió durante 15 días. La parálisis causada por las toxinas se trazó como el porcentaje de la distancia de carrera el día antes de la inyección, que se estableció como 100%, frente al tiempo (véase la Figura 3).
La inyección de PAS200-rBoNT/A dio como resultado una parálisis máxima después de 4 días correspondiente a la observada para el grupo de control tratado con Xeomin®. Durante la fase de recuperación después de la fase de parálisis máxima, la distancia de carrera del grupo de control alcanzó un valor de 25% del valor inicial después de 8 días, mientras que el grupo tratado con PAS200-rBoNT/A alcanzó ese valor solo después de 11 días. Por lo tanto, la duración de la parálisis efectiva se prolongó significativamente.
Ejemplo 5: Generación y purificación de una toxina botulínica PASilada de tipo A (PAS100-rBoNT/A)
PAS100-rBoNT/A que comprende un módulo "PAS" que comprende 100 residuos de aminoácido construidos a partir de los aminoácidos, prolina, serina y alanina se generó y purificó como se describe para PAS200-rBoNT/A en el ejemplo 1.
Ejemplo 6: Duración del efecto de PAS100-rBoNT/A en un "Ensayo de carrera con ratón"
Se realizó un ensayo de carrera con ratón utilizando PAS100-rBoNT/A como se describe en el ejemplo 4. Se inyectaron dosis equipotentes de PAS100-rBoNT/A o Xeomin® en el M. gastrocnemius de cada uno de ocho ratones y se midió la distancia de carrera diaria en la banda continua durante de 15 días. La parálisis causada por las toxinas se trazó como el porcentaje de la distancia de carrera el día antes de la inyección, que se estableció como 100%, frente al tiempo (véase la Figura 4).
La inyección de PAS100-rBoNT/A dio como resultado una parálisis máxima después de 6 días, para el grupo de control tratado con Xeomin® se observó una parálisis máxima después de 4 días. Durante la fase de recuperación, la distancia de carrera del grupo de control alcanzó un valor de 40% del valor de inicio 4 días después de que se observó la parálisis máxima (día 8), mientras que el grupo tratado con PAS100-rBoNT/A alcanzó ese valor 5 días después de la parálisis máxima (día 11). Por lo tanto, la duración de la parálisis efectiva se prolongó significativamente.
Tabla 1: Secuencias
Claims (15)
1. Una neurotoxina clostridial recombinante que comprende un segmento de proteína que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido,
en donde dicho segmento de proteína consiste en residuos de alanina, serina y prolina, o en donde dicho segmento de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dichas repeticiones consisten en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos, concretamente en donde los residuos de prolina comprendidos en dicho segmento de proteína constituyen más de 4% y menos de 40% de los aminoácidos de dicho segmento de proteína,
en donde dicho segmento de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEC ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEC ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o uno o varios multímeros de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias, y en donde dicho segmento de proteína se inserta en (i) el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el extremo C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el extremo N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; o (iv) el extremo C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, concretamente en el extremo N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante.
2. La neurotoxina clostridial recombinante de la reivindicación 1, en donde dicho segmento de proteína consiste en entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más concretamente entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más concretamente entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más concretamente entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más concretamente entre 90 y 220 residuos de aminoácido, concretamente 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido, o 200 residuos de aminoácido.
3. La neurotoxina clostridial recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho segmento de proteína comprende la secuencia de aminoácidos (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)n, siendo n (i) un número entero seleccionado entre 3 a 25 (SEC ID NO: 12), más concretamente entre 4 a 8 (SEC ID NO: 13), más concretamente entre 5 a 10 (SEC ID NO: 14), concretamente en donde n es 5 (SEC ID NO: 15) o 10 (SEC ID NO: 16); o (ii) un número entero seleccionado entre 5 y 150 (SEC ID NO: 17), más concretamente entre 6 y 20 (SEC ID NO: 18), más concretamente entre 7 y 13 (SEC ID NO: 19), más concretamente entre 8 y 12 (SEC ID NO: 20), más concretamente entre 9 y 11 (SEC ID nO: 21), concretamente en donde n es 10 (SEC ID NO: 16).
4. La neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F y G, concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina de Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina de Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxinas clostridiales; concretamente en donde dicha neurotoxina clostridial recombinante tiene una cadena ligera y una cadena pesada comprendidas en la secuencia de aminoácidos que se encuentra en SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9.
5. La neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha neurotoxina clostridial recombinante muestra un aumento de la duración del efecto con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin dicho segmento de proteína, p. ej. en donde el amento de la duración del efecto se debe a un aumento de la semivida biológica.
6. La neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en distonía cervical (tortícolis espasmódica); blefaroespasmo; hiperhidrosis axilar primaria severa; acalasia; dolor lumbar; hipertrofia benigna de próstata; neuropatías dolorosas focales crónicas; migraña y otros trastornos con cefalea.
7. Una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. El uso de la neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para el tratamiento cosmético seleccionado del tratamiento de arrugas, patas de gallo y líneas de expresión.
9. Un método para la generación de una neurotoxina clostridial recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho segmento de proteína en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental, o en donde dicho método comprende adicionalmente la etapa de expresar de forma heteróloga dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula anfitriona,
concretamente en una célula anfitriona bacteriana, más concretamente en una célula anfitriona de E. coli.
10. Una neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante, que es un precursor de la neurotoxina clostridial recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y que comprende un segmento de proteína como se define en la reivindicación 1, concretamente en donde la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F y G, concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más concretamente una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina de Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina de Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxinas clostridiales; concretamente en donde dicha neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante tiene la secuencia de aminoácidos que se encuentra en SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9.
11. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial de cadena sencilla recombinante de la reivindicación 10, concretamente una secuencia de ácido nucleico como se encuentra en SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 11.
12. Un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 11, que comprende la etapa de insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de proteína como se define en la reivindicación 1 en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.
13. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 11, o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la reivindicación 12.
14. Una célula anfitriona recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 11, la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la reivindicación 12, o el vector de la reivindicación 13.
15. Un método para producir la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante de la reivindicación 10, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 11, o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la reivindicación 12, o el vector de la reivindicación 13 en una célula anfitriona recombinante, o cultivar la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 14 en condiciones que dan como resultado la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14000791 | 2014-03-05 | ||
| PCT/EP2015/000489 WO2015132004A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-03-04 | Novel recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2704237T3 true ES2704237T3 (es) | 2019-03-15 |
Family
ID=50238090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15707550T Active ES2704237T3 (es) | 2014-03-05 | 2015-03-04 | Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9975929B2 (es) |
| EP (1) | EP3113792B1 (es) |
| ES (1) | ES2704237T3 (es) |
| WO (1) | WO2015132004A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201718627A (zh) | 2015-06-11 | 2017-06-01 | 梅茲製藥有限兩合公司 | 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞 |
| WO2017063743A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Improvements to ultrasound-based therapy of photoaged tissue |
| SG11201803958WA (en) | 2015-12-22 | 2018-07-30 | Xl Protein Gmbh | Nucleic acids encoding repetitive amino acid sequences rich in proline and alanine residues that have low repetitive nucleotide sequences |
| US11078472B2 (en) | 2016-01-20 | 2021-08-03 | Merz Pharma Gmbh & Co., Kgaa | Recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect |
| SG11201805195YA (en) | 2016-03-02 | 2018-07-30 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Composition comprising botulinum toxin |
| EP3290437A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-07 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant clostridial neurotoxins with decreased duration of effect |
| EP3333179A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-13 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum toxin with accelarated onset of effect |
| US10688162B2 (en) | 2017-01-10 | 2020-06-23 | Cellsnap Llc | Hybrid neurotoxins and uses thereof |
| WO2018233813A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
| EP3649143B1 (en) | 2017-07-06 | 2022-08-31 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect |
| US20210008156A1 (en) | 2017-10-26 | 2021-01-14 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect |
| WO2019096226A1 (en) * | 2017-11-16 | 2019-05-23 | Chengdu Easton Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Pasylated vegfr/pdgfr fusion proteins and their use in therapy |
| WO2019101308A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
| KR20250121363A (ko) * | 2022-12-08 | 2025-08-12 | 인스메드 인코포레이티드 | 우리카아제 접합체 및 이의 사용 방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6203794B1 (en) | 1994-05-31 | 2001-03-20 | Allergan Sales, Inc. | Modification of clostridial toxins for use as transport proteins |
| AU4746096A (en) | 1995-06-06 | 1996-12-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Analogs of botulinum toxin and pharmaceutical compositions o f botulinum toxin |
| US6214602B1 (en) | 1998-08-28 | 2001-04-10 | Promega Corporation | Host cells for expression of clostridial toxins and proteins |
| HK1046020B (en) | 1999-08-25 | 2007-05-11 | Allergan, Inc. | Activatable recombinant neurotoxins |
| US6903187B1 (en) | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
| US20020127247A1 (en) * | 2000-11-17 | 2002-09-12 | Allergen Sales, Inc. | Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence |
| EP1773874B1 (en) | 2004-08-04 | 2012-10-24 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active botulinum toxin type a |
| DE102005002978B4 (de) | 2005-01-21 | 2013-04-25 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Rekombinante Expression von Proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen Form |
| JP2009003130A (ja) | 2007-06-20 | 2009-01-08 | Sharp Corp | レンズユニット、レンズユニットの製造方法および撮像装置 |
| HRP20110368T1 (hr) * | 2007-06-21 | 2011-06-30 | Technische Universitt Mnchen | Biološki aktivni proteini s povećanom stabilnošću in vivo i/ili in vitro |
| AU2011254564B2 (en) | 2010-05-21 | 2014-03-27 | Xl-Protein Gmbh | Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses |
| WO2013068472A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Modified neurotoxins with poly-glycine and uses thereof |
-
2015
- 2015-03-04 EP EP15707550.8A patent/EP3113792B1/en active Active
- 2015-03-04 US US15/123,408 patent/US9975929B2/en active Active
- 2015-03-04 ES ES15707550T patent/ES2704237T3/es active Active
- 2015-03-04 WO PCT/EP2015/000489 patent/WO2015132004A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3113792B1 (en) | 2018-12-05 |
| WO2015132004A1 (en) | 2015-09-11 |
| EP3113792A1 (en) | 2017-01-11 |
| US9975929B2 (en) | 2018-05-22 |
| US20170058006A1 (en) | 2017-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2704237T3 (es) | Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con un aumento de la duración del efecto | |
| ES2592314T3 (es) | Neurotoxinas clostridiales con persistencia modificada | |
| US11357821B2 (en) | Recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect | |
| CA2934986C (en) | Multiprotease therapeutics for chronic pain | |
| ES2929347T3 (es) | Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con aumento de la duración del efecto | |
| ES2930237T3 (es) | Neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas con mayor duración de efectos | |
| US11952601B2 (en) | Recombinant botulinum toxin with increased duration of effect | |
| US20210008156A1 (en) | Novel recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect | |
| WO2016180533A1 (en) | Novel recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect | |
| US20200354706A1 (en) | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect | |
| EP3312193A1 (en) | Novel recombinant botulinum neurotoxins with accelerated onset of effect | |
| EP3290437A1 (en) | Novel recombinant clostridial neurotoxins with decreased duration of effect | |
| EP3333179A1 (en) | Novel recombinant botulinum toxin with accelarated onset of effect |