ES2929347T3 - Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con aumento de la duración del efecto - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes que exhiben una mayor duración del efecto ya métodos para la fabricación de tales neurotoxinas clostridiales recombinantes. Estas nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes comprenden (i) al menos dos dominios en espiral aleatorios, o (ii) al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, y los métodos comprenden los pasos de insertar al menos dos secuencias de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica (i) un dominio de espiral aleatoria, o (ii) un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental y la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende (i) las secuencias codificantes del dominio de espiral aleatoria, o (ii) las secuencias que codifican los dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II en una célula huésped. La invención se refiere además a nuevas neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes utilizadas en tales métodos, secuencias de ácido nucleico que codifican tales neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes y composiciones farmacéuticas que comprenden la neurotoxina clostridial recombinante con mayor duración del efecto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes con aumento de la duración del efecto

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes que presentan un aumento de la duración del efecto y a métodos para la fabricación de tales neurotoxinas clostridiales recombinantes. Estas nuevas neurotoxinas clostridiales recombinantes comprenden (i) al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en los que cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o (ii) al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, y los métodos comprenden las etapas de insertar al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican cada una (i) un segmento de proteína que consiste en residuos de alanina, serina y prolina, y que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o (ii) un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental y la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende (i) las secuencias codificantes del segmento de proteína, o (ii) las secuencias que codifican los dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II en una célula anfitriona. La invención se refiere adicionalmente a nuevas neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes utilizadas en tales métodos, a las secuencias de ácido nucleico que codifican tales neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla recombinantes y a las composiciones farmacéuticas que comprenden la neurotoxina clostridial recombinante con un aumento de la duración del efecto.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Clostridium es un género de bacterias grampositivas anaerobias, que pertenecen a los Firmicutes. Clostridium consiste en aproximadamente 100 especies que incluyen bacterias de vida libre comunes, así como patógenos importantes, tales como Clostridium botulinum y Clostridium tetani. Ambas especies producen neurotoxinas, toxina botulínica y toxina tetánica, respectivamente. Estas neurotoxinas son potentes inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependiente del calcio de células neuronales y están entre las toxinas más potentes conocidas por el hombre. La dosis letal en seres humanos se encuentra entre 0,1 ng y 1 ng por kilogramo de peso corporal. La ingestión oral de toxina botulínica a través de alimentos contaminados o la generación de toxina botulínica en las heridas pueden causar botulismo, que se caracteriza por la parálisis de diversos músculos. La parálisis de los músculos respiratorios puede causar la muerte del individuo afectado.

Aunque tanto la neurotoxina botulínica (BoNT) como la neurotoxina tetánica (TxNT) funcionan a través de un mecanismo de acción fisiológico inicial similar, inhibiendo la liberación de neurotransmisores desde el axón de la neurona afectada a la sinapsis, difieren en su respuesta clínica. Aunque la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular y otras sinapsis colinérgicas en el sistema nervioso periférico, inhibiendo la liberación del neurotransmisor acetilcolina y causando, por tanto, parálisis flácida, la toxina tetánica actúa principalmente en el sistema nervioso central, evitando la liberación de los neutrotransmisores inhibidores GABA (ácido gammaaminobutírico) y glicina al degradar la proteína sinaptobrevina. La consiguiente sobreactividad en los músculos da como resultado contracciones generalizadas de la musculatura agonística y antagónica, denominadas espasmo tetánico (parálisis rígida).

Aunque la neurotoxina tetánica existe en un tipo inmunológicamente distinto, se sabe que las neurotoxinas botulínicas aparecen en siete tipos inmunogénicos diferentes, denominados BoNT/A a BoNT/H. La mayoría de las cepas de Clostridium botulinum producen un tipo de neurotoxina, pero también se han descrito cepas que producen múltiples toxinas.

Las neurotoxinas botulínica y tetánica tienen secuencias de aminoácidos altamente homólogas y muestran una estructura de dominio similar. Su forma biológicamente activa comprende dos cadenas peptídicas, una cadena ligera de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa, conectadas por un enlace disulfuro. Una región conectora o bucle, cuya longitud varía entre las diferentes toxinas clostridiales, se encuentra entre los dos residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro. Esta región bucle es escindida proteolíticamente por una endoproteasa clostridial desconocida para obtener la toxina biológicamente activa.

El mecanismo molecular de intoxicación por TxNT y BoNT también parece ser similar: la entrada en la neurona diana está mediada por la unión de la parte C-terminal de la cadena pesada a un receptor específico de la superficie celular; la toxina es absorbida a continuación por endocitosis mediada por receptores. El bajo pH en el endosoma formado de esta manera desencadena después un cambio conformacional en la toxina clostridial que le permite integrarse en la membrana endosomal y translocarse a través de la membrana endosomal al citoplasma, donde es reducido el enlace disulfuro que une la cadena pesada y ligera. Después, la cadena ligera puede escindir selectivamente las llamadas proteínas SNARE, que son esenciales para las diferentes etapas de la liberación de neurotransmisores en la hendidura sináptica, por ejemplo reconocimiento, acoplamiento y fusión de vesículas que contienen neurotransmisores con la membrana plasmática. TxNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNt /F y BoNT/G causan la escisión proteolítica de la sinaptobrevina o VAMP (proteína de membrana asociada a la vesícula), BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada a la membrana plasmática SNAP-25 y BoNT/C escinde la proteína integrante de la membrana plasmática sintaxina y SNAP-25.

Las neurotoxinas clostridiales muestran duraciones de acción variables que son específicas del serotipo. El efecto terapéutico clínico de BoNT/A dura aproximadamente 3 meses para trastornos neuromusculares y de 6 a 12 meses para hiperhidrosis. Los efectos de BoNT/E, por otro lado, duran menos de 4 semanas. El efecto terapéutico más duradero de BoNT/A la hace preferible para uso clínico en comparación con otros serotipos, por ejemplo, serotipos B, C¹, D, E, F, G y H. Una explicación posible para las duraciones de acción divergentes podrían ser las distintas localizaciones subcelulares de los serotipos de BoNT. El dominio proteasa de la cadena ligera de BoNT/A se localiza de manera puntual en la membrana plasmática de las células neuronales, co-localizándose con su sustrato SNAP-25. Por el contrario, el serotipo BoNT/E de corta duración es citoplasmático. La asociación con la membrana podría proteger a BoNT/A de los mecanismos de degradación citosólicos permitiendo una persistencia prolongada de BoNT/A en la célula neuronal.

En Clostridium botulinum, la toxina botulínica se forma como un complejo proteico que comprende el componente neurotóxico y las proteínas no tóxicas. Las proteínas accesorias incorporan el componente neurotóxico, protegiéndolo así de la degradación por las enzimas digestivas en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, las neurotoxinas botulínicas de la mayoría de los serotipos son oralmente tóxicas. Los complejos con, por ejemplo, 500 kDa o con 900 kDa pueden obtenerse de cultivos de Clostridium botulinum Tipo A.

En los últimos años, las neurotoxinas botulínicas se han utilizado como agentes terapéuticos en el tratamiento de las distonías y los espasmos. Las preparaciones que comprenden complejos de toxina botulínica están disponibles comercialmente, por ejemplo de Ipsen Ltd. (Dysport®) o Allergan Inc. (Botox®). Un componente neurotóxico de alta pureza, libre de cualquier proteína complejante, está disponible, por ejemplo, en Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt (Xeomin®).

Las neurotoxinas clostridiales se inyectan generalmente en el tejido muscular afectado, acercando el agente a la placa terminal neuromuscular, es decir, cerca del receptor celular que media su absorción en la célula nerviosa que controla dicho músculo afectado. Se han observado diversos grados de diseminación de neurotoxinas. Se cree que la diseminación de la neurotoxina depende de la cantidad inyectada y de la preparación particular de la neurotoxina. Puede provocar efectos secundarios adversos, tales como parálisis en el tejido muscular cercano, que puede evitarse en gran medida reduciendo las dosis inyectadas al nivel terapéuticamente relevante. La sobredosificación también puede hacer que el sistema inmunitario genere anticuerpos neutralizantes que inactiven la neurotoxina, evitando que alivie la actividad muscular involuntaria. Se ha demostrado que la tolerancia inmunológica a la toxina botulínica se correlaciona con las dosis acumuladas.

En el presente, las neurotoxinas clostridiales todavía se producen predominantemente mediante procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Sin embargo, la producción industrial de neurotoxina clostridial a partir del cultivo anaeróbico de Clostridium es un procedimiento engorroso y lento. Debido a la alta toxicidad del producto final, el procedimiento debe realizarse bajo contención estricta. Durante el proceso de fermentación, los precursores de cadena sencilla son escindidos proteolíticamente por una proteasa clostridial desconocida para obtener la neurotoxina clostridial bicatenaria biológicamente activa. El grado de activación de las neurotoxinas por escisión proteolítica varía entre diferentes cepas y serotipos de neurotoxinas, lo que es una consideración importante para la fabricación debido a la necesidad de preparaciones de neurotoxinas con una actividad biológica bien definida. Además, durante los procesos de fermentación que utilizan cepas de Clostridium, las neurotoxinas clostridiales se producen como complejos proteicos, en los que el componente neurotóxico es integrado por proteínas accesorias. Estas proteínas accesorias no tienen un efecto beneficioso sobre la actividad biológica, la propagación de la neurotoxina o la duración del efecto. Sin embargo, pueden desencadenar una reacción inmunitaria en el paciente, lo que da como resultado inmunidad contra la neurotoxina clostridial que conduce a una falta de respuesta secundaria. Por lo tanto, podría ser ventajosa la fabricación de neurotoxinas clostridiales recombinantes que no son integradas por proteínas auxiliares.

Los métodos para la expresión recombinante de neurotoxinas clostridiales en E. coli son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes WO 00/12728, WO 01/14570 o WO 2006/076902). Además, las neurotoxinas clostridiales se han expresado en sistemas de expresión eucarióticos, tales como en Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, células de insectos y células de mamíferos (véase la Patente WO 2006/017749).

Las neurotoxinas clostridiales recombinantes se pueden expresar como precursores de cadena sencilla, que posteriormente deben ser escindidos proteolíticamente para obtener la neurotoxina clostridial biológicamente activa final. Por lo tanto, las neurotoxinas clostridiales se pueden expresar con alto rendimiento en bacterias de rápido crecimiento como polipéptidos de cadena sencilla relativamente no tóxicos.

Además, podría ser ventajoso modificar las características de la neurotoxina clostridial con respecto a la actividad biológica, la especificidad celular, el potencial antigénico y la duración del efecto mediante ingeniería genética para obtener neurotoxinas recombinantes con nuevas propiedades terapéuticas en áreas clínicas específicas. La modificación genética de las neurotoxinas clostridiales podría permitir alterar el modo de acción o ampliar el rango de dianas terapéuticas.

La Patente WO 96/39166 desvela análogos de la toxina botulínica que comprenden residuos de aminoácido que son más resistentes a la degradación en el tejido neuromuscular.

La familia de patentes basada en la Patente WO 02/08268 (incluyendo el miembro de la familia US 6.903.187) desvela una neurotoxina clostridial que comprende una modificación estructural seleccionada entre la adición o la deleción de un motivo basado en leucina, que altera la persistencia biológica de la neurotoxina (véanse también: Fernández-Salas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (2004) 3208-3213; Wang et al., J. Biol. Chem. 286 (2011) 6375-6385). Fernández-Salas et al. plantearon inicialmente la hipótesis de que el aumento de la persistencia se debía a las propiedades de unión a la membrana del motivo de dileucina (véase Fernández-Salas et al., loc. cit., pág.

3211 y 3213). Wang et al. mencionan esta teoría de la membrana (véase Wang et al., loc. cit., pág. 6376, columna izquierda, último párrafo completo, y pág. 6383, primer párrafo completo de "Discussion"), pero favorece una teoría alternativa: la protección contra la degradación por proteolisis (véase Wang et al., loc. cit., pág. 6384, columna izquierda, líneas 27 y sig.).

La Patente US 2002/0127247 describe neurotoxinas clostridiales que comprenden modificaciones en sitios de modificación secundaria y que muestran alteración de la persistencia biológica.

La Patente WO 2015/132004 describe neurotoxinas clostridiales que comprenden un dominio helicoidal aleatorio, en particular en las que dicho dominio helicoidal aleatorio consiste en residuos de alanina, serina y prolina, y que todas presentan una persistencia biológica alterada.

Las variantes de la toxina botulínica que muestran semividas biológicas más largas en el tejido neuromuscular que las toxinas botulínicas naturales serían ventajosas para reducir la frecuencia de administración y la incidencia de la generación de anticuerpos neutralizantes, ya que la tolerancia inmunológica a la toxina botulínica se correlaciona con las dosis acumuladas.

Además, los serotipos de BoNT que exhiben naturalmente una corta duración de acción se podrían utilizar potencialmente de manera eficaz en aplicaciones clínicas, si se pudiera mejorar su persistencia biológica. BoNT/E modificada con un aumento de la duración de la acción se podría utilizar potencialmente en pacientes que presenten una reacción inmunológica contra BoNT/A. Además, se demostró que BoNT/E induce un bloqueo más severo de la liberación del mediador del dolor de las neuronas sensoriales que BoNT/A. En aplicaciones clínicas donde BoNT/A proporciona solo alivio del dolor parcial o solo en un subconjunto de pacientes, tal como en el tratamiento de dolores de cabeza, o donde se ha encontrado que BoNT/E es más eficaz que BoNT/A, pero solo proporciona terapia a corto plazo, tal como en el tratamiento de la epilepsia, podría resultar útil BoNT/E con un aumento de la duración del efecto.

Existe una fuerte demanda para producir neurotoxinas clostridiales con un aumento de la duración del efecto, con el fin de permitir la reducción de la frecuencia de administración y la explotación del potencial terapéutico de los serotipos de BoNT, que hasta ahora se han considerado poco prácticos para la aplicación clínica debido a la corta semivida del respectivo efecto clínicamente relevante. Idealmente, la duración del efecto de una neurotoxina clostridial concreta se podría ajustar de manera personalizada para abordar cualquier característica y demanda particulares de una indicación dada, tal como la cantidad de neurotoxina que se administra, la frecuencia de administración, etc. Hasta la fecha, a pesar de los avances que ya se han realizado (véase, en particular, la Patente WO 2015/132004), tales aspectos no se han resuelto satisfactoriamente.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

Ha sido un objetivo de la presente invención proporcionar neurotoxinas clostridiales recombinantes que presenten un aumento de la duración del efecto y establecer un método fiable y preciso para fabricar y obtener tales neurotoxinas clostridiales recombinantes. Dicho método y las nuevas neurotoxinas clostridiales precursoras utilizadas en dichos métodos servirían para satisfacer la gran necesidad de neurotoxinas clostridiales recombinantes que exhiban un aumento de la duración del efecto.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los serotipos de origen natural de toxina botulínica presentan duraciones de efecto altamente divergentes, probablemente debido a su distinta localización subcelular. Se demostró que BoNT/A que muestra la persistencia más larga se localiza en las cercanías de la membrana plasmática de las células neuronales, mientras que el serotipo de corta duración BoNT/E es citosólico. Sin embargo, factores adicionales tales como la degradación, la difusión y/o las tasas de translocación podrían tener un impacto decisivo sobre las diferencias en la duración del efecto para los serotipos individuales de toxina botulínica.

Has ahora, excepto para el enfoque descrito y reivindicado en la Patente WO 2015/132004, no hay disponible ningún método aplicable de un modo general para modificar neurotoxinas clostridiales a fin de la duración de su efecto. Sorprendentemente, se ha descubierto que las neurotoxinas clostridiales recombinantes que tienen efectos incluso mejores que los desvelados en la Patente WO 2015/132004 pueden obtenerse clonando dos secuencias que codifican cada una (i) un dominio helicoidal aleatorio, o (ii) codificando un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, en un gen que codifica una neurotoxina clostridial parental, y por medio de la posterior expresión heteróloga del constructo generado en células anfitrionas recombinantes.

Por tanto, la presente solicitud describe una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos dominios helicoidales aleatorios separados. En un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido.

En un aspecto alternativo, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a la composición que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención para su uso en el tratamiento de un paciente.

La presente solicitud se refiere además a un método para tratar a un paciente que comprende la etapa de administrar una composición que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla mediante la inserción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una un segmento de proteína que consiste en residuos de alanina, serina y prolina, y que consisten en al menos 50 residuos de aminoácido, en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla mediante la inserción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla que comprende al menos dos segmentos separados de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla que comprende al menos dos dominios separados que tienen una conformación de hélice de poliprolina II. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla de la presente invención.

La presente solicitud describe además un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de insertar una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una un segmento de proteína que consiste en residuos de alanina, serina y prolina, y que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

La presente solicitud describe además un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de insertar una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

La presente solicitud describe además un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención.

La presente solicitud describe además una célula anfitriona recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención o el vector de la presente invención.

La presente solicitud describe además un método para producir la neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención o el vector de la presente invención en una célula anfitriona recombinante, o cultivar la célula anfitriona recombinante de la presente invención en condiciones que den como resultado la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico. FIGURAS

Figura 1: Presentación esquemática de la Toxina A botulínica Bis-PASilada (PASrBoNT/A-PAS).

Figura 2: SDSPAGE de PAS-rBoNT/A-PAS purificada. Antes de aplicar las muestras al gel, se añadió pmercaptoetanol. Calle "v.A.": PAS-rBoNT/A-PAS de cadena sencilla no activada, purificada que tiene un peso molecular (Pm) de aproximadamente 170 kDa. Calles "n.A." (después de la activación) y "n.R." (después de la purificación) muestran la cadena ligera (PAS-Lc) y la cande pesada (Hc-PAS) obtenidas después de la activación por trombina en condiciones reductoras.

Figura 3: Ensayo de carrera con ratón con PAS100-rBoNT/A-PAS100: •, ♦: PAS100-rBoNT/A-PAS100 (dos ensayos separados (^mR^a-159 y MRA-160), 9,0 pg de PAS100-rBoNT/A-PAS100 en cada caso); ▼: media del patrón (16 ensayos) de Xeomin® 81208 (0,6 U).

Figura 4: Constructos alternativos con tres o cuatro dominios PAS: (A) PAS-BoNT-PAS con secuencia PAS adicional en el término C de la cadena ligera (constructos alternativos posibles con secuencia PAS adicional en el término N de la cadena pesada); (B) PAS-BoNT-PAS con secuencia PAS adicional entre dominio de unión (término C y dominio de translocación de la cadena pesada; (C) PAS-BoNT-PAS con dos secuencias PAS adicionales en el término C de la cadena ligera y en un bucle expuesto de la cadena pesada, respectivamente (constructos alternativos posibles con secuencia PAS adicional en el término N de la cadena pesada y/o con secuencia PAS adicional en un bucle expuesto de la cadena ligera).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención puede comprenderse más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detalla de la invención y los ejemplos incluidos en la misma.

La presente solicitud describes una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos dominios helicoidales aleatorios separados. En un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido. En un aspecto alternativo, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II.

La presente invención describe además una neurotoxina clostridial recombinante que comprende al menos dos dominios que consisten en al menos 50 residuos de aminoácido seleccionados entre residuos de alanina (A), serina (S) y prolina (P).

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial" se refiere a una neurotoxina natural obtenible a partir de una bacteria de la clase Clostridia, incluyendo Clostridium tetani y Clostridium botulinum, o a una neurotoxina obtenible a partir de fuentes alternativas, incluyendo a partir de tecnologías recombinantes o a partir de modificaciones genéticas o químicas. En particular, las neurotoxinas clostridiales tienen actividad de endopeptidasa.

Las neurotoxinas clostridiales se producen como precursores de cadena sencilla que son escindidos proteolíticamente por una endoproteasa clostridial desconocida dentro de la región bucle para obtener la forma bicatenaria conectada por disulfuro biológicamente activa de la neurotoxina, que comprende dos elementos de cadena, una cadena ligera funcionalmente activa y una cadena pesada funcionalmente activa, donde un extremo de la cadena ligera está conectado a un extremo de la cadena pesada no a través de un enlace peptídico, sino a través de un enlace disulfuro.

En el contexto de la presente invención, la expresión "cadena ligera de neurotoxina clostridial" se refiere a aquella parte de una neurotoxina clostridial que comprende una actividad endopeptidasa responsable de escindir una o más proteínas que forman parte del llamado complejo SNARE implicado en el proceso que da como resultado la liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica: en las neurotoxinas clostridiales de origen natural, la cadena ligera tiene un peso molecular de aprox. 50 kDa.

En el contexto de la presente invención, la expresión "cadena pesada de neurotoxina clostridial" se refiere a aquella parte de una neurotoxina clostridial que es responsable de la entrada de la neurotoxina en la célula neuronal: en neurotoxinas clostridiales de origen natural, la cadena pesada tiene un peso molecular de aprox. 100 kDa.

En el contexto de la presente invención, la expresión "cadena de neurotoxina clostridial funcionalmente activa" se refiere a una cadena de neurotoxina clostridial recombinante capaz de realizar las funciones biológicas de una cadena de neurotoxina Clostridium botulinum de origen natural a al menos aproximadamente el 50 %, en particular a al menos aproximadamente el 60 %, a al menos aproximadamente el 70 %, a al menos aproximadamente el 80 %, y lo más en particular a al menos aproximadamente el 90 %, donde las funciones biológicas de las cadenas de neurotoxina clostridial incluyen, pero no se limitan a la unión de la cadena pesada a la célula neuronal, la entrada de la neurotoxina en una célula neuronal, la liberación de la cadena ligera de la neurotoxina de dos cadenas y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera. Los métodos para determinar una actividad neurotóxica se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente WO 95/32738, que describe la reconstitución de cadenas ligeras y pesadas obtenidas por separado de toxina tetánica y toxina botulínica.

En el contexto de la presente invención, la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro del 20 %, como alternativa dentro del 10%, incluyendo dentro del 5% de un valor o intervalo dado. Como alternativa, especialmente en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un log (es decir, un orden de magnitud), incluyendo dentro de un factor de dos de un valor dado.

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial recombinante" se refiere a una composición que comprende una neurotoxina clostridial que se obtiene mediante la expresión de la neurotoxina en una célula heteróloga tal como E. coli, e incluye, pero no se limita a, la materia prima obtenida de un procedimiento de fermentación (sobrenadante, composición después de la lisis celular), una fracción que comprende una neurotoxina clostridial obtenida de la separación de los ingredientes de dicha materia prima en un procedimiento de purificación, una proteína aislada y esencialmente pura y una formulación para uso farmacéutico y/o estético que comprende una neurotoxina clostridial y, adicionalmente, disolventes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial recombinante" se refiere además a una neurotoxina clostridial basada en una neurotoxina clostridial parental que comprende adicionalmente un dominio heterólogo, es decir, un segmento de proteína que consiste en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, que no es de origen natural en dicha neurotoxina clostridial parental, en particular un dominio helicoidal aleatorio sintético, un dominio sintético que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, un dominio helicoidal aleatorio o un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, a partir de una especie distinta a Clostridium botulinum, en particular, un dominio helicoidal aleatorio o un dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, a partir de una proteína humana.

En el contexto de la presente invención, el término "comprende" o "que comprende" significa "que incluye, pero no se limita a". Se pretende que el término sea abierto, para especificar la presencia de cualesquiera características, elementos, números enteros, etapas o componentes establecidos, pero sin excluir la presencia o adición de una o más de otras características, elementos, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. El término "que comprende" incluye así los términos más restrictivos "que consiste en" y "que consiste esencialmente en". En el contexto de la presente solicitud, la expresión "dominio helicoidal aleatorio" se refiere a un segmento de proteína, que carece esencialmente de una estructura secundaria. Los dominios helicoidales aleatorios pueden detectarse utilizando una diversidad de métodos, incluyendo métodos espectroscópicos, tales como métodos de dicroísmo circular o resonancia magnética nuclear (RMN), incluyendo experimentos multidimensionales de RMN o determinaciones estructurales cristalográficas.

En el contexto de la presente invención, la expresión "dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II" se refiere a un segmento de proteína, que aparece en aprox. el 7% (8.000 de cada 110.000) de todas las estructuras de proteína en la base de datos de proteínas PDB, y que se caracteriza por las siguientes características: (i) una hélice levógira extendida; (ii) 3,1 A por residuo y 3 residuos por giro (1,5 A y 4 residuos/giro en hélice a; 6 A en lámina p; 7,2 A completamente alargada); y (iii) una simetría rotacional triple con forma de prisma triangular. La conformación de hélice de poliprolina II se encuentra a menudo como tramos cortos que ayudan a la transición conformacional, tal como en p-PPII, p-PPII o PPII-a. Los dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II pueden detectarse utilizando una diversidad de métodos, incluyendo métodos espectroscópicos, tales como métodos de dicroísmo circular o resonancia magnética nuclear (RMN), incluyendo experimentos multidimensionales de RMN o determinaciones estructurales cristalográficas. En particular, en un gráfico de Ramachandran, la conformación de hélice de poliprolina II se caracteriza por un ángulo psi de la estructura principal cercano a de las cadenas beta antiparalelas y un ángulo phi que es cercano a las hélices alfa (véase Adzhubei et al., J. Mol. Biol. 425 (2013) 2100-32).

En situaciones particulares, dicho dominio helicoidal aleatorio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman una conformación de hélice aleatoria, en particular entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más en particular entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más en particular entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más en particular entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más en particular entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido. En realizaciones particulares, cada uno de dichos segmentos de proteínas comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman una conformación de hélice aleatoria, en particular entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más en particular entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más en particular entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más en particular entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más en particular entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido.

En realizaciones particulares, dicho dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, en particular entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más en particular entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más en particular entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más en particular entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más en particular entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido.

En realizaciones particulares, dicho dominio consiste en residuos de alanina (A), serina (S) y prolina (P). Estas secuencias denominadas "PAS" (véase, por ejemplo, Schlapschy et al., Protein Engineering, Design and Selection 26 (2013) 489-501; Patente EP 2 369 005; Patente WO 2011/144756) se han desarrollado para prolongar la semivida en plasma de proteínas farmacéuticamente activas. Se ha argumentado que la fusión genética don tales secuencias polipeptídicas desordenadas conformacionalmente proporciona una manera simple de anclar una cadena aleatoria solvatada con un gran volumen hidrodinámico al compañero de fusión, por ejemplo, una proteína de interés biofarmacéutico, de modo que el tamaño de la proteína de fusión resultante se aumenta significativamente, y que por estos medios se retarda en uno o dos órdenes de magnitud la eliminación típicamente rápida del componente biológicamente activo a través de la filtración. Sin embargo, se asume que, al menos en parte, tales secuencias PAS pueden formar, como alternativa, dominios que tienen también una conformación de hélice de poliprolina II.

Aunque pudo demostrarse que la fusión de un dominio basado en PAS al término N de una cadena ligera de neurotoxina botulínica dio como resultado una prolongación de la duración del efecto, como se muestra en la Patente WO 2015/132004, se descubrió posteriormente que una fusión de tal dominio basado en PAS al término C de la cadena pesada de una neurotoxina botulínica no ejerció ningún efecto sobre la duración del efecto, es decir, una neurotoxina botulínica con mono-PASilación en el término C de la cadena pesada no fue diferente del tipo silvestre (véanse los Ejemplos Comparativos 3 y 4). Por lo tanto, no cabría esperar ningún cambio destacado en la duración del efecto para una neurotoxina botulínica bis-PASilada. Sin embargo, la neurotoxina bis-PASilada mostró una duración mucho mayor que la proteína mono-PASilada (véanse los Ejemplos 1 y 2). Por lo tanto, la unión de al menos dos dominios helicoidales aleatorios o dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, tales como al menos dos dominios basados en PAS, es capaz de prolongar la duración del efecto de una proteína que es activa intracelularmente incluso más tiempo que la unión de uno solo de tales dominios, como se muestra en la Patente WO 2015/132004.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos. En realizaciones particulares, cada uno de dichos dominios comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.

En realizaciones particulares, los residuos de prolina comprendidos en al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho dominio. En realizaciones particulares, los residuos de prolina comprendidos en cada uno de dichos dominios constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho dominio.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o (a) multímero(s) de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias, en particular (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)ⁿ, siendo n (i) un número entero seleccionado de 3 a 25 (SEQ ID NO: 10), más en particular de 4 a 8 (SEQ ID NO: 11), más en particular de 5 a 10 (SEQ ID NO: 12), en particular en el que n es 5 (SEQ ID NO: 13) o 10 (SEQ ID NO: 14); o (ii) un número entero seleccionado de 5 a 150 (S^eQ ID NO: 15), más en particular de 6 a 20 (S^eQ ID NO: 16), más en particular de 7 a 13 (SEQ ID NO: 17), más en particular de 8 a 12 (SEQ ID NO: 18), más en particular de 9 a 11 (SEQ ID NO: 19), en particular en el que n es 10 (S^eQ ID NO: 14). En realizaciones particulares, cada uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o (a) multímero(s) de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias, en particular (ASPAAPAPAs PÁAPAPSApA^, siendo n (i) un número entero seleccionado de 3 a 25 (SEQ ID NO: 10), más en particular de 4 a 8 (SEQ ID NO: 11), más en particular de 5 a 10 (SEQ ID NO: 12), en particular en el que n es 5 (SEQ ID NO: 13) o 10 (SEQ ID NO: 14); o (ii) un número entero seleccionado de 5 a 150 (S^eQ ID NO: 15), más en particular de 6 a 20 (S^e Q ID NO: 16), más en particular de 7 a 13 (SEQ ID NO: 17), más en particular de 8 a 12 (SEQ ID NO: 18), más en particular de 9 a 11 (SeQ ID NO: 19), en particular en el que n es 10 (SEQ ID NO: 14).

En realizaciones particulares, dichos al menos dos segmentos o dominios de proteína se insertan en al menos dos posiciones separadas seleccionadas entre (i) el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el término C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el término N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; y (iv) el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, en particular en donde uno primero de tales dominios se inserta en el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante, y un segundo de tales dominios se inserta en el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante.

En realizaciones particulares, dichos tres dominios se insertan en tres posiciones separadas seleccionadas entre (i) el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el término C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el término N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iv) el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, (v) entre el dominio de unión C-terminal de la cadena pesada y el dominio de translocación de la cadena pesada, y (vi) en un bucle expuesto de la cadena pesada o la cadena ligera.

En realizaciones particulares, uno de dichos dominios se inserta en la cadena ligera de la toxina en una posición entre el residuo de aminoácido 123 y P31 (numeración de residuos de 3BTA.pdb) (bucle 20/30), en una posición entre el residuo de aminoácido D48 y T79 (bucle 60/70), en una posición entre el residuo de aminoácido G113 y N132 (bucle 120/130), en una posición entre el residuo de aminoácido P155 y F162 (bucle 160), en una posición entre el residuo de aminoácido S166 y T182 (bucle 170/180), en una posición entre el residuo de aminoácido E196 y K211 (bucle 200), en una posición entre el residuo de aminoácido Y232 y S258 (bucle 250), en una posición entre el residuo de aminoácido G266 y D274 (bucle 270), en una posición entre el residuo de aminoácido K298 y S308 (bucle 300), en una posición entre el residuo de aminoácido D325 y K329 (bucle 320), en una posición entre el residuo de aminoácido K358 y V372 (bucle 360/370), en una posición entre el residuo de aminoácido I376 y F401 (bucle 380/390).

En realizaciones particulares, uno de dichos dominios se inserta en el dominio de translocación (HN) de la cadena pesada de la toxina en una posición entre el residuo de aminoácido S466 y G477 (numeración de residuos de 3BTA.pdb) (bucle 470), en una posición entre el residuo de aminoácido T481 y S494 (bucle 480), en una posición entre el residuo de aminoácido T504 y K540 (cinturón de toxinas), en una posición entre el residuo de aminoácido A555 y V571 (bucle 560), en una posición entre el residuo de aminoácido ^l576 y S586 (bucle 580), en una posición entre el residuo de aminoácido N594 y F602 (bucle 600), en una posición entre el residuo de aminoácido T617 e I633 (bucle 620), en una posición entre el residuo de aminoácido G637 y F651 (bucle 640/650), en una posición entre el residuo de aminoácido L664 y T677 (bucle 670), en una posición entre el residuo de aminoácido V681 y N686 (bucle 680), en una posición entre el residuo de aminoácido N751-I765 (bucle 760), en una posición entre el residuo de aminoácido D824 e I830 (bucle 820), y en una posición entre el residuo de aminoácido L844 y N858 (bucle 850).

En realizaciones particulares, uno de dichos dominios se inserta en el dominio N-terminal del dominio de unión (HCⁿ) de la cadena pesada de la toxina en una posición entre el residuo de aminoácido G900 y N911 (numeración de residuos de 3BTA.pdb) (bucle 900), en una posición entre el residuo de aminoácido N917 y K922 (bucle 920), en una posición entre el residuo de aminoácido K928 y N934 (bucle 930), en una posición entre el residuo de aminoácido I948 y N959 (bucle 950), en una posición entre el residuo de aminoácido C966 y W973 (bucle 970), en una posición entre el residuo de aminoácido D988 e I992 (bucle 990), en una posición entre el residuo de aminoácido Y1000 y R1012 (bucle 1000/1010), en una posición entre el residuo de aminoácido 11040 y N1050 (bucle 1040) y en una posición entre el residuo de aminoácido G1058 y R1064 (bucle 1060).

En realizaciones particulares, uno de dichos dominios se inserta en el dominio C-terminal del dominio de unión (HCc) de la cadena pesada de la toxina en una posición entre el residuo de aminoácido 11090 y P1109 (numeración de residuos de 3BTA.pdb) (bucle 1100), en una posición entre el residuo de aminoácido L1113 y K1120 (bucle 1120), en una posición entre el residuo de aminoácido N1125 y Y1132 (bucle 1130), en una posición entre el residuo de aminoácido G1137 y T1157 (bucle 1140/1150), en una posición entre el residuo de aminoácido K1163 y D1177 (bucle 1170), en una posición entre el residuo de aminoácido T1194 y L1205 (bucle 1200), en una posición entre el residuo de aminoácido E1209 y V1219 (bucle 1210), en una posición entre el residuo de aminoácido K1223 y K1235 (bucle 1230), en una posición entre el residuo de aminoácido Q1239 y 11246 (bucle 1240), en una posición entre el residuo de aminoácido Q1253 y A1282 (bucle 1250), y en una posición entre el residuo de aminoácido 11270 y E1282 (bucle 1280).

En realizaciones particulares, uno primero de dichos dominios se inserta en el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante, un segundo de dichos dominios se inserta en el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante y un tercero de dichos dominios se inserta en el término C de la cadena ligera o el término N de la cadena pesada, en particular en el término C de la cadena ligera.

En otras realizaciones particulares, uno primero de dichos dominios se inserta en el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante, un segundo de dichos dominios se inserta en el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, y un tercero de dichos dominios se inserta entre el dominio de unión C-terminal de la cadena pesada y el dominio de translocación de la cadena pesada.

En otras realizaciones particulares, uno primero de dichos dominios se inserta en el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante, un segundo de dichos dominios se inserta en el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, y un tercero de dichos dominios se inserta en un bucle expuesto de la cadena pesada.

En realizaciones particulares, cuatro de dichos dominios se insertan en las siguientes cuatro posiciones: (i) el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el término C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el término N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; y (iv) el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante.

En realizaciones particulares, la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F, G y H, en particular neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, en particular neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina de Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina de Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial parental.

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F, G y H" se refiere a neurotoxinas encontradas en y obtenibles a partir de Clostridium botulinum. Actualmente, se conocen siete tipos serológicamente distintos, los serotipos designados A, B, C, D, E, F, G y H, incluyendo ciertos subtipos (por ejemplo A1, A2, A3, A4, etc.).

En realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial se selecciona entre una neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, en particular de neurotoxina de Clostridium botulinum de serotipo A, o de una variante funcional de cualquiera de tales neurotoxinas de Clostridium botulinum.

En realizaciones particulares, dicha neurotoxina clostridial recombinante tiene una cadena ligera y una cadena pesada comprendidas en la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la SEQ ID NO: 8 (véase la Tabla 1). En el contexto de la presente invención, la expresión "variante funcional de una neurotoxina clostridial" se refiere a una neurotoxina que difiere en la secuencia de aminoácidos y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina clostridial, pero todavía es funcionalmente activa. En el contexto de la presente invención, la expresión "funcionalmente activa" se refiere a la propiedad de una neurotoxina clostridial recombinante de exhibir una actividad biológica de al menos aproximadamente el 50 %, en particular de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % y de la manera más particular al menos aproximadamente el 90 % de la actividad biológica de una neurotoxina clostridial parental de origen natural, es decir, una neurotoxina clostridial parental sin ningún segmento de proteína que consiste en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido o sin ningún dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, donde las funciones biológicas incluyen, pero no se limitan a, la unión al receptor de neurotoxina, la entrada de la neurotoxina en una célula neuronal, la translocación de la cadena ligera en el citosol y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera,y, por lo tanto, la inhibición de la liberación de neurotransmisor desde la célula nerviosa afectada. Por motivos de claridad, cuando se compara la actividad funcional de una variante dada con una neurotoxina clostridial parental de acuerdo con la presente definición, se compara la actividad de neurotoxinas no PASiladas.

Al nivel de proteínas, una variante funcional mantendrá las características clave de la correspondiente neurotoxina clostridial, tales como los residuos clave para la actividad endopeptidasa en la cadena ligera, o los residuos clave para el anclaje a los receptores de neurotoxina o para la translocación a través de la membrana endosomal en la cadena pesada, pero puede contener una o más mutaciones que comprenden una deleción de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente, una adición de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente y/o una sustitución de uno o más aminoácidos de la neurotoxina clostridial correspondiente. En particular, dichos aminoácidos suprimidos, añadidos y/o sustituidos son aminoácidos consecutivos. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, se puede añadir, suprimir y/o sustituir cualquier número de aminoácidos, siempre que la variante funcional permanezca biológicamente activa. Por ejemplo, se pueden añadir, suprimir y/o sustituir 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 15, hasta 25, hasta 50, hasta 100, hasta 200, hasta 400, hasta 500 aminoácidos o incluso más aminoácidos. En consecuencia, una variante funcional de la neurotoxina puede ser un fragmento biológicamente activo de una neurotoxina natural. Este fragmento de neurotoxina puede contener una o más deleciones N-terminales, C-terminales y/o internas.

En otra realización, la variante funcional de una neurotoxina clostridial comprende adicionalmente un péptido señal. Normalmente, dicho péptido señal estará situado en el término N de la neurotoxina. Muchos de tales péptidos señal son conocidos en la técnica y están comprendidos por la presente invención. En particular, el péptido señal da como resultado el transporte de la neurotoxina a través de una membrana biológica, tal como la membrana del retículo endoplasmático, la membrana de Golgi o la membrana plasmática de una célula eucariótica o procariótica. Se ha descubierto que los péptidos señal, cuando se anclan a la neurotoxina, mediarán la secreción de la neurotoxina al sobrenadante de las células. En ciertas realizaciones, el péptido señal se escindirá en el transcurso de la secreción, o posteriormente, de modo que la proteína secretada carezca del péptido señal N-terminal, esté compuesta de cadenas ligeras y pesadas separadas, que están unidas covalentemente por puentes disulfuro, y sea proteolíticamente activa.

En realizaciones particulares, la variante funcional tiene en su parte de neurotoxina de clostridium una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 % o lo más particularmente al menos aproximadamente el 80 % y una homología de secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o lo más particularmente al menos aproximadamente el 95 % con respecto a la parte correspondiente en la neurotoxina clostridial parental. Los métodos y algoritmos para determinar la identidad y/o la homología de secuencia, incluyendo la comparación de variantes que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones con respecto a una secuencia parental, son bien conocidos por el experto normal en la técnica. A nivel de ADN, las secuencias de ácido nucleico que codifican el homólogo funcional y la neurotoxina clostridial parental pueden diferir en mayor medida debido a la degeneración del código genético. Se sabe que el uso de codones es diferente entre organismos procarióticos y eucarióticos. Por lo tanto, cuando se expresa una proteína procariótica tal como una neurotoxina clostridial, en un sistema de expresión eucariótico, puede ser necesario, o al menos útil, adaptar la secuencia de ácido nucleico al uso del codón de la célula anfitriona de expresión, lo que significa que la identidad o la homología de secuencia pueden ser bastante bajas a nivel de ácido nucleico.

En el contexto de la presente invención, el término "variante" se refiere a una neurotoxina que es un derivado modificado químicamente, enzimáticamente o genéticamente de una neurotoxina clostridial correspondiente, incluyendo una neurotoxina modificada químicamente o genéticamente de C. botulinum, concretamente de neurotoxina de C. botulinum de serotipo A, C o E. Un derivado modificado químicamente puede ser aquel que se modifique por piruvación, fosforilación, sulfatación, lipidación, pegilación, glicosilación y/o adición química de un aminoácido o un polipéptido que comprende entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos, incluyendo la modificación que se produce en la célula anfitriona eucariótica utilizada para expresar el derivado. Un derivado modificado enzimáticamente es aquel que se modifica por la actividad de enzimas, tales como enzimas endo o exoproteolíticas, incluyendo la modificación por enzimas de la célula anfitriona eucariótica utilizada para expresar el derivado. Como se señaló anteriormente, un derivado modificado genéticamente es aquel que se ha modificado mediante deleción o sustitución de uno o más aminoácidos contenidos en, o mediante la adición de uno o más aminoácidos (incluyendo polipéptidos que comprenden entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos) a, la secuencia de aminoácidos de dicha neurotoxina clostridial. Los métodos para diseñar y construir tales derivados modificados químicamente o genéticamente y para someter a prueba tales variantes para determinar su funcionalidad son bien conocidos por cualquier experto en la técnica.

La presente solicitud describes que dicha neurotoxina clostridial recombinante muestra un aumento de la duración del efecto con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin ninguno de dichos dominios. La presente solicitud describe además que dicha neurotoxina clostridial recombinante muestra un aumento de la duración del efecto con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica con uno solo de dichos dominios.

En el contexto de la presente invención, la expresión "un aumento de la duración del efecto" o "aumento de la duración de la acción" se refiere a una denervación de mayor duración mediada por una neurotoxina clostridial de la presente invención. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, la administración de a neurotoxina clostridial bicatenaria unida a disulfuro que comprende dichos dominios da como resultado una parálisis localizada durante un periodo de tiempo más largo con respecto a la administración de una neurotoxina clostridial bicatenaria unida a disulfuro idéntica sin tales dominios.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "un aumento de la duración del efecto/acción" se define como más de aproximadamente el 20 %, particularmente más de aproximadamente el 50 %, más en particular más de aproximadamente el 90 % un aumento de la duración del efecto de la neurotoxina recombinante de la presente invención con respecto a la neurotoxina idéntica sin dichos dominios.

En el contexto de la presente invención, el término "denervación" se refiere a denervación resultante de la administración de un agente de quimiodenervación, por ejemplo una neurotoxina.

En el contexto de la presente invención, la expresión "denervación localizada" o "parálisis localizada" se refiere a la denervación de una región anatómica concreta, generalmente un músculo o un grupo de músculos relacionados anatómicamente y/o fisiológicamente, que resulta de la administración de un agente de quimiodenervación, por ejemplo una neurotoxina, a la región anatómica concreta.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, las neurotoxinas clostridiales recombinantes de la presente invención podrían mostrar un aumento de la semivida biológica, una reducción de las tasas de degradación, una disminución de las tasas de difusión, un aumento de la absorción por las células neuronales y/o una modificación de las tasas de translocación intracelular, en cada caso con respecto a una neurotoxina clostridial parental idéntica sin dichos dominios.

En realizaciones particulares, el aumento de la duración del efecto se debe a un aumento de la semivida biológica. En el contexto de la presente solicitud, la expresión "semivida biológica" especifica la vida útil de una proteína, por ejemplo, una neurotoxina clostridial, in vivo. En el contexto de la presente solicitud, la expresión "semivida biológica" se refiere al período de tiempo, por el cual se degrada la mitad de un conjunto de proteínas in vivo. Por ejemplo, se refiere al período de tiempo en que se degrada la mitad de la cantidad de neurotoxina clostridial de una dosis administrada.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "semivida biológica aumentada" se define como más de aproximadamente el 20 %, en particular más de aproximadamente el 50 %, más en particular más de aproximadamente el 90 % semivida biológica aumentada de la neurotoxina recombinante de la presente invención con respecto a la neurotoxina idéntica sin dichos dominios.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "tasa de degradación reducida" significa que dichos dominios (secuencias PAS) protegen la cadena ligera y/o la cadena pesada frente a procesos de degradación, tales como, por ejemplo, el ataque de proteasas o modificar encimas como E3 ligasas. Particularmente en el caso de uno o más de dichos dominios (secuencias PAS) conectados a la cadena ligera, la cadena ligera se protege frente a tales procesos de degradación en el citosol de la neurona. Debido a esta protección, la semivida de la cadena ligera en la neurona se prolonga, dando como resultado un aumento de la duración del efecto terapéutico.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, parece ser posible que el aumento de la duración del efecto sea debido a un factor seleccionado entre difusión reducida, captación aumentada por neuronas, captación modificada por neuronas, interacción modificada de la neurotoxina recombinante con la matriz extracelular y/o la unión al receptor modificado, en particular en casos donde uno o más de dichos dominios (secuencias PAS) están conectados a la cadena pesada.

En realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial recombinante es para su uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere una quimiodenervación mejorada, en donde la neurotoxina clostridial recombinante provoca una denervación don una duración más larga con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica sin, o con solo uno de, dichos dominios.

En otras realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial recombinante es de serotipo E y es para su uso en el tratamiento de (a) pacientes que muestran una reacción inmunológica contra BoNT/A, o (b) cefalea o epilepsia. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención.

En realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección tomada de la lista de: distonía cervical (tortícolis espasmódica), blefaroespasmo, hiperhidrosis axilar primaria grave, acalasia, dolor lumbar, hipertrofia benigna de próstata, neuropatías focales crónicas dolorosas, migraña y otros trastornos con cefalea.

Las indicaciones adicionales donde el tratamiento con neurotoxinas botulínicas se encuentra actualmente bajo investigación y donde se puede utilizar la composición farmacéutica de la presente invención, incluyen incontinencia pediátrica, incontinencia debida a vejiga hiperactiva e incontinencia debida a vejiga neurogénica, fisura anal, trastornos espásticos asociados con lesión o enfermedad del sistema nervioso central, incluyendo traumatismo, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson o parálisis cerebral, distonías focales que afectan a las extremidades, cara, mandíbula o cuerdas vocales, trastornos de dolor en la articulación temporomandibular (TMJ), neuropatía diabética, cicatrización de heridas, salivación excesiva, disfunción de las cuerdas vocales, reducción del músculo masetero para disminuir el tamaño de la mandíbula inferior, tratamiento y prevención del dolor de cabeza crónico y dolor musculoesquelético crónico, tratamiento del ronquido, ayuda en la pérdida de peso al aumentar el tiempo de vaciado gástrico.

Más recientemente, las neurotoxinas clostridiales han sido evaluadas para el tratamiento de otras nuevas indicaciones, por ejemplo, queloides dolorosos, dolor neuropático diabético, dolor de rodilla refractario, aplicación de la zona de activación de neuralgia del trigémino para controlar el dolor, cicatrización después de una cirugía de labio leporino, cáncer y depresión.

Por tanto, la presente solicitud se refiere a un método de tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada con actividad muscular aumentada o aberrante, incluyendo una enfermedad o trastorno mencionados anteriormente en los párrafos [0082] a [0084], que comprende la etapa de administrar una composición que comprende una neurotoxina clostridial recombinante de acuerdo con la presente invención a dicho paciente.

La presente solicitud describe además el uso de la composición de la presente invención para un tratamiento cosmético.

Por tanto, la presente solicitud describe además un método de tratar cosméticamente a un paciente, que comprende la etapa de administrar una composición que comprende una neurotoxina clostridial recombinante de acuerdo con la presente invención a un paciente que desee dicho tratamiento cosmético.

En el contexto de la presente solicitud, las expresiones "tratamiento cosmético" o "tratar cosméticamente" se refieren a usos en aplicaciones cosméticas o estéticas, tales como el tratamiento de arrugas, patas de gallo, líneas de expresión, etc.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla mediante la inserción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una uno de dichos segmentos o dominios de proteína en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

En el contexto de la presente invención, la expresión "secuencia de ácido nucleico recombinante" se refiere a un ácido nucleico, que se ha generado uniendo material genético de dos fuentes diferentes.

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla" se refiere a un precursor de cadena sencilla para una neurotoxina clostridial de dos cadenas unidas por disulfuro, que comprende una cadena ligera de neurotoxina clostridial ligada funcionalmente activa, una cadena pesada de neurotoxina funcionalmente activa, y una región bucle que une el término C de la cadena ligera con el término N de la cadena pesada.

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla" se refiere a una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla que comprende al menos dos segmentos de proteína heterólogos que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, es decir, dominios seleccionados independientemente entre una especie distinta de Clostridium botulinum.

En realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla comprende un sitio de escisión de proteasa en dicha región de bucle.

Las neurotoxinas clostridiales precursoras de cadena sencilla tienen que escindirse proteolíticamente para obtener las neurotoxinas clostridiales biológicamente activas finales. La escisión proteolítica puede ocurrir durante la expresión heteróloga por las enzimas de la célula anfitriona, o al añadir enzimas proteolíticas al material proteico bruto aislado después de la expresión heteróloga. Las neurotoxinas clostridiales de origen natural contienen generalmente una o más señales de escisión para proteasas que escinden post-traduccionalmente la molécula precursora de cadena sencilla, de modo que se puede formar el complejo di- o multimérico final. En la actualidad, las neurotoxinas clostridiales todavía se producen predominantemente por procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Durante el proceso de fermentación, los precursores de cadena sencilla son escindidos proteolíticamente por una proteasa clostridial desconocida para obtener la neurotoxina clostridial bicatenaria biológicamente activa. En los casos en que la molécula precursora de cadena sencilla es el precursor de una proteasa, se puede producir una escisión autocatalítica. Alternativamente, la proteasa puede ser una enzima no clostridial separada expresada en la misma célula. La Patente WO 2006/076902 describe la escisión proteolítica de un precursor de cadena sencilla de neurotoxina clostridial recombinante en un sitio de reconocimiento y escisión heterólogo mediante incubación de producto lisado de la célula anfitriona de E. coli. La escisión proteolítica se realiza por medio de una proteasa de E. coli desconocida. En ciertas aplicaciones de expresión recombinante, se han introducido de forma recombinante sitios de escisión de proteasa modificados en la región de intercatenaria entre la cadena ligera y pesada de toxinas clostridiales, por ejemplo sitios de escisión de proteasas para trombina humana o proteasas no humanas (véase la Patente WO 01/14570).

En realizaciones particulares, el sitio de escisión de proteasa es un sitio que es escindido por una proteasa seleccionada de la lista de: una proteasa seleccionada de la lista de: trombina, tripsina, enteroquinasa, factor Xa, papaína vegetal, papaína de insecto, papaína de crustáceo, enteroquinasa, proteasa 3C de rinovirus humano, proteasa 3C de enterovirus humano, proteasa del virus del grabado del tabaco, virus del moteado de venas del tabaco, subtilisina y caspasa 3.

En una realización particular, la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante comprende adicionalmente una etiqueta de unión, concretamente seleccionada del grupo que comprende: glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta His, Strep-tag® o etiqueta FLAG.

En el contexto de la presente invención, la expresión "neurotoxina clostridial parental" se refiere a una neurotoxina clostridial inicial sin ningún segmento de proteína heterólogo que consiste en residuos de alanina, serina y prolina y que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o dominio que tiene una conformación de hélice de poliprolina II, seleccionado entre una neurotoxina clostridial natural, una variante funcional de una neurotoxina clostridial natural o una neurotoxina clostridial quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de serotipos diferentes de neurotoxina clostridial.

En realizaciones particulares, el método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención comprende además la etapa de expresar heterólogamente dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula anfitriona, en particular en una célula bacteriana anfitriona, más en particular en una célula de E. coli anfitriona.

En ciertas realizaciones, las células E. coli se seleccionan entre E. coli XL1-Blue, Nova Blue, TOP10, XL10-Gold, BL21 y K12.

En realizaciones particulares, el método para la generación de la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención comprende adicionalmente al menos una de las etapas de (i) generar una neurotoxina clostridial bicatenaria unida a disulfuro recombinante que comprende al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, provocando o permitiendo el contacto de dicha neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla con una endoproteasa y (ii) la purificación de dicha neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla o dicha neurotoxina clostridial recombinante bicatenaria unida por disulfuro por cromatografía.

En realizaciones particulares, la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante, o la neurotoxina clostridial bicatenaria unida por disulfuro recombinante, se purifican después de la expresión, o en el caso de la neurotoxina clostridial bicaternaria unida por disulfuro recombinante, después de la reacción de escisión. En tales realizaciones particulares, la proteína se purifica mediante cromatografía, concretamente mediante cromatografía de inmunoafinidad, o mediante cromatografía en una matriz de intercambio iónico, una matriz de interacción hidrófoba, o una matriz de cromatografía multimodal, concretamente una matriz de intercambio iónico fuerte, más concretamente una matriz de intercambio catiónico fuerte.

En el contexto de la presente invención, la expresión "causando... el contacto de dicha neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante... con una endoproteasa" se refiere a una etapa activa y/o directa de poner en contacto dicha neurotoxina y dicha endoproteasa, mientras que el término "permitiendo el contacto de una neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante... con una endoproteasa" se refiere a una etapa indirecta para establecer condiciones de tal manera que dicha neurotoxina y dicha endoproteasa estén en contacto entre sí.

En el contexto de la presente invención, el término "endoproteasa" se refiere a una proteasa que rompe los enlaces peptídicos de los aminoácidos no terminales (es decir, dentro de la cadena polipeptídica). Como no atacan a los aminoácidos terminales, las endoproteasas no pueden romper los péptidos en monómeros.

En realizaciones concretas, la escisión de la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante es casi completa.

En el contexto de la presente invención, la expresión "casi completo" se define como más de aproximadamente un 95 % de escisión, en particular más de aproximadamente un 97,5 %, más en particular más de aproximadamente un 99 % según lo determinado por SDS-PAGE y posterior Transferencia de Western o cromatografía de fase inversa. En realizaciones particulares, la escisión de la neurotoxina clostridial precursora de cadena sencilla recombinante se produce en una señal de escisión heteróloga localizada en la región bucle de la neurotoxina clostridial precursora recombinante.

En realizaciones particulares, la reacción de escisión se realiza con productos lisados brutos de células anfitrionas que contienen dicha proteína precursora de cadena sencilla.

En otras realizaciones particulares, la proteína precursora de cadena sencilla se purifica o se purifica parcialmente, en particular mediante una primera etapa de enriquecimiento cromatográfico, antes de la reacción de escisión. En el contexto de la presente invención, el término "purificado" se refiere a más de aproximadamente un 90 % de pureza. En el contexto de la presente invención, la expresión "parcialmente purificado" se refiere a una pureza de menos de aproximadamente el 90 % y un enriquecimiento de más de aproximadamente el doble.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla, que es un precursor para la neurotoxina clostridial recombinante de la presente invención. Por tanto, en dicho aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla que comprende al menos dos segmentos separados de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, o al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido. En realizaciones particulares, al menos uno de dichos segmentos de proteína o dichos dominios consiste de entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más en particular entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más en particular entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más en particular entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más en particular entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido. En realizaciones particulares, cada uno de dichos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido. En realizaciones particulares, cada uno de dichos segmentos de proteína o dichos dominios consta de entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, más en particular entre 60 y 500 residuos de aminoácido, más en particular entre 70 y 260 residuos de aminoácido, más en particular entre 80 y 240 residuos de aminoácido, más en particular entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos dominios consiste en residuos de alanina, serina y prolina. En realizaciones particulares, cada uno de dichos dominios consiste en residuos de alanina, serina y prolina.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de 6 residuos de aminoácido consecutivos son idénticos. En realizaciones particulares, cada uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en donde no más de 6 residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.

En realizaciones particulares, en al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína los residuos de prolina comprendidos en dicho dominio constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho dominio. En realizaciones particulares, en cada uno de dichos segmentos o dominios de proteína los residuos de prolina comprendidos en dicho dominio constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho dominio. En realizaciones particulares, al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o (a) multímero(s) de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias, en particular (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)ⁿ, siendo n (i) un número entero seleccionado de 3 a 25 (SEQ ID NO: 10), más en particular de 4 a 8 (SEQ ID NO: 11), más en particular de 5 a 10 (SEQ ID NO: 12), en particular en el que n es 5 (SEQ ID NO: 13) o 10 (SEQ ID NO: 14); o (ii) un número entero seleccionado de 5 a 150 (S^eQ ID NO: 15), más en particular de 6 a 20 (S^eQ ID NO: 16), más en particular de 7 a 13 (SEQ ID NO: 17), más en particular de 8 a 12 (SEQ ID NO: 18), más en particular de 9 a 11 (SEQ ID NO: 19), en particular en el que n es 10 (S^eQ ID NO: 14). En realizaciones particulares, cada uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o (a) multímero(s) de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias, en particular (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)ⁿ, siendo n (i) un número entero seleccionado de 3 a 25 (SEQ ID NO: 10), más en particular de 4 a 8 (SEQ ID NO: 11), más en particular de 5 a 10 (SEQ ID NO: 12), en particular en el que n es 5 (SEQ ID NO: 13) o 10 (SEQ ID NO: 14); o (ii) un número entero seleccionado de 5 a 150 (S^eQ ID NO: 15), más en particular de 6 a 20 (S^eQ ID NO: 16), más en particular de 7 a 13 (SEQ ID NO: 17), más en particular de 8 a 12 (SEQ ID NO: 18), más en particular de 9 a 11 (S^eQ ID NO: 19), en particular en el que n es 10 (SEQ ID NO: 14).

En realizaciones particulares, dicho(s) segmento(s) o dominio(s) de proteína se inserta(n) en (i) el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el término C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (i) el término N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; y/o (ii) el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante.

En realizaciones particulares, la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F, G, y H, en particular neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más en particular neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina Clostridium botulinum quimérica, en donde la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial.

En realizaciones particulares, dicha neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la SEQ ID NO: 8 (véase la Tabla 1).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla de la presente invención, en particular una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en la SEQ ID NO: 9 (véase la Tabla 1).

La presente solicitud describe además un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de insertar una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una uno de dichos dominios en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

La presente solicitud describe además un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención.

La presente solicitud describe además una célula anfitriona recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención o el vector de la presente invención.

En ciertas situaciones, las células anfitrionas recombinantes se seleccionan entre E. coli XL1-Blue, Nova Blue, TOP10, XL10-Gold, BL21 y K12.

La presente solicitud describe además un método para producir la neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención o la secuencia de ácido nucleico obtenible por el método de la presente invención o el vector de la presente invención en una célula anfitriona recombinante, o cultivar la célula anfitriona recombinante de la presente invención en condiciones que den como resultado la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico. EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generación y Purificación de una toxina botulínica bis-PASilada de tipo A (PAS100-rBoNT/A-PAS100) El constructo de ácido nucleico que codifica un módulo "PAS" que comprende 100 residuos de aminoácido construidos a partir de los aminoácidos prolina, serina y alanina se produjo sintéticamente. Utilizando enzimas de restricción Ndel y Swal, se insertó en primer lugar el módulo génico correspondiente en el término N de BoNT/A recombinante (rBoNT/A). En una segunda etapa, el módulo PAS se insertó en el término C de la cadena pesada utilizando las enzimas de restricción BgIII y Aatll (Figura 1). La correcta clonación se verificó mediante secuenciación.

La expresión se realizó en la cepa E. coli BI21 utilizando medio Riesenberg (Riesenberg D, Schulz V, Knorre WA, Pohl H^d, Korz D, Sanders EA, Ross A, Deckwer WD: High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate. J Biotechnol 1991, 20(1):17-27). La purificación se realizó utilizando una combinación de cromatografía de afinidad (etiqueta HIS y STREP) y de exclusión por tamaño, seguido de activación utilizando trombina, que también escindió las etiquetas de afinidad. La Figura 2 resume los resultados de la purificación y la activación.

Ejemplo 2: Duración del efecto de PAS100-rBoNT/A-PAS100 en un "Ensayo de carrera con ratón"

Se inyectaron dosis equipotentes de PAS100-rBoNT/A-PAS100 o Xeomin® en el M. gastrocnemius de ocho ratones que habían sido entrenados en una banda continua. Utilizando estas dosis, solo se observó una parálisis sub­ máxima para excluir los efectos sistémicos potenciales en la medida de lo posible, lo que puede tener un impacto en la duración del efecto. La distancia de carrera diaria en la banda continua se midió durante 15 días. La parálisis causada por las toxinas se trazó como el porcentaje de la distancia de carrera el día antes de la inyección, que se estableció como 100 %, frente al tiempo (véase la Figura 3).

La inyección de PAS100-rBoNT/A-PAS100 dio como resultado una parálisis máxima después de 7 días, para el grupo de control tratado con Xeomin® la parálisis máxima se observó después de 4 días. Durante la fase de recuperación, la distancia de carrera del grupo de control alcanzó un valor del 40 % del valor de partida 5 días después de haber observado la parálisis máxima (día 9), mientras que el grupo de control tratado con PAS100-rBoNT/A-PAS100 alcanzó ese valor 7 después de la parálisis máxima (día 15). Por lo tanto, la duración de la parálisis efectiva se prolongó significativamente.

Ejemplo comparativo 3: Generación y purificación de una toxina botulínica de tipo A PASilada en el término C de cadena pesada (rBoNT/A-PAS100)

El constructo de ácido nucleico que codifica un módulo "PAS" que comprende 100 residuos de aminoácido construidos a partir de los aminoácidos prolina, serina y alanina se produjo sintéticamente. Utilizando las enzimas de restricción Aatll y BgIII, se insertó el módulo génico correspondiente en el término C de la cadena pesada de BoNT/A recombinante (rBoNT/A). La correcta clonación se verificó mediante secuenciación.

La expresión se realizó en la cepa E. coli BI21 utilizando medio Riesenberg (Riesenberg D, Schulz V, Knorre WA, Pohl H^d, Korz D, Sanders EA, Ross A, Deckwer WD: High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate. J Biotechnol 1991, 20(1):17-27). La purificación se realizó utilizando una combinación de cromatografía de afinidad (etiqueta HIS y STREP) y de exclusión por tamaño, seguido de activación utilizando trombina, que también escindió las etiquetas de afinidad.

Ejemplo comparativo 4: Duración del efecto de rBoNT/A-PAS100 en un "Ensayo de carrera con ratón"

Se inyectaron dosis equipotentes de rBoNT/A-PAS100 o Xeomin® en el M. gastrocnemius de ocho ratones que habían sido entrenados en una banda continua. Utilizando estas dosis, solo se observó una parálisis sub-máxima para excluir los efectos sistémicos potenciales en la medida de lo posible, lo que puede tener un impacto en la duración del efecto. La distancia de carrera diaria en la banda continua se midió durante 15 días. La parálisis causada por las toxinas se trazó como el porcentaje de la distancia de carrera el día antes de la inyección, que se estableció como 100 %, frente al tiempo.

La inyección de rBoNT/A-PAS100 dio como resultado una parálisis máxima después de 4 días, para el grupo de control tratado con Xeomin® la parálisis máxima se observó también después de 4 días. Durante la fase de recuperación, la distancia de carrera del grupo de control alcanzó un valor del 40 % del valor de partida 5 días después de haber observado la parálisis máxima (día 9) y se observó el mismo efecto para el grupo tratado con rBoNT/A-PAS100. Por lo tanto, la duración de la parálisis efectiva fue esencialmente la misma y la PASilación en el término C de la cadena pesada no ejerció ningún efecto significativo sobre la duración del efecto.

Tabla 1: Secuencias

SEQ ID NO 1:

AS PAAPAPAS PAAPAPSAPA

SEQ ID NO 2:

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS

SEQ ID NO 3:

APSSPSPSAPSSPSPASPSS

SEQ ID NO 4:

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS

SEQ ID NO 5:

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA

SEQ ID NO 6:

AAS PAAPSAP PAAAS PAAPSAP PA

SEQ ID NO 7:

ASAAAPAAASAAASAPSAAA SEQ ID NO 8: PAS100 rBoNT/A-PAS100 (secuencia de aminoácidos)

S S A S PA A P A P A S P A A PA P S A PA A S P A A PA PA S P A A PA P S A PA A S P A A PA PA S P A A PA P S A PAAS PA A P A P A S P A A PA P S A PA A S P A A PA PA S P A A PA P S A P A A P FVNKQ FNYKD PVNGVD IA Y IK IP N A G Q M Q P V K A F K IH N K IW V IP E R D T F T N P E E G D L N P P P E A K Q V P V S Y Y D S T Y L S T D N E K D N Y L K G V T K L F E R IY S T D L G R M L L T S IV R G IP F W G G S T ID T E L K V ID T N C IN V I Q P D G S Y R S E E L N L V I I G P S A D I I Q F E C K S F G H E V L N L T R N G Y G S T Q Y I R F S P D F T F G F E E S L E V D T N P L L G A G K F A T D P A V T L A H E L IH A G H R L Y G IA IN P N R V F K V N T N A Y Y E M S G L E V S F E E L R T F G G H D A K F ID S L Q E N E F R L Y Y Y N K F K D IA S T L N K A K S IV G T T A S L Q Y M K N V F K E K Y L L S E D T S G K F S V D K L K F D K L Y K M L T E IY T E D N F V K F F K V L N R K T Y L N F D K A V F K IN I V P K V N Y T IY D G F N L R N T N L A A N F N G Q N T E IN N M N F T K L K N F T G L F E F Y K L L C V R G IIT S K A G A G K S L V P R G S A G A G A L N D L C IK V N N W D L F F S P S E D N F T N D L N K G E E IT S D T N IE A A E E N I S L D L IQ Q Y Y L T F N F D N E P E N IS IE N L S S D IIG Q L E L M P N IE R F P N G K K Y E L D K Y T M F H Y L R A Q E FE H G K SR IA L T N SV N E A L L N PSR V Y T FFSS D Y V K K V N K A T E A A M FL G W V E Q L V Y D F T D E T S E V S T T D K I A D I T I I I P Y I G P A L N I G N M L Y K D D F V G A L I F S G A V I L L E F I P E I A IP V L G T F A L V S Y IA N K V L T V Q T ID N A L S K R N E K W D E V Y K Y IV T N W L A K V N T Q ID L IR K K M K E A L E N Q A E A T K A IIN Y Q Y N Q Y T E E E K N N IN F N ID D L S S K L N E S IN K A M IN IN K F L N Q C S V S Y L M N S M IP Y G V K R L E D F D A S L K D A L L K Y IY D N R G T L IG Q V D R L K D K V N N T L S T D IP F Q L S K Y V D N Q R L L S T F T E Y I K N I I N T S I L N L R Y E S N H L I D L S R Y A S K I N I G S K V N F D P I D K N Q IQ L F N L E S S K IE V I L K N A I V Y N S M Y E N F S T S F W I R I P K Y F N S I S L N N E Y T I I N C M E N N S G W K V S L N Y G E IIW T L Q D T Q E IK Q R W F K Y S Q M IN IS D Y IN R W IF V T IT N N R L N N S K IY IN G R L ID Q K P IS N L G N IH A S N N IM F K L D G C R D T H R Y IW IK Y F N L F D K E L N E K E IK D L Y D N Q S N SG ILK D FW GDYLQYDKPYYM LNLYDPNKYVDVNNVGIRGYM YLKGPRGSVM TTNIYLNS S L Y R G T K F IIK K Y A S G N K D N IV R N N D R V Y IN W V K N K E Y R L A T N A S Q A G V E K I L S A L E I P

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SEQ ID NO 9: PAS100 rBoNT/A-PAS100 (secuencia de ácido nucleico)

TCTTCTGCAAGTCCGGCAGCACCGGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACCTAGCGCA CCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAGCCCTGCAGCTCCAGCACCGTCAGCA CCAGCAGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCCAGCTCCTAGTGCC C C TG C TG CCTCTCCTG CTG CTCCG G CA CCA G C AA G TCC TG C TG C G CCTG CA CCG A G TG CT CCGGCTGCTAG TCCTG CCG CA CCA G CTCCG G C TA G TCC A GC TGC TCCA G CCCCTTCA G CC CCTGCAGCACCATTTGTGAACAAGCAGTTTAACTATAAGGACCCGGTGAACGGTGTGGAT ATCGCGTATATCAAAATCCCGAATGCGGGCCAGATGCAACCAGTCAAGGCGTTCAAGATT CATAACAAGAT TTG G G TTA TTC C G GAAC G T GATAC C T T CAC CAAT C C G GAAGAAG G C GAT TTAAATCCGCCGCCAGAAGCCAAACAAGTGCCGGTGAGCTACTATGATAGCACGTATCTT AG CAC C GATAAT GAAAAAGACAAT TAC C T GAAG G G C G T GAC CAAG T T G T T C GAG C G CAT C TACAGTACCGA CTTA G G CCG CA TG TTG TTG A CG A G CA TCG TTCG CG G TA TCCCG TTCTG G GGCGGCTCGACCAT T GATACCGAGT T GAAAGT CAT T GACACGAAC T GTAT CAAT GT TAT C CAACCGGACGGCAGTTATCGCAGCGAGGAGTTAAATTTGGTCATCATCGGTCCAAGCGCA G A TA TTA TTCAGTTCGAATGCAAGAGCTTCGGCCATGAGGTCTTGAATTTGACGCGCAAC 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G C T CAG CAAG C G TAAT GAGAAAT G G GAC GAG G T T TATAAG TAT AT C G T GAC CAAC T G G T TAG CAAAAGT CAATACGCAGATCGATCTCATCCGCAAAAAAATG AAAGAAG C C T T G GAAAAT CAAG C G GAG G CAAC CAAAG C CAT CAT TAAT TAC CAG TATAAC CAATATAC C GAAGAAGAAAAAAACAATAT CAAC T T CAATAT C GAT GAT T T GAG CAG CAAA C T GAACGAGAGCAT TAACAAAG C GATGAT TAACATCAACAAGTTC T T GAATCAATGCAGC GTGAGCTATCTCATGAACAGCATGATCCCGTATGGCGTCAAACGCTTGGAAGATTTTGAC GCCAGCCTGAAAGATGCGCTCCTCAAGTATATTTATGACAACCGCGGCACCCTCATTGGC CAG G T G GAC C G C T T GAAG GATAAAG T GAACAATAC G C T CAG CAC G GATAT C C C G T T C CAG C T GAG CAAG TAC G T C GACAAC CAG C G C T TAC T GAG CAC C T T TAC C GAG TATAT CAAGAAC AT CAT TAATAC CAG CAT C C T CAAC TTGCGCTAT GAGAG CAAT CAC C T GAT C GAC C T CAG C C G C TAC G C CAG CAAGAT CAACAT C G G CAG CAAG G T CAAT T T C GAC C C GAT C GATAAGAAT CAGAT C CAAT T G T T TAAC C T G GAAAG CAG CAAGAT C GAG G T T A T C T T GAAGAAC G C GAT T G T G TACAACAG CAT G TAC GAGAAC T T TAG CAC GAG C TTC TG G A TTCG TA TCCCG A A G TA T 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GACGTCGGCAACCTCAGCCAGGTTGTGGTGATGAAGTCTAAAAACGACCAGGGCATCACG AACAAG T G CAAAAT GAAT T T G CAAGATAACAAC G G CAAC GACAT C G G C T T T A T T G G T T T T CAC CAG T T CAATAACAT C G C CAAAC T C G T G G C CAG CAAT T G G TATAAC C G C CAAAT T GAA CGCAGCAGCCGCACGCTCGGCTGTAGCTGGGAGTTCATCCCGGTGGACGATGGCTGGGGC GAGCGCCCGCTCGCAAGTCCGGCAGCACCGGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACCT AGCGCACCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAGCCCTGCAGCTCCAGCACCG TCAGCACCAGCAGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCCAGCTCCT A G TG C C C C TG C TG C C TC TC C TG CTG CTCCG G CA CC AG C A A G TC CTG CTG CG CCTG CA CCG A G TG CTCCG G CTG CTA G TCCTG CCG CA CCA G CTCCG G CTA G TCCA G CTG CTCC A G CCCCT TCA G CCCCTGCA

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una neurotoxina clostridial recombinante que comprende (i) al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en donde cada uno de dichos segmentos de proteína consiste en al menos 50 residuos de aminoácido, o (ii) al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, en donde cada uno de dichos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman dicha conformación de hélice de poliprolina II.

2. La neurotoxina clostridial recombinante, según la reivindicación 1, en la que cada uno de dichos segmentos de proteína de (i), o cada uno de dichos dominios de (ii), consta de entre 50 y 3000 residuos de aminoácido, entre 60 y 500 residuos de aminoácido, entre 70 y 260 residuos de aminoácido, entre 80 y 240 residuos de aminoácido o entre 90 y 220 residuos de aminoácido, en particular 100 residuos de aminoácido, 150 residuos de aminoácido o 200 residuos de aminoácido.

3. La neurotoxina clostridial recombinante, según la reivindicación 1 o 2, en la que al menos uno de dichos dominios de la subparte (ii) consiste en residuos de alanina, serina y prolina.

4. La neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en la que dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en la que no más de seis residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.

5. La neurotoxina clostridial recombinante, según la reivindicación 4, en la que los residuos de prolina comprendidos en dicho segmento o dominio de proteína constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho segmento o dominio de proteína.

6. La neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que al menos uno de dichos segmentos o dominios de proteína comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 1); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 2); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 3), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 4), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 5), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 6) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 7) o versiones permutadas circulares o (a) multímero(s) de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias, en particular (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)ⁿ, siendo n (i) un número entero seleccionado de 3 a 25 (SEQ ID NO: 10), más en particular de 4 a 8 (SEQ ID NO: 11), más en particular de 5 a 10 (SEQ ID NO: 12), en particular en el que n es 5 (^s E^q ID NO: 13) o 10 (SEQ ID NO: 14); o (ii) un número entero seleccionado de 5 a 150 (SEQ ID NO: 15), más en particular de 6 a 20 (SEQ ID NO: 16), más en particular de 7 a 13 (SEQ ID NO: 17), más en particular de 8 a 12 (SEQ ID NO: 18), más en particular de 9 a 11 (SEQ ID NO: 19), en particular en el que n es 10 (SEQ ID NO: 14).

7. La neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichos al menos dos segmentos o dominios de proteína se insertan en al menos dos posiciones separadas seleccionadas entre (i) el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (ii) el término C de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iii) el término N de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante; (iv) el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante, (v) entre el dominio de unión C-terminal de la cadena pesada y el dominio de translocación de la cadena pesada, y (vi) en un bucle expuesto de la cadena pesada o la cadena ligera; en particular en la que uno primero de dichos segmentos o dominios de proteína se inserta en el término N de la cadena ligera de dicha neurotoxina clostridial recombinante, y un segundo de dichos segmentos o dominios de proteína se inserta en el término C de la cadena pesada de dicha neurotoxina clostridial recombinante.

8. La neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F, G y H, en particular una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más en particular una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina Clostridium botulinum quimérica, en la que la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial; en particular en la que dicha neurotoxina clostridial recombinante tiene una cadena ligera y una cadena pesada comprendidas en la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la SEQ ID NO: 8.

9. La neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere una quimiodenervación mejorada, en la que la neurotoxina clostridial recombinante provoca una denervación con una duración mayor con respecto a una neurotoxina clostridial idéntica con uno o ninguno de dichos segmentos o dominios de proteína.

10. Una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Uso de la neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para tratamiento cosmético.

12. Un método para la generación de una neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla mediante la inserción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican cada una uno de dichos segmentos o dominios de proteína en al menos dos posiciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostridial parental.

13. El método, según la reivindicación 12, que comprende además la etapa de expresar heterólogamente dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula anfitriona, en particular en una célula bacteriana anfitriona, más en particular en una célula anfitriona de E. coli.

14. Una neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla que comprende (i) al menos dos segmentos de proteína que consisten en residuos de alanina, serina y prolina, en la que dichos segmentos de proteína consisten en al menos 50 residuos de aminoácido, o (ii) al menos dos dominios que tienen una conformación de hélice de poliprolina II, en donde cada uno de dichos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 residuos de aminoácido que forman dicha conformación de hélice de poliprolina II, en donde dicha neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla es un precursor para la neurotoxina clostridial recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, por ejemplo, en donde la secuencia de dicha neurotoxina clostridial se selecciona entre la secuencia de (i) una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, B, C, D, E, F, G y H, en particular una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, C y E, más en particular una neurotoxina Clostridium botulinum de serotipo A, o (ii) de la secuencia de una variante funcional de una neurotoxina Clostridium botulinum de (i), o (iii) de la secuencia de una neurotoxina Clostridium botulinum quimérica, en la que la cadena ligera y la cadena pesada de la neurotoxina clostridial son de diferentes serotipos de neurotoxina clostridial; en particular en la que dicha neurotoxina clostridial precursora recombinante de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la SEQ ID NO: 8.

15. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina clostridial recombinante de cadena sencilla, según la reivindicación 14, en particular una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en la SEQ ID NO: 9.