ES2296782T3 - Motivo a base de leucina y neurotoxinas clostridiales. - Google Patents

Abstract

Una neurotoxina clostridial modificada que comprende al menos un motivo a base de leucina adicional, comprendiendo el motivo a base de leucina adicional: (a) un quinteto que comprende los primeros cinco aminoácidos en el que al menos un aminoácido es un aminoácido ácido o al menos un aminoácido es un aminoácido que contiene hidroxilo; y (b) un doblete que comprende dos aminoácidos tras el quinteto en el que al menos uno de los aminoácidos es una leucina o al menos uno de los aminoácidos es una isoleucina; en la que el motivo adicional a base de leucina aumenta la persistencia biológica de la neurotoxina botulínica modificada con respecto a una neurotoxina botulínica idéntica sin el motivo a base de leucina adicional.

Description

Motivo a base de leucina y neurotoxinas clostridiales.

Antecedentes

La presente invención se refiere a neurotoxinas modificadas, particularmente neurotoxinas clostridiales modificadas, y al uso de las mismas para tratar diversas afecciones incluyendo afecciones que se han tratado usando toxinas botulínicas que se producen en la naturaleza.

La toxina botulínica, por ejemplo, la toxina botulínica tipo A, se ha usado en el tratamiento de numerosas afecciones incluyendo dolor, afecciones del músculo esquelético, afecciones del músculo liso y afecciones glandulares. Las toxinas botulínicas también se usan para fines cosméticos.

Existen numerosos ejemplos para el tratamiento usando toxina botulínica. Para ejemplos de tratamiento del dolor véanse Aoki, et al., patente estadounidense 6.113.915 y Aoki, et al., patente estadounidense 5.721.215. Para un ejemplo de tratamiento de un trastorno neuromuscular, véase la patente estadounidense número 5.053.005, que sugiere tratar la desviación de la columna vertebral juvenil, es decir, escoliosis, con un inhibidor de la liberación de acetilcolina, preferiblemente la toxina botulínica A. Para el tratamiento de estrabismo con toxina botulínica tipo A, véase Elston, J. S., et al., British Journal of ophthalmology, 1985, 69, 718-724 y 891-896., Para el tratamiento de blefaroespasmos con toxina botulínica tipo A, véase Adenis, J. P., et al., J. Fr. Ophthalmol., 1990, 13 (5) en las páginas 259-264. Para tratar tortícolis espasmódica y distonía bucomandibular, véase Jankovic et al., Neurology, 1987, 37, 616-623. La disfonía espasmódica también se ha tratado con la toxina botulínica tipo A. Véase Blitzer et al., Ann. Otol. Rhino. Laryngol, 1985, 94, 591-594. La distonía lingual se trató con la toxina botulínica tipo A según Brin et al., Adv. Neurol. (1987) 50, 599-608. Cohen et al., Neurology (1987) 37 (Supl. 1), 123-4, da a conocer el tratamiento del calambre muscular del escribiente con toxina botulínica tipo A.

El documento WO 96/39166 A proporciona mutaciones en la toxina botulínica que proporcionan la molécula con una semivida más larga en el tejido neuromuscular.

Sería beneficioso tener toxinas botulínicas con una persistencia biológica alterada y/o actividad biológica alterada. Por ejemplo, una toxina botulínica puede usarse para inmovilizar músculos y evitar movimientos de las extremidades tras una intervención quirúrgica de tendones para facilitar la recuperación. Sería beneficioso tener una toxina botulínica (tal como una toxina botulínica tipo A) que muestre un periodo reducido de persistencia biológica de modo que un paciente pueda recuperar la movilidad y el uso muscular en aproximadamente el tiempo en el que se recupera de la intervención quirúrgica. Además, una toxina botulínica con una actividad biológica alterada, tal como una actividad biológica potenciada, puede tener utilidad como una toxina más eficaz (es decir más potente por cantidad unitaria de toxina), de modo que pueda usarse menos toxina.

Adicionalmente, existe una necesidad de neurotoxinas modificadas (tales como toxinas clostridiales modificadas) que puedan mostrar un periodo aumentado de persistencia biológica y neurotoxinas modificadas (tales como toxinas clostridiales modificadas) con una persistencia biológica y/o actividad biológica reducida y procedimientos para preparar tales toxinas.

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Definiciones

Antes de proceder a describir la presente invención se proporcionan las siguientes definiciones y se aplican en el presente documento.

"Cadena pesada" significa la cadena pesada de una neurotoxina clostridial. Tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa y puede denominarse en el presente documento como cadena pesada o como H.

"H_{N}" significa un fragmento (que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa) derivado de la cadena pesada de una neurotoxina clostridial que es aproximadamente equivalente al segmento amino-terminal de la cadena pesada, o la parte correspondiente al fragmento de la cadena pesada intacta. Se cree que contiene la parte de la neurotoxina clostridial natural o de tipo salvaje implicada en el traslado de la cadena ligera a través de una membrana endosómica intracelular.

"H_{C}" significa un fragmento (de aproximadamente 50 kDa) derivado de la cadena pesada de una neurotoxina clostridial que es aproximadamente equivalente al segmento carboxilo-terminal de la cadena pesada, o la parte correspondiente al fragmento en la cadena pesada intacta. Se cree que es inmunogénico y que contiene la parte de la neurotoxina clostridial natural o de tipo salvaje implicada en la unión de alta afinidad a diversas neuronas (incluyendo neuronas motoras), y otros tipos de células diana.

"Cadena ligera" significa la cadena ligera de una neurotoxina clostridial. Tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, y puede denominarse como cadena ligera, L o como el domino proteolítico (secuencia de aminoácidos) de una neurotoxina clostridial. Se cree que la cadena ligera es eficaz como inhibidor de la exocitosis, incluyendo como inhibidor de la liberación de neurotransmisores (es decir, acetilcolina) cuando la cadena ligera está presente en el citoplasma de una célula diana.

"Neurotoxina" significa una molécula que puede interferir con las funciones de una célula, incluyendo una neurona. La "neurotoxina" puede producirse en la naturaleza o prepararse por el hombre. La función interferida puede ser exocitosis.

"Neurotoxina modificada" significa una neurotoxina que incluye una modificación estructural. En otras palabras, una "neurotoxina modificada" es una neurotoxina que se ha modificado mediante una modificación estructural. La modificación estructura cambia la persistencia biológica, tal como la semivida biológica (es decir la duración de la acción de la neurotoxina) y/o la actividad biológica de la neurotoxina modificada con respecto a la neurotoxina a partir de la cual se produce o deriva la neurotoxina modificada. La neurotoxina modificada es estructuralmente diferente de una neurotoxina que existe en la naturaleza.

"Mutación" significa una modificación estructural de una secuencia de ácido nucleico o proteína que se produce en la naturaleza. Por ejemplo, en el caso de mutaciones de ácidos nucleicos, una mutación puede ser una deleción, adición o sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia de ADN. En el caso de una mutación de secuencia proteica, la mutación puede ser una deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos en una secuencia proteica. Por ejemplo, un aminoácido específico comprendido en una secuencia proteica puede sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido seleccionado de un grupo que incluye los aminoácidos alanina, asparagina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, tirosina o cualquier otro aminoácido natural o que no se produce en la naturaleza o aminoácidos modificados químicamente. Las mutaciones en una secuencia proteica pueden ser el resultado de las mutaciones en las secuencias de ADN que cuando se transcriben, y se traduce el ARNm resultante, producen la secuencia proteica mutada. Las mutaciones en secuencia proteica también pueden crearse fusionando una secuencia peptídica que contiene la mutación deseada con una secuencia proteica deseada.

"Modificación estructural" significa cualquier cambio en una neurotoxina que la hace física o químicamente diferente de una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural.

"Persistencia biológica" o "persistencia" significa la duración temporal de la interferencia o influencia producida por una neurotoxina o una neurotoxina modificada con una función celular (tal como una función neuronal), incluyendo la duración temporal de una inhibición de la exocitosis (tal como la exocitosis de un neurotransmisor, por ejemplo, acetilcolina) de una célula, tal como una neurona.

"Semivida biológica" o "semivida" significa el tiempo en el que la concentración de una neurotoxina o una neurotoxina modificada, preferiblemente la parte activa de la neurotoxina o neurotoxina modificada, por ejemplo, la cadena ligera de toxinas clostridiales, se reduce hasta la mitad de la concentración original en una célula de mamífero, tal como en una neurona de mamífero.

"Actividad biológica" o "actividad" significa la cantidad de exocitosis celular inhibida de una célula por unidad de tiempo, tal como la exocitosis de un neurotransmisor de una neurona.

"Célula diana" significa una célula (incluyendo una neurona) con una afinidad de unión por una neurotoxina o por una neurotoxina modificada.

Sumario

Se han descubiertos nuevas neurotoxinas estructuralmente modificadas. Las presentes neurotoxinas estructuralmente modificadas pueden proporcionar beneficios sustanciales, por ejemplo, una persistencia biológica y/o semivida biológica aumentada o disminuida y/o una actividad biológica aumentada o disminuida en comparación con la neurotoxina no modificada.

Según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas, que incluyen una neurotoxina y una modificación estructural. La modificación estructural es eficaz para alterar una persistencia biológica de la neurotoxina estructuralmente modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural. También, la neurotoxina estructuralmente modificada es estructuralmente diferente de una neurotoxina que existe en la naturaleza.

La presente invención también abarca una neurotoxina modificada que comprende una neurotoxina con una modificación estructural, en la que dicha modificación estructural es eficaz para alterar una actividad biológica de dicha neurotoxina modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin dicha modificación estructural, y en la que dicha neurotoxina modificada es estructuralmente diferente de una neurotoxina que existe en la naturaleza. Esta modificación estructural puede ser eficaz para reducir una exocitosis de una célula diana en más de la cantidad de la exocitosis reducida de la célula diana por una neurotoxina idéntica sin dicha modificación estructural. Como alternativa, la modificación estructural puede ser eficaz para reducir una exocitosis de una célula diana en menos de la cantidad de la exocitosis reducida de la célula por una neurotoxina idéntica sin dicha modificación estructural. De manera significativa, la exocitosis puede ser exocitosis de un neurotransmisor y la neurotoxina modificada puede mostrar una actividad biológica alterada sin mostrar una persistencia biológica alterada. La modificación estructural puede comprender un motivo a base de leucina. Adicionalmente, la neurotoxina modificada puede mostrar una actividad biológica alterada así como una persistencia biológica alterada. La presente invención también incluye las circunstancias en las que: (a) la neurotoxina modificada muestra una actividad biológica aumentada así como una persistencia biológica aumentada; (b) la neurotoxina modificada muestra una actividad biológica aumentada y una persistencia biológica reducida; (c) la neurotoxina modificada muestra una actividad biológica disminuida y una persistencia biológica disminuida, y; (d) la neurotoxina modificada muestra una actividad biológica disminuida y una persistencia biológica aumentada.

De manera importante, una cantidad unitaria (es decir, en una base molar) de la neurotoxina modificada puede ser más eficaz para reducir una exocitosis de una célula que lo que lo es una cantidad unitaria de la neurotoxina que existe en la naturaleza. En otras palabras, una cantidad unitaria de una neurotoxina modificada, tal como una toxina botulínica tipo A modificada, puede romper su sustrato intracelular (SNAP) de tal manera que resulta una inhibición superior de la exocitosis de neurotransmisor (es decir, se libera menos neurotransmisor de la célula), en comparación con la inhibición de la exocitosis de neurotransmisor mostrada por la neurotoxina que se produce en la naturaleza.

Además, según la presente invención, hay neurotoxinas estructuralmente modificadas, en las que una modificación estructural es eficaz para potenciar una persistencia biológica de la neurotoxina modificada. La persistencia biológica potenciada de la neurotoxina estructuralmente modificada puede deberse, al menos en parte, a una semivida y/o actividad biológica aumentada de la neurotoxina estructuralmente modificada.

Aun además según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que se reduce una persistencia biológica de la neurotoxina estructuralmente modificada con respecto a la de una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural. Esta reducción en la persistencia biológica puede deberse, al menos en parte, a una actividad y/o semivida biológica disminuida de la neurotoxinas estructuralmente modificadas.

Según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que la modificación estructural comprende un motivo a base de leucina.

Aun además según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas que pueden incluir una modificación estructural. La neurotoxina puede comprender tres regiones de secuencia de aminoácidos. La primera región puede ser eficaz como un resto de unión molecular. Este resto de unión puede ser un resto de unión para una célula diana, tal como una neurona. El resto de unión puede ser el extremo carboxilo terminal de una cadena pesada de toxina botulínica. Se conoce bien que el extremo carboxilo terminal de una cadena pesada de toxina botulínica puede ser eficaz para unirse, por ejemplo, a receptores encontrados en determinadas células, incluyendo determinadas células nerviosas. En una realización, el extremo carboxilo terminal se une a receptores encontrados en una membrana presináptica de una célula nerviosa. La segunda región puede ser eficaz para trasladar una neurotoxina estructuralmente modificada, o una parte de una neurotoxina estructuralmente modificada a través de una membrana endosómica. La tercera región puede ser eficaz para inhibir la exocitosis de una célula diana. La inhibición de la exocitosis puede ser la inhibición de la liberación de neurotransmisor, tal como acetilcolina de una membrana presináptica. Por ejemplo, se conoce bien que la cadena ligera de toxina botulínica es eficaz para inhibir, por ejemplo, la liberación de acetilcolina (así como otros neurotransmisores) de diversas células neuronales y no neuronales.

Al menos una de las regiones primera, segunda o tercera puede derivarse sustancialmente de una neurotoxina clostridial. La tercera región puede incluir la modificación estructural. Además, la neurotoxina modificada puede ser estructuralmente diferente de una neurotoxina que existe en la naturaleza. También, la modificación estructural puede ser eficaz para alterar una persistencia biológica de la neurotoxina modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural.

En una realización, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas, en las que la neurotoxina puede ser toxina botulínica serotipo A, B, C_{1}, C_{2}, D, E, F, G, toxina tetánica y/o mezclas de las mismas.

En otra realización, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que la tercera región puede derivarse del serotipo A de toxina botulínica. Además, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que la tercera región no puede derivarse del serotipo A de toxina botulínica.

Aun en otra realización, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que la modificación estructural incluye un componente que potencia la persistencia biológica eficaz para potenciar la persistencia biológica de la neurotoxina estructuralmente modificada. La potenciación de la persistencia biológica puede deberse al menos en parte a un aumento en la actividad y/o semivida biológica de la neurotoxina estructuralmente modificada.

Además según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas que comprenden un componente que potencia la persistencia biológica, en las que el componente que potencia la persistencia biológica puede comprender un motivo a base de leucina. El motivo a base de leucina puede comprender una serie de 7 aminoácidos, en la que un quinteto de aminoácidos y un doblete de aminoácidos pueden comprender el motivo a base de leucina. El quinteto de aminoácidos puede definir el extremo amino-terminal del motivo a base de leucina. El doblete de aminoácidos puede definir el extremo carboxilo-terminal del motivo a base de leucina. Se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que el quinteto de aminoácidos puede comprender uno o más aminoácidos ácidos. Por ejemplo, el aminoácido ácido puede ser glutamato o aspartato. El quinteto de aminoácidos puede comprender un aminoácido que contiene hidroxilo. El aminoácido que contiene hidroxilo puede ser, por ejemplo, una serina, una treonina o una tirosina. Este aminoácido que contiene hidroxilo puede estar fosforilado. Al menos un aminoácido comprendido en el doblete de aminoácidos puede ser una leucina, isoleucina, metionina, alanina, fenilalanina, triptófano, valina o tirosina. Además, el doblete de aminoácidos en el motivo a base de leucina puede ser leucina-leucina, leucina-isoleucina, isoleucina-leucina o isoleucina-isoleucina, leucina-metionina. El motivo a base de leucina puede ser una secuencia de aminoácidos de fenilalanina-glutamato-fenilalanina-tirosina-lisina-leucina-leucina.

Además según la presente invención, la tercera región puede derivarse del serotipo A de toxina botulínica o de uno de los otros serotipos de toxina botulínica.

Aun además según la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas en las que puede reducirse la persistencia biológica de la neurotoxina estructuralmente modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural. La persistencia biológica reducida puede deberse en parte a una semivida biológica disminuida y/o a una actividad biológica disminuida de la neurotoxina.

En una realización, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas, en las que la modificación estructural puede incluir un motivo a base de leucina con una mutación de uno o más aminoácidos que comprende(n) el motivo a base de leucina. La mutación puede ser una deleción o sustitución de uno o más aminoácidos del motivo a base de leucina.

En una realización de la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas, en las que las regiones primera, segunda y/o tercera de las neurotoxinas estructuralmente modificadas pueden producirse mediante metodologías de ADN recombinante, es decir, producirse de manera recombinante.

En otra realización de la presente invención, se proporcionan neurotoxinas estructuralmente modificadas, en las que la región primera, segunda y/o tercera de la neurotoxina se aísla de una neurotoxina clostridial que existe en la naturaleza.

Otra realización de la presente invención proporciona una neurotoxina modificada que comprende una toxina botulínica (tal como una toxina botulínica tipo A) que incluye una modificación estructural que es eficaz para alterar una persistencia biológica de la neurotoxina modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural. La modificación estructural puede comprender una deleción de los aminoácidos 416 a 437 de una cadena ligera de la neurotoxina (figura 3).

Aun además según la presente invención, se proporciona una toxina botulínica modificada, tal como una toxina botulínica tipo A modificada, que incluye una modificación estructural eficaz para alterar una persistencia biológica de la neurotoxina modificada con respecto a una neurotoxina idéntica sin dicha modificación estructural. La modificación estructural puede comprender una sustitución de leucina en la posición 427 por una alanina y una sustitución de leucina en la posición 428 por una alanina en una cadena ligera de dicha neurotoxina (figura 3).

Adicionalmente, el alcance de la presente invención también incluye procedimientos para potenciar la persistencia biológica y/o para potenciar la actividad biológica de una neurotoxina. En estos procedimientos, puede fusionarse o añadirse una modificación estructural a la neurotoxina, por ejemplo, la modificación estructural puede ser un componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica. La modificación estructural que puede fusionarse o añadirse a la neurotoxina es un motivo a base de leucina.

También según la presente invención, se proporcionan procedimientos para reducir la persistencia biológica y/o para reducir la actividad biológica de una neurotoxina. Estos procedimientos pueden comprender una etapa de mutar un aminoácido de la neurotoxina. Por ejemplo, puede mutarse un aminoácido de un motivo a base de leucina dentro de la neurotoxina. Estas mutaciones pueden ser, por ejemplo, deleciones de aminoácidos o sustituciones de
aminoácidos.

La presente invención también incluye procedimientos para tratar una afección. Los procedimientos pueden comprender una etapa de administrar una dosis eficaz de una neurotoxina estructuralmente modificada a un mamífero para tratar una afección. La neurotoxina estructuralmente modificada puede incluir una modificación estructural. La modificación estructural es eficaz para alterar la persistencia biológica y/o la actividad biológica de la neurotoxina. Estos procedimientos para tratar una afección pueden utilizar una neurotoxina que no comprende un motivo a base de leucina. También, estos procedimientos para tratar una afección pueden utilizar una neurotoxina, que incluye un componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica. El componente que potencia la actividad o persistencia biológica es un motivo a base de leucina. La afección tratada puede ser un trastorno neuromuscular, un trastorno neurovegetativo o dolor. El tratamiento de un trastorno neuromuscular puede comprender una etapa de administrar localmente una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a un músculo o a un grupo de músculos. Un procedimiento para tratar un trastorno neurovegetativo puede comprender una etapa de administrar localmente una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a una glándula o glándulas. Un procedimiento para tratar el dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada al sitio del dolor. Además, el tratamiento de dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a la médula espinal.

Aun además según la presente invención, se proporcionan procedimientos para tratar con neurotoxinas modificadas afecciones que incluyen disfonía espasmódica, distonía laríngea, disfonía bucomandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismus, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, dolor de espasmos musculares, cefalea, surcos de la frente y arrugas de la piel.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la ubicación de GFP-cadena ligera de toxina botulínica A en células PC12 vivas diferenciadas por el FCN (factor de crecimiento nervioso) visualizadas en un microscopio invertido de fluorescencia.

La figura 2 muestra la ubicación de GFP-cadena ligera de toxina botulínica A truncada en células PC12 vivas diferenciadas por FCN visualizadas en un microscopio invertido de fluorescencia.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos para la cadena de toxina botulínica tipo A. La secuencia de aminoácidos mostrada, menos los aminoácidos subrayados representa la cadena ligera truncada de toxina botulínica tipo A.

La figura 4 muestra la ubicación de GFP-cadena ligera de toxina botulínica A con una mutación de LL a AA en la posición 427 y 428 en células PC12 vivas diferenciadas por FCN visualizadas en un microscopio invertido de fluorescencia.

La figura 5 muestra la ubicación de anti-SNAP-25 marcado fluorescentemente visualizado en secciones confocales horizontales de células PC12 diferenciadas por estaurosporina.

La figura 6 muestra una estructura cristalográfica de rayos X de la toxina botulínica tipo A.

La figura 7 muestra la ubicación de GFP-cadena ligera de neurotoxina botulínica tipo B en células PC12 vivas diferenciadas por FCN visualizadas en un microscopio invertido de fluorescencia.

La figura 8 muestra la alineación de secuencia y la secuencia consenso para la cadena ligera de toxina botulínica tipo A HallA y cadena ligera de toxina botulínica tipo B Danesa I.

La figura 9 es un gráfico que ilustra los resultados de un ensayo ELISA in vitro llevado a cabo por los inventores que demuestra que una LC/A truncada in vitro rompe el sustrato a una tasa menor o de manera menos eficaz de lo que lo hace LC/A no truncada.

La figura 10 muestra una comparación de constructos de LC/A expresados en E. coli para análisis in vitro.

Descripción detallada

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la persistencia biológica y/o la actividad biológica de una neurotoxina puede alterarse modificando estructuralmente la neurotoxina. En otras palabras, puede formarse una neurotoxina modificada con una persistencia biológica y/o actividad biológica alterada a partir de una neurotoxina que contiene o incluye una modificación estructural. En una realización, la modificación estructural incluye fusionar un componente que potencia la persistencia biológica a la estructura primaria de una neurotoxina para potenciar su persistencia biológica. El componente que potencia la persistencia biológica es un motivo a base de leucina. Incluso más preferiblemente, la semivida biológica y/o la actividad biológica de la neurotoxina modificada se potencia aproximadamente en un 100%. En general, la neurotoxina modificada tiene una persistencia biológica aproximadamente del 20% al 300% más que una neurotoxina idéntica sin la modificación estructural. Es decir, por ejemplo, la neurotoxina modificada que incluye el componente que potencia la persistencia biológica puede producir una inhibición sustancial de la liberación de neurotransmisor por ejemplo, acetilcolina de un nervio terminal durante aproximadamente del 20% a aproximadamente el 300% más de tiempo que una neurotoxina que no está modificada.

La presente invención también incluye dentro de su alcance una neurotoxina modificada con una actividad biológica alterada en comparación con la actividad biológica de la neurotoxina nativa o no modificada. Por ejemplo, la neurotoxina modificada puede mostrar una inhibición de exocitosis reducida o potenciada (tal como la exocitosis de un neurotransmisor) de una célula diana con o sin ninguna alteración en la persistencia biológica de la neurotoxina modificada.

Según la presente invención una serie de siete aminoácidos es un motivo a base de leucina. La serie está organizada en dos grupos. Los primeros cinco aminoácidos empezando desde el extremo amino-terminal del motivo a base de leucina de forman un "quinteto de aminoácidos". Los dos aminoácidos que siguen inmediatamente al quinteto de aminoácidos forman un "doblete de aminoácidos". En una realización preferida, el doblete de aminoácidos está ubicado en la región carboxilo-terminal del motivo a base de leucina. En otra realización preferida, el quinteto de aminoácidos incluye al menos un aminoácido ácido seleccionado de un grupo constituido por un glutamato y un aspartato.

El doblete de aminoácidos incluye al menos un aminoácido hidrófobo, por ejemplo leucina, isoleucina, metionina, alanina, fenilalanina, triptófano, valina o tirosina. Preferiblemente, el doblete de aminoácidos es leucina-leucina, leucina-isoleucina, isoleucina-leucina o isoleucina-isoleucina, leucina-metionina. Incluso más preferiblemente, el doblete es leucina-leucina. En una realización, el motivo a base de leucina es xDxxxLL (SEC ID NO: 1), en el que x puede ser cualquier aminoácido. En otra realización, el motivo a base de leucina es xExxxLL (SEC ID NO: 2), en el que E es ácido glutámico. En otra realización, el doblete de aminoácidos puede incluir una isoleucina o una metionina, formando xDxxxLI (SEC ID NO: 3) o xExxxLM (SEC ID NO: 4), respectivamente. Adicionalmente, el ácido aspártico, D, puede sustituirse por un ácido glutámico, E, formando xExxxLI (SEC ID NO: 5), xExxxIL (SEC ID NO: 21) y xExxxLM (SEC ID NO: 6). En una realización preferida, el motivo a base de leucina es fenilalanina-glutamato-fenilalanina-tirosina-lisina-leucina-leucina, SEC ID NO: 7.

En otra realización, el quinteto de aminoácidos comprende al menos un aminoácido que contiene hidroxilo, por ejemplo, una serina, una treonina o una tirosina. Preferiblemente, el aminoácido que contiene hidroxilo puede estar fosforilado. Más preferiblemente, el aminoácido que contiene hidroxilo es una serina que puede estar fosforilada permitiendo la unión de proteínas adaptadoras.

Aunque se proporcionan como ejemplos aminoácidos no modificados, también se contempla que un aminoácido modificado está dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, el motivo a base de leucina puede incluir una leucina halogenada, preferiblemente, fluorada.

Se encuentran diversos motivos a base de leucina en diversas especies. En la tabla 1 se muestra una lista de posibles motivos a base de leucina derivados de las diversas especies que pueden usarse según esta invención. No se pretende que esta lista sea limitante.

TABLA 1

1

VMAT es el transportador vesicular de monoamina; VACht es el transportador vesicular de acetilcolina y Vam3p de S. cerevisiae es un homólogo de levadura de sinaptobrevina. Los residuos de serina en cursiva son posibles sitios de fosforilación.

La neurotoxina modificada puede formarse a partir de cualquier neurotoxina. Además, la neurotoxina modificada puede formarse a partir de un fragmento de una neurotoxina, por ejemplo, una toxina botulínica eliminando una parte de la cadena ligera y/o cadena pesada. Preferiblemente, la neurotoxina utilizada es una neurotoxina clostridial. Una neurotoxina clostridial comprende un polipéptido que tiene tres regiones de secuencia de aminoácidos. La primera región de secuencia de aminoácidos puede incluir un resto de unión a célula diana (es decir una neurona) que se deriva de manera sustancialmente completa de una neurotoxina seleccionada de un grupo constituido por toxina de beratti; toxina de butyricum; toxina tetánica; toxina botulínica tipo A, B, C_{1}, D, E, F y G. Preferiblemente, la primera región de secuencia de aminoácidos se deriva de la región carboxilo-terminal de una cadena pesada de toxina, H_{C}. Además, la primera región de secuencia de aminoácidos puede comprender un resto de transporte dirigido que puede comprender una molécula (tal como una secuencia de aminoácidos) que puede unirse a un receptor, tal como una proteína de superficie celular u otro componente biológico en una célula diana.

La segunda región de secuencia de aminoácidos es eficaz para trasladar el polipéptido o una parte del mismo a través de una membrana endosómica al citoplasma de una neurona. En una realización, la segunda región de secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende una amina terminal de una cadena pesada, H_{N}, derivada de una neurotoxina seleccionada de un grupo constituido por toxina de beratti; toxina de butyricum; toxina tetánica; toxina botulínica tipo A, B, C_{1}, D, E, F y G.

La tercera región de secuencia de aminoácidos tiene actividad terapéutica cuando se libera en el citoplasma de una célula diana, tal como una neurona. En una realización, la tercera región de secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende una cadena ligera de toxina, L, derivada de una neurotoxina seleccionada de un grupo constituido por toxina de beratti; toxina de butyricum; toxina tetánica; toxina botulínica tipo A, B, C_{1}, D, E, F y G.

La neurotoxina clostridial puede ser una neurotoxina híbrida. Por ejemplo, cada una de las regiones de secuencia de aminoácidos de la neurotoxina puede derivarse de un serotipo diferente de neurotoxina clostridial. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido comprende una primera región de secuencia de aminoácidos derivada de la H_{C} de la toxina tetánica, una segunda región de secuencia de aminoácidos derivada de la H_{N} de toxina botulínica tipo B, y una tercera región de secuencia de aminoácidos derivada de la cadena ligera del serotipo E de toxina botulínica. Todas las demás combinaciones posibles están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Como alternativa, las tres regiones de secuencia de aminoácidos de la neurotoxina clostridial pueden se de la misma especie y del mismo serotipo. Si las tres regiones de secuencia de aminoácidos de la neurotoxina son de igual especie y serotipo de neurotoxina clostridial, la neurotoxina se denomina con el nombre de la especie y del serotipo. Por ejemplo, un polipéptido de neurotoxina puede tener sus regiones de secuencia de aminoácidos primera, segunda y tercera, derivadas de toxina botulínica tipo E. En este caso, la neurotoxina se denomina toxina botulínica tipo E.

Adicionalmente, puede modificarse cada una de las tres regiones de secuencia de aminoácidos a partir de la secuencia que se produce en la naturaleza de la que se derivan. Por ejemplo, la región de secuencia de aminoácidos puede tener al menos uno o más aminoácidos añadidos o delecionados en comparación con la secuencia que se produce en la naturaleza.

Puede fusionarse un motivo a base de leucina con cualquier de las neurotoxinas descritas anteriormente formando una neurotoxina modificada con una persistencia biológica potenciada y/o una actividad biológica potenciada. "Fusión" según se usa en el contexto de esta invención incluye añadir covalentemente a, o insertar covalentemente dentro de, una estructura primaria de una neurotoxina. Por ejemplo, puede añadirse un componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica a una neurotoxina clostridial que no tiene un motivo a base de leucina en su estructura primaria. En una realización, se fusiona un motivo a base de leucina con una neurotoxina híbrida, en la que la tercera secuencia de aminoácidos se deriva de toxina botulínica serotipo A, B, C_{1}, C_{2}, D, E, F o G. En otra realización, se fusiona el motivo a base de leucina con una toxina botulínica tipo E.

En otra realización, se añade un componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica a una neurotoxina alterando una secuencia de ADN clonado que codifica la neurotoxina. Por ejemplo, se añade una secuencia de ADN que codifica un componente que potencia la persistencia biológica según la presente invención y/o un componente que potencia la actividad biológica según la presente invención a una secuencia de ADN clonado que codifica la neurotoxina en la que va a añadirse el componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica. Esto puede realizarse de varios modos que son familiares para un biólogo molecular experto. Por ejemplo, pueden usarse mutagénesis dirigida o clonación por PCR para producir el cambio deseado en la secuencia de ADN que codifica la neurotoxina. Entonces puede volver a introducirse la secuencia de ADN en una cepa huésped nativa. En el caso de las toxinas botulínicas, la cepa huésped nativa será una cepa de Clostridium botulinum. Preferiblemente, esta cepa huésped carecerá del gen de toxina botulínica nativa. En un procedimiento alternativo, puede introducirse el ADN alterado en un sistema de huésped heterólogo tal como E. coli u otras líneas celulares de procariotas, levadura, insectos o líneas celulares de mamífero. Una vez se ha introducido el ADN alterado en su huésped, la toxina recombinante que contiene el componente añadido que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica puede producirse mediante, por ejemplo, metodologías de fermentación convencionales.

De manera similar, puede eliminarse de una neurotoxina un componente que potencia la persistencia biológica. Por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida para eliminar los componentes que potencian la persistencia biológica, por ejemplo, un motivo a base de leucina.

Se encuentran técnicas convencionales de biología molecular, que pueden usarse para llevar a cabo estas y otras manipulaciones genéticas, en Sambrook et al. (1989) que se incorpora en su totalidad al presente documento por referencia.

En una realización, el motivo a base de leucina se fusiona con, o se añade a, la tercera región de secuencia de aminoácidos de la neurotoxina. En una realización preferida, el motivo a base de leucina se fusiona, o se añade, a la región hacia el extremo carboxílico terminal de la tercera región de secuencia de aminoácidos. More preferiblemente, el motivo a base de leucina se fusiona, o se añade, al extremo carboxílico terminal de la tercera región de una neurotoxina. Incluso más preferiblemente, el motivo a base de leucina se fusiona, o se añade, al extremo carboxílico terminal de la tercera región de la toxina botulínica tipo E. La tercera secuencia de aminoácidos a la que se fusiona o se añade el motivo a base de leucina puede ser un componente de una neurotoxina modificada híbrida o quimérica. Por ejemplo, el motivo a base de leucina puede fusionarse, o añadirse, a la tercera región de secuencia de aminoácidos (o una parte de la misma) de un tipo de toxina botulínica (es decir una toxina botulínica tipo A), en la que el motivo a base de leucina-tercera región de secuencia de aminoácidos se ha fusionado o conjugado a su vez con las regiones de secuencia de aminoácidos primera y segunda de otro tipo (o tipos) de una toxina botulínica (tal como toxina botulínica tipo
B y/o E).

En otra realización, una modificación estructural de una neurotoxina que tiene un componente que potencia la persistencia biológica y/o un componente que potencia la actividad biológica preexistente, por ejemplo, un motivo a base de leucina, incluye delecionar o sustituir uno o más aminoácidos del motivo a base de leucina. Además, una neurotoxina modificada incluye una modificación estructural que da como resultado una neurotoxina con uno o más aminoácidos delecionados o sustituidos en el motivo a base de leucina. La eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos del motivo a base de leucina preexistente es eficaz para reducir la persistencia biológica y/o una actividad biológica de una neurotoxina modificada. Por ejemplo, la deleción o sustitución de uno o más aminoácidos del motivo a base de leucina de la toxina botulínica tipo A reduce la semivida biológica y/o la actividad biológica de la neurotoxina modificada.

Los aminoácidos que pueden sustituirse por aminoácidos contenidos en un componente que potencia la persistencia biológica incluyen alanina, asparagina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, tirosina y otros aminoácidos que se producen en la naturaleza así como aminoácidos no convencionales.

En la presente invención se ha demostrado que la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A nativa se ubica en las membranas de células PC12 diferenciadas en un patrón característico. Se demuestra que los componentes que potencian la persistencia biológica contribuyen sustancialmente a esta ubicación.

Los datos de la presente invención demuestran que cuando la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A está truncada o cuando el motivo a base de leucina está mutado, la cadena ligera pierde sustancialmente su capacidad para ubicarse en la membrana en su patrón característico. Se cree que la ubicación en la membrana celular es un factor clave para determinar la persistencia biológica y/o la actividad biológica de una toxina botulínica. Esto se debe a que la ubicación en una membrana celular puede proteger a la proteína ubicada de la degradación de proteínas intercelulares.

Las figuras 1 y 2 muestran que la deleción del motivo a base de leucina de la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A puede cambiar la ubicación en la membrana de la cadena ligera de tipo A. La figura 1 muestra la ubicación de la proteína de fusión de GFP-cadena ligera A en células PC12 diferenciadas. Las proteínas de fusión de GFP se produjeron y visualizaron en células PC12 diferenciadas usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, según lo descrito en Galli et al (1998) Mol Biol Cell 9:1437-1448, incorporado en su totalidad al presente documento por referencia; también, por ejemplo, según lo descrito en Martinez-Arca et al (2000) J Cell Biol 149:889-899, también incorporado en su totalidad al presente documento por referencia. En la figura 2 se muestra la ubicación de una GFP-cadena ligera A truncada. Comparando las figuras 1 y 2, puede observarse que se altera completamente el patrón de ubicación mediante la deleción del extremo N-terminal y extremo C-terminal que comprende el motivo a base de leucina. La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A. Las secuencias de aminoácidos subrayadas indican los aminoácidos que se delecionaron en el mutante truncado. El motivo a base de leucina está indicado mediante el corchete con asterisco.

Se han realizado otros estudios en la presente invención para analizar el efecto de las sustituciones de aminoácidos específicos dentro del motivo a base de leucina. Por ejemplo, en un estudio se sustituyeron los dos residuos de leucina contenidos en el motivo a base de leucina por residuos de alanina. La figura 4 muestra la imagen fluorescente de las células PC12 diferenciadas transfectadas con ADN que codifica esta GFP-cadena ligera de la toxina botulínica A con di-leucina sustituida por di-alanina. Tal como puede observarse, la sustitución de leucina por alanina en las posiciones 427 y 428 en la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A cambia sustancialmente la ubicación característica de la cadena ligera.

Dentro del alcance de esta invención se encuentra que puede usarse un motivo a base de leucina para proteger también la cadena pesada. Un cinturón helicoidal aleatorio se extiende desde el domino de translocación de la toxina botulínica tipo A y rodea a la cadena ligera. Es posible que este cinturón mantenga las dos subunidades próximas entre sí dentro de la célula mientras que la cadena ligera esté ubicada en la membrana celular. En la figura 6 se muestra la estructura de la toxina botulínica tipo A nativa.

Además, los datos de la presente invención muestran que el motivo a base de leucina puede ser valioso para ubicar la toxina botulínica A próxima al sustrato SNAP-25 dentro de la célula. Esto puede significar que el motivo a base de leucina es importante no sólo para determinar la semivida de la toxina, sino también para determinar la actividad de la toxina. Es decir, la toxina tendrá una actividad mayor si se mantiene próxima al sustrato SNAP-25 dentro de la célula. La figura 5 muestra la ubicación de SNAP-25 en secciones confocales horizontales de células PC12 diferenciadas (de Martinez-Arca et al (2000) J Cell Biol 149:889-899). Puede observarse similitud en el patrón de la ubicación cuando se compara la ubicación de la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A tal como se observa en la figura 1 con la ubicación de SNAP-25 observada en la figura 5.

Los datos de la presente invención muestran claramente el truncamiento de la cadena ligera, delecionando así el motivo a base de leucina, o la sustitución de aminoácidos en el motivo a base de leucina cambia sustancialmente la ubicación en la membrana de la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A en células nerviosas. Tanto en el truncamiento como en la sustitución un porcentaje de la cadena ligera alterada puede ubicarse en la membrana celular en un patrón distinto del de la cadena ligera tipo A nativa (véanse las figuras 1, 2 y 4). Estos datos sustentan la presencia de componentes que potencian la persistencia biológica distintos de un motivo a base de leucina tales como motivos de tirosina y derivados de aminoácidos.

En un aspecto amplio de la presente invención, se proporciona un procedimiento para tratar una afección usando una neurotoxina modificada. Las afecciones pueden incluir, por ejemplo, afecciones del músculo esquelético, afecciones del músculo liso, dolor y afecciones glandulares. La neurotoxina modificada también puede usarse para cosmética, por ejemplo, para tratar surcos de la frente.

Los trastornos neuromusculares y afecciones que pueden tratarse con una neurotoxina modificada incluyen: por ejemplo, disfonía espasmódica, distonía laríngea, distonía lingual y bucomandibular, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastornos del párpado, tortícolis espasmódica, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismus, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares pueden tratarse usando los presentes procedimientos de administración. Otros ejemplos de afecciones que pueden tratarse usando los presentes procedimientos y composiciones son lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva y secreciones gastrointestinales excesivas, así como otros trastornos secretores. Además, la presente invención puede usarse para tratar afecciones dermatológicas, por ejemplo, reducción de surcos de la frente, reducción de arrugas de la piel. La presente invención también puede usarse en el tratamiento de lesiones deportivas.

La patente estadounidense número 5.053.005 de Borodic da a conocer procedimientos para tratar la curvatura de la columna vertebral infantil, es decir, escoliosis, usando toxina botulínica tipo A. La descripción de Borodic se incorpora en su totalidad al presente documento por referencia. En una realización, usando procedimientos sustancialmente similares a los descritos por Borodic, puede administrarse una neurotoxina modificada a un mamífero, preferiblemente un ser humano, para tratar la curvatura de la columna vertebral. En una realización preferida, se administra una neurotoxina modificada que comprende toxina botulínica tipo E fusionada con un motivo a base de leucina. Incluso más preferiblemente, se administra una neurotoxina modificada que comprende toxina botulínica tipo A-E con un motivo a base de leucina fusionado al extremo carboxilo-terminal de su cadena ligera al mamífero, preferiblemente un ser humano, para tratar la curvatura de la columna vertebral.

Además, puede administrarse la neurotoxina modificada para tratar otros trastornos neuromusculares usando técnicas bien conocidas que se realizan comúnmente con toxina botulínica tipo A. Por ejemplo, puede usarse la presente invención para tratar el dolor, por ejemplo, cefalea, dolor de espasmos musculares y diversas formas de dolor inflamatorio. Por ejemplo, patente estadounidense número 5.721.215 de Aoki y patente estadounidense número 6.113.915 de Aoki dan a conocer procedimientos para usar la toxina botulínica tipo A para tratar el dolor. La descripción de estas dos patentes se incorpora en su totalidad al presente documento por referencia.

También pueden tratarse trastornos del sistema nervioso autónomo con una neurotoxina modificada. Por ejemplo, la disfunción glandular es un trastorno del sistema nervioso autónomo. La disfunción glandular incluye sudoración excesiva y salivación excesiva. La disfunción respiratoria es otro ejemplo de un trastorno del sistema nervioso autónomo. La disfunción respiratoria incluye enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma. Sanders et al. dan a conocer procedimientos para tratar el sistema nervioso autónomo; por ejemplo, tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como sudoración excesiva, salivación excesiva, asma, etc., usando toxinas botulínicas que existen en la naturaleza. La descripción de Sander et al. se incorpora en su totalidad por referencia al presente documento. En una realización pueden emplearse procedimientos sustancialmente similares a los de Sanders et al., pero usando una neurotoxina modificada, para tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como los referidos anteriormente. Por ejemplo, puede aplicarse localmente una neurotoxina modificada a la cavidad nasal del mamífero en una cantidad suficiente para degenerar neuronas colinérgicas del sistema nervioso autónomo que controlan la secreción mucosa en la cavidad nasal.

El dolor que puede tratarse mediante una neurotoxina modificada incluye dolor producido por tensión muscular, o espasmo, o dolor que no está asociado con espasmo muscular. Por ejemplo, Binder, en la patente estadounidense número 5.714.468 da a conocer que la cefalea producida por perturbaciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía pueden tratarse con una toxina botulínica que se produce en la naturaleza, por ejemplo toxina botulínica tipo A. Las descripciones de Binder se incorporan en su totalidad al presente documento por referencia. En una realización, pueden emplearse procedimientos sustancialmente similares a los de Binder, pero usando una neurotoxina modificada, para tratar cefaleas, especialmente aquéllas producidas por perturbaciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía. El dolor producido por espasmo muscular también puede tratarse mediante una administración de una neurotoxina modificada. Por ejemplo, una toxina botulínica tipo E fusionada con un motivo a base de leucina, preferiblemente en el extremo carboxilo-terminal de la cadena ligera de la toxina botulínica tipo E, puede administrarse por vía intramuscular en la ubicación del dolor/espasmo para aliviar el dolor.

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Además, puede administrarse una neurotoxina modificada a un mamífero para tratar el dolor que no está asociado con un trastorno muscular, tal como espasmo. En una realización amplia, los procedimientos de la presente invención para tratar el dolor no relacionado con espasmo incluyen la administración central o administración periférica de la neurotoxina modificada.

Por ejemplo, Foster et al. en la patente estadounidense número 5.989.545 da a conocer que una toxina botulínica conjugada con un resto de transporte dirigido puede administrarse de manera central (vía intratecal) para aliviar el dolor. Las descripciones de Foster et al. se incorporan en su totalidad por referencia al presente documento. En una realización, pueden emplearse procedimientos sustancialmente similares a los de Foster et al., pero usando la neurotoxina modificada según esta invención, para tratar el dolor. El dolor que va a tratarse puede ser un dolor agudo, o preferiblemente, dolor crónico.

También puede aliviarse un dolor agudo o crónico que no está asociado con un espasmo muscular con una administración local, periférica de la neurotoxina modificada en una ubicación de dolor real o percibido en el mamífero. En una realización, la neurotoxina modificada se administra por vía subcutánea en, o cerca de, la ubicación del dolor, por ejemplo, en, o cerca de, un corte. En otra realización, la neurotoxina modificada se administra por vía intramuscular en, o cerca de, la ubicación del dolor, por ejemplo, en, o cerca de, la ubicación de una contusión en el mamífero. En otra realización, la neurotoxina modificada se inyecta directamente en una articulación de un mamífero, para tratar o aliviar el dolor producido por afecciones artríticas. Además, la inyección o infusión repetida frecuente de la neurotoxina modificada en una ubicación de dolor periférico está dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, dados los efectos terapéuticos de larga duración de la presente invención, puede no ser necesaria una inyección o infusión frecuente de la neurotoxina. Por ejemplo, la puesta en práctica de la presente invención puede proporcionar un efecto analgésico, por inyección, durante 2 meses o más, por ejemplo 27 meses, en seres humanos.

Sin desear limitar la invención a ningún mecanismo o teoría de funcionamiento, se cree que cuando se administra localmente la neurotoxina modificada en una ubicación periférica, inhibe la liberación de neuro-sustancias, por ejemplo la sustancia P, a partir del terminal sensitivo primario periférico inhibiendo la exocitosis dependiente de SNARE. Debido a que la liberación de la sustancia P por el terminal sensitivo primario periférico puede producir o al menos aumentar el proceso de transmisión del dolor, la inhibición de su liberación en el terminal sensitivo primario periférico reducirá la llegada al cerebro de la transmisión de las señales de dolor.

Además de tener acciones farmacológicas en la ubicación periférica, la neurotoxina modificada de la presente invención también puede tener efectos inhibidores en el sistema nervioso central, tras la administración intratecal directa, tal como se expone en la patente estadounidense 6.113.915, o tras la administración periférica, en las que, presumiblemente, la toxina modificada actúa mediante el transporte retrógrado por medio de un aferente sensitivo primario. Esta hipótesis de transporte axonal retrógrado se sustenta mediante datos publicados que muestran que la toxina botulínica tipo A puede transportarse de manera retrógrada al asta posterior cuando la neurotoxina se inyecta de manera periférica. Así, el trabajo de Weigand et al, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, y Habermann, Nauny-Schmiedberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56, mostró que la toxina botulínica puede ascender a la zona medular mediante transporte retrógrado. Como tal, puede esperarse que una neurotoxina modificada, por ejemplo toxina botulínica tipo A con uno o más aminoácidos mutados del motivo a base de leucina, inyectada en una ubicación periférica, por ejemplo por vía intramuscular, se transporte de manera retrógrada desde el terminal sensitivo primario periférico hasta una región central.

La cantidad de la neurotoxina modificada administrada puede variar ampliamente según el trastorno particular que se esté tratando, su gravedad y otras diversas variables del paciente, incluyendo tamaño, peso, edad y respuesta al tratamiento. Generalmente, la dosis de neurotoxina modificada que ha de administrarse variará con la edad, afección que presenta y peso del mamífero, preferiblemente un ser humano, que va a tratarse. También se considerará la potencia de la neurotoxina modificada.

Suponiendo una potencia (para una toxina botulínica tipo A) que es sustancialmente equivalente a DL_{50} = 2,730 U en un paciente humano y que una persona media pesa 75 kg, una dosis letal (para una toxina botulínica tipo A) sería aproximadamente 36 U/kg de una neurotoxina modificada. Por tanto, cuando se administra una neurotoxina modificada una DL_{50} de este tipo, será apropiado administrar menos de 36 U/kg de la neurotoxina modificada en sujetos humanos. Preferiblemente, se administran de aproximadamente 0,01 U/kg a 30 U/kg de la neurotoxina modificada. Más preferiblemente, se administran de aproximadamente 1 U/kg a aproximadamente 15 U/kg de la neurotoxina modificada. Incluso más preferiblemente, se administran de aproximadamente 5 U/kg a aproximadamente 10 U/kg de la neurotoxina modificada. Generalmente se administrará la neurotoxina modificada como una composición a una dosificación que es proporcionalmente equivalente a aproximadamente 2,5 cc/100 U. Los expertos en la técnica sabrán, o podrán establecer fácilmente, cómo ajustar estas dosificaciones para neurotoxinas de mayor o menor potencia. Se sabe que la toxina botulínica tipo B puede administrarse a un nivel aproximadamente cincuenta veces superior al usado para una toxina botulínica tipo A para un efecto terapéutico similar. Así, las cantidades de unidades expuestas anteriormente pueden multiplicarse por un factor de aproximadamente cincuenta para una toxina botulínica tipo B.

Aunque se proporcionan ejemplos de vías de administración y dosificaciones, la vía de administración y dosificación apropiadas se determinan generalmente según cada caso por el médico responsable del paciente. Tales determinaciones son de rutina para un experto en la técnica (véase por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14ª edición, publicado por McGraw Hill). Por ejemplo, la vía y la dosificación para la administración de una neurotoxina modificada según la presente invención descrita puede seleccionarse basándose en criterios tales como las características de solubilidad de la neurotoxina modificada elegida así como los tipos de trastornos que están tratándose.

La neurotoxina modificada puede producirse mediante unión química del motivo a base de leucina a una neurotoxina usando procedimientos químicos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse la toxina botulínica tipo E estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador, y luego recogiendo y purificando la mezcla fermentada según procedimientos conocidos.

También puede producirse la neurotoxina modificada mediante técnicas recombinantes. Se prefieren las técnicas recombinantes para producir una neurotoxina que tiene regiones de secuencia de aminoácidos de diferentes especies clostridiales o que tienen regiones de secuencia de aminoácidos modificadas. Además, se prefiere la técnica recombinante para producir la toxina botulínica tipo A con el motivo a base de leucina que se está modificando mediante deleción. La técnica incluye etapas de obtener materiales genéticos de fuentes naturales, o fuentes sintéticas, que tienen códigos para un resto de unión celular, una secuencia de aminoácidos eficaz para translocar la neurotoxina o una parte de la misma y una secuencia de aminoácidos que tiene actividad terapéutica cuando se libera en un citoplasma de una célula diana, preferiblemente una neurona. En una realización preferida, los materiales genéticos tienen códigos para el componente que potencia la persistencia biológica, preferiblemente el motivo a base de leucina, la H_{C}, la H_{N} y la cadena ligera de las neurotoxinas clostridiales y fragmentos de las mismas. Los constructos genéticos se incorporan a las células huésped para la amplificación fusionando en primer lugar los constructos genéticos con un vector de clonación, tal como fagos o plásmidos. Entonces se insertan los vectores de clonación en un huésped, por ejemplo, Clostridium sp., E. coli u otra línea celular de procariota, levadura, insecto, o líneas celulares de mamífero. Tras las expresiones de los genes recombinantes en células huésped, pueden aislarse las proteínas resultantes usando técnicas convencionales.

Existen muchas ventajas de producir estas neurotoxinas modificadas de manera recombinante. Por ejemplo, para formar una neurotoxina modificada, un fragmento de modificación, o componente debe estar unido o insertado en una neurotoxina. La producción de neurotoxina a partir de cultivos anaerobios de Clostridium es un proceso engorroso y que requiere mucho tiempo que incluye un protocolo de purificación en múltiples etapas que implica varias etapas de precipitación de proteína y cristalización prolongada y repetida de la toxina o bien varias fases de cromatografía en columna. De manera significativa, la alta toxicidad del producto establece que el procedimiento debe realizarse con una contención estricta (norma BL-3). Durante el proceso de fermentación, las neurotoxinas de cadena sencilla plegada se activan mediante las proteasas clostridiales endógenas mediante un proceso denominado hacer mellas para crear una cadena doble. Algunas veces, el proceso de hacer mellas implica la eliminación de aproximadamente 10 residuos de aminoácido de la cadena sencilla para crear la forma de cadena doble en la que las dos cadenas permanecen covalentemente unidas mediante el enlace disulfuro intracatenario.

La neurotoxina con mellas es mucho más activa que la forma sin mellas. La cantidad y ubicación precisa de las mellas varía con los serotipos de la bacteria que produce la toxina. Las diferencias en la activación de la neurotoxina de cadena sencilla, y por tanto, el rendimiento de la toxina con mellas, se deben a las variaciones en el serotipo y las cantidades de actividad proteolítica producida por una cepa dada. Por ejemplo, se activa más del 99% de neurotoxina de cadena sencilla de Clostridial botulinum serotipo A mediante la cepa Hall A de Clostridial botulinum, mientras que las cepas del serotipo B y E producen toxinas con menores cantidades de activación (del 0% al 75% dependiendo del tiempo de fermentación). Así, la alta toxicidad de la neurotoxina madura desempeña una parte importante en la fabricación comercial de neurotoxinas como agentes terapéuticos.

El grado de activación de las toxinas clostridiales modificadas mediante ingeniería genética, es, por tanto, una consideración importante para la fabricación de estos materiales. Sería una ventaja principal si neurotoxinas tales como la toxina botulínica y la toxina tetánica pudieran expresarse de manera recombinante, con un alto rendimiento en bacterias de rápido crecimiento (tales como células heterólogas de E. coli) como cadenas sencillas relativamente no tóxicas (o cadenas sencillas que tienen una actividad tóxica reducida) que fueran seguras, se aislaran fácilmente y se convirtieran de manera sencilla en la forma completamente activa.

Siendo la seguridad una preocupación primordial, el trabajo previo se ha concentrado en la expresión en E. coli y la purificación de cadenas ligera y H individuales de toxinas botulínica y tetánica; estas cadenas aisladas son, en sí mismas, no tóxicas; véase Li et al., Biochemistry 33:7014-7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34:15175-15181 (1995). Tras la producción por separado de estas cadenas peptídicas y en condiciones estrictamente controladas, pueden combinarse las cadenas ligera y H mediante unión de disulfuro oxidativa formando las cadenas dobles neuroparalíticas.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes proporcionan a los expertos en la técnica procedimientos preferidos específicos para tratar el dolor no relacionado con espasmos dentro del alcance de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Tratamiento de dolor asociado con trastorno muscular

Una mujer de 36 años de edad desafortunada tiene un historial de 15 años de enfermedad de la articulación temporomandibular y dolor crónico en los músculos masetero y temporal. Quince años antes de la evaluación ella observó un aumento de la inmovilidad de la mandíbula asociado con dolor y la apertura y cierre de la mandíbula y dolor ligero en cada lado de su cara. Originalmente se piensa que el lado izquierdo está peor que el derecho. Se le diagnostica que tiene disfunción de la articulación temporomandibular (TMJ) con subluxación de la articulación y se trata con meniscectomía, otoplastia quirúrgica y resección del cóndilo.

Continua teniendo dificultad para abrir y cerrar su mandíbula tras los procedimientos quirúrgicos y por esta razón, varios años más tarde, se realiza un procedimiento quirúrgico para sustituir las articulaciones protésicas en ambos lados. Tras el procedimiento quirúrgico siguen los espasmos progresivos y la desviación de la mandíbula. Se realiza otra revisión quirúrgica posterior a la intervención quirúrgica original para corregir el aflojamiento de la articulación protésica. La mandíbula continúa mostrando dolor e inmovilidad considerables tras estos procedimientos quirúrgicos. La TMJ sigue siendo sensible así como el propio músculo. Existen puntos sensibles sobre la articulación temporomandibular así como un aumento del tono en todo el músculo. Se le diagnostica que tiene síndrome de dolor miofascial postquirúrgico y se le inyecta la neurotoxina modificada en los músculos mesetero y temporal; la neurotoxina modificada es la toxina botulínica tipo E que comprende un motivo a base de leucina. La dosis particular así como la frecuencia de las administraciones dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente.

Varios días después de las inyecciones ella observó una mejora sustancial en su dolor e informa que su mandíbula parece más suelta. Esto mejora gradualmente a lo largo de un periodo de 2 a 3 semanas en el que ella observa una capacidad aumentada para abrir la mandíbula y un dolor en disminución. La paciente afirma que el dolor es mejor que en cualquier momento de los últimos 4 años. El estado mejorado continúa durante hasta 27 meses después de la inyección original de la neurotoxina modificada.

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Ejemplo 2 Tratamiento del dolor posterior a lesión de la médula espinal

Se trata a un paciente, de 39 años de edad, que experimenta dolor posterior a una lesión de la médula espinal, mediante administración intratecal, por ejemplo, mediante punción lumbar o mediante caterización (para infusión) en la médula espinal, con la neurotoxina modificada; la neurotoxina modificada es la toxina botulínica tipo E que comprende un motivo a base de leucina. La dosis de toxina y el sitio de inyección particulares, así como la frecuencia de las administraciones de toxina, dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente según lo expuesto anteriormente. En el plazo de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 días después de la administración de neurotoxina modificada, el dolor de la paciente se reduce sustancialmente. El alivio del dolor persiste durante hasta 27 meses.

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Ejemplo 3 Administración periférica de una neurotoxina modificada para tratar el "algodistrofia del miembro superior"

El dolor en el hombro, brazo y mano puede desarrollarse, con distrofia muscular, osteoporosis y fijación de articulaciones. Aunque es lo más común después de insuficiencia coronaria, este síndrome puede producirse con osteoartritis cervical o enfermedad del hombro localizada o después de cualquier enfermedad prolongada que requiere que el paciente permanezca en cama.

Una mujer de 46 años de edad presenta un dolor de tipo algodistrofia del miembro superior. El dolor se localiza particularmente en la región deltoidea. Se trata a la paciente mediante una inyección en bolo de una neurotoxina modificada por vía subcutánea en el hombro; preferiblemente la neurotoxina modificada es la toxina botulínica tipo E que comprende un motivo a base de leucina. La neurotoxina modificada también puede ser, por ejemplo, toxina botulínica modificada tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G que comprenden un motivo a base de leucina. La dosis particular así como la frecuencia de las administraciones dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente, según lo expuesto anteriormente. En el plazo de 1-7 días después de la administración de la neurotoxina modificada el dolor del paciente se alivia sustancialmente. La duración del alivio del dolor es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 27 meses.

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Ejemplo 4 Administración periférica de una neurotoxina modificada para tratar neuralgia postherpética

La neuralgia postherpética es uno de los problemas de dolor crónico más inextricables. Los pacientes que padecen este proceso terriblemente doloroso con frecuencia son ancianos, tienen una enfermedad debilitante y no son adecuados para los procedimientos de intervención mayor. El diagnóstico se realiza fácilmente mediante la aparición de las lesiones curadas de herpes y por el historial del paciente. El dolor es intenso y emocionalmente angustioso. La neuralgia postherpética puede producirse en cualquier sitio, pero lo más frecuente es en el tórax.

Un hombre de 76 años de edad presenta un dolor de tipo postherpético. El dolor está localizado en la región abdominal. Se trata al paciente con una inyección en bolo de una neurotoxina modificada por vía intradérmica en el abdomen; la neurotoxina modificada es, por ejemplo, toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F y/o G. La neurotoxina modificada comprende un motivo a base de leucina y/u otros motivos a base de tirosina. La dosis particular así como la frecuencia de la administración dependen de diversos factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente, según lo expuesto anteriormente. En el plazo de 1-7 días después de la administración de la neurotoxina modificada el dolor del paciente se alivia sustancialmente. La duración del alivio del dolor es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 27 meses.

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Ejemplo 5 Administración periférica de una neurotoxina modificada para tratar dolor de tumor nasofaríngeo

Estos tumores, lo más frecuente carcinomas de células escamosas, se encuentran normalmente en la fosa de Rosenmuller y pueden invadir la base del cráneo. El dolor en la cara es común. Es constante, de naturaleza de dolor sordo.

Un hombre de 35 años de edad presenta un dolor de tipo tumor nasofaríngeo. El dolor se encuentra en la mejilla inferior izquierda. Se trata al paciente con una inyección en bolo de una neurotoxina modificada por vía intramuscular en la mejilla, preferiblemente la neurotoxina modificada es la toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G que comprende derivados adicionales de aminoácidos que potencian la persistencia biológica, por ejemplo, fosforilaciones de tirosina. La dosis particular así como la frecuencia de las administraciones dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente. En el plazo de 1-7 días después de la administración de la neurotoxina modificada el dolor del paciente se alivia sustancialmente. La duración del alivio del dolor es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 27 meses.

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Ejemplo 6 Administración periférica de una neurotoxina modificada para tratar dolor inflamatorio

Un paciente, de 45 años de edad, presenta un dolor inflamatorio en la región del pecho. Se trata al paciente con una inyección en bolo de una neurotoxina modificada por vía intramuscular en el pecho, preferiblemente la neurotoxina modificada es toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G que comprende motivos adicionales a base de tirosina. La dosis particular así como la frecuencia de las administraciones dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente, según lo expuesto anteriormente. En el plazo de 1-7 días después de la administración de la neurotoxina modificada el dolor del paciente se alivia sustancialmente. La duración del alivio del dolor es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 27 meses.

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Ejemplo 7 Tratamiento de sudoración excesiva

Se trata a un hombre, de 65 años de edad, con sudoración excesiva unilateral, mediante administración de una neurotoxina modificada. La dosis y la frecuencia de la administración dependen del grado del efecto deseado. Preferiblemente, la neurotoxina modificada es toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F y/o G. Las neurotoxinas modificadas comprenden un motivo a base de leucina. La administración es en el plexo de nervio glandular, ganglio nervioso, médula espinal o sistema nervioso central. El sitio específico de administración ha de determinarse mediante el conocimiento del médico de la anatomía y fisiología de las glándulas diana y las células secretoras. Además, puede inyectarse con la toxina la zona del cerebro o nivel de la médula espinal apropiada. El cese de sudoración excesiva después del tratamiento con la neurotoxina modificada es de hasta 27 meses.

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Ejemplo 8 Tratamientos postquirúrgicos

Una mujer, de 22 años de edad, presenta un tendón del hombro roto y se somete a intervención quirúrgica ortopédica para reparar el tendón. Después de la intervención quirúrgica, se le administra al paciente por vía intramuscular una neurotoxina modificada en el hombro. La neurotoxina modificada puede ser toxina botulínica tipo A, B, C, D, E, F y/o G en las que uno o más aminoácidos de un componente que potencia la persistencia biológica se delecionan de la toxina. Por ejemplo, uno o más residuos de leucina puede(n) delecionarse de y/o mutarse en el motivo a base de leucina en la toxina botulínica serotipo A. Como alternativa, uno o más aminoácidos del motivo a base de leucina puede(n)
sustituirse por otros aminoácidos. Por ejemplo, las dos leucinas en el motivo a base de leucina pueden sustituirse por alaninas. La dosis particular así como la frecuencia de las administraciones dependen de una variedad de factores dentro del conocimiento del médico responsable del paciente. El sitio específico de administración ha de determinarse mediante el conocimiento del médico de la anatomía y fisiología de los músculos. La neurotoxina modificada administrada reduce el movimiento del brazo para facilitar la recuperación de la intervención quirúrgica. El efecto de la neurotoxina modificada es durante aproximadamente cinco semanas o menos.

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Ejemplo 9 Clonación, expresión y purificación del gen de cadena ligera de neurotoxina botulínica

Este ejemplo describe procedimientos para clonar y expresar una secuencia de nucleótidos de ADN que codifica una cadena ligera de toxina botulínica y purificar el producto proteico resultante. Puede amplificarse una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de toxina botulínica mediante protocolos de PCR que emplean oligonucleótidos sintéticos que tienen secuencias correspondientes a las regiones de extremo 5' y 3' del gen de cadena ligera. El diseño de los cebadores puede permitir la introducción de sitios de restricción, por ejemplo, sitios de restricción Stu I y EcoR I en los extremos 5' y 3' del producto de PCR del gen de cadena ligera de toxina botulínica. Estos sitios de restricción pueden usarse posteriormente para facilitar la subclonación unidireccional de los productos de la amplificación. Adicionalmente, estos cebadores pueden introducir un codón de parada en el extremo C-terminal de la secuencia que codifica la cadena ligera. El ADN cromosómico de C. botulinum, por ejemplo, la cepa HallA, puede servir como un molde en la reacción de amplificación.

La amplificación por PCR puede realizarse en un volumen de 0,1 ml que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 50 pmol de cada cebador, 200 ng de ADN genómico y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. La mezcla de reacción puede someterse a 35 ciclos de desnaturalización (1 minuto a 94ºC), apareamiento (2 minutos a 55ºC) y polimerización (2 minutos a 72ºC). Finalmente, la reacción puede prolongarse durante otros 5 minutos a 72ºC.

El producto de amplificación por PCR puede digerirse con, por ejemplo, Stu I y EcoR I, para liberar el fragmento de ADN de PCR, clonado, que codifica la cadena ligera. Entonces, este fragmento puede purificarse mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa, y ligarse en, por ejemplo un fagémido pBluescript II SK digerido con Sma I y EcoR I. Pueden identificarse transformantes bacterianos, por ejemplo, E coli, que alberga este fagémido recombinante, mediante procedimientos convencionales, tales como la selección blanco/azul. Pueden identificarse los clones que comprenden el ADN que codifica la cadena ligera mediante análisis de secuencia de ADN por procedimientos convencionales. Pueden confirmarse las secuencias clonadas mediante comparación de las secuencias clonadas con las secuencias publicadas para las cadenas ligeras de toxina botulínica, por ejemplo, Binz, et al., en J. Biol. Chem. 265, 9153 (1990), Thompson et al., en Eur. J. Biochem. 189, 73 (1990) y Minton, Clostridials Neurotoxins, The Molecular Pathogenesis of Tetanus and Botulism pág. 161-191, editado por C. Motecucco (1995).

La cadena ligera puede subclonarse en un vector de expresión, por ejemplo, pMal-P2. pMal-P2 alberga el gen malE que codifica MBP (proteína de unión a maltosa) que se controla mediante un promotor fuertemente inducible, P_{tac}.

Para verificar la expresión de la cadena ligera de toxina botulínica, puede usarse una colonia bacteriana bien aislada que alberga al gen de cadena ligera que contiene pMal-P2 para inocular caldo L que contiene 0,1 mg/ml de ampicilina y glucosa al 2% (p/v), y se hace crecer durante la noche con agitación a 30ºC. Los cultivos obtenidos durante la noche pueden diluirse 1:10 en caldo L recién preparado que contiene 0,1 mg/ml de ampicilina y se incuban durante 2 horas. Puede inducirse la expresión de la proteína de fusión mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM. Después de otra incubación de 4 horas a 30ºC, pueden recogerse las bacterias mediante centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos.

Un análisis de SDS-PAGE a pequeña escala puede confirmar la presencia de una banda proteica de 90 kDa en las muestras derivadas de bacterias inducidas por IPTG. Este MW concordaría con el tamaño predicho de una proteína de fusión que tiene MBP (\sim 40 kDa) y componentes de la cadena ligera de toxina botulínica (\sim 50 kDa).

La presencia de las proteínas de fusión deseadas en extractos bacterianos inducidos por IPTG puede confirmarse mediante inmunotransferencia de tipo Western usando la sonda de cadena anti L policlonal descrita por Cenci di Bello et al., en Eur. J. Biochem. 219, 161 (1993). Pueden visualizarse bandas reactivas en las membranas de PVDF (Pharmacia; Milton Keynes, RU) usando una inmunoglobulina anti-conejo conjugada con la peroxidasa del rábano (BioRad; Hemel Hempstead, RU) y el sistema de detección ECL (Amersham, RU). Los resultados de la inmunotransferencia de tipo Western normalmente confirman la presencia de la proteína de fusión dominante junto a varias bandas apenas visibles que corresponden a las proteínas de MW inferior que la proteína de fusión de tamaño completo. Esta observación sugiere que la degradación limitada de la proteína de fusión se produjo en las bacterias o durante el procedimiento de aislamiento.

Para producir la cadena ligera subclonada, pueden resuspenderse sedimentos de cultivos de 1 litro de bacterias que expresan las proteínas de cadena ligera de neurotoxina botulínica de tipo natural en un tampón de columna [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 200 mM, EGTA 1 mM y DTT 1 mM] que contiene fluoruro de fenilmetansulfonilo 1 mM (PMSF) y benzamidina 10 mM, y lisarse mediante sonicación. Los lisados pueden clarificarse mediante centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes pueden aplicarse a una columna de afinidad de amilosa [2x10 cm, 30 ml de resina] (New England BioLabs; Hitchin, RU). Las proteínas que no se han unido pueden separarse por lavado de la resina con tampón de columna hasta que el eluato esté libre de proteína tal como se evalúa por una lectura de la absorbancia estable a 280 nm. La proteína de fusión de cadena MBP-L unida puede eluirse posteriormente con tampón de columna que contiene maltosa 10 mM. Pueden combinarse las fracciones que contienen la proteína de fusión y dializarse frente a Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) complementado con NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM y DTT 1 mM durante 72 horas a 4ºC.

Pueden purificarse las proteínas de fusión de cadena MBP-L después de la liberación de la bacteria huésped. La liberación de la bacteria puede realizarse mediante la degradación enzimática o la rotura mecánica de la membrana celular bacteriana. Puede usarse para la purificación la cromatografía de afinidad de amilosa. Pueden separarse las cadenas ligeras mutantes o de tipo natural recombinantes de los dominios de unión a azúcar de las proteínas de fusión mediante rotura específica del sitio con factor Xa. Este procedimiento de rotura da normalmente MBP libre, cadenas ligeras libres y una pequeña cantidad de proteína de fusión sin rotura. Aunque puede demostrarse que las cadenas ligeras resultantes presentes en tales mezclas tienen las actividades deseadas, puede emplearse una etapa de purificación adicional. Por ejemplo, la mezcla de productos de rotura puede aplicarse a una segunda columna de afinidad de amilosa que se une tanto a MBP como a la proteína de fusión sin rotura. Pueden aislarse las cadenas ligeras libres en la fracción a través del flujo.

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Ejemplo 10 Reconstitución de la cadena ligera nativa, la cadena ligera de tipo natural recombinante con la cadena pesada purificada

Las cadenas ligera y pesada nativas pueden disociarse de BoNT con urea 2 M, reducirse con DTT 100 mM y luego purificarse según los procedimientos cromatográficos establecidos. Por ejemplo, Kozaki et al. (1981, Japan J. Med. Sci. Biol. 34, 61) y Maisey et al. (1988, Eur. J. Biochem. 177, 683). Puede combinarse una cadena pesada purificada con una cantidad equimolar de la cadena ligera nativa o bien la cadena ligera recombinante. Puede llevarse a cabo la reconstitución dializando las muestras frente a un tampón que está constituido por Tris 25 mM (pH 8,0), acetato de cinc 50 \muM y NaCl 150 mM durante 4 días a 4ºC. Tras la diálisis, se controla la asociación de la cadena ligera recombinante y la cadena pesada nativa para formar cadenas dobles de 150 kDa unidas por disulfuros, mediante SDS-PAGE y/o se cuantifica mediante barrido densitométrico.

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Ejemplo 11 Producción de una neurotoxina modificada con una persistencia biológica potenciada

Puede producirse una neurotoxina modificada empleando técnicas recombinantes junto con técnicas químicas convencionales.

Puede producirse de manera recombinante una cadena de neurotoxina, por ejemplo una cadena ligera de toxina botulínica que va a unirse con un componente que potencia la persistencia biológica para formar una neurotoxina modificada y purificarse según lo descrito en el ejemplo 9.

La cadena de neurotoxina recombinante derivada de las técnicas recombinantes puede unirse de manera covalente con (o acoplarse a) un componente que potencia la persistencia biológica, por ejemplo un motivo a base de leucina, un motivo a base de tirosina y/o un derivado de aminoácido. Las secuencias peptídicas que comprenden los componentes que potencian la persistencia biológica pueden sintetizarse mediante tecnologías convencionales de t-Boc/Fmoc en disolución o fase sólida tal como los expertos en la técnica conocen. También están cubiertas las técnicas de síntesis similares por el alcance de esta invención, por ejemplo las metodologías empleadas en Milton et al. (1992, Biochemistry 31, 8799-8809) y Swain et al. (1993, Peptide Research 6, 147-154). Uno o más componentes que potencia(n) la persistencia biológica puede(n) unirse a la cadena ligera de toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G, por ejemplo, en el extremo carboxilo terminal de la toxina. La fusión de los componentes que potencian la persistencia biológica se consigue mediante acoplamiento químico usando reactivos y técnicas conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo la química de reactivo de Traut y PDPH/ EDAC.

Como alternativa, puede producirse de manera recombinante una neurotoxina modificada sin la etapa de fusión del componente que potencia la persistencia biológica con una cadena de toxina botulínica recombinante. Por ejemplo, puede producirse una cadena de neurotoxina recombinante, por ejemplo, una cadena ligera de toxina botulínica, derivada de las técnicas recombinantes del ejemplo 9 con un componente que potencia la persistencia biológica, por ejemplo un motivo a base de leucina, un motivo a base de tirosina y/o un derivado de aminoácido. Por ejemplo, puede(n)
añadirse una o más secuencia(s) de ADN que codifica(n) los componentes que potencian la persistencia biológica a la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G. Esta adición puede realizarse mediante diversos procedimientos utilizados para la mutagénesis dirigida que son familiares para los expertos en la técnica.

La cadena ligera modificada recombinante que contiene el componente que potencia la persistencia biológica añadido o fusionado puede reconstituirse con una cadena pesada de una neurotoxina mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 10, produciendo así una neurotoxina modificada completa.

Las neurotoxinas modificadas producidas según este ejemplo tienen una persistencia biológica potenciada. Preferiblemente, la persistencia biológica se potencia en aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 300% con respecto a una neurotoxina idéntica sin el/los otro(s) componente(s) que potencia(n) la persistencia biológica.

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Ejemplo 12 Producción de una neurotoxina modificada con una persistencia biológica reducida

Puede producirse una neurotoxina modificada con una persistencia biológica reducida empleando técnicas recombinantes. Por ejemplo, puede producirse una cadena ligera de toxina botulínica derivada de las técnicas recombinantes del ejemplo 9 sin un componente que potencia la persistencia biológica. Por ejemplo, puede(n) mutarse uno o más motivo(s) a base de leucina, motivo(s) a base de tirosina y/o derivados de aminoácido. Por ejemplo, puede(n) eliminarse una o más secuencia(s) de ADN que codifica(n) los componentes que potencian la persistencia biológica de la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de toxina botulínica tipo A, B, C1, C2, D, E, F o G. Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el motivo a base leucina puede eliminarse de la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de toxina botulínica tipo A. La eliminación de las secuencias de ADN puede realizarse mediante diversos procedimientos familiares para los expertos en la técnica.

Puede reconstituirse la cadena ligera modificada recombinante con el componente que potencia la persistencia biológica delecionado con una cadena pesada de una neurotoxina mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 10, produciéndose así una neurotoxina modificada completa.

La neurotoxina modificada producida según este ejemplo tiene una persistencia biológica reducida. Preferiblemente, la persistencia biológica se reduce en aproximadamente el 20% a aproximadamente el 300% con respecto a una neurotoxina idéntica, por ejemplo toxina botulínica tipo A, con el motivo a base de leucina.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con respecto a ciertos procedimientos preferidos, son posibles otras realizaciones, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse de manera eficaz una amplia variedad de neurotoxinas modificadas en los procedimientos de la presente invención en lugar de neurotoxinas clostridiales. También, los correspondientes códigos genéticos, es decir la secuencia de ADN, para las neurotoxinas modificadas se consideran también que son parte de esta invención. Adicionalmente, la presente invención incluye procedimientos de administración periférica en los que dos o más neurotoxinas modificadas, por ejemplo toxina botulínica tipo E con un motivo a base de leucina y toxina botulínica tipo B fusionado que comprende un motivo a base de leucina, se administran simultánea o consecutivamente. Aunque esta invención se ha descrito con respecto a diversos ejemplos y realizaciones específicos, ha de entenderse que la invención no se limita a ellos y que puede ponerse en práctica de manera diversa con el alcance de las siguientes reivindicaciones.

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Ejemplo 13 Producción de una neurotoxina modificada con una persistencia biológica reducida

La ubicación en la membrana celular es probablemente un factor clave para determinar la persistencia biológica de las toxinas botulínicas. Esto se debe a que la ubicación en una membrana celular puede proteger a la proteína ubicada de los complejos de degradación de proteínas intercelulares.

Se sabe bien y se acepta generalmente que la persistencia biológica de la neurotoxina botulínica tipo B es más corta que la persistencia biológica de la neurotoxina botulínica tipo A. En este trabajo, se demostró que cuando se trunca la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A, que comprende eliminar el motivo a base de leucina, la cadena ligera pierde sustancialmente su capacidad para ubicarse en la membrana celular en su patrón característico. De hecho, la cadena ligera de tipo A truncada se ubica en la membrana celular en un patrón similar al de la cadena ligera de toxina botulínica tipo B.

Por tanto, puede realizarse la hipótesis de que la toxina botulínica tipo A truncada tiene una persistencia biológica reducida y/o una actividad biológica reducida similares a las de la toxina botulínica tipo B.

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Ejemplo 14 Producción de una neurotoxina modificada con una persistencia biológica alterada

La ubicación en la membrana celular es probablemente un factor clave para determinar la persistencia biológica de las toxinas botulínicas. Esto se debe a que la ubicación en una membrana celular puede proteger a la proteína ubicada de los complejos de degradación de proteínas intercelulares.

En este trabajo, se demostró que cuando se muta la cadena ligera de la toxina botulínica tipo A, cambiando las dos leucinas en las posiciones 427 y 428 por alaninas (figura 3), la cadena ligera pierde sustancialmente su capacidad para ubicarse en la membrana celular en su patrón característico.

A partir de estos datos puede concluirse que la toxina botulínica tipo A mutada tiene una persistencia biológica alterada.

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Ejemplo 15 Rotura in vitro de SNAP 25 mediante LC/A truncada

Tal como se ilustra en la figura 9, los inventores llevaron a cabo un ensayo ELISA in vitro demostrando que una LC/A truncada rompe in vitro un sustrato SNAP-25 de manera menos eficaz de lo que lo hace la LC/A no truncada. Los datos presentados no son una medida de la inhibición de la exocitosis sino una medida de la formación in vitro de la rotura de SNAP-25. El ensayo se llevó a cabo tal como sigue:

Materiales

BirA-SNAP25_{128-206} - éste es un sustrato recombinante para LC/A, constituida por una secuencia señal BirA unida al extremo N-terminal de los residuos 128 - 206 de SNAP25. Se produjo este constructo de fusión en E. coli y se biotiniló la secuencia señal BirA por la E. coli. Se revistieron las placas de microtitulación con estreptavidina. La toxina utilizada era el complejo BoNT/A o constructos de LC/A. El anticuerpo primario era anticuerpo anti-SNAP25_{197}. Este anticuerpo reconoce el extremo C-terminal de SNAP25 tras la rotura mediante la toxina de tipo A (BirA-SNAP25_{128-197}). El anticuerpo secundario era IgG de cabra anti conejo conjugada con la peroxidasa del rábano. El sustrato ImmunoPure TMB era de Pierce, un sustrato colorimétrico para la peroxidasa del rábano. El anticuerpo que reconoce el producto SNAP25_{197} roto es específico para el producto roto y no reconoce el sustrato SNAP25_{206} sin rotura de longitud completa.

Procedimiento

se unió BirA-SNAP25_{120-206} a estreptavidina en una placa de microtitulación. Se añadieron a las placas diluciones en serie de complejo de BoNT/A de 900 kDa, His6-S-LC/A nativa, o His6-S-LC/A truncada-His6. Se incubaron previamente todas las muestras de toxina con DTT (este no se requiere para los constructos de LC/A, pero se trataron igual que el complejo BoNT/A). Se incubaron las muestras de toxina con el sustrato durante 90 minutos a 37ºC. Se eliminó la toxina y se incubó el sustrato unido con anticuerpo anti-SNAP25_{197}. Se separó por lavado el anticuerpo que no se había unido y entonces se incubaron las placas con el anticuerpo secundario (IgG anti-conejo conjugada con la peroxidasa del rábano). Se separó por lavado de nuevo el anticuerpo que no se había unido y se realizó un ensayo colorimétrico para determinar la peroxidasa del rábano. Se cuantificó el ensayo mediante la lectura de la absorbancia a 450 nm.

En otro trabajo de los inventores descrito en el presente documento, los constructos de cadena ligera que se expresaron en células PC-12, se expresaron directamente en células PC-12 y no contienen ninguna etiqueta. Los constructos de cadena ligera que se han expresado en E. coli para estos ensayos in vitro contienen etiquetas de afinidad para fines de purificación (estas etiquetas no están presentes en las proteínas expresadas en las células PC-12, según lo descrito en el presente documento). La LC/A expresada en PC12 era la proteína de fusión GFP-LC/A. Entre la GFP y la LC/A hay un conjunto de Gly para separar ambas proteínas.

Una explicación de los diversos constructos es la siguiente: complejo (rojo en el gráfico) es complejo BoNT/A de 900 kDa aislado de C. botulinum.

Constructo de LC/A truncada que carece de 8 aminoácidos en el extremo N-terminal y 22 aminoácidos en el extremo C-terminal. Sin embargo, este constructo contiene una 6-histidina y una etiqueta S en el extremo N-terminal así como una etiqueta 6-histidina en el extremo C-terminal.

LC/A truncada dializada, igual que LC/A truncada, pero se ha eliminado el imidazol resultante de la purificación.

Constructo de LC/A completa (verde oscuro en el gráfico), LC/A nativa (longitud completa), pero que contiene la etiqueta S y la 6-histidina en el extremo N-terminal. No tiene 6-histidina en el extremo C-terminal.

LC/A completa dializada (verde claro en el gráfico), igual que LC/A completa pero se ha eliminado el imidazol resultante de la purificación.

Para representar gráficamente estas diferencias, la figura 10 muestra el mismísimo extremo N-terminal y el mismísimo extremo C-terminal de estos constructos (la parte media de las proteínas de LC/A no se muestra). Lo que se denomina como tipo natural corresponde a la LC/A nativa que los inventores habían expresado directamente en las células PC-12 (este es el constructo con el que los inventores demostraron la actividad mediante el análisis de inmunotransferencia de tipo Western del producto SNAP25 roto). La LC/A truncada es la cadena ligera truncada que contiene las etiquetas His y S. N-His-LC/A es lo que se denominó como LC/A completa en la figura 9.

<110> STEWARD, LANCE E

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FERNANDEZ-SALAS, ESTER

\hskip1cm

HERRINGTON, TODD M

\hskip1cm

AOKI, KEI R

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<120> Motivo a base de leucina y neurotoxinas clostridiales

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<130> D-2885CIP

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<150> Documento US 09/620.840

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<151> 21-07-2000

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<160> 20

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(5)

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<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las de la secuencia a base de leucina

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x puede ser cualquier aminoácido o derivados de los mismos

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<400> 1

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\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Leu}

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<210> 2

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(5)

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<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

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x puede ser cualquier aminoácido o derivados de los mismos

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<400> 2

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\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Leu}

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<210> 3

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(5)

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<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

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<400> 3

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\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Ile}

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<210> 4

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(5)

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<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: este fragmento puede provenir de una fuente de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: Este fragmento puede provenir de una fuente de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Arg Ala Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Met Ala Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Arg Asp Val Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Thr Gln Val Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Val Gln Ala Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Lys Gln Asn Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pollo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Arg Gln Asn Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oveja

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Thr Gln Val Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium botulinum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 441

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium botulinum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> STEWARD, LANCE E

\hskip1cm

FERNANDEZ-SALAS, ESTER

\hskip1cm

HERRINGTON, TODD M

\hskip1cm

AOKI, KEI R

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Motivo a base de leucina y neurotoxinas clostridiales

\vskip0.400000\baselineskip

<130> D-2885CIP

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 09/620.840

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 21-07-2000

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las de la secuencia a base de leucina

\hskip1cm

x puede ser cualquier aminoácido o derivados de los mismos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\hskip1cm

x puede ser cualquier aminoácido o derivados de los mismos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: el fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares a las del motivo a base de leucina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: Este fragmento puede provenir de una fuente de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: Este fragmento puede provenir de una fuente de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Arg Ala Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Met Ala Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu Arg Asp Val Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Thr Gln Val Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Val Gln Ala Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Lys Gln Asn Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pollo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Arg Gln Asn Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oveja

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Thr Gln Val Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium botulinum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 441

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium botulinum

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 20

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11

12

13

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<210> 21

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (1)..(1)

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<223> Descripción de secuencia artificial: Fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares al motivo a base de leucina

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (3)..(5)

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<223> Descripción de secuencia artificial: Fragmento que tiene propiedades sustancialmente similares al motivo a base de leucina

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<400> 21

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xExxxIL

\hfill

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<210> 22

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Vam3p de S. cerevisiae

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<400> 22

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NEQSPLL

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Claims (22)

1. Una neurotoxina clostridial modificada que comprende al menos un motivo a base de leucina adicional, comprendiendo el motivo a base de leucina adicional:

(a)

un quinteto que comprende los primeros cinco aminoácidos en el que al menos un aminoácido es un aminoácido ácido o al menos un aminoácido es un aminoácido que contiene hidroxilo; y

(b)

un doblete que comprende dos aminoácidos tras el quinteto en el que al menos uno de los aminoácidos es una leucina o al menos uno de los aminoácidos es una isoleucina;

en la que el motivo adicional a base de leucina aumenta la persistencia biológica de la neurotoxina botulínica modificada con respecto a una neurotoxina botulínica idéntica sin el motivo a base de leucina adicional.

2. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que la neurotoxina clostridial que se está modificando es una neurotoxina botulínica.

3. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 2, en la que la neurotoxina botulínica se selecciona del grupo constituido por una toxina botulínica tipo A, una toxina botulínica tipo B, una toxina botulínica tipo C1, una toxina botulínica tipo D, una toxina botulínica tipo E, una toxina botulínica tipo F, una toxina botulínica tipo G y una toxina botulínica quimérica de las mismas.

4. La neurotoxina botulínica modificada según la reivindicación 3, en la que la neurotoxina botulínica que se está modificando es una toxina botulínica tipo A.

5. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que la neurotoxina clostridial que se está modificando es una neurotoxina tetánica.

6. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el quinteto de aminoácidos comprende un aminoácido ácido seleccionado del grupo constituido por un glutamato y un aspartato.

7. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el aminoácido que contiene hidroxilo del quinteto se selecciona del grupo constituido por una serina, una treonina y una tirosina.

8. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 6, en la que el aminoácido que contiene hidroxilo puede estar fosforilado.

9. La neurotoxina clostridal modificada según la reivindicación 1, en la que un aminoácido del doblete comprende una leucina, una isoleucina, una metionina, una alanina, una fenilalanina, un triptófano o una valina.

10. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el doblete comprende un doblete leucina-leucina, un doblete leucina-isoleucina, un doblete isoleucina-leucina, un doblete isoleucina-isoleucina o un doblete leucina-metionina.

11. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el motivo a base de leucina adicional comprende una secuencia consenso seleccionada del grupo constituido por SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, SEC ID No. 3, SEC ID No. 4, SEC ID No. 5, SEC ID No. 6 y SEC ID No. 21.

12. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el motivo a base de leucina adicional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID No. 7, SEC ID No. 8, SEC ID No. 9, SEC ID No. 10, SEC ID No. 11, SEC ID No. 12, SEC ID No. 13, SEC ID No. 14, SEC ID No. 15, SEC ID No. 16, SEC ID No. 17, SEC ID No. 18 y SEC ID No. 22.

13. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el motivo a base de leucina comprende la SEC ID No. 7.

14. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que la persistencia biológica aumentada se debe a un aumento en la semivida biológica de la neurotoxina clostridial modificada.

15. La neurotoxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que la persistencia biológica aumentada se debe a un aumento en la actividad biológica de la neurotoxina clostridial modificada.

16. Uso de una neurotoxina modificada, según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neuromuscular, un trastorno neurovegetativo o dolor.

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17. El uso según la reivindicación 16, en el que la afección es disfonía espasmódica, distonía laríngea, disfonía bucomandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal, colitis espasmódica, vejiga neurógena, anismus, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfonía, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, dolor de espasmos musculares, cefalea, surcos de la frente y arrugas de la piel.

18. Una toxina botulínica tipo A modificada que comprende una mutación en un motivo a base de leucina de la SEC ID No. 7, en la que la mutación disminuye la persistencia biológica de la toxina botulínica tipo A modificada con respecto a una neurotoxina botulínica tipo A sin la mutación del motivo a base de leucina.

19. La toxina botulínica tipo A modificada según la reivindicación 18, en la que la mutación del motivo a base de leucina es una deleción de uno o más aminoácidos de la SEC ID No. 7.

20. La toxina botulínica tipo A modificada según la reivindicación 18, en la que la mutación del motivo a base de leucina es una sustitución de uno o más aminoácidos de la SEC ID No. 7.

21. La toxina botulínica tipo A modificada según la reivindicación 18, en la que la persistencia biológica disminuida se debe a una disminución en la semivida biológica de la toxina botulínica tipo A modificada.

22. La toxina botulínica tipo A modificada según la reivindicación 18, en la que la persistencia biológica disminuida se debe a una disminución en la actividad biológica de la toxina botulínica tipo A modificada.