MX2012008650A - Metodos de conversion intracelular de proteinas monocatenarias en su formula bicatenaria. - Google Patents

Metodos de conversion intracelular de proteinas monocatenarias en su formula bicatenaria.

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Abstract

La presente descripción describe constructos de expresión que comprenden proteínas monocatenarías que comprenden una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y una proteasa que puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario, composiciones celulares que comprenden este constructo de expresión y métodos intracelulares de conversión de la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.

Description

METODOS DE CONVERSION INTRACELULAR DE PROTEINAS MONOCATENARIAS EN SU FORMULA BICATERNARIA i Descripción detallada de la invención La capacidad de las toxinas de Cl'ostridium, tales como, por ejemplo, las neurotoxinas botulinicas (BoNT) , BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y de la neurotoxina del tétanos (TeNT) , para inhibir la transmisión neuronal, se explota en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, por ejemplo, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004) . Las toxinas de Clostridium comercialmente disponibles como composiciones farmacéuticas incluyen las preparaciones de BoNT/A tales como por ejemplo BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA) , DYSPORT®/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Portón Down, Inglaterra), NEÜRONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y XEOMIN® ( erz Pharmaceuticals , GmbH., Frankfurt, Alemania); y las preparaciones de BoNT/B tales como por ejemplo MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA) . A modo de ejemplo, BOTOX ® está actualmente autorizado en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor esencial, arrugas del entrecejo o líneas faciales EF. : 233482 hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, lineas labiales nasales, disfonia espasmódica, estrabismo y el trastorno de nervios VII.
La utilidad terapéutica de las toxinas de Clostridium se ha extendido más allá de sus actuales aplicaciones miorrelajantes para tratar dolencias sensoriales basadas en los nervios, tales como, por ejemplo, diversos tipos de dolor crónico, inflamación neurogénica y trastornos urogenitales, asi como también trastornos de base no -neuronal tales como por ejemplo la pancreatitis. Un enfoque que se está aprovechando actualmente para expandir las terapias basadas en toxinas de Clostridium es la que implica la modificación de una toxina de Clostridium de manera tal que la toxina modificada tenga una capacidad alterada en direccionar a las células, en favor de una célula diana de toxina no Clostridium. Esta capacidad redireccionada se logra mediante la sustitución de un dominio de direccionamiento de origen natural de una toxina de Clostridium con un dominio de direccionamiento que muestra una actividad selectiva de unión para un receptor de toxina no Clostridium presente en una célula diana de toxina no Clostridium. Tales modificaciones en un dominio de direccionamiento tienen como resultado una toxina modificada que es capaz de unirse selectivamente a un receptor de toxina no Clostridium (receptor diana) presente en una célula diana de toxina no Clostridium (redireccionada) . Una toxina de Clostridium redireccionada con una actividad de direccionamiento para una célula diana de toxina no Clostridium puede unirse a un receptor presente en la célula diana de toxina no Clostr.idium, trasladarse al interior del citoplasma, y ejercer su efecto proteolitico en el complejo SNARE de la célula diana de toxina no Clostridium.
Los ejemplos no taxativos de toxinas de Clostridium redireccionadas con una actividad de direccionamiento hacia una célula diana de toxina no Clostridium se describen por ejemplo en: Keith A. Foster et ál . , Clostridium Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Patente estadounidense N° 5,989,545; Clifford C. Shone et ál., Recombinant Toxin Fragments, Patente estadounidense N° 6,461,617; Stephan ' Donovan, Clostridium Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente estadounidense N° 6,500,436; Conrad P. Quinn et ál., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Patente estadounidense N° 6,632,440; Lance E. Steward et ál . , Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Patente estadounidense N° 6,843,998; J. Oliver Dolly et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7, 419, 676; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridíum Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Patente estadounidense N° 7,514,088; Keith A. Foster et ál., Inhibition of Secretíon from Non-.neural Cells, Publicación de Patente estadounidense N° 2003/0180289; y Keith A. Foster et ál., Re-targeted Toxin Conjugates, Publicación Internacional de Patente WO 2005/023309. La capacidad de redireccionar los efectos terapéuticos asociados con las toxinas de Clostridíum ha ampliado considerablemente la cantidad de aplicaciones medicinales aptas para utilizar una terapia con las toxinas de Clostridíum. A título de ejemplo no taxativo, las toxinas de Clostridíum modificadas redireccionadas a las neuronas sensoriales, son útiles en el tratamiento de diversos tipos de dolor crónico, tales como por ejemplo hiperalgesia y alodinia, dolor neuropático y dolor inflamatorio, véase por ejemplo Foster, anteriormente, (1999) ; y Donovan, anteriormente, (2002); y Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Componente, Patente estadounidense N° 7.022.329. A título de otro ejemplo no taxativo, las toxinas de Clostridíum modificadas redireccionadas a células pancreáticas, son útiles en el tratamiento de pancreatitis, véase por ejemplo Steward, anteriormente, (2005) .
Las toxinas de Clostridíum, ya sea de origen natural o modificadas, se procesan de manera de obtener una forma bicatenaria con el fin de lograr la plena actividad. Las toxinas de Clostridium de origen natural se traducen, cada una de ellas como un polipéptido monocatenaria de aproximadamente 150 kDa, que posteriormente se escinde por escisión proteolitica dentro de un bucle de disulfuro por una proteasa de origen natural (Figura 1) . Esta escisión se produce dentro de la región discreta de bucle bicatenario creada entre dos residuos de cisteina que forman un puente disulfuro. Este procesamiento postraduccional permite obtener una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa, que comprende el dominio enzimático, y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa, que comprende los dominios de translocación y que se unen a la célula, estando la LC y la HC unidas por el único enlace disulfuro y por las interacciones no covalentes (Figura 1) . Las toxinas de Clostridium producidas de forma recombinante por lo general sustituyen el' sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario, de origen natural, por un sitio de escisión de proteasa exógena (Figuras 2A-2B) . Véase, por ejemplo Dolly, J.O. et ál, Activatable Clostridium Toxins, Patente estadounidense 7.419.676, incorporada en la presente mediante esta referencia. Si' bien las toxinas de Clostridium redireccionadas varían en su peso molecular global debido al tamaño de la porción de direccionamiento, el proceso de activación y su dependencia con respecto a los sitios de escisión exógenos son esencialmente los mismos que para las toxinas de Clostridium de forma recombinante producidas. Véase, por ejemplo, Steward, L.E. et ál., Activatable Clostridium Toxins, Publicación de Patente estadounidense 2009/0005313; Steward, L.E. et ál., Modified Clostridium Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridium Toxin Target Cells, Solicitud de Patente estadounidense 11/776,075; Steward, L.E. et ál., Modified Clostridium Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridium Toxin Target Cells, Publicación de Patente estadounidense 2008/0241881, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante esta referencia.
Hasta la fecha, la conversión de la forma monocatenaria de una toxina de Clostridium producida de forma recombinante o de una toxina de Clostridium modificada en su forma bicatenaria requería un proceso de activación in vitro. En primer lugar, las células bacterianas utilizadas para producir estas toxinas de forma recombinante carecen de la proteasa de origen natural presente en las cepas Clostridium que producen las toxinas nativas. En segundo lugar, no ha habido gran necesidad de células bacterianas para producir toxinas activadas de forma recombinante, debido a preocupaciones de seguridad en el mánejo de las toxinas activadas. Véase por ejemplo Dolly, US 7.419.676, anteriormente, (2008) . Sin embargo, si fuese posible superar estas preocupaciones, la producción de toxinas activadas producidas de forma recombinante, seria la base del proceso de fabricación de las toxinas de Clostridium producidas de forma recombinante o toxinas de Clostridium modificadas. Por ejemplo, actualmente la producción de toxinas de Clostridium producidas de forma recombinante o de toxinas de Clostridium modificadas implica los siguientes pasos de purificación: 1) cromatografía de afinidad con metal inmovilizado; 2) diálisis de intercambio de iones; 3) reacción de escisión de proteasas; 4) cromatografía de intercambio de iones; y 5) adición de PEG y congelación instantánea para almacenamiento a -80 °C. La utilización de una célula bacteriana que pueda escindir proteolíticamente la toxina de Clostridium recombinante intracelularmente mientras aun expresa la toxina, puede reducir la cantidad de pasos de purificación a lo siguiente: 1) cromatografía de afinidad de metal inmovilizado; 2) diálisis de intercambio de iones; 3) cromatografía de intercambio de iones; y 4) adición de PEG y congelación instantánea para almacenamiento a -80 °C.
La presente descripción describe un método para convertir una proteína monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario en su forma bicatenaria que no se basa en un proceso in vitro para la conversión de la forma monocatenaria de la toxina en su forma bicatenaria. Esto se logra mediante el uso de células que expresan tanto la proteína como la proteasa necesaria para convertirla en doble cadena activa.
Por lo tanto, los aspectos de la presente memoria proporcionan un constructo de expresión doble que incluye un marco de lectura abierto que codifica una proteína monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede proteolíticamente escindir el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado en la región del bucle bicatenario. En aspectos adicionales, la proteína monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena puede ser, por ejemplo, una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena, una toxina de Clostridium modificada que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena, o una proteína monocatenaria que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. Los polinucleótidos, así como también las toxinas de Clostridium que comprenden una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena que codifican, se describen en por ejemplo Dolly, J.O. et ál., Activatable Clostridium Toxins, Patente estadounidense N° 7.132.259; Dolly, J.O. et ál., Activatable Clostridium Toxins, Patente estadounidense N° 7.419.676, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante esta referencia en su totalidad. Los polinucleótidos, asi como también las proteínas que comprenden un 'dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de la toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena que codifican, se describen en por ejemplo Ste ard, L.E. et ál., Multivalent Clostridium Toxins, Publicación de patente estadounidense 2009/0048431; Steward, L.E. et ál., Activatable Clostridium Toxins, Publicación de patente estadounidense 2009/0069238; Steward, L.E. et ál., Modified Clostridium Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridium Toxin Target Cells, Solicitud de Patente estadounidense 1/776,075; Steward, L.E. et ál . , Modified Clostridium Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridium Toxin Target Cells, Publicación de patente estadounidense 2008/0241881; Foster, .A. et ál., Fusión Proteins, Publicación de patente estadounidense 2009/0035822; Foster, K.A. et ál., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Publicación de patente estadounidense 2009/0162341; Steward, L.E. et ál . , Activatable Clostridium Toxins, Publicación de patente estadounidense 2008/0032931; Foster, K.A. et ál., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Publicación de Patentes de los EE.UU. 2008/0187960; Steward, L.E. et ál., Degradable Clostridium Toxins, Publicación de patente estadounidense 2008/0213830; Steward, L.E. et ál., Modified Clostridium Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridium Toxin Target Cells, Publicación de Patentes de patente estadounidense; Dolly, J.O. et ál., Activatable Clostridium Toxins, Patente estadounidense N° 7,419,676; y una Solicitud de Patente acompañante Ghanshani, et ál., Modified Clostridium Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, Expediente de Abogado No. 18468 PROV (BOT) , cada uno de los cuales se adjunta a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Otros aspectos de la presente descripción proporcionan una célula que comprende un constructo de expresión doble que incluye un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena y un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede proteoliticamente escindir el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado en la región del bucle bicatenario.
En aspectos adicionales, la proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena puede ser, por ejemplo, una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena, una toxina de Clostridium modificada que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena, o una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena como se describe en la presente descripción .
Aun en otros aspectos de la presente descripción se proporciona un método intracelular para la conversión de una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes: a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a una primera temperatura durante un determinado intervalo de tiempo a efectos de lograr la máxima densidad celular, el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa; donde la proteasa puede escindir el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; b) cultivar la célula a una segunda temperatura durante un determinado intervalo de tiempo a efectos de lograr la máxima inducción de la expresión de la proteina a partir del marco de lectura abierto que codifica la proteina monocatenaria, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y la proteasa a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, con lo que se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria .
Aun otros aspectos de la presente descripción proveen un método intracelular para convertir una toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes: a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 3,5 horas, el constructo de expresión doble comprende; i) un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium monocatenaria, la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena; y ii)un marco de lectura abierto que codifica una proteasa; donde la proteasa puede escindir el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; b) cultivar la célula a 22 °C durante de aproximadamente 16 a aproximadamente ^ 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la toxina de Clostridium monocatenaria y de proteasa a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa producida escinde la toxina de Clostridium monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, con lo cual se convierte la toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria.
Otros aspectos de la presente descripción proveen un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria, la proteina monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, y un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y ii) un marco de lectura abierto que codifica un proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteína monocatenaria y de la proteasa TEV a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.
Otros aspectos de la presente descripción proveen un método intracelular para convertir una proteína monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una proteína monocatenaria, la proteína monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, y un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteína monocatenaria y de la proteasa TEV a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado en el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria .
Aun otros aspectos más de la presente descripción proveen un método intracelular para convertir una proteína monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una proteína monocatenaria, la proteína monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación un dominio de unión de la toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteína monocatenaria y de la proteasa TEV a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa TEV ubicado en la región de bucle bicatenario, con lo cual se convierte la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.
Aun en otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria, la proteina monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión de una toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y de la proteasa TEV a partir del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa TEV ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, con lo cual se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria.
En otros aspectos de la presente descripción se provee un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos, la proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena puede ser, por ejemplo, una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, una toxina de Clostridium modificada que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, o una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena como se describe en la presente descripción .
En otros aspectos de la presente descripción, se provee ! un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir proteoliticamente el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado en la región de bucle bicatenario de una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de la presente descripción, se provee una célula que comprende un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir proteoliticamente el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado en la región de bucle bicatenario de una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En aspectos adicionales, la proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena puede ser, por ejemplo, una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, una toxina de Clostridium modificada que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, o una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena como se describe en la presente descripción .
Aun en otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes: a) cultivar una célula que comprende: i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir proteolíticamente el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado en la región de bucle bicatenario de una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; b) cultivar la célula a una segunda temperatura durante un determinado intervalo de tiempo a efectos de logar la máxima inducción de la expresión de la proteina a partir del marco de lectura abierto que codifica la proteína monocatenaria, donde el cultivo en el paso (b) induce expresión de la proteína monocatenaria y de la proteasa a partir de los constructos de expresión; y donde la proteasa producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, con lo pual se convierte la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.
Aun en otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes: a) cultivar una célula a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 3,5 horas, la célula comprende i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium monocatenaria que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir proteoliticamente el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado en la región de bucle bicatenario de una proteína monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; b) cultivar la célula a 22 °C durante de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce expresión de la toxina de Clostridium monocatenaria y de la proteasa a partir de los constructos de expresión; y donde la proteasa producida escinde la toxina de Clostridium monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, con lo cual se convierte la toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria.
En otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, la célula comprende: i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, y un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce expresión de la proteína monocatenaria y de la proteasa TEV a partir de los constructos de expresión; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión ¡opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.
En otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteína monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula a 37 °C durante aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, la célula comprende i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína monocatenaria que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, y un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y de la proteasa TEV a partir de los construptos de expresión; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de TEV ubicado en el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria.
En aun otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, la célula comprende i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión a la toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y de la proteasa TEV a partir de los constructos de expresión; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa TEV ubicado en el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria. t Aun en otros aspectos de la presente descripción se provee un método intracelular para convertir una proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, el método comprende los pasos siguientes a) cultivar una célula a 37 °C de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas, la célula comprende: i) un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión a la toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, y ii) otro constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica proteasa TEV; b) cultivar la célula de aproximadamente 20 a aproximadamente 24 °C de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el cultivo en el paso (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y de la proteasa TEV a partir de los constructos de expresión; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, con lo cual se convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria.
La Figura 1 muestra la organización de los dominios de las toxinas de Clostridium de origen natural. La forma monocatenaria ilustra la organización lineal de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, y un dominio de unión | de Hc. La región de bucle bicatenario ubicada entre los dominios de translocación y enzimático ha sido ilustrada mediante corchete doble SS. Esta región comprende un sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario endógena que al tener lugar una escisión proteolitica con una proteasa de origen natural, tal como por ejemplo una proteasa toxina de Clostridium endógena o una proteasa de origen natural producida en el entorno, convierte la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria.
Las Figuras 2A-2B son vistas esquemática del paradigma actual de la liberación del neurotransmisor y de la intoxicación por toxina de Clostridium en una neurona central y periférica. En la Figura 2A se muestra una vista esquemática para el mecanismo de liberación del neurotransmisor de una neurona central y periférica. El proceso de la liberación se puede describir en dos pasos: 1) atracamiento vesicular, donde la proteína SNARE unida a vesícula de una vesícula que ' contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con las proteínas SNARE unidas a membrana ubicadas en la membrana plasmática; y 2) liberación del neurotransmisor, donde la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas del neurotransmisor experimentan exocitosis. En la Figura 2B se muestra una vista esquemática del mecanismo de intoxicación para la actividad de la toxina de tétanos y botulismo en una neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación se puede describir en cuatro pasos: 1) unión del receptor, donde una toxina de Clostridium se une a un sistema receptor Clostridium e inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, en donde, después de la unión con la toxina, una vesícula que contiene el sistema complejo toxina-receptor experimenta endocitosis en la célula; 3) translocación de las cadenas livianas, donde se cree que tienen lugar múltiples acontecimientos, por ejemplo cambios en el pH interno de la vesícula, formación de un poro de canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de la toxina de Clostridium, separación de la cadena ligera de toxina de Clostridium con respecto a la cadena pesada, y 4) modificación de la diana enzimática, donde la cadena ligera activada de la toxina de Clostridium escinde proteolíticamente su sustrato SNARE diana, tal como por ejemplo SNAP-25, VAMP o sintaxina, con lo cual impide el atraque de la vesícula y la liberación del neurotransmisor .
Las toxinas de Clostridium producidas por Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clo tridium baratii y Clostridium butyricum son las más ampliamente utilizadas en los tratamientos terapéuticos y cosméticos en seres humanos y otros mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete tipos, antigénicamente distintos, de toxinas de Botulinum (BoNT, por sus siglas en inglés) , que han sido identificados mediante la investigación de brotes de botulismo en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F) , animales (BoNT/Cl y /D) , o aislados del suelo (BoNT/G) . Los BoNT poseen una identidad de aminoácidos de aproximadamente un 35% entre sí y comparten la misma organización de dominio funcional y la misma estructura arquitectónica global. Los expertos en el arte reconocen que dentro de cada tipo de toxina de Clostridium puede haber subtipos que difieren un tanto en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, en la actualidad hay cuatro subtipos de BoNT/A: BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3 y BoNT/A4 , y los subtipos específicos muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente el 89% cuando se los compara con otro subtipo de BoNT/A. Si bien la totalidad de los siete serotipos de BoNT tienen una estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno de ellos también presenta características bacteriológicas distintas. En cambio, la toxina de tétanos (TeNT, por sus siglas en inglés) es producida por un grupo uniforme de C. tetani. Dos otras especies Clostridium, C. baratii y C. butyricum, producen toxinas, BaNT y BuNT, que son similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente .
Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente diferentes; 1) un dominio enzimático ubicado en la LC que incluye una región metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de cinc que de manera específica se direcciona a los componentes núcleo del aparato de liberación de los neurotransmisores; 2) un dominio de translocación (HN) contenido dentro de la mitad de extremo amino de la HC que facilita la liberación de la LC desde la vesículas intracelulares hacia el- interior del citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión (Hc) encontrado en la mitad de extremo carboxilo de la HC que determina la actividad de unión y la especificidad de la unión de la toxina al complejo del receptor ubicado en la superficie de la célula diana. El dominio Hc comprende dos rasgos estructurales distintos de un tamaño aproximadamente igual que indican la función y que llevan la denominación de subdominios HCN y HCc. En la Tabla 1 se muestran las regiones límite aproximadas para cada dominio hallado en las toxinas de Clostrxdium dadas como ejemplos.
Tabla 1. Secuencias y regiones de referencia de toxinas de Clostridium La actividad de unión, translocación y enzimática de estos tres dominios funcionales son necesarios, todos ellos, para la toxicidad. Si bien todavía no se conocen con precisión todos los detalles de este proceso, el mecanismo general de intoxicación celular por medio del cual las toxinas de Clostridium entran en una .neurona e inhiben la liberación de neurotransmisor, es similar, independientemente del serotipo o subtipo. Si bien los solicitantes no desean estar limitados por la siguiente descripción, el mecanismo de intoxicación se puede describir en al menos cuatro pasos: 1) unión del receptor; 2) internalización del complejo, 3) la translocación de la cadena ligera, y 4) la modificación de la diana enzimática. El proceso se inicia cuando el dominio He de una toxina de Clostridium se une a un sistema receptor especifico para la toxina ubicada en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de la unión de un complejo receptor se logra, en parte, por combinaciones especificas de gangliósidos y de receptores de proteínas que parecen comprender claramente cada complejo de toxina de Clostridium/receptor . Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor son internalizados por endocitosis, y las vesículas internalizadas se clasifican en determinadas rutas intracelulares . El paso de la translocación parece ser desencadenado por la acidificación del compartimiento de la vesícula. Este proceso parece iniciar dos importantes reordenamientos estructurales dependientes del pH que incrementan el carácter hidrófobo y promueven la formación de la forma bicatenaria de la toxina. Una vez activada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina es liberada de la vesícula intracelular en el citosol, donde parece dirigirse específicamente a uno de los tres componentes núcleo conocidos del aparato de liberación de neurotransmisor . Estas proteínas de núcleo, la proteína de membrana asociada con vesícula (VAMP, por sus siglas en inglés) /sinaptobrevina, proteína asociada a sinaptosomas de 25 kDa (SNAP-25) y la sintaxina, son necesarias para el atraque sináptico de la vesícula y de la fusión en la terminación nerviosa, y constituyen los miembros de la familia del receptor de proteínas solubles de unión al factor sensible a la N-etilmaleimida (SNARE, por sus siglas en inglés) . El BoNT/A y BoNT/E escinden la SNAP-25 en la región carboxilo terminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y el BoNT/Cl también escinde el SNAP-25 cerca del terminal carboxilo. Los serotipos de botulina BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y la toxina del tétanos, actúan sobre la porción central conservada de VAMP, y liberan la porción amino terminal de VAMP en el citosol. El BoNT/Cl escinde' sintaxina en un solo sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La proteólisis selectiva de los SNARE sinápticas justifica el bloqueo de liberación de neurotransmisor causado por las toxinas de Clostridium in vivo. Las diana de proteína SNARE de las toxinas de Clostridium son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, al igual que en las neuronas, la actividad de la peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véase, por ejemplo Yann Humeau et ál., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmisor Reléase, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et ál., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et ál., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).
En un aspecto de la invención, una toxina de Clostridium modificada comprende, en parte, una toxina de Clostridium monocatenaria modificada y una toxina de Clostridium bicatenaria modificada. Como se expuso en lo que antecede, una toxina de Clostridium, de origen natural o no natural, se sintetiza inicialmente en forma de un polipéptido monocatenario . Esta forma monocatenaria se escinde posteriormente en un sitio de escisión de proteasa ubicado dentro de una región discreta de bucle bicatenario creado entre dos residuos de cisteina que forman un puente disulfuro por una proteasa. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada. Como se lo usa en la presente, la expresión "región de bucle bicatenario" se refiere a una región de bucle de una toxina de Clostridium de origen natural o no natural formada por un puente disulfuro ubicado entre el dominio LC y el dominio HC. Tal como se la usa en la presente, la expresión "toxina de Clostridium modificada monocatenaria" se refiere a cualquier toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción que se encuentra en su forma monocatenaria, es decir, la toxina no ha sido escindida en el sitio de escisión de la proteasa ubicado dentro de la región de bucle bicatenario por su proteasa análoga. Tal como se la usa en la presente, la expresión "toxina de Clostridium modificada bicatenaria" se refiere a cualquier toxina modificada dé Clostridium descrita en la presente descripción que se encuentra en su forma bicatenaria, es decir, la toxina ha sido escindida en el sitio de escisión de la proteasa ubicado dentro de la región de bucle bicatenario por su proteasa análoga.
Los aspectos de la presente invención proveen, en parte, moléculas de polinucleótidos . Tal como se la utiliza en la presente, el término "molécula de polinucleótidos" es sinónimo de "molécula de ácido nucleico" y se refiere a una forma polimérica de nucleótidos tales como por ejemplo ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, de cualquier longitud. Las moléculas de polinucleótidos útiles incluyen sin limitación, moléculas de ADN de origen natural y no natural y moléculas de ARN de origen natural y no natural. Los ejemplos, no taxativos, de moléculas de ADN de origen natural y no natural incluyen las moléculas de ADN monocatenario, moléculas de ADN bicatenario, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADNc, constructos de vectores tales como por ejemplo constructos plásmidos, constructos fagémidos, constructos bacteriófagos, constructos retrovirales y constructos de cromosoma artificiales. Los ejemplos no taxativos de moléculas de ARN de origen natural y no natural incluyen ARN monocatenario, ARN bicatenario y ARNm.
Las técnicas de biología molecular bien establecidas que pueden ser necesarias para preparar una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción incluyen sin limitación los procedimientos en los que interviene una amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , reacciones de enzimas de restricción, electroforesis de gel de agarosa, ligación de ácido nucleico, transformación bacteriana, purificación de ácido nucleico, secuenciación de ácidos nucleicos y técnicas basadas en recombinación, son rutinarias y se hallan dentro de la capacidad del experto en el arte y en base a las enseñanzas de la presente. Ejemplos no taxativos de protocolos específicos necesarios para preparar una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina de Clostridium modificada se describen por ejemplo en MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, anteriormente, (2001) ; y en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BTOLOGY (Frederick M. Ausubel et ál . , eds . John Wiley & Sons, 2004) . Adicionalmente, se dispone de una variedad de productos disponibles en el comercio para preparar una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina de Clostridium modificada. Estos protocolos son procedimientos de rutina que se hallan dentro de la capacidad del experto en el arte y en base a las enseñanzas de la presente.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, un marco de lectura abierto. Tal como se la utiliza en la presente, la expresión "marco de lectura abierto" es sinónimo de ORF y se refiere a cualquier molécula de polinucleótidos que codifique una proteina, o una porción de una proteina. Un marco de lectura abierto empieza usualmente con un codón de inicio (representado por ejemplo como AUG para una molécula de ARN y como ATG en una molécula de ADN en el código estándar) y se lee en tripletes de codones hasta que el marco termina con un codón de terminación (representado por ejemplo como UAA, UGA o UAG para una molécula de ARN y como TAA, TGA o TAG en una molécula de ADN en el código estándar) . Tal como se lo utiliza en la presente, el término "codón" se refiere a una secuencia de tres nucleótidos en una molécula de polinucleótidos que especifica un aminoácido en particular durante la síntesis de la proteína'; también lleva la designación de triplete o triplete de codón.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, un constructo de expresión. Un constructo de expresión comprende una molécula de polinucleótidos que incluye un marco de lectura abierto descrito en la presente descripción unido operativamente a un vector de expresión útil para expresar la molécula de polinucleótidos en una célula o un extracto libre de células. Es posible emplear una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de polinucleótidos descrita en la presente descripción, los que incluyen sin limitación un vector de expresión viral; un vector de expresión procariota; vectores de expresión eucariotas tales como por ejemplo un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión libre de células (in vitro) . Además, se da por entendido que los vectores de expresión útiles para implementar aspectos de estos métodos, pueden incluir aquellos que expresan la molécula de polinucleótidos bajo el control de un elemento promotor o reforzador constitutivo, específico para tejidos, específico para células, o inducibles, o ambos. Los ejemplos, no taxativos, de vectores de expresión, junto con reactivos y condiciones bien establecidas para preparar y utilizar un constructo de expresión a partir de tales vectores de expresión son de fácil obtención en el comercio e incluyen, sin limitación, los de BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, preparación y uso de un vector de expresión adecuado son procedimientos de rutina dentro de los alcances del experto en el arte y se hallan en i las enseñanzas de la presente .
Los constructos de expresión descritos en la presente descripción pueden comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que incluye una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, donde la escisión del sitio de escisión de proteasa exógena convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria. En aspectos de esta modalidad, un vector de expresión viral está unido operativamente con un molécula de polinucleótidos que codifica una proteina que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; un vector de expresión procariota está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteína que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; un vector de expresión de levadura está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteína que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; una vector de expresión de insecto está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteína que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; y un vector de expresión de mamífero está operativamente unido a un molécula de polinucleótidos que codifica una proteína que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario.. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión adecuado para expresar una molécula de polinucleótidos descrito en la presente descripción puede ser expresado mediante el extracto libre de células. En un aspecto de esta modalidad, un vector de expresión libre de células está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteína que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario.
En una modalidad, un constructo de expresión descrito en la presente descripción puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión descrito en la presente descripción puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina de Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena. En aspectos de esta modalidad, la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un orden lineal de amino a carboxilo, de: 1) el dominio enzimático de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio de translocación de Clostridium y el dominio de unión de Clostridium; 2) el dominio enzimático de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio de unión de Clostridium y el dominio de translocación de Clostridium; 3) el dominio de unión de Clostridium, el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena y el dominio enzimático de toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión de Clostridium, el dominio enzimático de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena y el dominio de translocación de toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio enzimático de toxina de Clostridium y el dominio de unión de toxina de Clostridium; o 6) el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio de unión de toxina I de Clostridium y el dominio enzimático de . toxina de Clostridium.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de unión de BoNT/A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de unión de BoNT/B, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de unión de BoNT/Cl y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de unión de BoNT/D, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de unión de BoNT/E, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de prqteasa exógena; 6) un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de unión de BoNT/F, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 7) un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de unión de BoNT/G, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 8) un dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de unión de TeNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 9) un dominio enzimático de BaNT, un dominio de translocación de BaNT, un dominio de unión de BaNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 10) un dominio enzimático de BuNT, un dominio de translocación de BuNT, un dominio de unión de BuNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos más de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de unión de BoNT/A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 2) un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de unión BoNT/B, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 3) un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio !de translocación de BoNT/Cl, un dominio de unión de BoNT/Cl, y una región de bucle bicatenario que comprende a sitio de escisión de proteasa TEV; 4) un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación BoNT/D, un dominio de unión BoNT/D, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 5) un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de unión de BoNT/E, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 6) un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de unión de BoNT/F, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 7) un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de unión de BoNT/G, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 8) un dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de unión de TeNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 9) un dominio enzimático de BaNT, un dominio de translocación de BaNT, un dominio de unión de BaNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; 10) un dominio enzimático de BuNT, un dominio de translocación de BuNT, un dominio de unión de BuNT, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV.
Ejemplos de tales toxinas de Clostridium que comprenden una región de bucle bicatenario que c'omprende un sitio de escisión de la proteasa exógena se describen en, por ejemplo J. Oliver Dolly, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.132.529; J. Oliver Dolly, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.419.676; Lance Steward, et ál., Leucine-Based Motifs and Clostridium Neurotoxins, Patente estadounidense N° 6.903.187; Lance Steward, et ál., Leucine-Based Motifs and Clostridium Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.393.925; Wei-Jen Lin, et ál., Neurotoxins with Enhanced Target Specificity, Patente estadounidense N° 7.273.722; Lance Steward, et ál . , Modified Botulinum Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.491.799; Lance E. Steward, et ál., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type E, Publicación de Patente estadounidense 2008/0138893; Ester Fernandez-Salas, et ál., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type A, Publicación de Patente estadounidense 2008/0057575; cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia. ! En otra modalidad, un constructo de expresión descrito en la presente descripción puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En aspectos de esta modalidad, la proteina monocatenaria comprende un orden lineal de amino a carboxilo de: 1) el dominio enzimático de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio de translocación de Clostridium y el dominio de unión no Clostridium; 2) el dominio enzimático de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio de unión no Clostridium y el dominio de translocaci,ón de Clostridium; 3) el dominio de unión no Clostridium, el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena y el dominio enzimático de toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión no Clostridium, el dominio enzimático de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena y el dominio de translocación de toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena, el dominio enzimático de toxina de Clostridium y el dominio de unión no Clostridium; o 6) el dominio de translocación de toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio de unión no Clostridium y el dominio enzimático de toxina de Clostridium.
I En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión opioide, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena . En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium; un dominio de translocación de toxina de Clostridium; un dominio de unión de encefalina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido adrenomedular-22 bovino (BAM22), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de endomorfina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de endorfina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de dinorfina, y una región de bucle bicátenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de nociceptina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hemorfina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; u 8) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de rimorfina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de melanocortina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de ¡ lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hormona estimuladora de melanocitos; y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de adrenocorticotropina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de lipotropina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto, que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido galanina, y una región de bucle bicatenario .que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de galanina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium,; un dominio de unión asociada con mensaje de galanina (GMAP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Closiridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido granina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de cromogranina A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de cromogranina B, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium; un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de cromogranina C, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de taquiquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de sustancia P, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neuropéptido K, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neuropéptido gamma, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de pr teasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neuroquinina A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hemoquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; o 6) una dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de endoquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium,, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neuropéptido Y (NPY, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium un dominio de unión de péptido YY (PYY), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido pancreático (PP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de icosapéptido pancreático (PIP, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido neurohormona, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hormona que libera corticotropina (CCRH, por sus siglas en inglés) y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hormona paratiroide (PTH, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de ihormona liberadora de tirotropina (TRH, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; o 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de somatostatina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de citocina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de .toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor neurotrófico ciliar (CNTF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de glicoforina A (GPA, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor inhibidor de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de interleucina (IL), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de onostatina M, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión cardiotrofina-1 (CT-1) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de citocina similar a cardiotrofina (CLC, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 8) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neuroleucina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de quinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de bradiquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de calidina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de desArg9 bradiquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; o 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de desArglO bradiquinina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-1, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-4, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-8, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-9, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de ' Clostridium, un dominio de unión de FGF-17, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de FGF-18, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de neurotrofina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de ' proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor del crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neurotrofina-3 (NT-3) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neurotrofina -4/5 (NT-4/5) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; o 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido activador de cabeza (HA, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario. que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura' abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de factor de necrosis tumoral (TNF) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de factor de crecimiento derivado de glial (GDNF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de neurturina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de persefina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de artemina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de factor de crecimiento de transformación ß (TGFP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena . En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de TGFpi, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de TGFp2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium^ un dominio de unión de ?T?ß3, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, una dominio de unión de TGF , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de proteina morfogenética ß de los huesos (BMP, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP3, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP4, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium,' un dominio de unión de BMP5, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP6, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP7, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP8, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 8) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de BMP10, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de factor ß de diferenciación del crecimiento (GDF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF1, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF3, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF5, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF6, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF7, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF8, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 8) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF10, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 9) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF11, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 10) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de GDF15, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de activina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de activina A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de activina B, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de activina C, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de activina E, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena; o 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de inhibina A, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exogena .
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium,! un dominio de unión de péptido factor de crecimiento de insulina (IGF, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina -de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de IGF-1, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de IGF-2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de hormona similar al glucagón, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de secretina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido similar al glucagón, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena .
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium; un dominio de unión de péptido hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena .
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de péptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de VIP1, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 2). un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de VIP2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de polipeptido inhibidor gástrico (GIP, por sus siglas en inglés) , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de intestino péptidovisceral relacionado con calcitonina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica: 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de gastrina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido liberador de gastrina, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de i escisión de proteasa exógena; o 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de colecistoquinina (CCK, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de péptido de receptor activado por proteasa (PAR, por sus siglas en inglés), y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de PARI , y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de PAR2, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de PAR3, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; o 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión PAR3, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena.
Ejemplos de tales proteínas que comprenden una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena se han descrito en por ejemplo, J. Oliver Dolly, et ál., Activatable Reco binant Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.132.529; J. Oliver Dolly, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente estadounidense N° 7.419.676; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridium Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Patente estadounidense N° 7.514.088; Keith A. Foster et ál., Re-targeted Toxin Conjugates, Publicación Internacional de Patente WO 2005/023309; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2008/0032930; Lance E. Steward, et ál . , Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2008/0032931; Lance E. Steward, et ál . , Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2008/0161226; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2008/0221012; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2009/0004224; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2009/0005313; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2009/0018081; Lance E. Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación de Patente estadounidense 2009/0069238; y Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridium Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Publicación de Patente estadounidense 2009/0048431, cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En otra modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína que comprende un dominio enzimático de- toxi'na de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, y un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado. En aspectos de esta modalidad, la proteina monocatenaria comprende un orden lineal de amino a carboxilo de: 1) un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado, un dominio de translocación de toxina de Clostridium y un dominio enzimático de toxina de Clostridium; 2) un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado, un dominio enzimático de toxina de Clostridium, y un dominio de translocación de toxina de Clostridium; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado, y un dominio de translocación de toxina de Clostridium; 4) un dominio de translocación de toxina de Clostridium, a un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado, y un dominio enzimático de toxina de Clostridium; 5) un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio enzimático de toxina de Clostridium, y un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado; y 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, y un dominio de unión de sitio de escisión de proteasa integrado.
En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión comprende un marco de lectura abierto que codifica 1) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de encefalina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 2) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de adrenomedular-22 bovino (BAM22) al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 3) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de endomorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 4) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de endorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 5) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de dinorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 6) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de nociceptina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; 7) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de hemorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; u 8) un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de rimorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado.
Ejemplos de tales proteínas que comprenden dominios de unión de sitios de escisión de proteasa integrado se describen por ejemplo en la Solicitud de Patente acompañante de Sanjiv Ghanshani, et ál., Modified Clostridium Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, incorporada en la presente mediante esta referencia.
Los constructos de expresión descritos en la presente descripción pueden comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteasa. En aspectos de esta modalidad, un vector de expresión viral está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa; un vector de expresión procariota está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa; un vector de expresión de levadura está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa; un vector de expresión de insecto está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa; y un vector de expresión de mamífero está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa. En otros aspectos de esta modalidad, un constructo de expresión que es adecuado para expresar una molécula de polinucleótidos descrita en la presente descripción puede ser expresado usando un extracto libre de células. En un aspecto de esta modalidad, un vector de expresión de extracto libre de células está operativamente unido a una molécula de polinucleótidos que codifica una proteasa.
En un aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión que comprende un marco de lectura abierto codifica una enterocinasa, una proteasa de rinovirus 3C humano, una proteasa de enterovirus humano 3C, una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) , una proteasa de virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV, por sus siglas en inglés), una proteasa de subtilisina o una proteasa caspasa 3. Ejemplos de enterocinasas proteasas y de moléculas de polinucleótidos que las codifican se describen en por ejemplo Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, Patente estadounidense N° 5.665.566; Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, Patente estadounidense N° 6.746.859, cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia. Ejemplos de proteasas. de subtilisina y de las moléculas de polinucleótidos que las codifican se describen en por ejemplo: Donn N. Rubingh, et ál . , Subtillisin Protease Variants having Amino Acid Deletions and Substitutions in Defined Epitope Regions, Patente estadounidense N° 6.586.224, incorporada en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En otro aspecto de esta modalidad, una enterocinasa es la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de esta modalidad, una enterocinasa comprende los aminoácidos 239-1035 de SEQ ID NO: 11. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una enterocinasa es una variante de enterocinasa de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de enterocinasa. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una enterocinasa es una variante de enterocinasa de origen no natural, tal como por ejemplo una variante de enterocinasa conservadora, una variante de enterocinasa no conservadora, una enterocinasa quimérica, un fragmento de enterocinasa activa, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta modalidad, una enterocinasa es una que ha sido descrita en la Patente estadounidense 5.665.566 o en la Patente estadounidense 6.746.859. En otro aspecto de esta modalidad, una enterocinasa, una variante de enterocinasa de origen natural o una variante de enterocinasa de origen no natural, se obtiene de una especie de mamífero tal como por ejemplo un ser humano, una vaca o un roedor.
En otros aspectos de esta modalidad, una enterocinasa comprende un polipéptido que tiene' una identidad de aminoácidos de por ejemplo por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 11; o como máximo de 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 11. En aun otros aspectos de esta modalidad, una enterocinasa comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 11. En aun otros aspectos de esta modalidad, una enterocinasa comprende un polipéptido que tiene por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO:ll.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa del rinovirus humano 3C es la SEQ ID NO: 12. En otro aspecto de la presente modalidad, una proteasa de rinovirus humano 3C es una variante de una proteasa de rinovirus humano 3C de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de una proteasa de rinovirus humano 3C. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de rinovirus humano 3C es una variante de una proteasa de rinovirus humano 3C de origen no natural, tal como por ejemplo una variante de proteasa de rinovirus humano 3C conservadora, una variante de proteasa de rinovirus humano 3C no conservadora, una quimera de proteasa de rinovirus humano 3C, un fragmento de la proteasa activa de rinovirus humano 3C, o cualquier combinación de* las mismas. En otro aspecto de esta modalidad, proteasa de rinovirus humano 3C, una variante de proteasa de rinovirus humano 3C de origen natural o una variante de proteasa de rinovirus humano 3C de origen no natural, se obtiene de una especie de rinovirus.
En otros aspectos de esta modalidad, una proteasa de rinovirus humano 3C comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de por ejemplo por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 12; o a lo de sumo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de esta modalidad, una proteasa de rinovirus humano 3C comprende un polipéptido que tiene por lo menos por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO :12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO : 12. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de rinovirus humano 3C comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C es la SEQ ID NO: 13. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C es una variante de proteasa de enterovirus humano 3C de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de proteasa de enterovirus humano 3C. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C es una variante de proteasa de enterovirus humano 3C de origen no natural, tal como por ejemplo una variante conservadora de proteasa de enterovirus humano 3C, una variante no conservadora de proteasa de enterovirus humano 3C, una quimera de proteasa de enterovirus humano 3C, un fragmento de proteasa de enterovirus humano 3C activo, o cualquier combinación de los mismas. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C, una variante de proteasa de enterovirus humano 3C de origen natural, o una variante de proteasa de enterovirus humano 3C de origen no natural, se obtiene de una especie de enterovirus.
En otros aspectos de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C comprende un poli'péptido que tiene una identidad de aminoácidos de por ejemplo por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 13; o como máximo de 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 13. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 13. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de enterovirus humano 3C comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 13.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV es la SEQ ID NO: 14. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV comprende los aminoácidos 2038-2270 de la SEQ ID NO: 14. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV comprende SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV es una variante de proteasa TEV de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de proteasa TEV. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV es una variante de proteasa TEV de origen no natural, tal como por ejemplo una variante conservadora de proteasa TEV, una variante no conservadora de proteasa TEV, una quimera de proteasa TEV, un fragmento de proteasa TEV activo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV, una variante de proteasa TEV de origen natural, o una variante de proteasa TEV de origen no natural, se obtiene de una especie de Potyvirus.
En otros aspectos de esta modalidad, una proteasa TEV comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de por ejemplo 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa TEV comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa comprende a polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N : 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TVMV es la SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TEV comprende los aminoácidos 2002-2236 de la SEQ ID NO: 24. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TVMV es una variante de proteasa TVMV de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de proteasa TVMV. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa TVMV es una variante de proteasa TVMV de origen no natural, tal como por ejemplo una variante conservadora de proteasa TVMV, una variante no conservadora de proteasa TVMV, una quimera de proteasa TVMV, un fragmento de proteasa TVMV activo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de , esta modalidad, una proteasa TVMV, una variante de proteasa TVMV de origen natural, o una variante de proteasa TVMV de origen no natural, se obtiene de una especie de Potyvirus.
En otros aspectos de esta modalidad, una proteasa TVMV comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de por ejemplo, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 24 o a los aminoácidos 2002-2236 de la SEQ ID NO: 24; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 24 o con respecto a los aminoácidos 2002-2236 de la SEQ ID NO: 24. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa TVMV comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o con respecto a los aminoácidos 2002-2236 of SEQ ID NO: 24; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o con respecto a los aminoácidos 2002-2236 de la SEQ IS NO: 24. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una TMV proteasa comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o con respecto a los .'aminoácidos 2002-2236 de la SEQ ID NO: 24; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ : 24 o con respecto a los aminoácidos 2002-2236 de la SEQ ID NO: 24.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de subtilisina es la SEQ ID NO: 25. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de subtilisina comprende los aminoácidos 107-365 de la SEQ ID NO: 25. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de subtilisina es una variante de proteasa de subtilisina de origen natural, tal como por ejemplo una isoforma de proteasa de subtilisina. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de subtilisina es una variante de proteasa de subtilisina de origen no natural, tal como por ejemplo una variante conservadora de proteasa de subtilisina, una variante no conservadora de proteasa de subtilisina, una quimera de proteasa de subtilisina, un fragmento activo de proteasa de subtilisina, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de subtilisina, una variante de proteasa de subtilisina de origen natural, o una variante de proteasa de subtilisina de origen no natural, se obtiene de una especie de Bacillus.
En otros aspectos de esta modalidad, una proteasa de subtilisina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de por ejemplo por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% con respecto a la SEQ ID NO: 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 la SEQ ID NO: 25/ o de como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con respecto a la SEQ ID NO: 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 de la SEQ IS NO: 25. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de subtilisina comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 de la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, no contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO : 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 de la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de subtilisina comprende un polipéptido que tiene por ejemplo por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30r 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO : 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 de la SEQ IS NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones, y/o sustituciones, contiguas, de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO : 25 o con respecto a los aminoácidos 107-365 de la SEQ IS NO: 25.
En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 es la SEQ ID NO: 26. En otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 es una variante de proteasa de Caspasa 3 de origen natural, tales como, por ejemplo, una isoforma de proteasa de Caspasa 3. En aun otro aspecto de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 es una variante de proteasa de Caspasa 3 de origen no natural, tales I como, por ejemplo, una variante de proteasa de Caspasa 3 conservadora, una variante de proteasa de Caspasa 3 no conservadora, una quimera de proteasa de Caspasa 3, un fragmento de proteasa de Caspasa 3 activo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta modalidad, se obtiene una proteasa de Caspasa 3, una variante de proteasa de Caspasa 3 de origen natural o una variante de proteasa de Caspasa 3 de origen no natural de una especie de mamífero tales como, por ejemplo, un ser humano, una vaca o un roedor.
En otros aspecto de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% con la SEQ ID NO: 26; o como máximo el 70%, como máximo el 75%, como máximo el 80%, como máximo el 85%, como máximo el 90% o como máximo el 95% con SEQ ID NO: 26. En otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguas respecto de SEQ ID NO: 26; o! como máximo el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguas con respecto a la SEQ ID NO: 26. En otros aspectos más de esta modalidad, una proteasa de Caspasa 3 comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguas respecto de SEQ ID NO: 26; o como máximo el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 supresiones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguas respecto de SEQ ID NO: 26.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, un constructo de expresión doble. Un constructo de expresión doble comprende dos moléculas de polinucleótidos, donde cada una incluye un marco de lectura abierto descrito en la presente descripción unido operativamente a un vector de expresión útil para expresar ambas moléculas de polinucleótidos en un extracto celular o libre de células. Puede emplearse una amplia variedad de vectores de expresión doble para expresar una molécula de polinucleótidos descrita en la presente descripción, que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, un vector de expresión doble viral; un vector de expresión doble procariota; un vector de expresión doble eucariota, como ser, por ejemplo, un vector de expresión doble de levadura, un vector de expresión doble de insecto y un vector de expresión doble de mamífero; y un vector de expresión doble de extracto libre de células. Además, cabe destacar que los vectores de expresión doble útiles para poner en práctica aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan las moléculas de polinucleótidos bajo el control de un elemento potenciador o elemento promotor constitutivo, especifico de tejido, especifico de célula o inducible o ambos. Ejemplos no taxativos de vectores de expresión doble, junto con reactivos y condiciones bien establecidos para la! producción y para el uso de un constructo de expresión a partir de los vectores de expresión se encuentran fácilmente disponibles de sus fabricantes comerciales entre los que se encuentra EMD Biosciences-Novagen, de Madison, WI, sin que la enumeración sea taxativa. La selección, producción y uso de un vector de expresión doble apropiado son procedimientos de rutina que se encuentran dentro del alcance de los expertos en la técnica y de las enseñanzas de la presente.
Los constructos de expresión doble descritas en la presente descripción pueden comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que incluye una región de bucle bicatenario que comprende a su vez un sitio de escisión de proteasa exógena y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, lo que convierte la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria.
De esta manera, en una modalidad, un constructo de expresión doble comprende un marco de lectura abierto que I codifica una proteína que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena de acuerdo con lo descrito en la presente descripción, y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario, de acuerdo con lo descrito en la presente descripción.
En un aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que incluye una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV. En otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que incluye un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión con la toxina de Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV. En otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que incluye un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión con la toxina de Clostridium, una región de bucle bicatenario y un sitio de escisión de proteasa TEV, donde el sitio de escisión de proteasa TEV se encuentra ubicado dentro de la región de bucle bicatenario y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV.
En un aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión con la toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa que puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario. En otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión con la toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV. En aun otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión con la toxina no Clostridium, una región de bucle bicatenario y un sitio de escisión de proteasa TEV, donde el sitio de escisión de proteasa TEV se encuentra ubicado dentro de la región de bucle bicatenario y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV.
En un aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, y un dominio de unión a sitio de escisión de proteasa integrado. En otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión a sitio de escisión de proteasa TEV integrado y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV. En aun otro aspecto de esta modalidad, un constructo de expresión doble puede comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de translocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a sitio de escisión de proteasa TEV integrado, donde el sitio de escisión de proteasa TEV se encuentra ubicado dentro de la región de bucle bicatenario y otro marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV.
La ubicación de uno de los marcos de lectura abiertos contenidos dentro del constructo de expresión doble puede estar en cualquier orden respecto de la ubicación del otro marco de lectura abierto, con la salvedad de que aún puede producirse una transcripción desde ambos marcos de lectura abiertos. Típicamente, cuando se lleva a cabo un constructo de expresión doble, el inicio de la transcripción de la primera región promotora transcribe ambos marcos de lectura abiertos, mientras que el inicio de la transcripción de la segunda región promotora transcribe solo uno de los marcos de lectura abiertos. De esta forma, según la ubicación del marco de lectura abierto respecto de la primera y de la segunda regiones promotoras, puede producirse el doble de transcripciones desde uno de los marcos de lectura abiertos.
De esta manera, en una modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteasa se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En un aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV que se encuentra dentro de la región de bucle bicatenario se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En otro aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un domino de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En otro aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un domino de translocación de toxina de Clostridium, y un dominio de unión a sitio de escisión de proteasa TEV integrado se encuentra bajo el control de ambas regiones promotora, la primera y la segunda.
En otra modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteasa se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En un aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de ! escisión de proteasa TEV se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En otro aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteina .que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un domino de translocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión de toxina no Clostridium, y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV se encuentra bajo el control de la primera región promotora mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda. En aun otro aspecto de esta modalidad, el marco de lectura abierto que codifica una proteina que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un domino de translocación de toxina de Clostridium, y un dominio de unión a sitio de escisión de proteasa TEV integrado se encuentra bajo el control de la primera región promotora, mientras que el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV se encuentra bajo el control de ambas regiones promotoras, la primera y la segunda.
La orientación 5 '-3' de uno de los marcos de lectura abiertos contenida dentro del constructo de expresión doble puede estar en cualquier dirección respecto de la orientación 5 ' -31 del otro marco de lectura abierto, con la salvedad de que aún puede producirse una transcripción desde ambos marcos de lectura abiertos. En una modalidad, la orientación 5 '-3' de uno de los marcos de lectura abiertos se encuentra en la misma dirección que la orientación 5' -3' del otro marco de lectura abierto. En otra modalidad, la orientación 5' -3' de uno de los marcos de lectura abiertos se encuentra en dirección opuesta a la orientación 5' -3' del otro marco de lectura abierto. En un aspecto de esta modalidad, la orientación 5 '-3' de uno de los marcos de lectura abiertos es convergente respecto de la orientación 51 -3 ' del otro marco de lectura abierto. En otro aspecto de esta modalidad, la orientación 5 '-3' de uno de los marcos de lectura abiertos es divergente respecto de la orientación 51 -3 ' del otro marco de lectura abierto.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, una proteina que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un s!itio de escisión de proteasa exógena. De acuerdo con lo empleado en la presente, la expresión "región de bucle bicatenario" hace referencia a la secuencia de aminoácidos de una toxina de Clostridium que contiene un sitio de escisión de proteasa usado para convertir la forma monocatenaria de una toxina de Clostridium en una forma bicatenaria. Entre los ejemplos no taxativos de una región de bucle bicatenario de toxina de Clostridium se incluyen una región de bucle bicatenario de BoNT/A que comprende aminoácidos 430-454 de SEQ ID NO: 1; una región de bucle bicatenario de BoNT/B que comprende aminoácidos 437-446 de SEQ ID NO: 2; una región de bucle bicatenario de BoNT/Cl que comprende aminoácidos 437-453 de SEQ ID NO: 3; una región de bucle bicatenario de BoNT/D que comprende aminoácidos 437-450 de SEQ ID NO: 4; una región de bucle bicatenario de BoNT/E que comprende aminoácidos 412-426 de SEQ ID NO: 5; una región de bucle bicatenario de BoNT/F que comprende aminoácidos 429-445 de SEQ ID NO: 6; una región de bucle bicatenario de BoNT/G que comprende aminoácidos 436-450 de SEQ ID NO: 7; una región de bucle bicatenario de TeNT que comprende aminoácidos 439-467 de SEQ ID NO: 8; una región de bucle bicatenario de BaNT que comprende aminoácidos 421-435 de SEQ ID NO: 9; y una región de bucle bicatenario de BuNT que comprende aminoácidos 412-426 de SEQ ID NO: 10 (Tabla 2) .
Región de bucle bicatenario de toxinas De acuerdo con lo mencionado con anterioridad, las toxinas de Clostridium son traducidas como un polipéptido monocatenario de alrededor de 150 kDa que es escindido con posterioridad por escisión proteolitica dentro de un bucle de bisulfuro por una proteasa de origen natural. Este procesamiento posterior a la traducción da una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de alrededor de 50 kDa y una cadena pesada (HC) de alrededor de 100 kDa unidas por un enlace único de bisulfuro e interacciones no covalentes. Si bien se desconoce la identidad de la proteasa en la actualidad, se ha determinado el sitio de escisión de la proteasa de bucle bicatenario para muchas toxinas de Clostridium. En BoNT, la escisión en K448-A449 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/A en la forma bicatenaria; la escisión en K441-A442 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/B en la forma bicatenaria; la escisión en 449-T450 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/Cl en la forma bicatenaria; la escisión en R445-D446 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en R422-K423 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión en K439-A440 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/F en la forma bicatenaria; y la escisión en K446-S447 convierte la forma única de polipéptido de BoNT/G en la forma bicatenaria. La escisión proteolitica de la forma única de polipéptido de TeNT en A457-S458 da como resultado la forma bicatenaria. La escisión proteolitica de la forma única de polipéptido de BaNT en K431-N432 da como resultado la forma bicatenaria. La escisión proteolitica de la forma única de polipéptido de BuNT en R422-K423 da como resultado la forma bicatenaria. Un sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario como este está unido operativamente dentro del marco a una toxina de Clostridium modificada como una proteina de fusión. Sin embargo, asimismo, cabe destacar que los sitios de escisión adicionales dentro del bucle bicatenario también parecen ser escindidos, lo que da como resultado la generación de un fragmento de péptido pequeño que se pierde. A modo de ejemplo no taxativo, una escisión de un polipéptido monocatenario BoNT/A da como resultado, en definitiva, la pérdida de un fragmento de diez aminoácidos dentro del bucle bicatenario.
Se prevé que cualquier molécula que comprenda una región de bucle bicatenario puede ser modificada de manera que incluya un sitio de escisión de proteasa exógena para los métodos descritos. Entre los ejemplos de moléculas que pueden tener un bucle bicatenario modificado de manera que incluya un sitio de escisión de proteasa exógena útil para los métodos descritos se incluyen, por ejemplo, Keith A. Foster et ál., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, la patente estadounidense 5.989.545; Clifford C. Shone et ál., Recombinant Toxin Fragments, la pátente estadounidense 6.461.617; Conrad P. Quinn et ál., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, la patente estadounidense 6.632.440; Lance E. Steward et ál., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, la patente estadounidense 6.843.998; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, la patente estadounidense 7.244.437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, la patente estadounidense 7.413.742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, la patente estadounidense 7.425.338, cada uno de los cuales es incorporado en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Una región de bucle bicatenario es modificada por la adición de un sitio de escisión de proteasa exógena. De la forma empleada en la presente, la expresión, "sitio de escisión de proteasa exógena" es sinónimo de "sitio de escisión de proteasa de origen no natural", o "sitio de escisión de proteasa no nativa" y hace referencia a un sitio de escisión de proteasa que no se encuentra presente normalmente en una región de bucle bicatenario desde una toxina de Clostridium de origen natural. Se prevé que todos y cualquiera de los sitios de escisión de proteasa exógena que pueden ser empleados para convertir la forma de polipéptido monocatenario de una toxina de Clostridium en la forma bicatenaria resultan útiles para poner en práctica aspectos de la presente invención. Entre los ejemplos no taxativos de sitios de escisión de proteasa exógena se incluyen, por ejemplo, un sitio de escisión de proteasa enterocinasa, un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de escisión de proteasa de enterovirus humano 3C, un sitio de escisión de proteasa de grabado de tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) , un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco (TV V, por sus siglas en inglés) , un sitio de escisión de proteasa de subtilisina o un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3.
Se prevé que un sitio de escisión de proteasa exógena de todas y cualquiera de sus longitudes pueden resultar útiles en aspectos de la presente invención con la salvedad de que el sitio de escisión de proteasa exógena sea capaz de ser escindido por su respectiva proteasa. De esta manera, en aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de proteasa exógena puede presentar una longitud de por ejemplo como minimo 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 aminoácidos; o como máximo 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 aminoácidos.
En una modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa exógena. En aspectos de esta modalidad, una región de bucle bicatenario es modificada de manera que comprenda, por ejemplo, un sitio de escisión de proteasa enterocinasa, un sitio de escisión de proteasa de virus de grabado del tabaco, un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco, un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de escisión de proteasa de enterovirus humano 3C un sitio de escisión de subtilisina, y un sitio de escisión de Caspasa 3. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa exógena se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT . En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa exógena es ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En un aspecto de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de virus de grabado de tabaco que presenta la secuencia de consenso E-P5-P4-Y-P2-Q*-G (SEQ ID NO: 27) o E-P5-P4-Y-P2-Q*-S (SEQ ID NO: 28), donde P2, P4 y P5 pueden ser cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de virus de grabado de tabaco que comprende SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de virus de grabado de tabaco se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT. En otros aspectos ' de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de virus de grabado de tabaco está ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina que se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En otro aspecto de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco que presenta la secuencia de consenso P6-P5-V-R-F-Q*-G (SEQ ID NO: 39) o P6-P5-V-R-F-Q*-S (SEQ ID NO: 40), donde P5 y P6 pueden ser cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de moteado de las venas del tabaco que comprende SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, o SEQ ID NO: 44. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT . En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco es ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina que se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En aun otro aspecto de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C que presenta la secuencia de consenso P5-P4-L-F-Q*-G-P (SEQ ID NO: 45), donde P4 es G, A, V, L, I, M, S o T y P5 puede ser cualquier aminoácido, prefiriéndose D o E. En otros aspectos de la modalidad, una región de bucle bicatenario comprende . un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C que comprende SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 51. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C está ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina que se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En aun otro aspecto de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa subtilisina que presenta la secuencia de consenso P6-P5-P4-P3-H*-Y (SEQ ID NO: 52) o P6-P5-P4-P3-Y-H* (SEQ ID NO: 53), donde P3, P4, P5 y P6 pueden ser cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa de subtilisina que comprende SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de subtilisina se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT.
En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de subtilisina está ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En un aspecto adicional de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3 que presenta la secuencia de consenso D-P3-P2-D*P1' (SEQ ID NO: 57) , donde P3 puede ser cualquier aminoácido, prefiriéndose E, P2 puede ser cualquier aminoácido y Pl ' puede ser cualquier aminoácido, prefiriéndose G o S. En otros aspectos de la modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3 que comprende SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 63. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3 se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuN . En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3 está ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
En aun otros aspectos de esta modalidad, una región de bucle bicatenario comprende un sitio de escisión de proteasa enterocinasa que presenta la secuencia de consenso DDDDK (SEQ ID NO: 64). En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa enterocinasa se encuentra ubicado dentro del bucle bicatenario de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, o BuNT. En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa enterocinasa es ubicado dentro del bucle bicatenario de una proteina descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.989.545; en la patente estadounidense 6.461.617; en la patente estadounidense 6.632.440; en la patente estadounidense 6.843.998; en la patente estadounidense 7.244.437; en la patente estadounidense 7.413.742; y en la patente estadounidense 7.425.338.
Una región de bucle bicatenario es modificada de manera de reemplazar un sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario de origen natural por un sitio de escisión de proteasa exógena. En esta modificación, el sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario de origen natural pasa a ser inoperable y de esta manera, no puede ser escindido por su proteasa. Solo el sitio de escisión de proteasa exógena puede ser escindido por su correspondiente proteasa exógena. En este tipo de modificación, el sitio de proteasa exógena está unido operativamente dentro del marco a una toxina de Clostridium modificada como una proteiná de fusión y el sitio puede ser escindido por su respectiva proteasa exógena. El reemplazo de un sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario endógena por un sitio de escisión de proteasa exógena puede ser una sustitución de los sitios donde el sitio exógeno se diseña en la posición que se aproxima a la ubicación del sitio de escisión del sitio endógeno. El reemplazo de un sitio de escisión de proteasa de bucle bicatenario endógena por un sitio de escisión de proteasa exógena puede ser la adición de un sitio exógeno donde el sitio exógeno se diseña en una posición diferente a la ubicación del sitio de escisión del sitio endógeno, el sitio endógeno se diseña de forma que resulte inoperable.
Un sitio de escisión de proteasa de origen natural contenido dentro de la región de bucle bicatenario puede tornarse inoperable al alterar al menos dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por la proteasa de bucle bicatenario de origen natural. Pueden hacerse modificaciones más amplias, con la salvedad de que los dos residuos de cisteina de la región de bucle bicatenario permanezcan intactos y que la región aún pueda formar un puente de disulfuro. Entre los ejemplos no taxativos de una alteración de aminoácidos se incluye la eliminación de un aminoácido o el reemplazo del aminoácido original por un aminoácido diferente. De esta forma, en una modalidad, un sitio de escisión de proteasa de origen natural contenido dentro de la región de bucle bicatenario puede tornarse inoperable al alterar los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa de origen natural contenido dentro de la región de bucle bicatenario pasa a ser inoperable al alterar, por ejemplo, al menos tres aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos cuatro aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos cinco aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos seis aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos siete aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos ocho aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos nueve aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos diez aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; al menos quince aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; o al menos veinte aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural .
En aun otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de proteasa bicatenaria de origen natural contenido dentro de la región de bucle bicatenario pasa a ser inoperable al alterar, por ejemplo, como máximo tres aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen forma natural; como máximo cuatro aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo cinco aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo seis aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo siete aminoácidos que incluyen I los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo ocho aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo nueve aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo diez aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; como máximo quince aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural; o como máximo veinte aminoácidos que incluyen los dos aminoácidos que flanquean el enlace de péptido escindido por una proteasa de origen natural .
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, una célula. Se prevé que pueden usarse todas y cualquiera de las células. De esta manera, los aspectos de esta modalidad incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, células procariotas que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, cepas de células bacterianas aerobias, microaerofilicas, capnofilicas , facultativas, anaerobias, de Gram negativo y de Gram positivo tales como aquellas que derivan, por ejemplo, de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucariotas que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, cepas de levadura como ser, por ejemplo, aquellas derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia augusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y lineas celulares derivadas de insectos, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamíferos y líneas celulares derivadas de células de mamíferos, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de ratón, rata, hámster, cerdo, vaca, caballo, primate y ser humano. Las líneas celulares pueden conseguirse en American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures y Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures . Ejemplos no taxativos de protocolos específicos para seleccionar, producir y emplear una línea celular adecuada se describen en, por ejemplo, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Matt eus F. A. Goosen et ál. eds . , Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et ál. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997) ; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et ál eds . , John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS : A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4° edición, 2000) ; ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3O edición, 2000) ; MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, anteriormente, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2° edición, 2002) ; y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, anteriormente, (2004) . Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y a partir de las enseñanzas de la presente.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, la introducción en una célula de un constructo de expresión o de un constructo de expresión doble de acuerdo con lo descrito en la presente descripción. Un constructo de expresión o un constructo de expresión doble introducida en una célula puede ser mantenido en forma transitoria o estable por esa célula. Los constructos de expresión mantenidos en forma estable o los constructos de expresión doble pueden ser extracromosómicas y pueden replicarse de manera autónoma, o bien pueden estar integrados en el material cromosómico de la célula y pueden replicarse de manera no autónoma. Se prevé que pueden usarse todos y cualquiera de los métodos para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble que describe la presente descripción dentro de una célula. Entre los métodos útiles para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble en una célula se incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, la transfección mediada químicamente como ser, por ejemplo, una transfección mediada por fosfato de calcio, por dietilaminoetil (DEAE, por sus siglas en inglés) dextrano, por lípidos, por polietilenimina (PEI, por sus siglas en inglés) , por polilisina y por polibreno, una transfección mediada físicamente como ser, por ejemplo, una transfección de administración de partícula biolística, de microinyección, de fusión de protoplasto y de electroporación y una transfección mediada viralmente, como ser, por ejemplo, una transfección mediada por retrovirales , referirse, por ejemplo, a Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pág. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds . , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a edición, 2001) . El experto en el arte comprende que la selección de un método específico para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá en forma transitoria el constructo de expresión o el constructo de expresión doble, o si la célula contendrá de manera estable el constructo de expresión o el constructo de expresión doble. Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y a partir de las enseñanzas de la presente.
En un aspecto de esta modalidad, se usa un método mediado químicamente, denominado transfeccion, para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción dentro de una célula. En métodos de transfeccion mediados químicamente, el reactivo químico forma un complejo 'con el constructo de expresión o el constructo de expresión doble que facilita su absorción en las células. Los reactivos químicos incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, mediados por fosfato de calcio, véase, por ejemplo, Martin Jordán & Florian orm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Métodos 136-143 (2004); mediados por dietilaminoetil (DEAE, por sus siglas en inglés) dextrano, mediados por lípidos, mediados por polímeros catiónicos tipo mediados por polietilenimina (PEI, por sus siglas en inglés) y mediados por polilisina y mediados por polibreno véase, por ejemplo, Chun Zhang et ál., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Métodos 144-150 (2004). Los sistemas de administración mediados químicamente pueden prepararse a través de métodos estándar y están comercialmente disponibles en, véase, por ejemplo, kit de transfección CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ; kit de transfección en mamíferos, fosfato de calcio y DEAE Dextrano, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) ; reactivo de transfección Lipofectamine™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) ; kit de transfección ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD) y los kits de transfección SuperFect y Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA) .
En otro aspecto de esta modalidad, se usa un método mediado físicamente para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción dentro de una célula. Las técnicas físicas incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, la de electroporación, la biolística y la de microinyección . Las técnicas biolísticas y de microinyección perforan la pared celular con el fin de introducir el constructo de expresión o el constructo de expresión doble en la célula, véase, por ejemplo, Jeike E. Biewenga et ál., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); y John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Métodos 121-125 (2004). La electroporación, también denominada electropermeabilización, utiliza impulsos eléctricos breves, de alta tensión, para crear poros transitorios en la membrana a través de los cuales ingresan las moléculas de polinucleótidos y pueden ser usadas en forma efectiva para transfecciones estables y temporales de todos los tipos de célula, véase, por ejemplo, M. Golzio et ál., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Métodos 126-135 (2004); y Oliver Greschet ál., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Métodos 151-163 (2004).
En otro aspecto de esta modalidad, se usa un método mediado viralmente, definido como transducción, para introducir un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción dentro de una célula. En métodos mediados por virales de transducción transitoria, se ha manipulado el proceso a través del cual las partículas virales infectan y se replican en una célula huésped con el fin de usar este mecanismo para introducir el constructo de expresión o el constructo de expresión doble en la célula. Los métodos mediados viralmente han sido desarrollados a partir de una amplia variedad de virus que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes simple, picornavirus , alfavirus y baculovirus, véase, por ejemplo, a Armin Blesch, Lentíviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Métodos 164-172 (2004); y Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 ethods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003) ; Karim Benihoud et ál, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et ál., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et ál., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et ál., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Métodos 179-186 (2004); Ilya Frolov et ál., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002) ; Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); y A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).
Los adenovirus, que son virus de ADN bicatenario, sin membrana, se seleccionan, con frecuencia, para transducción de células de mamíferos dado que los adenovirus manejan moléculas de polinucléotidos relativamente grandes, de alrededor de 36 kb, se producen a alta titulación, y pueden infectar con eficacia una amplia variedad de células tanto de división como de no división, véase, por ejemplo, Wim T. J. M. C. Hermens et ál., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); y Hiroyuki Mizuguchi et él., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001) . La transducción que utiliza un sistema basado en adenovirus no soporta la expresión prolongada de proteínas dado que la molécula de ácido nucleico es transportada por un episoma en el núcleo de las células, en vez de ser integrado en el cromosoma de la célula huésped. Los sistemas de vectores adenovirales y los protocolos específicos referidos a la forma de uso de los vectores se describen, por ejemplo, en Sistema de Expresión Adenoviral VIRAPOWER™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y en Manual de Instrucciones 25-0543 versión del Sistema de Expresión Adenoviral AVIRAPO ER™, Invitrogen, Inc., (15 de julio de 2002); y en el Sistema de Vector Adenoviral ADEASY™ (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y Manual de Instrucciones 064004f del Sistema de Vector Adenoviral ADEASY™, Stratagene, Inc.
La introducción de un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente memoria en una célula también pueden ser lograda mediante el uso de retrovirus de ARN monocatenaria, como ser, por ejemplo, oncorretrovirus y lentivirus. La transducción mediada por retrovirus produce, con frecuencia, eficiencias de transducción cercanas al 100%, puede controlar con facilidad la cantidad de copias provirales mediante la variación de la multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés), y puede ser usada para transducir células en forma transitoria o estable, véase, por ejemplo, a Tiziana Tonini et ál., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Métodos 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell Unes and transgenic animáis, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y a Roland Wolkowicz et ál., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Las partículas retrovirales consisten de un genoma de ARN empaquetado en una cápsida de proteína, rodeado por una membrana de lípidos. El retrovirus infecta una célula huésped mediante la inyección de su ARN en el citoplasma junto con la enzima de transcríptasa inversa. La plantilla de ARN es luego transcripta en forma inversa en un cADN bicatenario, lineal, que se replica a sí mismo al integrarse en el genoma de la célula huésped. Las partículas virales son esparcidas en forma vertical (desde la célula madre a las células hija a través del provirus), o bien, en forma horizontal (de célula a célula a través de viriones) . Esta estrategia de replicacion permite una expresión persistente a largo plazo dado que las moléculas de ácido nucleico de interés son integradas en forma estable en un cromosoma de la célula huésped, lo que permite la expresión a largo plazo de la proteina. Por ejemplo, estudios en animales han demostrado que los vectores lentivirales inyectados en una variedad de tejidos producen una expresión de proteina sostenida por más de 1 año, véase, por ejemplo, a Luigi Naldini et ál . , In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272 ( 5259 ) Science 2 S3-2 67 ( 1996 ) . Los sistemas de vectores derivados de oncorretrovirus, como ser, por ejemplo, virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV, por sus siglas en inglés) , son ampliamente usados e infectan muchas células diferentes de no división. Los lentivirus también pueden infectar muchos tipo de células diferentes, entre los que se incluyen células de división y de no división y poseen proteínas de cubierta compleja, lo que permite un gran direccionamiento celular específico.
Los vectores retrovirales y los protocolos específicos referidos a la forma de usar los vectores se describen, por ejemplo, en Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline- responsive promoters, la patente estadounidense 5.464.758, Hermann Bu ard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, la patente estadounidense 5.814.618, David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, la patente estadounidense 5.514.578, y David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, la patente estadounidense 6.245.531; Elisabetta Vegeto et ál., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, la patente estadounidense 5.364.791, Elisabetta Vegeto et ál., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, la patente estadounidense 5.874.534, y Elisabetta Vegeto et ál., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, la patente estadounidense 5.935.934. Además, los sistemas de administración viral pueden ser preparados a través de métodos estándar y están comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, Sistemas de Expresión Génica Tet-Off y Tet-On BD™ (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) y Manuales del Usuario de los Sistemas de Expresión Génica Tet-Off y Tet-OnBD™, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de 2003), Sistema GENESWITCH™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y Sistema de Expresión Regulado por el Sistema A de mifepristona GENESWITCH™ para células de mamífero versión D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de noviembre de 2002); Sistema de Expresión Lentiviral VIRAPOWER™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y Manual de Instrucciones 25-0501 versión E del Sistema de Expresión Lentiviral VIRAPOWER™, Invitrogen, Inc., (8 de diciembre de 2003); Sistema de Expresión Mamifera Inducible Retroviral COMPLETE CONTROL® (Stratagene, La Jolla, CA) y Manual de Instrucciones 064005e del Sistema de Expresión Mamifera Inducible Retroviral COMPLETE CONTROL®.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, la expresión de un constructo de expresión o constructo de expresión doble descrito en la presente descripción. Se prevé que cualquiera de una variedad de sistemas de expresión pueda ser de utilidad para la expresión de un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción, incluyendo, sin limitación, sistemas de base celular y sistemas de expresión libre de células. Los sistemas de base celular incluyen, sin limitación, sistemas de expresión virales, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión de levaduras, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas libres de células incluyen, sin limitación, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocitos de conejo y. extractos de E. coli y, en general, son equivalentes al método descrito en la presente. La expresión de un constructo de expresión o constructo de expresión doble usando un sistema de expresión pueden incluir cualquiera de una variedad de características que incluyen, sin limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada por virus, expresión integrada de forma estable y expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores bien caracterizados, reactivos, condiciones y células están bien establecidos y están disponibles con facilidad de vendedores comerciales que incluyen, sin limitación, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianápolis , IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Los ejemplos no taxativos de la selección y el uso de sistemas de expresión heterólogos apropiados se describen, por ejemplo, en PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins y B. David Hames eds . , Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernández & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999) ; y Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001). Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de sus enseñanzas.
Una variedad de procedimientos de expresión con base celular es de utilidad para la expresión de un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción. Los ejemplos incluyen, sin limitación, sistemas de expresión virales, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión de levaduras, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas de expresión virales incluyen, sin limitación, VIRAPO ER™ Lentiviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistemas de Expresión Adenoviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema de Expresión Adenoviral ADEASY™ XL (Stratagene, La Jolla, CA) y Sistema de Expresión Génica Retroviral VIRAPORT® (Stratagene, La Jolla, CA) . Los ejemplos no taxativos de sistemas de expresión procariotas incluyen el Sistema de Expresión pET CHAMPION™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), Sistema de Expresión Bacteriana TRIEX™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), Sistema de Expresión QIAEXPRESS® (QIAGEN, Inc.) y Sistema de Purificación y Expresión de Proteína AFFINITY® (Stratagene, La Jolla, CA) . Los sistemas de expresión de levaduras incluyen, sin limitación, Kit de Expresión Pichia EASYSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Kits de Vector de Expresión YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y Sistema de Expresión S. pombe SPECTRA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) . Los ejemplos no taxativos de sistemas de expresión de baculovirus incluyen BACULODIRECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y BD BACULOGOLD™ (BD Biosciences-Pharmigen , San Diego, CA) . Los sistemas de expresión de insectos incluyen, sin limitación, Sistema de Expresión Drosophila (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema INSECTSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y Sistema INSECTDIRECT™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Los ejemplos no taxativos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen Sistema T-REX™ (Expresión regulada por tetraciclinas ) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema FLP-IN™ T-REX™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema pcDNA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema pSecTag2 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema EXCHANGER® , Sistema de TAP de Mamífero INTERPLAY™ (Stratagene, La Jolla, CA) , Sistema de Expresión de Mamífero Inducible COMPLETE CONTROL® (Stratagene, La Jolla, .CA) y Sistema de Expresión de Mamífero Inducible II LACSWITCH® (Stratagene, La Jolla, CA) .
Otro procedimiento de la expresión de un constructo de expresión o un constructo de expresión doble descrito en la presente descripción emplea un sistema de expresión libre de células tales como, sin limitación, extractos procariotas y extractos eucariotas. Los ejemplos no taxativos de extractos de células procariotas incluyen el kit HY RTS 100 E. coli (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) , Kit de Traducción In Vitro ACTIVEPRO™ (Ambion, Inc., Austin, TX) , Sistema ECOPRO™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y Sistema de Expresión Plus Expressway™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) . Los extractos de células eucariotas incluyen, sin limitación, el kit CECF de germen de trigo RTS 100 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) , Sistemas de Extractos de Germen de Trigo Acoplado TNT® (Promega Corp., Madison, WI), Kit de Germen de Trigo IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX) , Kit de Lisado . de Reticulocitos IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX) , Sistema II PROTEINSCRIPT® (Ambion, Inc., Austin, TX) y Sistemas de Lisado de Reticulocito Acoplado TNT® (Promega Corp., Madison, WI) .
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, en parte, crecimiento de una célula a una primera temperatura durante cierto período , de tiempo y luego crecimiento de la célula a una segunda temperatura durante cierto período de tiempo. La primera y la segunda temperatura y los períodos de tiempo en que crecen las células a la primera y la segunda temperaturas se determinan en base a la cantidad deseada de proteína para ser expresada por la célula y la eficiencia de escisión deseado en el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario para convertir la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria.
En una modalidad, una célula se cultiva a una primera temperatura durante cierto período de tiempo a fin de lograr una máxima densidad celular. En aspectos de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 0,5 horas, aproximadamente 1,0 hora, aproximadamente 1/5 horas, aproximadamente 2,0 horas , aproximadamente 3,0 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,0 horas, aproximadamente 5,0 horas, aproximadamente 6,0 horas, aproximadamente 7,0 horas, aproximadamente 8,0 horas , aproximadamente 9,0 horas o aproximadamente 10 horas . En otros aspectos de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 42 °C durante aproximadamente 0,5 horas, aproximadamente 1,0 hora, aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,0 horas, aproximadamente 3,0 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,0 horas, aproximadamente 5,0 horas. En aspectos de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 0,5 horas, aproximadamente 1,0 hora, aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,0 horas, aproximadamente 3,0 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,0 horas, o aproximadamente 5,0 horas. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 12 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, a aproximadamente 20 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, o a aproximadamente 24 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 12 °C a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, o a aproximadamente 20 °C a aproximadamente 24 °C durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas.
En otra modalidad, una célula se cultiva a una segunda temperatura durante cierto periodo de tiempo a fin de lograr máxima inducción de la expresión de proteínas. En aspectos de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5,5 horas, aproximadamente 6,5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas, aproximadamente 10,5 horas, aproximadamente 11,5 horas, aproximadamente 12,5 horas, aproximadamente 13,5 horas, aproxim damente 14,5 horas, aproximadamente 15,5 horas, aproximadamente 16,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas. En otros aspecto de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5,5 horas, aproximadamente 6,5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas, aproximadamente 10,5 horas, aproximadamente 11,5 horas, aproximadamente 12,5 horas, aproximadamente 13,5 horas, aproximadamente 14,5 horas, aproximadamente 15,5 horas, aproximadamente 16,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 25 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5,5 horas, aproximadamente 6,5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas, aproximadamente 10,5 horas, aproximadamente 11,5 horas, aproximadamente 12,5 horas, aproximadamente 13,5 horas, aproximadamente 14,5 horas, aproximadamente 15,5 horas, aproximadamente 16,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 22 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5,5 horas, aproximadamente 6,5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas, aproximadamente 10,5 horas, aproximadamente 11,5 horas, aproximadamente 12,5 horas, aproximadamente 13,5 horas, aproximadamente 14,5 horas, aproximadamente 15,5 horas, aproximadamente 16,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas. En otros aspectos de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas , aproximadamente 5, 5 horas, aproximadamente 6, 5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas, aproximadamente 10, 5 horas, ¦aproximadamente 11, 5 horas, aproximadamente 12, 5 horas , aproximadamente 13, 5 horas, aproximadamente 14, 5 horas, aproximadamente 15,5 horas, aproximadamente 16,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas. En aun otros aspectos más de esta modalidad, una célula se cultiva a aproximadamente 12 °C durante aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5, 5 horas, aproximadamente 6, 5 horas, aproximadamente 7,5 horas, aproximadamente 8,5 horas, aproximadamente 9,5 horas , aproximadamente 10, 5 horas , aproximadamente 11, 5 horas, aproximadamente 12, 5 horas, aproximadamente 13, 5 horas, aproximadamente 14, 5 horas, aproximadamente 15, 5 horas, aproximadamente 16 ,5 horas, o aproximadamente 24,5 horas.
Los aspectos de la presente invención también se pueden describir de la siguiente manera: 1. Un método intracelular de conversión de proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, que comprende las etapas de: a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a una primera temperatura durante cierto periodo de tiempo a fin de lograr máxima densidad celular, donde el constructo de expresión doble comprende; i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa; donde la proteasa puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; b) crecimiento de la célula a una segunda temperatura durante cierto periodo de tiempo a fin de lograr máxima inducción de la expresión de proteina del marco de lectura abierto que codifica la proteina monocatenaria, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y la proteasa del constructo de expresión doble; y donde la proteasa producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro . de la región de bucle bicatenario, convirtiendo así la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria . 2. Un método intracelular de conversión de toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria, que comprende las etapas de: a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 3,5 horas, donde el constructo de expresión doble comprende; i) un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium monocatenaria, la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa; donde la proteasa puede escindir el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro del bucle bicatenario; b) crecimiento de la célula ' a 22 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la toxina de Clostridium monocatenaria y la proteasa del constructo de expresión doble; y donde la proteasa producida escinde la toxina de Clostridium monocatenaria en el sitio de escisión de proteasa exógena ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, convirtiendo asi la toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria. 3. El método intracelular de acuerdo con 2, donde la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión' de la toxina de Clostridium; 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio de unión de la toxina de Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 3) el dominio de unión de la toxina de Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión de la toxina de Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de la toxina de Clostridium; o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio de unión de Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium. 4. El método intracelular de acuerdo con 2, donde el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de ; BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT, o un dominio enzimático de BuNT. 5. El método intracelular de acuerdo con 2 , donde el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT, o un dominio de translocación de BuNT. 6. El método intracelular de acuerdo con 2, donde el dominio de unión de la toxina de Clostridium es un dominio de unión de BoNT/A, un dominio de unión de BoNT/B, un dominio de unión de BoNT/Cl, un dominio de unión de BoNT/D, un dominio de unión de BoNT/E, un dominio de unión de BoNT/F, un dominio de unión de BoNT/G, un dominio de unión de TeNT, un dominio de unión de BaNT, o un dominio de unión de BuNT. 7. El método intracelular de acuerdo con 2, donde el sitio de escisión de proteasa exógena es un sitio de escisión de proteasa enterocinasa, un sitio de escisión de proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de escisión de proteasa de enterovirus humano 3C, un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) , un sitio de escisión de proteasa de virus de moteado de las venas del tabaco (TVMV, por sus siglas en inglés), un sitio de escisión de proteasa de subtilisina o un sitio de escisión de proteasa Caspasa 3. 8. El método intracelular de acuerdo con 2, donde la proteasa es una proteasa enterocinasa, una proteasa de rinovirus humano 3C, una proteasa de enterovirus humano 3C, una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) , una proteasa del moteado de las venas del tabaco (TVMV, por sus siglas en inglés) , una proteasa de subtilisina o una proteasa Caspasa 3. 9. Un método intracelular de conversión de proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, que comprende las etapas de a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 8 horas, donde el constructo de expresión doble comprende; i) un marco de lectura abierto que codifica una proteína monocatenaria, la proteína monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) crecimiento de la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la proteína monocatenaria y la proteasa TEV del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, convirtiendo así la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria. 10. El método intracelular de acuerdo con 9, donde la proteína comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, 3) el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, 4) el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado. 11. El método intracelular de acuerdo con 9, donde el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT, o un dominio enzimático de BuNT. 12. El método intracelular de acuerdo con 9, donde el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT, o un dominio de translocación de BuNT. 13. El método intracelular de acuerdo con 9, donde el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado es un dominio de unión de nociceptina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de dinorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de encefalina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de BAM22 al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de endomorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión a endorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de hemorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, o un dominio de unión de rimorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado . 14. Un método intracelular de conversión de proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, que comprende las etapas de: a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 8 horas, donde el constructo de expresión doble comprende i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria, la proteina monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión de toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un s'itio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) crecimiento de la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y la proteasa TEV del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, convirtiendo asi la proteina monocatenaria en su forma bicatenaria . 15. El método intracelular de acuerdo con 14, donde la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de toxina no Clostridium; 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de unión de toxina no Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 3) el dominio de unión de toxina no Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión de toxina no Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de toxina no Clostridium; o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena, el dominio de unión no Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium. 16. El método intracelular de acuerdo con 14, donde el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT, o un dominio enzimático de BuNT. 17. El método intracelular de acuerdo con 14, donde el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT, ó un dominio de translocación de BuNT. 18. El método intracelular de acuerdo con 14, donde el dominio de unión de toxina no Clostridium es un dominio de unión péptido opioide, un dominio de unión a péptido de melanocortina, un dominio de unión a péptido de galanina, un dominio de unión a péptido de granina, un dominio de unión a péptido de taquiquinina, un dominio de unión a péptido relacionado con neuropéptido Y, un dominio de unión a péptido de neurohormona, un dominio de unión a péptido de citocina, un dominio de unión a péptido de quinina, el dominio de unión a péptido de factor de crecimiento de fibroblastos, un dominio de unión a péptido de neurotrofina, un dominio de unión a péptido de factor de necrosis tumoral, un dominio de unión a péptido de factor neurotrófico derivado glial, un dominio de unión a péptido de factor ß de crecimiento de transformación, un dominio de unión a péptido de proteina morfogenética ósea, un dominio de unión a péptido del factor de crecimiento y diferenciación, un dominio de unión a péptido de activina, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento endotelial vascular, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento de insulina, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento epidérmico, un dominio de unión a péptido de hormona tipo glucagón, un dominio de unión a péptido activante de la adenilato ciclasa de la pituitaria, un dominio de unión a péptido de hormona liberadora de la hormona de crecimiento, un dominio de unión a péptido intestinal vasoactivo, un dominio de unión a péptido polipéptido inhibidor gástrico, un dominio de unión a péptido intestinal peptidovisceral relacionado con calcitonina, o un dominio de unión a péptido receptor activado por proteasa.
EJEMPLOS Ejeiaplo 1 Variantes de proteasa TEV En el siguiente ejemplo se ilustra cómo preparar y utilizar variantes de proteasa TEV que tienen una estabilidad y/o solubilidad incrementadas.
A. Construcción' de constructos de expresión pET29/ EV A efectos de producir una proteasa TEV de forma recombinante, se sintetizó un marco de lectura que codifica la proteasa TEV deseada mediante procedimientos estándar (BlueHeron Biotechnology, Bothell, A) . Unos oligonucleótidos complementarios de 20 a 50 bases de longitud, que abarcaban todo el marco de lectura abierto, fueron sintetizados mediante síntesis estándar de fosforamidita . Estos oligonucleótidos fueron hibridados en dúplexes de doble cadena que fueron secuencialmente ligados entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótidos de longitud completa. Esta molécula de polinucleótidos fue clonada mediante métodos de biología molecular estándar de manera de obtener un portador pUCBHBl en el sitio Smal a efectos de generar plásmidos pUCBHBl/TEV. La molécula de polinucleótidos sintetizada fue verificada mediante secuenciado para lo cual se utilizó BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
El marco de lectura abierto que codifica las variantes TEV fue optimizado con codón para E. coli y todos codifican un fragmento proteolítico de aproximadamente 250 aminoácidos de longitud de aproximadamente 27,5 kDa, correspondiente a los residuos 2038-2279 de la poliproteína de longitud completa TEV fusionados a una etiqueta de purificación por afinidad de polihistidina de extremo N o C. La expresión recombinante de la proteasa TEV de tipo salvaje resulta en una proteina que tiene una propensión a escindirse a si misma en Serina 219 de manera de generar una proteasa truncada con una actividad proteolitica grandemente disminuida. Por lo tanto, para eliminar en gran medida la autoproteólisis y la subsiguiente generación de este producto truncado, se sintetizaron variantes de TEV en los que se cambió Serina 219 sea en Asparagina (S219N) sea en Valina (S219V) . Además, está bien documentado que aunque la proteasa TEV recombinante de tipo salvaje se expresa a niveles muy altos en E. coli, es casi totalmente insoluble (Kapust et ál., 2001). Por lo tanto, para mejorar la solubilidad del TEV expresado, se prepararon varios variantes de aminoácidos y se las ensayó para determinar si los cambios dieron lugar a un aumento de la solubilidad de la proteina. Las variantes de TEV sintetizadas se muestran en la Tabla 3. La Variante 1 representaba un constructo de TEV optimizado con codón diseñado con etiqueta His de extremo C y la mutación S219N. La variante 11 era un constructo con la secuencia de ADN nativo de la proteasa TEV diseñado con una etiqueta de extremo N y la mutación S219N.
Para construir constructos de expresión de la variante pET29/TEV, un constructo pUCBHBl/TEV fue digerido con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica la TEV, y 2) permiten que este inserto esté operativamente unido a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) . Usando un procedimiento de ADN ligasa T4, este inserto se ligó direccionalmente en un vector pET29 digerido con las mismas endonucleasas de restricción en el sitio de clonación múltiple. La mezcla de ligación fue transformada en células Acella electro-competentes E. coli BL21 (DE3) (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 mg/ml de canamicina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C para su cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a la canamicina. Los constructos candidatos se aislaron utilizando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalina, y se los analizó mediante mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto del gen de TEV. Esta estrategia de clonación dio una vector de expresión pET29 que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica variantes de TEV operativamente unidas a un péptido de purificación por afinidad de polihistidina carboxi-terminal o amino-terminal.
B. Análisis de la expresión de TEV bajo diferentes condiciones de inducción Para determinar las mejores condiciones para el cultivo e inducción de la proteína, se cultivaron las variantes 9 y 10 de pET29/TEV (Tabla 3) y se los indujo en un medio inducido por IPTG y un medio de autoinducción. Además, se examinó la longitud de inducción.
Para inducir la expresión con IPTG, las células que alojan el constructo de expresión TEV fueron inicialmente cultivadas durante la noche para producir un cultivo iniciador. Se inoculó medio LB fresco a razón de 1:1000 con el cultivo de la noche y se dejó crecer, bajo agitación, a 37 °C, hasta alcanzar un OD600 de 0,7, momento éste en el que se añadió IPTG hasta una concentración final de- 0,6 mM. Las células se cosecharon a las 4 horas después de la inducción y los Usados totales de células fueron evaluados para detectar la expresión diana.
Para expresar los constructos bajo condiciones de autoinducción, 3,0 mi de medio PA-0,5G que contienen 50 g/ml de canamicina fueron inoculados con una sola colonia de células BL21 (DE3) que albergan el constructo de expresión apropiado y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante la noche. 1,0 µ? de este cultivo iniciador se utilizó para inocular 1,0 mi de medio de autoinducción ZYP-5052 que contienen 50 pg/ml de canamicina. Las células fueron cultivadas a 37 °C bajo agitación y se removieron alícuotas a las 5, 8, 12, 20 y 28 horas.
Para determinar la expresión total de la proteasa TEV, 40 µ? del cultivo celular inducido de cada punto de tiempo se mezclaron con un volumen igual de 2x amortiguador de muestra Laemmi y se incubaron a 95 °C durante 10 minutos. 2 µ? de 1 unidad/µ? de Benzonasa en 1 M de MgS0 fueron añadidos a esta mezcla y se incubó a 95 °C durante 5 minutos. Se cargó una alícuota de 15 µ? y se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS, para lo cual se utilizó NuPAGE® Novex 4-12% geles de poliacrilamida precolados Bis-Tris (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) bajo condiciones de desnaturalización y reductoras. El gel se lavó y se fijó en solución de fijación que comprende 10% de metanol, 7% de ácido acético, durante 30 minutos. Después de la fijación, la solución de fijación se retiró y el gel se incubó con Tinción gel de proteína SYPRO Ruby a temperatura ambiente durante 3 horas. El gel se destiñó entonces en la solución de desteñido que comprende 10% de metanol, 7% de ácido acético, a temperatura ambiente durante 3 horas. La imagen se visualizó con un Typhoon 9410 Variable Modo Imager y mediante software de Análisis de Imager (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) .
Para determinar la expresión de la proteasa TEV soluble, 1,0 mi del cultivo celular inducido se lisaron mediante la adición de 100 µ? de una solución de lisis de células que comprendía lx reactivo FastBreak™ de lisis celular (Promega Corp., Madison, WI), NaCl 500 mM, 250 unidades/ml benzonasa nucleasa (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), y 1 x cóctel inhibidor de proteasa III (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ) y se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos con vórtex constante. El lisado se centrifugó a 4300 rpm durante 15 minutos, para sedimentar los residuos. 800 µ? del sobrenadante se transfirió a un tubo limpio, al que se añadieron 30 µ? de perlas magnéticas de MagneHis, la mezcla se incubó durante 5 minutos bajo rotación constante. Después de la incubación, las perlas magnéticas fueron secuestradas sobre un soporte magnético, se removió la solución, y las perlas se lavaron tres veces con 150 µ? de amortiguador de lavado que comprendía NaCl 500 mM. La proteína se eluyó con 80 µ? de amortiguador de elución, se añadió un volumen igual de 2 x amortiguador de muestra Laemmli, y la mezcla se incubó a 95 °C durante 10 minutos. Se cargó una parte alícuota de 15 µ? se cargó y se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida MOPs para lo cual se utilizó geles de poliacrilamida prefabricados de NuPAGE ® Novex 4-12% Bis- ris (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) bajo condiciones de desnaturalización y reductoras.
Los resultados de los experimentos de inducción indicaron que las condiciones de autoinducción resultaron en proteasa TEV expresada 5 a 10 veces más con respecto a la inducción por IPTG. La comparación de la expresión de la proteasa TEV total y soluble en los medios de autoinducción reveló que, aunque los tiempos de inducción más prolongados resultaron en una mayor cantidad total de proteína, la cantidad de proteasa TEV soluble recuperable disminuyó. De hecho, alrededor de 8 horas de expresión a 37 °C produjo la mayor cantidad de proteína soluble. Por último, aunque ambas variantes TEV S219N y TEV S219V presentaron una autoproteólisis significativamente menor, la variante TEV S219V mostró más producto truncado en prolongados tiempos de inducción, lo que sugieren que la variante TEV S219V era más propensa a la autoproteólisis.
Una vez que las condiciones de crecimiento e inducción se optimizaron utilizando las variantes pET29/TEV 9 y 10, la expresión de la totalidad de las once variantes pET29/TEV fue examinada en paralelo bajo estas condiciones. Los resultados indicaron que el orden de rendimiento creciente de la proteasa TEV soluble, de mayor a menor de los cinco expresadores más elevados, era de las variantes pET29/TEV 5, 10, 7, 3, y 6. En comparación, la variante TEV 11 se expresó en el nivel más bajo de todos.
C. Expresión y purificación a gran escala Para comparar rigurosamente los niveles de expresión de proteasa TEV de las cinco variantes pET29/TEV superiores, junto con la variante 11 como un control, bajo condiciones a gran escala, 3,0 mi de medio PA-0.5g que contienen 50 µq/ l de canamicina se inoculó con una sola colonia de células BL21 (DE3) que albergan el constructo de expresión apropiado y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante la noche. 250 µ? de este cultivo iniciador fueron utilizados para inocular 250 mi de ZYP-5052 que contenían 50 pg/ml de canamicina y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 8 horas. Las células fueron sedimentadas por centrifugación.
Para lisar las células, los sedimentos celulares se resuspendieron en un sedimento celular de 5,0 mL/gramo de solución de lisis que comprendía reactivo de extracción de proteínas BUGBUSTER™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), 1 x Conjunto III de cóctel de inhibidor de proteasa (EMD Biosciences -Calbiochem, Gibbstown, Nueva Jersey) , 25 unidades/mL de Benzonasa nucleasa, y 1 Kunit (mL de rLysozyme (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). La suspensión celular se incubó a temperatura ambiente en un agitador de plataforma durante 20 minutos, seguido por incubación sobre hielo durante 15 minutos. La suspensión sé centrifugó a 4 °C durante 30 minutos a 30.350 rcf para sedimentar los residuos, y el material sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. Para preparar los sedimentos de extractos de células insolubles para el análisis de SDS-PAGE, el sedimento se resuspendió en un volumen original con 1 X de reactivo NUGBUSTER de extracción de proteínas.
Para purificar una variante de proteasa TEV mediante purificación por IMAC, el lisado clarificado se mezcló con resina de cobalto de afinidad de metal TALON™ SuperFlow, equilibrada con solución de lavado IMAC que comprende fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0, NaCl 500 mM, glicerol al 10% y 35 itiM de imidazol. La mezcla de lisado-resina se incubó en un agitador de plataforma a 4 °C durante 1 hora y luego se transfirió a un soporte de columna de 20 mi desechable conectado a un colector de vacío. La columna se lavó dos veces con cinco volúmenes de columna de solución de lavado IMAC. La proteasa TEV se eluyó de la resina con dos volúmenes de columna de solución de elución IMAC, que comprendía 25 mM fosfato sódico, pH 7,8, NaCl 500 mM, glicerol al 10% y 500 mM de imidazol, y se recogió en fracciones de 1,0 mL. Cada fracción que contiene la proteína se identificó mediante el mezclado de alícuotas de 10 ul . con 200 µ? de reactivo colorante de Bradford QUICKSTART™. Las fracciones de elución pico se reunieron y se dializaron para la purificación de cromatografía de intercambio iónico secundario.
Para dializar una variante de proteasa TEV purificada mediante IMAC, la muestra agrupada que 'comprende la fracción de elución pico se dializó en un FASTDIALYZER ® equipado con una membrana 25 kD M CO a 4 °C en 1 L de un amortiguador de desalinizado bajo agitación constante durante la noche. Para la cromatografía de intercambio catiónico, el amortiguador de desalinizado (Amortiguador A) comprendía 50 mM Tris-HCl, pH 8.
Para purificar una variante de proteasa TEV por cromatografía de intercambio catiónico, la solución de proteína desalinizada se cargó en una columna de intercambio de cationes UNO-SI 1 mL, se pre-equilibró con Amortiguador A, con un caudal de 0,5 ml/min. La proteína unida se eluyó por gradiente de NaCl con Amortiguador B que comprendía fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0, NaCl 1 M con un caudal de 1,0 ml/min, como sigue: 5% amortiguador B para 3 mi, amortiguador B al 20% para 10 mi, 20% a 100% de amortiguador B en 10 mi. La elución de las proteínas de la columna se detectó con un detector de UV-visible a 214 nm, 260 nm, y 280 nm, y todas las fracciones pico se agruparon y se determinó la concentración de proteínas. Las alícuotas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La variante de TEV 7 tuvo el mayor rendimiento de la proteasa soluble (aproximadamente 35 mg/1) , seguido por la variante 3 (aproximadamente 24 mg/1) y la variante 10 (aproximadamente 23 mg/1) . Las dos variantes restantes, 5 y 6, tuvieron rendimientos de 18 y 8 mg/L, respectivamente. El rendimiento de la variante TEV 11 fue de aprox. 0,6 mg/1. Como tal, todas las cinco variantes TEV superiores que contienen un cambio de aminoácidos que mejora la solubilidad, resultaron en al menos un aumento de 10 veces en la proteasa TEV soluble purificada respecto a la variante TEV 11 que solo comprendía el cambio de aminoácidos de eliminación de autoproteólisis (S219N) . Cuando se compara el orden de clasificación del rendimiento de la proteasa TEV en los estudios de expresión a pequeña y gran escala, la variante 5 mostró el mayor rendimiento en las expresiones a pequeña escala (Ejemplo 1C) . Sin embargo, fue la variante 7 la que tuvo el mayor rendimiento en las expresiones a gran escala. La repetición de la comparación de los rendimientos de lotes a gran escala reveló de manera constante que la variante 7 era la variante de mayor expresión. Como resultado de ello, la variante 7 representó el constructo líder de proteasa TEV y se lo utilizó para todos los estudios posteriores descritos en la presente.
Para determinar la actividad proteolítica de las variantes de proteasa TEV, una variante de proteasa TEV, o Acproteasa TEV como un control positivo, se añadió a 30 µ? de una solución de reacción que comprendía 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, DTT 1 mM, y 2,5 µ? de un sustrato TEV, y se incubó a 30 °C durante 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Las reacciones fueron apagadas mediante la adición de 2 x amortiguador de muestra Laemmi, y se incubaron la muestra a 95 °C durante 10 minutos. Se cargó una parte alícuota de 15 µ? y se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de MOPs para lo cual se utilizaron geles NuPAGE ® Novex 4-12% Bis-Tris de poliacrilamida precolados (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) bajo condiciones de desnaturalización y reductoras. El gel se lavó y se fijó en solución de fijación que comprendía 10% de metanol, 7% de ácido acético durante 30 minutos. Después de la fijación, se retiró la solución de fijación y se incubó el gel con Tinción de SYPRO Rubí de proteína a temperatura ambiente durante 3 horas. El gel se destiñó entonces en la solución de desteñido que comprendía 10% de metanol, 7% de ácido acético a temperatura ambiente durante 3 horas. La imagen se visualizó con un instrumento Typhoon 9410 Variable ode Imager, y se analizó con el software de Análisis de Imágenes ImageQuantTL (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La relación entre las intensidades de sustrato no escindido y producto escindido se utilizó para calcular el porcentaje de sustrato TEV escindido. Los resultados del ensayo de la actividad de proteasa TEV se proporcionan en la Tabla 4.
Ejemplo 2 Activación intracel lar de una toxina de Clostridimn con un sitio de escisión de proteasa TEV, mediante el uso de dos constructos de expresión diferentes El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento que es útil para expresar en una célula una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena como se describe en la presente descripción.
A. Construcción del constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV Con el objeto de producir un BoNT/A que comprende un sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro de la región bucle bicatenario, un marco de lectura abierto (SEC ID NO: 87) que codifica el BoNT/A-TEV (SEQ ID NO: 88) deseado fue sintetizado utilizando procedimientos estándar (BlueHeron Biotecnología, Seattle, WA) . Unos oligonucleótidos complementarios de 20 a 50 bases de longitud, que abarcan todo el marco de lectura abierto de BoNT/A-TEV, fueron sintetizados mediante síntesis estándar de fosforamidita . Estos oligonucleótidos fueron hibridados en forma de dúplexes de doble cadena que fueron ligados entre sí secuencialmente para ensamblar la molécula de polinucleótidos de longitud completa. Esta molécula de polinucleótidos se clonó utilizando métodos estándar de biología molecular en un vector portador pUCBHBl en el sitio Smal para generar los constructos pUCBHBl/BoNT/A-TEV. La molécula de polinucleótidos sintetizado fue verificada por secuenciación utilizando BIG DYE TER INATOR ™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
Para generar el constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV, pUCBHBl/BoNT/A-TEV fue digerido con endonucleasas de restricción que: 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-TEV, y 2) permiten que este inserto esté operativamente unido a un vector pET29 (E D Biosciences-Novagen, adison, WI) . Este inserto se subclonó mediante un procedimiento de ADN ligasa T4 en un vector pET29 digerido con endonucleasas de restricción análoga de manera de obtener el constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV adecuado. La mezcla de ligación se transformó en células electro-competentes E. coli BL21 (DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenia 50 µg/ml de canamicina, y se colocó en una incubadora a 37 °C para el cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen constructos de expresión fueron identificadas como las colonias resistentes a la canamicina. Se aislaron constructos candidato mediante la utilización de un procedimiento de minipreparación de plásmido por lisis alcalina, y se analizó mediante mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio un constructo de expresión pET29 que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica BoNT/A-TEV operativamente unida a un péptido de purificación por afinidad polihistidina de extremo carboxilo.
B. Constxrucción de los constractos de expresión pET22/TEV.
Para generar una variante de constructo de expresión pET22/TEV, una variante de constructo de expresión pET29/TEV 7 fue digerida con endonucleasas de restricción que: 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto (SEC ID NO: 77) que codifica la proteasa TEV (SEC ID NO: 78), y 2) permiten que este inserto esté operativamente unido a un vector pET22 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, I) . Este inserto se subclonó mediante un procedimiento de ADN ligasa T4 en un vector pET22 digerido con las endonucleasas de restricción análogas de manera de obtener el constructo de expresión pET22/TEV adecuado. La mezcla de ligación se transformó en células electro-competentes E. coli BL21 (DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 g/ml de ampicilina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C para el cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a la ampicilina. Los constructos candidatos se aislaron utilizando un procedimiento de minipreparación de plásmidos por lisis alcalina, y se analizó mediante mapeo digestión de endonucleasas de restricción, y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto.
Esta estrategia de clonación permite obtener un constructo de expresión pET22 que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica la variante TEV 7 operativamente ligada a un péptido de purificación por afinidad de polihistidina amino-terminal.
C. Construcción de células que comprenden constructos de expresión pET29/BoNT/A- EV y pET22/TEV Para preparar una célula que comprende los constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pET22/TEV, un constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV fue transformado en células electro-competentes de E. coli BL21 (DE3) que alojan la variante 7 de constructo de expresión pET22/TEV mediante electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 g/ml de ampicilina y 50 pg/ml de canamicina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C para el cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen ambas constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a ampicilina-canamicina . Los constructos candidatos se aislaron utilizando un procedimiento de minipreparación de plásmidos por lisis alcalina, y se analizaron mediante mapeo de digestión de endonucleasas de restricción para determinar la , presencia de ambos constructos. Esta estrategia de clonación permite obtener células que comprenden los constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pET22/TEV D. Activación in situ de BoNT/A- EV.
Para producir formas bicatenaria de BoNT/A-TEV bajo condiciones de autoinducción, 3,0 mi de medio PA-0.5G que contienen 50 g/ml de canamicina y 50 g/ml de ampicilina se inoculó con una sola colonia de células BL21(DE3) que albergan constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pET22/TEV y se cultivó a 37 °C bajo agitación durante la noche. Aproximadamente 1,0 µ? de este cultivo iniciador se utilizó para inocular 1,0 mi de ZYP-5052 que contiene 50 pg/ml de canamicina y 50 µg ml de ampicilina, y se cultivó a 37 °C bajo agitación durante 3,5 horas y después a 22 °C con agitación durante 18,5 horas. Como control, unas células que albergan pET29/BoNT/A-TEV solo fueron cultivadas e inducidas como se ha descrito anteriormente, excepto que se utilizaron 50 µg ml de canamicina como un agente selectivo.
Después de cultivo e inducción, las células se Usaron y se purificaron por IMAC esencialmente como se describe en el Ejemplo IB. Las muestras purificadas por IMAC se analizaron por SDS-PAGE, y los geles se tiñeron esencialmente como se describe en el Ejemplo IB.
Los resultados indican que cuando se expresa pET29/BoNT/A-TEV solo, una banda de aproximadamente 150 kDa correspondiente a la cadena simple de BoNT/A-TEV fue detectada bajo condiciones tanto reductoras como no reductoras. En cambio, cuando el BoNT/A-TEV fue co-expresado con la proteasa TEV, se observaron dos bandas bajo condiciones reductoras, una de aproximadamente 50 kDa y la otra de aproximadamente 100 kDa. Por otra parte, cuando las mismas muestras se procesaron bajo condiciones no reductoras, las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa desaparecieron, y se observó una nueva banda de aproximadamente 150 kDa. En conjunto, estas observaciones indican que las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa vistas bajo condiciones reductoras correspondían a las cadenas ligeras y pesadas de la BoNT/A-TEV, y que la presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de di-cadena de la BoNT/A-TEV. Por lo tanto, la co-expresión de BoNT/A-TEV y proteasa TEV en estas células da como resultado la escisión de la BoNT/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del bucle bicatenario y la subsiguiente formación de la forma bicatenaria de BoNT/A-TEV.
Para confirmar estos resultados, se efectuó una expresión a gran escala de células BL21 (DE3) que albergan los constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pET22/TEV. 3,0 mi de medio de PA-0.5G que contienen 50 g/ml de canamicina y 50 g/ml de ampicilina se inocularon con una sola colonia de células BL21 (DE3) que comprenden los constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pET22/TEV y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante la noche.
Aproximadamente 250 ul de este cultivo iniciador se utilizaron para inocular 250 mi de ZYP-5052 que contiene 50 yg/ml de canamicina y 50 pg/ml de ampicilina y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante 3,5 horas y luego a 22 °C bajo agitación durante 18,5 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación. Las células se lisaron y purificaron por IMAC como se describe en el Ejemplo 1C.
Para dializar BoNT/A-TEV purificado por IMAC para la cromatografía secundaria de intercambio iónico, la muestra agrupada de las fracciones de elución pico se dializó en un instrumento FASTDIALYZER ® equipado con membrana de 25 kD MWCO a 4 °C en 1 L de un amortiguador de desalinizado bajo agitación constante durante toda la noche. Para la cromatografía de intercambio aniónico, el amortiguador de desalinizado (Amortiguador A) comprendía Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.
Para purificar BoNT/A-TEV por cromatografía de intercambio aniónico, la solución de proteína desalinizada se cargó en una columna de intercambio aniónico 1 mi UNO-Q1, preequilibrada con amortiguador A, con un caudal de 0,5 ml/min. La proteína unida se eluyó por gradiente de NaCl con Amortiguador B que comprendía 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 1 M con un caudal de 0,5 ml/min como sigue: 3% de amortiguador B para 3 mi, 7% de amortiguador B para 10 mi, 7% a 100% de amortiguador B a lo largo de 10 mi. La elución de las proteínas de la columna se detectó con un detector de UV-visible a 214 nm, 260 nm, y 280 nm, y todas las fracciones pico se agruparon y se determinó la concentración de proteínas. Las alícuotas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La proteína' BoNT/A-TEV purificada se analizó por SDS-PAGE, y los geles se tiñeron esencialmente como se describe en el Ejemplo IB. Los resultados confirman los experimentos , iniciales a pequeña escala e indican que el BoNT/A-TEV monocatenario se convierte en su forma bicatenaria con una eficiencia cercana al 100%.
Para evaluar la actividad de las dobles cadenas de BoNT/A-TEV, se evaluaron estas toxinas en un ensayo basado en células y ensayo basado en animales.
Para ensayar la actividad de las cadenas dobles de BoNT/A-TEV mediante un ensayo basado en células, se llevó a cabo un ensayo de la actividad de BoNT/A basado en inmunoensayo para lo cual se utilizó un ELISA sándwich ECL múltiplex esencialmente como se describe en la Solicitud de Patente de Fernández-Salas, et ál., Immuno-Based BoNT/A Activity ñssays, Expediente de Abogado No. 18383 (CET) , que se incorpora mediante esta referencia en su totalidad.
Para obtener un lisado de células tratadas con BoNT/A-TEV para el análisis, aproximadamente 50.000 células de un cultivo madre de una cepa celular SiMa fueron sembradas en un placa de 96 pocilios de poli-D-lisina que contenía un medio libre de suero que contenia Medio Esencial Mínimo, GlutaMAX ™ 2 mM con sales de Earle, suplemento 1 x B27, suplemento 1 x N2, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, HEPES 10 mM y 25 pg/ml de GTbl . Estas células se incubaron en una incubadora a 37 °C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células se diferenciaron, de acuerdo con la evaluación de criterios morfológicos estándar y de rutina, tales como la detención del crecimiento y la extensión de neuritos (aproximadamente 3 días) . El medio fue retirado por aspiración de cada pocilio y sustituido con medio fresco que contiene sea 0 (muestra no tratada), 0,01 nM, 0,04 nM, 0,12 nM, 0.37 nM, 1.11 nM, 3,33 nM y 10,0 nM de un BoNT/A-TEV. Después' de un tratamiento de 24h, las células se lavaron, se incubaron durante otros dos días sin toxina. Para cosechar las células, se aspiró el medio, se lavó con 1 x PBS, y se lisó mediante la adición de 30 ul de amortiguador de lisis que comprende HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, 1,5 mM de MgCl2, EGTA 1 mM, 1% de Tritón X-100 a cada pocilio, y la placa se incubó en un agitador rotatorio a 500 rpm durante 30 minutos a 4 °C. La placa se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos a 4 °C para sedimentar los residuos celulares, y el material sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocilios, recubierta con anticuerpo, para llevar a cabo el paso de la detección.
Para preparar la solución de anticuerpo para la captura de a-SNAP-25, el anticuerpo monoclonal -SNAP-25 contenido en la ascitis de la linea celular de hibridoma 2E2A6 fue purificado utilizando un protocolo de purificación estándar para la proteina A. Para preparar la solución de anticuerpo de detección de a-SNAP-25, un anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25 S9684 (Sigma, St . Louis, MO) se conjugó con reactivo de etiquetado éster de rutenio (II) -tris-bipiridina-( 4-metilsulfonato) NHS (Meso Scale Delivery, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Delivery, Gaithersburg, MD) . Para preparar el soporte en fase sólida que comprende el anticuerpo de captura que era especifico para un producto escindido SNAP-25, aproximadamente 5 ul de una solución de anticuerpo monoclonal 2E2A6 de a-SNAP-25 (20 g/ml en 1 x PBS) se añadió a cada pocilio de una placa de Alta Unión MSD de 96 pocilios, y la solución se dejó secar al aire en un gabinete de seguridad biológica durante 2-3 horas a fin de que se evapore el liquido de la solución. Los pocilios unidos con anticuerpo de captura se bloquearon a continuación y se utilizaron directamente para detectar la actividad de BoNT/A.
Para detectar la presencia de un producto SNAP-25 escindido por análisis ELISA sándwich ECL, se retiró por aspiración el amortiguador de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 ul de un lisado de las células tratadas con BoNT/A a cada pocilio, y las placas se incubaron a 4 °C durante 2 horas. Los pocilios de la placa fueron lavados tres veces por aspiración del lisado de células y enjuagados de cada pocilio tres veces con 200 ul de PBS 1 X, 0,1% de Tween-20 ® (polioxietileno (20) monolaureato de sorbitano) . Después del lavado, 25 ul de 5 mg/ml de solución de anticuerpo de detección OÍ—SNAP-25 que comprendía 2% de Reactivo Amersham de Bloqueo en 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 ® (monolaureato de sorbitano polioxietilenado (20) ) se añadió a cada pocilio, la placa se selló, y la placa sellada se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora bajo agitación. Después de la incubación del anticuerpo de detección a-SNAP-25, los pocilios se lavaron tres veces con 200 ul de PBS 1 X, 0,1% de Tween-20 ® (monolaureato de sorbitano polioxietilenado (20) ) . Los datos brutos obtenidos del instrumento Imager ECL se transfirieron seguidamente a SigmaPlot v 9,0, y se utilizó un ajuste logístico de 4 parámetros para definir las curvas de dosis-respuesta. No se utilizaron restricciones para la función logística de 4 parámetros al trazar los datos. Los informes gráficos fueron generados usando el siguiente análisis: R2 (coeficiente de correlación), a (Max para un conjunto de datos), b (pendiente), y X0 ± SE (EC50 ± error estándar) . Los resultados de dos pasadas independientes indican que la actividad de ambas cadenas dobles era casi idéntica y se hallaba dentro de 2 veces la cadena doble nativa .
Para ensayar la actividad de las cadenas dobles BoNT/A-TEV mediante un ensayo basado en animales, se llevó a cabo un ensayo DAS (Digit Abduction Score) in vivo. Se pesaron unos ratones CD-1 Fe y se los colocó en subconjuntos de 10 animales cada uno para cada ensayo de DAS discreto. Unos ratones fueron incluidos en un subconjunto en particular en base a los siguientes criterios: 1) buena salud; 2) respuesta de DAS de línea de base sólida de 0; 3) inclusión en un intervalo mediano de pesos de X +/- 2 g establecido para el subconjunto seleccionado; y 4) un peso mayor de 17,0 g.
Cada ratón recibió una inyección de 5 uL de una de las siete diferentes dosis de BoNT/ A TEV (0,01 nM, 0,04 nM, 0,12 nM, 0,37 nM, 1,11 nM, 3,33 nm y 10,0 nM) con una aguja dé calibre 30 en el músculo gastrocnemio de la pata posterior derecha. Como control, el músculo gastrocnemio de la pata posterior izquierda recibió una inyección de 5 ul de una solución que no contiene ningún BoTN/ A-TEV. Los ratones se observaron para la respuesta del DAS consecutivamente durante los primeros 4 días. El DAS fue leído izando cada ratón por su cola y observando con precisión las patas posteriores inyectadas. La abducción, o la falta de abducción, de los dígitos posteriores revela el efecto de la parálisis debido a la toxina de prueba inyectada en el músculo. La abducción de los dígitos de la pata posterior inyectada se comparó con la de la pata posterior no inyectada y se le asignó un puntaje correspondiente. Los datos de DAS se analizaron mediante el cálculo de la dosis ED50 basado en el puntaje DASS medio de pico y el AUC (área bajo la curva) en términos de g/kg y/o de ng/kg. Esto se llevó a cabo como sigue: 1) el puntaje DAS de pico medio para cada dosis se calculó en cada estudio, 2) cualquier dosis que provocó más de cinco muertes en cualquier estudio fue eliminado de la consideración, 3) la dosis máxima utilizada en un estudio individual dado fue la dosis más baja que provocó un pico promedio de 4,0; y, 4) la dosis más baja utilizada en un estudio individual dado fue la dosis más alta que provocó un pico promedio de 0; 5) se construyeron curvas para cada estudio individual de DAS de pico promedios vs log (dosis), 6) un valor de AUC fue calculado para cada grupo de 10 ratones de los múltiples grupos en algunos estudios; 7) se construyeron curvas para cada estudio individual de AUC promedio vs log (dosis); 8) una curva de respuesta replicada x, y, fue construida para cada conjunto de múltiples estudios idénticos, para cada toxina de ensayo; 9) los datos de dosis - respuesta fueron analizados por regresión no lineal (no ponderada) , para lo cual se utilizó una ecuación logística de tres parámetros (Sigma Plot v 8.0, SPSS Ciencia, Chicago, Illinois) con la siguiente ecuación: y = a/(l + (x/x0)b) donde y es la respuesta, a es la ymax asintótica, b es la pendiente, x es la dosis, y 0 es la dosis ED50. Para las determinaciones de ED50 de pico, Ymax se estableció en 4 (máxima lectura en la escala DAS) . Los valores de ED50 medios (de pico y/o AUC) se calcularon para cada estudio de ocho dosis llevado a cabo.
Los resultados de dos pasadas independientes indican que el nivel de actividad de ambas cadenas dobles fue casi idéntico y se hallaba dentro de 2 veces la doble cadena nativa. Tomados en su conjunto, el ensayo basado en células y los datos del ensayo DAS indican que el proceso de activación intracelular proporciona rBoNT/A bicatenario que no solo era estructuralmente comparable con el material fragmentado in vitro, sino también funcionalmente indistinguibles.
Ejemplo 3 Activación intracelular de una toxina de Clostridium con un sitio de escisión de proteasa TEV mediante dos constructos de expresión diferentes bajo el control de promotores independientes El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento útil para expresar en una célula una toxina de Clostridium que comprende una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógena como se describe en la presente descripción. En este caso, la formación de la forma bicatenaria de la toxina está regulada por la proteasa TEV bajo el control de un promotor independiente A. Construcción del constructo de expresión pBAD/TEV Con el fin de producir una proteasa TEV de forma recombinante, cuya expresión estaba bajo el control de un promotor arabinosa (PBAD) I el marco de lectura abierto que codifica la variante 7 de proteasa TEV (Tabla 3 [130]), menos una etiqueta His de extremo N, se clonó en el vector de expresión pBAD/Myc-HisA para construir pBAD/TEV. Para construir pBAD/TEV, un marco de lectura abierto que codifica la variante 7 de proteasa TEV (SEC ID NO: 106), menos una etiqueta poli-histidina de extremo N, se sintetizó utilizando procedimientos estándar (BlueHeron Biotecnología, San Diego, CA) . El fragmento sintético también estaba flanqueado por sitios de restricción para permitir que este inserto esté operativamente unido a un vector pBAD/Myc-HisA (Life Technologies, Madison, WI) . Usando un procedimiento de ADN ligasa T4 este inserto se ligó direccionalmente en un vector pBAD/Myc-HisA digerido con las mismas endonucleasas de restricción en el sitio de clonación múltiple. La mezcla de ligación se transformó en células Acella electro-competentes E. coli BL21 (DE3) (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 g/ml de ampicilina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C para el cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a ampicilina. Los constructos candidatos se aislaron utilizando un procedimiento de mini preparación de plásmidos mediante lisis alcalina, y se analizaron mediante mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto del gen de TEV. Esta estrategia de clonación permite obtener un constructo de expresión pBAD/TEV que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica la variante 7 de TEV libre de un péptido de purificación por afinidad de polihistidina .
B. Construcción de células que coxnprenden constructos de expresión p?T29/BoNT/A-TEV y pBAD/TEV Para preparar una célula que comprende constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pBAD/TEV, un constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV (descrito en el Ejemplo 2A) se transformó en células electro-competentes de E. coli BL21 (DE3) que albergan la variante 7 de constructo de expresión pBAD/TEV utilizando electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 g/ml de ampicilina y 50 µg/ml de canamicina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C para su cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen ambos constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a ampicilina-canamicina. Los constructos candidatos se aislaron mediante un procedimiento de mini preparación de plásmidos mediante lisis alcalina, y se los analizó mediante mapeo de digestión de endonucleasas de restricción para determinar la presencia de ambas construcciones. Esta estrategia de clonación produjo células que comprenden constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pBAd/TEV.
C. Activación in situ de BoNT/A-TEV.
Para producir formas bicatenarias de BoNT/A-TEV bajo condiciones de autoinducción, 3,0 mL de medio PA-0.5G que contiene 50 pg/mL de canamicina y 50 µg/mL de ampicilina, se inocularon con una única colonia de células BL21 (DE3) que alojan constructos de expresión pET29/BoNT/A-TEV y pBAD/TEV y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante la noche. 250 pL de este cultivo de inicio fueron utilizados para inocular 250 mL de ZYP-5052 que contiene 50 pg/mL de canamicina y 100 pg/mL de ampicilina, y se cultivaron a 37 °C bajo agitación durante 8 horas y seguidamente a 22 °C bajo agitación durante 14 horas. En este momento, se indujo la expresión de TEV con 0,2% de L-arabinosa y se cultivó durante 4 horas adicionales a 22°C. Como control, se cultivan células BL21 (DE3) que alojan pET29/BoNT/A-TEV solo, y se indujo como arriba descrito, solo que se utilizaron 50 pg/mL de canamicina como agente selectivo.
Después de cultivo e inducción, las células se Usaron y se purificaron por IMAC esencialmente como se describe en el Ejemplo 1C. Para la diálisis del BoNT/TEV purificado por IMAC para la cromatografía secundaria de intercambio iónico, la muestra agrupada de las fracciones de elución pico se dializó en una instrumento FASTDIALYZER ® equipado con membrana 25 kD MWCO a 4 °C en 1 ul de un amortiguador de desalinizado con constante agitación durante la noche. Por la cromatografía de intercambio aniónico, el amortiguador de desalinizado (Amortiguador A) comprendía 50 mM Tris-HCl, pH 8,0.
Para purificar BoNT/A-TEV por cromatografía de intercambio aniónico, la solución de proteína desalinizada se cargó en un 1 mi de columna de intercambio aniónico UNO-Q1, preequilibrada con Amortiguador A, con un caudal de 0,5 ml/min. La proteína unida se eluyó por gradiente de NaCl con Amortiguador B que comprendía 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 1 M con un caudal de 0,5 ml/min como sigue: 3% de amortiguador B para 3 mi, 7% de amortiguador B para 10 mi, 7% a 100% amortiguador B por más de 10 mi. La elución de las proteínas de la columna se detectó con un detector de UV-visible a 214 nm, 260 nm, y 280 nm, todas las fracciones pico se agruparon, y se determinó la concentración de proteínas La proteína BoNT/A-TEV purificada se analizó por SDS-PAGE, y los geles se tiñeron esencialmente como se describe en el Ejemplo IB. Los resultados indican que cuando se expresa pET29/BoNT/A-TEV solo, se detecta una banda de aproximadamente 150 kDa correspondiente a la cadena simple para BoNT/A-TEV tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras. En contraste, cuando el BoTN/ A-TEV fue co-expresada con la proteasa TEV bajo control del promotor pBAD e inducido con arabinosa, se observaron dos bandas bajo condiciones reductoras, uno de aproximadamente 50 kDa y el otro de aproximadamente 100 kDa. Por otra parte, cuando se sometieron las mismas muestras a condiciones no reductoras, las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 150 kDa. En conjunto, estas observaciones indican que las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa vistas bajo condiciones reductoras corresponden a las cadenas ligeras y pesadas de la BoTN/-TEV, y que la presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de la cadena doble de la BoNT/A-TEV. Por lo tanto, la coexpresión de la proteasa BoNT/A-TEV y TEV en estas células da como resultado la escisión de la BoNT/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del bucle bicatenario y la subsiguiente formación de la forma bicatenaria de BoNT/A-TEV. Los resultados indican que entre 90 y 95% del BoNT/ A-TEV monocatenaria se convierte en su forma bicatenaria.
Ejemplo 4 Activación intracelular de una toxina de Clostridium con un sitio de escisión de proteasa TEV usando un constructo de expresión doble El siguiente ejemplo ilustra métodos útiles para purificar y cuantificar una toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena tal como se describe en la presente descripción.
A. Construcción de const ucto de expresión doble p?T29/BoNT/A-TEV/2xTEV.
Para construir el constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, se sintetizó un fragmento sintético (SEQ ID NO: 89) que codifica los últimos 37 aminoácidos de BoNT/A-TEV, asi como el promotor de transcripción (promotor T7, sitio del operador lac) y elementos de traducción (RBS) necesarios para la expresión de E. coli y toda la región de codificación de variante 7 de TEV usando procedimientos estándar (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA) . Los oligonucleótidos complementarios de 20 a 50 bases de longitud se sintetizaron usando síntesis de fosforamidita estándar. Estos oligonucleótidos se hibridaron en dúplex bicatenarios que se ligaron secuencialmente juntos para asemejar la molécula de polinucleótidos de longitud total. Esta molécula de polinucleótidos se clonó usando métodos de biología estándar en un vector de portador pUCBHBl en el sitio Smal para generar el plásmido pUCBHBl/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV. La molécula de polinucleótidos sintetizada fue verificada por secuenciación usando BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ??G 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA.
Para generar el constructo de expresión pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, se digirió püCBHBl/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende el extremo C de BoNT/A-TEV, motivos de transcripción y traducción necesarios para expresión de E. coli de un segundo marco de lectura abierto y toda la región de codificación de variante 7 de TEV; y 2) permiten que este inserto se una operativamente detrás del gen BoNT/A en el vector pET29/BoNT/A-TEV del Ejemplo 1A. Este inserto se subclonó usando un procedimiento de ADN ligasa T4 en el vector pET2 /BoNT/A-TEV digerido con las endonucleasas de restricción análogas para obtener el constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV apropiado que comprende los marcos de lectura abiertos de BoNT/A-TEV y variante 7 de proteasa TEV con los elementos de transcripción y traducción intervinientes de la SEQ ID NO: 89. La mezcla de ligación se transformó en células electro-competentes de E. coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 pg/mL de canamicina y se colocaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a canamicina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizaron por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio como resultado un constructo de expresión doble pET29 que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica una variante de BoNT/A-TEV operativamente unida a una etiqueta de purificación por afinidad de polihistidina de extremo carboxilo y una proteasa TEV. La organización del marco de lectura abierto era tal que el inicio de la transcripción desde el primer promotor T7 da como resultado un mARN con el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-TEV y el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV. Además,, el inicio de la transcripción desde el segundo promotor T7 da como resultado un mARN con el marco de lectura abierto que codifica solo la proteasa TEV. Asi, habría doble cantidad de transcriptos que codifican una proteasa TEV en comparación con BoNT/A-TEV.
B . Activación i situ de BoNT/A-TEV de pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV.
Para producir formas bicatenarias de BoNT/A-TEV en condiciones de autoinducción, se inocularon 3,0 mL de medio PA-0.5G que contenía 50 µg/mL de canamicina con una colonia simple de células BL21(DE3) que comprenden constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/TEV y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. Aproximadamente 250 µ?? de este cultivo de inicio se usaron para inocular 250 mL de ZYP-5052 que contenían 50 µ?/???, de canamicina y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 3,5 horas y luego a 22 °C con agitación durante 18,5 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación. Las células se Usaron, se purificaron por IMAC, se desalinizaron, se purificaron por cromatografía de intercambio iónico, se analizaron por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 2D. Como un control, las células BL21(DE3) que alojaban pET29/BoNT/A-TEV solo se cultivaron y se indujeron tal como se describió con anterioridad, excepto porque solo se usaron 50 ug/mL de canamicina como un agente selectivo.
Los resultados indican que, cuando se expresa sola, se detectó una banda de aproximadamente 150 kDa correspondiente a la cadena simple para BoNT/A-TEV en · condiciones tanto de reducción como de no reducción. Por el contrario, cuando se coexpresó BoNT/A-TEV con proteasa TEV, se observaron dos bandas en condiciones de reducción, una de aproximadamente 50 kDa y la otra de aproximadamente 100 kDa. Más aún, cuando las mismas muestras se corrieron en condiciones de no reducción, las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 150 kDa. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que las bandas de aproximadamente 50 kDa y de aproximadamente 100 kDa vistas en condiciones de reducción corresponden a las cadenas ligera y pesada de BoNT/A-TEV y que la presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de dos cadenas de BoNT/A-TEV. Los resultados además indican que el BoNT/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con una eficiencia de más del 95%. Asi, la coexpresión de BoNT/A-TEV y proteasa TEV a partir de un constructo de expresión doble en estas células da como resultado la escisión de BoNT/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del bucle bicatenario y la posterior formación de la forma bicatenaria de BoNT/A-TEV.
C. Construcción de const uctos de expresión doble pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV.
Para determinar si la inversión de la organización de los marcos de lectura abiertos que codifican BoNT/A-TEV y la proteasa TEV afectaría el rendimiento y la eficacia del escisión de BoNT/A-TEV, se preparó un constructo de expresión doble donde el inicio de la transcripción desde el primer promotor T7 da como resultado un mARN con los marcos de lectura abiertos que codifican TEV y BoNT/A-TEV y el inicio de la transcripción desde el segundo promotor T7 da como resultado un mARN con el marco de lectura abierto que codifica solo BoNT/A-TEV. Así, habría doble cantidad de mARN que codifican BoNT/A-TEV en comparación con proteasa TEV.
Para construir el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV, se realizaron dos reacciones de clonación secuencial. En primer lugar, el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 91) que codifica la variante 7 de TEV (SEQ ID NO: 22) se amplificó por PCR del constructo de expresión pET29/TEV de la variante 7. El extremo 5' del marco de lectura abierto que codifica la etiqueta de polihistidina se excluyó de la amplificación para codificar una proteasa sin etiqueta. Después de la amplificación, el producto de PCR se digirió en los sitios de restricción exclusivos, se incorporó en los extremos del producto de PCR por medio de los cebadores de PCR y se clonó en los correspondientes sitios en CSI (sitio de clonación múltiple) del plásmido pRSFduet-1 de expresión doble (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) usando un procedimiento de ADN ligasa T4. Este constructo intermediario se designó pRSduet/TEV. A continuación, se digirió un constructo de expresión pET29/BoNT-A/TEV con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 87) que codifica el BoNT/A-TEV (SEQ ID NO: 88); y 2) permiten que este inserto se una operativamente con MCS2 en pRSFduet/TEV . El inserto BoNT/A-TEV se subclonó en el MCS2 del vector pRSFduet usando un procedimiento de ADN ligasa T4 para obtener el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV apropiado. · Esta estrategia de clonación dio como resultado un constructo de expresión doble pRSFduet donde la transcripción desde el primer promotor T7 produciría mARN que codifican TEV y BoNT/A-TEV y la transcripción desde el segundo promotor T7 produciría mARN que codifica solo BoNT/A-TEV.
Esta estrategia de clonación dará un constructo de expresión doble pRSFduet donde el primer promotor T7 transcribirá el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-TEV y el segundo promotor T7 transcribirá el marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV.
D. Construcción del constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/TEV Para determinar rendimientos de BoNT/A-TEV y eficacia de conversión en dos cadenas desde una configuración de unidad de transcripción donde BoNT/A-TEV y TEV solo podrían ser producidas desde sus propios mARN independientes, se construyó pET29/BoNT/A-TEV/TEV . Para generar el constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/TEV, se usó un fragmento de ADN sintético corto para incorporar un sitio de terminador T7 (SEQ ID NO: 92) en la secuencia interviniente entre los marcos de lecturas abiertos de BoNT/A-TEV y TEV en el constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV (Ejemplo 3A anterior) . Usando un procedimiento de ADN ligasa T4, esto se llevó a cabo esencialmente intercambiando la región interviniente en pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV que carecía de un sitio de terminador T7 con un fragmento de ADN sintético que alberga los elementos intervinientes de transcripción y traducción junto con un sitio de terminación T7 de la SEQ ID NO: 93. El constructo de expresión doble resultante, designado pET29/BoNT/A-TEV/TEV, comprende la molécula de polinucleótidos que codifica una variante de BoNT/A-TEV operativamente unida a una etiqueta de afinidad de polihistidina de extremo carboxilo y proteasa TEV, transcripto a partir de los primeros y segundos promotores T7, respectivamente.
E. Activación in situ de BoNT/A—TEV.
El crecimiento y la inducción de formas bicatenarias de BoNT/A-TEV en condiciones de autoinducción se realizaron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 2D, excepto porque se usaron las células BL21(DE3) que comprenden un constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, un constructo de expresión doble pRSF/TEV/2xBoNT/A-TEV o un constructo de expresión doble pET29/BoNT/A-TEV/TEV y colonias simples de cada una de estas lineas celulares para inocular cuatro cultivos de 1,0 mL en paralelo. Después del crecimiento y la inducción, los cuatro replicados de 1, 0 mL se agruparon para procesamiento. Las células se Usaron y se purificaron por IMAC y se analizaron por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo IB. Como un control, las células BL21(DE3) que alojaban pET29/BoNT/A-TEV solo se cultivaron y se indujeron tal como se describió con anterioridad, excepto porque solo se usaron 50 µ?/?a? de canamicina como un agente selectivo. Los resultados indican que, BoNT/A-TEV se expresó en niveles muy comparables de células que contenían cualquiera de los tres constructos de expresión doble; sin embargo, la extensión de la conversión en la doble cadena varió. El BoNT/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con aproximadamente una eficacia del 96% cuando las proteínas se expresaron de pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV, con una eficacia de aproximadamente el 81% cuando las proteínas se expresaron de pET29/BoNT/A-TEV/TEV y con más del 99% de eficacia cuando las proteínas se expresaron de pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV .
Ejemplo 5 Activación intracelular de una proteína que comprende un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado usando un constructo de expresión doble El siguiente ejemplo ilustra métodos útiles para purificar y cuantificar cualquiera de las proteínas que comprende un bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógena descrito en la presente descripción.
A. Construcción de constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xNoci HN/A-TEV.
Para construir el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV, se digirió un constructo de expresión pET29/NociLHN/A-TEV con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 94) que codifican NociLHN/A-TEV (SEQ ID NO: 95); y 2) permiten que este inserto se una operativamente con MCS2 de pRSFduet/TEV, un vector pRSFduet-1 que aloja variante 7 de TEV en MCSI (descrito en el Ejemplo 3C) . El inserto de NociLHN/A-TEV se subclonó en el MCS2 del constructo pRSFduet/TEV usando un procedimiento de ADN ligasa T4 para obtener el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV apropiado. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7.0) que contenían 50 pg/mL de canamicina y se ubicaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a canamicina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de , plásmido de lisis alcalino y se analizó por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio como resultado un constructo de expresión doble pRSFduet donde la transcripción desde el primer promotor T7 produciría mARN que codifica TEV y NociLHN/A-TEV y transcripción desde el segundo promotor T7 produciría mARN que codifica solo NociLHN/A-TEV.
B. Activación in situ de NociLHN/A-TEV.
Para producir formas bicatenarias de NociLHN/A-TEV en condiciones de autoinducción, se inocularon 3,0 mL de medio PA-0.5G que contenía 50 pg/mL de canamicina con una colonia simple de células BL21(DE3) que comprende constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. 250 pL de este cultivo de inicio se usaron para inocular 250 mL de ZYP-5052 que contenían 50 yg/mL de canamicina y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 8 horas y luego a 16 °C con agitación durante 18 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación. Las células se lisaron, se purificaron por IMAC, se desalinizaron, se purificaron por cromatografía de intercambio iónico, se analizaron por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 2D. Como un control, células BL21(DE3) que alojan NociLHN/A-TEV solo se cultivaron y se indujeron tal como se describió con anterioridad .
Los resultados indican que, cuando se expresa sola, se detectó una banda de aproximadamente 102 kDa correspondiente a la cadena simple de NociLHN/A-TEV en condiciones tanto de reducción como de no reducción. Por el contrario, cuando se coexpresó NociLHN/A-TEV con proteasa TEV, se observaron dos bandas en condiciones de reducción, una de aproximadamente 50,8 kDa y la otra de aproximadamente 51,3 kDa . Más aún, cuando las mismas muestras se corrieron en condiciones de no reducción, las bandas de aproximadamente 50,8 kDa y aproximadamente 51,3 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 102 kDa. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que las bandas de aproximadamente 50,8 kDa y de aproximadamente 51,3 kDa vistas en condiciones de reducción respectivamente corresponden al dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium con el resto de direccionamiento de nociceptina unido a su extremo amino. La presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de dos cadenas de NociLHN/A-TEV y que el NociLHN/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con una eficiencia de más del 95%. Asi, la coexpresión de NociLHN/A-TEV y proteasa TEV a partir de un constructo de expresión doble en estas células da como resultado el escisión de NociLHN/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión de opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y la posterior formación de la forma bicatenaria de NociLHN/A-TEV.
C. Construcción del constructo de expresión doble pRSFdaet/TEV/2xDynLHN/A-TEV El constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV se generó casi exactamente al pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV. Se digirió un constructo de expresión pET29/DynLHN/A-TEV con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 96) que codifica DynLHN/A-TEV (SEQ ID NO: 97) ; y 2) permiten que este inserto se una operativamente con el MCS2 de pRSFduet/TEV (descrito en el Ejemplo 3C) . El inserto de DynLHN/A-TEV se subclonó en el MCS2 del constructo pRSFduet/TEV usando un procedimiento de ADN ligasa T4 para obtener el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV apropiado. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de¦ agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 µg/mL de canamicina y se ubicaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a canamicina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizaron por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio como resultado un constructo de expresión doble pRSFduet donde la transcripción desde el primer promotor T7 produciría mARN que codifica TEV y DynLHN/A-TEV y transcripción desde el segundo promotor T7 produciría mARN que codifica solo DynLHN/A-TEV.
D. Activación in si u de DynLHN/A-TEV Para producir formas bicatenarias de NociLHN/A-TEV en condiciones de autoinducción, se inocularon 3,0 mL de medio PA-0.5G que contenía 50 g/mL de canamicina con una colonia simple de células BL21(DE3) que comprende constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. 250 L de este cultivo iniciador se usaron para inocular 250 mL de ZYP-5052 que contenían 50 µg/mL de canamicina y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 8 horas y luego a 16 °C con agitación durante 18 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación. Las células se Usaron, se purificaron por IMAC, se desalinizaron, se purificaron por cromatografía de intercambio iónico, se analizaron por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 2D. Como un control, se cultivaron células BL21(DE3) que aloja DynLHN/A-TEV solo y se indujeron tal como se describió con anterioridad.
Los resultados indican que, cuando se expresa sola, se detectó una banda de aproximadamente 102 kDa correspondiente a la cadena simple para DynLHN/A-TEV en condiciones tanto de reducción como de no reducción. Por el contrario, cuando se coexpresó DynLHN/A-TEV con proteasa TEV, se observaron dos bandas en condiciones de reducción, una de aproximadamente 50,8 kDa y la otra de aproximadamente 52 kDa. Más aún, cuando las mismas muestras se corrieron en condiciones de no reducción, las bandas de aproximadamente 50,8 kDa y de aproximadamente 52 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 102 kDa. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que la banda de aproximadamente 50,8 kDa corresponde al dominio enzimático de la toxina de Clostridium y una banda de aproximadamente 52 kDa corresponde al dominio de translocación de la toxina de Clostridium con el resto de direccionamiento de dinorfina unido a su extremo amino. La presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de dos cadenas de DynLHN/A-TEV y también que DynLHN/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con una eficiencia de más del 95%. Asi, la coexpresión de DynLHN/A-TEV y proteasa TEV de un constructo de expresión doble en estas células da como resultado el escisión de DynLHN/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y la posterior formación de la forma bicatenaria de DynLHN/A-TEV.
Ejemplo 6 Activación intracelular de una proteína que comprende un dominio de unión de galanina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado usando dos diferentes constructos de expresión El siguiente ejemplo ilustra métodos útiles para purificar y cuantificar cualquiera de las proteínas que comprende un bucle bicatenario que comprende un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado descrito en la presente descripción donde la proteína diana y la proteasa se expresan a partir de plásmidos separados y bajo el control de diferentes promotores.
A. Construcción del constructo de expresión pET29/Gal HN/A- EV Para construir el constructo de expresión pET29/GalLHN/A-TEV, primero se digirió un constructo de expresión pET29/DynLHN/A-TEV con endonucleasas de restricción para extirpar un segmento de ADN que codifica el bucle bicatenario que comprende un dominio de unión de dinorfina a un sitio de escisión de proteasa TEV integrado El fragmento de la estructura marco resultante pET29/LHn/A se ligó con un fragmento de ADN sintético entre corchetes con los sitios compatibles de restricción (SEQ ID NO: 98), que comprenden el bucle bicatenario que comprende un dominio de unión de galanina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado (SEQ ID NO: 99) . La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de E. coli BL21 (DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 µg/mL de canamicina y se colocaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a canamicina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizó por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio como resultado el constructo de expresión pET29/GalLHN/A-TEV que comprende el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 100) que codifica GalLHN/A-TEV (SEQ ID NO: 101) donde la expresión de GalLHN/A-TEV está regida por el promotor T7.
B. Constjracción de constructo de expresión pColdIV/TEV.
Para generar un constructo de expresión donde TEV está regido por el promotor de shock en frío (csp) , el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 91) que codifica la variante 7 de TEV (SEQ ID NO: 22) se amplificó por PCR del constructo de expresión pET29/TEV de la variante 7. El extremo 5' del marco de lectura abierto que codifica la etiqueta de afinidad de polihistidina se excluyó de la amplificación para codificar una proteasa sin etiqueta. Después de la amplificación, el producto de PCR se digirió en los sitios de restricción exclusivos, se incorporó en los extremos del producto de PCR por medio de los cebadores de PCR y se clonó en los correspondientes sitios en el sitio de clonación múltiple del plásmido de expresión pColdlV (Clontech Laboratories, Inc.
Madison, WI) usando un procedimiento de ADN ligasa T4. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de E. coli BL2i(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, D) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 g/mL de ampicilina y se colocaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructos de expresión fueron identificadas como colonias resistentes a ampicilina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizaron por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio el constructo de expresión pColdIV/TEV que comprende la molécula de polinucleotidos que codifica la variante 7 de TEV bajo el control del promotor shock en frío.
C. Construcción de células que comprenden los constructos de expresión pET29/GalLHN/A— EV y pColdIV/TEV Para preparar una célula con los constructos de expresión pET29/GalLHN/A-TEV y pColdIV/TEV, se transformó el constructo de expresión pET29/GalLHN/A-TEV en células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3) que alojan pColdIV/TEV usando electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 100 g/mL de ampicilina y 50 g/mL de canamicina y se colocaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían ambos constructos de expresión se identificaron como colonias resistentes a ampicilina-canamicina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizaron por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción para determinar la presencia de ambos constructos. Esta estrategia de clonación dio células que comprendían los constructos de expresión pET29/GalLHN/A-TEV y pColdIV/TEV.
D. Activación In slt de pET29/GalLHN/A Para producir formas bicatenarias de GalLHN/A-TEV en condiciones de autoinducción, se inocularon 3,0 mL de medio PA-0.5G que contenían 50 pg/mL de canamicina y 100 pg/mL de ampicilina con una colonia simple de células BL21(DE3) que aloja los constructos de expresión pET29/GalLHN/A-TEV y pColdIV/TEV y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. Aproximadamente 250 L de este cultivo iniciador se usaron para inocular 250 mL de ZYP-5052 que contenían 50 pg/mL de canamicina y 100 g/mL de ampicilina y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 8 horas y luego a 15 °C con agitación durante 18 horas. Las células se lisaron y se purificaron por IMAC usando resina Magne-His.
Para purificar GalLHN/A-TEV bicatenario por purificación Magne-His, se resuspendieron las células inducidas de cultivos de expresión de 250 mL en 16 mL de amortiguador frió de lavado (4-6 °C) IMAC que consistía en 100 mM de HEPES, pH 7,5, 10% v/v de glicerol, 10 mM de imidazol, NaCl 1 M. La suspensión celular se transfirió a una cámara de tratamiento bajo atmósfera sellada (#101-021-006, Branson Ultrasonics Corporation) y se sónico por 15 pulsos (10 seg, 30% de amplitud, cuerpo disruptor de 0,5 pulgadas) con 1 minuto entre pulsos (Sonifier® Digital 450, Branson Ultrasonics Corporation) . Durante la sonicación, la cámara de tratamiento con atmósfera sellada se enfrió haciendo pasar agua helada desde un baño de agua en circulación (3,5 °C) a través de la camisa externa de la cámara. El material sonicado se transfirió desde la cámara de tratamiento a un tubo limpio Oakridge y se centrifugó a 30.500 RCF durante 30 min (SL-50T Rotor, Sorvall; FIBERLite® F21S-8X50 Rotor, Piramoon Technologies Inc.) a 4 °C para eliminar los desechos celulares insolubles. El lisado clarificado se aspiró por jeringa y se pasó primero a través de un filtro de jeringa de 0,8 µp? y luego 0,45 µp? (Sartorius) en series a un tubo cónico limpio de 50 mL. Se sometió Resina de Purificación de Proteína Magne-His™ a vórtex (Promega Corp., Madison, I) hasta dar una suspensión uniforme y se transfirieron 4 mL de la suspensión al lisado clarificado. El tubo se selló y se invirtió varias veces para mezclar bien las partículas. La mezcla se incubó durante 30 min con buena agitación para unir la proteina objeto a 16 °C. El tubo se transfirió a una unidad de Separación Magnética MagneSil (Promega Corp., Madison, WI) y se dejó durante ~2 min capturar las partículas de resina. La solución sobrenadante se eliminó y el tubo se eliminó de la unidad de separación. La resina se resuspendió luego en 10 mL de amortiguador de lavado IMAC, se capturó en la unidad de separación magnética y el amortiguador' de lavado se retiró. La etapa de lavado se repitió dos veces más. Para eluir la proteína diana, la resina se resuspendió en 5 mL de amortiguador de elución Magne-His™ (100 mM de HEPES, pH 7,5, 500 mM de imidazol) incubado a temperatura ambiente durante 2 min, la resina se capturó en la unidad de separación magnética y la solución sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. La etapa de la elución se repitió una vez.
Para dializar el GalLHN/A-TEV purificado con IMAC para la cromatografía secundaria de intercambio iónico, las fracciones de elución agrupadas se dializaron en un FASTDIALYZER® equipado con 25 kD de membrana MWCO a 4 °C en 1 L de un amortiguador desalinizado (amortiguador A: 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) con agitación constante durante la noche.
Para purificar GalLHN/A-TEV bicatenario por cromatografía de intercambio aniónico, la solución de proteína desalinizada se cargó en una columna de intercambio aniónico de 1 mL de UNO-Q1, se preequilibró con amortiguador A, a un caudal de 1 mL/min. La proteina ligada se eluyó por gradiente de NaCl con amortiguador B que comprende 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 1 M a una tasa de flujo de 1 mL/min de la siguiente manera: 7% de amortiguador B para 3 mL, 15% de amortiguador B para 7 mL, 10% a 50% de amortiguador B para 10 mL. La elución de las proteínas de la columna se detectó con un detector de rayos UV visibles a 214 nm, 260 nm y 280 nm y se agruparon todas las fracciones pico y se determinó la concentración de proteina. Las alícuotas de congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Se analizó la proteína purificada BoNT/A-TEV por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo IB.
Los resultados indican que, cuando se coexpresó GalLHN/A-TEV con proteasa TEV, se observaron bandas casi superpuestas en condiciones de reducción, una de aproximadamente 51,1 kDa y otra de aproximadamente 52,1 kDa. Más aún, cuando las mismas muestras se corrieron en condiciones de no reducción, las dos bandas de aproximadamente 51,1 kDa y 52,1 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 103 kDa. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que la banda de aproximadamente 51,1 kDa corresponde al dominio enzimático de la toxina de Clostridium y la banda de aproximadamente 52,1 kDa corresponde al dominio de translocación de la toxina de Clostridium con el resto de direccionamiento de galanina unido a su extremo amino. La presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de dos cadenas de GalLH /A-TEV y también de que GalLHN/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con una eficacia de aproximadamente el 90%. Asi, la coexpresión de GalLHN/A-TEV y proteasa TEV en estas células de plásmidos independientes da como resultado el escisión de GalLHN/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión de galanina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y la posterior formación de la forma bicatenaria de GalLHN/A-TEV.
Ejemplo 7: Activación profética intracelular de una proteína que comprende un sitio de unión de galanina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado usando un constructo de expresión doble El siguiente ejemplo ilustra métodos útiles para purificar y cuantificar cualquiera de las proteínas que comprende un bucle bicatenario que comprende un dominio de unión de opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado descrito en la presente descripción donde la proteína blanco y la proteasa se expresan desde un plásmido de expresión doble.
A. Construcción del constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV Para construir el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV similar a los pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV y pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV construidos con anterioridad (ver el Ejemplo 4), se digerirá un constructo de expresión pET29/GalLHN/A-TEV con endonucleasas de restricción para 1) extirpar el inserto que comprende el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 100) que codifica GalLH /A-TEV (SEQ ID NO: 101); y 2) permitir que este inserto se una operativamente al MCS2 de pRSFduet/TEV, un vector pRSFduet-1 que aloja la variante 7 de TEV en CSI (descrito en el Ejemplo 3C) . El inserto de GalLHN/A-TEV se subclonará en el MCS2 del constructo pRSFduet/TEV usando un procedimiento de ADN ligasa T4 para obtener el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV. La mezcla de ligación se transformará en células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 50 g/mL de canamicina y colocadas en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Se identificarán bacterias que contienen constructos de expresión como colonias resistentes a canamicina y constructos candidatos confirmados por mapeo de digestión de endonucleasas de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dará un constructo de expresión doble pRSFduet donde la transcripción desde el primer promotor T7 producirá mARN que codifican TEV y GalLHN/A-TEV y la transcripción desde el segundo promotor T7 producirá mARN que codifican solo GalLHN/A-TEV.
B. Activación in situ de GalLHN/A-TEV Para producir formas bicatenarias de GalLHN/A-TEV en condiciones de autoinducción, se inocularán 3,0 mL de medio PA-0.5G que contienen 50 g/mL de canamicina con una colonia simple de células BL21(DE3) que comprende el constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2 GalLHN/A-TEV y se cultivarán a 37 °C con agitación durante la noche. 250 pL de este cultivo de inicio se usará para inocular 250 mL de ZYP-5052 con 50 g/mL de canamicina y se cultivarán a 37 °C con agitación durante 8 horas y luego a 16 °C con agitación durante 18 horas. Las células se sedimentarán por centrifugación, se lisarán, se purificarán por I AC, de desalizarán y se purificarán por cromatografía de intercambio aniónico tal como se describe en el Ejemplo 5D. La proteína diana purificada se analizará por SDS-PAGE en condiciones tanto de reducción como de no reducción y los geles se teñirán esencialmente tal como se describió en el Ejemplo IB para evaluar los niveles de expresión y la extensión en la que GalLHN/A-TEV producida a partir del constructo de expresión doble pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV se convierte en su forma bicatenaria .
Ejemplo 8 Activación intracelular de una proteína que comprende un dominio de unión de dinorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado usando un constructo de expresión doble en BEVS El siguiente ejemplo ilustra métodos útiles para purificar y cuantificar cualquiera de las proteínas que comprende un bucle bicatenario que comprende un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado descrito en la presente descripción donde se coexpresan la proteína diana y la proteasa en un constructo de expresión doble y bajo el control de dos promotores independientes en el sistema de vector de expresión de baculovirus (BEVS, por sus siglas en inglés) .
A. Construcción de constructo de expresión doble pBAC-6/ EV/DynLHN/A- EV.
Para construir el constructo de expresión doble pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV, se sintetizó un fragmento sintético (SEQ ID NO: 107) que codifica la variante 7 de TEV recombinante corriente abajo de la secuencia promotora plO y DynLHn/A-TEV corriente abajo de la secuencia promotora polH en orientación opuesta usando procedimientos estándar (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA) . Los oligonucleótidos complementarios de 20 a 50 bases de longitud se sintetizaron usando síntesis de fosforamidita estándar. Estos oligonucleótidos se hibridaron en dúplex bicatenarios que se ligaron secuencialmente juntos para asemejar la molécula de polinucleótidos de longitud total. Esta molécula de polinucleótidos se clonó usando métodos de biología molecular estándar en un vector de portador pUCBHBl en el sitio Smal para generar el plásmido pUCBHBl/plO-TEV/polH-DynLHN/A-TEV. La molécula de polinucleótidos sintetizada fue verificada por secuenciación usando BIG DYE TERMINATOR™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA.
Para generar el constructo de expresión doble pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV, se digirió pUCBHBl/plO-TEV/polH-DynLHN/A-TEV con endonucleasas de restricción que 1) extirpan el inserto que comprende toda la región de codificación de variante 7 de TEV bajo el control del promotor plO y DynLHN/A-TEV en la dirección opuesta bajo el control del promotor polH; y 2) permiten que este inserto se una operativamente a un vector de transferencia pBAC-6 (E D Biosciences-Novagen, Madison, WI) . Este inserto se subclonó usando un procedimiento de ADN ligasa T4 en el vector de transferencia pBAC-6 digerido con las endonucleasas de restricción análogas para obtener el constructo de expresión doble pBAC-6 diseñado que comprende marco de lectura abierto de variante 7 de proteasa TEV corriente abajo del promotor plO y un segundo marco de lectura abierto de DynLHN/A-TEV corriente abajo del promotor polH. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de E. coli BL21(DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, colocadas en placas de agar Luria-Bertani al 1,5% (pH 7.0) que contenían 100 g/mL de ampicilina y se colocaron en un incubador a 37 °C para crecimiento durante la noche. Las bacterias que contenían constructo de expresión se identificaron como colonias resistentes a ampicilina. Los constructos candidatos se aislaron usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizaron por mapeo de digestión de endonucleasa de restricción y secuenciando ambas cadenas de ADN para confirmar la presencia y la integridad del inserto. Esta estrategia de clonación dio como resultado un constructo de expresión doble pBAC-6 que comprende la molécula de polinucleótidos que codifica un DynLH/A-TEV operativamente unido a una etiqueta de purificación por afinidad de polihistidina de extremo carboxilo y proteas'a TEV.
B. Generación de stock de baculovirus recozabínantes TEV/DynLHN/A-TEV de alta titulación Antes de poder producir formas bicatenarias de DynLHN/A-TEV, se generaron stocks de baculovirus recombinantes de alta titulación que comprendían TEV/DynLHN/A-TEV. Aproximadamente 2xl06 de células de insectos Sf9 se sembraron en recipientes de 35 mm con un volumen de 2 mL de medio de cultivo celular de insectos ESF921. Una solución de transfección se preparó mezclando la solución A (que comprende 2 µ? de pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV, 0,5 µg de ADN de baculovirus flashBAC linealizado (Oxford Expression Technologies, Oxford, Reino Unido) y 100 ]iL de medio de transfección) con solución B (que comprendía 6 pL de reactivo de transfección TRANSLT®-2020 y 100 pL de medio de transfección) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron luego 800 pL más de medio de transfección a la mezcla de soluciones A/B, se mezclaron bien y se añadieron gota a gota a las células. Las células se incubaron a 28 °C durante 5 horas, al final de lo cual se añadieron 3 mL de ESF 921 para lograr un volumen final de 4 mL en cada pocilio. La incubación se continuó a 28 °C durante 4-5 días para la producción de P0 virus recombinantes . Para generar stocks de semillas de baculovirus Pl recombinantes de alta titulación, se titularon virus aislados de sobrenadante P0 usando ¿aculoQUANT (Oxford Expression Technologies, Oxford, Reino Unido) y luego se amplificaron en recipientes de agitación. Aproximadamente 100-200 mL de células Sf9 a una densidad de 2xl06 células/mL se infectaron con virus P0 con una MOI (multiplicidad de infección) < 1 pfu/célula y se incubaron con agitación durante 4 - 5 días. Después de cuantificar, el stock Pl de alta titulación se usó para infectar células Tni para una expresión de proteínas de mayor nivel .
C. Activación in situ de DynLHN/A-TEV Para producir formas bicatenarias de DynHN/A-TEV, se infectaron 50 mL de células Tni a una concentración de 1 x 106/mL con una MOI de 5 con stock viral recombinante Pl que comprende TEV/DynLHN/A-TEV y se colectaron 3 días después de la infección (pi) . Las células se lisaron y se purificaron por IMAC usando resina Magne-His .
Para purificar DynLHN/A-TEV bicatenario por purificación Magne-His, el sedimento celular se resuspendió en 20 mL de PBS sin Ca2+ o Mg2+ en presencia de 100 µ?· de reactivo PopCulture de insectos y 20 pL (10U) de Benzonasa Nucleasa, se mezclaron bien y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de clarificar el lisado celular por centrifugación a 16.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C, el sobrenadante se mezcló con 4 mL de resina de purificación de proteína Magne-His™ uniformemente suspendida (Promega Corp., Madison, WI) . La mezcla se incubó durante 20 rain a temperatura ambiente con agitación moderada para unir la proteína diana. El tubo se transfirió a una unidad de separación magnética MagneSil durante aproximadamente 2 min para permitir la captura de las partículas de resina. Después de eliminar el sobrenadante, el tubo se eliminó de la unidad de separación y la resina se resuspendió en 10 mL de amortiguador de lavado IMAC. Nuevamente, la resina se capturó en la unidad de separación magnética y el amortiguador de lavado se eliminó. La etapa de lavado se repitió dos veces más. Para eluir la proteina diana, la resina se resuspendió en 2,5 mL de amortiguador de elución Magne-His™ (100 mM de HEPES, pH 7, 5, 500 mM de imidazol) , se incubó a temperatura ambiente durante 2 min, la resina se capturó en la unidad de separación magnética y la solución sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. La etapa de elución se repitió otra vez para maximizar la recuperación diana de la resina magnética.
Para dializar el DynLHN/A-TEV purificado por IMAC para cromatografía secundaria de intercambio iónico, las fracciones de elución agrupadas se dializaron en un FASTDIALYZER® equipado con una membrana de 25 kD MWCO a 4 °C en 1 L de un amortiguador de desalinizado (amortiguador A: 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) con agitación constante durante la noche.
Para purificar DynLHN/A-TEV bicatenario por cromatografía de intercambio aniónico, la solución proteína desalinizada se cargó en una columna de intercambio aniónica de 1 mL UNO-Q1, se preequilibró con amortiguador A, a un caudal de 1 mL/min. La proteína unida se eluyó por gradiente de NaCl con amortiguador B que comprendía 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 1 M a un caudal de 1 mL/min de la siguiente manera: 7% de amortiguador B para 3 mL, 15% de amortiguador B para 7 mL, 10% a 50% de amortiguador B para 10 mL. La elución de las proteínas de la columna se detectó con un detector de rayos UV visibles a 214 nm, 260 nm y 280 nm y se agruparon todas las fracciones pico y se determinó la concentración de proteína. Las alícuotas se almacenaron a -20 °C. La proteína purificada de DynLHN/A-TEV se analizó por SDS-PAGE y los geles se tiñeron esencialmente tal como se describió en el Ejemplo IB.
Los resultados indican que, cuando se coexpresó DynLHN/A-TEV con proteasa TEV en células de insectos y se purificó hasta casi homogeneidad, se observaron bandas casi superpuestas en condiciones de reducción, una de aproximadamente 51 kDa y otra de aproximadamente 52 kDa. Más aún, cuando las mismas muestras se corrieron en condiciones de no reducción, las dos bandas de aproximadamente 50 kDa y 52 kDa desaparecieron y se observó una nueva banda de aproximadamente 102 kDa. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que la banda de aproximadamente 51 kDa corresponde al dominio enzimático de la toxina de Clostridium y la banda de aproximadamente 52 kDa corresponde al dominio de translocación de la toxina de Clostridium con el resto de direccionamiento de dinorfina unido con su extremo amino. La presencia de estas dos bandas era indicativa de la formación de dos cadenas de DynLHN/A-TEV y también que DynLHN/A-TEV monocatenario se convirtió en su forma bicatenaria con una eficacia del 80-90%. Así, la coexpresión de DynLHN/A-TEV y proteasa TEV en células de insectos infectadas con baculovirus TEV/DynLHN/A-TEV recombinantes generados del constructo de expresión doble pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV da como resultado el escisión de DynLHN/A-TEV en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión de dinorfina a sitio de escisión de proteasa TEV integrado y la posterior formación de la forma bicatenaria de DynLHN/A-TEV.
A pesar de que se describieron aspectos de la presente invención con referencia a las modalidades descritas, un experto en la técnica apreciará rápidamente que los ejemplos específicos descritos solo son ilustrativos de estos aspectos y no son limitativos de la presente invención. Se pueden hacer diversas modificaciones sin apartarse del espíritu de la presente invención.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método intracelular de conversión de toxina de Clostridium monocatenaria que comprende una región de bucle bicatenario en su forma bicatenaria, caracterizado porque comprende las etapas de: a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 3,5 horas, donde el constructo de expresión doble comprende: i) un marco de lectura abierto que codifica una toxina de Clostridium monocatenaria, donde la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) crecimiento de la célula a 22 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la toxina de Clostridium monocatenaria y la proteasa TEV del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la toxina de Clostridium monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, convirtiendo asi la toxina de Clostridium monocatenaria en su forma bicatenaria. 2. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de la toxina de Clostridium; 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de unión de la toxina de Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 3) el dominio de unión de la toxina de Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión de la toxina de Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de la toxina de Clostridium; o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de unión de la Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium. 3. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT o un dominio enzimático de BuNT. . El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT o un dominio de translocación de BuNT. 5. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de unión de la toxina de Clostridium es un dominio de unión de BoNT/A, un dominio de unión de BoNT/B, un dominio de unión de BoNT/Cl, un dominio de unión de BoNT/D, un dominio de unión de BoNT/E, un dominio de unión de BoNT/F, un dominio de unión de BoNT/G, un dominio de unión de TeNT, un dominio de unión de BaNT o un dominio de unión de BuNT. 6. Un método intracelular de conversión de proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, caracterizado porque comprende las etapas de a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 8 horas, donde el constructo de expresión doble comprende i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria, donde la proteina monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) crecimiento de la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y la proteasa TEV del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteina monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro del dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, convirtiendo asi la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria. 7. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteina comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, 3) el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, 4) el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium; o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado. 8. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT, o un dominio enzimático de BuN . 9. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT, o un dominio de translocación de BuNT. 10. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de unión opioide al sitio de escisión de proteasa TEV integrado es un dominio de unión de nociceptina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de dinorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de encefalina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado un dominio de unión de BAM22 al sitio de escisión de proteasa TEV integrado un dominio de unión de endomorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado un dominio de unión de endorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado, un dominio de unión de hemorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado o un dominio de unión de rimorfina al sitio de escisión de proteasa TEV integrado. 11. Un método intracelular de conversión de proteina monocatenaria en su forma bicatenaria, caracterizado porque comprende las etapas de a) crecimiento de una célula que comprende un constructo de expresión doble a 37 °C durante aproximadamente 8 horas, donde el constructo de expresión doble comprende; i) un marco de lectura abierto que codifica una proteina monocatenaria, donde la proteina monocatenaria comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación, un dominio de unión de toxina no Clostridium y una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV; y ii) un marco de lectura abierto que codifica una proteasa TEV; b) crecimiento de la célula a aproximadamente 12 a aproximadamente 16 °C durante aproximadamente 16 a aproximadamente 18 horas, donde el crecimiento en la etapa (b) induce la expresión de la proteina monocatenaria y la proteasa TEV del constructo de expresión doble; y donde la proteasa TEV producida escinde la proteína monocatenaria en el sitio de escisión de la proteasa TEV ubicado dentro de la región de bucle bicatenario, convirtiendo así la proteína monocatenaria en su forma bicatenaria . 12. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la toxina de Clostridium monocatenaria comprende un orden de polipéptido simple de amino a carboxilo lineal de 1) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de toxina no Clostridium; 2) el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de unión de toxina no Clostridium y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 3) el dominio de unión de toxina no Clostridium, el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium; 4) el dominio de unión de toxina no Clostridium, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV y el dominio de translocación de la toxina de Clostridium; 5) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y el dominio de unión de toxina no Clostridium; o 6) el dominio de translocación de la toxina de Clostridium, la región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV, el dominio de unión no Clostridium y el dominio enzimático de la toxina de Clostridium. 13. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio enzimático de la toxina de Clostridium es un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de de BoNT/E, un dominio enzimático BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT, o un dominio enzimático de BuNT. 14. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio de translocación de la toxina de Clostridium es un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/Cl, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT, o un dominio de translocación de BuNT. 15. El método intracelular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio de unión de toxina no Clostridium es un dominio de unión péptido opioide, un dominio de unión a péptido de melanocortina, un dominio de unión a péptido de galanina, un dominio de unión a péptido de granina, un dominio de unión a péptido de taquiquinina, un dominio de unión a péptido relacionado con neuropéptido Y, un dominio de unión a péptido de neurohormona, un dominio de unión a péptido de citocina, un dominio de unión a péptido de quinina, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento de fibroblastos, un dominio de unión a péptido de neurotrofina, un dominio de unión a péptido de factor de necrosis tumoral, un dominio de unión a péptido de factor neurotrófico derivado glial, un dominio de unión a péptido de factor ß de crecimiento de transformación, un dominio de unión a péptido de proteina morfogenética ósea, un dominio de unión a péptido del factor de crecimiento y diferenciación, un dominio de unión a péptido de activina, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento endotelial vascular, un dominio de unión a péptido de' factor de crecimiento de insulina, un dominio de unión a péptido de factor de crecimiento epidérmico, un dominio de unión a péptido de hormona tipo glucagón, un dominio de unión a péptido activante de la adenilato ciclasa de la pituitaria, un dominio de unión a péptido de hormona liberadora de la hormona de crecimiento, un dominio de unión a péptido intestinal vasoactivo, un dominio de unión a péptido polipéptido inhibidor gástrico, un dominio de unión a péptido intestinal peptidovisceral relacionado con calcitonina o un dominio de unión a péptido receptor activado por proteasa.
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