JP2013517797A - 単鎖タンパク質をそれらの2鎖形態に細胞内変換する方法 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
1.単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)最大細胞密度を達成するために、二重発現構築体を含む細胞を、第1の温度である期間増殖させ、二重発現構築体が、
i)外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームからのタンパク質発現の最大誘導を達成するために、細胞を第2の温度である期間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
2.単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約3.5時間増殖させ、二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)細胞を22℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、二重発現構築体からの単鎖クロストリジウム毒素及びプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。
3.単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、2に記載の細胞内方法:(1)クロストリジウムの酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン;2)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン;3)クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン;4)クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン;5)クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン;又は6)クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
4.クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/Fの酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、2に記載の細胞内方法。
5. クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、2に記載の細胞内方法。
6.クロストリジウム毒素結合ドメインが、BoNT/A結合ドメイン、BoNT/B結合ドメイン、BoNT/C1結合ドメイン、BoNT/D結合ドメイン、BoNT/E結合ドメイン、BoNT/F結合ドメイン、BoNT/G結合ドメイン、TeNT結合ドメイン、BaNT結合ドメイン、又はBuNT結合ドメインである、2に記載の細胞内方法。
7.外来性プロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス3Cプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑紋ウイルス(TVMV)プロテアーゼ切断部位、サブチリシンプロテアーゼ切断部位、又はカスパーゼ3プロテアーゼ切断部位である、2に記載の細胞内方法。
8.プロテアーゼが、エンテロキナーゼプロテアーゼ、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ、ヒトエンテロウイルス3Cプロテアーゼ、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、タバコ葉脈斑紋ウイルス(TVMV)プロテアーゼ、サブチリシンプロテアーゼ、又はカスパーゼ3プロテアーゼである、2に記載の細胞内方法。
9.単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約8時間増殖させ、二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)TEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)細胞を、約12〜16℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びTEVプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたTEVプロテアーゼが、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置するTEVプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
10.タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、9に記載の細胞内方法:1)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、2)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン、3)統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン、4)統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン、5)クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は6)クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン。
11.クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/Fの酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、9に記載の細胞内方法。
12.クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、9に記載の細胞内方法。
13.統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオド(opiod)結合ドメインが、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−BAM22結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型TEVプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、9に記載の細胞内方法。
14.単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約8時間増殖させ、二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びTEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)TEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)細胞を、約12〜16℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びTEVプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたTEVプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置するTEVプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
15.単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、14に記載の細胞内方法:(1)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン;2)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン;3)非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン;4)非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン;5)クロストリジウム毒素移行ドメイン、TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン;又は6)クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
16.クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/Fの酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、14に記載の細胞内方法。
17.クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、14に記載の細胞内方法。
18.非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドY関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞(epidermial)増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、14に記載の細胞内方法。
TEVプロテアーゼ変異体
以下の例は、安定性及び/又は溶解度が増加されたTEVプロテアーゼ変異体を製作及び使用する方法を示す。
TEVプロテアーゼを組換え的に産生するために、所望のTEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを、標準的手順(BlueHeron Biotechnology社製、ボセル、ワシントン州)を使用して合成した。オープンリーディングフレーム全体に及ぶ、長さが20〜50塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、PUCBHB1担体ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/TEVプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、BIG DYE TERMINATOR(商標)Chemistry 3.1(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)及びABI3100型配列決定装置(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して配列決定することにより確認した。
使用する最良の増殖及びタンパク質誘導条件を決定するために、pET29/TEV変異体9及び10(表3)を、IPTG誘導培地及び自己誘導培地中で増殖及び誘導した。加えて、誘導の長さを試験した。
対照としての変異体11に加えて、上位5つのpET29/TEV変異体からのTEVプロテアーゼ発現レベルを、大規模条件下で厳密に比較するために、50μg/mLカナマイシンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、適切な発現構築体を内包するBL21(DE3)細胞の単一コロニーを播種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLカナマイシンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら8時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。
2つの異なる発現構築体を使用した、TEVプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素を細胞内で発現させるのに有用な手順を示す。
二鎖ループ領域内に位置するTEVプロテアーゼ切断部位を含むBoNT/Aを産生するために、所望のBoNT/A−TEV(配列番号88)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号87)を、標準的手順(BlueHeron Biotechnology社、ボセル、ワシントン州)を使用して合成した。BoNT/A−TEVのオープンリーディングフレーム全体に及ぶ、長さが20〜50塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、PUCBHB1担体ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A−TEV構築体を生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、BIG DYE TERMINATOR(商標)Chemistry 3.1(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)及びABI3100型配列決定装置(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して配列決定することにより確認した。
pET22/TEV変異体発現構築体を生成するために、pET29/TEV変異体7発現構築体を、1)TEVプロテアーゼ(配列番号78)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号77)を含むインサートを切除し、及び2)このインサートが、pET22ベクター(EMD Biosciences−Novagen社、マディソン、ウィスコンシン州)に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。このインサートを、T4DNAリガーゼ手順を使用して、類似の制限エンドヌクレアーゼで消化されたpET22ベクターにサブクローニングして、適切なpET22/TEV発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mLアンピシリンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、アミノ末端ポリヒスチジン親和性精製ペプチドに作用可能に結合されたTEV変異体7をコードするポリヌクレオチド分子を含むpET22発現構築体が得られた。
pET29/BoNT/A−TEV及びpET22/TEV発現構築体を含む細胞を製作するために、pET29/BoNT/A−TEV発現構築体を、エレクトロポレーションを使用して、pET22/TEV変異体7発現構築体を内包するエレクトロコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換し、50μg/mLアンピシリン及び50μg/mLカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を確認した。このクローニング戦略により、pET29/BoNT/A−TEV及びpET22/TEV発現構築体を含む細胞が得られた。
自己誘導条件下で二鎖形態のBoNT/A−TEVを産生するために、50μg/mLカナマイシン及び50μg/mLアンピシリンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pET29/BoNT/A−TEV及びpET22/TEV発現構築体を内包するBL21(DE3)細胞の単一コロニーを接種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。約1.0μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLカナマイシン及び50μg/mLアンピシリンを含有する1.0mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら3.5時間増殖させ、その後22℃で振とうしながら18.5時間増殖させた。対照として、pET29/BoNT/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、50μg/mLカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
y=a/(1+(x/x0)b)
式中、yは応答であり、aは漸近ymaxであり、bは傾きであり、xは用量であり、0はED50用量である。ピークED50を決定するために、Ymaxを4に設定した(尺度の最大DAS測定値)。平均(ピーク及び/又はAUC)ED50値を、実施した各8用量の試験毎に計算した。
独立したプロモーターの制御下にある2つの異なる発現構築体を使用した、TEVプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素を細胞内で発現させるのに有用な手順を示す。この場合、二鎖形態の毒素の形成は、独立したプロモーターの制御下にあるTEVプロテアーゼにより制御される。
その発現がアラビノースプロモーター(PBAD)の制御下にあったTEVプロテアーゼを組換え的に産生するために、TEVプロテアーゼ変異体7(表3[130])をコードするオープンリーディングフレームを、N末端Hisタグを除いて、発現ベクターpBAD/Myc−HisAにクローニングして、pBAD/TEVを構築した。pBAD/TEVを構築するために、TEVプロテアーゼ変異体7(配列番号106)をコードするオープンリーディングフレームを、N末端ポリ−ヒスチジンタグを除いて、標準的手順(BlueHeron Biotechnology社、カールズバッド、カリフォルニア州)を使用して合成した。また、合成断片は、このインサートが、pBAD/Myc−HisAベクター(Life Technologies社、マディソン、ウィスコンシン州)に作用可能に結合されることを可能にする制限部位により隣接されていた。T4DNAリガーゼ手順を使用して、このインサートを、多重クローニング部位が同じ制限エンドヌクレアーゼで消化されたpBAD/Myc−HisAベクターに方向的に正しくライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、TEV遺伝子インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、ポリヒスチジン親和性精製ペプチドを含まないTEV変異体7をコードするポリヌクレオチド分子を含むpBAD/TEV発現構築体が得られた。
pET29/BoNT/A−TEV及びpBAD/TEV発現構築体を含む細胞を製作するために、pET29/BoNT/A−TEV発現構築体(実施例2Aに記載)を、エレクトロポレーションを使用して、pBAD/TEV変異体7発現構築体を内包するエレクトロコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換し、50μg/mLのアンピシリン及び50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を決定した。このクローニング戦略により、pET29/BoNT/A−TEV及びpBAD/TEV発現構築体を含む細胞が得られた。
自己誘導条件下で二鎖形態のBoNT/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシン及び50μg/mLのアンピシリンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pET29/BoNT/A−TEV及びpBAD/TEV発現構築体を内包するBL21(DE3)細胞の単一コロニーを接種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシン及び100μg/mLのアンピシリンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら8時間増殖させ、その後22℃で振とうしながら14時間増殖させた。この時点で、TEV発現を0.2%L−アラビノースで誘導し、培養物を22℃で更に4時間増殖させた。対照として、pET29/BoNT/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、50μg/mLのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
二重発現構築体を使用した、TEVプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素を精製及び定量化するのに有用な手順を示す。
pET29/BoNT/A−TEV/2×TEV二重発現構築体を構築するために、BoNT/A−TEVの最後の37個アミノ酸、並びに大腸菌発現に必要な転写(T7プロモーター、lacオペレーター部位)及び翻訳(RBS)エレメント、並びにTEV変異体7のコード領域全体をコードする合成断片(配列番号89)を、標準的手順(BlueHeron Biotechnology、ボセル、ワシントン州)を使用して合成した。長さが20〜50塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、PUCBHB1担体ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A−TEV_C−term/T7Prom/TEVプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、BIG DYE TERMINATOR(商標)Chemistry 3.1(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)及びABI3100型配列決定装置(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して配列決定することにより確認した。
自己誘導条件下で二鎖形態のBoNT/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pET29/BoNT/A−TEV/TEV二重発現構築体を含むBL21(DE3)細胞の単一コロニーを接種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。約250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら3.5時間増殖させ、その後22℃で振とうしながら18.5時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例2Dの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、IMAC精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、SDS−PAGEで分析し、ゲルを染色した。対照として、pET29/BoNT/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、50μg/mLのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
BoNT/A−TEV及びTEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームの構成を逆にすることが、BoNT/A−TEVの収量及び切断効率に影響を及ぼすことになるか否かを決定するために、第1のT7プロモーターからの転写開始が、TEV及びBoNT/A−TEVをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを産出し、第2のT7プロモーターからの転写開始が、BoNT/A−TEVのみをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを産出する二重発現構築体を製作した。したがって、BoNT/A−TEVをコードするmRNAは、TEVプロテアーゼと比較して、2倍多く存在するだろう。
それら自体の独立したmRNAからBoNT/A−TEV及びTEVのみを産生することができる転写単位構成からのBoNT/A−TEV収量及び二鎖への変換効率を決定するために、pET29/BoNT/A−TEV/TEVを構築した。pET29/BoNT/A−TEV/TEV二重発現構築体を生成するために、短鎖合成DNA断片を使用して、T7ターミネーター部位(配列番号92)を、二重発現構築体pET29/BoNT/A−TEV/2×TEV(上記の実施例3A)のBoNT/A−TEV及びTEVのオープンリーディングフレーム間の介在配列に組み込んだ。これは、本質的には、T4DNAリガーゼ手順を使用して、T7ターミネーター部位を欠如したpET29/BoNT/A−TEV/2×TEVの介在領域を、配列番号93のT7終止部位と共に介在性転写及び翻訳エレメントを内包する合成DNA断片と交換することにより達成した。pET29/BoNT/A−TEV/TEVと称する、その結果生じた二重発現構築体は、それぞれ第1及び第2のT7プロモーターから転写される、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性タグ及びTEVプロテアーゼに作用可能に結合されたBoNT/A−TEV変異体をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
pET29/BoNT/A−TEV/2×TEV二重発現構築体、pRSF/TEV/2×BoNT/A−TEV二重発現構築体、又はpET29/BoNT/A−TEV/TEV二重発現構築体を含むBL21(DE3)細胞を使用した以外は、本質的に実施例2Dの記載と同様に、自己誘導条件下での二鎖形態のBoNT/A−TEVの増殖及び誘導を実施し、これら細胞系の各々からの単一コロニーを使用して、4つの1.0mL培養に並行して播種した。増殖及び誘導した後、4つの1.0mLの複製物を、プロセシング用に一緒に貯溜した。実施例1Bの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、IMAC精製し、SDS−PAGEで分析し、ゲルを染色した。対照として、pET29/BoNT/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、50μg/mLのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。結果は、BoNT/A−TEVが、3つの二重発現構築体のうちのいずれかを含有する細胞から全く同等なレベルで発現されたが、二鎖への変換の程度は様々であったことを示す。単鎖BoNT/A−TEVは、タンパク質が、pET29/BoNT/A−TEV/2×TEVから発現された場合は、約96%の効率で、タンパク質が、pET29/BoNT/A−TEV/TEVから発現された場合は、約81%の効率で、タンパク質が、pRSFduet/TEV/2×BoNT/A−TEVから発現された場合は、約99%を超える効率で、その二鎖形態に変換された。
二重発現構築体を使用した、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な手順を示す。
pRSFduet/TEV/2×NociLHN/A−TEV二重発現構築体を構築するために、pET29/NociLHN/A−TEV発現構築体を、1)NociLHN/A−TEV(配列番号95)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号94)を含むインサートを切除し、2)このインサートが、TEV変異体7をMCSIに内包するpRSFduet−1ベクターであるpRSFduet/TEV(実施例3Cに記載)のMCS2に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。NociLHN/A−TEVインサートを、T4DNAリガーゼ手順を使用して、pRSFduet/TEV構築体のMCS2にサブクローニングし、適切なpRSFduet/TEV/2×NociLHN/A−TEV二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、第1のT7プロモーターからの転写が、TEV及びNociLHN/A−TEVをコードするmRNAを産生することになり、第2のT7プロモーターからの転写が、NociLHN/A−TEVのみをコードするmRNAを産生することになる、pRSFduet二重発現構築体が得られた。
自己誘導条件下で二鎖形態のNociLHN/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pRSFduet/TEV/2×NociLHN/A−TEV二重発現構築体を含むBL21(DE3)細胞の単一コロニーを播種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら8時間増殖させ、その後16℃で振とうしながら18時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例2Dの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、IMAC精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、SDS−PAGEで分析し、ゲルを染色した。対照として、NociLHN/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、上述のように増殖及び誘導した。
pRSFduet/TEV/2×DynLHN/A−TEV二重発現構築体を、pRSFduet/TEV/2×NociLHN/A−TEVとほとんど同じように生成した。pET29/DynLHN/A−TEV発現構築体を、1)DynLHN/A−TEV(配列番号97)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号96)を含むインサートを切除し、2)このインサートが、pRSFduet/TEV(実施例3Cに記載)のMCS2に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。DynLHN/A−TEVインサートを、T4DNAリガーゼ手順を使用して、pRSFduet/TEV構築体のMCS2にサブクローニングし、適切なpRSFduet/TEV/2×DynLHN/A−TEV二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、第1のT7プロモーターからの転写が、TEV及びDynLHN/A−TEVをコードするmRNAを産生することになり、第2のT7プロモーターからの転写が、DynLHN/A−TEVのみをコードするmRNAを産生することになる、pRSFduet二重発現構築体が得られた。
自己誘導条件下で二鎖形態のNociLHN/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pRSFduet/TEV/2×DynLHN/A−TEV二重発現構築体を含むBL21(DE3)細胞の単一コロニーを播種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら8時間増殖させ、その後16℃で振とうしながら18時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例2Dの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、IMAC精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、SDS−PAGEで分析し、ゲルを染色した。対照として、DynLHN/A−TEVのみを内包するBL21(DE3)細胞を、上述のように増殖及び誘導した。
2つの異なる発現構築体を使用した、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、別々のプラスミドから発現され、異なるプロモーターの制御下にある、本明細書で開示される統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
pET29/GalLHN/A−TEV発現構築体を構築するために、まずpET29/DynLHN/A−TEV発現構築体を、制限エンドヌクレアーゼで消化して、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメインを含む二鎖ループをコードするDNAセグメントを切除した。その結果生じたpET29/LHn/Aフレームワーク断片を、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメイン(配列番号99)を含む二鎖ループを含む、適合する制限部位で挟まれた合成DNA断片(配列番号98)とライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、GalLHN/A−TEVの発現がT7プロモーターの制御下にある、GalLHN/A−TEV(配列番号101)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号100)を含むpET29/GalLHN/A−TEV発現構築体を得た。
TEVがコールドショックプロモーター(csp)の制御下にある発現構築体を生成するために、TEV変異体7(配列番号22)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号91)を、pET29/TEV変異体7発現構築体からPCRで増幅した。ポリ−ヒスチジン親和性タグをコードするオープンリーディングフレームの5’末端を増幅から除外して、タグの付いていないプロテアーゼをコードした。増幅した後、PCRプライマーによりPCR産物の末端に組み込まれた固有の制限部位で、PCR産物を消化し、T4DNAリガーゼ手順を使用して、発現プラスミドpColdIV(Clontech Laboratories,Inc.社、マディソン、ウィスコンシン州)の多重クローニング部位の対応する部位にクローニングした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mLのアンピシリンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、コールドショックプロモーターの制御下にTEV変異体7をコードするポリヌクレオチド分子を含むpColdIV/TEV発現構築体を得た。
pET29/GalLHN/A−TEV及びpColdIV/TEV発現構築体を含む細胞を製作するために、pET29/GalLHN/A−TEV発現構築体を、エレクトロポレーションを使用して、pColdIV/TEVを内包するエレクトロコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換し、100μg/mLのアンピシリン及び50μg/mLのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を確認した。このクローニング戦略により、pET29/GalLHN/A−TEV及びpColdIV/TEV発現構築体を含む細胞を得た。
自己誘導条件下で二鎖形態のGalLHN/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシン及び100μg/mLのアンピシリンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pET29/GalLHN/A−TEV及びpColdIV/TEV発現構築体を内包するBL21(DE3)細胞の単一コロニーを播種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。約250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシン及び100μg/mLのアンピシリンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振盪とうしながら8時間増殖させ、その後15℃で振盪とうしながら18時間増殖させた。細胞を溶解し、Magne−His樹脂を使用してIMAC精製した。
二重発現構築体を使用した、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含むタンパク質の予想される細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、二重発現プラスミドから発現される、本明細書で開示される統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
以前に構築されたpRSFduet/TEV/2×NociLHN/A−TEV及びpRSFduet/TEV/2×DynLHN/A−TEV(実施例4を参照)と同様なpRSFduet/TEV/2×GalLHN/A−TEV二重発現構築体を構築するために、pET29/GalLHN/A−TEV発現構築体を、1)GalLHN/A−TEV(配列番号101)をコードするオープンリーディングフレーム(配列番号100)を含むインサートを切除し、2)このインサートが、MCSIにTEV変異体7を内包するpRSFduet−1ベクターであるpRSFduet/TEV(実施例3Cに記載)のMCS2に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化することになる。GalLHN/A−TEVインサートを、T4DNAリガーゼ手順を使用して、pRSFduet/TEV構築体のMCS2にサブクローニングし、適切なpRSFduet/TEV/2xGalLHN/A−TEV二重発現構築体を得ることになる。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)に形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含有する1.5%LB寒天プレート(pH7.0)に播種し、37℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させることになる。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定し、候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両DNA鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認することになる。このクローニング戦略により、第1のT7プロモーターからの転写が、TEV及びGalLHN/A−TEVをコードするmRNAを産生することになり、第2のT7プロモーターからの転写が、GalLHN/A−TEVのみをコードするmRNAを産生することになる、pRSFduet二重発現構築体が得られることになる。
自己誘導条件下で二鎖形態のGalLHN/A−TEVを産生するために、50μg/mLのカナマイシンを含有する3.0mLのPA−0.5G培地に、pRSFduet/TEV/2×GalLHN/A−TEV二重発現構築体を含むBL21(DE3)細胞の単一コロニーを接種し、37℃で振とうしながら一晩増殖させることになる。250μLのこの開始培養を使用して、50μg/mLのカナマイシンを含有する250mLのZYP−5052に播種し、37℃で振とうしながら8時間増殖させ、その後16℃で振とうしながら18時間増殖させることになる。実施例5Dに記載のように、細胞を遠心分離によりペレットにし、溶解し、IMAC精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製することになる。精製した目的タンパク質を、実施例1Bの記載と本質的に同様に、還元及び非還元条件下の両方でSDS−PAGEにより分析し、ゲルを染色して、発現レベル及びpRSFduet/TEV/2×GalLHN/A−TEV二重発現構築体から産生されるGalLHN/A−TEVがその二鎖形態に変換される程度を評価することになる。
BEVS中の二重発現構築体を使用した、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、二重発現構築体で同時発現され、バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)の2つの異なるプロモーターの制御下にある、本明細書で開示される統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
pBAC−6/TEV/DynLHN/A−TEV二重発現構築体を構築するために、p10プロモーター配列の下流にある組換えTEV変異体7、及び反対の方向性でpolHプロモーター配列の下流にあるDynLHn/A−TEVをコードする合成断片(配列番号107)を、標準的手順(BlueHeron Biotechnology社、ボセル、ワシントン州)を使用して合成した。長さが20〜50塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、pUCBHB1担体ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/p10−TEV/polH−DynLHN/A−TEVプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、BIG DYE TERMINATOR(商標)Chemistry 3.1(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)及びABI3100型配列決定装置(Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して配列決定することにより確認した。
二鎖形態のDynLHN/A−TEVを産生し得る前に、TEV/DynLHN/A−TEVを含む高力価組換えバキュロウイルスストックを生成した。およそ2×106個のSf9昆虫細胞を、35mm皿中の2mL容積の昆虫細胞培養培地ESF921に接種した。溶液A(2μgのpBAC−6/TEV/DynLHN/A−TEV、0.5μgの線形化flash BACバキュロウイルスDNA(Oxford Expression Technologies社製、オックスフォード、英国)、及び100μLの形質移入培地を含む)と溶液B(6μLのTRANSLT(登録商標)−2020形質移入試薬及び100μLの形質移入培地を含む)を混合し、室温で30分間インキュベートすることにより、形質移入溶液を調製した。次に、更なる800μLの形質移入培地を、溶液A/B混合物に添加し、穏やかに混合し、細胞に滴加した。細胞を28℃で5時間インキュベートし、その終了時に、3mLのESF921を添加して、各ウエルの最終容積を4mLにした。P0組換えウイルスを産生するために、インキュベーションを28℃で4〜5日間継続した。より高力価のP1組換えバキュロウイルス種ストックを生成するために、P0上清から単離したウイルスを、baculoQUANT(Oxford Expression Technologies社製、オックスフォード、英国)を使用して滴定し、振とうフラスコで更に増幅した。2×106細胞/mLの密度の約100〜200mLのSf9細胞を、MOI(感染多重度)<1pfu/細胞でP0ウイルスに感染させ、振とうさせながら4〜5日間インキュベートした。定量化した後、高力価P1ストックを使用して、高レベルタンパク質発現用のTni細胞に感染させた。
二鎖形態のDynHN/A−TEVを生成するために、1×106/mLの濃度の50mL Tni細胞を、5のMOIで、TEV/DynLHN/A−TEVを含む組換えP1ウイルスストックに感染させ、感染後(pi)3日目に回収した。細胞を溶解し、Magne−His樹脂を使用してIMAC精製した。
Claims (15)
- 二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約3.5時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及びTEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)TEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)前記細胞を22℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖クロストリジウム毒素及び前記TEVプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたTEVプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記TEVプロテアーゼ切断部位で前記単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより前記単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。 - 前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項1に記載の細胞内方法:(1)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン;2)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン;3)前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン;4)前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン;5)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン;又は6)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
- 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/F酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 前記クロストリジウム毒素結合ドメインが、BoNT/A結合ドメイン、BoNT/B結合ドメイン、BoNT/C1結合ドメイン、BoNT/D結合ドメイン、BoNT/E結合ドメイン、BoNT/F結合ドメイン、BoNT/G結合ドメイン、TeNT結合ドメイン、BaNT結合ドメイン、又はBuNT結合ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約8時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む前記単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)TEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)前記細胞を、約12〜16℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記TEVプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたTEVプロテアーゼが、前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置する前記TEVプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。 - 前記タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項6に記載の細胞内方法:1)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、2)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、3)前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、4)前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、5)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は6)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイドの結合ドメイン。
- 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/Fの酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 前記統合型TEVプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインが、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−BAM22結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型TEVプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型TEVプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、請求項1に記載の細胞内方法。
- 単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
a)二重発現構築体を含む細胞を、37℃で約8時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
i)酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びTEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ii)TEVプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
b)前記細胞を、約12〜16℃で約16〜約18時間増殖させるステップを含み、
ステップ(b)の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記TEVプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたTEVプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記TEVプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。 - 前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項11に記載の細胞内方法:(1)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン;2)前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン;3)前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン;4)前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン;5)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン;又は6)前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記TEVプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
- 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/Fの酵素ドメイン、BoNT/G酵素ドメイン、TeNT酵素ドメイン、BaNT酵素ドメイン、又はBuNT酵素ドメインである、請求項11に記載の細胞内方法。
- 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、BoNT/A移行ドメイン、BoNT/B移行ドメイン、BoNT/C1移行ドメイン、BoNT/D移行ドメイン、BoNT/E移行ドメイン、BoNT/F移行ドメイン、BoNT/G移行ドメイン、TeNT移行ドメイン、BaNT移行ドメイン、又はBuNT移行ドメインである、請求項11に記載の細胞内方法。
- 前記非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドY関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、請求項11に記載の細胞内方法。
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Cited By (3)
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JP2018502580A (ja) * | 2015-01-09 | 2018-02-01 | イプセン・バイオイノベーション・リミテッドIpsen Bioinnovation Limited | 陽イオン性神経毒 |
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JP2022502070A (ja) * | 2018-10-10 | 2022-01-11 | 上饒市康可得生物科技有限公司Shangrao Concord Pharmaceutical Co., Ltd. | プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント |
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CA2829793C (en) * | 2011-03-11 | 2018-11-27 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Method for the determination of botulinum neurotoxin biological activity |
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MX363788B (es) * | 2012-11-21 | 2019-04-03 | Ipsen Bioinnovation Ltd | Métodos para la producción de polipéptidos procesados proteolíticamente. |
RU2627181C2 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-08-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантного человеческого белка cd47 |
US10308927B2 (en) * | 2017-01-17 | 2019-06-04 | The United States of America, as Represented by the Secretary of Homeland Security | Processing of a modified foot-and-mouth disease virus P1 polypeptide by an alternative protease |
CN109055339B (zh) * | 2018-09-19 | 2020-09-01 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用 |
CN111019925B (zh) * | 2018-10-10 | 2022-08-23 | 上饶市康可得生物科技有限公司 | 筛选蛋白酶变体的方法以及获得的蛋白酶变体 |
CN111019926B (zh) * | 2018-10-10 | 2021-11-26 | 上饶市康可得生物科技有限公司 | Tev蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途 |
WO2020073554A1 (zh) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | 上饶市康可得生物科技有限公司 | Tev蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途 |
KR20200080749A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법 |
WO2021062063A1 (en) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Improved variants of tev protease for biotechnological applications |
CN113801866B (zh) * | 2021-09-02 | 2022-08-16 | 无锡佰翱得生物科学有限公司 | 一种高效表达具有高活性及稳定性的重组tev酶及其制备方法和应用 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
EP4321618A1 (en) * | 2022-08-09 | 2024-02-14 | NUMAFERM GmbH | Variants of tev protease and uses thereof |
CN116640196B (zh) * | 2023-05-10 | 2024-02-06 | 山东农业大学 | 囊泡相关膜蛋白的相关蛋白vap1在抗马铃薯y病毒中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040018589A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-01-29 | Jun Zhong | Method for producing biologically active botulinum neurotoxins through recombinant DNA technique |
WO2008028535A1 (de) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Universitätsklinikum Freiburg | Split-core-partikel für die präsentation von fremdmolekülen, insbesondere für impfstoffartwendungen und verfahren zu deren herstellung |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991013167A1 (en) | 1990-02-26 | 1991-09-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification and expression of insect steroid receptor dna sequences |
US5364791A (en) | 1992-05-14 | 1994-11-15 | Elisabetta Vegeto | Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations |
AU685054C (en) | 1992-05-14 | 2003-02-27 | Baylor College Of Medicine | Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy |
ATE242330T1 (de) | 1993-01-15 | 2003-06-15 | Inst Genetics Llc | Klonierung von enterokinase und verfahren zu deren verwendung |
US6746859B1 (en) | 1993-01-15 | 2004-06-08 | Genetics Institute, Llc | Cloning of enterokinase and method of use |
US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
US5814618A (en) | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
GB9818548D0 (en) | 1998-08-25 | 1998-10-21 | Microbiological Res Authority | Treatment of mucas hypersecretion |
US6776990B2 (en) | 1999-04-08 | 2004-08-17 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for the treatment of pancreatitis |
CZ2002220A3 (cs) | 1999-07-22 | 2002-05-15 | The Procter & Gamble Company | Varianty subtilisinové proteasy s delecemi a substitucemi aminokyselin v definovaných epitopových regionech |
US7740868B2 (en) | 1999-08-25 | 2010-06-22 | Allergan, Inc. | Activatable clostridial toxins |
ES2277854T5 (es) | 1999-08-25 | 2011-02-04 | Allergan, Inc. | Neurotoxinas recombinantes activables. |
US20090018081A1 (en) | 1999-08-25 | 2009-01-15 | Allergan, Inc. | Activatable clostridial toxins |
US20080032931A1 (en) | 1999-08-25 | 2008-02-07 | Steward Lance E | Activatable clostridial toxins |
US20030180289A1 (en) | 1999-09-23 | 2003-09-25 | Foster Keith Alan | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
US7138127B1 (en) | 2000-01-19 | 2006-11-21 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain |
US6500436B2 (en) | 2000-01-19 | 2002-12-31 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain |
US7491799B2 (en) | 2000-07-21 | 2009-02-17 | Allergan, Inc. | Modified botulinum neurotoxins |
US6903187B1 (en) | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
US7273722B2 (en) | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
US7132529B2 (en) | 2001-07-30 | 2006-11-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of stearoyl-CoA desaturase expression |
US7022329B2 (en) | 2002-02-25 | 2006-04-04 | Allergan, Inc. | Method for treating neurogenic inflammation pain with botulinum toxin and substance P components |
US6836976B2 (en) | 2003-03-18 | 2005-01-04 | Solveig Laura Haugland | Collapsible outdoor footwear and backpack |
GB0321344D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Health Prot Agency | Re-targeted toxin conjugates |
WO2006011966A1 (en) | 2004-06-30 | 2006-02-02 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active botulinum toxin type e |
US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
US7811584B2 (en) | 2004-06-30 | 2010-10-12 | Allergan, Inc. | Multivalent clostridial toxins |
EP1773874B1 (en) | 2004-08-04 | 2012-10-24 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active botulinum toxin type a |
US7892565B2 (en) | 2004-09-01 | 2011-02-22 | Allergan, Inc. | Degradable clostridial toxins |
US20060099710A1 (en) * | 2004-11-10 | 2006-05-11 | Donnelly Mark I | Vector for improved in vivo production of proteins |
GB0426394D0 (en) | 2004-12-01 | 2005-01-05 | Health Prot Agency | Fusion proteins |
US7659092B2 (en) | 2004-12-01 | 2010-02-09 | Syntaxin, Ltd. | Fusion proteins |
DE102005002978B4 (de) * | 2005-01-21 | 2013-04-25 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Rekombinante Expression von Proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen Form |
ATE514709T1 (de) * | 2005-03-15 | 2011-07-15 | Allergan Inc | Modifizierte clostridientoxine mit erhöhter targeting-kapazität für endogene clostridientoxin-rezeptorsysteme |
EP1996178A2 (en) | 2006-03-17 | 2008-12-03 | Andover Healthcare, Inc. | Organotellurium and selenium-based antimicrobial antimicrobial formulations and articles |
CA2657521A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells |
EP2038298A2 (en) | 2006-07-11 | 2009-03-25 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells |
WO2008062010A2 (en) * | 2006-11-22 | 2008-05-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making activated carboxypeptidases |
US8486422B2 (en) * | 2007-07-26 | 2013-07-16 | Allergan, Inc. | Methods of activating clostridial toxins |
WO2010040134A2 (en) * | 2008-10-04 | 2010-04-08 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Independently inducible system of gene expression |
SG182691A1 (en) * | 2010-01-25 | 2012-08-30 | Allergan Inc | Methods of intracellular conversion of single-chain proteins into their di-chain form |
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
US20040018589A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-01-29 | Jun Zhong | Method for producing biologically active botulinum neurotoxins through recombinant DNA technique |
WO2008028535A1 (de) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Universitätsklinikum Freiburg | Split-core-partikel für die präsentation von fremdmolekülen, insbesondere für impfstoffartwendungen und verfahren zu deren herstellung |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6014042190; PLoS ONE vol.4, no.10, 2009, e7474 * |
JPN6014042191; Gene Targeting Protocols , 2002, p.127-156 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018502580A (ja) * | 2015-01-09 | 2018-02-01 | イプセン・バイオイノベーション・リミテッドIpsen Bioinnovation Limited | 陽イオン性神経毒 |
JP2022502070A (ja) * | 2018-10-10 | 2022-01-11 | 上饒市康可得生物科技有限公司Shangrao Concord Pharmaceutical Co., Ltd. | プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント |
JP7386552B2 (ja) | 2018-10-10 | 2023-11-27 | 上饒市康可得生物科技有限公司 | プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント |
JP2019206582A (ja) * | 2019-08-09 | 2019-12-05 | イプセン バイオイノベーション リミテッド | 陽イオン性神経毒 |
JP2021104047A (ja) * | 2019-08-09 | 2021-07-26 | イプセン バイオイノベーション リミテッド | 陽イオン性神経毒 |
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