CN102822196B - 将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法 - Google Patents
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Abstract
本说明书公开了包含含有双链环区域(所述双链环区域包含外源蛋白酶裂解位点)和可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的单链蛋白质的表达构建体、包含这样的表达构建体的细胞组合物以及将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法。
Description
本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年1月25日提交的美国临时专利申请系列第61/286,963号的优先权,所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
梭菌毒素例如肉毒神经毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)抑制神经元传递(neuronal transmission)的能力正被开发利用于各种治疗性和美容性应用,参见,例如,William J.Lipham,COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN(Slack,Inc.,2004)。作为药物组合物商购可得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂,例如(Allergan,Inc.,Irvine,CA)、(BeaufourIpsen,Porton Down,England)、)Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,South Korea)、BTX-A(Lanzhou Institute BiologicalProducts,China)和Merz Pharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany);和BoNT/B 制剂,例如MYOBLOCTM/NEUROBLOCTM(Elan Pharmaceuticals,San Francisco,CA)。例如,目前在一个或多个国家被批准用于下列适应征:失弛缓症,成人痉挛状态(adult spasticity)、肛裂、背痛、眼睑痉挛、夜磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间纹或面部动力性皱纹(hyperkinetic facial line)、头痛、半面痉挛、膀胱机能亢进(hyperactivityof bladder)、多汗症、儿童脑性瘫痪(juvenile cerebral palsy)、多发性硬化、肌阵挛病症(myoclonic disorder)、鼻唇纹(nasal labial line)、痉挛性发音困难(spasmodic dysphonia)、斜视和第七神经障碍(VII nervedisorder)。
梭菌毒素的治疗性功用,除了它们目前松弛肌肉的应用外,已被扩展至治疗基于感觉神经的疾病例如各种慢性疼痛、神经源性炎症和泌尿生殖系统病症以及基于非神经元的病症例如胰腺炎。目前正被开发以扩展基于梭菌毒素的治疗的一个方法包括修饰梭菌毒素以便经修饰的毒素具有针对非-梭菌毒素靶细胞改变细胞靶向的能力。该重新靶向的(re-targeted)能力通过用显示对存在于非-梭菌毒素靶细胞中的非-梭菌毒素受体的选择性结合活性的靶向结构域替代梭菌毒素的天然存在的靶向结构域来实现。对靶向结构域的此类修饰导致能够选择性结合存在于非-梭菌毒素靶细胞上的非-梭菌毒素受体(靶受体)(重新靶向的)的经修饰的毒素。具有针对非-梭菌毒素靶细胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素可结合非-梭菌毒素靶细胞上的受体,转位至细胞质中,以及对非-梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物施加其蛋白水解作用。
具有针对非-梭菌毒素靶细胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素的非限定性实例描述于例如Keith A.Foster等人,Clostridial ToxinDerivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions,美国专利5,989,545;Clifford C.Shone等人,Recombinant Toxin Fragments,美国专利6,461,617;Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives andMethods For Treating Pain,美国专利6,500,436;Conrad P.Quinn等人,Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion,美国专利6,632,440;Lance E.Steward等人,Methods And CompositionsFor The Treatment Of Pancreatitis,美国专利6,843,998;J.Oliver Dolly等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,419,676;LanceE.Steward等人,Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methodsof Their Use,美国专利7,514,088;Keith A.Foster等人,Inhibition ofSecretion from Non-neural Cells,美国专利公布2003/0180289;和KeithA.Foster等人,Re-targeted Toxin Conjugates,国际专利公布WO2005/023309。重新靶向的与梭菌毒素相关的治疗作用的能力已极大地扩展能够使用梭菌毒素疗法的医学应用的数目。作为非限定性实例,重新靶向感觉神经元的经修饰的梭菌毒素在治疗各种类型的慢性疼痛例如痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛和炎症疼痛中是有用的,参见,例如,Foster,同上,(1999);和Donovan,同上,(2002);以及Stephan Donovan,Method For Treating Neurogenic InflammationPain with Botulinum Toxin and Substance P Components,美国专利7,022,329。作为另一个非限定性实例,重新靶向的胰腺细胞的经修饰的梭菌毒素在治疗胰腺炎中是有用的,参见,例如,Steward,同上,(2005)。
梭菌毒素,无论是天然存在的还是经修饰的,都被加工成双链形式以获得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽,所述单链多肽随后在二硫环内被天然存在的蛋白酶蛋白水解而裂解(图1)。该裂解在形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的不连续双链环区域中发生。该翻译后加工产生包含约50kDa的轻链(LC)(其包含酶促结构域)和约100kDa的重链(HC)(其包含转位和细胞结合结构域)的双链分子,LC和HC通过单个二硫键和非共价相互作用保持在一起(图1)。重组产生的梭菌毒素通常用外源蛋白酶裂解位点替代天然存在的双链环蛋白酶裂解位点(图2)。参见,例如,Dolly,J.O.等人,Activatable Clostridial Toxin,美国专利7,419,676,其通过引用将其并入本文。虽然重新靶向的梭菌毒素由于靶向部分的大小而在其总体分子量上发生变化,但活化过程及其对外源裂解位点的依赖性与重组产生的梭菌毒素的活化过程及其对外源裂解位点的依赖性基本上相同。参见,例如,Steward,L.E.等人,Activatable ClostridialToxin,美国专利公布2009/0005313;Steward,L.E.等人,ModifiedClostridial Toxin with Enhanced Translocation Capabilities and AlteredTargeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells,美国专利申请11/776,075;Steward,L.E.等人,Modified Clostridial Toxin withEnhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity forClostridial Toxin Target Cells,美国专利公布2008/0241881,将所述每个专利通过引用并入本文。
迄今为止,重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的单链形式至其双链形式的转化需要体外活化过程。首先,用于重组产生此类毒素的细菌细胞缺乏存在于产生天然毒素的梭菌属(Clostridial)菌株中的天然存在的蛋白酶。其次,出于在处理活化毒素中产生的安全顾虑,不存在对重组产生活化毒素的细菌细胞的大量需要。参见,例如,Dolly,U.S.7,419,676,同上,(2008)。然而,如果这些顾虑可被克服,则重组产生的活化毒素的产生可使重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的制备过程简化。例如,目前重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的制备包括下列纯化步骤:1)固定金属亲和层析,2)缓冲液交换透析,3)蛋白酶裂解反应,4)离子交换层析和5)PEG的添加以及快速冷冻以在-80℃下贮存。可细胞内蛋白水解裂解重组梭菌毒素同时其仍然表达毒素的细菌细胞的使用将纯化步骤的数目减少至下列步骤:1)固定金属亲和层析,2)缓冲液交换透析,3)离子交换层析,和4)PEG的添加以及快速冷冻以在-80℃下贮存。
本说明书公开了将包含双链环区域的单链蛋白质转化成其双链形式的方法,所述方法不依赖于用于将毒素的单链形式转化成其双链形式的体外加工。这可通过使用表达蛋白质和将其转化成活性双链所必需的蛋白酶的细胞来实现。
因此,本说明书的方面提供了双重表达构建体,所述构建体包括编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框和编码可蛋白水解裂解位于双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的开放阅读框。在其它方面,包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。多核苷酸以及它们编码的包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素描述于例如Dolly,J.O.等人,Activatable Clostridial Toxin,美国专利7,132,259;Dolly,J.O.等人,Activatable Clostridial Toxin,美国专利7,419,676(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。多核苷酸以及它们编码的包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质描述于例如Steward,L.E.等人,Multivalent Clostridial Toxin,美国专利公布2009/0048431;Steward,L.E.等人,Activatable Clostridal Toxin,美国专利公布2009/0069238;Steward,L.E.等人,Modified Clostridial Toxin withEnhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity ForNon-Clostridial Toxin Target Cells,美国专利申请11/776,075;Steward,L.E.等人,Modified Clostridial Toxin with Enhanced TranslocationCapabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin TargetCells,美国专利公布2008/0241881;Foster,K.A.等人,Fusion Proteins,美国专利公布2009/0035822;Foster,K.A.等人,Non-Cytotoxic ProteinConjugates,美国专利公布2009/0162341;Steward,L.E.等人,Activatable Clostridial Toxin,美国专利公布2008/0032931;Foster,K.A.等人,Non-Cytotoxic Protein Conjugates,美国专利公布2008/0187960;Steward,L.E.等人,Degradable Clostridial Toxin,美国专利公布2008/0213830;Steward,L.E.等人,Modified ClostridialToxin With Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingActivity For Clostridial Toxin Target Cells,美国专利公布2008/0241881;Dolly,J.O.等人,Activatable Clostridial Toxin,美国专利7,419,676;和同伴专利申请Ghanshani等人,Modified ClostridialToxin Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-BindingDomain,Attorney Docket No.18468PROV(BOT)(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。
本说明书的其它方面提供了包含双重表达构建体的细胞,所述构建体包括编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框和编码可蛋白水解裂解位于双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的开放阅读框。在其它方面,包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在第一温度下生长一定的时间段以达到最大细胞密度,所述双重表达构建体包含;i)编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框;和ii)编码蛋白酶的开放阅读框;其中所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点;b)将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到从编码单链蛋白质的开放阅读框进行蛋白质表达的最大诱导,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约2至约3.5小时,所述双重表达构建体包含;i)编码单链梭菌毒素的开放阅读框,所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;和ii)编码蛋白酶的开放阅读框,其中所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点;b)将细胞在22℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链梭菌毒素和蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链梭菌毒素,从而将单链梭菌毒素转化成其双链形式。
本发说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约2至约8个小时,所述双重表达构建体包含;i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域;和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述双重表达构建体包含;i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域;和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;b)将细胞在约20至约24℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述双重表达构建体包含;i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述双重表达构建体包含;i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;b)将细胞在约20至约24℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了表达构建体,所述表达构建体包含编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在其它方面,包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。
本说明书的其它方面提供了表达构建体,所述表达构建体包含编码蛋白酶的开放阅读框,所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点。
本说明书的其它方面提供了细胞,所述细胞包含含有编码单链蛋白质(所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域)的开放阅读框的表达构建体和含有编码蛋白酶(所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点)的开放阅读框的另一个表达构建体。在其它方面,包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)生长细胞,所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体,所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;和ii)含有编码蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体;所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点;b)将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到从编码单链蛋白质的开放阅读框进行蛋白质表达的最大诱导,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将细胞在37℃下生长约2至约3.5小时,所述细胞包含i)含有编码单链梭菌毒素的开放阅读框的表达构建体,所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域以及包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和ii)含有编码蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体,所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点;b)将细胞在22℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链梭菌毒素和蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链梭菌毒素,从而将单链梭菌毒素转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域以及整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域,和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体;b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域以及整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域,和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体;b)将细胞在约20至约24℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域,和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体;b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:a)将细胞在37℃下生长约2至约8小时,所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域,和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体;b)将细胞在约20至约24℃下生长约16至约18小时,其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达;并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
附图简述
图1显示天然存在的梭菌毒素的结构域组织。单链形式描述了包含酶促结构域、转位结构域和HC结合结构域的氨基至羧基的线性组织。位于转位与酶促结构域之间的双链环区域通过双SS托架(doubleSS bracket)来描述。该区域包含内源双链环蛋白酶裂解位点,所述裂解位点在用天然存在的蛋白酶例如内源梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解后,将毒素的单链形式转化成双链形式。
图2显示中枢和周围神经元中神经递质的释放和梭菌毒素中毒的目前范例的示意图。图2A显示中枢和周围神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可被描述为包括两个步骤:1)囊泡停靠(vesicle docking),其中包含神经递质分子的囊泡的囊泡结合的SNARE蛋白与位于质膜的膜结合SNARE蛋白结合;和2)神经递质释放,其中囊泡与质膜融合并且神经递质分子被胞吐。图2B显示中枢和周围神经元的破伤风和肉毒毒素活性的中毒机制的示意图。该中毒过程可被描述为包括4个步骤:1)受体结合,其中梭菌毒素结合梭菌受体系统并且起始中毒过程;2)复合物内化,其中在毒素结合后,包含毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞入细胞;3)轻链转位,其中据认为发生多个事件,包括例如囊泡的内部pH的改变,包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔的形成,梭菌毒素轻链与重链的分离,以及活性轻链的释放,和4)酶促靶修饰,其中梭菌毒素的活性轻链蛋白水解裂解其靶SNARE底物例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白,从而阻止囊泡的停靠和神经递质的释放。
由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)和酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的梭菌毒素被最广泛地用于人和其它动物的治疗性治疗和美容治疗。肉毒梭菌的菌株产生7个在抗原性上不同的类型的肉毒毒素(BoNT),其已通过调查人(BoNT/A,/B,/E和/F)、动物(BoNT/C1和/D)的肉毒中毒暴发被鉴定或从土壤分离(BoNT/G)。BoNT彼此具有约35%的氨基酸同一性并且共有相同的功能结构域组织和总体结构构造。本领域技术人员承认在每一种类型的梭菌毒素内,可存在在它们的氨基酸序列上以及也在编码此类蛋白质的核酸上少许不同的亚型。例如,目前存在4个BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4,当与另一个BoNT/A亚型相比较时特定亚型显示约89%的氨基酸同一性。虽然所有7个BoNT血清型具有相似的结构和药理性质,但每一个血清型也显示异质的细菌学特征。相反地,破伤风毒素(TeNT)由均一组的破伤风梭菌产生。两个其它梭菌属种类巴氏梭菌和酪酸梭菌产生毒素BaNT和BuNT,所述毒素分别与BoNT/F和BoNT/E相似。
每一个成熟双链分子包含3个功能上不同的结构域:1)位于LC中的酶促结构域,其包括包含特异性靶向神经递质释放装置(neurotransmitter release apparatus)的核心组分的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区域;2)HC的氨基末端半部分内包含的转位结构域(HN),其帮助LC从细胞内囊泡至靶细胞的细胞质中的释放;和3)HC的羧基末端半部分内发现的结合结构域(HC),其决定毒素对位于靶细胞的表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性。HC结构域包含两个具有大致相同尺寸的不同结构特征,所述结构特征显示功能并且被命名为HCN和HCC亚结构域(subdomain)。表1提供了在示例性梭菌毒素中发现的每一个结构域的大致边界区域。
表1.梭菌毒素的参照序列和区域
这3个功能结构域的结合、转位和酶促活性全都是毒性所必需的。虽然该方法的所有细节尚未确知,但无论血清型或亚型如何,梭菌毒素籍以进入神经元并且抑制神经递质释放的总体细胞中毒机制是相似的。虽然申请者不希望受到下列描述的限制,但中毒机制可被描述为包括至少4个步骤:1)受体结合,2)复合物内化,3)轻链转位,和4)酶促靶修饰(图3)。当梭菌毒素的HC结构域结合位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体系统时,该过程被起始。受体复合物的结合特异性据认为部分地通过似乎明显地包含每种梭菌毒素受体复合物的神经节苷脂和蛋白质受体的特定组合来实现。一旦结合,毒素/受体复合物通过胞吞作用被内化并且内化的囊泡被分选至特定的细胞内途径。转位步骤似乎通过囊泡区室的酸化触发。该过程似乎起始两个重要的pH-依赖性结构重排,所述结构重排增加疏水性和促进毒素的双链形式的形成。一旦被激活,毒素的轻链内肽酶从细胞内囊泡释放至细胞溶胶,在细胞溶胶中其似乎特异性靶向神经递质释放装置的3个已知核心组分之一。此类核心蛋白、囊泡关联膜蛋白(vesicle-associated membrane protein)(VAMP)/突触囊泡蛋白、25 kDa的突触小体相关蛋白(synaptosomal-associated protein)(SNAP-25)和突触融合蛋白是在可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachmentprotein-receptor)(SNARE)家族的神经末梢和组成成员上突触囊泡停靠和融合所必需的。BoNT/A和BoNT/E裂解羧基末端区域中的SNAP-25,从而分别释放9或26个氨基酸的区段,BoNT/C1还在羧基端附近裂解SNAP-25。肉毒菌素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分,将VAMP的氨基末端部分释放至细胞溶胶中。BoNT/C1在细胞溶胶膜表面附近的单个位点上裂解突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解负责由梭菌毒素引起的神经递质释放的体内阻断。梭菌毒素的SNARE蛋白靶对于多种非神经元类型的胞吐是共同的;在这些细胞中,如在神经元中,轻链肽酶活性抑制胞吐,参见,例如,Yann Humeau等人,How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block NeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000);Kathryn Turton等人,Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure,Function and TherapeuticUtility,27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002);Giovanna Lalli等人,The Journey of Tetanus and Tetanus Neurotoxins in Neurons,11(9)Trends Microbiol.431-437,(2003)。
在本发明的方面,经修饰的梭菌毒素部分地包含单链经修饰的梭菌毒素和双链经修饰的梭菌毒素。如上文中所述,梭菌毒素,无论是天然存在的还是非天然存在的,最初都合成为单链多肽。该单链形式随后在位于不连续双链环区域(形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的)内的蛋白酶裂解位点上被蛋白酶裂解。该翻译后加工产生包含轻链(LC)和重链的双链分子。如本文中所用的,术语“双链环区域”是指通过位于LC结构域与HC结构域之间的二硫桥形成的天然存在的或非天然存在的梭菌毒素的环区域。如本文中所用,术语“单链修饰的梭菌毒素”是指本说明书中公开的任何经修饰的梭菌毒素,其以其单链形式存在,即,所述毒素在位于双链环区域内的蛋白酶裂解位点上未被其关联蛋白酶裂解。如本文中所用,术语“双链经修饰的梭菌毒素”是指本说明书中公开的任何经修饰的梭菌毒素,其以其双链形式形式存在,即,毒素已在位于双链环区域内的蛋白酶裂解位点上被其关联蛋白酶裂解。
本发明的方面部分地提供了多核苷酸分子。如本文中所用,术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义并且意指具有任何长度的核苷酸例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的多聚体形式。有用的多核苷酸分子包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在和非天然存在的RNA分子。天然存在的和非天然存在的DNA分子的非限定性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体,例如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限定性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
对于制备编码本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子可以是必需的已确立的分子生物学技术包括但不限于牵涉聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序的方法,基于重组的技术是常规的并且完全在本领域技术人员的能力范围内以及来自本文中的教导。制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的具体方案的非限定性实例描述于例如MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,同上,(2001);和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(FrederickM.Ausubel等人编,John Wiley&Sons,2004)。此外,用于制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的多种商购可得的制品是广泛可获得的。此类方案是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法并且来自本文中的教导。
本说明书中公开的方法部分地包括开放阅读框。如本文中所用,术语“开放阅读框”与“ORF”同义并且意指编码蛋白质或蛋白质的部分的任何多核苷酸。开放阅读框通常始于起始密码子(以标准密码子表示为例如AUG(对于RNA分子)和ATG(在DNA分子中))并且以密码子-三联体阅读直至框架以终止密码子(以标准密码子表示为例如UAA、UGA或UAG(对于RNA分子)和TAA、TGA或TAG(在DNA分子中))终止。如本文中所用,术语“密码子”意指在蛋白质合成过程中指定特定氨基酸的多核苷酸分子中的3个核苷酸的序列;也称为三联体或密码子-三联体。
本说明书中公开的方法部分地包括表达构建体。表达构建体包含多核苷酸分子,所述多核苷酸包括本说明书中公开的可操作地连接于用于在细胞或无细胞提取物中表达所述多核苷酸分子的表达载体的开放阅读框。多种表达载体可用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子,包括但不限于病毒表达载体;原核表达载体;真核表达载体例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体;以及无细胞(体外)表达载体。还应理解,用于实施此类方法的方面的表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达多核苷酸分子的那些表达载体。表达载体以及用于从此类表达载体制备和使用表达构建体的已确立的试剂和条件的非限定性实例可容易地从提供商获得,包括但不限于BDBiosciences-Clontech,Palo Alto,CA;BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA;Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA;EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI;QIAGEN,Inc.,Valencia,CA;和Stratagene,La Jolla,CA。适当的表达载体的选择、制备和使用是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法以及来自本文中的教导。
本说明书中公开的表达构建体可包含编码蛋白质的开放阅读框,所述蛋白质包括含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域,其中外源蛋白酶裂解位点的裂解将单链蛋白质转化为其双链形式。在本实施方案的方面,病毒表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子;原核表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子;酵母表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子;昆虫表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子;以及哺乳动物表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子。在本实施方案的其它方面,适用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达构建体可使用无细胞提取物来表达。在本实施方案的方面,无细胞表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子。
在一个实施方案中,本说明中公开的表达构建体包含编码梭菌毒素的开放阅读框,所述梭菌毒素包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的方面,本说明书中公开的表达构建体可包含编码梭菌毒素的开放阅读框,所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域以及包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的方面,单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基顺序:1)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素结合结构域;2)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域;3)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域;4)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域,包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域;5)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素结合结构域;或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)BoNT/A毒素酶促结构域、BoNT/A转位结构域、BoNT/A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)BoNT/B酶促结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/C1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)BoNT/D酶促结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/D结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)BoNT/E酶促结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/E结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)BoNT/F酶促结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/F结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)BoNT/G酶促结构域、BoNT/G转位结构域、BoNT/G结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;8)TeNT酶促结构域、TeNT转位结构域、TeNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;9)BaNT酶促结构域、BaNT转位结构域、BaNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;10)BuNT酶促结构域、BuNT转位结构域、BuNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)BoNT/A毒素酶促结构域、BoNT/A转位结构域、BoNT/A结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)BoNT/B酶促结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/B结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/C1结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)BoNT/D酶促结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/D结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)BoNT/E酶促结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/E结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)BoNT/F酶促结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/F结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)BoNT/G酶促结构域、BoNT/G转位结构域、BoNT/G结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;8)TeNT酶促结构域、TeNT转位结构域、TeNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;9)BaNT酶促结构域、BaNT转位结构域、BaNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;10)BuNT酶促结构域、BuNT转位结构域、BuNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域。
此类包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的实例描述于例如J.Oliver Dolly等人,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利7,132,529;J.Oliver Dolly等人,ActivatableRecombinant Neurotoxins,美国专利7,419,676;Lance Steward等人,Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins,美国专利6,903,187;Lance Steward等人,Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins,美国专利7,393,925;Wei-Jen Lin等人,Neurotoxins with EnhancedTarget Specificity,美国专利7,273,722;Lance Steward等人,ModifiedBotulinum Neurotoxins,美国专利7,491,799;Lance E.Steward等人,Optimized Expression of Active Botulinum Toxin TypeE,美国专利公布2008/0138893;Ester Fernandez-Salas等人,Optimized Expression ofActive Botulinum Toxin Type A,美国专利公布2008/0057575中;将所述每个专利通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中,本说明书中公开的表达构建体可包含编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框。在本实施方案的方面,单链蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基顺序:1)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和非-梭菌毒素结合结构域;2)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域;3)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域;4)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域;5)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和非-梭菌毒素结合结构域;或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、阿片样物质结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、脑啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、牛肾上腺髓质-22(BAM22)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、内吗啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、内啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、强啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、痛敏肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血衍吗啡素(hemorphin)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、强啡肽B(rimorphin)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、黑皮质素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促黑素细胞激素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促肾上腺皮质激素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促脂解素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框架,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽信息相关肽(GMAP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、鸟尿素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白C结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、速激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、P物质结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽K结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽γ结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经激肽A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血红素激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、endokinin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽Y相关肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽Y(NPY)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肽YY(PYY)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰腺肽(PP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰腺二十肽(PIP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经激素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促皮质素-释放激素(CCRH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甲状旁腺素(PTH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促甲状腺激素释放激素(TRH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长抑素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、细胞因子肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、睫状神经营养因子(CNTF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血型糖蛋白-A(GPA)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、白血病抑制因子(LIF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、白细胞介素(IL)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、抑瘤素M结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、心脏营养素-1(CT-1)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、心脏营养素-样细胞因子(CLC)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经白细胞素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、desArg9缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、desArg10缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、成纤维细胞生长因子(FGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-9结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-17结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-18结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经生长因子(NGF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、脑源性神经营养因子(BDNF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子-3(NT-3)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子-4/5(NT-4/5)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、头激活肽(HA)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肿瘤坏死因子(TNF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胶质细胞源性生长因子(GDNF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、neurturin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、persephrin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、artemin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、转化生长因子β(TGFβ)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域,梭菌毒素转位结构域、骨形态发生蛋白β(BMP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP5结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP6结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP7结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMP10结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长分化因子β(GDF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF5结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF6结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF7结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF10结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;9)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF11结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或10)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF15结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白C结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白E结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、抑制素A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血管内皮生长因子(VEGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰岛素生长因子(IGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、IGF-1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、IGF-2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、表皮生长因子(EGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、高血糖素样激素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、分泌素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、高血糖素样肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长激素释放激素(GHRH)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长激素释放激素(GHRH)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血管活性肠肽(VIP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、VIP1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、VIP2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肠抑胃肽(GIP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、降钙素相关肽脑肠肽(Calcitonin-related peptidesvisceral gut peptide)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胃泌素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胃泌素-释放肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胆囊收缩素(CCK)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、蛋白酶激活受体(PAR)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR1结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。
此类包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的实例描述于例如J.Oliver Dolly等人,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利7,132,529;J.Oliver Dolly等人,ActivatableRecombinant Neurotoxins,美国专利7,419,676;Lance E.Steward等人,Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,美国专利7,514,088;Keith A.Foster等人,Re-targeted Toxin Conjugates,International Patent Publication WO 2005/023309;Lance E.Steward等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2008/0032930;Lance E.Steward等人,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利公布2008/0032931;Lance E.Steward等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2008/0161226;Lance E.Steward等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2008/0221012;Lance E.Steward等人,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0004224;Lance E.Steward等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2009/0005313;Lance E.Steward等人,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2009/0018081;Lance E.Steward等人,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0069238;和Lance E.Steward等人,Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,美国专利公布2009/0048431(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。
在另一个实施方案中,表达构建体包含开编码蛋白质的放阅读框架,所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域。在本实施方案的方面,单链蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基顺序:1)整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域;2)整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素转位结构域;3)梭菌毒素酶促结构域、整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素转位结构域;4)梭菌毒素转位结构域、整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素酶促结构域;5)梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域;和6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域。
在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域。在本实施方案的其它方面,表达构建体包含开放阅读框,其编码1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-脑啡肽结合结构域;2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-牛肾上腺髓质-22(BAM22)结合结构域;3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-内吗啡肽结合结构域;4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-内啡肽结合结构域;5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域;6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-痛敏肽结合结构域;7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-血衍吗啡素结合结构域;或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽B结合结构域。
此类包含整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的实例描述于例如同伴专利申请Sanjiv Ghanshani等人,Modified ClostridialToxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-BindingDomain,将其通过引用整体并入本文。
本说明书中公开的表达构建体可包含编码蛋白酶的开放阅读框。在本实施方案的方面,病毒表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子;原核表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子;酵母表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子;昆虫表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子;以及哺乳动物表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子。在本实施方案的其它方面,适用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达构建体可使用无细胞提取物来表达。在本实施方案的方面,无细胞提取物表达载体可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子。
在本实施方案的方面,包含开放阅读框的表达构建体编码肠激酶、人鼻病毒3C蛋白酶、人肠病毒3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑驳病毒(TVMV)蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或半胱天冬酶3蛋白酶。肠激酶蛋白酶和编码它们的多核苷酸分子的实例描述于例如Edward R.LaVallie,Cloning of Enterokinase and Method ofUse,美国专利5,665,566;Edward R.LaVallie,Cloning of Enterokinaseand Method of Use,美国专利6,746,859(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。枯草杆菌蛋白酶和编码它们的多核苷酸的实例描述于例如Donn N.Rubingh等人,Subtillisin Protease Variants havingAmino Acid Deletions and Substitutions in Defined Epitope Regions,美国专利6,586,224(将其通过引用整体并入本文)中。
在本实施方案的另一个方面,肠激酶为SEQ ID NO:11。在本实施方案的另一个方面,肠激酶包含SEQ ID NO:11的氨基酸239-1035。在本实施方案的另一个方面,肠激酶是天然存在的肠激酶变体例如肠激酶同种型。在本实施方案的另一个方面,肠激酶是非天然存在的肠激酶变体例如保守肠激酶变体、非-保守肠激酶变体、肠激酶嵌合体、活性肠激酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,肠激酶为美国专利5,665,566或美国专利6,746,859中公开的肠激酶。在本实施方案的另一个方面,肠激酶、天然存在的肠激酶变体或非天然存在的肠激酶变体获自哺乳动物的物种例如人、牛或啮齿类动物。
在本实施方案的其它方面,肠激酶包括多肽,所述多肽与SEQ IDNO:11具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:11具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,肠激酶包括多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:11具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,肠激酶包括多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:11具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或对于SEQ ID NO:11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,人鼻病毒3C蛋白酶是SEQ ID NO:12。在本实施方案的另一个方面,人鼻病毒3C蛋白酶是天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体例如人鼻病毒3C蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,人鼻病毒3C蛋白酶为非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体例如保守人鼻病毒3C蛋白酶变体、非-保守人鼻病毒3C蛋白酶变体、人鼻病毒3C蛋白酶嵌合体、活性人鼻病毒3C蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,人鼻病毒3C蛋白酶、天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体或非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体获自鼻病毒属的物种。
在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽与SEQ ID NO:12具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:12具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:12具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或至多相对于SEQ ID NO:12具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,人肠病毒3C蛋白酶为SEQ ID NO:13。在本实施方案的另一个方面,人肠病毒3C蛋白酶为天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体例如人肠病毒3C蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,人肠病毒3C蛋白酶为非天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体例如保守人肠病毒3C蛋白酶变体、非-保守人肠病毒3C蛋白酶变体、人肠病毒3C蛋白酶嵌合体、活性人肠病毒3C蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,人肠病毒3C蛋白酶、天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体或非天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体获自肠道病毒属的物种。
在本实施方案的其它方面,人肠病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽与SEQ ID NO:13具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:13具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,人肠病毒3C蛋白酶包括多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,人肠病毒3C蛋白酶包括多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶为SEQ ID NO:14。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶包含SEQ IS NO:14的氨基酸2038-2270。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶为天然存在的TEV蛋白酶变体例如TEV蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶为非天然存在的TEV蛋白酶变体例如保守TEV蛋白酶变体、非-保守TEV蛋白酶变体,TEV蛋白酶嵌合体、活性TEV蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶、天然存在的TEV蛋白酶变体或非天然存在的TEV蛋白酶变体获自马铃薯Y病毒属的物种。
在本实施方案的其它方面,TEV蛋白酶包含多肽,所述多肽与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,TEV蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置;或相对于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,TEV蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,TVMV蛋白酶为SEQ ID NO:24。在本实施方案的另一个方面,TEV蛋白酶包含SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236。在本实施方案的另一个方面,TVMV蛋白酶为天然存在的TVMV蛋白酶变体例如TVMV蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,TVMV蛋白酶为非天然存在的TVMV蛋白酶变体例如保守TVMV蛋白酶变体、非-保守TVMV蛋白酶变体、TVMV蛋白酶嵌合体、活性TVMV蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,TVMV蛋白酶、天然存在的TVMV蛋白酶变体或非天然存在的TVMV蛋白酶变体获自马铃薯Y病毒属的物种。
在本实施方案的其它方面,TVMV蛋白酶包括多肽,所述多肽与SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,TVMV蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,TVMV蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:24或SEQ IS NO:24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,枯草杆菌蛋白酶为SEQ ID NO:25。在本实施方案的另一个方面,枯草杆菌蛋白酶包含SEQ IS NO:25的氨基酸107-365。在本实施方案的另一个方面,枯草杆菌蛋白酶为天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体例如枯草杆菌蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,枯草杆菌蛋白酶为非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体例如保守枯草杆菌蛋白酶变体、非-保守枯草杆菌蛋白酶变体、枯草杆菌蛋白酶嵌合体、活性枯草杆菌蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,枯草杆菌蛋白酶、天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体获自芽孢杆菌属的物种。
在本实施方案的其它方面,枯草杆菌蛋白酶包含多肽,所述多肽与SEQ ID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,枯草杆菌蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,枯草杆菌蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQID NO:25或SEQ IS NO:25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的另一个方面,半胱天冬酶3蛋白酶为SEQ ID NO:26。在本实施方案的另一个方面,半胱天冬酶3蛋白酶为天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体例如半胱天冬酶3蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面,半胱天冬酶3蛋白酶为非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体例如保守半胱天冬酶3蛋白酶变体、非-保守半胱天冬酶3蛋白酶变体、半胱天冬酶3蛋白酶嵌合体、活性半胱天冬酶3蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面,半胱天冬酶3蛋白酶、天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体或非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体获自哺乳动物的物种例如人、牛或啮齿类动物。
在本实施方案的其它方面,半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽,所述多肽与SEQ ID NO:26具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性;或与SEQ ID NO:26具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面,半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面,半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQ ID NO:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换;或相对于SEQ ID NO:26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。
本说明书中公开的方法部分地包括双重表达构建体。双重表达构建体包含两个多核苷酸分子,每一个多核苷酸分子包括可操作地连接于用于在细胞或无细胞提取物中表达两个多核苷酸分子的表达载体的本说明书中公开的开放阅读框。多种双重表达载体可用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子,包括但不限于病毒双重表达载体;原核双重表达载体;真核双重表达载体例如酵母双重表达载体、昆虫双重表达载体和哺乳动物双重表达载体;以及无细胞提取物双重表达载体。还应理解,用于实施这些方法的方面的双重表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达多核苷酸分子的那些表达载体。双重表达载体以及用于从此类表达载体制备和使用表达构建体的已确立的试剂和条件的非限定性实例可容易地从提供商获得,包括但不限于EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI。适当的双重表达载体的选择、制备和使用是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法以及来自本文中的教导。
本说明书中公开的双重表达构建体可包含编码蛋白质的开放阅读框,所述蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域,和编码蛋白酶的另一个开放阅读框,所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
因此,在一个实施方案中,双重表达构建体包含编码蛋白质的开放阅读框,所述蛋白质包含含有本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域,和编码蛋白酶的另一个开放阅读框,所述蛋白酶可裂解位于本说明书中公开的双链环内的外源蛋白酶裂解位点。
在本实施方案的方面,双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含含有TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域、双链环区域和TEV蛋白酶裂解位点,其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。
在本实施方案的方面,双重表达构建体包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域)的开放阅读框和编码可裂解位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域、双链环区域和TEV蛋白酶裂解位点,其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。
在本实施方案的方面,双重表达构建体包含编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面,双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域,其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。
双重表达构建体中包含的开放阅读框之一的位置可以以相对于另一个开放阅读框的位置的任何顺序存在,只要从两个开放阅读框的转录仍然可发生。当制备双重表达构建体时,来自第一启动子区域的转录起始通常转录两个开放阅读框,然而,来自第二启动子区域的转录起始通常仅转录开放阅读框之一。因此,取决于开放阅读框相对于第一和第二启动子区域的定位,可从开放阅读框之一产生多至2倍的转录物。
因此,在一个实施方案,编码蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码包含包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的方面,编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码包含位于双链环区域中的TEV蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面,编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面,编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。
在另一个实施方案中,编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的方面,编码包含含有TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而,编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面,编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面,编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下,然而编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。
双重表达构建体中包含的开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向可以处于任何方向,只要从两个开放阅读框的转录仍然可发生。在一个实施方案中,开放阅读框之一的5’-3’取向处于与另一个开放阅读框的5’-3’取向相同的方向。在另一个实施方案中,开放阅读框之一的5’-3’取向处于与另一个开放阅读框的5’-3’取向相反的方向。在本实施方案的方面,开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向是收敛的(convergent)。在本实施方案的另一个方面,开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向是发散的(divergent)。
本说明书中公开的方法部分地包括包含包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质。如本文中所用,术语“双链环区域”意指包含用于将梭菌毒素的单链形式转化成双链形式的蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的氨基酸序列。梭菌毒素双链环区域的非限定性实例包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸430-454的BoNT/A的双链环区域;包含SEQ ID NO:2的氨基酸437-446的BoNT/B的双链环区域;包含SEQID NO:3的氨基酸437-453的BoNT/C1的双链环区域;包含SEQ IDNO:4的氨基酸437-450的BoNT/D的双链环区域;包含SEQ ID NO:5的氨基酸412-426的BoNT/E的双链环区域;包含SEQ ID NO:6的氨基酸429-445的BoNT/F的双链环区域;包含SEQ ID NO:7的氨基酸436-450的BoNT/G的双链环区域;包含SEQ ID NO:8的氨基酸439-467的TeNT的双链环区域;包含SEQ ID NO:9的氨基酸421-435的BaNT的双链环区域;和包含SEQ ID NO:10的氨基酸412-426的BuNT的双链环区域(表2)。
表2.梭菌毒素的双链环区域
如上文中提及的,梭菌毒素被翻译为约150kDa的单链多肽,其随后在二硫环内被天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解。该翻译后加工产生包含通过单个二硫键和非共价相互作用保持在一起的约50kDa的轻链(LC)和约100kDa的重链(HC)的双链分子。虽然蛋白酶的本体目前还不清楚,但已确定了许多梭菌毒素的双链环蛋白酶裂解位点。在BoNT中,在K448-A449上的裂解将BoNT/A单链多肽形式转化成双链形式;在K441-A442上的裂解将BoNT/B单链多肽形式转化成双链形式;在K449-T450上的裂解将BoNT/C1单链多肽形式转化成双链形式;在R445-D446上的裂解将BoNT/D单链多肽形式转化成双链形式;在R422-K423上的裂解将BoNT/E单链多肽形式转化成双链形式;在K439-A440上的裂解将BoNT/F单链多肽形式转化成双链形式;以及在K446-S447上的裂解将BoNT/G单链多肽形式转化成双链形式。TeNT的单链多肽形式在A457-S458上的蛋白水解裂解导致双链形式。BaNT的单链多肽形式在K431-N432上的蛋白水解裂解导致双链形式。BuNT的单链多肽形式在R422-K423上的蛋白水解裂解导致双链形式。这样的双链环蛋白酶裂解位点作为融合蛋白在框内可操作地连接于经修饰的梭菌毒素。然而,还应当指出,双链环内的另外的裂解位点也似乎被裂解,导致将丢失的小的肽片段产生。作为非限定性实例,BoNT/A单链多肽的裂解最终导致双链环内10个氨基酸的片段的丢失。
预期可修饰包含双链环区域的任何分子以包括用于公开的方法的外源蛋白酶裂解位点。可具有经修饰以包括用于公开的方法的外源蛋白酶裂解位点的双链环的分子的实例包括,例如Keith A.Foster等人,Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral SensoryAfferent Functions,美国专利5,989,545;Clifford C.Shone等人,Recombinant Toxin fragments,美国专利6,461,617;Conrad P.Quinn等人,Methods and Compounds for the Treatment of MucusHypersecretion,美国专利6,632,440;Lance E.Steward等人,MethodsAnd Compositions For The Treatment Of Pancreatitis,美国专利6,843,998;Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and MethodsFor Treating Pain,美国专利7,244,437;Stephan Donovan,ClostridialToxin Derivatives and Methods For Treating Pain,美国专利7,413,742;Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods ForTreating Pain,美国专利7,425,338;将所述每个专利通过引用整体并入本文。
双链环区域通过添加外源蛋白酶裂解位点来进行修饰。如本文中所用,术语“外源蛋白酶裂解位点”与“非天然存在的蛋白酶裂解位点”或“非天然蛋白酶裂解位点”同义并且是指非正常存在于天然存在的梭菌毒素的双链环区域中的蛋白酶裂解位点。预期可用于将梭菌毒素的单链多肽形式转化成双链形式的任何和所有外源蛋白酶裂解位点对于实施本发明的方面是有用的。外源蛋白酶裂解位点的非限定性实例包括例如肠激酶蛋白酶裂解位点、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、人肠病毒3C蛋白酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点、烟草脉斑驳病毒(TVMV)蛋白酶裂解位点、枯草杆菌蛋白酶裂解位点或半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点。
预期任何和所有长度的外源蛋白酶裂解位点在本发明的方面可以是有用的,只要外源蛋白酶裂解位点能够被其各自的蛋白酶裂解。因此,在本实施方案的方面,外源蛋白酶裂解位点可以具有例如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60个氨基酸;或至多6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60个氨基酸的长度。
在一个实施方案中,双链环区域包含外源蛋白酶裂解位点。在本实施方案的方面,双链环区域经修饰以包含例如肠激酶蛋白酶裂解位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶裂解位点、烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、人肠病毒3C蛋白酶裂解位点、枯草杆菌蛋白酶裂解位点和半胱天冬酶3裂解位点。在本实施方案的其它方面,外源蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,外源蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
在本实施方案的方面,双链环区域包含具有共有序列E-P5-P4-Y-P2-Q*-G(SEQ ID NO:27)或E-P5-P4-Y-P2-Q*-S(SEQ IDNO:28)的烟草蚀纹病毒蛋白酶裂解位点,其中P2、P4和P5可以是任意氨基酸。在实施方案的其它方面,双链环区域包含含有SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的烟草蚀纹病毒蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,烟草蚀纹病毒蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,烟草蚀纹病毒蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
在本实施方案的另一个方面,双链环区域包含具有共有序列P6-P5-V-R-F-Q*-G(SEQ ID NO:39)或P6-P5-V-R-F-Q*-S(SEQ ID NO:40)的烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点,其中P5和P6可以是任意氨基酸。在实施方案的其它方面,双链环区域包含含有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,烟草脉斑驳病毒蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
在本实施方案的另一个方面,双链环区域包含具有共有序列P5-P4-L-F-Q*-G-P(SEQ ID NO:45)的人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点,其中P4为G、A、V、L、I、M、S或T并且P5可以为任意氨基酸(D或E是优选的)。在实施方案的其它方面,双链环区域包含含有SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环中。在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
在本实施方案的另一个方面,双链环区域包含具有共有序列P6-P5-P4-P3-H*-Y(SEQ ID NO:52)或P6-P5-P4-P3-Y-H*(SEQ ID NO:53)的枯草杆菌蛋白酶裂解位点,其中P3、P4以及P5和P6可以是任意氨基酸。在实施方案的其它方面,双链环区域包含含有SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的枯草杆菌蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,枯草杆菌蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,枯草杆菌蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的双链环内。
在本实施方案的其它方面,双链环区域包含具有共有序列D-P3-P2-D*P1’(SEQ ID NO:57)的半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点,其中P3可以是任意氨基酸(E是优选的),P2可以是任意氨基酸并且P1’可以是任意氨基酸(G或S是优选的)。在实施方案的其它方面,双链环区域包含含有SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63的半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
在本实施方案的另一个方面,双链环区域包含具有共有序列DDDDK(SEQ ID NO:64)的肠激酶蛋白酶裂解位点。在本实施方案的其它方面,肠激酶蛋白酶裂解位点位于例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT的双链环内。在本实施方案的其它方面,肠激酶蛋白酶裂解位点位于例如美国专利5,989,545;美国专利6,461,617;美国专利6,632,440;美国专利6,843,998;美国专利7,244,437;美国专利7,413,742和美国专利7,425,338中公开的蛋白质的双链环内。
对双链环区域进行修饰以用外源蛋白酶裂解位点替代天然存在的双链环蛋白酶裂解位点。在该修饰中,天然存在的双链环蛋白酶裂解位点是不可操作的,从而不能被其蛋白酶裂解。只有外源蛋白酶裂解位点可被其相应外源蛋白酶裂解。在该类型的修饰中,将外源蛋白酶位点以融合蛋白的形式在框内可操作地连接于经修饰的梭菌毒素,并且所述位点可被其各自的外源蛋白酶裂解。用外源蛋白酶裂解位点替代内源双链环蛋白酶裂解位点可以是其中在邻近内源位点的裂解位点位置的位点上对外源位点进行工程化的位点的置换。用外源蛋白酶裂解位点替代内源双链环蛋白酶裂解位点可以是外源位点的添加,其中在与内源位点的裂解位点位置不同的位点上对外源位点进行工程化,所述内源位点被工程化为不可操作的。
可通过改变至少2个侧翼连接于天然存在的双链环蛋白酶裂解的肽键的氨基酸来使双链环区域中包含的天然存在的蛋白酶裂解位点不能被操作。可进行更广泛的改变,只要双链环区域的2个半胱氨酸残基保持完整并且所述区域仍然可形成二硫桥。氨基酸改变的非限定性实例包括氨基酸的缺失或用不同氨基酸对原始氨基酸的替代。因此,在一个实施方案中,通过改变2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸来使双链环区域中包含的天然存在的蛋白酶裂解位点不能被操作。在本实施方案的其它方面,通过改变例如3个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少4个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少5个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少6个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少7个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少8个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少9个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少10个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至少15个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;或至少20个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸来使双链环区域中包含的天然存在的蛋白酶裂解位点不能被操作。
在本实施方案的其它方面,通过改变例如至多3个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多4个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多5个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多6个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多7个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多8个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多9个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多10个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;至多15个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸;或至多20个氨基酸,包括2个侧翼连接于天然存在的蛋白酶裂解的肽键的氨基酸来使双链环区域中包含的天然存在的双链蛋白酶裂解位点不能被操作。
本说明书中公开的方法部分地包括细胞。预期可使用任何和所有细胞。因此,本实施方案的方面包括但不限于原核细胞,包括但不限于好氧、微量需氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧、革兰阴性和革兰阳性细菌细胞的菌株例如来源于例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis),藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridia perfringens)、难辨梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乳球菌(Lactococcus lactis)、甲基营养菌属(Methylobacterium extorquens)、Neisseria meningirulls、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)的菌株;以及真核细胞,包括但不限于酵母菌株,例如来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)、醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌株;来源于昆虫的昆虫细胞和细胞系,例如来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的细胞或细胞系;哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系例如,来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的细胞或细胞系。细胞系可获自美国典型培养物保藏中心、欧洲细胞培养物收藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物和细胞培养保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)。用于选择、制备和使用适当的细胞系的具体实施方案的非限定性实例描述于例如INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等人编著,Marcel Dekker,1993);INSECT CELL CULTURES:FUNDAMENTAL ANDAPPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等人编著,Kluwer Academic Publishers,1996);Maureen A.Harrison&Ian F.Rae,GENERAL TECHNIQUES OF CELLCULTURE(Cambridge University Press,1997);CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等人编著,John Wiley and Sons,1998);R.Ian Freshney,CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASICTECHNIQUE(Wiley-Liss,第4版2000);ANIMAL CELL CULTURE:APRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编著,Oxford UniversityPress,第3版2000);MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,同上,(2001);BASIC CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis,Oxford Press,第2版.2002);和CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,同上,(2004)。这些方案是在本领域技术人员的能力范围内的常规方法并且来自本文中的教导。
本说明书中公开的方法部分地包括,将本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体引入细胞。可通过该细胞瞬时或稳定地维持引入细胞的表达构建体或双重表达构建体。稳定维持的表达构建体或双重表达构建体可以是染色体外的并且可自主复制或可将它们整合入细胞的染色体材料中并且非自主地复制。预期可使用用于将本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体引入细胞的任何和所有方法。用于将表达构建体或双重表达构建体引入细胞的方法包括但不限于化学药品介导的转染例如磷酸钙介导的、二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介导的、脂质介导的、聚乙烯亚胺(PEI)介导的、多聚赖氨酸介导的和聚凝胺(polybren)介导的、物理介导的转染,例如基因枪(biolisticparticle)递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔;和病毒介导的转染例如逆转录病毒介导的转染,参见,例如,Introducing Cloned Genesinto Cultured Mammalian Cells,pp.16.1-16.62(Sambrook&Russell,编著,Molecular Cloning A Laboratory Manual,第3卷,第3版.2001)。本领域技术人员理解将表达构建体或双重表达构建体引入细胞的具体方法的选择部分地取决于细胞是否瞬时包含表达构建体或双重表达构建体或细胞是否稳定地包含表达构建体或双重表达构建体。此类方案是本领域技术人员的能力范围内的常规方法并且来自本文中的教导。
在本实施方案的方面,化学药品介导的方法(称为转染)用于将本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体引入细胞。在化学药品介导的转染方法中,化学试剂与表达构建体或双重表达构建体形成复合物,所述复合物帮助其至细胞内的摄入。此类化学试剂包括但不限于磷酸钙介导的,参见,例如,Martin Jordan&Florian Worm,Tranafection of adherent and suspended cells by calcium phosphate,33(2)Methods 136-143(2004);二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介导的、脂质介导的、阳离子聚合物介导的如聚乙烯亚胺(PEI)介导的以及多聚赖氨酸介导的和聚凝胺介导的,参见,例如,Chun Zhang等人,Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells,33(2)Methods 144-150(2004)。此类化学介导的递送系统可利用标准方法来制备并且是商购可得的,参见,例如,CellPhect转染试剂盒(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ);哺乳动物转染试剂盒,磷酸钙和DEAE葡聚糖,(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA);LipofectamineTM转染试剂(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA);ExGen 500转染试剂盒(Fermentas,Inc.,Hanover,MD)以及SuperFect和Effectene转染试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)。
在本实施方案的另一个方面,物理介导的方法用于将本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体引入细胞。物理技术包括但不限于电穿孔、基因枪和显微注射。基因枪和显微注射技术使细胞壁穿孔以将表达构建体或双重表达构建体引入细胞,参见,例如,Jeike E.Biewenga等人,Plasmid-mediated gene transfer in neurons using thebiolistics technique,71(1)J.Neurosci.Methods.67-75(1997);和JohnO’Brien&Sarah C.R.Lummis,Biolistic and diolistic transfection:usingthe gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells,33(2)Methods 121-125(2004)。电穿孔(也称为电通透作用)使用短暂的高电压、电脉冲以在膜上产生多核苷酸分子通过其进入的瞬时通道,并且可有效地用于所有细胞类型的稳定和瞬时转染,参见,例如,M.Golzio等人,In vitro and in vivo electric field-mediatedpermeabilization,gene transfer,and expression,33(2)Methods126-135(2004);和Oliver Gresch等人,New non-viral method for genetransfer into primary cells,33(2)Methods 151-163(2004)。
在本实施方案的另一个方面,病毒介导的方法(称为转导)用于将本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体引入细胞。在病毒介导的瞬时转导方法中,操纵病毒颗粒籍以感染宿主细胞并且在其中复制的过程以使用该机制将表达构建体或双重表达构建体引入细胞。已从许多种病毒开发了病毒介导的方法,包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated viruse)、单纯疱疹病毒(herpessimplex viruse)、小核糖核酸病毒、甲病毒和杆状病毒,参见,例如,Armin Blesch,Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivoand in vivo gene transfer,33(2)Methods 164-172(2004);和MaurizioFederico,From lentiviruses to lentivirus vectors,229Methods Mol.Biol.3-15(2003);E.M.Poeschla,Non-primate lentiviral vectors,5(5)Curr.Opin.Mol.Ther.529-540(2003);Karim Benihoud等人,Adenovirusvectors for gene delivery,10(5)Curr.Opin.Biotechnol.440-447(1999);H.Bueler,Adeno-associated viral vectors for gene transfer and genetherapy,380(6)Biol.Chem.613-622(1999);Chooi M.Lai等人,Adenovirus and adeno-associated virus vectors,21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002);Edward A.Burton等人,Gene delivery using herpessimplex virus vectors,21(12)DNA Cell Biol.915-936(2002);PaolaGrandi等人,Targeting HSV amplicon vectors,33(2)Methods179-186(2004);Ilya Frolov等人,Alphavirus-based expression vectors:strategies and applications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996);Markus U.Ehrengruber,Alphaviral gene transfer inneurobiology,59(1)Brain Res.Bull.13-22(2002);Thomas A.Kost&J.Patrick Condreay,Recombinant baculoviruses as mammalian cellgene-delivery vectors,20(4)Trends Biotechnol.173-180(2002);和A.Huser&C.Hofmann,Baculovirus vectors:novel mammalian cellgene-delivery vehicles and their applications,3(1)Am.J.Pharmacogenomics 53-63(2003)。
腺病毒(其为无包膜双链DNA病毒)通常被选择用于哺乳动物细胞转导,因为腺病毒可操作约36kb的相对大的多核苷酸分子,以高滴度产生,并且可高效地感染多种分裂和不分裂细胞,参见,例如,Wim T.J.M.C.Hermens等人,Transient gene transfer to neurons andglia:analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS,71(1)J.Neurosci.Methods 85-98(1997);和Hiroyuki Mizuguchi等人,Approaches for generating recombinant adenovirus vectors,52(3)Adv.Drug Deliv.Rev.165-176(2001)。使用基于腺病毒的系统的转导不支持长时间的蛋白质表达,因为核酸分子由细胞核中的附加体携带而未被整合在宿主染色体中。腺病毒载体系统和如何使用此类载体的具体方案公开于例如VIRAPOWERTM腺病毒表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和VIRAPOWERTM腺病毒表达系统说明书25-0543version A,Invitrogen,Inc.,(2002年7月15日);和ADEASYTM腺病毒载体系统(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)和ADEASYTM腺病毒载体系统说明书064004f,Stratagene,Inc.中。
本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体至细胞中的引入还可使用单链RNA逆转录病毒例如致癌逆转录病毒(oncoretroviruse)和慢病毒。逆转录病毒介导的转导通常产生接近100%的转导效率,可通过改变感染复数(MOI)容易地控制前病毒拷贝数,并且可用于瞬时或稳定转导细胞,参见,例如,Tiziana Tonini等人,Transient production of retroviral-and lentiviral-based vectors forthe transduction of Mammalian cells,285 Methods Mol.Biol.141-148(2004);Armin Blesch,Lentiviral and MLV based retroviralvectors for ex vivo and in vivo gene transfer,33(2)Methods164-172(2004);Félix Recillas-Targa,Gene transfer and expression inmammalian cell lines and transgenic animals,267 Methods Mol.Biol.417-433(2004);和Roland Wolkowicz等人,Lentiviral vectors for thedelivery of DNA into mammalian cells,246 Methods Mol.Biol.391-411(2004)。逆转录病毒颗粒由包装在由脂质包膜包围的蛋白质壳体中的RNA基因组组成。逆转录病毒通过将其RNA连同逆转录酶一起注射入细胞质来感染宿主细胞。随后RNA模板被逆转录成线性双链cDNA,所述双链cDNA通过整合至宿主细胞基因组中来复制其本身。垂直(通过前病毒从亲代细胞至子代细胞)以及水平(通过病毒体从细胞至细胞)扩散病毒颗粒。该复制策略使得能够长期持续表达,因为目标核酸分子被稳定地整合至宿主细胞的染色体中,从而使得能够长期表达蛋白质。例如,动物研究已显示注射入各种组织内的慢病毒载体产生超过1年的持续蛋白质表达,参见,例如,Luigi Naldini等人,In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by alentiviral vector,272(5259)Science 263-267(1996)。致癌逆转录病毒衍生的载体系统例如Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)被广泛地使用并且感染许多不同的不分裂细胞。慢病毒还可感染许多不同的细胞类型,包括分裂和不分泌细胞并且具有复杂的包膜蛋白,所述包膜蛋白使得能够进行高度特异性细胞靶向。
逆转录病毒载体和如何使用此类载体的具体方案公开于例如Manfred Gossen&Hermann Bujard,Tight control of gene expression ineukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters,美国专利5,464,758,Hermann Bujard&Manfred Gossen,Methods for regulatinggene expression,美国专利5,814,618,David S.Hogness,Polynucleotidesencoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cellstransformed with same,美国专利5,514,578,和David S.Hogness,Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor,美国专利6,245,531;Elisabetta Vegeto等人,Progesterone receptor having C.terminalhormone binding domain truncations,美国专利5,364,791,,ElisabettaVegeto等人,Mutated steroid hormone receptors,methods for their useand molecular switch for gene therapy,美国专利5,874,534,和ElisabettaVegeto等人,Mutated steroid hormone receptors,methods for their useand molecular switch for gene therapy,美国专利5,935,934中。此外,此类病毒递送系统可利用标准方法来制备并且可商购获得,参见,例如,BDTM Tet-Off和Tet-On基因表达系统(BD Biosciences-Clonetech,Palo Alto,CA)以及BDTM Tet-Off和Tet-On基因表达系统用户手册,PT3001-1,BD Biosciences Clonetech,(2003年3月14日),GENESWITCHTM系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)以及GENESWITCHTM System A Mifepristone-Regulated Expression Systemfor Mammalian Cells version D,25-0313,Invitrogen,Inc.,(2002年11月4日);VIRAPOWERTM Lentiviral Expression System(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和VIRAPOWERTM慢病毒表达系统说明书25-0501版本E,Invitrogen,Inc.,(2003年12月8日);以及COMPLETE逆转录病毒诱导型哺乳动物表达系统(Stratagene,LaJolla,CA)和COMPLETE逆转录病毒诱导型哺乳动物表达系统说明书,064005e。
本说明书中公开的方法部分地包括表达本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体。预期许多表达系统中的任何表达系统可用于表达本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体,包括但不限于,基于细胞的系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。无细胞系统包括但不限于麦胚提取物、兔网织红细胞提取物和大肠杆菌提取物并且通常等同本文中公开的方法。使用表达系统进行表达构建体或双重表达构建体的表达可包括许多特征中的任何特征,包括但不限于诱导型表达、非诱导型表达、组成型表达、病毒介导的表达、稳定整合的表达和瞬时表达。包括充分表征的载体、试剂、条件和细胞的表达系统已被确立并且可容易地从提供商获得,所述提供商包括但不限于Ambion,Inc.Austin,TX;BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA;BD BiosciencesPharmingen,San Diego,CA;Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA;QIAGEN,Inc.,Valencia,CA;Roche Applied Science,Indianapolis,IN;和Stratagene,La Jolla,CA。关于适当的异源表达系统的选择和使用的非限定性实例描述于例如PROTEIN EXPRESSION.A PRACTICALAPPROACH(S.J.Higgins和B.David Hames编著,Oxford UniversityPress,1999);Joseph M.Fernandez&James P.Hoeffler,GENEEXPRESSION SYSTEMS USING NATURE FOR THE ART OFEXPRESSION(Academic Press,1999);和Meena Rai&Harish Padh,Expression Systems for Production of Heterologous Proteins,80(9)CURRENT SCIENCE 1121-1128,(2001)中。这些方案是完全在本领域技术人员的能力范围内的常规方法和来自本文中的教导。
多种基于细胞的表达方法对于表达本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体是有用的。实例包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。病毒表达系统包括但不限于VIRAPOWERTM慢病毒(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、腺病毒表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、ADEASYTM XL腺病毒载体系统(Stratagene,La Jolla,CA)和逆转录基因表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)。原核表达系统的非限定性实例包括CHAMPIONTM pET表达系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)、TRIEXTM细菌表达系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)、表达系统(QIAGEN,Inc.)和蛋白质表达和纯化系统(Stratagene,La Jolla,CA)。酵母表达系统包括但不限于EASYSELECTTM毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、YES-ECHOTM表达载体试剂盒(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和SPECTRATM粟酒裂殖酵母(S.pombe)表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)。杆状病毒表达系统的非限定性实例包括BACULODIRECTTM(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和BD BACULOGOLDTM(BD Biosciences-Pharmigen,San Diego,CA)。昆虫表达系统包括但不限于果蝇属表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、INSECTSELECTTM系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和INSECTDIRECTTM系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。哺乳动物表达系统的非限定性实例包括T-REXTM(四环素-调节的表达)系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、FLP-INTM T-REXTM系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、pcDNATM系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、pSecTag2系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、系统、INTERPLAYTM哺乳动物TAP系统(Stratagene,La Jolla,CA)、COMPLETE诱导型哺乳动物表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)和II诱导型哺乳动物表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)。
表达本说明书中公开的表达构建体或双重表达构建体的另一个方法使用无细胞表达系统,例如但不限于原核生物提取物和真核生物提取物。原核细胞提取物的非限定性实例包括RTS 100大肠杆菌HY试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、ACTIVEPROTM体外翻译试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)、ECOPROTM系统(EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI)和ExpresswayTM Plus表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)。真核细胞提取物包括但不限于RTS100麦胚CECF试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、偶联的麦胚提取物系统(Promega Corp.,Madison,WI)、麦胚IVTTM试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)、网织红细胞裂解物IVTTM试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)、II系统(Ambion,Inc.,Austin,TX)和偶联的网织红细胞裂解物系统(Promega Corp.,Madison,WI)。
本说明书中公开的方法部分地包括将细胞在第一温度下生长一定的时间段,随后将细胞在第二温度下生长一定的时间段。基于待细胞表达的蛋白质的期望的量和位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上将单链蛋白质转化成其双链形式的期望的裂解效率来确定第一和第二温度以及细胞在第一和第二温度下生长的时间段。
在一个实施方案中,将细胞在第一温度下生长一定的时间段以达到最大细胞密度。在本实施方案的方面,将细胞在约37℃下生长约0.5小时、约1.0小时、约1.5小时、约2.0小时、约3.0小时、约3.5小时、约4.0小时、约5.0小时、约6.0小时、约7.0小时、约8.0小时、约9.0小时或约10小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约42℃下生长约0.5小时、约1.0小时、约1.5小时、约2.0小时、约3.0小时、约3.5小时、约4.0小时、约5.0小时。在本实施方案的方面,将细胞在约30℃下生长约0.5小时、约1.0小时、约1.5小时、约2.0小时、约3.0小时、约3.5小时、约4.0小时或约5.0小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约12℃下生长约2小时至约8小时,在约16℃下生长约2小时至约8小时,在约20℃下生长约2小时至约8小时或在约24℃生长约2小时至约8小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约12℃至约16℃下生长约2小时至约8小时或在约20℃至约24℃下生长约2小时至约8小时。
在另一个实施方案中,将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到蛋白质表达的最大诱导。在本实施方案的方面,将细胞在约37℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约30℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约25℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约22℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约16℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。在本实施方案的其它方面,将细胞在约12℃下生长约1.5小时、约2.5小时、约3.5小时、约4.5小时、约5.5小时、约6.5小时、约7.5小时、约8.5小时、约9.5小时、约10.5小时、约11.5小时、约12.5小时、约13.5小时、约14.5小时、约15.5小时、约16.5小时或约24.5小时。
本发明的方面还可如下描述:
1.将单链蛋白质转化为其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在第一温度下生长一定的时间段以达到最大细胞密度,所述双重表达构建体包含;
i)编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框;和
ii)编码蛋白酶的开放阅读框;其中蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点;
b)将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到使蛋白质从编码单链蛋白质的开放阅读框表达的最大诱导,
其中步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和蛋白酶从双重表达构建体的表达;和
其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
2.将单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约3.5小时,所述双重表达构建体包含;
i)编码单链梭菌毒素的开放阅读框,单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域;和
ii)编码蛋白酶的开放阅读框;其中蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点;
b)将细胞在22℃下生长约16至约18小时,
其中步骤(b)中的生长诱导单链梭菌毒素和蛋白酶从双重表达构建体表达;和
其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链梭菌毒素,从而将单链梭菌毒素转化成其双链形式。
3.根据2的细胞内方法,其中单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素结合结构域;2)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域;3)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域;4)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域;5)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素结合结构域;或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。
4.根据2的细胞内方法,其中梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
5.根据2的细胞内方法,其中梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
6.根据2的细胞内方法,其中梭菌毒素结合结构域为BoNT/A结合结构域、BoNT/B结合结构域、BoNT/C1结合结构域、BoNT/D结合结构域、BoNT/E结合结构域、BoNT/F结合结构域、BoNT/G结合结构域、TeNT结合结构域、BaNT结合结构域或BuNT结合结构域。
7.根据2的细胞内方法,其中外源蛋白酶裂解位点为肠激酶蛋白酶裂解位点,人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、人肠病毒3C蛋白酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点、烟草脉斑驳病毒(TVMV)蛋白酶裂解位点、枯草杆菌蛋白酶蛋白酶裂解位点或半胱天冬酶3蛋白酶裂解位点。
8.根据2的细胞内方法,其中蛋白酶为肠激酶蛋白酶、人鼻病毒3C蛋白酶、人肠病毒3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑驳病毒(TVMV)蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶蛋白酶或半胱天冬酶3蛋白酶。
9.将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约8小时,所述双重表达构建体包含;
i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域;和
ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;
b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,
其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;和
其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
10.根据9的细胞内方法,其中蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域,2)梭菌毒素酶促结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和梭菌毒素转位结构域,3)整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域,4)整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素转位结构域,5)梭菌毒素转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和梭菌毒素酶促结构域或6)梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域。
11.根据9的细胞内方法,其中梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
12.根据9的细胞内方法,其中梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
13.根据9的细胞内方法,其中整合的TEV蛋白酶裂解位点-opiod结合结构域为整合的TEV蛋白酶裂解位点-痛敏肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-脑啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-BAM22结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内吗啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-血衍吗啡素结合结构域或整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽B结合结构域。
14.将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长约8小时,所述双重表达构建体包含;
i)编码单链蛋白质的开放阅读框,单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;和
ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;
b)将细胞在约12至约16℃下生长约16至约18小时,
其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达;在
其中所产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质,从而将单链蛋白质转化成其双链形式。
15.根据14的细胞内方法,其中单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和非-梭菌毒素结合结构域;2)梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域;3)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域;4)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域;5)梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和非-梭菌毒素结合结构域;或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。
16.根据14的细胞内方法,其中梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
17.根据14的细胞内方法,其中梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
18.根据14的细胞内方法,其中非-梭菌毒素结合结构域为阿片样物质肽结合结构域、黑皮质素肽结合结构域、甘丙肽肽结合结构域、鸟尿素(granin)肽结合结构域、速激肽结合结构域、神经肽Y相关肽结合结构域、神经激素肽结合结构域、细胞因子肽结合结构域、激肽结合结构域、成纤维细胞生长因子肽结合结构域、神经营养因子肽结合结构域、肿瘤坏死因子肽结合结构域、胶质细胞源性神经营养因子肽结合结构域、转化生长因子β肽结合结构域、骨形态发生蛋白肽结合结构域、生长和分化因子肽结合结构域、激活蛋白肽结合结构域、血管内皮生长因子肽结合结构域、胰岛素生长因子肽结合结构域、表皮生长因子肽结合结构域、高血糖素样激素肽结合结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽结合结构域、生长激素释放激素肽结合结构域、血管活性肠肽结合结构域、肠抑胃肽肽结合结构域、降钙素-相关肽脑肠肽结合结构域或蛋白酶激活受体肽结合结构域。
实施例
实施例1
TEV蛋白酶变体
下列实施例举例说明如何制备和使用具有增强的稳定性和/或溶解性的TEV蛋白酶变体。
A.pET29/TEV表达构建体的构建
为了重组产生TEV蛋白酶,使用标准方法(BlueHeronBiotechnology,Bothell,WA)合成编码期望的TEV蛋白酶的开放阅读框。使用标准亚磷酰胺合成法来合成长度为20至50个碱基的横跨整个开放阅读框的互补寡核苷酸。使这些寡核苷酸杂交成双链的双链体,所述双链体随后被连接在一起以装配全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点克隆到pUCBHB1运载载体(carrier vector)中以产生pUCBHB1/TEV质粒。通过使用BIGDYE TERMINATORTM Chemistry 3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)测序来验证合成的多核苷酸分子。
将编码TEV变体的开放阅读框进行密码子最优化以用于大肠杆菌表达,所有开放阅读框都编码约27.5kDa的约250个氨基酸的蛋白水解片段,相应于融合至N-或C-末端多组氨酸亲和纯化标签的全长TEV多蛋白(polyprotein)的残基2038-2279。野生型TEV蛋白酶的重组表达导致具有在丝氨酸219上裂解其自身以产生蛋白水解活性大大降低的截短的蛋白酶的倾向的蛋白质。因此,为了大大消除自体溶解和该截短产物的随后产生,合成其中丝氨酸219被改变成天冬酰胺(S219N)或缬氨酸(S219V)的TEV变体。此外,有大量证据表明虽然重组野生型TEV蛋白酶以极高水平在大肠杆菌中表达,但其几乎是完全不溶解的(Kapust等人,2001)。因此,为了提高表达的TEV的溶解度,产生并且测试几种氨基酸变体以确定改变是否导致增加的蛋白质溶解度。合成的TEV变体示于表3中。变体1代表经工程化具有C末端His-标签和S219N突变的密码子最优化的TEV构建体。变体11是具有经工程化具有N末端标签和S219N突变的TEV蛋白酶的天然DNA序列的构建体。
为了构建pET29/TEV变体表达构建体,利用限制性内切核酸酶降解pUCBHB1/TEV构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码TEV的开放阅读框的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pET29载体(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。通过使用T4DNA连接酶法,将该插入物在多克隆位点上定向连接到用相同限制性内切核酸酶降解的pET29载体中。通过电穿孔将连接混合物转化至电感受态(electro-competent)大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD),将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,将板置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认TEV基因插入物的存在和完整性。该克隆策略产生包含编码可操作地连接于羧基末端或氨基末端多组氨酸亲和纯化肽的TEV变体的多核苷酸分子的pET29表达构建体。
B.在不同诱导条件下的TEV表达的分析
为了确定使用的最佳生长和蛋白质诱导条件,将pET29/TEV变体9和10(表3)在IPTG诱导培养基和自诱导培养基中进行生长和诱导。此外,检查诱导的长度。
为了利用IPTG诱导表达,首先将包含TEV表达构建体的细胞生长过夜以产生起始培养物。用过夜培养物以1∶1000接种新鲜LB培养基,在37℃下在振荡的条件下使其生长直至OD600达到0.7,此时将IPTG添加至0.6mM的终浓度。在诱导后4小时收获细胞,评估总细胞裂解物以检测靶表达。
为了在自诱导条件下表达构建体,用包含适当的表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,并且在37℃下在振荡的条件下生长过夜。将1.0μL的该起始培养物用于接种1.0mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052自诱导培养基。将细胞在37℃下在振荡的条件下生长,在第5、8、12、20和28小时取出等分。
为了测定总TEV蛋白酶的表达,将来自每一个时间点的40μL的诱导细胞培养物与等体积的2xLaemmi样品缓冲液混合,在95℃下孵育10分钟。将2μL的1M MgSO4中的1个单位/μL Benzonase添加至该混合物,在95℃下孵育5分钟。加载15μL等分,在变性还原条件下,使用Novex 4-12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA),通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。清洗凝胶,将其在包含10%甲醇、7%醋酸的固定溶液中固定30分钟。在固定后,除去固定液,用SYPRO Ruby蛋白质凝胶染色剂在室温下孵育凝胶3小时。随后在室温下在包含10%甲醇,7%醋酸的脱色溶液中对凝胶脱色3小时。利用Typhoon 9410 Variable ModeImager和Imager分析软件(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)使图像可视。
为了测定可溶性TEV蛋白酶表达,通过添加100μL包含1xFASTBREAKTM细胞裂解试剂(Promega Corp.,Madison,WI)、500mMNaCl、250个单位/mL的benzonase核酸酶(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)和1x蛋白酶抑制剂混合物III(EMDBiosciences-Calbiochem,Gibbstown,NJ)的细胞裂解溶液来裂解1.0mL的诱导的细胞培养物,在恒定涡旋的条件下将其在室温下孵育25分钟。将裂解物以4300rpm离心15分钟以沉淀碎片。将800μL上清液转移至干净管中,向其中添加30μL MagneHis磁珠,在等速旋转的条件下将混合物孵育5分钟。孵育后,将磁珠吸附在磁性表座(magnetic stand)上,除去溶液,用150μL含有500mM NaCl的洗涤缓冲液洗涤珠粒3次。用80μL的洗脱缓冲液洗脱蛋白质,加入等体积的2xLaemmli样品缓冲液,将混合物在95℃下孵育10分钟。加载15μL等分,在变性还原条件下使用Novex 4-12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合物。
诱导实验的结果显示自诱导条件导致相对于IPTG-诱导超过5-10倍的表达的TEV蛋白酶。自诱导培养基中总TEV蛋白酶和可溶性TEV蛋白酶表达的比较显示虽然更长的诱导时间导致更多的总蛋白,但可回收的可溶性TEV蛋白酶的量减少。事实上,在37℃下约8小时的表达产生最大量的可溶性蛋白质。最后,虽然TEV S219N和TEVS219V变体展示显著更少的自体溶解,但TEV S219V变体在延长的诱导时间上显示更多的截短产物,这表明TEV S219V变体更易于自体溶解。
当使用pET29/TEV变体9和10最优化生长和诱导条件后,在这些条件下平行检查所有11种pET29/TEV变体的表达。结果表明可溶性TEV蛋白酶的不断增加的产量的顺序从5个最高表达者的最高至最低为pET29/TEV变体5、10、7、3和6。相比较之下,TEV变体11在所有变体中以最低水平表达。
C.大规模表达和纯化
为了在大规模的条件下严格比较前5个pET29/TEV变体以及作为对照的变体11的TEV蛋白酶表达水平,用包含适当的表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,在振荡的条件下在37℃下生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052,在振荡的条件下在37℃下生长8小时。通过离心沉淀细胞。
为了裂解细胞,将细胞以5.0mL/克细胞沉淀重悬浮于包含BUGBUSTERTM蛋白质提取试剂(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI),1x蛋白酶抑制剂混合物组III(EMDBiosciences-Calbiochem,Gibbstown,NJ)、25个单位/mL Benzonase核酸酶和1Kunit/mL rLysozyme(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)的裂解溶液中。将细胞悬浮液在室温下于平板摇床(platformrocker)上孵育20分钟,然后在冰上孵育15分钟。将悬浮液在4℃下以30,350rcf离心30分钟以沉淀碎片,随后将悬浮液转移至干净的管中。为了制备不溶液性细胞提取物沉淀以进行SDS-PAGE分析,用1xBUGBUSTERTM蛋白质提取试剂将沉淀重悬浮至原始体积。
为了利用IMAC纯化来纯化TEV蛋白酶变体,将澄清的裂解物与用包含25mM磷酸钠(pH 7.0)、500mM NaCl、10%甘油和35mM咪唑的IMAC洗涤溶液平衡的TALONTM SuperFlow Metal AffinityCobalt树脂混合。将裂解物-树脂混合物在平板摇床上于4℃下孵育1小时,随后转移至连接于真空歧管(vacuum manifold)的20mL一次性柱支持物。用5倍柱体积的IMAC洗涤溶液洗涤柱子2次。用2倍柱体积的包含25mM磷酸钠(pH 7.8)、500mM NaCl、10%甘油和500mM咪唑的IMAC洗脱液从树脂洗脱TEV蛋白酶,然后收集在1.0mL级分中。通过将10μL等分与200μL QUICKSTARTTM Bradford染色剂混合来鉴定每一个包含蛋白质的级分。将峰值洗脱级分汇集,将其透析以进行次级离子交换层析纯化。
为了透析IMAC-纯化的TEV蛋白酶变体,在恒定搅拌的条件下将包含峰值洗脱级分的汇集样品在配备有25 kD MWCO膜的中在4℃下于1L的脱盐缓冲液中透析过夜。对于阳离子交换层析,脱盐缓冲液(缓冲液A)包含50mM Tris-HCl,pH 8.0。
为了利用阳离子交换层析纯化TEV蛋白酶变体,将脱盐蛋白质溶液以0.5mL/分钟的流速加载至用缓冲液A预平衡的1mL UNO-S1阳离子交换柱。如下以1.0mL/分钟的流速利用NaCl梯度(使用包含25mM磷酸钠(pH 7.0)、1M NaCl的的缓冲液B)洗脱结合的蛋白质:5%的缓冲液B进行3mL,20%的缓冲液B进行10mL,在进行的10mL中从20%的缓冲液B变化至100%的缓冲液B。利用紫外光可见检测器在214nm、260nm和280nm处检测蛋白质从柱子的洗脱,将所有峰值级分汇集,测定蛋白质浓度。将等分在液氮中快速冷冻并且于-80℃下贮存。TEV变体7具有最高的可溶性蛋白酶产量(ca.35mg/L),随后是变体3(ca.24mg/L)和变体10(ca.23mg/L)。其余2个变体5和6分别具有18和8mg/L的产量。TEV变体11的产率为ca.0.6mg/L。这样,所有前5个包含溶解度增强氨基酸改变的TEV变体全都导致相对于TEV变体11纯化的可溶液性TEV蛋白酶增加至少10倍,所述TEV变体11仅包含自体溶解消除氨基酸改变(S219N)。当比较来自小规模和大规模表达研究的TEV蛋白酶的产量的等级顺序时,变体5在小规模表达中显示最高的产量(实施例1C)。然而,其为在大规模表达中具有最高产量的变体7。来自大规模批次的产量的反复比效始终显示变体7为最高表达变体。因此,变体7代表了领先(lead)TEV蛋白酶构建体并且用于此处描述的所有随后研究中。
为了测定TEV蛋白酶变体的蛋白水解活性,将作为阳性对照的TEV蛋白酶变体或AcTEV蛋白酶添加至30μL的包含50mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM DTT和2.5μg的TEV底物的反应液中,在30℃下孵育30分钟、60分钟和120分钟。通过添加2xLaemmi样品缓冲液并且在95℃下将样品孵育10分钟来淬灭反应。加载15μL等分,在变性还原条件下,使用Novex4-12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。洗涤凝胶,将其在包含10%甲醇、7%醋酸的固定液中固定30分钟。固定后,除去固定液,用SYPRO Ruby蛋白质凝胶染料在室温下孵育凝胶3小时。随后在包含10%甲醇、7%醋酸的脱色溶液中使凝胶脱色3小时。利用Typhoon 9410 Variable Mode成像仪显现图像,利用ImageQuantTL成像分析软件(GE Healthcare,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)进行分析。将未裂解的底物和裂解的产物的比率用于计算裂解的TEV底物的百分比。TEV蛋白酶活性测定的结果示于表4中。
实施例2
使用两种不同的表达构建体进行的具有TEV蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的细胞内激活
下列实施例举例说明了用于在细胞中表达包含含有本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的方法。
A.pET29/BoNT/A-TEV表达构建体的构建
为了产生包含位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点的BoNT/A,使用标准方法(BlueHeron Biotechnology,Bothell,WA)合成编码期望的BoNT/A-TEV(SEQ ID NO:88)的开放阅读框(SEQ IDNO:87)。使用标准亚磷酰胺法合成长度为20至50个碱基的横跨BoNT/A-TEV的整个开放阅读框的互补寡核苷酸。将这些寡核苷酸杂交成双链的双链体,所述双链体随后被连接在一起以装配全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点上克隆到pUCBHB1运载载体中以产生pUCBHB1/BoNT/A-TEV构建体。使用BIG DYE TERMINATORTM Chemistry 3.1(AppliedBiosystems,Foster City,CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过测序验证合成的多核苷酸分子。
为了产生pET29/BoNT/A-TEV表达构建体,用限制性内切核酸酶降解pUCBHB1/BoNT/A-TEV,所述内切核酸酶1)切除包含编码BoNT/A-TEV的开放阅读框的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pET29载体(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。使用T4 DNA连接酶法将该插入物亚克隆至用类似的限制性内切核酸酶降解的pET29载体中以产生适当的pET29/BoNT/A-TEV表达构建体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将其涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH7.0)上,并且置于37℃的培养箱中生长过夜。将包含表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生包含编码可操作地连接于羧基末端多组氨酸亲和纯化肽的BoNT/A-TEV的多核苷酸分子的pET29表达构建体。
B.pET22/TEV表达构建体的构建
为了产生pET22/TEV变体表达构建体,用限制性内切核酸酶降解pET29/TEV变体7表达构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码TEV蛋白酶(SEQ ID NO:78)的开放阅读框(SEQ ID NO:77)的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pET22载体(EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI)。使用T4DNA连接酶法将该插入物亚克隆至用类似的限制性内切核酸酶降解的pET22载体中以产生适当的pET22/TEV表达构建体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将其涂铺在含有50μg/mL氨苄青霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,将板置于37℃的培养箱中生长过夜。将包含表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生包含编码可操作地连接于氨基末端多组氨酸亲和纯化肽的TEV变体7的多核苷酸分子的pET22表达构建体。
C.包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的细胞的构建
为了产生包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的细胞,使用电穿孔将pET29/BoNT/A-TEV表达构建体转化到包含pET22/TEV变体7表达构建体的电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,将其涂铺在包含50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中过夜生长。将包含两种表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素-卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图进行分析以确定两种构建体的存在。该克隆策略产生包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的细胞。
D.BoNT/A-TEV的原位激活
为了在自诱导条件下产生BoNT/A-TEV的双链形式,用包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的PA-0.5G培养基,并且在37℃下振荡生长过夜。将约1.0μL的该起始培养物用于接种1.0mL的包含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的ZYP-5052,并且在37℃下振荡生长3.5小时,随后在22℃下振荡生长18.5小时。作为对照,除了仅将50μg/mL卡那霉素用作选择试剂外,如上所述生长和诱导仅包含pET29/BoNT/A-TEV的BL21(DE3)细胞。
在生长和诱导后,基本上如实施例1B中所述裂解细胞,对细胞进行IMAC纯化。通过SDS-PAGE分析IMAC纯化的样品,基本上如实施例1B中所述对凝胶进行染色。
结果表明当将单独表达pET29/BoNT/A-TEV时,在还原和非还原条件下都检测到对应于BoNT/A-TEV的单链的约150kDa的条带。相反地,当将BoNT/A-TEV与TEV蛋白酶共表达时,在还原条件下观察到两个条带,一个条带约50kDa,另一条带约100kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,约50kDa和约100kDa的条带消失,并且观察到约150kDa的新条带。综合起来,这些观察表明在还原条件下看到的约50kDa和约100kDa的条带对应于BoNT/A-TEV的轻链和重链,并且这两个条带的存在表明BoNT/A-TEV的双链形成。因此,在这些细胞中BoNT/A-TEV和TEV蛋白酶的共表达导致BoNT/A-TEV在位于双链环内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成BoNT/A-TEV的双链形式。
为了确认这些结果,进行包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的BL21(DE3)细胞的大规模表达。用包含pET29/BoNT/A-TEV和pET22/TEV表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的PA-0.5G培养基,并且在37℃下振荡生长过夜。将约250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的ZYP-5052,并且在37℃下振荡生长3.5小时,随后在22℃下振荡生长18.5小时。通过离心沉淀细胞。如实施例1C中所述裂解细胞并且进行IMAC纯化。
为了透析IMAC-纯化的BoNT/A-TEV以进行次级离子交换层析,在恒定搅拌的条件下将包含峰值洗脱级分的汇集样品在配备有25kDMWCO膜的中在4℃下于1L的脱盐缓冲液中透析过夜。为了进行阴离子交换层析,脱盐缓冲液(缓冲液A)包含50mMTris-HCl,pH 8.0。
为了利用阴离子交换层析纯化BoNT/A-TEV,将脱盐蛋白质溶液以0.5mL/分钟的流速加载至用缓冲液A预平衡的1mL UNO-Q1阴离子交换柱。如下以0.5mL/分钟的流速利用NaCl梯度(使用包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1M NaCl的的缓冲液B)洗脱结合的蛋白质:3%的缓冲液B进行3mL,7%的缓冲液B进行10mL,在进行的10mL中从7%的缓冲液B变化至100%的缓冲液B。利用紫外光可见检测器在214nm、260nm和280nm处检测蛋白质从柱子的洗脱,将所有峰值级分汇集,测定蛋白质浓度。将等分在液氮中快速冷冻并且于-80℃下贮存。基本上如实施例1B中所述通过SDS-PAGE分析纯化的BoNT/A-TEV蛋白,对凝胶进行染色。结果确认了初始小规模实验并且表明单链BoNT/A-TEV以接近100%的效率转化成其双链形式。
为了评估BoNT/A-TEV双链的活性,在基于细胞的测定和基于动物的测定中评估这些毒素。
为了使用基于细胞的测定测试BoNT/A-TEV双链的活性,基本上如专利申请Fernandez-Salas等人,Immuno-Based BoNT/A ActivityAssays,Attorney Docket No.18383(BOT)(将其通过引用整体并入本文)所述使用多重ECL夹心ELISA进行基于免疫的BoNT/A活性测定。
为了获得BoNT/A-TEV处理的细胞裂解物以用于分析,将来自SiMa细胞系的原种培养物的约50,000个细胞接种在包含无血清培养基(含有最低基础培养基、2mM GlutaMAXTM I(具有Earle’s盐)、1xB27补充剂、1xN2补充剂、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL的GTb1)的多聚-D-赖氨酸96孔板中。将这些细胞在37℃的培养箱中于5%二氧化碳下孵育直至细胞分化,如通过标准和常规形态学标准例如生长停止和神经突延伸(neurite extension)(约3天)评估的。从每一个孔中抽吸培养基,用包含0(未处理的样品)、0.01nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.11nM、3.33nM和10.0nM的BoNT/A-TEV的新鲜培养基替代。处理24小时后,洗涤细胞,将其在无毒素存在的情况下孵育另外两天。为了收获细胞,抽吸培养基,用1xPBS洗涤细胞,通过向每一个孔中添加30μl包含50mMHEPES、150mMNaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X-100的裂解缓冲液来进行裂解,在4℃将板在摇床上以500rpm旋转孵育30分钟。将板在4℃下以4000rpm离心20分钟以沉淀细胞碎片,将上清液转移至捕获抗体涂覆的96孔板以进行检测步骤。
为了制备α-SNAP-25捕获抗体溶液,使用标准蛋白A纯化方案纯化来自杂交瘤细胞系2E2A6的腹水中包含的α-SNAP-25单克隆抗体。为了制备α-SNAP-25检测抗体溶液,按照制造商的说明书(Meso ScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)将α-SNAP-25兔多克隆抗体S9684(Sigma,St.Louis,MO)缀合于钌(II)-三-二吡啶-(4-甲磺酸酯)NHS酯标记试剂(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)。为了制备包含对于SNAP-25裂解的产物是特异性的捕获抗体的固相载体,向96孔MSD High Bind板的每一个孔中添加约5μL的α-SNAP-25单克隆抗体2E2A6溶液(20μg/mL于1xPBS中),使溶液在生物安全柜中风干2-3小时以液体蒸发溶液。随后封闭捕获抗体结合的孔,将其直接用于检测BoNT/A活性。
为了通过ECL夹心ELISA分析来检测裂解的SNAP-25产物的存在,抽吸来自贮存的板的封闭缓冲液,将25μL来自用BoNT/A处理的细胞的裂解物添加至每一个孔中,将板在4℃下孵育2小时。通过抽吸细胞裂解物洗涤板孔3次,用200μL1xPBS、0.1%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每一个孔3次。洗涤后,将25μl的1xPBS、0.1%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中的5μg/mLα-SNAP-25检测抗体溶液(含有2%Amersham封闭试剂)添加至每一个孔中,密封板,将密封的板在室温下振荡孵育1小时。在α-SNAP-25检测抗体孵育后,用200μL1xPBS、0.1%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤孔3次。随后将获自ECL成像仪的原始数据转移至SigmaPlotv.9.0,将4-参数逻辑拟合(logistics fit)用于确定剂量-反应曲线。当将数据作图时,不存在用于4-参数逻辑功能的限制。使用下列分析:R2(相关系数)、a(数据组的最大值)、b(斜率(hillslope))和X0±SE(EC50值±标准误差)产生图形报告。来自两个独立运行的结果表明两种双链的活性几乎相同并且在天然双链的2倍之内。
为了使用基于动物的测定测试BoNT/A-TEV双链的活性,进行体内的趾外展评分(DAS)测定。称取CD-1Fe小鼠的重量,将小鼠置于10只动物的亚组中以进行每一个独立的DAS测定。基于下列标准将小鼠归入特定亚组:1)良好的健康;2)为0的强健基线DAS反应;3)包含在针对选择的亚组确立的X±2g的平均重量范围内和4)大于17.0g的重量。
用30规针在右后肢的腓肠肌中用5μL的7种不同剂量之一的BoNT/A-TEV(0.01nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.11nM、3.33nM和10.0nM)注射每一只小鼠。作为对照,用5μL不包含任何BoNT/A-TEV的溶液注射左后肢的腓肠肌。前4天连续观察小鼠的DAS反应。通过尾巴提起每一只小鼠并且精确地观察注射的后肢来读DAS。后趾的外展或不外展显示因肌肉中注射的测试毒素而产生的瘫痪的效果。将注射的后肢的趾外展与未注射的后肢的趾外展相比较,并且相应地进行评分。通过基于峰值平均DAS评分和AUC(曲线下面积)计算ED50剂量(以u/Kg和/或ng/Kg表示)来分析DAS数据。这可如下实现:1)在每一个研究中计算每一个剂量的平均峰值DAS评分;2)将在任何研究中引起超过5例死亡的任何剂量从考虑中消除;3)用于给定的个别研究的最高剂量是引起为4.0的平均峰值的最低剂量;4)用于给定的个别研究的最低剂量为引起为0的平均峰值的最高剂量;5)构建每一个个别研究的平均峰值DAS相对log(剂量)的曲线;6)在一些研究中计算多个组的每一个组(10只小鼠)的AUC值;7)构建每一个个别研究的平均AUC相对log(剂量)的曲线;8)对于每一种测试毒素,构建每一组多个相同研究的x,y重复反应曲线;9)使用下列公式,利用3参数逻辑方程(Sigma Plot V 8.0;SPSS Science,Chicago,Illinois)通过非线性回归(非加权)分析剂量-反应数据:
y=a/(1+(x/x0)b)
其中y为反应,a为渐近ymax,b为斜率,x为剂量,0为ED50剂量,对于峰值ED50测定,将Ymax设置为4(标度上的最大DAS读数)。计算每一个进行的8-剂量研究的平均(峰值和/或AUC)ED50值。
来自两个独立运行的结果表明两种双链的活性的水平几乎相同并且在天然双链的2倍以内。综合起来,基于细胞的测定和DAS测定的数据表明细胞内激活的方法产生不仅在结构上可与体外裸露的材料相比较而且在功能上不能区别的双链rBoNT/A。
实施例3
使用两种在不同启动子控制之下的不同表达构建体进行的具有TEV蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的细胞内激活
下列实施例举例说明用于在细胞中表达包含含有本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的方法。在该情况下,毒素的双链形式的形成受处于独立启动子的控制之下的TEV蛋白酶调节。
A.pBAD/TEV表达构建体的构建
为重组产生其表达处于阿拉伯糖启动子(PBAD)控制之下的TEV蛋白酶,将编码除去N末端His标签的TEV蛋白酶变体7(表3[130])的开放阅读框克隆到表达载体pBAD/Myc-HisA中以构建pBAD/TEV。为了构建pBAD/TEV,使用标准方法(BlueHeron Biotechnology,Carlsbad,CA)合成编码除去了N末端多组氨酸标签的TEV蛋白酶变体7(SEQ IDNO:106)的开放阅读框。使合成片段侧翼连接限制酶切位点以使该插入物能够可操作地连接于pBAD/Myc-HisA载体(Life Technologies,Madison,WI)。通过使用T4 DNA连接酶法,将该插入物在多克隆位点中定向连接于用相同限制性内切核酸酶降解的pBAD/Myc-HisA载体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL氨苄青霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,将板置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认TEV基因插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pBAD/TEV表达构建体,其包含编码不含多组氨酸亲和纯化肽的TEV变体7的多核苷酸分子。
B.包含pET29/BoNT/A-TEV和pBAD/TEV表达构建体的细胞的构建
为了产生包含pET29/BoNT/A-TEV和pBAD/TEV表达构建体的细胞,使用电穿孔将pET29/BoNT/A-TEV表达构建体(描述于实施例2A中)转化到包含pBAD/TEV变体7表达构建体的电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,将其涂铺在包含50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中过夜生长。将包含两种表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素-卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图进行分析以确定两种构建体的存在。该克隆策略产生包含pET29/BoNT/A-TEV和pBAD/TEV表达构建体的细胞。
C.BoNT/A-TEV的原位激活
为了在自诱导条件下产生BoNT/A-TEV的双链形式,用包含pET29/BoNT/A-TEV和pBAD/TEV表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下振荡生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的ZYP-5052,并且在37℃下振荡生长8小时,随后在22℃下振荡生长14小时。在该时间点上,用0.2%L-阿拉伯糖诱导TEV表达,将培养物在22C下再生长另外4小时。作为对照,除了仅将50μg/mL卡那霉素用作选择试剂外,如上所述生长和诱导仅包含pET29/BoNT/A-TEV的BL21(DE3)细胞。
在生长和诱导后,基本上如实施例1C中所述裂解细胞,对细胞进行IMAC纯化。为了透析IMAC-纯化的BoNT/A-TEV以进行次级离子交换层析,在恒定搅拌的条件下将包含峰值洗脱级分的汇集样品在配备有25kD MWCO膜的中在4℃下于1L的脱盐缓冲液中透析过夜。为了进行阴离子交换层析,脱盐缓冲液(缓冲液A)包含50mM Tris-HCl,pH 8.0。
为了利用阴离子交换层析纯化BoNT/A-TEV,将脱盐蛋白质溶液以0.5mL/分钟的流速加载至用缓冲液A预平衡的1mL UNO-Q1阴离子交换柱。如下以0.5mL/分钟的流速利用NaCl梯度(使用包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1M NaCl的的缓冲液B)洗脱结合的蛋白质:3%的缓冲液B进行3mL,7%的缓冲液B进行10mL,在进行的10mL中从7%的缓冲液B变化至100%的缓冲液B。利用紫外光可见检测器在214nm、260nm和280nm处检测蛋白质从柱子的洗脱,将所有峰值级分汇集,测定蛋白质浓度。
基本上如实施例1B中所述通过SDS-PAGE分析纯化的BoNT/A-TEV蛋白,对凝胶进行染色。结果表明当单独表达pET29/BoNT/A-TEV时,在还原和非还原条件下都检测到对应于BoNT/A-TEV的单链的约150kDa的条带。相反地,当将BoNT/A-TEV与处于PBAD启动子的控制之下的TEV蛋白酶共表达并且用阿拉伯糖诱导时,在还原条件下观察到两个条带,一个条带约50kDa,另一条带约100kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,约50kDa和约100kDa的条带消失,并且观察到约150kDa的新条带。综合起来,这些观察表明在还原条件下看到的约50kDa和约100kDa的条带对应于BoNT/A-TEV的轻链和重链,并且这两个条带的存在表明BoNT/A-TEV的双链形成。因此,在这些细胞中BoNT/A-TEV和TEV蛋白酶的共表达导致BoNT/A-TEV在位于双链环内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成BoNT/A-TEV的双链形式。结果表明90-95%之间的单链BoNT/A-TEV被转化成其双链形式。
实施例4
使用双重表达构建体进行的具有TEV蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的细胞内激活
下列实施例举例说明用于纯化和定量包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的方法。
A.pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV双重表达构建体的构建
为了构建pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV双重表达构建体,使用标准方法(BlueHeron Biotechnology,Bothell,WA)合成编码BoNT/A-TEV的最后37个氨基酸以及大肠杆菌表达所必需的的转录(T7启动子,lac操纵基因部位)和翻译(RBS)元件和TEV变体7的完整编码区的合成片段(SEQ ID NO:89)。使用标准亚磷酰胺合成法合成长度为20至50个碱基的互补寡核苷酸。将这些寡核苷酸杂交成双链的双链体,所述双链体随后被连接在一起以装配全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点上克隆到pUCBHB1运载载体中以产生pUCBHB1/BoNT/A-TEV C-端/T7Prom/TEV质粒。使用BIG DYE TERMINATORTM Chemistry 3.1(Applied Biosystems,FosterCity,CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过测序验证合成的多核苷酸分子。
为了产生pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV表达构建体,利用限制性内切核酸酶降解pUCBHB1/BoNT/A-TEV C-端/T7Prom/TEV,所述内切核酸酶1)切除包含BoNT/A-TEV的C端、用于第二开放阅读框的大肠杆菌表达所必需的转录和翻译基序以及TEV变体7的完整编码区域的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于来自实施例1A的pET29/BoNT/A-TEV载体中的BoNT/A基因之后。通过使用T4DNA连接酶法,将该插入物亚克隆到用类似的限制性内切核酸酶降解的pET29/BoNT/A-TEV 载体中以产生适当的pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV双重表达构建体(其包含BoNT/A-TEV和具有SEQ ID NO:89的干扰转录和翻译元件的TEV蛋白酶变体7的开放阅读框)。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pET29双重表达构建体,其包含编码可操作地连接于羧基末端多组氨酸亲和纯化标签的BoNT/A-TEV变体和TEV蛋白酶的多核苷酸分子。开放阅读框组织是这样组织的,以便从第一T7启动子的转录起始产生具有编码BoNT/A-TEV的开放阅读框和编码TEV蛋白酶的开放阅读框的mRNA。此外,从第二T7启动子的转录起始产生具有仅编码TEV蛋白酶的开放阅读框的mRNA。因此,与BoNT/A-TEV相比较存在多至2倍的编码TEV蛋白酶的转录物。
B.从pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV原位激活BoNT/A-TEV
为了在自诱导条件下产生BoNT/A-TEV的双链形式,用包含pET29/BoNT/A-TEV/TEV双重表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下振荡生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052,并且在37℃下振荡生长3.5小时,随后在22℃下振荡生长18.5小时。通过离心沉淀细胞。基本上如实施例2D中所述裂解细胞,进行IMAC纯化,脱盐,利用阴离子交换层析进行纯化,通过SDS-PAGE进行分析,对凝胶进行染色。作为对照,除仅将50μg/mL卡那霉素用作选择试剂外,如上所述生长和诱导仅包含pET29/BoNT/A-TEV的BL21(DE3)细胞。
结果表明当将单独表达时,在还原和非还原条件下都检测到对应于BoNT/A-TEV的单链的约150kDa的条带。相反地,当将BoNT/A-TEV与TEV蛋白酶共表达时,在还原条件下观察到两个条带,一个条带约50kDa,另一条带约100kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,约50kDa和约100kDa的条带消失,并且观察到约150kDa的新条带。综合起来,这些观察表明在还原条件下看到的约50kDa和约100kDa的条带对应于BoNT/A-TEV的轻链和重链,并且这两个条带的存在表明BoNT/A-TEV的双链形成。结合还表明单链BoNT/A-TEV以大于95%的效率被转化成其双链形式。因此,在这些细胞中BoNT/A-TEV和TEV蛋白酶从双重表达构建体的共表达导致BoNT/A-TEV在位于双链环内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成BoNT/A-TEV的双链形式。
C.pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV双重表达构建体的构建
为了确定反转编码BoNT/A-TEV和TEV蛋白酶的开放阅读框的组织是否影响BoNT/A-TEV的产量和裂解功效,制备双重表达构建体,在所述双重表达构建体中,从第一T7启动子的转录起始产生具有编码TEV和BoNT/A-TEV的开放阅读框的mRNA,并且从第二T7启动子的转录起始产生具有仅编码BoNT/A-TEV的开放阅读框的mRNA。因此,与TEV蛋白酶相比较存在多至2倍的编码BoNT/A-TEV的mRNA。
为了构建pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV双重表达构建体,进行2个连续克隆反应。首先,通过PCR从pET29/TEV变体7表达构建体扩增编码TEV变体7(SEQ ID NO:22)的开放阅读框(SEQ ID NO:91)。从扩增中排除编码多组氨酸亲和标签的开放阅读框的5’末端以编码无标签蛋白酶(tag-less protease)。扩增后,在唯一的限制酶切位点上降解PCR产物,通过PCR引物将其并入在PCR产物的末端,使用T4DNA连接酶法将其在双重表达质粒pRSFduet-1(EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI)的MCSI(多克隆位点)中克隆到相应的位点。该中间构建体被称为pRSduet/TEV。然后,利用限制性内切核酸酶降解pET29/BoNT-A/TEV表达构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码BoNT/A-TEV(SEQ ID NO:88)的开放阅读框(SEQ IDNO:87)的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pRSFduet/TEV的MCS2。通过使用T4DNA连接酶法,将BoNT/A-TEV插入物亚克隆到pRSFduet载体的MCS2以产生适当的pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV双重表达构建体。该克隆策略产生pRSFduet双重表达构建体,其中从第一T7启动子转录将产生编码TEV和BoNT/A-TEV的mRNA,从第二T7启动子转录将产生仅编码BoNT/A-TEV的mRNA。
该克隆策略产生pRSFduet双重表达构建体,其中第一T7启动子将转录编码BoNT/A-TEV的开放阅读框,并且第二T7启动子将转录编码TEV蛋白酶的开放阅读框。
D.pET29/BoNT/A-TEV/TEV双重表达构建体的构建
为了测定BoNT/A-TEV产量和从转录单位构型(其中只可从它们自已的独立mRNA产生BoNT/A-TEV和TEV)至双链的转化的效率,构建pET29/BoNT/A-TEV/TEV。为了产生pET29/BoNT/A-TEV/TEV双重表达构建体,将短的合成DNA片段用于将T7终止子位点(SEQID NO:92)并入在双重表达构建体pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV的BoNT/A-TEV与TEV的开放阅读框之间的插入序列中(上文实施例3A)。通过使用T4 DNA连接酶法,这基本上可通过将pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV中的缺乏T7终止子的插入区域与合成DNA片段(该片段包含插入转录和翻译元件以及SEQ ID NO:93的T7终止子位点)交换来实现。所得的双重表达构建体(命名为pET29/BoNT/A-TEV/TEV)包含编码分别从第一和第二T7启动子转录的可操作地连接于羧基末端多组氨酸亲和标签的BoNT/A-TEV变体和TEV蛋白酶的多核苷酸。
E.BoNT/A-TEV的原位激活
除使用包含pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV双重表达构建体、pRSF/TEV/2xBoNT/A-TEV双重表达构建体或pET29/BoNT/A-TEV/TEV双重表达构建体的BL21(DE3)细胞外,基本上如实施例2D中所述在自诱导条件下进行BoNT/A-TEV的双链形式的生长和诱导,将来自这些细胞系的每一个细胞系的单个菌落用于平行接种4个1.0mL的培养物。在生长和诱导后,将4个1.0mL的重复汇集在一起以进行处理。基本上如实施例1B中所述,裂解细胞,进行IMAC纯化,通过SDS-PAGE进行分析,对凝胶进行染色。作为对照,除仅将50μg/mL卡那霉素用作选择试剂外,如上所述生长和诱导仅包含pET29/BoNT/A-TEV的BL21(DE3)细胞。结果表明BoNT/A-TEV以非常接近的水平从包含3种双重表达构建体的任一种的细胞表达;然而,至双链的转化的程度可变化。当从pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV表达蛋白质时,单链BoNT/A-TEV以ca.96%的效率转化成其双链形式,当从pET29/BoNT/A-TEV/TEV表达蛋白质时,单链BoNT/A-TEV以ca.81%的效率转化成其双链形式,以及当从pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV表达蛋白质时,单链BoNT/A-TEV以大于99%的效率转化成其双链形式。
实施例5
使用双重表达构建体进行的包含整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域的蛋白质的细胞内激活
下列实施例举例说明用于纯化和定量包含含有本说明书中公开的外源TEV蛋白酶裂解位点的双链环的任何蛋白质的方法。
A.pRSFduet/TEV/2xNocilHN/A-TEV双重表达构建体的构建
为了构建pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV双重表达构建体,利用限制性内切核酸酶降解pET29/NociLHN/A-TEV表达构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码NociLHN/A-TEV(SEQ ID NO:95)的开放阅读框(SEQ ID NO:94)的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pRSFduet/TEV(在MCSI中包含TEV变体7的pRSFduet-1载体)的MCS2(描述于实施例3C中)。通过使用T4DNA连接酶法,将NociLHN/A-TEV插入物亚克隆到pRSFduet/TEV构建体的MCS2以产生适当的pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV双重表达构建体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pRSFduet双重表达构建体,其中从第一T7启动子转录将产生编码TEV和NociLHN/A-TEV的mRNA,从第二T7启动子转录将产生仅编码NociLHN/A-TEV的mRNA。
B.NociLHN/A-TEV的原位激活
为了在自诱导条件下产生NociLHN/A-TEV的双链形式,用包含pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV双重表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下振荡生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052,并且在37℃下振荡生长8小时,随后在16℃下振荡生长18小时。通过离心沉淀细胞。基本上如实施例2D中所述,裂解细胞,进行IMAC纯化,脱盐,利用阴离子交换层析进行纯化,通过SDS-PAGE进行分析,对凝胶进行染色。作为对照,如上所述生长和诱导仅包含NociLHN/A-TEV的BL21(DE3)细胞。
结果表明当将单独表达时,在还原和非还原条件下都检测到对应于NociLHN/A-TEV的单链的约102kDa的条带。相反地,当将NociLHN/A-TEV与TEV蛋白酶共表达时,在还原条件下观察到两个条带,一个条带约50.8kDa,另一条带约51.3kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,约50.8kDa和约51.3kDa的条带消失,并且观察到约102kDa的新条带。综合起来,这些观察表明在还原条件下看到的约50.8kDa和约51.3kDa的条带分别对应于梭菌毒素酶促结构域和具有连接于其氨基端的痛敏肽靶向部分的梭菌毒素转位结构域。这两个条带的存在表明NociLHN/A-TEV的双链形成,并且还表明单链NociLHN/A-TEV以大于95%的效率被转化成其双链形式。因此,在这些细胞中NociLHN/A-TEV和TEV蛋白酶从双重表达构建体的共表达导致NociLHN/A-TEV在位于整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成NociLHN/A-TEV的双链形式。
C.pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV双重表达构建体的构建
几乎完全如pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV一样产生pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV双重表达构建体。用限制性内切核酸酶降解pET29/DynLHN/A-TEV表达构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码DynLHN/A-TEV(SEQ ID NO:97)的开放阅读框(SEQ IDNO:96)的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pRSFduet/TEV的MCS2(描述于实施例3C中)。通过使用T4DNA连接酶法,将DynLHN/A-TEV插入物亚克隆到pRSFduet/TEV构建体的MCS2以产生适当的pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV双重表达构建体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pRSFduet双重表达构建体,其中从第一T7启动子转录将产生编码TEV和DynLHN/A-TEV的mRNA,从第二T7启动子转录将产生仅编码DynLHN/A-TEV的mRNA。
D.DynLHN/A-TEV的原位激活
为了在自诱导条件下产生NociLHN/A-TEV的双链形式,用包含pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV双重表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下振荡生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052,在37℃下振荡生长8小时,随后在16℃下振荡生长18小时。通过离心沉淀细胞。基本上如实施例2D中所述,裂解细胞,进行IMAC纯化,脱盐,利用阴离子交换层析进行纯化,通过SDS-PAGE进行分析,对凝胶进行染色。作为对照,如上所述生长和诱导仅包含DynLHN/A-TEV的BL21(DE3)细胞。
结果表明当将单独表达时,在还原和非还原条件下都检测到对应于DynLHN/A-TEV的单链的约102kDa的条带。相反地,当将DynLHN/A-TEV与TEV蛋白酶共表达时,在还原条件下观察到两个条带,一个条带约50.8kDa,另一条带约52kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,约50.8kDa和约52kDa的条带消失,并且观察到约102kDa的新条带。综合起来,这些观察表明约50.8kDa的条带对应于梭菌毒素酶促结构域并且约52kDa的条带对应于具有连接于其氨基端的强啡肽靶向部分的梭菌毒素转位结构域。这两个条带的存在表明DynLHN/A-TEV的双链形成,并且还表明单链DynLHN/A-TEV以大于95%的效率被转化成其双链形式。因此,在这些细胞中DynLHN/A-TEV和TEV蛋白酶从双重表达构建体的共表达导致DynLHN/A-TEV在位于整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成DynLHN/A-TEV的双链形式。
实施例6
使用两种不同的表达构建体进行的包含整合的TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的蛋白质的细胞内激活
下列实施例举例说明用于纯化和定量包含含有本说明书中公开的整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域的双链环的任何蛋白质的方法,其中靶蛋白和蛋白酶从独立的质粒表达并且处于不同启动子的控制之下。
A.pET29/GalLHN/A-TEV表达构建体的构建
为了构建pET29/GalLHN/A-TEV表达构建体,首先利用限制性内切核酸酶降解pET29/DynLHN/A-TEV表达构建体,以切除编码包含整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域的双链环的DNA区段。将所得的pET29/LHn/A构架片段与用相容性限制酶切位点(SEQ ID NO:98)括入的合成DNA片段连接,从而包含含有整合的TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域(SEQ ID NO:99)的双链环。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生包含编码GalLHN/A-TEV(SEQ ID NO:101)的开放阅读框(SEQ ID NO:100)的pET29/GalLHN/A-TEV表达构建体,其中GalLHN/A-TEV的表达处于T7启动子的控制之下。
B.pColdIV/TEV表达构建体的构建
为了产生其中TEV处于冷激启动子(csp)的控制之下的表达构建体,利用PCR从pET29/TEV变体7表达构建体扩增编码TEV变体7(SEQ ID NO:22)的开放阅读框(SEQ ID NO:91)。从扩增中排除编码多组氨酸亲和标签的开放阅读框的5’末端以编码无标签蛋白酶(tag-less protease)。扩增后,在唯一的限制酶切位点上降解PCR产物,通过PCR引物将其并入PCR产物的末端,使用T4DNA连接酶法将其在表达质粒pColdIV(Clontech Laboratories,Inc.Madison,WI)的多克隆位点中克隆到相应的位点。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL氨苄青霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生包含编码处于冷激启动子的控制之下的TEV变体7的多核苷酸分子的pColdIV/TEV表达构建体。
C.包含pET29/GalLHN/A-TEV和pColdIV/TEV表达构建体的细胞的构建
为了产生包含pET29/GalLHN/A-TEV和pColdIV/TEV表达构建体的细胞,使用电穿孔将pET29/GalLHN/A-TEV表达构建体转化到包含pColdIV/TEV的电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,将所述细胞涂铺在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将包含两种表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素-卡那霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图进行分析以确定两种构建体的存在。该克隆策略产生包含pET29/GalLHN/A-TEV和pColdIV/TEV表达构建体的细胞。
D.pET29/GalLHN/A的原位激活
为了在自诱导条件下产生GalLHN/A-TEV的双链形式,用包含pET29/GalLHN/A-TEV和pColdIV/TEV表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下在振荡的条件下生长过夜。将约250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的ZYP-5052,在振荡的条件下在37℃下生长8小时,随后在15℃下在振荡的条件下生长18小时。裂解细胞,使用Magne-His树脂进行IMAC纯化。
为了利用Magne-His纯化来纯化双链GalLHN/A-TEV,将来自250mL表达培养物的诱导的细胞重悬浮于16mL由100mM HEPES(pH7.5)、10%v/v甘油、10mM咪唑、1M NaCl组成的冷(4-6℃)IMAC洗涤缓冲液中。将细胞悬浮物转移至密封的大气处理室(sealed-atmosphere treatment chamber)(#101-021-006,BransonUltrasonics Corporation),利用15个脉冲(10秒,30%振幅,0.5英寸的破碎角(disruptor horn))进行超声处理,脉冲之间间隔1分钟(Digital 450,Branson Ultrasonics Corporation)。在超声处理过程中,通过将冷冻的水从循环水浴(3.5℃)通过小室的外套来冷却密封的大气处理室。将超声的材料从处理室转移至干净的Oakridge管,在4℃下以30,500 RCF离心30分钟(SL-50T Rotor,Sorvall;F21S-8X50 Rotor,Piramoon Technologies Inc.)以除去不溶性细胞碎片。利用注射器抽吸澄清的裂解物,首先将其通过0.8μm,随后通过串联的0.45μm注射器式滤器(Sartorius)进入干净的50mL锥形管。将Magne-HisTM蛋白质纯化树脂(Promega Corp.,Madison,WI)涡旋至均匀悬浮液,将4mL悬浮液转移至澄清的裂解物中。密封管,颠倒数次以充分混合颗粒。将混合物在16℃轻轻振动下孵育30分钟以结合靶蛋白。将管转移至MagneSil磁性分离单位(Promega Corp.,Madison,WI),使其捕获树脂颗粒约2分钟。除去上清液,从分离单位取出管。随后将树脂重悬浮于10mL IMAC洗涤缓冲液中,将其捕获在磁性分离单位上,随后除去洗涤缓冲液。再重复洗涤步骤2次。为了洗脱靶蛋白,将树脂重悬浮于在室温下孵育了2分钟的5mLMagne-HisTM洗脱缓冲液(100mM HEPES(pH 7.5)、500mM咪唑)中,将树脂捕获在磁性分离单位上,将上清液转移至新管。再重复洗脱步骤1次。
为了透析IMAC-纯化的GalLHN/A-TEV以进行次级离子交换层析,在恒定搅拌的条件下将汇集的洗脱级分在配备有25kD MWCO膜的中在4℃下于1L的脱盐缓冲液(缓冲液A:50mM Tris-HCl,pH 8.0)中透析过夜。
为了利用阴离子交换层析纯化双链GalLHN/A-TEV,将脱盐蛋白质溶液以1mL/分钟的流速加载至用缓冲液A预平衡的1mLUNO-Q1阴离子交换柱。如下以1mL/分钟的流速利用NaCl梯度(使用包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1M NaCl的的缓冲液B)洗脱结合的蛋白质:7%的缓冲液B进行3mL,15%的缓冲液B进行7mL,在进行的10mL中从10%的缓冲液B变化至50%的缓冲液B。利用紫外光可见检测器在214nm、260nm和280nm处检测蛋白质从柱子的洗脱,将所有峰值级分汇集,测定蛋白质浓度。将等分在液氮中快速冷冻并且于-80℃下贮存。基本上如实施例1B中所述,通过SDS-PAGE分析纯化的BoNT/A-TEV蛋白,进行凝胶染色。
结果表明当将GalLHN/A-TEV与TEV蛋白酶共表达时,在还原条件下观察到两条几乎重叠的条带,一个条带约51.1kDa,另一条带约52.1kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,两条约51.1kDa和52.1kDa的条带消失,并且观察到约103kDa的新条带。综合起来,这些观察表明约51.1kDa的条带对应于梭菌毒素酶促结构域并且约52.1kDa的条带对应于具有连接于其氨基端的甘丙肽靶向部分的梭菌毒素转位结构域。这两个条带的存在表明GalLHN/A-TEV的双链形成,并且还表明单链GalLHN/A-TEV以接近90%的效率被转化成其双链形式。因此,在这些细胞中GalLHN/A-TEV和TEV蛋白酶从独立的质粒的共表达导致GalLHN/A-TEV在位于整合的TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成GalLHN/A-TEV的双链形式。
实施例7:
使用双重表达构建体进行的包含整合的TEV蛋白酶裂解位点-甘丙肽结合结构域的蛋白质的预测的细胞内激活
下列实施例举例说明用于纯化和定量包含含有本说明书中公开的整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域的双链环的任何蛋白质的方法,其中靶蛋白和蛋白酶从双重表达质粒表达。
A.pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV双重表达构建体的构建
为了构建与先前构建的pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV和pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV相似的pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV双重表达构建体(参见实施例4),利用限制性内切核酸酶降解pET29/GalLHN/A-TEV表达构建体,所述内切核酸酶1)切除包含编码GalLHN/A-TEV(SEQ ID NO:101)的开放阅读框(SEQ ID NO:100)的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pRSFduet/TEV(在MCSI中包含TEV变体7的pRSFduet-1载体)的MCS2(描述于实施例3C中)。通过使用T4DNA连接酶法,将GalLHN/A-TEV插入物亚克隆到pRSFduet/TEV构建体的MCS2中以产生pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV双重表达构建体。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,并且置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗卡那霉素菌落,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来确认所述候选构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pRSFduet双重表达构建体,其中从第一T7启动子转录将产生编码TEV和GalLHN/A-TEV的mRNA,从第二T7启动子转录将产生仅编码GalLHN/A-TEV的mRNA。
B.GalLHN/A-TEV的原位激活
为了在自诱导条件下产生GalLHN/A-TEV的双链形式,用包含pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV双重表达构建体的BL21(DE3)细胞的单个菌落接种3.0mL的包含50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基,使细胞在37℃下在振荡的条件下生长过夜。将250μL的该起始培养物用于接种250mL包含50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052,在振荡的条件下在37℃下生长8小时,随后在16℃下在振荡的条件下生长18小时。如实施例5D中所述,通过离心沉淀细胞,裂解细胞,进行IMAC纯化,脱盐,利用阴离子交换层析进行纯化。基本上如实施例1B中所述,在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析纯化的靶蛋白,并且对凝胶进行染色以评估表达水平以及从pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV双重表达构建体产生的GalLHN/A-TEV转化成其双链形式的程度。
实施例8
在BEVS中使用双重表达构建体细胞内激活包含整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域的蛋白质
下列实施例举例说明用于纯化和定量包含含有本说明书中公开的整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域的双链环的任何蛋白质的方法,其中靶蛋白和蛋白酶在双重表达构建体中共表达并且处于杆状病毒表达载体系统(BEVS)的两个独立启动子的控制之下。
A.pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV双重表达构建体的构建
为了构建pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV双重表达构建体,使用标准方法(BlueHeron Biotechnology,Bothell,WA)合成以相反取向编码p10启动子序列下游的重组TEV变体7和polH启动子序列的下游的DynLHn/A-TEV的合成片段(SEQ ID NO:107)。使用标准亚磷酰胺合成法合成长度为20至50个碱基的互补寡核苷酸。将这些寡核苷酸杂交成双链的双链体,所述双链体随后被连接在一起以装配全长多核苷酸分子。使用标准分子生物学方法将该多核苷酸分子在SmaI位点上克隆到pUCBHB1运载载体以产生pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV质粒。使用BIG DYETERMINATORTM Chemistry 3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)和ABI 3100测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过测序验证合成的多核苷酸分子。
为了产生pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV双重表达构建体,利用限制性内切核酸酶降解pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV,所述内切核酸酶1)切除包含处于P10启动子的控制之下的TEV变体7和以相反方向处于polH启动子的控制之下的DynLHN/A-TEV的完整编码区的插入物;和2)使得该插入物能够可操作地连接于pBAC-6转移载体(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。通过使用T4DNA连接酶法,将该插入物亚克隆到用类似限制性内切核酸酶降解的pBAC-6转移载体以产生工程化的pBAC-6双重表达构建体(该构建体包含位于p10启动子的下游的TEV蛋白酶变体7的开放阅读框和位于polH启动子的DynLHN/A-TEV下游的第二开放阅读框)。通过电穿孔将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中,将所述细胞涂铺在含有100μg/mL氨苄青霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂糖板(pH 7.0)上,将板置于37℃的培养箱中进行过夜生长。将含有表达构建体的细菌鉴定为抗氨苄青霉素菌落。使用碱性裂解质粒少量制备法分离候选构建体,通过限制性内切核酸酶降解作图和对两条DNA链测序来分析所述构建体以确认插入物的存在和完整性。该克隆策略产生pBAC-6双重表达构建体,该构建体包含编码可操作地连接于羧基末端多组氨酸亲和纯化标签的DynLH/A-TEV和TEV蛋白酶的多核苷酸分子。
B.高滴度TEV/DynLHN/A-TEV重组杆状病毒原种的产生
在可产生DynLHN/A-TEV的双链形式之前,产生包含TEV/DynLHN/A-TEV的高滴度重组杆状病毒原种。将约2x106Sf9的昆虫细胞于2mL体积的昆虫细胞培养基ESF921中接种在35mm培养皿中。通过将溶液A(包含2μg的pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV,0.5μg的线性化的flashBAC杆状病毒DNA(Oxford Expression Technologies,Oxford,UK)和100μL转染介质)与溶液B(包含6μL的-2020转染剂和100μL的转染介质)混合来制备转染溶液,将其在室温下孵育30分钟。随后将额外的800μL转染介质添加至溶液A/B混合物,轻轻混合,将其逐滴添加至细胞中。将细胞在28℃下孵育5小时,最后添加3mL ESF 921以使每一个孔中的终体积达到4mL。在28℃下继续孵育4-5天以产生P0重组病毒。为了产生更高滴度的P1重组杆状病毒种子原种,使用baculoQUANT(OxfordExpression Technologies,Oxford,UK)滴定从P0上清液分离的病毒,将其在摇瓶中进一步扩增。用P0病毒以小于1pfu/细胞的MOI(感染复数)感染密度为2x106个细胞/mL的约100-200mL的Sf9细胞,在振荡的条件下将其孵育4-5天。定量后,将高滴度P1原种用于感染Tni细胞以进行高水平蛋白质表达。
C.DynLHN/A-TEV的原位激活
为了产生DynHN/A-TEV的双链形式,用包含TEV/DynLHN/A-TEV的重组P1病毒原种以为5的MOI感染50mL浓度为1x106/mL的Tni细胞,感染后(pi)3天收获细胞。裂解细胞,使用Magne-His树脂进行IMAC纯化。
为了利用Magne-His纯化来纯化双链DynLHN/A-TEV,在100μLInsect PopCulture试剂和20μL(10U)Benzonase核酸酶存在的情况下将细胞沉淀重悬浮于20mL的PBSw/o Ca2+或Mg2+中,轻轻混合,在室温下孵育15分钟。在通过在4℃下以16,000rpm离心15分钟澄清细胞裂解物后,将上清液与4mL均匀悬浮的Magne-HisTM蛋白质纯化树脂(Promega Corp.,Madison,WI)混合。在轻轻振荡的情况下将混合物在室温下孵育20分钟以结合靶蛋白。将管转移至MagneSil磁性分离单位进行约2分钟以使得能够捕获树脂颗粒。在除去上清液后,将管从分离单位取出,将树脂重悬浮于10mL IMAC洗涤缓冲液。再次地,将树脂捕获在磁性分离单位上,除去洗涤缓冲液。再重复洗涤步骤2次。为了洗脱靶蛋白,将树脂重悬浮于2.5mL Magne-HisTM洗脱缓冲液(100mM HEPES(pH 7.5)、500mM咪唑),于室温下孵育2分钟,树脂被捕获在磁性分离单位上,将上清液转移至新管。再次重复洗脱步骤以使靶从磁性树脂的回收最大化。
为了透析IMAC-纯化的DynLHN/A-TEV以进行次级离子交换层析,在恒定搅拌的条件下将汇集的洗脱级分在配备有25kD MWCO膜的中在4℃下于1L的脱盐缓冲液(缓冲液A:50mM Tris-HCl,pH 8.0)中透析过夜。
为了利用阴离子交换层析纯化双链DynLHN/A-TEV,将脱盐蛋白质溶液以1mL/分钟的流速加载至用缓冲液A预平衡的1mL UNO-Q1阴离子交换柱。如下以1mL/分钟的流速利用NaCl梯度(使用包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1M NaCl的的缓冲液B)洗脱结合的蛋白质:7%的缓冲液B进行3mL,15%的缓冲液B进行7mL,在进行的10mL中从10%的缓冲液B变化至50%的缓冲液B。利用紫外光可见检测器在214nm、260nm和280nm处检测蛋白质从柱子的洗脱,将所有峰值级分汇集,测定蛋白质浓度。将等分于-20℃下贮存。基本上如实施例1B中所述,通过SDS-PAGE分析纯化的DynLHN/A-TEV蛋白,进行凝胶染色。
结果表明当将DynLHN/A-TEV与TEV蛋白酶在昆虫细胞中共表达并且纯化至接近均一时,在还原条件下观察到两条几乎重叠的条带,一个条带约51 kDa,另一条带约52 kDa。此外,当在非还原条件下运行相同的样品时,两条约50 kDa和52 kDa的条带消失,并且观察到约102 kDa的新条带。综合起来,这些观察表明约51 kDa的条带对应于梭菌毒素酶促结构域并且约52 kDa的条带对应于具有连接于其氨基端的强啡肽靶向部分的梭菌毒素转位结构域。这两个条带的存在表明DynLHN/A-TEV的双链形成,并且还表明单链DynLHN/A-TEV以80-90%的效率被转化成其双链形式。因此,DynLHN/A-TEV和TEV蛋白酶在用从pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV双重表达构建体产生的TEV/DynLHN/A-TEV重组杆状病毒感染的昆虫细胞中的共表达导致DynLHN/A-TEV在位于整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上被裂解,以及随后形成DynLHN/A-TEV的双链形式。
虽然已参考公开的实施方案描述了本发明的方面,但本领域技术人员将容易地理解,公开的具体的实施例仅举例说明这些方面并且决不限制本发明。可在不背离本发明的精神的情况下进行各种变动。
Claims (13)
1.一种将包含双链环区域的单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长3.5小时,所述双重表达构建体包含:
i)编码单链梭菌毒素的开放阅读框,所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;和
ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;
b)将所述细胞在22℃下生长16至18小时,
其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链梭菌毒素和TEV蛋白酶从所述双重表达构建体的表达;以及
其中所述产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链梭菌毒素,从而将所述单链梭菌毒素转化成其双链形式;
其中所述TEV蛋白酶选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:84所示的蛋白酶。
2.权利要求1所述的细胞内方法,其中所述单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素转位结构域和所述梭菌毒素结合结构域;2)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域;3)所述梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素酶促结构域;4)所述梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素转位结构域;5)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素结合结构域;或6)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。
3.权利要求1所述的细胞内方法,其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
4.权利要求1所述的细胞内方法,其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
5.权利要求1所述的细胞内方法,其中所述梭菌毒素结合结构域为BoNT/A结合结构域、BoNT/B结合结构域、BoNT/C1结合结构域、BoNT/D结合结构域、BoNT/E结合结构域、BoNT/F结合结构域、BoNT/G结合结构域、TeNT结合结构域、BaNT结合结构域或BuNT结合结构域。
6.一种将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长8小时,所述双重表达构建体包含;
i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域;和
ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;
b)将所述细胞在12至16℃下生长16至18小时,
其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链蛋白质和所述TEV蛋白酶从所述双重表达构建体表达;和
其中所述产生的TEV蛋白酶在位于所述整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链蛋白质,从而将所述单链蛋白质转化成其双链形式;
其中所述TEV蛋白酶选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:84所示的蛋白酶。
7.权利要求6所述的细胞内方法,其中所述蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)所述梭菌毒素酶促结构域、所述梭菌毒素转位结构域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域,2)所述梭菌毒素酶促结构域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域,3)所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域和所述梭菌毒素酶促结构域,4)所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素转位结构域,5)所述梭菌毒素转位结构域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域;或6)所述梭菌毒素转位结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域。
8.权利要求6所述的细胞内方法,其中所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域为整合的TEV蛋白酶裂解位点-痛敏肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-脑啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-BAM22结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内吗啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内啡肽结合结构域区域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-血衍吗啡素结合结构域或整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽B(rimorphin)结合结构域。
9.一种将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法,所述方法包括步骤:
a)将包含双重表达构建体的细胞在37℃下生长8小时,所述双重表达构建体包含;
i)编码单链蛋白质的开放阅读框,所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域;和
ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框;
b)将所述细胞在12至16℃下生长16至18小时,
其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链蛋白质和所述TEV蛋白酶从所述双重表达构建体表达;和
其中所述产生的TEV蛋白酶在位于所述双链环区域的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链蛋白质,从而将所述单链蛋白质转化成其双链形式;
其中所述TEV蛋白酶选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:84所示的蛋白酶。
10.权利要求9所述的细胞内方法,其中所述单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序:1)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素转位结构域和所述非-梭菌毒素结合结构域;2)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述非-梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域;3)所述非-梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素酶促结构域;4)所述非-梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素转位结构域;5)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述非-梭菌毒素结合结构域;或6)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述非-梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。
11.权利要求9所述的细胞内方法,其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
12.权利要求9所述的细胞内方法,其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
13.权利要求9所述的细胞内方法,其中所述非-梭菌毒素结合结构域为阿片样物质肽结合结构域、黑皮质素肽结合结构域、甘丙肽肽结合结构域、鸟尿素(granin)肽结合结构域、速激肽结合结构域、神经肽Y相关肽结合结构域、神经激素肽结合结构域、细胞因子肽结合结构域、激肽结合结构域、成纤维细胞生长因子肽结合结构域、神经营养因子肽结合结构域、肿瘤坏死因子肽结合结构域、胶质细胞源性神经营养因子肽结合结构域、转化生长因子β肽结合结构域、骨形态发生蛋白肽结合结构域、生长和分化因子肽结合结构域、激活蛋白肽结合结构域、血管内皮生长因子肽结合结构域、胰岛素生长因子肽结合结构域、表皮生长因子肽结合结构域、高血糖素样激素肽结合结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽结合结构域、生长激素释放激素肽结合结构域、血管活性肠肽结合结构域、肠抑胃肽结合结构域、降钙素-相关肽脑肠肽结合结构域或蛋白酶激活受体肽结合结构域。
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