JP2016164205A - 単鎖タンパク質をそれらの２鎖形態に細胞内変換する方法 - Google Patents

単鎖タンパク質をそれらの２鎖形態に細胞内変換する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】単鎖タンパク質をそれらの２鎖形態に細胞内変換する方法を提供するすること。【解決手段】本明細書は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質及び二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを含む発現構築体、そのような発現構築体を含む細胞組成物、及び単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法を開示する。【選択図】なし

Description

本特許出願は、米国特許法第１１９（ｅ）に基づき、２０１０年１月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／２８６，９６３号の優先権を主張するものであり、それは、参照により全体が組み込まれる。
例えば、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇ等のクロストリジウム毒素及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）が、ニューロン伝送を阻害する能力は、多種多様な治療用及び化粧用応用において探求されている。例えば、William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin （Slack, Inc., 2004）を参照されたい。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素には、以下のものが含まれる：例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．社製、アービン、カリフォルニア州）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）/ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）（Ｂｅａｕｆｏｕｒ Ｉｐｓｅｎ社製、ポートンダウン：英国）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）（Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ，Ｉｎｃ．社製、Ｏｃｈａｎｇ−ｍｙｅｏｎ、韓国）ＢＴＸ−Ａ（Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、中国）及びＸＥＯＭＩＮ（登録商標）（Ｍｅｒｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＧｍｂＨ．社製、フランクフルト、ドイツ）等のＢｏＮＴ／Ａ調製物；及び例えば、ＭＹＯＢＬＯＣ（商標）／ＮＥＵＲＯＢＬＯＣ（商標）（Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製、サンフランシスコ、カリフォルニア州）等のＢｏＮＴ／Ｂ調製物。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、現在、以下の適用について１つ又は複数の国で承認されている：アカラシア、成人痙性、肛門裂傷、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、頚部ジストニー、本態性振戦、眉間しわ又は多動性顔面しわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、間代性筋痙攣障害、鼻唇しわ、痙攣性発声障害、斜視、及びＶＩＩ神経障害。
クロストリジウム（Clostrdial）毒素の治療有用性は、例えば、種々の種類の慢性疼痛、神経原性炎症、及び泌尿生殖器障害（urogentital disorder）等の知覚神経性の疾患、並びに例えば膵炎等の非ニューロン性の疾患を治療するために、それらの現行の骨格筋弛緩薬応用を超えて拡張されている。クロストリジウム毒素に基づく療法を拡張するために現在探求されている１つの手法は、修飾毒素が非クロストリジウム毒素標的細胞に対する変更された細胞標的化能力を有するように、クロストリジウム毒素を修飾することである。この再標的化能力は、クロストリジウム毒素の天然標的化ドメインを、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して選択的結合活性を示す標的化ドメインに置換することにより達成される。標的化ドメインに対するそのような修飾は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体（標的受容体）に選択的に結合することができる（再標的化）修飾毒素をもたらす。非クロストリジウム毒素標的細胞に対する標的化活性を有する再標的化クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する受容体に結合し、細胞質に移行し、非クロストリジウム毒素標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体に対して、そのタンパク質分解効果を及ぼすことができる。
非クロストリジウム毒素標的細胞に対する標的活性を有する再標的化クロストリジウム毒素の非限定的な例は、以下の文献に記載されている：例えば、Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions、米国特許第５，９８９，５４５号；Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments、米国特許第６，４６１，６１７号；Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain、米国特許第６，５００，４３６号；Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion、米国特許第６，６３２，４４０号；Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis、米国特許第6,843,998号；J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許第７，４１９，６７６号；Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use、米国特許第７，５１４，０８８号；Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells、米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９；及びKeith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates、国際公開第２００５／０２３３０９号。クロストリジウム毒素に伴う治療効果を再標的化する能力は、クロストリジウム毒素療法を使用することができる医学的応用の数を大きく拡大させている。非限定的な例として、感覚ニューロンに再標的化された修飾クロストリジウム毒素は、例えば痛覚過敏及び異痛症、神経障害性疼痛及び炎症性疼痛等の種々の慢性疼痛の治療に有用である。例えば、Foster、上記（１９９９年）；及びDonovan、上記（２００２年）；及びStephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components、米国特許第７，０２２，３２９号を参照されたい。別の非限定的な例として、膵細胞に再標的化された修飾クロストリジウム毒素は、膵炎の治療に有用である。例えば、Steward、上記（２００５年）を参照されたい。
クロストリジウム毒素は、天然か又は修飾かに関わらず、完全な活性を達成するために二鎖形態にプロセシングされる。天然クロストリジウム毒素は各々、およそ１５０ｋＤａの単鎖ポリペプチドとして翻訳され、これは、その後天然プロテアーゼによるジスルフィドループ内でのタンパク質分解切断により切断される（図１）。この切断は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基間に生成されている個別の二鎖ループ領域内で生じる。この翻訳後プロセシングにより、酵素ドメインを含むおよそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）、及び移行及び細胞結合ドメインを含むおよそ１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣ及びＨＣが単一ジスルフィド結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持されている二鎖状分子が産出される（図１）。組換え的に産生されるクロストリジウム毒素では、一般的に、天然二鎖ループプロテアーゼ切断部位が、外来性プロテアーゼ切断部位に置換されている（図２）。例えば、参照により本明細書に組み込まれるDolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許第７，４１９，６７６号を参照されたい。再標的化クロストリジウム毒素は、それらの全体的分子量が、標的化部分のサイズにより様々であるが、活性化プロセス及び外来性切断部位に対するその依存性は、組換え的に産生されたクロストリジウム毒素のものと本質的に同じである。例えば、Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許出願公開第２００９／０００５３１３号；Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells、米国特許出願第１１／７７６，０７５号；Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells、米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号を参照されたい。これら文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
現在まで、単鎖形態の組換え的に産生されたクロストリジウム毒素又は修飾クロストリジウム毒素のその二鎖形態への変換には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化プロセスが必要とされている。第１に、これら毒素を組換え的に産生するのに使用される細菌細胞は、天然毒素を産生するクロストリジウム菌株に存在する天然プロテアーゼを欠如している。第２に、活性化毒素の取扱いで問題となる安全性に対する懸念があるため、活性化毒素を組換え的産生する細菌細胞に対する必要性は大きくなかった。例えば、Dolly、米国特許第７，４１９，６７６号、上記（２００８年）を参照されたい。しかしながら、これらの懸念を克服することができれば、組換え的に産生された活性化された毒素の産生は、組換え的に産生されたクロストリジウム毒素又は修飾クロストリジウム毒素の製造プロセスを能率的にするだろう。例えば、現在、組換え的に産生されたクロストリジウム毒素又は修飾クロストリジウム毒素の製造は、以下の精製ステップを含む：１）固定化金属親和性クロマトグラフィー、２）緩衝液交換透析、３）プロテアーゼ切断反応、４）イオン交換クロマトグラフィー、並びに５）ＰＥＧの添加及び−８０℃で保管するための瞬間冷凍。組換えクロストリジウム毒素を細胞内でタンパク質分解的に切断することができ、その一方で依然として毒素を発現している細菌細胞の使用は、精製ステップの数を以下のように減らすことができる：１）金属親和性クロマトグラフィー、２）緩衝液交換透析、３）イオン交換クロマトグラフィー、並びに４）ＰＥＧの添加及び−８０℃で保管するための瞬間冷凍。
本明細書は、単鎖形態の毒素をその二鎖形態に変換するためのｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスに依存しない、二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を開示する。これは、そのタンパク質及びそれを活性二鎖に変換するために必要なプロテアーゼを両方とも発現する細胞を使用することにより達成される。
したがって、本明細書の態様は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び二鎖ループ領域に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク質分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む二重発現構築体を提供する。更なる態様では、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質は、例えば、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む修飾クロストリジウム毒素、又はクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質であってもよい。ポリヌクレオチド、並びにそれらがコードする外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素は、例えば、Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許第７，１３２，２５９号；Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許第７，４１９，６７６号に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド、並びにそれらがコードするクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質は、下記の文献に記載されている：例えば、Steward, L.E. et al., Multivalent Clostridial Toxins、米国特許出願公開第２００９／００４８４３１号；Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許出願公開第２００９／００６９２３８号；Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells、米国特許出願第１１／７７６，０７５号；Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells、米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号；Foster, K.A. et al., Fusion Proteins、米国特許第出願公開第２００９／００３５８２２号；Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates、米国特許出願公開第２００９／０１６２３４１号；Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許出願公開第２００８／００３２９３１号；Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates、米国特許出願公開第２００８／０１８７９６０号；Steward, L.E. et al., Degradable Clostridial Toxins、米国特許出願公開第２００８／０２１３８３０号；Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells、米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号；Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins、米国特許第７，４１９，６７６号；及び併願特許出願Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain、代理人整理番号１８４６８ＰＲＯＶ（ＢＯＴ）、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書の他の態様は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び二鎖ループ領域に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク質分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む二重発現構築体を含む細胞を提供する。更なる態様では、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質は、例えば、本明細書に開示されているような、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む修飾クロストリジウム毒素、又はクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質であってもよい。
本明細書の更に他の態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）最大細胞密度を達成するために、二重発現構築体を含む細胞を第１の温度である期間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームからのタンパク質発現の最大誘導を達成するために、第２の温度である期間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更に他の態様は、単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）二重発現構築体を含む細胞を３７℃で約２〜約３．５時間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）２２℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖クロストリジウム毒素及びプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）二重発現構築体を含む細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）約１２〜約１６℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）二重発現構築体を含む細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）約２０〜約２４℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書のなお更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）二重発現構築体を含む細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）約１２〜約１６℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書のなお更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）二重発現構築体を含む細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、二重発現構築体が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ；ｂ）約２０〜約２４℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の他の態様は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体を提供する。更なる態様では、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質は、例えば、本明細書に開示されているような、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む修飾クロストリジウム毒素、又はクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質であってもよい。
本明細書の他の態様は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質の二鎖ループ領域に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク質分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体を提供する。
本明細書の他の態様は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質の二鎖ループ領域に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク質分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含む細胞を提供する。更なる態様では、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質は、例えば、本明細書に開示されているような、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む修飾クロストリジウム毒素、又はクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質であってもよい。
本明細書の更に他の態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、ａ）ｉ）外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質の二鎖ループ領域に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含む細胞を増殖させるステップ；ｂ）単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームからのタンパク質発現の最大誘導を達成するために、ある期間第２の温度で細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖タンパク質及びプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更に他の態様は、単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）細胞を３７℃で約２〜約３．５時間増殖させ、細胞が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質の二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位をタンパク分解的に切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含むステップ；ｂ）２２℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖クロストリジウム毒素及びプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、細胞が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含むステップ；ｂ）約１２〜約１６℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書の更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、細胞が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含むステップ；ｂ）約２０〜約２４℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書のなお更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、細胞が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含むステップ；ｂ）約１２〜約１６℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
本明細書のなお更なる態様は、単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、（ａ）細胞を３７℃で約２〜約８時間増殖させ、細胞が、ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む発現構築体、及びｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む別の発現構築体を含むステップ；ｂ）約２０〜約２４℃で約１６〜約１８時間、細胞を増殖させるステップを含み、ステップ（ｂ）の増殖が、発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法を提供する。
天然クロストリジウム毒素のドメイン構成を示す図である。単鎖形態は、酵素ドメイン、移行ドメイン、及びＨＣ結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルの線形構成を示す。移行ドメイン及び酵素ドメイン間に位置する二鎖ループ領域は、２重ＳＳブラケットにより示されている。この領域は、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ又は環境内で産生される天然プロテアーゼ等の天然プロテアーゼによるタンパク質分解性切断時に、単鎖形態の毒素を二鎖形態に変換する内因性二鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。
中枢及び末梢ニューロンでの神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現行枠組みの模式図を示す図である。図２ａは、中枢及び末梢ニューロンの神経伝達物質放出機序の模式図を示す。放出プロセスは、２つのステップを含むと説明することができる：１）小胞ドッキング、そこでは、神経伝達物質分子を含有する小胞の小胞結合型ＳＮＡＲＥタンパク質が、原形質膜に位置する膜結合型ＳＮＡＲＥタンパク質と結合する；及び２）神経伝達物質放出、そこでは、小胞が原形質膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされる。 中枢及び末梢ニューロンでの神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現行枠組みの模式図を示す図である。図２ｂは、中枢及び末梢ニューロンでの破傷風及びボツリヌス毒素活性の中毒機序の模式図を示す。この中毒プロセスは、４つのステップを含むと説明することができる：１）受容体結合、そこでは、クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体系に結合し、中毒プロセスを開始する；２）複合体の内部移行、そこでは、毒素結合の後、毒素／受容体系複合体を含有する小胞が、細胞にエンドサイトーシスされる；３）軽鎖移行、そこでは、例えば、小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャネル孔の形成、クロストリジウム毒素軽鎖と重鎖との分離、及び活性軽鎖の放出等の複数の事象が生じると考えられている；及び４）酵素的標的修飾、そこでは、クロストリジウム毒素の活性軽鎖（activate light chain）が、例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、又はシンタキシン等のその標的ＳＮＡＲＥ基質をタンパク分解的に切断し、それにより小胞ドッキング及び神経伝達物質放出が阻止される。
クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウム・バラティイ（Clostridium baratii）、及びクロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）により産生されるクロストリジウム毒素が、ヒト及び他の哺乳動物の治療的及び化粧的処置に最も広く使用されている。Ｃ．ボツリヌスの菌株は、７つの抗原的に異なるタイプのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を産生し、それらは、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ、及び／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）のボツリヌス中毒発生を研究することにより同定されているか、又は土壌から単離されている（ＢｏＮＴ／Ｇ）。ＢｏＮＴは、互いにおよそ３５％のアミノ酸同一性を有し、同じ機能的ドメイン構成及び全体的構造様式を共有する。各タイプのクロストリジウム毒素内には、それらのアミノ酸配列、及びまたそれらタンパク質をコードする核酸が多少異なるサブタイプが存在し得ることが、当業者により認識されている。例えば、現在、４つのＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、及びＢｏＮＴ／Ａ４があり、特定のサブタイプは、別のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較して、およそ８９％のアミノ酸同一性を示す。７つのＢｏＮＴ血清型は全て、同様の構造及び薬理学的特性を有するが、各々は異なる細菌学的特徴も示す。対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は、Ｃ．テタニの均一な群により産出される。２つの他のクロストリジウム種である、Ｃ．バラティイ及びＣ．ブチリクムは、毒素ＢａＮＴ及びＢｕＮＴを産生し、それらは、それぞれＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｅに類似している。
各成熟二鎖分子は、以下の３つの機能的に別個のドメインを含む：１）神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン；２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を容易にするＨＣのアミノ末端半分内に含まれる移行ドメイン（ＨＮ）；及び３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体に対する毒素の結合活性及び結合特異性を決定するＨＣのカルボキシル末端半分内に見出される結合ドメイン（ＨＣ）。ＨＣドメインは、機能を示し、ＨＣＮ及びＨＣＣサブドメインと称されるほぼ等しいサイズの２つの別個の構造的特徴を含む。表１は、例示的なクロストリジウム毒素に見出される各ドメインのおおよその境界領域を示す。
表１．クロストリジウム毒素基準配列及び領域
Figure 2016164205
これら３つの機能的ドメインの結合、移行、及び酵素活性は、全て毒性に必要である。このプロセスの全詳細はまだ正確には知られていないが、それによりクロストリジウム毒素がニューロンに進入し、神経伝達物質放出を阻害する全体的な細胞中毒機序は、血清型又はサブタイプに関わらず類似している。本出願人らは、以下の記述により制限されることは望まないが、中毒機序は、少なくとも４つのステップを含むと説明することができる：１）受容体結合、２）複合体内部移行、３）軽鎖移行、及び４）酵素的標的修飾（図３）。このプロセスは、クロストリジウム毒素のＨＣドメインが、標的細胞の原形質膜表面に位置する毒素特異的受容体系に結合すると、開始される。受容体複合体の結合特異性は、部分的には、ガングリオシドと、各クロストリジウム毒素受容体複合体を個別に含むと考えられるタンパク質受容体との特定の組み合わせにより達成されると考えられている。毒素／受容体複合体は、結合すると、エンドサイトーシスにより内部移行化され、内部移行化された小胞は、特定の細胞内経路に区分けされる。移行ステップは、小胞区画の酸性化が引き金となって起きると考えられる。このプロセスは、疎水性を増加させ、二鎖形態の毒素の形成を容易にする２つの重要なｐＨ依存性構造的再編成を開始させると考えられる。毒素の軽鎖エンドペプチダーゼは、活性化されると、細胞内小胞からサイトゾルに放出され、神経伝達物質放出装置の３つの既知のコア成分のうちの１つを特異的に標的とすると考えられる。これらコアタンパク質である、小胞結合型膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム結合タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）、及びシンタキシンは、神経終末でのシナプス小胞ドッキング及び融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子結合タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、ＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端領域で切断して、それぞれ９個又は２６個アミノ酸のセグメントを放出し、ＢｏＮＴ／Ｃ１も、カルボキシル末端付近でＳＮＡＰ−２５を切断する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇ、及び破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中央部分に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分をサイトゾルに放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、サイトゾル膜表面付近の単一部位でシンタキシンを切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解は、クロストリジウム毒素によりｉｎ ｖｉｖｏで引き起こされる神経伝達物質放出の阻止を説明する。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、様々な非ニューロン型でのエキソサイトーシスに共通しており、これら細胞では、ニューロンでのように、軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000)；Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002)；Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)を参照されたい。
本発明の態様では、修飾クロストリジウム毒素は、部分的には、単鎖修飾クロストリジウム毒素及び二鎖修飾クロストリジウム毒素を含む。上で考察されているように、クロストリジウム毒素は、天然か又は非天然かに関わらず、まず単鎖ポリペプチドとして合成される。この単鎖形態は、その後、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基間に生成される個別の二鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位で、プロテアーゼにより切断される。この翻訳後プロセシングにより、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖を含む二鎖分子が産出される。本明細書で使用される場合、用語「二鎖ループ領域」は、ＬＣドメイン及びＨＣドメイン間に位置するジスルフィド架橋により形成された天然又は非天然クロストリジウム毒素のループ領域を指す。本明細書で使用される場合、用語「単鎖修飾クロストリジウム毒素」は、その単鎖形態にある、つまり毒素が、その同族プロテアーゼにより、二鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位で切断されていない、本明細書で開示される任意の修飾クロストリジウム毒素を指す。本明細書で使用される場合、用語「二鎖修飾クロストリジウム毒素」は、その二鎖形態にある、つまり毒素が、その同族プロテアーゼにより、二鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位で切断されている、本明細書で開示される任意の修飾クロストリジウム毒素を指す。
本発明の態様は、部分的には、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド分子」は、「核酸分子」と同義であり、例えば、任意の長さのリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド等の、ヌクレオチドのポリマー形態を意味する。有用なポリヌクレオチド分子には、限定ではないが、天然及び非天然ＤＮＡ分子並びに天然及び非天然ＲＮＡ分子が含まれる。天然及び非天然ＤＮＡ分子の非限定的な例には、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、例えばプラスミド構築体、ファージミド構築体、バクテリオファージ構築体、レトロウイルス構築体、及び人工染色体構築体等のベクター構築体が含まれる。天然及び非天然ＲＮＡ分子の非限定的な例には、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、及びｍＲＮＡが含まれる。
本明細書で開示される修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を製作するために必要である場合がある十分に確立された分子生物学的技術には、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定、及び組換えに基づく技術を含む手順が含まれ、それらは日常的であり、当業者の範囲内にある、本明細書の教示に由来する。修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を製作するために必要な特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、上記（２００１年）；及びCurrent Protocols in Molecular Biology（Frederick M Ausubel et al., eds. John Wiley ＆ Sons, 2004）に記載されている。加えて、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を製作するために有用な様々な市販製品が、広く入手可能である。これらプロトコールは、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
本明細書で開示される方法は、部分的には、オープンリーディングフレームを含む。本明細書で使用される場合、用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と同義であり、タンパク質又はタンパク質の部分をコードする任意のポリヌクレオチド分子を意味する。オープンリーディングフレームは、通常、開始コドン（例えば、標準的コードでは、ＲＮＡ分子の場合はＡＵＧであり、ＤＮＡ分子ではＡＴＧである）から始まり、フレームが終止コドン（例えば、標準的コードでは、ＲＮＡ分子の場合はＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧであり、ＤＮＡ分子ではＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧである）で終わるまで、コドントリプレットで解読される。本明細書で使用される場合、用語「コドン」は、タンパク質合成中に特定のアミノ酸を指定するポリヌクレオチド分子中の３個のヌクレオチドの配列を意味し、トリプレット又はコドントリプレットとも呼ばれる。
本明細書で開示される方法は、部分的には、発現構築体を含む。発現構築体は、細胞又は無細胞抽出物中でポリヌクレオチド分子を発現するのに有用な発現ベクターに作用可能に結合された、本明細書中で開示されたオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を含む。多種多様な発現ベクターを、本明細書中で開示されたポリヌクレオチド分子の発現に使用することができ、それらには、限定ではないが、ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；例えば酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、及び哺乳動物発現ベクター等の真核生物発現ベクター；及び無細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現ベクターが含まれる。これら方法の態様を実施するのに有用な発現ベクターは、構成的な、組織特異的な、細胞特異的な、又は誘導可能なプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、又はその両方の制御下でポリヌクレオチド分子を発現するものが含まれていてもよいことが更に理解される。発現ベクターの非限定的な例は、そのような発現ベクターから発現構築体を製作及び使用するための十分に確立された試薬及び条件と共に、限定ではないが、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州；ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州；ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．社、バレンシア、カリフォルニア州；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州を含む商業的販売業者から容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、製作、及び使用は、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
本明細書中で開示された発現構築体は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいてもよく、外来性プロテアーゼ切断部位の切断により、単鎖タンパク質がその二鎖形態に変換される。この実施形態の態様では、ウイルス発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており、原核生物発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており、酵母発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に連結されており、昆虫発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており、哺乳動物発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されている。この実施形態の他の態様では、本明細書中で開示されたポリヌクレオチド分子を発現するために好適な発現構築体は、無細胞抽出物を使用して発現することができる。この実施形態の一態様では、無細胞発現ベクターは、二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されている。
一実施形態では、本明細書で開示される発現構築体は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレームを含むことができる。この実施形態の態様では、本明細書で開示される発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレームを含むことができる。この実施形態の態様では、単鎖クロストリジウム毒素は、線形のアミノからカルボキシルの順序の以下のものを含む：（１）クロストリジウムの酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；３）クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）ＢｏＮＴ／Ａ毒素酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；８）ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；９）ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；１０）ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ移行ドメイン、ＢｕＮＴ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の更なる他の態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）ＢｏＮＴ／Ａ毒素酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；８）ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；９）ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；１０）ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ移行ドメイン、ＢｕＮＴ結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むそのようなクロストリジウム毒素の例は、例えば、J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許第７，１３２，５２９号；J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許第７，４１９，６７６号；Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins、米国特許第６，９０３，１８７号；Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins、米国特許第７，３９３，９２５号；Wei-Jen Lin, et al., Neurotoxins with Enhanced Target Specificity、米国特許第７，２７３，７２２号；Lance Steward, et al., Modified Botulinum Neurotoxins、米国特許第７，４９１，７９９号；Lance E. Steward, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type E、米国特許出願公開第２００８／０１３８８９３号；Ester Fernandez-Salas, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type A、米国特許出願公開第２００８／００５７５７５号に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本明細書で開示される発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むことができる。この実施形態の態様では、単鎖タンパク質は、線形のアミノからカルボキシルの順序の以下のものを含む：（１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；３）非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、オピオイド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、エンケファリン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ウシ副腎髄質−２２（ＢＡＭ２２）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、エンドモルフィン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、エンドルフィン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ダイノルフィン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ノシセプチン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、へモルフィン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は８）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、リモルフィン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、メラニン細胞刺激ホルモン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、副腎皮質刺激ホルモン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、リポトロピン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ガラニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ガラニンメッセージ関連ペプチド（ＧＭＡＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロモグラニンＡ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロモグラニンＢ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロモグラニンＣ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、サブスタンスＰ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経ペプチドＫ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経ペプチドガンマ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニューロキニンＡ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ヘモキニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、エンドキニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、膵臓ペプチド（ＰＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、脾臓イコサペプチド（ＰＩＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＣＲＨ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ソマトスタチン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、インターロイキン（ＩＬ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、オノスタチン（onostatin）Ｍ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は８）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニューロロイキン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ブラジキニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、カリジン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ｄｅｓＡｒｇ９ブラジキニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ｄｅｓＡｒｇ１０ブラジキニン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−４結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−８結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−９結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−１７結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＦＧＦ−１８結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、神経成長因子（ＮＧＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、頭部活性化因子ペプチド（ＨＡ、head activator peptide）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、グリア由来増殖因子（ＧＤNＦ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ニュールツリン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、パーセフリン（persephrin）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アルテミン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＧＦβ１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＧＦβ２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＧＦβ３結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＧＦβ４結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、骨形成タンパク質β（ＢＭＰ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ３結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ４結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ５結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ６結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ７結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ８結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は８）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＢＭＰ１０結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、増殖分化因子β（ＧＤＦ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む；１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ３結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ５結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ６結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ７結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；７）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ８結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；８）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ１０結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；９）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ１１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は１０）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＧＤＦ１５結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アクチビンＡ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アクチビンＢ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アクチビンＣ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、アクチビンＥ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、インヒビンＡ結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＩＧＦ−１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＩＧＦ−２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、セクレチン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、グルカゴン様ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＶＩＰ１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＶＩＰ２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド（Calcitonin-related peptidesvisceral gut peptide）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ガストリン結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ガストリン放出ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、コレシストキニン（ＣＣＫ）結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ペプチド結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＰＡＲ１結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＰＡＲ２結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＰＡＲ３結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域；又は４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＰＡＲ３結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域。
外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むそのようなタンパク質の例は、例えば、J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許第７，１３２，５２９号；J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許第７，４１９，６７６号；Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use、米国特許第７，５１４，０８８号；Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 国際公開第２００５／０２３３０９号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００８／００３２９３０号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００８／００３２９３１号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００８／０１６１２２６号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００８／０２２１０１２号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００９／０００４２２４号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００９／０００５３１３号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００９／００１８０８１号；Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins、米国特許出願公開第２００９／００６９２３８号；及びLance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use、米国特許出願公開第２００９／００４８４３１号に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の態様では、単鎖タンパク質は、線形のアミノからカルボキシルの順序の以下のものを含む：（１）統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；２）統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；４）クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン；並びに６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメイン。
この実施形態の他の態様では、発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の更なる態様では、発現構築体は、以下のものをコードするオープンリーディングフレームを含む：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ウシ副腎髄質−２２（ＢＡＭ２２）結合ドメイン；３）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン；４）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン；５）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン；６）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン；７）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン；又は８）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメイン。
統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むそのようなタンパク質の例は、例えば、併願特許出願Sanjiv Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domainに記載されており、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で開示される発現構築体は、プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むことができる。この実施形態の態様では、ウイルス発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており；原核生物発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており；酵母発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており；昆虫発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されており；及び哺乳動物発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されている。この実施形態の他の態様では、発現構築体は、本明細書中で開示されたポリヌクレオチド分子を発現するのに好適であり、無細胞抽出物を使用して発現することができる。この実施形態の一態様では、無細胞抽出物発現ベクターが、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド分子に作用可能に結合されている。
この実施形態の態様では、オープンリーディングフレームを含む発現構築体は、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）プロテアーゼ、サブチリシンプロテアーゼ、又はカスパーゼ３プロテアーゼをコードする。エンテロキナーゼプロテアーゼ及びそれらをコードするポリヌクレオチド分子の例は、例えば、Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use、米国特許第５，６６５，５６６号；Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use、米国特許第６，７４６，８５９号に記載されており、これら文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。サブチリシンプロテアーゼ及びそれらをコードするポリヌクレオチド分子の例は、例えば、Donn N. Rubingh, et al., Subtillisin Protease Variants having Amino Acid Deletions and Substitutions in Defined Epitope Regions、米国特許第６，５８６，２２４号に記載されており、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
この実施形態の別の態様では、エンテロキナーゼは、配列番号１１である。この実施形態の別の態様では、エンテロキナーゼは、配列番号１１のアミノ酸２３９〜１０３５を含む。この実施形態の更に別の態様では、エンテロキナーゼは、例えばエンテロキナーゼアイソフォーム等の天然エンテロキナーゼ変異体である。この実施形態のなお別の態様では、エンテロキナーゼは、例えば、保存的エンテロキナーゼ変異体、非保存的エンテロキナーゼ変異体、エンテロキナーゼキメラ、活性エンテロキナーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の非天然エンテロキナーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、エンテロキナーゼは、米国特許第５，６６５，５６６号又は米国特許第６，７４６，８５９号に開示されているものである。この実施形態の別の態様では、エンテロキナーゼ、天然エンテロキナーゼ変異体、又は非天然エンテロキナーゼ変異体は、例えば、ヒト、ウシ、又はげっ歯動物等の哺乳動物の種から得られる。
この実施形態の他の態様では、エンテロキナーゼは、配列番号１１に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号１１に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、エンテロキナーゼは、例えば、配列番号１１に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１１に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、エンテロキナーゼは、例えば、配列番号１１に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１１に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、配列番号１２である。この実施形態の更に別の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えばヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼアイソフォーム等の、天然ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、保存的ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、非保存的ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼキメラ、活性ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の、非天然ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、天然ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、又は非天然ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体は、ライノウイルスの種から得られる。
この実施形態の他の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、配列番号１２に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号１２に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、配列番号１２に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１２に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、配列番号１２に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１２に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、配列番号１３である。この実施形態の更に別の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えばヒトエンテロウイルスウイルス３Ｃプロテアーゼアイソフォーム等の天然ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、保存的ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、非保存的ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼキメラ、活性ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の、非天然ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ、天然ヒトエンテロウイルスウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体、又は非天然ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ変異体は、エンテロウイルスの種から得られる。
この実施形態の他の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、配列番号１３に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号１３に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、配列番号１３に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１３に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼは、例えば、配列番号１３に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１３に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１４である。この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１４のアミノ酸２０３８〜２２７０を含む。この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３を含む。この実施形態の更に別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、例えばＴＥＶプロテアーゼアイソフォーム等の天然ＴＥＶプロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、例えば、保存的ＴＥＶプロテアーゼ変異体、非保存的ＴＥＶプロテアーゼ変異体、ＴＥＶプロテアーゼキメラ、活性ＴＥＶプロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の、非天然ＴＥＶプロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼ、天然ＴＥＶプロテアーゼ変異体、又は非天然ＴＥＶプロテアーゼ変異体は、ポティウイルスの種から得られる。
この実施形態の他の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に関して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に関して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、配列番号２４である。この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼは、配列番号２４のアミノ酸２００２〜２２３６を含む。この実施形態の更に別の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、例えばＴＶＭＶプロテアーゼアイソフォーム等の天然ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、例えば、保存的ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体、非保存的ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体、ＴＶＭＶプロテアーゼキメラ、活性ＴＶＭＶプロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の、非天然ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼ、天然ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体、又は非天然ＴＶＭＶプロテアーゼ変異体は、ポティウイルスの種から得られる。
この実施形態の他の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、配列番号２４又は配列番号２４のアミノ酸２００２〜２２３６に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号２４若しくは配列番号２４のアミノ酸２００２〜２２３６に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、例えば、配列番号２４又は配列番号２４の２００２〜２２３６に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２４若しくは配列番号２４の２００２〜２２３６に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、ＴＶＭＶプロテアーゼは、例えば、配列番号２４又は配列番号２４の２００２〜２２３６に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２４若しくは配列番号２４の２００２〜２２３６に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、配列番号２５である。この実施形態の別の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５を含む。この実施形態の更に別の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、例えばスブチリシンプロテアーゼアイソフォーム等の天然スブチリシンプロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、サブチリシンプロテアーゼは、例えば、保存的サブチリシンプロテアーゼ変異体、非保存的サブチリシンプロテアーゼ変異体、サブチリシンプロテアーゼキメラ、活性サブチリシンプロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組に合わせ等の、非天然サブチリシンプロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、サブチリシンプロテアーゼ、天然サブチリシンプロテアーゼ変異体、又は非天然サブチリシンプロテアーゼ変異体は、バチルスの種から得られる。
この実施形態の他の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、配列番号２５又は配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号２５若しくは配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、例えば、配列番号２５又は配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２５若しくは配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、スブチリシンプロテアーゼは、例えば、配列番号２５又は配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２５若しくは配列番号２５のアミノ酸１０７〜３６５に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
この実施形態の別の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、配列番号２６である。この実施形態の更に別の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、例えばカスパーゼ３プロテアーゼアイソフォーム等の天然カスパーゼ３プロテアーゼ変異体である。この実施形態の更に別の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、例えば、保存的カスパーゼ３プロテアーゼ変異体、非保存的カスパーゼ３プロテアーゼ変異体、カスパーゼ３プロテアーゼキメラ、活性カスパーゼ３プロテアーゼ断片、又はそれらの任意の組み合わせ等の、非天然カスパーゼ３プロテアーゼ変異体である。この実施形態の別の態様では、カスパーゼ３キナーゼ、天然カスパーゼ３キナーゼ変異体、又は非天然カスパーゼ３キナーゼ変異体は、例えば、ヒト、ウシ、又はげっ歯動物等の哺乳動物の種から得られる。
この実施形態の他の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、配列番号２６に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性；又は配列番号２６に対して、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、例えば、配列番号２６に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２６に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の非隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態の更に他の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼは、例えば、配列番号２６に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換；又は配列番号２６に関して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個の隣接アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
本明細書で開示される方法は、部分的には、二重発現構築体を含む。二重発現構築体は、２つのポリヌクレオチド分子を含み、その各々は、細胞又は無細胞抽出物中で両ポリヌクレオチド分子を発現するのに有用な発現ベクターに作用可能に結合された、本明細書中で開示されたオープンリーディングフレームを含む。多種多様な二重発現ベクターを、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド分子の発現に使用することができ、それらには、限定ではないが、ウイルス二重発現ベクター ；原核生物二重発現ベクター；例えば酵母二重発現ベクター、昆虫二重発現ベクター、及び哺乳動物二重発現ベクター等の真核生物二重発現ベクター；及び無細胞抽出物二重発現ベクターが含まれる。これら方法の態様を実施するのに有用な二重発現ベクターは、構成的な、組織特異的な、細胞特異的な、又は誘導可能なプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、又はその両方の制御下でポリヌクレオチド分子を発現するものが含まれていてもよいことが更に理解される。二重発現ベクターの非限定的な例は、そのような発現ベクターから発現構築体を製作及び使用するための十分に確立された試薬及び条件と共に、限定ではないが、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州を含む商業的販売業者から容易に入手可能である。適切な二重発現ベクターの選択、製作、及び使用は、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
本明細書で開示される二重発現構築体は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換するすることができるプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
したがって、一実施形態では、二重発現構築体は、本明細書に開示の外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び本明細書に開示の二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含む。
この実施形態の一態様では、二重発現構築体は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。この実施形態の別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。この実施形態の更に別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び二鎖ループ領域、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含み、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が二鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
この実施形態の一態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むたんぱく質をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及び二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼを切断することができるプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。この実施形態の別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。この実施形態の更に別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、二鎖ループ領域、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含み、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が二鎖ループ領域内に位置するタンパク質をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
この実施形態の一態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型プロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この実施形態の別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むタンパク質をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。この実施形態の更に別の態様では、二重発現構築体は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含み、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が二鎖ループ領域内に位置するタンパク質をコードする１つのオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードする別のオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
二重発現構築体内に含まれているオープンリーディングフレームのうちの１つの位置は、両オープンリーディングフレームからの転写が依然として生じ得る限り、他方のオープンリーディングフレームの位置に対して任意の順序であってもよい。二重発現構築体を製作する場合、第１のプロモーター領域からの転写開始は、典型的には両オープンリーディングフレームを転写するが、第２のプロモーター領域からの転写開始は、典型的にはオープンリーディングフレームのうちの１つのみを転写する。したがって、第１及び第２のプロモーター領域に対するオープンリーディングフレームの位置に応じて、オープンリーディングフレームのうちの１つからは、２倍の転写物を製作することができる。
したがって、１つの実施形態では、プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の一態様では、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、二鎖ループ領域内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の更に別の態様では、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。
別の実施形態では、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、プロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の一態様では、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の別の態様では、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。この実施形態の更に別の態様では、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−結合ドメインを含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター領域の制御下にあるが、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームは、第１のプロモーター及び第２のプロモーター領域の両方の制御下にある。
二重発現構築体内に含まれているオープンリーディングフレームのうちの１つの５’−３’方向性は、両オープンリーディングフレームからの転写が依然として生じ得る限り、他方のオープンリーディングフレームの５’−３’方向性に対して任意の方向であってもよい。１つの実施形態では、オープンリーディングフレームのうちの１つの５’−３’方向性は、他方のオープンリーディングフレームの５’−３’方向性と同じ方向である。別の実施形態では、オープンリーディングフレームのうちの１つの５’−３’方向性は、他方のオープンリーディングフレームの５’−３’方向性と反対の方向である。この実施形態の一態様では、オープンリーディングフレームのうちの１つの５’−３’方向性は、他方のオープンリーディングフレームの５’−３’方向性に対して収束性である。この実施形態の別の態様では、オープンリーディングフレームのうちの１つの５’−３’方向性は、他方のオープンリーディングフレームの５’−３’方向性に対して分散性である。
本明細書で開示される方法は、部分的には、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語「二鎖ループ領域」は、単鎖形態のクロストリジウム毒素を二鎖形態に変換するのに使用されるプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素のアミノ酸配列を意味する。クロストリジウム毒素二鎖ループ領域の非限定的な例には、以下のものが含まれる：配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａの二鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂの二鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１の二鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄの二鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅの二鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆの二鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇの二鎖ループ領域；配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴの二鎖ループ領域；配列番号９のアミノ酸４２１〜４３５を含むＢａＮＴの二鎖ループ領域；及び配列番号１０のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｕＮＴの二鎖ループ領域（表２）。
表２．クロストリジウム毒素の二鎖ループ領域
Figure 2016164205
上で言及されているように、クロストリジウム毒素は、およそ１５０ｋＤａの単鎖ポリペプチドとして翻訳され、これは、その後天然プロテアーゼによるジスルフィドループ内でのタンパク質分解的切断により切断される（図１）。この翻訳後プロセシングにより、単一ジスルフィド結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持される、およそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）及びおよそ１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む二鎖分子が産出される。どんなプロテアーゼかは、現在のところ知られていないが、多くのクロストリジウム毒素の二鎖ループプロテアーゼ切断部位が決定されている。ＢｏＮＴでは、Ｋ４４８−Ａ４４９での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ａを二鎖形態に変換し、Ｋ４４１−Ａ４４２での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｂを二鎖形態に変換し、Ｋ４４９−Ｔ４５０での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｃ１を二鎖形態に変換し、Ｒ４４５−Ｄ４４６での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｄを二鎖形態に変換し、Ｒ４２２−Ｋ４２３での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｅを二鎖形態に変換し、Ｋ４３９−Ａ４４０での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｆを二鎖形態に変換し、及びＫ４４６−Ｓ４４７での切断は、単一ポリペプチド形態のＢｏＮＴ／Ｇを二鎖形態に変換する。単一ポリペプチド形態のＴｅＮＴが、Ａ４５７−Ｓ４５８でタンパク質分解的に切断されると、二鎖形態がもたらされる。単一ポリペプチド形態のＢａＮＴが、Ｋ４３１−Ｎ４３２でタンパク質分解的に切断されると、二鎖形態がもたらされる。単一ポリペプチド形態のＢｕＮＴが、Ｒ４２２−Ｋ４２３でタンパク質分解的に切断されると、二鎖形態がもたらされる。そのような二鎖ループプロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素にインフレームで作用可能に結合されている。しかしながら、二鎖ループ内の追加の切断部位も切断され、小ペプチド断片喪失の発生がもたらされると考えられることにも留意べきである。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ単鎖ポリペプチドの切断により、二鎖ループ内の１０個アミノ酸の断片の喪失が最終的にもたらされる。
二鎖ループ領域を含む任意の分子を、本開示の方法に有用な外来性プロテアーゼ切断部位を含むように修飾することができることが想定される。本開示の方法に有用な外来性プロテアーゼ切断部位を含むように修飾された二鎖ループを有することができる分子の例には、以下のものが含まれる：例えば、Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions、米国特許第５，９８９，５４５号；Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments、米国特許第６，４６１，６１７号；Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion、米国特許第６，６３２，４４０号；Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis、米国特許第６，８４３，９９８号；Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain、米国特許第７，２４４，４３７号；Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain、米国特許第７，４１３，７４２号；Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain、米国特許第７，４２５，３３８号。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
二鎖ループ領域は、外来性プロテアーゼ切断部位の付加により修飾される。本明細書で使用される場合、用語「外来性プロテアーゼ切断部位」は、「天然には存在しないプロテアーゼ切断部位」又は「非天然プロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然クロストリジウム毒素に由来する二鎖ループ領域に通常は存在しないプロテアーゼ切断部位を指す。単鎖ポリペプチド形態のクロストリジウム毒素を二鎖形態に変換するために使用することができるありとあらゆる外来性プロテアーゼ切断部位が、本発明の態様を実施するのに有用であることが想定される。外来性プロテアーゼ切断部位の非限定的な例には、以下のものが含まれる：例えば、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）プロテアーゼ切断部位、サブチリシンプロテアーゼ切断部位、又はカスパーゼ３プロテアーゼ切断部位。
外来性プロテアーゼ切断部位が、そのそれぞれのプロテアーゼにより切断可能である限り、ありとあらゆる長さの外来性プロテアーゼ切断部位が、本発明の態様に有用であると想定される。したがって、この実施形態の態様では、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０個のアミノ酸；又は最大で６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０個のアミノ酸の長さを有していてもよい
一実施形態では、二鎖ループ領域は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の態様では、二鎖ループ領域は、以下のものを含むように修飾される：例えば、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、サブチリシン切断部位、及びカスパーゼ３切断部位。この実施形態の他の態様では、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、外来性プロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の一態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列Ｅ−Ｐ５−Ｐ４−Ｙ−Ｐ２−Ｑ＊−Ｇ（配列番号２７）又はＥ−Ｐ５−Ｐ４−Ｙ−Ｐ２−Ｑ＊−Ｓ（配列番号２８）を有するタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位を含み、Ｐ２、Ｐ４、及びＰ５は、任意のアミノ酸であってもよい。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、又は配列番号３８を含むタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の更に他の態様では、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の別の態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列Ｐ６−Ｐ５−Ｖ−Ｒ−Ｆ−Ｑ＊−Ｇ（配列番号３９）又はＰ６−Ｐ５−Ｖ−Ｒ−Ｆ−Ｑ＊−Ｓ（配列番号４０）を有するタバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ切断部位を含み、Ｐ５及びＰ６は、任意のアミノ酸であってもよい。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、又は配列番号４４を含むタバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の更に他の態様では、タバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、タバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の更に別の態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列Ｐ５−Ｐ４−Ｌ−Ｆ−Ｑ＊−Ｇ−Ｐ（配列番号４５）を有するヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を含み、Ｐ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、又はＴであり、Ｐ５は、任意のアミノ酸であってもよく、Ｄ又はＥが好ましい。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域は、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１を含むヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の更に他の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の更に別の態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｈ＊−Ｙ（配列番号５２）又はＰ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｙ−Ｈ＊（配列番号５３）を有するサブチリシンプロテアーゼ切断部位を含み、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５、及びＰ６は、任意のアミノ酸であってもよい。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域は、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５６を含むスブチリシンプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の更に他の態様では、スブチリシンプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、スブチリシンプロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の更なる態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列Ｄ−Ｐ３−Ｐ２−Ｄ＊Ｐ１’（配列番号５７）を有するカスパーゼ３プロテアーゼ切断部位を含み、Ｐ３は任意のアミノ酸であってもよく、Ｅが好ましく、Ｐ２は任意のアミノ酸であってもよく、Ｐ１’は任意のアミノ酸であってもよく、Ｇ又はＳが好ましい。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、又は配列番号６３を含むカスパーゼ３プロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の更に他の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の他の態様では、カスパーゼ３プロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
この実施形態の更に別の態様では、二鎖ループ領域は、コンセンサス配列ＤＤＤＤＫ（配列番号６４）を有するエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の他の態様では、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、又はＢｕＮＴの二鎖ループ内に位置する。この実施形態の更に他の態様では、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位は、以下の文献に開示されているタンパク質の二鎖ループ内に位置する：例えば、米国特許第５，９８９，５４５号；米国特許第６，４６１，６１７号；米国特許第６，６３２，４４０号；米国特許第６，８４３，９９８号；米国特許第７，２４４，４３７号；米国特許第７，４１３，７４２号；及び米国特許第７，４２５，３３８号。
二鎖ループ領域は、天然二鎖ループプロテアーゼ切断部位を外来性プロテアーゼ切断部位に置換するように修飾される。この修飾では、天然二鎖ループプロテアーゼ切断部位は、作用不能にされており、したがってそのプロテアーゼにより切断され得ない。外来性プロテアーゼ切断部位は、その対応する外来性プロテアーゼによってのみ切断することができる。この種の修飾では、外来性プロテアーゼ部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素にインフレームで作用可能に結合されており、この部位は、そのそれぞれの外来性プロテアーゼにより切断することができる。外来性プロテアーゼ切断部位による内因性二鎖ループプロテアーゼ切断部位の置換は、外来性部位が内因性部位の切断部位位置とほぼ同じ位置に操作される、部位の置換であってもよい。外来性プロテアーゼ切断部位による内因性二鎖ループプロテアーゼ切断部位の置換は、外来性部位が内因性部位の切断部位位置とは異なる位置に操作されており、内因性部位が作用不能に操作される、外来性部位の付加であってもよい。
二鎖ループ領域内に含まれる天然プロテアーゼ切断部位は、天然二鎖ループプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する少なくとも２個のアミノ酸を変更することにより作用不能にすることができる。二鎖ループ領域の２個のシステイン残基の完全性が保たれ、この領域が依然としてジスルフィド架橋を形成することができる限り、より広範な変更を行ってもよい。アミノ酸変更の非限定的な例には、アミノ酸の欠失、又は異なるアミノ酸による元のアミノ酸の置換が含まれる。したがって、１つの実施形態では、二鎖ループ領域内に含まれる天然プロテアーゼ切断部位は、天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を変更することにより作用不能にされる。この実施形態の他の態様では、二鎖ループ領域内に含まれる天然プロテアーゼ切断部位は、以下のものを変更することにより作用不能にされる：例えば、天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも３個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも４個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも５個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも６個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも７個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも８個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも９個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも１０個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも１５個のアミノ酸；又は天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む少なくとも２０個のアミノ酸。
この実施形態の更に他の態様では、二鎖ループ領域内に含まれる天然二鎖プロテアーゼ切断部位は、以下のものを変更することにより作用不能にされる：例えば、天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で３個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で４個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で５個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で６個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で７個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で８個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で９個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で１０個のアミノ酸；天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で１５個のアミノ酸；又は天然プロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸を含む最大で２０個のアミノ酸。
本明細書で開示される方法は、部分的には、細胞を含む。ありとあらゆる細胞を使用することができることが想定される。したがって、この実施形態の態様には、限定ではないが、以下のものが含まれる：限定ではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridia perfringens）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridia difficile）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）、ナイセリア・メニンギルス（Neisseria meningirulls）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、及びサルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）に由来するもの等の、好気性、微好気性、好二酸化炭素性、通性、嫌気性、グラム陰性、及びグラム陽性の細菌細胞の菌株を含む原核細胞；及び限定ではないが、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）に由来するもの等の酵母菌株を含む真核細胞；例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、及びタバコスズメガ（Manduca sexta）に由来するもの等の昆虫に由来する昆虫細胞及び細胞系；及び例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、及びヒトに由来するもの等の哺乳動物細胞に由来する哺乳動物細胞及び細胞系。細胞系は、アメリカ培養細胞系統保存機関、欧州細胞カルチャーコレクション（European Collection of Cell Cultures）、及びドイツ微生物及び細胞カルチャーコレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）から取得することができる。適切な細胞系を選択、製作、使用するための特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、以下の文献に記載されている：例えば、Insect Cell Culture Engineering (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993)；Insect Cell Cultures: Fundamental and Applied Aspects (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996)；Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, General Techniques of Cell Culture (Cambridge University Press, 1997)；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998)；R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, 4th ed. 2000)；Animal Cell Culture: A Practical Approach (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000)；Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra, (2001)；Basic Cell Culture: A Practical Approach (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002)；and Current Protocols in Molecular Biology，supra,（2004）。これらプロトコールは、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
本明細書で開示される方法は、部分的には、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入することを含む。細胞に導入された発現構築体又は二重発現構築体は、その細胞により一過性に又は安定的に維持することができる。安定的に維持された発現構築体又は二重発現構築体は、染色体外にあり、自律的に複製することができるか、又はそれらは細胞の染色体物質に組み込まれ、非自律的に複製することができる。本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入するためのありとあらゆる方法を使用することができることが想定される。発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入するのに有用な方法には、限定ではないが、以下のものが含まれる：例えば、リン酸カルシウム媒介性、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介性、脂質媒介性、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性、ポリリシン媒介性、及びポリブレン媒介性等の、化学物質媒介性の形質移入；例えば、微粒子銃粒子送達、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーション等の、物理的媒介性の形質移入（tranfection）；及び例えばレトロウイルス媒介性形質移入等のウイルス媒介性形質移入。例えば、Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62（Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001）を参照されたい。当業者であれば、発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入する特定の方法の選択は、部分的には、細胞が、発現構築体又は二重発現構築体を一過性に含有することになるか否か、又は細胞が、発現構築体又は二重発現構築体を安定的に含有することになるか否かに依存することになることを理解する。これらプロトコールは、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
この実施形態の一態様では、形質移入と称される、化学物質を媒介とする方法を使用して、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入する。化学物質を媒介とする形質移入法では、化学試薬が、発現構築体又は二重発現構築体と、細胞へのその取り込みを容易にする複合体を形成する。そのような化学試薬には、限定ではないが、以下のものが含まれる：リン酸カルシウム媒介性、例えば、Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)を参照されたい；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介性、脂質媒介性、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性及びポリリシン媒介性及びポリブレン媒介性等の陽イオン性ポリマー媒介性、例えば, Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)を参照されたい。そのような化学物質を媒介とする送達系は、標準的方法により調製することができ、市販されている。例えば、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ形質移入キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）；哺乳動物形質移入キット、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．社製、ラホーヤ、カリフォルニア州）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社製、カールズバッド、カリフォルニア州）；ＥｘＧｅｎ５００形質移入キット （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．社製、ハノーバー、メリーランド州）、及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．社製、バレンシア、カリフォルニア州）を参照されたい。
この実施形態の別の態様では、物理的媒介性の方法を使用して、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入する。物理的技術には、限定ではないが、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びマイクロインジェクションが含まれる。微粒子銃及びマイクロインジェクション技術は、発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入するために細胞壁に孔を開ける。例えば、Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997)；及びJohn O'Brien ＆ Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004)を参照されたい。電気透過処理とも呼ばれるエレクトロポレーションは、短い高電圧の電気パルスを使用して、ポリヌクレオチド分子が進入する一過性の孔を膜に生成し、全ての細胞タイプを安定的及び一過性に形質移入するために有効に使用することができる。例えば、M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004)；及びOliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)を参照されたい。
この実施形態の別の態様では、形質導入と呼ばれるウイルス媒介性の方法を使用して、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入する。一過性形質導入のウイルス媒介性の方法では、ウイルス粒子が宿主細胞に感染し複製するプロセスが、この機序を使用して発現構築体又は二重発現構築体を細胞に導入するために操作されている。ウイルス媒介性の方法は、限定ではないが、以下のものを含む多種多様なウイルスから開発されている：レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウィルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、及びバキュロウイルス、例えば、Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004)；及びMaurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003)；E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003)；Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999)；H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999)；Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002)；Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002)；Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004)；Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996)；Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002)；Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002)；及びA. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)を参照されたい。
アデノウイルスは、非エンベロープ性の二本鎖ＤＮＡウィルスであり、約３６ｋｂの比較的大きなポリヌクレオチド分子を操作し、高い力価で産生され、多種多様な分裂及び非分裂細胞の両方に効率的に感染することができるため、哺乳動物細胞の形質導入に選択されることが多い。例えばWim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997)；及び Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001)を参照されたい。アデノウイルスに基づく系を使用する形質導入は、核酸分子が、宿主細胞染色体に組み込まれるのではなく、細胞核のエピソームにより保持されるため、持続的なタンパク質発現を支援しない。アデノウイルスベクター系及びそのようなベクターの使用法の特定のプロトコールは、例えば、以下のものに開示されている：ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）アデノウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社製、カールズバッド、カリフォルニア州）及びＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）アデノウイルス発現系の使用説明書２５−０５４３ バージョンＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社（２００２年７月１５日）；及びＡＤＥＡＳＹ（商標）アデノウイルスベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．社製、ラホーヤ、Ｃａ）及びＡＤＥＡＳＹ（商標）アデノウイルスベクター系の使用説明書０６４００４ｆ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．社。
また、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体の細胞への導入は、例えば、オンコレトロウイルス及びレンチウイルス等の、一本鎖ＲＮＡレトロウイルスを使用して達成することができる。レトロウイルス媒介性の形質導入は、多くの場合、１００％に近い形質導入効率をもたらし、感染多重度（ＭＯＩ）を変更することによりプロウイルスのコピー数を容易に制御することができ、一過性又は安定的のいずれかで細胞を形質導入するために使用することができる。例えば、Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004)；Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004)；FelixRecillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004)；及びRoland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)を参照されたい。レトロウイルス粒子は、脂質エンベロープで囲まれているタンパク質カプシドに包み込まれているＲＮＡゲノムで構成される。レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写酵素酵素と共に細胞質に注入することにより宿主細胞に感染する。その後、ＲＮＡテンプレートは、線形の二本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、それを宿主細胞ゲノムに組み込むことによりそれ自体を複製する。ウイルス粒子は、垂直に（プロウイルスにより、親細胞から娘細胞に）並びに水平に（ビリオンにより、細胞から細胞に）蔓延する。目的の核酸分子が宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれ、それによりタンパク質の長期的な発現が可能になるため、この複製戦略は、長期的に一貫した発現を可能にする。例えば、動物研究により、様々な組織に注入されたレンチウイルスベクターが、１年間を超えて持続的なタンパク質発現をもたらしたことが示されている。例えば、Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)を参照されたい。例えば、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）等のオンコレトロウイルス由来ベクター系が広く使用されており、多数の異なる非分裂細胞を感染させる。レンチウイルスも、分裂及び非分裂細胞を含む多数の異なる細胞タイプを感染させ、高度に特異的な細胞標的化を可能にする複雑なエンベロープタンパク質を有することができる。
レトロウイルスベクター、およびそのようなベクターの使用法の特定のプロトコールは、以下の文献に開示されている。例えば、Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters、米国特許第５，４６４，７５８号；Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression、米国特許第５，８１４，６１８号；David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same、米国特許第５，５１４，５７８号；及びDavid S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor、米国特許第６，２４５，５３１号；Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations、米国特許第５，３６４，７９１号；Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy、米国特許第５，８７４，５３４号；Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy、米国特許第５，９３５，９３４号。更に、そのようなウイルス送達系は、標準的方法により調製することができ、市販されている。例えば、以下を参照されたい：ＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製、パロアルト、カリフォルニア州）及びＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系のユーザーマニュアル、ＰＴ３００１−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社（２００３年３月１４日）、ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社製、カールズバッド、カリフォルニア州）及びＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）系 哺乳動物細胞用ミフェプリストン制御発現系 バージョンＤ、２５−０３１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社（２００２年１１月４日）；ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）レンチウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社及びＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）レンチウイルス発現系の使用説明書２５−０５０１ バージョンＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社（２００３年１２月８日）；及びＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）レトロウイルス誘導可能哺乳動物発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ラホーヤ、カリフォルニア州）及びＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）レトロウイルス誘導可能哺乳動物発現系の使用説明書、０６４００５ｅ。
本明細書で開示される方法は、部分的には、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を発現させることを含む。限定ではないが、細胞に基づく系及び無細胞発現系を含む様々な発現系はいずれも、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体の発現に有用であり得ることが想定される。細胞に基づく系には、限定ではないが、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系、及び哺乳動物発現系が含まれる。無細胞系には、限定ではないが、コムギ麦芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物、及び大腸菌抽出物が含まれ、一般的に、本明細書で開示される方法に相当する。発現系を使用した発現構築体又は二重発現構築体の発現には、限定ではないが、誘導可能発現、非誘導可能発現、構成的発現、ウイルス媒介性発現、安定的に組み込まれた発現、及び一過性発現を含む様々な特徴のいずれが含まれていてもよい。十分に特徴付けられたベクター、試薬、条件、及び細胞を含む発現系は、十分に確立しており、限定ではないが、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、オースティン、テキサス州；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州；ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．社、バレンシア、カリフォルニア州；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナポリス、インディアナ州；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州を含む商業的販売業者から容易に入手可能である。適切な異種性発現系の選択及び使用の非限定的な例には、例えば、以下の文献に記載されている：Protein Expression. A Practical Approach （S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999）；Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, Gene Expression Systems. Using Nature for the Art of Expression（Academic Press, 1999）；及びMeena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) Current Science 1121-1128, (2001)。これらプロトコールは、十分に当業者の範囲内にある、本明細書の教示に照らして日常的な手順である。
細胞に基づく様々な発現手順が、本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体の発現に有用である。例には、限定ではないが、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系、及び哺乳動物発現系が含まれる。ウイルス発現系には、限定ではないが、以下のものが含まれる：ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）レンチウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、アデノウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＡＤＥＡＳＹ（商標）ＸＬアデノウイルスベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）、及びＶＩＲＡＰＯＲＴ（登録商標）レトロウイルス遺伝子発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）。原核生物発現系の非限定的な例には、以下のものが含まれる：ＣＨＡＭＰＩＯＮ（商標）ｐＥＴ発現系（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）、ＴＲＩＥＸ（商標）細菌発現系（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）、ＱＩＡＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）発現系（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．社）、及びＡＦＦＩＮＩＴＹ（登録商標）タンパク質発現及び精製系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）。酵母発現系には、限定ではないが、以下のものが含まれる：ＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴ（商標）ピキア発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＹＥＳ−ＥＣＨＯ（商標）発現ベクターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、及びＳＰＥＣＴＲＡ（商標）Ｓ．ポンベ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）。バキュロウイルス発現系の非限定的な例には、以下のものが含まれる：ＢＡＣＵＬＯＤＩＲＥＣＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、及びＢＤ ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）。昆虫発現系には、限定ではないが、以下のものが含まれる：ショウジョウバエ発現系（ＤＥＳ（登録商標））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＩＮＳＥＣＴＳＥＬＥＣＴ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、及びＩＮＳＥＣＴＤＩＲＥＣＴ（商標）系（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）。哺乳動物発現系の非限定的な例には、以下のものが含まれる：Ｔ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン制御発現）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＦＬＰ−ＩＮ（商標）Ｔ−ＲＥＸ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ｐｃＤＮＡ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ｐＳｅｃＴａｇ２系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）、ＥＸＣＨＡＮＧＥＲ（登録商標）系、ＩＮＴＥＲＰＬＡＹ（商標）哺乳動物ＴＡＰ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）誘導可能哺乳動物発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）、及びＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（登録商標）ＩＩ誘導可能哺乳動物発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ、カリフォルニア州）。
本明細書で開示される発現構築体又は二重発現構築体を発現する別の手順では、限定ではないが、原核生物抽出物及び真核生物抽出物等の無細胞発現系が使用される。原核細胞抽出物の非限定的な例には、以下のものが含まれる：ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナポリス、インディアナ州）、ＡＣＴＩＶＥＰＲＯ（商標））Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ翻訳キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、オースティン、テキサス州）、ＥＣＯＰＲＯ（商標）系（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）、及びＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）。真核細胞抽出物には、限定ではないが、以下のものが含まれる：ＲＴＳ１００コムギ麦芽ＣＥＣＦキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナポリス、インディアナ州）、ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄコムギ麦芽抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、米国ウィスコンシン州）、コムギ麦芽ＩＶＴ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、オースティン、テキサス州）、Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、オースティン、テキサス州）、ＰＲＯＴＥＩＮＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ系（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、オースティン、テキサス州）、及びＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ網状赤血球抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、ウィスコンシン州）。
本明細書で開示される方法は、部分的には、細胞を第１の温度である期間増殖させ、その後細胞を第２の温度である期間増殖させることを含む。第１及び第２の温度並びに第１及び第２の温度で細胞を増殖させる期間は、細胞により発現されるタンパク質の所望量、及び単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換するための二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位での所望の切断効率に基づいて決定される。
１つの実施形態では、細胞は、最大細胞密度を達成するために、ある期間、第１の温度で増殖される。この実施形態の態様では、細胞は、約３７℃で、約０．５時間、約１．０時間、約１．５時間約２．０時間、約３．０時間、約３．５時間、約４．０時間、約５．０時間、約６．０時間、約７．０時間、約８．０時間、約９．０時間、又は約１０時間増殖される。この実施形態の他の態様では、細胞は、約４２℃で、約０．５時間、約１．０時間、約１．５時間約２．０時間、約３．０時間、約３．５時間、約４．０時間、約５．０時間増殖される。この実施形態の態様では、細胞は、約３０℃で、約０．５時間、約１．０時間、約１．５時間約２．０時間、約３．０時間、約３．５時間、約４．０時間、又は約５．０時間増殖される。この実施形態の更に他の態様では、細胞は、約１２℃で約２時間〜約８時間、約１６℃で約２時間〜約８時間、約２０℃で約２時間〜約８時間、又は約２４℃で約２時間〜約８時間増殖される。この実施形態の更に他の態様では、細胞は、約１２℃〜約１６℃で約２時間〜約８時間、又は約２０℃〜約２４℃で約２時間〜約８時間増殖される。
別の実施形態では、細胞は、タンパク質発現の最大誘導を達成するために、ある期間、第２の温度で増殖される。この実施形態の態様では、細胞は、約３７℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。この実施形態の他の態様では、細胞は、約３０℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。この実施形態の更に他の態様では、細胞は、約２５℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。この実施形態の更に他の態様では、細胞は、約２２℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。この実施形態の更なる態様では、細胞は、約１６℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。この実施形態のなお更なる態様では、細胞は、約１２℃で、約１．５時間、約２．５時間、約３．５時間、約４．５時間、約５．５時間、約６．５時間、約７．５時間、約８．５時間、約９．５時間、約１０．５時間、約１１．５時間、約１２．５時間、約１３．５時間、約１４．５時間、約１５．５時間、約１６．５時間、又は約２４．５時間増殖される。
また、本発明の態様は、以下のように記述することができる：
１．単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）最大細胞密度を達成するために、二重発現構築体を含む細胞を、第１の温度である期間増殖させ、二重発現構築体が、
ｉ）外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームからのタンパク質発現の最大誘導を達成するために、細胞を第２の温度である期間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
２．単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約３．５時間増殖させ、二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及び外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）細胞を２２℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖クロストリジウム毒素及びプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位で単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。
３．単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、２に記載の細胞内方法：（１）クロストリジウムの酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；３）クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
４．クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、２に記載の細胞内方法。
５． クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、２に記載の細胞内方法。
６．クロストリジウム毒素結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、又はＢｕＮＴ結合ドメインである、２に記載の細胞内方法。
７．外来性プロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）プロテアーゼ切断部位、サブチリシンプロテアーゼ切断部位、又はカスパーゼ３プロテアーゼ切断部位である、２に記載の細胞内方法。
８．プロテアーゼが、エンテロキナーゼプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）プロテアーゼ、サブチリシンプロテアーゼ、又はカスパーゼ３プロテアーゼである、２に記載の細胞内方法。
９．単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたＴＥＶプロテアーゼが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
１０．タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、９に記載の細胞内方法：１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン、３）統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン、４）統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン、５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は６）クロストリジウム毒素移行ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン。
１１．クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、９に記載の細胞内方法。
１２．クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、９に記載の細胞内方法。
１３．統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオド（opiod）結合ドメインが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ＢＡＭ２２結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、９に記載の細胞内方法。
１４．単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、二重発現構築体からの単鎖タンパク質及びＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
産生されたＴＥＶプロテアーゼが、二鎖ループ領域内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位で単鎖タンパク質を切断し、それにより単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
１５．単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、１４に記載の細胞内方法：（１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；３）非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）非クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及びクロストリジウム毒素移行ドメイン；５）クロストリジウム毒素移行ドメイン、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び非クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）クロストリジウム毒素移行ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン。
１６．クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、１４に記載の細胞内方法。
１７．クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、１４に記載の細胞内方法。
１８．非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞（epidermial）増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、１４に記載の細胞内方法。
実施例１
ＴＥＶプロテアーゼ変異体
以下の例は、安定性及び／又は溶解度が増加されたＴＥＶプロテアーゼ変異体を製作及び使用する方法を示す。
Ａ． ｐＥＴ２９／ＴＥＶ発現構築体の構築。
ＴＥＶプロテアーゼを組換え的に産生するために、所望のＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを、標準的手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ボセル、ワシントン州）を使用して合成した。オープンリーディングフレーム全体に及ぶ、長さが２０〜５０塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、ＰＵＣＢＨＢ１担体ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ＴＥＶプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、ＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００型配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して配列決定することにより確認した。
ＴＥＶ変異体をコードするオープンリーディングフレームを、大腸菌発現用にコドン最適化した。全ては、Ｎ末端又はＣ末端ポリ−ヒスチジン親和性精製タグ化のいずれかに融合された、全長ＴＥＶポリタンパク質の残基２０３８〜２２７９に対応する、およそ２７．５ｋＤａのおよそ２５０個アミノ酸のタンパク質分解断片をコードする。野生型ＴＥＶプロテアーゼを組換え発現すると、セリン２１９でそれ自体を切断し、タンパク質分解活性が大きく低減した切断型プロテアーゼを生成する傾向を有するタンパク質がもたらされる。したがって、自己タンパク分解及びその後のこの切断型産物産生の大部分を排除するために、セリン２１９をアスパラギン（Ｓ２１９Ｎ）又はバリン（Ｓ２１９Ｖ）のいずれかに変更したＴＥＶ変異体を合成した。加えて、組換え野生型ＴＥＶプロテアーゼは、大腸菌で非常に高レベルで発現されるが、ほとんど完全に不溶性であることがよく知られている（Kapust et al., 2001）。したがって、発現されたＴＥＶの溶解度を向上させるために、幾つかのアミノ酸変異体を製作及び試験して、変更がタンパク質溶解度の増加をもたらしたか否かを決定した。合成したＴＥＶ変異体は、表３に示されている。変異体１は、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ及びＳ２１９Ｎ突然変異を有するように操作されたコドン最適化ＴＥＶ構築体を表していた。変異体１１は、Ｎ末端タグ及びＳ２１９Ｎ突然変異を有するように操作されたＴＥＶプロテアーゼの天然ＤＮＡ配列を有する構築体だった。
Figure 2016164205
ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体発現構築体を構築するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ＴＥＶ構築体を、１）ＴＥＶをコードするオープンリーディングフレームを含むインサートを切除し、及び２）このインサートが、ｐＥＴ２９ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、このインサートを、多重クローニング部位が同じ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＥＴ２９ベクターに、方向的に正しくライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、ＴＥＶ遺伝子インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、カルボキシル末端又はアミノ末端ポリヒスチジン親和性精製ペプチドのいずれかに作用可能に結合されたＴＥＶ変異体をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構築体が得られた。
Ｂ．様々な誘導条件下におけるＴＥＶ発現の分析。
使用する最良の増殖及びタンパク質誘導条件を決定するために、ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体９及び１０（表３）を、ＩＰＴＧ誘導培地及び自己誘導培地中で増殖及び誘導した。加えて、誘導の長さを試験した。
ＩＰＴＧで発現を誘導するために、ＴＥＶ発現構築体を内包する細胞を、まず一晩培養して、開始培養を生成した。新しいＬＢ培地に、一晩培養物を１：１０００で播種し、３７℃で振とうしながらＯＤ６００が０．７に達するまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを０．６ｍＭの終濃度になるように添加した。誘導の４時間後に細胞を回収し、総細胞溶解産物を評価して標的発現を検出した。
自己誘導条件下で構築体を発現させるために、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、適切な発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。１．０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１．０ｍＬのＺＹＰ−５０５２自己誘導培地に播種した。３７℃で振とうしながら細胞を増殖させ、５、８、１２、２０、及び２８時間の時点で等量を取り出した。
総ＴＥＶプロテアーゼ発現を決定するために、各時点の４０μＬの誘導細胞培養を、等容積の２×Ｌａｅｍｍｉ試料緩衝液と混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。２μＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４中１単位／μＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅをこの混合物に添加し、９５℃で５分間インキュベートした。１５μＬ等量を、変性、還元条件下で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用して、ＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により負荷及び分離した。ゲルを洗浄し、１０％メタノール、７％酢酸を含む固定溶液で３０分間固定した。固定した後、固定溶液を取り除き、ゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色液と共に室温で３時間インキュベートした。その後、ゲルを、１０％メタノール、７％酢酸を含む脱染溶液で室温にて３時間脱染した。画像は、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０型Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅｒ解析ソフトウェアを用いて視覚化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）。
可溶性ＴＥＶプロテアーゼ発現を決定するために、１×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）細胞溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、ウィスコンシン州）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０単位／ｍＬ ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）、及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ギブスタウン、ニュージャージー州）を含む１００μＬの細胞溶解溶液を添加し、常にボルテックスしながら室温で２５分間インキュベートすることにより、１．０ｍＬの誘導細胞培養を溶解した。溶解産物を４３００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、残屑をペレットにした。８００μＬの上清をきれいなチューブに移し、それに、３０μＬのＭａｇｎｅＨｉｓ磁気ビーズを添加し、混合物を、常に回転させながら５分間インキュベートした。インキュベーション後、磁気ビーズを磁気スタンドで隔離し、溶液を除去し、ビーズを、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む１５０μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。タンパク質を８０μＬの溶出緩衝液で溶出し、等容積の２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を添加し、混合物を、９５℃で１０分間インキュベートした。１５μＬ等量を、変性、還元条件下で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用して、ＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により負荷及び分離した。
誘導実験の結果は、自己誘導条件が、ＩＰＴＧ誘導と比べて、５〜１０倍多くのＴＥＶプロテアーゼ発現をもたらしたことを示した。自己誘導培地での総ＴＥＶプロテアーゼ発現及び可溶性ＴＥＶプロテアーゼ発現を比較すると、より長い誘導時間が、より多くの総タンパク質をもたらしたが、回収可能な可溶性ＴＥＶプロテアーゼの量は減少したことが明らかになった。実際、３７℃で約８時間の発現が、最大量の可溶性タンパク質を産出した。最後に、ＴＥＶ Ｓ２１９Ｎ及びＴＥＶ Ｓ２１９Ｖ変異体は両方とも、著しくより少ない自己タンパク分解を示したが、ＴＥＶ Ｓ２１９Ｖ変異体は、誘導時間が長いと、より多くの切断型産物を示し、ＴＥＶ Ｓ２１９Ｖ変異体が自己タンパク分解をより起こし易いことが示唆された。
ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体９及び１０を使用して、増殖及び誘導条件を最適化した後、１１個のｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体全ての発現を、これら条件下で並行して試験した。結果は、可溶性ＴＥＶプロテアーゼ収量増加の順序が、５つの最も高い発現体のうちの最大から最少の順で、ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体５、１０、７、３、及び６だったことを示した。それに比べて、ＴＥＶ変異体１１は、全ての中で最も低いレベルで発現された。
Ｃ．大規模発現及び精製。
対照としての変異体１１に加えて、上位５つのｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体からのＴＥＶプロテアーゼ発現レベルを、大規模条件下で厳密に比較するために、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、適切な発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら８時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。
細胞を溶解するために、細胞ペレットを、ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（商標）タンパク質抽出試薬（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ギブスタウン、ニュージャージー州）、２５単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ、及び１Ｋ単位／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）を含む、細胞ペレット１グラム当たり５．０ｍＬの溶解溶液に再懸濁した。細胞懸濁物を、室温にて揺動台上で２０分間インキュベーションし、その後氷上で１５分間インキュベートした。懸濁物を、４℃にて３０分間３０，３５０ｒｃｆで遠心分離して残屑をペレットにし、上清をきれいなチューブに移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の不溶性細胞抽出ペレットを調製するために、ペレットを、１×ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（商標）タンパク質抽出試薬で再懸濁して元の容積にした。
ＩＭＡＣ精製によりＴＥＶプロテアーゼ変異体を精製するために、清澄化された溶解産物を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、及び３５ｍＭイミダゾールを含むＩＭＡＣ洗浄溶液で平衡化されたＴＡＬＯＮ（商標）ＳｕｐｅｒＦｌｏｗ金属親和性コバルト樹脂と混合した。溶解産物−樹脂混合物を、４℃にて１時間、揺動台上でインキュベートし、その後真空マニホールドに取り付けられた２０ｍＬの使い捨てカラム支持体に移した。カラムを、５カラム容積のＩＭＡＣ洗浄溶液で２回洗浄した。２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、及び５００ｍＭイミダゾールを含む２カラム容積のＩＭＡＣ溶出溶液で、ＴＥＶプロテアーゼを樹脂から溶出し、１．０ｍＬ画分で収集した。タンパク質を含有する各画分は、１０μＬ等量を、２００μＬのＱＵＩＣＫＳＴＡＲＴ（商標）ブラッドフォード染料試薬と混合することにより特定した。ピーク溶出画分を貯溜し、二次のイオン交換クロマトグラフィー精製用に透析した。
ＩＭＡＣで精製したＴＥＶプロテアーゼ変異体を透析するために、ピーク溶出画分を含む貯溜試料を、２５ｋＤ ＭＷＣＯ膜を取付けたＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）で、常に撹拌しながら１Ｌ脱塩緩衝液中で４℃にて一晩透析した。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、脱塩緩衝液（緩衝液Ａ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含んでいた。
陽イオン交換クロマトグラフィーによりＴＥＶプロテアーゼ変異体を精製するために、脱塩したタンパク質溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化された１ｍＬ ＵＮＯ−Ｓ１陽イオン交換カラムに、０．５ｍＬ／分の流速で負荷した。２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを１．０ｍＬ／分の流速で以下のように用いたＮａＣｌ勾配により、結合したタンパク質を溶出した：５％緩衝液Ｂを３ｍＬ、２０％緩衝液Ｂを１０ｍＬ、１０ｍＬにわたって２０％から１００％の緩衝液Ｂ。カラムからのタンパク質の溶出は、ＵＶ可視検出器を用いて２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍで検出し、ピーク画分を全て貯溜し、タンパク濃度を決定した。等量を液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。ＴＥＶ変異体７は、最も高い可溶性プロテアーゼ収量（約３５ｍｇ／Ｌ）を示し、変異体３（約２４ｍｇ／Ｌ）及び変異体１０（約２３ｍｇ／Ｌ）がその後に続いた。残りの２つの変異体５及び６は、それぞれ１８及び８ｍｇ／Ｌの収量を示した。ＴＥＶ変異体１１の収量は、約０．６ｍｇ／Ｌだった。したがって、溶解度増強アミノ酸変更を含有する上位５つのＴＥＶ変異体は全て、自己タンパク分解排除アミノ酸変更（Ｓ２１９Ｎ）のみを含んでいたＴＥＶ変異体１１と比べて、精製された可溶性ＴＥＶプロテアーゼの少なくとも１０倍の増加をもたらした。小規模発現及び大規模発現研究でのＴＥＶプロテアーゼ収量の順位序列を比較すると、変異体５は、小規模発現で最も高い収量を示した（実施例１Ｃ）。しかしながら、大規模発現で最も高い収量を示したのは、変異体７だった。大規模バッチからの収量を繰り返して比較すると、変異体７が最高発現変異体であることが、一貫して明らかにされた。その結果、変異体７が、リードＴＥＶプロテアーゼ構築体であり、本明細書に記載されているこの後の研究全てにこれを使用した。
ＴＥＶプロテアーゼ変異体のタンパク質分解活性を決定するために、ＴＥＶプロテアーゼ変異体又は陽性対照としてのＡｃＴＥＶプロテアーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、及び２．５μｇのＴＥＶ基質を含む３０μＬの反応溶液に添加し、３０℃で３０分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした。２×Ｌａｅｍｍｉ試料緩衝液を添加することにより、反応物を反応停止させ、試料を９５℃で１０分間インキュベートした。１５μＬ等量を、変性、還元条件下で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用して、ＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により負荷及び分離した。ゲルを洗浄し、１０％メタノール、７％酢酸を含む固定溶液で３０分間固定した。固定した後、固定溶液を取り除き、ゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色液と共に室温で３時間インキュベートした。その後、ゲルを、１０％メタノール、７％酢酸を含む脱染溶液で３時間室温にて脱染した。画像は、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０型Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒを用いて視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ画像解析ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）で分析した。非切断基質及び切断産物の強度比率を使用して、切断ＴＥＶ基質のパーセントを計算した。ＴＥＶプロテアーゼ活性アッセイの結果は、表４に示されている。
Figure 2016164205
実施例２
２つの異なる発現構築体を使用した、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素を細胞内で発現させるのに有用な手順を示す。
Ａ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体の構築。
二鎖ループ領域内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａを産生するために、所望のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号８８）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号８７）を、標準的手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ボセル、ワシントン州）を使用して合成した。ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのオープンリーディングフレーム全体に及ぶ、長さが２０〜５０塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、ＰＵＣＢＨＢ１担体ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ構築体を生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、ＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００型配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して配列決定することにより確認した。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を生成するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするオープンリーディングフレームを含むインサートを切除し、及び２）このインサートが、ｐＥＴ２９ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。このインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、類似の制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＥＴ２９ベクターにサブクローニングして、適切なｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性精製ペプチドに作用可能に結合されたＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構築体が得られた。
Ｂ． ｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体の構築。
ｐＥＴ２２／ＴＥＶ変異体発現構築体を生成するために、ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体７発現構築体を、１）ＴＥＶプロテアーゼ（配列番号７８）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号７７）を含むインサートを切除し、及び２）このインサートが、ｐＥＴ２２ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。このインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、類似の制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＥＴ２２ベクターにサブクローニングして、適切なｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、アミノ末端ポリヒスチジン親和性精製ペプチドに作用可能に結合されたＴＥＶ変異体７をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２２発現構築体が得られた。
Ｃ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞の構築。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞を製作するために、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、エレクトロポレーションを使用して、ｐＥＴ２２／ＴＥＶ変異体７発現構築体を内包するエレクトロコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を確認した。このクローニング戦略により、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞が得られた。
Ｄ． ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。約１．０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら３．５時間増殖させ、その後２２℃で振とうしながら１８．５時間増殖させた。対照として、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
増殖及び誘導の後、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製した。ＩＭＡＣで精製した試料を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。
結果は、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが単独で発現される場合、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの単鎖に対応するおよそ１５０ｋＤａのバンドが、還元及び非還元条件下の両方で検出されたことを示す。対照的に、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのバンドが還元条件下で観察され、その一方はおよそ５０ｋＤａであり、他方はおよそ１００ｋＤａだった。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは消失し、およそ１５０ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、還元条件下で見られたおよそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの軽鎖及び重鎖に対応し、これらの２つのバンドの存在は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが二鎖を形成したことを示していたことを示す。したがって、これら細胞中でＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、二鎖ループ内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
これら結果を確認するため、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の大規模発現を行った。 ５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＥＴ２２／ＴＥＶ発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。約２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら３．５時間増殖させ、その後２２℃で振とうしながら１８．５時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例１Ｃに記載のように、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製した。
ＩＭＡＣで精製したＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを、二次のイオン交換クロマトグラフィー用に透析するために、ピーク溶出画分を含む貯溜試料を、２５ｋＤ ＭＷＣＯ膜を取付けたＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）で、撹拌しながら１Ｌ脱塩緩衝液中で４℃にて一晩透析した。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、脱塩緩衝液（緩衝液Ａ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含んでいた。
陰イオン交換クロマトグラフィーによりＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、脱塩したタンパク質溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化された１ｍＬ ＵＮＯ−Ｑ１陰イオン交換カラムに、０．５ｍＬ／分の流速で負荷した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを０．５ｍｌ／分の流速で以下のように用いたＮａＣｌ勾配により、結合したタンパク質を溶出した：３％緩衝液Ｂを３ｍＬ、７％緩衝液Ｂを１０ｍＬ、１０ｍＬにわたって７％から１００％の緩衝液Ｂ。カラムからのタンパク質の溶出は、ＵＶ可視検出器を用いて２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍで検出し、ピーク画分を全て貯溜し、タンパク濃度を決定した。等量を液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。精製したＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶタンパク質を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。結果は、最初の小規模実験を裏付けし、単鎖ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが、１００％に近い効率でその二鎖形態に変換されることを示す。
ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二鎖の活性を評価するために、これら毒素を、細胞に基づくアッセイ及び動物に基づくアッセイで評価した。
細胞に基づくアッセイを使用して、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二鎖の活性を試験するために、多重ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した免疫に基づくＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイを、特許出願Fernandez-Salas, et al., Immuno-Based BoNT/A Activity Assays、代理人整理番号第１８３８３号（ＢＯＴ）の記載と本質的に同様に実施した。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ処理細胞溶解産物を分析用に取得するために、ＳｉＭａ細胞系の保存培養に由来するおよそ５０，０００個の細胞を、最少必須培地、アール塩を有する２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ、１×Ｂ２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２５μｇ／ｍＬのＧＴｂ１を含有する無血清培地を含有するポリ−Ｄ−リジン９６ウエルプレートに接種した。成長停止及び神経突起伸張等の標準的及び日常的な形態学的基準で評価して、細胞が区別されるようになるまで（およそ３日間）、これらの細胞を、５％二酸化炭素下にて３７℃のインキュベーター中でインキュベートした。各ウエルから培地を吸引し、０（未処理試料）、０．０１ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．３７ｎＭ、１．１１ｎＭ、３．３３ｎＭ、及び１０．０ｎＭのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを含有する新しい培地と交換した。２４時間処理した後、細胞を洗浄し、毒素なしで更に２日間インキュベートした。細胞を回収するために、培地を吸引し、１×ＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む３０μＬの溶解緩衝を各ウエルに添加することにより溶解し、プレートを、５００ｒｐｍで回転する振とう器で３０分間４℃にてインキュベートした。プレートを４℃にて２０分間４０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞残屑をペレットにし、捕捉抗体でコーティングされた９６ウエルプレートに上清を移して、検出ステップを実施した。
α−ＳＮＡＰ−２５捕捉抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞系２Ｅ２Ａ６に由来する、腹水に含有されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を、標準的プロテインＡ精製プロトコールを使用して精製した。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、ミズーリ州）に、製造業者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）の説明書に従って、ルテニウム（ＩＩ）−Ｔｒｉｓ−ビピリジン−（４−メチスルホナート）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）を結合させた。ＳＮＡＰ−２５切断産物に特異的だった捕捉抗体を含む固相支持体を調製するために、およそ５μＬのα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１×ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）を、９６ウエルＭＳＤ高結合プレートの各ウエルに添加し、溶液を液体蒸発させるために、生物学的安全キャビネット中で溶液を２〜３時間空気乾燥させた。その後、捕捉抗体結合ウエルをブロッキングし、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するために直接使用した。
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ分析により、切断ＳＮＡＰ−２５産物の存在を検出するために、保管したプレートからブロッキング緩衝液を吸引し、ＢｏＮＴ／Ａで処理された細胞に由来する２５μＬの溶解産物を、各ウエルに添加し、プレートを４℃で２時間インキュベートした。細胞溶解産物を吸引し、各ウエルを２００μＬの１×ＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）モノラウレアート（monolaureate））で３回すすぐことにより、プレートウエルを３回洗浄した。洗浄した後、１×ＰＢＳ中２％のＡｍｅｒｓｈａｍ社製ブロッキング試薬、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）を含む、２５μＬの５μｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を各ウエルに添加し、プレートを密閉し、密封したプレートを、振とうしながらで室温で１時間インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体インキュベーションの後、ウエルを、２００μＬの１×ＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）で３回洗浄した。その後、ＥＣＬ画像化装置から得られた生データを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン９．０に移し、４パラメーターロジスティックフィッティングを使用して、用量−反応曲線を定義した。データをプロットした際、４パラメーターロジスティック関数に使用された制約はなかった。グラフによる報告を、以下の分析を使用して生成した：Ｒ２（相関係数）、ａ（データセットの最大値）、ｂ（傾き）、及びX0±ＳＥ（ＥＣ５０値±標準誤差）。２つの独立実験からの結果は、二鎖の活性は両方ともほとんど同一であり、天然二鎖の２倍以内だったことを示す。
動物に基づくアッセイを使用してＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二鎖の活性を試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏ指外転スコア（ＤＡＳ、Digit Abduction Score）を実施した。ＣＤ−１ Ｆｅマウスを計量し、各個別のＤＡＳアッセイにつき、１０匹の動物のサブセットに振り分けた。マウスは、以下の基準に基づいて特定のサブセットに含めた：１）健康が良好であること、２）ロバストな基線ＤＡＳ応答が０であること、３）選択されたサブセットについて確立されたＸ±２ｇの中央値体重範囲内に含まれること、及び４）体重が１７．０ｇを超えること。
各マウスに、５μＬのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの異なる７つの用量（０．０１ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．３７ｎＭ、１．１１ｎＭ、３．３３ｎＭ、及び１０．０ｎＭ）のうちの１つを、３０番ゲージ針を用いて右後肢の腓腹筋に注射した。対照として、左後肢の腓腹筋に、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを一切含有しない５μＬの溶液を注射した。マウスは、最初の４日間連続的にＤＡＳ応答を観察した。ＤＡＳは、各マウスを尾部で持ち上げ、注射した後肢を正確に観察することにより測定した。後指が外転する又は外転しないことにより、筋肉に注射された試験毒素による麻痺の影響が明らかになる。注射された後肢の指外転を、注射されていない後肢の指外転と比較し、それに応じてスコア化した。ＤＡＳデータは、ｕ／ｋｇ及び／又はｎｇ／ｋｇの単位で、ピーク平均ＤＡＳスコア及びＡＵＣ（曲線下面積）に基づき、ＥＤ５０用量を計算することにより分析した。これは、以下のようにして達成された：１）各研究における各用量の平均ピークＤＡＳを計算した；２）任意の試験において５匹を超える死亡を誘発したあらゆる用量を検討から除外した；３）所与の個々の試験で使用された最高用量は、４．０の平均ピークを誘発した最低用量だった；４）所与の個々の試験で使用された最低用量は、０の平均ピークを誘発した最高用量だった；５）個々の試験について、平均ピークＤＡＳ対ｌｏｇ（用量）の曲線を構築した；６）幾つかの試験で、各１０匹マウス群の複数群について、ＡＵＣ値を計算した；７）個々の試験について、平均ＡＵＣ対ｌｏｇ（用量）の曲線を構築した；８）各試験毒素の複数の同一試験の各組について、ｘ、ｙ反復応答曲線を構築した；９）用量反応データを、以下の式を使用した３パラメーターロジスティック式を使用して（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ ｖ８．０；ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、シカゴ、イリノイ州）非線形回帰（非荷重）により分析した：
ｙ＝ａ／（１＋（ｘ／ｘ０）ｂ）
式中、ｙは応答であり、ａは漸近ｙｍａｘであり、ｂは傾きであり、ｘは用量であり、０はＥＤ５０用量である。ピークＥＤ５０を決定するために、Ｙｍａｘを４に設定した（尺度の最大ＤＡＳ測定値）。平均（ピーク及び／又はＡＵＣ）ＥＤ５０値を、実施した各８用量の試験毎に計算した。
２つの独立実験からの結果は、二鎖の活性レベルは両方ともほとんど同一であり、天然二鎖の２倍以内だったことを示す。まとめると、細胞に基づくアッセイ及びＤＡＳアッセイのデータは、細胞内活性化のプロセスが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでニックされた物質と構造的に同等であっただけでなく、機能的にも区別できない二鎖ｒＢｏＮＴ／Ａを産出することを示す。
実施例３
独立したプロモーターの制御下にある２つの異なる発現構築体を使用した、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含むクロストリジウム毒素を細胞内で発現させるのに有用な手順を示す。この場合、二鎖形態の毒素の形成は、独立したプロモーターの制御下にあるＴＥＶプロテアーゼにより制御される。
Ａ． ｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体の構築。
その発現がアラビノースプロモーター（ＰＢＡＤ）の制御下にあったＴＥＶプロテアーゼを組換え的に産生するために、ＴＥＶプロテアーゼ変異体７（表３［１３０］）をコードするオープンリーディングフレームを、Ｎ末端Ｈｉｓタグを除いて、発現ベクターｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡにクローニングして、ｐＢＡＤ／ＴＥＶを構築した。ｐＢＡＤ／ＴＥＶを構築するために、ＴＥＶプロテアーゼ変異体７（配列番号１０６）をコードするオープンリーディングフレームを、Ｎ末端ポリ−ヒスチジンタグを除いて、標準的手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用して合成した。また、合成断片は、このインサートが、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マディソン、ウィスコンシン州）に作用可能に結合されることを可能にする制限部位により隣接されていた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、このインサートを、多重クローニング部位が同じ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターに方向的に正しくライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、ＴＥＶ遺伝子インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、ポリヒスチジン親和性精製ペプチドを含まないＴＥＶ変異体７をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体が得られた。
Ｂ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞の構築。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞を製作するために、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体（実施例２Ａに記載）を、エレクトロポレーションを使用して、ｐＢＡＤ／ＴＥＶ変異体７発現構築体を内包するエレクトロコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を決定した。このクローニング戦略により、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞が得られた。
Ｃ． ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＢＡＤ／ＴＥＶ発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら８時間増殖させ、その後２２℃で振とうしながら１４時間増殖させた。この時点で、ＴＥＶ発現を０．２％Ｌ−アラビノースで誘導し、培養物を２２℃で更に４時間増殖させた。対照として、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
増殖及び誘導の後、実施例１Ｃの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製した。ＩＭＡＣで精製したＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを、二次的イオン交換クロマトグラフィー用に透析するために、ピーク溶出画分を含む貯溜試料を、２５ｋＤ ＭＷＣＯ膜を取付けたＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）で、撹拌しながら１Ｌ脱塩緩衝液中で４℃にて一晩透析した。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、脱塩緩衝液（緩衝液Ａ）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含んでいた。
陰イオン交換クロマトグラフィーによりＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、脱塩したタンパク質溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化された１ｍＬ ＵＮＯ−Ｑ１陰イオン交換カラムに、０．５ｍＬ／分の流速で負荷した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを０．５ｍｌ／分の流速で以下のように用いたＮａＣｌ勾配により、結合したタンパク質を溶出した：３％緩衝液Ｂを３ｍＬ、７％緩衝液Ｂを１０ｍＬ、１０ｍＬにわたって７％から１００％の緩衝液Ｂ。カラムからのタンパク質の溶出は、ＵＶ可視検出器を用いて２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍで検出し、ピーク画分を全て貯溜し、タンパク濃度を決定した。
精製したＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶタンパク質を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。結果は、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが単独で発現される場合、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの単鎖に対応するおよそ１５０ｋＤａのバンドが、還元及び非還元条件下の両方で検出されたことを示す。対照的に、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが、ＰＢＡＤプロモーターの制御下でＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのバンドが還元条件下で観察され、その一方はおよそ５０ｋＤａであり、他方はおよそ１００ｋＤａだった。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは消失し、およそ１５０ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、還元条件下で見られたおよそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの軽鎖及び重鎖に対応し、これらの２つのバンドの存在は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが二鎖を形成したことを示していたことを示す。したがって、これら細胞中でＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、二鎖ループ内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。結果は、９０〜９５％の単鎖ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが、その二鎖形態に変換されることを示す。
実施例４
二重発現構築体を使用した、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム毒素の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素を精製及び定量化するのに有用な手順を示す。
Ａ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ二重発現構築体を構築するために、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの最後の３７個アミノ酸、並びに大腸菌発現に必要な転写（Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター部位）及び翻訳（ＲＢＳ）エレメント、並びにＴＥＶ変異体７のコード領域全体をコードする合成断片（配列番号８９）を、標準的手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ボセル、ワシントン州）を使用して合成した。長さが２０〜５０塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、ＰＵＣＢＨＢ１担体ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ＿Ｃ−ｔｅｒｍ／Ｔ７Ｐｒｏｍ／ＴＥＶプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、ＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００型配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して配列決定することにより確認した。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ発現構築体を生成するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ＿Ｃ−ｔｅｒｍ／Ｔ７Ｐｒｏｍ／ＴＥＶを、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのＣ末端、第２のオープンリーディングフレームの大腸菌発現に必要な転写及び翻訳モチーフ、及びＴＥＶ変異体７のコード領域全体を含むインサートを切除し、２）このインサートが、実施例１ＡのｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶベクターのＢｏＮＴ／Ａ遺伝子の後ろに作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。このインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、類似の制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶベクターにサブクローニングして、配列番号８９の介在性転写及び翻訳エレメントを有するＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼ変異体７オープンリーディングフレームを含む適切なｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性精製タグ及びＴＥＶプロテアーゼに作用可能に結合されたＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９二重発現構築体が得られた。オープンリーディングフレームの構成は、第１のＴ７プロモーターからの転写開始が、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするオープンリーディングフレーム、及びＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを産出するような構成だった。加えて、第２のＴ７プロモーターからの転写開始は、ＴＥＶプロテアーゼのみをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを産出する。したがって、ＴＥＶプロテアーゼをコードする転写物は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶより、２倍多く存在するだろう。
Ｂ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶに由来するＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶ二重発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。約２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら３．５時間増殖させ、その後２２℃で振とうしながら１８．５時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例２Ｄの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。対照として、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。
結果は、単独で発現された場合、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの単鎖に対応するおよそ１５０ｋＤａのバンドが、還元及び非還元条件下の両方で検出されたことを示す。対照的に、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのバンドが還元条件下で観察され、その一方はおよそ５０ｋＤａであり、他方はおよそ１００ｋＤａだった。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは消失し、およそ１５０ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、還元条件下で見られたおよそ５０ｋＤａ及びおよそ１００ｋＤａのバンドは、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの軽鎖及び重鎖に対応し、これらの２つのバンドの存在は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが二鎖を形成したことを示していたことを示す。結果は、単鎖ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが、９５％を超える効率でその二鎖形態に変換されたことも示した。したがって、これら細胞中で二重発現構築体からＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、二鎖ループ内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
Ｃ． ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームの構成を逆にすることが、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの収量及び切断効率に影響を及ぼすことになるか否かを決定するために、第１のＴ７プロモーターからの転写開始が、ＴＥＶ及びＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを産出し、第２のＴ７プロモーターからの転写開始が、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを産出する二重発現構築体を製作した。したがって、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするｍＲＮＡは、ＴＥＶプロテアーゼと比較して、２倍多く存在するだろう。
ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を構築するために、２つの連続するクローニング反応を実施した。まず、ＴＥＶ変異体７（配列番号２２）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９１）を、ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体７発現構築体からＰＣＲで増幅した。ポリ−ヒスチジン親和性タグをコードするオープンリーディングフレームの５’末端を増幅から除外して、タグの付いていないプロテアーゼをコードした。増幅した後、ＰＣＲプライマーによりＰＣＲ産物の末端に組み込まれた固有の制限部位で、ＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、二重発現プラスミドｐＲＳＦｄｕｅｔ−１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）のＭＣＳＩ（多重クローニング部位）の対応する部位にクローニングした。この中間構築体を、ｐＲＳｄｕｅｔ／ＴＥＶと称した。次に、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ−Ａ／ＴＥＶ発現構築体を、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号８８）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号８７）を含むインサートを切除し、２）このインサートが、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶのＭＣＳ２に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、ｐＲＳＦｄｕｅｔベクターのＭＣＳ２にサブクローニングし、適切なｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を得た。このクローニング戦略により、第１のＴ７プロモーターからの転写が、ＴＥＶ及びＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするｍＲＮＡを産生することになり、第２のＴ７プロモーターからの転写が、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみをコードするｍＲＮＡを産生することになる、ｐＲＳＦｄｕｅｔ二重発現構築体が得られた。
このクローニング戦略により、第１のＴ７プロモーターが、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶをコードするオープンリーディングフレームを転写することになり、第２のＴ７プロモーターが、ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングを転写することになるｐＲＳＦｄｕｅｔ二重発現構築体が得られるだろう。
Ｄ． ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
それら自体の独立したｍＲＮＡからＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶのみを産生することができる転写単位構成からのＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ収量及び二鎖への変換効率を決定するために、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶを構築した。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶ二重発現構築体を生成するために、短鎖合成ＤＮＡ断片を使用して、Ｔ７ターミネーター部位（配列番号９２）を、二重発現構築体ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ（上記の実施例３Ａ）のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶのオープンリーディングフレーム間の介在配列に組み込んだ。これは、本質的には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、Ｔ７ターミネーター部位を欠如したｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶの介在領域を、配列番号９３のＴ７終止部位と共に介在性転写及び翻訳エレメントを内包する合成ＤＮＡ断片と交換することにより達成した。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶと称する、その結果生じた二重発現構築体は、それぞれ第１及び第２のＴ７プロモーターから転写される、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性タグ及びＴＥＶプロテアーゼに作用可能に結合されたＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ変異体をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
Ｅ． ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶ二重発現構築体、ｐＲＳＦ／ＴＥＶ／２×ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体、又はｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶ二重発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用した以外は、本質的に実施例２Ｄの記載と同様に、自己誘導条件下での二鎖形態のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶの増殖及び誘導を実施し、これら細胞系の各々からの単一コロニーを使用して、４つの１．０ｍＬ培養に並行して播種した。増殖及び誘導した後、４つの１．０ｍＬの複製物を、プロセシング用に一緒に貯溜した。実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。対照として、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンのみを選択剤として使用した以外は、上述のように増殖及び誘導した。結果は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶが、３つの二重発現構築体のうちのいずれかを含有する細胞から全く同等なレベルで発現されたが、二鎖への変換の程度は様々であったことを示す。単鎖ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶは、タンパク質が、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／２×ＴＥＶから発現された場合は、約９６％の効率で、タンパク質が、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶ／ＴＥＶから発現された場合は、約８１％の効率で、タンパク質が、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶから発現された場合は、約９９％を超える効率で、その二鎖形態に変換された。
実施例５
二重発現構築体を使用した、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、本明細書で開示される外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な手順を示す。
Ａ． ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を構築するために、ｐＥＴ２９／ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、１）ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号９５）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９４）を含むインサートを切除し、２）このインサートが、ＴＥＶ変異体７をＭＣＳＩに内包するｐＲＳＦｄｕｅｔ−１ベクターであるｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ（実施例３Ｃに記載）のＭＣＳ２に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ構築体のＭＣＳ２にサブクローニングし、適切なｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、第１のＴ７プロモーターからの転写が、ＴＥＶ及びＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶをコードするｍＲＮＡを産生することになり、第２のＴ７プロモーターからの転写が、ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのみをコードするｍＲＮＡを産生することになる、ｐＲＳＦｄｕｅｔ二重発現構築体が得られた。
Ｂ． ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら８時間増殖させ、その後１６℃で振とうしながら１８時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例２Ｄの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。対照として、ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、上述のように増殖及び誘導した。
結果は、単独で発現された場合、ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの単鎖に対応するおよそ１０２ｋＤａのバンドが、還元及び非還元条件下の両方で検出されたことを示す。対照的に、ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのバンドが還元条件下で観察され、その一方はおよそ５０．８ｋＤａであり、他方はおよそ５１．３ｋＤａだった。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０．８ｋＤａ及びおよそ５１．３ｋＤａのバンドは消失し、およそ１０２ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、還元条件下で見られたおよそ５０．８ｋＤａ及びおよそ５１．３ｋＤａのバンドが、それぞれクロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びノシセプチン標的化部分がそのアミノ末端に結合されたクロストリジウム毒素移行ドメインに対応することを示す。これら２つのバンドの存在は、ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの二鎖が形成されたこと、及び単鎖ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶが、９５％を超える効率でその二鎖形態に変換されたことを示した。したがって、これら細胞中で二重発現構築体からＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
Ｃ． ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶとほとんど同じように生成した。ｐＥＴ２９／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、１）ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号９７）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９６）を含むインサートを切除し、２）このインサートが、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ（実施例３Ｃに記載）のＭＣＳ２に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ構築体のＭＣＳ２にサブクローニングし、適切なｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、第１のＴ７プロモーターからの転写が、ＴＥＶ及びＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶをコードするｍＲＮＡを産生することになり、第２のＴ７プロモーターからの転写が、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのみをコードするｍＲＮＡを産生することになる、ｐＲＳＦｄｕｅｔ二重発現構築体が得られた。
Ｄ． ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら８時間増殖させ、その後１６℃で振とうしながら１８時間増殖させた。細胞を、遠心分離でペレットにした。実施例２Ｄの記載と本質的に同様に、細胞を溶解し、ＩＭＡＣ精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。対照として、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのみを内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、上述のように増殖及び誘導した。
結果は、単独で発現された場合、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの単鎖に対応するおよそ１０２ｋＤａのバンドが、還元及び非還元条件下の両方で検出されたことを示す。対照的に、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのバンドが還元条件下で観察され、その一方はおよそ５０．８ｋＤａであり、他方はおよそ５２ｋＤａだった。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０．８ｋＤａ及びおよそ５２ｋＤａのバンドは消失し、およそ１０２ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、およそ５０．８ｋＤａのバンドが、クロストリジウム毒素酵素ドメインに対応し、およそ５２ｋＤａのバンドが、ダイノルフィン標的化部分がそのアミノ末端に結合されたクロストリジウム毒素移行ドメインに対応することを示す。これら２つのバンドの存在は、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの二鎖が形成されたこと、及び単鎖ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶが、９５％を超える効率でその二鎖形態に変換されたことも示す。したがって、これら細胞中で二重発現構築体からＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
実施例６
２つの異なる発現構築体を使用した、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、別々のプラスミドから発現され、異なるプロモーターの制御下にある、本明細書で開示される統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
Ａ． ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体の構築。
ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を構築するために、まずｐＥＴ２９／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、制限エンドヌクレアーゼで消化して、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメインを含む二鎖ループをコードするＤＮＡセグメントを切除した。その結果生じたｐＥＴ２９／ＬＨｎ／Ａフレームワーク断片を、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメイン（配列番号９９）を含む二鎖ループを含む、適合する制限部位で挟まれた合成ＤＮＡ断片（配列番号９８）とライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの発現がＴ７プロモーターの制御下にある、ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号１０１）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１００）を含むｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を得た。
Ｂ． ｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体の構築。
ＴＥＶがコールドショックプロモーター（ｃｓｐ）の制御下にある発現構築体を生成するために、ＴＥＶ変異体７（配列番号２２）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９１）を、ｐＥＴ２９／ＴＥＶ変異体７発現構築体からＰＣＲで増幅した。ポリ−ヒスチジン親和性タグをコードするオープンリーディングフレームの５’末端を増幅から除外して、タグの付いていないプロテアーゼをコードした。増幅した後、ＰＣＲプライマーによりＰＣＲ産物の末端に組み込まれた固有の制限部位で、ＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、発現プラスミドｐＣｏｌｄＩＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、マディソン、ウィスコンシン州）の多重クローニング部位の対応する部位にクローニングした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、コールドショックプロモーターの制御下にＴＥＶ変異体７をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体を得た。
Ｃ． ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞の構築。
ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞を製作するために、ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、エレクトロポレーションを使用して、ｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶを内包するエレクトロコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。両発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン−カナマイシン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両構築体の存在を確認した。このクローニング戦略により、ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体を含む細胞を得た。
Ｄ． ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＣｏｌｄＩＶ／ＴＥＶ発現構築体を内包するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを播種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。約２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振盪とうしながら８時間増殖させ、その後１５℃で振盪とうしながら１８時間増殖させた。細胞を溶解し、Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ樹脂を使用してＩＭＡＣ精製した。
Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ精製により二鎖ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、２５０ｍＬ発現培養に由来する誘導された細胞を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０容積／容積％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、１Ｍ ＮａＣｌで構成される１６ｍＬの冷却（４〜６℃）ＩＭＡＣ洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁物を、密閉大気治処理チャンバー（＃１０１−０２１−００６、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）に移し、パルス間に１分間の間隔をおいた１５回のパルス（１０秒間、３０％振幅、０．５インチ破砕ホーン）で超音波処理した（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）Ｄｉｇｉｔａｌ ４５０型、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）。超音波処理中、冷却水を循環水浴（３．５℃）からチャンバーの外部ジャケットに通すことにより、密閉大気治処理チャンバーを冷却した。超音波処理した物質を、処理チャンバーからきれいなＯａｋｒｉｄｇｅチューブに移し、４℃にて３０分間、３０，５００ＲＣＦで遠心分離して（ＳＬ−５０Ｔローター、Ｓｏｒｖａｌｌ社製；ＦＩＢＥＲＬｉｔｅ（登録商標）Ｆ２１Ｓ−８Ｘ５０ローター、Ｐｉｒａｍｏｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）、不溶性細胞残屑を除去した。清澄化した溶解産物を、注射器で吸引し、まず０．８μｍ注射器フィルターで、その後０．４５μｍ注射器フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で連続してろ過して、きれいな５０ｍＬコニカルチューブに入れた。Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ（商標）タンパク質精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、ウィスコンシン州）をボルテックスして均一な懸濁物にし、４ｍＬの懸濁物を、清澄化した溶解産物に移した。チューブを密閉し、数回逆さまにして、粒子を十分に混合した。混合物を穏やかに揺動させながら３分間インキュベートして、１６℃で目的タンパク質に結合させた。チューブを、ＭａｇｎｅＳｉｌ磁気分離ユニット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、ウィスコンシン州）に移し、約２分間、樹脂粒子を捕捉させた。上清溶液を除去し、チューブを分離ユニットから取り外した。その後、樹脂を、１０ｍＬのＩＭＡＣ洗浄緩衝液に再懸濁し、磁気分離ユニットで捕捉し、洗浄緩衝液を除去した。洗浄ステップを、更に２回繰り返した。目的タンパク質を溶出するために、樹脂を、５ｍＬのＭａｇｎｅ−Ｈｉｓ（商標）溶出緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、室温で２分間インキュベートし、樹脂を磁気分離ユニットで捕捉し、上清溶液を新しいチューブに移した。溶出ステップをもう一度繰り返した。
ＩＭＡＣで精製したＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを、二次のイオン交換クロマトグラフィー用に透析するために、貯溜溶出画分を、２５ｋＤ ＭＷＣＯ膜を取付けたＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）で、撹拌しながら１Ｌ脱塩緩衝液中で４℃にて一晩透析した。
陰イオン交換クロマトグラフィーにより二鎖ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、脱塩したタンパク質溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化された１ｍＬ ＵＮＯ−Ｑ１陰イオン交換カラムに、１ｍＬ／分の流速で負荷した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを１ｍｌ／分の流速で以下のように用いたＮａＣｌ勾配により、結合したタンパク質を溶出した：７％緩衝液Ｂを３ｍＬ、１５％緩衝液Ｂを７ｍＬ、１０ｍＬにわたって１０％から５０％の緩衝液Ｂ。カラムからのタンパク質の溶出は、ＵＶ可視検出器を用いて２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍで検出し、ピーク画分を全て貯溜し、タンパク濃度を決定した。等量を液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。精製したＢｏＮＴ／Ａ−ＴＥＶタンパク質を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。
結果は、ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現された場合、２つのほとんど重なり合うバンドが、還元条件下で観察され、一方はおよそ５１．１ｋＤａであり、他方はおよそ５２．１ｋＤａだったことを示す。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５１．１ｋＤａ及び５２．１ｋＤａの２つのバンドは消失し、およそ１０３ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、およそ５１．１ｋＤａのバンドが、クロストリジウム毒素酵素ドメインに対応し、およそ５２．１ｋＤａのバンドが、ガラニン標的化部分がそのアミノ末端に結合されたクロストリジウム毒素移行ドメインに対応することを示す。これら２つのバンドの存在は、ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの二鎖が形成されたこと、及び単鎖ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶが、およそ９０％の効率でその二鎖形態に変換されたことも示す。したがって、これら細胞中で独立したプラスミドからＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
実施例７：
二重発現構築体を使用した、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含むタンパク質の予想される細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、二重発現プラスミドから発現される、本明細書で開示される統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
Ａ． ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
以前に構築されたｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＮｏｃｉＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ（実施例４を参照）と同様なｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を構築するために、ｐＥＴ２９／ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ発現構築体を、１）ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ（配列番号１０１）をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号１００）を含むインサートを切除し、２）このインサートが、ＭＣＳＩにＴＥＶ変異体７を内包するｐＲＳＦｄｕｅｔ−１ベクターであるｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ（実施例３Ｃに記載）のＭＣＳ２に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化することになる。ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ構築体のＭＣＳ２にサブクローニングし、適切なｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２ｘＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を得ることになる。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させることになる。発現構築体を含有する細菌を、カナマイシン耐性コロニーとして特定し、候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認することになる。このクローニング戦略により、第１のＴ７プロモーターからの転写が、ＴＥＶ及びＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶをコードするｍＲＮＡを産生することになり、第２のＴ７プロモーターからの転写が、ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのみをコードするｍＲＮＡを産生することになる、ｐＲＳＦｄｕｅｔ二重発現構築体が得られることになる。
Ｂ． ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
自己誘導条件下で二鎖形態のＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを産生するために、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に、ｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、３７℃で振とうしながら一晩増殖させることになる。２５０μＬのこの開始培養を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２に播種し、３７℃で振とうしながら８時間増殖させ、その後１６℃で振とうしながら１８時間増殖させることになる。実施例５Ｄに記載のように、細胞を遠心分離によりペレットにし、溶解し、ＩＭＡＣ精製し、脱塩し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製することになる。精製した目的タンパク質を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、還元及び非還元条件下の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ゲルを染色して、発現レベル及びｐＲＳＦｄｕｅｔ／ＴＥＶ／２×ＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体から産生されるＧａｌＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶがその二鎖形態に変換される程度を評価することになる。
実施例８
ＢＥＶＳ中の二重発現構築体を使用した、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメインを含むタンパク質の細胞内活性化
以下の例は、目的タンパク質及びプロテアーゼが、二重発現構築体で同時発現され、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）の２つの異なるプロモーターの制御下にある、本明細書で開示される統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む二鎖ループを含むあらゆるタンパク質を精製及び定量化するのに有用な方法を示す。
Ａ． ｐＢＡＣ−６／ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体の構築。
ｐＢＡＣ−６／ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を構築するために、ｐ１０プロモーター配列の下流にある組換えＴＥＶ変異体７、及び反対の方向性でｐｏｌＨプロモーター配列の下流にあるＤｙｎＬＨｎ／Ａ−ＴＥＶをコードする合成断片（配列番号１０７）を、標準的手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ボセル、ワシントン州）を使用して合成した。長さが２０〜５０塩基の相補的オリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト合成を使用して合成した。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖二重構造体にし、その後それを一緒にライゲーションして、全長ポリヌクレオチド分子を組立てた。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を使用して、ｐＵＣＢＨＢ１担体ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ｐ１０−ＴＥＶ／ｐｏｌＨ−ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶプラスミドを生成した。合成したポリヌクレオチド分子は、ＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００型配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して配列決定することにより確認した。
ｐＢＡＣ−６／ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体を生成するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ｐ１０−ＴＥＶ／ｐｏｌＨ−ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを、１）ｐ１０プロモーターの制御下にあるＴＥＶ変異体７、及びｐｏｌＨプロモーターの制御下にある方向性が反対のＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのコード領域全体を含むインサートを切除し、２）このインサートが、ｐＢＡＣ−６トランスファーベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）に作用可能に結合されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼで消化した。このインサートを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を使用して、類似の制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＢＡＣ−６トランスファーベクターにサブクローニングし、ｐ１０プロモーターの下流にＴＥＶプロテアーゼ変異体７オープンリーディングフレーム、及びｐｏｌＨプロモーターの下流にＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの第２のオープンリーディングフレームを含む、操作されたｐＢＡＣ−６二重発現構築体を得た。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトローコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．５％ＬＢ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに置いて一晩増殖させた。発現構築体を含有する細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして特定した。候補構築体を、アルカリ溶菌プラスミドミニプレップ手順を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、両ＤＮＡ鎖を配列決定して、インサートの存在及び完全性を確認した。このクローニング戦略により、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性精製タグ及びＴＥＶプロテアーゼに作用可能に結合されたＤｙｎＬＨ／Ａ−ＴＥＶをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＣ−６二重発現構築体が得られた。
Ｂ．高力価ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ組換えバキュロウイルスストックの生成。
二鎖形態のＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを産生し得る前に、ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを含む高力価組換えバキュロウイルスストックを生成した。およそ２×１０６個のＳｆ９昆虫細胞を、３５ｍｍ皿中の２ｍＬ容積の昆虫細胞培養培地ＥＳＦ９２１に接種した。溶液Ａ（２μｇのｐＢＡＣ−６／ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ、０．５μｇの線形化ｆｌａｓｈ ＢＡＣバキュロウイルスＤＮＡ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、オックスフォード、英国）、及び１００μＬの形質移入培地を含む）と溶液Ｂ（６μＬのＴＲＡＮＳＬＴ（登録商標）−２０２０形質移入試薬及び１００μＬの形質移入培地を含む）を混合し、室温で３０分間インキュベートすることにより、形質移入溶液を調製した。次に、更なる８００μＬの形質移入培地を、溶液Ａ／Ｂ混合物に添加し、穏やかに混合し、細胞に滴加した。細胞を２８℃で５時間インキュベートし、その終了時に、３ｍＬのＥＳＦ９２１を添加して、各ウエルの最終容積を４ｍＬにした。Ｐ０組換えウイルスを産生するために、インキュベーションを２８℃で４〜５日間継続した。より高力価のＰ１組換えバキュロウイルス種ストックを生成するために、Ｐ０上清から単離したウイルスを、ｂａｃｕｌｏＱＵＡＮＴ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、オックスフォード、英国）を使用して滴定し、振とうフラスコで更に増幅した。２×１０６細胞／ｍＬの密度の約１００〜２００ｍＬのＳｆ９細胞を、ＭＯＩ（感染多重度）＜１ｐｆｕ／細胞でＰ０ウイルスに感染させ、振とうさせながら４〜５日間インキュベートした。定量化した後、高力価Ｐ１ストックを使用して、高レベルタンパク質発現用のＴｎｉ細胞に感染させた。
Ｃ． ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶのｉｎ ｓｉｔｕ活性化。
二鎖形態のＤｙｎＨＮ／Ａ−ＴＥＶを生成するために、１×１０６／ｍＬの濃度の５０ｍＬ Ｔｎｉ細胞を、５のＭＯＩで、ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを含む組換えＰ１ウイルスストックに感染させ、感染後（ｐｉ）３日目に回収した。細胞を溶解し、Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ樹脂を使用してＩＭＡＣ精製した。
Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ精製により二鎖ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、細胞ペレットを、１００μＬのＩｎｓｅｃｔ ＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ試薬及び２０μＬ（１０Ｕ）のＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼの存在下で、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋を含まない２０ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。４℃で１５分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離することにより細胞溶解産物を清澄化した後、上清を、均一に懸濁された４ｍＬのＭａｇｎｅ−Ｈｉｓ（商標）タンパク質精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社、マディソン、ウィスコンシン州）と混合した。混合物を穏やかに揺動させながら室温で２０分間インキュベートして、目的タンパク質に結合させた。チューブを、約２分間、ＭａｇｎｅＳｉｌ磁気分離ユニットに移し、樹脂粒子を捕捉した。上清を除去した後、チューブを分離ユニットから取り外し、樹脂を、１０ｍＬのＩＭＡＣ洗浄緩衝液に再懸濁した。再び、樹脂を磁気分離ユニットで捕捉し、洗浄緩衝液を除去した。洗浄ステップを、更に２回繰り返した。目的タンパク質を溶出するために、樹脂を、２．５ｍＬのＭａｇｎｅ−Ｈｉｓ（商標）溶出緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、室温で２分間インキュベートし、樹脂を磁気分離ユニットで捕捉し、上清溶液を新しいチューブに移した。溶出ステップを再び繰り返して、磁性樹脂からの標的回収を最大化した。
ＩＭＡＣで精製したＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを、二次のイオン交換クロマトグラフィー用に透析するために、貯溜溶出画分を、２５ｋＤ ＭＷＣＯ膜を取付けたＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）で、常に撹拌しながら１Ｌ脱塩緩衝液中（緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で４℃にて一晩透析した。
陰イオン交換クロマトグラフィーにより二鎖ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶを精製するために、脱塩したタンパク質溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化された１ｍＬ ＵＮＯ−Ｑ１陰イオン交換カラムに、１ｍＬ／分の流速で負荷した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを１ｍＬ／分の流速で以下のように用いたＮａＣｌ勾配により、結合したタンパク質を溶出した：７％緩衝液Ｂを３ｍＬ、１５％緩衝液Ｂを７ｍＬ、１０ｍＬにわたって１０％から５０％緩衝液Ｂ。カラムからのタンパク質の溶出は、ＵＶ可視検出器を用いて２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍで検出し、ピーク画分を全て貯溜し、タンパク濃度を決定した。等量を−２０℃で保存した。精製したＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶタンパク質を、実施例１Ｂの記載と本質的に同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲルを染色した。
結果は、昆虫細胞中でＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼと同時発現され、ほぼ同質性に精製される場合、２つのほとんど重なり合うバンドが、還元条件下で観察され、一方はおよそ５１ｋＤａであり、他方はおよそ５２ｋＤａだったことを示す。更に、同じ試料を非還元条件下で流した場合、およそ５０ｋＤａ及び５２ｋＤａの２つのバンドは消失し、およそ１０２ｋＤａの新しいバンドが観察された。まとめると、これらの観察は、およそ５１ｋＤａのバンドが、クロストリジウム毒素酵素ドメインに対応し、およそ５２ｋＤａのバンドが、ダイノルフィン標的化部分がそのアミノ末端に結合されたクロストリジウム毒素移行ドメインに対応することを示す。これら２つのバンドの存在は、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの二鎖が形成されたこと、及び単鎖ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶが、８０〜９０％の効率でその二鎖形態に変換されたことも示す。したがって、ｐＢＡＣ−６／ＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ二重発現構築体から生成されたＴＥＶ／ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞中で、ＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ及びＴＥＶプロテアーゼが同時発現されると、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン内に位置するＴＥＶプロテアーゼ切断部位でのＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶ切断、及びその後の二鎖形態のＤｙｎＬＨＮ／Ａ−ＴＥＶの形成がもたらされる。
本発明の態様は、開示された実施形態に関して記述されているが、当業者であれば、開示された特定の例は、これら態様の単なる例示に過ぎず、いかなる点においても本発明を制限するものではないことを容易に認識するだろう。本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改変をなすことができる。

Claims (15)

  1. 二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
    ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約３．５時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
    ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
    ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
    ｂ）前記細胞を２２℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
    ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖クロストリジウム毒素及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
    前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより前記単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。
  2. 前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
  3. 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  4. 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  5. 前記クロストリジウム毒素結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、又はＢｕＮＴ結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  6. 単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
    ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
    ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む前記単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
    ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
    ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
    ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
    前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
  7. 前記タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項６に記載の細胞内方法：１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、３）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、４）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイドの結合ドメイン。
  8. 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  9. 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  10. 前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ＢＡＭ２２結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
  11. 単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
    ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
    ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
    ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
    ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
    ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
    前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
  12. 前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
  13. 前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
  14. 前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
  15. 前記非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
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