JP2003507073A - 活性化可能な組換え神経毒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 活性化可能な組換え神経毒およびそれ由来のポリペプチドを含む組成物。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸、およびそのようなポリペプチドおよび核酸の作成方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 この出願は、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）に基づき、引用により本明細書中
に包含される１９９９年８月２５日提出の仮出願第６０／１５０，７１０号の優
先権を主張する。

【０００２】発明の属する分野 本発明は、神経生物学、分子生物学、および医学の分野で有用な方法および組
成物、ならびに潜在的な毒性治療物質およびその誘導体の製造方法に関する。本
発明はまた、治療物質、トランスポーター分子、付加生成物などとして使用する
ための、組換えクロストリディウムの神経毒（特にボツリヌス神経毒(botulinum
neurotoxins)）、その修飾バージョン、およびそのような分子の作成方法に関
する。

【０００３】発明の背景 神経毒、例えばクロストリディウムボツリヌス（Clostridium botulinum）お
よびクロストリディウムテタヌス（Clostridium tetani）から得られた神経毒は
、神経細胞および、治療目的でその細胞内へデリバリーされたときの他の細胞の
非常に強力かつ特異的な毒物である。これらのグラム陽性細菌は、互いに関連し
ているが区別される２種類のトキシンタイプを発現し、それぞれはジスルフィド
結合した２個のアミノ酸鎖：約５０ＫＤａの軽鎖（Ｌ）および約１００ＫＤａの
重鎖（Ｈ）を含み、これらの疾患症状の全面的な原因である。ホロトキシンはイ
ンビボで単一鎖として合成され、次いで翻訳後修飾においてニックされ、分離さ
れたＬおよびＨ鎖と含む活性な神経毒を形成する。

【０００４】 テタヌスおよびボツリヌストキシンはヒトに対して最も致命的な既知の物質に
含まれ、そのヒトにおける致死量は０．１ｎｇ〜１ｎｇ／体重ｋｇである。Tone
llo et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 389:251-260 (1996)。両トキシンは、影
響されるニューロンにおける神経伝達物質の放出を阻害することによって機能す
る。テタヌス神経毒（ＴｅＮＴ）は主に中枢神経系において作用し、一方ボツリ
ヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、末梢神経系の神経筋結合部および他のコリン作動性
シナプスで作用し、両者は影響を受けるニューロンの軸索からシナプスへのアセ
チルコリン放出を阻害することによって麻痺を引き起こす。

【０００５】 テタヌス神経毒（ＴｅＮＴ）は免疫学的にはっきり区別される１個の型（タイ
プ）として存在することが知られており；ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、Ｂ
ｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇと称される７個の異なる免疫原性として存在すること
が知られている。これらのすべての型はＣ．ボツリヌスの単離体から生産される
が、他の二種、Ｃ．バラチ（C. baratii）および Ｃ．ブチリカム（C. butyricu
m）もまた、それぞれ／Ｆおよび／Ｅと類似するトキシンを生産する。例えば、
引用によりその開示内容が本明細書中に包含される、Coffield et al., The Sit
e and Mechanism of Action of Botulinum Neurotoxin in Therapy with Botuli
num Toxin 3-13 (Jankovic J. & Hallett M. eds. 1994) を参照のこと。

【０００６】 型にかかわらず、毒化の分子的機構は同様であると思われる。この過程の最初
の段階では、トキシンが、その重鎖と細胞表面レセプターとの特異的相互作用に
より標的ニューロンのシナプス前膜（presynaptic membrane）に結合する；この
レセプターはボツリヌストキシンの各型およびＴｅＮＴによって異なると思われ
る。Dolly et al., Seminars in Neuroscience 6:149-158 (1994)（これは引用
により本明細書中に包含される）。重鎖のカルボキシ末端は細胞表面へのトキシ
ンの標的化に重要であると思われる。Ｉｄ．

【０００７】 第二の段階では、トキシンは毒化される細胞の原形質膜を通過する。トキシン
はまず、レセプター媒介性のエンドサイトーシスによって細胞に包み込まれ、こ
のトキシンを含むエンドソームが形成される。次いでトキシンはエンドソームか
ら細胞の細胞質に漏出する。この最後の過程はＨ鎖のアミノ末端によって媒介さ
れると考えられ、これにより約５．５またはそれ以下のｐＨに応じてトキシンの
コンフォメーション変化が引き起こされる。エンドソームは、エンドソーム内の
ｐＨを減少させるプロトンポンプを有していることが既知である。コンフォメー
ションシフトはトキシン内の疎水性残基を暴露させ、これによりトキシンがエン
ドソーム膜にはまり込むことが可能になる。次いでこのトキシンはエンドソーム
膜を介してサイトソルへ移動する。

【０００８】 ボツリヌストキシン活性の機構の最後の段階には、Ｈ鎖と軽（Ｌ）鎖を連結す
るジスルフィド結合の還元が関与すると思われる。ボツリヌスおよびテタヌスト
キシンの完全毒性活性はホロトキシン（holotoxin）のＬ鎖に含有される；この
Ｌ鎖は亜鉛（Ｚｎ^＋＋）エンドペプチダーゼであり、これは神経伝達物質含有小
胞が原形質膜の細胞質表面を認識結合し、原形質膜と融合するのに必要不可欠な
タンパク質を選択的に開裂させる。ＴｘＮＴ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、Ｂ
ｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇは、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプト
ブレビン２（小胞関連性の膜タンパク質（ＶＡＭＰ）と称されることもある）の
分解を引き起こす。シナプス小胞表面から延長するＶＭＡＰのサイトソルドメイ
ンのほとんどがいずれか１つのこれら開裂イベントの結果として除去される。各
トキシン（ＴｅＮＴおよびＢｏＮＴ／Ｂを除く）はそれぞれ別個の結合を特異的
に開裂させる。

【０００９】 ＢｏＮＴ／Ａおよび／Ｅは選択的に、原形質膜関連タンパク質ＳＮＡＰ−２５
を開裂させる；このタンパク質は主に原形質膜のサイトソル表面に結合して存在
する。ＢｏＮＴ／Ｃは、その大部分がサイトソルに暴露されている複合タンパク
質であるシンタキシンを開裂させる。シンタキシンはシナプス前末端活性領域で
カルシウムチャンネルと相互作用する。引用によりその開示内容が本明細書の部
分として包含される Tonello et al., Tetanus and Botulism Neurotoxins in I
ntracellular Protein Catabolism 251-260 (Suzuki K & Bond J. eds. 1996)
を参照のこと。

【００１０】 ＴｅＮＴおよびＢｏＮＴはともに神経筋接合部において取り込まれる。ＢｏＮ
Ｔは末梢ニューロン内に留まり、これらの細胞から神経伝達物質であるアセチル
コリンが放出するのを遮断する。そのレセプターを介して、ＴｅＮＴは、軸索に
沿って細胞体にまで逆行して移動する小胞に入り、運動性ニューロンと脊髄の阻
害性ニューロンの間のシナプス内間隙へ放出される。この時点でＴｅＮＴは阻害
性ニューロンのレセプターと結合し、再び内部移行し、軽鎖はサイトソルに入り
、これらの細胞からの阻害性神経伝達物質、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）および
グリシンの放出を遮断する。

【００１１】 その特異的な局在化作用のため、１９８１年以降、斜視（眼の調整不良）、眼
瞼痙攣（bephlarospasm、不随意のまぶた閉鎖）および片側顔面痙攣を含む種々
の痙攣性症状の患者の処置における治療物質としてＢｏＮＴの微小用量を用いて
きた。例えば、引用により本明細書中に包含される Borrodic et al., Pharmaco
logy and Histology Botulinum Toxin in Therapy with Botulinum Toxin 3-13
(Jankovic J. & Hallett M. eds. 1994) を参照のこと。７個のトキシン型（タ
イプ）のうち、ＢｏＮＴ／Ａは最も強力なＢｏＮＴであり、最も詳しく特徴付け
されている。また、痙攣性組織に少量のＢｏＮＴ／Ａを筋肉内注射し、脳損傷、
脊髄損傷、発作（stroke）、多発性硬化症および脳性麻痺による痙攣性を効率的
に処置した。麻痺の程度は、標的部位に供給（デリバリー）される用量および投
与容量の両方に依存する。

【００１２】 Ｌ鎖は神経興奮に関連する部分であるが、毒性であるためには神経細胞質にデ
リバリーされなければならない。同様に、単一鎖ホロトキシンプロ型は、Ｈおよ
びＬ鎖間の暴露されたループ領域中の１またはそれ以上のペプチド結合で分解さ
れ、完全に活性な成熟神経毒を創出するまでは、比較的低い毒性を示す。上に提
供される機構に示されるように、各神経毒のＨ鎖は細胞レセプター結合およびエ
ンドサイトーシスに不可欠である一方、Ｌ鎖およびＨ鎖（および無傷のジスルフ
ィド結合）はともにトキシンの細胞質への転位に必要とされる。上に示すように
、Ｌ鎖のみがアセチルコリン分泌の阻害によって引き起こされる毒性に関連する
。

【００１３】 クロストリディウム神経毒調製物の明確な治療効果にもかかわらず、このトキ
シンの産業的生産は困難である。嫌気性クロストリディウム培養由来の神経毒の
生産は、数回のタンパク質沈降工程および、延長された繰り返しのトキシンの結
晶化または数段階のカラムクロマトグラフィーを含む多段階の精製プロトコルが
関与する厄介で時間のかかるプロセスである。重大なことに、生成物の高い毒性
のせいで、手順を厳格抑制（ＢＬ−３）下で行わなければならない。発酵プロセ
スの間、フォールディングされた単一鎖神経毒は、内因性のクロストリディウム
プロテアーゼによりニッキングと呼ばれるプロセスを介して活性化される。これ
には、この単一鎖から約１０アミノ酸残基を除去して二鎖型を創出し、ここにこ
の２つの鎖は鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合されたままである。

【００１４】 ニックされた神経毒は、ニックされていない型よりずっと活性である。ニッキ
ングの量および正確な位置は、トキシンを生産する細菌の血清型（serotype）に
よって変化する。単一鎖神経毒の活性化における差異および、これゆえのニック
されたトキシンの収量は、与えられた株によって生産されるタンパク質分解活性
のタイプおよび量の変化に依存する。例えば９９％以上のＣ．ボツリヌスＡ型単
一鎖神経毒は Ｈａｌｌ Ａ Ｃ．ボツリヌス株によって活性化されるが、Ｂ型お
よびＥ型株はより低量の活性化（発酵時間に依存して０〜７５％）を伴うトキシ
ンを生産する。したがって、高い毒性の成熟神経毒は、治療物質としての神経毒
の商業的製造の主要な部分を担う。

【００１５】 したがって、操作されたクロストリディウムトキシンの活性化の程度は、これ
らの物質の製造に関する重要な考察である。迅速に生育する細菌（例えば異種大
腸菌）中、神経毒、例えばＢｏＮＴおよびＴｅＴｘを、安全であり、単離が容易
であり、単純に完全な活性形態に変換される比較的無毒の単一鎖（または減少し
た毒性活性を有する単一鎖）として高収量で発現できれば、重要な利点であるだ
ろう。

【００１６】 主要な関心が安全性である場合、以前の仕事は大腸菌における発現、およびＴ
ｅＴｘおよびＢｏＮＴの個々のＨおよびＬ鎖の精製に集中していた；これらの単
離鎖は、それ自身、無毒である；引用により本明細書中に包含される Li et al.
, Biochemistry 33:7014-7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34:15175-1
5181 (1995) を参照。これらのペプチドを分離精製した後、厳重に制御された条
件下で、ＨおよびＬサブユニットを酸化的ジスルフィド結合によって結合し、神
経麻痺性の二鎖を形成させる。不幸なことに、この戦略はいくつかの欠点を有す
る。

【００１７】 第一に、個々の鎖を大量に発現し、単離することは実際的ではなく；特にＬ鎖
の不存在下、単離されたＨ鎖は、水溶液中、完全に不溶性であり、タンパク質分
解を非常に受けやすい。第二に、個別に発現され、精製されたＨおよびＬ鎖をイ
ンビトロで酸化して活性な二鎖を製造することは非常に非効率的であり、低収量
の活性なトキシンしか生じさせず、多くの不活性なまちがってフォールディング
されたか、あるいは酸化された形態を生産する。正しくフォールディングされ、
かつ酸化されたＨおよびＬ鎖を含有するトキシンの精製は、これらの不活性型お
よび未反応の分離のＨおよびＬ鎖からの分離が難しく、困難である。

【００１８】 したがって、クロストリディウム神経毒を不活性な（あるいは低活性な）単一
鎖型として発現させ、時間消費および非効率的な構成鎖の認識の必要を排除し、
タンパク質鎖の溶解性を維持し、タンパク質のミスフォールディングおよび結果
としてのプロテアーゼ攻撃の受けやすさを減少させ、トキシン収量を改善し、な
らびに／あるいはこのトキシンの精製の単純な方法を提供することは有用であり
、有益であろう。

【００１９】 さらに、これらのトキシンを操作して単一鎖の、新規治療性質および／または
より長期間の作用を有する修飾神経毒分子または、治療部分を神経または他の細
胞型にデリバリー可能な輸送分子として使用するための毒性または無毒の形態を
提供することは有用であろう。このようなタンパク質を単一鎖として発現するこ
とにより、操作されたタンパク質の収量および精製が広く改善されるだろう。

【００２０】発明の要旨 本発明は、機能的結合ドメイン、転位ドメイン、および治療ドメインを含む単
離された組換えタンパク質であって、ここにまた、単一鎖として発現された後、
インビトロで特異的分解を受けやすいアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。
このようなタンパク質には、クロストリディウム神経毒およびその誘導体、例え
ば米国特許第５，９８９，５４５号および国際特許出願ＷＯ９５／３２７３８（
これらは引用により本明細書中に包含される）に開示されているタンパク質が含
まれ得る。

【００２１】 本発明の一態様では、タンパク質は、クロストリディウム神経毒Ｈ鎖の機能的
ドメインおよびクロストリディウム神経毒Ｌ鎖のいくつかまたはすべての機能部
分を単一のポリペプチド鎖中に含み、ＨドメインおよびＬドメイン間に位置する
挿入タンパク質分解部位を有し、これによりこの単一鎖タンパク質は分解（開裂
）され、好ましくはジスルフィド結合によって共有結合している個々の鎖を作成
することができるものである。本発明はまた、このようなタンパク質の作成方法
および細胞内におけるその発現方法、ならびにこのようなタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列領域のトランスファーおよび発現用の核酸ベクターおよびこ
のようなベクターを含む細胞を含む。タンパク質分解部位は、特定の酵素によっ
て選択的に認識され開裂されるアミノ酸配列を含む。

【００２２】 本発明の好ましい側面では、発現された単一鎖タンパク質は、クロストリディ
ウム神経毒のＨ鎖およびＬ鎖の生物学的に活性なドメインを含む。内部タンパク
質分解部位での分解により鎖ドメインが分離されると、完全な活性を有する神経
毒の活性化が生じる。

【００２３】 本発明の別の側面では、単一鎖タンパク質は、運動ニューロンのもの以外の細
胞受容体（レセプター）に標的化される結合ドメインを含む。このような結合ド
メインは、例えば、感覚求心性ニューロンまたは、膵臓腺房細胞のような非ニュ
ーロン性細胞型または組織と特異的に結合することができる。単一鎖タンパク質
は、クロストリディウム神経毒のものと類似する転位ドメイン、および治療的部
分を含む。この治療的部分は、クロストリディウム神経毒軽鎖であってよく、あ
るいは種々の治療的部分、例えば酵素、転写可能なヌクレオチド配列、成長因子
、アンチセンスヌクレオチド配列などであり得る。

【００２４】 好ましくは、本発明のトキシンおよびトキシンに基づくタンパク質は、トキシ
ンタンパク質の迅速な単離を可能にするほど十分に高度な効率で標的化合物と結
合可能な結合タグを含むさらなるアミノ酸配列を含有するように作成される。こ
のような結合部位を含むタンパク質は多数あり、当業者に周知であり、そしてこ
れはモノクローナル抗体、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ、プロテインＡ、Ｈｉｓ_６タグなどを含み得るがこれらに限定さ
れない。

【００２５】 このようなタンパク質は特定の化合物または化合物型に対する結合選択性を示
すため、標的化合物を、クロマトグラフィー樹脂またはミクロタイターウェルを
含むがこれらに限定されない固形支持体に固定化し、修飾トキシンのアフィニテ
ィー精製用に使用することができる。次いで、高塩類溶液または特定のアンタゴ
ニストを使用する標準的方法によってトキシン分子を溶出可能である。

【００２６】 神経毒を扱うことに付随する安全性のリスクを最小にするため、本発明のこの
側面のトキシンはその低活性（または不活性）の単一鎖プロ型として発現され、
次いでインビトロの注意深く制御されたタンパク質分解反応により、それらは、
好ましくはそれらが由来する天然神経毒と同じ効力レベルにまで活性化される。
タンパク質分解の効率および割合を改善するため、プロテアーゼのホロトキシン
基質に対するアクセス可能性を促進する、単一アミノ酸鎖のＨおよびＬ部位間の
特定に設計されたループ内で生じるように操作されたタンパク質分解部位を設計
可能である。

【００２７】 ヒトまたは一般に遭遇するプロテアーゼによって意図せずトキシンが活性化さ
れるリスクを減少させるため、開裂部位のアミノ酸配列は、好ましくは、（ヒト
プロテアーゼとしてか、あるいは予想されるヒトファウナおよびフローラの部分
として存在するものとして）通常ヒトには存在しないタンパク質分解性酵素に対
して高度な特異性を有するように設計される。このようなプロテアーゼの例の非
排他的リストには、ウシエンテロキナーゼ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫを分解する
）；タバコｅｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ（配列ＥＸＸＹＸＱＳ／Ｇ
を分解する）；バチルスアミリクイファシエンス（Bacillus amyliquifaciens）
由来のＧＥＮＥＮＡＳＥ（登録商標）（配列ＨＹまたはＹＨを分解する）；およ
びヒトライノウイルス３Ｃ由来のＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（登録商標）プロテア
ーゼ（アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰを分解する）が含まれる。上で用いられる
ように、文字Ｘは任意のアミノ酸を示す。特に記載しない限り、本明細書中に示
されるすべてのアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端方向であり、す
べてのヌクレオチド配列は５'から３'（左から右）である。

【００２８】 本発明の一側面では、単一鎖ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。
「単離された」とは、その天然環境から取り出されたことを意味する。例えば、
細胞内で発現されたタンパク質に関して、単離には細胞ライセート（溶解液）の
調製ならびにその後の精製工程が含まれる。細胞外で発現されたタンパク質は、
例えば細胞由来の上清の分離ならびにその後の任意の精製工程によって単離する
ことができる。

【００２９】 本発明の別の側面では、細菌および哺乳類中で、通常、タンパク質分解性ニッ
キングに耐性であるＣ．ボツリヌスサブタイプＥ神経毒の鎖間ループ領域を修飾
して、挿入されたタンパク質分解部位を含むようにし、このループ領域を本発明
の単一鎖トキシンまたは修飾されたトキシン分子中の鎖間ループ領域として用い
る。Ｃ．ボツリヌスサブタイプＥ由来のループを用いて、ニックされていないト
キシン分子をインビボで安定化し、選択プロテアーゼを用いて活性化されるまで
望ましくない分解に対して耐性にする。

【００３０】 本発明のさらに別の側面では、単一鎖ポリペプチドとして発現される組換え型
のＢｏＮＴ／Ｅを含む組成物が考慮される。

【００３１】 さらに別の側面では、単一鎖ポリペプチドとして発現された組換えキメラおよ
び／または修飾トキシン誘導体が考慮される。このようなポリペプチドは分子ト
ランスポーター、例えば Dolly et al., European Patent Specification EP 0
760 681 B1（引用により本明細書中に包含される）中に開示されるものであり得
るがこれらに限定されない。

【００３２】 本発明のさらなる側面では、あるクロストリディウム神経毒またはそのサブタ
イプ由来の軽鎖の少なくとも一部および、別の神経毒または神経毒サブタイプ由
来の重鎖の少なくとも一部を含む神経毒誘導体、ならびにその製造方法が含まれ
る。一態様では、ハイブリッド神経毒が１神経毒サブタイプ由来の軽鎖の全体お
よび別の神経毒サブタイプ由来の重鎖を含み得る。別の態様では、キメラ神経毒
誘導体は、ある神経毒サブタイプの重鎖の部分（例えば結合ドメイン）および別
の神経毒サブタイプ由来である重鎖の別の部分を含み得る。同様に、あるいは別
法として、治療因子（要素）は種々の神経毒の軽鎖部分を含み得る。

【００３３】 このようなハイブリッドまたはキメラ神経毒誘導体は、例えばこのような神経
毒の治療的利益を、既存の神経毒サブタイプに対して免疫学的に耐性である患者
、平均より低い濃度の、既存の神経毒重鎖結合部分に対する受容体を有するかも
しれない患者、あるいは膜または小胞毒素基質（例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭ
Ｐおよびシンタキシン）のプロテアーゼ耐性変異体を有し得る患者へデリバリー
する手段として有用である。種々の基質を伴う軽鎖を有する組換えキメラまたは
ハイブリッド神経毒誘導体を創出すると、このような患者が神経毒治療に応答す
ることを可能になる。

【００３４】 免疫学的耐性に関して、ほとんどの神経毒エピトープがトキシンの重鎖部分に
存在することが既知である。したがって、患者が例えばＢｏＮＴ／Ａに対する中
和抗体を有する場合、ＢｏＮＴ／Ｅ由来の重鎖およびＢｏＮＴ／Ａ由来の軽鎖（
これは他の神経毒軽鎖よりも長い期間の治療活性を有する）を含有するキメラ神
経毒はこの耐性を克服するだろう。同様に、患者がＢｏＮＴ／Ａに関する細胞表
面受容体をほとんど有さない場合、この患者が別のＢｏＮＴサブタイプに対する
適切な受容体を有するであろう機会は大きい。ハイブリッドまたはキメラ神経毒
（例えばＨＣ_Ａ、ＨＣ_Ｂ、ＨＣ_Ｃ１、ＨＣ_Ｄ、ＨＣ_Ｅ、ＨＣ_Ｆ、およびＨＣ_Ｇか
らなる群から選択される重鎖の少なくとも一部および、種々のクロストリディウ
ム神経毒サブタイプから選択される軽鎖の少なくとも一部であって、ＬＣ_Ａ、Ｌ
Ｃ_Ｂ、ＬＣ_Ｃ１、ＬＣ_Ｄ、ＬＣ_Ｅ、ＬＣ_Ｆ、およびＬＣ_Ｇからなる群から選択さ
れるものを含有するもの）であって、このサブタイプの重鎖を最も治療的に適当
な軽鎖（例えばＢｏＮＴ／Ａ軽鎖）と組み合わせたものを創出することにより、
患者は神経毒治療によりよく応答可能になる。

【００３５】 上記ハイブリッドまたはキメラ神経毒誘導体の別の利点は、特定の軽鎖（例え
ばＬＣ_Ａ）が長期間の作用を有し、他のものが短期間の作用を有し（例えばＬＣ _Ｅ およびＬＣ_Ｆ）、一方さらに別のものは中期間の作用を有する（例えばＬＣ_Ｂ ）という事実に関する。したがって、ハイブリッドおよびキメラ神経毒は第二お
よび第三世代の神経毒薬物であり、ここにその神経毒活性は、種々の活性、基質
特異性、または活性期間を有する種々の薬物を用いて、特定の治療的必要または
症状に対して調整することができる。

【００３６】 このようなハイブリッドまたはキメラ神経毒はまた、多価ＢｏＮＴワクチンを
接種された患者（例えば軍人または実験室労働者）の処置において有用であるだ
ろう。このようなワクチンはＢｏＮＴ／Ｆを含有せず；そのため、適当な軽鎖を
ＢｏＮＴ／Ｆ重鎖と組み合わせると現在の治療的神経毒が有効でないこのような
患者において有効な治療物質が創出されるだろう。

【００３７】 同じ戦略は、活性な神経毒軽鎖以外の治療的部分を有するクロストリディウム
神経毒の誘導体を用いる場合に有用であり得る。このような物質の重鎖は神経毒
由来であろうから、より知られていないか、あるいは稀な重鎖を用いて、治療的
神経毒誘導体の有効性を中和する耐性機構を回避することが有益であり得る。

【００３８】 同じ性質により、結合部分は、クロストリディウム神経毒重鎖由来の結合部分
以外のものであってよく、これにより運動ニューロン以外の細胞タイプに対する
標的化機能を提供するものであり得る。

【００３９】 また、生物学的活性物質（エンティティー）として高い収量で、これらの分子
を構築、発現、および精製する方法が本明細書中に含まれる。

【００４０】 発明の詳細な説明 本発明の組成物および方法には、修飾された神経毒およびその合成および使用
が含まれる。常在性プロテアーゼによる単一鎖ポリペプチドの切断により通常に
活性化される二本鎖神経毒は、常在性プロテアーゼ開裂部位をコードするヌクレ
オチド配列の変更または除去ならびに、宿主細胞またはヒトプロテアーゼによる
分解に耐性な別の異なるタンパク質分解性開裂部位をコードするヌクレオチド配
列の挿入により核酸レベルで修飾可能である。挿入されるアミノ酸配列は、ヒト
および宿主細胞組織由来では存在しない発現を進めるために選択された開裂物質
の使用によりインビトロで分解されるように設計される。

【００４１】 挿入されるアミノ酸配列は、ペプチド結合の分解能を有する化学物質、例えば
臭化シアンに対する感受性を与えるように選択し得る。しかし、ずっとより好ま
しくは、コードされるアミノ酸配列が、選択プロテアーゼに対して高度に特異的
なタンパク質分解性開裂部位を含み得ることである。選択プロテアーゼは、単一
鎖トキシン分子を発現する細胞（例えば大腸菌または天然クロストリディウム細
菌）中に通常存在しないものである。

【００４２】 別の側面では、本発明は、意図されるときにプロテアーゼによって分解され、
活性な二鎖分子を提供し得る、組換え単一鎖修飾クロストリディウム神経毒 に関する。このような修飾神経毒は毒性である必要がない；これらの特定のタン
パク質中、トキシンＬ鎖の酵素活性は排除することができ、このトキシンは薬物
または、治療活性を有する他のバイオ活性物質（生物活性物質）と組み合わせる
ことができる。別法として、特定の他の修飾神経毒において、Ｌ鎖は酵素的に活
性であるが、Ｈ鎖の部分は、この天然のトキシンの転位およびエンドサイトーシ
ス刺激活性を維持しながらこの神経毒の天然の標的以外の標的細胞に対する特異
性を提供する。

【００４３】 本発明のこの側面において記載されているような修飾された神経毒は、例えば
国際特許公開ＷＯ９５／３２７３８、ＷＯ９９／５５３５９、ＷＯ９６／３３２
７３、ＷＯ９８／０７８６４およびＷＯ９９／１７８０６（これらの文献は引用
により本明細書中に包含される）中に開示されている。本発明は単一鎖、開裂可
能バージョンのこれらの分子およびこれらの分子を作成する改善された方法を提
供する。

【００４４】 別の側面では、本発明は、テタヌストキシン（ＴｅＮＴ）、または１またはそ
れ以上のボツリヌストキシン（ＢｏＮＴ）サブタイプ由来の修飾されたクロスト
リディウム神経毒であって、天然に存在する鎖間ループ領域が、１）宿主プロテ
アーゼまたは自己分解作用による分解に対する耐性を与え、ならびに／あるいは
２）選択プロテアーゼに対して分解されやすい、異なるアミノ酸配列を含む修飾
ループ領域で置換されているものを含む。好ましくはこの開裂部位は選択プロテ
アーゼに対して高度に特異的である。

【００４５】 特定のクロストリディウム神経毒、例えばＢｏＮＴ／Ｅの鎖間ループ領域は、
天然に、インビボのタンパク質分解性開裂に耐性である。このプロテアーゼ耐性
は、常在性プロテアーゼに対して、ループに、他のクロストリディウム神経毒よ
り大きな耐性を与える二次または三次構造を反映するかもしれない。したがって
本発明の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｅの鎖間ループ領域を、より多大な治療活性ま
たは作用期間を有する別のＢｏＮＴ、例えばＢｏＮＴ／Ａまたは／Ｂに存在する
天然ループ領域と置換する。本発明の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅのループ領域
を修飾して、サブクローニング前に、選択プロテアーゼに高度に特異的なタンパ
ク質分解性開裂部位を含有させる。さもなければ高度に保存されたＢｏＮＴ／Ｅ
ループ領域は常在性のプロテアーゼ、あるいはヒト内で遭遇するプロテアーゼに
対して耐性であろうが、選択プロテアーゼによる消化によって活性化される能力
を保持しているだろう。

【００４６】 したがって本質的に、選択プロテアーゼは、組換え発現後の意図した時点で加
えることが可能な、神経毒の毒性（または修飾されたトキシン活性）の「アクチ
ベーター」として作用する。

【００４７】 この選択プロテアーゼは、特異的アミノ酸配列を認識し、その近くまたはその
位置でペプチド結合を分解する任意のプロテアーゼであってよいが、この選択プ
ロテアーゼはヒトプロテアーゼ、例えばヒトトリプシン、キモトリプシンまたは
ペプシン、または宿主細胞プロテアーゼでないのが非常に好ましい。さらに、選
択プロテアーゼは常在性のプロテアーゼと同一のアミノ酸配列を認識しない。最
後に、選択プロテアーゼは、組換え神経毒をコードするプラスミドを含む宿主細
胞によって発現されるものであるべきでない。

【００４８】 比較的稀なアミノ酸配列を認識する任意の非ヒトプロテアーゼを用いてもよい
が、ただし、アミノ酸認識配列が既知であることが条件である。アクチベーター
として選択されるプロテアーゼの例には、以下の任意のものが含まれるだろうが
、これらに制限されない：ウシエンテロキナーゼ、植物プロテアーゼ、例えばパ
パイン（Carica papaya 由来）およびレグミン（legumain）、昆虫パパインホモ
ログ（カイコ Sitophilus zeamatus 由来）、および甲殻類（crustacian）パパ
インホモログ（十脚類の各種節足動物、decapod）、タバコｅｔｃｈウイルス（
ＴＥＶ）プロテアーゼ（これは配列：ＥＸＸＹＸＱＳ／Ｇを分解する）；Bacill
us amyliquifaciens 由来のＧＥＮＥＮＡＳＥ（登録商標）（これは配列：ＨＹ
またはＹＨを分解する）および、ヒトライノウイルス３Ｃ由来のＰＲＥＳＣＩＳ
ＳＩＯＮ（登録商標）プロテアーゼ（これはアミノ酸配列：ＬＥＶＬＦＱＧＰを
分解する）。上に用いられるように、文字Ｘは任意のアミノ酸を示す。

【００４９】 特に記載しない限り、本明細書中、以下の用語は以下の意味を有する。

【００５０】 「結合因子」とは、生理的条件下、標的細胞に特有の細胞表面マーカーと選択
的に結合可能なアミノ酸配列領域を意味する。この細胞表面マーカーは、ポリペ
プチド、多糖類、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質を含み、あるいはこれら
以外の構造的特徴を有していてもよい。「選択的相互作用」とは、細胞表面マー
カーに関する結合因子の解離定数（Ｋ_ｄ）が、他の任意の細胞表面マーカーに関
する結合因子のものより少なくとも一桁小さいことを意味する。解離定数は、こ
の神経毒または修飾神経毒が暴露される任意の他の細胞表面マーカーに関する結
合因子より、好ましくは二桁小さく、さらにより好ましくは少なくとも三桁小さ
い。

【００５１】 「転位因子」とは、転位活性を有するクロストリディウム神経毒Ｈ鎖部分を含
む。「転位」とは、小胞膜を介するポリペプチドの輸送を促進し、これによりい
くつかまたはすべてのポリペプチドを細胞質に暴露する能力を意味する。

【００５２】 種々のボツリヌス神経毒において、転位は、エンドソーム内のｐＨ低下によっ
て生じる重鎖のアロステリックなコンフォメーション変化が関与すると考えられ
る。

【００５３】 このコンフォメーション変化が関与し、重鎖のＮ末端の半分によって媒介され
、小胞膜中の孔形成を生じさせることがわかる；この変化は、エンドソーム性小
胞内から細胞質内へのタンパク質分解性の軽鎖の移動を許容する。例えば、Lacy
, et al., Nature Struct. Biol. 5:898-902 (October 1998)。

【００５４】 ボツリヌス神経毒重鎖の転位媒介性部分のアミノ酸配列は当業者に既知であり
；さらに、転位活性を与えるために不可欠であることが知られているこの部分中
のアミノ酸残基もまた既知である。

【００５５】 したがって、例えば、任意の種々のクロストリディウムテタヌスまたはクロス
トリディウムボツリヌス神経毒サブタイプ重鎖の天然に存在するＮ末端ペプチド
半分を転位因子として用いること、あるいは、種々の重鎖のＮ末端半分の一次配
列を並べ、配列間の、保存されるアミノ酸、極性、立体性および疎水性に基づき
、共通一次転位配列を選択することによって、類似の転位因子を設計することは
は十分当業者の能力の範囲内であろう。

【００５６】 本発明の「治療因子」には、以下のもの含まれ得るがこれらに制限されない：
活性または不活性（すなわち修飾された）ホルモン受容体（例えばアンドロゲン
、エストロゲン、レチノイド、ペルオキシソーム増殖因子およびエクジソン受容
体など）およびホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、複製、転写、または
翻訳鋳型として用いられ得る核酸（例えば、所望の生物学的活性を有するかタン
パク質薬物の発現に関してか、あるいはアンチセンス物質としての核酸薬物の合
成に関して）、酵素、トキシン（アポトーシス誘導または阻害物質を含む）など
。

【００５７】 好ましい態様では、治療因子は、クロストリディウム神経毒軽鎖または、クロ
ストリディウム神経毒軽鎖のＳＮＡＲＥタンパク質配列特異的エンドペプチダー
ゼ活性を保持するその部分を含むポリペプチドである。ボツリヌス神経毒（Ｂｏ
ＮＴ）サブタイプＡ−Ｇの軽鎖のアミノ酸配列は決定され、同時にテタヌス神経
毒（ＴｅＮＴ）軽鎖のアミノ酸配列も決定された。各鎖はＺｎ^＋＋依存性エンド
ペプチダーゼに特有のＺｎ^＋＋結合モチーフ：Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−ｘ−ｘ−Ｈｉｓ
（左がＮ末端方向）を含有する（ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ａ／Ｂおよび／ＥではＨ
ＥＬＩＨ；ＢｏＮＴ／ＣではＨＥＬＮＨ；ならびにＢｏＮＴ／ＤではＨＥＬＴＨ
である）。

【００５８】 ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最近の研究では、このトキシンの、その標的基質、ＳＮＡ
Ｐ−２５に対する活性および特異性に関して重要なある特徴が示された。すなわ
ち、Zhou et al. Biochemistry 34:15175-15181 (1995) の研究は、この軽鎖ア
ミノ酸残基Ｈｉｓ_２２７がチロシンで置換されると、得られたポリペプチドはＳ
ＮＡＰ−２５を分解できなくなることを示し；Kurazono et al., J. Biol. Chem
. 14721-14729 (1992) は、組換えＢｏＮＴ／Ａ軽鎖を用いる、Aplysia califor
nica の頬側神経節のシナプス前コリン作動性ニューロンにおける研究を行い、
８Ｎ末端または３２Ｃ末端残基を除去しても毒性はなくならないが、１０Ｎ末端
または５７Ｃ末端残基を除去するとこの系の毒性が破壊されることを示した。最
も最近では、完全ＢｏＮＴ／Ａホロトキシンの結晶構造が解析された；その活性
部位はＨｉｓ_２２２、Ｇｌｕ_２２３、Ｈｉｓ_２２６、Ｇｌｕ_２６１およびＴｙｒ _３６５ が関与することが示された（Lacy et al., 上記）（これらの残基は、Kur
azono et al., 上記のＢｏＮＴ／Ａ Ｌ鎖のＨｉｓ_２２３、Ｇｌｕ_２２４、Ｈｉ
ｓ_２２７、Ｇｌｕ_２６２およびＴｙｒ_３６６に対応する）。興味深いことに、Ｂ
ｏＮＴ／Ａ〜ＥおよびＴｅＮＴ軽鎖のアラインメントは、すべてのこの鎖が、Ｂ
ｏＮＴ／Ａと類似する位置にこれらの残基を変化なく有することを示す。Kurazo
no et al., 上記。

【００５９】 ＢｏＮＴ／Ａの触媒ドメインは、ＳＮＡＰ−２５のＣ末端に非常に特異的であ
り、分解を生じさせるのに、最も少なくてＳＮＡＰ−２５アミノ酸１７個を必要
とすることがわかっている。触媒部位はポケットに似ており；Ｃｙｓ_４２９とＣ
ｙｓ_４５３間のジスルフィド結合を介して軽鎖が重鎖と結合したとき、重鎖の転
位ドメインは、軽鎖がサイトゾルに入るまで触媒ポケットへのアクセスをブロッ
クすることがわかった。次いでこのジスルフィド結合が還元されると、触媒ポケ
ットが「開き」、軽鎖が完全に活性になる。

【００６０】 上記のように、ＶＡＭＰおよびシンタキシンはそれぞれＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ
、ＧおよびＴｅＮＴ、およびＢｏＮＴ／Ｃ_１によって分解され、ＳＮＡＰ−２５
はＢｏＮＴ／Ａ ＥおよびＣ１によって分解される。

【００６１】 ＢｏＮＴ／Ａ以外の種々のクロストリディウム神経毒軽鎖の基質特異性は既知
である。したがって、当業者は、これらのサブタイプにおいて、分解および基質
認識に不可欠なトキシン残基を容易に決定でき（例えばサイトダイレクト突然変
異誘発またはトキシン分子の種々の領域の欠失の後、タンパク質分解性活性およ
び基質特異性を試験することによって）、したがって同または類似の活性を保持
しているか、あるいは欠いている天然神経毒軽鎖の変異体を容易に設計できる。

【００６２】 特定の好ましい態様では、上記のように変更された本発明の単一鎖神経毒また
は神経毒誘導体は、他の偶発的な内因性タンパク質分解性部位、例えばトリプシ
ン、ＡｒｇＣプロテアーゼ、キモトリプシンまたは宿主細胞プロテアーゼによっ
て分解される部位が除去されるようにさらに修飾される。以下に示されるように
、これらの領域のアミノ酸一次配列がプロテアーゼ耐性を与えるように修飾する
と、神経毒の収量を増大させることができ、分解および活性化前の単一鎖神経毒
の毒性を減少させることができる。

【００６３】 多くのプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列、およびその分解特異性
は当業者に周知である。したがって、単一鎖トキシンのＬおよびＨ鎖部分間のル
ープ領域における特異的タンパク質分解性開裂部位の設計およびポリペプチド中
の偶発的プロテアーゼ部位のプロテアーゼ耐性への修飾は、種々のタンパク質に
関する特異性および認識配列を比較する決まりきった作業である。第一の場合、
候補であるタンパク質分解性部位は完全に排他的である必要はなく、この単一鎖
神経毒の取り扱い、保存および精製時に存在するかもしれないヒトおよび／また
は宿主細胞プロテアーゼに関する開裂部位が排除される必要があるのみである。
もちろん、プロテアーゼ部位はできるだけ特異的であるのが好ましい。後者の場
合、タンパク質分解性開裂部位の修飾は単に、この部位にアクチベータープロテ
アーゼおよびヒトおよび宿主細胞プロテアーゼに対する耐性を与えるのに十分で
あれば足りる。

【００６４】 別の好ましい態様では、組換え修飾された単一鎖神経毒は、この鎖を、特異的
結合複合体の１メンバーを含む結合タグと結合させることによってさらに修飾さ
れる。「特異的結合複合体」とは、規定の環境条件下で互いに結合し、同一条件
下の環境中に存在する他の化学的または生化学的存在（エンティティー）と有意
に結合することがない２またはそれ以上の化学的または生化学的存在を意味する
。特異的結合複合体のメンバーの例には、抗体およびその抗原、レクチンおよび
その標的炭水化物、核酸ストランド、およびその相補的核酸ストランド、細胞表
面受容体およびそのリガンド、金属およびこの金属と配位複合体またはキレート
複合体を形成可能な化合物などが含まれるが、これらに制限されない。

【００６５】 この態様では、結合タグは、リンカー、好ましくは開裂可能リンカーを介して
単一鎖トキシンと連結され得る。これは完全なリストではないが、可能なリンカ
ーの例には、１）式：ＨＯＯＣ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎ＝１〜１２）
で示される脂肪族ジカルボン酸（遊離のアミノ基で連結され得る）；２）ＨＯ−
(ＣＨ_２)_ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎ＞１０）（ポリペプチドのアミノ末端での結合
に適当）、３）置換ポリベンゼン構造、および４）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（ＮＨＳ）エステルリンカーが含まれる。エステルを含有するリンカーの使用
は、比較的穏やかな酸性条件下、単一鎖神経毒の精製において使用後にエステル
リンカーの分解を可能にする。

【００６６】 別法として、最も好ましくは、結合タグは、単一鎖トキシンと、融合タンパク
質として同時に発現される、いくつかあるいはすべての適当に選択されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を含み得る；このようなポリペプチドは、マルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）のマルトース結合ドメイン；Ｈｉｓ_６タグ（６ヒスチジン
残基の連続）；カルモジュリン結合タンパク質のカルモジリン（calmodilin）結
合ドメイン；およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合
ドメインを含み得るが、これらに制限されない。他のポリペプチド結合タグは当
業者に周知であり、本発明における使用に容易に適合可能である。

【００６７】 さらに、結合タグは、それ自身と単一鎖トキシンのアミノ末端またはカルボキ
シル末端間にプロテアーゼ開裂部位を有し、このペプチドの精製後に除去可能で
あるように構築することができる。タンパク質分解性開裂部位は、単一鎖トキシ
ンをＨおよびＬ鎖間でニックするために選択される同一のアクチベータープロテ
アーゼによって開裂されるように設計することができる。

【００６８】 したがって、本発明の課題は、非クロストリディウムプロテアーゼを用いる反
応によって活性化されるまで、天然神経毒と比べて減少した毒性を有する、組換
え活性化可能単一鎖神経毒分子を提供することである。この単一鎖神経毒はより
容易に精製され、精製プロセスにおいて取り扱うのに危険性がより低く、場合に
より、このトキシンにさらに望ましい性質を与えるよう修飾可能である。

【００６９】 本発明の課題はまた、神経毒をコードするヌクレオチド配列を修飾して、Ｈお
よびＬ鎖を分離する天然アミノ酸タンパク質分解性開裂配列を、常在性のクロス
トリディウムまたは宿主細胞プロテアーゼに対して安定であるが、インビトロで
の選択プロテアーゼによる分解を受けやすいアミノ酸配列で置換することによる
、組換え活性化可能単一鎖神経毒の作成方法を提供することである。

【００７０】 本発明の課題はさらに、そのＨおよびＬ鎖のコーディング領域のヌクレオチド
配列の修飾を介して、他のアミノ酸残基による不安定なアミノ酸の置換を生じさ
せ、常在性のタンパク質分解性開裂部位を除去し、このトキシンに望ましくない
タンパク質分解に対する耐性を与えることによって、適当な神経毒ポリペプチド
を提供することである。

【００７１】 さらに、本発明の課題は、発現された単一鎖神経毒を、結合複合体のもう一方
を含む結合パートナーを用いるアフィニティー精製において使用可能な特異的結
合複合体のパートナーを含む結合部分と連結することによる単一鎖としての組換
え神経毒の精製方法を提供することである。精製はバッチ式またはクロマトグラ
フィーカラムによって行うことができる。その後、結合部分はアフィニティー工
程にしたがって除去し、神経毒から分離することができる。

【００７２】 本発明の課題はまた、治療物質として使用するための単一鎖組換え修飾神経毒
分子を提供することである。修飾された神経毒分子は、それが由来する天然神経
毒と比べて変更された標的特異性または変更された活性、あるいは両者を有し得
る。

【００７３】 本発明の課題はまた、野生型神経毒より容易に精製することができる、単一鎖
の活性化可能な組換え神経毒を提供することである。このような神経毒は、臨床
使用用に、適正にフォールディングされた高度に純粋なトキシンの大規模な製造
を可能にする。

【００７４】 以下に実施例を挙げ、本発明の具体的態様を説明するが、これらはいかなる意
味においても請求の範囲によって規定される本発明の範囲を制限しない。

【００７５】 実施例１単一鎖ＴｅＴｘコーディング領域を含有する発現ベクターの構築 本発明は、大腸菌内で、アフィニティークロマトグラフィーによって容易に精
製される単一タンパク質としてＴｅＴｘを発現するプラスミドの構築を記載する
ことで例証できる。ＴｅＴｘはパイロットシステムといｓて選択できる。なぜな
ら、（ｉ）すぐれたワクチンの利用可能性はその取り扱いのリスクを大きく減少
させるから、および（ｉｉ）ＨＣおよびＬＣドメインの発現の点で、最も包括的
に研究されたトキシンであるからである。しかし、当業者であれば、単一鎖ポリ
ペプチドとして発現され、タンパク質分解性開裂によって活性化される任意の二
鎖または二成分トキシンまたは他の生物活性分子を用いる同一または同様の戦略
を用いることができることが理解できよう。野生型ＴｅＴｘのＬ鎖および、２３
４位のグルタミン酸残基がアラニンに変更されている変異バージョンのＴｅＴｘ
軽鎖（「Ｅ２３４Ａ」、Ａｌａ２３４、または「Ｅ２３４Ａ変異軽鎖」と称する
）を含有する単一鎖分子をそれぞれ構築した。この後者の変異は不活性ＴｅＴｘ
軽鎖を生じさせ、Ｅ２３４Ａ変異軽鎖をコードするプラスミド（ｐＭＡＬ−Ｅ２
３４Ａ）を Li et al., Biochemistry 33:7014-7020 (1994) （引用により本明
細書中に包含される）に記載のように構築した。各単一鎖トキシンの構築に関し
て以下のプロトコルを用いる。

【００７６】 Stratagene QuickChange（登録商標）サイトダイレクト突然変異誘発キット（
サイトダイレクト突然変異誘発技術に関しては、例えば Smith et al., J. Biol
. Chem. 253:6651-6560 (1979); これはその全体が引用により本明細書中に包含
される）を用いてベクターｐＴｒｃＨｉｓＡ（Invitrogen から購入）を修飾し
、前から存在するエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂部位をコードするヌクレオチド
の上流に２つの追加制限部位（ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を創出した。こ
のプラスミドはまた、その後ろにエンテロキナーゼ開裂部位のすぐ上流の６ヒス
チジン残基をコードする一連のコドンが続く翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含有す
る。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ｓｔＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位を含むマルチクローニング部位はＥＫ部
位のすぐ下流に位置する；このＨｉｎｄＩＩＩ部位はサイトダイレクト突然変異
誘発によって除去される。以下のプライマーを用いて、ＥＫ開裂部位の上流に制
限部位（下線）を挿入する： 配列番号：１

【数１】 配列番号：２

【数２】 。

【００７７】 得られたプラスミドは、ウシエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂部位をコードする
ヌクレオチド配列の５'側に位置するＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の両者
を含有する。

【００７８】 野生型ＴｅＴｘＬ鎖をコードするヌクレオチド配列は、Li et al., Biochemis
try 33, 7014-7020 (1994)（引用により本明細書中に包含される）に記載される
プラスミドｐＭＡＬ−ＬＣから得た。このプラスミドはＴｅＴｘ軽鎖を、Ｌ鎖の
コーディング配列のすぐ上流に位置するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と
の融合タンパク質としてコードする。融合タンパク質のＭＢＰとＬ鎖部分はヒト
血液凝固因子Ｘａの開裂部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を含み、アフ
ィニティー精製が行われた後のＭＢＰの除去を促進するように設計される。

【００７９】 Ｌ鎖のコーディング配列を含有するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＭＡＬ−ＬＣ
から、このプラスミドをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたＬ鎖
を含むＤＮＡ断片をゲル精製し、この断片をプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＡの、Ｅ
Ｋ部位の上流に新たに創出されたＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結する
ことによって切り出す。この断片はマルトース結合タンパク質配列をＬ鎖のＮ末
端から削除する。

【００８０】 同一の手法を用いて、プラスミドｐＭＡＬ−ＬＣ−Ａｌａ^２３４（Ｌ鎖のアミ
ノ酸２３４に単一アミノ酸変化を施したもの。天然のグルタミン酸をアラニンで
置換。）由来の変異体Ｌ鎖含有するＤＮＡ断片をサブクローニングする。この変
化は、Ｌ鎖の亜鉛エンドペプチダーゼ活性を排除し、天然Ｈ鎖およびＡｌａ^{２３ ４} Ｌ鎖を含有する非毒性の再構成テタヌストキシンを生じさせるのに十分である
。

【００８１】 プラスミドｐＭＡＬ−ＨＣからＨ鎖を含有するＤＮＡ断片を得る；このベクタ
ーの構築は Li et al., J. Biochem. 125:1200-1208 (1999)（引用により本明細
書中に包含される）に記載されている。簡単には、Ｈ鎖をコードする遺伝子は、
別々のプラスミド中にクローニングされた、Ｈ鎖の異なる部分のコーディング配
列を含有する３個のＤＮＡ断片の組み合わさることによって構築される。Ｈ鎖の
アミノ末端半分を含む断片をまず、標準的ポリメラーゼ連鎖反応法（例えば Mul
lis, 米国特許第４，６８３，２０２号および Mullis et al., 米国特許第４，
８００，１５９号（これらは引用により本明細書中に包含される）を参照）を用
いて増幅し；以下のプライマー：ＰＣＲプライマーａ（ＸｂａＩ開裂部位を含有
）およびｂ（ＢｇｌＩＩ開裂部位を含有）（それぞれ配列番号：３および４）を
用いて、ｐＴｅｔ８と称されるプラスミド中に含まれるＨ鎖断片を増幅し；ＰＣ
Ｒプライマーｃ（ＢｇｌＩＩ開裂部位を含有）およびｄ（ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＳａｌＩ開裂部位を含有）（それぞれ配列番号：５および６）を用いてｐＴｅｔ
１４と称されるプラスミドに含まれるＨ鎖断片を増幅した。これらのプライマー
のヌクレオチド配列を以下に提供する（制限部位には下線する）： 配列番号：３

【数３】 配列番号：４

【数４】 配列番号：５

【数５】 配列番号：６

【数６】 。

【００８２】 ＰＣＲ増幅および増幅されたＨ鎖断片のゲル精製後、各断片をＢｇｌＩＩで消
化し、連結して、Ｈ鎖の完全Ｎ末端半分のコーディング領域を得た。次いでこの
連結産物をＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＭＢＰおよび因子Ｘａ部位
に関するコーディング領域の下流に位置するｐＭＡＬ−ｃ２−Ｔ（コのプラスミ
ドはＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断されている）のマルチクローニング部位に
サブクローニングした。ｐＭＡＬ−ｃ２は、当業者に周知の商業的に利用可能な
ベクターである。得られたプラスミドはｐＭＡＬ−Ｈ_Ｎである。

【００８３】 完全Ｈ鎖コーディング領域を以下のように組み合わせた。ｐＭＡＬ−Ｈ_Ｎプラ
スミドをＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化し、Ｈ鎖のＮ末端をコードするＤＮＡ断
片を得る。プラスミドｐＴｅｔ２１５をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｈ
鎖カルボキシル末端をコードするＤＮＡ断片を得る。ベクターｐＭＡＬ−ｃ２−
ＴをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、消化されたＨ鎖断片に連結し、別のエ
ンドヌクレアーゼを使用するおかげで、適正な方向で組み合わせる。得られたプ
ラスミドはｐＭＡＬ−ＨＣである。

【００８４】 ＨおよびＬ鎖をコードするＤＮＡ断片（Ａｌａ^２３４Ｌ鎖を含む）を、ｐＭＡ
Ｌ−ＬＣまたはｐＭＡＬＥ２３４ＡおよびｐＭＡＬ−ＨＣ構築物から直接、切断
および精製し、上記修飾ｐＴｒｃＨｉｓＡベクターにサブクローニングした。こ
のＨ鎖をまず、修飾ベクターのＥＫ部位のすぐ下流のＢａｍＨＩ部位に連結し、
得られたプラスミドをゲル精製した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳ
ａｌＩで消化した後、ＥＫ開裂部位の少し上流の位置にＬ鎖を連結した。

【００８５】 得られたプラスミド構築物は、以下のものを含む、単一鎖トキシンタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含有する：（アミノ末端からカルボキシル末端
へ）６ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、次いでＬ鎖、エンテロキナーゼ開裂部位
、およびＨ鎖。ＥＫ開裂部位（ＤＤＤＤＫ）を含有する翻訳されたＬおよびＨ鎖
間の連結部分を以下（Ｎ末端からＣ末端方向へ）および図１に示す。 配列番号：７

【数７】 。

【００８６】 ２つの鎖の単一単位としての発現を可能にするため、ｐＭＡＬ−ＬＣ中のＬ鎖
コーディング配列の３'末端に存在する終止コドンを含むヌクレオチド配列を、
２プライマー（配列番号：８および９）を用いサイトダイレクト突然変異誘発に
よって除去し、ＨおよびＬ両鎖を含有する単一読み枠を得た。 配列番号：８

【数８】 配列番号：９

【数９】 。

【００８７】 得られたｐＴｒｃＨｉｓＡに基づく構築物を、Hanahan の方法を用いて熱ショ
ックにより大腸菌株ＪＭ１０９中に形質導入し、形質転換コロニーを、１００μ
ｇ／ｍＬアンピシリンを含有する Luria 寒天プレート上で単離する。これらの
形質転換体からプラスミドを精製し、分析用制限エンドヌクレアーゼ消化および
アガロースゲル電気泳動によって挿入を確認する。

【００８８】 実施例２単一鎖ＴｅＴｘの発現および物理的特徴付け ｐＴｒｃＨｉｓＡに基づく単一鎖ＴｅＴｘ構築物の発現（ハイブリッド trp/l
ac プロモーターの制御下）を、１００μｇアンピシリンを含む Luria ブロス２
００ｍＬ中の代表的な形質転換体クローンの集密培養に１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソ
プロピルチオ−ガラクトピラノシド）の添加によって誘導し、さらに３７℃で１
６時間インキュベートした後、遠心により細胞を回収する。

【００８９】 細胞ペレットをバッファーＡ（２０ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４、５００ｍＭ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．８））３０ｍＬに再懸濁し、４℃で超音波処理（中位設定で１０秒間
バースト）して溶解させた。遠心（９，０００Ｘｇ、３０分間、４℃）により不
溶性破片を除去し、上清を遠心によって回収する。

【００９０】 各単一鎖構築体を含有する上清を、単一鎖トキシン分子のアミノ末端のヒスチ
ジン残基とニッケル間のキレート化によるアフィニティー精製用のニッケルイオ
ン樹脂（Invitrogen Corp.）を用いて、２２℃で２０分間インキュベートする。
次いでこの樹脂を未にカラムにロードし、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｎａ_２Ｐ
Ｏ_４、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０））２００ｍＬで洗浄し、すべての非
特異的結合物質を除去し、バッファーＡ中１００ｍＭイミダゾール８〜１５ｍＬ
を用いて０，５ｍＬフラクション上に組換え単一鎖タンパク質を溶出させる。Br
adford のタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories）に溶出させた単一鎖の
濃度を測定し；約１ｍｇの融合タンパク質が回収された。

【００９１】 実施例３組換え単一鎖ＴｅＴｘのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析 単一鎖ＴｅＴｘ構築物をアンピシリンを含む Luria ブロス中で生育させ、Ｉ
ＰＴＧによるタンパク質発現の誘導前および後の両方で一定量をとる。粗製の細
胞抽出物を、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下の還元条件下で、サ
ンプルバッファー中に希釈することによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製する。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、分離されたタンパク質を以下のようにウエスタン
ブロットした：標準的方法（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)、こ
れは引用によりその全体が本明細書中に包含される）を用いて、このタンパク質
を電気泳動的にポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移し、この膜を
処理して、バックグラウンドＩｇの結合を減少させ、次いで抗−Ｈｉｓ_６抗体を
用いてプローブし、その後、アルカリホスファターゼ−コンジュゲート化二次抗
体を用いて検出し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／
ニトロブルーテトラゾリウム基質を用いて展開する。

【００９２】 図２Ａのレーン１および２に示されるように、ウエスタンブロットはタンパク
質合成の誘導前に検出可能なＴｅＴｘ発現を示さなかった；対照的に、タンパク
質誘導後に採取した一定量中には、約分子量１５０ｋＤａの単一バンドが見られ
た（レーン３および４参照）。図２Ａ中、レーン１および３はＷＴ軽鎖構築物で
あり、レーン２および４はＥ２３４Ａ変異構築物を含む。

【００９３】 図２Ｂは、Ｅ２３４Ａ構築物で形質転換された細胞由来のＩＰＴＧ誘導された
細胞抽出物のウエスタンブロットである。重要なことに、軽鎖の識別可能な低分
子量のタンパク質分解性開裂産物は観察されず、発現および精製後の単一鎖トキ
シンの相対的安定性に関する証拠を提供する。

【００９４】 図３は第二の実験の結果を示す。第二の実験では、アフィニティー精製された
組換え単一鎖（ＳＣ）ＴｅＴｘを以下のようにエンテロキナーゼでニックした。
３０μｇの精製単一鎖トキシンを、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．１％ Tween-20（ｖ／ｖ）含む溶液中、 １ユニッ
トのエンテロキナーゼとインキュベートする。コントロールとして、組換えタン
パク質を、ＥＫを含まない同じ反応混合物とインキュベートする。これらのサン
プル、プラス一定量の天然（非組換え）ＴｅＴｘを、還元（＋ＢＭＥ）または非
還元（−ＢＭＥ）条件下、８％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥに
付する。得られたゲルを用いて、ウエスタンブロットおよび、その後の抗−Ｈク
レーム抗体を用いる検出（図３Ｂ）、ならびにクーマシーブルーによる直接染色
（図３Ａ）を行う。

【００９５】 図３に示されるように、非還元条件下、すべての３サンプル（天然ＴｅＴｘ（
レーン１）、ニックされていない組換えトキシン（レーン２）、およびエンテロ
キナーゼでニックされた組換えトキシン（レーン３））は、本質的に区別可能な
約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有するダブレットとして移動する（明らかに
異なる配座異性体、これらは還元時には単一のバンドになる）。非還元ゲルによ
り、１）高レベルの発現が得られたこと、２）軽鎖と重鎖を連結するジスルフィ
ド結合が完全に形成されていること、および３）組換え単一鎖トキシンが観察可
能なタンパク質分解性分解に付されないことが確認される。

【００９６】 対照的に、還元条件下、野生型およびニックされた組換えトキシンは、ウエス
タンブロットおよびクーマシー染色の両者により約１００ｋＤａ分子量を有する
Ｈ鎖を生じさせる。さらに、クーマシー染色されたゲルでは、これらのサンプル
の両者はまた、Ｌ鎖に相当する、約５０ｋＤａのより低い分子量の種を示す。野
生型Ｌ鎖は、組換えＬ鎖より低い見かけの分子量で移動し、ここに組換えＬ鎖は
Ｈｉｓ６部分および修飾されたＥＫ開裂部位含有鎖間連結領域が存在するせいで
２２のさらなるアミノ酸残基を有する。ニックされていない組換えトキシン（レ
ーン２）は、見かけの分子量約１５０ｋＤａを有する単一バンドとして移動する
。注目すべきは、ニックされていないトキシンがレーン３に少しも見られないこ
とであり、これはエンテロキナーゼ処理の効率を示す。

【００９７】 実施例４組換え単一鎖ＴｅＴｘによるインビトロトキシン誘導性の麻痺 天然トキシンは、ＣＮＳにおいて作用するより高い濃度であっても、神経筋麻
痺を生じさせることが既知であるため、組換えＴｅＴｘの生物学的活性をまた、
マウス横隔神経片側横隔膜を用いて、試験し、野生型トキシンと比較する。この
実験では、マウス左側横隔神経−片側横隔膜をマウス（ＴＯ株、４週齢および重
量約２０ｇ）から解剖し、すぐに、Krebs-Ringer 溶液（１１８ｍＭ ＮａＣｌ、
４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、２３．
８ｍＭ ＮａＨＣＯ_４、１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１１．７ｍＭ グルコース（
ｐＨ７．４））１０ｍＬを含み、９５％酸素および５％二酸化炭素でバブルされ
、０．１％ウシ血清アルブミンを補った（トキシンの非特異的吸着を減少させる
ため）閉じた循環灌流系に移す（Li et al., Biochemistry 33: 7014-7020 (199
4)）。片側横隔膜を、Krebs-Ringer バッファー１０ｍＬを含む浴に３７℃で１
０分間保持した後、それぞれ４または１０ｎＭ 天然ＴｅＴｘ（それぞれ▼およ
び▽）または１０ｎＭのニックされた組換えＴｅＴｘ（●）または１０ｎＭのニ
ックされていない組換えＴｅＴｘ（○）に暴露する（図４を参照）。

【００９８】 二極性電極を用いる横隔神経の超最大刺激により筋肉痙攣を引き起こし、増幅
器およびコンピュータシステム（MacLab, AD Instruments, UK）に連結された強
度−変換トランスデューサー（Lectromed, UK）により記録する。神経刺激のパ
ラメータは１．５〜２．５Ｖ振り幅を有する０．１msec長の０．２Ｈｚ矩形波で
ある。神経筋伝達のトキシン誘導性麻痺は、神経によって引き起こされる筋肉収
縮に必要とされる時間として定量し、元の値の１０％に減少する（９０％減少）
。

【００９９】 図４に示されるように、１０ｎＭのニックされた組換えＴｅＴｘは、神経誘導
性の筋肉痙攣のブロックに関して、１０ｎＭ天然トキシンと同等に効力があり、
調製物は、約１７０分間に筋肉の緊張の９０％減少を生じさせることがわかった
。したがって、単一鎖の活性化可能で、簡単なアフィニティークロマトグラフィ
ー工程で精製されるポリペプチドとして、大腸菌内で大量に発現されるこのＴｅ
Ｔｘの新規調製物は、試験されたすべての範疇によって完全に活性であることが
わかった。

【０１００】 対照的に、１０ｎＭ のニックされていないＴｅＴｘ調製物は、筋肉の緊張を
減少させるのに約２倍の時間を必要とし、４ｎＭ 野生型ＴｅＴｘとおよそ同等
の活性を示した。コントロールとして、ＫＲバッファーおよび実験サンプル中に
存在する微量のエンテロキナーゼとインキュベートされた片側横隔膜は５時間に
わたって、筋肉の緊張の無視できるほどの減少しか示さなかった。 したがってこの実験は、ニックされていないＴｅＴｘが、インビトロで野生型
またはニックされた組換えタンパク質より相当弱い毒性を有することを示す。

【０１０１】 実施例５ 単一鎖ＴｅＴｘをさらに修飾してタンパク質分解性開裂部位を取り除くと、ニッ
クされていない組換えトキシンの毒性が減少する ニックされていない組換え単一鎖形態のＴｅＴｘは、ニックされた形態と比較
して減少した毒性を示すが、インビボのさらなるプロテアーゼによるこのトキシ
ンの活性化から残りのトキシン活性がおそらく生じるだろう。この可能性を試験
するために、トリプシンおよびＡｒｇ Ｃプロテアーゼによるタンパク質分解性
開裂に受けやすい単一鎖トキシン分子中の部位を、単一鎖ＴｅＴｘをこれらの酵
素と以下のようにインキュベートすることによって同定する。５０μｇの組換え
単一鎖ＴｅＴｘをＡｒｇ Ｃ４μｇと３７℃で４時間；トリプシン０．１μｇと
３７℃で０．５時間；またはプロテアーゼを含まないバッファー（コントロール
として）とインキュベートする。これらの反応は、０．１％ＳＤＳを含むＳＤＳ
−ＰＡＧＥバッファーを添加し、次いで５分間煮沸することによって終了させ；
次いでこのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のポリビニリデンジフルオライ
ド（ＰＶＤＦ）膜へのウエスタン電気泳動的トランスファーに付する。この膜を
Ｈｉｓ６タグに特異的なＩｇＧでブロットし、西洋ワサビペルオキシダーゼ染色
系を用いて検出する。

【０１０２】 図５に示されるように、ウエスタンブロットにより、トリプシンおよびＡｒｇ
Ｃプロテアーゼは同一サイズのＬ鎖（およびつまりＨ鎖）断片を生じさせるこ
とがわかる。さらに二重ゲルのトランスファーをタンパク質に関してポンソーレ
ッドで染色し、分子量約１００ｋＤａのＨ鎖バンドを各レーンから切り出し、Ｎ
末端配列決定によって分析する。

【０１０３】 組換え単一鎖ＴｅＴｘ中、ＬＣおよびＨＣは１７アミノ酸（ＧＥＫＬＹＤＤＤ
ＤＫＤＲＷＧＳＳＲ）によって連結され、Ｈ鎖のはじめ（ＳＬＴＤＬＧＧＥＬ．
．．）がそれに続く。トリプシンおよびＡｒｇ Ｃの両者によって作成されたよ
り長い断片のＮ末端アミノ酸配列決定により、１００ｋＤａトリプシンおｙぼい
Ａｒｇ Ｃプロテアーゼ開裂産物タンパク質の最初の５アミノ酸はＳＬＴＤＬで
あることがわかる；したがって、これらのプロテアーゼは単一鎖トキシンをＲ−
Ｓ結合間（図１を参照）で分解し、そのＣ末端にＥＫリンカーを含有するＨ鎖お
よびＬ鎖を遊離させ、したがってこの変異体は、ＥＫニックされたトキシンと本
質的に同一の二鎖トキシンを生じさせる。

【０１０４】 ＥＫリンカー配列のカルボキシ末端のアルギニンは、サイトダイレクト突然変
異誘発によってグリシンに変異され（Ｒ４９６Ｇ）、得られた単一鎖トキシンポ
リペプチドは上記のように発現され、精製される。

【０１０５】 Ｒ４９６Ｇ変異単一鎖（ＷＴＬＣ）トキシンおよびその変異を欠いているＳＣ ＴｅＴｘ６μｇを、０、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬのトリプシン
に対して滴定し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クーマシーブリリアントブル
ーで染色して、図６に示される開裂パターンを得る。観察できるように、両単一
鎖分子はトリプシン分解を受けやすい；しかしながら、Ｒ４９６Ｇ変異体は、鎖
間ループ領域に変異を有さないＳＣトキシンより少量の断片しか生じさせなかっ
た。例えば、ＳＣ ＷＴトキシンのトリプシン開裂時に３つのトリプシンペプチ
ドバンドは明らかに軽鎖バンドの近くに観察できるのに対し、Ｒ４９６Ｇ消化物
中にはそのようなバンドは２つしか見られない。

【０１０６】 Ｒ４９６Ｇ変異ＳＣトキシン中に残りのトリプシン部位が存在するという事実
は、この変異体が、ニックされていないＳＣトキシンと比べて低下した毒性を生
じさせないことをおそらく説明する；両調製物は上記マウスの致死率および神経
筋麻痺アッセイにおいて同様の値を示す。

【０１０７】 種々のアッセイ系を用いて、天然にＴｅＴｘに影響される細胞である、ＣＮＳ
ニューロンに対する神経毒活性を測定する。用いられる細胞は小脳ニューロンで
ある；これらの細胞は７日齢のラット小脳から分離される。ニューロンを、３部
の Basal Eagle Medium および１部のバッファー（これは４０ｍＭ ヘペス−Ｎ
ａＯＨ（ｐＨ７．３）、７８．４ｍＭ ＫＣｌ、３７．６ｍＭ Ｄ−グルコース、
２．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．６ｍＭ ＭｇＳＯ_４および１．０ｍＭ ＮａＨ_２Ｐ
Ｏ_４からなる）、ならびに１×Ｎ２補助物、１．０ｍＭ Ｌ−グルタミン、６０
ユニット／ｍＬ ペニシリン、６０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび５％（
ｖ／ｖ）透析されたウマ血清からなる培地中に１〜２×１０^６／ｍＬで懸濁する
。この細胞懸濁液１Ｌを２２ｍｍ直径のポリ−Ｄ−リシンコーティングウェルに
加える。シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ、４０μＭ）を２４
時間後に５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２培養中に加え、４０μＭ Ａｒａ−Ｃを含有する
上記培地を毎週置換してニューロンを維持する。

【０１０８】 各アッセイでは、ニューロンを少なくとも１０日間インビトロで培養し、Ｏ２
ガス化 Krebs-Ringer ヘペスバッファー（ＫＲＨ、ｍＭ：２０ ヘペス.ＮａＯＨ
ｐＨ７．４、１２８ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．４ＣａＣ
ｌ_２、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０ Ｄ−グルコースおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ）で４回洗浄し、０．２５μＣｉ／ｍＬ [１４Ｃ]−グルタミン（すなわ
ちグルタメート前駆体）を含有する後者のバッファー０．５ｍＬを加えた。すべ
ての工程は３７℃で行う。４５分のラベル化期間後、培地を除去し、ニューロン
を上のように４回洗浄する。コントロールおよびトキシン処理ニューロンを、１
．４ｍＭ Ｃａ^２＋または０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（すなわちＣａ^２＋非依存性放出
を評価するため）を含むＫＲＨバッファー中、３７℃でインキュベートし；次い
で一定量を取り出し、シンチレーションカウントによる [^１４Ｃ]−グルタメー
ト含有量の評価用に維持する。上記基本（basal）培地の取り出し後直ちに、５
０ｍＭ ＫＣｌを含有する修飾ＫＲＨバッファー（正常な浸透圧ポテンシャルを
維持するために低下した８３ｍＭ ＮａＣｌ内容量を含む）および１．４ Ｃａ^{２ ＋} または０．５ｍＭ ＥＧＴＡを、５分の刺激期間に加える。最後に、ニューロ
ンを、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２０ｍＭ ＥＧＴＡ.ＮａＯＨ ｐＨ７．
５で可溶化し、その残りの放射能含量を計算するために一定量をシンチレーショ
ンカウントに付する。基本および刺激されたサンプル中の^１４Ｃ−グルタメート
量は計算されたトータル細胞含量のパーセンテージで記載する。意味のある放出
のＣａ^２＋依存性部分を計算するために、ＥＧＴＡ含有バッファー中の[^１４Ｃ]
−グルタメート含量パーセンテージを、Ｃａ^２＋含有サンプル中で記録される値
から引き算し、次いで後者の基本読み値を５０ｍＭ ＫＣｌサンプルに関して得
られた値から引き算し、Ｋ^＋誘発性Ｃａ^２＋依存性のグルタメート放出部分を得
る。

【０１０９】 図８は組換えトキシンの神経伝達物質放出阻害能を示す。インビトロで１０日
間維持した小脳ニューロンを氷冷ＫＲＨバッファー（５ｍＭ Ｍｇ^２＋および０
．５ｍＭ Ｃａ^２＋を含有）で２回洗浄し、次いでこのバッファー中、４℃で６
０分間、特定の濃度の天然ＴｅＴｘ（●）、ＥＫ−ニックされたＴｅＴｘ Ｒ４
９６Ｇ（○）、単一鎖のニックされていないＴｅＴｘ（▼）、またはＥＫ−ニッ
クされたＴｅＴｘ Ｅ２３４Ａ（▽）に暴露した（図８参照）。天然ＴｅＴｘ（
０．２ｎＭ）を、次いで特定のウェルに加え、さらに３０分後、ニューロンを氷
冷ＫＲＨバッファーで３回洗浄し、３７℃で３０分間インキュベートした。次い
でＫ^＋誘発性Ｃａ^２＋依存性の神経伝達物質放出の評価を上に詳説されるように
行った。このアッセイの結果を図８に示す。

【０１１０】 小脳ニューロンをニックされた組換えＴｅＴｘに暴露した場合、天然トキシン
ンと同様の強度を有する、Ｃａ^＋＋依存性神経伝達物質放出の用量依存性阻害が
見られる。ニックされた組換えＳＣ ＴｅＴｘ、ＷＴおよびＲ４９６Ｇの両者は
このアッセイにおいて同様の値を示した。したがって、ニックされていない単一
鎖分子中のトキシン活性は、単一のトリプシン開裂部位の除去によって排除され
ないが、単一鎖トキシンの領域中、さらなるそのような部位の除去が可能であり
、インビトロで活性化されなければ低い毒性を示し、その完全活性が達成可能で
ある、活性化可能な単一鎖プロ型のトキシンが達成できる。

【０１１１】 実施例７ プロテアーゼ欠損ＴｅＴｘ変異体は、抹消および中枢ニューロンにおけるＴｅＴ
ｘの作用をアンタゴナイズする 表１は、トキシン活性の３アッセイにおいて試験された、記載のＴｅＴｘ構築
体の作表化された結果を示す：ＨＶ６２ペプチドの分解能（これはタンパク質分
解性活性のみを測定する）；神経筋麻痺（これはトキシン分子が細胞に入り、そ
れから神経伝達物質放出を阻害する能力を示す）、およびマ種々のトキシン構築
体の腹腔内注射の際のマウス致死率。これらのアッセイのうち前２つは上記のよ
うに行う。

【０１１２】 マウス致死率アッセイは本質的に以下のように行った： 組換え精製された単一鎖ＴｅＴｘ、Ｒ４９６Ｇ変異ＴｅＴｘおよびＥ２３４Ａ変
異ＴｅＴｘのサンプルをそれぞれ、２つの一定量に分け、そのうち１つはエンテ
ロキナーゼで処理してトキシンをニックする。すべてのサンプルを５０ｍＭ 燐
酸バッファー（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％（ｗ／ｖ
）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に連続希釈し、このトキシン調製物をマウス
腹腔内に注射する。

【０１１３】 表１に示されるように、天然およびニックされたＴｅＴｘ調製物は、マウス致
死率アッセイにおいて、約１×１０^８／ｍｇのＬＤ_５０を有し、比較的活性であ
った。ニックされていない組換えトキシンおよびニックされたＲ４９６Ｇ変異体
は両方とも約半分の活性であった。最後に、ニックされたＥ２３４Ａ、タンパク
質分解的に不活性なトキシンは５×１０^７分の１の活性より低い活性であった。

【０１１４】

【表１】 表１ ^ａタンパク質分解の初期率は Foran et al. (1994) に詳説されるＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ−に基づく方法を用いて測定された。１５μＭのヒトＶＡＭＰ−２の残基３３
〜９４に対応する合成ペプチド（ＨＶ６２）とのインキュベートを、２ｍＭ Ｄ
ＴＴ、０．２ｍｇ．ｍｌ−１ＢＳＡおよび５０μＭ ＺｎＣｌ_２を含む５０ｍＭ
ヘペス，ＮａＯＨ ｐH７．５中、１０〜１５％の基質を３０分間でタンパク質分
解するのに必要な適当な濃度の各還元されたトキシン調製物を用いて３７℃で行
った。データは平均である（±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４）。^ｂ ＬＤ５０は、４日以内に注射されたマウスの５０％を殺すトキシンの量である
。^ｃ トキシン調製物は、２２℃で１時間、ＥＫ（１ユニット／３０μｇ）でニック
した。^ｄ このｖ^ｏ値はＲＰ−ＨＰＬＣアッセイの検出下限を示す；長くインキュベート
してもＨＶ６２のタンパク質分解は観察されなかった。

【０１１５】 精製されたＳＣ Ｅ２３４Ａ ＴｅＴｘ（ここでは、２３４位の触媒的ＥがＡで
置換されている）は、ＥＫでのニック前または後において、ヒトＶＡＭＰ−２残
基３３から９４を含むペプチド（ＨＶ６２と称する）の検出可能なタンパク質分
解を全く示さなかった。したがって、ニックされたＴｅＴｘ Ｅ２３４Ａはマウ
ス中で全く毒性がなく、神経筋接合物での、あるいは小脳ニューロンからの伝達
物質放出の阻害が不能であることが証明された。

【０１１６】 しかしながら重要なことに、この変異体トキシンは、抹消および中枢ニューロ
ン上の細胞表面受容体に対する結合能を保持した。小脳ニューロンをニックされ
た（１０〜６０ｎＭ）またはニックされていない（７〜４０ｎＭ）ＴｅＴｘ Ｅ
２３４Ａと４℃でプレインキュベートし、次いで０．２ｎＭ天然トキシンを加え
ると、３７℃における天然トキシンによる伝達物質放出阻害が同様の程度にアン
タゴナイズされた（図７）。

【０１１７】 図９に示されるように、マウス横隔膜を１００ｎＭ ＴｅＴｘ Ｅ２３４Ａに４
℃で６０分間暴露した後、１ｎＭ天然トキシンを加えると、神経筋麻痺を生じさ
せるのにかかる時間が長くなった。

【０１１８】 マウス横隔神経片側横隔膜をＫＲ中３７℃で、この神経を刺激（０．２Ｈｚ、
１．５〜２．５ｖ）し、筋肉緊張を記録しながら、２０ｎＭ組換えＴｅＴｘ Ｅ
２３４Ａ（△）とインキュベートした。拮抗の評価では、片側横隔膜を４℃で６
０分間、０．１％ＢＳＡのみ（□）、または後者プラス１００ｎＭ ニックされ
たＴｅＴｘ Ｅ２３４Ａ（○）を含むＭＫＲとインキュベートした後、１ｎＭ 天
然ＴｅＴｘを加えた。後者に３０分暴露した後、組織をＭＫＲで３回、ＫＲで２
回洗浄した。温度を３７℃に上げ、上に概説されるように、誘発される筋肉痙攣
を記録しながら神経を刺激した。両組織において観察される、変異体によるトキ
シン結合に関する、この見かけの拮抗により、組換え二鎖ＴｅＴｘが細胞表面受
容体に対して、ＴｅＴｘの重鎖およびＨｃ単独よりずっと高いアフィニティーを
示すことが示される。これらの結果は組換え二鎖ＴｅＴｘのコンフォメーション
がこの細胞表面受容体に対して高いアフィニティーを有することを示す。

【０１１９】 さらに、非常に重要なことに、これらのデータは、ＴｅＴｘと同一の細胞受容
体に関する特異的結合を有する組換え分子を本特許出願の発明方法にしたがって
作成できることを示す。しかし、このような分子はＥ２３４Ａ変異体のように、
トキシン分子として不活性であり得るが、標的細胞による取り込み能は維持して
いるだろう；つまり潜在的トランスポーター分子として作用する。

【０１２０】 実施例８単一鎖ＢｏＮＴの発現 上に記載の方法と同様の方法を用いて、ＢｏＮＴサブタイプＡ神経毒Ｈおよび
Ｌ鎖を含むＤＮＡ断片を共に結合し、ＥＫ開裂部位によって分離した。この単一
鎖トキシンコーディング配列を、以下の表２に記載のように、種々のＮ末端配列
およびプロモーターを有する種々の発現ベクターに挿入した。

【表２】 表２

【０１２１】 「融合タグ」はそれぞれ、精製を助けるものとして、ならびに発現タンパク質
の溶解性および安定性を改善するために特異的結合複合体のメンバーを含んでい
た。これらのプラスミドを表２に示される大腸菌株に形質導入し、単一鎖トキシ
ンの発現をモニターした。

【０１２２】 別の態様では、単一鎖ＢｏＮＴ／Ａ構築物をプラスミドｐＭＡＬ−２のＢａｍ
ＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位間に挿入し、Ｎ末端にマルトース結合タンパ
ク質、次いで因子Ｘａ開裂部位を含有する融合ポリペプチドのコーディング配列
を生じさせた。

【０１２３】 アンピシリンを含む Luria ブロス中、形質転換体ＪＭ１０９コロニーを選択
した。発現は最終濃度０．３ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導した。ＴｅＴｘ
構築体に関して、一定量の細胞培養を収集し、誘導後、各サンプル中の細胞をソ
ニケーションによって溶解させ、上清を、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ用に調製した。電気泳動により、その見かけの分子量にしたがってタン
パク質を分離した後、このゲルを、ＢｏＮＴ／ＡのＨ鎖に対して作成した抗体を
用いるウエスタンブロットに付する。ウエスタンブロットは見かけの分子量約２
００ｋＤａの免疫学的に反応性の単一鎖トキシンバンドを示した。単一鎖ＢｏＮ
Ｔ分子さらに修飾して偶然のタンパク質開裂部位を排除（上記、トリプシンおよ
びＡｒｇ Ｃプロテアーゼに対して不安定なＴｅＴｘ部位において施された修飾
と同様に）すると、単一鎖ＢｏＮＴ／Ａ分子のさらに大きな安定性が導けるだろ
う。

【０１２４】 実施例９ＢｏＮＴ／Ｅを発現するプラスミドベクターの構築 クロストリディウムボツリヌスサブタイプＥ（株 Beluga）（ＢｏＮＴ／Ｅ）
由来の単一鎖組換えバージョンの神経毒を発現するプラスミドを以下のように構
築した。ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒のＥＭＢＬデータベースｃＤＮＡ配列（Genbank 受
け入れ番号 Ｘ６２０８９）に基づいてＰＣＲプライマーを設計した。このヌク
レオチド配列は本明細書中配列番号１０として示す。

【数１０】

【数１１】

【０１２５】 フォワードプライマーは以下のヌクレオチド塩基配列を有していた：

【数１２】 配列番号１１ ［ここに、ＢａｍＨＩエンドヌクレア−ゼ部位は下線されており、軽鎖マイナス
出発コドンは太字にしてある］。インバース（逆）プライマーは以下の配列を有
していた：

【数１３】 配列番号１２ ［ここに、ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ部位は下線されており、重鎖コーディン
グ領域の末端は太字にしてあり、終止コドンは小文字にしてある］。これらのプ
ライマーは標準的ＤＮＡ合成方法論を用いて作成した。

【０１２６】 この２つのプライマーを、種々の量のクロストリディウムボツリヌスタイプＥ
（株 Beluga）染色体ＤＮＡを含むＰＣＲ反応において用いた。このＰＣＲ反応
では、増幅遺伝子中の配列エラーを回避するため、プルーフリーディング活性を
有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Life Technology か
ら入手）を用いた。増幅反応条件は以下のものであった：４５秒変性（９５℃）
、次いで４５秒アニーリング（５６℃）、次いでプライマー伸展反応３分４８秒
（６８℃）を３０サイクル。

【０１２７】 このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロ
ースゲル電気泳動に付した。アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色すると
、約３．５キロベースの主要なＤＮＡ断片を示した（図１０参照）。この断片を
含むバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡをアガロースゲルからせいせいし、Ｂａ
ｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＱＥ３０ベクター（Quiagen）に連結
した。得られた連結プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を上記のように形質転
換し、形質転換体を選択ＬＢ寒天プレートにプレートした。いくつかのクローン
を回収し、正しいＢｏＮＴ／Ｅ ＤＮＡ挿入物を制限消化によってチェックした
。得られた構築体は、ｐＱＥ３０ベクターのＨｉｓ_６タグに融合されたＢｏＮＴ
／Ｅ遺伝子（マイナス最初のメチオニン）を含み、２個のさらなるアミノ酸残基
（グリシン、セリン）を含む（これらは操作されたＢａｍＨＩ部位によって寄与
される）。

【０１２８】 実施例１１ サイトダイレクト突然変異誘発によるＢｏＮＴ／Ｅのタンパク質分解的に不活性
な変異体の構築 ＢｏＮＴ／Ｅポリペプチド構築物の２１２位（活性部位内）のグルタミン酸を
グルタミンに変異させることにより、タンパク質分解的に不活性で、非毒性の単
一鎖ＢｏＮＴ／Ｅポリペプチドを得た。

【０１２９】 グルタミン置換は決まりきったサイトダイレクト突然変異誘発方を用いてフォ
ワードプライマー上に導入した。変異原性ＤＮＡプライマーは以下の配列を有し
ていた：

【数１４】 配列番号１３ ［ここに、２１２位のグルタミンをコードするコドンは小文字で示す］。

【０１３０】 逆ＰＣＲ反応は、以下のリバースプライマー：

【数１５】 配列番号１４ および上記Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technology）とともに上記プライ
マーを用いて行った。ＰＣＲ鋳型は野生型単一鎖ＢｏＮＴ／Ｅ構築物（ｐＱＥＥ
ＳＣｗｔと称する）であった。サイクルパラメータ（３０サイクル）は以下のよ
うであった：１）４５秒変性工程（９５℃）；２）４５秒アニーリング工程（５
６℃）；および３）７分１０秒の伸展工程（６８℃）。

【０１３１】 増幅反応の終わりに、制限酵素ＤｐｎＩを用いてＤＮＡ鋳型を消化し、変異し
たクローンのみの選択を可能にした。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に付
した後、約７キロベースのバンドを取り出し、ＤＮＡを精製し、これをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（Promega）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Promega）の存在下で
自己連結用に用い、ＰＣＲ産物のリン酸化を可能にした。連結混合物を用いて大
腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、形質転換体を選択寒天プレートにプレートした
。正しいプラスミド構築物をいくつかの形質転換体において制限消化によって確
認し、また変異をＤＮＡ配列決定によって確認した。図１１は変異体ＢｏＮＴ／
Ｅプラスミドの構築に関するプロトコルおよびエチジウムブロミド染色されたＰ
ＣＲ反応混合物（レーン２および３）ｖｓ分子量マーカー（レーン１）アガロー
スゲルを示す。

【０１３２】 実施例１２単一鎖組換えＢｏＮＴ／Ｅの精製 発現されたタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグが存在することにより、金属
アフィニティークロマトグラフィーによる組換え神経毒の単一工程の精製が可能
であった。

【０１３３】 ＢｏＮＴ／Ｅ単一鎖構築物の発現用に大腸菌株Ｍ１５（Qiagen）を用いた。こ
の株は、ＩＰＴＧを用いる誘導前の神経毒遺伝子の転写を防ぐために、ｌａｃ
Ｉ^ｑ受容体遺伝子をコードする領域を含む内因性のプラスミド（ｐＲＥＰ４、カ
ナマイシン耐性）を保持する。ｐＱＥ３０ベクターは、大腸菌ＲＮＡポリメラー
ゼによって認識されるＴ５バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター
を含む。

【０１３４】 ｐＱＥＥＳＣｗｔを含有するＭ１５細胞のコロニーを３７℃で一晩、０．１ｍ
ｇ／ｍＬアンピシリン；０．０２５ｍｇ／ｍＬカナマイシンおよび０．２％グル
コース（ｗ／ｖ）を含む２ＴＹ培地５ｍＬ中で培養し、得られた培養を同培地５
００ｍＬの接種に用いた。この第二の培養が６００ｎｍで０．５〜０．８の光学
密度に達したときに、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭまで加え、培養を２５℃で
一晩インキュベートし、神経毒を発現させた。

【０１３５】 次いで培養を遠心分離し、約２．３ｇの湿細胞ペレットを得、これを抽出バッ
ファー（２０ｍＭ ヘペスｐＨ７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ベンゾア
ミジン、２μＭ ペプスタチンおよび２μＭ Ｅ−６４）１０ｍＬに再懸濁した。
リゾチームを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬまで加え、細胞懸濁液を氷上で６０分
間インキュベートした。約０．５ｍＬのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ、Biospe
cから入手）を細胞懸濁液に加え、次いで２分間ボルテックスし、細胞を壊した
。遠心分離（１０，０００ｘｇ、３０分間、４℃）によって細胞を含まない抽出
液を得た。上清を、４℃で４５分間、振動プラットホーム中、抽出バッファーで
プレ洗浄した０．５ｍＬ Talon（登録商標）コバルト金属アフィニティー樹脂（
Clontech）とインキュベートした。次いでこの樹脂を使い捨てのクロマトグラフ
ィーカラムにロードし、１０ベッド容量の洗浄バッファー（２０ｍＭ ヘペスｐ
Ｈ７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ イミダゾール）で２回洗浄し、結合し
た神経毒を６ベッド容量の溶出バッファー（２０ｍＭ ヘペスｐＨ７．０、３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ イミダゾール）で溶出させた。

【０１３６】 溶出物を４℃で一晩、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ヘペス（ｐＨ７．
０）に透析し、遠心ろ過（ＭＷカットオフ１０ｋＤａ）して濃縮し、最終濃度１
ｍｇ／ｍＬタンパク質にした。

【０１３７】 図１２に示されるように、アフィニティー精製トキシンの純度は、還元条件下
でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシー染色および、ウエスタンブロッティン
グ、Quiagen から入手したマウスモノクローナル抗−Ｈｉｓ抗体でのＮ末端の検
出（２０００倍希釈）によって示された。高化学発光溶液（Santa Cruz）および
マウス二次的西洋ワサビペルオキシダーゼ（アフィニティー精製されたもの、Si
gma から入手）を、結合した抗体の検出に用いた。ウェル当たり約２μｇのタン
パク質サンプルをロードした。

【０１３８】 実施例１３精製した組換えＢｏＮＴ／Ｅ単一鎖ポリペプチドのトリプシン活性 精製したＢｏＮＴ／Ｅ一本鎖（単一鎖）神経毒ポリペプチド試料を、６０分間
、１０ｍｍ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、濃度１ｍｇ
毒素（トキシン）/ｍｌでトリプシン（最終濃度１．５μｇ/ｍｌ）を用いて一本
鎖をニッキングすることで活性化した。反応後、このトリプシンを０．５ｍＭ
ＰＭＳＦおよび１０μｇトリプシン阻害物質/ｍｌを用いて不活性化した。この
トリプシン処理の質は、還元および非還元双方の条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後
、このポリアクリルアミドゲルを、マウスモノクローナル抗−Ｈｉｓ抗体（キア
ゲン、２０００倍希釈）とマウスモノクローナル抗−Ｈ_ＣＩｇＧ（２６倍希釈）
を用いてクマシー染色を用いた染色、およびウェスタンブロッティングにより推
定し、検証した。図１３に示すように、クマシー染色したニックタンパク質は、
還元条件下において２つのバンドに分離され、一方で非還元条件下においては、
ジスルフィド連結された重鎖と軽鎖は、天然毒素に類似する。この抗体−検出し
た組換え重鎖は、その野生型クロストリディウム対照物と、およそ大きさが同一
であるのに対して、組換え軽鎖は、天然タンパク質と比べてわずかに高分子量側
へ移動している。この後者の特徴は、Ｎ−末端のＨｉｓ_６タグによる付加的な残
基のせいである。

【０１３９】 実施例１４組換えＢｏＮＴ／Ｅはタンパク質分解活性がある 天然ニックＢｏＮＴ／Ｅ毒素、ニックなし一本鎖組換え毒素、ニック二本鎖（
二鎖）組換え毒素、およびニック変異体（Ｅ２１２Ｑ）ＢｏＮＴ／Ｅのストック
溶液（１μＭ）をＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水（ＨＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中にて調製した。
これらの試料を、２０ｍＭ ＤＴＴの非存在下、または存在下にて、３７℃で３
０分間、インキュベートした後、図１４に示す最終濃度にＨＢＳ ０．０２ｍｌ
中で連続的に希釈した。

【０１４０】 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに連結したＳＮＡＰ−２５のアミノ酸
１４０−２０５を含む組換えペプチド（ＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５[１４０−２０
５]と称する）を、プロテアーゼ基質として用い、組換えＢｏＮＴ／Ｅポリペプ
チドのタンパク質分解活性を試験した。このプロテアーゼ基質１０μｇを毒素試
料とともにインキュベートした。２ｍＭ ＤＴＴの非存在下、または存在下にお
いて、３７℃で３０分間、この消化反応を引き続き行わせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサ
ンプルバッファーを添加し、５分間沸騰させて、反応を停止させた。

【０１４１】 この結果得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５[１４０
−２０５] ３μｇ／レーン）および銀染色することで分析した。図１４に示すよ
うに、ニックされていない組換え一本鎖毒素でさえ、タンパク質分解活性を保持
している。期待したように、変異体Ｅ２１２Ｑ ＢｏＮＴ／Ｅ構築物は、検出可
能なタンパク質分解活性を有さない。図１４は、ＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５[１４
０−２０５]バンドのみを示す。

【０１４２】 実施例１５ニッキングは組換えＢｏＮＴ／Ｅを完全に機能させる 培養（２×１０^６/直径２２ｍｍウェル）にて、１０日間維持した小脳神経（
小脳ニューロン）を、クレブス−リンガー ヘペス（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ
ＨＥＰＥＳ）（ＫＲＨ）バッファーを用いて洗浄した後、指定の濃度の天然Ｂｏ
ＮＴ／Ｅ（●）、トリプシン−ニック組換え体（○）、またはニックなし一本鎖
ＢｏＮＴ／Ｅ（▼）に暴露した（図１５を参照のこと）。３７℃にて６０分後、
、このトキシンを含むバッファーを取り除き、この細胞を２回洗浄した後、０．
２５μＣｉ/ｍｌ[^１４Ｃ]−標識化グルタミン（即ち、グルタメート前駆体）を
含むＫＲＨバッファーとともにインキュベートした。４５分後、後者の培地を除
去し、この神経（ニューロン）を３７℃にて４回洗浄し、伝達物質グルタメート
放出を評価した。コントロールおよび毒素−処理した神経を１．４ｍＭ Ｃａ^２
＋または０．５ｍＭ ＥＧＴＡのいずれかを含む、ＫＲＨバッファー中、３７℃
にて５分間インキュベートし、Ｃａ^２＋−非依存性放出を評価した；その後、こ
れらの[^１４Ｃ]−グルタメート含有量を決定するために、部分標本を取りだした
（以下を参照のこと）。

【０１４３】 基底培地を除去した後すぐに、５０ｍＭ ＫＣｌと１．４ｍＭ Ｃａ^２＋または
０．５ｍＭ ＥＧＴＡのいずれかを含むＫＲＨバッファーを添加し、上記のよう
に５分の刺激期間後に、[^１４Ｃ]−グルタメートアッセイのために部分標本を取
り出した。最終的に、神経を１％（ｗ/ｖ）ＳＤＳを含む２０ｍＭ ＥＧＴＡ．Ｎ
ａＯＨ ｐＨ７．５を用いて可溶化させ、部分標本を取りだし、細胞内に残留す
る放射能量を決定した。それぞれの試料中の[^１４Ｃ]−グルタメート量をシンチ
レーション計数して検定し、基底および刺激状態における放出レベルを、計算し
た総細胞含有量に関連するパーセンテージとして表した。

【０１４４】 それぞれの試料について、放出のＣａ^２＋−依存性構成要素を得るために、Ｅ
ＧＴＡを含むバッファー中の[^１４Ｃ]−グルタメート含有量％を、Ｃａ^２＋を含
むＫＲＰ試料について記録された値から差し引き、後者の基底示数を５０ｍＭ
ＫＣｌ試料について得られた値から差し引き、Ｋ^＋−誘発性Ｃａ^２＋−依存性放
出を得た。このように、毒素−処理した神経から得られた値は、毒素−不含コン
トロールと比較して表される。

【０１４５】 図１５は、残留するタンパク質分解活性に関わらず、ニックなし組換えＢｏＮ
Ｔ/Ｅが、天然ＢｏＮＴ/Ｅまたはニック組換えバージョンのいずれよりも、目に
見えて低い活性を有することを示す。このことは、ニックなし毒素が標的細胞に
侵入するのに十分な能力を持たないことを反映しているのだろう。従って、ニッ
ク組換えバージョンは、天然毒素よりもグルタメート放出の阻害により効果があ
ることを示す。

【０１４６】 実施例１６ 組換えＢｏＮＴ／Ｅはマウス神経筋終板（Endplate）において神経毒素の神経 筋麻痺活性と同等の活性を有する；ニッキングは効力を増大する ０．１％ ＢＳＡを含み、９５％ Ｏ_２/５％ ＣＯ_２飽和させたＫＲ中のマウス
横隔神経片側横隔膜を、浴槽に置いた。この横隔神経を刺激（０．２Ｈｚ、１．
５〜２．５ｍＶ）し、０．２ｎＭ 組換えニックＢｏＮＴ／Ｅ（○）または０．
２ｎＭ 天然ＢｏＮＴ／Ｅ（□）（図１６Ａ）、および１ｎＭ 組換えニックなし
（○）、１ｎＭ 組換えニック（●）または０．０５ｎＭ組換えニックＢｏＮＴ
／Ｅ（▽）（図１６Ｂ）を添加する前後の、神経誘発された筋肉緊張を記録した
。図１６Ａおよび図１６Ｂに示すように、組換えニックＢｏＮＴ／Ｅは、このア
ッセイにおいて天然毒素よりも高い活性を示す有効な麻痺剤である。ニックなし
毒素は、このアッセイにおいてニック毒素よりも有意に低い活性を示す。

【０１４７】 組換えニックＢｏＮＴ／Ｅの神経筋麻痺活性もまた、マウスの後ろ足筋肉への
筋肉内注射により実施した。これは、足指拡張反射アッセイ（toe spread refle
x assay）により推定されるように、典型的なボツリヌス症候群のパターンに伴
う麻痺を示した。

【０１４８】 このニック、組換え神経毒のインビボ神経毒性は、この毒素をマウスへ注射し
、１０^７マウスＬＤ_５０ユニット／ｍｇ以下の特定の神経毒性を有することで証
明した。

【０１４９】 実施例１７ＢｏＮＴ／Ｅ Ｅ２１２Ｑプロテアーゼ不活性変異体はＢｏＮＴ／Ｅ−誘導性神
経麻痺をアンタゴナイズする マウス横隔神経片側横隔膜を、ＫＲ培地中の１０ｎＭ ＢｏＮＴ／Ｅ Ｅ２１２
Ｑに暴露し、この神経を刺激し、誘発された筋肉緊張を記録した。図１７に示す
ように、ＢｏＮＴ Ｅ２１２Ｑ変異体は、神経に誘発される筋肉緊張（○）を減
少させないことで決定されるように、神経伝達を阻害しない。この神経毒素の活
性と拮抗（アンタゴナイズ）する非毒素変異体の能力を推定するために、０．１
％ ＢＳＡを含み、９５％ Ｏ_２/５％ ＣＯ_２で飽和させ、５ｎＭ ＢｏＮＴ／Ｅ
含有物を含まない（□）、または含む（△）ＭＫＲ中、マウス横隔神経片側横隔
膜を、４℃の浴槽に６０分間置いた。天然ニックＢｏＮＴ／Ｅをそれぞれの浴槽
に添加（最終濃度 ０．０５ｎＭ）し、この組織をさらに３０分間インキュベー
トした。その後、この神経−筋肉をそれぞれ、３回ＭＫＲ次いでＫＲで洗浄し、
温度を３７℃にまで上げ、この神経を刺激し、誘発された筋肉緊張を記録した。

【０１５０】 図１７に示すように、横隔神経片側横隔膜をＥ２１２Ｑプロテアーゼ不活性変
異体を用いて、予めインキュベートする場合、このアッセイにおいて、天然Ｂｏ
ＮＴ／Ｅ活性の開始期は遅れ、そして拮抗した。これはこの組換え変異体が天然
毒素のように正確に同じ細胞表面受容体に結合することを示す。このように、本
特許出願の方法は、完全な機能性受容体結合ドメインを有する組換えおよび修飾
された毒素、および治療物質の細胞内デリバリーについてのＢｏＮＴ−関連輸送
分子を作成するのに用いることができる。

【０１５１】 本明細書中の実施例が、好ましい組成物および方法を記載すること、並びに、
種々のクローニングストラテジー、プロテアーゼ開裂部位、および特異的結合複
合体メンバーを、本発明の範囲内を維持しつつ、本発明の実施および使用に用い
得ることは当業者であれば理解されよう。さらに、種々の二本鎖または二成分の
毒素分子、およびこれらの修飾バージョン（例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｅおよびそ
れらの修飾バージョン）を、本発明の方法および組成物を基礎として用いること
もできる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓＡ中の一本鎖ＴｅＴｘ構
築体および結合領域のヌクレオチド配列の概略図である。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、Ｌ鎖のカルボキシル末端とＨ鎖のアミノ末端および
操作されたループ領域（エンテロキナーゼ分解部位を含む）を連結するアミノ酸
配列を示す。

【図２】 図２Ａは、２種の組換え単一鎖トキシンを含む、大腸菌ＪＭ１０
９形質転換体の細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す
（ＩＰＴＧでのプラスミドタンパク質発現の誘導前または後）。検出に用いられ
る抗体は抗−Ｈｉｓ_６モノクローナル抗体である。 図２Ｂは、Ｅ２３４Ａ構築体で形質転換された細胞由来のＩＰＴＧ誘導化細胞
抽出物のウエスタンブロットである。

【図３】 図３Ａは、アフィニティー精製された組換え単一鎖（ＳＣ）Ｔｅ
Ｔｘをエンテロキナーゼでニックし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、
クーマシーブリリアントブルーを用いて視覚化する（還元または非還元条件下）
実験の結果を示す。 図３Ｂは、アフィニティー精製された組換え単一鎖（ＳＣ）ＴｅＴｘをエンテ
ロキナーゼでニックし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し（還元および非
還元条件下）、抗ＴｅＴ％Ｘ重鎖抗体を用いるウエスタンブロットに付する実験
の結果を示す。

【図４】 図４は、天然ＴｅＴｘ、および組換え単一鎖神経毒を用いる、ニ
キング前および後の、時間の関数としての、インビトロ神経／筋肉調製物中で誘
導された麻痺の程度のプロットである。

【図５】 図５は、組換え単一鎖ＴｅＴｘをトリプシンおよびＡｒｇ Ｃと
インキュベーションした際のペプチド断片、および得られた断片の１つのＮ末端
配列から推定された、これらの物質によって認識されるアミノ酸配列の図である
。

【図６】 図６はニックされなかったＳＣ ＷＴ ＴｅＴｘおよびＳＣ Ｒ４
９６Ｇ ＴｅＴｘを種々の濃度のトリプシンで消化したものを示す。

【図７】 図７は、Ｅ２３４Ａ変異体ＴｅＴｘとプレインキュベートされた
小脳細胞の、ＴｅＴｘに刺激されるＣａ^＋＋依存性神経伝達物質放出の阻害に対
する阻害作用を示す。

【図８】 図８は、天然、組換えＥ２３４Ａ変異体単一鎖、および組換えＲ
４９６Ｇ変異体単一鎖ＴｅＴｘへの暴露の際の、小脳ニューロンのＣａ^＋＋依存
性神経伝達物質放出に対する作用を示す。

【図９】 図９は、Ｅ２３４Ａ変異体ＴｅＴｘとプレインキュベートされた
マウス片側横隔膜のＴｅＴｘによって刺激された麻痺活性に対する阻害作用を示
す。

【図１０】 図１０は、単一鎖ＢｏＮＴ／Ｅをコードするプラスミドの構築
に関するスキーム、およびこのプラスミドの構築時に得られたＰＣＲ断片のアガ
ロースゲル電気泳動図を示す。

【図１１】 図１１は、Ｅ２１２Ｑタンパク質分解的に不活性な単一鎖Ｂｏ
ＮＴ／Ｅ変異体をコードするプラスミドの構築に関するスキーム、およびこのプ
ラスミドの構築時に得られた逆向きのＰＣＲ断片のアガロースゲル電気泳動図を
示す。

【図１２】 図１２は、組換え単一鎖ＢｏＮＴ／Ｅに関する発現および精製
スキーム、および精製フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図およびウエス
タンブロットを示す。

【図１３】 図１３は、天然ＢｏＮＴ／Ｅ、組換えのニックされていないＢ
ｏＮＴ／Ｅ、および組換えのニックされたＢｏＮＴ／Ｅの、還元および非還元条
件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図、およびこのトキシンの重鎖および軽
鎖に対するウエスタンブロットを示す。

【図１４】 図１４は天然のＢｏＮＴ／Ｅ、組換えの、ニックされているＢ
ｏＮＴ／ＥおよびニックされていないＢｏＮＴ／Ｅ、およびＥ２１２Ｑ変異体を
ＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５［１４０−２０５］プロテアーゼ基質とインキュベート
した結果を示す。

【図１５】 図１５は、小脳細胞を、天然ＢｏＮＴ／Ｅ、ニックされていな
い組換え単一鎖ＢｏＮＴ／Ｅ、およびニックされた組換え単一鎖ＢｏＮＴ／Ｅと
インキュベートすることのＣａ^＋＋依存性グルタメート放出に対する作用を示す
。

【図１６】 図１６Ａは、マウス横隔神経片側横隔膜を０．２ｎＭの組換え
のニックされたＢｏＮＴ／Ｅ（○）または０．２ｎＭの天然ＢｏＮＴ／Ｅ（□）
とインキュベートすることの筋肉の緊張に対する作用を示す。 図１６Ｂは、マウス横隔神経片側横隔膜を１ｎＭの組換えのニックされていな
いＢｏＮＴ／Ｅ（○）、１ｎＭの組換えのニックされたＢｏＮＴ／Ｅ（●）また
は０．０５ｎＭの組換えのニックされたＢｏＮＴ／Ｅ（▽）とインキュベートす
ることの筋肉の緊張に対する作用を示す。

【図１７】 図１７は、天然のニックされたＢｏＮＴ／Ｅトキシンへの暴露
前に不活性Ｅ２１２Ｑ変異体とプレインキュベーションすることによる、マウス
横隔神経片側横隔膜に対する麻痺活性の減弱を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/10 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/33 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チャン・クオ・チオン イギリス、ダブリュー14・８ユージェイ、 ロンドン、モーニングトン・アベニュー13 番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 CA04 HA01 HA17 4B064 AG31 BH09 CA02 CA19 CC24 CE12 DA01 4C084 AA01 AA06 AA07 BA01 BA07 BA22 CA04 DC50 NA14 ZA021 ZA061 ZA221 ZA291 ZA331 4H045 AA10 AA20 BA10 CA11 DA83 EA29 FA74 【要約の続き】

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）以下を含む第一のアミノ酸配列領域 ｉ）生理学的条件下、標的細胞表面マーカーと特異的に結合可能な結合因子を
   含む第一のドメイン；および、 ｉｉ）小胞膜を横切るポリペプチドのトランスファーを促進可能な転位因子を
   含む第二のドメイン；ならびに、 ｂ）標的細胞の細胞質内に放出されたときに生物学的活性を有する治療因子を含
   む第二のアミノ酸配列領域 を含む単離された単一鎖ポリペプチドであって、ここにその第一および第二のア
   ミノ酸配列領域は、プロテアーゼへの暴露時に開裂されるプロテアーゼ開裂部位
   を含む第三のアミノ酸配列領域によって分離されており、ただしこのプロテアー
   ゼは該単一鎖ポリペプチドを発現する細胞によって通常発現されないものである
   ポリペプチド。
2. 【請求項２】 第一のアミノ酸配列領域がクロストリディウム神経毒Ｈ鎖の
   少なくとも一部を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 クロストリディウム神経毒Ｈ鎖の部分がクロストリディウム
   ボツリヌスサブタイプＡの神経毒重鎖由来である、請求項２に記載のポリペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 第二のアミノ酸配列領域がクロストリディウム神経毒Ｌ鎖の
   少なくとも一部を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 クロストリディウム神経毒Ｌ鎖の部分がクロストリディウム
   ボツリヌスサブタイプＡ、ＢまたはＥから得られたもの由来である、請求項４に
   記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 クロストリディウム神経毒Ｈ鎖の部分がクロストリディウム
   テタヌスから得られたもの由来である、請求項２に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 クロストリディウム神経毒Ｈ鎖の部分がクロストリディウム
   ボツリヌスサブタイプＢ、クロストリディウムボツリヌスサブタイプＣ、クロス
   トリディウムボツリヌスサブタイプＤ、クロストリディウムボツリヌスサブタイ
   プＥ、クロストリディウムボツリヌスサブタイプＦ、クロストリディウムボツリ
   ヌスサブタイプＧ、Ｃ．バラチ、およびＣ．ブチリカムからなる群から選択され
   る生物の神経毒重鎖由来である、請求項２に記載のポリペプチド。
8. 【請求項８】 第一のドメインが膵臓腺房細胞表面に結合可能な結合因子を
   含む、請求項１に記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 第二のドメインがクロストリディウム神経毒Ｌ鎖を含む、請
   求項８に記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 結合因子が感覚求心性ニューロンの標的細胞表面マーカー
    と特異的に結合する請求項１に記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 プロテアーゼ開裂部位が以下からなる群から選択されるプ
    ロテアーゼによって開裂される、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチ
    ド： ａ）非ヒトエンテロキナーゼ； ｂ）タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ； ｃ）バチルススブチリス由来のプロテアーゼ； ｄ）バチルスアミリクイファシエンス由来のプロテアーゼ； ｅ）ライノウイルス由来のプロテアーゼ； ｆ）パパイン； ｇ）昆虫パパインホモログおよび、 ｈ）甲殻類パパインホモログ。
12. 【請求項１２】 プロテアーゼ開裂部位が以下からなる群から選択されるア
    ミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド： ａ）ＤＤＤＤＫ； ｂ）ＥＸＸＹＸＱＳ／Ｇ； ｃ）HY; ｄ）YH;および、 ｅ）LEVLFQGP （ここにＸ＝任意のアミノ酸である）。
13. 【請求項１３】 さらに結合タグを含む、請求項１または１１に記載のポリ
    ペプチド。
14. 【請求項１４】 結合タグが、Ｈｉｓ_６、モノクローナル抗体、マルトース
    結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、およ
    びカルモジュリン結合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドの標的
    結合部分を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 第一のアミノ酸配列領域が第一のクロストリディウム神経
    毒サブタイプ由来の重鎖の少なくとも一部を含み、第二のアミノ酸配列領域が第
    二のクロストリディウム神経毒サブタイプ由来の軽鎖の少なくとも一部を含み、
    ここに第一および第二のクロストリディウム神経毒サブタイプは同じでない、請
    求項１に記載のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 重鎖部分がＨＣ_Ａ、ＨＣ_Ｂ、ＨＣ_Ｃ１、ＨＣ_Ｄ、ＨＣ_Ｅ、
    ＨＣ_Ｆ、およびＨＣ_Ｇからなる群から選択される重鎖由来であり、軽鎖部分がＬ
    Ｃ_Ａ、ＬＣ_Ｂ、ＬＣ_Ｃ１、ＬＣ_Ｄ、ＬＣ_Ｅ、ＬＣ_Ｆ、ＬＣ_Ｇからなる群から選択
    される軽鎖由来であり、ここに重鎖および軽鎖部分は異なるクロストリディウム
    神経毒サブタイプ由来である、請求項１５に記載のポリペプチド。
17. 【請求項１７】 重鎖および軽鎖部分の少なくとも一方が、それぞれ、クロ
    ストリディウム神経毒サブタイプ由来の完全より小さい重鎖または軽鎖を含む、
    請求項１６に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 重鎖および軽鎖部分の少なくとも一方が、それぞれ、クロ
    ストリディウム神経毒サブタイプ由来の完全重鎖または軽鎖を含む、請求項１６
    に記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 第一または第二のアミノ酸配列領域が修飾され、プロテア
    ーゼによって特異的に開裂される少なくとも１アミノ酸配列が排除されている、
    請求項１、２、８、１０または１５のいずれかに記載のポリペプチド。
20. 【請求項２０】 開裂可能な単一鎖ポリペプチドをコードするオープンリー
    ディングフレームを含む核酸配列領域を有するプラスミドであって、このオープ
    ンリーディングフレームが ａ）以下を含む第一のヌクレオチド配列領域： ｉ）生理学的条件下、標的細胞表面マーカーと特異的に結合可能な結合因子を
    含む第一のアミノ酸配列領域をコードする第一の部分；および、 ｉｉ）小胞膜を横切るポリペプチドのトランスファーを促進可能な転位因子を
    含む第二のアミノ酸配列領域をコードする第二の部分；ならびに、 ｂ）標的細胞の細胞質内に放出されたときに生物学的活性を有する治療因子を含
    む第三のアミノ酸配列領域をコードする第二のヌクレオチド配列領域 を含み、ここに第一および第二のヌクレオチド配列領域は、プロテアーゼへの暴
    露時に開裂されるプロテアーゼ開裂部位を含む第四のアミノ酸配列をコードする
    第三のヌクレオチド配列領域によって分離され、ただしこのプロテアーゼはこの
    単一鎖ポリペプチドを発現する細胞によって通常発現されず、ここにこの単一鎖
    ポリペプチドは適当な宿主細胞内でこのプラスミドによって発現されるプラスミ
    ド。
21. 【請求項２１】 第一および第二のヌクレオチド配列領域がさらに結合タグ
    を含むアミノ酸配列領域をコードする、請求項２０に記載のプラスミド。
22. 【請求項２２】 結合タグが、以下からなる群から選択されるポリペプチド
    の標的結合部分を含む、請求項２１に記載のプラスミド： Ｈｉｓ_６、モノクローナル抗体、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ
    −トランスフェラーゼ、プロテインＡ、およびカルモジュリン結合タンパク質。
23. 【請求項２３】 第一のヌクレオチド配列領域がクロストリディウム神経毒
    重鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２０に記載のプラスミド。
24. 【請求項２４】 第一のヌクレオチド配列領域がクロストリディウムボツリ
    ヌス神経毒重鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２３に記載のプラスミド
    。
25. 【請求項２５】 第一のヌクレオチド配列領域がクロストリディウムテタヌ
    ス神経毒重鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２３に記載のプラスミド。
26. 【請求項２６】 第二のヌクレオチド配列領域がクロストリディウム神経毒
    軽鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２０または２３のいずれかに記載の
    プラスミド。
27. 【請求項２７】 第二のヌクレオチド配列領域がクロストリディウムボツリ
    ヌス神経毒軽鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２６に記載のプラスミド
    。
28. 【請求項２８】 第二のヌクレオチド配列領域がクロストリディウムテタヌ
    ス神経毒軽鎖の少なくとも一部をコードする、請求項２６に記載のプラスミド。
29. 【請求項２９】 第一のヌクレオチド配列領域が、運動ニューロン以外の細
    胞タイプと特異的に結合する結合因子をコードする、請求項２０に記載のプラス
    ミド。
30. 【請求項３０】 第一のヌクレオチド配列領域が、膵臓腺房細胞および感覚
    求心性ニューロンからなる群から選択される細胞タイプと特異的に結合する結合
    因子をコードする、請求項２９に記載のプラスミド。
31. 【請求項３１】 第二のヌクレオチド配列領域がクロストリディウム神経毒
    軽鎖以外の治療因子をコードする、請求項２０に記載のプラスミド。
32. 【請求項３２】 クロストリディウム神経毒由来の単一鎖ポリペプチドを作
    成する方法であって、 ａ）請求項２０〜３１のいずれかに記載のプラスミドを適当な宿主細胞内に挿入
    し； ｂ）宿主細胞を培養中で生育させ； ｃ）宿主細胞が該プラスミドによってコードされる単一鎖ポリペプチドを発現す
    ることを可能にし、あるいは誘導することを含む方法。
33. 【請求項３３】 請求項１３に記載の組換え単一鎖ポリペプチドを精製する
    方法であって、該単一鎖ポリペプチドを発現する細胞を溶解させて細胞溶解液を
    作成し、この細胞溶解液を標的化合物と接触させ、結合タグと標的化合物を含む
    固定化可能な特異的結合複合体を形成させる工程を含む方法。
34. 【請求項３４】 ａ）以下を含む第一のアミノ酸配列領域 ｉ）生理学的条件下、標的細胞表面マーカーと特異的に結合可能な結合因子を
    含む第一のドメイン；および、 ｉｉ）小胞膜を横切るポリペプチドのトランスファーを促進可能な転位因子を
    含む第二のドメイン；ならびに、 ｂ）標的細胞の細胞質内に放出されたときに生物学的活性を有する治療因子を含
    む第二のアミノ酸配列領域 を含む単離された単一鎖ポリペプチドであって、ここにその第一および第二のア
    ミノ酸配列領域は、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒の鎖間ループ領域を含む第三のアミノ酸
    配列領域によって分離されているポリペプチド。