JP2009508489A - クロストリジウム毒素活性化クロストリジウム毒素 - Google Patents
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Abstract
明細書は、２本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素；かかる２本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子；および２本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法を開示する。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
本出願は、特許法§１１９（ｅ）に従って、２００５年９月１９日に出願した米国仮特許出願60/718,616の優先権を主張する。そして、その内容は完全に本願明細書に引用する。
クロストリジウム毒素、例えば、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴｓ）、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/G、破傷風神経毒(TeNT)、バラティウム（Baratium）毒素(BaNT)およびブチリカム（Butyricum）毒素(BuNT)等の、神経伝達を阻害する能力は、多種多様な治療的なおよび化粧品用適用で利用されている。例えば、William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004)参照。医薬組成物として商業的に入手可能なクロストリジウム毒素は、例えば、BOTOX（登録商標）(Allergan, Inc., Irvine, CA)、Dysport（登録商標）/Reloxin（登録商標） (Beaufour Ipsen, Porton Down, England)、Linurase（登録商標） (Prollenium, Inc., Ontario, Canada)、Neuronox（登録商標） (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, South Korea) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China)およびXeomin（登録商標） (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany)等のBoNT/A製剤;例えば、MyoBloc（登録商標）/NeuroBloc（登録商標） (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA)等のBoNT/B製剤、を含む。例として、BOTOX（登録商標）は、以下の適用で１以上の国で現在承認されている：アカラシア、成人痙性、裂肛、背痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、頸部異緊張症、本態性振戦、眉間のしわ、または運動過多性の顔のしわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の活動亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻、口唇のしわ、痙攣性発声障害、斜視およびＶＩＩ神経障害。
ヒトにおける多様な苦痛を処置するクロストリジウム毒素治療の増加する使用は、これらの毒素が生産される効率の増加を必要とする。しかしながら、このような毒素処置の需要の更なる増加に対するニーズを満たすことは難しくなってきている。１つの未解決の課題は、すべてのクロストリジウム毒素が最適活性を成し遂げるために２本鎖（di-chain）の分子の形態に変わることを必要とするということである。歴史的には、この変換は、２つの方法のうちの１つでなされてきた。第１の方法は単に菌株自体からクロストリジウム毒素を精製し、それによって、毒素の単鎖の形態を２本鎖の形態に変換するために用いる自然に生じる内因性のプロテアーゼに依存する。第２の方法は、適切な場所で見つかる偶然の切断部位を利用するか、または、一般に使用され、商業的に入手可能な外因性のプロテアーゼの切断部位を遺伝子操作することによって単鎖形態を２本鎖に変換する外因性プロテアーゼを利用する。しかしながら、これら方法の両方にはいくつかの欠点がある。例えば、内因性プロテアーゼを採用する方法は、クロストリジウム属は、本来、少ししか毒素を生産しないので、低い毒素収率で生産される。さらに、これらの毒素は、研究用にほとんど適してない、よって、それらの治療および化粧品への貢献を改善するためのクロストリジウム毒素の遺伝子操作の努力を妨げる。最後に、いくつかのクロストリジウム毒素は、単鎖形態の毒素を２本鎖形態に変換するのに必要な内因性プロテアーゼを産生しない。外因性プロテアーゼの使用の欠点は、プロテアーゼの特異性がないことであり、その結果、不適切な場所でのタンパク分解性開裂のために不活性毒素が得られる。さらに、現在入手可能なプロテアーゼの多くは、製造基準（GMS）の承認を欠いた動物期限由来であり、製造プロセスの間に更なる精製工程を必要とする。よって、単鎖形態の毒素を２本鎖形態に変換するために現在使用されている方法は、非効率的で、扱いにくく、より高い全体の生産コストにつながる。これらの毒素の２本鎖形態が、科学的、治療的および化粧品の適用に必要とされているので、これらの欠点は、全体的なクロストリジウム毒素の商業的生産の顕著な障害であり、よって、大きな問題である。さらに、将来の治療に予測されるクロストリジウム毒素の量、そして、より良好な治療的性質を有する毒素に対する需要の両方が、増大している。したがって、これらの必要を満たすために、クロストリジウム毒素２本鎖分子のより良い生産方法を開発する必要性が存在する。
本発明は、単鎖形態のクロストリジウム毒素を２本鎖形態に変換する新規な方法による修飾されたクロストリジウム毒素を提供する。これらの、そして関連する利点は、例えば、神経筋障害、神経因性障害、目疾患、痛み、筋肉損傷、頭痛、心臓血管疾患、精神神経性障害、内分泌障害、癌、耳の障害および運動過多性の顔のしわ、並びに、クロストリジウム毒素の哺乳類への投与が有利な効果を奏する他の疾患等の、多様な、臨床的、治療的そして化粧品用の適用に有用である。
図の簡単な説明
図１は、クロストリジウム毒素翻訳後プロセッシングの現在のパラダイムの概略図を示す。クロストリジウム毒素は、酵素ドメイン、トランスロケーションドメインおよび結合ドメインを含む約１５０ｋＤａの単鎖ポリペチドとして翻訳される。酵素のドメインのシステイン残基およびトランスロケーションドメインからのシステイン残基から形成されるジスルフィド結合は、２本鎖ループを形成する。この２本鎖ループの中に、毒素を合成するクロストリジウム属より内因性に、または、環境中で見出される起源より外因性に、産生され得る天然に存在するプロテアーゼに対する、プロテアーゼ切断部位が存在する。天然に存在するプロテアーゼによるプロテアーゼ切断部位の切断が、単鎖形態の毒素を２本鎖形態に変換する。２本鎖形態の毒素は、ジスルフィド結合および２つの鎖間の非共有的な相互作用により一緒に保持される。
図１は、クロストリジウム毒素翻訳後プロセッシングの現在のパラダイムの概略図を示す。クロストリジウム毒素は、酵素ドメイン、トランスロケーションドメインおよび結合ドメインを含む約１５０ｋＤａの単鎖ポリペチドとして翻訳される。酵素のドメインのシステイン残基およびトランスロケーションドメインからのシステイン残基から形成されるジスルフィド結合は、２本鎖ループを形成する。この２本鎖ループの中に、毒素を合成するクロストリジウム属より内因性に、または、環境中で見出される起源より外因性に、産生され得る天然に存在するプロテアーゼに対する、プロテアーゼ切断部位が存在する。天然に存在するプロテアーゼによるプロテアーゼ切断部位の切断が、単鎖形態の毒素を２本鎖形態に変換する。２本鎖形態の毒素は、ジスルフィド結合および２つの鎖間の非共有的な相互作用により一緒に保持される。
図２は、神経伝達物質放出の現在の模範および中枢および末梢神経で位のクロストリジウム毒素中毒の概略図を示す。図２ａは、中枢および末梢神経の神経伝達物質放出メカニズムの模式図を示す。放出プロセスは、以下の２段階：１）ベジクルドッキング、ここで、神経伝達分子を含むベジクルのベジクルに結合されたＳＮＡＲＥ蛋白質が、原形質膜に位置する膜に結合されたＳＮＡＲＥ蛋白質に結合しする；および、２）神経伝達物質の放出、ここで、ベジクルが原形質膜に融合し、神経伝達分子がエキソサイトーシスされる、として記載され得る。図２ｂは、中枢および末梢神経における破傷風およびボツリヌス毒素活性の中毒メカニズムのスキームを示す。中毒メカニズムは、以下の４段階：１）受容体結合、ここで、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム受容体系に結合し、そして、中毒プロセスを開始する；２）複合体内部移行、ここで、毒素結合の後、毒素／受容体系複合体を含むベジクルが細胞内にエンドサイトーシスされる；３）Ｌ鎖トランスロケーション、ここで、多数の現象の結果、活性のある軽鎖を細胞質中へ放出する；および４）酵素標的修飾、ここで、クロストリジウム毒素の活性のある軽鎖が、例えば、SNAP-25、VAMPまたはSyntaxin（シンタキシン）等の標的ＳＮＡＲＥ基質を蛋白質分解的に開裂させ、これによって、ベジクルドッキングおよび神経伝達物質の放出を妨げる、として記載され得る。
図３は、SNAP-25、VAMPおよびSyntaxinの細胞内局在および切断部位の模式図を示す。VAMPはシナプス小胞膜に位置し、一方、SNAP-25およびSyntaxinは、原形質膜に存在する。BoNT/AおよびBoNT/Eは、SNAP-25を、カルボキシ末端近くで切断し、９または２６残基をそれぞれ放出する。BoNT/B、BoNT /D、BoNT /F、BoNT /GおよびTeNTは、VAMP（白ボックス）の保存された中央部分に作用し、VAMPのアミノ末端細胞質部分の半分を細胞質へ放出する。BoNT/C1は、SNAP-25をカルボキシ末端近くで、並びにSyntaxinを、細胞質膜表面の近くの単一部位で切断する。BoNT/ C1の作用により、Syntaxinの細胞質部分の大部分が放出されるが、一方、BoNT/ C1の選択的な蛋白質分解によりSNAP-25はほんの少ししか放出されない。
図４は、修飾クロストリジウム毒素の概略図を示す。図４ａは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/A切断に感受性のあるSNAP-25ファミリーのメンバー由来の、BoNT/A切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/AによるBoNT/A切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図４ｂは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/E切断に感受性のあるSNAP-25ファミリーのメンバー由来の、BoNT/E切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/EによるBoNT/E切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。
図５は、修飾クロストリジウム毒素の概略図を示す。図５ａは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/B切断に感受性のあるVAMPファミリーのメンバー由来の、BoNT/B切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/BによるBoNT/B切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図５ｂは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/D切断に感受性のあるVAMPファミリーのメンバー由来の、BoNT/D切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/DによるBoNT/D切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図５ｃは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/F切断に感受性のあるVAMPファミリーのメンバー由来の、BoNT/F切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/FによるBoNT/F切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図５ｄは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/G切断に感受性のあるVAMPファミリーのメンバー由来の、BoNT/G切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/GによるBoNT/G切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図５ｅは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、TeNT切断に感受性のあるVAMPファミリーのメンバー由来の、TeNT切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。TeNTによるTeNT切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。
図６は、修飾クロストリジウム毒素の概略図を示す。図６ａは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/C1切断に感受性のあるSyntaxinファミリーのメンバー由来の、BoNT/C1切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/C1によるBoNT/C1切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。図６ｂは、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、および、例えば、BoNT/C1切断に感受性のあるSNAP-25ファミリーのメンバー由来の、BoNT/C1切断部位を含む、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、結合ドメインおよび２本鎖ループを示す。BoNT/C1によるBoNT/C1切断部位の切断は、単鎖形態の修飾毒素を２本鎖形態に変換する。
図７は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０３の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２２５のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-A17のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ａ１７、ＢｏＮＴ／Ａ基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図８は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０５の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２２７のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-BT35のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＴ３５、BoNT/B基質切断部位およびTeNT基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図９は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０７の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２２９のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-Csyn8のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｃｓｙｎ８、BoNT/C1基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図１０は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０９の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３１のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-DF39のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＤＦ３９、BoNT/D基質切断部位およびBoNT/F基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図１１は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２１１の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３３のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-E8のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｅ８、BoNT/E基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図１２は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２１３の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３５のポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構築物pET29b/BoNT/A-G8のプラスミドマップを示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：ＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｇ８、BoNT/G基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；Ｔ７ ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終止部位；ｆ１起源、バクテリオファージｆ１複製開始点；カナマイシン、カナマイシン耐性を与えるアミノ・ホスホトランスフェラーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起源；ｌａｃＩ、ラクトースＩをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図１３は、カルボキシル末端c-mycおよびポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０３の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３６のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物pPICZ A/BoNT/A-A17のプラスミドマップを示す。略語は以下のようである：PAOX1、アルデヒドオキシダーゼ１プロモーター領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ａ１７、BoNT/A基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；ＡＯＸ１ ＴＴ、アルデヒドオキシダーゼ１転写終止部位；Zeocin（登録商標）、ゼオシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｐＵＣ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起源。
図１４は、カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０３の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３７のポリヌクレオチド分子を含むバキュロウイルストランスファー（baculovirus transfer）構築物pBACgus3/BoNT/A-A17のプラスミドマップを示す。トロンビンプロテアーゼ切断部位は、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾BoNT/Aの間に操作可能に連結されている。略語は以下のようである：PPH、ポリヘドリンプロモーター領域；ｇｐ６４、ｇｐ６４シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ａ１７、BoNT/A基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；トロンビン、トロンビン切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；ｐＵＣ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起源；アンピシリン、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子；ｆ１ ori、バクテリオファージｆ１複製開始点；ｇｕｓ、β−グルクロニダーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子。
図１５は、カルボキシル末端c-mycおよびポリヒスチジン結合ポリペプチドが操作可能に連結された、配列番号：２０３の修飾BoNT/Aをコードする配列番号：２３８のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物pSecTag2/BoNT/A-A17のプラスミドマップを示す。略語は以下のようである：PＣＭＶ、サイトメガロウイルスプロモーター領域；ＩｇＫ、免疫グロブリンＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；Ａ１７、BoNT/A基質切断部位をコードしているポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンを結合しているポリペチドをコードしているポリヌクレオチド分子；ＢＧＨｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位；ｆ１ ori、バクテリオファージｆ１複製開始点；ＰＳＶ４０、シミアンウイルスプロモーター領域；Zeocin（登録商標）、ゼオシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｐＵＣ ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起源；アンピシリン、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼをコード化しているポリヌクレオチド分子。
詳細な説明
クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムバラティ（Clostridium baratii）およびクロストリジウムブチリカム（Clostridium butyricum）が生産するクロストリジウム毒素は、ヒトおよび他の哺乳動物の治療および化粧品用の処置に最も広く使用される。Ｃ．ボツリナムの属は、７つの抗原性が異なるボツリヌス毒素（BoNTs）を生産し、それらは、ヒト（BoNT/A、/B、/Eおよび/F）、動物（BoNT/C1および/D）におけるボツリヌス中毒症発生研究により同定されるか、または土壌より単離されてきた（BoNT/G）。BoNTsはそれぞれ、約３５％のアミノ酸同一性を保有し、同じ機能のドメイン機構および全体的な構造を共有する。クロストリジウム毒素のそれぞれのタイプには、それらのアミノ酸配列において、そして、また、それら蛋白質をコードする核酸配列において、いくぶん異なるサブタイプが存在することは、当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/Aサブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3およびBoNT/A4が存在し、特定のサブタイプは、他の１つのBoNT/Aサブタイプと比較したとき、約８９％のアミノ酸同一性を示す。７つ全てのBoNT血清型は同様の構造および薬理学的性質を有するが、それぞれは、また、不均一な細菌学的特徴を示す。一方、破傷風毒素（TeNT）は、Ｃ．テタニの同一のグループによって産生される。他の２つのクロストリディア（Clostridia）属、C. バラティおよびC.ブチリカムも、また、毒素、BaNTおよびBuNTをそれぞれ生産し、それらは、ぞれぞれBoNT/FおよびBoNT/Eと同様である。
クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウムテタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウムバラティ（Clostridium baratii）およびクロストリジウムブチリカム（Clostridium butyricum）が生産するクロストリジウム毒素は、ヒトおよび他の哺乳動物の治療および化粧品用の処置に最も広く使用される。Ｃ．ボツリナムの属は、７つの抗原性が異なるボツリヌス毒素（BoNTs）を生産し、それらは、ヒト（BoNT/A、/B、/Eおよび/F）、動物（BoNT/C1および/D）におけるボツリヌス中毒症発生研究により同定されるか、または土壌より単離されてきた（BoNT/G）。BoNTsはそれぞれ、約３５％のアミノ酸同一性を保有し、同じ機能のドメイン機構および全体的な構造を共有する。クロストリジウム毒素のそれぞれのタイプには、それらのアミノ酸配列において、そして、また、それら蛋白質をコードする核酸配列において、いくぶん異なるサブタイプが存在することは、当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/Aサブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3およびBoNT/A4が存在し、特定のサブタイプは、他の１つのBoNT/Aサブタイプと比較したとき、約８９％のアミノ酸同一性を示す。７つ全てのBoNT血清型は同様の構造および薬理学的性質を有するが、それぞれは、また、不均一な細菌学的特徴を示す。一方、破傷風毒素（TeNT）は、Ｃ．テタニの同一のグループによって産生される。他の２つのクロストリディア（Clostridia）属、C. バラティおよびC.ブチリカムも、また、毒素、BaNTおよびBuNTをそれぞれ生産し、それらは、ぞれぞれBoNT/FおよびBoNT/Eと同様である。
クロストリジウム毒素は、それぞれ、約１５０ｋDaの単鎖ポリペプチドとして翻訳され、その後、天然に存在するプロテアーゼによって、ジスルフィドループ内で蛋白質分解性の切断により切断される（図１）。この切断は、ジスルフィド架橋を形成する２つおシステイン残基の間でつくられる２本鎖ループ（di-chain loop）領域の中で起こる。この翻訳後のプロセッシングは、単一のジスルフィド結合および２本の鎖間の非共有結合により互いが保持された、約５０ｋDaの軽鎖（LC）および約１００ｋDaの重鎖（HC）を含む、２本鎖分子を産生する。単鎖分子を２本鎖に変換するのに用いられる天然に存在するプロテアーゼは、現在知られていない。いくつかの血清型、例えば、BoNT/Aでは、細菌血清型により内因性に産生され、毒素が環境中に放出される前に、細胞内で切断が生じる。しかしながら、他の血清型、例えば、BoNT/Eでは、細菌種は、単鎖形態を２本鎖形態に変換することができる内因性のプロテアーゼを産生しないようである。このような状況において、毒素は細胞より単鎖の毒素として放出され、その後、環境中で見出される天然に存在するプロテアーゼにより２本鎖形態に変換される。
それぞれの成熟型の２本鎖分子は、３つの機能の異なるドメインを含む：１）神経伝達物質放出の装置の核となる構成要素を特異的に標的とする、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン（表１）；２）標的細胞の細胞質中への細胞内ベジクルからのＬＣの放出を促進するＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端半分に含まれるトランスロケーションドメイン（表１）；３）標的細胞の表面に位置する受容体への毒素の結合活性および特異的結合を決定するＨＣ（ＨＣ）のカルボキシル末端半分に見出され得る結合ドメイン（表１）。
これら３つの機能ドメインの、結合、トランスロケーションおよび酵素活性は、全て毒素に必要である。このプロセスの詳細の全ては未だ正確には知られていないが、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質の放出を阻害する全体的な細胞の中毒メカニズムは、タイプによらず同様である。出願人は以下の記載により限定されることを望まないが、中毒メカニズムは、少なくとも４工程：１）受容体結合、２）複合体の内在化、３）軽鎖にトランスロケーション、および４）酵素的標的修飾、を含むものとして記載され得る（図２参照）。プロセスは、クロストリジウム毒素のＨＣドメインが、標的細胞の原形質膜表面に位置する毒素特異的受容体複合体に結合するときに開始される。受容体複合体の結合特異性は、ガングリオシド、およびそれぞれのクロストリジウム毒素受容体複合体をはっきりと含むようである蛋白質の特異的な組み合わせにより、部分的に成し遂げられる。一度結合すると、毒素／受容体複合体は、エンドサイトーシスにより内部移行し、そして、内在化されたベジクルが特定の細胞内ルートで振り分けられる。トランスロケーション工程は、ベシクルコンパートメントの酸性化により誘発されるようである。このプロセスは、疎水性を増加させ、毒素の２本鎖形態の形成を促進する２つの重要なｐＨ依存的な構造の再構成により誘発されるようである。一度活性化されると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼは、細胞内ベジクルから細胞質に放出され、ここで、それは、神経伝達物質放出装置の３つの知られている核となる構成要素の１つを特異的に標的とする。これらの核となる蛋白質、ベジクル−結合膜蛋白質（VAMP）／シナプトブレビン（synaptobrevin）、２５ｋＤａシナプトソーム−結合蛋白質（SNAP-25）およびSyntaxinは、神経終末におけるシナプス小胞ドッキングおよび融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド−感受性因子−結合蛋白−受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、カルボキシル末端の近くでＳＮＡＰ−２５を切断し、９または２６のアミノ酸部分をそれぞれ放出し、そして、ＢｏＮＴ／Ｃ１もカルボキシル末端の近くでＳＮＡＰ―２５を切断する。ボツリヌス・セロタイプＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇおよび破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中央部分に作用して、サイトゾルにＶＡＭＰのアミノ終末部分を放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、細胞質の膜表面近くで単一部位でSyntaxinを切断する。シナプスのSNAREsの選択的な蛋白質分解は、インビボにおけるクロストリジウム毒素に起因する神経伝達物質のブロックを説明する。クロストリジウム毒素のSNARE蛋白質の標的は、あらゆる非神経タイプにおけるエキソサイトーシスに共通である；これらの細胞においては、神経細胞と同様に、軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)参照。
本発明は、クロストリジウム毒素の酵素活性を使用して単鎖ポリペプチド形態から２本鎖形態に変換されうる修飾クロストリジウム毒素を開示する。これは、２本鎖ループ領域に見出される天然に存在するプロテアーゼ切断部位を、クロストリジウム毒素基質切断部位に置換することにより成し遂げられる。修飾において、クロストリジウム毒素基質切断部位置換は、クロストリジウム毒素に対する基質であり、活性化はBoNT/A酵素活性を有するクロストリジウムを用いることにより成し遂げられる。この切断部位置換により、異なるプロテアーゼの依存を取り除いて、これら修飾毒素が互いに活性化することが可能になる。例えば、BoNT/A基質切断部位を含む修飾BoNT/Aにより、BoNT/A酵素活性を有するクロストリジウム毒素が修飾BoNT/AのBoNT/A基質切断部位を切断することが可能になり、それにより、毒素の２本鎖形態が生産される。修飾において、クロストリジウム毒素基質切断部位置換は、クロストリジウム毒素に対する基質であり、活性化はBoNT/C1酵素活性を有するクロストリジウムを用いることにより成し遂げられる。例えば、BoNT/C1基質切断部位を含む修飾BoNT/Aにより、BoNT/C1酵素活性を有するクロストリジウム毒素が修飾BoNT/AのBoNT/C1基質切断部位を切断することが可能になり、それにより、毒素の２本鎖形態が生産される。
本発明の一態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、修飾されたクロストリジウム毒素の２本鎖ループ領域内に位置する。いかなるクロストリジウム毒素基質切断部位も使うことができると想像され、それは、ＢｏＮＴ／Ａ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ基質切断部位、ＴｅＮＴ基質切断部位、ＢａＮＴ基質切断部位およびＢｕＮＴ基質切断部位を含むが、これらに限定されない。
本発明の別の態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、２本鎖ループ領域に位置する。
本発明の他の態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素を製造する方法を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、２本鎖ループ領域に位置する。本発明の他の態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素を細胞で製造する方法を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、２本鎖ループ領域に位置し、そして、細胞内で発現構築物が発現する。
本発明の態様は、一部には、クロストリジウム毒素を提供する。本明細書で用いられるように、用語「クロストリジウム毒素」は、全体的な細胞メカニズムを達成することができるいずれかのペプチドを意味し、そのメカニズムは、それにより、クロストリジウム毒素が神経細胞内に入り、神経伝達物質の放出を阻害し、そして、クロストリジウム毒素が低い、または高い親和性で受容体複合体に結合すること、毒素／受容体複合体を内在化すること、クロストリジウム毒素軽鎖を細胞室内にトランスロケーションすること、およびクロストリジウム毒素基質を修飾することを含む。
クロストリジウム毒素は、限定されずに、天然に存在するクロストリジウム毒素変異体、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプ；天然に存在しないクロストリジウム毒素変異体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体、クロストリジウム毒素キメラ改変体およびそれらの活性なクロストリジウム毒素フラグメント、それらのいずれの組み合わせを含む。本明細書で使用されるように、「クロストリジウム毒素改変体」は、天然に存在しようが、または天然に存在しなくても、開示された参照配列（表１参照）の対応する領域から、少なくとも１アミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素を意味し、参照配列の対応する領域に対し同一性％で記載されうる。非限定的な例として、配列番号：１の１−１２９６アミノ酸を含むBoNT/A改変体は、配列番号：１の１−１２９６アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：２の１−１２９１アミノ酸を含むBoNT/B改変体は、配列番号：２の１−１２９１アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：３の１−１２９１アミノ酸を含むBoNT/C1改変体は、配列番号：３の１−１２９１アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：４の１−１２７６アミノ酸を含むBoNT/D改変体は、配列番号：４の１−１２７６アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：５の１−１２５２アミノ酸を含むBoNT/E改変体は、配列番号：５の１−１２５２アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：６の１−１２７４アミノ酸を含むBoNT/F改変体は、配列番号：７の１−１２７４アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；配列番号：７の１−１２９７アミノ酸を含むBoNT/G改変体は、配列番号：７の１−１２９７アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得；そして配列番号：８の１−１３１５アミノ酸を含むTeNT改変体は、配列番号：８の１−１３１５アミノ酸領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る。
いずれの多様な配列アライメント方法が同一性％を決定するために使用することができ、それは、限定されずに、グローバル法、ローカル方法およびハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ方法を含む。同一性％を決定する方法は、当業者の見識内であり、そして本明細書から、ルーチンな手続である。
グローバル法は、分子の初めから終わりまでの配列を整列させ、個々の残基ペアのスコアを加算し、ギャップペナルティを与えることにより最適な整列を決定する。非限定的な方法として、例えば、CLUSTAL W、例えば、 Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照; および 反復的改良（iterative refinement）例えば、 Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照、を含む。
ローカル法は、全ての入力した配列により共有される１以上の保存モチーフを同定することにより、配列を整列させる。非限定的な方法として、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); Gibbs sampling、例えば、 C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照; Align-M、例えば、 Ivo Van Walle et al., Align-M A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004)を参照、を含む。
ハイブリッド法は、グローバルおよびローカルの両方の整列法の機能面を組み合わせる。非限定的な方法として、Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee、例えば、Caedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000)を参照; MUSCLE、例えば、 Robert C. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004)を参照;および、DIALIGN-T、例えば、Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005)を参照、を含む。
本明細書で使用される用語「天然に存在するクロストリジウム毒素改変体」は、人為的操作の助けなしで生産されるクロストリジウム毒素を意味し、限定なしで、選択的にスプライスされた転写物から産生されるクロストリジウム毒素アイソフォーム、自発的な変異により産生されるクロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプを含む。天然に存在するクロストリジウム毒素アイソフォームの非限定的な例として、例えば、BoNT/A アイソフォーム、BoNT/B アイソフォーム、BoNT/C1 アイソフォーム、BoNT/D アイソフォーム、BoNT/E アイソフォーム、BoNT/F アイソフォーム、BoNT/G アイソフォーム、およびTeNT アイソフォームを含む。クロストリジウム毒素サブタイプの非限定的な例には、例えば、BoNT/Aサブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3およびBoNT/A4; BoNT/Bサブタイプ、BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B ２価（bivalent）およびBoNT/B 非蛋白質分解（nonproteolytic）; BoNT/C1サブタイプBoNT/C1-1およびBoNT/C1-2; BoNT/EサブタイプBoNT/E1、 BoNT/E2およびBoNT/E3;およびBoNT/FサブタイプBoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3およびBoNT/F4を含む。
本明細書で使用される用語「天然に存在しないクロストリジウム毒素改変体」は、人為的操作の助けなしで生産されるクロストリジウム毒素を意味し、限定なしで、無作為変異またはラショナルデザインを用いた遺伝子操作により生産されるクロストリジウム毒素、および化学合成により生産されるクロストリジウム毒素を含む。天然に存在しないクロストリジウム毒素改変体の非限定的な例として、例えば、保存的なクロストリジウム改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体、クロストリジウムキメラ改変体および活性なクロストリジウム毒素フラグメントを含む。
本明細書で使用されるように、用語「保存的なクロストリジウム毒素改変体」は、参照クロストリジウム毒素配列（表１）から、少なくとも１つのアミノ酸が、そのアミノ酸の性質と同様の性質の少なくとも１つを有する他のアミノ酸またはアミノ酸アナログで置換された
クロストリジウム毒素を意味する。性質の例は、限定なしで、同様の、サイズ、トポグラフィー、荷電、疎水性、親水性、脂肪親和性、共有結合形成能、水素結合能、生理化学的性質等、またはそれらの組み合わせを含む。保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素に取って代わることができる。保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ 酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸、５００以上のアミノ酸、を置換し得る。保存的クロストリジウム毒素改変体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、少なくとも10連続アミノ酸、少なくとも15連続アミノ 酸、少なくとも20連続アミノ酸、または少なくとも25連続アミノ酸を置換でき、その基礎となる参照クロストリジウム毒素に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有する。保存的なクロストリジウム毒素改変体の非限定的な例には、例えば、保存的なBoNT/A改変体、保存的なBoNT/B改変体、保存的なBoNT/C1改変体、保存的なBoNT/D改変体、保存的なBoNT/E改変体、保存的なBoNT/F改変体、保存的なBoNT/G改変体、および保存的なTeNT改変体を含む。
クロストリジウム毒素を意味する。性質の例は、限定なしで、同様の、サイズ、トポグラフィー、荷電、疎水性、親水性、脂肪親和性、共有結合形成能、水素結合能、生理化学的性質等、またはそれらの組み合わせを含む。保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素に取って代わることができる。保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ 酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸、５００以上のアミノ酸、を置換し得る。保存的クロストリジウム毒素改変体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、少なくとも10連続アミノ酸、少なくとも15連続アミノ 酸、少なくとも20連続アミノ酸、または少なくとも25連続アミノ酸を置換でき、その基礎となる参照クロストリジウム毒素に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有する。保存的なクロストリジウム毒素改変体の非限定的な例には、例えば、保存的なBoNT/A改変体、保存的なBoNT/B改変体、保存的なBoNT/C1改変体、保存的なBoNT/D改変体、保存的なBoNT/E改変体、保存的なBoNT/F改変体、保存的なBoNT/G改変体、および保存的なTeNT改変体を含む。
本明細書で使用されるように、用語「非保存的なクロストリジウム毒素改変体」は、参照クロストリジウム毒素配列（表１）から、１）その基礎となる参照クロストリジウム毒素から少なくとも１アミノ酸が欠失され；２）その基礎となる参照クロストリジウム毒素から少なくとも１アミノ酸が付加され；または３）少なくとも１アミノ酸が、参照クロストリジウム毒素配列（表１）からの元のアミノ酸の性質と同様の性質を共有していない他のアミノ酸またはアミノ酸アナログで置換されている、クロストリジウム毒素を意味する。非保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素に取って代わることができる。非保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸を欠失させることができる。非保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸を付加させることができる。非保存的なクロストリジウム毒素改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ 酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸、５００以上のアミノ酸、を置換し得る。非保存的クロストリジウム毒素改変体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素から、少なくとも10連続アミノ酸、少なくとも15連続アミノ 酸、少なくとも20連続アミノ酸、または少なくとも25連続アミノ酸を置換でき、その基礎となる参照クロストリジウム毒素に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有することができる。非保存的なクロストリジウム毒素改変体の非限定的な例には、例えば、非保存的なBoNT/A改変体、非保存的なBoNT/B改変体、非保存的なBoNT/C1改変体、非保存的なBoNT/D改変体、非保存的なBoNT/E改変体、非保存的なBoNT/F改変体、非保存的なBoNT/G改変体、および非保存的なTeNT改変体を含む。
本明細書で使用されるように、用語「クロストリジウム毒素キメラ改変体」は、クロストリジウム毒素の少なくとも１部分および少なくとも１つの他の蛋白質の少なくとも１部分を含み、表１の参照クロストリジウム毒素から異なる少なくとも１つの性質を有する毒素を形成している分子を意味する。クロストリジウム毒素キメラ改変体の１クラスは、改変されたクロストリジウム毒素を含む。天然に存在するクロストリジウム毒素の内因性細胞結合ドメインは、他の分子の細胞結合ドメインで修飾されるか、または置換される。そのような修飾されたクロストリジウム毒素は、改変された細胞結合活性を有し、なぜなら、修飾された毒素は、例えば、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞の表面上に存在する同じ受容体を使用することができ（天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞に対する増強された細胞結合活性とされる）；天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞の表面上に存在する異なる受容体を使用することができ（天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された細胞結合活性とされる）、または、天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞の表面上に存在する異なる受容体を使用することができる（天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された細胞結合活性とされる）からである。
クロストリジウム毒素キメラ改変体は、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞、例えば運動神経を中毒させることができる増強された細胞結合活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素でありえる。この結合活性を増強する１つの方法は、その天然に存在する受容体への細胞結合活性を増大させるために、天然に存在するクロストリジウム毒素の内因性のターゲッティングドメインを修飾することにより達成される。標的ドメインに対するかかる修飾により、例えば、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞に存在する内因性のクロストリジウム毒素受容体への結合親和性を増加させる増強された細胞結合活性；天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞に存在する内因性のクロストリジウム毒素受容体のサブグループへの結合特異性を増加させる増強された細胞結合活性；または、結合親和性および結合特異性の両方を増加させる増強された細胞結合活性が得られる。天然に存在するクロストリジウム毒素受容体に対する細胞結合活性が増強された修飾されたクロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、Lance E. Steward, et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptors, International Patent Publication No. 2006/008956 (Mar. 14, 2006), Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capability, および Enhanced Targeting Activity, U.S. Provisional Patent Application No. 60/807,063 (Jul. 11, 2006)に記載されており；その内容は、引用をもって、その全体が、本明細書に組み込まれる。
クロストリジウム毒素キメラ改変体は、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞、例えば運動神経を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素でありえる。この結合活性を改変する１つの方法は、天然に存在するクロストリジウム毒素の内因性の標的ドメインを、その天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞の表面に存在する異なる受容体へ背宅的に結合する他の分子の標的ドメインで置換することにより達成される。かかる標的ドメインの修飾により、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在するクロストリジウム毒素でない受容体（標的受容体）に特異的に結合することができる修飾された毒素が得られる。天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞に対するこの増強された結合活性は、より多くの毒素が標的細胞に運ばれるので、個人に対し投与される修飾されたクロストリジウム毒素の有効用量を低くする。したがって、増強された結合仮性を有する修飾されたクロストリジウム毒素は、治療標的でない領域への望まれない毒素の分散を低減し、それにより、望まれない部位への毒素の拡散に関連する望まれない副作用を低減させ、または防ぎ得る。クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された結合活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, International Patent Publication No. 2006/009831 (Mar. 14, 2005); Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, U.S. Patent Application No. 11/376,696 (Mar. 15, 2006); および Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Provisional Patent Application No. 60/807,062, (Jul. 11, 2006)に記載され；その内容は、引用をもって、その全体が、本明細書に組み込まれる。
クロストリジウム毒素キメラ改変体は、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞以外の細胞、例えば、運動神経以外の細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素でありえる。これらの改変された毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する標的受容体を用いることでこの中毒を成し遂げる。この再標的化された能力は、クロストリジウム毒素の天然に存在する標的ドメインを、非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在するクロストリジウム毒素でない受容体に対する選択的な結合活性を示す標的ドメインで置換することにより達成される。かかる標的ドメインに対する修飾は、非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在するクロストリジウム毒素でない受容体（標的受容体）に対し選択的な結合することができる修飾された毒素を得ることができる。非クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された標的活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素は、標的受容体に結合でき、細胞質にトランスロケーションし、そして非クロストリジウム毒素標的細胞のSNARE複合体に対する蛋白分解性効果を発揮することができる。非クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された標的活性を有する修飾されたクロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, U.S. Patent 5,989,545 (Nov. 23, 1999); Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, U.S. Patent 6,461,617 (Oct. 8, 2002); Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, U.S. Patent 6,632,440 (Oct. 14, 2003); Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, U.S. Patent 6,843,998 (Jan. 18, 2005); Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, U.S. Patent Publication 2002/0037833 (Mar. 28, 2002); Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, U.S. Patent Publication 2003/0180289 (Sep. 25, 2003); J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, WO 2001/014570 (Mar. 1, 2001); Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, International Patent Publication WO 2005/023309 (Mar. 17, 2005); Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, U.S. Patent Application No. 11/376,696 (Mar. 15, 2006); および Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Provisional Patent Application No. 60/807,059, (Jul. 11, 2006)に記載され；その内容は、引用をもって、その全体が、本明細書に組み込まれる。クロストリジウム毒素に関連する治療効果を再標的化する能力は、クロストリジウム毒素治療を使用することができる医療適用の数を大きく拡張した。非限定定な例として、感覚神経に再標的化された修飾されたクロストリジウム毒素は、多様な慢性痛、例えば、痛覚過敏およびアロディニア、神経因性疼痛および炎症性疼痛の治療に有用である（例えば、Foster, supra, (1999); and Donovan, supra, (2002); and Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, U.S. Patent 7,022,329 (Apr. 4, 2006)を参照）。非限定的な例として、膵臓細胞に再標的化された修飾されたクロストリジウム毒素は、膵炎の治療に有用である、例えば、Steward, supra, (2005)を参照。
したがって、１つの実施態様において、クロストリジウム毒素キメラ改変体は、結合ドメインが、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増強された細胞結合活性を含む、本明細書に開示された修飾されたクロストリジウム毒素を含むことができる。他の実施態様において、クロストリジウム毒素キメラ改変体は、結合ドメインが、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を含む、本明細書に開示された修飾されたクロストリジウム毒素を含むことができる。さらに他の実施態様において、クロストリジウム毒素キメラ改変体は、結合ドメインが、天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を含む、本明細書に開示された修飾されたクロストリジウム毒素を含むことができる。
本発明の一態様において、多様なクロストリジウム毒素フラグメントが、これらの活性なフラグメントが、クロストリジウム毒素が蛋白分解的に基質を切断する全体的な細胞メカニズムを実行することができることを条件として、有用であることが想定される。したがって、この実施態様の側面では、例えば、少なくとも300アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも600アミノ酸、少なくとも700アミノ酸、少なくとも800アミノ酸、少なくとも900アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1100アミノ酸および少なくとも1200アミノ酸の長さを有するクロストリジウム毒素フラグメントを含むことができる。この実施態様の他の側面では、例えば、多くとも300アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも500アミノ酸、多くとも600アミノ 酸、多くとも700アミノ酸、多くとも800アミノ酸、多くとも900アミノ酸、多くとも1000アミノ酸、多くとも1100アミノ酸および多くとも1200アミノ酸を含むことができる。
本発明の一態様において、軽鎖を含む多様なクロストリジウム毒素フラグメントが、これらの軽鎖フラグメントが、神経伝達物質放出装置の核となる構成要素に特異的に結合することができ、したがって、クロストリジウム毒素が蛋白分解的に基質を切断する全体的な細胞メカニズムの実行に参加することができることを条件として、有用であることもまた想定される。クロストリジウム毒素の軽鎖は、約420-460アミノ酸の長さであり、酵素ドメインを含む（表１）。研究は、クロストリジウム毒素軽鎖の完全長が、酵素ドメインの酵素活性に必要でないことを示してきた。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最初の８アミノ酸（配列番号：１の残基１−８）は、酵素活性に必要とされない。もう１つの非限定的な例として、TeNT軽鎖の最初の８アミノ酸（配列番号：８の残基１−８）は、酵素活性に必要とされない。同様に、その軽鎖のカルボキシル末端も活性に必要とされない。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最後の３２アミノ酸（配列番号：１の残基４１７−４４８）は、酵素活性に必要とされない。もう１つの非限定的な例として、TeNT軽鎖の最後の３１アミノ酸（配列番号：８の残基４２７−４５７）は、酵素活性に必要とされない。したがって、この態様の側面では、例えば、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸および少なくとも450アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。この実施態様の他の側面では、例えば、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも425アミノ酸および多くとも450アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。
本発明の一態様において、トランスロケーションドメインを含む多様なクロストリジウム毒素HN領域が、これらの活性なフラグメントが、LCを、細胞内ベジクルから標的細胞の細胞質内へ放出することを促進することができ、したがって、クロストリジウム毒素が蛋白分解的に基質を切断する全体的な細胞メカニズムの実行に参加することができることを条件として、有用であることもまた想定される。クロストリジウム毒素の重鎖由来のHN領域は、約410-430アミノ酸の長さであり、トランスロケーションドメインを含む（表１）。研究は、クロストリジウム毒素重鎖由来のHN領域の完全長が、トランスロケーションドメインのトランスロケーション活性に必要でないことを示してきた。したがって、この実施態様の側面では、例えば、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸および少なくとも425アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。この実施態様の他の側面では、例えば、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸および多くとも425アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。
本発明の一態様において、結合ドメインを含む多様なクロストリジウム毒素HC領域が、これらの活性なフラグメントは結合活性を決定することができ、標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合特異性が、クロストリジウム毒素が蛋白分解的に基質を切断する全体的な細胞メカニズムを実行することができることを条件として、有用であることもまた想定される。クロストリジウム毒素の重鎖由来のHC領域は、約400-440アミノ酸の長さであり、結合ドメインを含む（表１）。研究は、クロストリジウム毒素重鎖由来のHC領域の完全長が、結合ドメインの結合活性に必要でないことを示してきた。したがって、この実施態様の側面では、例えば、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸および少なくとも425アミノ酸の長さを有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素HC領域を含むことができる。この実施態様の他の側面では、例えば、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸および多くとも425アミノ酸の長さを有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素HC領域を含むことができる。
したがって、一実施態様において、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインおよびクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面において、クロストリジウム毒素は、天然に存在しないクロストリジウム毒素改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体または活性なクロストリジウム毒素フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様のもう１つの側面において、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメインまたはその活性フラグメント、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、クロストリジウム毒素結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の他の態様において、クロストリジウム毒素は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTを含むことができる。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Aを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Aは、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/AトランスロケーションドメインおよびBoNT/A結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Aは配列暗号：１を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Aは、天然に存在するBoNT/A改変体、例えば、BoNT/AアイソフォームまたはBoNT/Aサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Aは、配列番号：１の天然に存在するBoNT/A改変体、例えば、配列番号：１のBoNT/Aアイソフォームまたは配列番号：１のBoNT/Aサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Aは、天然に存在しないBoNT/A改変体、例えば、保存的なBoNT/A改変体、非保存的なBoNT/A改変体または活性なBoNT/Aフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Aは、配列番号：１の天然に存在しないBoNT/A改変体、例えば、配列番号：１の保存的なBoNT/A改変体、配列番号：１の非保存的なBoNT/A改変体または配列番号：１の活性なBoNT/Aフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Aは、BoNT/A酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Aトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/A結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Aは、配列番号：１の１−４４８アミノ酸のBoNT/A酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：１の４４９−８７１アミノ酸のBoNT/Aトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：１の８７２−１２９６アミノ酸のBoNT/A結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：１と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：１と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：１と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：１と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：１と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：１と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Aは、例えば、配列番号：１と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Bを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Bは、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/BトランスロケーションドメインおよびBoNT/B結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Bは配列暗号：２を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Bは、天然に存在するBoNT/B改変体、例えば、BoNT/BアイソフォームまたはBoNT/Bサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Bは、配列番号：２の天然に存在するBoNT/B改変体、例えば、配列番号：２のBoNT/Bアイソフォームまたは配列番号：２のBoNT/Bサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Bは、天然に存在しないBoNT/B改変体、例えば、保存的なBoNT/B改変体、非保存的なBoNT/B改変体または活性なBoNT/Bフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Bは、配列番号：２の天然に存在しないBoNT/B改変体、例えば、配列番号：２の保存的なBoNT/B改変体、配列番号：２の非保存的なBoNT/B改変体または配列番号：２の活性なBoNT/Bフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Bは、BoNT/B酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Bトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/B結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Bは、配列番号：２の１−４４１アミノ酸のBoNT/B酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：２の４４２−８５８アミノ酸のBoNT/Bトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：２の８５９−１２９１アミノ酸のBoNT/B結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：２と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：２と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：２と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：２と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：２と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：２と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Bは、例えば、配列番号：２と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/C1を含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/C1は、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/C1トランスロケーションドメインおよびBoNT/C1結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/C1は配列暗号：３を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/C1は、天然に存在するBoNT/C1改変体、例えば、BoNT/C1アイソフォームまたはBoNT/C1サブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/C1は、配列番号：３の天然に存在するBoNT/C1改変体、例えば、配列番号：３のBoNT/C1アイソフォームまたは配列番号：３のBoNT/C1サブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/C1は、天然に存在しないBoNT/C1改変体、例えば、保存的なBoNT/C1改変体、非保存的なBoNT/C1改変体または活性なBoNT/C1フラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/C1は、配列番号：３の天然に存在しないBoNT/C1改変体、例えば、配列番号：３の保存的なBoNT/C1改変体、配列番号：３の非保存的なBoNT/C1改変体または配列番号：３の活性なBoNT/C1フラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/C1は、BoNT/C1酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/C1トランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/C1結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/C1は、配列番号：３の１−４４９アミノ酸のBoNT/C1酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：３の４５０−８６６アミノ酸のBoNT/C1トランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：３の８６７−１２９１アミノ酸のBoNT/C1結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：３と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：３と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：３と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：３と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：３と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：３と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/C1は、例えば、配列番号：３と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Dを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Dは、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/DトランスロケーションドメインおよびBoNT/D結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Dは配列暗号：４を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Dは、天然に存在するBoNT/D改変体、例えば、BoNT/DアイソフォームまたはBoNT/Dサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Dは、配列番号：４の天然に存在するBoNT/D改変体、例えば、配列番号：４のBoNT/Dアイソフォームまたは配列番号：４のBoNT/Dサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Dは、天然に存在しないBoNT/D改変体、例えば、保存的なBoNT/D改変体、非保存的なBoNT/D改変体または活性なBoNT/Dフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Dは、配列番号：４の天然に存在しないBoNT/D改変体、例えば、配列番号：４の保存的なBoNT/D改変体、配列番号：４の非保存的なBoNT/D改変体または配列番号：４の活性なBoNT/Dフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Dは、BoNT/D酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Dトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/D結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Dは、配列番号：４の１−４４５アミノ酸のBoNT/D酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：３の４４６−８６２アミノ酸のBoNT/Dトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：４の８６３−１２７６アミノ酸のBoNT/D結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：４と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：４と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：４と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：４と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：４と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：４と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Dは、例えば、配列番号：４と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Eを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Eは、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/EトランスロケーションドメインおよびBoNT/E結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Eは配列暗号：５を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Eは、天然に存在するBoNT/E改変体、例えば、BoNT/EアイソフォームまたはBoNT/Eサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Eは、配列番号：５の天然に存在するBoNT/E改変体、例えば、配列番号：５のBoNT/Eアイソフォームまたは配列番号：５のBoNT/Eサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Eは、天然に存在しないBoNT/E改変体、例えば、保存的なBoNT/E改変体、非保存的なBoNT/E改変体または活性なBoNT/Eフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Eは、配列番号：５の天然に存在しないBoNT/E改変体、例えば、配列番号：５の保存的なBoNT/E改変体、配列番号：５の非保存的なBoNT/E改変体または配列番号：５の活性なBoNT/Eフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Eは、BoNT/E酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Eトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/E結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Eは、配列番号：５の１−４２２アミノ酸のBoNT/E酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：５の４２３−８４５アミノ酸のBoNT/Eトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：５の８４６−１２５２アミノ酸のBoNT/E結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：５と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：５と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：５と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：５と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：５と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：５と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Eは、例えば、配列番号：５と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Fを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Fは、BoNT/F酵素ドメイン、BoNT/FトランスロケーションドメインおよびBoNT/F結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Fは配列暗号：６を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Fは、天然に存在するBoNT/F改変体、例えば、BoNT/FアイソフォームまたはBoNT/Fサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Fは、配列番号：６の天然に存在するBoNT/F改変体、例えば、配列番号：６のBoNT/Fアイソフォームまたは配列番号：６のBoNT/Fサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Fは、天然に存在しないBoNT/F改変体、例えば、保存的なBoNT/F改変体、非保存的なBoNT/F改変体または活性なBoNT/Fフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Fは、配列番号：６の天然に存在しないBoNT/F改変体、例えば、配列番号：６の保存的なBoNT/F改変体、配列番号：６の非保存的なBoNT/F改変体または配列番号：６の活性なBoNT/Fフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Fは、BoNT/F酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Fトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/F結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Fは、配列番号：６の１−４３９アミノ酸のBoNT/F酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列番号：６の４４０−８６４アミノ酸のBoNT/Fトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列番号：６の８６５−１２７４アミノ酸のBoNT/F結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：６と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：６と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：６と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：６と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：６と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号：６と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Fは、例えば、配列番号：６と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はBoNT/Gを含む。この実施態様の１つの側面では、BoNT/Gは、BoNT/G酵素ドメイン、BoNT/GトランスロケーションドメインおよびBoNT/G結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Gは配列暗号：７を含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Gは、天然に存在するBoNT/G改変体、例えば、BoNT/GアイソフォームまたはBoNT/Gサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、BoNT/Gは、配列暗号：７の天然に存在するBoNT/G改変体、例えば、配列暗号：７のBoNT/Gアイソフォームまたは配列暗号：７のBoNT/Gサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Gは、天然に存在しないBoNT/G改変体、例えば、保存的なBoNT/G改変体、非保存的なBoNT/G改変体または活性なBoNT/Gフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、BoNT/Gは、配列暗号：７の天然に存在しないBoNT/G改変体、例えば、配列暗号：７の保存的なBoNT/G改変体、配列暗号：７の非保存的なBoNT/G改変体または配列暗号：７の活性なBoNT/Gフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Gは、BoNT/G酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、BoNT/Gトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、BoNT/G結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、BoNT/Gは、配列暗号：７の１−４３９アミノ酸のBoNT/G酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列暗号：７の４４０−８６４アミノ酸のBoNT/Gトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列暗号：７の８６５−１２７４アミノ酸のBoNT/G結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列暗号：７と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列暗号：７と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列暗号：７と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、BoNT/Gは、例えば、配列暗号：７と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
もう１つの実施態様において、クロストリジウム毒素はTeNTを含む。この実施態様の１つの側面では、TeNTは、TeNT酵素ドメイン、TeNTトランスロケーションドメインおよびTeNT結合ドメインを含む。この実施態様のもう１つの側面では、TeNTは配列暗号：８を含む。この実施態様のもう１つの側面では、TeNTは、天然に存在するTeNT改変体、例えば、TeNTアイソフォームまたはTeNTサブタイプを含む。この実施態様のもう１つの側面では、TeNTは、配列暗号：８の天然に存在するTeNT改変体、例えば、配列暗号：８のTeNTアイソフォームまたは配列暗号：８のTeNTサブタイプを含む。この実施態様の更なる側面では、TeNTは、天然に存在しないTeNT改変体、例えば、保存的なTeNT改変体、非保存的なTeNT改変体または活性なTeNTフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面では、TeNTは、配列暗号：８の天然に存在しないTeNT改変体、例えば、配列暗号：８の保存的なTeNT改変体、配列暗号：８の非保存的なTeNT改変体または配列暗号：８の活性なTeNTフラグメント、またはそれらの組合せを含む。この実施態様の更なる他の側面では、TeNTは、TeNT酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、TeNTトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、TeNT結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。この実施態様の更なる側面では、TeNTは、配列暗号：８の１−４３９アミノ酸のTeNT酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、配列暗号：８の４４０−８６４アミノ酸のTeNTトランスロケーションドメインまたはその活性フラグメント、配列暗号：８の８６５−１２７４アミノ酸のTeNT結合ドメインまたはその活性フラグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列暗号：８と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列暗号：８と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列暗号：８と多くとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面では、TeNTは、例えば、配列暗号：８と比較して、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
本発明の側面は、一部で、クロストリジウム毒素基質切断部位を提供する。本明細書で使用されているように、用語「クロストリジウム毒素基質切断部位」は、隣接するか隣接しない認識要素、または両方と共に、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下で、クロストリジウム毒素により切断可能な結合で検出可能な蛋白質分解に十分な、切断可能な結合を意味する。定義上、クロストリジウム毒素基質切断部位は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適している状況の下で、少なくとも一つのクロストリジウム毒素によって、切断されやすい。いずれの、および全ての長さのクロストリジウム毒素基質切断部位が、本発明の態様において、クロストリジウム毒素基質切断部位が、クロストリジウム毒素により切断されることができることを条件として、有用であることが想定される。したがって、この実施態様の側面において、クロストリジウム毒素基質切断部位は、例えば、少なくとも6アミノ酸の長さ、少なくとも7アミノ 酸の長さ、少なくとも8アミノ酸の長さ、少なくとも9アミノ酸の長さ、少なくとも10アミノ酸の長さ、少なくとも15アミノ酸の長さ、少なくとも20アミノ酸の長さ、少なくとも25アミノ酸の長さ、少なくとも30アミノ酸の長さ、少なくとも40アミノ酸の長さ、少なくとも50アミノ酸の長さまたは少なくとも60アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面では、クロストリジウム毒素基質切断部位は、例えば、多くとも6アミノ酸の長さ、多くとも7アミノ 酸の長さ、多くとも8アミノ酸の長さ、多くとも9アミノ酸の長さ、多くとも10アミノ酸の長さ、多くとも15アミノ酸の長さ、多くとも20アミノ酸の長さ、多くとも25アミノ酸の長さ、多くとも30アミノ酸の長さ、多くとも40アミノ酸の長さ、多くとも50アミノ酸の長さまたは多くとも60アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なクロストリジウム毒素基質切断部位は、限定はされないが、天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位；天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位改変体；および天然に存在しないクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体およびクロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体が含まれる。本明細書で使用されるように、用語「クロストリジウム毒素基質切断部位改変体」は、天然に存在するか、天然に存在しなく、開示される参照配列の対応する領域から少なくとも１アミノ酸変化を有し、参照配列の対応する領域に対して同一性％で記載され得るクロストリジウム毒素基質切断部位を意味する。いずれの多様な配列アライメント方法が同一性％を決定するために使用することができ、それは、限定されずに、グローバル法、ローカル方法およびハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ方法を含む。同一性％を決定する方法は、当業者の見識内であり、そして本明細書から、ルーチンな手続である。
本明細書で使用されるように、用語「天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位改変体」は、人為的操作の助けがなく生産されるクロストリジウム毒素基質切断部位を意味し、限定なしに、選択的にスプライスされた転写物から生産されるクロストリジウム毒素基質切断部位アイソフォーム、自発的な変異により産生されるクロストリジウム毒素基質切断部位アイソフォームおよびクロストリジウム毒素基質切断部位サブタイプを含む。
本明細書で使用される用語「天然に存在しないクロストリジウム毒素基質切断部位改変体」は、人為的操作の助けなしで生産されるクロストリジウム毒素基質切断部位を意味し、限定なしに、無作為変異またはラショナルデザインを用いた遺伝子操作により生産されるクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、および化学合成により生産されるクロストリジウム毒素基質切断部位改変体を含む。天然に存在しないクロストリジウム毒素基質切断部位改変体の非限定的な例として、例えば、保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体およびクロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体を含む。
本明細書で使用されるように、用語「保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体」は、参照クロストリジウム毒素基質切断部位配列から、少なくとも１つのアミノ酸が、そのアミノ酸の性質と同様の性質の少なくとも１つを有する他のアミノ酸またはアミノ酸アナログで置換されたクロストリジウム毒素を意味する。性質の例は、限定なしで、同様の、サイズ、トポグラフィー、荷電、疎水性、親水性、脂肪親和性、共有結合形成能、水素結合能、生理化学的性質等、またはそれらの組み合わせを含む。保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素基質切断部位に取って代わることができる。保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸を置換し得る。保存的クロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有することができる。保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体の非限定的な例には、例えば、保存的なBoNT/A基質切断部位改変体、保存的なBoNT/B基質切断部位改変体、保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、保存的なBoNT/D基質切断部位改変体、保存的なBoNT/E基質切断部位改変体、保存的なBoNT/F基質切断部位改変体、保存的なBoNT/G基質切断部位改変体、保存的なTeNT基質切断部位改変体、保存的なBaNT基質切断部位改変体および保存的なBuNT基質切断部位改変体を含む。
本明細書で使用されるように、用語「非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体」は、参照クロストリジウム毒素基質切断部位配列（表３）から、１）その基礎となる参照クロストリジウム毒素から少なくとも１アミノ酸が欠失され；２）その基礎となる参照クロストリジウム毒素から少なくとも１アミノ酸が付加され；または３）少なくとも１アミノ酸が、参照クロストリジウム毒素配列（表１）からの元のアミノ酸の性質と同様の性質を共有していない他のアミノ酸またはアミノ酸アナログで置換されている、クロストリジウム毒素基質切断部位を意味する。非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素基質切断部位に取って代わることができる。非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸を付加させることができる。非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸を置換し得る。非保存的クロストリジウム毒素基質切断部位改変体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有することができる。非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体の非限定的な例には、例えば、非保存的なBoNT/A基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/B基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/D基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/E基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/F基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/G基質切断部位改変体、非保存的なTeNT基質切断部位改変体、非保存的なBaNT基質切断部位改変体および非保存的なBuNT基質切断部位改変体を含む。
本明細書で使用されているように、用語「クロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体」は、少なくとも１つの最初のアミノ酸と同様の性質を有する非天然のオリゴマーで置換された少なくとも１つのアミノ酸を有するクロストリジウム毒素基質切断部位を意味する。性質の例は、限定なしで、ペプチド１次構造要素のトポグラフィー、ペプチド１次構造要素の機能、ペプチド２次構造要素のトポグラフィー、ペプチド２次構造要素の機能等、またはそれらの組み合わせを含む。クロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位と実体的に同様に機能でき、そして、本発明のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素基質切断部位に取って代わることができる。クロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体は、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸を置換し得る。クロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体は、また、その基礎となる参照クロストリジウム毒素基質切断部位に対し、少なくとも50%アミノ酸同一性、65%アミノ酸同一性、75%アミノ酸同一性、85%アミノ酸同一性、または95%アミノ酸同一性を有することができる。ペプチド模倣体の方法の例は、例えば、Amy S. Ripka & Daniel H. Rich, Peptidomimetic design, 2(4) CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 441-452 (1998); and M. Angels Estiarte & Daniel H. Rich, Peptidomimetics for Drug Design, 803-861 (BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J. Abraham ed., Wiley-Interscience, 6th ed 2003)参照。保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体の非限定的な例には、例えば、BoNT/A基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/B基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/D基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/E基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/F基質切断部位ペプチド模倣体、BoNT/G基質切断部位ペプチド模倣体、TeNT基質切断部位ペプチド模倣体、BaNT基質切断部位ペプチド模倣体およびBuNT基質切断部位ペプチド模倣体を含む。
クロストリジウム毒素基質切断部位の１つのタイプは、例えば、SNARE蛋白質等のクロストリジウム毒素のインビボ標的基質から導かれる。クロストリジウム毒素の天然のSNARE標的は、限定なしで、SNAP-25ファミリー、VAMPファミリーおよびSyntaxinファミリーを含む。SNAP-25およびSyntaxinは原形質膜に結合し、一方、VAMPはシナプス小胞膜に結合する（図３参照）。BoNT/AおよびBoNT/Eは、その蛋白質のカルボキシル末端部分の異なる２つの部位でSNAP-25を認識し、特異的に切断する（表２）。TeNTおよびBoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、およびBoNT/Gは、毒素によって、異なる結合でVAMPs（また、シナプトブレビンとしても知られている）の保存された中央部分を特異的に標的とする（表
３）。BoNT/C1は、SNAP-25のカルボキシル末端付近に加えて、細胞質膜表面付近の単一部位でSyntaxinを切断する（表２および４）。切断部位および毒素感受性は必ずしも保存されていないが、これらクロストリジウム毒素の３つの蛋白質標的は、酵母からヒトまで保存されている。（以下、参照；また、例えば、Humeau, supra, (2000); Heiner Niemann et al., Clostridial Neurotoxins: New Tools for Dissecting Exocytosis, 4(5) Trends Cell Biol. 179-185 (1994); および Rossella Pellizzari et al., Tetanus and Botulinum Neurotoxins: Mechanism of Action and Therapeutic Uses, 354(1381) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 259 268 (1999)）。
３）。BoNT/C1は、SNAP-25のカルボキシル末端付近に加えて、細胞質膜表面付近の単一部位でSyntaxinを切断する（表２および４）。切断部位および毒素感受性は必ずしも保存されていないが、これらクロストリジウム毒素の３つの蛋白質標的は、酵母からヒトまで保存されている。（以下、参照；また、例えば、Humeau, supra, (2000); Heiner Niemann et al., Clostridial Neurotoxins: New Tools for Dissecting Exocytosis, 4(5) Trends Cell Biol. 179-185 (1994); および Rossella Pellizzari et al., Tetanus and Botulinum Neurotoxins: Mechanism of Action and Therapeutic Uses, 354(1381) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 259 268 (1999)）。
天然に存在するSNAP-25は、約２０６残基の膜貫通領域のない蛋白質であり、神経原形質膜の細胞質表面に結合されている（図３参照）。SNAP-25は、発達過程の軸索伸長に必要とされ、成熟神経系で、神経終末可塑性のために必要とされ得る。SNAP-25は、例えば、ヒト（Homo）、サル（Macaca）、ウシ（Bos）、ラット（Rattus）、マウス（Mus）、野鶏（Gallus）、フナ（Carassius）、ダニオ（Danio）、シビレエイ（Torpedo）、アフリカツメガエル（Xenopus）、ウニ（Strongylocentrotus）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ヒル（hirudo）、イカ（loligo）、モノアラガイ（Lymnaea）および線虫（Caenorhabditis）属を含む多様な脊椎動物および無脊椎動物から単離されてきている（表２）。ヒトにおいて、少なくとも２つのアイソフォームが発達過程で異なって発現され；アイソフォームａは、胎児発達の間に構成的に発現され、一方、アイソフォームｂは、誕生時に見られ、大人において優位である。SNAP-25アナログ、例えば、SNAP-23は、また、神経系の外、例えば、膵臓細胞で発現される。
表２−SNAP-25および関連蛋白質の切断 霊長類: ヒトSNAP-25A 配列番号：９の残基 163-206; ヒトSNAP-25B 配列番号：１０の残基 163-206; ヒトSNAP-23A 配列番号：１１の残基 169-211; ヒトSNAP-23B 配列番号：１２の残基 116-158; サルSNAP-25B 配列番号：１３の残基 163-206; 齧歯類: ラットSNAP-25A 配列番号：１４の残基 163-206; ラットSNAP-25B 配列番号：１５の残基 163-206; マウスSNAP-25B 配列番号：１６の残基 163-206; ラットSNAP-23 配列番号：１７の残基 168-210; マウスSNAP-23 配列番号：１８の残基 168-210; 鳥類: ニワトリ SNAP-25B 配列番号：１９の残基 163-206; 魚類: 金魚SNAP-25A 配列番号：２０の残基 161-204; 金魚SNAP-25B 配列番号：２１の残基 160-203; ゼブラフィッシュSNAP-25A 配列番号：２２の残基 161-204; ゼブラフィッシュSNAP-25B 配列番号：２３の残基 160-203; ゼブラフィッシュSNAP-23 配列番号：２４の残基 174-214; エイ: シビレエイ（marbled electric ray） SNAP-25 配列番号：２５の残基 170-210; 両生類: カエル SNAP-25A 配列番号：２６の残基 163-206; カエルSNAP-25B 配列番号：２７の残基 163-206; カエルSNAP-23 配列番号：２８の残基 163-204; ウニSNAP-25 配列番号：２９の残基 169-212; 昆虫: ミバエSNAP-25 配列番号：３０の残基 171-212; ミバエSNAP-24 配列番号：３１の残基 170-212; 環形動物: ヒルSNAP-25 配列番号：３２の残基 170-212; 頭足動物: イカSNAP-25 配列番号：３３の残基 245-267; 腹足類: たにしSNAP-25 配列番号：３４の残基 244-266; 線形動物: 線虫SNAP-25 配列番号：35の残基 165-207。
天然に存在するVAMPは、約１２０残基の蛋白質であり、種およびアイソフォームにより正確な長さを有する。図３に示されるように、VAMPは、ベジクル管腔内に短いカルボキシル末端領域を含み、一方、分子のほとんどは、細胞質に露出されている。プロリンが豊富なアミノ末端３０残基は種およびアイソフォーム間で様々であるが、荷電および親水性残基が豊富で既知の切断部位を含むVAMPの中央部分は、高度に保存されている（表３）。VAMPは、シナプス小胞膜上のシナプトフィジン（synaptophysin）と共局在化する。VAMPは、例えば、ヒト（Homo）、サル（Macaca）、ウシ（Bos）、ラット（Rattus）、マウス（Mus）、野鶏（Gallus）、ダニオ（Danio）、シビレエイ（Torpedo）、アフリカツメガエル（Xenopus）、ウニ（Strongylocentrotus）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ヒル（hirudo）、イカ（loligo）、モノアラガイ（Lymnaea）、アメフラシ（Aplysia）および線虫（Caenorhabditis）属を含む多様な脊椎動物および無脊椎動物から単離されてきている。さらに、VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）を含むVAMPの多様なアイソフォームが単離されており、毒素切断に感受性のない形態が非神経細胞で単離されている。VAMP-1およびVAMP-2の分布は異なる細胞タイプで変化するが、VAMPは全ての脊椎動物組織上に存在するようである。ニワトリおよびラットのVAMP-1は、TeNTおよびBoNT/Bにより切断されない。これらVAMP-1の相同分子種は、ヒトおよびマウスのVAMP-1のTeNTおよびBoNT/B切断部位に存在するグルタミンの代わりにバリンを有する。その置換はVAMP-1およびVAMP-2の両方を同じ程度に切断するBoNT/D、/Fまたは/Gに影響を与えない。
表３−VAMPおよび関連蛋白質の切断 霊長類：ヒトVAMP-1-1 配列番号：３６の残基 49-92; ヒトVAMP-1-2 配列番号：３７の残基 49-92; ヒトVAMP-1-3 配列番号：３８の残基 49-92; ヒトVAMP-2 配列番号：３９の残基 47-90; サルVAMP-2 配列番号：４０の残基 47-90; ヒトVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）配列番号：４１の残基 30-73; ウシ: ウシ VAMP-2 配列番号：４２の残基 47-90; 齧歯類: ラット VAMP-1 配列番号：４３の残基 49-92; ラット VAMP-1-b 配列番号：４４の残基 49-92; マウス VAMP-1 配列番号：４５の残基 49-92; ラットVAMP-2 配列番号：４６の残基 47-90; ラットVAMP-2-b 配列番号：４７の残基 47-90; マウス VAMP-2 配列番号：４８の残基 47-90; ラット VAMP-3/cellubrevin 配列番号： の残基 34-77 of SEQ ID NO: 49; Mouse VAMP-3/セルブレビン 配列番号：５０の残基 34-77; 鳥類: ニワトリ VAMP-1 配列番号：５１の残基 190-233; ニワトリ VAMP-2 配列番号：５２の残基 47-88; ニワトリ VAMP-3/セルブレビン 配列番号：５３の残基 34-77; 魚類: ゼブラフィッシュ VAMP-1 配列番号：５４の残基 50-93; ゼブラフィッシュ VAMP-2 配列番号：５５の残基 41-84; ゼブラフィッシュ VAMP-3 配列番号：５６の残基 33-60; エイ: シビレエイ VAMP-1 配列番号：５７の残基 51-94; 両生類: カエル VAMP-2 配列番号：５８の残基 45-88; カエル VAMP-3 配列番号：５９の残基 32-75; ウニ VAMP 配列番号：６０の残基 31-74; 昆虫: ミバエ SynA1 配列番号：６１の残基 40-83; ミバエ SynA2 配列番号：６２の残基 63-106; ミバエ SynB1 配列番号：６３の残基 63-106; ミバエ SynB2 配列番号：６４の残基 63-106; ミバエ SynC 配列番号：６５の残基 57-100; ミバエ SynD 配列番号：６６の残基 66-109; ミバエ SynE 配列番号：６７の残基 57-100; 環形動物: ヒル VAMP 配列番号：６８の残基 45-88; 頭足動物: イカ VAMP 配列番号：６９の残基 56-99; 腹足類: たにし VAMP 配列番号：７０の残基 49-92; アメフラシ VAMP 配列番号：７１の残基 37-80; 線形動物: Nematode worm SNB1 配列番号： の残基 72-115 of SEQ ID NO: 72; 線虫 SNB様 配列番号：７３の残基 82-115。
天然に存在するSyntaxinは、神経原形質膜の細胞質表面に位置し、カルボキシル末端を介して膜にアンカーされ、そのほとんどの蛋白質は細胞質に露出されている（図３参照）。Syntaxinは、神経伝達物質の放出が起こる、プレシナプスの膜の活性なゾーンでカルシウムチャンネルと共局在化している。さらに、Syntaxinは、原形質膜とベジクルの間の機能的な架橋を形成するSSV膜の蛋白質である、シナプトタグミン（synaptotagmin）と相互作用する。Syntaxinは、例えば、ヒト（Homo）、ウシ（Bos）、ラット（Rattus）、マウス（Mus）、野鶏（Gallus）、ダニオ（Danio）、ウニ（Strongylocentrotus）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ヒル（hirudo）、イカ（Loligo）、モノアラガイ（Lymnaea）およびアメフラシ（Aplysia）属を含む多様な脊椎動物および無脊椎動物から単離されてきている（表４）。神経細胞において、３つの僅かに異なる長さ（２８５および２８８残基）を有するアイソフォームが単離され（アイソフォーム１Ａ、１Ｂ１および１Ｂ２）、アイソフォーム２、３、４および５は他の組織で発現する。異なるアイソフォームは、様々なBoNT/C1に対する感受性を有し、1A、1B1、1B2、2および3Syntaxinアイソフォームがこの毒素により切断される。
表４−Syntaxinおよび関連蛋白質の切断 霊長類: ヒト Syntaxin1A 配列番号：７４の残基 242-264; ヒト Syntaxin1B1 配列番号：７５の残基 241-263; ヒト Syntaxin1B2 配列番号：７６の残基 241-263; ヒト Syntaxin2-1 配列番号：７７の残基 241-263; ヒト Syntaxin2-2 配列番号：７８の残基 241-263; ヒトSyntaxin2-3 配列番号：７９の残基 241-263; ヒト Syntaxin3 配列番号：８０の残基 241-263; ウシ: ウシ Syntaxin1A 配列番号：８１の残基 242-264; ウシ Syntaxin1B2 配列番号：８２の残基 241-263; 齧歯類: ラット Syntaxin1A 配列番号：８３の残基 242-264; ラットSyntaxin1B2 配列番号：８４の残基 241-263; マウス Syntaxin1A 配列番号：８５の残基 242-264; マウス Syntaxin1B1 配列番号：８６の残基 241-263; マウス Syntaxin1B2 配列番号：８７の残基 241-263; ラット Syntaxin2 配列番号：８８の残基 243-265; マウス Syntaxin2 配列番号：８９の残基 242-264; ラット Syntaxin3A 配列番号：９０の残基 241-263; マウス Syntaxin3A 配列番号：９１の残基 241-263; マウス Syntaxin3B 配列番号：９２の残基 241-263; マウス Syntaxin3C 配列番号：９３の残基 223-245; 鳥類: ニワトリ Syntaxin1B 配列番号：９４の残基 235-257; ニワトリ Syntaxin2 配列番号：９５の残基 240-262; 魚類: ゼブラフィッシュ Syntaxin1B 配列番号：９６の残基 241-263; ゼブラフィッシュSyntaxin3 配列番号：９７の残基 239-261; ウニ Syntaxin1B 配列番号：９８の残基 241-263; 昆虫: ミバエ Syntaxin1A 配列番号：９９の残基 245-267; 環形動物: ヒル Syntaxin1A 配列番号：１００の残基 248-270; 頭足動物: イカ Syntaxin1A 配列番号：１０１の残基 245-267; 腹足動物: たにし Syntaxin1A 配列番号：１０２の残基 244-266; アメフラシ Syntaxin1A 配列番号：１０３の残基 244-266。
本発明の態様において、幅広いクロストリジウム毒素基質切断部位が使用され、異なるクロストリジウム毒素に対する特異的で異なる切断部位は本分野で良く知られている。非限定的な例として、BoNT/Aは、Gln-Arg結合およびLys-His結合を切断し;BoNT/BおよびTeNTは、Gln-Phe結合を切断し;BoNT/C1は、Lys-AlaまたはArg-Ala結合を切断し;BoNT/Dは、Lys-Leu 結合を切断し;BoNT/EはArg-Ile結合およびLys-Ile結合を切断し; BoNT/Fは、Gln-Lys結合を切断し;そして、BoNT/Gは、Ala-Ala結合を切断する(表５参照)。標準的な命名法として、クロストリジウム毒素切断部位を囲む配列は、P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'と表示され、P1-P1'が切断可能な結合を表す。P1またはP1'部位または両方が、天然に存在する残基の代わりに他のアミノ酸またはアミノ酸模倣体で置換され得る。例として、P1位（Gln)が、修飾されアラニン、２−アミノ酪酸またはアスパラギン残基になるBoNT/A基質が調製され；これらの基質は、P1-Arg結合でBoNT/Aにより加水分解された。例えば、James J. Schmidt & Karen A Bostian, Endoproteinase Activity of Type A Botulinum Neurotoxin: Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin, 16(1) J. Protein Chem. 19 26 (1997)参照。置換が切断結合、例えば、BoNT/A切断結合のP1位に導入されることができることは認識されている一方、P1'残基の変換が有利であり得ることは更に認識されている。例えば、Vadakkanchery V. Vaidyanathan et al., Proteolysis of SNAP-25 Isoforms by Botulinum Neurotoxin Types A, C, and E: Domains and Amino Acid Residues Controlling the Formation of Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage, 72(1) J. Neurochem. 327-337 (1999)参照。
したがって、修飾されたクロストリジウム毒素基質は、P1'残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質における天然に存在する残基に比較して修飾されず、または置換されない、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む。この態様の側面において、P1'残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質における天然に存在する残基に比較して修飾されず、または置換されない、クロストリジウム毒素基質切断部位は、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位またはBuNT 基質切断部位であり得る。
他の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素基質は、P1残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質における天然に存在する残基に比較して修飾され、または置換されたクロストリジウム毒素基質切断部位を含み；かかるクロストリジウム毒素は、P1およびP1'間のペプチド結合切断の感受性を保持している。この態様の側面において、P1’残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質における天然に存在する残基に比較して修飾され、または置換されたクロストリジウム毒素基質切断部位は、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位またはBuNT 基質切断部位であり得る。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/A基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型A基質切断部位」は、「BoNT/A基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下でBoNT/Aにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Aにより切断される切断結合は、例えば、Gln-ArgまたはLys-Hisであり得る。本発明の態様において、BoNT/A基質切断部位がBoNT/Aにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/A基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/A基質切断部位は、BoNT/Aによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/A-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表２に示されるように、BoNT/Aによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、例えば、ヒト、ラット、マウス、ダニオ、フナ、SNAP-25AおよびSNAP-25B；およびシビレエイSNAP-25を含む。したがって、BoNT/A基質切断部位は、BoNT/A切断に感受性のある、例えば、ヒトSNAP-25AまたはSNAP-25B;ウシSNAP-25AまたはSNAP-25B;ラットSNAP-25AまたはSNAP-25B;マウスSNAP-25AまたはSNAP-25B;アフリカツメガエルSNAP-25AまたはSNAP-25B;ダニオ（Danio）SNAP-25AまたはSNAP-25B; フナSNAP-25AまたはSNAP-25B; シビレエイ SNAP-25; キタムラサキウニSNAP-25; ヤリイカ SNAP-25; モノアラガイ（Lymnaea）SNAP-25; アメフラシ SNAP-25、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Aにより切断される天然のSNAP-25アミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表２）。この知見は、天然に存在するBoNT/A−感受性SNAP-25配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/A基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/A認識配列が、望まれるのであれば、上記および表２で示された生命体において同定されたSNAP-25蛋白質に含まれるBoNT/A基質切断部位のような、他のBoNT/A-感受性SNAP-25アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
さらに、BoNT/Aにより切断される天然のBoNT/A基質切断部位を含むアミノ酸配列の実験的操作は、かかる配列が絶対に保存されているわけでないことを明らかにする。これら結果は、天然に存在する毒素-感受性配列に比較して、多様な残基が、BoNT/A基質切断部位内で置換され得ることを示している。非限定的な例として、ヒトSNAP-25の残基187から203に相当する１７merに比較して、BoNT/A基質中のAsp193をアスパラギンに置換することにより、0.23の相対的な蛋白分解速度が得られGlu194をグルタミンに置換することにより、2.08の相対的な蛋白分解速度が得られ; Ala195を2-アミノ酪酸に置換することにより、0.38の相対的な蛋白分解速度が得られ; そして、Gln197をアスパラギン、2-アミノ酪酸またはアラニンに置換することにより、それぞれ、0.66、0.25、または0.19の相対的な蛋白分解速度が得られる（表６参照）。さらに、Ala199を2-アミノ酪酸に置換することにより、0.79の相対的な蛋白分解速度が得られ; Thr200をセリンまたは2-アミノ酪酸に置換することにより、それぞれ、0.26または1.20の相対的な蛋白分解速度が得られ;Lys201をアラニンに置換することにより、0.12の相対的な蛋白分解速度が得られ; そして、Met202をアラニンまたはノルロイシンに置換することにより、それぞれ、0.38または1.20の相対的な蛋白分解速度が得られる。例えば、Schmidt & Bostian, supra, (1997)参照。別の試験では、SNAP-25のGln197がメチオニン、セリン、スレオニン、グルタミンまたはリジンも置換され得、そして、まだ、BoNT/Aにより効率的に切断され得る。例えば、Vadakkanchery V. Vaidyanathan et al., Proteolysis of SNAP-25 Isoforms by Botulinum Neurotoxin Types A, C, and E: Domains and Amino Acid Residues Controlling the Formation of Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage, 72 J. Neurochem. 327-337 (1999)参照。これらの結果は、限定なしで、Glu194、Ala195、Gln197、Ala199、Thr200およびMet202、Leu203、Gly204、Ser205、およびGly206、並びにGln-Arg切断結合よりより遠い残基を含む残基が、置換またはコンジュゲートされ得ることを示す。
多様なBoNT/A基質切断部位が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得る。BoNT/A基質切断部位は、例えば、ヒトSNAP-25の残基 46-206、残基 134から206、残基 137から206または146-206を有し得る。例えば、Teresa A. Ekong et al., Recombinant SNAP-25 is an Effective Substrate for Clostridium botulinum Type A Toxin Endopeptidase Activity in vitro, 143 (Pt 10) Microbiology 3337-3347 (1997); Clifford C. Shone et al., Toxin Assays, U.S. Patent No. 5,962,637 (Oct. 5, 1999); および Vaidyanathan et al., supra, (1999)参照。BoNT/A基質切断部位は、また、限定なしで、ヒトSNAP-25の残基190から202に対応する、配列Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala Thr Lys Met (配列番号：133)、またはそのペプチド模倣体；ヒトSNAP-25の残基187から201に対応する、Ser-Asn Lys Thr Arg Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr Lys (配列番号： 134) 、またはそのペプチド模倣体; ヒトSNAP-25の残基187から202に対応する、 Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号： 135) 、またはそのペプチド模倣体; ヒトSNAP-25の残基187から203に対応する、Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (配列番号： 136) 、またはそのペプチド模倣体; ヒトSNAP-25の残基186から202に対応する、Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号： 150) 、またはそのペプチド模倣体; または、ヒトSNAP-25の残基186から203に対応する、Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (配列番号：: 151) 、またはそのペプチド模倣体を含むことができる。例えば、James J. Schmidt & Karen A Bostian, Proteolysis of Synthetic Peptides by Type A Botulinum Neurotoxin, 14(8) J. Protein Chem. 703-708 (1995); Schmidt & Bostian, supra, (1997); James J. Schmidt et al., Type A Botulinum Neurotoxin Proteolytic Activity: Development of Competitive Inhibitors and Implications For Substrate Specificity at the S1' Binding Subsite, 435(1) FEBS Lett. 61 64 (1998); および James J. Schmidt & Karen A Bostian, Assay for the Proteolytic Activity of Serotype a From Clostridium botulinum, U.S. Patent No. 5,965,699 (Oct. 12, 1999)参照。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/A基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/A基質切断部位はGln-Argを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/A基質切断部位はLys-Hisを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列 Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (配列番号： 104); アミノ酸配列 Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys (配列番号： 105); アミノ酸配列 Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys (配列番号： 106)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/A基質切断部位は、天然に存在するBoNT/A基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/A基質切断部位は、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の天然に存在するBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/A基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/A基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/A基質切断部位改変体またはBoNT/A基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/A基質切断部位は、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の天然に存在しないBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の保存的なBoNT/A基質切断部位改変体;配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の非保存的なBoNT/A基質切断部位改変体；配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号: 133、配列番号: 134、配列番号: 135、配列番号: 136、配列番号: 138、配列番号: 141、配列番号: 148、配列番号: 150または配列番号: 151を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０４と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０４と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/A基質切断部位は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/B基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型B基質切断部位」は、「BoNT/B基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下でBoNT/Bにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Bにより切断される切断結合は、例えば、Gln-Pheであり得る。本発明の態様において、BoNT/B基質切断部位がBoNT/Bにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/B基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/B基質切断部位は、BoNT/Bによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/B-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表３に示されるように、BoNT/Bによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、例えば、ヒトおよびマウス VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）；ウシ VAMP-2; ラット VAMP-2 およびVAMP-3; ニワトリVAMP-2; シビレエイVAMP-1; キタムラサキウニVAMP; ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synDおよびsynE; ヒルVAMP; および線虫SNB1-likeを含む。したがって、BoNT/B基質切断部位は、BoNT/B切断に感受性のある、例えば、ヒトVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ウシVAMP-2; ラットVAMP-2またはVAMP 3; マウスVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ニワトリVAMP-1、VAMP-2またはVAMP-3; アフリカツメガエルVAMP-2またはVAMP-3; ダニオ VAMP-1またはVAMP-2; シビレエイVAMP-1; キタムラサキウニ VAMP; ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synD または synE; ヒルVAMP; ヤリイカVAMP; モノアラガイVAMP; アメフラシ VAMP; 線虫 SNB1、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Bにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表３）。この知見は、天然に存在するBoNT/B−感受性VAMP配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/B基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/B基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表３で示された生命体において同定されたVAMP-1およびVAMP-2蛋白質に含まれるBoNT/B基質切断部位のような、他のBoNT/B-感受性VAMP-1およびVAMP-2アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
多様なBoNT/B基質切断部位が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得る。かかるBoNT/B基質切断部位は、VAMP蛋白質、例えば、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2の親水性コアのいくつかまたは全てに対応する配列を含むことができる。BoNT/B基質切断部位は、限定なしで、ヒトVAMP-2 (配列番号: 39)の残基 33 から 94、残基 45 から 94、残基 55 から 94、残基 60 から 94、残基 65 から 94、残基 60 から 88または残基 65 から 88、または、ヒトVAMP-1-1 (配列番号: 36)、VAMP-1-2 (配列番号: 37)およびVAMP-1-3 (配列番号: 38)の残基 60 から 94を含むことができる。例えば、Shone et al., Eur. J. Biochem. 217: 965 971 (1993); and Shone et al., supra, (Oct. 5, 1999)参照。BoNT/B基質切断部位は、また、限定なしで、ヒトVAMP-2残基60から94に対応する、配列Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Leu-Lys (配列番号: 152)、またはそのペプチド模倣体（例えば、James J. Schmidt & Robert G. Stafford, High Throughput Assays for the Proteolytic Activities of Clostridial Neurotoxins, U.S. Patent No. 6,762,280 (Jul. 13, 2004)参照）、およびヒトVAMP-1の残基62から96に対応する、BoNT/B認識配列Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Cys-Lys (配列番号: 153)、またはそのペプチド模倣体を含むことができる。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/B基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/B基質切断部位はGln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号: 107); アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (配列番号: 108); アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (配列番号: 109); アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (配列番号: 110); アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (配列番号: 111); またはアミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (配列番号: 112)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/B基質切断部位は、天然に存在するBoNT/B基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/B基質切断部位は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在するBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/B基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/B基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/B基質切断部位改変体またはBoNT/B基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/B基質切断部位は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在しないBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の保存的なBoNT/B基質切断部位改変体; 配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の非保存的なBoNT/B基質切断部位改変体；配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/C1基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型C1基質切断部位」は、「BoNT/C1基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でBoNT/C1により切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/C1により切断される切断結合は、例えば、Lys-AlaまたはArg-Alaであり得る。本発明の態様において、BoNT/C1基質切断部位がBoNT/C1により切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/C1基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/C1基質切断部位は、BoNT/C1による切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/C1-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表４に示されるように、BoNT/C1による切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、例えば、ヒトおよびマウスSyntaxin 1A、Syntaxin 1B1およびSyntaxin 1B2; ウシおよびラット Syntaxin 1A および Syntaxin 1B2; ラット Syntaxin 2 およびラット syntaxin 3; キタムラサキウニ Syntaxin; ショウジョウバエ Syntaxin 1A; ヒル Syntaxin1A; ヤリイカ Syntaxin 1A; アメフラシ Syntaxin 1Aを含む。したがって、BoNT/B基質切断部位は、BoNT/B切断に感受性のある、例えば、ヒトSyntaxin 1A、Syntaxin 1B1、Syntaxin 1B2、Syntaxin 2-1、Syntaxin 2-2、Syntaxin 2-3 または Syntaxin 3A; ウシ Syntaxin 1A、Syntaxin 1B1 または Syntaxin 1B2; ラット Syntaxin 1A、Syntaxin 1B1、Syntaxin 1B2、Syntaxin 2 または Syntaxin 3A; マウス Syntaxin 1A、Syntaxin 1B1、Syntaxin 1B2、Syntaxin 2、Syntaxin 3A、Syntaxin 3B または Syntaxin 3C; ニワトリ Syntaxin 1A または Syntaxin 2; アフリカツメガエル Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; ダニオ Syntaxin 1A、Syntaxin 1B または Syntaxin 3; シビレエイ Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; キタムラサキウニ Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; ショウジョウバエ Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; ヒル Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; ヤリイカ Syntaxin 1A または Syntaxin 1B; モノアラガイ Syntaxin 1A または Syntaxin 1B、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/C1により切断される天然のSyntaxin１Aアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかであり（表４）、天然に存在するBoNT/C1−感受性Syntaxin配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/C1基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/C1基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表４で示された生命体において同定されたSyntaxin蛋白質に含まれるBoNT/C1基質切断部位のような、他のBoNT/C1-感受性Syntaxinアイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
広範な研究ではないが、多様なBoNT/C1基質切断部位が、ルーチンな方法により決められ得る。BoNT/C1基質切断部位の最小限の最適なフラグメントは、限定なしで、ヒトSNAP-25A (配列番号: 9)の残基93から202、または、ヒトSNAP-25B (配列番号: 10)の残基 93から202を含むことができる。例えば、Vaidyanathan et al., supra, (1999)参照。しかしながら、他のBoNTs基質より、もっと小さい基質フラグメントが効率よくBoNT/C1により切断されることができると思われる。
さらに表２に示されるように、BoNT/C1による切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、例えば、ヒト、ラット、マウス、ダニオ、フナSNAP-25AおよびSNAP-25B；およびショウジョウバエSNAP-25を含む。したがって、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、BoNT/C1による切断に感受性のある、ヒトSNAP-25A または SNAP-25B; ウシ SNAP-25A または SNAP-25B; ラット SNAP-25A または SNAP-25B; マウス SNAP-25A または SNAP-25B; アフリカツメガエル SNAP-25A または SNAP-25B; ダニオ SNAP-25A または SNAP-25B; フナ SNAP-25A または SNAP-25B; シビレエイ SNAP-25; キタムラサキウニ SNAP-25; ショウジョウバエ SNAP-25 または SNAP-24; ヒル SNAP-25; ヤリイカ SNAP-25; モノアラガイ SNAP-25、それらのアイソフォームまたは他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。天然に存在する多様なsyntaxin配列に関して上記で議論されているように、BoNT/C1により切断される天然のSNAP-25アミノ酸配列の比較から、顕著な配列多様性がわかり（表２）、天然に存在するBoNT/C1−感受性SNAP-25配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明で開示されるBoNT/C1基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/C1基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表２で示された生命体において同定されたSNAP-25蛋白質に含まれるBoNT/A基質切断部位のような、他のBoNT/C1-感受性SNAP-25アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/C1基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/C1基質切断部位はLys-Alaを含むSyntaxinの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、Arg-Alaを含むSyntaxinの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 113); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr (配列番号: 114); アミノ酸配列 Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 115); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr (配列番号: 116); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 117); アミノ酸配列 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr (配列番号: 118); または、アミノ酸配列 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr (配列番号: 119)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119の天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体またはBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119の天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119の保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体; 配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119の非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体；配列番号: 113, 配列番号: 114, 配列番号: 115, 配列番号: 116, 配列番号: 117, 配列番号: 118 または 配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１１３と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１１３と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この態様の一側面において、BoNT/C1基質切断部位はArg-Alaを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、Arg-Alaを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号: 120); またはアミノ酸配列 Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu (配列番号: 121)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、配列番号:120または配列番号:121の天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号:120または配列番号:121のBoNT/C1基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号:120または配列番号:121のBoNT/C1基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体またはBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/C1基質切断部位は、配列番号:120または配列番号:121の天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号:120または配列番号:121の保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体; 配列番号:120または配列番号:121の非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体；配列番号:120または配列番号:121のBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２０と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２０と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/C1基質切断部位は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/D基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型D基質切断部位」は、「BoNT/D基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でBoNT/Dにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Dにより切断される切断結合は、例えば、Lys-Leuであり得る。本発明の態様において、BoNT/D基質切断部位がBoNT/Dにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/D基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/D基質切断部位は、BoNT/Dによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/D-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表３に示されるように、BoNT/Dによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、、例えば、ヒト、ラットおよびマウス VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）；ウシ VAMP-2;; ニワトリVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3;アフリカツメガエル VAMP-2またはVAMP-3；ダニオ VAMP-1またはVAMP-2； シビレエイVAMP-1; キタムラサキウニVAMP; ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synDおよびsynE; ヒルVAMP;ヤリイカVAMP；モノアラガイVAMP；アメフラシVAMP； および線虫SNB1を含む。したがって、BoNT/D基質切断部位は、BoNT/D切断に感受性のある、例えば、ヒトVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ウシVAMP-2; ラットVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; マウスVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ニワトリVAMP-1、VAMP-2またはVAMP-3; アフリカツメガエルVAMP-2またはVAMP-3; ダニオ VAMP-1またはVAMP-2; シビレエイVAMP-1; キタムラサキウニ VAMP; ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synD または synE; ヒルVAMP; ヤリイカVAMP; モノアラガイVAMP; アメフラシ VAMP; 線虫 SNB1、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Dにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表３）。この知見は、天然に存在するBoNT/D−感受性VAMP配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/D基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/D基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表３で示された生命体において同定されたVAMP-1およびVAMP-2蛋白質に含まれるBoNT/B基質切断部位のような、他のBoNT/B-感受性VAMP-1およびVAMP-2アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
多様なBoNT/D基質切断部位が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得る。かかるBoNT/D基質切断部位は、例えば、ラットVAMP-2（配列番号：４６）の残基27から116;残基37から116;残基1から86;残基1から76;または残基1から69を含むことができる。例えば、Shinji Yamasaki et al., Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum neurotoxins and tetanus toxin, 269(17) J. Biol. Chem. 12764-12772 (1994)参照。したがって、BoNT/D基質切断部位は、また、限定なしで、ヒトVAMP-2残基37から75に対応する、配列Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (配列番号: 154)、またはそのペプチド模倣体（例えば、Schmidt & Stafford, supra, (Jul. 13, 2004)参照）、およびヒトVAMP-1アイソフォーム、VAMP-1-1、VAMP-1-2およびVAMP-1-3の残基39から77に対応する、BoNT/D認識配列Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (配列番号: 155)、またはそのペプチド模倣体を含むことができる。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/D基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/D基質切断部位はLys-Leuを含むVAMPの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (配列番号: 122)またはアミノ酸配列Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu (配列番号: 123)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/D基質切断部位は、天然に存在するBoNT/D基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/D基質切断部位は、配列番号: 122または配列番号: 123の天然に存在するBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/D基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/D基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/D基質切断部位改変体またはBoNT/D基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/D基質切断部位は、配列番号: 122または配列番号: 123の天然に存在しないBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 122または配列番号: 123の保存的なBoNT/D基質切断部位改変体; 配列番号: 122または配列番号: 123の非保存的なBoNT/D基質切断部位改変体；配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２２と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/B基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２２と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/D基質切断部位は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/E基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型E基質切断部位」は、「BoNT/E基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でBoNT/Eにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Eにより切断される切断結合は、例えば、Arg-IleまたはLys-Ileであり得る。本発明の態様において、BoNT/E基質切断部位がBoNT/Eにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/E基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/E基質切断部位は、BoNT/Eによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/E-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表２に示されるように、BoNT/Eによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、例えば、ヒト、ニワトリ、ダニオ、フナ SNAP-25AおよびSNAP-25B; ラットおよびマウス SNAP-25A、SNAP-25BおよびSNAP-23; および 線虫 SNAP-25を含む。したがって、BoNT/E基質切断部位は、BoNT/C1切断に感受性のある、ヒトSNAP-25A または SNAP-25B; ウシ SNAP-25A または SNAP-25B; ラット SNAP-25A、SNAP-25BまたはSNAP-23; マウス SNAP-25A、SNAP-25BまたはSNAP-23; アフリカツメガエル SNAP-25A または SNAP-25B; ダニオ SNAP-25A または SNAP-25B; フナ SNAP-25A または SNAP-25B; キタムラサキウニ SNAP-25; ショウジョウバエ SNAP-24; ヒル SNAP-25; ヤリイカ SNAP-25; モノアラガイ SNAP-25;線虫SNAP-25、それらのアイソフォームまたは他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Eにより切断される天然のSNAP-23およびSNAP-25アミノ酸配列の比較から、顕著な配列多様性がわかる（表２）。この知見は、天然に存在するBoNT/E−感受性SNAP-23またはSNAP-25配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明で開示されるBoNT/E基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/E基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表２で示された生命体において同定されたSNAP-25蛋白質に含まれるBoNT/E基質切断部位のような、他のBoNT/E-感受性SNAP-25アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
多様なBoNT/E基質切断部位が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得る。BoNT/E基質切断部位は、例えば、ヒトSNAP-25A（配列番号：９）およびヒトSNAP-25B（配列番号：１０）の残基46-206、残基92から206、残基、残基134から206、残基、137から206; 146-206、156-206または146-186を有する。例えば、Vaidyanathan et al., supra, (1999); および Schmidt & Stafford, supra, (Jul. 13, 2004)参照。
したがって、１つの実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/E基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/E基質切断部位はArg-Ileを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列 Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (配列番号: 124); アミノ酸配列 Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys (配列番号: 125); アミノ酸配列 Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met (配列番号: 126); アミノ酸配列 Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys (配列番号: 127);またはアミノ酸配列 Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys (配列番号: 128)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/E基質切断部位は、天然に存在するBoNT/E基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/E基質切断部位は、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128の天然に存在するBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128のBoNT/E基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128のBoNT/E基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/E基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/E基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/E基質切断部位改変体またはBoNT/E基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/E基質切断部位は、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128の天然に存在しないBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128の保存的なBoNT/E基質切断部位改変体; 配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128の非保存的なBoNT/E基質切断部位改変体；配列番号:124、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127または配列番号:128のBoNT/E基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２４と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２４と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/E基質切断部位は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/F基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型F基質切断部位」は、「BoNT/F基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でBoNT/Fにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Fにより切断される切断結合は、例えば、Gln-Lysであり得る。本発明の態様において、BoNT/F基質切断部位がBoNT/Fにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/F基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/F基質切断部位は、BoNT/Fによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/F-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表３に示されるように、BoNT/Fによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、、例えば、ヒト、ラットおよびマウス VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）；ウシ VAMP-2;; ニワトリVAMP-1およびVAMP-2; シビレエイVAMP-1;および ショウジョウバエ sybAおよびsynBを含む。したがって、BoNT/F基質切断部位は、BoNT/F切断に感受性のある、例えば、ヒトVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ウシVAMP-2; ラットVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; マウスVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ニワトリVAMP-1、VAMP-2またはVAMP-3; アフリカツメガエルVAMP-2またはVAMP-3; ダニオ VAMP-1またはVAMP-2; シビレエイVAMP-1; ショウジョウバエ sybAおよびsynB; ヒルVAMP; ヤリイカVAMP; モノアラガイVAMP; アメフラシ VAMP; 線虫 SNB1、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Fにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表３）。この知見は、天然に存在するBoNT/F−感受性VAMP配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/F基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/F基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表３で示された生命体において同定されたVAMP-1およびVAMP-2蛋白質に含まれるBoNT/F基質切断部位のような、他のBoNT/F-感受性VAMP-1およびVAMP-2アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
多様なBoNT/F認識配列が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得る。かかるBoNT/F基質切断部位は、例えば、ラットVAMP-2（配列番号：４６）の残基27から116;残基37から116;残基1から86;残基1から76;または残基1から69を含むことができる。例えば、Yamasaki et al., supra, (1994)参照。これらのBoNT/F認識配列は、また、例えば、ラットVAMP-2の残基27から69または残基37から69を含むことができる。同様のBoNT/F認識配列は、望まれるならば、例えば、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2のような他の１つのBoNT/F-感受性VAMPアイソフォームの対応する（相同の）部分から調製され得ることが理解される。BoNT/F認識配列は、また、限定なしで、ヒトVAMP-2残基37から75に対応する、配列Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (配列番号: 154)、またはそのペプチド模倣体（例えば、Schmidt & Stafford, supra, (Jul. 13, 2004)参照）、およびヒトVAMP-1アイソフォーム、VAMP-1-1、VAMP-1-2およびVAMP-1-3の残基39から77に対応する、BoNT/D認識配列Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (配列番号: 155)、またはそのペプチド模倣体を含むことができる。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/F基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/F基質切断部位はGln-Lysを含むVAMPの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (配列番号: 129); またはアミノ酸配列Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu (配列番号: 130)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/F基質切断部位は、天然に存在するBoNT/F基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/F基質切断部位は、配列番号: 129または配列番号: 130の天然に存在するBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/F基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/F基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/F基質切断部位改変体またはBoNT/F基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/F基質切断部位は、配列番号: 129または配列番号: 130の天然に存在しないBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 129または配列番号: 130の保存的なBoNT/F基質切断部位改変体; 配列番号: 129または配列番号: 130の非保存的なBoNT/F基質切断部位改変体；配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２９と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２９と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/F基質切断部位は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/G基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「ボツリヌス毒素血清型G基質切断部位」は、「BoNT/G基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でBoNT/Gにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。BoNT/Gにより切断される切断結合は、例えば、Ala-Alaであり得る。本発明の態様において、BoNT/G基質切断部位がBoNT/Gにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのBoNT/G基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なBoNT/G基質切断部位は、BoNT/Gによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、BoNT/G-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表３に示されるように、BoNT/Gによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、、例えば、ヒトおよびマウス VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）；ウシ VAMP-2; ニワトリVAMP-1; およびシビレエイVAMP-1を含む。したがって、BoNT/G認識配列は、BoNT/G切断に感受性のある、例えば、ヒトVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ウシVAMP-2; ラットVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; マウスVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ニワトリVAMP-1、VAMP-2またはVAMP-3; アフリカツメガエルVAMP-2またはVAMP-3; ダニオ VAMP-1またはVAMP-2; シビレエイVAMP-1;線虫 SNB1、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、BoNT/Gにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表３）。この知見は、天然に存在するBoNT/G−感受性VAMP配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なBoNT/G基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のBoNT/G基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表３で示された生命体において同定されたVAMP-1およびVAMP-2蛋白質に含まれるBoNT/G基質切断部位のような、他のBoNT/G-感受性VAMP-1およびVAMP-2アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、BoNT/G基質切断部位を含む。この態様の一側面において、BoNT/G基質切断部位はAla-Alaを含むVAMPの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (配列番号: 131);またはアミノ酸配列Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (配列番号: 132)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/G基質切断部位は、天然に存在するBoNT/G基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、BoNT/G基質切断部位は、配列番号: 131または配列番号: 132の天然に存在するBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、BoNT/G基質切断部位は、天然に存在しないBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/G基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/G基質切断部位改変体またはBoNT/G基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、BoNT/G基質切断部位は、配列番号: 131または配列番号: 132の天然に存在しないBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 131または配列番号: 132の保存的なBoNT/G基質切断部位改変体; 配列番号: 131または配列番号: 132の非保存的なBoNT/G基質切断部位改変体；配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１３１と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１３１と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、BoNT/G基質切断部位は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
本発明の実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、TeNT基質切断部位を含む。本明細書で用いられるように、用語「破傷風毒素基質切断部位」は、「TeNT基質切断部位」と同義語であって、隣接する、または隣接しない、または両方の、認識要素と一緒に、適した条件下でTeNTにより切断され得る結合での蛋白質分解を検出するのに十分な、切断され得る結合を意味する。TeNTにより切断される切断結合は、例えば、Gln-Pheであり得る。本発明の態様において、TeNT基質切断部位がTeNTにより切断されることができるという条件で、あらゆるおよび全ての長さのTeNT基質切断部位が有用であり得ることが想定される。したがって、この態様の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さまたは少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この実施態様の他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さまたは多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
本発明の態様で有用なTeNT基質切断部位は、TeNTによる切断に感受性のある蛋白質の部分に相当することができるか、または、TeNT-感受性蛋白質の部分と実質的に同様であることができる。表３に示されるように、TeNTによる切断に感受性のある多様な天然に存在する蛋白質が本分野で知られており、、例えば、ヒトおよびマウス VAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン（cellubrevin）；ウシ VAMP-2; ラット VAMP-2およびVAMP-3; ニワトリVAMP-2;シビレエイVAMP-1；キタムラサキウニVAMP;ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synDおよびsynE; ヒルVAMP; および線虫SNB1様を含む。したがって、TeNT認識配列は、TeNT切断に感受性のある、例えば、ヒトVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ウシVAMP-2; ラットVAMP-2またはVAMP 3; マウスVAMP-1、VAMP-2またはVAMP 3; ニワトリVAMP-1、VAMP-2またはVAMP-3; アフリカツメガエルVAMP-2またはVAMP-3; ダニオ VAMP-1またはVAMP-2; シビレエイVAMP-1; キタムラサキウニVAMP; ショウジョウバエ sybA、synB、synC、synDまたはsynE; ヒルVAMP; ヤリイカVAMP; モノアラガイVAMP; アメフラシVAMP; 線虫 SNB1およびSNB様、それらのアイソフォーム、または他の天然に存在する蛋白質の部分に相当することができる。さらに、TeNTにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較から、かかる配列が完全には保存されていないことが明らかである（表３）。この知見は、天然に存在するTeNT−感受性VAMP配列に比較した多様なアミノ酸置換および修飾が、本発明の態様において有用なTeNT基質切断部位に忍容であり得ることを示す。同様のTeNT基質切断部位が、望まれるのであれば、上記および表３で示された生命体において同定されたVAMP-1およびVAMP-2蛋白質に含まれるTeNT基質切断部位のような、他のTeNT-感受性VAMP-1およびVAMP-2アイソフォーム、パラログ（paralog）またはオルソログの対応する（相同の）部分から、調製されることができることは理解される。
多様なTeNT認識配列が本分野で良く知られるか、またはルーチンな方法により決められ得、例えば、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2のようなVAMP蛋白質の親水性コアのいくつかまたは全てに対応する配列を含む。TeNT認識配列は、例えば、ヒトVAMP-2（配列番号：３９）の残基25から93または残基33から94；F. Cornille et al., Solid-Phase Synthesis, Conformational Analysis and In Vitro Cleavage Of Synthetic Human Synaptobrevin II 1-93 by Tetanus Toxin L chain, 222(1) Eur. J. Biochem. 173 181 (1994); Patrick Foran et al., Differences in the Protease Activities of Tetanus and Botulinum B Toxins Revealed By the Cleavage of Vesicle-Associated Membrane Protein and Various Sized Fragments, 33(51) Biochemistry 15365 15374 (1994);ラットVAMP-2の残基51から93または残基1から86、例えば、Yamasaki et al., supra, (1994)参照；またはヒトVAMP-1-1（配列番号:36）の残基33から94、ヒトVAMP-1-2（配列番号:37）の残基33から94およびヒトVAMP-1-3（配列番号：38）の残基33から94を含むことができる。TeNT認識配列は、また、例えば、ヒトVAMP-2（配列番号:39）またはラットVAMP-2（配列番号：46）の残基25から86、残基33から86または51から86の残基27から69または残基37から69を含むことができる。同様のTeNT認識配列は、望まれるならば、例えば、ヒトVAMP-1またはウニまたはアメフラシVAMPのような他の１つのTeNT-感受性VAMPアイソフォームまたは種ホモログの対応する（相同の）部分から調製され得ることが理解される。
したがって、一実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、TeNT基質切断部位を含む。この態様の一側面において、TeNT基質切断部位はGln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号: 107); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (配列番号: 108); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (配列番号: 109); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (配列番号: 110); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (配列番号: 111); or アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (配列番号: 112)を含む。この実施態様のもう１つの側面において、TeNT基質切断部位は、天然に存在するTeNT基質切断部位改変体を含む。この実施態様のもう１つの側面において、TeNT基質切断部位は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在するTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位アイソフォーム;または、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位サブタイプを含む。この実施態様の更なるもう１つの側面において、TeNT基質切断部位は、天然に存在しないTeNT基質切断部位改変体、例えば、保存的なTeNT基質切断部位改変体、非保存的なTeNT基質切断部位改変体またはTeNT基質切断部位ペプチド模倣体、または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。この実施態様の更にもう１つの側面において、TeNT基質切断部位は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在しないTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 1120の保存的なTeNT基質切断部位改変体; 配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の非保存的なTeNT基質切断部位改変体；配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位ペプチド模倣体；または、それらのいずれの組み合わせ、を含む。
この実施態様の他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に別の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の更に他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様の他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。この実施態様のなお更なる他の側面において、TeNT基質切断部位は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸欠失を有するペプチドを含む。
クロストリジウム毒素基質切断部位のもう１つのタイプは、クロストリジウム毒素それ自体の自己触媒的フラグメントから得られる。クロストリジウム毒素は自己触媒的断片化を受けることができ、その結果、２つの主要なポリペプチドフラグメントが形成されることが知られてきた。第１の領域は、配列番号：１のアミノ酸250-267を含み、ここで、結合Tyr250-Tyr251およびPhe266-Gly267が切断を受けやすい。第２の領域は、配列番号：１の残基419-439を含み、ここで、結合Phe419-Thr420、Phe423-Glu424、Leu429-Cys430、Cys 430-Val431、Arg432-Gly433およびLys438-Thr439は自己触媒的切断を受けやすい。配列番号：１のアミノ酸250-267に相当するBoNT/A領域は、クロストリジウム毒素の中で、高度に保存されている（表７）。
したがって、１つの実施態様において、修飾されたクロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素自己触媒的切断部位を含む。この実施態様の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的切断部位は、BoNT/A 残基 250Tyr-251Tyr、BoNT/B 残基 256Phe-257Phe、BoNT/C1 残基 257Phe-258Tyr、BoNT/D 残基 257Phe-258Phe、BoNT/E 残基 239Pro-240Leu、BoNT/F 残基 254Pro-255Leu、BoNT/G 残基 256Phe-257Phe または、TeNT 残基 259Ile-260Tyrを含むクロストリジウム毒素の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様のもう１つの側面では、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、Phe-Glyを含むクロストリジウム毒素の少なくとも６つの連続した残基を含む。この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的切断部位は、BoNT/A 残基 Phe266-Gly267、BoNT/B 残基 Phe272-Gly273、BoNT/C1 残基 Phe273-Gly274、BoNT/D 残基 Phe273-Gly274、BoNT/E 残基 Phe255-Gly256、BoNT/F 残基 Phe270-Gly271、BoNT/G 残基 Phe272-Gly273 またはTeNT 残基 Phe275-Gly276を含むクロストリジウム毒素の少なくとも６つの連続した残基を含む。
この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280を含む。この実施態様の更なる他の側面では、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 247-254; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 253-260; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 254-261; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 254-261; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 236-243; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 251-258; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 253-260;または配列番号: 8のTeNT 残基 256-263を含む。この実施態様の更なる他の側面では、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 263-270; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 269-276; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 270-277; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 270-277; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 252-259; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 267-274; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 269-276;または、配列番号: 8のTeNT 残基 272-279を含む。
この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；または、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも５０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも６０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも７０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも８０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも９０％のアミノ酸同一性を有するペプチド；または、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するペプチドを含む。
この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸の付加を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸の付加を有するペプチドを含む。
この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するペプチドを含む。
この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するペプチドを含む。
この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸の付加を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸の付加を有するペプチドを含む。
この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するペプチドを含む。この実施態様の更なる他の側面において、クロストリジウム毒素自己触媒的基質切断部位は、例えば、配列番号: 1のBoNT/A 残基 246-271; 配列番号: 2のBoNT/B 残基 252-277; 配列番号: 3のBoNT/C1 残基 253-278; 配列番号: 4のBoNT/D 残基 253-278; 配列番号: 5のBoNT/E 残基 235-260; 配列番号: 6のBoNT/F 残基 250-275; 配列番号: 7のBoNT/G 残基 252-277;または配列番号: 8のTeNT 残基 255-280に比較して少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するペプチドを含む。
本発明の一態様において、クロストリジウム毒素基質切断部位は、２本鎖ループ領域内に位置する。本明細書で使用されるように、用語「２本鎖ループ領域」は、単鎖形態のクロストリジウム毒素を２本鎖形態に変換するために用いられるプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素のアミノ酸配列を意味する。非限定的な例として、BoNT/Aの２本鎖ループ領域は、配列番号: 1のアミノ酸 430-454を含む; BoNT/Bの２本鎖ループ領域は、配列番号: 2のアミノ酸 437-446を含む; BoNT/C1の２本鎖ループ領域は、配列番号: 3のアミノ酸 437-453を含む; BoNT/Dの２本鎖ループ領域は、配列番号: 4のアミノ酸 437-450を含む; BoNT/Eの２本鎖ループ領域は、配列番号: 5のアミノ酸 412-426を含む; BoNT/Fの２本鎖ループ領域は、配列番号: 6のアミノ酸 429-445を含む; BoNT/Gの２本鎖ループ領域は、配列番号: 7のアミノ酸 436-450を含む;およびTeNTの２本鎖ループ領域は、配列番号: 8のアミノ酸 439-467を含む。
上記に言及のように、クロストリジウム毒素は、蛋白質分解性切断により、単一ポリペプチドから２本鎖分子に変換される。天然に存在するプロテアーゼの同定は現在不明だが、多くのクロストリジウム毒素に対する２本鎖ループプロテアーゼ切断部位の位置は決定されてきている（表８）。２本鎖ループ内での切断は、単一ペプチド結合に限られないようである。したがって、天然に存在する２本鎖ループプロテアーゼを用いるクロストリジウム毒素の切断により、元々の切断部位の周辺のいくつかの残基が失われる。この損失は、ジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基間に位置するいくつかのアミノ酸に限られる。非限定的な例として、BoNT/A単鎖ポリペプチド切断により、結果的に、２本鎖ループ内の１０アミノ酸が損失される。BoNTsにおいて、K448-A449での切断が、単鎖形態のBoNT/Aを２本鎖形態に変換する;K441-A442での切断が、単鎖形態のBoNT/Bを２本鎖形態に変換する;K449-T450での切断が、単鎖形態のBoNT/C1を２本鎖形態に変換する;R445-D446での切断が、単鎖形態のBoNT/Dを２本鎖形態に変換する;R422-K423での切断が、単鎖形態のBoNT/Eを２本鎖形態に変換する;K439-A440での切断が、単鎖形態のBoNT/Fを２本鎖形態に変換する;およびK446-S447での切断が、単鎖形態のBoNT/Gを２本鎖形態に変換する。単鎖形態のTeNTのA457-S458での蛋白質分解性の切断により、２本鎖形態が得られる。
しかしながら、２本鎖ループ内の付加的な切断部位が、また切断され得、小さいペプチドフラグメントの損失が発生することも、また、気づかれるべきである。非限定的な例として、BoNT/A単鎖ポリペプチドの切断により、結果として、２本鎖ループ内の１０アミノ酸が損失される。したがって、S441-L442での切断は、単鎖形態のBoNT/Aを２本鎖形態に変換し;G444-I445 での切断は、単鎖形態のBoNT/Bを２本鎖形態に変換し; S445-L446での切断は、単鎖形態のBoNT/C1を２本鎖形態に変換し;K442-N443での切断は、単鎖形態のBoNT/Dを２本鎖形態に変換し;K419-G420 での切断は、単鎖形態のBoNT/Eを２本鎖形態に変換し;K423-S424での切断は、単鎖形態のBoNT/Eを２本鎖形態に変換し;K436-G437での切断は、単鎖形態のBoNT/Fを２本鎖形態に変換し;T444-G445での切断は、単鎖形態のBoNT/Gを２本鎖形態に変換し;そして、E448-Q449での切断は、単鎖形態のBoNT/Gを２本鎖形態に変換する。
２本鎖ループ領域は、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位に加えて、クロストリジウム毒素基質切断部位を含むために修飾され得る。このタイプの修飾において、両方の切断部位は、融合蛋白質として修飾されたクロストリジウム毒素にフレームで（in-frame）操作可能に結びつけられ、両方の部位は、それぞれのプロテアーゼにより切断され得る。非限定的な例として、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位とBoNT/A基質切断部位の両方を含む二本鎖ループを含む修飾BoNT/Aは、C.ボツリナム血清型Aに見出される内因性の２本鎖ループプロテアーゼまたはBoNT/Aのいずれかにより切断され得る。もう１つの非限定的な例として、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位とBoNT/E基質切断部位の両方を含む二本鎖ループを含む修飾BoNT/Aは、C.ボツリナム血清型Aに見出される内因性の２本鎖ループプロテアーゼまたはBoNT/Eのいずれかにより切断され得る。
二本鎖ループ領域は、また、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位をクロストリジウム毒素基質切断部位で置換するために修飾され得る。このタイプの修飾において、天然に存在するプロテアーゼ切断部位は操作不可能であり、したがって、このプロテアーゼによって切断され得ない。クロストリジウム毒素基質切断部位だけが、対応する毒素によって切断され得る。かかるクロストリジウム毒素切断部位は、融合蛋白質として修飾されたクロストリジウム毒素に操作可能に結びつけられる。非限定的な例として、BoNT/A基質切断部位のみを含む２本鎖ループを含む単鎖形態の修飾BoNT/Aは、BoNT/Aにより切断され得るが、C.ボツリナム血清型Aに見出される内因性２本鎖ループプロテアーゼでは切断され得ない。もう１つの非限定的な例として、BoNT/E基質切断部位のみを含む２本鎖ループを含む単鎖形態の修飾BoNT/Aは、BoNT/Eにより切断され得るが、C.ボツリナム血清型Aに見出される内因性２本鎖ループプロテアーゼでは切断され得ない。
天然に存在する２本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接するアミノ酸の少なくとも１つを改変することにより操作不可能とされ得る。２本鎖ループ領域の２つのシステイン残基が無傷のままであり、そしてジスルフィド結合の形成がまだ達成され得ることを条件として、更なる広い改変がなされ得る。アミノ酸改変の非限定的な例には、アミノ酸の欠失または元のアミノ酸を異なるアミノ酸へ置換することを含む。これらの改変は、当業者に知られている標準的な変異方法を用いてなされ得る。さらに、変異方法並びに良く特徴付けされた試薬、条件およびプロトコルの非限定的な例は、限定なしで、BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; および Stratagene, La Jolla, CAを含む、商業的な供給者より、容易に入手可能である。これらのプロトコルは、当業者の見識内および本明細書が教える範囲内のルーチンな方法である。
したがって、一実施態様において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接するアミノ酸の少なくとも１つを改変することにより操作不可能とされ得る。この実施態様の側面において、二本鎖ループプロテアーゼ切断部位のP1アミノ酸または二本鎖ループプロテアーゼ切断部位のP1’アミノ酸は、改変される。この実施態様の他の側面において、BoNT/AのK448 またはA449のいずれかがが改変される;BoNT/AのS441またはL442のいずれかがが改変される;BoNT/BのK441またはA442のいずれかがが改変される;BoNT/BのG444またはI445のいずれかがが改変される;BoNT/C1のK449またはT450のいずれかがが改変される;BoNT/C1のS445またはL446のいずれかがが改変される;BoNT/DのR445またはD446のいずれかがが改変される;BoNT/DのK442またはN443のいずれかがが改変される;BoNT/EのR422またはK423のいずれかがが改変される;BoNT/EのK419またはG420のいずれかがが改変される;BoNT/EのK423またはS424のいずれかがが改変される;BoNT/FのK439またはA440のいずれかがが改変される;BoNT/FのK436またはG437のいずれかがが改変される;BoNT/GのK446またはS447のいずれかがが改変される;BoNT/GのT444またはG445のいずれかがが改変される;BoNT/GのE448またはQ449のいずれかがが改変される;またはTeNTのA457またはS458のいずれかがが改変される。
もう１つの実施態様において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸のを改変することにより操作不可能とされ得る、つまり、P1およびP1'。この実施態様における他の側面において、BoNT/AのK448およびA449の両方が変換される;BoNT/AのS441およびL442の両方が変換される;BoNT/BのK441およびA442の両方が変換される;BoNT/BのG444およびI445の両方が変換される;BoNT/C1のK449およびT450の両方が変換される;BoNT/C1のS445およびL446の両方が変換される;BoNT/DのR445およびD446の両方が変換される;BoNT/DのK442およびN443の両方が変換される;BoNT/EのR422およびK423の両方が変換される;BoNT/EのK419およびG420の両方が変換される;BoNT/EのK423およびS424の両方が変換される;BoNT/FのK439およびA440の両方が変換される;BoNT/FのK436およびG437の両方が変換される;BoNT/GのK446およびS447の両方が変換される;BoNT/GのT444およびG445の両方が変換される;BoNT/GのE448およびQ449の両方が変換される;またはTeNTのA457およびS458の両方が変換される。
この実施態様の他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、例えば、二本鎖ループ領域にある少なくとも２つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも３つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも４つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも５つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも６つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも７つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも８つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも９つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも１０のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある少なくとも１５のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。この実施態様の更なる他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接するアミノ酸の１つ、および、例えば、二本鎖ループ領域にある少なくとも１以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも２以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも３以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも４以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも５以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも６以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも７以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも８以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも９以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも１０以上のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある少なくとも１５以上のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。この実施態様の更なる他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸および、例えば、二本鎖ループ領域にある少なくとも１以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも２以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも３以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも４以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも５以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも６以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも７以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも８以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも９以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある少なくとも１０以上のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある少なくとも１５以上のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。
この実施態様の他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、例えば、二本鎖ループ領域にある多くとも２つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも３つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも４つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも５つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも６つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも７つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも８つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも９つのアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも１０のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある多くとも１５のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。この実施態様の更なる他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接するアミノ酸の１つ、および、例えば、二本鎖ループ領域にある多くとも１以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも２以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも３以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも４以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも５以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも６以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも７以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも８以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも９以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも１０以上のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある多くとも１５以上のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。この実施態様の更なる他の側面において、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸および、例えば、二本鎖ループ領域にある多くとも１以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも２以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも３以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも４以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも５以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも６以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも７以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも８以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも９以上のアミノ酸；二本鎖ループ領域にある多くとも１０以上のアミノ酸；または、二本鎖ループ領域にある多くとも１５以上のアミノ酸を変換することによって、操作不可能とされる。
クロストリジウム毒素の二本鎖ループ領域は、いずれかおよび全てのクロストリジウム毒素基質切断部位を含むために修飾され得ことが想定される。この実施態様の側面において、本明細書で開示されるクロストリジウム毒素の２本鎖ループは、修飾され得て、例えば、BoNT/A基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位、またはBuNT 基質切断部位を含む。この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素の二本鎖ループは、修飾され得て、天然に存在するプロテアーゼ切断部位に加え、例えば、BoNT/ 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、またはTeNT 基質切断部位を含む。この実施態様の更に他の側面において、クロストリジウム毒素の二本鎖ループは、修飾され得て、天然に存在するプロテアーゼ切断部位を、例えば、BoNT/A基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位、またはBuNT 基質切断部位で置換する。
クロストリジウム毒素基質切断部位の位置は、部位の切断が、毒素の単一のジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基の間に起きなければならないことを条件として、クロストリジウム毒素のいずれであり得る。したがって、この実施態様の側面において、クロストリジウム毒素基質切断部位の位置は、例えば、切断が システイン 430 および システイン 454の間で起きることを条件として、配列番号: 1のBoNT/Aのいずれか;切断が システイン 437 および システイン446の間で起きることを条件として、配列番号: 2のBoNT/Bのいずれか;切断が システイン 437 および システイン 453の間で起きることを条件として、配列番号: 2のBoNT/C1のいずれか;切断が システイン 437 および システイン 450の間で起きることを条件として、配列番号: 4のBoNT/Dのいずれか; 切断が システイン 412 および システイン 426の間で起きることを条件として、配列番号: 5のBoNT/Eのいずれか;切断が システイン 429 および システイン 445の間で起きることを条件として、配列番号: 6のBoNT/Fのいずれか;切断が システイン 436 および システイン 450の間で起きることを条件として、配列番号: 7のBoNT/Gのいずれか;または、切断が システイン 439 および システイン 467の間で起きることを条件として、配列番号: 8のTeNTのいずれか、であり得る。
本明細書で開示される修飾クロストリジウム毒素は、任意に、１以上の付加的な成分を含みうる。任意の成分の非限定的な例として、修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、フレキシブルなスペーサーを含むフレキシブルな領域を含むことができる。フレキシブルなスペーサーの非限定的な例は、例えば、G-スペーサーGGGGS (配列番号: 156)または A-スペーサー EAAAK (配列番号: 157)を含む。フレキシブルなスペーサーを含むフレキシブルな領域は、ポリペプチドの特徴、特性または性質を最適化するためにポリペプチドの長さを調節するために使用され得る。かかるフレキシブルな領域は、フレームで、操作可能に融合蛋白質として修飾されたクロストリジウム毒素に結合される。非限定的な例として、タンデムに１以上のフレキシブルなスペーサーを含むポリペプチドの領域は、よりプロテアーゼ切断部位を露出し、それにより、プロテアーゼによる部位の切断を促進する。もう１つの非限定的な例として、タンデムに１以上のフレキシブルなスペーサーを含むポリペプチド領域は、よりリガンドドメインを提供し、それによって、リガンドドメインの受容体条のその結合ドメインへの結合を促進する。
したがって、１つの実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、フレキシブルなスペーサーを含むフレキシブルな領域を含む。もう１つの実施態様において、明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、複数のフレキシブルなスペーサーをタンデムで含むフレキシブルな領域を含む。この実施態様の側面において、フレキシブルな領域は、タンデムで、例えば、少なくとも 1のG-スペーサー、少なくとも 2のG-スペーサー、少なくとも 3のG-スペーサー、少なくとも 4のG-スペーサーまたは少なくとも 5 のG-スペーサーを含むことができる。この実施態様の他の側面において、フレキシブルな領域は、タンデムで、例えば、多くとも 1ののG-スペーサー、多くとも 2 のG-スペーサー、多くとも 3 のG-スペーサー、多くとも 4 のG-スペーサーまたは多くとも 5 のG-スペーサーを含むことができる。この実施態様の更に他の側面において、フレキシブルな領域は、タンデムで、例えば、少なくとも 1 のA-スペーサー、少なくとも 2 のA-スペーサー、少なくとも 3 のA-スペーサー、少なくとも 4 のA-スペーサーまたは少なくとも 5 のA-スペーサーを含むことができる。この実施態様の更に他の側面において、フレキシブルな領域は、タンデムで、例えば、多くとも 1 のA-スペーサー、多くとも 2 のA-スペーサー、多くとも 3 のA-スペーサー、多くとも 4 のA-スペーサーまたは多くとも 5 のA-スペーサーを含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、同一のフレキシブルなスペーサーの１以上のコピー、異なるフレキシブルなスペーサー領域の１以上のコピー、またはそれらの組合せを含むフレキシブルな領域を含むことができる。
任意の成分の非限定的な例として、修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、エピトープ結合領域を含むことができる。エピトープ結合領域は、例えば、蛋白質精製および蛋白質可視化を含む幅広いあらゆる手法に使用され得る。かかるエピトープ結合領域は、融合蛋白質として修飾されたクロストリジウム毒素にフレームで操作可能に結合される。エピトープ結合領域の非限定的な例は、例えば、FLAG, Express（登録商標）(配列番号: 158)、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルニチン (HA) (配列番号: 159)、ヒトp62c-Myc蛋白質 (c MYC) (配列番号: 160)、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G) (配列番号: 161)、サブスタンス P (配列番号: 162)、単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質-D前駆体(配列番号: 163)、V5 (配列番号: 164)、AU1 (配列番号: 165) および AU5 (配列番号: 166); アフィニティー結合 、例えば、ポリヒスチジン (HIS) (配列番号: 167)、ストレプトアビジン結合ペプチド (strep)、およびビオチンまたはビオチン化配列; ペプチド結合領域、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合領域、カルモジュリン結合蛋白質のカルモジュリン結合ドメイン、およびマルトース結合蛋白質のマルトース結合ドメインを含む。適切な結合ペプチドを選択し、作成しおよび使用するための特異的なプロトコルの非限定的な例は、例えば、Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3rd ed. 2001); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998);および USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)に記載されている。さらに、結合ペプチド並びによく特徴付けされた試薬の非限定的な例は、限定なしで、BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA;および Stratagene, La Jolla, CAを含む商業的な提供者から容易に入手可能である。これらのプロトコルは、当業者の見識内および本明細書が教える範囲内のルーチンな方法である。
したがって、１つの実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、エピトープ結合領域を含むことができる。もう１つの実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、複数のエピトープ結合領域を含むことができる。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、少なくとも 1のエピトープ結合領域、少なくとも 2のエピトープ結合領域、少なくとも 3のエピトープ結合領域、少なくとも 4のエピトープ結合領域または少なくとも 5のエピトープ結合領域を含むことができる。この実施態様の他の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、多くとも 1のエピトープ結合領域、多くとも 2のエピトープ結合領域、多くとも 3のエピトープ結合領域、多くとも 4のエピトープ結合領域または多くとも 5のエピトープ結合領域を含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、同一のエピトープ結合領域の１以上のコピー、異なるエピトープ結合領域の１以上のコピーまたはそれらの組合せを含むことができる。
エピトープ結合領域の位置は、限定なしで、修飾されたクロストリジウム毒素のアミノ末端で、修飾されたクロストリジウム毒素内で、または修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端で、を含むあらゆる位置であり得る。したがって、１つの実施態様において、エピトープ結合領域は、クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置する。かかる位置において、開始メチオニンは、エピトープ結合領域の前に置かれるべきである。さらに、開始メチオニンを含むもう１つのペプチドのアミノ末端に操作可能に連結されたポリペプチドを付加するとき、元のメチオニン残基は削除され得ることは、本分野において、知られている。これは、付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含み、そして、元の開始メチオニンは癒合蛋白質の最適な発現を低減させ得るという事実による。この実施態様の側面において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素のアミノ末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG, Express（登録商標）エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルニチン(HA) エピトープ結合領域、ヒトp62c-Myc 蛋白質 (c-MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンス P エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質-D前駆体エピトープ結合領域、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジンエピトープ結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合領域、カルモジュリン結合蛋白質のカルモジュリン結合ドメイン、およびマルトース結合蛋白質のマルトース結合ドメインであり得る。
もう１つの実施態様において、エピトープ結合領域は、修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置する。この実施態様の側面において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG, Express（登録商標）エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルニチン(HA) エピトープ結合領域、ヒトp62c-Myc 蛋白質 (c-MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンス P エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質-D前駆体エピトープ結合領域、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジンエピトープ結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合領域、カルモジュリン結合蛋白質のカルモジュリン結合ドメイン、およびマルトース結合蛋白質のマルトース結合ドメインであり得る。
任意の成分の更なるもう１つの非限定的な例として、修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、外因性のプロテアーゼ切断部位を含む。外因性のプロテアーゼ切断部位は、例えば、蛋白質性切断によるエピトープ結合領域の除去、を含む多様な手法により使用されることができる。かかる外因性のプロテアーゼ切断部位は、融合蛋白質として修飾されたクロストリジウム毒素にフレームで操作可能に結合される。外因性のプロテアーゼ切断部位の非限定的な例は、例えば、エンテロキナーゼ切断部位 (表９); トロンビン切断部位 (表９); Factor Xa 切断部位 (表９); ヒトライノウイルス3C プロテアーゼ 切断部位 (表９);タバコエッチウイルス（tobacco etch virus）(TEV)プロテアーゼ 切断部位 (表９); ジぺぷちじるアミノペプチダーゼ 切断部位および小さなユビキチン様修飾因子（small ubiquitin-like modifier）(SUMO)/ユビキチン様蛋白質-1(ULP-1) プロテアーゼ切断部位、例えば、MADSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSS EIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (配列番号: 185)を含む。
したがって、１つの実施態様において、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、外因性のプロテアーゼ切断部位を含む。もう１つの実施態様において、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、複数の外因性のプロテアーゼ切断部位を含む。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、少なくとも1の外因性のプロテアーゼ切断部位、少なくとも2の外因性のプロテアーゼ切断部位、少なくとも3の外因性のプロテアーゼ切断部位、少なくとも4の外因性のプロテアーゼ切断部位または少なくとも5の外因性のプロテアーゼ切断部位を含むことができる。この実施態様の他の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、多くとも1の外因性のプロテアーゼ切断部位、多くとも2の外因性のプロテアーゼ切断部位、多くとも3の外因性のプロテアーゼ切断部位、多くとも4の外因性のプロテアーゼ切断部位または多くとも5の外因性のプロテアーゼ切断部位を含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、同一の外因性プロテアーゼ切断部位の１以上のコピー、異なる外因性プロテアーゼ切断部位の１以上のコピー、またはそれらのいずれの組み合わせを含むことができる。
外因性プロテアーゼ切断部位の位置は、多様な位置であり得、例えば、限定なしで、蛋白質分解性切断によりエピトープ結合領域の除去が促進されるため、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間を含む。外因性プロテアーゼ切断部位が、エピトープ結合領域を取り除くために使用され得ることは想定される。上記のように、エピトープ結合領域は、蛋白質精製手法に使用され得、蛋白質が精製された後で、かかるエピトープ結合領域が取り除かれることがしばしば望ましい。それを実施する一般的な方法は、目的の蛋白質とエピトープ結合領域の間にプロテアーゼ切断部位を有することであり、それにより、プロテアーゼ切断部位の蛋白質分解性切断が、目的の蛋白質をエピトープ結合領域から分離する。エピトープ結合領域を取り除くのに使用されるプロテアーゼ切断部位の非限定的な例、並びに、よく特徴付けされたプロテアーゼ、試薬、条件およびプロトコルは、限定なしで、BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; および Stratagene, La Jolla, CAを含む商業的な供給者から容易に入手できる。適切なプロテアーゼ切断部位の選択、作成および使用は、当業者の見識の範囲および本明細書の教示からルーチンな手順である。
したがって、１つの実施態様において、外因性プロテアーゼ切断部位は、エピトープ結合ペプチドと修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する。この実施態様の他の側面において、ウシエンテロキナーゼ切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置し、タバコエッチウイルス切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置し、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置し、SUMO/ULP-1プロテアーゼ切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置し、トロンビンプロテアーゼ切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置し、または凝固因子Xaプロテアーゼ切断部位は、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する。この実施態様の他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置するウシエンテロキナーゼ切断部位は、配列番号：１６８を含む。この実施態様の他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置するタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は、配列番号: 169、配列番号: 170、配列番号: 171、配列番号: 172、配列番号: 173、配列番号: 174、配列番号: 175、配列番号: 176、配列番号: 177または 配列番号: 178を含む。この実施態様の更に他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する、ヒトライノウイルス3C プロテアーゼ切断部位は、配列番号: 179、配列番号: 180、配列番号: 181、配列番号: 182、配列番号: 183 または 配列番号: 184を含む。この実施態様の更に他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位は、配列番号: 185。この実施態様の更に他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する、トロンビンプロテアーゼ切断部位は、配列番号: 186、配列番号: 187、配列番号: 188、配列番号: 189、配列番号: 190、配列番号: 191、配列番号: 192、配列番号: 193、配列番号: 194、配列番号: 195、配列番号: 196、配列番号: 197、配列番号: 198、配列番号: 199 または 配列番号: 200を含む。この実施態様の他の側面において、エピトープ結合領域と修飾されたクロストリジウム毒素の間に位置する、凝固因子Xa プロテアーゼ切断部位は配列番号: 201 または 配列番号: 202を含む。
本発明の態様は、一部として、修飾されたクロストリジウム毒素を提供する。本明細書で使用されているように、用語「修飾されたクロストリジウム毒素」は、少なくとも天然に存在する二本鎖プロテアーゼ切断部位を本明細書で開示されるクロストリジウム毒素基質切断部位への置換、または本明細書で開示されるクロストリジウム毒素基質切断部位の二本鎖ループ領域への付加を含む、いずれの天然に存在するクロストリジウム毒素または天然に存在しないクロストリジウム毒素を意味する。本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素、ここで、基質切断部位は、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位に置換されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素、ここで、 基質切断部位は二本鎖ループ領域に付加されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素および天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる増強された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、基質切断部位は、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位に置換されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素 および天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる増強された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、基質切断部位は二本鎖ループ領域に付加されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素および天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、 基質切断部位は、天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位に置換されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素および天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、 基質切断部位は、二本鎖ループ領域に付加されている; クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素および天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、 基質切断部位は天然に存在する二本鎖ループプロテアーゼ切断部位に置換されている;および、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素および天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒にすることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメイン、ここで、基質切断部位は二本鎖ループ領域に付加されている、を含む。
本明細書で開示されるクロストリジウム足粗修飾の非限定的な例は、例えば天然に存在する二本鎖プロテアーゼ切断部位のクロストリジウム毒素基質切断部位への置換、クロストリジウム毒素基質切断部位の付加、外因性プロテアーゼ切断部位の付加、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増大された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインによる内因性細胞結合ドメインの置換、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増大された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインの付加、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインによる内因性細胞結合ドメインの置換、天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインの付加、天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインによる、内因性細胞結合ドメインの置換、天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性を有する細胞結合ドメインの付加、addition of an 外因性プロテアーゼ切断部位、酵素、トランスロケーションおよび結合ドメインの再構成、スペーサー領域の付加およびエピトープ結合領域の付加、を含む。
かかる修飾は、クロストリジウム毒素が細胞を中毒させる能力に実質的に影響しないと理解される。本明細書で使用されるように、用語「実質的に影響しない」は、クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質の放出を阻害し、そして、クロストリジウム毒素の低または高親和性受容体複合体への結合、毒素／受容体複合体の内部移行、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質へのトランスロケーションおよびクロストリジウム毒素の酵素的修飾を含む全体的な細胞メカニズムをなお実行できることを意味する。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも10%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも20%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも30%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも40%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも50%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも60%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも70%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも80%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の少なくとも90%の毒性を示すまたは天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも95%の毒性を示す。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素は、例えば、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも10%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも20%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも30%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも40%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも50%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも60%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも70%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも80%の毒性を示す、天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも90%の毒性を示すまたは天然に存在するクロストリジウム毒素の多くとも95%の毒性を示す。
本発明の実施態様は、一部として、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド分子」は「核酸分子」と同義であり、ポリマー形態の核酸、例えば、いろいろな長さのリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを意味する。本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素をコードすることができるいずれの、および全てのポリヌクレオチド分子は有用であり得、限定なしで、天然に存在する、または天然に存在しないＤＮＡ分子および天然に存在する、または天然に存在しないＲＮＡ分子を含む。天然に存在する、または天然に存在しないＤＮＡ分子の非限定的な例は、二本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＡＮ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクター構築物、例えば、プラスミド構築物、ファージミド構築物、バクテリオファージ構築物、レトロウイルス構築物および人工的染色体構築物を含む。天然に存在する、または天然に存在しないＲＮＡ分子の非限定的な例は、単鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む。
したがって、１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインおよびクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するクロストリジウム毒素改変体、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォームまたはクロストリジウム毒素サブタイプを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないクロストリジウム毒素改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体または活性のあるクロストリジウム毒素フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素酵素ドメインまたはその活性なフラグメント、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインまたはその活性なフラグメント、クロストリジウム毒素結合ドメインまたはその活性なフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせ、を含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の他の側面において、クロストリジウム毒素は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTを含む。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Aを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/AトランスロケーションドメインおよびBoNT/A結合ドメインを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：１を含むBoNT/Aをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/A改変体、例えば、BoNT/AアイソフォームまたはBoNT/Aサブタイプを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：１の天然に存在するBoNT/A改変体、例えば、配列番号：１のBoNT/Aアイソフォームまたは配列番号：１のBoNT/Aサブタイプを含む、BoNT/Aをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/A改変体、例えば、保存的なBoNT/A改変体、非保存的なBoNT/A改変体または活性なBoNT/Aフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：１の天然に存在しないBoNT/A改変体、例えば、配列番号：１の保存的なBoNT/A改変体、配列番号：１の非保存的なBoNT/A改変体または配列番号：１の活性なBoNT/Aフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Aをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/A酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Aトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/A結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Aをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号: 1からのアミノ酸1-448のBoNT/A酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号: 1からのアミノ酸449-860のBoNT/Aトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号: 1からのアミノ酸861-1296のBoNT/A結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Aをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：１と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：１と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：１と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Aをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Bを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/BトランスロケーションドメインおよびBoNT/B結合ドメインを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：２を含むBoNT/Bをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/B改変体、例えば、BoNT/BアイソフォームまたはBoNT/Bサブタイプを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：２の天然に存在するBoNT/B改変体、例えば、配列番号：２のBoNT/Bアイソフォームまたは配列番号：２のBoNT/Bサブタイプを含む、BoNT/Bをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/B改変体、例えば、保存的なBoNT/B改変体、非保存的なBoNT/B改変体または活性なBoNT/Bフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：２の天然に存在しないBoNT/B改変体、例えば、配列番号：２の保存的なBoNT/B改変体、配列番号：２の非保存的なBoNT/B改変体または配列番号：２の活性なBoNT/Bフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Bをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/B酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Bトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/B結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Bをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：２からのアミノ酸1-441のBoNT/B酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：２からのアミノ酸442-847のBoNT/Bトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：２からのアミノ酸848-1291のBoNT/B結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Bをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：２と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：２と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：２と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Bをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/C1を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/C1トランスロケーションドメインおよびBoNT/C1結合ドメインを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：３を含むBoNT/C1をコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/C1改変体、例えば、BoNT/C1アイソフォームまたはBoNT/C1サブタイプを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：３の天然に存在するBoNT/C1改変体、例えば、配列番号：３のBoNT/C1アイソフォームまたは配列番号：３のBoNT/C1サブタイプを含む、BoNT/C1をコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/C1改変体、例えば、保存的なBoNT/C1改変体、非保存的なBoNT/C1改変体または活性なBoNT/C1フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：３の天然に存在しないBoNT/C1改変体、例えば、配列番号：３の保存的なBoNT/C1改変体、配列番号：３の非保存的なBoNT/C1改変体または配列番号：３の活性なBoNT/C1フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1をコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/C1酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/C1トランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/C1結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1をコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：３からのアミノ酸1-449のBoNT/C1酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：３からのアミノ酸450-855のBoNT/C1トランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：３からのアミノ酸856-1291のBoNT/C1結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：３と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：３と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：３と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1をコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Dを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/DトランスロケーションドメインおよびBoNT/D結合ドメインを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：４を含むBoNT/Dをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/D改変体、例えば、BoNT/DアイソフォームまたはBoNT/Dサブタイプを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：４の天然に存在するBoNT/D改変体、例えば、配列番号：４のBoNT/Dアイソフォームまたは配列番号：４のBoNT/Dサブタイプを含む、BoNT/Dをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/D改変体、例えば、保存的なBoNT/D改変体、非保存的なBoNT/D改変体または活性なBoNT/Dフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：４の天然に存在しないBoNT/D改変体、例えば、配列番号：４の保存的なBoNT/D改変体、配列番号：４の非保存的なBoNT/D改変体または配列番号：４の活性なBoNT/Dフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Dをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/D酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Dトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/D結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Dをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：４からのアミノ酸1-442のBoNT/D酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：４からのアミノ酸443-851のBoNT/Dトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：４からのアミノ酸852-1276のBoNT/D結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Dをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：４と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：４と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：４と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Dをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Eを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/EトランスロケーションドメインおよびBoNT/E結合ドメインを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：５を含むBoNT/Eをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/E改変体、例えば、BoNT/EアイソフォームまたはBoNT/Eサブタイプを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：５の天然に存在するBoNT/E改変体、例えば、配列番号：５のBoNT/Eアイソフォームまたは配列番号：５のBoNT/Eサブタイプを含む、BoNT/Eをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/E改変体、例えば、保存的なBoNT/E改変体、非保存的なBoNT/E改変体または活性なBoNT/Eフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：５の天然に存在しないBoNT/E改変体、例えば、配列番号：５の保存的なBoNT/E改変体、配列番号：５の非保存的なBoNT/E改変体または配列番号：５の活性なBoNT/Eフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Eをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/E酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Eトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/E結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Eをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：５からのアミノ酸1-422のBoNT/E酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：５からのアミノ酸423-834のBoNT/Eトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：５からのアミノ酸835-1252のBoNT/E結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Eをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：５と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：５と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：５と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：５に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Eをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Fを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/F酵素ドメイン、BoNT/FトランスロケーションドメインおよびBoNT/F結合ドメインを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：６を含むBoNT/Fをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/F改変体、例えば、BoNT/FアイソフォームまたはBoNT/Fサブタイプを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：６の天然に存在するBoNT/F改変体、例えば、配列番号：６のBoNT/Fアイソフォームまたは配列番号：６のBoNT/Fサブタイプを含む、BoNT/Fをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/F改変体、例えば、保存的なBoNT/F改変体、非保存的なBoNT/F改変体または活性なBoNT/Fフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：６の天然に存在しないBoNT/F改変体、例えば、配列番号：６の保存的なBoNT/F改変体、配列番号：６の非保存的なBoNT/F改変体または配列番号：６の活性なBoNT/Fフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Fをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/F酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Fトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/F結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Fをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：６からのアミノ酸1-436のBoNT/F酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：６からのアミノ酸437-852のBoNT/Fトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：６からのアミノ酸853-1274のBoNT/F結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Fをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：６と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：６と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：６と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：６に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Fをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/Gを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/G酵素ドメイン、BoNT/GトランスロケーションドメインおよびBoNT/G結合ドメインを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：７を含むBoNT/Gをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/G改変体、例えば、BoNT/GアイソフォームまたはBoNT/Gサブタイプを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：７の天然に存在するBoNT/G改変体、例えば、配列番号：７のBoNT/Gアイソフォームまたは配列番号：７のBoNT/Gサブタイプを含む、BoNT/Gをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/G改変体、例えば、保存的なBoNT/G改変体、非保存的なBoNT/G改変体または活性なBoNT/Gフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：７の天然に存在しないBoNT/G改変体、例えば、配列番号：７の保存的なBoNT/G改変体、配列番号：７の非保存的なBoNT/G改変体または配列番号：７の活性なBoNT/Gフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Gをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、BoNT/G酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/Gトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、BoNT/G結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Gをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：７からのアミノ酸1-442のBoNT/G酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：７からのアミノ酸443-852のBoNT/Gトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：７からのアミノ酸853-1297のBoNT/G結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/Gをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：７と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：７と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：７と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むBoNT/Gをコードする。
もう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、TeNTを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、TeNT酵素ドメイン、TeNTトランスロケーションドメインおよびTeNT結合ドメインを含むTeNTをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：８を含むTeNTをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するTeNT改変体、例えば、TeNTアイソフォームまたはTeNTサブタイプを含むTeNTをコードする。この実施態様のもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：８の天然に存在するTeNT改変体、例えば、配列番号：８のTeNTアイソフォームまたは配列番号：８のTeNTサブタイプを含む、TeNTをコードする。この実施態様の更なるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないTeNT改変体、例えば、保存的なTeNT改変体、非保存的なTeNT改変体または活性なTeNTフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含むTeNTをコードする。この実施態様の更なるもう１つ側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号：８の天然に存在しないTeNT改変体、例えば、配列番号：８の保存的なTeNT改変体、配列番号：８の非保存的なTeNT改変体または配列番号：８の活性なTeNTフラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、TeNTをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、TeNT酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、TeNTトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、TeNT結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、TeNTをコードする。この実施態様のさらにもう１つの側面において、配列番号：８からのアミノ酸1-441のTeNT酵素ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：８からのアミノ酸442-870のTeNTトランスロケーションドメインまたはそれらの活性なフラグメント、配列番号：８からのアミノ酸871-1315のTeNT結合ドメインまたはそれらの活性なフラグメント、およびそれらのいずれの組み合わせを含む、TeNTをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：８と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８と多くとも70%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも75%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも80%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも85%アミノ酸同一性、配列番号：８と多くとも90%アミノ酸同一性または配列番号：８と多くとも95%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の非連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の更なる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：８に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、200または500の連続的なアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むTeNTをコードする。
さらなるもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、例えば、クロストリジウム毒素基質切断部位アイソフォームまたはクロストリジウム毒素基質切断部位サブタイプを含むクロストリジウム毒素基質切断部位をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体またはクロストリジウム毒素基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせ、を含むクロストリジウム毒素基質切断部位をコードする。
この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、P1'残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質に天然に存在する残基に比較して、修飾されない、または置換されない、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、P1'残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質に天然に存在する残基、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位またはBuNT 基質切断部位に比較して、修飾されない、または置換されない、クロストリジウム毒素基質切断部位をコードする。
この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、P1残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質に天然に存在する残基に比較して、修飾されまたは置換される、クロストリジウム毒素基質切断部位を含み；かかるクロストリジウム毒素基質は、P1およびP1’残基の間のペプチド結合切断に対する感受性が保持されている。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、、P1'残基が、クロストリジウム毒素により切断される標的蛋白質に天然に存在する残基、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位またはBuNT 基質切断部位に比較して、修飾され、または置換される、クロストリジウム毒素基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Gln-Argを含むSNAP-25の少なくとも６連続残基を含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (配列番号: 104); アミノ酸配列 Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys (配列番号: 105); アミノ酸配列 Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys (配列番号: 106)を含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/A基質切断部位改変体を含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の天然に存在するBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位サブタイプを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/A基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/A基質切断部位改変体またはBoNT/A基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の天然に存在しないBoNT/A基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の保存的なBoNT/A基質切断部位改変体、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106の非保存的なBoNT/A基質切断部位改変体または配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106のBoNT/A基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号: 133、配列番号: 134、配列番号: 135、配列番号: 136、配列番号: 138、配列番号: 141、配列番号: 148、配列番号: 150または配列番号: 151を含むBoNT/A基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０４と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０４と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０４と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０４に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/A基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/B基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号: 107); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (配列番号: 108); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (配列番号: 109); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (配列番号: 110); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (配列番号: 111); またはアミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (配列番号: 112)を含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/B基質切断部位改変体を含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在するBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位サブタイプを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/B基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/B基質切断部位改変体またはBoNT/B基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在しないBoNT/B基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の保存的なBoNT/B基質切断部位改変体、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の非保存的なBoNT/B基質切断部位改変体または配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/B基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/B基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/C1基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Lys-Alaを含むSyntaxinの少なくとも６連続残基を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 113); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr (配列番号: 114); アミノ酸配列 Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 115); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr (配列番号: 116); アミノ酸配列 Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号: 117); アミノ酸配列 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr (配列番号: 118);またはアミノ酸配列 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr (配列番号: 119)を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119の天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位サブタイプを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体またはBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119の天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119の保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119の非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体または配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118または配列番号: 119のBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１１３と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１１３と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１１３と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１１３に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、Arg-Alaを含むSNAP-25の少なくとも６連続残基を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号: 120);またはアミノ酸配列Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu (配列番号: 121)を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体を含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 120または配列番号: 121の天然に存在するBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 120または配列番号: 121のBoNT/C1基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 120または配列番号: 121のBoNT/C1基質切断部位サブタイプを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体またはBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 120または配列番号: 121の天然に存在しないBoNT/C1基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 120または配列番号: 121の保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体、配列番号: 120または配列番号: 121の非保存的なBoNT/C1基質切断部位改変体または配列番号: 120または配列番号: 121のBoNT/C1基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２０と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２０と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２０と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２０に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/C1基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/D基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Lys-Leuを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (配列番号: 122);またはアミノ酸配列Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu (配列番号: 123)を含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/D基質切断部位改変体を含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 122または配列番号: 123の天然に存在するBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位サブタイプを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/D基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/D基質切断部位改変体またはBoNT/D基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 122または配列番号: 123の天然に存在しないBoNT/D基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 122または配列番号: 123の保存的なBoNT/D基質切断部位改変体、配列番号: 122または配列番号: 123の非保存的なBoNT/D基質切断部位改変体または配列番号: 122または配列番号: 123のBoNT/D基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/D基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２２と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２２と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２２と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２２に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/D基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/E基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Arg-Ileを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (配列番号: 124); アミノ酸配列Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys (配列番号: 125); アミノ酸配列Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met (配列番号: 126); アミノ酸配列Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys (配列番号: 127);またはアミノ酸配列Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys (配列番号: 128)を含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/E基質切断部位改変体を含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128の天然に存在するBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128のBoNT/E基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128のBoNT/E基質切断部位サブタイプを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/E基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/E基質切断部位改変体またはBoNT/E基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128の天然に存在しないBoNT/E基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128の保存的なBoNT/E基質切断部位改変体、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128の非保存的なBoNT/E基質切断部位改変体または配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127または配列番号: 128のBoNT/E基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/E基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２４と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２４と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２４と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２４に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/E基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/F基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Gln-Lysを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (配列番号: 129);またはアミノ酸配列Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu (配列番号: 130)を含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/F基質切断部位改変体を含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 129または配列番号: 130の天然に存在するBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位サブタイプを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/F基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/F基質切断部位改変体またはBoNT/F基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 129または配列番号: 130の天然に存在しないBoNT/F基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 129または配列番号: 130の保存的なBoNT/F基質切断部位改変体、配列番号: 129または配列番号: 130の非保存的なBoNT/F基質切断部位改変体または配列番号: 129または配列番号: 130のBoNT/F基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/F基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２９と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１２９と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１２９と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１２９に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/F基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、BoNT/G基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Ala-Alaを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (配列番号: 131);またはアミノ酸配列Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (配列番号: 132)を含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するBoNT/G基質切断部位改変体を含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 131または配列番号: 132の天然に存在するBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位アイソフォームまたは配列番号: 配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位サブタイプを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、保存的なBoNT/G基質切断部位改変体、非保存的なBoNT/G基質切断部位改変体またはBoNT/G基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 131または配列番号: 132の天然に存在しないBoNT/G基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 131または配列番号: 132の保存的なBoNT/G基質切断部位改変体、配列番号: 131または配列番号: 132の非保存的なBoNT/G基質切断部位改変体または配列番号: 131または配列番号: 132のBoNT/G基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、BoNT/G基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１３１と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１３１と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１３１と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１３１に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むBoNT/G基質切断部位をコードする。
更にもう１つの実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、TeNT基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードする。この実施態様の側面において、ポリヌクレオチド分子は、Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６連続残基を含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号: 107); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (配列番号: 108); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (配列番号: 109); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (配列番号: 110); アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (配列番号: 111); or アミノ酸配列 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (配列番号: 112)を含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するTeNT基質切断部位改変体を含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様のもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在するTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォームのような、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位アイソフォーム、または配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォームのような、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位サブタイプを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様のさらなる他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、天然に存在しないTeNT基質切断部位改変体、例えば、保存的なTeNT基質切断部位改変体、非保存的なTeNT基質切断部位改変体またはTeNT基質切断部位ペプチド模倣体、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、TeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更なるもう１つの側面において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の天然に存在しないTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の保存的なTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォーム；配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112の非保存的なTeNT基質切断部位改変体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質基質切断部位アイソフォーム；または配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のTeNT基質切断部位ペプチド模倣体、例えば、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111または配列番号: 112のBoNT/B基質切断部位アイソフォーム、またはそれらのいずれの組み合わせを含む、TeNT基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７と少なくとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と少なくとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と少なくとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７と多くとも50%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも62.5%アミノ酸同一性、配列番号：１０７と多くとも75%アミノ酸同一性または配列番号：１０７と多くとも87.5%アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも１、２、または３の非連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。
この実施態様の他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更に他の側面において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、多くとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。この実施態様の更なる他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号：１０７に比較して、少なくとも２または３の連続的なアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含むTeNT基質切断部位をコードする。
更なる他の実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに、フレキシブルなスペーサーを含むフレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子を含む。もう１つの実施態様において、明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに、複数のフレキシブルなスペーサーをタンデムで含むフレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子を含む。この実施態様の側面において、フレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子は、タンデムで、例えば、少なくとも 1のG-スペーサー、少なくとも 2のG-スペーサー、少なくとも 3のG-スペーサー、少なくとも 4のG-スペーサーまたは少なくとも 5 のG-スペーサーを含むことができる。この実施態様の他の側面において、フレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子は、タンデムで、例えば、多くとも 1ののG-スペーサー、多くとも 2 のG-スペーサー、多くとも 3 のG-スペーサー、多くとも 4 のG-スペーサーまたは多くとも 5 のG-スペーサーを含むことができる。この実施態様の更に他の側面において、フレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子は、タンデムで、例えば、少なくとも 1 のA-スペーサー、少なくとも 2 のA-スペーサー、少なくとも 3 のA-スペーサー、少なくとも 4 のA-スペーサーまたは少なくとも 5 のA-スペーサーを含むことができる。この実施態様の更に他の側面において、フレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子は、タンデムで、例えば、多くとも 1 のA-スペーサー、多くとも 2 のA-スペーサー、多くとも 3 のA-スペーサー、多くとも 4 のA-スペーサーまたは多くとも 5 のA-スペーサーを含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、同一のフレキシブルなスペーサーの１以上のコピー、異なるフレキシブルなスペーサー領域の１以上のコピー、またはそれらの組合せを含むフレキシブルな領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。
更にもう１つの実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。もう１つの実施態様において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素は、さらに、複数のエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、エピトープ結合領域をコードする少なくとも 1のポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも 2ポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも 3のポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも 4のポリヌクレオチド分子またはエピトープ結合領域をコードする少なくとも 5のポリヌクレオチド分子を含むことができる。この実施態様の他の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、エピトープ結合領域をコードする多くとも 1のポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも 2ポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも 3のポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも 4のポリヌクレオチド分子またはエピトープ結合領域をコードする多くとも 5のポリヌクレオチド分子を含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域コードする同一のポリヌクレオチド分子の１以上のコピー、エピトープ結合領域コードする異なるポリヌクレオチド分子の１以上のコピーまたはそれらの組合せを含むことができる。エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子の位置は、あらゆる位置であり得、限定なしで、修飾されたクロストリジウム毒素のアミノ末端、修飾されたクロストリジウム毒素内、または修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端を含む。
この実施態様の１つの側面において、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子は、修飾されたクロストリジウム毒素のアミノ末端に位置する。この実施態様の側面において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素のアミノ末端に位置するエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、FLAG, Express（登録商標）エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルニチン(HA) エピトープ結合領域、ヒトp62c-Myc 蛋白質 (c-MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンス P エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質-D前駆体エピトープ結合領域、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジンエピトープ結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合領域、カルモジュリン結合蛋白質のカルモジュリン結合ドメイン、およびマルトース結合蛋白質のマルトース結合ドメインであり得る。
もう１つの実施態様において、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子は、修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置する。この実施態様の側面において、本明細書で開示される修飾されたクロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置するエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、FLAG, Express（登録商標）エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルニチン(HA) エピトープ結合領域、ヒトp62c-Myc 蛋白質 (c-MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンス P エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質-D前駆体エピトープ結合領域、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジンエピトープ結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合領域、カルモジュリン結合蛋白質のカルモジュリン結合ドメイン、およびマルトース結合蛋白質のマルトース結合ドメインであり得る。
さらにもう１つの実施態様において、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子を含む。もう１つの実施態様において、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに、複数の外因性のプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子を含む。この実施態様の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも1のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも２のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも３のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも４のポリヌクレオチド分子または外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも５のポリヌクレオチド分子を含むことができる。この実施態様の他の側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする多くとも1のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする多くとも２のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする多くとも３のポリヌクレオチド分子、外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする多くとも４のポリヌクレオチド分子または外因性のプロテアーゼ切断部位をコードする多くとも５のポリヌクレオチド分子を含むことができる。この実施態様のもう１つの側面において、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、同一の外因性プロテアーゼ切断部位の１以上のコピー、異なる外因性プロテアーゼ切断部位の１以上のコピー、またはそれらのいずれの組み合わせを含むことができる。
更なるもう１つの実施態様において、外因性プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の他の側面において、ウシエンテロキナーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置し、タバコエッチウイルス切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置し、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置し、SUMO/ULP-1プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置し、トロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置し、または凝固因子Xaプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の他の側面において、配列番号：１６８のウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の他の側面において、配列番号: 169、配列番号: 170、配列番号: 171、配列番号: 172、配列番号: 173、配列番号: 174、配列番号: 175、配列番号: 176、配列番号: 177または 配列番号: 178のタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の更に他の側面において、配列番号: 179、配列番号: 180、配列番号: 181、配列番号: 182、配列番号: 183 または 配列番号: 184のヒトライノウイルス3C プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の更に他の側面において、配列番号: 185のSUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の更に他の側面において、配列番号: 186、配列番号: 187、配列番号: 188、配列番号: 189、配列番号: 190、配列番号: 191、配列番号: 192、配列番号: 193、配列番号: 194、配列番号: 195、配列番号: 196、配列番号: 197、配列番号: 198、配列番号: 199 または 配列番号: 200のトロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。この実施態様の他の側面において、配列番号: 201 または 配列番号: 202の凝固因子Xa プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置する。
本発明のもう１つの態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素を製造する方法を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、二本鎖ループ領域の中に位置し、かかる方法は、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内で発現させる工程を含む。本発明のもう１つの態様は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素を製造する方法を提供し、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位、二本鎖ループ領域の中に位置し、かかる方法は、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を細胞内に導入し、そして、発現構築物を細胞内で発現させる工程を含む。
本明細書で開示される方法は、一部として、クロストリジウム毒素を含む。本明細書で開示されるいずれのおよび全てのクロストリジウム毒素は、本明細書で開示される方法を用いて製造され得ることは想定される。したがって、この実施態様の側面において、限定なしで、天然に存在するクロストリジウム毒素、天然に存在するクロストリジウム毒素改変体、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプ、天然に存在しないクロストリジウム毒素改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体およびそれらのクロストリジウム毒素フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせの製造を含む。
本明細書で開示される方法は、一部として、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む。本明細書で開示されるいずれのおよび全てのクロストリジウム毒素基質切断部位は、本明細書で開示される方法を用いて製造されることができることは想定される。したがって、この実施態様の側面において、限定なしで、天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位、天然に存在するクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、例えば、クロストリジウム毒素基質切断部位アイソフォームおよびクロストリジウム毒素基質切断部位サブタイプ、天然に存在しないクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、例えば、保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体、非保存的なクロストリジウム毒素基質切断部位改変体およびそれらのクロストリジウム毒素基質切断部位フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせの製造を含む。
本明細書で開示される方法は、一部として、ポリヌクレオチド分子を含む。いずれのおよび全ての本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子が使用され得ることは想定される。したがって、この実施態様の側面は、限定なしで、天然に存在するクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子；天然に存在するクロストリジウム毒素改変体、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプをコードするポリヌクレオチド分子；天然に存在しないクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子、例えば、保存的なクロストリジウム毒素改変体、非保存的なクロストリジウム毒素改変体およびそれらのクロストリジウム毒素フラグメント、またはそれらのいずれの組み合わせをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
本明細書で開示される方法は、一部として、発現構築物を含む。発現構築物は、細胞で、または無細胞抽出物でポリヌクレオチド分子を発現させるために有用な発現ベクターに操作可能に連結された本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子を含む。あらゆる発現ベクターが修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために採用されることができ、限定なしで、ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターおよび哺乳動物発現ベクター；および無細胞抽出物発現ベクターを含む。これらの方法の態様を実施するために有用な発現ベクターは、修飾されたクロストリジウム毒素を、構成的な、組織特異的な、細胞特異的な、または誘導プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、またはその両方の制御下で発現させるものを含み得ることは、さらに理解され得る。発現ベクターの非限定的な例は、かかる発現ベクターからの発現構築物を作成し、そして使用するためのよく確立された試薬および条件と共に、限定なしで、BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; および Stratagene, La Jolla, CAを含む、商業的な供給者から容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、作成および使用は、当業者の見識内および本明細書の教示からルーチンな手法である。
したがって、この実施態様の側面は、限定なしで、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に操作可能に連結されたウイルス発現ベクター;修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に操作可能に連結された原核生物発現ベクター;修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に操作可能に連結された酵母発現ベクター;修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に操作可能に連結された昆虫発現ベクター;および修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に操作可能に連結された哺乳類発現ベクターを含む。この実施態様の他の側面は、限定なしで、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子と操作可能に連結した無細胞抽出物発現ベクターを含む無細胞抽出物を使用する本明細書で開示されるクロストリジウム毒素を発現させるために適した発現構築物、を含む。この実施態様の他の側面は、限定なしで、配列番号: 109から配列番号: 132 および 配列番号: 136 から 配列番号: 159のいずれかを含むポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を含む。この実施態様の他の側面は、限定なしで、配列番号: 85 から 配列番号: 108のいずれかを含む修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を含む。
本明細書で開示される方法は、一部として、細胞を含む。いずれのおよび全ての細胞が使用され得ることが想定される。したがって、この実施態様の側面は、限定なしで、原核生物細胞（限定なしで、好気性、微好気性、カプノフィリック（capnophilic）、通性（facultative）、嫌気性、グラム陰性およびグラム陽性の細菌細胞種、例えば、エシェリキア コリ（Escherichia coli）、バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス リケニフォルムス（Bacillus licheniformis）、バクテロイデス フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリディア ペルフリンゲンス（Clostridia perfringens）、クロストリディア ディフィシル（Clostridia difficile）、カウロバクター クレセンタス（Caulobacter crescentus）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）、メチロバクテリウム エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）、ナイセリア メニンギラルス（Neisseria meningirulls）、ナイセリア メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimuriumから由来されるものを含む）;および真核生物細胞（限定なしで、酵母種、例えば、ピチア パストリス（Pichia pastoris）、ピチア メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア アンガスタ（Pichia angusta）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）および ヤロヴィア リポリティカ（Yarrowia lipolytica）由来のもの；昆虫細胞および昆虫由来の細胞株、例えば、スポンドプテラ フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）、トリコプラシア ニ（Trichoplusia ni）、ドルソフィラ メラノガスター（Drosophila melanogaster）およびたばこスズメガ（Manduca sexta）由来のもの；および哺乳類細胞および哺乳類由来の細胞株、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒト由来のものを含む）を含む。細胞株は、American Type Culture Collection (2004); European Collection of Cell Cultures (2204); および the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (2004)から得ることができる。適切な細胞株の選択、作成および使用のための特異的なプロトコルの非限定的な例は、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED 態様 (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002);およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004)に記載されている。これらのプロトコルは、当業者の見識内および本明細書の教示からルーチンな方法である。
本明細書で開示される方法は、一部として、細胞へのポリヌクレオチド分子の導入を含む。細胞へ導入されるポリヌクレオチド分子は、細胞により、一過的に、または安定的に保持されることができる。安定的に保持されるポリヌクレオチド分子は、染色体外（extra-chromosomal）で、自立的に複製し得るか、または、それらは細胞の染色体物質の中に組み込まれ、非自立的に複製され得る。本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子の細胞へ導入するためのいずれかおよび全ての方法が使用され得ることが想定される。細胞へ核酸分子を導入するために有用な方法は、限定なしで、化学的媒介トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム媒介、ジエチルアミノエチル（DEAE）デキストラン媒介、脂質媒介、ポリエチレンイミン（PEI）媒介およびポリリジン媒介；物理的媒介トランスフェクション、例えば、バイオリスティックパーティクル（biolistic particle）運搬、マイクロインジェクション、プロトプラストフュージョンおよびエレクトロポレーション；およびウイルス媒介トランスフェクション、例えば、レトロウイルス媒介トランスフェクション、を含む（例えば、Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001)を、参照）。当業者は、発現構築物を細胞に導入する特異的な方法の選択が、部分的に、細胞が一過的に発現構築物を含むのか、または細胞が安定的に発現構築物を含むのかに依存することを理解する。これらのプロトコルは、当業者の見識内および本明細書から教示されるルーチンな方法である。
この実施態様の側面において、トランスフェクションについての化学的媒介方法が、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。化学的媒介トランスフェクション方法において、化学的試薬は、核酸と複合体を形成し、細胞への取り込みを促進する。かかる化学的試薬は、限定なしで、リン酸カルシウム媒介、例えば、Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)参照; ジエチル-アミノエチル (DEAE) デキストラン媒介、脂質媒介ポリエチレンイミン(PEI)媒介およびポリリジン媒介のようなカチオン性ポリマー媒介、および ポリブレン媒介、例えば、Chun Zhang et al., Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain-Derived Cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)を、参照）を含む。かかる化学的媒介運搬システムは、標準的な方法によって準備され得、商業的に入手可能である、例えば、CellPhect Transfection Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); Lipofectamine（登録商標） Transfection Reagent (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection kit (Fermentas, Inc., Hanover, MD), および SuperFect and Effectene Transfection Kits (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を参照。
この実施態様のもう１つの側面において、物理的媒介方法が、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。物理的技術は、限定なしで、エレクトロポレーション、バイオリスティックおよびマイクロインジェクションを含む。バイオリスティックおよびマイクロインジェクション技術は、核酸分子を細胞内へ導入するために細胞壁へ穴を開ける、例えば、Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-Mediated Gene Transfer in Neurons Using the Biolistics Technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); および John O’Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and Diolistic Transfection: Using the Gene Gun to Deliver DNA and Lipophilic Dyes into Mammalian Cells, 33(2) Methods 121-125 (2004)を参照。エレクトロポレーション、または電気浸透とも呼ばれる、短く、高電圧の、電気的パルスを用い、核酸分子が侵入する膜における一過的な穴をつくり、全ての細胞種の安定的で一過的なトランスフェクションのために、効果的に使用され得る、例えば、M. Golzio et al., In vitro and in vivo Electric Field-Mediated Permeabilization, Gene Transfer, and Expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); および Oliver Greschet al., New Non-Viral Method for Gene Transfer into Primary Cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)を参照。
この実施態様のもう１つの側面において、トランスフェクションに用いるウイルス媒介方法が、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。一過性トランスフェクションのウイルス媒介方法において、ウイルス粒子が宿主細胞において感染し、複製するプロセスが操作され、このメカニズムを、核酸分子を細胞内へ導入するために使用される。ウイルス媒介方法は、限定なしで、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナ・ウイルス、アルファウイルスおよびバキュロウイルスを含む多様なウイルスから開発されてきた、例えば、Armin Blesch, Lentiviral and MLV based Retroviral Vectors for ex vivo and in vivo Gene Transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); and Maurizio Federico, From Lentiviruses to Lentivirus Vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-Primate Lentiviral Vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus Vectors for Gene Delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-Associated Viral Vectors for Gene Transfer and Gene Therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and Adeno-Associated Virus Vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene Delivery Using Herpes Simplex Virus Vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV Amplicon Vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-Based Expression Vectors: Strategies and Applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral Gene Transfer in Neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant Baculoviruses as Mammalian Cell Gene-Delivery Vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); および A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus Vectors: Novel Mammalian Cell Gene-Delivery Vehicles and Their Applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)を、参照。
アデノウイルスは、エンベロープのない二本鎖ＤＮＡウイルスであり、アデノウイルスが、約３６ｋｂの比較的大きなポリヌクレオチド分子を取り扱い、高いタイターで製造され、そして、多様な分裂および非分裂の両方の細胞に効率的に感染することができるので、哺乳類細胞の形質導入によく選択される、例えば、Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient Gene Transfer to Neurons and Glia: Analysis of Adenoviral Vector Performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); および Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for Generating Recombinant Adenovirus Vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001)を参照。アデノウイルスを基本にした系を用いる形質導入は、核酸分子が、宿主細胞の染色体に組み込まれるよりも、エピソームから細胞の核へ運ばれるので、持続的な蛋白質発現を支持しない。アデノウイルス系およびかかるベクターの使用の特異的なプロトコルは、例えば、ViraPower（登録商標） Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and ViraPower（登録商標） Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); and AdEasy（登録商標） Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA)および AdEasy（登録商標） Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.に開示される。
核酸分子運搬は、また、例えば、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルス等の一本鎖ＲＮＡレトロウイルスを使用することができる。レトロウイルス媒介形質導入は、また、１００％に近い遺伝子導入効率を生産し、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させることによりプロウイルスのコピー数を容易に制御でき、そして、一過的または安定的な形質導入細胞に使用され得る、例えば、Tiziana Tonini et al., Transient Production Of Retroviral- and Lentiviral-Based Vectors For the Transduction of Mammalian Cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV Based Retroviral Vectors for ex vivo and in vivo Gene Transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Faelix Recillas-Targa, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell Lines and Transgenic Animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); および Roland Wolkowicz et al., Lentiviral Vectors for the Delivery of DNA into Mammalian Cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)を参照。レトロウイルス粒子は、脂質エンベロープに囲まれた蛋白質カプシドに詰め込まれたＲＮＡゲノムで構成される。レトロウイルスは、細胞質に逆転写酵素と共にそのＲＮＡを注入することにより宿主細胞に感染する。ＲＮＡ鋳型は、そして、線形の、二本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、宿主細胞ゲノムに組み込まれることにより自身を複製する。ウイルス粒子は、垂直に（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞へ）並びに水平に（ビリオンを介して細胞から細胞へ）の両方に拡散される。この複製ストラテジーは、目的の核酸分子が宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれ、それにより、蛋白質の長期間発現が可能となるから、長期間持続発現が可能となる。例えば、動物での検討は、多様な組織に注入されたレンチウイルスベクターが、１年以上の持続的な蛋白質発現をすることが示されている、例えば、Luigi Naldini et al., In vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Non-Dividing Cells By a Lentiviral Vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)を参照。オンコレトロウイルス由来ベクター系、例えば、モロネイ（Moloney）マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）は、幅広く使用され、そして、多くの異なる非分裂細胞に感染する。レンチウイルスは、また、分裂および非分裂細胞を含む、多くの異なる細胞タイプに感染することができ、高度に特異的な細胞ターゲティングを可能にする、複雑なエンベロープ蛋白質を所有する。
レトロウイルスベクターおよびかかるベクターの使用する特異的なプロトコルは、例えば、U.S. Patent Nos. Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight Control of Gene Expression in Eukaryotic Cells By Tetracycline-Responsive Promoters, U.S. Patent No. 5,464,758 (Nov. 7, 1995) and Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for Regulating Gene Expression, U.S. Patent No. 5,814,618 (Sep. 29, 1998) David S. Hogness, Polynucleotides Encoding Insect Steroid Hormone Receptor Polypeptides and Cells Transformed With Same, U.S. Patent No. 5,514,578 (May 7, 1996) and David S. Hogness, Polynucleotide Encoding Insect Ecdysone Receptor, U.S. Patent 6,245,531 (Jun. 12, 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone Receptor Having C. Terminal Hormone Binding Domain Truncations, U.S. Patent No. 5,364,791 (Nov. 15, 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene Therapy, U.S. Patent No. 5,874,534 (Feb. 23, 1999) および Elisabetta Vegeto et al., Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene Therapy, U.S. Patent No. 5,935,934 (Aug. 10, 1999)に開示されている。さらに、かかるウイルス運搬システムは、標準的な方法により調製され得、商業的に入手可能である、例えば、BD（登録商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) and BD（登録商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar. 14, 2003), GeneSwitch（登録商標） System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GeneSwitch（登録商標） System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); ViraPower（登録商標） Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and ViraPower（登録商標） Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); and Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) および Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005を参照。
本明細書で開示される方法は、一部として、ポリヌクレオチド分子からの修飾されたクロストリジウム毒素の発現を含む。いずれの多様な発現系が、本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子から修飾されたクロストリジウム毒素の発現に有用であり得、限定なしで、細胞ベースの系および無細胞発現系を含む。細胞ベースの系は、限定なしで、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系を含む。無細胞系は、限定なしで、小麦胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物および大腸菌抽出物を含み、一般的に、本明細書で開示される方法と等価である。発現系を用いるポリヌクレオチド分子の発現は、限定なしで、誘導発現、非誘導発現、構成的発現、ウイルス媒介発現、安定的に組み込まれた発現、および一過的発現を含む、いずれの多様な特徴を含むことができる。よく特徴付けされたベクター、試薬、条件および細胞を含む発現系は、限定なしで、Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; and Stratagene, La Jolla, CA、を含む商業的な供給者から容易に入手可能である。適切なヘテロ発現系の選択および使用における非限定的な例は、例えば、PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); および Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) Curr. Sci. 1121-1128, (2001)、に開示されている。これらのプロトコルは、当業者の見識内および本明細書の教示からルーチンな方法である。
多様な細胞ベースの発現手法が、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子によりコードされた修飾されたクロストリジウム毒素の発現に有用である。例は、限定なしで、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系を含む。ウイルス発現系は、限定なしで、ViraPower（登録商標） Lentiviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), the Adenoviral Expression Systems (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、 AdEasy（登録商標） XL Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA) および ViraPort（登録商標） Retroviral Gene Expression System (Stratagene, La Jolla, CA)を含む。原核生物発現系の非限定的な例は、Champion（登録商標） pET Expression System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)、 TriEx（登録商標） Bacterial Expression Systems (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), the QIAexpress（登録商標） Expression System (QIAGEN, Inc.)、および Affinity（登録商標） Protein Expression and Purification System (Stratagene, La Jolla, CA)を含む。酵母発現系は、限定なしで、EasySelect（登録商標） Pichia Expression Kit (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、YES-Echo（登録商標） Expression Vector Kits (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA ) および the SpECTRA（登録商標） S. pombe Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)を含む。バキュロウイルス発現系の非限定的な例は、BaculoDirect（登録商標） (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), the Bac-to-Bac（登録商標） (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), および the BD BaculoGold（登録商標） (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA)を含む。昆虫発現系は、限定なしで、Drosophila Expression System (DES（登録商標）) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、InsectSelect（登録商標） System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) および InsectDirect（登録商標） System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含む。哺乳類発現系の非限定的な例は、T-REx（登録商標） (Tetracycline-Regulated Expression) System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、 Flp-In（登録商標） T-REx（登録商標） System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、 pcDNA（登録商標） system (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、 pSecTag2 system (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)、 Exchanger（登録商標） System、InterPlay（登録商標） Mammalian TAP System (Stratagene, La Jolla, CA), Complete Control（登録商標） Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) および LacSwitch（登録商標） II Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA)を含む。
本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を発現するもう１つの手法は、無細胞発現系、例えば、限定なしで、原核生物抽出物および真核生物抽出物を採用する。原核生物細胞抽出物の非限定的な例は、RTS 100 E. coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)、 ActivePro In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX)、 EcoPro（登録商標） System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) および Expressway（登録商標） Plus Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)を含む。真核生物細胞抽出物は、限定なしで、RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)、TnT（登録商標） Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp., Madison, WI)、 Wheat Germ IVT（登録商標） Kit (Ambion, Inc., Austin, TX)、 Retic Lysate IVT（登録商標） Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), the PROTEINscript（登録商標） II System (Ambion, Inc., Austin, TX) および TnT（登録商標） Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp., Madison, WI)を含む。
本発明の側面は、また、以下に記載され得る：
１．二本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
２．クロストリジウム基質切断部位がボツリヌス毒素基質切断部位である、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位 およびBoNT/G 基質切断部位からなる群から選択される、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４．ボツリヌス毒素基質切断部位がBoNT/A切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Argを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Hisを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
８．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/B切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
９．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１０．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111 または 配列番号: 112を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１．二本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
２．クロストリジウム基質切断部位がボツリヌス毒素基質切断部位である、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位 およびBoNT/G 基質切断部位からなる群から選択される、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４．ボツリヌス毒素基質切断部位がBoNT/A切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Argを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Hisを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 104、配列番号: 105または配列番号: 106を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
８．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/B切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
９．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１０．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111 または 配列番号: 112を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１１．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/C1切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１２．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、Syntaxin（シンタキシン）の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１４．ボツリヌス毒素基質切断部位が、Syntaxin（シンタキシン）の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119、配列番号: 120 または 配列番号: 121を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/D切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Leuを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１８。ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 122 または 配列番号: 123を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１９．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/E切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１２．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、Syntaxin（シンタキシン）の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１４．ボツリヌス毒素基質切断部位が、Syntaxin（シンタキシン）の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119、配列番号: 120 または 配列番号: 121を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/D切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Leuを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１８。ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 122 または 配列番号: 123を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
１９．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/E切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２０．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Ileを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２１．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Ileを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２２．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127 または 配列番号: 128を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/F切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２４．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Lysを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 129 または 配列番号: 130を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/G切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がAla-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２８．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 131 または 配列番号: 132を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２９．クロストリジウム毒素基質切断部位が、破傷風毒素基質切断部位を含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２１．ボツリヌス毒素基質切断部位が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Ileを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２２．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127 または 配列番号: 128を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２３．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/F切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２４．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Lysを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２５．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 129 または 配列番号: 130を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２６．ボツリヌス毒素基質切断部位が、BoNT/G切断部位を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２７．ボツリヌス毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がAla-Alaを含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２８．ボツリヌス毒素基質切断部位が、配列番号: 131 または 配列番号: 132を含む、２に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
２９．クロストリジウム毒素基質切断部位が、破傷風毒素基質切断部位を含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３０．破傷風毒素基質切断部位が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、２９に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３１．修飾されたクロストリジウム毒素が、ボツリヌス毒素酵素ドメイン、ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインおよびボツリヌス毒素結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３２．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/AトランスロケーションドメインおよびBoNT/A結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３３．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/BトランスロケーションドメインおよびBoNT/B結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３４．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/C1トランスロケーションドメインおよびBoNT/C1結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３５．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/DトランスロケーションドメインおよびBoNT/D結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３６．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/EトランスロケーションドメインおよびBoNT/E結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３７．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/F酵素ドメイン、BoNT/FトランスロケーションドメインおよびBoNT/F結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３８．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/G酵素ドメイン、BoNT/GトランスロケーションドメインおよびBoNT/G結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３９．修飾されたクロストリジウム毒素が、破傷風毒素酵素ドメイン、破傷風毒素トランスロケーションドメインおよび破傷風毒素結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３１．修飾されたクロストリジウム毒素が、ボツリヌス毒素酵素ドメイン、ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインおよびボツリヌス毒素結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３２．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/A酵素ドメイン、BoNT/AトランスロケーションドメインおよびBoNT/A結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３３．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/B酵素ドメイン、BoNT/BトランスロケーションドメインおよびBoNT/B結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３４．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/C1酵素ドメイン、BoNT/C1トランスロケーションドメインおよびBoNT/C1結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３５．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/D酵素ドメイン、BoNT/DトランスロケーションドメインおよびBoNT/D結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３６．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/E酵素ドメイン、BoNT/EトランスロケーションドメインおよびBoNT/E結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３７．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/F酵素ドメイン、BoNT/FトランスロケーションドメインおよびBoNT/F結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３８．修飾されたボツリヌス毒素が、BoNT/G酵素ドメイン、BoNT/GトランスロケーションドメインおよびBoNT/G結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
３９．修飾されたクロストリジウム毒素が、破傷風毒素酵素ドメイン、破傷風毒素トランスロケーションドメインおよび破傷風毒素結合ドメインを含む、１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４０．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増強された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４１．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４２．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４３．クロストリジウム毒素基質切断部位が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位およびBuNT 基質切断部位からなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４４．クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメイン、BaNT 酵素ドメイン およびBuNT 酵素ドメインからなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４５．クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；が、BoNT/A トランスロケーションドメイン、BoNT/B トランスロケーションドメイン、BoNT/C1 トランスロケーションドメイン、BoNT/D トランスロケーションドメイン、BoNT/E トランスロケーションドメイン、BoNT/F トランスロケーションドメイン、BoNT/G トランスロケーションドメインおよびTeNT トランスロケーションドメイン、BaNT トランスロケーションドメイン およびBuNT トランスロケーションドメインからなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４６．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増強された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４７．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４８．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４９．クロストリジウム毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位およびBuNT 基質切断部位をコードする、４６−４８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子。
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増強された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４１．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４２．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
４３．クロストリジウム毒素基質切断部位が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位およびBuNT 基質切断部位からなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４４．クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメイン、BaNT 酵素ドメイン およびBuNT 酵素ドメインからなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４５．クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；が、BoNT/A トランスロケーションドメイン、BoNT/B トランスロケーションドメイン、BoNT/C1 トランスロケーションドメイン、BoNT/D トランスロケーションドメイン、BoNT/E トランスロケーションドメイン、BoNT/F トランスロケーションドメイン、BoNT/G トランスロケーションドメインおよびTeNT トランスロケーションドメイン、BaNT トランスロケーションドメイン およびBuNT トランスロケーションドメインからなる群から選択される、４０−４２のいずれかに記載の修飾されたクロストリジウム毒素。
４６．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる増強された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４７．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在するクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４８．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；および
ｅ）天然に存在しないクロストリジウム毒素標的細胞を中毒させることができる改変された細胞結合活性；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位が、二本鎖ループ領域内に位置する）
を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
４９．クロストリジウム毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位、TeNT 基質切断部位、BaNT 基質切断部位およびBuNT 基質切断部位をコードする、４６−４８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子。
５０．クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメイン、BaNT 酵素ドメイン またはBuNT 酵素ドメインをコードする、４６−４８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子。
５１，クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A トランスロケーションドメイン、BoNT/B トランスロケーションドメイン、BoNT/C1 トランスロケーションドメイン、BoNT/D トランスロケーションドメイン、BoNT/E トランスロケーションドメイン、BoNT/F トランスロケーションドメイン、BoNT/G トランスロケーションドメインおよびTeNT トランスロケーションドメイン、BaNT トランスロケーションドメイン またはBuNT トランスロケーションドメインをコードする、４６−４８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子。
５２．クロストリジウム毒素基質切断部位が二本鎖ループ領域に位置する、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードする、ポリヌクレオチド分子。
５３．クロストリジウム毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、ボツリヌス毒素基質切断部位である、５２に記載のポリヌクレオチド分子。
５４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、およびBoNT/G 基質切断部位からなる群から選択される、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Argを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Hisを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 104、配列番号: 105 または 配列番号: 106をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/B切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５１，クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A トランスロケーションドメイン、BoNT/B トランスロケーションドメイン、BoNT/C1 トランスロケーションドメイン、BoNT/D トランスロケーションドメイン、BoNT/E トランスロケーションドメイン、BoNT/F トランスロケーションドメイン、BoNT/G トランスロケーションドメインおよびTeNT トランスロケーションドメイン、BaNT トランスロケーションドメイン またはBuNT トランスロケーションドメインをコードする、４６−４８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子。
５２．クロストリジウム毒素基質切断部位が二本鎖ループ領域に位置する、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素をコードする、ポリヌクレオチド分子。
５３．クロストリジウム毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、ボツリヌス毒素基質切断部位である、５２に記載のポリヌクレオチド分子。
５４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、およびBoNT/G 基質切断部位からなる群から選択される、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Argを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Hisを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 104、配列番号: 105 または 配列番号: 106をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
５９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/B切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６０．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６１．ボツリヌス毒素基質切断部位を含むポリヌクレオチド分子が、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111 または 配列番号: 112をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６２．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/C1切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６３．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、Syntaxinの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、Syntaxinの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119、配列番号: 120 または 配列番号: 121をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/D切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Leuを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 122、または 配列番号: 123をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６１．ボツリヌス毒素基質切断部位を含むポリヌクレオチド分子が、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111 または 配列番号: 112をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６２．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/C1切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６３．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、Syntaxinの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、Syntaxinの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 113、配列番号: 114、配列番号: 115、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119、配列番号: 120 または 配列番号: 121をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/D切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Leuを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
６９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 122、または 配列番号: 123をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７０．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/E切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７１．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Ileを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７２．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Ileを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７３．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127 または 配列番号: 128をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/F切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Lysを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 129または 配列番号: 130をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/G切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がAla-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 131または 配列番号: 132をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７１．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がArg-Ileを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７２．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、SNAP-25の少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がLys-Ileを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７３．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 124、配列番号: 125、配列番号: 126、配列番号: 127 または 配列番号: 128をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７４．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/F切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７５．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Lysを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７６．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 129または 配列番号: 130をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７７．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/G切断部位を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７８．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がAla-Alaを含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
７９．ボツリヌス毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、配列番号: 131または 配列番号: 132をコードする、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８０．クロストリジウム毒素基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、破傷風毒素切断部位を含む、５２に記載のポリヌクレオチド分子。
８１．破傷風毒基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、８０に記載のポリヌクレオチド分子。
８２．修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ボツリヌス毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびボツリヌス毒素結合ドメインを含む、８０に記載のポリヌクレオチド分子。
８３．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Aトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/A結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８６．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/B酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Bトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/B結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８７．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/C1酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/C1トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/C1結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８８．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/D酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Dトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/D結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８９．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/E酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Eトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/E結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８１．破傷風毒基質切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、VAMPの少なくとも６連続残基を含み、該６連続残基がGln-Pheを含む、８０に記載のポリヌクレオチド分子。
８２．修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ボツリヌス毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびボツリヌス毒素結合ドメインを含む、８０に記載のポリヌクレオチド分子。
８３．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/A酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Aトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/A結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８６．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/B酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Bトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/B結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８７．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/C1酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/C1トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/C1結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８８．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/D酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Dトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/D結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
８９．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/E酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Eトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/E結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９０．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/F酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Fトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/F結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９１．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/G酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Gトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/G結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９２．修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、破傷風毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、破傷風毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子および破傷風毒素結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９３．ポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を細胞内で発現させる工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法であって、修飾されたクロストリジウム毒素が、４６−９２のいずれかにより定義される、方法。
９４．
ａ）４６−９２のいずれかで定義された修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内で導入すること；およびｂ）ポリヌクレオチド分子によってコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を発現させる、工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法。
９５．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；
ｅ）クロストリジウム毒素細胞結合ドメイン；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位二本鎖ループ領域内にある）
、を含む修飾されたクロストリジウム毒素。
９１．修飾されたボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、BoNT/G酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、BoNT/Gトランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子およびBoNT/G結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９２．修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、破傷風毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、破傷風毒素トランスロケーションドメインをコードするポリヌクレオチド分子および破傷風毒素結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を含む、５３に記載のポリヌクレオチド分子。
９３．ポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を細胞内で発現させる工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法であって、修飾されたクロストリジウム毒素が、４６−９２のいずれかにより定義される、方法。
９４．
ａ）４６−９２のいずれかで定義された修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内で導入すること；およびｂ）ポリヌクレオチド分子によってコードされる修飾されたクロストリジウム毒素を発現させる、工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の製造方法。
９５．
ａ）クロストリジウム毒素基質切断部位；
ｂ）二本鎖ループ領域；
ｃ）クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｄ）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；
ｅ）クロストリジウム毒素細胞結合ドメイン；
（ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位二本鎖ループ領域内にある）
、を含む修飾されたクロストリジウム毒素。
以下の非限定的な例は、開示された実施態様のより完全な理解を促すために例示的目的のみで提供され、本明細書で開示される実施態様のいずれかを限定することを意図されていない。
実施例１
BoNT/A基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素の構築物
BoNT/A基質切断部位を含む修飾されたクロストリジウム毒素の構築物
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/A基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-A17（配列番号：203）に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：214）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-A17は、BoNT/Aにより切断され得る17アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/A-A17を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/A-A17 (配列番号: 203)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 225)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-A17をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照、その全ての内容は引用により、その全てが本明細書に組み込まれる。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-A17を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号：204のBoNT/A-A8をコードする配列番号：215または配列番号：226のポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1クローニング構築物を作成する。BoNT/A-A8は、BoNT/Aで切断されることができる8アミノ酸クロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。さらに、当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/A基質切断部位を有するように修飾することができる。
pET29/BoNT/A-A17を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-A17構築物を、１）BoNT/A-A17をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 225のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-A17を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする、配列番号：225のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図７）。
同様のクローニング手法を、配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする配列番号：214のポリヌクレオチド分子；または、配列番号：204のBoNT/A-A8をコードする配列番号：215または配列番号：226のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成するために使用する。
実施例２
BoNT/B およびTeNTの両方の基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
BoNT/B およびTeNTの両方の基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/B基質切断部位とTeNT基質切断部位の両方を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-BT35 (配列番号: 205)に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：216）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-BT35は、BoNT/BまたはTeNTのいずれかにより切断され得る35アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/A-BT35を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/A-BT35 (配列番号: 205)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 227)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-BT35をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-BT35を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号：206のBoNT/A-BT8をコードする配列番号：217または配列番号：228のポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1クローニング構築物を作成する。BoNT/A-B8は、BoNT/BまたはTeNTで切断されることができる8アミノ酸クロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。さらに、当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/B基質切断部位およびTeNT基質切断部位の両方を有するように修飾することができる。
pET29/BoNT/A-BT35を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-BT35構築物を、１）BoNT/A-BT35をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 225のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-BT35を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：205のBoNT/A-BT35をコードする、配列番号：227のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図８）。
同様のクローニング手法を、配列番号：205のBoNT/A-BT35をコードする配列番号：216のポリヌクレオチド分子；または、配列番号：206のBoNT/A-BT8をコードする配列番号：217または配列番号：228のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成するために使用する。
実施例３
BoNT/C1基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
BoNT/C1基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/C1基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-Csyn8 (配列番号: 207)に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：218）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-Csyn8は、BoNT/C1により切断され得る8アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/A-Csyn8 (配列番号: 207)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 229)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-Csyn8をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号：208のBoNT/A-Csyn8をコードする配列番号：219または配列番号：230のポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1クローニング構築物を作成する。BoNT/A-Csyn8は、BoNT/C1で切断されることができる8アミノ酸クロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。さらに、当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/C１基質切断部位を有するように修飾することができる。
pET29/BoNT/A-Csyn8を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8構築物を、１）BoNT/A-Csyn8をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 229のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-Csyn8を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：207のBoNT/A-Csyn8をコードする、配列番号：229のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図９）。
同様のクローニング手法を、配列番号：207のBoNT/A-A17をコードする配列番号：218のポリヌクレオチド分子；または、配列番号：208のBoNT/A-Csyn8をコードする配列番号：219または配列番号：230のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成するために使用する。
実施例４
BoNT/D基質切断部位、BoNT/F基質切断部位またはBoNT/D、BoNT/Fの両方の基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
BoNT/D基質切断部位、BoNT/F基質切断部位またはBoNT/D、BoNT/Fの両方の基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/D基質切断部位、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/F基質切断部位、または毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/D基質切断部位およびBoNT/F基質切断部位の両方を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-DF39 (配列番号: 209)に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：220）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-DF39は、BoNT/DまたはBoNT/Fのいずれかにより切断され得る39アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/ A-DF39を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/ A-DF39 (配列番号: 209)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 231)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-DF39をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-DF39を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号：210のBoNT/A-D8をコードする配列番号：221または配列番号：232のポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1クローニング構築物；または配列番号：212のBoNT/A-F8をコードする配列番号：223または配列番号：234のポリヌクレオチド分子を含む構築物を作成する。BoNT/A-D8は、BoNT/Dで切断されることができる8アミノ酸クロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。BoNT/A-F8は、BoNT/Fで切断されることができる8アミノ酸クロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。さらに、当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/D基質切断部位を含む、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/B基質切断部位を含む、またはその毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/D基質切断部位およびBoNT/F基質切断部位の両方を含むように、修飾することができる。
pET29/BoNT/A-DF39を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-DF39構築物を、１）BoNT/A-DF39をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 231のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-DF39を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：209のBoNT/A-DF39をコードする、配列番号：231のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図１０）。
同様のクローニング手法を、配列番号：209のBoNT/A-DF39をコードする配列番号：220のポリヌクレオチド分子；または、配列番号：210のBoNT/A-D8をコードする配列番号：221または配列番号：232のポリヌクレオチド分子；または配列番号：212のBoNT/A-F8をコードする配列番号：223または配列番号：234のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成するために使用する。
実施例５
BoNT/E基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
BoNT/E基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/E基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-E8 (配列番号: 211)に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：222）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-E8は、BoNT/Eにより切断され得る8アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/A-E8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/A-E8 (配列番号: 211)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 233)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-Csyn8をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-E8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/E基質切断部位を有するように修飾することができる。
pET29/BoNT/A-E8を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-E8構築物を、１）BoNT/A-E8をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 233のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-E8を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：211のBoNT/A-E8をコードする、配列番号：233のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図１１）。
実施例６
BoNT/G基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
実施例６
BoNT/G基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の構築
この例は、毒素の二本鎖ループ領域に位置するBoNT/G基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素の作成の仕方を説明する。
BoNT/A-G8 (配列番号: 213)に基づいたポリヌクレオチド分子（配列番号：224）を、標準的な手法を用いて合成する（BlueHeron（登録商標） Biotechnology, Bothell, WA）。BoNT/A-G8は、BoNT/Gにより切断され得る8アミノ酸のクロストリジウム毒素基質切断部位を含むように修飾されたBoNT/Aである。20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、完全長ポリヌクレオチド分子を集めるために連結した二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチド分子を、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローン化し、pUCBHB1/BoNT/A-G8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)および ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてシークエンシングすることにより確かめる。
望まれるなら、発現最適化されたBoNT/A-E8 (配列番号: 213)に基づくポリヌクレオチド分子(配列番号: 235)を、大腸菌種での発現を改善させるために合成することができる。BoNT/A-D8をコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌種の天然のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む；２）大腸菌種に見出される天然のポリヌクレオチド分子の平均G+C含量に、より近接にマッチするG+C含量を有する；３）ポリヌクレオチド分子内で見出されるポリモノヌクレオチド領域を減らす；および／または４）ポリヌクレオチド分子内に見出される内部制御または構造部位を削除する、ために修飾することができる。Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。一旦、配列最適化が完了すると、20から50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的なホスホルアミデート合成を用いて合成する。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結して完全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる二本鎖デュプレックスとする。このポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的手法を用いて、pUCBHB1ベクターのSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-G8を作成する。合成されたポリヌクレオチド分子を、Big Dye Terminator（登録商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、シークエンシングより確認する。更に望まれるなら、異なる生命体、例えば、酵母種、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への最適化を行うことができる、例えば、Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); および Steward, supra, 国際特許公開番号. WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)を参照。
当業者は上記した同様のクローニング手法を用いて、クロストリジウム毒素、例えば、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G および TeNTを、これらの毒素が、その毒素の二本鎖ループ領域でBoNT/G基質切断部位を有するように修飾することができる。
pET29/BoNT/A-G8を構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-G8構築物を、１）BoNT/A-E8をコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号: 235のポリヌクレオチド分子を含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpET29ベクター(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結させることができる、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートを、T4 DNAリガーゼを用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-G8を産生する、pET29ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、50μg/mLのカナマイシンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：213のBoNT/A-G8をコードする、配列番号：235のポリヌクレオチド分子を含む、pET29発現構築物を作成する（図１２）。
実施例７
細菌細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素の細菌細胞でのいずれの発現に有用な手順を説明する。
細菌細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示された修飾されたクロストリジウム毒素の細菌細胞でのいずれの発現に有用な手順を説明する。
例えば、pET29/BoNT/A-ED-PAR1Tb、pET29/BoNT/A-TD-PAR1TbまたはpET29/BoNT/A-BD-PAR1Tbのような発現構築物（例えば、実施例１、２および３を参照）を、熱ショック形質転換プロトコルを用いて、化学的にコンピテントなE. coli BL21 (DE3)細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に導入する。熱ショック反応を、50μｇ/mLのカナマイシンを含む1.5％Luria-Bertaniアガープレート(pH 7.0)上に置き、37℃、一晩培養のために放置する。例えば、pET29/BoNT/A-A17、pET29/BoNT/A-BT35、pET29/BoNT/A-Csyn8、pET29/BoNT/A-DF39、pET29/BoNT/A-E8 または pET29/BoNT/A-G8のような発現構築物を含む形質転換された大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを、50μｇ/mLのカナマイシンを含む3.0mLのPA-0.5G培地を含むバッフルフラスコ（baffled flask）に植菌するために使用し、その後、37℃インキュベーターで、250rpmで攪拌され、一晩培養のために放置する。得られる一晩スターター培養物を、次に、50μｇ/mLのカナマイシンを1:1000の希釈で含むZYP-5052自己誘発培地を含む3Lバッフルフラスコに植菌するために用いる。培養ボリュームは、約600mL（20%フラスコボリューム）から約750mL（25%フラスコボリューム）の範囲である。これらの培養物は、37℃インキュベーターで、250rpmで攪拌され、約5.5時間培養され、そして、一晩発現のために、16℃インキュベーターで250rpmに移される。細胞を、遠心分離（4,000 rpm、４℃、20-30分）により回収し、直ちに使用するか、または必要とされるまで-80℃で乾燥保存する。
実施例８
修飾されたクロストリジウム毒素の精製および定量化
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の精製および定量化に有用な方法を説明する。
修飾されたクロストリジウム毒素の精製および定量化
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の精製および定量化に有用な方法を説明する。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)蛋白質精製のために、実施例４に記載された修飾されたクロストリジウム毒素を発現させるために用いたE. coli BL21 (DE3) cellのペレットを、カラム結合緩衝液(25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES), pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 2x プロテアーゼ阻害剤カクテル Set III (EMD Biosciences-Calbiochem, San Diego CA); 5 ユニット/mLのベンゾナーゼ（Benzonase）(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI); 0.1% (v/v) TritonX（登録商標） 100、4−オクチルフェノールポリエトキシレート; 10% (v/v) グリセロール)に再懸濁し、それから、冷たいオークリッジ(Oakridge)遠沈管に移す。細胞懸濁液を、細胞を溶解するために、氷上で超音波処理し（Branson デジタルソニファイアー(Digital Sonifier)で、60秒の冷却インターバルで、40%アンプリチュード、10-12パルス、10秒）、そして、遠心して（16,000 rpm、4℃、20分）、溶解物を洗浄する。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを、2.5-5.0 mL のTALON（登録商標） SuperFlow Co2+ アフィニティーレジン(BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA)を充填した 20mL Econo-Pacカラム支持体（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使用して調製し、それから、5カラム体積の脱イオン化された蒸留水、その後、5カラム体積のカラム結合緩衝液で洗浄することにより平衡化する。洗浄された溶解物を、ゆっくりと平衡化されたカラムに、重力の流れにより（約 0.25-0.3 mL/分）供する。それから、カラムを、５カラム体積のカラム洗浄緩衝液（N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) TritonX（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシレート; 10% (v/v) グリセロール）で洗浄する。クロストリジウム毒素を、20-30mLのカラム溶出緩衝液（25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES), pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリム; 500 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100, 4−オクチルフェノール ポリエトキシレート; 10% (v/v) グリセロール）で溶出し、約１２の１mＬフラクションに集める。各溶出フラクションに含まれるクロストリジウム毒素の量を、Bradford色素アッセイによって測定する。この手順において、各1.0mLフラクションの20μLのアリコートを、Bio-Rad Protein Reagent(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)200μLと混合し、脱イオン蒸留水で1から4希釈し、そして、比色シグナルの強度を分光光度計を用いて測定する。最も強いシグナルを有す５フラクションを溶出ピークと考え、混合する。トータル蛋白質収量は、ウシガンマグロブリンを標準(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)として、プールされたピークの溶出フラクションのトータル蛋白質濃度を見積もることにより決定する。
FPLC脱塩カラムを用いる修飾されたクロストリジウム毒素の精製のために、HiPrep（登録商標） 26/10 サイズ排除カラム (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を、４℃、80mLのカラム緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム、 pH 6.5)で前もって平衡化する。カラムが平衡化された後、クロストリジウム毒素サンプルを、サイズ排除カラムに、４℃のカラム緩衝液のアイソクラチック移動相で、そして、BioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて10mL/分の流速で、供する。脱塩された修飾されたクロストリジウム毒素サンプルを約7-12mLの単一フラクションとして集める。
FPLCイオン交換カラムを用いる修飾されたクロストリジウム毒素の精製のために、IMACカラムからの溶出に続く脱塩化されたクロストリジウム毒素を、1mL Q1（登録商標）アニオン交換カラム (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に、BioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて、供する。サンプルを、４℃カラム緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム、 pH 6.5)で、カラムに供し、以下のように、４℃カラム緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム、 pH 6.5)の線形グラジエントにより溶出する：工程１、1 mL/分の流速で、 5.0 mLの5% 溶出緩衝液;工程２、1 mL/分の流速で、 20.0 mL の 5-30% 溶出緩衝液; 工程３、1 mL/分の流速で、 2.0 mL の 50%溶出緩衝液; 工程４、1 mL/分の流速で、 4.0 mL の100% 溶出緩衝液; および工程５、1 mL/分の流速で、 5.0 mLの 0% 溶出緩衝液。カラムからのクロストリジウム毒素の溶出は、280、260、および214nmでモニターし、280nmで、最小閾値(0.01 au)より大きく吸収するピークを集める。クロストリジウム毒素のほとんどを、約100から200mMの塩化ナトリウムで溶出する。クロストリジウム毒素の平均的なトータル収率を、Bradfordアッセイにより測定する。
修飾されたクロストリジウム毒素の発現を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析する。上記手順を用いて精製されたサンプルに、2x LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を加え、変性還元状態で、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Trisプレキャストポリアクリルアミドゲル (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を用いて、MOPS polyacrylアミドゲル電気泳動により分離する。ゲルをSYPRO（登録商標） Ruby (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)で染色し、分離されたポリアクリルアミドゲルをクロストリジウム毒素発現レベルの定量のために、Fluor-S MAX MultiImager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いてイメージする。クロストリジウム毒素のサイズと量を、MagicMark（登録商標）蛋白質分子量標準 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)と比較して測定する。
修飾されたクロストリジウム毒素の発現を、また、ウエスタンブロット解析により解析する。上記手順を用いて精製された蛋白質サンプルに、2x LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を加え、変性還元状態で、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Trisプレキャストポリアクリルアミドゲル (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を用いて、MOPS polyacrylアミドゲル電気泳動により分離する。分離されたポリペプチドを、ゲルからポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、Trans-Blot（登録商標） SD セミドライ電気泳動トランスファーセル装置(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて、ウエスタンブロッティングによりトランスファーする。PVDF膜を、室温、２時間、25 mM Tris-緩衝化食塩水 (25 mM 2−アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール 塩酸 (Tris-HCl)(pH 7.4)、137 mM 塩化ナトリウム、 2.7 mM 塩化カリウム)、0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20)ソルビタンモノラウレート 2% ウシ血清アルブミン、 5% ノンファットドライミルクを含む溶液中でインキュベーションすることでブロッキングする。ブロッキングされた膜を、４℃で一晩、適切な一次抗体をプローブとして含む、Tris-緩衝化食塩水TWEEN-20（登録商標） (25 mM Tris-緩衝化食塩水、 0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20)ソルビタンモノラウレート)中でインキュベートする。一次抗体でプローブされたブロットを、Tris-緩衝化食塩水TWEEN-20（登録商標）で１５分／回で３回洗浄する。洗浄された膜を、室温で、２時間、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼが結合した適切な免疫グロブリンG抗体を含むTris-緩衝化食塩水TWEEN-20（登録商標）中で、インキュベートする。二次抗体でプローブされたブロットを、Tris-緩衝化食塩水TWEEN-20（登録商標）で１５分／回で３回洗浄する。標識化されたクロストリジウム毒素のシグナル検出を、ECL Plus（登録商標） ウエスタンブロット検出システム (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いて可視化し、修飾されたクロストリジウム毒素発現レベルの定量のためにTyphoon 9410 Variable Mode Imager (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いてイメージする。
実施例９
酵母細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の酵母細胞での発現に有用な手法を説明する。
実施例９
酵母細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の酵母細胞での発現に有用な手法を説明する。
修飾されたクロストリジウム毒素をコードする好適な酵母発現構築物を構築するために、pPIC A ベクター (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に操作可能に連結されたポリヌクレオチド分子をクローニングするための好適な制限エンドヌクレアーゼ部位を、配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする配列番号：236のポリヌクレオチド分子の５’および３’末端に組み込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、そして、pUCBHB1/BoNT/A-A17構築物を実施例１に記載されるように得る。この構築物を、１）BoNT/A-A17をコードする配列番号: 236のオープンリーディングフレームを含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpPIC Aベクターに操作可能に連結させることができる制限酵素で消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手法を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpET29/BoNT/A-E8を産生する、pPIC Aベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、25μg/mLのゼオシン（登録商標）を含む、1.5％低塩Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.5)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を含む細菌をゼオシン（登録商標）耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端c-mycおよびポリヒスチジン結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする、配列番号：236のポリヌクレオチド分子を含む、pPIC A発現構築物を作成する（図１２）。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号: 204のBoNT/A-A8;配列番号: 205のBoNT/A-BT35;配列番号: 206のBoNT/A-BT8; 配列番号: 207のBoNT/A-Csyn8; 配列番号: 208のBoNT/A-Csnp8; 配列番号: 209のBoNT/A-DF39; 配列番号: 210のBoNT/A-D8; 配列番号: 211のBoNT/A-E8; 配列番号: 212のBoNT/A-F8;または配列番号: 213のBoNT/A-D8をコードする、pPIC A発現構築物を作成する。
修飾されたクロストリジウム毒素を発現する酵母細胞株を構築するために、pPICZ A/BoNT/A-A17を、好適な制限エンドヌクレアーゼ（つまり、SacI、PmeI または BstXI）で消化して、得られる直線化された発現構築物を、エレクトロポレーション手法を用いて、適切なP. pastoris MutS 種 KM71Hに形質転換する。形質転換混合物を100μg/mLのゼオシン（登録商標）を含む1.5%YPDSアガープレート(pH 7.5)上にプレーティングし、28-30℃インキュベーターに1-3日間培養のために置く。5’ AOX1 遺伝子座でpPICZ A/BoNT/A-A17が組み込まれた形質転換体の選別を、ゼオシン（登録商標）耐性コロニーにより決定する。pPICZ A/BoNT/A-A17構築物を組み込んだ細胞株を、小スケールの発現試験を用いてBoNT/A-A17発現を試験する。pPICZ A/BoNT/A-A17を組み込んだ試験細胞株からのコロニーの単離を、100mLのMGYH培地を含む1.0Lのバッフルフラスコに植菌するために用い、約28-30℃、振盪インキュベーター（250 rpm）で、培養が、OD600=2-6 (約16-18 時間)に達するまで成長させる。細胞を遠心分離（3,000x g 、22 °C、5分）により回収する。発現を惹起するために、細胞ペレットを15mLのMMH培地に再懸濁し、100%メタノールを最終濃度0.5%で加える。培養を、約28-30℃、振盪インキュベーター（250 rpm）で６日間成長させる。更なる100%メタノールを最終濃度0.5%になるように、培養物に24時間毎に加える。1.0mLのアリコートを時間０から時間１４４時間まで24時間毎に培養物から取り出す。細胞を、アリコートから細胞をペレットにするマイクロ遠心により回収し、３回の-80℃、5分間、そして37℃5分間からなる凍結融解工程を用いて溶解する。溶解サンプルを2x LDS サンプル緩衝液(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に加え、そして、確立された細胞株からの発現を、BoNT/A-A17を発現する細胞株を同定するために、抗BoNT/A、抗mycまたは抗His 抗体のいずれかを用いたウエスタンブロット解析（実施例８に記載されたような）により測定する。BoNT/A-A17の最も高い発現レベルを示すP. pastoris MutS KM71H細胞株を、商業的な培養手法を用いる大量スケール発現に選択する。大量スケール発現の手法は、培養容積が、5 L BioFlo 3000 培養器の約2.5LMGYH培地であることを除き、上記に概要され、全ての試薬の濃度は、この容積に対し正比例増加し得る。同様の手順を、配列番号: 204 から配列番号: 213のいずれの修飾されたクロストリジウム毒素をコードするpPICZ A構築物の発現に使用することができる。
BoNT/A-A17を、実施例８で記載したIMAC手法を用いて精製する。生産されるBoNT/A-A17の量を決定するために、各培養からの発現を、Bradford dyeアッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウエスタンブロット解析（実施例８に記載のような）により評価する。
実施例１０
昆虫細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の昆虫細胞での発現に有用な手法を説明する。
昆虫細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の昆虫細胞での発現に有用な手法を説明する。
修飾されたクロストリジウム毒素をコードする好適な昆虫発現構築物を構築するために、pBACgus3ベクター (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に操作可能に連結されたポリヌクレオチド分子をクローニングするための好適な制限エンドヌクレアーゼ部位を、配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする配列番号：237のポリヌクレオチド分子の５’および３’末端に組み込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、そして、pUCBHB1/BoNT/A-A17構築物を実施例１に記載されるように得る。この構築物を、１）BoNT/A-A17をコードする配列番号: 237のオープンリーディングフレームを含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpBACgus3ベクターに操作可能に連結させることができる制限酵素で消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手法を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpBACgus3/BoNT/A-A17を産生する、pBACgus3ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、アミノ末端gp64シグナルペプチドおよびカルボキシル末端トロンビン切断、ポリヒスチジンアフィニティー結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする、配列番号：237のポリヌクレオチド分子を含む、pBACgus3発現構築物を作成する（図１４）。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号: 204のBoNT/A-A8;配列番号: 205のBoNT/A-BT35;配列番号: 206のBoNT/A-BT8; 配列番号: 207のBoNT/A-Csyn8; 配列番号: 208のBoNT/A-Csnp8; 配列番号: 209のBoNT/A-DF39; 配列番号: 210のBoNT/A-D8; 配列番号: 211のBoNT/A-E8; 配列番号: 212のBoNT/A-F8;または配列番号: 213のBoNT/A-D8をコードする、pPIC A発現構築物を作成する。
バキュロウイルス発現系を用いて修飾されたクロストリジウム毒素を発現するために、約2.5x106 Sf9細胞を、2 mLの BacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含む４つの60mm培養ディッシュにプレートし、28℃インキュベーターで約２０分インキュベートする。トランスフェクション毎に、修飾されたクロストリジウム毒素をコードするpBACgus3構築物、例えば、pBACgus3/BoNT/A-A17の100ngを含む25μLのBacVector（登録商標） Insect培地および500ng TlowE トランスファープラスミドを5μLのInsect GeneJuice（登録商標） (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)および 20 μL ヌクレアーゼフリー水を含む25μLの希釈されたInsect GeneJuice（登録商標）に添加することにより、50μLのトランスフェクション溶液を、6mLのポリスチレンチューブに調製する。１５分の培養後、450μLのBacVector（登録商標）培地をトランスフェクション溶液に添加し穏やかに混和する。このトランスフェクション溶液を1/10希釈として用いて、さらに、1/50、1/250 および 1/1250希釈のトランスフェクション溶液を作成する。100μLのトランスフェクション溶液を、４つの60mm培養ディッシュの１つからのSf9細胞に添加し、抗生物質フリー、血清フリーのBacVector（登録商標） Insect培地で２回洗浄し、22℃でインキュベートする。１時間後、6mLの5%ウシ血清アルブミンを含む1% BacPlaque agarose-BacVector（登録商標）Insect培地を添加する。アガロースが凝固した後、5%ウシ血清アルブミンを含む2mLのBacPlaque agarose-BacVector（登録商標）Insect培地を形質転換される細胞に添加し、プラークが目に見えるまで、細胞を28℃インキュベーターに3-5日移す。3-5日のポストトランスフェクションの後、30 μL の 20 mg/mL X-Gluc 溶液 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含む2mLのBacVector（登録商標） Insect培地で洗浄した単層を約２時間２８℃インキュベーターでインキュベートすることにより、単層のプラークを、pBACgus3/BoNT/A-A17を含む組換ウイルスプラークの存在を試験するβ-グルクロニダーゼ受容体遺伝子活性のために染色する。
候補組換ウイルスプラークを単離した後、いくつかの候補ウイルスプラークを溶離し、プラークを精製する。組換ウイルスを溶離するために、滅菌パスツールピペットを用いて、組換ウイルスプラークを含むプラグを滅菌スクリューキャップバイアル内の1mLのBacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に移す。バイアルを、22℃約２時間、または4℃約１６時間インキュベートする。各組換ウイルスプラークのために、2mLのBacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含む35mm培養ディッシュに、2.5x105 Sf9細胞をプレートし、28℃インキュベーターで約２０分インキュベートする。培地を除き、そして、200μLの溶離された組換ウイルスを添加する。１時間後、5%ウシ血清アルブミンを含む2mLの1% BacPlaque agarose-BacVector（登録商標） Insect培地を添加する。アガロースが凝固した後、5%ウシ血清アルブミンを含む2mLのBacPlaque agarose-BacVector（登録商標）Insect培地を形質転換された細胞に添加し、プラークが目に見えるまで、細胞を28℃インキュベーターに3-5日移す。3-5日のポストトランスフェクションの後、30 μL の 20 mg/mL X-Gluc 溶液 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含む2mLのBacVector（登録商標） Insect培地で洗浄した単層を約２時間２８℃インキュベーターでインキュベートすることにより、単層のプラークを、pBACgus3/BoNT/A-A17を含む組換ウイルスプラークの存在を試験するβ-グルクロニダーゼ受容体遺伝子活性のために染色する。
ウイルスの種ストックを調製するために、滅菌パスツールピペットを用いて、組換ウイルスプラークを含むプラグを滅菌スクリューキャップバイアル内の1mLのBacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)に移すことにより組換ウイルスを溶離する。バイアルを4℃、約16時間インキュベートする。約5x105 Sf9細胞を、5mLのBacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含むT-25フラスコにプレーティングし、28℃インキュベーターで約２０分インキュベートする。培地を除き、そして、300μLの溶離された組換ウイルスを添加する。１時間後、5%ウシ血清アルブミンを含む5mLのBacVector（登録商標） Insect 培地を形質転換された細胞に添加し、細胞の大部分が付着せず、不健康になるまで、細胞を28℃インキュベーターに3-5日移す。ウイルスを、15mLのスナップキャップチューブに培地を移し、残骸を除くためにチューブを５分間1000Xgで遠心することにより回収する。精製された上清を、新しい15mLのスナップキャップチューブに移し、４℃で保存する。
高力価のウイルスストックを調製するために、約2x107 Sf9細胞を、10mLのBacVector（登録商標） Insect 培地 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)を含むT-25フラスコにプレーティングし、28℃インキュベーターで約２０分インキュベートする。培地を除き、そして、500μLのウイルス種ストックを添加する。１時間後、5%ウシ血清アルブミンを含む10mLのBacVector（登録商標） Insect 培地を形質転換された細胞に添加し、細胞の大部分が付着せず、不健康になるまで、細胞を28℃インキュベーターに3-5日移す。ウイルスを、15mLのスナップキャップチューブに培地を移し、残骸を除くためにチューブを５分間1000Xgで遠心することにより回収する。精製された上清を、新しい15mLのスナップキャップチューブに移し、４℃で保存する。高力価ウイルスストックは、バキュロウイルスを約2x108から3x109 pfu含む。
バキュロウイルス発現系を用いてgp64-BoNT/A-A17を発現するために、約1.25x108 Sf9細胞を、250 mLのBacVector（登録商標） Insect 培地を含む１Lフラスコに播種し、約5x108の細胞密度になるまでオービタルシェーカー(150rpm)で培養する。培養物を、約2.5x109の高力価組換バキュロウイルスで植菌し、28℃、オービタルシェーカー(150rpm)で、約４８時間インキュベートする。培地を、培地をチューブに移し、チューブを残骸を取り除くために500x g、５分遠心することにより回収する。培地サンプルを2x LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に加え、BoNT/A-A17を発現するバキュロウイルスストックを単離するために、発現を、抗-BoNT/A または抗-His 抗体を用いたウエスタンブロット（実施例８に記載されたような）により測定する。同様の手順を、配列番号: 204から配列番号: 213までの修飾されたクロストリジウム毒素のいずれかをコードするpBACgus3構築物を発現させるために使用することができる。
BoNT/A-A17を、実施例８で記載したIMAC手法を用いて精製する。生産されるBoNT/A-A17の量を決定するために、各培養からの発現を、Bradford dyeアッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウエスタンブロット解析（実施例８に記載のような）により評価する。
実施例１１
哺乳動物細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の哺乳動物細胞での発現に有用な手法を説明する。
哺乳動物細胞での修飾されたクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書で開示されたいずれの修飾されたクロストリジウム毒素の哺乳動物細胞での発現に有用な手法を説明する。
修飾されたクロストリジウム毒素をコードする好適な哺乳動物発現構築物を構築するために、pSecTag2 ベクター (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に操作可能に連結されたポリヌクレオチド分子をクローニングするための好適な制限エンドヌクレアーゼ部位を、配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする配列番号：238のポリヌクレオチド分子の５’および３’末端に組み込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、そして、pUCBHB1/BoNT/A-A17構築物を実施例１に記載されるように得る。この構築物を、１）BoNT/A-A17をコードする配列番号: 238のオープンリーディングフレームを含むインサートを切り出す、そして、２）このインサートをpSecTag2 ベクターに操作可能に連結させることができる制限酵素で消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手法を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化してpSecTag2/BoNT/A-A17を産生する、pSecTag2 ベクターにサブクローニングする。ライゲーション混合物を、化学的に、コンピテントE. coli DH5α細胞(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に、熱ショック方法を用いて形質転換し、100μg/mLのアンピシリンを含む、1.5％Luria-Bertaniアガ―プレート(pH 7.0)にプレーティングし、３７℃インキュベーター内で一晩培養のために置く。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして単離する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニ調製手法を用いて単離し、エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより解析し、インサートの存在と方向を決定する。このクローニング手法により、カルボキシル末端c-mycおよびポリヒスチジン結合ペプチドに操作可能に連結された配列番号：203のBoNT/A-A17をコードする、配列番号：238のポリヌクレオチド分子を含む、pSecTag2発現構築物を作成する（図１５）。
同様のクローニング手法を用いて、配列番号: 204のBoNT/A-A8;配列番号: 205のBoNT/A-BT35;配列番号: 206のBoNT/A-BT8; 配列番号: 207のBoNT/A-Csyn8; 配列番号: 208のBoNT/A-Csnp8; 配列番号: 209のBoNT/A-DF39; 配列番号: 210のBoNT/A-D8; 配列番号: 211のBoNT/A-E8; 配列番号: 212のBoNT/A-F8;または配列番号: 213のBoNT/A-D8をコードする、pSecTag2発現構築物を作成する。
細胞株で修飾されたクロストリジウム毒素を一過的に発現させるために、約1.5x105 SH-SY5Y細胞を、10% ウシ胎児血清 (FBS), 1x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) および 1x MEM 非必須アミノ酸溶液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)で補充した、3mLの完全Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)を含む35mm組織培養ディッシュにプレーティングし、約5x105 細胞/ml (6-16 時間)の濃度に到達するまで、３７℃インキュベーターで、５％二酸化炭素下で培養する。5分間室温でインキュベートした15μLのLipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む250μLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumを、修飾されたクロストリジウム毒素をコードする5μgのpSecTag2発現構築物、例えば、pSecTag2/BoNT/A-A17を含む250μLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumに添加することにより、500μLのトランスフェクション溶液を調製する。このトランスフェクションを室温で約２０分間インキュベートする。完全な補充されたDMEM培地を2mLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumで置換し、500μLのトランスフェクション溶液をSH-SY5Y細胞に添加し、細胞を、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約6-18時間インキュベートする。トランスフェクション培地を3mLの新しい完全な、補充されたDMEM培地で置き換え、細胞を、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約48時間インキュベートする。培地と細胞の両方を、BoNT/A-A17の発現の解析のために回収する。培地を、15mLのスナップキャップチューブに培地を移し、残骸を除くためにチューブを５分間500Xgで遠心することにより回収する。細胞を、3.0mLの100mMリン酸緩衝化食塩水、pH7.4で洗浄することにより回収し、62.6 mM 2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール 塩酸 (Tris-HCl)、pH 6.8 および 2% ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を含む緩衝液で細胞を溶解する。培地および細胞の両方を2x LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に加え、BoNT/A-A17を発現するpSecTag2発現構築物を単離するために、発現を、抗-BoNT/A 抗-c-mycまたは抗-His 抗体を用いたウエスタンブロット（実施例５に記載されたような）により測定する。同様の手順を、配列番号: 204から配列番号: 213までの修飾されたクロストリジウム毒素のいずれかをコードするpSecTag2発現構築物を一過的に発現させるために使用することができる。
修飾されたクロストリジウム毒素を安定的に発現する細胞株を作成するために、約1.5x105 SH-SY5Y細胞を、10% ウシ胎児血清 (FBS), 1x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) および 1x MEM 非必須アミノ酸溶液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)で補充した、3mLの完全Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)を含む35mm組織培養ディッシュにプレーティングし、約5x105 細胞/ml (6-16 時間)の濃度に到達するまで、３７℃インキュベーターで、５％二酸化炭素下で培養する。5分間室温でインキュベートした15μLのLipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む250μLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumを、修飾されたクロストリジウム毒素をコードする5μgのpSecTag2発現構築物、例えば、pSecTag2/BoNT/A-A17を含む250μLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumに添加することにより、500μLのトランスフェクション溶液を調製する。このトランスフェクションを室温で約２０分間インキュベートする。完全な補充されたDMEM培地を2mLのOPTI-MEM Reduced Serum Mediumで置換し、500μLのトランスフェクション溶液をSH-SY5Y細胞に添加し、細胞を、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約6-18時間インキュベートする。トランスフェクション培地を3mLの新しい完全な、補充されたDMEM培地で置き換え、細胞を、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約48時間インキュベートする。培地を、約5μg/mLのゼオシン（登録商標）、10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) および1x MEM 非必須アミノ酸溶液(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を含む、3mLの新しい完全なDMEMで置換する。細胞を、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約3-4週間インキュベートし、古い培地は、新しいゼオシン（登録商標）選択的、完全な補充されたDMEMで４から５日毎に置換する。一度、ゼオシン（登録商標）耐性コロニーが確立されると、耐性コロニーを、これらの細胞が、約6から20x105 cells/mLに達するまで、約5μg/mlのゼオシン（登録商標）、10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) および1x MEM 非必須アミノ酸溶液(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を含む、35mmの培養プレートに再プレーティングする。pSecTag2/BoNT/A-A17が安定的に組み込まれたSH-SY5Y細胞株からのBoNT/A-A17の発現を試験するために、それぞれの細胞株からの約1.5x105 SH-SY5Y細胞を、3mlのゼオシン（登録商標）選択的、完全、補充されたDMEMを含む35mmの組織培養ディッシュにプレーティングし、細胞が約5x105 cells/mLに達するまで、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで培養する（6-16時間）。培地を3mLの新しいゼオシン（登録商標）選択的、完全、補充されたDMEMに置換し、5%二酸化炭素下３７℃インキュベーターで約48時間インキュベートする。培地および細胞の両方を、BoNT/A-A17-c-myc-Hisの発現解析のために回収する。培地を、15mLのスナップキャップチューブに培地を移し、残骸を除くためにチューブを５分間500Xgで遠心することにより回収する。細胞を、3.0mLの100mMリン酸緩衝化食塩水、pH7.4で洗浄することにより回収し、62.6 mM 2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール 塩酸 (Tris-HCl)、pH 6.8 および 2% ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を含む緩衝液で細胞を溶解する。培地および細胞の両方を2x LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)に加え、BoNT/A-A17を発現するSH-SY5Y細胞株を単離するために、発現を、抗-BoNT/A 抗-c-mycまたは抗-His 抗体を用いたウエスタンブロット（実施例５に記載されたような）により測定する。最も高いBoNT/A-A17の発現レベルを示す確立されたSH-SY5Y細胞株を、3Lフラスコを用いた大量発現のために選択する。大量発現のための手法は、スタートの体積が約800-1000mLの完全DMEMであり、そして、全ての試薬の濃度が、この体積に対して正比例に増加すること以外は、上記に概要される。同様の手法を、配列番号: 204から配列番号: 213までの修飾されたクロストリジウム毒素のいずれかをコードするpSecTag2発現構築物を安定的に発現させるために使用することができる。
BoNT/A-A17を、実施例８で記載したIMAC手法を用いて精製する。生産されるBoNT/A-A17の量を決定するために、各培養からの発現を、Bradford dyeアッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウエスタンブロット解析（実施例８に記載のような）により評価する。
本発明の態様を開示された実施態様を参照して記載したが、当業者は、開示された特定の実施例が、これらの態様の例だけに過ぎず、本発明を決して限定しないことを容易に理解する。本発明の精神から離れることなく、多様な修飾がなされ得る。
Claims (4)
- 二本鎖ループ領域内に位置するクロストリジウム基質切断部位を含む、修飾されたクロストリジウム毒素。
- 請求項１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
- 請求項２に記載のポリヌクレオチド分子を細胞で発現させる工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素を製造する方法であって、ポリヌクレオチド分子からの発現が、請求項１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素を産生する、方法。
- ａ．請求項２に記載のポリヌクレオチド分子を細胞に導入すること；および
ｂ．ポリヌクレオチド分子を発現させること（ただし、ポリヌクレオチド分子からの発現が、請求項１に記載の修飾されたクロストリジウム毒素を産生する）
工程を含む、修飾されたクロストリジウム毒素を製造する方法。
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