ES2341892T3 - Toxinas clostridiales activables por toxinas clostridiales. - Google Patents
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Abstract
Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en la región del bucle bicatenario.
Description
Toxinas clostridiales activables por toxinas
clostridiales.
La presente solicitud de patente reivindica
prioridad conforme a 35 U.S.C. \NAK119(e) respecto de la
solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie
60/718.616 presentada el 19 de septiembre de 2005.
La capacidad de las toxinas clostridiales, tales
como, p. ej., las neurotoxinas botulínicas (BoNT) BoNT/A, BoNT/B,
BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, la neurotoxina tetánica
(TeNT), la neurotoxina de C. Baratii (BaNT) y la neurotoxina
butírica (BuNT), para inhibir la transmisión neuronal se está
explotando en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y
cosméticas, véase, p. ej., William J. Lipham, "COSMETIC AND
CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN" (Slack, Inc., 2004).
Las toxinas clostridiales comercialmente disponibles como
composiciones farmacéuticas incluyen las preparaciones de BoNT/A,
tales como, p. ej., BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA),
Dysport®/Reloxin®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Inglaterra),
Linurase® (Prollenium, Inc., Ontario, Canadá), Neuronox®
(Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea
del Sur), BTX-A (Lanzhou Institute Biological
Products, China) y Xeomin® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt,
Alemania); y las preparaciones de BoNT/B, tales como, p. ej.,
MyoBloc^{TM}/NeuroBloc^{TM} (Elan Pharmaceuticals, San
Francisco, CA). Como ejemplo, el BOTOX® está aprobado en la
actualidad en uno o más países para las siguientes indicaciones:
acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda,
blefaroespasmo, bruxomanía, distonía cervical, temblor esencial,
líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza,
espasmo hemifacial, hiperactividad de vejiga, hiperhidrosis,
parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos
mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica,
estrabismo y trastorno nervioso VII.
El creciente uso de terapias con toxinas
clostridiales en el tratamiento de una amplia selección de dolencias
del ser humano hace necesario aumentar la eficiencia con la que se
producen estas toxinas. Sin embargo, puede resultar difícil cubrir
las necesidades de la creciente demanda de tales tratamientos con
toxinas. Un problema por resolver es la necesidad de convertir
todas las toxinas clostridiales en la forma bicatenaria de la
molécula para conseguir una actividad óptima. Históricamente, esta
conversión se ha hecho en uno de estos dos modos. El primer
procedimiento simplemente purifica una toxina clostridial de la
propia cepa bacteriana, basándose, de ese modo, en la proteasa
endógena natural usada para convertir la forma monocatenaria de la
toxina en la forma bicatenaria. El segundo procedimiento utiliza
una proteasa exógena que convierte la forma monocatenaria en la
cadena doble, bien aprovechando un sitio de escisión fortuito
encontrado en la ubicación apropiada o mediante el diseño genético
de un sitio de escisión por proteasa de las proteasas exógenas
comercialmente disponibles que se usan habitualmente. Sin embargo,
ambos procedimientos presentan varias desventajas. Por ejemplo, los
procedimientos que emplean una proteasa endógena tienen bajos
rendimientos de toxina, porque las cepas clostridiales nativas
habitualmente producen poca toxina. Además, estas cepas son poco
apropiadas para la investigación, dificultando así los esfuerzos
por mejorar las características terapéuticas y cosméticas de las
toxinas clostridiales sometidas a manipulación genética. Por último,
hay varias cepas clostridiales que no producen la proteasa endógena
necesaria para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la
forma bicatenaria. Una desventaja del uso de proteasas exógenas es
la falta de especificidad de la proteasa que da como resultado
toxina inactiva debido a la escisión proteolítica de ubicaciones
inapropiadas. Además, muchas de las proteasas actualmente
disponibles proceden de fuentes animales que no cumplen las normas
de correcta fabricación (NCF), por lo que requieren más etapas de
purificación durante el procedimiento de fabricación. De este modo,
los procedimientos usados actualmente para convertir la forma
monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria son ineficaces,
incómodos de realizar y conducen a unos costes globales de
producción mayores. Estas desventajas representan un obstáculo
relevante para la producción comercial a escala global de las
toxinas clostridiales y constituyen, por tanto, un problema muy
importante, pues las formas bicatenarias de estas toxinas son
necesarias para aplicaciones científicas, terapéuticas y cosméticas.
Además, están en aumento tanto la cantidad de toxinas clostridiales
que se prevé para futuras terapias como la demanda de toxinas con
mayores propiedades terapéuticas. Por lo tanto, existe la necesidad
de desarrollar mejores procedimientos para generar moléculas
bicatenarias de toxinas clostridiales para cubrir esta
necesidad.
La presente invención proporciona toxinas
clostridiales modificadas que se basan en un nuevo procedimiento
para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma
bicatenaria. Éstas y otras ventajas relacionadas son útiles para
diversas aplicaciones clínicas, terapéuticas y cosméticas, tales
como, p. ej., el tratamiento de trastornos neuromusculares,
trastornos neuropáticos, trastornos oculares, dolor, daños
musculares, dolor de cabeza, enfermedades cardiovasculares,
trastornos neurosiquiátricos, trastornos endocrinos, cánceres,
trastornos óticos y líneas faciales hipercinéticas, así como otros
trastornos en los que la administración de toxinas clostridiales a
un mamífero puede producir un efecto beneficioso.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra un esquema del paradigma
actual del procesamiento posterior a la traducción de las toxinas
clostridiales. Las toxinas clostridiales son traducidas en forma de
un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que
comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un
dominio de unión. Un enlace disulfuro formado desde un residuo de
cisteína del dominio enzimático y un residuo de cisteína del dominio
de translocación forma un bucle bicatenario. En este bucle
bicatenario hay un sitio de escisión por proteasa para una proteasa
natural que puede ser producida endógenamente desde la cepa
clostridial que sintetiza la toxina, o exógenamente desde una
fuente encontrada en el medio ambiente. La escisión del sitio de
escisión por proteasa por parte de la proteasa natural convierte la
forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. La forma
bicatenaria de la toxina se mantiene unida por el enlace tipo
disulfuro y las interacciones no covalentes que hay entre las
dos
cadenas.
cadenas.
La Fig. 2 muestra un esquema del paradigma
actual de la liberación de neurotransmisores y la intoxicación con
toxinas clostridiales en una neurona central y periférica. La Fig.
2a muestra un esquema del mecanismo de la liberación de
neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de
liberación se puede describir como aquél que comprende dos etapas:
1) acoplamiento de la vesícula, en el que la proteína SNARE unida a
una vesícula que contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con
las proteínas SNARE de unión a la membrana ubicadas en la membrana
plasmática; 2) liberación de neurotransmisores, en la que la
vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas
neurotransmisoras son sometidas a exocitosis. La Fig. 2b muestra un
esquema del mecanismo intoxicación por la actividad de las toxinas
tetánica y botulínica de una neurona central y periférica. El
proceso de intoxicación se puede describir como aquél que comprende
cuatro etapas: 1) unión a un receptor, en la que la toxina
clostridial se une a un sistema receptor clostridial e inicia el
proceso de intoxicación; 2) interiorización del complejo, en el que
tras la unión de la toxina, una vesícula que contiene el complejo
de toxina/sistema receptor es sometida a endocitosis dentro de la
célula; 3) translocación de la cadena ligera, en la que múltiples
hechos dan lugar a la liberación de la cadena ligera activa dentro
del citoplasma; y 4) modificación de la diana enzimática, en la que
la cadena ligera activa de la toxina clostridial escinde
proteolíticamente su sustrato de SNARE diana, tal como, p. ej.,
SNAP-25, VAMP o sintaxina, evitando así el
acoplamiento de la vesícula y la liberación de neurotrans-
misores.
misores.
La Fig. 3 muestra un esquema de la ubicación
subcelular y los sitios de escisión de la SNAP-25,
VAMP y sintaxina. La VAMP se ubica en la membrana de la vesícula
sináptica, mientras que la SNAP-25 y la sintaxina se
ubican en la membrana plasmática. BoNT/A y BoNT/E escinden a la
SNAP-25 cerca del terminal carboxilo, liberando
nueve o 26 residuos, respectivamente. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F,
BoNT/G y TeNT actúan sobre la parte central conservada de la VAMP
(recuadro blanco) y liberan la mitad citosólica
amino-terminal de la VAMP en el citosol. BoNT/C1
escinde a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo,
así como escinde a la sintaxina en un único sitio cerca de la
superficie de la membrana citosólica. La acción de BoNT/C1 da como
resultado la liberación de una gran parte del dominio citosólico de
la sintaxina, mientras que sólo se libera una pequeña parte de la
SNAP-25 mediante la proteolisis selectiva de
BoNT/C1.
La Fig. 4 muestra un esquema de toxinas
clostridiales modificadas. La Fig. 4a muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/A derivado, p. ej., de
un miembro de la familia de la SNAP-25 susceptible a
la escisión por BoNT/A. La escisión del sitio de escisión de BoNT/A
por parte de BoNT/A convierte la forma monocatenaria de la toxina
modificada en la forma bicatenaria. La Fig. 4b muestra una toxina
clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un
dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle
bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la
toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/E
derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la
SNAP-25 susceptible a la escisión por BoNT/E. La
escisión del sitio de escisión de BoNT/E por parte de BoNT/E
convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la
forma
bicatenaria.
bicatenaria.
La Fig. 5 muestra un esquema de toxinas
clostridiales modificadas. La Fig. 5a muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/B derivado, p. ej., de
un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por
BoNT/B. La escisión del sitio de escisión de BoNT/B por parte de
BoNT/B convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en
la forma bicatenaria. La Fig. 5b muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/D derivado, p. ej., de
un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por
BoNT/D. La escisión del sitio de escisión de BoNT/D por parte de
BoNT/D convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en
la forma bicatenaria. La Fig. 5c muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/F derivado, p. ej., de un
miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por
BoNT/F. La escisión del sitio de escisión de BoNT/F por parte de
BoNT/F convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en
la forma bicatenaria. La Fig. 5d muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/G derivado, p. ej., de un
miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por
BoNT/G. La escisión del sitio de escisión de BoNT/G por parte de
BoNT/G convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en
la forma bicatenaria. La Fig. 5e muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de TeNT derivado, p. ej., de un
miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por TeNT.
La escisión del sitio de escisión de TeNT por parte de TeNT
convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la
forma bicatenaria.
La Fig. 6 muestra un esquema de toxinas
clostridiales modificadas. La Fig. 6a muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/C1 derivado, p. ej., de
un miembro de la familia de la sintaxina susceptible a la escisión
por BoNT/C1. La escisión del sitio de escisión de BoNT/C1 por parte
de BoNT/C1 convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada
en la forma bicatenaria. La Fig. 6b muestra una toxina clostridial
modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de
translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que
incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial
que comprende un sitio de escisión de BoNT/C1 derivado, p. ej., de
un miembro de la familia de la SNAP-25 susceptible a
la escisión por BoNT/C1. La escisión del sitio de escisión de
BoNT/C1 por parte de BoNT/C1 convierte la forma monocatenaria de la
toxina modificada en la forma
bicatenaria.
bicatenaria.
La Fig. 7 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-A17
que comprende una molécula de polinucleótido de la SEC ID N.º 225
que codifica una BoNT/A modificada de SEC ID N.º 203 ligada
operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina
carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la
proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de
unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son
las siguientes: P_{T7}: una región promotora del bacteriófago T7;
ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que
codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación
de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un
dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis:
una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión
a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la
transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de
replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de
polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere
resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322
de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de
polinucleótido que codifica una lactosa
I.
I.
La Fig. 8 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota
pET29b/BoNT/A-BT35 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 227 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 205 ligada operativamente a un polipéptido
de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un
sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente
entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A
modificada. Las abreviaturas son las siguientes: P_{T7}: una
región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de
polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; BT35:
una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión
del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato de TeNT;
TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de
translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que
codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina;
6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de
unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la
transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de
replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de
polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere
resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322
de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de
polinucleótido que codifica una lactosa I.
La Fig. 9 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota
pET29b/BoNT/A-Csyn8 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 229 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 207 ligada operativamente a un polipéptido
de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un
sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente
entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A
modificada. Las abreviaturas son las siguientes: P_{T7}: una
región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de
polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; Csyn8:
una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión
del sustrato de BoNT/C1; TD, una molécula de polinucleótido que
codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de
polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A;
Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de
escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que
codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región
de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de
f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una
molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa
que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un
origen de pBR322 de la región de replicación plasmídica; lacl: una
molécula de polinucleótido que codifica una lactosa
I.
I.
La Fig. 10 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota
pET29b/BoNT/A-DF39 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 231 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 209 ligada operativamente a un polipéptido
de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un
sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente
entre el polipéptido de unión a la polihistidina y la BoNT/A
modificada. Las abreviaturas son las siguientes: P_{T7}: una
región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de
polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; DF39:
una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión
del sustrato de BoNT/D y un sitio de escisión del sustrato de
BoNT/F; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que
codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina;
6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de
unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la
transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de
replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de
polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere
resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322
de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de
polinucleótido que codifica una lactosa I.
La Fig. 11 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-E8
que comprende una molécula de polinucleótido de la SEC ID N.º 233
que codifica una BoNT/A modificada de SEC ID N.º 211 ligada
operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina
carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la
proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de
unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son
las siguientes: P_{T7}: una región promotora del bacteriófago T7;
ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
enzimático de BoNT/A; E8: una molécula de polinucleótido que
codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/E; TD, una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación
de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un
dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis:
una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión
a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la
transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de
replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de
polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere
resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322
de la región de replicación de plásmidos; lacl: una molécula de
polinucleótido que codifica una lactosa
I.
I.
La Fig. 12 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-G8
que comprende una molécula de polinucleótido de la SEC ID N.º 235
que codifica una BoNT/A modificada de SEC ID N.º 213 ligada
operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina
carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la
proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de
unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son
las siguientes: P_{T7}: una región promotora del bacteriófago T7;
ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
enzimático de BoNT/A; G8: una molécula de polinucleótido que
codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/G; TD, una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación
de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un
dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis:
una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión
a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la
transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de
replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de
polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere
resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322
de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de
polinucleótido que codifica una lactosa
I.
I.
La Fig. 13 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión de levadura pPICZ
A/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 236 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 203 ligada operativamente a los
polipéptidos carboxi-terminales de unión a
polihistidina y c-myc. Las abreviaturas son las
siguientes: P_{AOX1}: una región promotora de la aldehído oxidasa
1; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que
codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación
de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un
dominio de unión de BoNT/A; c-myc: una molécula de
polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a
c-myc; 6xHis: una molécula de polinucleótido que
codifica un polipéptido de unión a polihistidina; AOX1 TT: una
región de terminación de la transcripción de la aldehído oxidasa 1;
Zeocin^{TM}: una molécula de polinucleótido que codifica un
polipéptido de resistencia a Zeocin^{TM}; origen de pUC: un
origen de pUC de la región de replicación plasmídica.
La Fig. 14 muestra un mapa plasmídico del
constructo de transferencia de baculovirus
pBACgus3/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 237 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 203 ligada operativamente a un polipéptido
de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un
sitio de escisión de la proteasa trombina ligado operativamente
entre la BoNT/A modificada y el polipéptido de unión a
polihistidina. Las abreviaturas son las siguientes: P_{PH}: una
región promotora de polihedrina; gp64: una molécula de
polinucleótido que codifica un polipéptido señal gp64; ED: una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de
BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido
que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una
molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de
BoNT/A; Trombina: una molécula de polinucleótido que codifica un
sitio de escisión de la proteasa trombina; 6xHis: una molécula de
polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a
polihistidina; origen de pUC: un origen de pUC de la región de
replicación plasmídica; Ampicilina: una molécula de polinucleótido
que codifica una \beta-lactamasa que confiere
resistencia a la ampicilina; origen de f1: un origen de replicación
del bacteriófago f1; gus: una molécula de polinucleótido que
codifica una \beta-
glucuronidasa.
glucuronidasa.
La Fig. 15 muestra un mapa plasmídico del
constructo de expresión en mamíferos
pSecTag2/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de
polinucleótido de la SEC ID N.º 238 que codifica una BoNT/A
modificada de SEC ID N.º 203 ligada operativamente a los
polipéptidos carboxi-terminales de unión a
polihistidina y c-myc. Las abreviaturas son las
siguientes: P_{CMV}: una región promotora de citomegalovirus; IgK:
una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de una
inmunoglobulina K; ED: una molécula de polinucleótido que codifica
un dominio enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de
BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio
de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que
codifica un dominio de unión de BoNT/A; c-myc: una
molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a
c-myc; 6xHis; una molécula de polinucleótido que
codifica un polipéptido de unión a polihistidina; BGH pA: un sitio
de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino; origen de
f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; P_{SV40}: una
región promotora del virus de simio 40; Zeocin^{TM}: una región
que codifica un polipéptido de resistencia a Zeocin^{TM}; origen
de pUC: un origen de pUC de la región de replicación plasmídica;
Ampicilina: una molécula de polinucleótido que codifica una
\beta-lactamasa que confiere resistencia a
la
ampicilina.
ampicilina.
\vskip1.000000\baselineskip
Las toxinas clostridiales producidas por
Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium
baratii y Clostridium butyricum son las más usadas en
tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros
mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete tipos
antigénicamente distintos de toxinas botulínicas (BoNT) que han
sido identificados mediante la investigación de brotes de botulismo
en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D) o han
sido aislados del suelo (BoNT/G). Las BoNT poseen entre sí una
identidad de los aminoácidos del aproximadamente 35% y comparten la
misma organización de los dominios funcionales y la misma
arquitectura estructural global. Los expertos en la técnica
reconocen que, dentro de cada tipo de toxina clostridial, pueden
existir subtipos que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y
también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por
ejemplo, en la actualidad, hay cuatro subtipos de BoNT/A, BoNT/A1,
BoNT/A2, BoNT/A3 y BoNT/A4, mostrando los subtipos específicos una
identidad de los aminoácidos del aproximadamente 89% al ser
comparados con otro subtipo de BoNT/A. Aunque los siete serotipos
de BoNT tienen estructura y propiedades farmacológicas similares,
cada uno presenta además características bacteriológicas
heterogéneas. Por el contrario, la toxina tetánica (TeNT) es
producida por un grupo uniforme de C. tetani. Otras dos
especies clostridiales, C. baratii y C. butyricum,
también producen toxinas BaNT y BuNT, respectivamente, que son
similares a BoNT/F y BoNT/E,
respectivamente.
respectivamente.
Las toxinas clostridiales son traducidas en
forma de polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que,
posteriormente, es escindido mediante escisión proteolítica dentro
de un bucle de disulfuro por una proteasa natural (Fig. 1). Esta
escisión tiene lugar dentro de una región del bucle bicatenario
diferenciada creada entre dos residuos de cisteína que forman un
enlace de tipo disulfuro. Este procesamiento posterior a la
traducción produce una molécula bicatenaria que comprende una
cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada
(HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen juntas por el único
enlace de tipo disulfuro y por interacciones no covalentes entre
las dos cadenas. Actualmente se desconoce la proteasa natural usada
para convertir la molécula monocatenaria en la cadena doble. En
algunos serotipos, tales como, p. ej., BoNT/A, la proteasa natural
se produce endógenamente por el serotipo bacteriano y la escisión
tiene lugar dentro de la célula antes de que la toxina sea liberada
en el medio ambiente. Sin embargo, en otros serotipos, tales como,
p. ej., BoNT/E, la cepa bacteriana parece no producir una proteasa
endógena capaz de convertir la forma monocatenaria de la toxina en
la forma bicatenaria. En estas situaciones, la toxina se libera de
la célula en forma de toxina monocatenaria que luego es
posteriormente convertida en la forma bicatenaria por una proteasa
natural encontrada en el medio
ambiente.
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(Continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Cada molécula bicatenaria madura comprende tres
dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático ubicado
en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una
actividad endopeptidasa dependiente del cinc que se dirige
específicamente a los componentes del núcleo del aparto de
liberación de neurotransmisores (Tabla 1); 2) un dominio de
translocación contenido en la mitad amino-terminal
de la HC (H_{N}) que facilita la liberación de la LC desde las
vesículas intracelulares hacia el citoplasma de la célula diana
(Tabla 1); y 3) un dominio de unión encontrado en la mitad
carboxi-terminal de la HC (H_{C}) que determina la
actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina con el
complejo receptor ubicado en la superficie de la célula
diana
(Tabla 1).
(Tabla 1).
Todas las actividades de unión, de translocación
y enzimática de estos tres dominios funcionales son necesarias para
la toxicidad. Aunque todavía no se conocen con exactitud todos los
detalles de este proceso, el mecanismo de intoxicación celular
global mediante el cual las toxinas clostridiales entran en una
neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar
independientemente del tipo. Aunque los solicitantes no desean
quedar limitados a la siguiente descripción, se puede describir el
mecanismo de intoxicación como aquél que comprende al menos cuatro
etapas: 1) unión a un receptor, 2) interiorización del complejo, 3)
translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana
enzimática (véase la Fig. 2). El proceso se inicia cuando el
dominio H_{C} de una toxina clostridial se une a un complejo
receptor específico de una toxina ubicado en la superficie de la
membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la
especificidad de unión de un complejo receptor se consigue, en
parte, por la combinaciones específicas de los gangliósidos y los
receptores de proteínas que parecen comprender con claridad cada
complejo de receptor y toxina clostridial. Una vez unidos, los
complejos de toxina/receptor son interiorizados mediante endocitosis
y las vesículas interiorizadas son clasificadas en vías
intracelulares específicas. La etapa de translocación parece estar
desencadenada por la acidificación del compartimento vesicular.
Este proceso parece iniciar dos importantes reajustes estructurales
dependientes del pH que aumentan la hidrofobicidad y promueven la
formación de la forma bicatenaria de la toxina. Una vez activada,
la endopeptidasa de la cadena ligera de la toxina es liberada de la
vesícula intracelular en el citosol, en el que se dirige
específicamente a uno de los tres componentes del núcleo conocidos
del aparato de liberación de neurotransmisores. Estas proteínas del
núcleo, la proteína de membrana asociada a vesículas
(VAMP)/sinaptobrevina, la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa
(SNAP-25) y la sintaxina, son necesarias para el
acoplamiento de la vesícula sináptica y la fusión en el terminal
nervioso, y son miembros de la familia de receptores de proteínas
de unión al factor sensible a la N-etilmaleimida (SNARE).
BoNT/A y BoNT/E escinden a la SNAP-25 en la región
carboxiterminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis
aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también escinde a la
SNAP-25 cerca del terminal carboxilo. Los serotipos
botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y la toxina tetánica
actúan sobre la parte central conservada de la VAMP y liberan la
mitad amino-terminal de la VAMP en el citosol.
BoNT/C1 escinde a la sintaxina en un único sitio cerca de la
superficie de la membrana citosólica. La proteolisis selectiva de
los SNARE sinápticos es responsable del bloqueo de la liberación de
neurotransmisores provocado por las toxinas clostridiales in
vivo. Las dianas de proteínas SNARE de las toxinas
clostridiales son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos
no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad
peptidasa de la cadena ligera inhibe la exocitosis, Véase, p. ej.,
Yann Humeau et al., "How Botulinum and Tetanus Neurotoxins
Block Neurotransmitter Release", 82(5) Biochimie.
427-446 (2000); Kathryn Turton et al.,
"Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and
Therapeutic Utility", 27(11) Trends Biochem. Sci.
552-558. (2002); Giovanna Lalli et al.,
"The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons",
11(9) Trends Microbiol., 431-437,
(2003).
La presente invención revela toxinas
clostridiales modificadas que se pueden convertir de la forma de
polipéptido monocatenario a la forma bicatenaria usando la
actividad enzimática de una toxina clostridial. Esto se consigue
reemplazando el sitio de escisión de una proteasa natural encontrado
en la región del bucle bicatenario por un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial. En una modificación en la que la
sustitución del sitio de escisión del sustrato de toxina
clostridial es el sustrato para la toxina clostridial, la activación
se realiza usando una toxina clostridial que tenga una actividad
enzimática de BoNT/A. Esta sustitución del sitio de escisión
permitirá a estas toxinas modificadas activarse entre sí, eliminando
la dependencia de una proteasa diferente. Por ejemplo, una BoNT/A
modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
permitirá a una toxina clostridial que tenga actividad enzimática
de BoNT/A escindir el sitio de escisión del sustrato de BoNT/A de
la BoNT/A modificada, produciendo así la forma bicatenaria de la
toxina. En una modificación en la que la sustitución del sitio de
escisión del sustrato de toxina clostridial es el sustrato para una
toxina clostridial diferente, la activación se realiza usando una
toxina clostridial que tenga una actividad enzimática de BoNT/C1.
Por ejemplo, una BoNT/A modificada que comprende un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 permitirá a una toxina clostridial
que tenga actividad enzimática de BoNT/C1 escindir el sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1 de la BoNT/A modificada,
produciendo así la forma bicatenaria de la
toxina.
toxina.
Los aspectos de la presente invención
proporcionan toxinas clostridiales modificadas que comprenden un
sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en las que el
sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en
una región del bucle bicatenario de la toxina clostridial
modificada. Se prevé el uso de cualquier sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de
TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT y un sitio de
escisión de sustrato de BuNT.
Otros aspectos de la presente invención
proporcionan moléculas de polinucleótido que codifican toxinas
clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial, en las que el sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle
bicatenario.
Otros aspectos de la presente invención
proporcionan procedimientos para producir una toxina clostridial
modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario. Otros
aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para
producir en una célula una toxina clostridial modificada que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial,
en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial
está ubicado en la región del bucle bicatenario y para expresar el
constructo de expresión en la célula
Los aspectos de la presente invención
proporcionan, en parte, una toxina clostridial. Como se usa en la
presente memoria, la expresión "toxina clostridial" significa
cualquier polipéptido que pueda ejecutar el mecanismo celular
global mediante el cual una toxina clostridial entra en una neurona
e inhibe la liberación de neurotransmisores, y engloba la unión de
una toxina clostridial a un complejo receptor de baja o alta
afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la
translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el
citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina
clostridial.
Una toxina clostridial incluye, sin limitación,
variantes naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej.,
isoformas de toxinas clostridiales y subtipos de toxinas
clostridiales; variantes no naturales de toxinas clostridiales,
tales como, p. ej., variantes conservadoras de toxinas
clostridiales, variantes no conservadoras de toxinas clostridiales,
variantes quiméricas de toxinas clostridiales y fragmentos activos
de toxinas clostridiales de las mismas, o cualquier combinación de
las mismas. Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante de toxina clostridial", bien sea natural o no
natural, significa una toxina clostridial que tiene al menos un
cambio de un aminoácido de la región correspondiente de las
secuencias de referencia reveladas (véase la Tabla 1) y se puede
describir en porcentaje de identidad con la región correspondiente
de esa secuencia de referencia. Como ejemplos no restrictivos, una
variante de BoNT/A que comprende los aminoácidos
1-1296 de la SEC ID N.º 1 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región
de los aminoácidos 1-1296 de la SEC ID N.º 1; una
variante de BoNT/B que comprende los aminoácidos
1-1291 de la SEC ID N.º 2 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la
región de los aminoácidos 1-1291 de la SEC ID N.º 2;
una variante de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos
1-1291 de la SEC ID N.º 3 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región
de los aminoácidos 1-1291 de la SEC ID N.º 3; una
variante de BoNT/D que comprende los aminoácidos
1-1276 de la SEC ID N.º 4 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la
región de los aminoácidos 1-1276 de la SEC ID N.º 4;
una variante de BoNT/E que comprende los aminoácidos
1-1252 de la SEC ID N.º 5 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región
de aminoácidos 1-1252 de la SEC ID N.º 5; una
variante de BoNT/F que comprende los aminoácidos
1-1274 de la SEC ID N.º 6 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la
región de los aminoácidos 1-1274 de la SEC ID N.º 6;
una variante de BoNT/G que comprende los aminoácidos
1-1297 de la SEC ID N.º 7 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región
de los aminoácidos 1-1297 de la SEC ID N.º 7; y una
variante de TeNT que comprende los aminoácidos
1-1315 de la SEC ID N.º 8 tendrá al menos una
diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución,
eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la
región de aminoácidos 1-1315 de la SEC ID
N.º 8.
N.º 8.
Se puede usar cualquiera de una variedad de
procedimientos de alineación de secuencias para determinar el
porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación, procedimientos
globales, procedimientos locales y procedimientos híbridos, tales
como, p. ej., los procedimientos de aproximación de segmentos. Los
protocolos para determinar el porcentaje de identidad son
procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la
técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente
memoria.
\newpage
Los procedimientos globales alinean secuencias
del principio al fin de la molécula y determinan el mejor
alineamiento sumando las puntuaciones de los pares de residuos
individuales e imponiendo penalizaciones por los huecos. Los
procedimientos no restrictivos incluyen, p. ej., CLUSTAL W, véase,
p. ej., Julie D. Thompson et al., "CLUSTAL W: Improving
the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through
Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties
and Weight Matrix Choice"; 22(22) Nucleic Acids
Research 4673-4680 (1994); y la mejora
iterativa, véase, p. ej., Osamu Gotoh, "Significant Improvement in
Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative
Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments",
264(4) J. Mol. Biol. 823-838
(1996).
(1996).
Los procedimientos locales alinean secuencias
mediante la identificación de uno o más motivos conservados
compartidos por todas las secuencias de entrada. Los procedimientos
no restrictivos incluyen, p. ej., Match-box, véase,
p. ej., Eric Depiereux y Ernest Feytmans,
"Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the
Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences",
8(5) CABIOS 501-509 (1992); el muestreo de
Gibbs, véase, p. ej., C. E. Lawrence et al., "Detecting
Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple
Alignment", 262(5131) Science
208-214 (1993); Align-M, véase, p.
ej., Ivo Van Walle et al., "Align-M - A New
Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences",
20(9) Bioinformatics, :1428-1435
(2004).
Los procedimientos híbridos combinan aspectos
funcionales de los procedimientos de alineamiento tanto globales
como locales. Los procedimientos no restrictivos incluyen, p. ej.,
la comparación segmento a segmento, véase, p. ej., Burkhard
Morgenstern et al., "Multiple DNA and Protein Sequence
Alignment Based On
Segment-To-Segment Comparison",
93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
12098-12103 (1996); T-Coffee, véase,
p. ej., Cédric Notredame
et al., "T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment", 302 (1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, p. ej., Robert C. Edgar, "MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput", 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); y DIALIGN-T, véase, p. ej., Amarendran R. Subramanian et al., "DIALIGN-T.- An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment", 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).
et al., "T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment", 302 (1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, p. ej., Robert C. Edgar, "MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput", 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); y DIALIGN-T, véase, p. ej., Amarendran R. Subramanian et al., "DIALIGN-T.- An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment", 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante natural de toxina clostridial" significa cualquier
toxina clostridial producida sin la ayuda de la manipulación humana,
incluyendo, sin limitación, las isoformas de toxinas clostridiales
producidas a partir de transcriptos cortados y empalmados
alternativamente, las isoformas de toxinas clostridiales producidas
mediante la mutación espontánea y los subtipos de toxinas
clostridiales. Los ejemplos no restrictivos de una isoforma de
toxina clostridial incluyen, p. ej., isoformas de BoNT/A, isoformas
de BoNT/B, isoformas de BoNT/C1, isoformas de BoNT/D, isoformas de
BoNT/E, isoformas de BoNT/F, isoformas de BoNT/G e isoformas de
TeNT. Los ejemplos no restrictivos de un subtipo de toxina
clostridial incluyen, p. ej., los subtipos de BoNT/A BoNT/A1,
BoNT/A2, BoNT/A3 y BoNT/A4; los subtipos de BoNT/B BoNT/B1,
BoNT/B2, BoNT/B divalente y BoNT/B no proteolítica; los subtipos de
BoNT/C1 BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; los
subtipos de BoNT/E BoNT/E1, BoNT/E2 y BoNTE3; y los subtipos de
BoNT/F BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3 y BoNT/F4.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante no natural de toxina clostridial" significa cualquier
toxina clostridial producida con la ayuda de la manipulación
humana, incluyendo, sin limitación, las toxinas clostridiales
producidas mediante ingeniería genética usando mutagénesis aleatoria
o un diseño racional, y las toxinas clostridiales producidas
mediante síntesis química. Los ejemplos no restrictivos de las
variantes no naturales de toxinas clostridiales incluyen, p. ej.,
las variantes conservadoras de toxinas clostridiales, las variantes
no conservadoras de toxinas clostridiales, las variantes quiméricas
de toxinas clostridiales y los fragmentos activos de toxinas
clostridiales.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante conservadora de toxina clostridial" significa una
toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por
otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una
propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la
toxina clostridial de referencia (Tabla 1). Los ejemplos de
propiedades incluyen, sin limitación, un tamaño similar, topografía,
carga, hidrofobicidad, hidrofilidad, lipofilidad, capacidad de
unión covalente, capacidad de unión mediante enlaces de hidrógeno,
una propiedad fisicoquímica, y similares, o cualquier combinación de
las mismas. Una variante conservadora de toxina clostridial puede
funcionar de una manera sustancialmente igual a la toxina
clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora
de toxina clostridial, y se puede sustituir por la toxina
clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente
invención. Una variante conservadora de toxina clostridial puede
sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más
aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos,
diez o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos,
40 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos,
200 o más aminoácidos, 300 o más aminoácidos, 400 o más
aminoácidos, o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de
referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina
clostridial. Una variante conservadora de toxina clostridial
también puede sustituir al menos 10 aminoácidos contiguos, al menos
15 aminoácidos contiguos, al menos 20 aminoácidos contiguos, o al
menos 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de
referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina
clostridial, que posee una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de
los aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o
una identidad de los aminoácido del 95% con la toxina clostridial de
referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina
clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante
conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., las variantes
conservadoras de BoNT/A, las variantes conservadoras de BoNT/B, las
variantes conservadoras de BoNT/C1, las variantes conservadoras de
BoNT/D, las variantes conservadoras de BoNT/E, las variantes
conservadoras de BoNT/F, las variantes conservadoras de BoNT/G y
las variantes conservadoras de
TeNT.
TeNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante no conservadora de toxina clostridial" significa una
toxina clostridial en la que 1) al menos un aminoácido está
eliminado de la toxina clostridial de referencia en la que se basa
la variante no conservadora de toxina clostridial; 2) al menos un
aminoácido está añadido a la toxina clostridial de referencia en la
que se basa la toxina clostridial no conservadora; o 3) al menos un
aminoácido está sustituido por otro aminoácido o un análogo de
aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del
aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de
referencia (Tabla 1). Una variante no conservadora de toxina
clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar a
la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante
no conservadora de toxina clostridial, y se puede sustituir por la
toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente
invención. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede
eliminar uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más
aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y
diez o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la
que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una
variante no conservadora de toxina clostridial puede añadir uno o
más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos,
cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más
aminoácidos a la toxina clostridial de referencia en la que se basa
la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no
conservadora de toxina clostridial puede sustituir uno o más
aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro
o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos, diez o más aminoácidos,
20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos, 40 o más aminoácidos,
50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos, 200 o más aminoácidos,
300 o más aminoácidos, 400 o más aminoácidos, o 500 o más
aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se
basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante
no conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al
menos 10 aminoácidos contiguos, al menos 15 aminoácidos contiguos,
al menos 20 aminoácidos contiguos, o al menos 25 aminoácidos
contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa
la variante no conservadora de toxina clostridial, que posee una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de
los aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%,
una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los
aminoácido del 95% con la toxina clostridial de referencia en la
que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Los
ejemplos no restrictivos de una variante no conservadora de toxina
clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de BoNT/A,
variantes no conservadoras de BoNT/B, variantes no conservadoras de
BoNT/C1, variantes no conservadoras de BoNT/D, variantes no
conservadoras de BoNT/E, variantes no conservadoras de BoNT/F,
variantes no conservadoras de BoNT/G y variantes no conservadoras
de
TeNT.
TeNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante quimérica de toxina clostridial" significa una
molécula que comprende al menos una parte de una toxina clostridial
y al menos una parte de al menos otra proteína para formar una
toxina con al menos una propiedad diferente de las toxinas
clostridiales de referencia de la Tabla 1. Una clase de variante
quimérica de toxina clostridial comprende una toxina clostridial
modificada en la que el dominio de unión celular endógeno de una
toxina clostridial natural está bien modificado o reemplazado con
un dominio de unión celular de otra molécula. Tal toxina clostridial
modificada posee una actividad de unión celular alterada, porque la
toxina modificada puede, p. ej., usar el mismo receptor presente
sobre la superficie de una célula diana de toxina clostridial
natural, a lo que se denomina actividad de unión celular aumentada
para una célula diana de toxina clostridial natural; usar un
receptor diferente presente sobre la superficie de una célula diana
de toxina clostridial natural, a lo que se denomina actividad de
unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial
natural, o usar un receptor diferente presente sobre la superficie
de la célula diana de toxina no clostridial, a lo que se denomina
actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina
clostridial no
natural.
natural.
Una variante quimérica de toxina clostridial
puede ser una toxina clostridial modificada con una mayor actividad
de unión celular capaz de intoxicar una célula diana de toxina
clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Un modo de lograr
este aumento de la actividad de unión es mediante la modificación
del dominio diana endógeno de una toxina clostridial natural para
aumentar una actividad de unión celular de la toxina por su receptor
natural. Tales modificaciones realizadas en un dominio diana dan
como resultado, p. ej., una mayor actividad de unión celular que
aumenta la afinidad de unión por un receptor de toxina clostridial
endógeno presente en una célula diana de toxina clostridial
natural; una mayor actividad de unión celular que aumenta la
especificidad de unión por un subgrupo de receptores de toxinas
clostridiales endógenos presentes en una célula diana de toxina
clostridial natural; o una mayor actividad de unión celular que
aumenta tanto la afinidad de unión como la especificidad de unión.
En, p. ej., Lance E. Steward, et al., "Modified Clostridial
Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous
Clostridial Toxin Receptors", publicación de patente
internacional n.º 2006/008956 (14 de marzo de 2006), Lance E.
Steward, "Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation
Capability, and Enhanced Targeting Activity", solicitud de
patente provisional estadounidense n.º 60/807.063 (11 de julio de
2006), se describen ejemplos no restrictivos de toxinas
clostridiales modificadas como un aumento de la actividad de unión
celular por un receptor de toxina clostridial natural; cuyos
contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en el
presente documento por
referencia.
referencia.
Una variante quimérica de toxina clostridial
puede ser una toxina clostridial modificada con una actividad de
unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina
clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Uno modo de
conseguir esta capacidad alterada es mediante la sustitución del
dominio diana endógeno de una toxina clostridial natural con un
dominio diana de otra molécula que se una selectivamente con un
receptor diferente presente sobre la superficie de una célula diana
de toxina clostridial natural. Tal modificación realizada en un
dominio diana da como resultado una toxina modificada que es capaz
de unirse selectivamente a un receptor de toxinas no clostridiales
(receptor diana) presente en una célula diana de toxina clostridial.
Esta mayor actividad de unión por una célula diana de toxina
clostridial natural permite la administración de dosis menos
eficaces de una toxina clostridial modificada a un individuo, porque
se enviará más toxina a la célula diana. De este modo, las toxinas
clostridiales modificadas con una mayor actividad de unión reducirán
la dispersión no deseada de la toxina hacia zonas a las que no se
dirige el tratamiento, reduciendo o previniendo así los efectos
secundarios no deseados asociados a la difusión de una toxina
clostridial en una ubicación no deseada. En, p. ej., Lance E.
Steward et al., "Modified Clostridial Toxins with Altered
Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells",
publicación de patente internacional n.º 2006/009831 (14 de marzo de
2005); Lance E. Steward et al., "Multivalent Clostridial
Toxin Derivatives and Methods of Their Use", solicitud de
patente estadounidense n.º 11/376.696 (15 de marzo de 2006); y Lance
E. Steward, "Modified Clostridial Toxins with Enhanced
Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for
Clostridial Toxin Target Cells", solicitud de patente
provisional estadounidense n.º 60/807.062 (11 de julio de 2006), se
describen ejemplos no restrictivos de toxinas clostridiales
modificadas con una capacidad de unión celular alterada para una
célula diana de toxina clostridial; cuyos contenidos se encuentran
incorporados en su totalidad en el presente documento por
referencia.
referencia.
Una variante quimérica de toxina clostridial
puede ser una toxina clostridial modificada con una actividad de
unión celular alterada capaz de intoxicar una célula distinta de una
célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una célula
distinta de una neurona motora. Estas toxinas modificadas consiguen
esta intoxicación usando un receptor diana presente en una célula
diana de toxina no clostridial. Esta capacidad redirigida se
consigue sustituyendo un dominio diana natural de una toxina
clostridial con un dominio diana que presente una actividad de
unión selectiva por un receptor de una toxina no clostridial
presente en una célula diana de toxina no clostridial. Tales
modificaciones realizadas en un dominio diana dan como resultado una
toxina modificada que es capaz de unirse selectivamente a un
receptor de toxina no clostridial (receptor diana) presente en una
célula diana de toxina no clostridial (redirigida). Una toxina
clostridial modificada con una actividad alterada dirigida a una
célula diana de toxina no clostridial se puede unir a un receptor
diana, translocarse en el citoplasma y ejercer su efecto
proteolítico sobre el complejo de SNARE de la célula diana de toxina
no clostridial. En, p. ej., Keith A. Foster et al.,
"Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory
Afferent Functions", patente estadounidense n.º 5.989.545 (23 de
noviembre de 1999); Clifford C. Shone et al., "Recombinant
Toxin Fragments", patente estadounidense n.º 6.461.617 (8 de
octubre de 2002); Conrad P. Quinn et al., "Methods and
Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion", patente
estadounidense n.º 6.632.440 (14 de octubre de 2003); Lance E.
Steward et al., "Methods And Compositions For The Treatment
Of Pancreatitis", patente estadounidense n.º 6.843.998 (18 de
enero de 2005); Stephan Donovan, "Clostridial Toxin Derivatives
and Methods For Treating Pain", publicación de patente
estadounidense n.º 2002/0037833 (28 de marzo de 2002); Keith A.
Foster et al., "Inhibition of Secretion from
Non-neural Cells", publicación de patente
estadounidense n.º 2003/0180289 (25 de septiembre de 2003); J.
Oliver Dolly et al., "Activatable Recombinant
Neurotoxins", WO 2001/014570 (1 de marzo de 2001); Keith A.
Foster et al., "Re-targeted Toxin
Conjugates", publicación de patente internacional n.º WO
2005/023309 (17 de marzo de 2005); Lance E. Steward et al.,
"Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their
Use", publicación de patente estadounidense n.º 11/376.696 (15
de marzo de 2006); y Lance E. Steward, "Modified Clostridial
Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered
Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin
Target Cells", publicación de patente provisional estadounidense
n.º 60/807.059, (11 de julio de 2006), se describen ejemplos no
restrictivos de toxinas clostridiales modificadas con una actividad
alterada dirigida a una célula diana de toxina no clostridial;
cuyos contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en el
presente documento por referencia. La capacidad de redirigir los
efectos terapéuticos asociados a toxinas clostridiales ha aumentado
enormemente el número de aplicaciones médicas capaces de usar una
terapia con toxinas clostridiales. Como ejemplo no restrictivo, las
toxinas clostridiales modificadas redirigidas a neuronas sensoriales
son útiles en el tratamiento de diversos tipos de dolor crónico,
tales como, p. ej., hiperalgesia y alodinia, dolor neuropático y
dolor inflamatorio, véase, p. ej., Foster, supra, (1999); y
Donovan, supra, (2002); y Stephan Donovan, "Method For
Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and
Substance P Components", patente estadounidense n.º 7.022.329 (4
de abril de 2006). Como otro ejemplo no restrictivo, las toxinas
clostridiales modificadas redirigidas a células pancreáticas son
útiles en el tratamiento de la pancreatitis, Véase, p. ej.: Steward,
supra,
(2005).
(2005).
De este modo, en una realización, una variante
quimérica de toxina clostridial puede comprender una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria, en la que el
dominio de unión comprende una mayor actividad de unión celular
capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural.
En otra realización, una variante quimérica de toxina clostridial
puede comprender una toxina clostridial modificada revelada en la
presente memoria, en la que el dominio de unión comprende una
actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula
diana de toxina clostridial natural. En otra realización más, una
variante quimérica de toxina clostridial puede comprender una
toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria, en
la que el dominio de unión comprende una actividad de unión celular
alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial
no
natural.
natural.
También se prevé que cualquiera de una variedad
de fragmentos de toxinas clostridiales pueda ser útil en aspectos
de la presente invención con la condición de que estos fragmentos
activos puedan ejecutar el mecanismo celular global mediante el
cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato.
De este modo, los aspectos de esta realización pueden incluir
fragmentos de toxinas clostridiales que tengan una longitud de, p.
ej., al menos 300 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos
500 aminoácidos, al menos 600 aminoácidos, al menos 700
aminoácidos, al menos 800 aminoácidos, al menos 900 aminoácidos, al
menos 1.000 aminoácidos, al menos 1.100 aminoácidos y al menos
1.200 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir
fragmentos de toxinas clostridiales que tengan una longitud de, p.
ej., como máximo 300 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como
máximo 500 aminoácidos, como máximo 600 aminoácidos, como máximo 700
aminoácidos, como máximo 800 aminoácidos, como máximo 900
aminoácidos, como máximo 1.000 aminoácidos, como máximo 1.100
aminoácidos y como máximo 1.200 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad
de fragmentos de toxinas clostridiales que comprendan la cadena
ligera puede ser útil en aspectos de la presente invención con la
condición de que estos fragmentos de cadenas ligeras puedan
dirigirse específicamente a los componentes del núcleo del aparato
de liberación de neurotransmisores y participar así en la ejecución
del mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial
escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de
toxinas clostridiales son de una longitud de aproximadamente
420-460 aminoácidos y comprenden un dominio
enzimático (Tabla 1). La investigación ha demostrado que no es
necesaria toda la longitud de una cadena ligera de toxina
clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático.
Como ejemplo no restrictivo, no se requieren los ocho primeros
aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos
1-8 de la SEC ID N.º 1) para la actividad
enzimática. Como otro ejemplo no restrictivo, no se requieren los
ocho primeros aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos
1-8 de la SEC ID N.º 8) para la actividad
enzimática. Asimismo, el terminal carboxilo de la cadena ligera no
es necesario para la actividad. Como ejemplo no restrictivo, no se
requieren los 32 últimos aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A
(residuos 417-448 de la SEC ID N.º 1) para la
actividad enzimática. Como otro ejemplo no restrictivo, no se
requieren los 31 últimos aminoácidos de la cadena ligera de TeNT
(residuos 427-457 de la SEC ID N.º 8) para la
actividad enzimática. De este modo, los aspectos de esta realización
pueden incluir cadenas ligeras de toxinas clostridiales que
comprendan un dominio enzimático que tenga una longitud de, p. ej.,
al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400
aminoácidos, al menos 425 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos.
Otros aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de
toxinas clostridiales que comprendan un dominio enzimático que
tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350 aminoácidos, como
máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como máximo
425 aminoácidos y como máximo 450 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad
de regiones H_{N} de toxinas clostridiales que comprendan un
dominio de translocación puede ser útil en aspectos de la presente
invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan
facilitar la liberación de LC de las vesículas intracelulares en el
citoplasma de la célula diana y participar así en la ejecución del
mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial
escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones H_{N} de las
cadenas pesadas de toxinas clostridiales son de una longitud de
aproximadamente 410-430 aminoácidos y comprenden un
dominio de translocación (Tabla 1). La investigación ha demostrado
que no es necesaria toda la longitud de una región H_{N} de una
cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de
translocación del dominio de translocación. De este modo, los
aspectos de esta realización pueden incluir regiones H_{N} de
toxinas clostridiales que comprendan un dominio de translocación
que tenga una longitud de, p. ej., al menos 350 aminoácidos, al
menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425
aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir
regiones H_{N} de toxinas clostridiales que comprendan un dominio
de translocación que tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350
aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400
aminoácidos y como máximo 425 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad
de regiones H_{C} de toxinas clostridiales que comprendan un
dominio de unión puede ser útil en aspectos de la presente invención
con la condición de que estos fragmentos activos puedan determinar
la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina con
el complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana y
ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una toxina
clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones
H_{C} de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales son de una
longitud de aproximadamente 400-440 aminoácidos y
comprenden un dominio de unión (Tabla 1). La investigación ha
demostrado que no es necesaria toda la longitud de una región
H_{C} de una cadena pesada de toxina clostridial para la
actividad de unión del dominio de unión. De este modo, los aspectos
de esta realización pueden incluir regiones H_{C} de toxinas
clostridiales que comprendan un dominio de unión que tenga una
longitud de, p. ej., al menos 350 aminoácidos, al menos 375
aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos.
Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones H_{C}
de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de unión que
tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350 aminoácidos, como
máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos y como máximo
425 aminoácidos.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial,
un dominio de translocación de toxina clostridial y un dominio de
unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, una
toxina clostridial comprende una variante natural de toxina
clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de toxina clostridial o
un subtipo de toxina clostridial. En otro aspecto de esta
realización, una toxina clostridial comprende una variante de
toxina clostridial no natural, tal como, p. ej., una variante
conservadora de toxina clostridial, una variante no conservadora de
toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta
realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático
de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio
de translocación de toxina clostridial o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento
activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otros
aspectos de esta realización, una toxina clostridial puede
comprender una BoNT/A, una BoNT/B, una BoNT/C1, una BoNT/D, una
BoNT/E, una BoNT/F, una BoNT/G o una TeNT.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una BoNT/A
comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de
translocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende la SEC ID N.º 1.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende una
variante natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A
o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/A comprende una variante natural de BoNT/A de la SEC ID N.º 1,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A de la SEC ID N.º 1 o un
subtipo de BoNT/A de la SEC ID N.º 1. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de
BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A, una
variante no conservadora de BoNT/A o un fragmento activo de BoNT/A,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de BoNT/A
de la SEC ID N.º 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/A de SEC ID N.º 1, una variante no conservadora de BoNT/A de
SEC ID N.º 1 o un fragmento activo de BoNT/A de SEC ID N.º 1, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/A o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A
comprende un dominio enzimático de BoNT/A de los aminoácidos
1-448 de SEC ID N.º 1 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/A de los aminoácidos
449-871 de la SEC ID N.º 1 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/A de los aminoácidos
872-1296 de la SEC ID N.º 1 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 1, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 1 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 1, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 1, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 1 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID N.º 1.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 1.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 1.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una BoNT/B
comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de
translocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende la SEC ID N.º 2.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende una
variante natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B
o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/B comprende una variante natural de BoNT/B de la SEC ID N.º 2,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B de la SEC ID N.º 2 o un
subtipo de BoNT/B de la SEC ID N.º 2. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de
BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B, una
variante no conservadora de BoNT/B o un fragmento activo de BoNT/B,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de BoNT/B
de la SEC ID N.º 2, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/B de SEC ID N.º 2, una variante no conservadora de BoNT/B de
SEC ID N.º 2 o un fragmento activo de BoNT/B de SEC ID N.º 2, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/B o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B
comprende un dominio enzimático de BoNT/B de los aminoácidos
1-441 de SEC ID N.º 2 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/B de los aminoácidos
442-858 de la SEC ID N.º 2 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/B de los aminoácidos
859-1291 de la SEC ID N.º 2 o un fragmento activo
del mismo, y cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 2, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 2 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 2, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 2, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 2 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID N.º 2.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 2.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 2.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una
BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de
translocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/C1. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende la SEC ID N.º 3.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una
variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de
BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta
realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1
de SEC ID N.º 3, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 de SEC ID
N.º 3 o un subtipo de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3. En otro aspecto más
de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de
BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una
variante no conservadora de BoNT/C1 o un fragmento activo de
BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más
de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural
de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, una variante no
conservadora de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3 o un fragmento activo de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un
dominio enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un
dominio de translocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 o un fragmento activo del
mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más
de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de
BoNT/C1 de los aminoácidos 1-449 de la SEC ID N.º 3
o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/C1 de los aminoácidos 450-866 de la SEC ID N.º
3 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1
de los aminoácidos 867-1291 de la SEC ID N.º 3 o un
fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 3, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 3 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 3, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 3, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 3 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID
N.º 3.
N.º 3.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30,
40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100,
200 ó 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30,
40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30,
40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100,
200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con
la SEC ID N.º 3.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una BoNT/D
comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de
translocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende la SEC ID N.º 4.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una
variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D
o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D de la SEC ID N.º 4,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D de la SEC ID N.º 4 o un
subtipo de BoNT/D de la SEC ID N.º 4. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de
BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una
variante no conservadora de BoNT/D o un fragmento activo de BoNT/D,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D
de la SEC ID N.º 4, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/D de SEC ID N.º 4, una variante no conservadora de BoNT/D de
SEC ID N.º 4 o un fragmento activo de BoNT/D de SEC ID N.º 4, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/D o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D
comprende un dominio enzimático de BoNT/D de los aminoácidos
1-445 de SEC ID N.º 4 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/D de los aminoácidos
446-862 de la SEC ID N.º 4 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/D de los aminoácidos
863-1276 de la SEC ID N.º 4 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 4, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 4 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 4, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 4, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 4 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID
N.º 4.
N.º 4.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos de
esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En otros
aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 4.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una BoNT/E
comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de
translocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende la SEC ID N.º 5.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una
variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E
o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E de la SEC ID N.º 5,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E de la SEC ID N.º 5 o un
subtipo de BoNT/E de la SEC ID N.º 5. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de
BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una
variante no conservadora de BoNT/E o un fragmento activo de BoNT/E,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E
de la SEC ID N.º 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/E de SEC ID N.º 5, una variante no conservadora de BoNT/E de
SEC ID N.º 5 o un fragmento activo de BoNT/E de SEC ID N.º 5, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/E o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E
comprende un dominio enzimático de BoNT/E de los aminoácidos
1-422 de SEC ID N.º 5 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/E de los aminoácidos
423-845 de la SEC ID N.º 5 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/E de los aminoácidos
846-1252 de la SEC ID N.º 5 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 5, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 5 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 5, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 5, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 5 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID N.º 5. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID
N.º 5.
N.º 5.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 5. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 5.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una BoNT/F
comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de
translocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende la SEC ID N.º 6.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una
variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F
o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F de la SEC ID N.º 6,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F de la SEC ID N.º 6 o un
subtipo de BoNT/F de la SEC ID N.º 6. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de
BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una
variante no conservadora de BoNT/F o un fragmento activo de BoNT/F,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F
de la SEC ID N.º 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/F de SEC ID N.º 6, una variante no conservadora de BoNT/F de
SEC ID N.º 6 o un fragmento activo de BoNT/F de SEC ID N.º 6, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/F o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F
comprende un dominio enzimático de BoNT/E de los aminoácidos
1-439 de SEC ID N.º 6 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/F de los aminoácidos
440-864 de la SEC ID N.º 6 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/F de los aminoácidos
865-1274 de la SEC ID N.º 6 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 6, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 6 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 6, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 6, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 6 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID
N.º 6.
N.º 6.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 6.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 6.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una BoNT/G
comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de
translocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G. En otro
aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende la SEC ID N.º 7.
En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende una
variante natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G
o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una
BoNT/G comprende una variante natural de BoNT/G de la SEC ID N.º 7,
tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G de la SEC ID N.º 7 o un
subtipo de BoNT/G de la SEC ID N.º 7. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/G comprende una variante no natural de
BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G, una
variante no conservadora de BoNT/G o un fragmento activo de BoNT/G,
o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/G comprende una variante no natural de BoNT/G
de la SEC ID N.º 7, tal como, p. ej., una variante conservadora de
BoNT/G de SEC ID N.º 7, una variante no conservadora de BoNT/G de
SEC ID N.º 7 o un fragmento activo de BoNT/G de SEC ID N.º 7, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G o
un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de
BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
BoNT/G o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G
comprende un dominio enzimático de BoNT/G de los aminoácidos
1-446 de SEC ID N.º 7 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/G de los aminoácidos
447-863 de la SEC ID N.º 7 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/G de los aminoácidos
864-1297 de la SEC ID N.º 7 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 7, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º
7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC
ID N.º 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con
la SEC ID N.º 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
90% con la SEC ID N.º 7 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 95% con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos más de esta
realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID
N.º 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la
SEC ID N.º 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80%
con la SEC ID N.º 7, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 85% con la SEC ID N.º 7, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 90% con la SEC ID N.º 7 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con la SEC ID
N.º 7.
N.º 7.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En
otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 7.
En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos de esta
realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos más
de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En otros
aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una
BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 7.
En otra realización, una toxina clostridial
comprende una TeNT. En un aspecto de esta realización, una TeNT
comprende un dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación
de TeNT y un dominio de unión de TeNT. En un aspecto de esta
realización, una TeNT comprende la SEC ID N.º 8. En otro aspecto de
esta realización, una TeNT comprende una variante natural de TeNT,
tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En
otro aspecto de esta realización, una TeNT comprende una variante
natural de TeNT de la SEC ID N.º 8, tal como, p. ej., una isoforma
de TeNT de la SEC ID N.º 8 o un subtipo de TeNT de la SEC ID N.º 8.
En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una
variante no natural de TeNT, tal como, p. ej., una variante
conservadora de TeNT, una variante no conservadora de TeNT o un
fragmento activo de TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una
variante no natural de TeNT, de la SEC ID N.º 8, tal como, p. ej.,
una variante conservadora de TeNT de la SEC ID N.º 8, una variante
no conservadora de TeNT de la SEC ID N.º 8 o un fragmento activo de
TeNT de la SEC ID N.º 8, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende un dominio
enzimático de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio
de unión de TeNT o un fragmento activo del mismo, y cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT de los aminoácidos
1-457 de SEC ID N.º 8 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de TeNT de los aminoácidos
458-879 de la SEC ID N.º 8 o un fragmento activo
del mismo, un dominio de unión de TeNT de los aminoácidos
880-1315 de la SEC ID N.º 8 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 8, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 8, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º
8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC
ID N.º 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con
la SEC ID N.º 8 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del
95% con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización,
una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEC ID N.º 8, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º
8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC
ID N.º 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con
la SEC ID N.º 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del
90% con la SEC ID N.º 8 o una identidad de los aminoácidos como
máximo del 95% con la SEC ID
N.º 8.
N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos de esta
realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más
de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,
100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos de esta
realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más
de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 500 o 8 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros
aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros
aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros
aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8.
Los aspectos de la presente invención
proporcionan, en parte, un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión
"sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial" significa
un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento
adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una
toxina clostridial produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de
la toxina clostridial. Por definición, un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial es susceptible a la escisión por
parte de al menos una toxina clostridial en condiciones adecuadas
para la actividad proteasa de la toxina clostridial. Se prevé que un
sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de cualquiera
y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente
invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato
de toxina clostridial pueda ser escindido por una toxina
clostridial. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser, p. ej., de
una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7
aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud
de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos,
una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20
aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud
de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos,
una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos
60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser p. ej., de una
longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos,
de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de
como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15
aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40
aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una
longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial útil en los aspectos de la invención incluye, sin
limitación, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial
natural; variantes naturales de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial; y variantes no naturales de un sitio de escisión
de sustrato de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes
conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial, variantes no conservadoras de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial y peptidomiméticos de un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial. Como se usa en la
presente memoria, la expresión "variante de un sitio de escisión
de sustrato de toxina clostridial", bien sea natural o no
natural, significa un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial que tiene al menos un cambio de un aminoácido de la
región correspondiente de las secuencias de referencia reveladas, y
se puede describir en porcentaje de identidad con la región
correspondiente de esa secuencia de referencia. Se puede usar
cualquiera de una variedad de procedimientos de alineación de
secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo,
sin limitación, procedimientos globales, procedimientos locales y
procedimientos híbridos, tales como, p. ej., los procedimientos de
aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el
porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios al alcance de
cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las
enseñanzas de la presente
memoria.
memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial" significa cualquier sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial producido sin la ayuda de manipulación humana,
incluyendo, sin limitación, las isoformas de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial producidas a partir de transcriptos
cortados y empalmados alternativamente, las isoformas de un sitio
de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas mediante
mutación espontánea y los subtipos de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial" significa cualquier sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial producido con la ayuda de
manipulación humana; incluyendo, sin limitación, las variantes de un
sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas
mediante ingeniería genética usando mutagénesis aleatoria o un
diseño racional y las variantes de un sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial producidas mediante síntesis química. Los
ejemplos no restrictivos de variantes naturales de sitios de
escisión de sustratos de toxinas clostridiales incluyen, p. ej.,
variantes conservadoras de sitios de escisión de sustratos de
toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de sitios de
escisión de sustratos de toxinas clostridiales y peptidomiméticos de
sitios de escisión de sustratos de toxinas clostri-
diales.
diales.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial" significa un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por
otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una
propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del
sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, un
tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilidad,
lipofilidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión
mediante enlaces de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, y
similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar
al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia en el que se basa la variante conservadora del sitio de
escisión del sustrato de la toxina clostridial, y se puede sustituir
por el sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más
aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos o
cinco o más aminoácidos del sitio de escisión del sustrato de la
toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante
conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial. Una variante conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial también puede poseer una identidad de
los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los
aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una
identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los
aminoácidos del 95% con el sitio de escisión del sustrato de toxina
clostridial de referencia en el que se basa la variante
conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A, variantes conservadoras de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, variantes conservadoras de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, variantes
conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D,
variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F, variantes conservadoras de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G, variantes conservadoras de un sitio de escisión
de sustrato de TeNT, variantes conservadoras de un sitio de escisión
de sustrato de BaNT y variantes conservadoras de un sitio de
escisión de sustrato de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial" significa un sitio de escisión de sustrato de
una toxina clostridial en el que 1) al menos un aminoácido está
eliminado del sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial de referencia en el que se basa la variante no
conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial; 2) al menos un aminoácido está añadido al sitio de
escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el
que se basa el sitio de escisión no conservador del sustrato de la
toxina clostridial; o 3) al menos un aminoácido está sustituido por
otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna
propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del
sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia (Tabla 3). Una variante no conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial puede funcionar de una
manera sustancialmente similar al sitio de escisión del sustrato de
la toxina clostridial de referencia en el que se basa el sitio de
escisión no conservador del sustrato de la toxina clostridial, y se
puede sustituir por el sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente
invención. Una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial puede añadir uno o más aminoácidos,
dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más
aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos al
sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio
de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Un sitio de
escisión no conservador de sustrato de toxina clostridial puede
sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más
aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, o cinco o más aminoácidos
del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio
de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial también puede poseer una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una
identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de los
aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácidos del 95% con
el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de
referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio
de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Los ejemplos no
restrictivos de una variante no conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial incluyen, p. ej.,
variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de
BoNT/A, variantes no conservadoras de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/B, variantes no conservadoras de sitios de
escisión de sustratos de BoNT/C1, variantes no conservadoras de
sitios de escisión de sustratos de no BoNT/D, variantes no
conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/E,
variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de
BoNT/F, variantes no conservadoras de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/G, variantes no conservadoras de sitios de
escisión de sustratos de TeNT, variantes no conservadoras de sitios
de escisión de sustratos de BaNT y variantes no conservadoras de
sitios de escisión de sustratos de
BuNT.
BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial" significa un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por un
oligómero no natural que tiene al menos una propiedad similar a la
del primer aminoácido. Los ejemplos de las propiedades incluyen,
sin limitación, la topografía de un elemento estructural primario
peptídico, la funcionalidad de un elemento estructural primario
peptídico, la topología de un elemento estructural secundario
peptídico, la funcionalidad de un elemento estructural secundario
peptídico, y similares, o cualquier combinación de las mismas. Un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar
al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de
referencia en el que se basa el peptidomimético del sitio de
escisión del sustrato de la toxina clostridial, y se puede
sustituir por el sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente
invención. Un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más
aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos o
cinco o más aminoácidos del sitio de escisión del sustrato de la
toxina clostridial de referencia en el que se basa el
peptidomimético del sitio de escisión del sustrato de la toxina
clostridial. Un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial también puede poseer una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos
del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de
los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácidos del 95%
con el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de
referencia en el que se basa el peptidomimético del sitio de
escisión del sustrato de la toxina clostridial. Para consultar
ejemplos de procedimientos con peptidomimético, véase, p. ej.: Amy
S. Ripka y Daniel H. Rich, "Peptidomimetic design", 2(4)
CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 441-452 (1998); y M. Angels
Estiarte y Daniel H. Rich, "Peptidomimetics for Drug Design",
803-861 (BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG
DISCOVERY, Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J. Abraham ed.,
Wiley-Interscience, VI edición 2Q03). Los ejemplos
no restrictivos de una variante conservadora de un sitio de escisión
de sustrato de toxina clostridial incluyen, p. ej.,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/A,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/B,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/D,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/E,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/F,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/G,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de TeNT,
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BaNT y
peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de
BuNT.
BuNT.
Un tipo de sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial deriva de dianas de sustratos in vivo de
toxinas clostridiales, tales como, p. ej., las proteínas SNARE. Las
dianas de SNARE naturales de las toxinas clostridiales incluyen,
sin limitación, la familia de la SNAP-25, la familia
de la VAMP y la familia de la sintaxina. La SNAP-25
y la sintaxina están asociadas a la membrana plasmática, mientras
que la VAMP está asociada a la membrana de la vesícula sináptica
(véase, la Fig. 3). BoNT/A y BoNT/E reconocen y escinden
específicamente a la SNAP-25 en dos sitios
diferentes del la parte carboxi-terminal de la
proteína (Tabla 2). TeNT y BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G se
dirigen específicamente a la parte central conservada de las VAMP
(también conocidas como sinaptobrevina) en distintos enlaces en
función de la toxina (Tabla 3). BoNT/C1 escinde la sintaxina en un
único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica, además
de la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo (Tablas
2 y 4). Las tres dianas proteicas de estas toxinas clostridiales son
conservadas de la levadura a los seres humanos, aunque los sitios
de escisión y la susceptibilidad a las toxinas no son necesariamente
conservados, véase más adelante; véase también Humeau,
supra, (2000); Heiner Niemann et al., "Clostridial
Neurotoxins: New Tools for Dissecting Exocytosis", 4(5)
Trends Cell Biol. 179-185 (1994); y Rossella
Pellizzari et al., "Tetanus and Botulinum Neurotoxins:
Mechanism of Action and Therapeutic Uses", 354(1381)
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.
259-268
(1999).
(1999).
La SNAP-25 natural, una proteína
de aproximadamente 206 residuos que carece de un segmento
transmembrana, está asociada a la superficie citosólica del
plasmalema nervioso (véase la Fig. 3). La SNAP-25 es
necesaria para el crecimiento axonal durante el desarrollo y puede
ser necesaria para la plasticidad terminal nerviosa del sistema
nervioso maduro. La SNAP-25 ha sido aislada de una
variedad de especies de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p.
ej., las especies pertenecientes a los géneros Homo, Macaca, Bos,
Rattus, Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus,
Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea y
Caenorhabditis (Tabla 2). En seres humanos, se expresan al
menos dos isoformas diferencialmente durante el desarrollo; la
isoforma a se expresa constitutivamente durante el desarrollo
fetal, mientras que la isoforma b aparece en el nacimiento y
predomina en la vida adulta. Los análogos de
SNAP-25, tales como SNAP-23, también
se expresan fuera del sistema nervioso, por ejemplo, en las células
pancreáticas.
Tabla 2: Escisión de SNAP-25
y proteínas relacionadas. Primate: residuos de la
SNAP-25A humana 163-206 de la SEC
ID N.º 9; residuos de la SNAP-25B humana
163-206 de la SEC ID N.º 10; residuos de la
SNAP-23A humana 169-211 de la SEC
ID N.º 11; residuos de la SNAP-23B humana
116-158 de la SEC ID N.º 12; residuos de la
SNAP-25B de mono 163-206 de la SEC
ID N.º 13; Roedor: residuos de la SNAP-25A de rata
163-206 de la SEC ID N.º 14; Residuos de la
SNAP-25B de rata 163-206 de la SEC
ID N.º 15; residuos de la SNAP-25B de ratón
163-206 de la SEC ID N.º 16; Residuos de la
SNAP-23 de rata 168-210 de la SEC ID
N.º 17; residuos de la SNAP-23 de ratón
168-210 de la SEC ID N.º 18; Ave: residuos de la
SNAP-25B de pollo 163-206 de la SEC
ID N.º 19; Pez: Residuos de la SNAP-25A de pez rojo
161-204 de la SEC ID N.º 20; residuos de la
SNAP-25B de pez rojo 160-203 de la
SEC ID N.º 21; residuos de la SNAP-25A de pez cebra
161-204 de la SEC ID N.º 22; residuos de la
SNAP-25B de pez cebra 160-203 de la
SEC ID N.º 23; residuos de la SNAP-23 de pez cebra
174-214 de la SEC ID N.º 24; Raya: residuos de la
SNAP-25 de raya eléctrica de mármol
170-210 de la SEC ID N.º 25; Anfibio: residuos de la
SNAP-25A de rana 163-206 de la SEC
ID N.º 26; residuos de la SNAP-25B de rana
163-206 de la SEC ID N.º 27; residuos de la
SNAP-23 de rana 163-204 de la SEC ID
N.º 28; residuos de la SNAP-25 de erizo de mar
169-212 de la SEC ID N.º 29; Insecto: residuos de
la SNAP-25 de mosca de la fruta
171-212 de la SEC ID N.º 30; residuos de la
SNAP-24 de mosca de la fruta 170-212
de la SEC ID N.º 31; Gusano segmentado: residuos de la
SNAP-25 de sanguijuela 170-212 de
la SEC ID N.º 32; Cefalópodo: residuos de la SNAP-25
de calamar 245-267 de la SEC ID N.º 33;. Gastrópodo:
residuos de la SNAP-25 de caracol de laguna
244-266 de la SEC ID N.º 34; Gusano redondo:
residuos de la SNAP-25 de gusano nematodo
165-207 de la SEC ID N.º 35.
La VAMP natural es una proteína de
aproximadamente 120 residuos con una longitud exacta que depende de
la especie y de la isoforma. Como se muestra en la Fig. 3, la VAMP
contiene un segmento carboxi-terminal corto dentro
del lumen vesicular, mientras que la mayoría de la molécula está
expuesta al citosol. Los treinta residuos
amino-terminales ricos en prolina son divergentes
entre las especies y las isoformas, mientras que la parte central
de la VAMP, que es rica en residuos cargados e hidrófilos e incluye
sitios de escisión conocidos, está muy conservada (Tabla 3). La
VAMP se ubica junto con la sinaptofisina en las membranas de la
vesícula sináptica. La VAMP ha sido aislada de una variedad de
especies de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p. ej., las
especies pertenecientes a los géneros Homo, Macaca, Bos, Rattus,
Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus,
Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea, Aplysia
y Caenorhabditis. Además, se han identificado múltiples
isoformas de VAMP incluyendo VAMP-1,
VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina, y se
han identificado formas no sensibles a la escisión por toxinas en
células no neuronales. La VAMP parece estar presente en todos los
tejidos de vertebrados, aunque la distribución de la
VAMP-1 y la VAMP-2 varía en
diferentes tipos de células. La VAMP-1 de pollo y de
rata no es escindida por la TeNT ni por la BoNT/B. Estos ortólogos
de VAMP-1 tienen una valina en lugar de la glutamina
presente en la VAMP-1 humana y murina en el sitio
de escisión de TeNT o BoNT/B. La sustitución no afecta a BoNT/D, /F
o /G, que escinden tanto a VAMP-1 como a
VAMP-2 con velocidades
similares.
similares.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Tabla 3: Escisión de VAMP y proteínas
relacionadas. Primate: residuos de la
VAMP-1-1 humana
49-92 de la SEC ID N.º 36; residuos de la
VAMP-1-2 humana
49-92 de la SEC ID N.º 37; residuos de la
VAMP-1-3 humana
49-92 de la SEC ID N.º 38; residuos de la
VAMP-2 humana 47-90 de la SEC ID N.º
39; residuos de la VAMP-2 de mono
47-90 de la SEC ID N.º 40; residuos de la VAMP-
3/celubrevina humana 30-73 de la SEC ID N.º 41;
Bovino: residuos de la VAMP-2 de vaca
47-90 de la SEC ID N.º 42; Roedor: residuos de la
VAMP-1 de rata 49-92 de la SEC ID
N.º 43; residuos de la VAMP-1-b de
rata 49-92 de la SEC ID N.º 44; residuos de la
VAMP-1 de ratón 49-92 de la SEC ID
N.º 45; residuos de la VAMP-2 de rata
47-90 de la SEC ID N.º 46; residuos de la
VAMP-2-b de rata
47-90 de la SEC ID N.º 47; residuos de la
VAMP-2 de ratón 47-90 de la SEC ID
N.º 48; residuos de la VAMP-3/celubrevina de rata
34-77 de la SEC ID N.º 49; residuos de la
VAMP-3/celubrevina de ratón 34-77 de
la SEC ID N.º 50; Ave: residuos de la VAMP-1 de
pollo 190-233 de la SEC ID N.º 51; residuos de la
VAMP-2 de pollo 47-88 de la SEC ID
N.º 52; residuos de la VAMP-3/celubrevina de pollo
34-77 de la SEC ID N.º 53; Pez: residuos de la
VAMP-1 de pez cebra 50-93 de la SEC
ID N.º 54; residuos de la VAMP-2 de pez cebra
41-84 de la SEC ID N.º 55; residuos de la
VAMP-3 de pez cebra 33-60 de la SEC
ID N.º 56; Raya: residuos de la VAMP-1 de raya
eléctrica de mármol 51-94 de la SEC ID N.º 57;
Anfibio: residuos de la VAMP-2 de rana
45-88 de la SEC ID N.º 58; residuos de la
VAMP-3 de rana 32-75 de la SEC ID
N.º 59; residuos de la VAMP de erizo de mar 31-74 de
la SEC ID N.º 60; Insecto: residuos de la SinA1 de mosca de la
fruta 40-83 de la SEC ID N.º 61; residuos de la
SinA2 de mosca de la fruta 63-106 de la SEC ID N.º
62; residuos de la SinB1 de mosca de la fruta 63-106
de la SEC ID N.º 63; residuos de la SinB2 de mosca de la fruta
63-106 de la SEC ID N.º 64; residuos de la SinC de
mosca de la fruta 57-100 de la SEC ID N.º 65;
residuos de la SinD de mosca de la fruta 66-109 de
la SEC ID N.º 66; residuos de la SinE mosca de la fruta
57-100 de la SEC ID N.º 67; Gusano segmentado:
residuos de la VAMP de sanguijuela 45-88 de la SEC
ID N.º 68; Cefalópodo: residuos de la VAMP de calamar
56-99 de la SEC ID N.º 69; Gastrópodo: residuos de
la VAMP de caracol de laguna 49-92 de la SEC ID N.º
70; residuos de la VAMP de babosa de mar 37-80 de la
SEC ID N.º 71; Gusano redondo: residuos de la SNB1 de gusano
nematodo 72-115 de la SEC ID N.º 72; residuos de
tipo SNB de gusano nematodo 82-115 de la SEC ID N.º
73.
La sintaxina natural se ubica en la superficie
citosólica del plasmalema nervioso y está anclada a la membrana
mediante un segmento carboxi-terminal, estando la
mayoría de la proteína expuesta al citosol (véase la Fig. 3). La
sintaxina se ubica junto con los canales del calcio en las zonas
activas de la membrana presináptica, en la que tiene lugar la
liberación de los neurotransmisores. Además, la sintaxina interactúa
con la sinaptotagmina, una proteína de la membrana de las vesículas
SSV que forma un puente funcional entre el plasmalema y las
vesículas. La sintaxina ha sido aislada de una variedad de especies
de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p. ej., las especies
pertenecientes a los géneros Homo, Bos, Rattus, Mus, Gallus,
Danio, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea
y Aplysia (Tabla 4). Se han identificado tres isoformas de
una longitud ligeramente diferente (285 y 288 residuos) en células
nerviosas (isoformas 1A, 1B1 y 1B2), siendo las isoformas 2, 3, 4 y
5 expresadas en otros tejidos. Las diferentes isoformas tienen
sensibilidades variables a BoNT/C1, siendo las isoformas de
sintaxina 1 A, 1 B1, 1B2, 2 y 3 escindidas por esta toxina.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Tabla 4: Escisión de la sintaxina y proteínas
relacionadas. Primate: residuos de la Sintaxina1A humana
242-264 de la SEC ID N.º 74; residuos de la
Sintaxina1B1 humana 241-263 de la SEC ID N.º 75;
residuos de la Sintaxina1B2 humana 241-263 de la
SEC ID N.º 76; residuos de la Sintaxina2-1 humana
241-263 de la SEC ID N.º 77; residuos de la
Sintaxina2-2 humana 241-263 de la
SEC ID N.º 78; residuos de la Sintaxina2-3 humana
241-263 de la SEC ID N.º 79; residuos de la
Sintaxina3 humana 241-263 de la SEC ID N.º 80;
Bovino: residuos de la Sintaxina1A de vaca 242-264
de la SEC ID N.º 81; residuos de la Sintaxina1B2 de vaca
241-263 de la SEC ID N.º82; Roedor: residuos de la
Sintaxina1A de rata 242-264 de la SEC ID N.º 83;
residuos de la Sintaxina1B2 de rata 241-263 de la
SEC ID N.º 84; residuos de la Sintaxina1A de ratón
242-264 de la SEC ID N.º 85; residuos de la
Sintaxina1B1 de ratón 241-263 de la SEC ID N.º 86;
residuos de la Sintaxina1B2 de ratón 241-263 de la
SEC ID N.º 87; residuos de la Sintaxina2 de rata
243-265 de la SEC ID N.º 88; residuos de la
Sintaxina2 de ratón 242-264 de la SEC ID N.º 89;
residuos de la Sintaxina3A de rata 241-263 de la SEC
ID N.º 90; residuos de la Sintaxina3A de ratón
241-263 de la SEC ID N.º 91; residuos de la
Sintaxina3B de ratón 241-263 de la SEC ID N.º 92;
residuos de la Sintaxina3C de ratón 223-245 de la
SEC ID N.º 93; Ave: residuos de la Sintaxina1B de pollo
235-257 de la SEC ID N.º 94; residuos de la
Sintaxina2 de pollo 240-262 de la SEC ID N.º 95;
Pez: residuos de la Sintaxina1B de pez cebra
241-263 de la SEC ID N.º 96; residuos de la
Sintaxina3 de pez cebra 239-261 de la SEC ID N.º
97; residuos de la Sintaxina1B de erizo de mar
241-263 de la SEC ID N.º 98; Insecto: residuos de la
Sintaxina1A de mosca de la fruta 245-267 de la SEC
ID N.º 99; Gusano segmentado: residuos de Sintaxina1A de sanguijuela
248-270 de la SEC ID N.º 100; Cefalópodo: residuos
de la Sintaxina1A de calamar 245-267 de la SEC ID
N.º 101; Gastrópodo: residuos de la Sintaxina1A de caracol de
laguna 244-266 de la SEC ID N.º 102; residuos de la
Sintaxina1A de babosa de mar 244-266 de la SEC
ID
N.º 103.
N.º 103.
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Una amplia variedad de sitios de escisión de
sustratos de toxinas clostridiales son útiles en aspectos de la
invención, siendo los sitios de escisión específicos y diferenciados
para las diferentes toxinas clostridiales conocidos en la técnica.
Como ejemplos no restrictivos, BoNT/A escinde un enlace
Gln-Arg y un enlace Lys-His; BoNT/B
y TeNT escinden un enlace Gln-Phe; BoNT/C1 escinde
un enlace Lys-Ala o Arg-Ala; BoNT/D
escinde un enlace Lys-Leu; BoNT/E escinde un enlace
Arg-Ile y un enlace Lys-Ile; BoNT/F
escinde un enlace Gln-Lys; y BoNT/G escinde un
enlace Ala-Ala (véase la Tabla 5). En la
nomenclatura estándar, la secuencia que rodea un sitio de escisión
de una toxina clostridial se denomina
P_{5}-P_{4}-P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'-P_{4}'-P_{5}',
en la que P_{1}-P_{1}' representa el enlace
escindible. Se entiende que un sitio P_{1} o P_{1}', o ambos,
puede ser sustituido por otro aminoácido o mimético de aminoácido en
lugar del residuo natural. Como ejemplo, se han preparado sustratos
de BoNT/A en los que la posición P_{1} (Gln) está modificada para
que sea una alanina, ácido 2-aminobutírico o un
residuo de asparagina; estos sustratos fueron hidrolizados por
BoNT/A en el enlace P_{1}-Arg, véase, p. ej.:
James J. Schmidt y Karen A. Bostian, "Endoproteinase Activity of
Type A Botulinum Neurotoxin: Substrate Requirements and Activation
by Serum Albumin", 16(1) J. Protein Chem.
19-26 (1997). Aunque se reconoce la posibilidad de
introducir sustituciones en la posición P_{1} del enlace
escindible, por ejemplo, un enlace escindible por BoNT/A, se
reconoce además que la conservación del residuo de P_{1}' puede
ser ventajosa, véase, p. ej., Vadakkanchery V. Vaidyanathan et
al., "Proteolysis of SNAP-25 Isoforms by
Botulinum Neurotoxin Types A, C, and E: Domains and Amino Acid
Residues Controlling the Formation of
Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage",
72(1) J. Neurochem. 327-337
(1999).
De este modo, en una realización, un sustrato de
toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P_{1}' no está
modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural de
una proteína diana escindida por la toxina clostridial. En aspectos
de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial en el que el residuo P_{1}' no está modificado ni
sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína
diana escindida por la toxina clostridial puede ser, p. ej., un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un
sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En otra realización, un sustrato de toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial en el que el residuo P_{1} está modificado o
sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína
diana escindida por la toxina clostridial; tal sustrato de toxina
clostridial conserva la susceptibilidad a la escisión del enlace
peptídico entre los residuos P_{1} y P_{1}'. En aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial en el que el residuo P_{1}' está modificado o
sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína
diana escindida por la toxina clostridial puede ser, p. ej., un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un
sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo A"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/A" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/A produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de
la toxina clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/A
puede ser, por ejemplo, Gln-Arg o
Lys-His. Se prevé que un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A de cualquiera y todas las longitudes puede ser
útil en aspectos de la presente invención con la condición de que
el sitio de escisión del sustrato de BoNT/A pueda ser escindido por
BoNT/A. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A puede ser, p. ej., de una longitud
de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos,
una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9
aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud
de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos,
una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos
30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una
longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60
aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A puede ser p. ej., de una longitud de
como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7
aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una
longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15
aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40
aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una
longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/A
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/A,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/A. Como se muestra en la Tabla 2, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/A, e incluyen, por ejemplo, la
SNAP-25A y la SNAP-25B humanas, de
rata, de ratón, de Danio y de Carassius; y la
SNAP-25 de Torpedo. De este modo, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A puede corresponder, por ejemplo, a
un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B
humana; SNAP-25A o SNAP-25B bovina;
SNAP-25A o SNAP-25B de rata;
SNAP-25A o SNAP-25B de ratón;
SNAP-25A o SNAP-25B de
Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B
de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B
de Carassius; SNAP-25 de Torpedo;
SNAP-25 de Strongylocentrotus;
SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de
Lymnaea; SNAP-25 de Aplysia,
isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la
escisión por BoNT/A. Además, la comparación de las secuencias
nativas de aminoácidos de la SNAP-25 escindidas por
BoNT/A revela que tales secuencias están absolutamente conservadas
(Tabla 2). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una
variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
respecto a una secuencia de SNAP-25 sensible a la
BoNT/A natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A útil en
los aspectos de la presente invención. Se entiende que es posible
preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/A similar, si se
desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra
isoforma, parálogo o ortólogo de SNAP-25 sensible a
BoNT/A, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
contenido en las proteínas SNAP-25 identificadas en
los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.
Además, la manipulación experimental de la
secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A escindido por BoNT/A revela que tales secuencias
están absolutamente conservadas. Estos resultados indican que es
posible sustituir una variedad de residuos de un sitio de escisión
de sustrato de toxina BoNT/A en comparación con una secuencia
sensible a la toxina natural. Como ejemplo no restrictivo, en
comparación con un 17-mero correspondiente a los
residuos 187 a 203 de la SNAP-25 humana, la
sustitución de Asp193 por asparagina en el sustrato de BoNT/A dio
como resultado una velocidad relativa de proteolisis de 0,23; la
sustitución de Glu194 por glutamina dio como resultado una velocidad
relativa de 2,08; la sustitución de Ala195 por ácido
2-aminobutírico dio como resultado una velocidad
relativa de 0,38; y la sustitución de Gln197 por asparagina, ácido
2-aminobutírico o alanina dio como resultado una
velocidad relativa de 0,66; 0,25 ó 0,19, respectivamente (véase la
Tabla 6). Además, la sustitución de Ala199 por ácido
2-aminobutírico dio como resultado una velocidad
relativa de 0,79; la sustitución de Thr200 por serina o ácido
2-aminobutírico dio como resultado una velocidad
relativa de 0,26 ó 1,20, respectivamente; la sustitución de Lys201
por alanina dio como resultado una velocidad relativa de 0,12; y la
sustitución de Met202 por alanina o norleucina dio como resultado
una velocidad relativa de 0,38 ó 1,20, respectivamente; véase,
p.ej.: Schmidt y Bostian, supra, (1997). En otro estudio, se
pudo sustituir la Gln197 de la SNAP-25 por
metionina, serina, treonina, glutamina o lisina, y siguió siendo
escindido eficazmente por BoNT/A, véase, p. ej., Vadakkanchery V.
Vaidyanathan et al., "Proteolysis of
SNAP-25 Isoforms by Botulinum Neurotoxin Types A, C,
and E: Domains and Amino Acid Residues Controlling the Formation of
Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage", 72
J. Neurochem. 327-337 (1999). Estos
resultados indican que los residuos, incluyendo pero no limitándose
a Glu194, Ala195, Glen197, Ala199, Thr200 y Met202, Leu203, Gly204,
Ser205 y Gly206, así como los residuos más distales del enlace
escindible de Gln-Arg, se pueden sustituir o
conjugar.
Hay una variedad de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/A que son conocidos en la técnica y que se pueden
definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A puede tener, por ejemplo, los residuos
46-206, los residuos 134 a 206, los residuos 137 a
206 o 146-206 de la SNAP-25 humana,
véase, p. ej., Teresa A. Ekong et al., "Recombinant
SNAP-25 is an Effective Substrate for Clostridium
botulinum Type A Toxin Endopeptidase Activity in
vitro", 143 (Pt 10) Microbiology
3337-3347 (1997); Clifford C. Shone et al.,
"Toxin Assays", patente estadounidense n.º 5.962.637 (5 de
octubre de 1999); y Vaidyanathan et al., supra, (1999). Un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A también puede comprender,
sin limitación, la secuencia
Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID N.º 133) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 190 a 202 de la SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys
(SEC ID N.º 134) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 187 a 201 de la SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID N.º 135) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 187 a 202 de la SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gin-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu
(SEC ID N.º 136) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 187 a 203 de la SNAP-25 humana;
Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID N.º 150) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 186 a 202 de la SNAP-25 humana; o
Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu
(SEC ID N.º 151) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 186 a 203 de la SNAP-25 humana.
Véase, por ejemplo, James J. Schmidt y Karen A Bostian,
"Proteolysis of Synthetic Peptides by Type A Botulinum
Neurotoxin", 14(8) J. Protein Chem.
703-708 (1995); Schmidt y Bostian, supra,
(1997); James J. Schmidt et al., "Type A Botulinum
Neurotoxin Proteolytic Activity: Development of Competitive
Inhibitors and Implications For Substrate Specificity at the S1'
Binding Subsite", 435(1) FEBS Lett.
61-64 (1998); y James J. Schmidt y Karen A Bostian,
"Assay for the Proteolytic Activity of Serotype a From
Clostridium botulinum", patente estadounidense n.º
5.965.699 (12 de octubre de 1999).
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/A comprende al menos seis residuos consecutivos
de la SNAP-25 incluyendo Gln-Arg. En
otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A comprende al menos seis residuos consecutivos de la
SNAP-25 incluyendo Lys-His. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys
(SEC ID N.º 104); la secuencia de aminoácidos
Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys
(SEC ID N.º 105); la secuencia de aminoácidos de
Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys
(SEC ID N.º 106). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º 106, tal como, p.
ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de
SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º 106; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID
N.º 105 o SEC ID N.º 106. En otro aspecto más de esta realización,
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante
natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, tal como, p.
ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A, una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos. En otro
aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A comprende una variante no natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID
N.º 106; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o
SEC ID N.º 106; una variante no conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o
SEC ID N.º 106 o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º
106, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
comprende p. ej., la SEC ID N.º 133, SEC ID N.º 134, SEC ID N.º 135,
SEC ID
\hbox{N.º 136, SEC ID N.º 138, SEC ID N.º 141, SEC ID
N.º 148, SEC ID N.º 150 o SEC ID N.º 151.}
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 104, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 104 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 104. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 104, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 104, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 104 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 104.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 104.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo
dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo B"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/B" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/B produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de
la toxina clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/B
puede ser, por ejemplo, Gln-Phe. Se prevé que un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de cualquiera y todas las
longitudes puede ser útil en aspectos de la presente invención con
la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/B
pueda ser escindido por BoNT/B. De este modo, en aspectos de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B puede ser,
p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de
al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una
longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10
aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud
de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25
aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud
de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos
o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B puede ser
p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9
aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25
aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60
aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/B
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/B,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/B. Como se muestra en la Tabla 3, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/B, e incluyen, por ejemplo,
VAMP-1, VAMP-2 y
VAMP-3/celubrevina humanas y de ratón;
VAMP-2 bovina; VAMP-2 y
VAMP-3 de rata; VAMP-2 de pollo;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de
Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de
Drosophila; VAMP de Hirudo; y el tipo SNB1 de
Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B puede corresponder, por ejemplo, a un segmento
de VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina;
VAMP-2 o VAMP-3 de rata;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de ratón; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de pollo;
VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus;
VAMP-1 o VAMP-2 de Danio;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de
Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD o sinE de
Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo;
VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de
Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína
natural sensible a la escisión por BoNT/B. Además, la comparación
de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por
BoNT/B revela que tales secuencias están absolutamente conservadas
(Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una
variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
respecto a una secuencia de VAMP sensible a la BoNT/B natural en un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B útil en los aspectos de la
presente invención. Se entiende que es posible preparar un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B similar, si se desea, a partir de un
segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u
ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible
a BoNT/B, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
contenido en las proteínas VAMP-1 y
VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/B que son conocidos en la técnica y que se pueden
definir mediante procedimientos rutinarios. Tales sitios de escisión
de sustratos de BoNT/B pueden incluir, por ejemplo, una secuencia
correspondiente a parte o todo el núcleo hidrófilo de una proteína
VAMP, tal como la VAMP-1 humana o
VAMP-2 humana. Los sitios de escisión de sustratos
de BoNT/B pueden incluir, sin limitación, los residuos 33 a 94, los
residuos 45 a 94, los residuos 55 a 94, los residuos 60 a 94, los
residuos 65 a 94, los residuos 60 a 88 o los residuos 65 a 88 de la
VAMP-2 humana (SEC ID N.º 39), o los residuos 60 a
94 de la VAMP-1-1 humana (SEC ID
N.º 36), VAMP-1-2 (SEC ID N.º 37) y
VAMP-1-3 (SEC ID N.º 38), véase, p.
ej., Shone et al., Eur. J. Biochem. 217:
965-971 (1993); y Shone et al., supra, (5 de
octubre de 1999). Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/B
también pueden incluir, sin limitación, la secuencia
Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Leu-Lys
(SEC ID N.º 152) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 60 a 94 de la VAMP-2 humana, véase,
p. ej., James J. Schmidt y Robert G. Stafford, "High Throughput
Assays for the Proteolytic Activities of Clostridial
Neurotoxins", patente estadounidense n.º 6.762.280 (13 de julio
de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/B
Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Cys-Lys
(SEC ID N.º 153) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 62 a 96 de la VAMP-1 humana.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/B comprende al menos seis residuos consecutivos
de la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser
(SEC ID N.º 107); secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser
(SEC ID N.º 108); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn
(SEC ID N.º 109); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln
(SEC ID N.º 110); la secuencia de aminoácidos
-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser
(SEC ID N.º 111); o la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser
(SEC ID N.º 112). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110,
SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; tal como, p. ej., una isoforma de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de la SEC ID N.º 107,
SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC
ID N.º 112; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID
N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID
N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110,
SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; una variante no conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID
N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID
N.º 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID
N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, o cualquier combinación de
los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 107. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 107, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo
dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1. Como se usa en la presente memoria, la expresión
"sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de
serotipo C1" es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1" y significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/C1 produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible
escindido por BoNT/C1 puede ser, por ejemplo,
Lys-Ala o Arg-Ala. Se prevé que un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de cualquiera y todas las
longitudes puede ser útil en aspectos de la presente invención con
la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/C1
pueda ser escindido por BoNT/C1. De este modo, en aspectos de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede ser,
p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de
al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una
longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10
aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud
de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos,
una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos
40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una
longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede ser
p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como
máximo de 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo 9
aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25
aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 40 aminoácidos, una longitud de cómo máximo
50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60
aminoácidos.
aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/C1,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/C1. Como se muestra además en la Tabla 4,
en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales
sensibles a la escisión por BoNT/C1, e incluyen, por ejemplo,
sintaxina 1A, sintaxina 1B1 y sintaxina 1 B2 humanas y de ratón;
sintaxina 1 A y sintaxina 1 B2 bovinas y de rata; sintaxina 2 de
rata y sintaxina 3 de rata; sintaxina de Strongylocentrotus,
sintaxina 1A de Drosophila; sintaxina 1A de Hirudo;
sintaxina 1A de Loligo; sintaxina 1A de Aplysia. De
este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede
corresponder, por ejemplo, a un segmento de sintaxina 1A, sintaxina
1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2-1, sintaxina
2-2, sintaxina 2-3 o sintaxina 3A
humana; sintaxina 1A, sintaxina 1B1 o sintaxina 1B2 bovina;
sintaxina 1A, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2 o sintaxina
3A de rata; sintaxina 1 A, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina
2, sintaxina 3A, sintaxina 3B o sintaxina 3C de ratón; sintaxina 1A
o sintaxina 2 de pollo; sintaxina 1 A o sintaxina 1B de
Xenopus; sintaxina, 1 A, sintaxina 1B o sintaxina 3 de
Danio; sintaxina 1A o sintaxina 1B de Torpedo;
sintaxina 1 A o sintaxina 1B de Strongylocentrotus;
sintaxina 1A o sintaxina 1B de Drosophila; sintaxina 1A o
sintaxina 1B de Hirudo; sintaxina 1 A o sintaxina 1B de
Loligo; sintaxina 1 A o sintaxina 1 B de Lymnaea,
isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la
escisión por BoNT/C1. Además, la comparación de las secuencias
nativas de aminoácidos de sintaxina escindidas por BoNT/C1 revela
que tales secuencias están absolutamente conservadas (véase la
Tabla 4), lo que indica que se puede tolerar una variedad de
sustituciones y modificaciones de aminoácidos en comparación con la
secuencia de sintaxina sensible a BoNT/C1 natural en un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 útil en los aspectos de la presente
invención. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/C1 similar, si se desea, a partir de un segmento
correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de
sintaxina sensible a BoNT/C1, tal como, el sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 contenido en las proteínas de sintaxina
identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la
Tabla 4.
Aunque no están ampliamente estudiados, es
posible definir una variedad de sitios de escisión de sustratos de
BoNT/C1 mediante procedimientos rutinarios. El fragmento óptimo
mínimo para los sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1 puede
incluir, sin limitación, los residuos 93 a 202 de la
SNAP-25A humana (SEC ID N.º 9) o los residuos 93 a
202 de la SNAP-25B humana (SEC ID N.º 10), véase, p.
ej., Vaidyanathan et al., supra, (1999). Sin embargo, como
ocurre con los sustratos de otras BoNT, se sospecha que la BoNT/C1
puede escindir eficazmente un fragmento de sustrato mucho más
pequeño.
Como se muestra en la Tabla 2, en la técnica, se
conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión
por BoNT/C1, e incluyen, por ejemplo, la SNAP-25A y
la SNAP-25B humanas, de rata, de ratón, de
Danio y de Carassius; y la SNAP-25 de
Drosophila. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de
SNAP-25A o SNAP-25B humana;
SNAP-25A o SNAP-25B bovina;
SNAP-25A o SNAP-25B de rata;
SNAP-25A o SNAP-25B de ratón;
SNAP-25A o SNAP-25B de
Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B
de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B
de Carassius; SNAP-25 de Torpedo;
SNAP-25 de Strongylocentrotus;
SNAP-25 o SNAP-24 de
Drosophila; SNAP-25 de Hirudo;
SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de
Lymnaea, isoformas de las mismas, u otra proteína natural
sensible a la escisión por BoNT/C1. Según lo tratado anteriormente
con respecto a las variantes de secuencias de sintaxina naturales,
la comparación de las secuencias de aminoácidos de la
SNAP-25 nativas escindidas por BoNT/C1 revela una
variabilidad secuencial relevante (Tabla 2), lo que indica que se
puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de
aminoácidos en comparación con una secuencia de la
SNAP-25 sensible a la BoNT/C1 natural en un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 revelado en la presente memoria. Se
entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 similar, si se desea, a partir de un segmento
correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de
SNAP-25 sensible a BoNT/C1, tal como, el sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A contenido en las proteínas de la
SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 2.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos
consecutivos de Sintaxina incluyendo Lys-Ala. En
otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos consecutivos de
Sintaxina incluyendo Arg-Ala. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 113); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 114); la secuencia de aminoácidos
Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 115); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 116); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 117); la secuencia de aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 118); o la secuencia de aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 119). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116,
SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119, tal como, p. ej.,
una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC
ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID
N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119; o un subtipo de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º
114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118
o SEC ID N.º 119. En otro aspecto más de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1, una variante no conservadora de sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro
aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende una variante no natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114,
SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o
SEC ID N.º 119; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID
N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º
118 o SEC ID N.º 119, una variante no conservadora de sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114,
SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC
ID N.º 119 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC
ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119, o
cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 113 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 113. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º
113, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la
SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos como máximo del
75% con la SEC ID N.º 113 o una identidad de los aminoácidos como
máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 113.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos
una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos
en comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con
la SEC ID N.º 113.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo
una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 113.
En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos
consecutivos de la SNAP-25 incluyendo
Arg-Ala. En otros aspectos de esta realización, un
sitio de escisión de sustrato de toxina BoNT/C1 comprende, p. ej.,
la secuencia de aminoácidos
Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID N.º 120) o la secuencia de aminoácidos de
Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu
(SEC ID N.º 121). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato BoNT/C1 comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121, tal como, p. ej., una isoforma
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o
SEC ID N.º 121; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no conservadora de
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o
SEC ID N.º 121; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID
N.º 121; una variante no conservadora de sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de
SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 120 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 120. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º
120, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la
SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos como máximo del
75% con la SEC ID N.º 120 o una identidad de los aminoácidos como
máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 120.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos
una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos
en comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con
la SEC ID N.º 120.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 120.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo D"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/D" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/D produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido
por BoNT/D puede ser, por ejemplo, Lys-Leu. Se
prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de cualquiera
y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente
invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato
de BoNT/D pueda ser escindido por BoNT/D. De este modo, en aspectos
de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una
longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8
aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud
de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos,
una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos
25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una
longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50
aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros
aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6
aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como
máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10
aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30
aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como
máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/D
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/D,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/D. Como se muestra en la Tabla 3, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/D, e incluyen, por ejemplo,
VAMP-1, VAMP-2 y
VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón;
VAMP-2 bovina; VAMP-1,
VAMP-2 y VAMP-3 de pollo;
VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus;
VAMP-1 o VAMP-2 de Danio;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de
Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de
Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo;
VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia y SNB1 de
Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D puede corresponder, por ejemplo, a un segmento
de VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de rata; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de ratón;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o
VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o
VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de
Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC,
sinD o sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de
Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1
de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína
natural sensible a la escisión por BoNT/D. Además, la comparación
de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por
BoNT/D revela que tales secuencias están absolutamente conservadas
(Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una
variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la BoNT/D natural en
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D útil en los aspectos de
la presente invención. Se entiende que es posible preparar un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/D similar, si se desea, a partir de
un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u
ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible
a BoNT/D, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
contenido en las proteínas VAMP-1 y
VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/D que son conocidos en la técnica o que se pueden
definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D puede incluir, por ejemplo, los residuos 27 a
116; residuos 37 a 116; residuos 1 a 86; residuos 1 a 76; o los
residuos 1 a 69 de la VAMP-2 de rata (SEC ID N.º
46), véase, p. ej., Shinji Yamasaki et al., "Cleavage of
members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum
neurotoxins and tetanus toxin", 269(17) J. Biol.
Chem. 12764-12772 (1994). De este modo, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede incluir, por ejemplo,
los residuos 27 a 69 o los residuos 37 a 69 de la
VAMP-2 de rata. Un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D también puede incluir, sin limitación, la secuencia
Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser
(SEC ID N.º 154) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 37 a 75 de la VAMP-2 humana, véase,
p. ej., Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la
secuencia de reconocimiento de BoNT/D
Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser
(SEC ID N.º 155) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 39 a 77 de las isoformas de la
VAMP-1 humana
VAMP-1-1,
VAMP-1-2 y
VAMP-1-3.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/D comprende al menos seis residuos consecutivos
de la VAMP incluyendo Lys-Leu. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu
(SEC ID N.º 122); o la secuencia de aminoácidos de
Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu
(SEC ID N.º 123). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123, tal como, p. ej., una isoforma
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o
SEC ID N.º 123; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123; tal como, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123; una variante no conservadora de
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID
N.º 123; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123, o cualquier combinación
de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 122, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 122 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 122. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 122, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 122, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 122 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 122.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 122.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo
dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo E"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/E" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/E produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido
por BoNT/E puede ser, por ejemplo, Arg-IIe o
Lys-lle. Se prevé que un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E de cualquiera y todas las longitudes puede ser
útil en aspectos de la presente invención con la condición de que
el sitio de escisión del sustrato de BoNT/E pueda ser escindido por
BoNT/E. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E puede ser, p. ej., de una longitud de
al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una
longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9
aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud
de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20
aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud
de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40
aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud
de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización,
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser p. ej., de una
longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos,
de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de
como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15
aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40
aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una
longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/E
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/E,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/E. Como se muestra en la Tabla 2, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/E, e incluyen, por ejemplo,
SNAP-25A y SNAP-25B humanas, de
pollo, de Danio y de Carassius;
SNAP-25A, SNAP-25B y
SNAP-23 de rata y de ratón; y
SNAP-25 de Caenorhabditis. De este modo, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede corresponder, por
ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o
SNAP-25B humana; SNAP-25A o
SNAP-25B bovina; SNAP-25A,
SNAP-25B o SNAP-23 de rata;
SNAP-25A, SNAP-25B o
SNAP-23 de ratón; SNAP-25A o
SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A
o SNAP-25B de Danio;
SNAP-25A o SNAP-25B de
Carassius; SNAP-25 de
Strongylocentrotus; SNAP-24 de
Drosophila; SNAP-25 de Hirudo;
SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de
Lymnaea; SNAP-25 de Caenorhabditis,
isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la
escisión por BoNT/E. Además, la comparación de las secuencias de
aminoácidos nativas de SNAP-23 y
SNAP-25 escindidas por BoNT/E revela que tales
secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 2). Este
descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de
sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una
secuencia de la SNAP-23 o la SNAP-25
sensible a BoNT/E natural en un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E útil en los aspectos de la presente invención. Se entiende
que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente
(homólogo) de otra isoforma, parálogo o ortólogo de la
SNAP-25 sensible a BoNT/E, tal como, la secuencia de
reconocimiento de BoNT/E contenida en las proteínas
SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 2.
Hay una variedad de sitios de escisión de
sustratos de BoNT/E que son conocidos en la técnica o que se pueden
definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E puede tener, por ejemplo, los residuos
46-206, residuos 92 a 206, residuos 134 a 206,
residuos 137 a 206; 146-206, 156-206
ó 146-186 de la SNAP-25A humana
(SEC ID N.º 9) y la SNAP-25B humana (SEC ID N.º 10),
véase, p. ej., Vaidyanathan et al., supra, (1999); y Schmidt
y Stafford, supra, (13 de julio de 2004).
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/E comprende al menos seis residuos consecutivos
de la SNAP-25 incluyendo Arg-IIe. En
otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E comprende al menos seis residuos consecutivos de la
SNAP-25 incluyendo Lys-lle. En
otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys
(SEC ID N.º 124); la secuencia de aminoácidos
Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys
(SEC ID N.º 125); la secuencia de aminoácidos
Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met
(SEC ID N.º 126); la secuencia de aminoácidos
Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys
(SEC ID N.º 127); o la secuencia de aminoácidos
Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys
(SEC ID N.º 128). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o
SEC ID N.º 128; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E de la SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125,
SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID
N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128. En otro
aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E comprende una variante no natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º
127 o SEC ID N.º 128, tal como, p. ej., una variante conservadora
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID N.º 124,
SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128; una
variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º
127 o SEC ID N.º 128; un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º
126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128, SEC ID N.º XX o cualquier
combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 124, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 124 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 124. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 124, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 124, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 124 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 124.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 124.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo F"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/F" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/F produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido
por BoNT/F puede ser, por ejemplo, Gln-Lys. Se
prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de cualquiera
y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente
invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato
de BoNT/F pueda ser escindido por BoNT/F. De este modo, en aspectos
de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una
longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8
aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud
de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos,
una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos
25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una
longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50
aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros
aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6
aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como
máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10
aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30
aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como
máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/F
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/F,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/F. Como se muestra en la Tabla 3, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/F, e incluyen, por ejemplo,
VAMP-1, VAMP-2 y
VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón;
VAMP-2 bovina; VAMP-1 y
VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de
Torpedo; y sinA y sinB de Drosophila. De este modo,
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F puede corresponder, por
ejemplo, a un segmento de VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 humana;
VAMP-2 bovina; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de rata;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de ratón; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de pollo;
VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus;
VAMP-1 o VAMP-2 de Danio;
VAMP-1 de Torpedo; sinA y sinB de
Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo;
VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de
Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína
natural sensible a la escisión por BoNT/F. De este modo, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a
un segmento de VAMP-1 o VAMP-2
humana; VAMP-1 o VAMP-2 de ratón;
VAMP-1 o VAMP-2 bovina;
VAMP-1 o VAMP-2 de rata; celubrevina
de rata; VAMP-1 o VAMP-2 de pollo;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Aplysia;
sib de Drosophila; VAMP de sanguijuela, u otra proteína
natural sensible a la escisión por BoNT/F. Además, la comparación
de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por
BoNT/F revela que tales secuencias están absolutamente conservadas
(Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una
variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la BoNT/E natural en
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E útil en los aspectos de
la presente invención. Se entiende que es posible preparar un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F similar, si se desea, a partir de
un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u
ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2
sensible a BoNT/F, tal como, el sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F contenido en las proteínas VAMP-1 y
VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de secuencias de reconocimiento
de BoNT/F que son conocidas en la técnica o que se pueden definir
mediante procedimientos rutinarios. Una secuencia de reconocimiento
de BoNT/F puede incluir, por ejemplo, los residuos 27 a 116; los
residuos 37 a 116; los residuos 1 a 86; los residuos 1 a 76; o los
residuos 1 a 69 de la VAMP-2 de rata (SEC ID N.º
46), véase, p. ej., Yamasaki et al., supra, (1994). Estas
secuencias de reconocimiento de BoNT/F también pueden comprender,
por ejemplo, los residuos 27 a 69 o los residuos 37 a 69 de la
VAMP-2 de rata. Se entiende que es posible preparar
una secuencia de reconocimiento de BoNT/F similar, si se desea, a
partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma,
parálogo u ortólogo de VAMP sensible a BoNT/F, tal como,
VAMP-1 humana o VAMP-2 humana. Una
secuencia de reconocimiento de BoNT/F también puede incluir, sin
limitación, la secuencia
Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser
(SEC ID N.º 154) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 37 a 75 de la VAMP-2 humana, véase,
p. ej., Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la
secuencia de reconocimiento de BoNT/F
Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser
(SEC ID N.º 155) o un peptidomimético de la misma, que corresponde
a los residuos 39 a 77 de la VAMP-1 humana.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/F comprende al menos seis residuos consecutivos
de la VAMP incluyendo Gln-Lys. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu
(SEC ID N.º 129); o la secuencia de aminoácidos de
Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu
(SEC ID N.º 130). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130, tal como, p. ej., una isoforma
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o
SEC ID N.º 130; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130; tal como, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130; una variante no conservadora de
sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID
N.º 130; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130, o cualquier combinación
de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 129, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 129 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 129. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 129, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 129, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 129 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 129.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 129.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo G"
es sinónimo de "sitio de escisión de sustrato de BoNT/G" y
significa un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
que una BoNT/G produzca una proteolisis detectable en el enlace
escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido
por BoNT/G puede ser, por ejemplo, Ala-Ala. Se
prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de cualquiera
y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente
invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato
de BoNT/G pueda ser escindido por BoNT/G. De este modo, en aspectos
de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una
longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8
aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud
de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos,
una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos
25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una
longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50
aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros
aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6
aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como
máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10
aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30
aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como
máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/G
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/G,
o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una
proteína sensible a BoNT/G. Como se muestra en la Tabla 3, en la
técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a
la escisión por BoNT/G, e incluyen, por ejemplo,
VAMP-1, VAMP-2 y
VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón;
VAMP-2 bovina; VAMP-1 y
VAMP-2 de pollo; y VAMP-1 de
Torpedo. De este modo, una secuencia de reconocimiento de
BoNT/G puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de rata; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de ratón;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o
VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o
VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de
Torpedo; SNB1 de Caenorhabditis, isoformas de las
mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/G.
Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de
las VAMP escindidas por BoNT/G revela que tales secuencias están
absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que
se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de
aminoácidos con respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la
BoNT/G natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G útil en
los aspectos de la presente invención. Se entiende que es posible
preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/G similar, si se
desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra
isoforma, parálogo o ortólogo de VAMP-1 o
VAMP-2 sensible a BoNT/G, tal como, la secuencia de
reconocimiento de BoNT/G contenida en la VAMP-1 y la
VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados
anteriormente en la Tabla 3.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/G comprende al menos seis residuos consecutivos
de la VAMP incluyendo Ala-Ala. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys
(SEC ID N.º 131); o la secuencia de aminoácidos
Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys
(SEC ID N.º 132). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende
una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132, tal como, p. ej., una isoforma
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o
SEC ID N.º 132; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132; tal como, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132; una variante no conservadora de
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID
N.º 132; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132, o cualquier combinación
de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%
con la SEC ID N.º 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 62,5% con la SEC ID N.º 131, una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 131 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 131. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 131, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 131, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 131 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º 131.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al
menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 131.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende
un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º
131.
131.
En un aspecto de la invención, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de TeNT. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio
de escisión de sustrato de la toxina tetánica" es sinónimo de
"sitio de escisión de sustrato de TeNT" y significa un enlace
escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no
adyacentes, o ambos, suficientes para que una TeNT produzca una
proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones
apropiadas. Un enlace escindible escindido por TeNT puede ser, por
ejemplo, Gln-Phe. Se prevé que un sitio de escisión
de sustrato de TeNT de cualquiera y todas las longitudes puede ser
útil en aspectos de la presente invención con la condición de que el
sitio de escisión del sustrato de TeNT pueda ser escindido por
TeNT. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de TeNT puede ser, p. ej., de una longitud de
al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una
longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9
aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud
de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20
aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud
de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40
aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud
de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización,
un sitio de escisión de sustrato de TeNT puede ser p. ej., de una
longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos,
de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de
como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15
aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una
longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como
máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40
aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una
longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de TeNT
útiles en los aspectos de la invención pueden corresponder a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por TeNT, o
pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína
sensible a TeNT. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se
conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión
por TeNT, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1,
VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas
y de ratón; VAMP-2 bovina; VAMP-2 y
VAMP-3 de rata; VAMP-2 de pollo;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de
Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de
Drosophila; VAMP de Hirudo; y el tipo SNB1 de
Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina;
VAMP-2 o VAMP-3 de rata;
VAMP-1, VAMP-2 o
VAMP-3 de ratón; VAMP-1,
VAMP-2 o VAMP-3 de pollo;
VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus;
VAMP-1 o VAMP-2 de Danio;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de
Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD o sinE de
Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo;
VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 y tipo SNB de
Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína
natural sensible a la escisión por TeNT. Además, la comparación de
las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por
TeNT revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas
(Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una
variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la TeNT natural en un
sitio de escisión de sustrato de TeNT útil en los aspectos de la
presente invención. Se entiende que es posible preparar un sitio de
escisión de sustrato de TeNT similar, si se desea, a partir de un
segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u
ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible
a TeNT, tal como, el sitio de escisión de sustrato de TeNT
contenido en la VAMP-1 y VAMP-2
identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la
Tabla 3.
Hay una variedad de secuencias de reconocimiento
de TeNT que son conocidas en la técnica o que se pueden definir
mediante procedimientos rutinarios, e incluyen secuencias
correspondientes a parte o todo el núcleo hidrófilo de una proteína
VAMP tal como la VAMP-1 humana o la
VAMP-2 humana. Una secuencia de reconocimiento de
TeNT puede incluir, por ejemplo, los residuos 25 a 93 o los
residuos 33 a 94 de la VAMP-2 humana (SEC ID N.º
39); F. Cornille et al., "Solid-Phase
Synthesis, Conformational Analysis and In vitro Cleavage Of
Synthetic Human Synaptobrevin II 1-93 by Tetanus
Toxin L chain", 222(1) Eur. J. Biochem.
173-181 (1994); Patrick Foran et al.,
"Differences in the Protease Activities of Tetanus and Botulinum B
Toxins Revealed By the Cleavage of
Vesicle-Associated Membrane Protein and Various
Sized Fragments", 33(51) Biochemistry
15365-15374 (1994); los residuos 51 a 93 o los
residuos 1 a 86 de la VAMP-2 de rata, véase, p. ej.,
Yamasaki et al., supra, (1994); o los residuos 33 a 94 de la
VAMP-1-1 humana (SEC ID N.º 36), los
residuos 33 a 94 de la VAMP-1-2
humana (SEC ID N.º 37) y los residuos 33 a 94 de la
VAMP-1-3 humana (SEC ID N.º 38). Una
secuencia de reconocimiento de TeNT también puede incluir, por
ejemplo, los residuos 25 a 86, los residuos 33 a 86 o los residuos
51 a 86 de la VAMP-2 humana (SEC ID N.º 39) o la
VAMP-2 de rata (SEC ID N.º 46). Se entiende que es
posible preparar una secuencia de reconocimiento de TeNT similar, si
se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de
otra isoforma u homólogo de la especie de la VAMP sensible a TeNT,
tal como, VAMP-1 humana, o VAMP de erizo de mar o
de
Aplysia.
Aplysia.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato
de TeNT. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT comprende al menos seis residuos consecutivos de
la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser
(SEC ID N.º 107); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser
(SEC ID N.º 108); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn
(SEC ID N.º 109); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln
(SEC ID N.º 110); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser
(SEC ID N.º 111); o la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser
(SEC ID N.º 112). En otro aspecto de esta realización, un sitio de
escisión de sustrato de TeNT comprende una variante natural de un
sitio de escisión de sustrato de TeNT. En otro aspecto de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende una
variante natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC
ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID
N.º 111 o SEC ID N.º 112; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio
de escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108,
SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; o
un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º
107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111
o SEC ID N.º 112. En otro aspecto más de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, tal como una variante
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, una
variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de
esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT
comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109,
SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej.,
una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º
110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; una variante no conservadora
de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC
ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID
N.º 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º
110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la
SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
62,5% con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 75% con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 107. En otros
aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato
de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad
de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEC ID N.º 107, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEC ID
N.º 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con
la SEC ID N.º 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del
87,5% con la SEC ID N.º
107.
107.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o
diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o
cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con
la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º
107.
107.
Otro tipo de sitio de escisión de los sustratos
de las toxinas clostridiales se obtiene de fragmentos
autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales. Se ha
indicado que una toxina clostridial puede sufrir una fragmentación
autocatalítica que da como resultado la formación de dos fragmentos
de polipéptido principales. Por ejemplo, se han localizado enlaces
peptídicos susceptibles a la escisión autocatalítica en dos regiones
de la BoNT/A. La primera región comprende los aminoácidos
250-267 de la SEC ID N.º 1, en la que los enlaces
Tyr250-Tyr251 y Phe266-Gly267 son
susceptibles a la escisión. La segunda región comprende los residuos
419-439 de la SEC ID N.º 1, en la que los enlaces
Phe419-Thr420, Phe423-Glu424,
Leu429-Cys430, Cys430-Val431,
Arg432-Gly433 y Lys438-Thr439 son
susceptibles a la escisión autocatalítica. La región de BoNT/A
correspondiente a los aminoácidos 250-267 de la SEC
ID N.º 1 está muy conservada entre las toxinas clostridiales (Tabla
7).
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada comprende un sitio de escisión autocatalítica
de sustrato de una toxina clostridial. En aspectos de esta
realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de
toxina clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos de
una toxina clostridial que incluyen los residuos de BoNT/A
250Tyr-251Tyr, los residuos de BoNT/B
256Phe-257Phe, los residuos de BoNT/C1
257Phe-258Tyr, los residuos de BoNT/D
257Phe-258Phe, los residuos de BoNT/E
239Pro-240Leu, los residuos de BoNT/F
254Pro-255Leu, los residuos de BoNT/G
256Phe-257Phe o los residuos de TeNT
259Ile-260Tyr. En un aspecto de esta realización,
un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina
clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos de toxina
clostridial incluyendo Phe-Gly. En otros aspectos de
esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato
de toxina clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos
de una toxina clostridial que incluyen los residuos de BoNT/A
Phe266-Gly267, los residuos de BoNT/B
Phe272-Gly273, los residuos de BoNT/C1
Phe273-Gly274, los residuos de BoNT/D
Phe273-Gly274, los residuos de BoNT/E
Phe255-Gly256, los residuos de BoNT/F
Phe270-Gly271, los residuos de BoNT/G
Phe272-Gly273 o los residuos de TeNT
Phe275-Gly276.
Phe275-Gly276.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende p. ej., los residuos de BoNT/A 246-271 de
la SEC ID N.º 1; los residuos de BoNT/B 252-277 de
la SEC ID N.º 2; los residuos de BoNT/C1 253-278 de
la SEC ID N.º 3; los residuos BoNT/D 253-278 de la
SEC ID N.º 4; los residuos de BoNT/E 235-260 de la
SEC ID N.º 5; los residuos de BoNT/F 250-275 de la
SEC ID N.º 6; los residuos de BoNT/G 252-277 de la
SEC ID N.º 7; o los residuos de TeNT 255-280 de la
SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio
de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende, p. ej., los residuos de BoNT/A 247-254 de
la SEC ID N.º 1; los residuos de BoNT/B 253-260 de
la SEC ID N.º 2; los residuos de BoNT/C1 254-261 de
la SEC ID N.º 3; los residuos de BoNT/D 254-261 de
la SEC ID N.º 4; los residuos de BoNT/E 236-243 de
la SEC ID N.º 5; los residuos de BoNT/F 251-258 de
la SEC ID N.º 6; los residuos de BoNT/G 253-260 de
la SEC ID N.º 7; o los residuos de TeNT 256-263 de
la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende, p. ej., los residuos de BoNT/A 263-270 de
la SEC ID N.º 1; los residuos de BoNT/B 269-276 de
la SEC ID N.º 2; los residuos de BoNT/C1 270-277 de
la SEC ID N.º 3; los residuos de BoNT/D 270-277 de
la SEC ID N.º 4; los residuos de BoNT/E 252-259 de
la SEC ID N.º 5; los residuos de BoNT/F 267-274 de
la SEC ID N.º 6; los residuos de BoNT/G 269-276 de
la SEC ID N.º 7; o los residuos de TeNT 272-279 de
la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 50% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 60% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 70% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 80% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 90% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; o una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 95% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID
N.º 8.
N.º 8.
En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los
aminoácidos como máximo del 50% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como máximo del 60% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como máximo del 70% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como máximo del 80% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; una identidad de los
aminoácidos como máximo del 90% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8; o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 95% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos de BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID
N.º 8.
N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos,
tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en
comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la
SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la
SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la
SEC ID N.º 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEC
ID N.º 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC
ID N.º 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC
ID N.º 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC
ID N.º 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID
N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de
escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende
un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1, los
residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2, los
residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3, los
residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de
esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato
de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve
o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1, los
residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2, los
residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3, los
residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos o
tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con
los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1,
los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2,
los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3,
los residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión
autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un
polipéptido que tiene p. ej., como mínimo una, dos o tres
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1, los
residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2, los
residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3, los
residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º
8.
8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos, tres o
cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con
los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1,
los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2,
los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3,
los residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión
autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un
polipéptido que tiene p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1, los
residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2, los
residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3, los
residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de
esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato
de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej.,
como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o
diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-27-1 de la
SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la
SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la
SEC ID N.º 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEC
ID N.º 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC
ID N.º 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC
ID N.º 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC
ID N.º 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID
N.º 8.
En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial
comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos o tres
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEC ID N.º 1, los
residuos de BoNT/B 252-277 de la SEC ID N.º 2, los
residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEC ID N.º 3, los
residuos BoNT/D 253-278 de la SEC ID N.º 4, los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEC ID N.º 5, los
residuos de BoNT/F 250-275 de la SEC ID N.º 6, los
residuos de BoNT/G 252-277 de la SEC ID N.º 7 o los
residuos de TeNT 255-280 de la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión
autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un
polipéptido que tiene p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEC ID N.º 1, los residuos de BoNT/B
252-277 de la SEC ID N.º 2, los residuos de BoNT/C1
253-278 de la SEC ID N.º 3, los residuos BoNT/D
253-278 de la SEC ID N.º 4, los residuos de BoNT/E
235-260 de la SEC ID N.º 5, los residuos de BoNT/F
250-275 de la SEC ID N.º 6, los residuos de BoNT/G
252-277 de la SEC ID N.º 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEC ID N.º 8.
En un aspecto de la invención, un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región
del bucle bicatenario. Como se usa en la presente memoria, la
expresión "región del bucle bicatenario" significa la
secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial que contiene un
sitio de escisión por proteasa usado para convertir la forma
monocatenaria de una toxina clostridial en la forma bicatenaria.
Como ejemplos no restrictivos, la región del bucle bicatenario de
BoNT/A comprende los aminoácidos 430-454 de la SEC
ID N.º 1; la región del bucle bicatenario de BoNT/B comprende los
aminoácidos 437-446 de la SEC ID N.º 2; la región
del bucle bicatenario de BoNT/C1 comprende los aminoácidos
437-453 de la SEC ID N.º 3; la región del bucle
bicatenario de BoNT/D comprende los aminoácidos
437-450 de la SEC ID N.º 4; la región del bucle
bicatenario de BoNT/E comprende los aminoácidos
412-426 de la SEC ID N.º 5; la región del bucle
bicatenario de BoNT/F comprende los aminoácidos
429-445 de la SEC ID N.º 6; la región del bucle
bicatenario de BoNT/G comprende los aminoácidos
436-450 de la SEC ID N.º 7; y la región del bucle
bicatenario de TeNT comprende los aminoácidos
439-467 de la SEC ID
N.º 8.
N.º 8.
Como se menciona anteriormente, una toxina
clostridial se convierte de una forma polipeptídica monocatenaria a
una molécula bicatenaria mediante una escisión proteolítica. Aunque
actualmente se desconoce la identidad de la proteasa natural, se ha
determinado la ubicación del sitio de escisión por proteasa del
bucle bicatenario para muchas toxinas clostridiales (Tabla 8). La
escisión en el bucle bicatenario no parece estar restringida a un
solo enlace peptídico. De este modo, la escisión de una toxina
clostridial con una proteasa del bucle bicatenario natural da como
resultado la pérdida de varios residuos que giran en torno al sitio
de escisión original. Esta pérdida está limitada a unos cuantos
aminoácidos ubicados entre los dos residuos de cisteína que forman
el enlace de tipo disulfuro. Como ejemplo no restrictivo, la
escisión del polipéptido monocatenario de BoNT/A da como resultado
en última instancia la pérdida de diez aminoácidos en el bucle
bicatenario. Para las BoNT, la escisión en
K448-A449 convierte la forma monocatenaria de BoNT/A
en la forma bicatenaria; la escisión en K441-A442
convierte la forma monocatenaria de BoNT/B en la forma bicatenaria;
la escisión en K449-T450 convierte la forma
monocatenaria de BoNT/C1 en la forma bicatenaria; la escisión en
R445-D446 convierte la forma monocatenaria de
BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en
R422-K423 convierte la forma monocatenaria de
BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión de
K439-A440 convierte la forma monocatenaria de BoNT/F
en la forma bicatenaria; y la escisión en K446-S447
convierte la forma monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria.
La escisión proteolítica de la forma monocatenaria de TeNT en
A457-S458 da como resultado la forma
bicatenaria.
Sin embargo, también debería observarse que
otros sitios de escisión adicionales del bucle bicatenario también
parecen ser escindidos dando como resultado la pérdida de un pequeño
fragmento peptídico. Como ejemplo no restrictivo, la escisión del
polipéptido monocatenario de BoNT/A da como resultado en última
instancia la pérdida de un fragmento de diez aminoácidos en el
bucle bicatenario. De este modo, la escisión en
S441-L442 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/A en la forma bicatenaria; la escisión en
G444-1445 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/B en la forma bicatenaria; la escisión en
S445-L446 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/C1 en la forma bicatenaria; la escisión en
K442-N443 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en
K419-G420 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión de
K423-S424 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión en
K436-G437 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/F en la forma bicatenaria; la escisión en
T444-G445 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria; y la escisión en
E448-Q449 convierte la forma polipeptídica
monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria.
Es posible modificar la región del bucle
bicatenario para que incluya un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial además del sitio de escisión por proteasa del
bucle bicatenario natural. En este tipo de modificación, ambos
sitios de escisión están ligados operativamente en marco a una
toxina clostridial modificada como una proteína de fusión y ambos
sitios pueden ser escindidos por sus respectivas proteasas. Como
ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada que comprende un
bucle bicatenario que contiene tanto el sitio de escisión por
proteasa del bucle bicatenario natural como un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A puede ser escindida bien por la proteasa del
bucle bicatenario endógena encontrada en la C. botulinum de
serotipo A o por BoNT/A. Como otro ejemplo no restrictivo, una
BoNT/A modificada que comprende un bucle bicatenario que contiene
tanto el sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario
natural como un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser
escindida bien por la proteasa del bucle bicatenario endógena
encontrada en la C. botulinum de serotipo A o por
BoNT/E.
BoNT/E.
También es posible modificar la región del bucle
bicatenario para sustituir el sitio de escisión por proteasa del
bucle bicatenario natural con un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial. En este tipo de modificación, el sitio de
escisión por proteasa natural se vuelve inviable y, por tanto, no
puede ser escindido por su proteasa. Sólo el sitio de escisión de
sustrato de una toxina clostridial puede ser escindido por su
correspondiente toxina. Tal sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial está ligado operativamente en marco a una toxina
clostridial modificada en forma de una proteína de fusión. Como
ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada monocatenaria que
comprende un bucle bicatenario que sólo contiene un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A puede ser BoNT/A escindida, pero no
la proteasa del bucle bicatenario endógena encontrada en la C.
botulinum de serotipo A. Como otro ejemplo no restrictivo, una
BoNT/A modificada monocatenaria que comprende un bucle bicatenario
que sólo contiene un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede
ser BoNT/E escindida, pero no la proteasa del bucle bicatenario
endógena encontrada en la C. botulinum de serotipo A.
El sitio de escisión por proteasa del bucle
bicatenario natural puede hacerse inviable mediante la modificación
de al menos uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico
escindido por la proteasa natural. Se pueden hacer mayores
modificaciones con la condición de que los dos residuos de cisteína
de la región del bucle bicatenario permanezcan intactos y se pueda
seguir formando el enlace de tipo disulfuro. Los ejemplos no
restrictivos de una modificación de aminoácidos incluyen la
eliminación de un aminoácido o la sustitución del aminoácido
original con un aminoácido diferente. Estas modificaciones se pueden
realizar usando procedimientos de mutagénesis estándar conocidos
por el experto en la técnica. Además, los ejemplos no restrictivos
de los procedimientos de mutagénesis, así como los reactivos, las
condiciones y los protocolos bien caracterizados se pueden obtener
fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación,
BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD
Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad,
CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos
protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier
experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la
presente memoria.
De este modo, en una realización, un sitio de
escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve
inviable mediante la modificación de al menos uno de los aminoácidos
que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa
natural. En aspectos de esta realización, se modifica el aminoácido
P, del sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario o se
modifica el aminoácido P_{1'} del sitio de escisión por proteasa
del bucle bicatenario. En otros aspectos de esta realización, se
modifica bien K448 o A449 de BoNT/A; se modifica bien S441 o L442
de BoNT/A; se modifica bien K441 o A442 de BoNT/B; se modifica bien
G444 o 1445 de BoNT/B; se modifica bien K449 o T450 de BoNT/C1; se
modifica bien S445 o L446 de BoNT/C1; se modifica bien R445 o D446
de BoNT/D; se modifica bien K442 o N443 de BoNT/D; se modifica bien
R422 o K423 de BoNT/E; se modifica bien K419 o G420 de BoNT/E; se
modifica bien K423 o S424 de BoNT/E; se modifica bien K439 o A440 de
BoNT/F; se modifica bien K436 o G437 de BoNT/F; se modifica bien
K446 o S447 de BoNT/G; se modifica bien T444 o G445 de BoNT/G; se
modifica bien E448 o Q449 de BoNT/G; o se modifica bien A457 o S458
de
TeNT.
TeNT.
En otra realización, un sitio de escisión por
proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante
la modificación de dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico
escindido por una proteasa natural, i. e., P_{1} y P_{1}. En
otros aspectos de esta realización, se modifican tanto K448 como
A449 de BoNT/A; se modifican tanto S441 como L442 de BoNT/A; se
modifican tanto K441 como A442 de BoNT/B; se modifican tanto G444
como 1445 de BoNT/B; se modifican tanto K449 como T450 de BoNT/C1;
se modifican tanto S445 como L446 de BoNT/C1; se modifican tanto
R445 como D446 de BoNT/D; se modifican tanto K442 como N443 de
BoNT/D; se modifican tanto R422 como K423 de BoNT/E; se modifican
tanto K419 como G420 de BoNT/E; se modifican tanto K423 como S424
de BoNT/E; se modifican tanto K439 como A440 de BoNT/F; se modifican
tanto K436 como G437 de BoNT/F; se modifican tanto K446 como S447
de BoNT/G; se modifican tanto T444 como G445 de BoNT/G; se modifican
tanto E448 como Q449 de BoNT/G; o se modifican tanto A457 como S458
de TeNT.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve
inviable mediante la modificación de, p. ej., al menos dos
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos tres
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos cuatro
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos cinco
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos seis
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos siete
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos ocho
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos nueve
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos diez
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; o al menos 15
aminoácidos de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle
bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de
uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido
por una proteasa natural y, p. ej., al menos un aminoácido más de la
región del bucle bicatenario; al menos dos aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos tres aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos cuatro aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos cinco aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos seis aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos siete aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos ocho aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos nueve aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos diez aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; al menos 15 aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario
natural se vuelve inviable mediante la modificación de los dos
aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una
proteasa natural y, p. ej., al menos un aminoácido más de la región
del bucle bicatenario; al menos dos aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos tres aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos cuatro aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos cinco aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos seis aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos siete aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos ocho aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos nueve aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos diez aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; al menos 15 aminoácidos más de la región del
bucle
bicatenario.
bicatenario.
En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve
inviable mediante la modificación de, p. ej., cómo máximo dos
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo tres
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo cuatro
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo cinco
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo seis
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo siete
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo ocho
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo nueve
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo diez
aminoácidos de la región del bucle bicatenario; o como máximo 15
aminoácidos de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos
más de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del
bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la
modificación de uno de los aminoácidos que flanquean el enlace
peptídico escindido por una proteasa natural y, p. ej., cómo máximo
un aminoácido más de la región del bucle bicatenario; como máximo
dos aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo
tres aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como
máximo cuatro más aminoácidos de la región del bucle bicatenario;
como máximo cinco aminoácidos más de la región del bucle
bicatenario; como máximo seis aminoácidos más de la región del
bucle bicatenario; como máximo siete aminoácidos más de la región
del bucle bicatenario; como máximo ocho aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; como máximo nueve aminoácidos más de
la región del bucle bicatenario; como máximo diez aminoácidos más de
la región del bucle bicatenario; como máximo 15 aminoácidos más de
la región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta
realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle
bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de
dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una
proteasa natural y, p. ej., como máximo un aminoácido más de la
región del bucle bicatenario; como máximo dos aminoácidos más de la
región del bucle bicatenario; como máximo tres aminoácidos más de
la región del bucle bicatenario; como máximo cuatro aminoácidos más
de la región del bucle bicatenario; como máximo cinco aminoácidos
más de la región del bucle bicatenario; como máximo seis
aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo
siete aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como
máximo ocho aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como
máximo nueve aminoácidos más de la región del bucle bicatenario;
como máximo diez aminoácidos más de la región del bucle
bicatenario; como máximo 15 aminoácidos más de la región del bucle
bicatenario.
Se prevé la posibilidad de modificar la región
del bucle bicatenario de una toxina clostridial para que incluya
algún o todos los sitios de escisión del sustrato de la toxina
clostridial. En aspectos de esta realización, se puede modificar un
bucle bicatenario de una toxina clostridial revelada en la presente
memoria para que comprenda p. ej., un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de
escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de
BuNT. En otros aspectos de esta realización, se puede modificar un
bucle bicatenario de una toxina clostridial, además del sitio de
escisión por proteasa natural, para que comprenda p. ej., un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G o un sitio de escisión de sustrato
de TeNT. En otros aspectos más de esta realización, se puede
modificar un bucle bicatenario de una toxina clostridial para
sustituir un sitio de escisión por proteasa natural con p. ej., un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de
sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un
sitio de escisión de sustrato de BuNT.
La ubicación del sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial puede ser cualquiera dentro de la toxina
clostridial, con la condición de que la escisión del sitio debe
tener lugar entre los dos residuos de cisteína que forman el único
enlace de tipo disulfuro de la toxina. De este modo, en aspectos de
esta realización, la ubicación de un sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial puede ser, p. ej., cualquiera dentro de la
BoNT/A de SEC ID N.º 1, con la condición de que la escisión tenga
lugar entre la cisteína 430 y la cisteína 454; cualquiera dentro de
la BoNT/B de SEC ID N.º 2, con la condición de que la escisión tenga
lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 446; cualquiera dentro de
la BoNT/C1 de SEC ID N.º 2, con la condición de que la escisión
tenga lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 453; cualquiera
dentro de la BoNT/D de SEC ID N.º 4, con la condición de que la
escisión tenga lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 450;
cualquiera dentro de la BoNT/E de SEC ID N.º 5, con la condición de
que la escisión tenga lugar entre la cisteína 412 y la cisteína
426; cualquiera dentro de la BoNT/F de SEC ID N.º 6, con la
condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 429 y la
cisteína 445; cualquiera dentro de la BoNT/G de SEC ID N.º 7, con la
condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 436 y la
cisteína 450; o cualquiera dentro de la TeNT de SEC ID N.º 8, con
la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 439 y
la cisteína
467.
467.
Se entiende que una toxina clostridial
modificada revelada en la presente memoria puede incluir
opcionalmente uno o más componentes adicionales. Como ejemplo no
restrictivo de un componente opcional, una toxina clostridial
modificada puede comprender además una región flexible que comprenda
un espaciador flexible. Los ejemplos no restrictivos de un
espaciador flexible incluyen, p. ej., un espaciador de G GGGGS (SEC
ID N.º 156) o un espaciador de A EAAAK (SEC ID N.º 157). Se puede
usar una región flexible que comprende espaciadores flexibles para
ajustar la longitud de una región de polipéptido con el fin de
optimizar una característica, un atributo o una propiedad de un
polipéptido. Tal región flexible está ligada operativamente en marco
a la toxina clostridial modificada en forma de una proteína de
fusión. Como ejemplo no restrictivo, se puede usar una región de
polipéptido que comprenda uno o más espaciadores flexibles en
tándem para poner mejor al descubierto un sitio de escisión por
proteasa facilitando así la escisión del sitio por una proteasa.
Como otro ejemplo no restrictivo, se puede usar una región de
polipéptido que comprenda uno o más espaciadores flexibles en tándem
para presentar mejor un dominio de ligando, facilitando así la
unión de ese dominio de ligando con su dominio de unión sobre
un
receptor.
receptor.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria puede
comprender además una región flexible que comprenda un espaciador
flexible. En otra realización, una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria puede comprender además una región
flexible que comprenda una pluralidad de espaciadores flexibles en
tándem. En aspectos de esta realización, una región flexible puede
comprender en tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de G, al menos 2
espaciadores de G, al menos 3 espaciadores de G, al menos 4
espaciadores de G o al menos 5 espaciadores de G. En otros aspectos
de esta realización, una región flexible puede comprender en
tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de G, como máximo 2
espaciadores de G, como máximo 3 espaciadores de G, como máximo 4
espaciadores de G o como máximo 5 espaciadores de G. En otros
aspectos más de esta realización, una región flexible puede
comprender en tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de A, al menos
2 espaciadores de A, al menos 3 espaciadores de A, al menos 4
espaciadores de A o al menos 5 espaciadores de A. En otros aspectos
más de esta realización, una región flexible puede comprender en
tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de A, como máximo 2
espaciadores de A, como máximo 3 espaciadores de A, como máximo 4
espaciadores de A o como máximo 5 espaciadores de A. En otro aspecto
de esta realización, una toxina clostridial modificada puede
comprender una región flexible que comprenda una o más copias de los
mismos espaciadores flexibles, una o más copias de diferentes
regiones de espaciadores flexibles o cualquier combinación de
las
mismas.
mismas.
Como otro ejemplo no restrictivo de un
componente opcional, una toxina clostridial modificada puede
comprender además una región de unión a un epítopo. Una región de
unión a un epítopo se puede usar en una amplia variedad de
procedimientos que implican, p. ej., la purificación de proteínas y
la visualización de proteínas. Tal región de unión a un epítopo
está ligada operativamente en marco a una toxina clostridial
modificada en forma de una proteína de fusión. Los ejemplos no
restrictivos de una región de unión a un epítopo incluyen, p. ej.,
FLAG, Express^{TM} (SEC ID N.º 158), hemaglutinina (HA) del virus
de la gripe humana (SEC ID N.º 159), proteína
p62^{c-Myc} humana (c-MYC) (SEC ID
N.º 160), glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G) (SEC ID N.º 161), sustancia P (SEC ID N.º
162), precursor de glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV)
(SEC ID N.º 163), V5 (SEC ID N.º 164), AU1 (SEC ID N.º 165) y AU5
(SEC ID N.º 166); unión por afinidad, tal como, p. ej.,
polihistidina (HIS) (SEC ID N.º 167), péptido de unión a
estreptavidina (strep) y biotina o una secuencia de biotinilación;
regiones de unión a péptidos, tales como, p. ej., dominio de unión a
glutationa de la
glutationa-S-transferasa, el dominio
de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina y
el dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa.
Los ejemplos no restrictivos de los protocolos específicos para
seleccionar, elaborar y usar un péptido de unión apropiado se
describen en, p. ej., "Epitope Tagging", pp.
17.90-17.93 (Sambrook y Russell, ends., MOLECULAR
CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, III ed. 2001); "ANTIBODIES:
A LABORATORY MANUAL" (Edward Harlow y David Lane, eds., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, II Ed. 1998); y "USING
ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I" (Edward
Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998).
Además, los ejemplos no restrictivos de los péptidos de unión, así
como de los reactivos, las condiciones y los protocolos bien
caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores
comerciales que incluyen, sin limitación, BD
Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences
Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN,
Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos
son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la
técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente
memoria.
memoria.
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria puede
comprender además una región de unión a un epítopo. En otra
realización, una toxina clostridial modificada revelada en la
presente memoria puede comprender además una pluralidad de regiones
de unión epitópica. En aspectos de esta realización, una toxina
clostridial modificada puede comprender, p. ej., al menos 1 región
de unión epitópica, al menos 2 regiones de unión epitópica, al menos
3 regiones de unión epitópica, al menos 4 regiones de unión
epitópica o al menos 5 regiones de unión epitópica. En otros
aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada
puede comprender, p. ej., como máximo 1 región de unión epitópica,
como máximo 2 regiones de unión epitópica, como máximo 3 regiones
de unión epitópica, como máximo 4 regiones de unión epitópica o
como máximo 5 regiones de unión epitópica. En otro aspecto de esta
realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una
o más copias de la misma región de unión epitópica, una o más
copias de diferentes regiones de unión a epítopos, o cualquier
combinación de las mismas.
La ubicación de una región de unión epitópica
puede estar en diversas posiciones, incluyendo, sin limitación, en
el terminal amino de una toxina clostridial modificada, dentro de
una toxina clostridial modificada o en el terminal carboxilo de una
toxina clostridial modificada. De este modo, en una realización, una
región de unión epitópica se ubica en el terminal amino de una
toxina clostridial modificada. En tal ubicación, debería haber una
metionina inicial en frente de la región de unión epitópica. Además,
en la técnica, se sabe que cuando se añade un polipéptido que está
ligado operativamente al terminal amino de otro polipéptido que
comprende la metionina inicial, se puede eliminar el resido de
metionina original. Esto se debe al hecho de que el polipéptido
añadido contendrá una nueva metionina inicial y que la metionina
inicial original puede reducir la expresión óptima de la proteína
de fusión. En aspectos de esta realización, una región de unión
epitópica ubicada en el terminal amino de una toxina clostridial
modificada revelada en la presente memoria puede ser una región de
unión al epítopo FLAG, Expres^{TM}, una región de unión al epítopo
de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana, una región de
unión al epítopo de la proteína p62^{c-Myc} humana
(c-MYC), una región de unión al epítopo de la
glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G), una región de unión al epítopo de la
sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la
glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de
unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región
de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la
polihistidina, una región de unión al epítopo del péptido de unión
a estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una
región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión
a glutationa de la
glutationa-S-transferasa, un dominio
de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o
un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la
maltosa.
maltosa.
En otra realización, una región de unión
epitópica se ubica en el terminal carboxilo de una toxina
clostridial modificada. En aspectos de esta realización, una región
de unión epitópica ubicada en el terminal carboxilo de una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser una
región de unión al epítopo FLAG, Expres^{TM}, una región de unión
al epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana,
una región de unión al epítopo de la proteína
p62^{c-Myc} humana (c-myc), una
región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión
al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del
precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV),
una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo
AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al
epítopo de la polihistidina, una región de unión al epítopo del
péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo
de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación,
un dominio de unión a glutationa de la
glutationa-S-transferasa, un dominio
de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o
un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la
maltosa.
Como otro ejemplo no restrictivo más de un
componente opcional, una toxina clostridial modificada puede
comprender además un sitio de escisión por proteasa exógena. Un
sitio de escisión por proteasa exógena se puede usar en una amplia
variedad de procedimientos que implican, p. ej., la eliminación de
una región de unión epitópica mediante escisión proteolítica. Tal
sitio de escisión por proteasa exógena está ligado operativamente en
marco a una toxina clostridial modificada en forma de una proteína
de fusión. Los ejemplos no restrictivos de sitios de escisión por
proteasa incluyen, p. ej., un sitio de escisión por la enteroquinasa
(Tabla 9); un sitio de escisión por la trombina (Tabla 9); un sitio
de escisión por el Factor Xa (Tabla 9); un sitio de escisión por la
proteasa del rinovirus 3C humano (Tabla 9); un sitio de escisión por
la proteasa del virus del tabaco Etch (TEV) (Tabla 9); un sitio de
escisión por la dipeptidil-aminopeptidasa y un sitio
de escisión por la proteasa del modificador pequeño de tipo
ubiquitina (SUMO)/proteína 1 de tipo ubiquitina
(ULP-1), tal como, p. ej.,
MADSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEA
FAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (SEC. ID. N.º 185).
FAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (SEC. ID. N.º 185).
De este modo, en una realización, una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria puede
comprender además un sitio de escisión por proteasa exógena. En otra
realización, una toxina clostridial modificada revelada en la
presente memoria puede comprender además una pluralidad de sitios de
escisión por proteasa exógena. En aspectos de esta realización, una
toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., al menos 1
sitio de escisión por proteasa exógena, al menos 2 sitios de
escisión por proteasa exógena, al menos 3 sitios de escisión por
proteasa exógena, al menos 4 sitios de escisión por proteasa exógena
o al menos 5 sitios de escisión por proteasa exógena. En otros
aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada
puede comprender, p. ej., como máximo 1 sitio de escisión por
proteasa exógena, como máximo 2 sitios de escisión por proteasa
exógena, como máximo 3 sitios de escisión por proteasa exógena, como
máximo 4 sitios de escisión por proteasa exógena o como máximo 5
sitios de escisión por proteasa exógena. En otro aspecto de esta
realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una
o más copias del mismo sitio de escisión por proteasa exógena, una
o más copias de diferentes sitios de escisión por proteasa exógena,
o cualquier combinación de las mismas.
La ubicación de un sitio de escisión por
proteasa exógena puede estar en una variedad de posiciones,
incluyendo, sin limitación, entre una región de unión epitópica y
una toxina clostridial modificada con el fin de facilitar la
eliminación de la región de unión epitópica mediante escisión
proteolítica. Se prevé la posibilidad de usar un sitio de escisión
por proteasa exógena para eliminar una región de unión epitópica.
Como se menciona anteriormente, las regiones de unión epitópica se
pueden usar en procedimientos de purificación de proteínas y, a
menudo, es deseable eliminar tales regiones de unión epitópica una
vez purificada la proteína. Un modo común de hacerlo consiste en
tener un sitio de escisión por proteasa entre la proteína de interés
y la región de unión epitópica, mediante lo que la escisión
proteolítica del sitio de escisión por proteasa separa la proteína
de interés de la región de unión epitópica. Los ejemplos no
restrictivos de los sitios de escisión por proteasa usados para
eliminar las regiones de unión epitópica, así como las proteasas,
los reactivos, las condiciones y los protocolos bien caracterizados
se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que
incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech,
Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA;
Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y
Stratagene, La Jolla, CA. La selección, la elaboración y el uso de
un sitio de escisión por proteasa apropiado son procedimientos
rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se
pueden extraer de las enseñanzas de la presente
memoria.
memoria.
De este modo, en una realización, un sitio de
escisión por proteasa exógena está ubicado entre una región de
unión epitópica y una toxina clostridial modificada. En otros
aspectos de esta realización, un sitio de escisión por la
enteroquinasa bovina está ubicado entre una región de unión
epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión
por la proteasa del virus del tabaco Etch está ubicado entre una
región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada, un
sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano está
ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial
modificada, un sitio de escisión por la proteasa de
SUMO/ULP-1 está ubicado entre una región de unión
epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión
por la proteasa trombina está ubicado entre una región de unión
epitópica y una toxina clostridial modificada o un sitio de
escisión por la proteasa del factor de coagulación Xa está ubicado
entre una región de unión a un epítopo y una toxina clostridial
modificada. En otros aspectos de la realización, el sitio de
escisión por la enteroquinasa bovina ubicado entre una región de
unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la
SEC ID N.º 168. En otros aspectos de la realización, el sitio de
escisión por proteasa del virus del tabaco Etch ubicado entre una
región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada
comprende la SEC ID N.º 169, SEC ID N.º 170, SEC ID N.º 171, SEC ID
N.º 172, SEC ID N.º 173, SEC ID N.º 174, SEC ID N.º 175, SEC ID N.º
176, SEC ID N.º 177 o SEC ID N.º 178. En otros aspectos más de la
realización, el sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C
humano ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina
clostridial modificada comprende la SEC ID N.º 179, SEC ID N.º 180,
SEC ID N.º 181, SEC ID N.º 182, SEC ID N.º 183 o SEC ID N.º 184. En
otros aspectos más de la realización, el sitio de escisión por la
proteasa de SUMO/ULP-1 ubicado entre una región de
unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la
SEC ID N.º 185. En otros aspectos más de la realización, el sitio de
escisión por la proteasa trombina ubicado entre una región de unión
epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEC ID
N.º 186, SEC ID N.º 187, SEC ID N.º 188, SEC ID N.º 189, SEC ID N.º
190, SEC ID N.º 191, SEC ID N.º 192, SEC ID N.º 193, SEC ID N.º
194, SEC ID N.º 195, SEC ID N.º 196, SEC ID N.º 197, SEC ID N.º 198,
SEC ID N.º 199 o SEC ID N.º 200. En otros aspectos de la
realización, el sitio de escisión por la proteasa de factor de
coagulación Xa ubicado entre una región de unión epitópica y una
toxina clostridial modificada comprende la SEC ID N.º 201 o SEC ID
N.º 202.
Los aspectos de la presente invención
proporcionan, en parte, toxinas clostridiales modificadas. Como se
usa en la presente memoria, la expresión "toxina clostridial
modificada" significa cualquier toxina clostridial natural o
toxina clostridial no natural que comprende al menos la sustitución
de un sitio de escisión por proteasa bicatenaria natural con un
sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial según lo
revelado en la presente memoria, o la adición de un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial según lo revelado en la
presente memoria en la región del bucle bicatenario. Los ejemplos no
restrictivos de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en
la presente memoria incluyen, p. ej., una toxina clostridial
modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial, en la que el sitio de escisión del sustrato sustituyó
al sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural; una
toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión del
sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina
clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que
tiene una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar a una
célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio de
escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa
del bucle bicatenario natural; una toxina clostridial modificada
que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial
y un dominio de unión celular que tiene una mayor actividad de
unión celular capaz de intoxicar a una célula diana de toxina
clostridial natural, en la que el sitio de escisión del sustrato
está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina
clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que
tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a
una célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio
de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa
del bucle bicatenario natural; una toxina clostridial modificada
que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad de
unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de
toxina clostridial natural, en la que el sitio de escisión del
sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina
clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que
tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a
una célula diana de toxina clostridial no natural, en la que el
sitio de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por
proteasa del bucle bicatenario natural; y una toxina clostridial
modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad
de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de
toxina clostridial no natural, en la que el sitio de escisión del
sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario.
Los ejemplos no restrictivos de las
modificaciones de las toxinas clostridiales reveladas en la presente
memoria incluyen, p. ej., la sustitución de un sitio de escisión
por proteasa bicatenaria natural con un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial, la adición de un sitio de escisión
de sustrato de toxina clostridial, la adición de un sitio de
escisión por proteasa exógena, la sustitución de un dominio de unión
celular endógeno con un dominio de unión celular que tiene una
mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar a una célula
diana de toxina clostridial natural, la adición de un dominio de
unión celular que tiene una mayor actividad de unión celular capaz
de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, la
sustitución de un dominio de unión celular endógeno con un dominio
de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada
capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural,
la adición de un dominio de unión celular que tiene una actividad
de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de
toxina clostridial natural, la sustitución de un dominio de unión
celular endógeno con un dominio de unión celular que tiene una
actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula
diana de toxina clostridial no natural, la adición de un dominio de
unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada
capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial no
natural, la adición de un sitio de escisión por proteasa exógena,
la reorganización de los dominios enzimático, de translocalización y
de unión, la adición de una región espaciadora y la adición de una
región de unión epitópica.
Se entiende que la totalidad de tales
modificaciones no afecta sustancialmente a la capacidad de una
toxina clostridial para intoxicar a una célula. Como se usa en la
presente memoria, la expresión "que no afecta sustancialmente"
significa que una toxina clostridial todavía puede ejecutar el
mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial
entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores, y
engloba la unión de una toxina clostridial a un complejo receptor
de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de
toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina
clostridial en el citoplasma y la modificación enzimática de un
sustrato de toxina clostridial. En aspectos de esta realización, la
toxina clostridial modificada es, p. ej., al menos un 10% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 20% tan
tóxica como una toxina clostridial natural; al menos un 30% tan
tóxica como una toxina clostridial natura, al menos un 40% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 50% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 60% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 70% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 80% tan
tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 90% tan
tóxica como una toxina clostridial natural o al menos un 95% tan
tóxica como una toxina clostridial natural. En aspectos de esta
realización, la toxina clostridial modificada es, p. ej., como
máximo un 10% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 20% tan tóxica como una toxina clostridial natural; como
máximo un 30% tan tóxica como una toxina clostridial natura, como
máximo un 40% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 50% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 60% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 70% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 80% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como
máximo un 90% tan tóxica como una toxina clostridial natural o como
máximo un 95% tan tóxica como una toxina clostridial natural.
Los aspectos de la presente invención
proporcionan, en parte, moléculas de polinucleótido. Como se usa en
la presente memoria, la expresión "molécula de polinucleótido"
es sinónimo de "molécula de ácido nucleico" y significa una
forma polimérica de nucleótidos, tal como, p. ej., ribonucleótidos y
desoxirribunucleótidos, de cualquier longitud. Se prevé que
cualquiera y todas las moléculas de polinucleótido que puedan
codificar una toxina clostridial modificada revelada en la presente
memoria pueden ser útiles, incluyendo, sin limitación, moléculas de
ADN naturales y no naturales, y moléculas de ARN naturales y no
naturales. Los ejemplos no restrictivos de las moléculas de ADN
naturales y no naturales incluyen moléculas de ADN monocatenario,
moléculas de ADN bicatenario, moléculas de ADN genómico, moléculas
de ADNc, constructos vectoriales, tales como, p. ej., constructos
de plásmidos, constructos de fagémidos, constructos de
bacteriófagos, constructos retrovirales y constructos de cromosomas
artificiales. Los ejemplos no restrictivos de las moléculas de ARN
naturales y no naturales incluyen moléculas de ARN monocatenario,
moléculas de ARN bicatenario y ARNm.
De este modo, en una realización, una molécula
de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de
translocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina
clostridial. En un aspecto de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial que comprende una
variante natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una
isoforma de toxina clostridial o un subtipo de toxina clostridial.
En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una toxina clostridial que comprende una variante no
natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante
conservadora de toxina clostridial, una variante no conservadora de
toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina
clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina
clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de toxina clostridial o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento
activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otros
aspectos de esta realización, una toxina clostridial comprende una
BoNT/A, una BoNT/B, una BoNT/C1, una BoNT/D, una BoNT/E, una BoNT/F,
una BoNT/G o una TeNT.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un
dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A
y un dominio de unión de BoNT/A. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que
comprende la SEC ID N.º 1. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una
variante natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A
o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una
variante natural de BoNT/A de la SEC ID N.º 1, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/A de la SEC ID N.º 1 o un subtipo de BoNT/A de
la SEC ID N.º 1. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una
variante no natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/A, una variante no conservadora de BoNT/A o un
fragmento activo de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una variante no
natural de BoNT/A de la SEC ID N.º 1, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/A de SEC ID N.º 1, una variante no
conservadora de BoNT/A de SEC ID N.º 1 o un fragmento activo de
BoNT/A de SEC ID N.º 1, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un dominio
enzimático de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio
de unión de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, o cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una BoNT/A que comprende un dominio enzimático de BoNT/A de los
aminoácidos 1-448 de SEC ID N.º 1 o un fragmento
activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/A de los
aminoácidos 449-860 de la SEC ID N.º 1 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A de los
aminoácidos 861-1296 de la SEC ID N.º 1 o un
fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 1, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 1, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 1, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 1 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 1, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 1, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 1, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 1 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 1.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 1.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un
dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B
y un dominio de unión de BoNT/B. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que
comprende la SEC ID N.º 2. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una
variante natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B
o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una
variante natural de BoNT/B de la SEC ID N.º 2, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/B de la SEC ID N.º 2 o un subtipo de BoNT/B de
la SEC ID N.º 2. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una
variante no natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/B, una variante no conservadora de BoNT/B o un
fragmento activo de BoNT/B, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una variante no
natural de BoNT/B de la SEC ID N.º 2, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/B de SEC ID N.º 2, una variante no
conservadora de BoNT/B de SEC ID N.º 2 o un fragmento activo de
BoNT/B de SEC ID N.º 2, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B que comprende un
dominio enzimático de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un
dominio de translocación de BoNT/B o un fragmento activo del mismo,
un dominio de unión de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, y
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/B que comprende un dominio enzimático de
BoNT/B de los aminoácidos 1-441 de SEC ID N.º 2 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/B
de los aminoácidos 442-847 de la SEC ID N.º 2 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B de los
aminoácidos 848-1291 de la SEC ID N.º 2 o un
fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 2, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 2, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 2, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 2 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 2, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 2, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 2, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 2 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 2.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 2.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un
dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de translocación de
BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/C1. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que
comprende la SEC ID N.º 3. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una
variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de
BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que
comprende una variante natural de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, tal
como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3 o un subtipo
de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3. En otro aspecto más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende
una variante no natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora de BoNT/C1 o
un fragmento activo de BoNT/C1, o cualquier combinación de los
mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una variante no
natural de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, una variante no
conservadora de BoNT/C1 de SEC ID N.º 3 o un fragmento activo de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 3, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un dominio
enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio
de translocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un
dominio de unión de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, y
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que
comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 de los aminoácidos
1-449 de la SEC ID N.º 3 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/C1 de los aminoácidos
450-855 de la SEC ID N.º 3 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 de los aminoácidos
856-1291 de la SEC ID N.º 3 o un fragmento activo
del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 3, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 3, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 3, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 3 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 3. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 3, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 3, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 3, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 3 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 3.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 3.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un
dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D
y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que
comprende la SEC ID N.º 4. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una
variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D
o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una
variante natural de BoNT/D de la SEC ID N.º 4, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/D de la SEC ID N.º 4 o un subtipo de BoNT/D de
la SEC ID N.º 4. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una
variante no natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D o un
fragmento activo de BoNT/D, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una variante no
natural de BoNT/D de la SEC ID N.º 4, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/D de SEC ID N.º 4, una variante no
conservadora de BoNT/D de SEC ID N.º 4 o un fragmento activo de
BoNT/D de SEC ID N.º 4, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un dominio
enzimático de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio
de unión de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, o cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una BoNT/D que comprende un dominio enzimático de BoNT/D de los
aminoácidos 1-442 de SEC ID N.º 4 o un fragmento
activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/D de los
aminoácidos 443-851 de la SEC ID N.º 4 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D de los
aminoácidos 852-1276 de la SEC ID N.º 4 o un
fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 4, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 4, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 4, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 4 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 4, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 4, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 4, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 4 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 4.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 1.00, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 4.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un
dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E
y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que
comprende la SEC ID N.º 5. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una
variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E
o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una
variante natural de BoNT/E de la SEC ID N.º 5, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/E de la SEC ID N.º 5 o un subtipo de BoNT/E de
la SEC ID N.º 5. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una
variante no natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E o un
fragmento activo de BoNT/E, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una variante no
natural de BoNT/E de la SEC ID N.º 5, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/E de SEC ID N.º 5, una variante no
conservadora de BoNT/E de SEC ID N.º 5 o un fragmento activo de
BoNT/E de SEC ID N.º 5, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E que comprende un
dominio enzimático de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un
dominio de translocación de BoNT/E o un fragmento activo del mismo,
un dominio de unión de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, y
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una BoNT/E que comprende un dominio enzimático de
BoNT/E de los aminoácidos 1-422 de SEC ID N.º 5 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/E
de los aminoácidos 423-834 de la SEC ID N.º 5 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E de los
aminoácidos 835-1252 de la SEC ID N.º 5 o un
fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 5, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 5, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 5, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 5 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 5, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 5, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 5, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 5 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 5.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 5.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F
y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que
comprende la SEC ID N.º 6. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una
variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F
o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una
variante natural de BoNT/F de la SEC ID N.º 6, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/F de la SEC ID N.º 6 o un subtipo de BoNT/F de
la SEC ID N.º 6. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una
variante no natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F o un
fragmento activo de BoNT/F, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una variante no
natural de BoNT/F de la SEC ID N.º 6, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/F de SEC ID N.º 6, una variante no
conservadora de BoNT/F de SEC ID N.º 6 o un fragmento activo de
BoNT/F de SEC ID N.º 6, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un dominio
enzimático de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio
de unión de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, y cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
dominio enzimático de BoNT/F de los aminoácidos
1-436 de SEC ID N.º 6 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de translocación de BoNT/F de los aminoácidos
437-852 de la SEC ID N.º 6 o un fragmento activo del
mismo, un dominio de unión de BoNT/F de los aminoácidos
853-1274 de la SEC ID N.º 6 o un fragmento activo
del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 6, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 6, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 6, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 6 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 6, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 6, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 6, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 6 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 6.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 6.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un
dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G
y un dominio de unión de BoNT/G. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que
comprende la SEC ID N.º 7. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una
variante natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G
o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una
variante natural de BoNT/G de la SEC ID N.º 7, tal como, p. ej.,
una isoforma de BoNT/G de la SEC ID N.º 7 o un subtipo de BoNT/G de
la SEC ID N.º 7. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una
variante no natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/G, una variante no conservadora de BoNT/G o un
fragmento activo de BoNT/G, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una variante no
natural de BoNT/G de la SEC ID N.º 7, tal como, p. ej., una variante
conservadora de BoNT/G de SEC ID N.º 7, una variante no
conservadora de BoNT/G de SEC ID N.º 7 o un fragmento activo de
BoNT/G de SEC ID N.º 7, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un dominio
enzimático de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de
translocación de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio
de unión de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, o cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una BoNT/G que comprende un dominio enzimático de BoNT/G de los
aminoácidos 1-442 de SEC ID N.º 7 o un fragmento
activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/G de los
aminoácidos 443-852 de la SEC ID N.º 7 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G de los
aminoácidos 853-1297 de la SEC ID N.º 7 o un
fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 70% con la SEC ID N.º 7, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 7, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 7, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 7 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 7, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 7, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 7, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 7 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID
N.º 7.
N.º 7.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 7.
En otra realización, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende una TeNT. En un aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un
dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación de TeNT y un
dominio de unión de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende la SEC ID
N.º 8. En otro aspecto de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante natural
de TeNT, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de
TeNT. En otro aspecto de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante natural
de TeNT de la SEC ID N.º 8, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT
de la SEC ID N.º 8 o un subtipo de TeNT de la SEC ID N.º 8. En otro
aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una TeNT que comprende una variante no natural de TeNT,
tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT, una variante no
conservadora de TeNT o un fragmento activo de TeNT, o cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende una
variante no natural de TeNT de la SEC ID N.º 8, tal como, p. ej.,
una variante conservadora de TeNT de la SEC ID N.º 8, una variante
no conservadora de TeNT de la SEC ID N.º 8 o un fragmento activo de
TeNT de la SEC ID N.º 8, o cualquier combinación de los mismos. En
otro aspecto más de esta realización, una TeNT que comprende un
dominio enzimático de TeNT o un fragmento activo del mismo, un
dominio de translocación de TeNT o un fragmento activo del mismo, un
dominio de unión de TeNT o un fragmento activo del mismo, y
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una TeNT que comprende un dominio enzimático de TeNT de
los aminoácidos 1-441 de SEC ID N.º 8 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de TeNT de
los aminoácidos 442-870 de la SEC ID N.º 8 o un
fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT de los
aminoácidos 871-1315 de la SEC ID N.º 8 o un
fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos
como mínimo del 70% con la SEC ID N.º 8, una identidad de los
aminoácidos como mínimo del 75% con la SEC ID N.º 8, una identidad
de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEC ID N.º 8, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEC ID N.º
8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEC
ID N.º 8 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con
la SEC ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como
máximo del 70% con la SEC ID N.º 8, una identidad de los
aminoácidos como máximo del 75% con la SEC ID N.º 8, una identidad
de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEC ID N.º 8, una
identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEC ID N.º
8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEC
ID N.º 8 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con
la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500
eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 eliminaciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho,
nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ó 500 adiciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 8.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial.
En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que
comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato
de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial o un subtipo de un sitio
de escisión de sustrato de toxina clostridial. En otros aspectos de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de toxina clostridial que comprende una
variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, una variante
no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sustrato de toxina
clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P_{1}' no
está modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural
de una proteína diana escindida por la toxina clostridial. En otros
aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en
el que el residuo P_{1}' no está modificado ni sustituido en
comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida
por la toxina clostridial que puede ser, p. ej., un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de
TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de
escisión de sustrato de BuNT.
En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sustrato de toxina
clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de
sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P_{1} está
modificado o sustituido en comparación con el residuo natural de una
proteína diana escindida por la toxina clostridial; tal sustrato de
toxina clostridial conserva la susceptibilidad a la escisión del
enlace peptídico entre los residuos P_{1} y P_{1}'. En otros
aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en
el que el residuo P_{1}' está modificado o sustituido en
comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida
por la toxina clostridial que puede ser, p. ej., un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de
TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de
escisión de sustrato de BuNT.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25
incluyendo Gln-Arg. En otros aspectos de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A que comprende, p. ej., la secuencia
de aminoácidos
Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys
(SEC ID N.º 104); la secuencia de aminoácidos
Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys
(SEC ID N.º 105); la secuencia de aminoácidos de
Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys
(SEC ID N.º 106). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/A que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A que comprende una variante natural de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105
o SEC ID N.º 106, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o
SEC ID N.º 106; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º 106. En otro
aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A, una variante no conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A o un peptidomimético de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/A que comprende una variante no natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o
SEC ID N.º 106; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID
N.º 105 o SEC ID N.º 106; una variante no conservadora de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105
o SEC ID N.º 106 o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A de SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º
106, o cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos más
de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende p. ej., la
SEC ID N.º 133, SEC ID N.º 134, SEC ID N.º 135, SEC ID N.º 136, SEC
ID N.º 138, SEC ID N.º 141, SEC ID N.º 148, SEC ID N.º 150 o SEC ID
N.º
151.
151.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 104 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 104, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 104, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 104 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 104.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 104. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 104. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 104.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser
(SEC ID N.º 107); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser
(SEC ID N.º 108); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn
(SEC ID N.º 109); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln
(SEC ID N.º 110); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser
(SEC ID N.º 111); o la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser
(SEC ID N.º 112). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B que comprende una variante natural de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108,
SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112;
tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B de la SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC
ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID
N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID
N.º 112. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B que comprende una variante no
natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º
107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111
o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID
N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID
N.º 112; una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º
109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de
SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC
ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, o cualquier combinación de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende
al menos seis residuos consecutivos de sintaxina incluyendo
Lys-Ala. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 113); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 114); la secuencia de aminoácidos
Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 115); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 116); la secuencia de aminoácidos
Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 117); la secuencia de aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 118); o la secuencia de aminoácidos
Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr
(SEC ID N.º 119). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114,
SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC
ID N.º 119, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID
N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º
119; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de
SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC
ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119. En otro aspecto más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante no
natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1, una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro
aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende
una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID
N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119; tal como,
p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º
115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º
119, una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º
115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º
119 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID
N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118 o SEC ID N.º 119, o
cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 113 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 113, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 113 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 113.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 113. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 113. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 113.
En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende al menos seis residuos consecutivos de la
SNAP-25 incluyendo Arg-Ala. En otros
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina BoNT/C1 que
comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID N.º 120); o la secuencia de aminoácidos de
Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu
(SEC ID N.º 121). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º
121, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121; o un subtipo
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o
SEC ID N.º 121. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende una variante no natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante no
natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID
N.º 120 o SEC ID N.º 121; tal como, p. ej., una variante
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC
ID N.º 99 o SEC ID N.º XX; una variante no conservadora de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º
121; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 de SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121, o cualquier combinación
de los
mismos.
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
120, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 120 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 120, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 120 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 120.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un
polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 120. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 120. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 120.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Lys-Leu. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu
(SEC ID N.º 122); o la secuencia de aminoácidos
Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu
(SEC ID N.º 123). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D que comprende una variante natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123,
tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID
N.º 123. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D que comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o
SEC ID N.º 123; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID
N.º 123; una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D de SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de
SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 122 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 122, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 122, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 122 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 122.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 122. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 122. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 122.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Arg-lle. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys
(SEC ID N.º 124); la secuencia de aminoácidos
Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys
(SEC ID N.º 125); la secuencia de aminoácidos
Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met
(SEC ID N.º 126); la secuencia de aminoácidos
Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys
(SEC ID N.º 127); o la secuencia de aminoácidos
Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys
(SEC ID N.º 128). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E que comprende una variante natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125,
SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128; tal como, p. ej.,
una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de la
SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC
ID N.º 128; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º
127 o SEC ID N.º 128. En otro aspecto más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E que comprende una variante no natural de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, una
variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más
de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende una variante
no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID
N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID
N.º 128, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125,
SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128; una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEC ID
N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID
N.º 128; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E de SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID
N.º 127 o SEC ID N.º 128, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 124 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 124, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 124, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 124 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 124.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 124. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 124. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 124.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Gln-Lys. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu
(SEC ID N.º 129); o la secuencia de aminoácidos
Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu
(SEC ID N.º 130). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F que comprende una variante natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130,
tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID
N.º 130. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F que comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o
SEC ID N.º 130; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID
N.º 130; una variante no conservadora de sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F de SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de
SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 129 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 129, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 129, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 129 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 129.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 129. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 129. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 129.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En un
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende al
menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Ala-Ala. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G que comprende, p. ej., la secuencia de
aminoácidos
Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys
(SEC ID N.º 131); o la secuencia de aminoácidos
Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys
(SEC ID N.º 132). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G que comprende una variante natural de un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G que comprende una variante natural de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132,
tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132; o un subtipo de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID
N.º 132. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G o un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, o
cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G que comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o
SEC ID N.º 132; tal como, p. ej., una variante conservadora de un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID
N.º 132; una variante no conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G de SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de
SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132, o cualquier combinación de los
mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del
75% con la SEC ID N.º 131 o una identidad de los aminoácidos como
mínimo del 87,5% con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50%
con la SEC ID N.º 131, una identidad de los aminoácidos como máximo
del 62,5% con la SEC ID N.º 131, una identidad de los aminoácidos
como máximo del 75% con la SEC ID N.º 131 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 131.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro
sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC
ID N.º 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID
N.º 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como
máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de
aminoácidos contiguos en comparación con la SEC ID N.º 131. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o
tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la
SEC ID N.º 131. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 131.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En un aspecto
de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende al menos seis
residuos consecutivos de la VAMP incluyendo
Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de TeNT que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser
(SEC ID N.º 107); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser
(SEC ID N.º 108); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn
(SEC ID N.º 109); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln
(SEC ID N.º 110); la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser
(SEC ID N.º 111); o la secuencia de aminoácidos
Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser
(SEC ID N.º 112). En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT
que comprende una variante natural de un sitio de escisión de
sustrato de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT
que comprende una variante natural de un sitio de escisión de
sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109,
SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej.,
una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID
N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º
111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de
escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC
ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal
como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º
110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; o un subtipo de un sitio de
escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC
ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal
como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º
110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112. En otro aspecto más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante no natural
de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, tal como, p. ej., una
variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT,
una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de
TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio
de escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante no
natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC ID N.º
107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111
o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108,
SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; tal
como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de
sustrato de TeNT de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109,
SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej.,
una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC
ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID
N.º 111 o SEC ID N.º 112; tal como, p. ej., una variante no
conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC ID
N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º
111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108,
SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112; un
peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEC
ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID
N.º 111 o SEC ID N.º 112, tal como, p. ej, una isoforma de un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B de SEC ID N.º 107, SEC ID N.º
108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º
112; o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEC ID N.º
107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la
SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácido como mínimo del 75%
con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los aminoácidos como mínimo
del 87,5% con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la
SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del
62,5% con la SEC ID N.º 107, una identidad de los aminoácidos como
máximo del 75% con la SEC ID N.º 107 o una identidad de los
aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos
en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de
aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones
de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT
que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una,
dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato
de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo
dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos
más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un
sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que
tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación
con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta realización,
una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de
sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEC ID N.º 107. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de
escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene,
p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos
contiguos en comparación con la SEC ID N.º 107.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria puede comprender además una
molécula de polinucleótido que codifique una región flexible que
comprenda un espaciador flexible. En otra realización, una molécula
de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria puede comprender además una molécula
de polinucleótido que codifique una región flexible que comprenda
una pluralidad de espaciadores flexibles en tándem. En aspectos de
esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una
región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1
espaciador de G, al menos 2 espaciadores de G, al menos 3
espaciadores de G, al menos 4 espaciadores de G o al menos 5
espaciadores de G. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido que codifica una región flexible puede
comprender en tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de G, como
máximo 2 espaciadores de G, como máximo 3 espaciadores de G, como
máximo 4 espaciadores de G o como máximo 5 espaciadores de G. En
otros aspectos más de esta realización, una molécula de
polinucleótido que codifica una región flexible puede comprender en
tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de A, al menos 2 espaciadores
de A, al menos 3 espaciadores de A, al menos 4 espaciadores de A o
al menos 5 espaciadores de A. En otros aspectos más de esta
realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región
flexible puede comprender en tándem, p. ej., como máximo 1
espaciador de A, como máximo 2 espaciadores de A, como máximo 3
espaciadores de A, como máximo 4 espaciadores de A o como máximo 5
espaciadores de A. En otro aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada
puede comprender una molécula de polinucleótido que codifique una
región flexible que comprenda una o más copias de los mismos
espaciadores flexibles, una o más copias de diferentes regiones de
espaciadores flexibles o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria puede comprender además una
molécula de polinucleótido que codifique una región de unión
epitópica. En otra realización, una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente
memoria puede comprender además una molécula de polinucleótido que
codifique una pluralidad de regiones de unión epitópica. En
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada puede comprender, p.
ej., como mínimo 1 molécula de polinucleótido que codifique una
región de unión epitópica, como mínimo 2 moléculas de polinucleótido
que codifiquen regiones de unión epitópica, como mínimo 3 moléculas
de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como
mínimo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de
unión epitópica o como mínimo 5 moléculas de polinucleótido que
codifiquen regiones de unión epitópica. En otros aspectos de esta
realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada puede comprender, p. ej., como máximo 1
molécula de polinucleótido que codifique una región de unión
epitópica, como máximo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen
regiones de unión epitópica, como máximo 3 moléculas de
polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como
máximo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de
unión epitópica o como máximo 5 moléculas de polinucleótido que
codifiquen regiones de unión epitópica. En otro aspecto de esta
realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada puede comprender una o más copias de las
mismas moléculas de polinucleótido que codifican una región de unión
epitópica, una o más copias de diferentes moléculas de
polinucleótido que codifican una región de unión epitópica, o
cualquier combinación de las mismas. La ubicación de una molécula
de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica puede
estar en diversas posiciones, incluyendo, sin limitación, en el
terminal amino de una toxina clostridial modificada, dentro de una
toxina clostridial modificada o en el terminal carboxilo de una
toxina clostridial modificada.
En un aspecto de esta realización, una molécula
de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica se
ubica en el terminal amino de una toxina clostridial modificada. En
aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que
codifica una región de unión epitópica ubicada en el terminal amino
de una toxina clostridial modificada revelada en la presente
memoria puede ser, p. ej., una región de unión al epítopo FLAG,
Expres^{TM}, una región de unión al epítopo de la hemaglutinina
(HA) del virus de la gripe humana, una región de unión al epítopo
de la proteína p62^{c-Myc} humana
(c-MYC), una región de unión al epítopo de la
glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G), una región de unión al epítopo de la
sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la
glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de
unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región
de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la
polihistidina, una región de unión al epítopo del péptido de unión a
estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una
región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión
a glutationa de la
glutationa-S-transferasa, un dominio
de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o
un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la
maltosa.
En otro aspecto de esta realización, una
molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica está ubicada en el terminal carboxilo de una toxina
clostridial modificada. En aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica ubicada en el terminal carboxilo de una toxina
clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser, p.
ej., una región de unión al epítopo FLAG, Expres^{TM}, una región
de unión al epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe
humana, una región de unión al epítopo de la proteína
p62^{c-Myc} humana (c-MYC), una
región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión
al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del
precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV),
una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo
AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al
epítopo de la polihistidina, una región de unión al epítopo del
péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo
de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación,
un dominio de unión a glutationa de la
glutationa-S-transferasa, un dominio
de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o
un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la
maltosa.
En otra realización más, las moléculas de
polinucleótido que codifican una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria pueden comprender además una
molécula de polinucleótido que codifique un sitio de escisión por
proteasa exógena. En otra realización, una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada
revelada en la presente memoria puede comprender además una
pluralidad de moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de
escisión por proteasa exógena. En aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial
modificada puede comprender, p. ej., como mínimo 1 molécula de
polinucleótido que codifique un sitio de escisión por proteasa
exógena, como mínimo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen
sitios de escisión por proteasa exógena, como mínimo 3 moléculas de
polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa
exógena, como mínimo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen
sitios de escisión por proteasa exógena o como mínimo 5 moléculas
de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa
exógena. En otros aspectos de esta realización, una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede
comprender, p. ej., como máximo 1 molécula de polinucleótido que
codifique un sitio de escisión por proteasa exógena, como máximo 2
moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por
proteasa exógena, como máximo 3 moléculas de polinucleótido que
codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena, como máximo 4
moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por
proteasa exógena o como máximo 5 moléculas de polinucleótido que
codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena. En otro aspecto
de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica
una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias
del mismo sitio de escisión por proteasa exógena, una o más copias
de diferentes sitios de escisión por proteasa exógena, o cualquier
combinación de las mismas.
En otra realización más, una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión por proteasa
exógena está ubicada entre una molécula de polinucleótido que
codifica un péptido de unión epitópica y una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En
otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido
que codifica un sitio de escisión por la enteroquinasa bovina está
ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una
región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa
del virus del tabaco Etch está ubicada entre una molécula de
polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una
molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial
modificada; una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de
escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano está ubicada entre
una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada; una molécula de polinucleótido que codifica
un sitio de escisión por la proteasa de SUMO/ULP-1
está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una
región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa
trombina está ubicada entre una molécula de polinucleótido que
codifica una región de unión epitópica y una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; o
una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión
por la proteasa del factor de coagulación Xa está ubicada entre una
molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada. En otros aspectos de esta realización, una
molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la
enteroquinasa bovina de la SEC ID N.º 168 está ubicada entre una
molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada. En otros aspectos de la realización, una
molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la
proteasa del virus del tabaco Etch de la SEC ID N.º 169, SEC ID N.º
170, SEC ID N.º 171, SEC ID N.º 172, SEC ID N.º 173, SEC ID N.º
174, SEC ID N.º 175, SEC ID N.º 176, SEC ID N.º 177 o SEC ID N.º 178
está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una
región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos más de
la realización, una molécula de polinucleótido que codifica el
sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano de la SEC
ID N.º 179, SEC ID N.º 180, SEC ID N.º 181, SEC ID N.º 182, SEC ID
N.º 183 o SEC ID N.º 184 está ubicada entre una molécula de
polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una
molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial
modificada. En otros aspectos más de la realización, una molécula de
polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa de
SUMO/ULP-1 de la SEC ID N.º 185 está ubicada entre
una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión
epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada. En otros aspectos más de la realización, una
molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la
proteasa trombina de la SEC ID N.º 186, SEC ID N.º 187, SEC ID N.º
188, SEC ID N.º 189, SEC ID N.º 190, SEC ID N.º 191, SEC ID N.º 192,
SEC ID N.º 193, SEC ID N.º 194, SEC ID N.º 195, SEC ID N.º 196, SEC
ID N.º 197, SEC ID N.º 198, SEC ID N.º 199 o SEC ID N.º 200 está
ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una
región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de la
realización, una molécula de polinucleótido que codifica el sitio
de escisión por la proteasa del factor de coagulación Xa de la SEC
ID N.º 201 o SEC ID N.º 202 está ubicada entre una molécula de
polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una
molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial
modificada.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para producir una toxina clostridial
modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina
clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario,
procedimiento que comprende la etapa de expresar una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una
célula. Otro aspecto de la presente invención proporciona un
procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en
la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está
ubicado en la región del bucle bicatenario, procedimiento que
comprende las etapas de introducir un constructo de expresión que
comprende una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada en una célula y expresar el constructo de
expresión en la célula.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, una toxina clostridial. Se prevé la
posibilidad de producir cualquiera y todas las toxinas clostridiales
reveladas en la presente memoria usando los procedimientos
revelados en la presente memoria. De este modo, los aspectos de esta
realización incluyen producir, sin limitación, toxinas
clostridiales naturales, variantes naturales de toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de toxinas
clostridiales y subtipos de toxinas clostridiales; variantes no
naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., variantes
conservadoras de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras
de toxinas clostridiales y fragmentos de toxinas clostridiales de
las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial. Se prevé la posibilidad de producir cualquiera y
todos los sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales
revelados en la presente memoria usando los procedimientos revelados
en la presente memoria. De este modo, los aspectos de esta
realización incluyen producir, sin limitación, sitios de escisión
de sustratos de toxinas clostridiales naturales; variantes naturales
de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales, tales
como, p. ej., isoformas de sitios de escisión de sustratos de
toxinas clostridiales y subtipos de sitios de escisión de sustratos
de toxinas clostridiales; variantes no naturales de sitios de
escisión de sustratos de toxinas clostridiales, tales como, p. ej.,
variantes conservadoras de sitios de escisión de sustratos de
toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de sitios de
escisión de sustratos de toxinas clostridiales y peptidomiméticos
de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales de las
mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, una molécula de polinucleótido. Se
prevé la posibilidad de usar cualquiera y todas las moléculas de
polinucleótido reveladas en la presente memoria. De este modo, los
aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, moléculas de
polinucleótido que codifican toxinas clostridiales naturales;
moléculas de polinucleótido que codifican variantes naturales de
toxinas clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de toxinas
clostridiales y subtipos de toxinas clostridiales; moléculas de
polinucleótido que codifican variantes no naturales de toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., variantes conservadoras de
toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de toxinas
clostridiales y fragmentos de toxinas clostridiales de las mismas,
o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, un constructo de expresión. Un
constructo de expresión comprende una molécula de polinucleótido
revelada en la presente memoria ligada operativamente a un vector
de expresión útil para la expresión de la molécula de polinucleótido
en una célula o un extracto libre de células. Se puede emplear una
amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula
de polinucleótido que codifique una toxina clostridial modificada,
incluyendo, sin limitación, un vector de expresión viral; vector de
expresión procariota; vectores de expresión eucariotas, tales como,
p. ej., un vector de expresión en levaduras, un vector de expresión
en insectos y un vector de expresión en mamíferos; y un vector de
expresión en extracto libre de células. Se entiende además que los
vectores de expresión útiles para poner en práctica los aspectos de
estos procedimientos pueden incluir aquéllos que expresen una toxina
clostridial modificada bajo el control de un elemento promotor
constitutivo, de un tejido específico, de una célula específica o
inducible, un elemento potenciador, o ambos. Los ejemplos no
restrictivos de los vectores de expresión, junto con los reactivos
y las condiciones bien establecidos para elaborar y usar un
constructo de expresión a partir de tales vectores de expresión se
pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen,
sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto,
CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI;
QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La
selección, la elaboración y el uso de un vector de expresión
apropiado son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier
experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la
presente memoria.
De este modo, los aspectos de esta realización
incluyen, sin limitación, un vector de expresión viral ligado
operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una
toxina clostridial modificada; un vector de expresión procariota
ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica
una toxina clostridial modificada; un vector de expresión en
levaduras ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que
codifica una toxina clostridial modificada; un vector de expresión
en insectos ligado operativamente a una molécula de polinucleótido
que codifica una toxina clostridial modificada; y un vector de
expresión en mamíferos ligado operativamente a una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. Otros
aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, constructos
de expresión adecuados para expresar una toxina clostridial
modificada revelada en la presente memoria usando un extracto libre
de células que comprenda un vector de expresión en extracto libre
de células ligado operativamente a una molécula de polinucleótido
que codifique una toxina clostridial modificada. Otros aspectos de
esta realización incluyen, sin limitación, constructos de expresión
que comprenden moléculas de polinucleótido que comprenden una
cualquiera de la SEC ID N.º 109 a la SEC ID N.º 132 y de la SEC ID
N.º 136 a la SEC ID N.º 159. Otros aspectos de esta realización
incluyen, sin limitación, constructos de expresión que comprenden
moléculas de polinucleótido que codifican una toxina clostridial
modificada que comprende una cualquiera de la SEC ID N.º 85 a la SEC
ID N.º 108.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, una célula. Se prevé la posibilidad de
usar cualquiera y todas las células. De este modo, los aspectos de
esta realización incluyen, sin limitación, células procariotas que
incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aeróbicas,
microaerófilas, facultativas, anaeróbicas,
gram-negativas y gram-negativas,
tales como aquéllas derivadas de, p. ej., Escherichia coli,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis,
Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter
crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens,
Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas
fluorescens y Salmonella typhimurium; y células
eucariotas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales
como, p. ej., aquéllas derivadas de Pichia pastoris, Pichia
methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células
de insecto y líneas celulares de insecto, tales como, p. ej.,
aquéllas derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni,
Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de
mamífero y líneas celulares de mamífero, tales como, p. ej.,
aquéllas derivadas de ratón, rata, hámster, cerdo, oveja, caballo,
primate y ser humano. Las líneas celulares se pueden obtener de la
Colección Americana de Cultivos Tipo (2004); la Colección Europea
de Cultivos Celulares (2004); y la Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares (2004). Los ejemplos no
restrictivos de protocolos específicos para seleccionar, elaborar y
usar una línea celular apropiada se describen, p. ej., en "INSECT
CELL CULTURE ENGINEERING" (Mattheus F. A. Goosen et al.
eds., Marcel Dekker, 1993); "INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL
AND APPLIED ASPECTS" (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer
Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison 8 Ian F. Rae,
"GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE" (Cambridge University
Press, 1997); "CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES"
(Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian
Freshney, "CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC
TECHNIQUE" (Wiley-Liss, IV ed. 2000); "ANIMAL
CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH" (John R. W. Masters ed.,
Oxford University Press, III ed. 2000); "MOLECULAR CLONING A
LABORATORY MANUAL", supra, (2001); "BASIC CELL CULTURE:
A PRACTICAL APPROACH" (John M. Davis, Oxford Press, II ed.
2002); y "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY",
supra, (2004). Estos protocolos son procedimientos
rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se
pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, introducir una molécula de
polinucleótido en una célula. Una molécula de polinucleótido
introducida en una célula puede ser mantenida transitoria o
establemente por esa célula. Las moléculas de polinucleótido
mantenidas establemente pueden ser
extra-cromosómicas y replicarse de manera autónoma,
o pueden estar integradas en el material cromosómico de la célula y
replicarse de manera no autónoma. Se prevé la posibilidad de usar
cualquiera y todos los procedimientos para introducir una molécula
de polinucleótido revelados en la presente memoria. Los
procedimientos útiles para introducir una molécula de ácido
nucleico en una célula incluyen, sin limitación, la transfección con
mediadores químicos, tal como la mediada por fosfato de calcio, la
mediada por dextrano de dietilaminoetilo (DEAE), la mediada por
lípidos, la mediada por polietilenimina (PEI), la mediada por
polilisina y la mediada por polibreno; la transfección con
mediadores físicos, tal como, p. ej., la administración de
partículas biolísticas, la microinyección, la fusión de
protoplastos y la electroporación; y la transfección con mediadores
virales, tal como p. ej., la transfección mediada por retrovirus,
véase, p. ej., "Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian
Cells", pp. 16.1-16.62 (Sambrook y Russell,
eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Vol. 3, III ed.
2001). Cualquier experto en la técnica entiende que la selección de
un procedimiento específico para introducir un constructo de
expresión en una célula dependerá, en parte, de si la célula
contiene transitoriamente un constructo de expresión o de si la
célula contiene establemente un constructo de expresión. Estos
protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier
experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la
presente memoria.
En un aspecto de esta realización, se usa un
procedimiento con mediador químico, denominado transfección, para
introducir una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada en una célula. En los procedimientos con
mediadores químicos, el reactivo químico forma un complejo con el
ácido nucleico que facilita su absorción en las células. Tales
reactivos químicos incluyen, sin limitación, la mediación con
fosfato de calcio, véase, p.ej., Martin Jordan y Florian Worm,
"Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium
Phosphate", 33(2) Methods 136-143
(2004); la mediación con dextrano de
dietil-aminoetilo (DEAE), la mediación con lípidos,
la mediación con polímeros catiónicos como la mediación con
polietilenimina (PEI) y la mediación con polilisina, y la mediación
con polibreno, véase, p. ej., Chun Zhang et al.,
"Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to
Brain-Derived Cells", 33(2) Methods
144-150 (2004). Tales sistemas de administración
con mediadores químicos se pueden preparar mediante procedimientos
estándar y se encuentran comercialmente disponibles, véase, p.ej.,
el equipo de transfección CellPhect (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ); el equipo de transfección en mamíferos, fosfato de
calcio y dextrano de DEAE, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); el
reactivo de transfección Lipofectamine^{TM} (Invitrogen, Inc.,
Carlsbad, CA); el equipo de transfección ExGen 500 (Fermentas,
Inc., Hanover, MD) y los equipos de transfección SuperFect y
Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
En otro aspecto de esta realización, se usa un
procedimiento con mediador físico para introducir una molécula de
polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una
célula. Las técnicas físicas incluyen, sin limitación, la
electroporación, la biolística y la microinyección. Las técnicas de
biolística y microinyección perforan la pared celular para
introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, véase, p.
ej., Jeike E. Biewenga et al.,
"Plasmid-Mediated Gene Transfer in Neurons Using
the Biolistics Technique", 71(1) J. Neurosci.
Methods. 67-75 (1997); y John O'Brien y Sarah C.
R. Lummis, "Biolistic and Diolistic Transfection: Using the Gene
Gun to Deliver DNA and Lipophilic Dyes into Mammalian Cells",
33(2) Methods 121-125 (2004). La
electroporación, también denominada electropermeabilización, usa
pulsos eléctricos breves de alto voltaje para crear poros
transitorios en la membrana a través de los cuales entran las
moléculas de ácido nucleico, y se puede usar eficazmente para
realizar transfecciones estables y transitorias de todos los tipos
de células, véase, p. ej., M. Golzio et al., "In
vitro and in vivo Electric Field-Mediated
Permeabilization, Gene Transfer, and Expression", 33(2)
Methods 126-135 (2004); y Oliver Gresch et
al., "New Non-Viral Method for Gene Transfer
into Primary Cells", 33(2) Methods
151-163 (2004).
En otro aspecto de esta realización, se usa un
procedimiento con mediador viral, denominado transducción, para
introducir una molécula de polinucleótido que codifica una toxina
clostridial modificada en una célula. En los procedimientos de
transducción transitoria mediados por virus, el proceso mediante el
cual las partículas infectan y se replican en una célula huésped ha
sido manipulado para usar este mecanismo para introducir una
molécula de ácido nucleico en la célula. Se han desarrollado
procedimientos mediados por virus de una amplia variedad de virus
incluyendo, sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus
adeno-asociados, virus del herpes simple,
picornavirus, alfavirus y baculovirus; véase, p. ej., Armin Blesch,
"Lentiviral and MLV based Retroviral Vectors for ex vivo
and in vivo Gene Transfer", 33(2) Methods
164-172 (2004); y Maurizio Federico, "From
Lentiviruses to Lentivirus Vectors", 229 Methods Mol.
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Strategies and Applications", 93(21) Proc. Natl. Acad.
Sci., EE.UU. 11371-11377 (1996); Markus U.
Ehrengruber, "Alphaviral Gene Transfer in Neurobiology",
59(1) Brain Res. Bull., 13-22 (2002);
Thomas A. Kost y J. Patrick Condreay, "Recombinant Baculoviruses
as Mammalian Cell Gene-Delivery Vectors",
20(4) Trends Biotechnol, 173-180
(2002); y A. Huser. y C. Hofmann, "Baculovirus Vectors: Novel
Mammalian Cell Gene-Delivery Vehicles and Their
Applications", 3(1) Am. J. Pharmacogenomics
53-63 (2003).
Los adenovirus, que son virus de ADN bicatenario
desnudos, se seleccionan a menudo para la transducción en células
de mamífero, porque los adenovirus manejan moléculas de
polinucleótido relativamente grandes de aproximadamente 36 kb, se
producen a un título elevado y pueden infectar eficientemente una
amplia variedad tanto de células que se dividen como de células que
no se dividen; véase, p. ej., Wim T. J. M. C. Hermens et al.,
"Transient Gene Transfer to Neurons and Glia: Analysis of
Adenoviral Vector Performance in the CNS and PNS", 71(1)
J. Neurosci. Methods, 85-98 (1997); y
Hiroyuki Mizuguchi et al., "Approaches for Generating
Recombinant Adenovirus Vectors", 52(3) Adv. Drug
Deliv. Rev. 165-176 (2001). La transducción que
usa un sistema basado en adenovirus no soporta una expresión de
proteínas prolongada, porque la molécula de ácido nucleico es
transportada desde un episoma situado en el núcleo celular, en
lugar de estar integrado en el cromosoma de la célula huésped. Por
ejemplo, en el sistema de expresión adenoviral ViraPower^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y en el manual de instrucciones
del sistema de expresión adenoviral ViraPower^{TM}
25-0543, versión A, Invitrogen, Inc., (15 de julio
de 2002); y en el sistema de vectores adenovirales AdEasy^{TM}
(Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y el manual de instrucciones del
sistema de vectores adenovirales AdEasy^{TM} 064004f, Stratagene,
Inc., se revelan sistemas de vectores adenovirales y protocolos
específicos sobre cómo usar tales vectores.
La administración de moléculas de ácido nucleico
también puede usar retrovirus de ARN monocatenario, tales como, p.
ej., oncorretrovirus y lentivirus. La transducción mediada por
retrovirus a menudo produce eficiencias de transducción cercanas al
100%, puede controlar fácilmente el número de copias de provirus
variando la multiplicidad de infección (MdI) y se puede usar para
transducir células bien transitoria o establemente, véase, p. ej.,
Tiziana Tonini et al., "Transient Production Of Retroviral-
and Lentiviral-Based Vectors For the Transduction
of Mammalian Cells", 285 Methods Mol. Biol.
141-148 (2004); Armin Blesch, "Lentiviral and MLV
Based Retroviral Vectors for ex vivo and in vivo Gene
Transfer", 33(2) Methods 164-172
(2004); Félix Recillas-Targa, "Gene Transfer and
Expression in Mammalian Cell Lines and Transgenic Animals", 267
Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y Roland
Wolkowicz et al., "Lentiviral Vectors for the Delivery of
DNA into Mammalian Cells", 246 Methods Mol. Biol.
391-411 (2004). Las partículas retrovirales constan
de un genoma de ARN empaquetado en una cápside proteica rodeada de
una envoltura lipídica. El retrovirus infecta una célula huésped
inyectando su ARN en el citoplasma junto con la enzima de
transcriptasa inversa. Entonces se transcribe inversamente el molde
de ARN en un ADNc bicatenario lineal que se replica integrándose en
el genoma de la célula huésped. Las partículas virales se propagan
tanto verticalmente (de la célula precursora a las células hijas a
través del provirus) como horizontalmente (de célula a célula a
través de viriones). Esta estrategia de replicación permite una
expresión duradera a largo plazo, pues las moléculas de ácido
nucleico de interés son integradas establemente en un cromosoma de
la célula huésped, mediante lo que se permite una expresión de la
proteína a largo plazo. Por ejemplo, hay estudios con animales que
han demostrado que vectores de lentivirus inyectados en una
variedad de tejidos produjeron una expresión proteica sostenida
durante más de 1 año, véase, p. ej., Luigi Naldini et al.,
"In vivo Gene Delivery and Stable Transduction of
Non-Dividing Cells By a Lentiviral Vector",
272(5259) Science 263-267 (1996). Los
sistemas de vectores derivados de oncorretrovirus, tales como, p.
ej., el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) son
ampliamente usados e infectan muchas células diferentes que no se
dividen. Los lentivirus también pueden infectar muchos tipos de
células diferentes, incluyendo células que se dividen y células que
no se dividen, y poseen cubiertas proteicas complejas, lo que
permite dirigirse a células muy específicas.
Los vectores retrovirales y los protocolos
específicos sobre cómo usar tales vectores se revelan en, p. ej.,
la patente estadounidense de Manfred Gossen y Hermann Bujard,
"Tight Control of Gene Expression in Eukaryotic Cells By
Tetracycline-Responsive Promoters", patente
estadounidense n.º 5.464.758 (7 de noviembre de 1995), y Hermann
Bujard y Manfred Gossen, "Methods for Regulating Gene
Expression", patente estadounidense n.º 5.814.618 (29 de
septiembre de 1998); David S. Hogness, "Polynucleotides Encoding
Insect Steroid Hormone Receptor Polypeptides and Cells Transformed
With Same", patente estadounidense n.º 5.514.578 (7 de mayo de
1996) y David S. Hogness, "Polynucleotide Encoding Insect
Ecdysone Receptor", patente estadounidense n.º 6.245.531 (12 de
junio de 2001); Elisabetta Vegeto et al., "Progesterone
Receptor Having C. Terminal Hormone Binding Domain Truncations",
patente estadounidense n.º 5.364.791 (15 de noviembre de 1994);
Elisabetta Vegeto et al., "Mutated Steroid Hormone
Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene
Therapy", patente estadounidense n.º 5.874.534 (23 de febrero de
1999) y Elisabetta Vegeto et al., "Mutated Steroid Hormone
Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene
Therapy", patente estadounidense n.º 5.935.934 (10 de agosto de
1999). Además, tales sistemas de administración de virus se pueden
preparar mediante procedimientos estándar y se encuentran
comercialmente disponibles; véanse, p. ej., los sistemas de
expresión de genes Tet-Off y Tet-On
BD^{TM} (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA)
y el manual de usuario de los sistemas de expresión de genes
Tet-Off y Tet-On BD^{TM},
PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de
2003), el sistema GeneSwitch^{TM} (Invitrogen, Inc., Carlsbad,
CA) y el sistema GeneSwitch^{TM} "A Mifepristone- Regulated
Expression System for Mammalian Cells", versión D,
25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de noviembre de 2002);
el sistema de expresión lentiviral ViraPower^{TM} (Invitrogen,
Inc., Carlsbad, CA) y el manual de instrucciones del sistema de
expresión lentiviral ViraPower^{TM} 25-0501
versión E, Invitrogen, Inc., (8 de diciembre de 2003); y el sistema
de expresión en mamíferos inducible por retrovirus Complete
Control® (Stratagene, La Jolla, CA) y el manual de instrucciones
del sistema de expresión en mamíferos inducible por retrovirus
Complete Control®, 064005e.
Los procedimientos revelados en la presente
memoria incluyen, en parte, expresar una toxina clostridial
modificada a partir de una molécula de polinucleótido. Se prevé que
cualquiera de una variedad de sistemas de expresión puede ser útil
para expresar una toxina clostridial modificada a partir de una
molécula de polinucleótido revelada en la presente memoria,
incluyendo, sin limitación, sistemas basados en células y sistemas
de expresión libres de células. Los sistemas basados en células
incluyen, sin limitación, sistemas de expresión viral, sistemas de
expresión procariotas, sistemas de expresión en levaduras, sistemas
de expresión baculoviral, sistemas de expresión en insectos y
sistemas de expresión en mamíferos. Los sistemas libres de células
incluyen, sin limitación, extractos de germen de trigo, extractos
de reticulocitos de conejo y extractos de E. coli, y son
generalmente equivalentes al procedimiento revelado en la presente
memoria. La expresión de una molécula de polinucleótido usando un
sistema de expresión puede incluir cualquiera de una variedad de
características incluyendo, sin limitación, la expresión inducible,
la expresión no inducible, la expresión constitutiva, la expresión
mediada por virus, la expresión integrada establemente y la
expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen
vectores, reactivos, condiciones y células bien caracterizados están
ampliamente establecidos y se pueden obtener fácilmente de
proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Ambion, Inc.
Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA;
BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science,
Indianapolis, IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Por ejemplo, en
"PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH" (S. J. Higgins y B.
David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M.
Fernandez y James P. Hoeffler, "GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING
NATURE FOR THE ART OF EXPRESIÓN" (Academic Press, 1999); y Meena
Rai y Harish Padh, "Expression Systems for Production of
Heterologous Proteins", 80(9) Curr. Sci.
1121-1128, (2001), se describen ejemplos no
restrictivos sobre la selección y el uso de sistemas de expresión
heterólogos apropiados. Estos protocolos son procedimientos
rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden
extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Hay una variedad de procedimientos de expresión
basados en células que son útiles para expresar una toxina
clostridial modificada codificada por una molécula de polinucleótido
revelada en la presente memoria. Los ejemplos incluyen, sin
limitación, sistemas de expresión viral, sistemas de expresión
procariotas, sistemas de expresión en levaduras, sistemas de
expresión baculoviral, sistemas de expresión en insectos y sistemas
de expresión en mamíferos. Los sistemas de expresión viral incluyen,
sin limitación, el sistema de expresión lentiviral ViraPower^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), los sistemas de expresión
adenoviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema de vectores
adenovirales XL AdEasy^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) y el
sistema de expresión génica retroviral ViraPort® (Stratagene, La
Jolla, CA). Los ejemplos no restrictivos de sistemas de expresión
procariotas incluyen el sistema de expresión pET Champion^{TM}
(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), los
sistemas de expresión bacteriana TriEx^{TM} (EMD
Biosciences-Novagen, Madison. WI), el sistema de
expresión QlAexpres® (QIAGEN, Inc.), y el sistema de expresión y
purificación de proteínas Affinity® (Stratagene, La Jolla, CA). Los
sistemas de expresión en levaduras incluyen, sin limitación, el
equipo de expresión en Pichia EasySelect^{TM} (Invitrogen,
Inc., Carlsbad, CA), los equipos de vectores de expresión
YES-Echo^{TM} (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y
el sistema de expresión en S. pombe SpECTRA^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ejemplos no restrictivos de
sistemas de expresión baculoviral incluyen el BaculoDirect^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el
Bac-to-Bac® (Invitrogen, Inc.,
Carlsbad, CA) y el BD BaculoGold^{TM} (BD
Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA). Los sistemas
de expresión en insectos incluyen, sin limitación, el sistema de
expresión en Drosophila (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad,
CA), el sistema InsectSelect^{TM} (Invitrogen, Inc., Carlsbad,
CA) y el sistema InsectDirect^{TM} (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI). Los ejemplos no
restrictivos de sistemas de expresión en mamíferos incluyen el
sistema T-REx^{TM} (Expresión Regulada por
Tetraciclina) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), El sistema
Flp-In^{TM} T-REx^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema pcDNA^{TM}
(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema pSecTag2 (Invitrogen,
Inc., Carlsbad, CA), el sistema Exchanger®, el sistema TAP de
mamíferos InterPlay^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA), el sistema
de expresión en mamíferos inducible Complete Control (Stratagene, La
Jolla, CA) y el sistema de expresión en mamíferos inducible II
LacSwitch® (Stratagene, La Jolla, CA).
Otro procedimiento para expresar una toxina
clostridial modificada codificada por una molécula de polinucleótido
revelada en la presente memoria emplea un sistema de expresión
libre de células, tal como, sin limitación, extractos procariotas y
extractos eucariotas. Los ejemplos no restrictivos de extractos de
células procariotas incluyen el equipo HY de E. coli RTS 100
(Roche Applied Science, Indianápolis, IN), el equipo de traducción
in vitro ActivePro (Ambion, Inc., Austin, TX), el sistema
EcoPro^{TM} (EMD Biosciences-Novagen, Madison,
WI) y el sistema de expresión Plus Expressway^{TM} (Invitrogen,
Inc., Carlsbad, CA). El extracto de células eucariotas incluye, sin
limitación, el equipo CECF de germen de trigo RTS 100 (Roche Applied
Science, Indianápolis, IN), los sistemas de extractos de germen de
trigo acoplados TnT® (Promega Corp., Madison, WI), el equipo de
germen de trigo IVT^{TM} (Ambion, Inc., Austin, TX), el equipo de
lisados de reticulocitos IVT^{TM} (Ambion, Inc., Austin, TX), el
sistema II PROTEINscript® (Ambion, Inc., Austin, TX) y los sistemas
de lisados de reticulocitos acoplados TnT® (Promega Corp., Madison,
WI).
También se pueden describir los aspectos de la
presente invención de la siguiente manera:
- 1.
- Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en una región del bucle bicatenario.
- 2.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica.
- 3.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
- 4.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/A.
- 5.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Arg.
- 6.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-His.
- 7.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º 106.
- 8.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/B.
- 9.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Phe.
- 10.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112.
- 11.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/C1.
- 12.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-Ala.
- 13.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una sintaxina, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-Ala.
- 14.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una sintaxina, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-Ala.
- 15.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118, SEC ID N.º 119, SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121.
- 16.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/D.
- 17.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-Leu.
- 18.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123.
- 19.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/E.
- 20.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-Ile.
- 21.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-Ile.
- 22.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128.
- 23.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/F.
- 24.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Lys.
- 25.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130.
- 26.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/G.
- 27.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Ala-Ala.
- 28.
- La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende la SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132.
- 29.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.
\newpage
- 30.
- La toxina clostridial modificada según 29, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Phe.
- 31.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina clostridial modificada comprende un dominio enzimático de toxina botulínica, un dominio de translocación de toxina botulínica y un dominio de unión de toxina botulínica.
- 32.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A.
- 33.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B.
- 34.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de translocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/ C1.
- 35.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D.
- 36.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E.
- 37.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F.
- 38.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina botulínica modificada comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G.
- 39.
- La toxina clostridial modificada según 1, en la que la toxina clostridial modificada comprende un dominio enzimático de toxina tetánica, un dominio de translocación de toxina tetánica y un dominio de unión de toxina tetánica.
- 40.
- Una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular aumentada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
\vskip1.000000\baselineskip
- 41.
- Una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular modificada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
\newpage
- 42.
- Una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular modificada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial no natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
- 43.
- La toxina clostridial modificada según una cualquiera de 40-42, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT y un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
- 44.
- La toxina clostridial modificada según una cualquiera de 40-42, en la que el dominio enzimático de la toxina clostridial se selecciona del grupo constituido por un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G y un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT y un dominio enzimático de BuNT.
- 45.
- La toxina clostridial modificada según una cualquiera de 40-42, en la que el dominio de translocación de la toxina clostridial se selecciona del grupo constituido por un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/C1, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G y un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT y un dominio de translocación de BuNT.
- 46.
- Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular aumentada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
- 47.
- Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular modificada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
- 48.
- Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- una actividad de unión celular modificada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial no natural;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
\vskip1.000000\baselineskip
- 49.
- La molécula de polinucleótido según una cualquiera de 46-48, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT y un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
- 50.
- La molécula de polinucleótido según una cualquiera de 46-48, en la que la molécula de polinucleótido que codifica del dominio enzimático de toxina clostridial codifica un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT y un dominio enzimático de BuNT.
- 51.
- La molécula de polinucleótido según una cualquiera de 46-48, en la que la molécula de polinucleótido que codifica del dominio de translocación de toxina clostridial codifica un dominio de translocación de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/C1, un dominio de translocación de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/G, un dominio de translocación de TeNT, un dominio de translocación de BaNT y un dominio de translocación de BuNT.
- 52.
- Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
- 53.
- La molécula de polinucleótido según 52, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica.
- 54.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
- 55.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/A.
- 56.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Arg.
- 57.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-His.
- 58.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 104, SEC ID N.º 105 o SEC ID N.º 106.
- 59.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/B.
- 60.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Phe.
- 61.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 107, SEC ID N.º 108, SEC ID N.º 109, SEC ID N.º 110, SEC ID N.º 111 o SEC ID N.º 112.
- 62.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/C1.
- 63.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-Ala.
- 64.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una sintaxina, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-Ala.
- 65.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una sintaxina, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-Ala.
- 66.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 113, SEC ID N.º 114, SEC ID N.º 115, SEC ID N.º 116, SEC ID N.º 117, SEC ID N.º 118, SEC ID N.º 119, SEC ID N.º 120 o SEC ID N.º 121.
- 67.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/D.
- 68.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-Leu.
- 69.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 122 o SEC ID N.º 123.
- 70.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/E.
- 71.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Arg-lle.
- 72.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una SNAP-25, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Lys-lle.
- 73.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 124, SEC ID N.º 125, SEC ID N.º 126, SEC ID N.º 127 o SEC ID N.º 128.
- 74.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/F.
- 75.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Lys.
- 76.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 129 o SEC ID N.º 130.
- 77.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende un sitio de escisión de BoNT/G.
\newpage
- 78.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Ala-Ala.
- 79.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que comprende el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica codifica la SEC ID N.º 131 o SEC ID N.º 132.
- 80.
- La molécula de polinucleótido según 52, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.
- 81.
- La molécula de polinucleótido según 80, en la que la molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica comprende al menos seis residuos consecutivos de una VAMP, comprendiendo dichos seis residuos consecutivos Gln-Phe.
- 82.
- La molécula de polinucleótido según 80, en la que la molécula de polinucleótido que codifica la toxina clostridial modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de toxina botulínica, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de toxina botulínica y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de toxina botulínica.
- 83.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A.
- 86.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/B, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/B y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/B.
- 87.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/C1, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/C1 y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/C1.
- 88.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/D, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/D y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/D.
- 89.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/E, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/E y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/E.
- 90.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/F, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/F y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/F.
- 91.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina botulínica modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/G, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/G y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/G.
- 92.
- La molécula de polinucleótido según 53, en la que la molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada comprende una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de toxina tetánica, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de toxina tetánica y una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de toxina tetánica.
- 93.
- Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar una toxina clostridial modificada codificada por una molécula de polinucleótido en una célula, en la que la toxina clostridial modificada está definida por una cualquiera de 46-92.
- 94.
- Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de a) introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifique una toxina clostridial modificada según lo definido en una cualquiera de 46-92; y b) expresar la toxina clostridial modificada codificada por la molécula de polinucleótido.
- 95.
- Una toxina clostridial modificada que comprende:
- a)
- un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial;
- b)
- una región de bucle bicatenario;
- c)
- un dominio enzimático de toxina clostridial;
- d)
- un dominio de translocación de toxina clostridial; y
- e)
- un dominio de unión celular de toxina clostridial;
- \quad
- en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos no restrictivos se
proporcionan únicamente a efectos ilustrativos con el fin de
facilitar una comprensión más completa de las realizaciones
reveladas y no están destinados, de ningún modo, a limitar ninguna
de las realizaciones reveladas en la presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/A ubicado en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 214) basada en BoNT/A-A17 (SEC ID N.º 203)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). La BoNT/A-A17 es una BoNT/A modificada para
que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial
de 17 aminoácidos que pueda ser escindido por BoNT/A. Se sintetizan
oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis
estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en
dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la
molécula de polinucleótido de de longitud completa. Se clona esta
molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de
Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio SmaI,
para generar pUCBHB1/BoNT/A-A17. La molécula de
polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando
Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied
Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied
Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 225) basada
en BoNT/A-A17 (SEC ID N.º 203) con el fin de mejorar
la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de
polinucleótido que codifica la BoNT/A-A17 se puede
modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran
comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de
una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido
de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio
de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa
de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de
polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido;
y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos
encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance
E. Steward et al. "Optimizing Expression of Active
Botulinum Toxin Type ", publicación de patente internacional n.º
WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type
A", publicación de patente internacional n.º WO 2006/017749 (16
de febrero de 2006), estando el contenido de todas ellas
incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad.
Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan
oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis
estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en
dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la
molécula de polinucleótido de de longitud completa. Se clona esta
molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de
Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio SmaI,
para generar pUCBHB1/BoNT/A-A17. La molécula de
polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando
Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied
Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied
Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la
optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p.
ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea
celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra,
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente
internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se usa una estrategia de clonación similar para
producir constructos de clonación pUCBHB1 que comprendan la
molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 215 o SEC ID N.º 226 que
codifica BoNT/A-A8 de SEC ID N.º 204.
BoNT/A-A8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido por BoNT/A. Además,
cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E,
BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar
descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/A en la región del bucle bicatenario
de la toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-A17,
se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 con
endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que
comprende el marco de lectura abierto que codifica
BoNT/A-A17, tal como, p. ej., la molécula de
polinucleótido de SEC ID N.º 225; y 2) permitan a este inserto ser
ligado operativamente a un vector pET29 (EMD
Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona este
inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector
pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas
para producir pET29/BoNT/A-A17. Se transforma la
mezcla de unión en células DH5\alpha de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias
resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos
usando un procedimiento de mini-preparación de
plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de
fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para
determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta
estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29
que comprendía la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 225 que
codificaba la BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203 ligada
operativamente a un péptido de unión por afinidad a la
polihistidina carboxi-terminal
(Fig. 7).
(Fig. 7).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 214 que codifique
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203; o las moléculas de
polinucleótido de SEC ID N.º 215 o SEC ID N.º 226 que codifiquen
BoNT/A-A8 de SEC ID N.º 204.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda tanto un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/B como un sitio de escisión de sustrato de TeNT
ubicados en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 216) basada en BoNT/A-BT35 (SEC ID N.º 205)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). La BoNT/A-BT35 es una BoNT/A modificada para
que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial
de 35 aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/B o por
TeNT. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50
bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos
oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan
entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud
completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando
procedimientos estándar de Biología Molecualr en un vector pUCBHB1,
en el sitio Smal, para generar
pUCBHB1/BoNT/A-BT35. La molécula de polinucleótido
sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye
Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems,
Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 227) basada
en BoNT/A-BT35 (SEC ID N.º 205) con el fin de
mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La
molécula de polinucleótido que codifica la
BoNT/A-BT35 se puede modificar para 1) que contenga
codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las
moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia
coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más
estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de
polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia
coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos
encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los
sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la
molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type
", publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); Lance E. Steward et al. "Optimizing
Expression of Active Botulinum Toxin Type A", publicación de
patente internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan
oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la
síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para
ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se
clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos
estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio
Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-BT35. La
molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante
secuenciación usando Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry
3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI
3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede
hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal
como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o
una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra,
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente
internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de
2006).
2006).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que
comprendan la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 217 o SEC ID
N.º 228 que codifique BoNT/A-BT8 de SEC ID N.º 206.
BoNT/A-B8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/B o por TeNT.
Además, cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E,
BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar
descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean tanto un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/B como un sitio de escisión de
sustrato de TeNT en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Para construir
pET29/BoNT/A-BT35, se digiere un constructo
pUCBHB1/BoNT/A-BT35 con endonucleasas de restricción
que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura
abierto que codifica BoNT/A-BT35, tal como, p. ej.,
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 227; y 2) permitan a
este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD
Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona este
inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector
pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas
para producir pET29/BoNT/A-BT35. Se transforma la
mezcla de unión en células DH5\alpha de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias
resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos
usando un procedimiento de mini-preparación de
plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de
fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para
determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta
estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29
que comprendía la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 227 que
codificaba la BoNT/A-BT35 de SEC ID N.º 205 ligada
operativamente a un péptido de unión por afinidad a la
polihistidina carboxi-terminal (Fig. 8).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 216 que codifique
BoNT/A-BT35 de SEC ID N.º 205; o las moléculas de
polinucleótido de SEC ID N.º 217 o SEC ID N.º 228 que codifiquen
BoNT/A-BT8 de SEC ID N.º 206.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/C1 ubicado en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 218) basada en BoNT/A-Csyn8 (SEC ID N.º 207)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). BoNT/A-Csyn8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/C1. Se
sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando
la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para
ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se
clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos
estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio
Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8. La
molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante
secuenciación usando Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry
3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI
3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 229) basada
en BoNT/A-Csyn8 (SEC ID N.º 207) con el fin de
mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La
molécula de polinucleótido que codifica la
BoNT/A-Csyn8 se puede modificar para 1) que contenga
codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las
moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia
coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más
estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de
polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia
coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos
encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los
sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la
molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type",
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); Lance E. Steward et al. "Optimizing
Expression of Active Botulinum Toxin Type A", publicación de
patente internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan
oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la
síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para
ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se
clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos
estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio
SmaI, para generar pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8. La
molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante
secuenciación usando Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry
3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI
3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede
hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal
como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o
una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra,
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente
internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de
2006).
2006).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que
comprendan la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 219 o SEC ID
N.º 230 que codifique BoNT/A-Csnp8 de SEC ID N.º
208. BoNT/A-Csyn8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/C1. Además,
cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E,
BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar
descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/C1 en la región del bucle bicatenario
de la toxina.
Para construir
pET29/BoNT/A-Csyn8, se digiere un constructo
pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8 con endonucleasas de
restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de
lectura abierto que codifica BoNT/A-Csyn8, tal como,
p. ej., la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 229; y 2)
permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29
(EMD Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona
este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un
vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción
apropiadas para producir pET29/BoNT/A-Csyn8. Se
transforma la mezcla de unión en células DH5\alpha de E.
coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)
usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de
agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que
contienen 50 \mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora
a 37ºC para que crezcan durante una noche. Las bacterias que
contienen los constructos de expresión son identificadas como
colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos
candidatos usando un procedimiento de
mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se
analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por
endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la
orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un
constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de
polinucleótido de SEC ID N.º 229 que codificaba la
BoNT/A-Csyn8 de SEC ID N.º 207 ligada operativamente
a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina
carboxi-terminal (Fig. 9).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 218 que codifique
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 207; o las moléculas de
polinucleótido de SEC ID N.º 219 o SEC ID N.º 230 que codifiquen
BoNT/A-Csyn8 de SEC ID N.º 208.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/D ubicado en la región del bucle bicatenario de la
toxina, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F ubicado en la
región del bucle bicatenario de la toxina o tanto un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D como un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/F ubicados en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 220) basada en BoNT/A-DF39 (SEC ID N.º 209)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). BoNT/A-DF39 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
39 aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/D o por
BoNT/F. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50
bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos
oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan
entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud
completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando
procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1,
en el sitio SmaI, para generar
pUCBHB1/BoNT/A-DF39. La molécula de polinucleótido
sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye
Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems,
Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 231) basada
en BoNT/A-DF39 (SEC ID N.º 209) con el fin de
mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La
molécula de polinucleótido que codifica la
BoNT/A-DF39 se puede modificar para 1) que contenga
codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las
moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia
coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más
estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de
polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia
coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos
encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los
sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la
molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type",
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); Lance E. Steward et al. "Optimizing
Expression of Active Botulinum Toxin Type A", publicación de
patente internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan
oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la
síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para
ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se
clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos
estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio
SmaI, para generar pUCBHB1/BoNT/A-DF39. La
molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante
secuenciación usando Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry
3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI
3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede
hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal
como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o
una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra,
publicación de patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de
febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente
internacional n.º WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que
comprendan la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 221 o la SEC
ID N.º 232 que codifique BoNT/A-D8 de SEC ID N.º
210; o constructos que comprendan la molécula de polinucleótido de
SEC ID N.º 223 o SEC ID N.º 234 que codifique
BoNT/A-F8 de SEC ID N.º 212.
BoNT/A-D8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/D.
BoNT/A-F8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/F. Además,
cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas
clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E,
BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar
descrita anteriormente, tal que estas toxinas comprendan un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D en la región del bucle bicatenario
de la toxina, comprendan un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B
en la región del bucle bicatenario de la toxina o comprendan tanto
un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D como un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/F en la región del bucle bicatenario de
la toxina.
Para construir
pET29/BoNT/A-DF39, se digiere un constructo
pUCBHB1/BoNT/A-DF39 con endonucleasas de restricción
que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura
abierto que codifica BoNT/A-DF39, tal como, p. ej.,
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 231; y 2) permitan a
este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI). Se subclona este
inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector
pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas
para producir pET29/BoNT/A-DF39. Se transforma la
mezcla de unión en células DH5\alpha de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias
resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos
usando un procedimiento de mini-preparación de
plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de
fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para
determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta
estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29
que comprendía la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 231 que
codificaba la BoNT/A-DF39 de SEC ID N.º 209 ligada
operativamente a un péptido de unión por afinidad a la
polihistidina carboxi-terminal (Fig. 10).
Se puede usar una estrategia de clonación
similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan
la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 220 que codifique
BoNT/A-DF39 de SEC ID N.º 209; las moléculas de
polinucleótido de SEC ID N.º 221 o SEC ID N.º 232 que codifiquen
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 210; o moléculas de
polinucleótido de SEC ID N.º 223 o SEC ID N.º 234 que codifiquen
BoNT/A-F8 de SEC ID N.º 212.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/E ubicado en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 222) basada en BoNT/A-E8 (SEC ID N.º 211)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). BoNT/A-E8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/E. Se
sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando
la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar
la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta
molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de
Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal,
para generar pUCBHB1/BoNT/A-E8. La molécula de
polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando
Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied
Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied
Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 233) basada
en BoNT/A-E8 (SEC ID N.º 211) con el fin de mejorar
la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de
polinucleótido que codifica la BoNT/A-E8 se puede
modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran
comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de
una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido
de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio
de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa
de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de
polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido;
y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos
encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance
E. Steward et al. "Optimizing Expression of Active
Botulinum Toxin Type ", publicación de patente internacional n.º
WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type
A", publicación de patente internacional n.º WO 2006/017749 (16
de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial,
se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases
usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos
oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan
entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud
completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando
procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1,
en el sitio Smal, para generar
pUCBHB1/BoNT/A-E8. La molécula de polinucleótido
sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye
Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con
respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de
levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de
mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de
patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y
Steward, supra, publicación de patente internacional n.º WO
2006/017749 (16 de febrero de
2006).
2006).
Cualquier experto en la técnica puede modificar
toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D,
BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación
similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/E en la región del bucle
bicatenario de la
toxina.
toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-E8,
se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-E8 con
endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que
comprende el marco de lectura abierto que codifica
BoNT/A-E8, tal como, p. ej., la molécula de
polinucleótido de SEC ID N.º 233; y 2) permitan a este inserto ser
ligado operativamente a un vector pET29 (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI). Se subclona este
inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector
pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas
para producir pET29/BoNT/A-E8. Se transforma la
mezcla de unión en células DH5\alpha de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias
resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos
usando un procedimiento de mini-preparación de
plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de
fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para
determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta
estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29
que comprendía la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 233 que
codificaba la BoNT/A-E8 de SEC ID N.º 211 ligada
operativamente a un péptido de unión por afinidad a la
polihistidina carboxi-terminal (Fig. 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina
clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de
sustrato de BoNT/G ubicado en la región del bucle bicatenario de la
toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEC
ID N.º 224) basada en BoNT/A-G8 (SEC ID N.º 213)
usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell,
WA). BoNT/A-G8 es una BoNT/A modificada para que
comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de
ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/G. Se
sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando
la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se
hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar
la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta
molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de
Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal,
para generar pUCBHB1/BoNT/A-G8. La molécula de
polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando
Big Dye Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied
Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied
Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula
de polinucleótido de expresión optimizada (SEC ID N.º 235) basada
en BoNT/A-E8 (SEC ID N.º 213) con el fin de mejorar
la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de
polinucleótido que codifica la BoNT/A-D8 se puede
modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran
comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de
una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido
de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio
de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa
de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de
polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido;
y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos
encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance
E. Steward et al. "Optimizing Expression of Active
Botulinum Toxin Type", publicación de patente internacional n.º
WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward et
al. "Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type
A", publicación de patente internacional n.º WO 2006/017749 (16
de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial,
se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases
usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos
oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan
entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud
completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando
procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1,
en el sitio Smal, para generar
pUCBHB1/BoNT/A-G8. La molécula de polinucleótido
sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye
Terminator^{TM}, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con
respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de
levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de
mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de
patente internacional n.º WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y
Steward, supra, publicación de patente internacional n.º WO
2006/017749 (16 de febrero de
2006).
2006).
Cualquier experto en la técnica puede modificar
toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D,
BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación
similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G en la región del bucle
bicatenario de la
toxina.
toxina.
Para construir
pET29BoNT/BoNT/A-G8, se digiere un constructo
pUCBHB1/BoNT/A-G8 con endonucleasas de restricción
que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto
que codifica BoNT/A-E8, tal como, p. ej., la
molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 235; y 2) permitan a este
inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI). Se subclona este
inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector
pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas
para producir pET29/BoNT/A-G8. Se transforma la
mezcla de unión en células DH5\alpha de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias
resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos
usando un procedimiento de mini-preparación de
plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de
fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para
determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta
estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29
que comprendía la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 235 que
codificaba la BoNT/A-G8 de SEC ID N.º 213 ligada
operativamente a un péptido de unión por afinidad a la
polihistidina carboxi-terminal (Fig.
12).
12).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento
útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales
modificadas reveladas en la presente memoria en una célula
bacteriana.
Se introduce un constructo de expresión, tal
como, p. ej.,
pET29/BoNT/A-ED-PAR1Tb,
pET29/BoNT/A-TD-PAR1Tb o
pET29/BoNT/A-BD-PAR1Tb; véanse, p.
ej., los ejemplos 1, 2 y 3, en células BL21 (DE3) de E. coli
químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un
protocolo de transformación por choque térmico. Se coloca la
reacción de choque térmico en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50
\mug/ml de kanamicina, y se introduce en una incubadora a 37ºC
para que se desarrolle durante una noche. Se usan colonias
resistentes a la kanamicina de E. coli transformada que
contienen el constructo de expresión, tal como, p. ej.,
pET29/BoNT/A-A17, pET29BoNT/A-BT35,
pET29/BoNT/A-Csyn8,
pET29/BoNT/A-DF39, pET29/BoNT/A-E8 o
pET29/BoNT/A-G8, para inocular un matraz con placas
deflectoras que contiene 3,0 ml de medio PA-0.5G que
contiene 50 \mug/ml de kanamicina que luego es colocado en una
incubadora a 37ºC, agitando a 250 rpm para su crecimiento durante
una noche. El cultivo inicial resultante de una noche se usa a su
vez para inocular un matraz con placas deflectoras de 3 l que
contiene medio auto-inductor
ZYP-5052 que contiene 50 \mul/ml de kanamicina a
una dilución de 1:1000. Los volúmenes de cultivo variaron de
aproximadamente 600 ml (volumen del matraz del 20%) a
aproximadamente 750 ml (volumen del matraz del 25%). Se desarrollan
estos cultivos en una incubadora a 37ºC agitando a 250 rpm durante
aproximadamente 5,5 horas y luego se transfieren a una incubadora a
16ºC agitando a 250 rpm para que se expresen durante una noche. Se
cosechan las células mediante centrifugación (4.000 rpm a 4ºC
durante 20-30 minutos) y se usan inmediatamente, o
se almacenan en seco a -80ºC hasta que se
necesitan.
necesitan.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El siguiente ejemplo ilustra procedimientos
útiles para la purificación y la cuantificación de cualquiera de
las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente
memoria.
Para la purificación de proteínas mediante
cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), se
vuelven a suspender los sedimentos de células BL21 (DE3) de E.
coli usados para expresar una toxina clostridial modificada,
según lo descrito en el ejemplo 4, en tampón de unión a columnas
(ácido
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico)
25 mM) (HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500 mM; imidazol 10 mM; 2
x inhibidor de la proteasa Cocktail Set III (EMD
Biosciences-Calbiochem, San Diego CA); 5 unidades/ml
de benzonasa (EMD Biosciences-Novagen, Madison,
WI); Triton-X® 100 al 0,1% (v/v),
4-octilfenol-polietoxilato; glicerol
al 10% (v/v), y luego se transfieren a un tubo de centrifugación
Oakridge frío. Se somete la suspensión celular a ultrasonidos sobre
hielo (10-12 pulsos de 10 segundos a una amplitud
del 40% con intervalos de enfriamiento de 60 segundos sobre un
aparato de ultrasonido digital Digital Sonifier de Branson) para
lisar las células y luego se centrifuga (16.000 rpm a 4ºC durante
20 minutos) para aclarar el lisado. Se prepara una columna de
cromatografía de afinidad por metales inmovilizados usando un
soporte de columna Econo-Pac de 20 ml
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) empaquetado
con 2,5-5,0 ml de resina de afinidad por Co^{2+}
TALON^{TM} SuperFlow (BD Biosciences-Clontech,
Palo Alto, CA), que luego es equilibrada aclarando con 5 volúmenes
de columna de agua destilada desionizada, seguidos por 5 volúmenes
de columna de tampón de unión a la columna. Se aplica lentamente el
lisado aclarado a la columna equilibrada mediante flujo de gravedad
(aproximadamente 0,25-0,3 ml/minuto). Luego se lava
la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado de
columnas (ácido
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico)
(HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500 mM; imidazol 10 mM;
Triton-X® 100 al 0,1% (v/v),
4-octilfenol-polietoxilato;
glicerol al 10% (v/v). Se eluye la toxina clostridial con
20-30 ml de tampón de elución de columnas (ácido
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico)
25 mM (HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500 mM; imidazol 500 mM;
Triton-X® al 0,1% (v/v),
4-octilfenol-polietoxilato; glicerol
al 10% (v/v) y se recoge en aproximadamente doce fracciones de 1
ml. La cantidad de toxina clostridial contenida en cada fracción de
elución se determina mediante un análisis de colorantes de
Bradford. En este procedimiento, se combinan alícuotas de 20 \mul
de cada fracción de 1,0 ml con 200 \mul de reactivo de proteínas
Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA), se diluyen de 1 a 4 con agua destilada desionizada y
luego se mide la intensidad de la señal colorimétrica usando un
espectrofotómetro. Las cinco fracciones con la señal más potente se
consideran el máximo de elución, y se combinan entre sí. Se
determina la producción de proteínas total estimando la
concentración total de proteínas de las fracciones de máximos de
elución mezcladas usando gamma-globulina bovina como
patrón (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA).
CA).
Para la purificación de una toxina clostridial
modificada usando una columna de desalinización de FPLC, se
pre-equilibra una columna de exclusión por tamaños
26/10 HiPrep^{TM} (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) con 80
ml de tampón para columnas a 4ºC (fosfato de sodio 50 mM, pH 6,5).
Tras equilibrar la columna, se aplica una muestra de toxina
clostridial a la columna de exclusión por tamaños con una fase móvil
isocrática de tampón para columnas a 4ºC y a un caudal de 10
ml/minuto usando un sistema de cromatografía BioLogic DuoFlow
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se recoge la
muestra de toxina clostridial modificada desalinizada como una sola
fracción de aproximadamente 7-12 ml.
Para la purificación de una toxina clostridial
modificada usando una columna de intercambio iónico de FPLC, se
aplica una muestra de toxina clostridial que ha sido desalinizada
tras la elución desde una columna de IMAC a 1 ml de columna de
intercambio iónico Q1^{TM} (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA) usando un sistema de cromatografía BioLogic DuoFlow
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se aplica la
muestra a la columna en tampón para columnas a 4ºC (fosfato de
sodio 50 mM, pH 6,5) y se eluye mediante un gradiente lineal con
tampón de elución a 4ºC (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio
1M, pH 6,5) como se explica a continuación: etapa 1: 5,0 ml de
tampón de elución al 5% a un caudal de 1 ml/minuto; etapa 2: 20,0 ml
de tampón de elución al 5-30% a un caudal de 1
ml/minuto; etapa 3: 2,0 ml de tampón de elución al 50% a un caudal
de 1,0 ml/minuto; etapa 4: 4,0 ml de tampón de elución al 100% a un
caudal de 1,0 ml/minuto; y etapa 5: 5,0 ml de tampón de elución al
0% a un caudal de 1,0 ml/minuto. Se monitoriza la elución de la
toxina clostridial desde la columna a 280, 260 y 214 nm, y se
recogen los máximos que absorben por encima del umbral mínimo (0,01
ua) a 280 nm. La mayoría de la toxina clostridial se eluirá a una
concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 100 a 200 mM.
Las producciones medias totales de toxina clostridial se
determinarán mediante un análisis de Bradford.
Se analiza la expresión de una toxina
clostridial modificada mediante electroforesis sobre gel de
poliacrilamida. Se añaden las muestras purificadas usando el
procedimiento descrito anteriormente a 2 x tampón de muestra LDS
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se separan mediante electroforesis
sobre gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida
prefundidos con Bis-Tris al 4-12%
NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones
reductoras desnaturalizantes. Se tiñen los geles con Rubí SYPRO®
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se
visualizan las imágenes de los polipéptidos separados usando un
Multimager Fluor-S MAX (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA) para la cuantificación de los niveles de
expresión de las toxinas clostridiales. Se determina el tamaño y la
cantidad de la toxina clostridial mediante la comparación con
patrones de pesos moleculares de proteínas MagicMark^{TM}
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA).
También se analiza la expresión de una toxina
clostridial modificada mediante análisis de transferencia Western.
Se añaden las muestras de proteínas purificadas usando el
procedimiento descrito anteriormente a 2 x tampón de muestra LDS
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se separan mediante electroforesis
sobre gel de poliacrilamida con MOPS usando geles de poliacrilamida
prefundidos con Bis-Tris al 4-12%
NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones
reductoras desnaturalizantes. Se transfieren los polipéptidos
separados del gel a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF)
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante transferencia Western
usando un aparato celular de transferencia electroforética
semi-seco SD Trans-Blot®
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquean
las membranas de PVDF incubando a temperatura ambiente durante 2
horas en una solución que contiene solución salina tamponada con
Tris 25 mM (ácido
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanediol-clorhídrico
25 mM (Tris-HCl) (pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM,
cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1%,
monolaureato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero
bovino al 2%, leche desnatada en polvo al 5%. Se incuban las
membranas bloqueadas a 4ºC durante una noche en solución salina
tamponada con Tris TWEEN-20® (solución salina
tamponada con Tris 25 mM, TWEEN-20® al 0,1%,
monolaureato de polioxietileno (20) sorbitán) que contiene
anticuerpos primarios apropiados como sonda. Se lavan tres veces las
transferencias sondadas con anticuerpos primarios durante 15
minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris
TWEEN-20®. Se incuban las membranas lavadas a
temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada
con Tris TWEEN-20® que contiene un anticuerpo
frente a la inmunoglobulina G apropiado conjugado con peroxidasa de
rábano picante como anticuerpo secundario. Se lavan tres veces las
transferencias sondadas con anticuerpos secundarios durante 15
minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris
TWEEN-20®. Las señales de detección de la toxina
clostridial marcada se visualizan usando el sistema de detección de
transferencia Western ECL Plus^{TM} (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ) y las imágenes se visualizan con un visualizador de
imágenes de modo variable 9410 Typhoon (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ) para la cuantificación de los niveles de expresión
de las toxinas clostridiales
modificadas.
modificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento
útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales
modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de
levadura.
Para construir un constructo de expresión en
levaduras adecuado que codifique una toxina clostridial modificada,
se incorporan sitios de endonucleasas de restricción adecuados para
la clonación de una molécula de polinucleótido ligada
operativamente a un vector pPIC A (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en
los extremos 5' y 3' de la molécula de polinucleótido de SEC ID N.º
236 que codifica la BoNT/A-A17 de la SEC ID N.º 203.
Se sintetiza esta molécula de polinucleótido y se obtiene un
constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en
el ejemplo 1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción
que 1) escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto
de SEC ID N.º 236 que codifica la BoNT/A-A17; y 2)
permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector
pPIC A. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN
ligasa de T4 en un vector pPIC A que es digerido con endonucleasas
de restricción apropiadas para producir pPIC
A/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de unión en
células DH5\alpha de E. coli químicamente competentes
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque
térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani bajas en sal al 1,5% (pH 7,5) que
contienen 25 \mug/ml de Zeocin^{TM} y se colocan en una
incubadora a 37ºC para que crezcan durante una noche. Las bacterias
que contienen los constructos de expresión son identificadas como
colonias resistentes a Zeocin^{TM}. Se aíslan los constructos
candidatos usando un procedimiento de
mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y
se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por
endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la
orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un
constructo de expresión de pPIC A que comprendía la molécula de
polinucleótido de SEC ID N.º 236 que codificaba la
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203 ligada operativamente a
péptidos de unión a c-myc y polihistidina
carboxi-terminales (Fig. 13).
Se usa una estrategia de clonación similar para
producir los constructos de expresión pPIC A que codifican
BoNT/A-A8 de SEC ID N.º 204;
BoNT/A-BT35 de SEC ID N.º 205;
BoNT/A-BT8 de SEC ID N.º 206;
BoNT/A-Csyn8 de SEC ID N.º 207; BoNT/ACsnp8 de SEC
ID N.º 208; BoNT/A-DF39 de SEC ID N.º 209;
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 210;
BoNT/A-E8 de SEC ID N.º 211;
BoNT/A-F8 de SEC ID N.º 212; o
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º
213.
213.
Para construir una línea celular de levadura que
exprese una toxina clostridial modificada, se digiere pPlCZ
A/BoNT/A-A17 con una endonucleasa de restricción
adecuada (i.e., SacI, PmeI o BstXI) y se
transforma el constructo de expresión linealizado resultante en una
cepa Mut^{s} de P. pastoris apropiada Mut^{s} KM71H
usando un procedimiento de electroporación. Se coloca la mezcla de
transformación sobre placas de agar de YPDS al 1,5% (pH 7,5) que
contiene 100 \mug/ml de Zeocin^{TM} y se meten en una incubadora
a 28-30ºC durante 1-3 días de
crecimiento. La selección de los transformantes que tienen pPICZ
A/BoNT/A-A17 integrado en el locus AOX1 de 5' se
determina mediante la resistencia de las colonias a Zeocin^{TM}.
Se analizan las líneas celulares que tienen un constructo pPICZ
A/BoNT/A-A17 integrado en cuanto a la expresión de
BoNT/A-A17 usando un análisis de expresión a
pequeña escala. Las colonias aisladas de las líneas celulares
analizadas que tienen pPICZ A/BoNT/A-A17 integrado
se usan para inocular matraces con placas deflectoras que contienen
100 ml de medio MGYH y se desarrollan a aproximadamente
28-30ºC en una incubadora con agitador (250 rpm)
hasta que el cultivo alcanza una DO_{600} = 2-6
(aproximadamente 16-18 horas). Se cosechan las
células mediante centrifugación (3.000 xg a 22ºC durante 5
minutos). Para inducir la expresión, se vuelven a suspender los
sedimentos celulares en 15 ml de medio MMH y se añade metanol al
100% hasta una concentración final del 0,5%. Se desarrollan los
cultivos a aproximadamente 28-30ºC en una incubadora
con agitador (250 rpm) durante seis días. Se añade más metanol al
100% al cultivo cada 24 horas hasta una concentración final del
0,5%. Se toma una alícuota de 1,0 ml para análisis del cultivo cada
24 horas comenzando en el tiempo cero y acabando en el tiempo de
144 horas. Se recogen las células de las alícuotas mediante
microcentrifugación para sedimentar las células, y se lisan usando
tres series de congelación-decongelación que constan
de -80ºC durante 5 minutos, y luego 37ºC durante 5 minutos. Se
añaden muestras de lisis a 2 x tampón de muestra de LDS (Invitrogen,
Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión desde las líneas
celulares establecidas mediante análisis de transferencia Western
(según lo descrito en el ejemplo 8) usando anticuerpos bien frente a
BoNT/A, frente a c-myc o frente a His con el fin de
identificar las líneas que expresen a BoNT/A-A17. Se
selecciona la línea celular Mut^{s} KM71H de P. pastoris
que muestra el nivel de expresión más elevado de
BoNT/A-A17 para la expresión a gran escala usando
procedimientos de fermentación a nivel comercial. Los procedimientos
para la expresión a gran escala son como se explica resumidamente
con anterioridad, a excepción de que el volumen de cultivo es de
aproximadamente 2,5 l de medio MGYH desarrollado en un fermentador
BioFlo 3000 de 5 l y las concentraciones de todos los reactivos se
aumentarán proporcionalmente para este volumen. Se puede usar un
procedimiento similar para expresar un constructo pPICZ A que
codifique cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas de la
SEC ID N.º 204 a la SEC ID
N.º 213.
N.º 213.
\newpage
Se purifica BoNT/A-A17 usando el
procedimiento de IMAC, según lo descrito en el ejemplo 8. Se evalúa
la expresión de cada cultivo mediante un análisis con colorantes de
Bradford, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y análisis de
transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) con el fin
de determinar las cantidades de BoNT/A-A17
producidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento
útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales
modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de
insecto.
Para construir un constructo de expresión en
insectos adecuado que codifique una toxina clostridial modificada,
se incorporan sitios de endonucleasas de restricción para la
clonación de una molécula de polinucleótido ligada operativamente a
un vector pBACgus3 (EMD Biosciences-Novagen,
Madison, WI) en los extremos 5' y 3' de la molécula de
polinucleótido de SEC ID N.º 237 que codifica la
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203. Se sintetiza esta
molécula de polinucleótido y se obtiene un constructo
pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en el ejemplo
1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción que 1)
escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto de la
SEC ID N.º 237 que codifica la BoNT/A-A17; y 2)
permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector
pBACgus3. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN
ligasa de T4 en un vector pBACgus3 que es digerido con
endonucleasas de restricción apropiadas para producir
pBACgus3/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de
unión en células DH5\alpha de E. coli químicamente
competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento
de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100
\mug/ml de ampicilina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes
a la ampicilina. Se aíslan los constructos candidatos usando un
procedimiento de mini-preparación de plásmidos de
lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos
digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la
presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación
produjo un constructo de expresión pBACgus3 que comprendía la
molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 237 que codificaba la
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203 ligada operativamente
a un péptido señal gp64 amino-terminal y a un
péptido de unión por afinidad a polihistidina
carboxi-terminal escindible mediante trombina
(Fig. 14).
(Fig. 14).
Se usa una estrategia de clonación similar para
producir los constructos de expresión pBACgus3 que codifican
BoNT/A-A8 de SEC ID N.º 204;
BoNT/A-BT35 de SEC ID N.º 205;
BoNT/A-BT8 de SEC ID N.º 206;
BoNT/A-Csyn8 de SEC ID N.º 207;
BoNT/A-Csnp8 de SEC ID N.º 208;
BoNT/A-DF39 de SEC ID N.º 209;
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 210;
BoNT/A-E8 de SEC ID N.º 211;
BoNT/A-F8 de SEC ID N.º 212; o
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 213.
Para expresar una toxina clostridial modificada
usando un sistema de expresión baculoviral, se colocan
aproximadamente 2,5 x 10^{6} células Sf9 en cuatro placas de
cultivo de 60 mm que contienen 2 ml de medio para insectos
BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y
se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una incubadora a
28ºC. Para cada transfección, se prepara una solución de
transfección de 50 \mul en un tubo de poliestireno de 6 ml
añadiendo 25 \mul de medio para insectos BacVector® que contiene
100 ng de un constructo pBACgus3 que codifica una toxina
clostridial modificada, tal como, p. ej.,
pBACgus3/BoNT/A-A17, y 500 ng de plásmido de
transferencia TlowE a 25 \mul de GeneJuice® para insectos diluido
que contiene 5 \mul de GeneJuice® para insectos (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI) y 20 \mul de
agua libre de nucleasas, y se incuba esta solución durante
aproximadamente 15 minutos. Tras la incubación de 15 minutos, se
añaden 450 \mul de medio BacVector® a la solución de transfección
y se mezcla suavemente. Se elaboran otras soluciones de transfección
de diluciones de 1/50, 1/250 y 1/1250 usando esta solución de
transfección madre a una disolución 1/10. Se añaden 100 \mul de
una solución de transfección a las células Sf9 de una de las cuatro
placas de cultivo de 60 mm, se lavan dos veces con medio para
insectos BacVector® libre de antibióticos y libre de suero, y se
incuban a 22ºC. Tras una hora, se añaden 6 ml de medio para insectos
BacVector® con agarosa BacPlaque al 1% que contiene albúmina de
suero bovino al 5%. Una vez solidificada la agarosa, se añaden 2 ml
de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero
bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren las
células a una incubadora a 28ºC durante 3-5 días
hasta que se hacen visibles las placas. Tras 3-5
días de la transfección, se teñirán las placas de la monocapa en
cuanto a la actividad del gen indicador de la
\beta-glucuronidasa con el fin de analizar la
presencia de placas de virus recombinante que contengan
pBACgus3BoNT/A-A17 mediante la incubación de la
monocapa lavada con 2 ml de medio para insectos BacVector® que
contiene 30 \mul de 20 mg/ml de solución X-Gluc
(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) durante
aproximadamente 2 horas en una incubadora a 28ºC.
Tras identificar las placas de virus
recombinante candidatas, se eluyen varias placas de virus candidatas
y se purifican. Para eluir un virus recombinante, se transfiere un
tapón que contiene una placa de virus recombinante con una pipeta
de Pasteur estéril a 1 ml de medio para insectos BacVector® (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI) en un vial de
tapón de rosca estéril. Se incuba el vial durante aproximadamente 2
horas a 22ºC o durante aproximadamente 16 horas a 4ºC. Para cada
placa de virus recombinante, se colocan 2,5 x 10^{5} células Sf9
en placas de cultivo de 35 mm que contienen 2 ml de medio para
insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen,
Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una
incubadora a 28ºC. Se retira el medio y se añaden 200 \mul de
virus recombinante eluido. Tras una hora, se añaden 2 ml de medio
para insectos BacVector® con agarosa BacPlaque al 1% que contiene
albúmina de suero bovino al 5%. Una vez solidificada la agarosa, se
añade 1 ml de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina
de suero bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren
las células a una incubadora a 28ºC durante 3-5 días
hasta que las placas se hacen visibles. Tras 3-5
días de la transfección, se teñirán las placas de la monocapa en
cuanto a la actividad del gen indicador de la
\beta-glucuronidasa con el fin de analizar la
presencia de placas de virus recombinante que contengan
pBACgus3/BoNT/A-A17 mediante la incubación de la
monocapa lavada con 2 ml de medio para insectos BacVector® que
contiene 30 \mul de 20 mg/ml de solución X-Gluc
(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) durante
aproximadamente 2 horas en una incubadora a 28ºC.
Para preparar un cultivo patrón de virus, se
eluye un virus recombinante transfiriendo un tapón que contiene una
placa de virus recombinante con una pipeta de Pasteur estéril a 1 ml
de medio para insectos BacVector® (EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI) en un vial de
tapón de rosca estéril. Se incuba el vial durante aproximadamente
16 horas a 4ºC. Se colocan aproximadamente 5 x 10^{5} células Sf9
en un matraz T-25 que contiene 5 ml de medio para
insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen,
Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una
incubadora a 28ºC. Se retira el medio y se añaden 300 \mul de
virus recombinante eluido. Tras una hora, se añaden 5 ml de medio
para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al 5%
a las células transfectadas y se transfieren las células a una
incubadora a 28ºC durante 3-5 días hasta que la
mayoría de las células se sueltan y se vuelven inviables. Se cosecha
el virus transfiriendo el medio a tubos de tapa a presión de 15 ml,
y se centrifugan los tubos a 1.000 xg durante 5 minutos para
eliminar los residuos. Se transfiere el sobrenadante aclarado a
tubos de tapa a presión de 15 ml recién preparados y se almacenan a
4ºC.
Para preparar un cultivo patrón del virus a un
título elevado, se colocan aproximadamente 10 x 10^{7} células
Sf9 en un matraz T-75 que contiene 10 ml de medio
para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen,
Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una
incubadora a 28ºC. Se retira el medio y se añaden 500 \mul del
cultivo patrón del virus. Tras una hora, se añaden 10 ml de medio
para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al
5% a las células transfectadas y se transfieren las células a una
incubadora a 28ºC durante 3-5 días hasta que la
mayoría de las células se sueltan y se vuelven inviables. Se
cosecha el virus transfiriendo el medio a tubos de tapa a presión de
15 ml, y se centrifugan los tubos a 1.000 xg durante 5 minutos para
eliminar los residuos. Se transfiere el sobrenadante aclarado a
tubos de tapa a presión de 15 ml recién preparados y se almacenan a
4ºC. Los cultivos patrón del virus a título elevado deberían
contener aproximadamente de 2 x 10^{8} a 3 x 10^{9} ufp
de
baculovirus.
baculovirus.
Para expresar
gp64-BoNT/A-A17 usando un sistema de
expresión baculoviral, se siembran aproximadamente 1,25 x 10^{8}
células Sf9 en un matraz de 1 l que contiene 250 ml de medio para
insectos BacVector® y se cultivan en un agitador orbital (150 rpm)
a una densidad celular de aproximadamente 5 x 10^{8}. Se inocula
el cultivo con aproximadamente 2,5 x 10^{9} de baculovirus
recombinante patrón a título elevado y se incuba durante
aproximadamente 48 horas en un agitador orbital a 28ºC (150 rpm). Se
cosecha el medio transfiriéndolo a tubos y centrifugando los tubos
a 500 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se añaden
muestras de medio a 2 x tampón de muestra de LDS (Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA) y se mide la expresión mediante análisis de
transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) usando
anticuerpos bien frente a BoNT/A o frente a His con el fin de
identificar los cultivos patrón baculovirales que expresen a
BoNT/A-A17. Se puede usar un procedimiento similar
para expresar un constructo pBACgus3 que codifique cualquiera de las
toxinas clostridiales modificadas de la SEC ID N.º 204 a la SEC ID
N.º 213.
Se purifica BoNT/A-A17 usando el
procedimiento de IMAC, según lo descrito en el ejemplo 8. Se evalúa
la expresión de cada cultivo mediante un análisis con colorantes de
Bradford, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y análisis de
transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) con el fin
de determinar las cantidades de BoNT/A-A17
producidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento
útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales
modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de
mamífero.
Para construir un constructo de expresión en
mamíferos adecuado que codifique una toxina clostridial modificada,
se incorporan sitios de endonucleasas de restricción adecuados para
la clonación de una molécula de polinucleótido ligada
operativamente a un vector pSecTag2 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)
en los extremos 5' y 3' de la molécula de polinucleótido de SEC ID
N.º 238 que codifica la BoNT/A-A17 de SEC ID N.º
203. Se sintetiza esta molécula de polinucleótido y se obtiene un
constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en
el ejemplo 1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción
que 1) escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto
de la SEC ID N.º 238 que codifica la BoNT/A-A17; y
2) permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector
pSecTag2. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN
ligasa de T4 en un vector pSecTag2 que es digerido con
endonucleasas de restricción apropiadas para producir
pSecTag2/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de
unión en células DH5\alpha de E. coli químicamente
competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento
de choque térmico, se colocan en placas de agar de
Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100
\mug/ml de ampicilina y se colocan en una incubadora a 37ºC para
que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los
constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes
a la ampicilina. Se aíslan los constructos candidatos usando un
procedimiento de mini-preparación de plásmidos de
lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos
digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la
presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación
produjo un constructo de expresión pSecTag2 que comprendía la
molécula de polinucleótido de SEC ID N.º 238 que codificaba la
BoNT/A-A17 de SEC ID N.º 203 ligada operativamente
a péptidos de unión por afinidad a la polihistidina y a
c-myc carboxi-terminales (Fig.
15).
Se usa una estrategia de clonación similar para
producir los constructos de expresión pSecTag2 que codifican
BoNT/A-A8 de SEC ID N.º 204;
BoNT/A-BT35 de SEC ID N.º 205;
BoNT/A-BT8 de SEC ID N.º 206;
BoNT/A-Csyn8 de SEC ID N.º 207;
BoNT/A-Csnp8 de SEC ID N.º 208;
BoNT/A-DF39 de SEC ID N.º 209;
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 210;
BoNT/A-E8 de SEC ID N.º 211;
BoNT/A-F8 de SEC ID N.º 212; o
BoNT/A-D8 de SEC ID N.º 213.
Para expresar transitoriamente una toxina
clostridial modificada en una línea celular, se colocan
aproximadamente 1,5 x 10^{5} células SH-SY5Y en
una placa de cultivo tisular de 35 mm que contiene 3 ml de medio de
Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM), complementado con
suero bovino fetal al 10% (SBF), solución de 1 x
penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x
solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA) y se cultivan en una incubadora a 37ºC bajo dióxido de
carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de
aproximadamente 5 x 10^{5} células/ml (6-16
horas). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul
añadiendo 250 \mul de medio de suero reducido
OPTI-MEM que contiene 15 \mul de lipofectAMINE
2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente
durante 5 minutos a 250 \mul de medio de suero reducido
OPTI-MEM que contiene 5 \mug de un constructo de
expresión pSecTag2 que codifica una toxina clostridial modificada,
tal como, p. ej., pSecTag2/BoNT/A-A17. Se incuba
esta transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 20
minutos. Se reemplaza el medio DMEM complementado completo con 2 ml
de medio de suero reducido OPTI-MEM y se añaden los
500 \mul de solución de transfección a las células
SH-SY5Y, y se incuban las células en una incubadora
a 37ºC bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 6 a 18
horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM
complementado completo recién preparado, y se incuban las células
en una incubadora a 37ºC bajo dióxido de carbono al 5% durante 48
horas. Se recogen tanto el medio como las células para el análisis
de la expresión de BoNT/A-A17. Se cosecha el medio
transfiriéndolo a tubos de tapa a presión de 15 ml y centrifugando
los tubos a 500 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se
cosechan las células aclarándolas una vez con 3,0 ml de solución
salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4, y lisándolas con un
tampón que contiene ácido
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanediol-clorhídrico
62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8, y
lauril-sulfato de sodio al 2% (SDS). Se añaden tanto
el medio como las muestras celulares a 2 x tampón de muestra de LDS
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión mediante
análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo
5) usando anticuerpos bien frente a BoNT/A, frente a
c-myc o frente a His con el fin de identificar los
constructos pSecTag2 que expresen a BoNT/A-A17. Se
puede usar un procedimiento similar para expresar transitoriamente
un constructo pSecTag2 que codifique cualquiera de las toxinas
clostridiales modificadas de la SEC ID N.º 204 a la SEC ID N.º
213.
Para generar una línea celular integrada
establemente que exprese una toxina clostridial modificada, se
colocan aproximadamente 1,5 x 10^{5} células SHSY5Y en una placa
de cultivo tisular de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM completo
complementado con SBF al 10%, 1 x solución de
penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x
solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA), y se cultivan en una incubadora a 37ºC bajo dióxido
de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de
aproximadamente 5 x 10^{5} células/ml (6-16
horas). Se prepara una solución de transfección de 500 \mul
añadiendo 250 \mul de medio de suero reducido
OPTI-MEM, que contiene 15 \mul de lipofectAMINE
2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente
durante 5 minutos, a 250 \mul de medio de suero reducido
OPTI-MEM que contiene 5 \mug de un constructo de
expresión pSecTag2 que codifica una toxina clostridial modificada,
tal como, p. ej., pSecTag2/BoNT/A-A17. Se incuba
esta solución de transfección a temperatura ambiente durante
aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio DMEM complementado
completo con 2 ml de medio de suero reducido
OPTI-MEM y se añaden los 500 \mul de solución de
transfección a las células SH-SY5Y, y se incuban las
células en una incubadora a 37ºC bajo dióxido de carbono al 5%
durante aproximadamente 6 a 18 horas. Se reemplaza el medio de
transfección con 3 ml de DMEM complementado completo recién
preparado, y se incuban las células en una incubadora a 37ºC bajo
dióxido de carbono al 5% durante 48 horas. Se reemplaza el medio con
3 ml de DMEM completo recién preparado que contiene aproximadamente
5 \mug/ml de Zeocin^{TM}, SBF al 10%, 1 x solución de
penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x
solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA). Se incuban las células en una incubadora a 37ºC bajo
dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente
3-4 semanas, reemplazando el medio antiguo con DMEM
complementado completo selectivo para Zeocin^{TM} recién
preparado cada 4 a 5 días. Una vez establecidas las colonias
resistentes a Zeocin^{TM}, se vuelven a colocar los clones
resistentes en nuevas placas de cultivo de 35 mm que contiene DMEM
completo recién preparado complementado con aproximadamente 5
\mug/ml de Zeocin^{TM}, SBF al 10%, 1 x solución de
penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x
solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc,
Carlsbad, CA), hasta que estas células alcanzan una densidad de 6 a
20 x 10^{5} células/ml. Para analizar la expresión de
BoNT/A-A17 desde las líneas celulares de SHSY5Y que
han integrado establemente un pSecTag2/BoNT/A-A17,
se colocan aproximadamente 1,5 x 10^{5} células
SH-SY5Y de cada línea celular en una placa de
cultivo tisular de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM complementado
completo selectivo para Zeocin^{TM}, y se desarrollan en una
incubadora a 37ºC bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las
células alcanzan una densidad de aproximadamente 5 x 10^{5}
células/ml (6-16 horas). Se reemplaza el medio con 3
ml de DMEM complementado completo selectivo para Zeocin^{TM}
recién preparado, y se incuban las células en una incubadora a 37ºC
bajo dióxido de carbono al 5% durante 48 horas. Se recogen tanto el
medio como las células para el análisis de la expresión de
BoNT/A-A17-c-myc-His.
Se cosecha el medio transfiriéndolo a tubos de tapa a presión de 15
ml, y se centrifugan los tubos a 500 xg durante 5 minutos para
eliminar los residuos. Se cosechan las células aclarándolas una vez
con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4 y
lisándolas con un tampón que contiene ácido
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol-clorhídrico
62,6 mM (Tris-HCl), pH 6,8, y
lauril-sulfato de sodio al 2% (SDS). Se añaden tanto
el medio como las muestras celulares a 2 x tampón de muestra de LDS
(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión mediante
análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo
5) usando anticuerpos bien frente a BoNT/A, frente a
c-myc o frente a His con el fin de identificar las
líneas celulares de SH-SY5Y que expresen a
BoNT/A-A17. Se selecciona la línea celular de
SH-SY5Y establecida que muestra el nivel de
expresión más elevado de BoNT/A-A17 para una
expresión a gran escala usando matraces de 3 l. Los procedimientos
para la expresión a gran escala son como se explican resumidamente
con anterioridad, a excepción de que el volumen inicial es de
aproximadamente 800-1.000 l de DMEM completo, y las
concentraciones de todos los reactivos son aumentadas
proporcionalmente para este volumen. Se puede usar un procedimiento
similar para expresar establemente un constructo pSecTag2 que
codifique cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas de la
SEC ID N.º 204 a la SEC ID N.º 213.
Se purifica BoNT/A-A17 usando el
procedimiento de IMAC, según lo descrito en el ejemplo 8. Se evalúa
la expresión de cada cultivo mediante un análisis con colorantes de
Bradford, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y análisis de
transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) con el fin
de determinar las cantidades de BoNT/A-A17
producidas.
Aunque los aspectos de la presente invención
hayan sido descritos con referencia a las realizaciones reveladas,
cualquier experto en la técnica reconocerá fácilmente que los
ejemplos específicos revelados son sólo ilustrativos de estos
aspectos y que no limitan, de ningún modo, la presente
invención.
<110> Steward, Lance E.
\hskip1cmOka, Melvin S.
\hskip1cmAoki, Kei Roger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Toxinas clostridiales activables por
toxinas clostridiales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 17852 (BOT)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/718.616
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-09-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1296
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(448)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (449)...(1296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (449)...(871)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (872)...(1296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(441)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (442)...(1291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (442)...(858)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (858)...(1291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo C1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(449)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (450)...(1291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (450)...(866)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (867)...(1291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(445)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (446)...(1276)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (446)...(862)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (863)...(1276)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(422)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (423)...(1252)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (423)...(845)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (846)...(1252)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo F
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(439)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (440)...(1274)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (440)...(864)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (865)...(1274)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium botulinum
serotipo G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(446)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (447)...(1297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (447)...(863)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (864)...(1297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(457)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera que comprende el
dominio enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (458)...(1315)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada que comprende los
dominios de translocación y de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (458)...(879)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad amino-terminal
de la cadena pesada que comprende el dominio de translocación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (880)...(1315)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mitad
carboxi-terminal de la cadena pesada que comprende
el dominio de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25A de Homo
sapiens (Ser humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de Homo
sapiens (Ser humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23A de Homo
sapiens (Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23B de Homo
sapiens (Ser humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de
Macaca mulatta (Mono Rhesus)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25A de
Rattus norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de
Rattus norvegicus (Rata)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de Mus
musculus (Ratón)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23 de Rattus
norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23 de Mus
musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de
Gallus gallus (Pollo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25A de
Carassius auratus (Pez rojo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de
Carassius auratus (Pez rojo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25A de Danio
rerio (Pez cebra)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de Danio
rerio (Pez cebra)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23 de Danio
rerio (Pez cebra)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de
Torpedo marmorata (Raya eléctrica de mármol)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25A de
Xenopus laevis (Rana con garras africana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25B de
Xenopus laevis (Rana con garras africana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-23 de
Xenopus laevis (Rana con garras africana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de
Strongylocentrotus purpuratus (Erizo de mar)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de
Drosophila melanogaster (Mosca de la fruta)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-24 de
Drosophila melanogaster (Mosca de la fruta)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de Hirudo
medicinalis (Sanguijuela)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de Loligo
pealei (Calamar de aleta larga)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de
Lymnaea stagnalis (Caracol de laguna grande)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNAP-25 de
Caenorhabditis elegans (Gusano redondo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
VAMP-1-1 de Homo sapiens (Ser
humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
VAMP-1-2 de Homo sapiens (Ser
humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
VAMP-1-3 de Homo sapiens (Ser
humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Homo
sapiens (Ser humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Macaca
mulatta (Mono Rhesus)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Homo
sapiens (Ser humano)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Bos
tarsus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1 de Rattus
norvegicus (Rata)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1b de Rattus
norvegicus (Rata)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1 de Mus
musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Rattus
norvegicus (Rata)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2b de Rattus
norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Mus
musculus (Ratón)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Rattus
norvegicus (Rata)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211>103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Mus
musculus (Ratón)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1 de Gallus
gallus (Pollo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Gallus
gallus (Pollo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip0,8cm
\hskip0,7cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Gallus
gallus (Pollo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1 de Danio
rerio (Pez cebra)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Danio
rerio (Pez cebra)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Danio
rerio (Pez cebra)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-1 de Torpedo
marmorata (Raya eléctrica de mármol)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-2 de Xenopus
laevis (Rana con garras africana)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP-3 de Xenopus
laevis (Rana con garras africana)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP de Strongylocentrotus
purpuratus (Erizo de mar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynA1 de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynA2 de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynB1 de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynB2 de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynC de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynD de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SynE de Drosophila
melanogaster (Mosca de la fruta)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP de Hirudo medicinalis
(Sanguijuela)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP de Loligo pealei
(Calamar de aleta larga)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP de Lymnaea stagnalis
(Caracol de laguna grande)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAMP de Aplysia californica
(Babosa de mar de California)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNB1 de Caenorhabditis
elegans (Gusano redondo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tipo de SNB1 de Caenorhabditis
elegans (Gusano redondo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Homo sapiens (Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B1 de
Homo sapiens (Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B2 de
Homo sapiens (Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
Sintaxina-2-1 de Homo sapiens
(Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
Sintaxina-2-2 de Homo sapiens
(Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
Sintaxina-2-3 de Homo sapiens
(Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3 de
Homo sapiens (Ser humano)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Bos taurus (Vaca)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B2 de
Bos taurus (Vaca)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Rattus norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B2 de
Rattus norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B1 de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B2 de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-2 de
Rattus norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-2 de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3A de
Rattus norvegicus (Rata)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3A de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3B de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3C de
Mus musculus (Ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B de
Gallus gallus (Pollo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-2 de
Gallus gallus (Pollo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B de
Danio rerio (Pez cebra)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-3 de
Danio rerio (Pez cebra)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1B de
Strongylocentrotus purpuratus (Erizo de mar)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Drosophila melanogaster (Mosca de la fruta)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Hirudo medicinalis (Sanguijuela)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Loligo pealei (Calamar de aleta larga)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Lymnaea stagnalis (Caracol de laguna grande)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintaxina-1A de
Aplysia californica (Babosa de mar de California)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato
de TeNT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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<211> 8
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/C1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
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<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/E.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/E.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/E.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/E.
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/E.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/G.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/G.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante M16A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante M16X.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
2-aminohexanoico (norleucina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante K15A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante T14S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante T14B.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
2-aminobutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante A13B.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
2-aminobutírico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante Q11A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante Q11B.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
2-aminobutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante Q11N.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante N10A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante A9B.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
2-aminobutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante E8Q.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A, variante D7N.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/A.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/D y un sitio de escisión del sustrato
de BoNT/F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que comprende un sitio de
escisión del sustrato de BoNT/D y un sitio de escisión del sustrato
de BoNT/F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Espaciador G flexible.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Espaciador A flexible.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo FLAG.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo de la
hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo
c-Myc de la p62 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo de la
glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo de la
sustancia P.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Precursor de la glucoproteína D de
la región de unión al epítopo del virus del herpes simple.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo V5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo AU1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo AU5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de unión al epítopo HIS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
enteroquinasa bovina.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
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<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
virus del tabaco Etch (TEV).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
rinovirus humano 3C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
SUMO/ULP-1.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
factor de coagulación Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de escisión de la proteasa del
factor de coagulación Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1303
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1303)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_A17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_A8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
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<222> (1)...(1321)
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<223> BoNT/A_BT35
\newpage
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<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_BT8
\newpage
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<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_Csyn8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_Csnp8
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1325)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_DF39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_D8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_E8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_F8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1294)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_G8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3918
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3915)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_A17
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_A8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3972
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3969)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_BT35
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_BT8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_Csyn8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_Csnp8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3984
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptidos MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3981)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_DF39
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_D8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
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<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_E8
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_F8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3891
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
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<222> (1)...(3888)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BoNT/A_G8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3909)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-A17, optimizado para la expresión de E.
coli.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-A8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3966
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3963)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-BT35, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-BT8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-Csyp8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-Csnp8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3978
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3975)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-DF39, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-D8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-E8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-F8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3882)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-G8, optimizado para la expresión de E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3909)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-A17, optimizado para la expresión de P.
pastoris.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3909)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-A17, optimizado para la expresión de S.
frugiperda.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido MAT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3909)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido que codifica
BoNT/A-A17, optimizado para la expresión de H.
sapiens.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (14)
1. Una toxina clostridial modificada que
comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en
la región del bucle bicatenario.
2. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina
botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina
tetánica.
3. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G.
4. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial se obtiene de fragmentos autocatalíticos de las
propias toxinas clostridiales.
5. Una molécula de polinucleótido que codifica
una toxina clostridial modificada según lo definido en la
reivindicación 1.
6. Un procedimiento para producir una toxina
clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una
célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la
reivindicación 5, en la que la expresión de la molécula de
polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo
definido en la reivindicación 1.
7. Un procedimiento para producir una toxina
clostridial modificada que comprende las etapas de:
- a.
- introducir en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la reivindicación 5; y
- b.
- expresar la molécula de polinucleótido, en la que la expresión de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 1.
8. Una toxina clostridial modificada que
comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio
de translocación de toxina clostridial, un dominio de unión de
toxina clostridial y una región de bucle bicatenario;
en la que la región del bucle bicatenario se
interpone entre el dominio enzimático de la toxina clostridial y el
dominio de translocación de la toxina clostridial; y
en la que la modificación comprende un sitio de
escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado en la región del
bucle bicatenario.
9. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina
botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina
tetánica.
10. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 9, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato
de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de
escisión de sustrato de BoNT/G.
11. La toxina clostridial modificada según la
reivindicación 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial se obtiene de fragmentos autocatalíticos de las
propias toxinas clostridiales.
12. Una molécula de polinucleótido que codifica
una toxina clostridial modificada según lo definido en la
reivindicación 8.
13. Un procedimiento para producir una toxina
clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una
célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la
reivindicación 12, en la que la expresión de la molécula de
polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo
definido en la reivindicación 8.
14. Un procedimiento para producir una toxina
clostridial modificada que comprende las etapas de:
- a.
- introducir en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la reivindicación 12; y.
- b.
- expresar la molécula de polinucleótido, en la que la expresión de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada según lo definido en la reivindicación 8.
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