TW201814045A - 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供適合雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之重組體製造的方法、細胞及套組，其避免活化步驟的要求；以及因而獲得之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，其適合用於治療。

Description

製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
本發明提供一種雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之重組體製造之方法，其避免了活化步驟的要求。
梭狀芽孢桿菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生高效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害此等被遞送至的神經元及其他細胞。此種梭狀芽孢桿菌神經毒素之例包括由破傷風桿菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒桿菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G所產生的神經毒素，以及彼等由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生者。
於梭狀芽孢桿菌神經毒素中有一些為已知最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5ng/kg之半數致死劑量(LD50)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處且於周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風 毒素則作用於中樞神經系統。
梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運送蛋白質進行蛋白酶切割而作用-參見Gerald K(2002)「Cell and Molecular Biology」(第4版)John Wiley & Sons,Inc。首字母縮略詞SNARE衍生自術語可溶性NSF附著受體(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此無細胞毒性(non-cytotoxic)蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。
本質上，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連接在一起的兩個多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，其通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基間。只有通過此活化事件才能達到梭狀芽孢桿菌神經毒素的全部效力。此兩鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組件(translocation component)(HN域)及C-端標定組件(targeting component)(HC域)。此切割位係位於L-鏈及轉 位域組件之間。在將HC域與其目標神經元結合且此結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中之後，HN域將此L-鏈轉位通過胞內體膜並進入細胞溶質，此L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為非細胞毒性蛋白酶)。
肉毒桿菌神經毒素因其引起鬆弛性肌肉麻痺(flaccid muscle paralysis)及抑制膽鹼性分泌(cholinergic secretion)的能力而眾所周知。此等性質已造成肉毒桿菌神經毒素被採用於各式各樣的醫療及美容處置，包括治療眉間紋(glabellar line)或運動過度的面部紋(hyperkinetic facial lines)、頭痛、半面痙攣、膀胱機能亢進(hyperactivity of the bladder)、多汗症、鼻唇線(nasal labial line)、頸肌張力不全(cervical dystonia)、瞼痙攣、痙攣狀態(spasticity)及多汗症。
目前，包含BoNT的所有已批准的藥物/化妝品製劑皆含有自梭狀芽孢桿菌株純化的天然存在的神經毒素(於DYSPORT®、BOTOX®或XEOMIN®的情形為BoNT/A，及於MYOBLOC®的情形為BoNT/B)。BoNT產品之傳統製造係藉由培養肉毒桿菌，之後分離及純化肉毒桿菌神經毒素複合物或複合物游離神經毒素來進行。肉毒桿菌為產孢子細菌，因此需要特殊之繁雜的培養設備及設施。因此於如大腸桿菌之異源宿主中重組製造BoNT為有利的。然而，梭狀芽孢桿菌神經毒素之重組體製造的限制步驟為活化步驟。
的確，目前的重組梭狀芽孢桿菌神經毒素製造的實踐係於合適的異源宿主如大腸桿菌中以單個多肽 鏈的方式表現梭狀芽孢桿菌神經毒素(上游過程)。此初始步驟通常係接續一系列之純化步驟(例如藉由管柱層析)及需要添加適當蛋白酶之活化步驟(下游過程)，該蛋白酶將單鏈不活化的(或難以活化的)梭狀芽孢桿菌神經毒素轉化成雙鏈完全活性的形式。此活化步驟需要梭狀芽孢桿菌神經毒素活化環(activation loop)的特異性及受控制的切割。此切割係藉由使用適當蛋白酶來製造所欲雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素而達成，該所欲雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素包含以雙硫鍵連結的輕鏈及重鏈。此活化步驟已證明為梭狀芽孢桿菌神經毒素製造之一非常具有挑戰性的階段。特別是切割事件可發生於活化環外部，並造成產生經截短的梭狀芽孢桿菌神經毒素，然後必須將其從全長的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素中分離出來。此外，於培育期後，活化蛋白酶必須自經活化的毒素中去除，以避免污染最終的醫藥產物。
於活化階段可能遭遇的議題包括：- 識別「會切割活化環的同時亦避免於其他位置的不必要的切割(造成截短及降低/喪失功效)之-蛋白酶」的困難；- 從最終產物中移除活化蛋白酶的困難；- 取得用於發展及市售產品的製造之GMP等級活化蛋白酶的困難；- 用於確定最佳活化條件(溫度、時間、活化酶/神經毒素比率)的耗時方法。
一種能迴避活化步驟的要求之用於梭狀芽孢 桿菌神經毒素之重組體製造之方法，係因此具有極大的優點。
Maisey等人，1988(MAISEY,E.Anne,et al."Involvement of the constituent chains of botulinum neurotoxins A and B in the blockade of neurotransmitter release." European Journal of Biochemistry 177.3(1988)：683-691.)企圖使用已打開摺疊(unfolded)的先前純化的毒素形成雙鏈BoNT/A和B，所得到的域分開地重折疊(refold)。當組合的個別域時，他們發現>70%的毒素確實形成雙鏈毒素，然而效力大大地降低。於他們的討論中，他們假設此降低的效力可能歸因於自由域的存在、非共價結合或不正確的雙硫鍵形成。
US2006/0024794 A1描述使用桿狀病毒(baclovirus)表現系統來共表現(co-expressing)BoNT域以在昆蟲細胞中製造雙鏈毒素的可能性。然而，特別是於US2006/0024794 A1之圖10及11呈現的數據，顯示儘管形成小部分的雙鏈神經毒素，但大多數梭狀芽孢桿菌神經毒素仍然保持為游離輕鏈及重鏈。
因此，於本技術領域中有改善用於雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之重組體製造的方法的需求。
於第一態樣，本發明提供一種製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，其包含於異源宿主細胞中分別表現編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編 碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係在該宿主細胞的氧化環境中被表現。
於第二態樣，本發明提供一種細胞，其包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係在該細胞的氧化環境中被表現。
於第三態樣，本發明提供一種套組，其包含：a. 包含氧化環境的細胞，b. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因，及c. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因適合於在該細胞的氧化環境中分別表現梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈。
於第四態樣，本發明提供藉由依據本發明之方法所獲得的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於第五態樣，本發明提供一種醫藥組成物，其包含依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於第六態樣，本發明提供具有氧化性細胞質(oxidative cytoplasm)之宿主細胞之用途，其用於製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該宿主細胞包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係於該宿主細胞的氧化性細胞質中被表現。
本發明係基於本發明者們之發現，於異源宿主細胞的氧化環境中分別地共表現梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈，能以顯著提高的效率使兩個域一起折疊 以形成雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於第一態樣，本發明提供一種製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，其包含於異源宿主細胞中分別表現編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係於該宿主細胞的氧化環境中被表現。
於本文中使用時，術語「氧化環境」係意指促進胱胺酸形成(半胱胺酸的氧化二聚物)的細胞環境。此通常透過不同的氧化還原蛋白質的平衡而達成，諸如但不限於硫氧還蛋白系蛋白質(thioredoxin based proteins)(例如DsbA)及麩胱甘肽。氧化環境的非限制性例為革蘭氏陰性菌的周質(periplasm)或者真核表現系統如中國倉鼠卵巢(CHO)、昆蟲或酵母細胞的內質網。
於現有技術領域中已知有許多原核及真核表現系統。宿主細胞可選自例如：原核細胞，如大腸桿菌及巨桿菌(Bacillus megaterium)；或真核細胞，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及畢赤酵母(Pichia pastoris)。儘管亦可使用更高級的真核細胞，例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞，但宿主細胞較佳仍然係如肉毒桿菌，不具有醣苷化胞器(glycosylation apparatus)。
於一較佳具體實施例，宿主細胞為原核細胞。於一更佳具體實施例，氧化環境為原核細胞的細胞質。
藉由巰基在兩個半胱胺酸側鏈之間的氧化，生成共價鍵而形成雙硫鍵。於自然界中，細胞具有致力於減少其細胞質(還原細胞質)中的雙硫鍵的酶，且於細 胞質外的(extra-cytoplasmic)環境中發生雙硫鍵的形成，諸如革蘭氏陰性菌中的周質或真核生物中的內質網(ER)。因此，於如大腸桿菌之細胞的細胞質中製造需要雙硫鍵的重組蛋白質係有挑戰性的。
細菌細胞的細胞質可透過遺傳工程呈現氧化，例如藉由於細胞質中表現參與雙硫鍵形成的基因及/或壓制(repressing)參與雙硫鍵還原的基因及/或修飾此等基因。例如，將突變導入硫氧還蛋白(thioredoxin)的基因(trxB)及/或麩胱甘肽的基因(gor或gshA)路徑及/或細胞質性過度表現(cytoplasmically over-expression)DsbC的基因，可呈現細胞質環境氧化並允許形成雙硫鍵(Bessette,Paul H.,et al."Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm." Proceedings of the National Academy of Sciences 96.24(1999)：13703-13708；Lobstein,Julie,et al."SHuffle,a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm." Microbial cell factories 11.1 (2012)：1)。
具有氧化環境的市售大腸桿菌株之例包括：- AD494及BL21trxB株，可獲自Novagen，其中trxB基因經突變；- OrigamiTM株(Origami、Origami 2、Origami B)，可獲自Novagen，其中gor及trxB基因經突變；- Rosetta-gamiTM株(Rosetta-gami、Rosetta-gami 2及 Rosetta-gami B)，可獲自Novagen，其中gor及trxB基因經突變；- SHuffle®株(SHuffle T7、SHuffle T7 express)，可獲自New England Biolabs，其中gor及trxB基因經突變且缺少訊息序列的DsbC基因係於細胞質中被表現。
於一較佳具體實施例，該細胞為原核細胞，其中與其他相同的野生型細胞相比，至少一個參與雙硫鍵形成的基因於細胞質中被過度表現；及/或與其他相同的野生型細胞相比，至少一個參與雙硫鍵還原的基因被壓制。於一具體實施例中，該原核細胞為大腸桿菌細胞，選自下列株：AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及SHuffle株。於一較佳具體實施例，該原核細胞為大腸桿菌，來自Origami或SHuffle株。
於本文中使用時，術語「神經毒素」意指任何進入神經元並抑制神經傳導物釋放的多肽。此過程涵括神經毒素與低或高親和性受體的結合、神經毒素的內化、神經毒素的內肽酶部分轉位到細胞質中以及神經毒素受質的酶修飾。更具體而言，術語「神經毒素」涵括任何由梭狀芽孢桿菌細菌產生之進入神經元並抑制神經傳導物釋放的多肽(「梭狀芽孢桿菌神經毒素」)，及藉由重組技術或化學技術產生的此種多肽。其為此雙鏈形式，即為毒素的活性形式。此兩條鏈稱為重鏈(H鏈)，其具有約100kDa之分子量；及輕鏈(L鏈)，其具有約50kDa之分子量。此L鏈包含內肽酶活性。此H鏈包含兩個各自 具有約50kDa之分子量之功能上不同的域：「HC域」，其能夠使神經毒素與位於目標細胞表面的受體結合；以及「HN域」，其能夠將輕鏈(內肽酶)轉位到細胞質中。HC域由兩個結構不同的次域組成：「HCN次域」(HC域的N-端部分)和「HCC次域」(HC域的C-端部分)，其各自具有約25kDa之分子量。於本文中使用時，術語「雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素」意指由藉由雙硫鍵連接的梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈所組成的活性神經毒素。應理解，依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素能夠結合目標細胞，將輕鏈轉位到目標細胞的細胞質中並切割SNARE蛋白質，因而損害目標細胞的分泌能力。
不同的肉毒桿菌神經毒素(BoNT)血清型可基於利用特異性中和抗血清之去活性化來區分，關於此種利用血清型之分類係與胺基酸程度的序列同一性(sequence identity)百分比相關。基於胺基酸序列同一性百分比，指定血清型的BoNT蛋白質進一步被分為不同的亞型。提供BoNT/A胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：1(UniProt登錄號A5HZZ9)。提供BoNT/B胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：2(UniProt登錄號B1INP5)。提供BoNT/C胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：3(UniProt登錄號P18640)。提供BoNT/D胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：4(UniProt登錄號P19321)。提供BoNT/E胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：5(登錄號WP_003372387)。提供BoNT/F胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：6(UniProt登錄號Q57236)。提供BoNT/G胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：7 (登錄號WP_039635782)。提供破傷風神經毒素(TeNT)胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：8(UniProt登錄號P04958)。
提供編碼BoNT/A之核酸序列之一例為SEQ ID NO：9。提供編碼BoNT/B之一核酸序列為SEQ ID NO：10。提供編碼BoNT/C之一核酸序列為SEQ ID NO：11。提供編碼BoNT/D之一核酸序列為SEQ ID NO：12。提供編碼BoNT/E之一核酸序列為SEQ ID NO：13。提供編碼BoNT/F之一核酸序列為SEQ ID NO：14。提供編碼BoNT/G序列之一核酸序列為SEQ ID NO：15。提供編碼破傷風神經毒素(TeNT)序列之一核酸序列為SEQ ID NO：16。
示例性的L、HN、HCN、及HCC胺基酸域示於表1。
示例性的編碼L、HN、HCN及HCC域之核酸序列示於表2。
上述識別的參考序列應被視為一指引，因根據亞血清型可能發生輕微變化。舉例而言，US 2007/0166332(其全部內容藉由引用併入本文)引述些微不同的梭狀芽孢桿菌序列。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或者TeNT。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或者TeNT。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或者TeNT，且梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或者TeNT。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素 輕及重鏈係來自相同的血清型或亞型。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素輕及重鏈係來自不同的血清型或亞型。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈包含選自下列的序列：- SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至448；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至441；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至449；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至442；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至423；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至439；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至446；或者相對於其G具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至 少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至456；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：9之核苷酸1至1344編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：10之核苷酸1至1323編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：11之核苷酸1至1347編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：12之核苷酸1至1326編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：13之核苷酸1至1269編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：14之核苷酸1至1317編碼的胺基酸 序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：15之核苷酸1至1338編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，及- 以SEQ ID NO：16之核苷酸1至1368編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。
應理解梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈能夠切割SNARE蛋白質。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈包含選自下列的序列：- SEQ ID NO：1之胺基酸殘基449至1296；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基442至1291；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：3之胺基酸殘基450至1291；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基443至1276；或者相對 於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：5之胺基酸殘基424至1252；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基440至1278；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基447至1297；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：8之胺基酸殘基457至1315；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：9之核苷酸1345至3888編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：10之核苷酸1324至3873編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：11之核苷酸1348至3873編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80% 、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：12之核苷酸1327至3828編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：13之核苷酸1270至3756編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：14之核苷酸1318至3834編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：15之核苷酸1339至3891編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，及- 以SEQ ID NO：16之核苷酸1369至3945編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。
應理解梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈能夠結合目標細胞並將輕鏈轉位至目標細胞的細胞質中。
亦應理解依據本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的HN、HCN及HCC域可來自相同或不同的梭狀芽孢桿菌 血清型或亞型。
於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈包含HN、HCN及HCC域，其中‧HN域包含選自下列的序列：- SEQ ID NO：1之胺基酸殘基449至872；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基442至859；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：3之胺基酸殘基450至867；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基443至863；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：5之胺基酸殘基424至846；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基440至865；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基447至864；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%， - SEQ ID NO：8之胺基酸殘基457至880；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：9之核苷酸1345至2616編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：10之核苷酸1324至2577編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：11之核苷酸1348至2601編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：12之核苷酸1327至2589編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：13之核苷酸1270至2538編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：14之核苷酸1318至2595編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性 之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：15之核苷酸1339至2592編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，及- 以SEQ ID NO：16之核苷酸1369至2640編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%；‧HCN域包含選自下列的序列：- SEQ ID NO：1之胺基酸殘基873至1094；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1081；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：3之胺基酸殘基868至1095；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基864至1082；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：5之胺基酸殘基847至1069；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為 至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基866至1087；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基865至1089；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：8之胺基酸殘基881至1111；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：9之核苷酸2617至3282編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：10之核苷酸2578至3243編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：11之核苷酸2602至3285編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：12之核苷酸2590至3246編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80% 、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：13之核苷酸2539至3207編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：14之核苷酸2596至3261編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：15之核苷酸2593至3267編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，及- 以SEQ ID NO：16之核苷酸2641至3333編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%；‧及HCC域包含選自下列的序列：- SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1095至1296；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1096至1291；或者相對 於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1083至1276；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1070至1252；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1090至1297；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1112至1315；或者相對於其具有至少70%之序列同一性之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：9之核苷酸3283至3888編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：10之核苷酸3244至3873編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%， - 以SEQ ID NO：11之核苷酸3286至3873編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：12之核苷酸3247至3828編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：13之核苷酸3208至3756編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：14之核苷酸3262至3834編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，- 以SEQ ID NO：15之核苷酸3268至3891編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，及- 以SEQ ID NO：16之核苷酸3334至3945編碼的胺基酸序列；或者以相對於其具有至少70%之序列同一性之核酸序列編碼的胺基酸序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。
兩個以上核酸或胺基酸序列間的「序列同一性百分比」係在由比對序列所共有的相同位置處的相同核苷酸/胺基酸之數目的函數。因此，同一性%可以下述方式計算：在比對中每個位置處的相同核苷酸/胺基酸的數目除以比對序列中的核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列同一性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要引入之間隙(gap)的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及百分比同一性的確定可使用諸如BLAST的特定數學演算法進行，其為本技術領域中具有通常知識者所熟知的。
輕鏈及/或重鏈可來自鑲嵌神經毒素(mosaic neurotoxin)。於本文中使用時，術語「鑲嵌神經毒素」係指天然存在的梭狀芽孢桿菌神經毒素，其包含來自另一種類型的梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如不同血清型的梭狀芽孢桿菌神經毒素)的至少一個功能域，而該梭狀芽孢桿菌神經毒素通常不包括該至少一個功能域。鑲嵌神經毒素之例為天然存在的BoNT/DC及BoNT/CD。BoNT/DC包含血清型D的L鏈及HN域及血清型C的HC域，而BoNT/CD由血清型C的L鏈及HN域及血清型D的HC域所組成。
輕鏈及/或重鏈可來自經修飾的神經毒素及其衍生物，包括但不限於彼等下述者。經修飾的神經毒素或衍生物與神經毒素的天然(未修飾)形式相比，可含有經修飾的一個或多個胺基酸、或可含有不存在於天然(未修飾)形式之神經毒素的一個或多個插入的胺基酸。舉 例而言，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素相對於天然(未修飾)梭狀芽孢桿菌神經毒素序列，可於一個或多個域中具有經修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾神經毒素的功能性方面，例如生物活性或持續性。因此，於一具體實施例中，第一神經毒素及/或第二神經毒素係經修飾的神經毒素或經修飾的神經毒素衍生物。
經修飾的神經毒素保留神經毒素之至少一種功能，其選自：與目標細胞上的低或高親和性神經毒素受體結合的能力、將神經毒素的內肽酶部分(輕鏈)轉位到細胞質中的能力、及切割SNARE蛋白質的能力。較佳地，經修飾的神經毒素保留此等功能中之至少兩種。更佳地，經修飾的神經毒素保留此三種功能。
經修飾的神經毒素可於重鏈(例如經修飾的HC域)的胺基酸序列中具有一個或多個修飾，其中該經修飾的重鏈以較天然(未修飾)神經毒素更高或更低的親和性結合至目標神經細胞。HC域中的此等修飾可包括修飾HC域之神經節苷脂(ganglioside)結合位的殘基或蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位中的殘基，其改變與目標神經細胞的神經節苷脂受體及/或蛋白質受體的結合。此種經修飾神經毒素之例描述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，兩者之全部內容皆藉由引用併入本文中。
經修飾的神經毒素可於輕鏈的胺基酸序列中具有一個或多個修飾，例如可能改變或修改經修飾的LC之SNARE蛋白質特異性的受質結合或催化域中的修飾。 此種經修飾的神經毒素之例描述於WO 2010/120766及US 2011/0318385，兩者之全部內容皆藉由引用併入本文中。
經修飾的神經毒素可包含增加或減少此經修飾的神經毒素之生物活性及/或生物持續性之一個或多個修飾。例如，經修飾的神經毒素可包含白胺酸系或酪胺酸系模體(leucine-or tyrosine-based motif)，其中該模體增加或減少此經修飾的神經毒素之生物活性及/或生物持續性。適當的白胺酸系模體包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL、及xExxxLM(其中x為任一胺基酸)。適當的酪胺酸系模體包括Y-x-x-Hy(其中Hy為一疏水性胺基酸)。包含白胺酸系及酪胺酸系模體之經修飾的神經毒素之例描述於WO 2002/08268，其全部內容藉由引用併入本文中。
於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素為一種重定靶向的神經毒素(retargeted neurotoxin)。於本文中使用時，術語「重定靶向的神經毒素」(亦稱為「靶向分泌抑制劑(targeted secretion inhibitors)」、「TSIs」、「TVEMPs」或「TEMs」)意指包含與非梭狀芽孢桿菌受體結合的標的部分(Targeting Moiety(TM))之梭狀芽孢桿菌神經毒素。TM可取代梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之HC或HCC域的部分或全部。重定靶向的神經毒素之例揭示於WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO01/53336；WO02/07759、WO2005/023309、WO2006/026780、WO2006/099590、 WO2006/056093、WO2006/059105、WO2006/059113、WO2007/138339、WO2007/106115、WO2007/106799、WO2009/150469、WO2009/150470、WO2010/055358、WO2010/020811、WO2010/138379、WO2010/138395、WO2010/138382、WO2011/020052、WO2011/020056、WO2011/020114、WO2011/020117、WO2011/20119、WO2012/156743、WO2012/134900、WO2012/134897、WO2012/134904、WO2012/134902、WO2012/135343、WO2012/135448、WO2012/135304、WO2012/134902、WO2014/033441、WO2014/128497、WO2014/053651、WO2015/004464，此等全部皆藉由引用併入本文。
於一具體實施例中，編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之基因係存在於相同的相同載體。
於一具體實施例中，編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之基因係存在於不同載體。
原則上，可使用任何表現載體以達成於大腸桿菌中的共表現，例如pK7、pJ401、pBAD或pET載體。當使用分別的載體來表現每個域時，較佳使用不同的抗生素抗性標記及複製起始點來幫助質體穩定。以單一載體方法，通常有利於具有在分別的啟動子及核醣體結合位的控制下之基因，但此並非必需的。最後，兩種策略皆可藉由相同類型的啟動子控制兩個基因、或可對於每個基因利用不同的啟動子，例如，T7-lac、T5-lac、rhaBAD 及araBAD啟動子。
於一具體實施例中，編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈的基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的基因被製備為DNA或RNA載體的一部分，較佳為DNA載體，包含啟動子及終止子。適當的啟動子及終止子序列為本技術領域中眾所周知的。
在此情形，啟動子的選擇取決於用於表現的表現系統。通常，組成型啟動子(constitutive promoter)較佳，但亦可使用誘導型啟動子。以此方式製造的建構體包括載體之至少一部分，特別是調節元件，載體例如選自A-衍生物(A-derivates)、腺病毒(adenoviruse)、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、SV40-病毒及反轉錄病毒。載體較佳能夠於指定的宿主細胞中表現基因。
於一具體實施例中，載體具有選自下列的啟動子：
本發明之基因可使用本技術領域中已知的任何適合的方法製備。因此，可使用化學合成技術製備基因。或者，本發明之基因可使用分子生物學技術製備。
本發明之基因較佳以電腦模擬(in silico)設 計，然後藉由慣用的基因合成技術合成。
為了依據所使用的最終宿主細胞(例如大腸桿菌)表達系統之密碼子偏倚(codon-biasing)，而選擇性地修飾上述基因。
於一具體實施例中，依據本發明之方法進一步包含自宿主細胞回收雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之步驟。尤其，該方法可包括將宿主細胞進行溶菌以提供宿主細胞均質物之步驟，以及單離雙鏈梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質之步驟。於一具體實施例中，依據本發明之方法可進一步包含將編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之基因導入宿主細胞之步驟。例如，本發明之基因可以如本文所述的表現載體的形式而被導入細胞。
通常，從宿主細胞回收後，係將此雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素純化及/或濃縮。任何適合的方法皆可用於雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之回收、純化及/或濃縮。用於回收、純化及/或濃縮的標準技術為本技術領域中眾所周知的，例如層析方法及/或電泳。
雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含一或多個N-端及/或C-端定位的純化標籤，以幫助純化多肽。雖然可使用任何純化標籤，但較佳為以下：His-標籤(例如6×組胺酸)，較佳作為C-端及/或N-端標籤；MBP-標籤(麥芽糖結合蛋白質)，較佳作為N-端標籤；GST-標籤(麩胱甘肽-S-轉移酶)，較佳作為N-端標籤；His-MBP-標籤，較佳作為N-端標籤；GST-MBP-標籤，較佳作為N-端標籤； 硫氧還蛋白-標籤，較佳作為N-端標籤；及/或CBD-標籤(幾丁質結合域)，較佳作為N-端標籤。
一個或多個肽間隔物(spacer)/連接物(linker)分子可被包含於雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素中。例如，可在純化標籤與多肽分子的其餘部分之間使用肽間隔物。
於另一態樣，本發明提供一種包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因的細胞，其中該第一及第二基因係於細胞的氧化環境中被表現。
於一較佳具體實施例，該細胞為原核細胞。於一更佳具體實施例，該氧化環境為原核細胞的細胞質。
於一較佳具體實施例，該細胞為原核細胞，其中與其他相同的野生型細胞相比，參與雙硫鍵形成之至少一個基因在細胞質中被過度表現；及/或與其他相同的野生型細胞相比，參與雙硫鍵還原之至少一個基因在細胞質中被壓制。
於一具體實施例中，該原核細胞係大腸桿菌，選自下列株：AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及SHuffle株。於一較佳具體實施例，該原核細胞係來自Origami或SHuffle株的大腸桿菌。
於一具體實施例中，編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因係存在於相同載體。
於一具體實施例中，編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈 之第二基因係存在於不同載體。
於另一態樣，本發明提供一種套組，其包含：a. 包含氧化環境的細胞，b. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因，及c. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因適合於在該細胞的該氧化環境中分別表現梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈。
於另一態樣，本發明提供一種藉由依據本發明之方法所獲得的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於另一態樣，本發明提供一種醫藥組成物，其包含依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。較佳地，該醫藥組成物包含依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及選自醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、推進劑(propellant)及/或鹽的至少一種組份。
於另一態樣，本發明提供一種依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素或依據本發明之醫藥組成物，其係用於治療。
於另一態樣，本發明提供一種治療方法，其包含投予依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素或依據本發明之醫藥組成物之適合的劑量至需要的患者。
依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素係適合用於治療與多餘的神經元活性有關的病症，例如選自以下組成的群組的病症：痙攣性發音困難(spasmodic dysphonia)、痙攣性斜頸(spasmodic torticollis)、喉肌張力不全(laryngeal dystonia)、口下頷發音困難 (oromandibular dysphonia)、舌肌張力不全(lingual dystonia)、頸肌張力不全、局部性手肌張力不全(focal hand dystonia)、瞼痙攣、斜視、半面痙攣、眼瞼障礙(eyelid disorder)、腦性麻痺、局部痙攣狀態(focal spasticity)及其他聲音障礙、痙攣性結腸炎、神經性膀胱障礙、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態(limb spasticity)、抽搐(tics)、震顫、磨牙、肛裂、弛緩不能、吞嚥困難及其他肌張力失調(muscle tone disorders)、及以肌肉群的不自主運動為特徵的其他失調症、流淚(lacrimation)、多汗症(hyperhidrosis)、過度流涎、胃腸道分泌過多(excessive gastrointestinal secretions)、分泌失調、來自肌肉痙攣的疼痛、頭痛、偏頭痛及皮膚病症狀。
於另一態樣，本發明提供一種依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的非治療用途，其係用於處理美容或化妝的情況。
依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素可被配製用於口服、非腸胃道、連續輸注、吸入或局部施用。適於注射的組成物可為溶液、懸浮液或乳液、或者使用前溶解或懸浮於適當的媒液(vehicle)中的乾粉之形式。
於依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素被局部遞送的情形，嵌合神經毒素可以霜劑(例如用於局部施用)或用於皮下注射的方式配製。
局部遞送手段可包括氣溶膠(aerosol)或其它噴霧(例如噴霧器(nebuliser))。於此方面，嵌合神經毒素 的氣溶膠製劑能夠遞送到肺及/或其他鼻及/或支氣管或呼吸道通道。
依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素可藉由鞘內注射或硬膜外注射(epidural injection)於涉及受影響的器官的神經支配的脊髓段部位(level of the spinal segment)的脊柱中來投予至患者。
較佳投予途徑係經由腹腔鏡及/或局部的，特別是肌內注射。
用於投予依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量範圍係產生所欲治療效果的劑量範圍。應當理解，所需的劑量範圍取決於雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素或組成物的精確性質、投予途徑、製劑的性質、患者年齡、患者病症的性質、範圍或嚴重性、禁忌(若有的話)、以及主治醫師的判斷。為了最佳化，可使用標準經驗慣例來調整此等劑量程度的變動。
一般利用依據本發明之雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及無熱原的無菌媒液製備流體劑型。雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，取決於使用的媒液及濃度，可被溶解或懸浮於媒液中。於製備溶液時，雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素可溶解於媒液中，若需要，藉由添加氯化鈉使溶液為等滲透壓，且於填充到適當的無菌小瓶或安瓿中並密封之前，藉由通過使用無菌技術的無菌過濾器來過濾滅菌。或者，若溶液安定性為適當的，則其密封容器中的溶液可藉由高壓蒸氣滅菌來滅菌。有利的是，如緩衝劑、助溶劑、安定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化 劑及/或局部麻醉劑之添加劑可被溶解於媒液中。
使用前溶解或懸浮於適當的媒液之乾粉可藉由使用無菌技術於無菌區中填充經預滅菌的成分至無菌容器來製備。或者，可使用無菌技術於無菌區中將成分溶解於適當的容器。然後將產品冷凍乾燥並將容器無菌密封。
適合用於肌肉內、皮下或皮內注射之非腸胃道懸浮液，除了無菌組份係被懸浮於無菌媒液而替代溶解，且滅菌無法藉由過濾而完成以外，係以實質上相同的方式被製備。組份可在無菌狀態下被單離、或者其可在單離後藉由例如γ射線照射而滅菌。
依據本發明之投予可利用多種遞送技術，包括微粒子包囊(microparticle encapsulation)、病毒遞送系統或高壓氣溶膠衝擊(high-pressure aerosol impingement)。
於另一態樣，本發明提供一種宿主細胞的用途，其具有用以製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之氧化性細胞質，其中宿主細胞包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中第一及第二基因係於宿主細胞之細胞質中被表現。
本揭示內容不受本文所揭示的示例性方法及材料的限制，且相對於本文所述為相似或等同的任何方法及材料皆可用於本揭示內容的具體實施例的實踐或測試。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有指明，任 何核酸序列皆以5'至3'的方向從左到右書寫；胺基酸序列則以胺基至羧基的方向從左到右書寫。
於提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確規定，否則在該範圍的上限和下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。於本揭示內容中涵括在「所述範圍內的任何所述值或居中值」與「所述範圍內的任何其他所述或居中值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可在該範圍內獨立地被包括或排除，且其中於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩者皆包含之每個範圍亦被涵括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一個或兩個時，排除彼等所包含的限值之一個或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。
必須注意，於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」(「a」、「an」)、及「此」(「the」)包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑；以及提及「此梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括提及本技術領域中具有通常知識者已知的一種或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物(equivalent)等。
現在僅藉由示例的方式，參考下列圖式及實施例來描述本發明。
圖1-對BoNT/A的LC(圖1A)或全長BoNT/A1-偏好對HC(圖1B)所產生的多株內部抗體(polyclonal in-house antibodies)之西方墨點轉漬(Western blot)。MK：Magic Mark；樣品1：對照，Shuffle T7溶菌產物(lysate)-無IPTG；樣品2：Origami 2溶菌產物±DTT；樣品3：Shuffle T7溶菌產物±DTT；樣品4：Shuffle T7表現溶菌產物±DTT；樣品5：BL21(DE3)±DTT。
圖2-共表現的BoNT/A1(0)及單鏈表現的BoNT/A1(0)之純化後的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS PAGE)。MK：Bench Mark；樣品1：共表現的BoNT/A1(0)；2：單鏈表現的BoNT/A1(0)；樣品3：還原的共表現的BoNT/A1(0)；樣品4：還原的單鏈表現的BoNT/A1(0)。
圖3 -Optim讀出值。於所有圖中，電泳道(lane)1係純化的單鏈表現的BoNT/A1(0)，電泳道2係純化的共表現的BoNT/A1(0)。圖3A)係螢光發射重心平均值(emission barycentric mean，BCM)中溫度依賴性偏移的量度。圖3B)係於266nm的靜態光散射(SLS)中溫度依賴性偏移的量度，且圖3C)係於473nm的(SLS)中的溫度依賴性偏移的量度。由每個分子的4個重複讀數顯示平均值及標準偏差。
圖4-SEC於280nm之讀出值，圖4顯示280nm的全刻度層析圖。已註記純化的共表現的BoNT/A1(0)及純化的單鏈表現的BoNT/A1(0)。
圖5-麩胺酸(glutamate)釋放試驗。該圖係以此等抑 制大鼠腦皮質神經元中麩胺酸釋放的能力來比較共表現的BoNT/A1(SXN104279-DK170710)對天然梭狀芽孢桿菌的BoNT/A1(LIST Biological Laboratories)。
[實施例]
實施例1-使用單一載體(雙重啟動子)方法的BoNT/A1(0)輕鏈及重鏈之共表現
設計引子以分別擴增endonegative的BoNT/A1(0)的輕鏈(表3-引子1及2)及重鏈(表3-引子3及4)，確保將終止密碼子併入輕鏈(LC)末端且將起始密碼子併入重鏈(HC)的開始處。亦包括限制位NcoI(fwrd)及BamHI(rev)，以使LC可連接到pETDuet載體(Millipore#71146)的MSC1中，而NdeI(fwrd)及XhoI(rev)係用於能夠將HC連接到MSC 2中。使用表4所示的BoNT/A1(0)模板DNA，以Q5 Hot start HF master mix(NEB#M0494S)擴增基因。然後將擴增的LC及pETDuet載體以NcoI(NEB#R3193)及BamHI(NEB#R3136)消化(digest)，並使用NEB T4 DNA連接酶(#M0202S)連接。
接著，以Xho1(NEB#R0146S)及Nde(NEB#R0111S)消化所得到的pETDuet/LC載體及擴增的HC基因並將其連接在一起，生成所欲的最終建構體。
為了測試BoNT/A1(0)的共表現，依指示將載體轉形到Shuffle T7((NEB#C3026H)、Shuffle T7表現細胞(NEB#C3029)、BL21(DE3)(C2527I)及Origami2細胞(Merks# 714083)，並將生成的菌落以microbank bead的方式儲存於-80℃。注意所有的選殖及轉形步驟係遵循製造商的說明書。
為了表現，對於每個隔夜培養物，於250ml附擋板的燒瓶中準備100ml之含有50μg/ml胺苄青黴素(Ampicillin)的經修改TB(modified TB)(mTB)(Melford #T1703)。對於每個細胞系，此等係以一個microbank bead 接種，並於30℃下隔夜生長20小時，同時以225rpm震盪。隔天，於接種10ml隔夜培養物的2.5L擋板燒瓶中，使用900ml之mTB+50μg/ml胺苄青黴素來準備主要培養物。藉由於30℃生長，同時以225rpm震盪，使細胞密度達到OD600為1。一旦達到所欲OD，在以1mM IPTG(Sigma#I6758)誘導之前，使溫度降至16℃(1小時)。於16℃下將表現培養物再培養20小時，然後以6000rpm、30分鐘來回收細胞。
使用25mM Tris、150mM NaCl pH8將來自表 現的回收細胞以6ml/g再懸浮，然後藉由於20Kpsi下通過恆定系統(Constant Systems)均質器一次來提取可溶性蛋白質。藉由以12000rpm離心30分鐘來移除細胞碎片，然後以西方墨點轉漬評估澄清的溶菌產物(圖1)。
簡言之，於還原的樣品，藉由ThermoFishers NuPAGE® LDS樣品緩衝液(4X)#NP0007+0.1M DTT(Sigma)以1：10稀釋澄清的溶菌產物；或者於非還原的樣品，藉由Novex®Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液(2x)#LC2676以1：10稀釋澄清的溶菌產物。於95℃加熱10分鐘後，使用4-12%Bis Tris丙烯醯胺膠體對此等樣品進行SDS PAGE電泳。於對BoNT/A1的LC或全長BoNT/A1-偏好對HC所產生的多株內部抗體(polyclonal in-house antibodies)之墨點轉漬之前，將蛋白質轉移至0.2μM硝酸纖維素膜。使用抗兔IgG-過氧化酶抗體(Sigma#A0545-1ML)偵測抗體結合，並使用Super Signal West Dura延長期間基質(extended duration substrate)來顯影。
圖1呈現的結果顯示相當於全長BoNT/A1(0)的150kDa的條帶(band)係存在於樣品2、3及5(亦以較低的程度存在於樣品4)，但於陰性對照中未見到。於DTT存在下不再見到150kDa蛋白質的事實證實了此點，雙硫鍵已被還原且現於圖1A中的50kDa可見LC及於圖1B中的100kDa可見HC。
此等結果證實於輕鏈及重鏈共表現後，BoNT/A1(0)雙硫橋聯之細胞內形成於所有菌株中皆為可 行的，並且當使用含有氧化性細胞質的表達菌株時，與當使用具有還原細胞質的菌株時(BL21(DE3))進行比較，係存在最小量的游離LC。
實施例2-於Shuffle T7細胞中輕鏈及重鏈共表現後之BoNT/A1(0)純化
在Shuffle T7細胞中再次共表現3公升BoNT/A1(0)培養物，並如實施例1所述進行溶菌。使用如下3個層析步驟，自澄清的溶菌產物中純化得到的全長BoNT/A1(0)：
步驟1：丁基HP(Butyl HP)
藉由加入25mM Tris、2M(NH4)2SO4 pH 8將澄清的溶菌產物稀釋一半，使(NH4)2SO4濃度達到1M。然後以150cm/hr將樣品裝載於經預平衡的10ml Butyl HP管柱(2x5ml HiTrap Butyl HP，GE Healthcare#28-4110-05)。於使用25mM Tris、1M(NH4)2SO4 pH 8的10倍管柱體積(CV)洗滌後，任何結合的蛋白質係透過降至25mM Tris、35mM NaCl pH8的25CV線性梯度而被洗提，以5ml 收集流分(fraction)。然後藉由SDS PAGE分析流分，並匯集此等含有目標毒素的流分。
步驟2：Q HP
將Butyl HP池(pool)進行緩衝液交換成低鹽緩衝液，使其可裝載於Q HP管柱。此係藉由使用HiPrep26/10脫鹽管柱(GE Healthcare，#17-5087-01)並按照製造商的說明書，進行數次緩衝液交換而成為25mM Tris、20mM NaCl pH8來達成。
然後將樣品以75cm/hr裝載至經預平衡的4.7ml HiScreen Q HP管柱(GE Healthcare，#28-9505-11)。以25mM Tris、20mM NaCl pH8進行5CV洗滌後，結合的蛋白質係透過升至25mM Tris、300mM NaCl pH8的25CV線性梯度而被洗提，以2.5ml收集流分。藉由SDSPAGE分析後，匯集含有目標蛋白質的流分。
步驟3：苯基HP(Phenyl HP)
藉由以25mM Tris、2M(NH4)2SO4 pH 8將樣品稀釋一半以使(NH4)2SO4達到1M，而將Q HP池調節用於Phenyl HP管柱。將樣品以150cm/hr裝載於經預平衡的1ml Phenyl HP(GE Healthcare#17-1351-01)管柱，然後以3 CV的25mM Tris、1M(NH4)2SO4 pH 8洗滌管柱。結合的蛋白質之洗提係使用降至25mM Tris、35mM NaCl pH8的25 CV線性梯度，以0.5ml收集流分。藉由SDS PAGE分析後，匯集含有目標蛋白質的流分，得到如圖2所示的最終產物。
單鏈重組BoNT/A1(0)亦被表現及純化以作為對照使用。為了達成此點，將BoNT/A1(0)(表4-LC+活化環+HC)插入pJ401中，使其可使用BLR(DE3)大腸桿菌表現株(Novagen#69053)而被表現為單鏈產物。
為了表現，於250ml附擋板燒瓶中準備含有30μg/ml康黴素(Kanamycin)的100ml經修改TB(mTB)(Melford#T1703)，以進行隔夜培養。其係以一個microbank bead接種，並在37℃下隔夜生長20小時，同時以225rpm震盪。隔天使用15×1L mTB+30μg/ml康黴素 於2.5L擋板燒瓶中準備主要培養物，每個接種10ml隔夜培養物。藉由於37℃下生長，同時以225rpm震盪，使細胞密度達到OD600為0.5。一旦達到所欲的OD，於以1mM IPTG(Sigma#I6758)誘導之前，將溫度降至16℃(1小時)。於16℃下將表現培養物再培養20小時，然後以5000rpm、20分鐘來回收細胞。
將回收的細胞以如共表現的BoNT/A1(0)的方式進行溶菌及毒素純化。僅有的2個差異在於以較大規模進行純化，及在第2管柱及第3管柱間活化步驟：200ml Butyl HP->53ml Q HP->活化(參見下文)->10ml Phenyl HP
活化階段-以92μg(0.8μg Lys-C/ml之樣品)之Lys-C(Sigma #P2289)將Q HP池(藉由A280為0.46mg/ml)於4℃保溫20小時。活化後，將樣品立即以25mM Tris pH8、2M(NH4)2SO4將其稀釋一半，使其可裝載至Phenyl HP，然後以如實施例1的方式繼續純化。
自Phenyl HP管柱得到的兩種最終產物係藉由SDS-PAGE分析(圖2)。簡言之，於還原的樣品，以ThermoFishers NuPAGE® LDS樣品緩衝液(4X)#NP0007+0.1M DTT(Sigma)將含有共表現及單鏈表現的BoNT/A1(0)稀釋至0.1mg/ml，或者於非還原的樣品，以Novex® Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液(2x)#LC2676將含有共表現及單鏈表現的BoNT/A1(0)稀釋至0.1mg/ml。使用包含附加活化階段的相同方法而純化的單鏈表現的BoNT/A1(0)係作為對照使用。將製備的SDS樣品於95℃加熱10分鐘 ，使用4-12%Bis Tris丙烯醯胺膠體對此等樣品進行SDS PAGE電泳。使用SimplyBlue SafeStain(Thermo Fisher# LC6065)染色1小時，然後隔夜進行去染。
於圖2所示的結果證實共表現的BoNT/A1(0)之純化為成功的，其係與單鏈表現的BoNT/A1(0)有相同的行為表現，暗示正確的折疊。
亦於Optim及粒徑篩析層析法(Size exclusion chromatography)(SEC)上比較純化的樣品，其中Optim係一種測量內在螢光及光散射的裝置，其給予折疊及穩定性的指示(圖3)；粒徑篩析層析法係用於尺寸及聚集的曲線圖(profile)(圖4)。
該Optim結果顯示共表現的BoNT A1(0)及單鏈表現的BoNT/A1(0)於266及473nm的BCM、SLS具有非常相似的轉移點，此等轉移點分別係熔解溫度及小粒子和大粒子聚集的讀出值。
SEC結果顯示共表現的BoNT A1(0)及單鏈表達的BoNT/A1(0)於兩者具有最小聚集的相同的單體峰。
實施例3-用以確認活性之BoNT/A1的共表現及麩胺酸釋放試驗
設計引子而使BoNT/A1(0)pETDUET共表現載體的LC域(SEQ ID NO 17)中的兩個殘基(Q224E/Y227H)突變，以恢復此域之對該蛋白質水解活性至關重要的鋅結合。所得到的pETDUET載體將共表現活性BoNT/A1 LC及HC，因此允許在細胞系的系統中確認效力。使用快速變化閃電誘變(quick change lightning mutagenesis) (#210514-Agilent technologies)，按照製造商的說明而導入突變。
將生成的載體轉形至Shuffle T7細胞，並如實施例1-BoNT/A1(0)之共表現及實施例2-共表現的BoNT/A1(0)之純化所述而進行表現/純化。注意該分子僅需要前兩個層析管柱Butyl HP及Q HP，因為其不需活化步驟。
然後於大鼠Ctx麩胺酸釋放試驗中測試共表現的全長BoNT/A1，其將藉由抑制作為BoNT活性的結果之麩胺酸釋放來確認轉位及snare切割。市售天然的BoNT/A1(LIST biological laboratories)係作為相對於共表現的BoNT/A1的對照使用。
麩胺酸釋放試驗顯示共表現的BoNT/A1係以相當於天然BoNT/A的效力而抑制麩胺酸釋放。因此，此證實共表現係製造完全活性的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的可行方法，該完全活性的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素能夠進行中毒之所有需要的步驟(於神經元終板(neuronal endplate)的結合及內化、輕鏈之自胞內體至細胞質中的轉位、及目標SNARE蛋白質的蛋白酶切割)。
[序列]
‧SEQ ID NO：1.BoNT/A1，登錄號A5HZZ9，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：2.BoNT/B1，登錄號B1INP5，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：3.BoNT/C1，登錄號P18640，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：4.BoNT/D，登錄號P19321，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：5.BoNT/E1，登錄號WP_003372387，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：6.BoNT/F1，登錄號Q57236,，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：7.BoNT/G，登錄號WP_039635782，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：8.TeNT，登錄號P04958，胺基酸序列。
‧SEQ ID NO：9.BoNT/A1，DNA。
‧SEQ ID NO：10.BoNT/B1，DNA。
‧SEQ ID NO：11.BoNT/C1，DNA。
‧SEQ ID NO：12.BoNT/D，DNA。
‧SEQ ID NO：13.BoNT/E1，DNA。
‧SEQ ID NO：14.BoNT/F1，DNA。
‧SEQ ID NO：15.BoNT/G，DNA。
‧SEQ ID NO：16.TeNT，DNA。
‧SEQ ID NO：17，DNA，BoNT/A1(0)LC
‧SEQ ID NO：18，DNA，BoNT/A1(0)活化環ACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAG
‧SEQ ID NO：19，DNA，BoNT/A1(0)HC
‧SEQ ID NO：20，DNA，引子ATACACCATGGTATGCCATTCGTCAACAAGCAATT
‧SEQ ID NO：21，DNA，引子 GCTTTTGGATCCGGTTTATTTGCTGGTGATGATACCGCGC
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<120> 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
<130> IBL 004-EP
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<170> Patentln版本3.5
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<213> 肉毒桿菌
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<400> 23

Claims (16)

  1. 一種製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，其包含於異源宿主細胞中分別表現編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係在該宿主細胞的氧化環境中被表現。
  2. 如請求項1之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。
  3. 如請求項2之方法，其中該氧化環境為該宿主原核細胞之細胞質。
  4. 如請求項2或3之方法，其中該原核細胞為下述原核細胞：其中與其他相同的野生型細胞相比，至少一個參與雙硫鍵形成的基因於細胞質中被過度表現；及/或與其他相同的野生型細胞相比，至少一個參與雙硫鍵還原的基因被壓制(repressed)。
  5. 如請求項4之方法，其中該原核細胞係來自選自下列株的大腸桿菌( E.coli)細胞：AD494、BL21trxB、Origami、Rosetta-gami及Shuffle株。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈係選自BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型或TeNT輕鏈，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈係選自BoNT A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型或TeNT重鏈。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及該梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈係來自相同的BoNT血清型或亞型。
  8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及該梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈係來自不同的BoNT血清型或亞型。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及該編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因係存在於相同載體。
  10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及該編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因係存在於不同載體。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之步驟。
  12. 一種細胞，其包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係於該細胞的氧化環境中被表現。
  13. 一種套組，其包含：a. 包含氧化環境的細胞，b. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因，及c. 編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因適合於在該細胞的該氧化環境中分別表現梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈及重鏈。
  14. 一種雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，其係藉由如請求項1至11中任一項之方法所獲得。
  15. 一種醫藥組成物，其包含如請求項14之雙鏈梭狀芽 孢桿菌神經毒素。
  16. 一種具有氧化性細胞質之宿主細胞用於製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之用途，其中該宿主細胞包含編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈之第一基因及編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之第二基因，其中該第一及第二基因係於該宿主細胞的氧化性細胞質中被表現。
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