JP2018510653A - キメラポリペプチド - Google Patents

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バーギン，デイヴィッド
スティーブン ハケット，ギャヴィン
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Abstract

本発明は、その活性化を改善するように修飾されている組換えクロストリジウム神経毒に関する。特に、本発明は、活性化ループが、同一血清型内の異なる亜型由来の活性化ループによって置換されているキメラクロストリジウム神経毒に関する。本発明はまた、このようなキメラクロストリジウム神経毒を製造する方法およびこのような修飾されたクロストリジウム神経毒を活性化する方法ならびにこのようなキメラクロストリジウム神経毒を発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞、このようなキメラクロストリジウム神経毒を含む組成物およびその使用に関する。【選択図】図5

Description

本発明は、その活性化を改善するように修飾されている組換えクロストリジウム神経毒に関する。特に、本発明は、活性化ループが、同一血清型内の異なる亜型由来の活性化ループによって置換されているキメラクロストリジウム神経毒に関する。本発明はまた、このようなキメラクロストリジウム神経毒を製造する方法およびこのような修飾されたクロストリジウム神経毒を活性化する方法ならびにこのようなキメラクロストリジウム神経毒を発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞、このようなキメラクロストリジウム神経毒を含む組成物およびその使用に関する。
クロストリジウム属の細菌は、高度に強力な特異的なタンパク質毒素を産生し、それらが送達されるニューロンおよびその他の細胞を毒し得る。このようなクロストリジウム毒素の例として、C.テタニ(tetani)によって産生される神経毒(TeNT)およびC.ボツリヌム(botulinum)によって産生される神経毒(BoNT)血清型A〜GならびにC.バラティ(baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)によって産生されるものが挙げられる。
BoNTは、いくつかのアクセサリータンパク質と複合体形成したBoNT自体からなる大きなタンパク質複合体の形態でC.ボツリヌム(botulinum)によって産生される。現在、少なくとも7種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびGがあり、そのすべてが、同様の構造および作用様式を共有する。恐らくは8番目の血清型、Hが最近報告された。異なるBoNT血清型は、特異的中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性パーセンテージと相関する。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸パーセンテージ配列同一性に基づいて異なる亜型にさらにわけられる。
BoNTは、既知の最も強力な毒素であり、血清型に応じて0.5〜5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。BoNTは、胃腸管を介して身体に入り、全身循環に入った後、コリン作動性神経末端のシナプス前膜と結合し、神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨げることができる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞関連膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C1、BoNT/AおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/C1は、シンタキシンを切断する。BoNTは、神経筋接合部で作用し、末梢神経系においてコリン作動性伝達を阻害し、TeNTは、中枢神経系で作用する。
天然では、クロストリジウム神経毒は、一本鎖ポリペプチドとして合成され、これが、タンパク質分解による切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結される2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、活性化部位と呼ばれることが多い特異的な切断部位で起こり、これは、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基の間に位置する。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。当該2鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H-鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L-鎖)である。H-鎖は、C末端ターゲティング成分(HCドメイン)およびN末端転位置成分(HNドメイン)を含む。切断部位は、L-鎖および転位置成分の間の活性化ループと呼ばれる露出されたループ領域中に位置する(図1および表1参照のこと)。HCドメインのその標的ニューロンとの結合およびエンドサイトーシスによる結合している毒素の細胞への内部移行後、HNドメインは、L-鎖をエンドサイトーシスされた膜を越えてサイトゾル中に転位置し、L-鎖は、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシン)として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク質分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002年)「Cell and Molecular Biology」(第4版) John Wiley & Sons、Incを参照のこと。アクロニムSNAREは、用語、可溶性NSF結合受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)(ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子を意味する)に由来する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合にとって、従って、細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌にとって不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。したがって、非細胞傷害性プロテアーゼは、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。クロストリジウム毒素のL-鎖プロテアーゼは、SNAREタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼである。
生理的条件下で、BoNT重鎖は、ニューロンガングリオシドと結合し(HCドメインを介して)、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の内部に受領される。エンドサイトーシスされる区画の酸性媒体中では、HNドメインは、小胞膜中に貫入し、孔を形成する。軽鎖(ジスルフィド橋によって重鎖と連結されている)は、ジスルフィド橋にアクセスし、それを還元する細胞内酸化還元系によって重鎖から切断され、その結果、軽鎖は最終的にサイトゾル中に放出される。
ボツリヌス神経毒は、弛緩性筋肉麻痺を引き起こすその能力についてよく知られている。SNAREタンパク質の遍在性を考慮して、BoNTなどのクロストリジウム毒素は、幅広い療法において成功裏に使用されてきた。例として、本発明者らは、William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004年)に言及し、これには、いくつかの治療的および美容的または審美的適用において神経伝達を阻害するために、ボツリヌス神経毒(BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gならびにテタヌス神経毒(TeNT)などのクロストリジウム毒素の使用が記載されている-例えば、市販のボツリヌス毒素製品が現在、限局性痙縮、上肢痙縮、下肢痙縮、頸部ジストニア、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、腋の多汗症、慢性片頭痛、神経因性排尿筋過活動、眉間の皴、重度の側面の眼角の皴などの適応症の治療薬として承認されている。さらに、神経筋障害を治療するために(US6,872,397を参照のこと)、子宮障害を治療するために(US2004/0175399を参照のこと)、潰瘍および胃食道逆流症を治療するために(US2004/0086531を参照のこと)、ジストニアを治療するために(US6,319,505を参照のこと)、眼の障害を治療するために(US2004/0234532を参照のこと)、眼瞼痙攣を治療するために(US2004/0151740を参照のこと)、斜視を治療するために(US2004/0126396を参照のこと)、疼痛を治療するために(US6,869,610、US6,641,820、US6,464,986およびUS6,113,915を参照のこと)、線維筋痛症を治療するために(US6,623,742、US2004/0062776を参照のこと)、腰痛を治療するために(US2004/0037852を参照のこと)、筋肉傷害を治療するために(US6,423,319を参照のこと)、副鼻腔炎性頭痛を治療するために(US6,838,434を参照のこと)、緊張性頭痛を治療するために(US6,776,992を参照のこと)、頭痛を治療するために(US6,458,365を参照のこと)、片頭痛性疼痛の低減のために(US5,714,469を参照のこと)、心血管疾患を治療するために(US6,767,544を参照のこと)、パーキンソン病などの神経疾患を治療するために(US6,620,415、US6,306,403を参照のこと)、精神神経系障害を治療するために(US2004/0180061、US2003/0211121を参照のこと)、内分泌障害を治療するために(US6,827,931を参照のこと)、甲状腺障害を治療するために(US6,740,321を参照のこと)、コリン作動性に影響を受ける汗腺障害を治療するために(US6,683,049を参照のこと)、糖尿病を治療するために(US6,337,075、US6,416,765を参照のこと)、膵臓障害を治療するために(US6,261,572、US6,143,306を参照のこと)、骨腫瘍などの癌を治療するために(US6,565,870、US6,368,605、US6,139,845、US2005/0031648を参照のこと)、耳の障害を治療するために(US6,358,926、US6,265,379を参照のこと)、胃腸筋肉障害およびその他の平滑筋機能不全などの自律神経障害を治療するために(US5,437,291を参照のこと)、皮膚細胞増殖性障害を伴う皮膚病変の治療のために(US5,670,484を参照のこと)、神経因性炎症性障害の管理のために(US6,063,768を参照のこと)、脱毛の低減および毛の成長を刺激するために(US6,299,893を参照のこと)、下向きに曲がった口を治療するために(US6,358,917を参照のこと)、食欲の低減のために(US2004/40253274を参照のこと)、歯の治療および処置のために(US2004/0115139を参照のこと)、神経筋障害および状態を治療するために(US2002/0010138を参照のこと)、種々の障害および状態および関連する疼痛を治療するために(US2004/0013692を参照のこと)、喘息およびCOPDなどの粘液分泌過多に起因する状態を治療するために(WO00/10598を参照のこと)、炎症、内分泌状態、外分泌状態、免疫学的状態、心血管状態、骨の状態などの非ニューロン性状態を治療するために(WO01/21213を参照のこと)、クロストリジウム毒素治療が記載されている。上記の刊行物のすべてが、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる。
現在、BoNTを含むすべての承認薬/および化粧品は、BoNT/A(例えば、DYSPORT(登録商標)、BOTOX(登録商標)、XEOMIN(登録商標))またはBoNT/B神経毒(例えば、MYOBLOC(登録商標))のいずれかを含有する。その他のBoNT血清型および亜血清型は、望ましい特性を有する可能性がある。しかし、これらのBoNTの一本鎖形態の活性化された二本鎖型への変換の困難性のために、それらの特性/BoNTを利用することは困難であり得る。
BoNT活性化を改善するこれまでの試みには、BoNTポリペプチド内の適当な位置に見られる天然に存在する切断部位を使用することによって、またはありふれた市販の外因性プロテアーゼのプロテアーゼ切断部位をBoNTポリペプチドへ遺伝子操作で挿入することによって、一本鎖BoNTポリペプチドを活性二本鎖形態に切断する異種(外因性)プロテアーゼの使用が含まれていた。
外因性プロテアーゼの使用の欠点は、プロテアーゼ特異性がないことであり、不適切な位置でのタンパク質分解による切断のために不活性毒素をもたらす。例えば、クロストリジウム神経毒の活性化のために最も広く使用されるプロテアーゼ、トリプシンは、血清型B(BoNT/B)およびE(BoNT/E)のクロストリジウム神経毒を活性化するために有用でありながら、おそらくは、重サブユニットのC末端近くのタンパク質分解作用によるその他の血清型の副次的生成物を生成すると思われ、したがって、その細胞性受容体とのBoNT結合を破壊し得る。したがって、いくつかのBoNTの一本鎖形態を活性二本鎖形態へ変換するこのような方法は、非効率的であり、厄介であり、および/またはより高い全製造コストにつながる。
BoNT/A活性化ループは、亜型の間で高度に保存されている(図1を参照のこと)。また、効率的なBoNTアクチベーターであることは最も研究され、よく理解され、知られている。結果として、従来の知識に基づいて、BoNT活性化を改善しようとするその他のこれまでの試みは、所与のBoNT内の野生型切断部位を、BoNT血清型Aに由来する切断部位で置換すること、例えば、BoNT/B切断部位を含むBoNT/B活性化ループを、BoNT/A切断部位を含むBoNT/A活性化ループと置換することを含んでいた。
Kalb S.R.ら、Applied and environmental microbiology第77巻 第4号(2011年):1301〜1308頁
本発明者らは、天然BoNTの潜在的に望ましい特性は、いくつかの組換え亜型の不十分な活性化のために利用および/または評価することが困難であり得るという問題を解決した。特に、本発明者らは、天然BoNT/F7活性化ループが、BoNT/F1活性化ループで置換されている組換えボツリヌス毒素F7(rBoNT/F7-1)を作製した。BoNT/F7は、BoNT/F1と比較して異なる様式の基質結合を有する(Kalb S.R.ら、Applied and environmental microbiology第77巻 第4号(2011年):1301〜1308頁)。したがって、本発明者らは、BoNT/F7が、BoNT/F1と比較して差別化された機能的特性(効力など)を有するか否かを調べようとしたが、容易に活性化されないとわかった。本発明者らは、驚くべきことに、F7由来の機能的ドメインを、F1由来の活性化ループと組み合わせることによってこの問題を解決した。本発明者らはまた、驚くべきことに、このように得られたキメラBoNT/F7-1は、BoNT/F1と比較して、改善された特性、特に、改善された効力を有することを見い出した。
したがって、本発明者らは、天然に存在するBoNTタンパク質内で進化したが、それ自体は、組換えタンパク質としての製造を受け入れにくい、望ましい機能的ドメインを含有する十分に活性化された精製された組換えボツリヌス神経毒(BoNT)タンパク質を作製するための新規方法を開発した。本発明者らは、良好な活性化を示す特定のBoNT血清型の亜型(BoNT/Fによって例示される)に由来する活性化ループを、不十分にしか活性化しない点を除いて、可能性ある新規薬物として魅力的である同一血清型由来の亜型に組み合わせて含有するキメラBoNTを作製することによって、これを達成した。
本発明者らはまた、BoNT/Fを上回る差別化特性、特に、療法において使用するために望ましい特徴であるより高い効力を有する新規キメラBoNT/F7-1を提供した。
したがって、本発明は、第1のボツリヌス神経毒血清型F(BoNT/F)亜型由来のLHN骨格および異なるBoNT/F亜型由来の活性化ループ領域を含むキメラポリペプチドを提供する。ポリペプチドのLHN骨格は、配列番号17〜32のうちの少なくとも1種と少なくとも60％の配列同一性を有し得る。通常、ポリペプチドのLHN骨格は、(a)配列番号33〜48のうちの少なくとも1種と少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列および/または(b)配列番号49〜64のうちの少なくとも1種と少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、ポリペプチドのLHN骨格は、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型に由来する。
本発明のポリペプチドの活性化ループは、コンセンサス配列KSIIPKGTKAPPRL(配列番号65)に適合するアミノ酸配列またはコンセンサス配列において5個以下のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列を通常含む。活性化ループは、BoNT/F1亜型、BoNT/F2亜型、BoNT/F3亜型、BoNT/F4またはBoNT/F6亜型に由来し得る。一実施形態では、活性化ループは、KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)、KSIIPRKGTKQSPSL(配列番号67)またはKSIIPRKGTKAPPRL(配列番号65)から選択されるアミノ酸配列を含む。
通常、本発明のLHN骨格は、BoNT/F7亜型に由来し、BoNT/F活性化ループは、KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)のアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、ポリペプチドは、通常、BoNT/F活性化ループ内に、エンドペプチダーゼによって特異的に認識され、切断(cleaved)(または切断(cut))される切断部位を含む。エンドペプチダーゼによる切断は、通常、活性ホロ毒素の形成をもたらす。
本発明はさらに、(a)配列番号33〜48のうちの少なくとも1種と少なくとも40％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび(b)配列番号49〜64のうちの少なくとも1種と少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHNポリペプチドを含み、該HNポリペプチドのN末端が、該HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型由来のアミノ酸残基を含むキメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドを提供する。通常、HNポリペプチド配列のN末端アミノ酸残基は、AまたはQである。HNポリペプチド配列のN末端は、APPRLCIK(配列番号70)、APPRLCIT(配列番号71)、QSPSLCIK(配列番号72)およびQSPSLCIT(配列番号73)からなる群から選択されるアミノ酸モチーフで始まり得る。二本鎖ポリペプチドの軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列は、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型由来であり得る。
本発明の二本鎖ポリペプチドは、通常、本明細書に記載されるような本発明の一本鎖ポリペプチドから得られる。
本発明のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドは、ターゲティング部分の細胞との直接的な結合による、またはターゲティング部分の、細胞と結合するリガンド(単数または複数)との結合による、ポリペプチドの細胞との結合に適しているターゲティング部分をさらに含み得る。ターゲティング部分は、クロストリジウム神経毒由来のターゲティング部分であり得る。あるいは、ターゲティング部分は、非クロストリジウムターゲティング部分であり得る。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、プロモーターと作動可能に連結している本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
本発明はまた、細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるステップおよび発現されたポリペプチドを回収するステップを含む、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。前記方法は、前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップをさらに含み得る。
本発明はまた、前記ポリペプチドをエンドペプチダーゼとともにインキュベートすることを含む、本発明のポリペプチドを活性化する方法を提供し、ここで、BoNT/F活性化ループ中のポリペプチドの切断が、該ポリペプチドを一本鎖ポリペプチドから二本鎖ポリペプチドに変換し、それによって、ポリペプチドを活性化する。通常、前記エンドペプチダーゼは、Lys-Cである。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを発現する細胞を提供する。前記細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含み得る。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
本発明はまた、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療する方法において使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
本発明はまた、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療するための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを含有する美容用組成物を提供する。前記美容用組成物は、美容上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を予防または軽減するための本発明の美容用組成物の使用を提供する。
本発明はさらに、BoNT/F1亜型に由来する骨格およびBoNT/F7亜型に由来する活性化ループ領域を含むキメラBoNT/F7-1を提供する。
好ましい実施態様によれば、本発明のキメラBoNT/F7-1は、療法において使用するためのものである。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を予防または軽減するための本発明のキメラBoNT/F7-1の使用を提供する。
全てのBoNT/A亜型およびすべてのBoNT/F亜型の活性化ループ配列のアラインメントを示す図である。各亜型の活性化配列に下線が引かれている。活性化ループ内の点線は、種々のBoNT/AおよびBoNT/F亜型間のアラインメントを促進するように、アラインメントプロセスの一部として導入されたギャップに対応する。 配列アラインメントに基づいたBoNT/Fタンパク質配列の系統発生解析を示す図である。 個々のBoNT/F配列間の配列同一性パーセンテージおよび配列相違パーセンテージを示す表である。 UniParc BLASTにおいて同定されたすべての非重複性(非冗長性)BoNT/Fアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。軽鎖は、太字で示されており、活性化ループは、二重の下線が引かれており、ベルト配列は、点線で下線が引かれており、HNドメインはイタリック体であり、HCNドメインは、一重の下線が引かれており、HCCドメインは、破線で下線が引かれている。個々のBoNT/F配列内の点線は、異なるBoNT/F亜型間のアラインメントを促進するように、アラインメントプロセスの一部として導入されたギャップに対応する。 rBoNT/F1、rBoNT/F7およびrBoNT/F7-1の模式図を示す。 rBoNT/F1(UPI00000B66D1)、rBoNT/F7(UPI0001DE3DAC)およびrBoNT/F7-1の全長配列のアラインメントを示す図である。軽鎖は、太字で示されており、活性化ループは、二重の下線が引かれており、ベルト配列は、点線で下線が引かれており、HNドメインはイタリック体であり、HCNドメインは、一重の下線が引かれており、HCCドメインは破線で下線が引かれている。 精製キメラrBoNT/F7-1SXN102875バッチDB131202のSDS PAGEゲルを示す図であり(レーン1:分子量マーカー;レーン2:酸化(oxidised, Ox.)rBoNT/F7-1サンプル;レーン3:還元(reduced, Red.)rBoNT/F7-1サンプル)、レーンあたり1μgのタンパク質をロードした。 rBoNT/F7-1のN末端プロセシングを示す図である。図8Aは、活性化ループ内の切断部位を同定する模式図である。図8Bは、活性化された二本鎖rBoNT/F7-1の存在を確認するSDS-PAGEゲルである。図8Cは、N末端配列決定の結果を示す。図8Dは、異なるBoNT/F亜型の軽鎖のC末端、活性化ループおよびHNドメインのN末端を含む部分のアラインメントである。活性化ループのネックを形成するシステイン残基は、太字で、下線が引かれている。rBoNT/F7-1HNドメインのN末端に見られるBoNT/F1残基は、太字で、イタリック体で影が付けられている。 精製キメラrBoNT/F7-1の細胞不含プロテアーゼ活性を示す図である。組換え基質タンパク質VAMP-22-94-GFPを、組換え(rBoNT/F7-1)または天然(nBoNT/F)BoNT/Fのいずれかとともに37℃で30分間インキュベートし、その後、反応を停止し、逆相クロマトグラフィーによって解析した。図9Aは、基質(VAMP-22-94-GFP)が、生成物(VAMP22-58およびVAMP-259-94GFP)に変換される切断反応を示す図である。パネル図9Bは、停止された反応ミックス中に存在する切断されていない基質および切断されたVAMP-259-94-GFP生成物を定量するための例示的クロマトグラムを示す。図9Cは、組換えおよび天然BoNT/Fタンパク質の、生成物に変換された基質の割合および算出された比活性(時間あたり、pmol BoNTあたり、生成物に変換されるnmol基質)の例を示す。 キメラrBoNT/F7-1によるSCN Gly放出の阻害を示す図である。培養初代脊髄ニューロン(spinal cord neuron, SCN)を、種々の濃度の組換え(rBoNT/F7-1)または天然(Met/F/080116/MET)BoNT/Fに24時間曝露し、次いで、放射標識グリシン([3H]-グリシン)とともにロードし、脱分極し(高カリウムバッファーを用いて)、神経伝達物質(グリシン)放出を刺激した。 キメラrBoNT/F7-1によるex-vivo筋肉収縮の阻害を示す図である。単離横隔神経/片側横隔膜組織調製物を組織浴中にセットした。片側横隔膜筋肉を力変換器に取り付け(収縮を測定するために)、横隔神経を1Hzで電気刺激した(筋肉収縮を刺激するために)。100pM BoNT/Fの添加後、収縮力を、最大100分の期間継続的に測定した。力の低減(対照と比較して)を時間に対してプロットし、BoNTの添加から、収縮力の50％低減までに必要な時間をt50として記録した。 マウス指外転スコアリング(Digit Abduction Scoring)アッセイを示す図である。マウスに、短期間の全身麻酔下で一方の後肢の腓腹筋-ヒラメ筋複合筋肉中に注射を施し、筋肉弱体化を、指外転スコア(DAS)を使用して0〜4スケールで測定した。DAS最大値を、各用量で決定し、用量に対してプロットし、データを4-パラメータロジスティック方程式に適合させ、ED50およびDAS4(DAS4用量)値につながる用量を決定した(表を参照のこと)。
ボツリヌス毒素(BoNT)
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、いくつかのアクセサリータンパク質と複合体形成したBoNT自体からなる大きなタンパク質複合体の形態でC.ボツリヌム(botulinum)によって産生される。現在、8種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、GおよびHがあり、そのすべてが、同様の構造および作用様式を共有する。異なるBoNT血清型は、特異的中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性パーセンテージと相関する。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸パーセンテージ配列同一性に基づいて異なる亜型にさらにわけられる。
BoNTは、胃腸管において吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経末端のシナプス前膜と結合し、その神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨げる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞関連膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C1、BoNT/AおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し;BoNT/C1は、シンタキシンを切断する。
TeNTは、C.テタニ(tetani)によって単一血清型で産生される。C.ブチリカム(butyricum)は、BoNT/Eを産生し、C.バラティ(baratii)は、BoNT/Fを産生する。
本発明は、キメラBoNT LHNドメインを含むポリペプチドを提供し、そのようにしてまた、キメラクロストリジウム毒素を包含する。用語「クロストリジウム毒素」はまた、限定されるものではないが、以下に記載されるものを含む、修飾されたクロストリジウム毒素およびその誘導体を包含するものとする。修飾されたクロストリジウム毒素または誘導体は、クロストリジウム毒素の天然の(非修飾)形態と比較して修飾されている、1個以上のアミノ酸を含有し得、またはクロストリジウム毒素の天然の(非修飾)形態には存在しない1個以上の挿入されたアミノ酸を含有し得る。例として、修飾されたクロストリジウム毒素は、天然(非修飾)クロストリジウム毒素配列と比較して1つ以上のドメイン中の修飾されたアミノ酸配列を有し得る。このような修飾は、毒素の機能的態様、例えば、生物活性または残留性を修飾し得る。したがって、一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム毒素は、改変修飾クロストリジウム毒素または改変修飾クロストリジウム毒素誘導体または改変クロストリジウム毒素誘導体である。
特定のBoNT血清型への本明細書における言及は、通常、反対に明記されない限り、その血清型内のすべての亜型を指す。
本発明者らは、アミノ酸配列が公知であるBoNT血清型のすべての亜型について、活性化ループまたは二本鎖ループとして知られる、BoNT軽鎖および重鎖内の露出したループ領域を解析した。より詳細には、本発明者らは、UniParcデータベースにおいて同定された(重複性配列を除去する)すべての全長BoNTタンパク質の活性化ループ配列をアラインし、注釈をつけた。すべてのBoNT/AおよびBoNT/F亜型に由来する注釈がつけられたアラインメントが、図1に示されている。本発明者らは、驚くべきことに、BoNT/F亜型は、アラインされたすべての亜型のうち、最も多様な活性化ループを有することを見出した。
天然に存在するBoNTタンパク質は、C.ボツリヌム(botulinum)細菌内で、一本鎖、前駆体タンパク質として産生される。一本鎖形態は、活性化ループ内の切断(本明細書においてタンパク質分解とも呼ばれる)によって翻訳後修飾されるようになり、完全に活性な成熟二本鎖BoNTタンパク質を生じる。本発明者らは、これまでに、大腸菌において一本鎖前駆体タンパク質として組換えBoNTタンパク質を製造し、次いで、精製一本鎖BoNTで翻訳後タンパク質分解ステップを実施した。良好な活性化は、天然に存在するタンパク質と同一部位での特異的タンパク質分解と定義され、組換えBoNT内のその他の部位ではないとする場合、残念ながら、すべての精製組換えBoNTタンパク質が良好な活性化を示すわけではない。例えば、天然に存在するBoNTタンパク質、亜型BoNT/F7は、これまでに試験されたすべてのプロテアーゼによって複数の部位でタンパク質分解されたものとなる。本発明者らは、所望のタンパク質分解による切断の部位を含有する領域(活性化ループと呼ばれる)が、亜型F7から除去され、別の高度に関連するBoNT(亜型BoNT/F1と呼ばれる)に由来する同等領域で置換されたキメラタンパク質を構築することによって、問題(亜型BoNT/F7を活性化する)を解決した。本発明者らは、これまでに、亜型BoNT/F1が部位特異的に活性化されるようになる条件を同定した。したがって、本発明者らは、BoNT/F7の活性化ループを、BoNT/F1の活性化ループで置換することによって、BoNT亜型の活性化ループを、同一血清型に由来する別のBoNT亜型に由来する活性化ループと置換することによって、良好な活性化特性を有する組換えBoNTを作製することが可能であることを実証した。理論に捉われるものではないが、この血清型内活性化ループ交換は、異なるBoNT/F亜型の活性化ループ間の配列の相違のためにBoNT/F亜型と特に関連していると考えられる。本発明はまた、(活性化された)キメラ二本鎖ポリペプチドを提供する。これらの二本鎖ポリペプチドは、LHN骨格が由来するBoNT/F亜型に由来するアミノ酸配列および活性化ループが由来するBoNT/F亜型に由来するアミノ酸配列の両方を含有するので、それ自体キメラである。したがって、得られたキメラ二本鎖は、LHN骨格が由来するBoNT/F亜型にも、活性化ループが由来するBoNT/F亜型にも見られない独特のアミノ酸配列を有する。本発明のキメラ二本鎖ポリペプチドは、通常、本発明のキメラ一本鎖ポリペプチドの切断によって産生される。
したがって、本発明は、望ましい特性を有する機能ドメインが、組換え形態で容易に発現、精製および活性化されないタンパク質内で進化した場合でさえ、当該ドメインを含有する十分に活性な精製組換えキメラBoNTを作製する手段を提供する。
したがって、本発明は、第1のボツリヌス神経毒血清型F(BoNT/F)亜型に由来するLHN骨格および異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ領域を含むキメラ一本鎖ポリペプチドを提供する。
本発明との関連で、用語「キメラポリペプチド」は、2種の異なるBoNT/F亜型に由来する成分部分を含むものである。特に、本発明のキメラ一本鎖ポリペプチドは、第1のBoNT/F亜型に由来するLHN骨格および異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ領域を含む。キメラ二本鎖ポリペプチドは、本明細書に記載されるように、第1のBoNT/F亜型のLHN骨格に由来するアミノ酸配列および第2のBoNT/F亜型の活性化ループに由来するアミノ酸配列を含有する。
天然に存在するBoNT/F血清型タンパク質は、7種の亜型(図2)に分類される。BoNT/Fの軽鎖は、プロテアーゼ機能(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)を提供する。特に、BoNT/F軽鎖は、メタロプロテアーゼ活性を実証し、細胞性開口分泌に関与する小胞および/または細胞膜結合タンパク質をタンパク質分解切断可能である。通常、すべてのBoNT/F亜型軽鎖の基質は、小胞結合型膜タンパク質1、2および3(VAMP1、VAMP2およびVAMP3)である。BoNT軽鎖またはBoNT/F LHN骨格のプロテアーゼ活性は、任意の適当な技術によって決定できる。軽鎖またはその断片または変異体の切断活性を決定するための標準技術は、当技術分野で公知であり、例えば、マウス片側横隔膜アッセイ(hemidiaphragm assay, HDA)またはSNARE切断アッセイがある(例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれるWO95/33850およびMasuyer G、Beard M、Cadd VA、Chaddock JA、Acharya KR;Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B; J Struct Biol. 2011年4月;第174巻(l号):52〜7頁を参照のこと)。
異なるBoNTを命名して複数の血清型へ分けることは、アミノ酸配列によって定義されるのではなく、血清学的手段によって決定される。実際、BoNTの血清型A、B、C、D、EおよびFへの分類は、単に、標準マウス生物検定法[参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Botulism in the United States、1899〜1996年、Handbook for epidemiologists, clinicians, and laboratory workers; Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Infectious Diseases, Division of Bacterial and Mycotic Diseases、1998年]において、アメリカ疾病管理予防センター(US government Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)によって配布される一価抗毒素のセットによる中和に対するその感受性に基づき、それによって定義される。この関連で、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、BoNT血清型を定義および区別するために血清学的手段が使用されることを開示する、Dezfulian and Bartlett J.Clin.Microbiol.第21巻(2号):231〜233頁またはLindstrom and Korkeala Clin.Microbiol.Rev.第19巻(2号):298〜314頁、2006年も参照のこと。
したがって、本明細書におけるBoNT/Fへの言及は、上記のような参照抗F血清型一価抗毒素によって中和されるBoNTへの言及である。したがって、通常、本発明のLHN骨格は、(a)参照抗F血清型一価抗毒素によって中和されるBoNTに由来する軽鎖ポリペプチド配列および(b)参照抗F血清型一価抗毒素によって中和されるBoNTに由来するHNポリペプチド配列を含む。本発明のキメラ二本鎖ポリペプチドは、本明細書において記載されるような参照抗F血清型一価抗毒素によって中和され得る。本発明の一実施形態では、用語「BoNT/F」は、BoNT/FおよびBoNT/Aのハイブリッドであると考えられる、最近同定されたBoNT/HなどのBoNT/Fハイブリッド分子を包含する。
本発明のLHN骨格の軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列および/または本発明の二本鎖ポリペプチドも、本明細書に記載されるような公知のBoNT/F亜型に対するその配列同一性の点で定義され得る。
本発明によれば、BoNT/F LHN骨格は、BoNT/F軽鎖およびHNドメインを含むBoNT/F神経毒の領域として定義され得る。本明細書において、用語LHN骨格はまた、BoNT/F軽鎖の機能的断片もしくは変異体および/またはBoNT/F HNドメインの機能的断片もしくは変異体を含むLHN骨格を包含する。BoNT/F HNドメインの機能的断片または変異体は、全長BoNT/F HNドメインの転位置活性を保持する。BoNT/F軽鎖の機能的断片または変異体は、本明細書において定義されるような全長軽鎖の切断活性を保持する。言い換えれば、機能的BoNT/F軽鎖断片または変異体は、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的にターゲティングでき、したがって、BoNT/F毒素が基質をタンパク質分解性に切断する全体的な細胞機序の実行に関与する。BoNT/F LHN骨格中に含まれるようなBoNT/F軽鎖の変異体は、天然(非修飾)軽鎖の切断活性を保持するという条件で、BoNT/F軽鎖と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％の配列同一性を有し得る。
BoNT/F軽鎖の機能的断片は、全長軽鎖の活性を保持する最も短い可能なBoNT/F軽鎖配列、すなわち、本明細書に定義されるような最小BoNT/F軽鎖断片を含む。同様に、BoNT/F HNドメインの機能的断片は、全長HNドメインの活性を保持する最も短い可能なBoNT/F HNドメイン配列、すなわち、本明細書に定義されるような最小BoNT/F HNドメイン断片を含む。
本発明のBoNT/F LHN骨格は、BoNT/F軽鎖配列のアミノ酸配列中の1つ以上の修飾、例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン中の修飾を有し得る。当該修飾は、修飾された軽鎖の基質特異性を変更もしくは修飾し得る、および/または修飾された軽鎖活性の効力および/または持続期間を修飾するなど、修飾された軽鎖の活性を変更もしくは修飾する。このような修飾された軽鎖は、参照軽鎖よりも高いもしくは低い活性(効力)および/または長いもしくは短い持続期間を有し得る。前記参照軽鎖は、通常、対応する軽鎖の天然(非修飾)型である。
例えば、その他のBoNT/F配列と比較した、天然に存在するBoNT/F亜型の1種(亜型F5)の軽鎖配列内のアミノ酸の相違は、BoNT/F5がVAMP2のどのペプチド結合を切断するかという相違(その他のBoNT/F亜型(Q58-K59の間を切断する)と比較してL54-E55)の根底にある[参照により本明細書に組み込まれる、Kalb SR、Baudys J、Webb RP、Wright P、Smith TJ、Smith LA、Fernandez R、Raphael BH、Maslanka SE、Pirkle JL、Barr JR.; FEBS Lett. 2012年1月20日;第586巻(2号):109〜15頁;Discovery of a novel enzymatic cleavage site for botulinum neurotoxin F5]。別の例として、軽鎖配列は、PEG化され得、これは、修飾された軽鎖活性の持続期間を増大する(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、WO2007/104567を参照のこと)。軽鎖配列は、分解配列を含有し得、またはユビキチン化され得、これは、修飾された軽鎖の活性の持続期間を低減する(例えば、各々、参照により組み込まれる、WO2011/000929、WO2013/017522、WO2013/068476、WO2014/029497およびR.V. Kukrejaら、Biochim Biophys Acta.(2007年)第1774巻(2号):213〜22頁を参照のこと)。軽鎖配列は、例えば、基質認識ポケットを最適化することによって、効力を増大するように修飾され得る(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Guoら2013年、Toxicon第74巻:158〜166頁)。
クロストリジウム毒素の軽鎖は、およそ420〜460個のアミノ酸長であり、酵素ドメインを含む。通常、全長BoNT/F軽鎖は、430個のアミノ酸長である(配列番号1〜16のいずれか1種の残基1〜430に対応する位置のアミノ酸など。全長BoNT/Fコンセンサス配列の配列番号1を含む。)。したがって、BoNT/F軽鎖への本明細書における言及は、配列番号1の残基1〜430に対応するアミノ酸を含む、またはからなるアミノ酸配列と関連し得る。そのようなアミノ酸残基として、配列番号1のアミノ酸残基1〜430に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種に由来する、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基(図4または表1に示されるような)またはその変異体が挙げられる。
研究によって、クロストリジウム毒素軽鎖の全長は、酵素ドメインの酵素活性にとって必要ではないということが示されている。したがって、LHN骨格中に含まれるようなBoNT/F軽鎖の断片は、天然(非修飾)軽鎖の切断活性を保持するという条件で、BoNT/F軽鎖由来の少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも250個、少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個またはそれ以上の連続または非連続アミノ酸を含み得る。通常、BoNT/F軽鎖の断片は、BoNT/F軽鎖由来の少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む。本発明のLHN骨格の軽鎖部分は、それ自体、コンセンサス配列の配列番号1のアミノ酸残基15〜412に対応する、配列番号1〜16のいずれか1種の残基15〜412または配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基(例えば、表1を参照のこと)またはその変異体を含むまたはからなり得る、最小BoNT/F軽鎖断片を含み得るまたはからなり得る。本発明の適した軽鎖断片は、本明細書において図4および6に太字で示されている。本発明の軽鎖断片は、(非重複性BoNT/F配列の最小軽鎖断片を定義する)配列番号33〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45のアミノ酸配列またはその変異体を含み得るまたはからなり得る。
BoNT/F軽鎖の変異体は、参照BoNT/F軽鎖の切断活性を保持するという条件で、参照BoNT/F軽鎖と少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。通常、参照軽鎖ドメインまたは断片は、天然(非修飾)BoNT/F軽鎖である。
用語、断片はまた、本明細書に記載されるBoNT/F軽鎖変異体と関連する。したがって、例として、本発明のBoNT/F軽鎖断片は、少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個またはそれ以上の連続アミノ酸を有し得、ここで、BoNT/F軽鎖アミノ酸配列は、参照BoNT/F軽鎖に由来する対応するペプチド配列にわたって、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する。したがって、変異体BoNT/F軽鎖断片は、本明細書において開示される任意のBoNT/F軽鎖断片に対して、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
好ましい実施形態では、BoNT/F軽鎖またはその軽鎖断片または変異体は、BoNT/F7またはBoNT/F5由来である。したがって、本発明のBoNT/F軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1〜430に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種に由来するアミノ酸配列を含み得るまたはからなり得る。例えば、本発明のBoNT/F軽鎖は、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基1〜421または配列番号8のアミノ酸残基1〜428またはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。
好ましくは、本発明のLHN骨格は、BoNT/F7またはBoNT/F5由来の最小軽鎖断片を含むまたはからなる軽鎖断片を含む。したがって、本発明のBoNT/F軽鎖は、配列番号1のアミノ酸15〜412に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列を含み得るまたはからなり得る。例えば、本発明のBoNT/F軽鎖は、配列番号13〜16のいずれか1種の(好ましくは、配列番号13に由来する)アミノ酸残基15〜403または配列番号8のアミノ酸残基15〜410またはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。BoNT/F7またはBoNT/F5由来の最小軽鎖断片は、配列番号40または45〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45のアミノ酸配列またはその変異体を含み得るまたはからなり得る。
本発明のLHN骨格は、通常、配列番号33〜48のうち少なくとも1種、好ましくは、配列番号40または45〜48のうち少なくとも1種と、より好ましくは、配列番号45と少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)軽鎖ポリペプチド配列を含む。
BoNT/F亜型1、2、6および7はすべて、VAMP2を同一ペプチド結合で、すなわち、ヒトタンパク質中のQ58-K59の間で切断するが(参照により本明細書に組み込まれる、Kalbら(2011年)App.Enviro.Microbiol.第77巻(4号):1301〜8頁を参照のこと)、BoNT/F5は、L54-E55間の異なるペプチド結合を切断する(参照によって本明細書に組み込まれる、Kalbら(2012年)FEBS Lett.第586巻(2号):109〜115頁を参照のこと)という証拠がある。
本発明のLHN骨格は、配列番号1〜16のいずれか1種の残基1〜873に対応するアミノ酸残基を含むまたはからなるアミノ酸配列と、または、配列番号1のコンセンサス配列のアミノ酸残基1〜873に対応する(例えば、表1を参照)、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基を含むまたはからなるアミノ酸配列と、またはその変異体と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る:ここで、配列番号1〜16のいずれか1種の配列内の活性化ループ配列は、異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ配列(例示的活性化ループ配列は、本明細書に開示されている)によって置換される。
本発明のLHN骨格は、本明細書に開示されるような最小軽鎖およびHNドメイン断片を含む最小LHN骨格であり得る。したがって、本発明の最小LHN骨格は、配列番号1〜16のいずれか1種の残基15〜850に対応するアミノ酸残基、または、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来する、配列番号1のコンセンサス配列のアミノ酸残基15〜850(図4に示されるような)に対応するアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基、または、その変異体を含むまたはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る:ここで、配列番号1〜16のいずれか1種の配列内の活性化ループ配列は、異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ配列によって置換されている。
例えば、本発明のLHN骨格は、配列番号17〜32のいずれか1種(ここで、配列番号17は、BoNT/F LHNドメインコンセンサス配列である)、好ましくは、配列番号29と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性またはより高い配列同一性を有し得る。
好ましくは、本発明のLHN骨格は、BoNT/F7またはBoNT/F5由来の軽鎖断片およびHNドメインを含む。したがって、本発明のLHN骨格は、配列番号1のアミノ酸1〜873、より好ましくは、アミノ酸15〜850に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種に由来する、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列を含み得るまたはからなり得る。例えば、本発明のBoNT/F LHN骨格は、配列番号8または13〜16のいずれか1種(好ましくは、配列番号13)の配列内の活性化ループ配列が、本明細書において開示される異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ配列によって置換されるという条件で、配列番号13〜16のいずれか1種(好ましくは、配列番号13)のアミノ酸残基1〜862、より好ましくは、アミノ酸残基15〜839または配列番号8のアミノ酸残基1〜868、より好ましくは、15〜845、またはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。
好ましい実施形態では、本発明のLHN骨格は、配列番号1〜16のいずれか1種の配列内の活性化ループ配列が、異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループ配列によって置換されるという条件で、配列番号24または29〜32の少なくとも1種、好ましくは、配列番号29と、少なくとも60％またはそれ以上の配列同一性を有する。
通常、本発明の変異体LHN骨格は、本明細書において定義されるLHN骨格配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する。限定されない例として、本発明の変異体LHN骨格は、配列番号24または29〜32の少なくとも1種、好ましくは、配列番号29と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
本発明のLHN骨格は、通常、本明細書において開示されるようなBoNT/F軽鎖断片およびHNドメイン、好ましくは、本明細書において開示されるような最小BoNT/F軽鎖ポリペプチド配列および最小HNドメイン断片を含む。
クロストリジウム毒素のHNドメインは、およそ300〜400個のアミノ酸長であり、転位置ドメインを含む。通常、全長BoNT/F HNドメインは、およそ350個のアミノ酸長である(例えば、全長BoNT/Fコンセンサス配列の配列番号1を含む、配列番号1〜16のいずれか1種の残基520〜873に対応するアミノ酸位置)。したがって、本明細書におけるBoNT/F HNドメインへの言及は、配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応する(図4および表1に示されるような)配列番号2〜16のいずれか1種に由来するアミノ酸残基またはその変異体などの、配列番号1の残基520〜873に対応するアミノ酸を含むまたはからなるアミノ酸配列と関連し得る。
本発明によれば、BoNT/F LHN骨格は、BoNT/F HNドメインを含む。本明細書において、用語LHN骨格はまた、BoNT/F HNドメインの機能的断片または変異体を含むLHN骨格を包含する。BoNT/F HNドメインの機能的断片または変異体は、本明細書において定義されるような全長HNドメインの転位置活性を保持する。言い換えれば、機能的BoNT/F HNドメイン断片または変異体は、低pHの条件下で、脂質膜(例えば、エンドソーム膜)中にイオン透過性孔を形成可能であり、BoNT/F軽鎖がエンドソームを逃れることが可能となる。
したがって、LHN骨格中に含まれるようなBoNT/F HNドメインの断片は、参照HNドメインの転位置活性を保持するという条件で、BoNT/F HNドメイン由来の少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも250個、少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個またはそれ以上の連続または非連続アミノ酸を含み得る。参照HNドメインは、天然(非修飾)HNドメインであり得る。通常、BoNT/F HNドメインの断片は、BoNT/F HNドメイン由来の少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む。
本発明のLHN骨格のHNドメイン部分は、最小BoNT/F HNドメイン断片を含み得るまたはからなり得る。最小BoNT/F HNドメイン断片は、それ自体、配列番号1〜16のいずれか1種の残基520〜873に対応するアミノ酸残基、または、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来する、コンセンサス配列の配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応するアミノ酸位置に対応するアミノ酸残基(例えば、表1を参照のこと)、またはその変異体を含み得るまたはからなり得る、本発明の適したHNドメイン断片は、本明細書中、図4および6中でイタリック体である。
本発明のHNドメイン断片は、配列番号49〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61のアミノ酸配列(非重複性BoNT/F配列の最小HNドメイン断片を規定する)またはその変異体を含み得るまたはからなり得る。BoNT/F HNドメインの変異体は、参照BoNT/F HNドメインの転位置活性を保持するという条件で、参照BoNT/F HNドメインと、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。通常、参照HNドメインドメインまたは断片は、本明細書において開示されるような天然(非修飾)BoNT/F HNドメインである。
用語、断片はまた、本明細書に記載されるBoNT/F HNドメイン変異体に関する。したがって、例として、本発明のBoNT/F HNドメイン断片は、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400またはそれ以上の連続アミノ酸を有し得、ここで、BoNT/F HNドメインアミノ酸配列は、参照BoNT/F HNドメイン由来の対応するペプチド配列に対して、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。したがって、変異体BoNT/F HNドメイン断片は、本明細書において開示される任意のBoNT/F HNドメイン断片に対して、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
好ましい実施形態では、BoNT/F HNドメインの変異体、またはその断片または変異体は、参照BoNT/F HNドメインの転位置活性を保持するという条件で、参照BoNT/F HNドメインと、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。通常、参照HNドメインは、天然(非修飾)BoNT/ HNドメインである。
好ましい実施形態では、BoNT/F HNドメインまたはHNドメイン断片またはその変異体は、BoNT/F7またはBoNT/F5に由来する。したがって、本発明のBoNT/F HNドメインは、配列番号1のアミノ酸520〜873に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは配列番号13に由来するアミノ酸配列(例えば、表1を参照のこと)を含み得るまたはからなり得る。例えば、本発明のBoNT/F HNドメインは、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基509〜862または配列番号8のアミノ酸残基516〜868またはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。
好ましくは、本発明のLHN骨格は、BoNT/F7またはBoNT/F5由来の最小HNドメイン断片を含むまたはからなるHNドメイン断片を含む。したがって、本発明のBoNT/F HNドメインは、配列番号1のアミノ酸538〜850に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13由来のアミノ酸配列(例えば、表1を参照のこと)を含み得るまたはからなり得る。例えば、本発明のBoNT/F HNドメインは、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基527〜839または配列番号8のアミノ酸残基534〜845またはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。BoNT/F7またはBoNT/F5由来の最小HNドメイン断片は、配列番号56または61〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61のアミノ酸配列またはその変異体を含み得るまたはからなり得る。
本発明のLHN骨格は、通常、配列番号49〜64の少なくとも1種、好ましくは、配列番号56または61〜64の少なくとも1種、より好ましくは、配列番号61と、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)HNドメインポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のHNドメイン(またはその断片または変異体)は、ベルト領域ポリペプチド配列由来の1個以上のアミノ酸をさらに含み得る。例えば、本発明のHNドメイン(またはその断片または変異体)は、全長ベルト領域ポリペプチド配列またはその断片または変異体をさらに含み得る。BoNTベルト領域は、活性化ループと、HNドメインの開始部の間に位置するポリペプチド配列であり、ヒトの腰の周りに巻き付くベルトを暗示するような方法で、重鎖配列のその領域が、タンパク質の3次元構造においてBoNT軽鎖サブユニットの周囲に配置するのでそのように名付けられる。既知BoNT/F配列中のベルト領域の位置は、以下の表1に示されている(列挙されたアミノ酸位置は、全長BoNT配列中の位置に対応する)。したがって、本発明のHNドメインへの本明細書における言及は、ベルト領域ポリペプチド由来の1個以上のアミノ酸を含むまたは排除するHNドメインポリペプチド配列を指し得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、1種のBoNT/F亜型、好ましくは、BoNT/F7またはBoNT/F5由来の軽鎖(または本明細書において定義されるようなその断片または変異体)、HNドメイン(または本明細書において定義されるようなその断片または変異体)およびベルト領域ポリペプチド(またはその断片または変異体)および異なるBoNT/F亜型、例えば、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4またはBoNT/F6由来の活性化ループを含むBoNT/Fポリペプチド配列に関する。BoNT/F軽鎖断片および/またはHNドメイン断片は、本明細書において開示されるような最小断片またはその変異体であり得る。あるいは、本発明のキメラBoNT/Fは、天然BoNT/F由来の活性化ループが、異なるBoNT/F亜型、例えば、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4またはBoNT/F6由来の活性化ループで置換されている点を除いて、1種のBoNT/F亜型、好ましくは、BoNT/F7またはBoNT/F5由来の天然全長BoNT/Fポリペプチド(軽鎖、HNドメインおよびベルト領域を含む)に由来し得る、またはそれと本質的に同一であり得る。
通常、本発明のLHN骨格は、(a)配列番号1の残基1〜430に対応するアミノ酸(配列番号1のアミノ酸残基1〜430に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基など)を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1〜16のいずれか1種の残基15〜412に対応するアミノ酸残基、または配列番号1のアミノ酸残基15〜412に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸位置を含むもしくはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号33〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45を含むもしくはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)ポリペプチド配列ならびに(b)配列番号1のいずれか1種の残基520〜873に対応するアミノ酸(配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応する、配列番号2〜16、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基など)を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸位置を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号49〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61を含むまたはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)ポリペプチド配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明のLHN骨格は、BoNT/F7またはBoNT/F5の軽鎖または軽鎖断片およびBoNT/F7またはBoNT/5のHNドメインまたはHNドメイン断片を含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明のLHN骨格は、(a)配列番号1のアミノ酸1〜430に対応する、配列番号8もしくは13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基1〜421もしくは配列番号8のアミノ酸残基1〜428を含むもしくはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1のアミノ酸15〜412に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種に由来する、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種の、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基15〜403もしくは配列番号8のアミノ酸残基15〜410;および/または配列番号40もしくは45〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)ポリペプチド配列ならびに(b)配列番号1のアミノ酸520〜873に対応する、配列番号8もしくは13〜16のいずれか1種に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種の、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基509〜862もしくは配列番号8のアミノ酸残基516〜868;および/または配列番号1のアミノ酸538〜850に対応する、配列番号8もしくは13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16、好ましくは、配列番号13のいずれか1種のアミノ酸残基527〜839もしくは配列番号8のアミノ酸残基534〜845;および/または配列番号56もしくは61〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61を含むもしくはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を含む。
本発明のポリペプチドは、タンパク質分解酵素による切断のための部位を含み、この切断部位は、BoNT/F LHN骨格とは異なるボツリヌスF型(BoNT/F)亜型由来の活性化ループである。BoNT/F活性化ループは、一本鎖ポリペプチドの二本鎖形態への切断を可能にする。二本鎖形態への切断は、通常、ポリペプチドを活性化し、これは、細胞細胞質においてタンパク質分解による切断活性を実施するために、軽鎖またはその断片または変異体を遊離させるために必要である。
本明細書において、用語「BoNT/F活性化ループ」は、その断片および変異体を包含する。但し、当該断片または変異体が、切断されて、ポリペプチドの二本鎖形態を生成し、前記ポリペプチドを活性化し、軽鎖またはその断片または変異体を遊離させて、そのタンパク質分解による切断活性を実施させる能力を保持するということを条件とする。BoNT/F活性化ループは、任意の適当なプロテアーゼ(Lys-C)によって切断され得る。任意の所与のプロテアーゼの、活性化ループで切断する能力は、当技術分野で公知の任意の適当な技術によって決定してもよい、例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、WO1995/033850、Deklevaら、Biochem. Biophys. Res. Commun.(1989年)第162巻(2号):767〜72頁、Giminez、Biochimie.(1990年)第72巻(4号):213〜7頁およびGiminez,J. Protein Chem.(1993年)第12巻(3号):351〜63頁を参照のこと。
本発明のポリペプチドの活性化ループは、通常、コンセンサス配列KSIIPRKGTKAPPRL(配列番号65)またはコンセンサス配列において5個以下、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列に適合するアミノ酸配列を含む。
活性化ループは、(a)KSVIPKGTKAPPRL(配列番号66)、(b)KSIIPRKGTKQSPSL(配列番号67)または(c)KSIIPRKGTKAPPRL(配列番号65)または当該配列中の5個以下、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、活性化ループは、アミノ酸配列KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)または当該配列中の5個以下、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列を含む。
表1(以下)は、BoNT/F亜型の前駆体、天然二本鎖神経毒を示し、軽鎖、露出したループ(活性化ループ)、ベルト領域、HNドメインおよびHCドメイン(HCNおよびHCCドメインを含む)を同定する。
亜型に従ってわずかな変動が起こり得るので、参照配列は、指標と考えられなければならない。
表1を参照すると、軽鎖、HN、HCNおよびHCCドメインについて示されるアミノ酸位置(残基)は、全長BoNT/Fタンパク質配列中の当該領域のアミノ酸位置に対応する。表1に示されるUniParc受託番号は、種々のBoNT/F亜血清型の例である。したがって、一実施形態では、表1中に示される軽鎖、HN、HCNおよびHCCドメインのアミノ酸位置は、受託番号によって同定される全長BoNT/Fタンパク質配列中のアミノ酸位置に対応する。上記の表1に示される受託番号は、本件出願の出願日の時点でUniParcデータベースに入れられた対応するアミノ酸配列を参照する。
本発明のポリペプチドは、表1中で同定されるBoNT/F亜型のうちのいずれか1種の軽鎖またはその断片(本明細書において開示されるような最小軽鎖断片など)または変異体由来の配列を含むLHN骨格を含み得る。BoNTのドメイン構造は、当技術分野で周知であり、そのため、任意の特定のBoNTまたはその断片または変異体の軽鎖を参照することで十分である。あるいは、BoNT/F軽鎖またはその断片または変異体は、その配列の点で、または表1中の(本明細書に記載されるような)BoNT/F亜型のいずれか1種の全長配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置の点で定義され得る。例えば、LHN骨格は、UPI0001DE3DACのBoNT/F7の軽鎖を含み得る。この軽鎖は、その配列の点で(例えば、UPI0001DE3DACの最小軽鎖断片は、配列番号45のアミノ酸配列を有する)、またはUPI0001DE3DACのBoNT/F7の全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸の点で(例えば、UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DACは、配列番号13のアミノ酸配列を有する)のアミノ酸位置1〜421(全長軽鎖配列について)またはアミノ酸位置15〜403(最小軽鎖配列について)に対応するアミノ酸)さらに定義され得る。このような定義(配列および/またはアミノ酸位置の点で)は、表1中に列挙されるものを含む、任意のその他のBoNT/F LHN骨格または軽鎖に等しく当てはまる。
本発明のLHN骨格は、表1において同定されるBoNT/F亜型のいずれか1種のHNドメインまたはその断片(本明細書において開示されるような最小HNドメイン断片など)または変異体を含み得る。BoNTのドメイン構造は、当技術分野で周知であり、そのため、任意の特定のBoNTのHNドメインまたはその断片または変異体を参照することで十分である。あるいは、BoNT/F HNドメインまたはその断片または変異体は、その配列の点で、または表1中の(本明細書に記載されるような)BoNT/F亜型のいずれか1種の全長配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置の点で定義され得る。例えば、LHN骨格は、UPI0001DE3DACのBoNT/F7のHNドメインを含み得る。このHNドメインは、その配列の点で(例えば、UPI0001DE3DACの最小HNドメイン断片は、配列番号61のアミノ酸配列を有する)、またはUPI0001DE3DACのBoNT/F7の全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸の点で(例えば、UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DACは、配列番号13のアミノ酸配列を有する)のアミノ酸位置509〜862(全長HNドメイン配列について)またはアミノ酸位置527〜839(最小HNドメイン配列について)に対応するアミノ酸)さらに定義され得る。このような定義(配列および/またはアミノ酸位置の点で)は、表1中に列挙されるものを含む、任意のその他のBoNT/F LHN骨格またはHNドメインに等しく当てはまる。
本発明のポリペプチドは、表1において同定されるBoNT/F亜型のいずれか1種の活性化ループまたはその断片または変異体を含み得る。BoNTのドメイン構造は、当技術分野で周知であり、そのため、任意の特定のBoNTの活性化ループまたはその断片または変異体を参照することで十分である。あるいは、BoNT/F活性化ループまたはその断片または変異体は、その配列の点で、または表1中の(本明細書に記載されるような)BoNT/F亜型のいずれか1種の全長配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置の点で定義され得る。例えば、ポリペプチドは、UPI00000B66D1のBoNT/F1の活性化ループを含み得る。この活性化ループは、その配列の点で(配列番号66)、またはUPI00000B66D1のBoNT/F1の全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸の点で(UPI00000B66D1のアミノ酸位置430〜444に対応するアミノ酸)さらに定義され得る。このような定義(配列および/またはアミノ酸位置の点で)は、表1中に列挙されるものを含む、任意のその他のBoNT/F活性化ループに等しく当てはまる。
本発明によれば、ポリペプチドは、BoNT/F LHN骨格に対して異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループを含む。
したがって、本発明のポリペプチドは、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6またはBoNT/F7のいずれか1種に由来する BoNT/F LHN骨格を含み得る。通常、BoNT/F LHN骨格は、BoNT/F5またはBoNT/F7亜型に由来する。好ましい実施形態では、BoNT/F LHN骨格は、BoNT/F7亜型に由来する。
本発明のポリペプチドは、BoNT/F LHN骨格とは異なるBoNT/F亜型に由来するという条件で、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6またはBoNT/F7のいずれか1種に由来するBoNT/F活性化ループを含み得る。通常、BoNT/F活性化ループは、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4またはBoNT/F6のいずれか1種に由来する。好ましい実施形態では、BoNT/F活性化ループは、BoNT/F1またはBoNT/F6に由来する。
本発明のポリペプチドは、通常、BoNT/F5またはBoNT/F7亜型に由来するBoNT/F LHN骨格およびBoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4またはBoNT/F6亜型由来の活性化ループを含む。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、通常、BoNT/F5またはBoNT/F7亜型に由来するBoNT/F LHN骨格およびBoNT/F1またはBoNT/F6亜型に由来するBoNT/F活性化ループを含む。
軽鎖(またはその断片または変異体)およびHNドメイン(またはその断片または変異体)が、異なるBoNT/F亜型に由来するキメラLHN骨格が、本発明によって包含される。例えば、本発明のキメラLHN骨格は、BoNT/F7亜型由来の軽鎖(またはその断片または変異体)およびBoNT/F5亜型由来のHNドメイン(またはその断片または変異体)を含み得るし、逆もまた同様である。本発明のポリペプチドが、このようなキメラLHN骨格を含む場合には、通常、活性化ループは、軽鎖(またはその断片または変異体)またはHNドメイン(またはその断片または変異体)のいずれかとは異なるBoNT/F亜型に由来する。本明細書に記載されるように、好ましくは、BoNT/F活性化ループは、BoNT/F1またはBoNT/F6亜型に由来する。したがって、本発明のキメラ一本鎖ポリペプチドは、第1のBoNT/F亜型(例えば、BoNT/F7)に由来する軽鎖(またはその断片または変異体)、第2のBoNT/F亜型(例えば、BoNT/F1)に由来する活性化ループおよび第3のBoNT/F亜型(例えば、BoNT/F5)由来のHNドメイン(またはその断片または変異体)を含み得る。
本発明のポリペプチド、特に、その軽鎖成分をPEG化してもよい-これは、プロテアーゼ成分の安定性、例えば、作用期間を増大するように役立ち得る。ペグ化は、好ましくは、PEGの、プロテアーゼ成分のN末端への付加を含む。例として、軽鎖のN末端を、同一であっても、異なっていてもよい1個以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基で伸長してもよい。前記アミノ酸残基の1個以上は、結合している(例えば、共有結合によって結合している)それ自身のPEG分子を有し得る。この技術の例は、参照により本明細書に組み込まれるWO2007/104567に記載されている。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの生物活性および/または生物学的残留性を増大または減少する1つ以上の修飾を含み得る。例えば、ポリペプチドは、ロイシン-またはチロシン-ベースのモチーフを含み得、ここで、当該モチーフは、ポリペプチドの生物活性および/または生物学的残留性を増大または減少する。適したロイシンベースのモチーフとして、xDxxxLL、xExxxLL、xExxxILおよびxExxxLMが挙げられる(式中、xは、任意のアミノ酸である)。適したチロシンベースのモチーフとして、Y-x-x-Hyが挙げられる(式中、Hyは、疎水性アミノ酸である)。ロイシン-およびチロシン-ベースのモチーフを含む修飾されたクロストリジウム毒素の例は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるWO2002/08268に記載されている。
本発明のポリペプチドは、1以上のカチオン性修飾を含み得る。このようなポリペプチドは、投与部位での組織滞留の増大という特性を有し、これは、したがって、投与部位から離れた拡散の低減を示す。このようなカチオン性クロストリジウム毒素の例は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるPCT/GB2014/052097に記載されている。
本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドの種々の要素(LHN骨格、活性化ループおよび/またはターゲティング部分)を、各要素が、アミノ酸置換、アミノ酸挿入およびアミノ酸欠失から選択される少なくとも1つのアミノ酸修飾を独立に含み得るように修飾してもよい。
アミノ酸置換では、クロストリジウム毒素アミノ酸配列の一部を形成するアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で置換される。置換アミノ酸残基は、以下の表中の20種の標準アミノ酸のうち1種であり得る。
以下のアミノ酸は、荷電アミノ酸と考えられる:アスパラギン酸(負)、グルタミン酸(負)、アルギニン(正)およびリジン(正)
以下のアミノ酸は、無荷電、極性(それらが水素結合に関与し得ることを意味する)アミノ酸と考えられる:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン。
以下のアミノ酸は、無荷電、疎水性アミノ酸と考えられる:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリンおよびグリシン。
あるいは、アミノ酸置換における置換アミノ酸は、非標準アミノ酸(上記で記載された20種の標準セットの一部ではないアミノ酸)であり得る。例として、置換アミノ酸は、塩基性非標準アミノ酸、例えば、L-オルニチン、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸またはリジン、アルギニンおよびオルニチンのD-異性体であり得る)。非標準アミノ酸をタンパク質中に導入するための方法は、当技術分野で公知であり、大腸菌(E. coli)栄養要求性発現宿主を使用する組換えタンパク質合成が挙げられる。
アミノ酸挿入では、さらなるアミノ酸残基(通常、存在しないもの)が、ポリペプチドアミノ酸配列中に組み込まれ、したがって、前記配列中のアミノ酸残基の総数を増大する。アミノ酸欠失では、ポリペプチドアミノ酸配列からアミノ酸残基が除去され、したがって、前記配列中のアミノ酸残基の総数が低減する。
アミノ酸残基の置換、挿入または欠失によってタンパク質を修飾するための方法は、当技術分野で公知である。例として、アミノ酸修飾を、ポリペプチドをコードするDNA配列の修飾によって導入してもよい。これは、標準分子クローニング技術を使用して、例えば、ポリメラーゼ酵素を使用して、所望のアミノ酸(複数可)をコードするDNAの短い鎖(オリゴヌクレオチド)を使用して元のコード配列を置換する部位特異的突然変異誘発によって、または遺伝子の一部を種々の酵素(例えば、リガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ)を用いて挿入/欠失することによって達成できる。あるいは、修飾された遺伝子配列は、化学的に合成できる。
少なくとも1つのアミノ酸修飾は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、酸性アミノ酸残基の無荷電アミノ酸残基との置換、無荷電アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、塩基性アミノ酸残基の挿入および酸性アミノ酸残基の欠失から選択され得る。
好ましい実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸修飾は、ポリペプチド内のアミノ酸残基を同数に維持する点において有利な置換である。
本発明のポリペプチドは、2つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。したがって、一実施形態では、ポリペプチド(上記のような)は、1から80の間のアミノ酸修飾(例えば、1から70の間、1から60の間、1から50の間、1から40の間、1から30の間、1から20の間、1から10の間または9、8、7、6、5、4、3または2つのアミノ酸修飾)を含む。
修飾のための好ましい標的アミノ酸は、特定の質を有し得る。例として、好ましい標的アミノ酸は、(i)表面に露出したアミノ酸であり得る、(ii)ポリペプチド二次構造の外側に位置し得る、(iii)タンパク質機能にとって必須ではないポリペプチドの領域中に位置し得る、(iv)その同一性がクロストリジウム毒素の種類、亜型または血清型間で保存されないアミノ酸であり得る、(iv)その修飾が予測されるユビキチン化部位を作製しないアミノ酸であり得る、または(v)前記の任意の組合せであり得る。
本発明のポリペプチドは、天然に存在するクロストリジウム毒素複合体中に存在する複合体形成タンパク質から遊離していてもよい。
本発明のポリペプチドはまた、制限された数の非標準アミノ酸を含み得る。したがって、20種の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα-メチルセリンなど)が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換されてもよい。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸および非天然アミノ酸が、クロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基と置換されてもよい。本発明のポリペプチドはまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。天然に存在しないアミノ酸として、制限するものではないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシ-プロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチル-トレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ-システイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニル-アラニン、4-アザフェニル-アラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に組み込むためのいくつかの方法が、当技術分野で公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異が抑制されるin vitro系を使用できる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化するための方法は、当技術分野で公知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌(E.coli)S30抽出物および市販の酵素およびその他の試薬を含む無細胞系において実施する。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製する。例えば、Robertsonら、J.Am.Chem.Soc.第113巻:2722頁、1991年;Ellmanら、Methods Enzymol.第202巻:301頁、1991年;Chungら、Science第259書巻:806〜9頁、1993年;およびChungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90巻:10145〜9頁、1993年を参照のこと)。第2の方法では、翻訳を、アフリカツメガエル卵母細胞において、突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAの微量注入によって実施する(Turcattiら、J.Biol.Chem.第271巻:19991〜8頁、1996年)。第3の方法内では、大腸菌(E.coli)細胞を、置換されるべき天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下で、および所望の天然に存在しないアミノ酸(複数可)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸が、その天然対応物の代わりに ポリペプチド中に組み込まれる。Koideら、Biochem.第33巻:7470〜6頁、1994年。
本発明のポリペプチドは、組換え核酸技術を使用して製造できる。したがって、一実施形態では、ポリペプチド(上記のような)は、組換えポリペプチドである。
BoNTの、活性二本鎖形態への切断
クロストリジウム属(Clostridium)細菌は、神経毒を、各々1251〜1315個のアミノ酸を有する一本鎖ポリペプチドとして放出する。その後、天然に存在するプロテアーゼが、これらのタンパク質の各々を規定の位置で各々2つの鎖に切断する(「ニッキング」)が、2つの鎖はジスルフィド橋によって連結したままである。これらの二本鎖(二重鎖)タンパク質は、ホロ毒素と呼ばれる(Shoneら(1985年)、Eur J Biochem第151巻、75〜82頁を参照のこと)。2つの鎖は、本明細書に記載されるような異なる機能を有する。本明細書によれば、一本鎖ポリペプチドを二本鎖形態に切断するために、Lys-Cが使用される。切断は、任意の適当な技術によって決定でき、それらの例は、当技術分野で公知である。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWO1995/033850を参照のこと。例えば、総タンパク質について染色され、還元および非還元条件下で流されたSDS-PAGEゲルを使用して、本発明のポリペプチドの一本鎖形態および/または二本鎖形態の存在を同定してもよい。
ターゲティング部分
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドが細胞と結合するために適したターゲティング部分(TM)を含み得る。当該ポリペプチドと細胞との結合は、TMが直接的に標的細胞と結合することによるか、または、TMが標的細胞と結合するリガンド(単数または複数)と結合することによる通常、細胞と直接的に結合するTMは、細胞表面上の結合部位と機能的に相互作用し、本発明のポリペプチドおよび標的細胞の表面間に物理的会合を引き起こすことによって結合する。
その後、転位置成分(HNドメインまたはその断片または変異体)は、プロテアーゼ成分(軽鎖またはその断片または変異体)の、標的細胞のサイトゾルへの輸送を達成する。最後に、一度内側に入ると、軽鎖は、標的細胞のサイトゾル中に存在するSNAREタンパク質を切断することによって標的細胞の開口放出融合プロセスを阻害する。したがって、標的細胞の開口放出融合装置を不活性化することによって、本発明のポリペプチドは、標的細胞による分泌を阻害する(例えば、標的コリン作動性運動ニューロンからのアセチルコリンなどの神経伝達物質の分泌を阻害する)。
ターゲティング部分(TM)は、結合部位と機能的に相互作用して、本発明ポリペプチドと標的細胞の表面の間に物理的会合を引き起こす任意の化学構造を意味する。用語TMは、標的細胞上の結合部位と結合可能であり、その結合部位が、受容体媒介性エンドサイトーシスとも呼ばれる内部移行(例えば、エンドソーム形成)可能である、任意の分子(すなわち、天然に存在する分子またはその化学的/物理的に修飾された変異体)を包含する。TMは、エンドソームの膜転位置機能を有し得、この場合には、別個のTMおよびHNドメイン成分は、本発明の薬剤中に存在する必要はない。本発明のポリペプチドにおいて任意の適当なTMを使用してもよい。
好ましい実施形態では、TMは、BoNTのTMから選択される、すなわち、TMは、BoNT HCCドメインを含むまたはからなる。用語BoNT HCCドメインは、本明細書において、BoNT HCCドメインの機能的断片および変異体、すなわち、全長HCCドメインのターゲティング活性を保持するHCCドメイン断片および変異体を包含する。あるいは、TMは、非ボツリヌスクロストリジウム毒素由来のHCCドメインを含み得るまたはからなり得る。BoNT HCCドメインまたはHCドメインTMに関連する本明細書におけるすべての関連開示は、TeNT HCCドメインまたはHCドメインTMを含む、非ボツリヌスHCCドメインまたはHCドメインTMに等しく当てはまる。
BoNT HCCドメインは、大きなBoNT HCドメイン内に含まれるので、本発明のポリペプチドのTMは、BoNT HCドメインを含み得るまたはからなり得る。したがって、BoNT HCCドメインの本明細書におけるすべての説明は、大きなBoNT HCドメインに等しく当てはまる。
本発明のポリペプチドのTMは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FまたはBoNT/Gのいずれか1種に由来するHCCドメインまたはHCドメインを含み得るまたはからなり得る。異なるBoNT血清型および亜型(亜血清型)のHCCおよびHCドメインは、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2006/027207の表1またはWO2006/099590を参照のこと。
クロストリジウム毒素HCCドメイン参照配列の例として、以下が挙げられる:
BoNT/A-アミノ酸残基1092〜1296、例えば、R1092〜L1296
BoNT/B-アミノ酸残基1079〜1291、例えば、S1079〜E1291
BoNT/C1-アミノ酸残基1093〜1291、例えば、Q1093〜E1291
BoNT/D-アミノ酸残基1080〜1276、例えば、I1080〜E1276
BoNT/E-アミノ酸残基1067〜1252、例えば、P1067〜K1252
BoNT/F-アミノ酸残基1087〜1274、例えば、P1087〜E1274
BoNT/G-アミノ酸残基1087〜1297、例えば、S1087〜E1297
TeNT-アミノ酸残基1109〜1315、例えば、L1109〜D1315
上記の配列位置は、血清型/亜型に従ってわずかに変わり得る。
クロストリジウム毒素HCドメイン参照配列の例として、以下が挙げられる:
BoNT/A-アミノ酸残基872〜1296、例えば、N872〜L1296
BoNT/B-アミノ酸残基859〜1291、例えば、E859〜E1291
BONT/C1--アミノ酸残基867〜1291、例えば、N867〜E1291
BoNT/D-アミノ酸残基863〜1276、例えば、S863〜E1276
BoNT/E-アミノ酸残基846〜1252、例えば、R846〜K1252
BoNT/F-アミノ酸残基865〜1274、例えば、K865〜E1274
BoNT/G-アミノ酸残基864〜1297、例えば、N864〜E1297
TeNT-アミノ酸残基880〜1315、例えば、I880〜D1315
上記の配列位置は、血清型/亜型に従ってわずかに変わり得る。
一実施形態では、BoNT/F亜型に由来するHCCドメインまたはHCドメインを含むまたはからなるTMを含む本発明のポリペプチド。BoNT/F HCCドメインまたはHCドメインは、BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6またはBoNT/F7に由来し得る。例えば、HCCドメインまたはHCドメインは、BoNT/F5またはBoNT/F7に由来し得る。
HCCドメインまたはHCドメインは、本発明のポリペプチドのBoNT/F LHN骨格と同一BoNT/F亜型に由来し得る。例えば、BoNT/F LHN骨格が、BoNT/F7亜型に由来する場合には、TMは、BoNT/F7のHCCドメインまたはHCドメインであり得る。したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドは、活性化ループが、異なるBoNT/F亜型に由来する活性化ループによって置換されている(したがって、誤解を避けるために、本発明のポリペプチドは、天然に存在するBoNTではない)点を除いて一本鎖の天然に存在するBoNT/Fと同一である。
本発明のBoNT/F HCCドメインまたはHCドメインTMは、本明細書において表1において同定されるようなBoNT/F HCCドメインまたはHCドメインであり得る。例えば、上記で示されるように、好ましい実施形態では、HCCドメインまたはHCドメインは、BoNT/F7由来である。この場合には、HCCドメインまたはHCドメインは、BoNT/F7亜型、例えば、UPI0001DE3DACのBoNT/F7のHCCドメインまたはHCドメインまたはその断片または変異体を含み得るまたはからなり得る。本明細書に記載されるように、UPI0001DE3DACなどのBoNT/F7のHCCドメインまたはHCドメインまたはその断片または変異体を参照することで十分である。あるいは、BoNT/F7(例えば、UPI0001DE3DAC)のHCCドメインまたはHCドメインまたはその断片または変異体は、その配列の点で、またはBoNT/F7(上記のような)の全長アミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応するアミノ酸の点で定義され得る。UPI0001DE3DACの限定されない例を使用して、全長HCCドメインは、UPI0001DE3DAC(全長UPI0001DE3DACは、配列番号13のアミノ酸配列を有する))のアミノ酸位置1077〜1268(全長HCCドメインの)またはアミノ酸位置1095〜1260(最小HCCドメインの)に対応するアミノ酸と呼ばれ得る。このような定義(配列および/またはアミノ酸位置の点で)は、表1中に列挙されるものを含む、任意のその他のBoNT/F HCCドメインまたはHCドメインに等しく当てはまる。
したがって、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、BoNT/F5またはBoNT/F7活性化ループ配列が、BoNT/F5またはBoNT/F7以外のBoNT/F亜型に由来する活性化ループ配列によって置換されている点を除いて、全長BoNT/F5またはBoNT/F7アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、BoNT/F5またはBoNT/F7活性化ループ領域は、BoNT/F1活性化ループ領域によって置換される。例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列またはその変異体(本明細書において定義されるような)を含み得るまたはからなり得る。
本発明のTMは、修飾クロストリジウムHCCまたはHCドメインであり得る、例えば、各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるWO2006/027207、WO2006/114308およびWO2013/180799を参照のこと。
用語「結合/結合する/結合している(binding)」は、本明細書において、1つの分子(この場合には、HCCまたはHCドメイン)が、制限するものではないが、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用などまたはそれらの任意の組合せを含む少なくとも1種の分子間または分子内力によって別の分子と直接的または間接的に接触していることを意味し得る。したがって、「結合親和性(binding affinity)」とは、分子(この場合には、HCCまたはHCドメイン)の、特定の受容体に対する力を意味する。
あるいは、本発明のポリペプチドは、再ターゲティングされるクロストリジウム毒素であり得る、すなわち、ポリペプチドは、本明細書において開示されるようなBoNT/F LHN骨格およびBoNT/F活性化ループを含み得るが、非クロストリジウムTMを含み得る。
非クロストリジウムTMの例は、例えば、それらのすべてが参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、EP-B-0689459、WO1994/021300、EP-B-0939818、US6,461,617、US7,192,596、WO1998/007864、EP-B-0826051、US5,989,545、US6,395,513、US6,962,703、WO1996/033273、EP-B-0996468、US7,052,702、WO1999/017806、EP-B-1107794、US6,632,440、WO2000/010598、WO2001/21213、WO2006/059093、WO2000/62814、WO2000/04926、WO1993/15766、WO2000/61192、WO2005/023309、WO2006/059113、WO2006/059105、WO2007/138339、WO2009/150469、WO2010/055358、WO2009/150470、WO2010/020811、WO2010/094905、WO2014/128497およびWO1999/58571に記載されている。本明細書における、TSIおよび/または非クロストリジウムTMへの言及は、参照により本明細書に組み込まれるWO2011/018665に記載されるものなどの構造的等価物を含む。
本発明のポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。用語ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNA配列の両方を包含するが、通常、ポリヌクレオチドは、DNA配列を含む。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。通常、発現ベクター中では、本発明のポリヌクレオチドは、適したプロモーターと作動可能に連結している。ポリヌクレオチドをまた、適した終結配列と連結してもよい。適したプロモーターおよび終結配列は、当技術分野で周知である。
プロモーターの選択は、この場合には、発現のために使用される発現系に応じて変わる。一般に、構成プロモーターが好ましいが、誘導プロモーターを同様に使用してもよい。この方法で製造される構築物は、ベクターの少なくとも1つの部分、特に、調節エレメントを含み、ベクターは、例えば、A-誘導体、アデノウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、SV40-ウイルスおよびレトロウイルスから選択される。ベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞において核酸を発現可能である。
発現ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有し得る(may):
別の好ましい実施形態では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する:
本発明の核酸分子は、当技術分野で公知の任意の適したプロセスを使用して作製してもよい。したがって、核酸分子は、化学合成技術を使用して作製してもよい。あるいは、本発明の核酸分子は、分子生物学技術を使用して作製してもよい。
好ましくは、本発明の発現ベクターをコンピュータによって設計し、次いで、従来のポリヌクレオチド合成技術によって合成する。
ポリヌクレオチド配列情報を、使用されるべき最終宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli))発現系に応じて、コドンバイアスのために、随意により、修飾する。
好ましくは、転写され翻訳された場合に軽鎖コード配列によってコードされるプロテアーゼ切断部位に対応するアミノ酸配列を生成する、任意の固有の核酸配列について、ポリヌクレオチド骨格をスクリーニングする。このスクリーニングは、手作業で実施してもよく、またはコンピュータソフトウェア(例えば、DNASTAR、Inc.によるMapDrawプログラム)を用いて実施してもよい。
本発明はまた、上記のようなポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドも提供する。
2種以上の核酸またはアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列によって共有される同一位置数の関数である。したがって、同一性％は、ヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除され、100が乗された同一ヌクレオチド/アミノ酸の数として算出してもよい。配列同一性％の算出はまた、2種以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さも考慮し得る。2種以上の配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、当業者によく知られるBLASTなどの特定の数学アルゴリズムを使用して実施できる。
製造方法
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供し、前記方法は、細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるステップと、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む。方法は、通常、本発明のポリペプチドを細胞中に導入するステップをさらに含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドを本明細書に記載されるような発現ベクターの形態で細胞中に導入してもよい。
例えば、本発明のポリペプチドを製造するための前記方法は、ポリヌクレオチド(上記のような)を適した宿主細胞において発現させることと、宿主細胞を溶解して、ポリペプチドを含有する宿主細胞ホモジネートを提供することと、ポリペプチドを単離することとを含み得る。
細胞に提供され/導入されるポリヌクレオチドは、DNA、RNAまたはそれらの混合物であり得る。ポリヌクレオチドを、例えば、ホスホロチオエート(phosphorthioate)結合を挿入することなどによって、そのヌクレアーゼ耐性に関して、さらに修飾してもよい。核酸を出発核酸から製造してもよく、後者は、例えば、ゲノムまたはcDNAデータベースからのクローニングによって利用できる。さらに、核酸は、固相合成によって直接的に製造してもよい。適した方法は、当業者に公知である。出発核酸を想定する場合には、例えば、局所特異的突然変異誘発による特異的修飾を引き起こして、アミノ酸レベルで少なくとも1つの付加、挿入、欠失および/または置換をもたらしてもよい。次いで、核酸を、本明細書に記載されるような適したプロモーターと作動可能に連結する。
通常、細胞由来の本発明のポリペプチドは、細胞から回収した後に精製および/または濃縮する。本発明のポリペプチドの回収、精製および/または濃縮のために、任意の適した方法(複数可)を使用してもよい。回収、精製および/または濃縮のための標準技術、例えば、クロマトグラフィー法および/または電気泳動は、当技術分野で公知である。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの精製において補助するための、1つ以上のN末端および/またはC末端に位置する精製タグを含み得る。任意の精製タグを使用してよいが、以下が好ましい:好ましくは、C末端および/またはN末端タグとしてのHis-タグ(例えば、6×ヒスチジン)(配列番号126);好ましくは、N末端タグとしてのMBP-タグ(マルトース結合タンパク質);好ましくは、N末端タグとしてのGST-タグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ);好ましくは、N末端タグとしてのHis-MBP-タグ;好ましくは、N末端タグとしてのGST-MBP-タグ;好ましくは、N末端タグとしてのチオレドキシン-タグ;および/または好ましくは、N末端タグとしてのCBD-タグ(キチン結合ドメイン)。
ポリペプチド中に1種以上のペプチドスペーサー/リンカー分子を含めてもよい。例えば、精製タグおよびポリペプチド分子の残部の間にペプチドスペーサーを使用してもよい。
活性化方法
本発明のポリペプチドは、一本鎖形態で調製され(例えば、WO98/07864を参照のこと)、全活性のためには通常、タンパク質分解活性化ステップが必要である。したがって、本発明は、ポリペプチドを一本鎖形態からポリペプチドの二本鎖形態に変換することによって、本発明のポリペプチドを活性化する方法を提供する。この技術は、天然クロストリジウム神経毒(すなわち、ホロ毒素)が生成されるin vivo細菌機序に基づいており、以下の「単純化された」構造配置を有するポリペプチドをもたらす:
NH2-[軽鎖]-[切断部位]-[HNドメイン]-COOH
したがって、通常、ポリペプチドは、LHN骨格の軽鎖およびHNドメイン間の切断部位(活性化ループ)で切断するプロテアーゼを用いる処理によって活性化される。二本鎖タンパク質は、このように製造され、HNドメインを含有する別の単一ポリペプチド鎖と共有結合によって結合している(ジスルフィド橋によって)単一ポリペプチド鎖として軽鎖を含む。
本発明のポリペプチドの代替構造が、例えば、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれるWO2006/059113、WO06/059093、WO98/07864およびWO2012/156743に記載されている。
したがって、本発明は、前記ポリペプチドを、BoNT/F活性化ループプロテアーゼとともにインキュベートすることを含む、本発明のポリペプチドを活性化する方法を提供し、ここで、BoNT/F切断部位でのポリペプチドの切断は、該ポリペプチドを一本鎖ポリペプチドから二本鎖ポリペプチドに変換する。通常、一本鎖ポリペプチドから二本鎖ポリペプチドへのこの変換は、ポリペプチドを活性化する。
任意の適当な酵素(Lys-Cなど)によってBoNT/F切断部位(活性化ループ)を切断してもよい。市販されており、リゾバクター・エンザイモゲネス(Lysobacter enzymogenes)から単離され得るLys-Cが好ましい。
活性化された二本鎖ポリペプチド
本明細書に記載されるように、活性化されたBoNTは、活性化ループ内の酵素的切断によって生成する二本鎖ポリペプチドである。本発明者らは、本明細書に記載されるキメラBoNT/F7-1の活性化された二本鎖形態でN末端配列決定を実施し(実施例を参照のこと)、HNドメインを含む鎖は、野生型(非修飾)BoNT/F1またはBoNT/F7亜型のいずれにも見られない独特のN末端アミノ酸配列を有することを見い出した。
特に、本発明者らは、HNドメインを含む鎖が、N末端アミノ酸配列APPR(配列番号127)、より詳しくは、APPRLCIKV(配列番号74)を含むことを見い出した。したがって、キメラBoNT/F7-1の活性化された二本鎖形態は、BoNT/F1活性化ループ由来のいくつかのアミノ酸ならびにBoNT/F7のHNドメインに由来するアミノ酸をさらに含む、HNドメインを含む鎖を含む(図8を参照のこと)。
したがって、本発明は、(a)本明細書に開示されるような軽鎖ポリペプチド配列および(b)本明細書に開示されるようなHNポリペプチド配列を含むキメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドを提供し、ここで、HNポリペプチドのN末端は、HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型に由来するアミノ酸残基を含む。通常、HNポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、AまたはQである。例えば、HNポリペプチドのN末端は、APPR(配列番号127)またはQSPS(配列番号128)から選択されるアミノ酸モチーフで始まり得る。好ましい実施形態では、HNポリペプチドのN末端は、APPRLCIK(配列番号70)、APPRLCIT(配列番号71)、QSPSLCIK(配列番号72)およびQSPSLCIT(配列番号73)から選択されるアミノ酸モチーフで始まる。
好ましい実施形態では、本発明は、(a)配列番号1の残基1〜430に対応するアミノ酸(配列番号1のアミノ酸残基1〜430に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基など)を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1〜16のいずれか1種の残基15〜412に対応するアミノ酸残基、または配列番号1のアミノ酸残基15〜412に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号33〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45を含むまたはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)軽鎖ポリペプチド配列ならびに(b)配列番号1のいずれか1種の残基520〜873に対応するアミノ酸(配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応する、配列番号2〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸残基など)を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1のアミノ酸残基520〜873に対応する、配列番号2〜16、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸位置を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号49〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61を含むまたはからなるアミノ酸配列と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)HNドメインポリペプチド配列を含む、キメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドを提供し、ここで、HNポリペプチドのN末端は、HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型に由来するアミノ酸残基を含む。
好ましい実施形態では、本発明のキメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドは、BoNT/F7またはBoNT/F5の軽鎖または軽鎖断片およびBoNT/F7またはBoNT/5のHNドメインまたはHNドメイン断片を含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明のキメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドは、(a)配列番号1のアミノ酸1〜430に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基1〜421、または配列番号8のアミノ酸残基1〜428を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1のアミノ酸15〜412に対応する配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基15〜403または配列番号8のアミノ酸残基15〜410;および/または配列番号40または45〜48のいずれか1種、好ましくは、配列番号45と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を有する(BoNT/F)ポリペプチド配列ならびに(b)配列番号1のアミノ酸520〜873に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基509〜862、または配列番号8のアミノ酸残基516〜868を含むまたはからなるアミノ酸配列;および/または配列番号1のアミノ酸538〜850に対応する、配列番号8または13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13に由来するアミノ酸配列、例えば、配列番号13〜16のいずれか1種、好ましくは、配列番号13のアミノ酸残基527〜839、または配列番号8のアミノ酸残基534〜845;および/または配列番号56または61〜64のいずれか1種、好ましくは、配列番号61と、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上、最大100％のアミノ酸配列同一性を含み、ここで、HNポリペプチドのN末端は、HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型に由来するアミノ酸残基を含む。
特に好ましい実施形態では、本発明は、(a)配列番号33〜48の少なくとも1種、好ましくは、配列番号45と、少なくとも40％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび(b)配列番号49〜64の少なくとも1種、好ましくは、配列番号61と少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHNポリペプチドを含む、キメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドを提供し、ここで、HNポリペプチドのN末端は、HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型に由来するアミノ酸残基を含む。
通常、HNポリペプチドのN末端アミノ酸残基は、AまたはQである。例えば、HNポリペプチドのN末端は、APPR(配列番号127)またはQSPS(配列番号128)から選択されるアミノ酸モチーフで始まり得る。好ましい実施形態では、HNポリペプチドのN末端は、APPRLCIK(配列番号70)、APPRLCIT(配列番号71)、QSPSLCIK(配列番号72)およびQSPSLCIT(配列番号73)から選択されるアミノ酸モチーフで始まる。
本発明のキメラ二本鎖は、任意のBoNT/F亜型由来の、好ましくは、BoNT/F5またはBoNT/F7由来の軽鎖ポリペプチド配列を含み得る。本発明のキメラ二本鎖は、任意のBoNT/F亜型由来の、好ましくは、BoNT/F5またはBoNT/F7由来のHNポリペプチド配列を含み得る。軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列は、同一BoNT/F亜型由来であり得る。例えば、軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列は両方とも、BoNT/F5またはBoNT F7由来であり得る。軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列は、密接に関連する亜型に由来し得る。例えば、軽鎖ポリペプチド配列は、BoNT/F5由来であり得、HNポリペプチド配列は、BoNT F7に由来し得るし、逆もまた同様である。好ましい実施形態では、軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列は、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型に由来する。さらにより好ましい実施形態では、軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列の両方とも、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型に由来する、最も好ましくは、BoNT/F7亜型に由来する。軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列は、異なるBoNT/F亜型に由来し得る。通常、軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列は、同一または密接に関連するBoNT/F亜型に由来する。
本発明のキメラ二本鎖は、軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列のBoNT/F亜型とは異なるBoNT/F亜型の活性化ループに由来する1個以上のアミノ酸残基を含む。異なるBoNT/F亜型に由来する1個以上のアミノ酸が、軽鎖ポリペプチド配列のC末端および/またはHNポリペプチド配列のN末端に保持され得る。通常、本発明のキメラ二本鎖ポリペプチドのHNポリペプチド配列は、BoNT/F5またはBoNT/F7配列であり、そのN末端は、本明細書に記載されるようなBoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4またはBoNT/F6活性化ループに由来する1個以上のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、1個以上のアミノ酸は、本明細書に記載されるようなBoNT/F1活性化ループに由来する。
本発明のキメラ二本鎖ポリペプチドは、キメラ一本鎖ポリペプチドに対応するすべてのアミノ酸を含み得る、すなわち、二本鎖ポリペプチドの配列は、一本鎖中にあるのではなく2種のポリペプチド鎖中に分かれている点を除いて、一本鎖ポリペプチドのものと同一であり得る。あるいは、本発明のキメラ二本鎖ポリペプチドは、対応するキメラ一本鎖ポリペプチドと比較して、1個以上のアミノ酸を失っている場合もある。通常、これは、活性化されたキメラ二本鎖ポリペプチドからの活性化ループ配列の短い断片の喪失をもたらす、活性化ループ内の第2の(またはその後の)部位での切断のために起こる。したがって、キメラ二本鎖ポリペプチドは、対応するキメラ一本鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも1個の、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、少なくとも6個の、少なくとも7個の、少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個またはそれ以上のアミノ酸を失っている場合がある。
本発明の一本鎖キメラポリペプチドに関連する軽鎖ポリペプチド配列およびHNポリペプチド配列の定義に関する本明細書における開示のいずれも、本発明のキメラ二本鎖ポリペプチド内のこれらの配列に等しく当てはまる。例えば、本発明の二本鎖ポリペプチド中の軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列は、好ましくは、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型に由来する。本発明のTMに関する本明細書における任意の開示は、二本鎖ポリペプチドに等しく当てはまり、同様に一本鎖キメラポリペプチドに当てはまる。
本発明の二本鎖ポリペプチドは、通常、本明細書に記載されるような本発明の一本鎖キメラポリペプチドから得られる。
細胞
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターを増幅する、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)またはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)などの適した細胞(宿主細胞としても知られる)によって製造してもよい。
したがって、本発明はさらに、本発明のポリペプチドを発現する細胞を提供する。通常、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含有し、ポリヌクレオチドまたはベクターの発現に適している。多数の原核生物および真核生物発現系が技術水準において公知であり、細胞は、例えば、大腸菌(E.coli)またはB.メガテリウム(megaterium)などの原核細胞から、S.セレビシエ(cerevisiae)およびP.パストリス(pastoris)などの真核細胞から選択される。昆虫細胞または哺乳動物細胞などの高等真核細胞を同様に使用してもよいが、それにもかかわらず、糖鎖修飾装置を有さないC.ボツリヌム(botulinum)のような細胞が好ましい。
組成物および治療的/美容的適応症
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、随意により、医薬上許容される賦形剤、希釈剤、担体、噴射剤、塩および/または添加剤を含み得る。通常、本発明の医薬組成物は、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を治療または予防するのに適している。医薬組成物は、皮下、筋肉内、埋込錠および/または局所投与に特に適している。筋肉内投与が好ましい。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液またはエマルジョンまたは使用前に適した媒体中に溶解もしくは懸濁される乾燥散剤の形態であり得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを含む美容用組成物を提供する。美容用組成物は、随意により、美容上許容される賦形剤、希釈剤、担体、噴射剤、塩および/または添加剤を含み得る。通常、本発明の美容用組成物は、ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を軽減するのに適している。
美容用組成物は、皮下、筋肉内、埋込錠および/または局所投与に特に適している。筋肉内または皮下投与が好ましい。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液またはエマルジョンまたは使用前に適した媒体中に溶解もしくは懸濁される乾燥散剤の形態であり得る。
局所送達されるべきポリペプチド、二本鎖ポリペプチドまたは組成物の場合には、改変クロストリジウム毒素を、クリーム(例えば、局所適用用の)として、または皮下注射用に製剤化してもよい。局所送達手段として、経皮送達(例えば、接着パッチを介して)を挙げることができる。
本発明の医薬組成物または美容用組成物のいずれかの局所送達も考えられる。用語、局所送達は、通常、作用部位が、適用部位である(または適用部位の近傍である)ことを示す。限定されない例として、弱化されるべき筋肉中に注射されるBoNTは、筋肉内注射によるその筋肉への局所送達となる。
本発明の医薬組成物または美容用組成物のいずれかの全身送達も考えられる。用語、全身送達は、通常、作用部位が、作用部位(またはその近傍)ではなく、むしろ、BoNTが適用される場所から作用する場所に輸送される(通常、血液中で)ことを示す。限定されない例として、それに対する特異性を有する特定の筋肉を弱体化する意図で全身循環中に注入されたBoNTが、全身送達となる。
本発明のポリペプチド、二本鎖ポリペプチドおよび/または組成物を、くも膜下腔内または影響を受ける臓器の神経支配に関与する脊髄分節のレベルで脊柱における硬膜外注射によって患者に投与してもよい。
好ましい投与経路は、腹腔鏡下および/または局所、特に、筋肉内注射によってである。
本発明のポリペプチド、二本鎖ポリペプチドまたは組成物の投与のための投与量範囲は、所望の治療効果または美容効果をもたらすものである。必要な投与量範囲は、ポリペプチド、二本鎖ポリペプチドまたは組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度または重症度、あるとすれば禁忌および主治医の判断に応じて変わるということは認められよう。これらの投与量レベルの変動は、最適化のために標準的な経験的なルーチンを使用して調整することができる。
適した1日投与量(患者の体重1kgあたり)は、0.001〜10ng/kg、好ましくは、0.001〜5ng/kg、より好ましくは、0.02〜5ng/kg、特に好ましくは、0.04〜5ng/kgの範囲である。単位投与量は、10ピコグラム未満〜300ngで変わり得るが、通常、用量あたり0.1〜10ngの範囲となり、毎日または好ましくは、毎週または6ヶ月毎などのより少ない頻度で投与され得る。
特に好ましい投与計画は、1×用量としての0.5ngのポリペプチド/二本鎖ポリペプチドに基づいている。この関連で、好ましい投与量は、1×〜100×(すなわち、0.5〜50ng)の範囲にある。
流体投与形は、通常、ポリペプチド/二本鎖ポリペプチドおよび発熱物質不含滅菌媒体を使用して調製される。ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを、使用される媒体および濃度に応じて、媒体中に溶解または懸濁することができる。溶液の調製では、ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドを、媒体中に溶解でき、溶液は、必要に応じて塩化ナトリウムの添加によって等張性にし、無菌技術を使用して滅菌フィルターを通す濾過によって滅菌し、その後、適した滅菌バイアルまたはアンプル中に充填し、密閉する。あるいは、溶液安定性が適当である場合には、オートクレーブ処理によってその密閉容器中の溶液を滅菌してもよい。緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤または殺菌剤、懸濁剤または乳化剤およびまたは局所麻酔薬剤などの添加剤を媒体中に溶解することが有利であり得る。
使用前に適した媒体中に溶解または懸濁される乾燥散剤は、滅菌領域中で無菌技術を使用して、予め滅菌した成分を滅菌容器中に充填することによって調製してもよい。あるいは、滅菌領域中で無菌技術を使用して成分を適した容器中に溶解してもよい。次いで、生成物を凍結乾燥し、容器を無菌的に密閉する。
筋肉内、皮下または皮内注射に適した非経口懸濁液は、滅菌成分が、溶解される代わりに滅菌媒体に懸濁され、滅菌は濾過によって達成できない点を除いて、実質的に同一方法で調製する。成分は、滅菌状態で単離してもよく、あるいは、単離後に、例えば、γ照射によって滅菌してもよい。
懸濁剤、例えば、ポリビニルピロリドンを組成物(複数可)中に含めて、成分の均一分布を容易にしてもよい。
本発明に従う投与は、微粒子カプセル封入、ウイルス送達系または高圧エアロゾル衝突を含む種々の送達技術を利用し得る。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療する方法において使用するための本明細書に記載されるようなポリペプチド、二本鎖ポリペプチドおよび/または医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるようなポリペプチド、二本鎖ポリペプチドおよび/または医薬組成物の使用を提供する。本発明はさらに、医薬上有効な用量の、本明細書に記載されるようなポリペプチド、二本鎖ポリペプチドおよび/または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を治療する方法を提供する。疾患または障害は、本明細書に記載されるような任意の疾患または障害であり得る。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療する方法において使用するための、BoNT/F7-1ポリペプチドおよび/またはBoNT/F7-1ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療するための医薬の製造における、BoNT/F7-1ポリペプチドおよび/またはBoNT/F7-1ポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。本発明はさらに、医薬上有効な用量の、BoNT/F7-1ポリペプチドおよび/またはBoNT/F7-1ポリペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を治療する方法を提供する。疾患または障害は、本明細書に記載されるような任意の疾患または障害であり得る。BoNT/F7-1ポリペプチドは、好ましくは二本鎖(活性化された)BoNT/F7-1ポリペプチドである。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を予防または軽減するための、本明細書に記載されるようなポリペプチド、二本鎖ポリペプチドおよび/または美容用組成物の使用を提供する。美容的適応症は、本明細書に記載されるような任意の美容的適応症であり得る。
本発明はさらに、ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を予防または軽減するための、BoNT/F7-1ポリペプチドおよび/またはBoNT/F7-1ポリペプチドを含む美容用組成物の使用を提供する。美容用適応症は、本明細書に記載されるような任意の美容用適応症であり得る。BoNT/F7-1ポリペプチドは、好ましくは二本鎖(活性化された)BoNT/F7-1ポリペプチドである。
治療的および/または美容的適応症への、または医薬組成物および/または美容用組成物への本明細書における任意の言及は、本発明の一本鎖キメラポリペプチドおよび本明細書に記載される二本鎖ポリペプチドに等しく当てはまる。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するように働き、特許請求の範囲において規定される本発明の範囲を決して制限しない。
[実施例1] すべてのBoNT血清型および亜型にわたる活性化ループアミノ酸配列のアラインメント
UniParcデータベースを、全長BoNTタンパク質についてbasic local alignment search tool(BLAST)検索によって検索した。BLAST検索において同定されたすべての全長BoNTのアミノ酸配列を解析し、活性化ループ配列を同定した。すべてのBoNT/AおよびBoNT/F亜型の活性化ループ配列をアラインし(図1)、任意の有意な類似性および相違について解析した。
驚くべきことに、BoNT/A配列間で活性化ループ配列の高度の血清型内保存があるが、BoNT/F亜型間の保存のレベルはかなり低いことがわかった。特に、BoNT/F5およびBoNT/F7亜型由来の活性化ループは、その他のBoNT/F亜型と比較して特に異なっている(図1、3および4)ことがわかった。
[実施例2] キメラBoNT/F7-1をコードする発現プラスミドの調製
異なるBoNT/F亜型の系統発生解析を実施して(図2)、キメラタンパク質BoNT/F7-1の作製のためにBoNT/F1亜型およびBoNT/F7亜型を同定した。
天然に存在するタンパク質、UniParc番号UPI00000B66D1は、亜型F1(BoNT/F1)である。このBoNT/F1を組換えタンパク質として調製し、SXN102691、組換えBoNT/F1(rBoNT/F1)と名付けた。
天然に存在するタンパク質、UniParc番号UPI0001DE3DACは、3種のその他の高度に類似するタンパク質と一緒に亜型F7(BoNT/F7)にアラインする。このBoNT/F7を、組換えタンパク質として調製し、SXN102697、組換えBoNT/F7(rBoNT/F7)と名付けた。
rBoNT/F1およびrBoNT/F7を、一本鎖前駆体タンパク質として精製した。プロテアーゼLys-Cによる選択的タンパク質分解による、精製された一本鎖rBoNT/F1の翻訳後修飾のための条件を同定した。これによって、rBoNT/F1タンパク質の成熟二本鎖形態を作製した。翻訳後タンパク質分解ステップは、BoNTタンパク質の成熟した(活性化された)形態が、機能アッセイにおいて一本鎖形態と比較して、より高い比活性を示すので活性化と呼ばれる。
rBoNT/F1とは対照的に、rBoNT/F7を選択的に活性化するための条件を同定できなかった。代わりに、試験したすべての条件下で、rBoNT/F7タンパク質分解は、選択的ではなく、むしろ、タンパク質中のいくつかのさらなる部位で起こった。望まれない部位でのタンパク質分解(proteolysis)は、分解(degradation)と呼ばれる。
BoNTタンパク質の全体的な構造は、選択的にタンパク質分解されて活性化される部位の位置を含めて、よく保存されている。複数のBoNT間の保存は、二次および三次構造のレベルで特に明らかである。したがって、rBoNT/F1由来の活性化ループをrBoNT/F7の構造の中に置換することによって、rBoNT/F7の機能的特徴を保持し、また、rBoNT/F1のように翻訳後活性化を受け入れられるキメラタンパク質が生じると推論された。本発明者らは、このキメラタンパク質をrBoNT/F7-1と呼んだ(図5)。
キメラタンパク質rBoNT/F1-7は、UPI0001DE3DAC(BoNT/F7)由来のアミノ酸1〜421、UPI00000B66D1(BoNT/F1)由来のアミノ酸430〜444およびUPI0001DE3DAC(BoNT/F7)由来のアミノ酸435〜1268(全アミノ酸配列の図6を参照のこと)から構成される。キメラタンパク質rBoNT/F7-1は、SXN102875と名付けた。同一性パーセンテージおよびrBoNT/F1、rBoNT/F7およびrBoNT/F7-1の相違は、以下の表2に示されている。
キメラBoNT/F7-1をコードする発現プラスミドを、2ラウンドのPCRベースの部位特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis, SDM)によって作製し、BoNT/F7(SXN102697の本発明者らの既存の発現プラスミド中の)の活性化ループ領域のコドンを、BoNT/F1由来の活性化ループ領域のアミノ酸配列をコードするように修飾した。SXN102697の既存の発現プラスミドは、化学合成技術を使用して作製されたものであり、BoNT/F7(配列番号13-BoNT/F7-UniParc受託番号UPI0001DE3DAC)をコードするオープンリーディングフレームを含有し、大腸菌(E.coli)細菌細胞における効率的なタンパク質発現のためにコドン最適化される。
BoNT/F1活性化ループのアミノ酸配列は、KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)である。
BoNT/F7活性化ループのアミノ酸配列は、KSIVSKKGTKN--SL(配列番号69)である。
部位特異的突然変異誘発(SDM)プライマーは以下とした:
第1ラウンドの部位特異的突然変異誘発(SDM)
第1ラウンドのSDMの鋳型プラスミドは、A002697とした(BoNT/F7をコードする発現プラスミド)。第1ラウンドのSDMのために4種の独立反応を設定した。
PCR反応生成物を、DpnIを用いて37℃で2時間消化し、次いで、Top10細胞(Life Technologies、ワンショット(one shot)細胞ロット1419720)に形質転換した。DpnI消化反応ミックスは以下とした:
NEBバッファー4(10×) 5μl
PCR反応ミックス 44μl
DpnI 1μl
Top10細胞への形質転換は、製造業者の説明書に従って実施した。手短には、細胞を氷上で解凍し、次いで、50μlのコンピテント細胞に5μlの消化反応物を添加し、氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞を42℃で30秒間、熱ショックに付し、さらに2分間氷上に戻した。次いで、形質転換反応物に、200μlのSOC培地(コンピテント細胞を供給した)を添加し、細胞を37℃で1時間振盪インキュベーター中でインキュベートした。形質転換された細胞を、寒天-カナマイシンプレート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。
反応1は、34コロニーをもたらした。
反応2は、122コロニーをもたらした。
反応3は、59コロニーをもたらした。
反応4は、42コロニーをもたらした。
並行して実施したpUC陽性対照形質転換は、92コロニーをもたらした。
4種の反応条件の各々から単一コロニーを選び、一晩増殖させ(10ml L-Broth、カナマイシン)、Wizard Plus Miniprep (Promega)によって、製造業者の説明書に従って、プラスミドDNAを回収した。
4種の反応条件の各々から得たプラスミドDNAを、DNA配列決定のために送り、これによって、4種の場合すべてにおいて予想した点突然変異が挿入されていることが確認された。
第2ラウンドの部位特異的突然変異誘発(SDM)
第2ラウンドのSDMの鋳型プラスミドは、第1ラウンド(反応2)から得たプラスミドDNAとした。5種の異なる反応を設定した:
PCR反応生成物をDpnIを用いて消化し、次いで、ラウンド1について記載したTop10細胞に形質転換した。
反応1は、13コロニーをもたらした。
反応2は、16コロニーをもたらした。
反応3は、15コロニーをもたらした。
反応4は、0コロニーをもたらした。
反応5は、0コロニーをもたらした。
反応1および2から各1コロニーおよび反応3から2コロニーを一晩増殖させ、DNAを抽出し、上記のように配列決定のために送った。
タンパク質BoNT/F7-1をコードする所望の配列が存在することを確認した後、配列が確認されたDNAを、製造業者の説明書に従ってコンピテントBL21(DE3)細胞(Invitrogen)に形質転換し、細胞バンクを設置した。
[実施例3] rBoNT/F7-1の精製
細胞破砕器/ホモジナイザーによる溶解
rBoNT/F7-1を発現する大腸菌(E.coli)細胞を、遠心分離によって回収し、次いで、16μlのベンゾナーゼ(90％純度、25U/μl)を補給した3ml/gの溶解バッファー(50mM Tris pH8.0、200mM NaCl)に再懸濁した。再懸濁された細胞を氷上で5分間保持し、その後溶解した。
細胞を超音波処理(Misonix 3000超音波処理器、30秒バーストおよび45秒休止、8サイクル)によって溶解した。超音波処理したサンプルを、ディスポーザブル500ml遠心分離ポット(Corning、431123番)に移し、確実にキャップし、溶解物を4℃で4300gで1時間の遠心分離によって清澄化した。
ブチルセファロース高性能捕獲ステップ
清澄化した溶解物を、固体(粉末)(NH4)2SO4の添加によって50mM Tris pH8.0、100mM NaCl、1.35M(NH4)2SO4に調整した。(NH4)2SO4を小さい増分で、10分間にわたって不連続に混合しながら添加した。次いで、サンプルを500mlのcorning試験管にデカントし、バランスをとり、20℃で4300gで1時間の遠心分離によって清澄化した。次いで、清澄化した溶解物を、平衡/洗浄バッファー(50mM Tris pH8.0、1.35M(NH4)2SO4)中で平衡化した2×ブチルセファロース高性能HiTrapカラム(10ml樹脂)上に捕獲した。カラムにサンプル(200ml)をロードし、平衡/洗浄バッファーを用いて10カラム容積について洗浄し、次いで、50mM Tris pH8.0、1.35M(NH4)2SO4から50mM Tris pH8.0に25カラム容積にわたって溶出した。勾配を通じて5ml画分を集め、各画分から25μlサンプルを、25μlの4×LDSバッファーに添加し、dH2Oで100μlにし、次いで、SDS-PAGEに流した。標的タンパク質を含有する画分をプールした。
rBoNT/F7-1を低塩Q結合バッファーに脱塩すること
ブチルHP捕獲ステップから得たプールされた材料を、予め平衡化させたHiPrep26/10脱塩カラム(50mM Tris pH8.5で平衡化した53mlカラム)に適用した。次いで、サンプルを、12mlのバッチ中で8ml/分の流速でロードし、その後、カラムをバッファーで再平衡化した。低い伝導率<2mSv/cmで溶出するタンパク質を、1つのプールとして集めた。
中間体精製ステップHiScreen Q高性能
脱塩ステップからプールされた材料を、1.2ml/分の流速で予め平衡化させたQ HiScreen HPカラム(4.7ml)上にロードした。カラムを50mM Tris pH8.5で平衡化させた。3カラム容積の10mM Tris pH8.5を1.2ml/分の流速で用いてカラムを洗浄した。次いで、タンパク質を直線勾配(50mM Tris pH8.5から50mM Tris pH8.5、300mM NaClへの20カラム容積)と、それに続く、5カラム容積の、10mM Tris pH8.5、1M NaClの高塩洗浄にかけて溶出した。溶出は1.2ml/分の流速で完了し、溶出を通じて、2.5mlの複数の画分を集めた。ロード、フロースルー、画分の25μlのサンプルを採取し、SDS-PAGEで解析した。
SDS-PAGEサンプルを以下の通りに調製した、25μl画分サンプル、25μl LDS-バッファーおよび50μl dH2O。画分を混合し、遠沈させ、5分間沸騰させ、混合し、再度遠沈させ、その後、ゲル上にロードし、精製されたrBoNT/F7-1が得られたことを確認した(図7)。
タンパク質濃度および貯蔵
タンパク質を、6mlのvivaspin限外濾過カラム(50kda MWCO)を使用して濃縮した。これは、保持液容量が減少し、適した濃度をもたらすまで4300gで遠心分離することによって達成した。次いで、濃度をnanodrop liteで調べ、これから最終値を導いた。
[実施例4] rBoNT/F7-1の活性化
7mlの精製された一本鎖rBoNT/F7-1(0.201mg/ml)を、-80℃のフリーザーから取り出し、MSC1キャビネット中で解凍した。2.8μlのLys-Cを添加して(0.1mg/ml)、0.04μg/ml(1:5025比)の最終濃度とした。最初にLys-CをdH2Oで再構成し、0.1mg/mlのストックを得た。
プロテアーゼを添加していない対照と並行して、サンプルを4℃で一晩(16時間)インキュベートした。SDS-PAGE解析のためにサンプルを採取し、還元サンプルおよび非還元サンプルの両方を作製した。酸化条件には、SDSサンプルバッファー(Invitrogen LC2376番)を使用した。還元条件には、LDSサンプルバッファー(Invitrogen NP0007番)およびDTTを使用した。
[実施例5] rBoNT/F7-1のフェニルHPポリッシングステップ
1.6容積の50mM Tris pH8.0、5M NaClを添加することによって、塩濃度を3M NaClに調整した後、rBoNT/F7-1を16時間一晩活性化した。次いで、サンプルを、50mM Tris pH8.0、3M NaClで予め平衡化させた1mlのHiTrapフェニルHPカラム上にロードした。
次いで、平衡バッファーを用いてカラムを10カラム容積について洗浄し、次いで、タンパク質を25cvの3M NaClから0M塩への直線勾配の上で溶出した。勾配にわたって1ml画分を採取した。
SDS-PAGE解析のために2×10μlのサンプルを採取した。サンプルをSDSサンプルバッファー(非還元)またはLDSバッファー+100mM DTT(還元)のいずれかで調製し、SDS-PAGEで流した。
[実施例6] 活性化されたrBoNT/F7-1のN末端配列決定
活性化されたrBoNT/F7-1を、N末端配列決定に付した。上記のような活性化された二本鎖タンパク質のようにrBoNT/F7-1を精製した。100μlのSDSローディングバッファー、40μlのDTT(1M)および60μlのH2Oに200μlの最終サンプル(0.1mg/ml)を添加することによって、サンプルを調製した。サンプルを95℃で5分間加熱し、次いで、ゲル上にレーンあたり1μgをロードし(20μlのロード容積)、SDS-PAGEのために処理した(図8)。
BoNT/F7-1重鎖(約100kDaのバンド)を、9レーン(10レーンのゲルのうちの)の各々から切り出し、Edman分解によるN末端配列決定のために医薬品開発受託機関Alta Bioscienceに送った。Alta Bioscience serviceは、N末端タンパク質配列決定についてISO 17025:2005に正式認可を受けている。
返送された活性化BoNT/F7-1鎖の重鎖の戻されたN末端配列は以下であった:
これらの結果は、活性化されたrBoNT/F7-1は、活性化されたrBoNT/F7と比較して異なるタンパク質である(一次配列のレベルで)ことを示す。活性化されたrBoNT/F7-1は、重鎖部分の最N末端にアミノ酸APPRを含有する。このアミノ酸配列は、天然配列rBoNT/F7では生じない。
これは、活性化された二本鎖ポリペプチドのHNドメインを含有する鎖が、N末端アミノ酸配列APPRLCIKVを含むことを示した(図8)。したがって、このN末端配列は、BoNT/F1活性化ループ由来のアミノ酸モチーフAPPR、モチーフLCI(これは、BoNT/F1およびBoNT/F7亜型の両方に共通である)およびBoNT/F7 HNドメインのN末端に由来するアミノ酸KVを含む。APPRモチーフ(および拡張されたAPPRLCIKVモチーフ)は、天然BoNT/F7には見られない(図8において対応するBoNT/F7配列を強調する円によって示されるように)。したがって、rBoNT/F7-1の活性化された二本鎖形態は、BoNT/F1またはBoNT/F7亜型の天然(非修飾)形態のいずれにも見られない独特のアミノ酸配列を含有する。
[実施例7] rBoNT/F7-1の活性
rBoNT/F7-1の活性を、細胞不含プロテアーゼ活性測定法(図9)、脊髄ニューロン(spinal cord neuron, SCN)グリシン(Gly)放出阻害アッセイ(図10)、ex-vivo筋肉収縮の阻害アッセイ(図11)およびin vivo DASアッセイ(図12)を含む、いくつかの標準アッセイを使用して調べた。
細胞不含プロテアーゼ活性アッセイ
rBoNT/F7-1の細胞不含プロテアーゼアッセイの方法は、以下の通りとした:
BEH300 C4逆相解析HPLCカラムを、水中、0.1％ TFA(バッファーA)中、0.7ml/分(0.1ml/分から出発し、最初の数分かけてフローを徐々に増大する)で30分間平衡化した。参照および試験サンプルを、0.2mg/ml BSA、20mM DTT、50mM Hepesおよび20μM ZnCl2を有する100μlの総容積中(アッセイバッファー)、1nMに希釈した。試験サンプルおよび100μlのアッセイバッファー(陰性対照のための)を、37℃で30分間予めインキュベートした。濃縮VAMP2-GFPストック溶液を、アッセイバッファーを用いて20μΜに希釈することによって基質を調製した。50μlの基質に、50μlの各試験サンプル(または陰性対照へはバッファー)を添加し、穏やかにピペッティングすることによって混合し、次いで、37℃で30分間インキュベートした。次いで、チューブあたり25μlの0.3M EDTAを添加することによって反応を停止し、穏やかにピペッティングすることによって混合した。各反応ミックスに375μlのバッファーAを添加することによってサンプルを希釈した。ルアーロックシリンジおよび0.2μm PTFEフィルターを使用して各サンプルを濾過した。サンプルを流すために、カラム温度を40℃に、検出波長を280nmに、同一注入を100μlに、勾配を以下の表6に提示されるように設定した:
サンプルの2連の注入を、0.7ml/分で15分の溶出期間にわたって解析した。
図9Bに示されるように、rBoNT/F7-1は、図9Aの模式図において同定されるプロセスに従ってVAMP2基質を切断できた。図9Cに示されるように、rBoNT/F7-1は、天然BoNT/F対照と比較して高い％の切断生成物(65％対46％、ならびにより高い比活性(26nmol/h/pmol対18nmol/h/pmol)をもたらすと示された。
SCN Gly放出阻害アッセイ
rBoNT/F7-1のSCN gly放出阻害アッセイの方法は、以下の通りとした:
ラット脊髄ニューロン(SCN)の初代培養物を調製し、96ウェル組織培養プレート中で3週間増殖させた(Masuyerら、2011年、J. Struct. Biol. Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B;およびChaddockら、2002年、Protein Expr. Purif. Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type Aに記載されるように)。SCNフィード(feeding)培地でBoNTの段階希釈を調製した。処理されるべきウェルから得た増殖培地を集め、濾過した(0.2μmフィルター)。125μlの濾過された培地を各ウェルに添加して戻した。次いで、プレートに125μlの希釈した毒素を添加した(3連のウェル)。処理された細胞を37℃、10％CO2で24±1時間インキュベートした。
この例は、組換え試験タンパク質と比較した、List Biological laboratories(Cambell、CA、USA)によって供給される天然BoNT/Fの使用される濃度範囲の例を示す。示される濃度は、これら2種のタンパク質について、十分に規定された用量反応曲線をもたらすと予測される濃度の例であり、データ点は、上部および下部漸近線領域の両方を網羅する。その他の場合には、試験する実際の濃度を、経験的に最初に決定した。当該濃度は、任意の特定の実験にとって最も最適であった。
図10に示されるように、rBoNT/F7-1のグリシン放出％は、同一濃度の天然BoNT/F対照のものよりも高かった。
[3H]グリシン放出アッセイ
放射標識されたグリシンが負荷された、BoNT処理されたSCN
BoNT処理されたSCNをインキュベーターから回収し(BoNTに対する曝露の24±1時間後)、次いで、培地を除去した。各ウェルに、280μlの加温したHEPES緩衝MEM(500ml MEM中、12.5ml HEPES。25mM最終濃度)を添加した(第1の洗浄)。次いで、プレートをインキュベーターに5分間戻した。280μlの加温したHEPES緩衝MEM(上記のステップにおいて添加された)を除去し、第2の280μlのHEPES緩衝MEMで置換し(第2の洗浄)、35℃で5分間インキュベートした。第2の洗浄溶液を除去し、各ウェルに、180μlの[3H]グリシン(HEPES緩衝MEM中、2μCi/ml(Perkin Elmer 1mCi/ml NET00400))を添加した。次いで、プレートを35℃で30分間インキュベートした。3×20μlの[3H]グリシン作業ストックをカウント測定のために保持した。30分インキュベートした後、細胞から[3H]グリシンを除去した。細胞をHEPES緩衝MEM(250μl/ウェル)を用いて1回、5分間、HEPES緩衝(10mM)HBSS:200、210、230μl/ウェルを連続洗浄で用いて3回(洗浄あたり5分)洗浄した。
基底および刺激された分泌サンプルを回収する
「基底」読み取りのために、100μl/ウェルのHBSSをすべてのウェルに穏やかに加えた。第1のウェルへの添加の時点で時計を開始した。5分後、ウェルの内容物を、予め保冷した試験管に移し、これらのサンプルをさらなる処理まで4℃で保持した。「刺激された」読み取りのために、100μl/ウェルの、56mMのKClを含有するHBSSをすべてのウェルに穏やかに加えた。最初のウェルへの添加の時点で時計を開始した。5分後、ウェルの内容物を、予め保冷した試験管に移し、これらのサンプルをさらなる処理まで4℃で保持した。100μlの2M酢酸/0.1％トリフルオロ酢酸(溶解溶液)を用いて10分間、プレート中で細胞を溶解し、ピペットで3回上下させ、次いで、コレクションチューブの最終ラックに移した。「基底」および「刺激された」サンプルを、微量遠心管中、13000rpm(16.100×g)で5分間遠心分離した。各上清の50μlを6mlのシンチレーションバイアルに移し、4mlのOptima Gold MVシンチレーション流体を添加した。トリチウムのために書かれたプログラムを使用し、3分のカウント時間を使用して、Perkin Elmer TriCarb 2100液体シンチレーションアナライザー(LSA)(または等価物)を使用してカウント測定を実施し、DPMアウトプットが得られた。
データ解析
記録された1分あたりの脱分極(depolarisations per minute, DPM)値に2を乗じた(100μlの集められたもののうち50μlのみがカウントされたので)。基底DPMを(基底+刺激された+溶解物)DPMの百分率(％)として算出した。刺激されたDPMは、(刺激された+溶解物)DPMの％として算出した。正味の放出％は、刺激されたDPM％から基底DPM％を差し引くことによって算出した。各BoNT処理の正味の放出％は、当該処理と関連した、3連の「基底」対照ウェルの正味の放出％の平均の％として算出した(すなわち、「基底」対照は、平均された場合に100％に等しい)。各BoNT濃度の3連の正味の放出％の値を平均化し、各BoNT濃度の対照放出％値の平均の％としての3連の正味の放出％を平均化した。
以下の表8は、SCN Gly阻害アッセイにおいて、rBoNT/F7-1および対照(F/080166/Metv3)について調べられたEC50値を提供する。対照(F/080166/Metv3)は、市販の天然(非組換え)BoNT/Fである。これらの結果は、このアッセイでは、組換えBoNT/F7-1が、精製された天然に存在するBoNT/Fよりも強力であることを示す。
ex-vivo筋肉収縮の阻害アッセイ
ex-vivo筋肉収縮の阻害アッセイにおいてBoNT/F7-1の活性を測定するための方法は、以下の通りとした:
Krebs-Henseleitバッファーを、アッセイの当日に調製した:およそ1400mlのdH2Oに、以下を添加した:47mlの5M NaCl(Sigma S6546)、2.4mlの1M MgSO4(Sigma M3409)、8.9mlの45％ D-グルコース(Sigma G8769)、100mlの20×KCl、100mlの20×KH2PO4、20mlの250mM CaCl2、50mlの1M NaHCO3、必要に応じてpHを7.5に調整した。次いで、dH2Oを用いて最終容量を2リットルに調整した。
EmkaBath4組織浴システム(またはその他の適した臓器浴装置)を、製造業者の説明書に従って設定した。左側横隔神経/片側横隔膜組織調製物を、先に記載されたように調製した(Rasetti-Escarguilら、2009年、Toxicon, Measurement of botulinum types A,B, and E neurotoxicity using the pherenic nerve-hemidiaphragm: improved precision with in-bred mice;およびRasetti-Escarguilら、2011年、Toxicon, Pherenic nerve-hemidiaphragm as a highly sensitive replacement assay for determination of functional botulinum toxin antibodies)。横隔神経/片側横隔膜を、組織浴中の組織ホルダー/電極集合体に取り付けた。次いで、トランスデューサーを上下に動かし、張力をおよそ1gに設定した。組織における張力をモニタリングし、必要に応じて微調整を行って、最初のベースライン安定化相の間、1g近くに維持する。100μlの100×ツボクラリンを浴に直接添加することによってツボクラリン対照を実施した。トレースに組織の全麻痺(ツボクラリンによって引き起こされる)が記録される場合には、ツボクラリンを洗浄除去し、ベースライン収縮が再確立されるようになることを可能にした。試験されるべきBoNTを、0.05％ゼラチンを含有するバッファーで10×の所望の最終濃度に希釈した。浴から1mlのバッファーを除去し、1mlの10×BoNTを浴に直接添加し、次いで、これをピペットで5回上下することによって混合した。組織における張力をモニタリングし、毒素添加後の力を毒素添加前の力の平均パーセンテージとして算出し、時間に対してプロットした。次いで、データを改変Hill方程式(方程式1)にフィッティングした
式中、xは時間(分)、yは力であり、t50は、毒素添加前レベルの50％に収縮を低減する時間である。以下の場合には、このアッセイから得られたデータを拒絶した: 処置前に発達した力が0.5g未満である; 3μΜ D-ツボクラリンに対する応答が、<94％阻害である; および/または実験の最後での直接筋肉刺激の短いバーストが、筋肉収縮をもたらさない。
図11に示されるように(左側のグラフ)、rBoNT/F7-1は、処置後80分までに筋肉収縮を完全に阻害できた。図11(右側のグラフ)は、rBoNT/F7-1、rBoNT/F1および対照(F/080166/Metv3)のt50値を示し、rBoNT/F7-1が、rBoNT/F1または対照のいずれよりも短いt50を有することを実証する。以下の表9は、図11に示されるex vivo筋肉収縮アッセイにおける、rBoNT/F7-1、rBoNT/F1および対照(F/080166/Metv3)のt50値を提供する。対照(F/080166/Metv3)は、市販の天然(非組換え)BoNT/Fである。これらの結果は、このアッセイでは、組換えBoNT/F7-1が、精製された天然に存在するBoNT/Fおよび組換えBoNT/F1よりも強力であることを示す(より低いt50値=より強力)。
指外転スコアリング(DAS)アッセイ
DASアッセイにおいてBoNT/F7-1の活性を測定するための方法は、以下の通りとした:
方法は、尾によって短時間吊り下げられた場合の、マウスの驚愕反応足指広がり反射に基づいている。この反射は、指外転スコア(Digit Abduction Score, DAS)としてスコア化され、BoNTの、後肢の腓腹筋-ヒラメ筋への投与後に阻害される。マウスを尾によって短時間吊り下げ、動物がその後肢を広げ、後肢の指を外転させる特徴的な驚愕反応を誘発する。(Aokiら、1999年、Eur.J.Neurol.;6(付録4)S3〜S10)。
注射の当日、誘導チャンバー中でマウスに麻酔し、酸素中、イソフラン3％を与える。各マウスに、右後肢の腓腹筋-ヒラメ筋中に、BoNTまたは媒体(0.2％ゼラチンを含有するリン酸バッファー)の筋肉内注射を施す。
神経毒注射後、種々の程度の指外転を0〜4のスケールでスコア化する:
ここで、0=正常および4=指外転および脚の伸展の最大低減。各用量での最大効果の平均を使用する非線形調整解析(nonlinear adjustment analysis)によってED50を決定する。使用される数学モデルは、4パラメータロジスティックモデルである。
DASは、投薬後最初の1日の間、2時間毎に実施し;その後、1日あたり3回、4日間実施する。図12は、nBoNT/F1(参照として使用される)、rBoNT/F1およびrBoNT/F7-1のフィッティングされた曲線を示す。nBoNT/F1およびrBoNT/F1は極めて類似した用量反応を示すが、rBoNT/F7-1の曲線は、左にシフトしており、これは、nBoNT/F1およびrBoNT/F1と比較して、より低用量のrBoNT/F7-1が、類似したDAS反応を達成したことを意味し、したがって、マウスDASアッセイでは、rBoNT/F7-1がその他のものよりも強力であることを示す;各BoNTの算出されたED50およびDAS4(最高スコア)につながる用量の値を示す、以下の表(表10)も参照のこと:2または4の類似したDAS反応を達成するために必要な用量は、BoNT/F7-1については、rBoNT/F1およびnBoNT/F1よりもかなり低い。
配列情報
配列番号1 - BoNT/Fコンセンサス配列
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERN 50
TIGTKPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINS 100
NPAGKVLLXEISXAKPYLGNDHTPINEFXPVNRTTSVNIKLSTNVESSML 150
LNLLVLGAGPDIFEXSCYPVRKXPNSDXVYDPSNXGFGSINIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAXGVTYKETIEV 250
KQXPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATR 300
LSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKFKVKCRNTYFIK-YGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAV 400
NNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVN 450
NRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETI 500
PQISNRTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDLNVFFYLHAQKVPE 550
GETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVI 600
RDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNEAEKGNFKEAFELLGA 650
GILLEFVPELXIPVILVFTIKSYIDSYENKNKIIKAINNSLIEREAKWKE 700
IYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDE 750
KNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVG 800
KLKEYDKHVKSXLLNYILXHRSILGEQ-XQELNDLVTSTLNSSIPFELSS 850
YTNDKILIIYFNRLYKKIKDSSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGNVY 900
IYSTNRNQFGIYSSRLSEVNIAQNNDIIYNSRYQNFSISFWVRIPKHYNP 950
MNLNREYTIINCMGNNNSGWKISLRXNXDCEIIWTLQDTSGNKEKLIFRY 1000
XQLISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIVEKSISNLGDIHVSD 1050
NILFKIVGCDDTXYVGIRYFKVFNTELDKTEIETLYSNEPDPSILKDYWG 1100
NYLLYNKKYYLLNLLRKDKYITXNSGILNINQQRGVTEX-XIFSNYKLYE 1150
GVEVIIRKNGPIDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRGVEYRLYADTSIXKPE 1200
KTIKLIRTSNSNDSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGSNIGLLGFHSNNL 1250
VASSWYYNNIRRNTSSNGCFWSFISKEHGWQE- 1283
配列番号2 - BoNT/F1 - UniParc受入No. UPI00000B66D1
MPVVINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN 50
TIGTDPSDFD PPASLENGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGEVLLQE ISYAKPYLGN EHTPINEFHP VTRTTSVNIK SSTNVKSSII 150
LNLLVLGAGP DIFENSSYPV RKLMDSGGVY DPSNDGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGY NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYKETIKV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNNL LANYEKIATR 300
LSRVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNIKLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISNQTLNTL VQDDSYVPRY DSNGTSEIEE HNVVDLNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALSEESQV YTFFSSEFIN TINKPVHAAL FISWINQVIR 600
DFTTEATQKS TFDKIADISL VVPYVGLALN IGNEVQKENF KEAFELLGAG 650
ILLEFVPELL IPTILVFTIK SFIGSSENKN KIIKAINNSL MERETKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTVIEY KYNNYTSDER 750
NRLESEYNIN NIREELNKKV SLAMENIERF ITESSIFYLM KLINEAKVSK 800
LREYDEGVKE YLLDYISEHR SILGNSVQEL NDLVTSTLNN SIPFELSSYT 850
NDKILILYFN KLYKKIKDNS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGDVYIY 900
STNRNQFGIY SSKPSEVNIA QNNDIIYNGR YQNFSISFWV RIPKYFNKVN 950
LNNEYTIIDC IRNNNSGWKI SLNYNKIIWT LQDTAGNNQK LVFNYTQMIS 1000
ISDYINKWIF VTITNNRLGN SRIYINGNLI DEKSISNLGD IHVSDNILFK 1050
IVGCNDTRYV GIRYFKVFDT ELGKTEIETL YSDEPDPSIL KDFWGNYLLY 1100
NKRYYLLNLL RTDKSITQNS NFLNINQQRG VYQKPNIFSN TRLYTGVEVI 1150
IRKNGSTDIS NTDNFVRKND LAYINVVDRD VEYRLYADIS IAKPEKIIKL 1200
IRTSNSNNSL GQIIVMDSIG NNCTMNFQNN NGGNIGLLGF HSNNLVASSW 1250
YYNNIRKNTS SNGCFWSFIS KEHGWQEN 1278
配列番号3 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00016BB5D7
MPVVINSFNY NDPVNDETIL YMQKPYEERS RKYYKAFEIM PNVWIMPERD 50
TIGTKPDEFQ VPDSLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT MIKLFNRINS 100
NPTGKVLLEE VSNARPYLGD DDTLINEFFP VNVTTSVNIK FSTDVESSII 150
SNLLVLGAGP DIFKAYCTPL VRFNKSDKLI EPSNHGFGSI NILTFSPEYE 200
HIFNDISGGN HNSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAK AVTHKESLVA 250
ERGPLMIAEK PIRLEEFLTF GGEDLNIIPS AMKEKIYNDL LANYEKIATR 300
LREVNTAPPG YDINEYKDYF QWKYGLDRNA DGSYTVNRNK FNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFVKVPDL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNINLNP KIIDSIPDKG LVEKIIKFCK SIIPRKGTKQ SPSLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNESDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKV YTFFSSEFID TINKPVNAAL FIDWISKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IVIEAEKGNF EEAFELLGAG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNSL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESKYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAEVGK 800
LKEYDKHVKS DLLDYILYHK LILGEQTKEL IDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY SGRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPKHYRPMN 950
RNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRTIRDCEI IWTLQDTSGN KEKLIFRYEE 1000
LASISDYINK WIFVTITNNR LGNSRIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDE TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT RNSGILNINQ QRGVTGGISV FLNYKLYEGV 1150
EVIIRKNAPI DISNTDNFVR KNDLAYINVV DHGVEYRLYA DISITKSEKI 1200
IKLIRTSNPN DSLGQIIVMD SIGNNCTMNF QNNDGSNIGL LGFHSDDLVA 1250
SSWYYNHIRR NTSSNGCFWS FISKEHGWKE 1280
配列番号4 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00000B50F1
MPVVINSFNY NDPVNDETIL YMQKPYEERS RKYYKAFEIM PNVWIMPERD 50
TIGTKPDEFQ VPDSLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT MIKLFNRINS 100
NPTGKVLLEE VSNARPYLGD DDTLINEFLP VNVTTSVNIK FSTDVESSII 150
SNLLVLGAGP DIFKAYCTPL VRFNKSDKLI EPSNHGFGSI NILTFSPEYE 200
HIFNDISGGN HNSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAK AVTHKESLVA 250
ERGPLMIAEK PIRLEEFLTF GGEDLNIIPS AMKEKIYNDL LANYEKIATR 300
LREVNTAPPG YDINEYKDYF QWKYGLDRNA DGSYTVNRNK FNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFVKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNINLNP KIIDSIPDKG LVEKIIKFCK SIIPRKGTKQ SPSLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNESDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKV YTFFSSEFID TINKPVNAAL FIDWISKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IVIEAEKGNF EEAFELLGAG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNSL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESKYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAEVGK 800
LKEYDKHVKS DLLDYILYHK LILGEQTKEL IDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY SGRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV TIPKHYRPMN 950
RNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRTIRDCEI IWTLQDTSGN KEKLIFRYEE 1000
LASISDYINK WIFVTITNNR LGNSRIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDE TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT RNSGILNINQ QRGVTGGISV FLNYKLYEGV 1150
EVIIRKNAPI DISNTDNFVR KNDLAYINVV DHGVEYRLYA DISITKSEKI 1200
IKLIRTSNPN DSLGQIIVMD SIGNNCTMNF QNNDGSNIGL LGFHSDDLVA 1250
SSWYYNHIRR NTSSNGCFWS FISKEHGWKE 1280
配列番号5 - BoNT/F3 - UniParc受入No. UPI0001C0B12F
MPVVINSFNY NDPVNDETIL YMQKPYEERS RKYYKAFEIM PNVWIMPERD 50
TIGTKPDDFQ VPDSLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT MIKLFNRINS 100
NPTGKVLLEE VSNARPYLGD DDTLINEFFP VNVTTSVNIK FSTDVESSII 150
SNLLVLGAGP DIFKAYCTPL VRFNKSDKLI EPSNHGFGSI NILTFSPEYE 200
HIFNDISGGD HNSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAK AVTHKETIEV 250
KRGPLMIAEK PIRLEEFLTF GGEDLNIIPS AMKEKIYNDL LANYEKIATR 300
LREVNTAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDRNA DGSYTVNRNK FNGIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFVKVPDL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNINLNP KIIDSIPDKG LVEKIIKFCK SIIPRKGTKQ SPSLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNESDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEKSKV YTFFSSEFID TINESVNAAL FIDWINKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IVIDAEKGNF QEAFELLGAG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNAL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT KINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAEVGK 800
LKKYDRHVKS DLLDYILYHK LILGDQTKEL IDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY SDRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPKHYGPMN 950
RNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRNIRDCEI IWTLQDTSGN KEKLIFRYEE 1000
LANISDYINK WIFVTITNNR LGNSRIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDK TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT RNSGILNINQ QRGVTEGSVF LNYKLYEGVE 1150
VIIRKNGPID ISNTDNFVRK NDLAYINVVY HDVEYRLYAD ISITKPEKII 1200
KLIRTSNPND SLGQIIVMDS IGNNCTMNFQ NNNGGNIGLL GFHSDNLVAS 1250
SWYYNNIRRN TSSNGCFWSF ISKEHGWQE 1279
配列番号6 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001A92658
MPVVINSFNY DDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIMPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGEVLLQE ISYAKPYLGN DHTPINEFHP VTRTTSVNIK SSTNVESSII 150
LNLLVLGAGP NIFENSSYPV RKLMNSGEVY DPSNDGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYKETIKV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNDL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKNYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNINLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKLCK SIIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISSQTLNTL VQDDSYVPRY DSNGTSEIEE HNVVDLNAFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALSEESKV YTFFSSEFIN NINKPVHAAL FIGWISQVIR 600
DFTTESTQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IGNDARKGNF KEAFELLGAA 650
ILLEVVPELL IPVILVFTIK SFIDSSKNED KIIKAINNSL IEREAKWKEV 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTVIEY KYNSYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF IAESSISYLM KLINEAKVSE 800
LREYDEGVKE YLLDYILKNG SILGDHVQEL NDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN KLYKKIKDNC ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGELYIY 900
TTNRNQFTIY SGKLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPRYSNIVN 950
LNNEYTIINC MGNNNSGWKI SLNYNKIIWT LQDTAGNNEK LVFNYTQMIS 1000
ISDYINKWIF VTITNNRLGN SRIYINGNLI DQKSISNLGD IHVSDNILFK 1050
IVGCNDTRYV GIRYFKVFDT ELDKTEIETL YSDEPDPSIL KDFWGNYLLY 1100
NKRYYLLNLL RKDKSITQSS TFLSISRPRG VDRKANIFSN KRLYKGVEVI 1150
IRKNEPIDIS NTDNFVRKGD LAYINVVDRD VEYRLYADTS NAQPEKTIKL 1200
IRTSNPDDSL GQIIVMDSIG NNCTMNFQNN NGGNIGLLGF HSNTLVASSW 1250
YYNNIRRNTS SNGCFWSFIS KEHGWQEN 1278
配列番号7 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001C0B12D
MPVVINSFNY DDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIMPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGEVLLQE ISYAKPYLGN DHTPINEFHP VTRTTSVNIK SSTNVESSII 150
LNLLVLGAGP NIFENSSYPV RKLMNSGEVY DPSNDGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYKETIKV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNDL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKNYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTEIDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQNINLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKLCK SIIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
RELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSETIP 500
QISSQTLNTL VQDDSYVPRY DSNGTSEIEE HNVVDLNAFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALSEESKV YTFFSSEFIN NINKPVHAAL FIGWISQVIR 600
DFTTESTQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IGNDARKGNF KEAFELLGAA 650
ILLEVVPELL IPVILVFTIK SFIDSSKNED KIIKAINNSL IEREAKWKEV 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTVIEY KYNSYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF IAESSISYLM KLINEAKVSE 800
LREYDEGVKE YLLDYILKNG SILGDHVQEL NDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN KLYKKIKDNC ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGELYIY 900
TTNRNQFTIY SGKLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPRYSNIVN 950
LNNEYTIINC MGNNNSGWKI SLNYNKIIWT LQDTAGNNEK LVFNYTQMIS 1000
ISDYINKWIF VTITNNRLGN SRIYINGNLI DQKSISNLGD IHVSDNILFK 1050
IVGCNDTRYV GIRYFKVFDT ELDKTEIETL YSDEPDPSIL KDFWGNYLLY 1100
NKRYYLLNLL RKDNAITQSS TFLSISRARG VDRKANIFSN KRLYKGVEVI 1150
IRKNEPIDIS NTDNFVRKGD LAYINVVDRD VEYRLYANTS NAQPEKTIKL 1200
IRTSNSNDSL DQIIVMDSIG NNCTMNFQNN NGGNIGLLGF HSNTLVASSW 1250
YYNNIRRNTS SNGCFWSFIS KEHGWQE 1277
配列番号8 - BoNT/F5 - UniParc受入No. UPI0001C0B12E
MPVEINSFNY DDLVNDNTIL YIRPPYYERS NTYFKAFNIM ENVWIIPERY 50
RLGIEASKFD PPDSLKAGSD GYFDPNYLST NTEKNRYLQI MIKLFKRINS 100
NEAGKILLNQ IKDAIPYLGN SYTAEDQFTT NNRTISFNVR LANGTIEQEM 150
ANLIIWGPGP DLTTNRTGGT TYTPAQSLEA IPYKEGFGSI MTIEFSPEYA 200
TAFNDISLTS HAPSLFIKDP ALILMHELIH VLHGLYGTYT TGFKIKPNIT 250
EPYMEVTKPI TSGEFLTFGG NDVNKIPQLI QSQLRSKVLD DYEKIASRLN 300
KVNRATAEIN IDKFKYSYQL KYQFVKDSNG VYSVDLDKFN KLYDKIYSFT 350
EFNLAHEFKI KTRNSYLAKN FGPFYLPNLL DNSIYNEADG FNIGDLSVNY 400
KGQVIGSDID SIKKLEGQGV VSRVVRLCLN SSFKKNTKKP LCITVNNGDL 450
FFIASEDSYG EDTINTPKEI DDTTTLVPSF KNILDKVILD FNKQVTPQIP 500
NRRIRTDIQE DNYIPEYDSN GTSEIEEYNV VDLNAFFYLH AQKVPEGETN 550
ISLTSSIDTA LSEESKVYTF FSSEFIDTIN EPVNAALFID WISKVIRDFT 600
TEATQKSTVD KIADISLIVP YVGLALNIVN ETEKGNFKEA FELLGAGILL 650
EFVPELAIPV ILVFTIKSYI DSYENKNKII KAINNSLIER EAKWKEIYSW 700
IVSNWLTRIN TQFNKRKEQM YQALQNQVDA IKTAIEYKYN NYTSDEKNRL 750
ESEYNINNIE EELNKKVSLA MKNIERFITE SSISYLMKLI NEAEVGKLKE 800
YDKRVKRHLL EYIFDYRLIL GEQGGELIDL VTSTLNTSIP FELSSYTNDK 850
ILIIYFNRLY KKIKDSSILD MRYENNKFID ISGYGSNISI NGNVYIYSTN 900
RNQFGIYDDR LSEVNIAQNN DIIYNSRYQN FSISFWVRIP KHYRPMNHNR 950
EYTIINCMGN NNSGWKISLR TTGDCEIIWT LQDTSGNKKK LIFRYSQLGG 1000
ISDYINKWIF VTITNNRLGN SRIYINGNLI VEKSISNLGD IHVSDNILFK 1050
IVGCDDKMYV GIRYFKVFNT ELDKTEIEIL YSNEPDPSIL KDYWGNYLLY 1100
NKKYYLLNLL RNDKYITRNS DILNISHQRG VTKDLFIFSN YKLYEGVEVI 1150
IRKNGPIDIS NTDNFVRKND LAYINVVDHG VEYRLYADIS ITKPEKIIKL 1200
IRRSNPDDSL GQIIVMDSIG NNCTMNFQNN NGGNIGLLGF HSDNLVASSW 1250
YYNNIRRNTS SNGCFWSFIS KEHGWQE 1277
配列番号9 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D1
MPVAINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGKVLLQE ISYAKPYLGN DHTPIDEFSP VTRTTSVNIK LSTNVESSML 150
LNLLVLGAGP DIFESCCYPV RKLIDPDVVY DPSNYGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYEETIEV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNNL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTESDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQSIKLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
SELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSQTIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKV YTFFSSEFID TINKPVNAAL FIDWISKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IIIEAEKGNF EEAFELLGVG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNSL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAKVGK 800
LKKYDNHVKS DLLNYILDHR SILGEQTNEL SDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY NSRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPKHYKPMN 950
HNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRTVRDCEI IWTLQDTSGN KENLIFRYEE 1000
LNRISNYINK WIFVTITNNR LGNSRIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDE TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT LNSGILNINQ QRGVTEGSVF LNYKLYEGVE 1150
VIIRKNGPID ISNTDNFVRK NDLAYINVVD RGVEYRLYAD TKSEKEKIIR 1200
TSNLNDSLGQ IIVMDSIGNN CTMNFQNNNG SNIGLLGFHS NNLVASSWYY 1250
NNIRRNTSSN GCFWSFISKE NGWKE 1275
配列番号10 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0000126B8A
MPVAINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYEEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGKVLLQE ISYAKPYLGN DHTPIDEFSP VTRTTSVNIK LSTNVESSML 150
LNLLVLGAGP DIFESCCYPV RKLIDPDVVY DPSNYGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYEETIEV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNNL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTESDLANKF KVKCRNTYFI KYEFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQSIKLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
SELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSQTIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKD IFFSSEFIDT INKPVNAALF IDWISKVIRD 600
FTTEATQKST VDKIADISLI VPYVGLALNI IIEAEKGNFE EAFELLGVGI 650
LLEFVPELTI PVILVFTIKS YIDSYENKNK AIKAINNSLI EREAKWKEIY 700
SWIVSNWLTR INTQFNKRKE QMYQALQNQV DAIKTAIEYK YNNYTSDEKN 750
RLESEYNINN IEEELNKKVS LAMKNIERFM TESSISYLMK LINEAKVGKL 800
KKYDNHVKSD LLNYILDHRS ILGEQTNELS DLVTSTLNSS IPFELSSYTN 850
DKILIIYFNR LYKKIKDSSI LDMRYENNKF IDISGYGSNI SINGNVYIYS 900
TNRNQFGIYN SRLSEVNIAQ NNDIIYNSRY QNFSISFWVR IPKHYKPMNH 950
NREYTIINCM GNNNSGWKIS LRTVRDCEII WTLQDTSGNK ENLIFRYEEL 1000
NRISNYINKW IFVTITNNRL GNSRIYINGN LIVEKSISNL GDIHVSDNIL 1050
FKIVGCDDET YVGIRYFKVF NTELDKTEIE TLYSNEPDPS ILKNYWGNYL 1100
LYNKKYYLFN LLRKDKYITL NSGILNINQQ RGVTEGSVFL NYKLYEGVEV 1150
IIRKNGPIDI SNTDNFVRKN DLAYINVVDR GVEYRLYADT KSEKEKIIRT 1200
SNLNDSLGQI IVMDSIGNNC TMNFQNNNGS NIGLLGFHSN NLVASSWYYN 1250
NIRRNTSSNG CFWSSISKEN GWKE 1274
配列番号11 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D0
MPVAINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYKEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGKVLLQE ISYAKPYLGN DHTPIDEFSP VTRTTSVNIK LSTNVESSML 150
LNLLVLGAGP DIFESCCYPV RKLIDPDVVY DPSNYGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYEETIEV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNNL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTESDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQSIKLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
SELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSQTIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKV YTFFSSEFID TINKPVNAAL FIDWISKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IIIEAEKGNF EEAFELLGVG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNSL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAKVGK 800
LKKYDNHVKS DLLNYILDHR SILGEQTNEL SDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY NSRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPKHYKPMN 950
HNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRTVRDCEI IWTLQDTSGN KENLIFRYEE 1000
LNRISNYINK WIFVTITNNR LGNSRIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDE TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT LNSGILNINQ QRGVTEGSVF LNYKLYEGVE 1150
VIIRKNGPID ISNTDNFVRK NDLAYINVVD RGVEYRLYAD TKSEKEKIIR 1200
TSNLNDSLGQ IIVMDSIGNN CTMNFQNNNG SNIGLLGFHS NNLVASSWYY 1250
NNIRRNTSSN GCFWSFISKE NGWKE 1275
配列番号12 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0004E7C8CE
MPVAINSFNY NDPVNDDTIL YMQIPYKEKS KKYYKAFEIM RNVWIIPERN 50
TIGTNPSDFD PPASLKNGSS AYYDPNYLTT DAEKDRYLKT TIKLFKRINS 100
NPAGKVLLQE ISYAKPYLGN DHTPIDEFSP VTRTTSVNIK LSTNVESSML 150
LNLLVLGAGP DIFESCCYPV RKLIDPDVVY DPSNYGFGSI NIVTFSPEYE 200
YTFNDISGGH NSSTESFIAD PAISLAHELI HALHGLYGAR GVTYEETIEV 250
KQAPLMIAEK PIRLEEFLTF GGQDLNIITS AMKEKIYNNL LANYEKIATR 300
LSEVNSAPPE YDINEYKDYF QWKYGLDKNA DGSYTVNENK FNEIYKKLYS 350
FTESDLANKF KVKCRNTYFI KYGFLKVPNL LDDDIYTVSE GFNIGNLAVN 400
NRGQSIKLNP KIIDSIPDKG LVEKIVKFCK SVIPRKGTKA PPRLCIRVNN 450
SELFFVASES SYNENDINTP KEIDDTTNLN NNYRNNLDEV ILDYNSQTIP 500
QISNRTLNTL VQDNSYVPRY DSNGTSEIEE YDVVDFNVFF YLHAQKVPEG 550
ETNISLTSSI DTALLEESKV YTFFSSEFID TINKPVNAAL FIDWISKVIR 600
DFTTEATQKS TVDKIADISL IVPYVGLALN IIIEAEKGNF EEAFELLGVG 650
ILLEFVPELT IPVILVFTIK SYIDSYENKN KAIKAINNSL IEREAKWKEI 700
YSWIVSNWLT RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDAIKTAIEY KYNNYTSDEK 750
NRLESEYNIN NIEEELNKKV SLAMKNIERF MTESSISYLM KLINEAKVGK 800
LKKYDNHVKS DLLNYILDHR SILGEQTNEL SDLVTSTLNS SIPFELSSYT 850
NDKILIIYFN RLYKKIKDSS ILDMRYENNK FIDISGYGSN ISINGNVYIY 900
STNRNQFGIY NSRLSEVNIA QNNDIIYNSR YQNFSISFWV RIPKHYKPMN 950
HNREYTIINC MGNNNSGWKI SLRTVRDCEI IWTLQDTSGN KENLIFRYEE 1000
LNRISNYINK WIFVTITNNR LGNSKIYING NLIVEKSISN LGDIHVSDNI 1050
LFKIVGCDDE TYVGIRYFKV FNTELDKTEI ETLYSNEPDP SILKDYWGNY 1100
LLYNKKYYLF NLLRKDKYIT LNSGILNINQ QRGVTEGSVF LNYKLYEGVE 1150
VIIRKNGPID ISNTDNFVRK NDLAYINVVD RGVEYRLYAD TKSEKEKIIR 1200
TSNLNDSLGQ IIVMDSIGNN CTMNFQNNNG SNIGLLGFHS NNLVASSWYY 1250
NNIRRNTSSN GCFWSFISKE NGWKE 1275
配列番号13 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001DE3DAC
MPVNINNFNY NDPINNTTIL YMKMPYYEDS NKYYKAFEIM DNVWIIPERN 50
IIGKKPSDFY PPISLDSGSS AYYDPNYLTT DAEKDRFLKT VIKLFNRINS 100
NPAGQVLLEE IKNGKPYLGN DHTAVNEFCA NNRSTSVEIK ESKGTTDSML 150
LNLVILGPGP NILECSTFPV RIFPNNIAYD PSEKGFGSIQ LMSFSTEYEY 200
AFNDNTDLFI ADPAISLAHE LIHVLHGLYG AKGVTNKKVI EVDQGALMAA 250
EKDIKIEEFI TFGGQDLNII TNSTNQKIYD NLLSNYTAIA SRLSQVNINN 300
SALNTTYYKN FFQWKYGLDQ DSNGNYTVNI SKFNAIYKKL FSFTECDLAQ 350
KFQVKNRSNY LFHFKPFRLL DLLDDNIYSI SEGFNIGSLR VNNNGQNINL 400
NSRIVGPIPD NGLVERFVGL CKSIVSKKGT KNSLCIKVNN RDLFFVASES 450
SYNENGINSP KEIDDTTITN NNYKKNLDEV ILDYNSDAIP NLSSRLLNTT 500
AQNDSYVPKY DSNGTSEIKE YTVDKLNVFF YLYAQKAPEG ESAISLTSSV 550
NTALLDASKV YTFFSSDFIN TVNKPVQAAL FISWIQQVIN DFTTEATQKS 600
TIDKIADISL VVPYVGLALN IGNEVQKGNF KEAIELLGAG ILLEFVPELL 650
IPTILVFTIK SFINSDDSKN KIIKAINNAL RERELKWKEV YSWIVSNWLT 700
RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDGIKKIIEY KYNNYTLDEK NRLKAEYNIY 750
SIKEELNKKV SLAMQNIDRF LTESSISYLM KLINEAKINK LSEYDKRVNQ 800
YLLNYILENS STLGTSSVQE LNNLVSNTLN NSIPFELSEY TNDKILISYF 850
NRFYKRIIDS SILNMKYENN RFIDSSGYGS NISINGDIYI YSTNRNQFGI 900
YSSRLSEVNI TQNNTIIYNS RYQNFSVSFW VRIPKYNNLK NLNNEYTIIN 950
CMRNNNSGWK ISLNYNNIIW TLQDTTGNNQ KLVFNYTQMI DISDYINKWT 1000
FVTITNNRLG HSKLYINGNL TDQKSILNLG NIHVDDNILF KIVGCNDTRY 1050
VGIRYFKIFN MELDKTEIET LYHSEPDSTI LKDFWGNYLL YNKKYYLLNL 1100
LKPNMSVTKN SDILNINRQR GIYSKTNIFS NARLYTGVEV IIRKVGSTDT 1150
SNTDNFVRKN DTVYINVVDG NSEYQLYADV STSAVEKTIK LRRISNSNYN 1200
SNQMIIMDSI GDNCTMNFKT NNGNDIGLLG FHLNNLVASS WYYKNIRNNT 1250
RNNGCFWSFI SKEHGWQE 1268
配列番号14 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B220
MPVNINNFNY NDPINNTTIL YMKMPYYEDS NKYYKAFEIM DNVWIIPERN 50
IIGKKPSDFY PPISLDSGSS AYYDPNYLTT DAEKDRFLKT VIKLFNRINS 100
NPAGQVLLEE IKNGKPYLGN DHTAVNEFCA NNRSTSVEIK ESNGTTDSML 150
LNLVILGPGP NILECSTFPV RIFPNNIAYD PSEKGFGSIQ LMSFSTEYEY 200
AFNDNTDLFI ADPAISLAHE LIHVLHGLYG AKGVTNKKVI EVDQGALMAA 250
EKDIKIEEFI TFGGQDLNII TNSTNQKIYD NLLSNYTAIA SRLSQVNINN 300
SALNTTYYKN FFQWKYGLDQ DSNGNYTVNI SKFNAIYKKL FSFTECDLAQ 350
KFQVKNRSNY LFHFKPFRLL DLLDDNIYSI SEGFNIGSLR VNNNGQNINL 400
NSRIVGPIPD NGLVERFVGL CKSIVSKKGT KNSLCIKVNN RDLFFVASES 450
SYNENGINSP KEIDDTTITN NNYKKNLDEV ILDYNSDAIP NLSSRLLNTT 500
AQNDSYVPKY DSNGTSEIKE YTVDKLNVFF YLYAQKAPEG ESAISLTSSV 550
NTALLDASKV YTFFSSDFIN TVNKPVQAAL FISWIQQVIN DFTTEATQKS 600
TIDKIADISL VVPYVGLALN IGNEVQKGNF KEAIELLGAG ILLEFVPELL 650
IPTILVFTIK SFINSDDSKN KIIKAINNAL RERELKWKEV YSWIVSNWLT 700
RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDGIKKIIEY KYNNYTLDEK NRLKAEYNIY 750
SIKEELNKKV SLAMQNIDRF LTESSISYLM KLINEAKINK LSEYDKRVNQ 800
YLLNYILENS STLGTSSVQE LNNLVSNTLN NSIPFELSEY TNDKILISYF 850
NRFYKRIIDS SILNMKYENN RFIDSSGYGS NISINGDIYI YSTNRNQFGI 900
YSSRLSEVNI TQNNTIIYNS RYQNFSVSFW VRIPKYNNLK NLNNEYTIIN 950
CMRNNNSGWK ISLNYNNIIW TLQDTTGNNQ KLVFNYTQMI DISDYINKWT 1000
FVTITNNRLG HSKLYINGNL TDQKSILNLG NIHVDDNILF KIVGCNDTRY 1050
VGIRYFKIFN MELDKTEIET LYHSEPDSTI LKDFWGNYLL YNKKYYLLNL 1100
LKPNMSVTKN SDILNINRQR GIYSKTNIFS NARLYTGVEV IIRKVGSTDT 1150
SNTDNFVRKN DTVYINVVDG NSEYQLYADV STSAVEKTIK LRRISNSNYN 1200
SNQMIIMDSI GDNCTMNFKT NNGNDIGLLG FHLNNLVASS WYYKNIRNNT 1250
RNNGCFWSFI SKEHGWQE 1268
配列番号15 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI00000BAF8C
MPVNINNFNY NDPINNTTIL YMKMPYYEDS NKYYKAFEIM DNVWIIPERN 50
IIGKKPSDFY PPISLDSGSS AYYDPNYLTT DAEKDRFLKT VIKLFNRINS 100
NPAGQVLLEE IKNGKPYLGN DHTAVNEFCA NNRSTSVEIK ESNGTTDSML 150
LNLVILGPGP NILECSTFPV RIFPNNIAYD PSEKGFGSIQ LMSFSTEYEY 200
AFNDNTDLFI ADPAISLAHE LIHVLHGLYG AKGVTNKKVI EVDQGALMAA 250
EKDIKIEEFI TFGGQDLNII TNSTNQKIYV ILLSNYTAIA SRLSQVNRNN 300
SALNTTYYKN FFQWKYGLDQ DSNGNYTVNI SKFNAIYKKL FSFTECDLAQ 350
KFQVKNRSNY LFHFKPFRLL DLLDDNIYSI SEGFNIGSLR VNNNGQNINL 400
NSRIVGPIPD NGLVERFVGL CKSIVSKKGT KNSLCIKVNN RDLFFVASES 450
SYNENGINSP KEIDDTTITN NNYKKNLDEV ILDYNSDAIP NLSSRLLNTT 500
AQNDSYVPKY DSNGTSEIKE YTVDKLNVFF YLYAQKAPEG ESAISLTSSV 550
NTALLDASKV YTFFSSDFIN TVNKPVQAAL FISWIQQVIN DFTTEATQKS 600
TIDKIADISL IVPYVGLALN IGNEVQKGNF KEAIELLGAG ILLEFVPELL 650
IPTILVFTIK SFINSDDSKN KIIKAINNAL RERELKWKEV YSWIVSNWLT 700
RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDGIKKIIEY KYNNYTLDEK NRLRAEYNIY 750
SIKEELNKKV SLAMQNIDRF LTESSISYLM KLINEAKINK LSEYDKRVNQ 800
YLLNYILENS STLGTSSVPE LNNLVSNTLN NSIPFELSEY TNDKILIHIL 850
IRFYKRIIDS SILNMKYENN RFIDSSGYGS NISINGDIYI YSTNRNQFGI 900
YSSRLSEVNI TQNNTIIYNS RYQNFSVSFW VRIPKYNNLK NLNNEYTIIN 950
CMRNNNSGWK ISLNYNNIIW TLQDTTGNNQ KLVFNYTQMI DISDYINKWT 1000
FVTITNNRLG HSKLYINGNL TDQKSILNLG NIHVDDNILF KIVGCNDTRY 1050
VGIRYFKIFN MELDKTEIET LYHSEPDSTI LKDFWGNYLL YNKKYYLLNL 1100
LKPNMSVTKN SDILNINRQR GIYSKTNIFS NARLYTGVEV IIRKVGSTDT 1150
SNTDNFVRKN DTVYINVVDG NSEYQLYADV STSAVEKTIK LRRISNSNYN 1200
SNQMIIMDSI GDNCTMNFKT NNGNDIGLLG FHLNNLVASS WYYKNIRNNT 1250
RNNGCFWSFI SKEHGWQE 1268
配列番号16 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B221
MPVNINNFNY NDPINNTTIL YMKMPYYEDS NKYYKAFEIM DNVWIIPERN 50
IIGKKPSDFY PPISLDSGSS AYYDPNYLTT DAEKDRFLKT VIKLFNRINS 100
NPAGQVLLEE IKNGKPYLGN DHTAVNEFCA NNRSTSVEIK ESNGTTDSML 150
LNLVILGPGP NILECSTFPV RIFPNNIAYD PSEKGFGSIQ LMSFSTEYEY 200
AFNDNTDLFI ADPAISLAHE LIHVLHGLYG AKGVTNKKVI EVDQGALMAA 250
EKDIKIEEFI TFGGQDLNIV TNSTNQKIYD NLLSNYTAIA SRLSQVNINN 300
SALNTTYYKN FFQWKYGLDQ DSNGNYTVNI SKFNAIYKKL FSFTECDLAQ 350
KFQVKNRSNY LFHFKPFKLL DLLDDNIYSI SEGFNIGSLR VNNNGQNINL 400
NSRIVGPIPD NGLVERFVGL CKSIVSKKGT KNSLCIKVNN RDLFFVASES 450
SYNENGINSP KEIDDTTITN NNYKKNLDEV ILDYNSDAIP NLSSRLLNAT 500
AQNDSYVPKY DSNGTSEINE YTVDKLNVFF YLYAQKAPEG ESAISLTSSV 550
DTALLDASKV YTFFSSDFIN TVNKPVQAAL FISWIQQVIN DFTTEATQKS 600
TIDKIADISL VVPYVGLALN IGNEVQKGNF KEAIELLGAG ILLEFVPELL 650
IPTILVFTIK SFINSDDSKN KIIKAINNAL RERELKWKEV YSWIVSNWLT 700
RINTQFNKRK EQMYQALQNQ VDGIKKIIEY KYNNYTLDEK NRLKAEYNIY 750
NIKEELNKKV SLAMQNIDRF LTESSISYLM KLINEAKINK LSEYDKRVNQ 800
YLLNYILENS STLGTSSVQE LNNLVSNTLN NSIPFELSEY TNDKILISYF 850
NRFYKRIIDS SILNMKYENN RFIDSSGYGS NISINGDIYI YSTNRNQFGI 900
YSSRLSEVNI TQNNTIIYNS RYQNFSVSFW VRIPKYNNLK NLNNEYTIIN 950
CMRNNNSGWK ISLNYNNIIW TLQDTTGNNQ KLVFNYTQMI DISDYINKWT 1000
FVTITNNRLG HSKLYINGNL TDQKSISNLG NIHVDDNILF KIVGCNDTRY 1050
VGIRYFKIFN MELDKTEIET LYHSEPDSTI LKDFWGNYLL YNKKYYLLNL 1100
LKPNMSVTKN SDILNINRQR GIYSKTNIFS NARLYTGVEV IIRKFGSTDT 1150
SNTDNFVRKN DTVYISVVDG NSEYQLYADV STSAVEKTIK LRRISNSNYN 1200
SNQMIIMDSI GDNCTMNFKT NNGNDIGLLG FHLNNLVASS WYYKNIRNNT 1250
RNNGCFWSFI SKEHGWQE 1268
配列番号17 - BoNT/Fコンセンサス配列最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTKPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLXEISXAKPYLGNDHTPINEFXPVNRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFEXSCYPVRKXPNSDXVYDPSNXGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAXGVTYKETIEVKQXPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIK-YGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFN
IGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNRTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNEAEKGNFKEAFELLGAGILLEFVPELXIPVILVFTIKSYIDSYENKNKIIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKEYDKHVKSXLLNYILXHRSILGEQ-XQELNDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号18 - BoNT/F1 - UniParc受入No. UPI00000B66D1 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT TIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTP KEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSS
配列番号19 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00016BB5D7 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDEFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT MIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFFPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGNHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKESLVAERGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPGYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPDLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESDINTP KEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIEAEKGNFEEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESKYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKHVKSDLLDYILYHKLILGEQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号20 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00000B50F1 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDEFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT MIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFLPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGNHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKESLVAERGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPGYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESDINTP KEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIEAEKGNFEEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESKYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKHVKSDLLDYILYHKLILGEQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号21 - BoNT/F3 - UniParc受入No. UPI0001C0B12F 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDDFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTMIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFFPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGDHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKETIEVKRGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNGIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPDLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEKSKVYTFFSSEFIDTINESVNAALFIDWINKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIDAEKGNFQEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNALIEREAKWKEIYSWIVSNWLTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKKYDRHVKSDLLDYILYHKLILGDQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号22 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001A92658 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIMPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT TIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNDHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVESSIILNLLVLGAGPNIFENSSYPVRKLMNSGEVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKNYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKLCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTP KEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISSQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFINNINKPVHAALFIGWISQVIRDFTTESTQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNDARKGNFKEAFELLGAAILLEVVPELLIPVILVFTIKSFIDSSKNEDKIIKAINNSLIEREAKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNSYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFIAESSISYLMKLINEAKVSELREYDEGVKEYLLDYILKNGSILGDHVQELNDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号23 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001C0B12D 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIMPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNDHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVESSIILNLLVLGAGPNIFENSSYPVRKLMNSGEVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKNYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKLCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISSQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFINNINKPVHAALFIGWISQVIRDFTTESTQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNDARKGNFKEAFELLGAAILLEVVPELLIPVILVFTIKSFIDSSKNEDKIIKAINNSLIEREAKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNSYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFIAESSISYLMKLINEAKVSELREYDEGVKEYLLDYILKNGSILGDHVQELNDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号24 - BoNT/F5 - UniParc受入No. UPI0001C0B12E 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDNTILYIRPPYYERSNTYFKAFNIMENVWIIPERYRLGIEASKFDPPDSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNRYLQIMIKLFKRINSNEAGKILLNQIKDAIPYLGNSYTAEDQFTTNNRTISFNVRLANGTIEQEMANLIIWGPGPDLTTNRTGGTTYTPAQSLEAIPYKEGFGSIMTIEFSPEYATAFNDISLTSHAPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYTTGFKIKPNITEPYMEVTKPITSGEFLTFGGNDVNKIPQLIQSQLRSKVLDDYEKIASRLNKVNRATAEINIDKFKYSYQLKYQFVKDSNGVYSVDLDKFNKLYDKIYSFTEFNLAHEFKIKTRNSYLAKNFGPFYLPNLLDNSIYNEADGFNIGDLSVNYKGQVIGSDIDSIKKLEGQGVVSRVVRLCLNSSFKKNTKKPLCITVNNGDLFFIASEDSYGEDTINTPKEIDDTTTLVPSFKNILDKVILDFNKQVTPQIPNRRIRTDIQEDNYIPEYDSNGTSEIEEYNVVDLNAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFIDTINEPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVNETEKGNFKEAFELLGAGILLEFVPELAIPVILVFTIKSYIDSYENKNKIIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFITESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKRVKRHLLEYIFDYRLILGEQGGELIDLVTSTLNTSIPFELSS
配列番号25 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D1 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSQTIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号26 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0000126B8A 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYEFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSQTIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKDIFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号27 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D0 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYKEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSQTIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号28 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0004E7C8CE 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NDDTILYMQIPYKEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSQTIPQISNRTLNTLVQDNSYVPRYDSNGTSEIEEYDVVDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号29 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001DE3DAC 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号30 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B220 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号31 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI00000BAF8C 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYVILLSNYTAIASRLSQVNRNNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLIVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLRAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVPELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号32 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B221 最小LHN骨格(活性化ループを含む)
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIVTNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFKLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNATAQNDSYVPKYDSNGTSEINEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVDTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYNIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号33 - BoNT/Fコンセンサス配列最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTKPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLXEISXAKPYLGNDHTPINEFXPVNRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFEXSCYPVRKXPNSDXVYDPSNXGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAXGVTYKETIEVKQXPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIK-YGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFN
IGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号34 - BoNT/F1 - UniParc受入No. UPI00000B66D1 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT TIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPK
配列番号35 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00016BB5D7 最小L鎖断片
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDEFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT MIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFFPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGNHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKESLVAERGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPGYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPDLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号36 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00000B50F1 最小L鎖断片
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDEFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT MIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFLPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGNHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKESLVAERGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPGYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号37 - BoNT/F3 - UniParc受入No. UPI0001C0B12F 最小L鎖断片
NDETILYMQKPYEERSRKYYKAFEIMPNVWIMPERDTIGTKPDDFQVPDSLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTMIKLFNRINSNPTGKVLLEEVSNARPYLGDDDTLINEFFPVNVTTSVNIKFSTDVESSIISNLLVLGAGPDIFKAYCTPLVRFNKSDKLIEPSNHGFGSINILTFSPEYEHIFNDISGGDHNSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGAKAVTHKETIEVKRGPLMIAEKPIRLEEFLTFGGEDLNIIPSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLREVNTAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDRNADGSYTVNRNKFNGIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFVKVPDLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号38 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001A92658 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIMPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKT TIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNDHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVESSIILNLLVLGAGPNIFENSSYPVRKLMNSGEVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKNYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号39 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001C0B12D 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIMPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNDHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVESSIILNLLVLGAGPNIFENSSYPVRKLMNSGEVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNDLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKNYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNINLNPK
配列番号40 - BoNT/F5 - UniParc受入No. UPI0001C0B12E 最小L鎖断片
NDNTILYIRPPYYERSNTYFKAFNIMENVWIIPERYRLGIEASKFDPPDSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNRYLQIMIKLFKRINSNEAGKILLNQIKDAIPYLGNSYTAEDQFTTNNRTISFNVRLANGTIEQEMANLIIWGPGPDLTTNRTGGTTYTPAQSLEAIPYKEGFGSIMTIEFSPEYATAFNDISLTSHAPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYTTGFKIKPNITEPYMEVTKPITSGEFLTFGGNDVNKIPQLIQSQLRSKVLDDYEKIASRLNKVNRATAEINIDKFKYSYQLKYQFVKDSNGVYSVDLDKFNKLYDKIYSFTEFNLAHEFKIKTRNSYLAKNFGPFYLPNLLDNSIYNEADGFNIGDLSVNYKGQVIGSDID
配列番号41 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D1 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPK
配列番号42 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0000126B8A 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYEFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPK
配列番号43 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D0 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYKEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPK
配列番号44 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0004E7C8CE 最小L鎖断片
NDDTILYMQIPYKEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPK
配列番号45 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001DE3DAC 最小L鎖断片
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSR
配列番号46 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B220 最小L鎖断片
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSR
配列番号47 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI00000BAF8C 最小L鎖断片
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYVILLSNYTAIASRLSQVNRNNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSR
配列番号48 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B221 最小L鎖断片
NNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESNGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIVTNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFKLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSR
配列番号49 - BoNT/Fコンセンサス配列最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNEAEKGNFKEAFELLGAGILLEFVPELXIPVILVFTIKSYIDSYENKNKIIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKEYDKHVKSXLLNYILXHRSILGEQ-XQELNDLVTSTLN
SSIPFELSS
配列番号50 - BoNT/F1 - UniParc受入No. UPI00000B66D1 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSS
配列番号51 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00016BB5D7 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIEAEKGNFEEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESKYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKHVKSDLLDYILYHKLILGEQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号52 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00000B50F1 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIEAEKGNFEEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESKYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKHVKSDLLDYILYHKLILGEQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号53 - BoNT/F3 - UniParc受入No. UPI0001C0B12F 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEKSKVYTFFSSEFIDTINESVNAALFIDWINKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVIDAEKGNFQEAFELLGAGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNALIEREAKWKEIYSWIVSNWLTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAEVGKLKKYDRHVKSDLLDYILYHKLILGDQTKELIDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号54 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001A92658 最小HN断片
NAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFINNINKPVHAALFIGWISQVIRDFTTESTQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNDARKGNFKEAFELLGAAILLEVVPELLIPVILVFTIKSFIDSSKNEDKIIKAINNSLIEREAKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNSYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFIAESSISYLMKLINEAKVSELREYDEGVKEYLLDYILKNGSILGDHVQELNDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号55 - BoNT/F4 - UniParc受入No. UPI0001C0B12D 最小HN断片
NAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFINNINKPVHAALFIGWISQVIRDFTTESTQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIGNDARKGNFKEAFELLGAAILLEVVPELLIPVILVFTIKSFIDSSKNEDKIIKAINNSLIEREAKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNSYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFIAESSISYLMKLINEAKVSELREYDEGVKEYLLDYILKNGSILGDHVQELNDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号56 - BoNT/F5 - UniParc受入No. UPI0001C0B12E 最小HN断片
NAFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESKVYTFFSSEFIDTINEPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIVNETEKGNFKEAFELLGAGILLEFVPELAIPVILVFTIKSYIDSYENKNKIIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFITESSISYLMKLINEAEVGKLKEYDKRVKRHLLEYIFDYRLILGEQGGELIDLVTSTLNTSIPFELSS
配列番号57 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D1 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号58 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0000126B8A 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKDIFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号59 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0001C0B1D0 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号60 - BoNT/F6 - UniParc受入No. UPI0004E7C8CE 最小HN断片
NVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKVYTFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWISKVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVILVFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKKYDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSS
配列番号61 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001DE3DAC 最小HN断片
NVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号62 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B220 最小HN断片
NVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号63 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI00000BAF8C 最小HN断片
NVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLIVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLRAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVPELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号64 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001C0B221 最小HN断片
NVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVDTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYNIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSE
配列番号65 - BoNT/Fコンセンサス配列最小活性化ループ(UPI0001A92658 (BoNT/F4)及びUPI0001C0B12D (BoNT/F4)についての活性化ループ配列でもある)
KSIIPRKGTKAPPRL
配列番号66 - BoNT/F1 - UniParc受入No. UPI00000B66D1 最小活性化ループ (UPI0001C0B1D1 (BoNT/F6), UPI0000126B8A (BoNT/F6), UPI0001C0B1D0 (BoNT/F6)及びUPI0004E7C8CE (BoNT/F6)についての活性化ループ配列でもある)
KSVIPRKGTKAPPRL
配列番号67 - BoNT/F2 - UniParc受入No. UPI00016BB5D7 最小活性化ループ (UPI00000B50F1 (BoNT/F2)及びUPI0001C0B12F (BoNT/F3)についての活性化ループ配列でもある)
KSIIPRKGTKQSPSL
配列番号68 - BoNT/F5 - UniParc受入No. UPI0001C0B12E 最小活性化ループ
LNSSFKKNTKKPL
配列番号69 - BoNT/F7 - UniParc受入No. UPI0001DE3DAC 最小活性化ループ (UPI0001C0B220 (BoNT/F7), UPI00000BAF8C (BoNT/F7)及びUPI0001C0B221 (BoNT/F7)についての活性化ループ配列でもある)
KSIVSKKGTKNSL
配列番号70 - F1/4/6活性化ループ配列(切断部位の後) + F7重鎖配列の開始
APPRLCIK
配列番号71 - F1/4/6活性化ループ配列(切断部位の後) + F5重鎖配列の開始
APPRLCIT
配列番号72 - F2/3活性化ループ配列(切断部位の後) + F7重鎖配列の開始
QSPSLCIK
配列番号73 - F2/3活性化ループ配列(切断部位の後) + F5重鎖配列の開始
QSPSLCIT
配列番号74 - F1/4/6活性化ループ配列(切断部位の後) + F7重鎖配列の開始
APPRLCIKV
配列番号75 - 全長組換えBoNT/F7-1 (SXN102875_rBoNT-F7-1)
MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSVIPRKGTKAPPRLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSEYTNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSGYGSNISINGDIYIYSTNRNQFGIYSSRLSEVNI
TQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKYNNLKNLNNEYTIINCMRNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISDYINKWTFVTITNNRLGHSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKIFNMELDKTEIETLYHSEPDSTILKDFWGNYLLYNKKYYLLNLLKPNMSVTKNSDILNINRQRGIYSKTNIFSNARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGNSEYQLYADVSTSAVEKTIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNCTMNFKTNNGNDIGLLGFHLNNLVASSWYYKNIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE
配列番号76 - UPI0000001386 (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号77 - UPI0000ED909E (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号78 - UPI0000EF85BD (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号79 - UPI00016529B7 (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号80 - UPI00027EE164 (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号81 - UPI000003409D (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号82 - UPI0002AA7E5E (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号83 - UPI0001A954C8 (BoNT/A1)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号84 - UPI000016EA88 (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号85 - UPI0000EF84BD (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号86 - UPI000067C53E (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号87 - UPI000290BDD5 (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号88 - UPI0001C0B376 (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号89 - UPI000290BEB1 (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号90 - UPI0001F3B30D (BoNT/A2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号91 - UPI0001C32E84 (BoNT/A2V2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号92 - UPI0003C9D2A1 (BoNT/A2or3)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号93 - UPI000290B995 (BoNT/A5,3or2)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号94 - UPI00005B712C (BoNT/A3)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNYLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号95 - UPI00016DBC11 (BoNT/A3)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号96 - UPI000290C3D0 (BoNT/A3)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号97 - UPI00005B712D (BoNT/A4)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNELCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号98 - UPI00019DB885 (BoNT/A4)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNELCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号99 - UPI0001AE7D6A (BoNT/A5)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号100 - UPI000198BDAE (BoNT/A5)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号101 - UPI0001B7D251 (BoNT/A6)配列、活性化ループにまたがる
TGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDL
配列番号102 - UPI00000B66D1 (BoNT/F1)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNEND
配列番号103 - UPI00016BB5D7 (BoNT/F2)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESD
配列番号104 - UPI00000B50F1 (BoNT/F2)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESD
配列番号105 - UPI0001C0B12F (BoNT/F3)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASESSYNESD
配列番号106 - UPI0001A92658 (BoNT/F4)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKLCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNEND
配列番号107 - UPI0001C0B12D (BoNT/F4)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKLCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNEND
配列番号108 - UPI0001C0B12E (BoNT/F5)配列、活性化ループにまたがる
QGVVSRVVRLCLNSSFKKNTKKPLCITVNNGDLFFIASEDSYGEDT
配列番号109 - UPI0001C0B1D1 (BoNT/F6)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNEND
配列番号110 - UPI0000126B8A (BoNT/F6)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNEND
配列番号111 - UPI0001C0B1D0 (BoNT/F6)配列、活性化ループにまたがる
KGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASESSYNEND
配列番号112 - UPI0001DE3DAC (BoNT/F7)配列、活性化ループにまたがる
NGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENG
配列番号113 - UPI00000BAF8C (BoNT/F7)配列、活性化ループにまたがる
NGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENG
配列番号114 - UPI0001C0B221 (BoNT/F7)配列、活性化ループにまたがる
NGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENG
配列番号115 - UPI0001C0B220 (BoNT/F7)配列、活性化ループにまたがる
NGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENG
配列番号116 - BoNT/F7/1キメラ核酸配列、活性化ループにまたがる
GGCCTGTGCAAAAGCGTTATTCCGCGTAAGGGTACGAAAGCACCGCCTCGCCTGTGCATTAAAGT
配列番号117 - BoNT/F7/1キメラアミノ酸配列、活性化ループにまたがる
GLCKSVIPRKGTKAPPRLCIKV
配列番号118 - BoNT/Fコンセンサスアミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIVKFCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASES
配列番号119 - SXN102691 F1アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASES
配列番号120 - SXN102692 F2アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASES
配列番号121 - SXN102693 F3アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIIKFCKSIIPRKGTKQSPSLCIRVNNRELFFVASES
配列番号122 - SXN102694 F4アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIVKLCKSIIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASES
配列番号123 - SXN102695 F5アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GVVSRVVRLCLNSSFKKNTKKPLCITVNNGDLFFIASED
配列番号124 - SXN102696 F6アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNSELFFVASES
配列番号125 - SXN102697 F7アミノ酸配列、活性化ループの周囲
GLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASES
配列番号126 - Hisタグ
HHHHHH
配列番号127 - F1/4/6活性化ループ配列(切断部位の後) + F7重鎖配列の開始
APPR
配列番号128 - F2/3活性化ループ配列(切断部位の後) + F5重鎖配列の開始
QSPS
配列番号129 - F7 1 フォワードプライマー
CcaagAAGGGTACGAAAGCACCGCCTCGCCTGTGCATTAAAGTCAAC
配列番号130 - F7 1 リバースプライマー
gtTgactTtaAtgcaCagGcgaGgcggTgCtTtCgtaccCttcttgg
配列番号131 - F7 2 フォワードプライマー
CtTcGtgggcctgtgcAaaagcgTTattCcgcgtaagggtAcgaaAgCaC
配列番号132 - F7 2 リバースプライマー
gtgcTTtcgtaCCcTtacgcGgAatAacgcTTTtgcacaGgCCcacgAag
[図1]
BoNT/A subtypes: BoNT/A亜型
BoNT/F subtypes: BoNT/F亜型
[図2]
Amino Acid Substitutions per 100 residues: 100残基あたりのアミノ酸置換
[図3]
Percent Identity: 同一性パーセント
Divergence: 相違
[図4]
Majority: 大多数
[図5]
Chimeric proten combines F7 function with F1 activation: キメラタンパク質は、F7機能とF1活性化を組み合わせる
F7-poor activation: F7-不十分な活性化
F1-good activation: F1-良好な活性化
F7-1-good activation: F7-1-良好な活性化
[図7]
Heavy chain: 重鎖
Light chain: 軽鎖
Ox.: 酸化
Red. 還元
[図8]
Heavy chain: 重鎖
Light chain: 軽鎖
Activation loop: 活性化ループ
Cleavage site: 切断部位
Markers: マーカ
Ox.: 酸化
Red. 還元
N-terminal sequence of heavy chain: 重鎖のN末端配列
Position: 位置
Amino acid: アミノ酸
Majority: 大多数
Cut here: ここで切断
[図9]
Substrate: 基質
Products: 生成物
Product: 生成物
Elution time (min): 溶出時間(分)
Specific activity: 比活性
[図10]
[3H]-Glycine Release: [3H]-グリシン放出％
Basal: 基底
[図11]
Contractile force (% control): 収縮力(対照％)
Time (min): 時間(分)
t50(min): t50(分)
Protein: タンパク質
Concentration: 濃度
[図12]
mean DAS max value: 平均DAS最大値
Doses (pg/mouse): 用量(pg/マウス)
protein: タンパク質
ED50 (pg/mouse): ED50(pg/マウス)
DAS 4 dose (pg/mouse): DAS4用量(pg/マウス)

Claims (35)

  1. 第1のボツリヌス神経毒血清型F(BoNT/F)亜型由来のLHN骨格および異なるBoNT/F亜型由来の活性化ループ領域を含むキメラポリペプチド。
  2. 当該LHN骨格が、配列番号17〜32のうちの少なくとも1種と少なくとも60％の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 当該LHN骨格が、
    (a)配列番号33〜48のうちの少なくとも1種と少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列および/または
    (b)配列番号49〜64のうちの少なくとも1種と少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチド配列
    を含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  4. 当該LHN骨格が、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型に由来する、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 当該活性化ループが、コンセンサス配列KSIIPRKGTKAPPRL(配列番号65)に適合するアミノ酸配列またはコンセンサス配列において5個以下のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されているアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 当該活性化ループが、BoNT/F1亜型、BoNT/F2亜型、BoNT/F3亜型、BoNT/F4またはBoNT/F6亜型に由来する、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 当該活性化ループが、
    (a)KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)、
    (b)KSIIPRKGTKQSPSL(配列番号67)または
    (c)KSIIPRKGTKAPPRL(配列番号65)
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5または6に記載のポリペプチド。
  8. 当該LHN骨格が、BoNT/F7亜型に由来し、BoNT/F活性化ループが、KSVIPRKGTKAPPRL(配列番号66)のアミノ酸配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. BoNT/F活性化ループ内の切断部位が、エンドペプチダーゼによって特異的に認識され切断される、前記の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. エンドペプチダーゼによる切断が、活性ホロ毒素の形成をもたらす、請求項9に記載のポリペプチド。
  11. キメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチドであって、
    (a)配列番号33〜48のうちの少なくとも1種と少なくとも40％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび
    (b)配列番号49〜64のうちの少なくとも1種と少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHNポリペプチドと
    を含み、
    HNポリペプチドのN末端が、HNポリペプチドの残部とは異なるBoNT/F亜型由来のアミノ酸残基を含む、キメラ二本鎖BoNT/Fポリペプチド。
  12. HNポリペプチド配列のN末端アミノ酸残基が、AまたはQである、請求項11に記載の二本鎖ポリペプチド。
  13. HNポリペプチド配列のN末端が、APPRLCIK(配列番号70)、APPRLCIT(配列番号71)、QSPSLCIK(配列番号72)およびQSPSLCIT(配列番号73)からなる群から選択されるアミノ酸モチーフで始まる、請求項11または12に記載の二本鎖ポリペプチド。
  14. 軽鎖ポリペプチド配列および/またはHNポリペプチド配列が、BoNT/F5亜型またはBoNT/F7亜型由来である、請求項11から13のいずれか一項に記載の二本鎖ポリペプチド。
  15. 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリペプチドから得られる、請求項11から14のいずれか一項に記載の二本鎖ポリペプチド。
  16. ターゲティング部分の細胞との直接的な結合による、またはターゲティング部分の、細胞と結合するリガンド(単数または複数)との結合による、ポリペプチドの細胞との結合に適しているターゲティング部分をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項11から15のいずれか一項に記載の二本鎖ポリペプチド。
  17. ターゲティング部分が、クロストリジウム神経毒由来のターゲティング部分である、請求項16に記載のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチド。
  18. ターゲティング部分が、非クロストリジウムターゲティング部分である、請求項17に記載のポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチド。
  19. 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子。
  20. プロモーターと作動可能に連結している、請求項19に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  21. 細胞において請求項19に記載のポリヌクレオチドを発現させるステップおよび発現されたポリペプチドを回収するステップを含む、請求項1から10のいずれか一項に定義するポリペプチドを製造する方法。
  22. 請求項19に記載のポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
  23. 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性化する、当該ポリペプチドをエンドペプチダーゼとともにインキュベートする工程を含む方法: ここで、前記BoNT/F活性化ループ中における当該ポリペプチドの切断が、当該ポリペプチドを一本鎖ポリペプチドから二本鎖ポリペプチドに変換し、それによって、当該ポリペプチドを活性化する。
  24. エンドペプチダーゼが、Lys-Cである、請求項23に記載の方法。
  25. 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
  26. 請求項19に記載のポリヌクレオチドまたは請求項20に記載の発現ベクターを含む、請求項25に記載の細胞。
  27. 請求項1から10または16から18のいずれか一項に記載のポリペプチドあるいは請求項11から18のいずれか一項に記載の二本鎖ポリペプチドを含む医薬組成物。
  28. 医薬上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項27に記載の医薬組成物。
  29. ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療する方法において使用するための、請求項27または28に記載の医薬組成物。
  30. ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される疾患または障害を予防または治療するための医薬の製造における、請求項27または28に記載の医薬組成物の使用。
  31. 請求項1から10または16から18のいずれか一項に記載のポリペプチドあるいは請求項11から18のいずれか一項に記載の二本鎖ポリペプチドを含む美容用組成物。
  32. 美容上許容される賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項31に記載の美容用組成物。
  33. ボツリヌス神経毒の適用が指示される美容的適応症を予防または軽減するための、請求項31または32に記載の美容用組成物の使用。
  34. BoNT/F1亜型に由来する骨格およびBoNT/F7亜型に由来する活性化ループ領域を含むキメラBoNT。
  35. 療法において使用するための、請求項34に記載のキメラBoNT。
JP2018500855A 2015-03-27 2016-03-22 キメラポリペプチド Pending JP2018510653A (ja)

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