JP6378772B2 - 慢性疼痛のためのマルチプロテアーゼ（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ）治療薬 - Google Patents

Description

本発明は、侵害受容器または炎症誘導物質からの疼痛および／または炎症メディエータのエキソサイトーシスを破壊し、それにより疼痛を予防する能力の高いクロストリジウム神経毒素誘導体を含む方法および組成物にかかるものである。

背景
クロストリジウム・ボツリナムにより産生されるボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇは、シナプス小胞と細胞膜との融合を媒介し、そのためニューロンからの神経伝達物質、疼痛ペプチドおよびサイトカインのＣａ^２＋−刺激性エキソサイトーシスに必須である、ＳＮＡＲＥ（「可溶性ＮＳＦ接着タンパク質受容体」）タンパク質をタンパク質分解により切断することにより末梢神経からのアセチルコリン放出を特異的に遮断することで知られる、最も強力な毒である。

クロストリジウム毒素、例えばボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）（ＢｏＮＴ血清型ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびにテタヌス毒素ＴｅＴｘなど）が神経伝達を阻害する能力は、広範囲の治療的および美容的適用において活用されている（例えば、Ｗａｒｄ ＡＢ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ ＭＰ， ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＵＳＥＲＳ ＯＦ ＢＯＴＵＬＩＮＵＭ ＴＯＸＩＮＳ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ２００７）を参照されたい）。例として、ＢｏＮＴ／Ａ由来の薬剤ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、以下の適応症それぞれのために１つまたは複数の国々で用いられてきた：アカラシア、成人の痙性、裂肛、背痛、眼瞼痙攣、ブラキシズム、痙性斜頸、本態性振戦、眉間のしわ、または運動過多性の顔面のしわ（ｈｙｐｅｒｋｉｎｅｔｉｃ ｆａｃｉａｌ ｌｉｎｅｓ）、頭痛、片側顔面痙攣、過活動膀胱、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス障害、鼻唇溝、痙攣性発声障害、斜視および第ＶＩＩ神経障害。

Ｃ．ボツリナムおよびＣ．テタヌス由来毒素以外のクロストリジウム毒素が存在し、これらには、Ｃ．パーフリンゲンス、Ｃ．セプチカム、Ｃ．ディフィシル、Ｃ．スピロフォルム、Ｃ．ブチリカムおよびＣ．バラティが挙げられるがこれらに限定されない。しかし本明細書において、具体的に、または文脈により他に指示されない限り、「クロストリジウム毒素」という呼称または類似の呼称が、Ｃ．ボツリナムサブタイプおよびＣ．テタヌスサブタイプの神経毒素に関することは、理解されよう。

加えて、クロストリジウム毒素療法は、非限定的に以下のものなどの疾病を処置するために使用されており、そして提案されてきた：
ａ）神経筋障害、例えばＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｙｐｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， 米国特許第６，８７２，３９７号（２００５年３月２９日）; Ｒｈｅｔｔ Ｍ． Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， 米国特許出願公開第２００４／０１７５３９９号（２００４年９月９日）； Ｒｉｃｈａｒｄ Ｌ． Ｂａｒｒｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｕｌｃｅｒｓ ａｎｄ Ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｒｅｆｌｕｘ Ｄｉｓｅａｓｅ， 米国特許出願公開第２００４／００８６５３１号（２００４年５月７日）；およびＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｙｓｔｏｎｉａ ｗｉｔｈ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｃ ｔｏ Ｇ， 米国特許第６，３１９，５０５号（２００１年１１月２０日）参照；
ｂ） 目の障害、例えばＥｒｉｃ Ｒ． Ｆｉｒｓｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｅｙｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許出願公開第２００４／０２３４５３２号（２００４年１１月２５日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ，米国特許出願公開第２００４／０１５１７４０号（２００４年８月５日）；およびＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ，米国特許出願公開第２００４／０１２６３９６号（２００４年７月１日）参照；
ｃ）疼痛、例えばＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ，米国特許第６，８６９，６１０号（２００５年３月２２日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｐａｉｎ，米国特許第６，６４１，８２０号（２００３年１１月４日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐａｉｎ ｂｙ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ，米国特許第６，４６４，９８６号（２００２年１０月１５日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｇｌｅｉ Ｃｕｉ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐａｉｎ，米国特許第６，１１３，９１５号（２０００年９月２３日）； Ｍａｒｔｉｎ Ａ． Ｖｏｅｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ，米国特許第６，６２３，７４２号（２００３年９月２３日）； Ｍａｒｔｉｎ Ａ． Ｖｏｅｔ， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ，米国特許出願公開第２００４／００６２７７６号（２００４年４月１日）；およびＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｏｗｅｒ Ｂａｃｋ Ｐａｉｎ，米国特許出願公開第２００４／００３７８５２号（２００４年２月２６日）参照；
ｄ）筋肉損傷、例えばＧｒｅｇｏｒｙ Ｆ． Ｂｒｏｏｋｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｍｕｓｃｌｅ Ｉｎｊｕｒｉｅｓ，米国特許第６，４２３，３１９号（２００２年７月２３日）参照；
ｅ）頭痛、例えばＭａｒｔｉｎ Ｖｏｅｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｉｎｕｓ Ｈｅａｄａｃｈｅ，米国特許第６，８３８，４３４号（２００５年１月４日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｈｅａｄａｃｈｅ，米国特許第６，７７６，９９２号（２００４年８月１７日）；およびＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｈｅａｄａｃｈｅ，米国特許第６，４５８，３６５号（２００２年１０月１日）； Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ． Ｂｉｎｄｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｇｒａｉｎｅ Ｈｅａｄａｃｈｅ Ｐａｉｎ，米国特許第５，７１４，４６９号（１９９８年２月３日）参照；
ｆ）心血管疾患、例えばＧｒｅｇｏｒｙ Ｆ． Ｂｒｏｏｋｓ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ，米国特許第６，７６７，５４４号（２００４年７月２７日）参照；
ｅ）神経障害、例えばＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，米国特許第６，６２０，４１５号（２００３年９月１６日）；およびＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ，米国特許第６，３０６，４０３号（２００１年１０月２３日）参照；
ｇ）精神神経障害、例えばＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許出願公開第２００４／０１８００６１号（２００４年９月１６日）；およびＳｔｅｖｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許出願公開第２００３／０２１１１２１号（２００３年１１月１３日）参照；
ｆ）内分泌障害、例えばＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第６，８２７，９３１号（２００４年１２月７日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ，米国特許第６７４０３２１号（２００４年５月２５日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ ａ Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ Ｓｗｅａｔ Ｇｌａｎｄ，米国特許第６，６８３，０４９号（２００４年１月２７日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，米国特許第６，４１６，７６５号（２００２年７月９日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，米国特許第６，３３７，０７５号（２００２年１月８日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ ａ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ，米国特許第６，２６１，５７２号（２００１年７月１７日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第６，１４３，３０６号（２０００年１１月７日）参照；
ｇ）癌、例えばＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｏｎｅ Ｔｕｍｏｒｓ，米国特許第６，５６５，８７０号 （２００３年５月２０日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，米国特許第６，３６８，６０５号（２００２年４月９日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ，米国特許第６，１３９，８４５号（２０００年１０月３１日）；およびＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｆ． Ｂｒｉｎ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃａｎｃｅｒｓ，米国特許出願公開第２００５／００３１６４８号（２００５年２月１０日）参照；
ｈ）耳の障害、例えばＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｉｎｎｅｒ Ｅａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第６３５８９２６号（ ２００２年１９月３日）；およびＳｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｏｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第６２６５３７９号（２００１年７月２４日）参照；
ｉ）自律神経障害、例えばＰａｎｋａｉ Ｊ． Ｐａｓｒｉｃｈａ ａｎｄ Ａｎｔｈｏｎｙ Ｎ． Ｋａｌｌｏｏ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，米国特許第５，４３７，２９１号（１９９５年８月１日）参照；
ｊ）ならびに他の障害、例えばＷｉｌｌｉａｍ Ｊ． Ｂｉｎｄｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｋｉｎ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｃｅｌｌ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第５，６７０，４８４号（１９９７年９月２３日）； Ｅｒｉｃ Ｒ． Ｆｉｒｓｔ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，米国特許第６，０６３，７６８号（２０００年５月１６日）； Ｍａｒｖｉｎ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｂｒｉａｎ Ｊ． Ｆｒｅｕｎｄ， Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ Ｈａｉｒ Ｌｏｓｓ ａｎｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ Ｈａｉｒ Ｇｒｏｗｔｈ，米国特許第６，２９９，８９３号（２００１年１０月９日）； Ｊｅａｎ Ｄ． Ａ． Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ ａｎｄ Ａｌａｓｔａｉｒ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ， Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｗｎｔｕｒｎｅｄ Ｍｏｕｔｈ，米国特許第６，３５８，９１７号（２００２年３月１９日）； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ Ａｐｐｅｔｉｔｅ，米国特許出願公開第２００４／４０２５３２７４号（２００４年１２月１６日）；およびＨｏｗａｒｄ Ｉ． Ｋａｔｚ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｍ． Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｄｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，米国特許出願公開第２００４／０１１５１３９号（２００４年６月１７日）； Ｋｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ，米国特許出願公開第２００２／００１０１３８号（２００２年１月２４日）；およびＫｅｉ Ｒｏｇｅｒ Ａｏｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐａｉｎ，米国特許出願公開第２００４／００１３６９２号（２００４年１月２２日）参照。

以下の表２は、現在知られている様々なボツリヌス関連（ＢｏＮＴおよびＴｅＴＸ）クロストリジウム毒素のアイソタイプのアミノ酸配列を示している。これらの毒素は、互いに最小でおよそ３５％アミノ酸同一性を有し、同じ一般的な機能的ドメインの組織および全体的構造様式を共有する。天然由来のクロストリジウム毒素は、およそ１５０ｋＤａの一本鎖ポリペプチドとしてそれぞれ翻訳され、続いて天然由来のプロテアーゼ、例えば内在性クロストリジウム毒素プロテアーゼ、または環境で生成される天然由来のプロテアーゼによるジスルフィドループ内でのタンパク質分解的切断により切断される。この翻訳後処理は、鎖間ジスルフィド単結合および非共有結合的相互作用により結びつけられるおよそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）およびおよそ１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む成熟二本鎖分子を生じる。

各成熟二本鎖クロストリジウム毒素分子は、３つの機能的に異なるドメインを含む：１）細胞膜とのシナプス小胞の融合を媒介する１つまたは複数のＳＮＡＲＥタンパク質を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣ内に位置する酵素ドメイン；２）標的細胞のエンドソームから細胞質内への毒素の少なくともＬＣ鎖の放出を容易にするＨ鎖のアミノ末端ハーフ（「Ｈ_Ｎ」と呼称）内に含まれる転移ドメイン；ならびに３）毒素の結合活性および結合特異性を決定するＨ鎖のカルボキシ末端ハーフ（Ｈ_Ｃ）内に見出される結合ドメイン。

Ｈ_Ｃは、Ｈ_ＣＮおよびＨ_ｃｃサブドメイン（それぞれＨ_ＣのＮ−およびＣ−末端部分）を含む。ほとんど、または全てのＢｏＮＴ／Ｘ毒素が「二重受容体」を用いて標的細胞に結合し、そこでＨ_ＣＮおよびＨ_ｃｃサブドメインの両方を含む毒素のＨ_Ｃ部分が、特定の細胞表面ガングリオシドおよびタンパク質受容体（おそらくグリコシル化されている）に結合し、このタンパク質受容体の結合が、細胞内毒素の内在化を容易にする、という実質的証拠がここに存在する。「Ｘ」は、ボツリヌス毒素の任意の血清型を意味する。用語「ＢｏＮＴ／Ｘ」は、一般にボツリヌス毒素のサブタイプを示すのに用いられるが、この用語は、そのＴｅＴＸ領域も包含し得る。Ｈ_ＣＣは、標的細胞の表面に位置する受容体複合体に結合する。

これらの毒素の各血清型の株またはサブタイプが存在し、これらは示される毒素または毒素ドメインの同一性または活性特性の実質的な変化なしに、重要でない領域（いわゆる「可変」領域）内で特に（しかし排他的ではない）、アミノ酸配列が多少異なり得ることは、理解されよう。

以下の表１に、標準的な１文字および３文字アミノ酸コードが示されている：

当業者は、先に示されたアミノ酸配列内に（またはこれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列内に）変異を有するクロストリジウムサブタイプの毒素変異体が天然に存在し得ることを認識している。本明細書で用いられる用語「天然由来のクロストリジウムドメイン変異体」は、非限定的に、選択的にスプライシングされる転写産物から生成されるクロストリジウムドメインアイソフォーム、自然突然変異により生成されるクロストリジウムドメインアイソフォーム、およびクロストリジウムドメインサブタイプなど、天然由来の過程により生成される任意のクロストリジウムドメイン（エンドペプチダーゼ、転移、および／または結合ドメイン）を意味する。本明細書で用いられる天然由来のクロストリジウムドメイン変異体は、天然由来のクロストリジウムドメインが基づく参照クロストリジウムドメインと実質的に同じ手法で機能し、本発明の任意の態様において参照クロストリジウムドメインと置き換えられ得る。

天然由来のクロストリジウムドメイン変異体は、天然由来のクロストリジウムドメイン変異体が基づく参照クロストリジウムドメインからの１つまたは複数のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、または１００以上のアミノ酸を置換し得る。天然由来のクロストリジウムドメイン変異体は、天然由来のクロストリジウムドメインの生物学的または生化学的活性が実質的に保持される限り、天然由来のクロストリジウムドメイン変異体が基づく参照クロストリジウムドメインから少なくとも１０の連続するアミノ酸、少なくとも１５の連続するアミノ酸、少なくとも２０の連続するアミノ酸、または少なくとも２５の連続するアミノ酸も置換でき、天然由来のクロストリジウムドメイン変異体が基づく参照クロストリジウムドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を有する。ドメインの特徴的機能および同一性が実質的に改変されない限り、保存的アミノ酸挿入および欠失もまた起こり得ることも理解されよう。

当業者は、遺伝子コードの縮重により、異なっているが定義されたヌクレオチド配列を有する異なるＤＮＡ分子の有限集合によってこれらのアミノ酸配列がコードされ得ることを認識するであろう。例えば、所与のペプチドまたはタンパク質をコードする縮重したヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞において好適な発現に適合または選択される異なるコドンを有し得る。この情報を利用して、これらのアミノ酸ドメインをコードする領域の任意の組み合わせを含む核酸分子を単独で、またはさらなる核酸配列と一緒に組み立てて、適切な発現ベクターに挿入し、続いて選択した宿主細胞内で発現させるために、発現可能な核酸オープンリーディングフレームを構築できる。例えば、国際特許公開ＷＯ０１／１４５７０号には、そのような方法を利用して一本鎖で切断可能な組換え修飾または非修飾クロストリジウム神経毒素誘導体ならびにそのキメラおよびハイブリッド形態を作製する方法が開示されている。発現可能な組換え神経毒素およびその誘導体を作製する方法を開示するさらなる発行物としては、米国特許第５，９８９，５４５号；同第６，２０３，７９４号；同第６，３９５，５１３号；米国特許出願公開第２００３／０１６６２３８号；同第２００２／１６９９４２号；同第２００４／１７６２９９号；同第２００４／１２６３９７号；同第２００５／０３５７３０号；同第２００５／０６８４９４号；同第２００６／０１１９６６号；国際特許出願Ｗ０９５／３２７３８号；ＷＯ９９／５５３５９号；Ｗ０９６／３３２７３号；Ｗ０９８／０７８６４号；Ｗ０９９／１７８０６号；ＷＯ９８／０７８６４号；ＷＯ０２／４４１９９号；ＷＯ０２／４０５０６号、および２０１２年１０月４日出願の米国特許出願第１３／６４４，３８６号が挙げられる。本特許出願に引用されるこれらのおよび全ての他の特許、特許公開、ならびに非特許公開は、そのように具体的に示されているか否かにかかわらず、本明細書の一部として参照により本明細書に個別に組み込まれる。

組換えＤＮＡ技術の利用は、天然由来の毒素サブタイプおよびその株からの異なるまたは修飾された機能的特性を有する修飾クロストリジウム神経毒素の構築を可能にする。

例えば、ネイティブ神経毒素軽鎖の天然由来アミノ酸配列を改変すること、および／または異なる治療性部分を付加することが、治療薬をニューロン内に運搬するように設計された輸送タンパク質の構築を可能にする。米国特許６，２０３，７９４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

標的（細胞結合）ドメインを改変することで、毒素を腺房細胞などの膵臓細胞内に輸送して、それによりそのような細胞による活性化された消化酵素の分泌を予防するか（米国特許第６，８４３，９９８号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、または感覚求心性ニューロン内に輸送して、それにより神経伝達物質、サイトカインおよび疼痛ペプチドの放出を予防し、こうして疼痛の緩和を提供できる（米国特許第６，３９５，５１３号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

加えて、米国特許第７，４２２，８７７号（参照により本明細書に組み込まれる）には、例えば、１つの神経毒素サブタイプ、例えばＢｏＮＴ／Ａの結合ドメインおよび転移ドメイン（またはその修飾バージョン）、ならびに別の神経毒素サブタイプ、例えばＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖領域、を含むキメラ神経毒素誘導体の作製が開示されている。神経毒素サブタイプの間の一般的な構造相同性を考慮すれば、３つの基本的クロストリジウム神経毒素ドメインの任意の組み合わせが、一本のアミノ酸鎖（または切断された二本鎖分子）で生成され得る。それゆえ、例えば、神経毒素サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＴｅＴＸのいずれかからの結合ドメインは、神経毒素サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＴｅＴＸからの転移ドメインと独立して組み合わせることができ、さらに神経毒素サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＴｅＴＸのいずれかからのエンドペプチダーゼドメインと独立して組み合わせることができる。これは、例えば、キメラ一本鎖を組換え構築して発現させ、続いて切断して二本鎖毒素を生じることにより、または一本のＨおよびＬ鎖を別個に発現させて、その後それを、例えば鎖間ジスルフィド結合の作製により組み合わせて、次に精製することにより、実施できる。さらに、そのような技術を利用して、様々なドメインの活性を改変でき（例えば、突然変異をＬＣドメインに導入してＬＣのプロテアーゼ活性を破壊できる）、または天然由来のドメインを、本明細書の他の箇所に記載されるように他の部分と置き換えることができ、そこで例えば、ＢｏＮＴ／Ａ（またはその一部）のＨＣドメインを突然変異もしくは欠失させて、標的リガンド（ＴＬ）を付加できる。

各クロストリジウム神経毒素サブタイプの３つの一般的神経毒素ドメイン（結合、転移およびエンドペプチダーゼ）を議論する場合、クロストリジウム神経毒素の研究は十分に発達した分野であること、およびこれらのドメインのそれぞれを含むアミノ酸配列とそれらの機能との相関性が周知であることは、理解されよう。これらの用語（「転座ドメイン」、「結合ドメイン」、および「プロテアーゼ」、「エンドペプチダーゼ」、「ＬＣ」または「軽鎖」ドメイン）のそれぞれへの言及が、表２に列挙されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜１４に列挙されたクロストリジウム神経毒素サブタイプのアミノ酸配列のいずれかに含まれる対応するドメイン、およびこれらの配列のまたはこれらの配列内のドメインの保存的に修飾され最適化された変異体を含むことは理解されよう。

加えて、これらの一般的ドメインのサブドメインへの細分化もまた、公知である。例えば、サブドメインＨ_ＣＮ（ＢｏＮＴ／Ａのほぼアミノ酸８７１〜１０９１に対応する、ドメインのアミノ末端部分）およびＨ_ＣＣ（ＢｏＮＴ／Ａのほぼアミノ酸１０９２〜１２９６に対応する、Ｈ_Ｃドメインのカルボキシ末端部分）への結合ドメインＨ_Ｃの細分化もまた、周知である。例えばＬａｃｙ ＤＢ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＣ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ， １９９９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９１：１０９１−１１０４を参照されたい。サブドメインＨ_ＣＮは、ボツリヌス毒素サブタイプ間で高度に保存されているが、その機能についてはほとんど知られていない。Ｈ_ＣＣサブドメインは、それほど保存されていない。

加えて、これらのドメインおよびサブドメインそれぞれのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知であり、本明細書に開示されており、それゆえ遺伝子コードの知識と併せて本開示を利用すれば、発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列が作製され得る。もちろん、本明細書を考慮して、示されたポリペプチドをコードする他のヌクレオチド配列を直ちに想起することは、当業者にとって日常的作業であろう。また、遺伝子コードの縮重により、各ポリペプチドについて、限定的数のヌクレオチド配列が可能である。さらに、参照配列と１０％以下、８％以下または５％以下の塩基対差を含む相同性の領域に、これらのヌクレオチド配列（またはそれらの特有の部分）の保存的に修飾された変異体を含む核酸が合成され得ることは、明らかである。

さらに、表２および本明細書の他の箇所に示されるアミノ酸配列、または関連の配列表が、これらのアミノ酸配列およびその示された領域をコードするあらゆるヌクレオチド配列の完全な開示を提供することは、理解されよう。所与の神経毒素サブタイプのエンドペプチダーゼドメイン、転移ドメインまたは結合ドメインをコードするヌクレオチド配列は、表２または他の箇所に列挙されるそのような参照アミノ酸配列領域のいずれかに対して６０％以上、または６５％以上、または７０％以上、または７５％以上、または８０％以上、または８５％以上、または９０％以上、または９５％以上、または１００％の同一性をそれぞれ有し得る。

ボツリヌス神経毒素は、クロストリジウム細胞により発現されるが、この細胞は、この神経毒素と非共有結合的に会合する１つまたは複数の非毒素「神経毒素関連タンパク質」またはＮＡＰも産生し、前駆複合体としても公知のヘマグルチニン複合体を形成する。これらのＮＡＰは、汚染された食物中で摂取されると、腸内の神経毒素耐性プロテアーゼ分解を支援する。

ＮＡＰタンパク質は、３つのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（ＨＡ１、ＨＡ２およびＨＡ３）、および非毒性のノンヘマグルチニンタンパク質（ＮＴＮＨ）を含む。ＢｏＮＴ Ａ２、ＥおよびＦ型はＨＡ遺伝子を有さず、ＢｏＮＴおよびＮＴＮＨを含む１２Ｓ（約３００ｋＤａ）複合体のみを生成する。「Ｓ」は、遠心沈降速度の単位であるスベドベリ単位を表す。Ｂ、ＣおよびＤ型は１２Ｓおよび１６Ｓ（約５００ｋＤａ）複合体を生成し；１６Ｓ複合体としては、ＢｏＮＴ、ＮＴＮＨ、ＨＡ１、ＨＡ２およびＨＡ３が挙げられる。Ａ１型は、１２Ｓおよび１６Ｓ複合体に加えて約９００ｋＤａの１９Ｓ複合体を有し、１９Ｓ複合体は１６Ｓ複合体の二量体を表し得る。

現在のところ、ＢｏＮＴ／Ａ１−および／Ｂ−ヘマグルチニン複合体は、そのような臨床使用で認可されている。ＢｏＮＴ／Ａ１複合体の治療上の利点は、そのプロテアーゼがニューロン中でより長い寿命を有するため、ＢｏＮＴ／Ｂよりも持続性がある。

上に示される通り、ＢｏＮＴは、単一のジスルフィド共有結合および追加的な非共有結合を通して重鎖（ＨＣ）に連結する軽鎖関連プロテアーゼドメイン（ＬＣ）からなる。ＨＣのカルボキシ末端（Ｃ−末端）部分（Ｈ_Ｃ）は、運動ニューロン、自律神経細胞および感覚ニューロンをはじめとする様々な神経タイプで発現される特異的アクセプタに結合する。標的細胞に結合するとＢｏＮＴ分子はエンドサイトーシスにより小胞体内に輸送され、ＨＣのアミノ末端（Ｎ−末端）ハーフ（Ｈ_Ｎ）が、「エンドソーム様」膜小胞からサイトゾルへとＬＣを転移させるチャネルを形成する。その後、ＬＣは、特異的ＳＮＡＲＥタンパク質基質を切断し、それにより小胞−膜融合を媒介するＳＮＡＲＥの能力、およびそれによる細胞からの神経伝達物質、サイトカインおよび疼痛ペプチドの放出を破壊する。

様々なＢｏＮＴ血清型のＬＣは類似しているが同一ではなく、２つの異なるＬＣは、異なるＳＮＡＲＥタンパク質を切断し得るか、または同じＳＮＡＲＥタンパク質を異なった様式で切断し得る。例えばＬＣ／Ａ、ＬＣ／Ｃ、およびＬＣ／ＥはＳＮＡＰ−２５を切断し；ＬＣ／Ｂ、ＬＣ／Ｄ、ＬＣ／Ｆ、およびＬＣ／Ｇはシナプトブレビン−２（ＶＡＭＰ−２）を切断し、追加的にＬＣ／Ｃは、細胞分裂に必要であると報告されている別のＳＮＡＲＥタンパク質である、シンタキシンを切断する。ＴｅＴｘのＬＣは、ＶＡＭＰ−２を切断する。各血清型のＬＣは、分子内の特有の位置でそれらの基質を切断する。

例えば、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖（ＬＣ／Ａ）はＳＮＡＰ−２５のＣ−末端から９アミノ酸を除去するが、ＬＣ／Ｅはさらに１７のＣ末端残基を欠失させ、したがって、安定なＳＮＡＲＥ複合体を不安定化することによりニューロエキソドサイトーシスのより破壊的な遮断を与える（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。例えば、ＬＣ／Ａによる神経伝達物質放出の阻害は、Ｃａ^２＋インフラックスを増加させることにより通常は逆行させることができるが、ＬＣ／Ｅの場合それができず、それはＳＮＡＰ−２５基質の破壊がより大きいためと推定される。しかし、ＬＣ／Ｅによる活性の「堅牢性」がより大きいにもかかわらず、ＬＣ／Ｅは短い一過性神経筋麻痺しか誘発しないため、その臨床適用は限定される。

新しい特性を有する治療薬を創出することが、非常に望ましい。例えば、１つを超える血清型に由来する２つ以上の軽鎖エンドペプチダーゼをＢｏＮＴまたはＴｅＴｘ誘導体中で組み合わせ、各軽鎖が活性でありその基質ＳＮＡＲＥタンパク質中の異なるアミノ酸配列を認識する治療薬を、慢性疼痛、慢性炎症性の疾病（関節炎など）、および／またはサイトカイン放出を含む疾病などの疾病を標的とするように設計できる。

一例として、ＬＣ／Ｅの強力なプロテアーゼをＬＣ／Ａの長期持続作用と併せた治療薬が、設計される。これは、緊張性頭痛／片頭痛をはじめとする慢性疼痛、および関節炎などの慢性炎症性疾病を処置するためのＢｏＮＴ／Ａの有効性を改善するのに特に重要である。なぜならＢｏＮＴ／Ａ複合体は単独で、そのような患者の全てではないが一部において効果的であると見出されているためである。例えば、Ｎａｕｍａｎｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００８） ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ： ＢＯＴＵＬＩＮＵＭ ＮＥＵＲＯＴＯＸＩＮ ＩＮ ＴＨＥ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＡＵＴＯＮＯＭＩＣ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＰＡＩＮ （ＡＮ ＥＶＩＤＥＮＣＥ−ＢＡＳＥＤ ＲＥＶＩＥＷ）： ＲＥＰＯＲＴ ＯＦ ＴＨＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＳＵＢＣＯＭＭＩＴＴＥＥ ＯＦ ＴＨＥ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０：１７０７−１７１４（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。疼痛タンパク質およびサイトカインなどの疼痛関連因子のエキソサイトーシスの遮断が、慢性疼痛、神経因性疼痛および炎症性疾病を処置する上で有用であることを立証できる。

ＢｏＮＴ／Ａは、疼痛のほとんどの形態のシグナル伝達に関与するカチオンチャネルであるＴＲＰＶ１（一過性受容体電位バニロイド（ｖａｌｌｉｎｏｉｄ）１）を活性化することにより誘発される場合、感覚ニューロンからの疼痛刺激性ペプチド［例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）およびサブスタンスＰ］のエキソサイトーシスによる放出を遮断できない（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。

ＢｏＮＴ／Ｅもまた、その細胞表面アクセプタ（グリコシル化シナプス小胞タンパク質２Ａ（ＳＶＰ２Ａ）およびグリコシル化ＳＶＰ２Ｂ）が感覚ニューロンに少ないか存在しないため、感覚ニューロンからのＣＧＲＰおよびサブスタンスＰの、カプサシン刺激によるＰＴＲＶ１媒介性放出を阻害できない。しかし、ＢｏＮＴ／ＥのＨ_Ｃ（受容体結合ドメイン）がそのＢｏＮＴ／Ａからの対応物により置換されたキメラタンパク質は、これらの疼痛媒介ペプチドの放出を遮断でき、ＢｏＮＴ／Ａ細胞表面受容体が侵害受容性Ｃ線維へのＬＣ／Ｅのエンドサイトーシスおよび送達を容易にすることを示している。

ＬＣ／Ｅプロテアーゼは、ニューロン内部に入ると、２６のＳＮＡＰ−２５アミノ酸残基を除去し、これによりニューロエキソサイトーシスに必要とされる安定なＳＮＡＲＥ複合体の形成を妨害する（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。ＬＣ／ＡもまたＳＮＡＰ−２５を切断するが、それは９アミノ酸を切断するだけで、エキソサイトーシス活性の遮断は完全でなくそれほど安定でない。

ＬＣ／Ｅプロテアーゼのそのような有利な特性を臨床的に活用するように実践に移すためには、その作用期間を大きく延長させることが望ましい。

リンカーを介してＢｏＮＴ／ＡのＮ−末端ＬＣ／Ａ部分に接続される活性ＬＣ／Ｅをコードする遺伝子構築物を作製して、２つの活性プロテアーゼを含む複合神経毒素ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａを作製することによる、複合神経毒素の作製の略図である。 ［図２Ａ］Ｈｉｓ６のタグが付された（「Ｈｉｓ６」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として開示）ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ構築物の、Ｈｉｓ６タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）に対する高度の選択性を有するＣｏ^２＋−荷電アガロース樹脂であるＴａｌｏｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．により製造）を用いる、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の写真である。［図２Ｂ］プールしたＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ含有ＩＭＡＣ画分を続いてカチオン交換クロマトグラフィーに供した溶出プロファイルにおける、吸光度および導電率対時間を示す。 精製ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａをビオチン化トロンビンで処置して二本鎖毒素を作製しＨｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）タグを除去することを示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の写真である。記号＋および−は、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ鎖とＨＣ／Ａ鎖とを連結するジスルフィド結合を還元するための、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）剤を用いた処置、または用いない処置をそれぞれ示す。 ＢｏＮＴ／Ａ（上のゲル）およびＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ（下のゲル）の希釈系列を、培養ラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）中のＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ−２５を切断するそれらの能力についてアッセイする、ウェスタンブロットの写真である。 最大耐量（ＴＤ_ｍａｘ）を時間（日）の長さに対してプロットした、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／ＥまたはＢｏＮＴ／Ａを注射された腓腹筋における筋肉麻痺の持続時間を示す。 ［図６Ａ］ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの希釈系列をラットＴＧＮ（三叉神経節ニューロン）と一夜インキュベートし、その後、抗ＳＮＡＰ−２５および抗シンタキシン抗体を用いて、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／ＡがシンタキシンではなくＳＮＡＰ−２５を切断する（主に、ＬＣ／Ｅにより生成される２６残基のトランケート型ＳＮＡＰ−２５切断産物を生成する）能力について、その溶解物をアッセイする、ウェスタンブロットの写真である。［図６Ｂ］ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａによる用量反応曲線であり、ａ）ＳＮＡＰ−２５の切断、およびｂ）６０ｍＭ ＫＣｌにより誘発されるＣＧＲＰ放出の阻害、またはｃ）ラットＴＧＮ中のカプサイシン、ならびにＢｏＮＴ／Ａが、ＢｏＮＴ／ＡとインキュベートされたＴＧＮ中でカプサイシンにより誘発されるＣＧＲＰ放出を有意に減少させることができないことを示している。 ［図７Ａ］ラットモデルにおける抗侵害受容活性の持続時間のプロット、つまり生理食塩水、ＢｏＮＴ／ＡまたはＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａで処置された動物について、その後コールド（４℃）プレートに足を置き、ラットがプレートから足を逃避するのに必要な時間を測定する、術前４日〜術後約２１日に実施された神経部分損傷（ＳＮＩ）テストのプロットである。［図７Ｂ］ラットモデルにおける抗侵害受容活性の持続時間のプロット、つまり生理食塩水、ＢｏＮＴ／ＡまたはＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａで処置された動物について、その後に後足の足底表面に較正したフォン・フレイ・ヘアをあてた時の感受性によりアロディニアの誘導を測定する、術前４日〜術後約２１日に実施された神経部分損傷（ＳＮＩ）テストのプロットである。 ［図８Ａ］本発明のデュアルプロテアーゼポリペプチドの略図である。このポリペプチドは、２つの異なるＳＮＡＲＥタンパク質を不活化する（ＬＣ／ＢによりＶＡＭＰおよびＬＣ／ＡによりＳＮＡＰ−２５）。合成ＬＣ／Ｂ遺伝子は、リンカー配列（「ＤＩ」残基をコードする）を介してＢｏＮＴ／Ａの５−末端に融合されて、複合神経毒素ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａを生成する。後者はまた、２つのトロンビン認識配列を含む。［図８Ｂ］Ｔａｌｏｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．により製造）を用いる、ＩＭＡＣによるＨｉｓ_６タグＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａの精製を表す、クーマシーブルーにより染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。［図８Ｃ］ビオチン化トロンビンで処置して二本鎖（ＤＣ）毒素を生成したＩＭＡＣ精製ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。記号−および＋は、還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた、または用いない処置をそれぞれ示す。［図８Ｄ］ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａの系列希釈物がラットＣＧＮと３７℃で２４時間インキュベートされるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す。溶解物を、その後、抗ＳＮＡＰ−２５および抗ＶＡＭＰ２抗体を用いてアッセイして、２つのＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ−２５およびＶＡＭＰ２の毒素の切断をモニタリングする。その特異的抗体によりプローブされ、ＬＣ／ＢまたはＬＣ／Ａのいずれにの認識されないシンタキシン１を、内部負荷対照とした。［図８Ｅ］高濃度のＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａ構築物でのＳＮＡＰ−２５（長方形）およびＶＡＭＰ２（逆三角形）の切断を示す、ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａの用量／反応曲線を示す。 マルチＳＮＡＲＥ切断治療薬の候補が、ＳＮＡＲＥタンパク質の３つの主要なタイプ全てを不活化する（ＬＣ／Ｃ１によりＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン１〜３、ならびにＬＣ／ＤによりＶＡＭＰ１〜３）能力を有することを示す、本発明の別の例である。ＤＩは、ＬＣ／ＤとＬＣ／Ｃ１の間のリンカーである。 ［図１０Ａ］ラットモデルにおける抗侵害受容活性の持続時間のプロット、つまり生理食塩水、ＰＫ（ＧＭＰ遵守のＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ）またはプレガバリンで処置された動物について、その後に足をフォン・フレイ・フィラメントで刺激して、ラットによる足逃避の機械的閾値を測定する、術前４日〜術後約２１日に実施された神経部分損傷（ＳＮＩ）テストのプロットである。［図１０Ｂ］ラットモデルにおける抗侵害受容活性の持続時間のプロット、つまり生理食塩水、ＰＫ（ＧＭＰ遵守生成法に適合した工程を利用して製造されるＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ）またはプレガバリンで処置された動物について、その後コールド（４℃）プレートに足を置き、ラットがプレートからの足を逃避するのに必要な時間を測定する、術前４日〜術後約２１日に実施された神経部分損傷（ＳＮＩ）テストのプロットである。 ラットモデルにおける抗侵害受容活性の持続時間のプロット、つまり生理食塩水またはＰＫ（ＧＭＰ遵守生成法に適合した工程を利用して製造されるＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ）で処置された動物について、足をフォン・フレイ・フィラメントで刺激して、ラットによる足逃避の機械的閾値を測定する、術前４日〜術後約３６日に実施された神経部分損傷（ＳＮＩ）テストのプロットである。ＰＫの二回目の注射を、術後１０日目に１群の動物に実施した。

発明の詳細な説明
本発明は、ボツリヌス神経毒素由来の治療性ポリペプチド分子に関する方法および組成物を対象とする。詳細にはこの分子は、異なるＢｏＮＴ血清型の軽鎖に由来する少なくとも２つの活性エンドペプチダーゼドメインを含む。非常に好ましくはこのエンドペプチダーゼドメインは、それらの基質における異なるアミノ酸配列を認識して切断する。特に好ましくは、このエンドペプチダーゼドメインは、２つ以上のＢｏＮＴ血清型、または１つのＢｏＮＴ血清型と１つのＴｅＴｘ ＬＣに由来する。

選択されたＢｏＮＴの重鎖と、少なくとも２つの異なる活性クロストリジウム軽鎖エンドペプチダーゼドメインとを組み合わせる能力が、増強され目的に合った特性を有する改変された治療性分子を提供する。そのような治療薬は、２つの異なるＢｏＮＴ血清型の複合体をコードする遺伝子構築物の設計および作製、ならびに治療適用を有する多重的かつ相乗的な生物活性を示す組換えタンパク質の原核生物発現／精製により最初に例示される。

そのようなマルチエンドペプチダーゼ治療薬によるエキソサイトーシスの遮断は、疼痛を感知する受容体の感覚ニューロン表面への輸送を遮断するなど、さらなる活性を有し得る。したがってそのような治療薬は、可溶性シナプス因子のエキソサイトーシスを阻害するだけでなく、神経膜に不可欠なタンパク質の輸送も阻害し得る。

実施例の節に示されていない特定の治療薬において、治療薬が異なる細胞型に、またはさらなる細胞型に標的を変更するように、天然由来の結合ドメインを改変できる。例えば、Ａｏｋｉらの米国特許第６，７７６，９９０号では、ＢｏＮＴの結合領域が、ヒトコレシストキニンまたはその類似体で置換されており、それによりこの毒素（エンドペプチダーゼを１つだけ有する）を膵臓腺房細胞に標的させている。同様に、２０１２年１０月４日出願の米国特許出願第１３／６４４，３８６号では、標的リガンドが、特定の実施例で天然由来の結合ドメインを置換している。そのような一実施例において、ヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）をコードする遺伝子を用いて天然由来Ｈ_Ｃ領域またはその一部を置換し、それによりサイトカイン分泌細胞を標的としている。

本発明を例証する目下好ましい分子は、分子生物学的方法を利用して活性組換えＢｏＮＴ／ＡのＬＣ／Ａに融合されるＢｏＮＴ／ＥのＬＣを含むタンパク質を発現する核酸構築物を作製するための新規概念に基づいている。この独特の分子はニューロンＢｏＮＴ／Ａアクセプタ（例えば、シナプス小胞タンパク質２および／またはガングリオシド）に結合するＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ（図１に示す）を含み、アクセプタを介したエンドサイトーシスを受けてサイトゾルに転移し、そこでＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ−２５が効果的に切断されて、神経伝達物質、サイトカインおよび疼痛ペプチド放出の阻害をもたらす。「効果的に切断される」は、ＳＮＡＰ−２５分子の大部分が、Ｃａ^２＋インフラックスの増加によるエキソサイトーシス遮断の逆行を防ぐために十分な数の切断されるアミノ酸を有することを意味し、例えば、ＬＣ／ＥによるＳＮＡＰ−２５の切断の結果などである。

上に注記された構築物は、トロンビンプロテアーゼにより選択的に認識され切断される、／ＡのＨＣとＬＣの間に位置する特異的アミノ酸残基をコードする短い配列を含むように好ましくは設計され、そうして得られた一本鎖（ＳＣ）組換えタンパク質は、トロンビンへの暴露によりインビトロで二本鎖（ＤＣ）形態に変換され得る。

非常に好ましくは、本発明は、２つのアミノ酸リンカー（例えば、アスパラギン酸−イソロイシン；ＤＩ）を介してＢｏＮＴ／ＡのＬＣ／Ａ部分に連結され、新規な複合体毒素を生じる、ＬＣ／Ｅにより例示される。この構築物への感覚ニューロンの暴露を含む実験では、プロテアーゼが培養ニューロン内に送達されることが示され、付着したＬＣ／Ｅが安定化され、今度はＬＣ／Ａのような長期の神経麻痺を生じた。

重要なことに、ＬＣ／Ａとは異なり、この長期作用性分子は、ＬＣ／Ｅに切断されたＳＮＡＰ−２５が神経伝達物質、サイトカインおよび疼痛ペプチドの放出を媒介できないため、主にＬＣ／Ｅに特徴的なタンパク質分解産物を生じ、ラット培養感覚ニューロンからのカプサイシンにより誘発される疼痛メディエータの放出を遮断した。その上、この複合体タンパク質は、神経因性疼痛（神経部分損傷誘発性）のラットモデルにおいて、疼痛行動を減弱する際にＬＣ／Ａよりも効果的であることが立証された。

したがってこの例示的キメラ分子は、慢性疼痛処置のための治療薬として主要な利点：（Ａ）付着したＬＣ／Ａ内に存在する神経終末保持／安定化モチーフのおかげで正常に一過的に作用する／Ｅプロテアーゼの非常に望ましく、かつ大きく延長した寿命；（ｂ）／ＥプロテアーゼによるＳＮＡＰ−２５の優先的切断がＳＮＡＲＥ複合体を不安定化すること、および（ｃ）感覚ニューロンからの疼痛ペプチドのＴＲＰＶ１−を介したエキソサイトーシスの阻害、を提示する。これらの新しい知見は、相乗的に配合された作用を示すこの独自の改変タンパク質の抗侵害受容能力を強調する。天然ＢｏＮＴの第一世代を上回るその利点が、結果的に実証されており、したがって大きく改善された治療薬が得られるはずである。

ネイティブＢｏＮＴは１つしかプロテアーゼドメインをもたないため、余分のＬＣ（ｅｘｔｒａ ＬＣ）（異なる位置にある同じ基質（または別の基質）のいずれかを切断する）を送達するという革新的概念は、その阻害的特性を有意に増幅させるだけでなく、本来のＬＣ／Ａの影響をさらに安定化させて、驚くべき相乗作用、即ちＢｏＮＴ／Ｅと比較した治療利益の持続時間の大きな延長をもたらす。

別の例において、異なるマルチエンドペプチダーゼ治療薬が、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ核酸の構築に用いられる技術を利用したＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａ核酸構築物の構築により例示される。ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドの発現、およびトロンビン部位のニッキングにより、得られるタンパク質はＳＮＡＰ−２５およびＶＡＭＰ−２の両方を切断する。シナプス融合三元複合体に関与する２つのＳＮＡＲＥタンパク質の切断は、より効果的であろう。

本発明の一般的概念によれば、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインと、を含むポリペプチドを含み、上記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび上記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれが、ＳＮＡＲＥタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質における異なる切断部位を認識する、組成物が提供される。

この一般的概念の組成物を用いる核酸および処置方法も、企図される。さらに、慢性疼痛の処置における使用のための、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインと、を含むポリペプチドを含み、上記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび上記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれが、ＳＮＡＲＥタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質における異なる切断部位を認識する、治療性組成物も企図される。加えて、慢性疼痛の処置のための薬剤を製造するための、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物の使用であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインと、を含むポリペプチドを含み、上記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび上記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれが、ＳＮＡＲＥタンパク質に対して選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質において異なる切断部位を認識する、使用も企図される。

本発明の好ましい実施形態によれば、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、
ａ）結合ドメインと、
ｂ）転移ドメインと、
ｃ）クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、
ｄ）クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと、
を含むポリペプチドを含む、組成物が提供される。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、クロストリジウム神経毒素誘導体を含むポリペプチドをコードする核酸であって、上記核酸が、カルボキシ末端からアミノ末端への順に、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと、をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む、核酸が提供される。

本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、慢性疼痛の処置において使用するための、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと、を含むポリペプチドを含む、治療性組成物が提供される。

本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、慢性疼痛の処置のための薬剤を製造するための、クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物の使用であって、上記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来の第一のエンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来の第二のエンドペプチダーゼドメインと、を含むポリペプチドを含む、使用が提供される。

実施例
実施例１
Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現増大のために最適化されたコドンとＬｙｓ残基をコードする３つの余分のヌクレオチド（ＡＡＡ）とを有する合成ＢｏＮＴ／Ａの遺伝子を、原核生物発現ベクターｐＥＴ２９ａ（＋）のＮｄｅ ＩおよびＳａｌ Ｉ部位にクローニングして、ｐＥＴ−２９ａ−ＢｏＮＴ／Ａを生成した。

その後、ｐＥＴ２９ａクローニングベクターによりコードされるヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔａｄｉｎｅ）（Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））タグの制御された特異的ニッキングおよび同時除去の能力を提供するために、ｐＥＴ−２９ａ−ＢｏＮＴ／Ａをさらに修飾した。トロンビン切断部位をコードするヌクレオチド配列を、毒素のＨＣ／ＬＣループをコードする核酸領域に操作的に挿入した。これは、核酸およびアミノ酸の両形態で、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として、下に示されている。

修飾ＢｏＮＴ／Ａループヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびそのコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）

加えて、更なるトロンビン部位を、発現されるタンパク質のＨＣ／Ａをコードする領域とＨｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）領域の間に挿入した。これは、核酸およびアミノ酸の両形態で、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として、下に示されている。

ＢｏＮＴ／Ａ遺伝子の３’末端に融合されたヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびそのコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）

上に示されるヌクレオチド配列は、左から右に向かってそれぞれ以下の領域を含む。
ａ）ヌクレオチド１〜３：Ｃ−末端Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を除去するための、任意のトリプシン切断部位を提供する追加的Ｌｙｓをコードする、挿入されたＡＡＡコドン；
ｂ）１本の下線：Ｓａｌ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位；
ｃ）二重下線：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位；
ｄ）太字：トロンビン認識配列；
ｅ）１本の下線：Ｐｓｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位；
ｆ）二重下線：Ｘｈｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位；
ｇ）ヌクレオチド４９〜６６：Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）タグをコードするヌクレオチド領域。アライメントされたアミノ酸配列が、対応するヌクレオチドの上に示されている。矢印はトロンビン切断部位を示し、アスタリスクは翻訳「終止」コドンを表す。

上に記載されるＢｏＮＴ／Ａオープンリーディングフレームを含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の両方を含むこの核酸構築物を、ｐＥＴ２９ａ−ＢｏＮＴ／Ａ−２Ｔと呼称した。

ＰＣＲ産物（アンプリコン）を、ＬＣ／Ｅプロテアーゼ（残基１〜４１１）をコードする合成核酸から増幅し、増幅中に２つの制限部位（Ｎｄｅ ＩおよびＥｃｏ ＲＶ）を、核酸アンプリコンの５’および３’末端にそれぞれ組み込んだ。このＰＣＲアンプリコンをその後Ｎｄｅ ＩおよびＥｃｏ ＲＶにより消化して、同様にＮｄｅ ＩおよびＥｃｏ ＲＶで消化されたｐＥＴ２９ａ（＋）ベクターにクローニングした。得られた中間体ベクター構築物を、ｐＥＴ２９ａ−ＬＣ／Ｅと命名した。

ｐＥＴ２９ａ−ＢｏＮＴ／Ａ−２Ｔをテンプレートとして用いる一対のプライマー（バクテリオファージＴ７末端リバースプライマーおよびＢｏＮＴ／Ａの５’コード配列の上流のＥｃｏＲＶ制限配列を含むフォワードプライマー）によるＰＣＲにより、上に記されたＢｏＮＴ／Ａ−２Ｔのインタクト「一本鎖」オープンリーディングフレームＢｏＮＴ遺伝子領域を増幅した。得られたＰＣＲアンプリコンをＥｃｏＲＶおよびＸｈｏ Ｉ酵素により消化して精製し、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏ Ｉで切断したｐＥＴ２９ａ−ＬＣ／Ｅプラスミドに挿入した。この最終構築物をｐＥＴ２９ａ−ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａと呼称し、その核酸のオープンリーディングフレームをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５として開示し、対応するアミノ酸配列を本明細書においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として開示する。

実施例２
ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの発現のため、配列が検証された構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、標的タンパク質の発現を、スタディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ’ｓ）自動誘導培地を用いて誘導した（Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ．， ４１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ２０７ （２００５））。細菌溶解物中のＨｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）タグタンパク質の部分精製（約６０％）を、Ｔａｌｏｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｒｅｓｉｎを用いる固定金属（Ｃｏ^２＋）アフィニティークロマトグラフ（ＩＭＡＣ）で実現した。分子量約２００ｋＤａの主要なタンパク質が、５０ｍＭ以上のイミダゾールにより溶出され、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそのゲルのクーマシーブルー染色を示す図２Ａにおいて示される。ゲルのレーンは以下の通りである：レーン１：ＩＭＡＣカラムにアプライする前の洗浄された溶解物；レーン２：ＩＭＡＣカラムのフロースルー画分；レーン３：ＩＭＡＣカラムの洗浄画分；レーン４〜９：ＩＭＡＣカラムからイミダゾールを用いて溶出された画分。

プールされたＩＭＡＣ溶出画分を０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にバッファー交換し、その後、ＵＮＯ−Ｓ１カチオン交換カラムにロードすることによりさらに精製し、次に１５０ｍＭまでのＮａＣｌで洗浄し、その後、ＮａＣｌ勾配で溶出し、毒素は２２０ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度で溶出された。図２Ｂは、時間の関数としてのＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ一本鎖ポリペプチドの溶出プロファイル（２８０ｎｍの吸光度）を示し、ＮａＣｌ勾配の導電率上昇を重ね合わせている。矢印は、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａを含有する吸光度ピークの位置を示している。

実施例３
溶出されたインタクト毒素を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１４５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した後、精製された一本鎖（「ＳＣ」）タンパク質を−８０℃で貯蔵し、アリコットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために採取した。図３は、精製されたポリペプチドの還元（＋）および非還元（−）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の結果を示しており、見かけの分子量が約２００ｋＤａの単一バンド移動により明らかなように、この精製タンパク質が実際にＳＣ形態で発現されたことが確認される。このバンドは、還元剤の非存下または存在下のいずれかで認められた。例えば、図３のクーマシーブリリアントブルー染色ゲル写真のレーンＳＣ（−）およびＳＣ（＋）を参照されたい。

このＳＣポリペプチドのニッキングを、ビオチン化トロンビン（１単位／ｍｇタンパク質）との２２℃で３時間のインキュベーションにより試行し；その後、試料をストレプトアビジンアガロースで処理することにより、トロンビンプロテアーゼを除去する。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した試料中に、タンパク質のトロンビン処理後に約１００ｋＤａの見かけの分子量を有するバンドが出現しており；約２００ｋＤａのバンドはこれらの条件下では認められないが、非還元条件下で泳動されたゲルには存在し、一方約１００ｋＤａのバンドは、これらの後者の試料中には存在しない。図３のクーマシーブリリアントブルー染色ゲル写真のレーンＤＣ（−）およびＤＣ（＋）を参照されたい。

約１００ｋＤａのバンドは、類似のサイズであるＬＣ／Ｅ−ＬＣ／Ａ鎖とＨＣ／Ａ鎖の両方を表すと考えられる。このバンドの中のポリペプチドの正体は、推定の一本鎖ポリペプチドＬＣ／ＥおよびＢｏＮＴ／Ａのそれぞれに対する特異的な抗体を用いて、ニッキングおよび非ニッキングＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａで泳動されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットにより確認される。

図３に示される通り、ニッキングされた試料は、還元剤の非存在下で依然として２００ｋＤａ付近に移動しており、ＬＣ／Ｅ−ＬＣ／ＡとＨＣ／Ａの間に鎖間ジスルフィド結合が形成されたことを示し、このジスルフィド結合は、標識（−）と印され抗ＬＣ／Ｅまたは抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体のいずれかを用いて発色されたウェスタンブロットのレーンで示されるように全ての試料において残存している。したがって、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、複合毒素を分解せずに起こるループ領域での特異的ニッキングを強調する。非ニッキングおよびニッキングタンパク質の移動度のわずかな差は、トロンビン処理された試料中のＨｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）タグの除去によるものであり、これは、このタグに対する特異的抗体を使用して確認された。Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）タグが検出されない、図３の抗−Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）抗体を用いたウェスタンブロットを参照されたい。それゆえこの実験は、トロンビンプロテアーゼが同時に、ＨＣと最初のＬＣの間のジスルフィド結合の連結されるシステイン残基間で毒素をニッキングして、かつＨｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を除去し得ることも実証した。

実施例４
組換え生成されたＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａを、培養されたラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）と共に、１０倍系列希釈された０．０１ｐＭ〜１０００ｐＭの毒素濃度で一晩それぞれインキュベートした。これらの細胞を、７〜８日齢ラットの小脳から分離して、基本イーグル培地３部および４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３）＋７８．４ｍＭ ＫＣｌ＋３７．６ｍＭ Ｄ−グルコース＋２．８ｍＭ ＣａＣｌ_２＋１．６ｍＭ ＭｇＳＯ_４＋１．０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ １部、ならびに１×Ｎ２サプリメント、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、６０単位／ｍｌペニシリン、６０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２％（ｖ／ｖ）ウマ透析血清の中に、約１×１０^６／ｍｌで懸濁させる。この細胞懸濁液のアリコット（１ｍｌ）を、１６ｍｍ径ポリ−Ｄ−リシンコーティングウェル（即ち、２４ウェル形式）のそれぞれに添加し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２中で２０〜２４時間培養した後、シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（４０μＭ）を添加し；ニューロンを、１０日おきに同一の新たに調製された培地と交換することにより保持する。特定されたら、ニューロンを培地中のＢｏＮＴ／ＡまたはＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ（０．２−μｍフィルターで滅菌済）のいずれかに２４時間暴露する。ＢｏＮＴ／ＡまたはＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質と２４時間インキュベートした後、細胞をその後回収し、インタクトＳＮＡＰ−２５を認識する抗ＳＮＡＰ−２５抗体ならびに、ＬＣ／Ａ切断ＳＮＡＰ−２５およびＬＣ／Ｅ切断ＳＮＡＰ−２５を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供する。ＳＮＡＲＥタンパク質シンタキシン１を、陽性内部負荷対照として用いた。

抗ＳＮＡＰ−２５抗体を用いて、ウェスタンブロットを実施した。図４に認められる通り、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、インタクトＳＮＡＰ−２５の切断においてＢｏＮＴ／Ａとほぼ同程度に活性があり、各例で１ｐＭを超える毒素濃度で顕著な切断が起こった。注目すべきこととして、認められる通り、約１ｐＭ未満の毒素を用いる場合に、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／ＡでのＣＧＮの処置もまたＬＣ／Ａ切断生成物を与える。この切断生成物（「ＳＮＡＰ−２５_Ａ」）は、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ毒素濃度が約０．０１ｎＭを超えて上昇した場合に、同時に送達されるＬＣ／Ｅプロテアーゼにより、ＬＣ／Ｅの切断生成物（「ＳＮＡＰ−２５_Ｅ」）に実質的にさらに切断されると思われる（図４）。これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ａの重鎖転移ドメインは共有結合で連結されるＬＣ／ＡおよびＬＣ／Ｅプロテアーゼの両方をＣＧＮのサイトゾルへ送達でき、これらのプロテアーゼは依然として活性がありＳＮＡＰ−２５を切断し、それによりＳＮＡＲＥタンパク質を全体的または部分的に不活化させる、ということを示唆している。

実施例５
ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの特異的神経毒性は、参照により本明細書に組み入れられるＭａｉｓｅｙ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １７７ ＥＵＲ． Ｊ． ＢＩＯＣＨＥＭ． ６８３−６９１（１９８８）に記載される手法で、マウスに腹腔内注射することにより測定される。４日以内にマウスの５０％を殺傷する最低毒素量は、１最小致死量（ｍＬＤ５０）と定義される。毒素の特異的活性は、ｍＬＤ５０単位／ｍｇ毒素の数として表現できる。

ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ調製物のｍＬＤ５０は、０．７×１０^８であると観察される。この特異的活性は、組換えＢｏＮＴ／Ｅで観察される活性（０．４×１０^８）と組換えＢｏＮＴ／Ａ（２×１０^８）で観察される活性との間にある。インビボでの神経麻痺作用の持続時間は、参照により本明細書に組み入れられるＡｏｋｉ， Ｋ．Ｒ．， ３９ ＴＯＸＩＣＯＮ １８１５−１８２０ （２００１）に記載されるマウス指外転スコア（ＤＡＳ）アッセイを利用して評価した。

組換えＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａを、全身症状を生じることなく実験動物に投与され得る最大耐量である０．５ｍＬＤ_５０単位の用量で、マウス腓腹筋に注射する。このＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ投与量は約２７日間麻痺を誘発し；６単位のネイティブＢｏＮＴ／Ａにより誘導される効果と類似していた（図５参照）。ＢｏＮＴ／Ｅと比較して長期に持続するＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の作用は、見かけ上は、融合タンパク質中のＬＣ／Ａ部分の、付着したＬＣ／Ｅ部分を安定化させる能力によるもので；ＢｏＮＴ／Ｅ単独では、他の毒素よりもかなり短い麻痺を与える(図５のＢｏＮＴ／Ｅ対ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの比較を参照）。

実施例６
三叉神経節ニューロン（ＴＧＮ）を用いて、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の抗侵害受容能を検査する。これらの細胞は、疼痛の伝播へのそれらの関与および、培養中のこれらの細胞が、異なる刺激により惹起される疼痛ペプチド（ＣＧＲＰ、ＳＰ）の放出を研究するための良好なモデルを提供するという事実から、この実験の良好なモデルである（例えば、Ｂａｃｃｃａｇｌｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｇａｎ， ８０ ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ ＳＣＩ Ｕ．Ｓ．Ａ． ５９４−５９８ （１９８３）参照）。トウガラシから単離されたカプサイシンは、感覚ニューロンのＣ線維で主に発現されるＴＲＰＶ１を活性化する。したがって、アゴニストであるカプサイシンにより誘発されるＣＧＲＰの放出を遮断するこの複合毒素の能力は、その阻害活性の良好な指標になるはずである。

ＢｏＮＴ／Ａは、ＳＮＡＲＥタンパク質のＳＮＡＰ−２５の（「／Ａトランケート型」ＳＮＡＰ−２５切断生成物）のＣ末端から９アミノ酸残基を除去するのみで、ＴＧＮ中のカプサイシンにより誘起されるＣＧＲＰのエキソサイトーシスに影響を及ぼさない。これに対して、ＬＣ／Ｅプロテアーゼによる１７のさらなる残基の除去（「／Ｅトランケート型」ＳＮＡＰ−２５の切断生成物をもたらす）は、このカプサイシン刺激によるＣＧＲＰ放出を遮断する（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＭｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２９ Ｊ ＮＥＵＲＯＳＣＩ ４９８１−４９９２ （２００９）を参照されたい）。

長期作用性毒素ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの主なＳＮＡＰ−２５切断生成物は、ＣＧＮ中の「／Ａトランケート型」ＳＮＡＰ−２５切断生成物ではなくむしろ「／Ｅトランケート型」ＳＮＡＰ−２５切断生成物であるため（図４参照）、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／ＡはＣＧＲＰ疼痛ペプチドの放出を遮断するであろうと予測される。

手短に述べると、出生後５日目のウィスターラットから、Ｄｏｌｅｔｈａｌ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射で深麻酔を施した後にＴＧＮを切除する。組織を氷冷Ｌ１５培地に入れ、その後、氷冷滅菌ＣＭＦ−ＨＢＳＳで２回洗浄した後、１７０ｇで１分間遠心分離する。組織を小片に切り刻んで、Ｌ１５培地でプレコーティングされた１０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎピペットに通した後、この組織を、２．４Ｕ／ｍｌジスパーゼＩＩおよび１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩを含有するカルシウムおよびマグネシウム不含ハンクスバランス塩溶液（ＣＭＦ−ＨＢＳＳ）の１：１混合物中で、３７℃にて３０分間浸透しながらインキュベートする。その後、この懸濁液を、Ｌ１５培地でプレコーティングした１０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎピペットに通して、濁るまで穏やかに粉砕した後、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを１５分間添加する。

１７０ｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを懸濁させて、培地［１０％（ｖ／ｖ）熱非働化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するハムＦ１２溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス所在）］で３回洗浄する。細胞を、神経成長因子（ＮＧＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＦ１２培地中のポリ−Ｌ−リシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびラミニン（２０μｇ／ｍｌ）でプレコーティングされた２４ウェルプレートに播種して、３７℃のＣＯ_２インキュベータ中に保持する。２４時間後（そしてその後毎日）培養上清を、抗有糸分裂薬シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（１０μＭ）を含有する新鮮な培地と交換する。

ラットＴＧＮをＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの系列希釈物と３７℃で一夜インキュベートした後、切断の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の、インタクトならびにＡトランケート型およびＥトランケート型生成物に結合できる抗ＳＮＡＰ−２５抗体を用いるウェスタンブロットによりモニタリングする。

図６Ａに示される通り、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、主に「／Ｅトランケート型」ＳＮＡＰ−２５切断生成物を含む、ＳＮＡＰ−２５の用量依存的切断を与える。

加えて、予測された通り、この複合毒素は、６０ｍＭ ＫＣｌまたはカプサイシンにより誘発されるＴＧＮによるＣＧＲＰの放出を、用量依存的様式で遮断する（図６）。Ｃａ^２＋−依存性ＣＧＲＰ放出は、ＨＢＳ中の６０ｍＭ ＫＣｌ（ＮａＣｌで等張的に均衡を保たれた）での処理により刺激される。カプサイシンでの刺激の場合、原液（１ｍＭ）をエタノールまたはジメチルスルホキシド中でそれぞれ調製して、ＢＲ−ＨＢＳで必要な濃度に希釈した。全ての例で、ビヒクルの最終濃度は０．１％に保たれ；これは、基本的エフラックスを測定する場合もＢＲ−ＨＢＳに含まれる。

細胞をＫ^＋またはカプサイシンで刺激して、ＣＧＲＰ放出を３０分間モニタリングした。放出されたＣＧＲＰの量を測定するために、ＣＧＲＰに対するモノクローナル抗体でコーティングされた９６ウェルプレートに試料０．１ｍｌを添加して、酵素免疫測定をキットの使用説明書に従って実施した。

結果は、大きな有芯小胞からの疼痛ペプチド放出を阻害するＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａポリペプチドの能力を示し、一方でＢｏＮＴ／Ａでの同様の細胞処理は、ＴＲＰＶ１カチオンチャネルの活性化によるＣＧＲＰ放出を阻害できなかった。図６Ｂ参照。

実施例７
ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの抗侵害受容活性を、持続的な末梢神経因性疼痛のラットモデルにおいて、即ち神経部分損傷（ＳＮＩ）アッセイで評価した。このモデルは、事実上全ての神経因性疼痛（切断による完全損傷に誘発される、幻肢痛の特別な例を除く）が部分的な神経損傷により生じる、という観察に基づく。これらの神経因性疼痛としては、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、毒性神経障害、圧迫性神経障害および外傷が挙げられ、それらは突発的乱切痛、灼熱痛およびショック様の疼痛ならびに接触性アロディニア、針刺激性痛覚過敏およびヒペルパチーを含む疼痛過敏を特徴とする。

ＳＮＩ手術を、麻酔下の成体ラット（スプラーグ・ドーリー・ラットなど）で実施し、それは坐骨神経の３つの終末遠位分枝（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｓｔａｌ ｂｒａｎｃｈｅｓ）のうちの２つ（脛骨および総腓骨神経）の結紮および離断を含み、第３の分枝（腓腹神経）は無傷のまま残す（参照により本明細書に組み入れられるＤｅｃｏｓｔｅｒｄ， Ｉ． ＆ Ｗｏｏｌｆ， Ｃ．Ｊ．， ８７ ＰＡＩＮ ５８０−５８７ （２０００）参照）。このモデルは、実施が技術的に容易で、かつ生じる損傷度のばらつきが最小限であるという両方の利点を有する。

毒素は、遠位後肢の足底（扁平）側に注射する。ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａの最大足底内投与量（歩行運動機能に影響を及ぼさない）は、それぞれ７５および１５マウスＬＤ５０単位／ｋｇであることが見出されている。ＳＮＩのラットは、偽対照のラット（任意の損傷なしに坐骨神経の暴露を受けた）とは対照的に長期持続性の神経因性疼痛様の行動を示す。

神経因性疼痛の２つのモデルは、寒冷アロディニアおよび機械的アロディニアのテストである。最初のテストである寒冷過敏症のテストでは、手術を受けた足を４℃のコールドプレートに接触させて、足逃避期間を、図７Ａに示された通り様々なタイムポイントで記録する。寒冷過敏症調整の度量として、処置後の値を処置前の値の割合％として表す。

図７Ａが示す通り、寒冷過敏症は、処置後２週間、特に最初の１０日間、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａにより効率的に低減される（生理食塩水処置に比較してＰ＜０．００１）。ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの抗侵害受容効果は、ＢｏＮＴ／Ａにより誘導される効果よりも有意に大きい（注射後５および７日目にＰ＜０．０５）。毒素を与えるか生理食塩水を与えるかにかかわらず、寒冷誘導性アロディニアは、偽対照では認められない。

２番目のテストでは、動物を高く上げたワイヤグリッドの上に乗せて、処置された足の足底表面をフォン・フレイ・ヘアのセットで刺激して、疼痛（足の急速な逃避により示される）が検出される前にどれほどの感覚刺激に耐えられるかを決定することにより、機械的アロディニアを測定する。フォン・フレイ・ヘア（またはモノフィラメント）は、実際の力のほぼ対数スケールと、知覚される強度の線形スケールとを提供するために較正される。機械的閾値を、足の逃避に必要な力の平均最小グラム値の５０％として表す。

図７Ｂに示される通り、機械的閾値は、神経損傷により劇的に減少する（生理食塩水のみ投与のＳＮＩラットでの偽対照と比較）。促進されて、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、注射後２日以内にこの機械的過敏症を逆転させ始め、最大の鎮痛作用が処置後７日目に認められる。生理食塩水処置のラットよりも有意に高い機械的閾値が、注射後３〜１０日に記録される（生理食塩水に対してＰ＜０．００１）。その上、ＢｏＮＴ／Ａでの処置が損傷後の機械的閾値をわずかに上昇させるにもかかわらず、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａが有意により効果的であると見出される（Ｐ＜０．０５）。

毒素または生理食塩水のいずれもが、偽対照動物に投与された場合に寒冷および機械的刺激により惹起される疼痛行動に影響を及ぼさなかった（図７Ａ、Ｂ）。ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、寒冷逃避期間を減少させること（図７Ａ）、および特に機械的逃避閾値を増加させること（図７Ｂ）において、ＢｏＮＴ／Ａよりもかなり効果的であることが立証された。重要なこととして、ＳＮＩのラットへのＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの注射は、３および７日目での寒冷および機械的刺激に対する感受性を、全ての偽対照の値と類似の値まで正常化させた。要約すると、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、慢性神経因性疼痛のラットモデルにおいて、強力な抗侵害受容効果を誘発する。

実施例８
以下に示される複合的合成神経毒素オープンリーディングフレームＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａの遺伝子配列およびそのコードされるアミノ酸（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）は、それぞれ以下の領域を含む（ヌクレオチド残基に関して同定）：残基１〜１２３３、ＬＣ／Ｅ；残基１２４０〜５１３０、ＢｏＮＴ／Ａ。ヌクレオチド（１２３４〜１２３９）を含むＤＮＡ配列がリンカーとして導入され、適正なリーディングフレームを確実にする。一列に並べたアミノ酸配列が、対応するヌクレオチドの上に示されている。トロンビンプロテアーゼ認識配列が、ＬＣ／ＡとＨＮ／Ａの間のループに挿入され；同様に別のトロンビン部位が、切断配列を有するようにＢｏＮＴ／Ａ遺伝子のカルボキシ部位に導入され；これらによりＣ−末端Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の同時のニッキングおよび除去が可能になる。

複合的神経毒素遺伝子（ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ）配列およびそのコードされるアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）

本発明のこの実施例は、当該技術分野の最先端で提起される少なくとも２つの主要な問題に対処する。最初に、抗侵害受容性治療能を広げる、長期持続性ＢｏＮＴキメラを提供する。次に、慢性疼痛治療のための特有の能力を有する長期持続性ＢｏＮＴ由来治療薬を提供する。

慢性疼痛の管理は、患者が成人集団の２０％を超えることから、近代の健康管理にまつわる主要な難題として提起されている。この集団のかなりの割合は、一般に用いられる鎮痛剤に応答しない。加えて、医療麻薬の過多に関連する薬物依存性および濫用の増加、ならびに、ほとんどの症例における、本来疼痛に処方される多くの鎮痛剤の短い半減期が、オピオイドおよび非ステロイド系抗炎症薬の使用を魅力のない選択肢にしている。

ＢｏＮＴ／Ａ複合体の治療的使用は、推定される疼痛経路の阻害により、片頭痛患者の全てではないが一部にとって有益であることが立証された。ＢｏＮＴ／Ａが、疼痛ペプチドまたはインサイチュでのＣ線維のＴＲＰＶ１活性化により誘発されるニューロン発火を減弱させ得ず、培養ニューロンからのＣＧＲＰ放出を遮断する能力がないことは、長期持続性がありより広範囲に効果的な形態の開発が必須であることを強調する。

ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／ＥのＢｏＮＴ由来キメラはうまくＴＧＮに侵入し、／Ｅ様のＳＮＡＰ−２５切断生成物を与え、これが今度は疼痛メディエータの放出を阻害するが；その短い作用時間が、臨床適用を制限している。

本発明は、異なる血清型の少なくとも２つのＢｏＮＴのドメインを組み合わせて、新規な治療薬を生成する。この革新的な方策を用いて、異なるＢｏＮＴ血清型から複数のＬＣを含む構築物などの他のキメラ多重鎖治療薬を作製して、所望の特性を有する治療薬を得られる；例えば、マルチＳＮＡＲＥ切断毒素（異なるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する）であり、これは、例えば、ＬＣ／Ｅの代わりにＬＣ／Ｃ１をＢｏＮＴ／Ａに付着させることにより得られる。

実施例９
別の実施例において、上に記載された手法と実質的に類似の手法で、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ核酸中のＬＣ／Ｅ遺伝子を合成ＬＣ／Ｅ遺伝子と置き換えて、単一オープンリーディングフレームとしてＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａをコードする最終プラスミドを作製することにより、マルチエンドペプチダーゼ構築物を作製した。

ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａの発現については、配列が検証された核酸構築物をＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株内に形質転換して、得られたタンパク質を、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａに関して先に記載されるように発現させた。洗浄された細菌溶解物からのＨｉｓ_６タグ毒素の部分的精製を、Ｔａｌｏｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｒｅｓｉｎを用いるＩＭＡＣアフィニティー分離ステップを利用して実現した。分子量約２００ｋの主要なタンパク質が、１５０ｍＭ以上のイミダゾールにより溶出され、これは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそのゲルのクーマシーブルー染色を示す図８において示される。ゲルのレーンは、以下の通りである：レーン１：ＩＭＡＣカラムへアプライする前の洗浄された溶解物；２：ＩＭＡＣカラムのフロースルー画分；３：ＩＭＡＣカラム洗浄画分；４〜８：イミダゾールを用いて溶出された画分。

プールされたＩＭＡＣ溶出液を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１４５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）にバッファー交換して、アリコットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図８Ｃは、アリコットを還元（＋）および非還元（−）条件下で電気泳動した、精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。電気泳動によって、約２００ｋＤａの見かけの分子量で移動した主要なバンドから明らかなように、タンパク質が実際に一本鎖（「ＳＣ」）形態で発現されたことが確認された。このバンドは、還元剤の非存在下または存在下のいずれかで認められた。例えば、図８Ｃのクーマシーブリリアントブルー染色ゲルのレーンＳＣ（−）およびＳＣ（＋）を参照されたい。

このタンパク質とビオチン化トロンビン（１単位／ｍｇ毒素）の２２℃で３時間のインキュベーションにより、この一本鎖タンパク質のニッキング（およびＨｉｓ_６タグの除去）を実現し；その後、アガロースに固定されたストレプトアビジンで試料を処理することにより、トロンビンプロテアーゼを除去する。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動された試料中に、タンパク質のトロンビン処理後に約１００Ｋの見かけの分子量を有する２つのバンド（２つのタンパク質鎖の移動性が類似しているためＳＤＳ−ＰＡＧＥにより十分に分解されない）が出現し；約２００Ｋのバンドはこれらの条件下では認められなかったが、非還元条件下で泳動されたゲルには存在し、一方約１００ＫＤａのバンドは、これらの後者の試料中には存在しない。例えば、図８Ｃのクーマシーブリリアントブルー染色ゲルのレーンＤＣ（−）およびＤＣ（＋）を参照されたい。約１００Ｋのバンドは、ＬＣ／Ｂ−ＬＣ／ＡおよびＨＣ／Ａ鎖の両方を表すと考えられ、これらはわずかなサイズ差を有する。

ラットの培養小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を、５倍希釈系列された０．３２ｐＭ〜５０００ｐＭ濃度のトロンビン処理ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａとインキュベートした。ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａと３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびａ）インタクトＳＮＡＰ−２５およびＬＣ／Ａ処理の大きな切断生成物の両方を認識する抗ＳＮＡＰ−２５抗体と、ｂ）インタクトバージョンを選別する抗ＶＡＭＰ２抗体とを用いるウェスタンブロットに供した。抗シンタキシン１抗体を用いてＳＮＡＲＥタンパク質シンタキシン１を検出し、それを陽性内部負荷対照として用いた。複数のブロットからの代表的なウェスタンブロット（図８Ｄ）および定量データ（図８Ｅ）は、ＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／ＡはＳＮＡＰ−２５ならびにＶＡＭＰ２を切断したが；ＶＡＭＰ２は、より高濃度のＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａで効果的に切断されたことを示している。理論に限定されるのを望むものではないが、この結果は、ＶＡＭＰ切断を低下させるＢｏＮＴ／ＡのＬＣを介して、複合毒素の膜への隔離により生じた可能性がある［Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ２００４， １０１（９）：３２０８−３２１３］。

実施例１０
ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ（同じ基質の２つの異なる配列を認識する２つの活性プロテアーゼ）およびＬＣ／Ｂ−ＢｏＮＴ／Ａ（２つの異なる基質を切断する２つのプロテアーゼ）からの陽性の機能的結果に示されるように、およびこの特許出願の開示を考慮することにより、当業者は、本発明のさらなる実施例が、様々な神経タイプ（例えば、感覚ニューロンおよび交感神経細胞）からの疼痛ペプチド、サイトカイン、および神経伝達物質の放出を阻害するための、異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプの組み合わせにより様々な他のマルチエンドペプチダーゼ治療薬を作製するための組成物および方法を含み得ることを、認識しているであろう。その上、マルチプロテアーゼ毒素の作用の活性は、サイトカイン放出細胞のそのようなメディエータによる活性を間接的に遮断するであろう。

例えば、３つのＳＮＡＲＥタンパク質全てを不活化する単一治療薬を、リンカーを介してＢｏＮＴ／Ｄ（ＬＣ／Ｄ）の軽鎖をＢｏＮＴ／Ｃ１のＮ−末端に組換え融合することにより作製する（図９参照）。手短に述べると、ＬＣ／Ｄエンドペプチダーゼをコードする核酸を、ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａ中に「インフレームで」挿入して、ＬＣ／Ｅと置き換える。Ｅ．ｃｏｌｉ内での最適な発現のために最適化されたコドンを有するように、ＬＣ／Ｄをコードする合成遺伝子を設計する。得られたプラスミドは、ＬＣ／Ｄ−ＢｏＮＴ／Ａを含む中間体タンパク質をコードする。

次に、ＢｏＮＴ／Ｃ１（ＢｏＮＴ／Ａ構築物のように、そのループ領域にトロンビン切断部位を有する）をコードする合成遺伝子を用いて、ＬＣ／Ｄ−ＢｏＮＴ／Ａ中のＢｏＮＴ／Ａ遺伝子を置き換えて、ＬＣ／Ｄ−ＢｏＮＴ／Ｃ１オープンリーディングフレームを含む最終的な核酸構築物を得る。発現させ、精製され、およびニッキングを施されたＬＣ／Ｄ−ＢｏＮＴ／Ｃ１治療薬は、ＬＣ／Ｄでの切断によりＶＡＭＰ１〜３を不活化する能力を有し；ＬＣ／Ｃ１プロテアーゼは、シンタキシン１〜３およびＳＮＡＰ−２５を切断するであろう。この構築物は、慢性炎症および神経因性疼痛の処理に適するであろう。

実施例１１
６０歳男性が、左臀部に重度の慢性関節痛を示し、歩行困難を有している。検査により、患者は、股関節（臀部関節）の関節リウマチと診断されている。

患者は、有効用量のクロストリジウム神経毒素誘導体ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａを、大腿骨結節および坐骨結節の両方に直接注射することにより投与されている。この遺伝子構築物は上に記載されるように作製され、クロストリジウム毒素誘導体は、Ｈｉｓ_６タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を用いて、それを発現させた後にアフィニティー精製され、次にトロンビンニッキングおよびイオン交換クロマトグラフィーを行った後に使用する。

４８時間以内に、疼痛の程度および鋭さの顕著な改善があり、１週間以内に、患者はほとんど困難なく歩行できるようになっている。

実施例１２
ヒトに使用するための十分量のクロストリジウム神経毒素誘導体ＬＣ／Ｅ／ＢｏＮＴ／Ａの予想される最終的要件は、製造管理および品質管理に関する基準を満たす（ＧＭＰ遵守）施設での生成法に適合するＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の発現および精製のための、生成／精製基盤を必要とする。ＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の大規模生成および精製は、本質的にベンチスケール実験について上に記載されるように実施される。この工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予測される見かけの分子量（約２００ｋＤａ）を有する純粋な活性化生成物を生じる。鎖間ジスルフィド結合の還元に続いて、ＨＣ鎖とＬＣ／Ｅ−ＬＣ／Ａ鎖が、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を共にに移動し、それぞれが約１００ｋＤａの見かけの分子量を有し；クーマシーブリリアントブルーでの染色から、図３に示されるものと実質的に同一の移動パターンが明らかである。ＧＭＰ遵守生成法に適合した工程を利用して製造されるＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａは、「ＰＫ」と呼称する。

ＳＮＡＰ−２５を切断するためのＧＭＰ ＰＫタンパク質の活性、およびマウスにおけるその特異的神経毒性は、ベンチスケールで生成される同じタンパク質のものと一致する。同様に、ＰＫの抗侵害受容能は、ＰＫ材料を用いて実施例６の実験を再度行い、図６Ａおよび６Ｂに示されるものと実質的に同一の結果を得ることにより示される通り、感覚ニューロンに結合および侵入してＬＣ／Ｅトランケート型ＳＮＡＰ−２５を主に生成し、および脱分極刺激またはカプサイシン刺激によるＣＧＲＰ放出を阻害するその能力により実証される。

最も重要なことに、この有望なＰＫタンパク質は、ベンチスケールで生成されるＬＣ／Ｅ−ＢｏＮＴ／Ａタンパク質と同様に、インビボで等しく堅固な抗侵害受容性物質であることも立証される。慢性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおけるラットの一方の後足へのＰＫの単回注射（例えば、実施例７の図７Ａおよび７Ｂ参照）は、歩行活性に影響を及ぼさず（ロタロッドで定量）、または任意の検出可能な有害作用も誘導しないが、１４日の長期期間にわたり、機械的過敏性を偽薬群の対照レベルに軽減する。また、ＳＮＩモデルにおける高レベルの寒冷アロディニアも、逃避期間の顕著な減少に示されるように、同様に減弱される。偽操作動物への生理食塩水ビヒクルの注射は、例えば図７Ａおよび７Ｂにおいて測定される２つの侵害受容パラメータに関するベースラインレベルを変化させない。ＰＫタンパク質は高レベルの疼痛を明らかに軽減する。

これらの知見は、大規模な動物実験の数多くの組み合わせから再現性があることを立証し、重度の神経損傷による強い疼痛を後退させるためのＰＫのインビボ治療有効性を強調し、かつＢｏＮＴ／Ａ単独では疼痛、特に慢性疼痛の処置に不十分であることを明らかにする。

実施例１３
この新規なＧＭＰ様抗侵害受容物質の高い効率は、一定割合の患者において顕著な有害反応および限定的な鎮痛作用を及ぼすことでも知られる、神経因性疼痛用の第一選択処置として臨床使用される鎮痛剤プレガバリンの１０ｍｇ／ｋｇでの連日全身（Ｉ．Ｐ．）投与に関連して、ＰＫ（７５Ｕ／Ｋｇ）の単回注射のＳＮＩモデルで評価することによりさらに実証される。

同じく、ラットにおける慢性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）および寒冷アロディニアモデル、ならびにこれまでの段落でと同じ投与量の活性剤を用いると、ＰＫの単回足底内注射は連日プレガバリン投与よりも非常に長期の有益期間を生じ、連日プレガバリン投与はＰＫとは対照的に、機械的過敏の後退を有意に実現できず（図１０Ａ）、低温に対する増大した反応性のより軽度な減弱を誘導する（図１０Ｂ）。ＰＫの２回目の注射は、機械的感度（図１１）および寒冷アロディニア（図示しない）の両方でのその強力な鎮痛作用を延長し、それにより最初の処置後２５日よりも長く持続する、対照ベースラインを大幅に超える疼痛緩和を生じる。

本発明は、本明細書に記載された実施形態（複数可）に限定されず、本発明の範囲から逸脱することなく補正または改良することができる。

ここに、本発明を特許請求の範囲の形式で、下に示される実施形態の次の組み合わせにより記載する。
１）クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがＳＮＡＲＥタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質における異なる切断部位を認識する、組成物。
２）前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが単一ポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
３）前記ポリペプチドが、前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一の領域と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二の領域との間に位置する選択的エンドペプチダーゼ切断部位をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
４）前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが１つよりも多いポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
５）少なくとも２つの前記ポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項４に記載の組成物。
６）前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項１に記載の組成物。
７）前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項５に記載の組成物。
８）前記結合ドメインおよび転移ドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項１に記載の組成物。
９）前記結合ドメイン、転移ドメインが、ならびに前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項８に記載の組成物。
１０）前記結合ドメイン、転移ドメイン、および前記第一のエンドペプチダーゼドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインが第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項９に記載の組成物。
１１）前記第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがＢｏＮＴ／Ａであり、かつ前記第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがＢｏＮＴ／Ｅである、請求項１０に記載の組成物。
１２）前記第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがＢｏＮＴ／Ａであり、かつ前記第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプがＢｏＮＴ／Ｃ１である、請求項１１に記載の組成物。
１３）前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項１１に記載の組成物。
１４）前記第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項１３に記載の組成物。
１５）前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインが全て単一のポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１１に記載の組成物。
１６）前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
１７） ａ）前記結合ドメインのカルボキシ末端側、または前記第二のエンドペプチダーゼドメインのアミノ末端に位置するポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔａｄｉｎｅ）アミノ酸配列と、
ｂ）前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列と、
ｃ）前記第二のエンドペプチダーゼドメインと前記ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔａｄｉｎｅ）アミノ酸配列との間、または前記結合ドメインと前記ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔａｄｉｎｅ）アミノ酸配列との間に位置する第二のプロテアーゼ切断部位を含む第二のアミノ酸配列と、
をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
１８）クロストリジウム神経毒素誘導体を含むポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸が、カルボキシ末端からアミノ末端への順に：結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインをコードする単一のオープンリーディングフレームを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがＳＮＡＲＥタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質における異なる切断部位を認識する、核酸。
１９）前記結合ドメイン、前記転移ドメイン、前記第一のエンドペプチダーゼドメイン、および前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれをコードするコドンが、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される細胞型における発現のために最適化される、請求項１８に記載の核酸。
２０）前記コドンがＥ．Ｃｏｌｉ細菌細胞内での発現のために最適化される、請求項１９に記載の核酸。
２１）前記結合ドメイン、前記転移ドメイン、前記第一のエンドペプチダーゼドメイン、および前記第二のエンドペプチダーゼドメインからなる群から選択される少なくとも２つのドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、およびＴｅＴｘからなる群から選択される異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する核酸配列によりコードされる、請求項１８に記載の核酸。
２２）前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、およびＴｅＴｘからなる群から選択される異なるクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する核酸配列によりコードされる、請求項２１に記載の核酸。
２３）前記第一のエンドペプチダーゼドメインがＢｏＮＴ／Ａに由来する核酸配列によりコードされ、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインがＢｏＮＴ／Ｃ１に由来する核酸配列によりコードされる、請求項２２に記載の核酸。
２４）前記第一のエンドペプチダーゼドメインがＢｏＮＴ／Ａに由来する核酸配列によりコードされ、かつ前記第二のエンドペプチダーゼドメインがＢｏＮＴ／Ｅに由来する核酸配列によりコードされる、請求項２２に記載の核酸。
２５）前記オープンリーディングフレームが、エンドペプチダーゼ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列と終止コドンとの間の少なくとも６つのヒスチジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）残基をコードする、請求項２４に記載の核酸。
２６）クロストリジウム神経毒素誘導体を含む治療性組成物を投与することを含む慢性疼痛の処置の方法であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、第一のエンドペプチダーゼドメインと、第二のエンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含み、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインのそれぞれがＳＮＡＲＥタンパク質に対する選択的タンパク質分解活性を有し、かつＳＮＡＲＥタンパク質における異なる切断部位を認識する、方法。
２７）前記慢性疼痛が、炎症性侵害受容性疼痛および神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
２８）前記慢性疼痛が神経因性疼痛である、請求項２７に記載の方法。
２９）前記神経因性疼痛が、癌性疼痛、術後疼痛、神経因性疼痛、アロディニア、ヘルペス後神経痛、過敏性腸症候群、および他の内臓性疼痛、骨痛、末梢神経障害、循環器系関連の疼痛、ならびに頭痛からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
３０）前記慢性疼痛が炎症性侵害受容性疼痛である、請求項２７に記載の方法。
３１）前記慢性疼痛が関節炎の疼痛である、請求項２７に記載の方法。
３２）前記治療性組成物の前記結合ドメインおよび転移ドメインが第一のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来し、かつ前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび前記第二のエンドペプチダーゼドメインの少なくとも一方が第二のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプに由来する、請求項２６に記載の方法。

本発明の態様を、開示される実施形態を参照して記載したが、開示される具体的実施例がこれらの態様の例示に過ぎず、本発明を限定するものではないことを、当業者は即座に認識するであろう。本発明の主旨を逸脱することなく、様々な修正を実施できる。本明細書に記載されるいずれの特徴も、そしてそのような特徴の２つ以上のいずれの組み合わせも、本発明の範囲に含まれるが、ただしそのような組み合わせに含まれる特徴が互いに矛盾しないことを条件とする。さらに、本発明の任意の組成物または装置が、特許請求の範囲の１つまたは複数の要素を含むこと、本質的にそれからなること、またはそれからなることが理解され、追加として、特許請求の範囲の要素として具体的に含まれないいずれの要素も、その特許請求の範囲の消極的限定において具体的に除外されるという本明細書の基本原理を有すると見なされよう。

本明細書に引用されるあらゆる特許、発行物、特許出願、ならびに本明細書に引用されるアクセション番号により参照されるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、全体が本明細書の一部として参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (18)

1. クロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、
   ａ）結合ドメインと、
   ｂ）転移ドメインと、
   ｃ）クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来の第一の活性エンドペプチダーゼドメインと、
   ｄ）クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来の第二の活性エンドペプチダーゼドメインと
   を含むポリペプチドを含む、組成物。
2. 前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが単一ポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ポリペプチドが、前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一の領域と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二の領域との間に位置する選択的エンドペプチダーゼ切断部位をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記結合ドメイン、転移ドメイン、第一のエンドペプチダーゼドメイン、および第二のエンドペプチダーゼドメインが１つよりも多いポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
5. 少なくとも２つの前記１つよりも多いポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記結合ドメインおよび前記転移ドメインを含む第一のポリペプチド鎖と、前記第一のエンドペプチダーゼドメインおよび第二のエンドペプチダーゼドメインを含む第二のポリペプチド鎖とを含む、請求項５に記載の組成物。
8. 前記結合ドメインおよび転移ドメインがクロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａに由来する、請求項１に記載の組成物。
9. 前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組成物。
10. ａ）前記結合ドメインのカルボキシ末端側、または前記第二のエンドペプチダーゼドメインのアミノ末端に位置するポリヒスチジンアミノ酸配列と、
    ｂ）前記転移ドメインと前記第一のエンドペプチダーゼドメインとの間に位置する第一のプロテアーゼ切断部位を含む第一のアミノ酸配列と、
    ｃ）前記第二のエンドペプチダーゼドメインと前記ポリヒスチジンアミノ酸配列との間、または前記結合ドメインと前記ポリヒスチジンアミノ酸配列との間に位置する第二のプロテアーゼ切断部位を含む第二のアミノ酸配列と
    をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
11. 慢性疼痛の処置の方法において使用するためのクロストリジウム神経毒素誘導体を含む組成物であって、前記クロストリジウム神経毒素誘導体が、結合ドメインと、転移ドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプに由来する第一の活性エンドペプチダーゼドメインと、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプに由来する第二の活性エンドペプチダーゼドメインとを含むポリペプチドを含む、組成物。
12. 前記慢性疼痛が、炎症性侵害受容性疼痛および神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記慢性疼痛が神経因性疼痛である、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記神経因性疼痛が、癌性疼痛、術後疼痛、アロディニア、ヘルペス後神経痛、過敏性腸症候群、および他の内臓性疼痛、骨痛、末梢神経障害、循環器系関連の疼痛、ならびに頭痛からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記慢性疼痛が炎症性侵害受容性疼痛である、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記慢性疼痛が関節炎の疼痛である、請求項１２に記載の組成物。
17. 前記治療性組成物の前記結合ドメインおよび転移ドメインがクロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプに由来する、請求項１１に記載の組成物。
18. クロストリジウム神経毒素誘導体であって、
    ａ）ＳＮＡＲＥタンパク質を生理学的条件下で切断し、かつ実質的に生理学的な条件下でマウスの腓腹筋に注射された場合１０日以上の酵素的半減期を有する、クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａサブタイプに由来する、第一の活性クロストリジウム毒素由来のエンドペプチダーゼドメインと、
    ｂ）クロストリジウム神経毒素ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプに由来する、第二の活性クロストリジウム毒素由来のエンドペプチダーゼドメインと、
    ｃ）生理学的条件下で細胞膜からサイトゾルへの前記第一のエンドペプチダーゼドメインの移動を促進するクロストリジウム毒素由来の転移ドメインと、
    ｄ）クロストリジウム毒素由来の機能的結合ドメインと、を含み、
    ここで前記神経毒素誘導体は、ＢｏＮＴ／Ａ単独よりも、ラット培養感覚ニューロンからのカプサイシンにより誘発される疼痛メディエータの放出を遮断する、神経毒素誘導体。