ES2671493T3 - Tratamiento con multiproteasa para el dolor crónico - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: a) un dominio de unión, b) un dominio de translocación, y c) un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A, y d) un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E; en el que cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y de dicho segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento con multiproteasa para el dolor crónico

5 La presente divulgación señala procedimientos y composiciones que implican derivados de neurotoxina clostrídica que tienen una capacidad mejorada para interrumpir la exocitosis de mediadores del dolor y/o de la inflamación de los nociceptores o inductores de la inflamación, impidiendo así el dolor.

ANTECEDENTES

10

Los serotipos A-G de la neurotoxina botulínica (BoNT), producidos por Clostridium botulinum, son los venenos más potentes conocidos debido al bloqueo específico de la liberación de acetilcolina de los nervios periféricos al escindir proteolíticamente las proteínas sNaRE (receptores de proteína de unión a NSF soluble) que median la fusión de la vesícula sináptica con la membrana celular y, por lo tanto, son esenciales para la exocitosis estimulada por Ca2+ de 15 neurotransmisores, péptidos del dolor y citocinas de la neurona.

La capacidad de las toxinas clostrídicas, como por ejemplo, neurotoxinas botulínicas (BoNT) (incluyendo los serotipos BoNT de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, así como la toxina tetánica TeTx) para inhibir la transmisión neuronal se explotan en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y 20 cosméticas, véase p. ej., Ward AB and Barnes MP, CLINICAL USERS OF BOTULiNuM TOXINS (Cambridge University Press, Cambridge 2007). Como ejemplo, el agente BOTOX® derivado de BoNT/A se ha utilizado en uno o más países para cada una de las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en el adulto, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor esencial, líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral 25 juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno del nervio VII.

Existen toxinas clostrídicas distintas de las toxinas derivadas de C. botulinum y C. tetanus; estos incluyen, sin limitación, las toxinas de C. perfringins, C. septicum, C. difficile, C. spiroforme, C. butyricum y C. barati. Sin embargo, 30 se entenderá que en esta memoria descriptiva, una referencia a "toxinas clostrídicas" o una referencia similar, se refiere a las neurotoxinas de C. subtipos botulinum y C. subtipos tetani, menos que se indique específicamente o contextualmente lo contrario.

Además, las terapias de toxina clostrídica se utilizan o se han propuesto para el tratamiento de afecciones que 35 incluyen, sin limitación,

a) trastornos neuromusculares, véase p. ej., Kei Roger Aoki et al.., Method for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions with Botulinum Toxin Types A and B, patente de EE. UU. N.° 6.872.397 (Mar. 29, 2005); Rhett M. Schiffman, Methods for Treating Uterine Disorders, publicación de patente de EE. UU. N.° 2004/0175399 (Sep. 9,

40 2004); Richard L. Barron, Methods for Treating Ulcers and Gastroesophageal Reflux Disease, publicación de patente de eE. UU. N.°2004/0086531 (May. 7, 2004); y Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, patente de EE. UU. N.° 6.319.505 (Nov. 20, 2001);

b) trastornos oculares, véase p. ej., Eric R. First, Methods and Compositions for Treating Eye Disorders, 45 lapublicación de patente de EE. UU. N.°2004/0234532 (Nov. 25, 2004); Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin

Treatment for Blepharospasm, lapublicación de patente de EE. UU. N.° 2004/0151740 (Aug. 5, 2004); y Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Treatment for Strabismus, publicación de patente de EE. UU. N.°. 2004/0126396 (Jul. 1, 2004);

50 c) dolor, véase p. ej., Kei Roger Aoki et al., Pain Treatment by Peripheral Administration of a Neurotoxin, patente de EE. UU. N.° 6.869.610 (Mar. 22, 2005); Stephen Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods to Treat Pain, patente de EE. UU. N.° 6.641.820 (Nov. 4, 2003); Kei Roger Aoki, et al., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, patente de EE. uU. N.° 6.464.986 (Oct. 15, 2002); Kei Roger Aoki and Minglei Cui, Methods for Treating Pain, patente de EE. UU. N.° 6.113.915 (Sep. 5, 2000); Martin A. Voet, Methods for Treating 55 Fibromyalgia, patente de EE. UU. N.° 6.623.742 (Sep. 23, 2003); Martin A. Voet, Botulinum Toxin Therapy for Fibromyalgia, publicación de la patente de EE. UU. N.° 2004/0062776 (Apr. 1, 2004); y Kei Roger Aoki et al., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, publicación de la patente de EE. UU. N.° 2004/0037852 (Feb. 26, 2004);

60 d) lesiones musculares, véase p. ej., Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, patente de EE. UU.

N.° 6.423.319 (Jul. 23, 2002);

e) dolor de cabeza, véase p. ej., Martin Voet, Methods for Treating Sinus Headache, patente de EE. UU. N.° 6.838.434 (Jan. 4, 2005); Kei Roger Aoki et al., Methods for Treating Tensión Headache, patente de EE. UU. N.°

5 6.776.992 (Aug. 17, 2004); y Kei Roger Aoki et al., Method for Treating Headache, patente de EE. UU. N.° 6.458.365 (Oct. 1, 2002); William J. Binder, Method for Reduction of Migraine Headache Pain, patente de EE. UU. N.° 5.714.469 (Feb. 3, 1998);

f) enfermedades cardiovasculares, véase p. ej., Gregory F. Brooks and Stephen Donovan, Methods for Treating 10 Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxin, patente de EE. UU. N.° 6.767.544 (Jul. 27, 2004);

e) trastornos neurológicos, véase p. ej., Stephen Donovan, Parkinson's Disease Treatment, lapatente de EE. UU. N.° 6.620.415 (Sep. 16, 2003); y Stephen Donovan, Method for Treating Parkinson's Disease with a Botulinum Toxin, patente de EE. UU. N.° 6.306.403 (Oct. 23, 2001);

15

g) trastornos neuropsiquiátricos, véase p. ej., Stephen Donovan, Botulinum Toxin Therapy for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de EE. UU. N.° 2004/0180061 (Sep. 16, 2004); y Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de EE.UU N.° 2003/0211121 (Nov. 13, 2003);

20 f) trastornos endocrinos, véase p. ej., Stephen Donovan, Method for Treating Endocrine Disorders, patente de EE. Uu. N.° 6.827.931 (Dec. 7, 2004); Stephen Donovan, Method for Treating Thyroid Disorders with a Botulinum Toxin, patente de EE. UU. N.° 6740321 (May. 25, 2004); Kei Roger Aoki et al., Method for Treating a Cholinergic Influenced Sweat Gland, patente de EE. Uu. N.° 6.683.049 (Jan. 27, 2004); Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Diabetes, patente de EE. UU. N.° 6.416.765 (Jul. 9, 2002); Stephen Donovan, Methods for Treating Diabetes, 25 lapatente de EE. UU. N.° 6.337.075 (Jan. 8, 2002); Stephen Donovan, Method for Treating a Pancreatic Disorder with a Neurotoxin, lapatente de EE. UU. N.° 6.261.572 (Jul. 17, 2001); Stephen Donovan, Methods for Treating Pancreatic Disorders, patente de EE. UU. N.° 6.143.306 (Nov. 7, 2000);

g) cánceres, véase p. ej., Stephen Donovan, Methods for Treating Bone Tumors, patente de EE. UU. N.° 6.565.870 30 (May 20, 2003); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin to Improve Patient Function, patente de EE. UU. N.° 6.368.605 (Apr. 9, 2002); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin, patente de EE. UU. N.° 6.139.845 (Oct. 31, 2000); y Mitchell F. Brin and Stephen Donovan, Methods for Treating Diverse Cancers, publicación de patente de EE. uU. N.° 2005/0031648 (Feb. 10, 2005);

35 h) trastornos óticos, véase p. ej., Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Inner Ear Disorders, patente de EE. UU. N.° 6358926 (Mar. 19, 2002); y Stephen Donovan, Method for Treating Otic Disorders, patente de EE. UU. N.° 6265379 (Jul. 24, 2001);

i) trastornos autonómicos, véase p. ej., Pankai J. Pasricha and Anthony N. Kalloo, Method for Treating 40 Gastrointestinal Muscle Disorders and Other Smooth Muscle Dysfunction, patente de EE. UU. N.° 5.437.291 (Aug. 1,

1995);

j) así como otros trastornos, véase p. ej., William J. Binder, Method for Treatment of Skin Lesions Associated with Cutaneous Cell-proliferative Disorders, patente de EE. UU. N.° 5.670.484 (Sep. 23, 1997); Eric R. First, Application of

45 Botulinum Toxin to the Management of Neurogenic Inflammatory Disorders, patente de EE. UU. N.° 6.063.768 (May 16, 2000); Marvin Schwartz and Brian J. Freund, Method to Reduce Hair Loss and Stimulate Hair Growth, patente de EE. UU. N.° 6.299.893 (Oct. 9, 2001); Jean D. A. Carruthers and Alastair Carruthers, Cosmetic Use of Botulinum Toxin for Treatment of Downturned Mouth, patente de EE. UU. N.° 6.358.917 (Mar. 19, 2002); Stephen Donovan, Use of a Clostridial Toxin to Reduce Appetite, publicación de patente de EE. UU. N.° 2004/40253274 (Dec. 16, 50 2004); y Howard I. Katz and Andrew M. Blumenfeld, Botulinum Toxin Dental Therapies and Procedures, publicación de patente de EE. UU. N.° 2004/0115139 (Jun. 17, 2004); Kei Roger Aoki, et al., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, la publicación de patente de EE. UU N.° 2002/0010138 (Jan. 24, 2002); y Kei Roger Aoki, et al., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, publicación de patente de EE.UU N.° 2004/0013692 (Jan. 22, 2004).

55

La Tabla 2, a continuación, proporciona las secuencias de aminoácidos de los isotipos de diversas toxinas clostrídicas relacionadas con botulina actualmente conocidas (BoNT y TeTX). Estas toxinas poseen un mínimo de aproximadamente el 35 % de identidad de aminoácidos entre sí y comparten la misma organización de dominio funcional general y la arquitectura estructural general. Las toxinas clostrídicas naturales se traducen cada una como 60 un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se divide por escisión proteolítica

dentro de un bucle disulfuro mediante una proteasa natural, como por ejemplo, una proteasa de toxina clostrídica endógena o una proteasa natural producida en el entorno. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria madura que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen juntas por un único enlace disulfuro entre cadenas e 5 interacciones no covalentes.

Cada molécula de toxina clostrídica bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático localizado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a una o más proteínas SNARE que median en la 10 fusión de la vesícula sináptica con la membrana celular; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la cadena H (denominado "Hn") que facilita la liberación de al menos la cadena LC de la toxina de un endosoma en el citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad carboxilo terminal de la cadena H (Hc) que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina.

15 La HC comprende subdominios HCN y HCC s (Las partes N y C-terminal de HC, respectivamente). Ahora hay evidencia sustancial de que la mayoría o todas las toxinas BoNT/X se unen a una célula diana utilizando un "receptor dual", donde la parte Hc de la toxina que comprende los subdominios Hcn y Hcc se une a ciertos gangliósidos de superficie celular y un receptor de proteína (quizás glicosilado); la unión del receptor de proteína facilita la internalización de la toxina dentro de la célula. Por "X" se entiende cualquier serotipo de toxina botulínica. Aunque el término "BoNT/X" se 20 usa generalmente para indicar subtipos de toxina botulínica, el término también puede incluir las regiones TeTX de los mismos. Hcc se une al complejo receptor localizado en la superficie de la célula diana.

Se entenderá que existen cepas o subtipos de cada serotipo de estas toxinas; estos pueden variar algo en sus secuencias de aminoácidos, particularmente (pero no exclusivamente) en regiones no críticas (denominadas 25 regiones "variables") sin un cambio sustancial en la identidad o en la característica de actividad del dominio de toxina o toxina indicado.

En la Tabla 1 a continuación, se proporcionan los códigos de aminoácidos de una letra y tres letras estándares:

30 Tabla 1

Aminoácido

Código de tres letras Código de una letra

alanina

Ala A

arginina

Arg R

asparagina

Asn N

ácido aspártico

Asp D

asparagina o ácido aspártico

Asx B

cisteína

Cys C

ácido glutámico

Glu E

glutamina

Gln Q

glutamina o ácido glutámico

Glx Z

glicina

Gly G

histidina

His H

isoleucina

Ile I

leucina

Leu L

lisina

Lys K

metionina

Met M

fenilalanina

Phe F

prolina

Pro P

serina

Ser S

treonina

Thr T

triptófano

Try W

tirosina

Tyr Y

valina

Val V

Tabla 2

Secuencias y regiones de referencia de toxinas clostrídicas (identificadas de la dirección de amino a carboxi, número de aminoácido a número de aminoácido)______________________

Toxina

SEQ ID NO: LC Hn Hc

BoNT/A

7 M1-K448 A449-K871 N872-L1296

BoNT/B

8 M1-K441 A442-S858 E859-E1291

BoNT/C1

9 M1-K449 T450-N866 N867-E1291

BoNT/D

10 M1-R445 D446-N862 S863-E1276

BoNT/E

11 M1-R422 K423-K845 R846-K1252

BoNT/F

12 M1-K439 A440-K864 K865-E1274

BoNT/G

13 M1-K446 S447-S863 N864-E1297

TeNT

14 M1-A457 S458-V879 I880-D1315

Los expertos en la técnica reconocerán que pueden existir variantes de toxina de subtipo clostrídica en la naturaleza, que tienen la variaciones en las secuencias de aminoácidos mostradas anteriormente (o en las secuencias de 5 nucleótidos que codifican estas secuencias de aminoácidos). Como se usa en esta invención, el término "variante de dominio clostrídica natural" significa cualquier dominio clostrídico (endopeptidasa, translocación, y/o dominios de unión) producido por un proceso natural, que incluye, sin limitación, isoformas de dominio clostrídico producidas a partir de transcritos de splicing alternativo, isoformas de dominio clostrídico producidas por mutaciones espontáneas y subtipos de dominio clostrídico. Como se usa en esta invención, una variante de dominio clostrídico natural 10 funciona sustancialmente de la misma manera que el dominio clostrídico de referencia en el que se basa la variante de dominio clostrídico natural y puede sustituirse por el dominio clostrídico de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.

Una variante de dominio clostrídico natural puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o 15 más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos, diez o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos, 40 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos o 100 o más aminoácidos del dominio clostrídico de referencia en el que se basa la variante del dominio clostrídico natural. Una variante de dominio clostrídico natural también puede sustituir al menos 10 aminoácidos contiguos, al menos 15 aminoácidos contiguos, al menos 20 aminoácidos contiguos o al menos 25 aminoácidos contiguos del dominio clostrídico de 20 referencia en el que se basa la variante de dominio clostrídico natural, que posee al menos 50 % de identidad de aminoácidos, el 65 % de identidad de aminoácidos, el 75 % de identidad de aminoácidos, el 85 % de identidad de aminoácidos o el 95 % de identidad de aminoácidos en el que se basa la variante de dominio clostrídico natural, siempre que la actividad biológica o bioquímica del dominio clostrídico natural esté sustancialmente conservada. También se entenderá que las inserciones y deleciones de aminoácidos conservativas también pueden realizarse 25 siempre que no se alteren sustancialmente la función característica y la identidad del dominio.

Debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá que estas secuencias de aminoácidos pueden codificarse por un conjunto finito de diferentes moléculas de ADN que tienen diferentes, pero definidas, secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un 30 péptido o proteína dados pueden tener diferentes codones adaptados o seleccionados para favorecer la expresión en una célula huésped particular. Usando esta información, se puede construir un marco de lectura de ácido nucleico abierto expresable para el ensamblaje de una molécula de ácido nucleico que comprende cualquier combinación de estas regiones que codifican dominio de aminoácido, solo o con secuencias de ácido nucleico adicionales, insertado en un vector de expresión adecuado y la expresión posterior dentro de una célula huésped 35 elegida. Por ejemplo, la publicación de patente internacional WO01/14570 divulga procedimientos para fabricar derivados y formas quiméricas e híbridas de neurotoxina clostrídica modificados o sin modificar recombinantes escindibles, monocatenarios usando dichos procedimientos. Entre las publicaciones adicionales que describen procedimientos para fabricar neurotoxinas recombinantes expresables y sus derivados se incluyen las patentes de EE.UU N.° 5.989.545; 6.203.794; 6.395.513; los números de publicaciones de los EE.UU U.S. 2003/0166238; U.S. 40 2002/169942; U.S. 2004/176299; U.S. 2004/126397; U.S. 2005/035730; U.S. 2005/068494; U.S. 2006/011966;las solicitudes de patente internacional WO95/32738; WO 99/55359; WO96/33273; WO98/07864; WO99/17806; WO98/07864; WO02/44199; WO02/40506, y el N.° de serie de la solicitud de patente 13/644,386, depositada el 4 de octubre de 2012.

45 El uso de técnicas de ADN recombinante permite la construcción de neurotoxinas clostrídicas modificadas que tienen propiedades funcionales diferentes o modificadas a partir de los subtipos y cepas de toxina naturales de las mismas.

Por ejemplo, alterando la secuencia de aminoácidos natural de la cadena ligera de la neurotoxina nativa y/o añadiendo un resto terapéutico diferente permite la construcción de proteínas de transporte diseñadas para transportar un agente terapéutico dentro de una neurona. Véase la Patente de Estados Unidos N.° 6.203.794.

5 Alterando el dominio dirigido (unión a célula) se permite que la toxina sea transportada dentro de células pancreáticas, como por ejemplo células acinares, impidiendo así la secreción de enzimas digestivas activadas por dichas células. Véase la patente de EE. UU. N.° 6.843.998, o neuronas aferentes sensoriales, impidiendo así la liberación de neurotransmisores, citocinas y péptidos del dolor y, por tanto, proporcionando alivio del dolor, véase la patente de EE. UU. N.° 6.395.513.

10

Además, patente de EE. UU. N.° 7.422.877 divulga la creación de derivados de neurotoxina quimérica que comprenden, por ejemplo, el dominio de unión y el dominio de translocación (o versiones modificadas de los mismos) de un subtipo de neurotoxina, por ejemplo, BoNT/A, y la región de cadena ligera de otro subtipo de neurotoxina, por ejemplo, BoNT/E. Se verá que dada la homología estructural general entre los subtipos de 15 neurotoxinas, cualquier combinación de los tres dominios de neurotoxinas clostrídicas básicos, se puede fabricar en una única cadena de aminoácidos (o en moléculas bicatenarias escindidas). Por lo tanto, por ejemplo, un dominio de unión de cualquiera de los subtipos de neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G o TeTX puede combinarse independientemente con un dominio de translocación de los subtipos de neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G o TeTX, y adicionalmente combinarse de forma independiente con un dominio endopeptidasa de cualquiera de los subtipos de 20 neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G o TeTX. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante construcción y expresión recombinantes y de una única cadena quimérica que se escinde posteriormente para producir la toxina bicatenaria, o mediante expresión separada de cadenas H y L únicas, que luego se combinan, por ejemplo, mediante la creación de un enlace disulfuro entre cadenas y posteriormente se purifica. Además, usando dichas técnicas, la actividad de varios dominios puede alterarse (por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en un dominio LC para destruir la 25 actividad proteasa de la LC), o los dominios naturales pueden reemplazarse por otros restos, como se describe en otra parte de esta invención, donde, por ejemplo, el dominio HC de BoNT/A (o una parte del mismo) está mutado o eliminado y se ha unido un ligando dirigido (TL).

Cuando se habla de los tres dominios de neurotoxina generales de cada subtipo de neurotoxina clostrídica (unión, 30 translocación y endopeptidasa), se entenderá que la investigación de la neurotoxina clostrídica es un campo bien desarrollado, y la correlación de las secuencias de aminoácidos que comprende cada uno de estos dominios con sus funciones es bien conocida. Se entenderá que la referencia a cada uno de estos términos ("dominio de translocación", "dominio de unión" y "proteasa", "endopeptidasa", "LC" o "cadena ligera") incluye los dominios correspondientes contenidos en cualquiera de los aminoácidos. secuencias ácidas de subtipos de neurotoxina 35 clostrídica enumeradas en la SEQ ID NO: 7-14 como se enumera en la Tabla 2, así como variantes modificadas de forma conservadora y optimizadas de estas secuencias o dominios dentro de estas secuencias.

Además, también se conoce la subdivisión de estos dominios generales en subdominios. Por ejemplo, la subdivisión del dominio de unión Hc en subdominios Hcn (la parte amino terminal del dominio, que corresponde 40 aproximadamente a los aminoácidos 871-1091 de BoNT/A) y HCC (la parte carboxi terminal del dominio HC, que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 1092-1296 de BoNT/A) también es bien conocido. Véase, p. ej. Lacy Db and Stevens RC, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, 1999, J. Mol. Biol. 291:1091-1104. El subdominio Hcn está muy conservado entre los subtipos de toxina botulínica, sin embargo, se sabe poco sobre su función. El subdominio Hcc está menos conservado.

45

Además, se conocen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de cada uno de estos dominios y subdominios y se han desvelado en esta memoria descriptiva, y por lo tanto se puede hacer uso de la presente divulgación en combinación con el conocimiento del código genético, las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína a expresar. Sería, por supuesto, una cuestión de rutina para un experto en la materia a la vista de esta memoria 50 descriptiva, visualizar inmediatamente otras secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos indicados. Además, debido a la redundancia del código genético, es posible un número finito de secuencias de nucleótidos para cada polipéptido. Además, está claro que pueden sintetizarse ácidos nucleicos que comprenden variantes modificadas conservadoramente de estas secuencias de nucleótidos (o partes únicas de ellas) en la región de homología que contienen no más del 10 %, 8 % o 5 % de diferencias de pares de bases de una referencia 55 secuencia.

Además, se entenderá que las secuencias de aminoácidos expuestas en la Tabla 2 y en otros lugares en esta memoria descriptiva o en la lista de secuencias asociada proporciona una divulgación completa de cualquiera y todas las secuencias de nucleótidos que codifican estas secuencias de aminoácidos y en las regiones indicadas de 60 los mismos. Una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio endopeptidasa, dominio de translocación o

dominio de unión (incluyendo cualquier subdominio) de un subtipo de neurotoxina dado puede tener respectivamente 60 % o más, o 65 % o más, o 70 % o más, o 75 % o más, u 80 % o más, u 85 % o más, o 90 % o más, o 95 % o más, o 100 % de identidad con cualquiera de dichas regiones de secuencia de aminoácidos de referencia enumeradas en la Tabla 2 o en otra parte.

5

Las neurotoxinas botulínicas se expresan mediante células clostrídicas que también producen una o más "proteínas asociadas a neurotoxina" que no son toxinas o NAP que se asocian no covalentemente con la neurotoxina para formar complejos de hemaglutinina, también conocidos como complejos progenitores. Estos NAP ayudan a la neurotoxina a resistir la degradación de la proteasa en el intestino cuando se ingiere en alimentos contaminados.

10

Las proteínas NAP incluyen tres proteínas (HA1, HA2 y HA3) de hemaglutinina (HA), y una proteína no hemaglutinina no tóxica (NTNH). Los tipos A2, E y F de BoNT no tienen los genes HA, y solo producen un complejo 12S (aproximadamente 300 kDa) que comprende BoNT y NTNH. "S" representa la unidad Svedberg, una unidad de velocidad de sedimentación centrífuga. Los tipos B, C y D producen complejos 12S y 16S (aproximadamente 500 15 kDa); el complejo 16S incluye BoNT, NTNH, HA1, Ha2 y Ha3. El tipo a1 tiene los complejos 12S y 16S más un complejo 19S de aproximadamente 900 kDA, que puede representar un dímero de complejos 16S.

En la actualidad, los complejos BoNT/A1 y B-hemaglutinina se han aprobado para dichos usos clínicos. Los beneficios terapéuticos del complejo BoNT/A1 son más persistentes que los de BoNT/B debido a que su proteasa 20 tiene una vida útil más larga en las neuronas.

Como se indicó anteriormente, BoNT consiste en un dominio de cadena ligera asociada a la proteasa (LC), que está unida a una cadena pesada (HC) a través de un únicos enlace covalente disulfuro y enlaces no covalentes adicionales. Un resto carboxi terminal (C-terminal) de HC (Hc) se une a sus aceptores específicos expresados en 25 varios tipos de nervios, incluyendo las neuronas motoras, autonómicas y sensoriales. Cuando se une a una célula diana, la molécula de BoNT se transporta a las vesículas por endocitosis; la mitad amino terminal (N-terminal) de HC (Hn) forma un canal que permite que la LC se transloque desde vesículas de membrana de tipo "endosomal" hacia el citosol. Posteriormente, la LC escinde un sustrato de la proteína SNARE específico, destruyendo de este modo la capacidad de SNARE para mediar la fusión de vesículas y membranas y, por lo tanto, la liberación de 30 neurotransmisores, citocinas y péptidos del dolor de la célula.

Las LC de los diversos serotipos de BoNT son similares, pero no idénticos, y dos LC diferentes pueden escindir diferentes proteínas SNARE, o escindir la misma proteína SNARE de forma diferente. Por ejemplo, LC/A, LC/C y LC/E escinden la SNAP-25; LC/B, LC/D, LC/F y lC/G escinde la sinaptobrevina-2 (VAMP-2); adicionalmente, LC/C 35 escinde la sintaxina, otra proteína SNARE que se ha informado que es necesaria para la división celular. La LC de TeTx escinde la VAMP-2. Las LC de cada serotipo dividen su sustrato en una posición única en la molécula.

Por ejemplo, la cadena ligera de BoNT/A (LC/A) elimina 9 aminoácidos del C-terminal de SNAP-25, mientras que la LC/E elimina otros residuos 17 C-terminales y, por tanto, ofrece un bloqueo más disruptivo de la neuroexocitosis 40 mediante la desestabilización de complejos SNARE estables (Meng et al., 2009; Wang et al., 2011). Por ejemplo, la inhibición de la liberación de neurotransmisores por LC/A generalmente puede revertirse elevando la afluencia de Ca2+, pero no en el caso de LC/E, presumiblemente debido a la mayor destrucción del sustrato de SNAP-25. Sin embargo, a pesar de la mayor "robustez" de la actividad por LC/E, debido a que LC/E induce solo una parálisis neuromuscular transitoria corta, sus aplicaciones clínicas son limitadas.

45

Es altamente deseable para crear un agente terapéutico que tenga nuevas propiedades. Por ejemplo, los tratamientos en los que dos o más endopeptidasas de cadena ligera derivadas de más de un serotipo pueden combinarse en un derivado de BoNT o TeTx en el que cada cadena ligera está activa y reconoce una secuencia de aminoácidos diferente en su sustrato, la proteína SNARE puede diseñarse para afecciones como dolor crónico, 50 afecciones inflamatorias crónicas (incluida la artritis) y/o afecciones que implican la liberación de citocinas.

En un ejemplo, un agente terapéutico se diseña la combinación de la proteasa potente de LC/E combinada con la acción de larga duración de LC/A. Esto es particularmente importante para mejorar la eficacia de BoNT/A para el tratamiento del dolor crónico, incluyendo cefaleas tensionales/migrañas y enfermedades inflamatorias crónicas como 55 la artritis porque el complejo BoNT/A por sí solo es efectivo en algunos, pero no en todos, dichos pacientes. Véase p. ej., Naumann M. et al. (2008) ASSESSMENT: BOTULINUM NEUROTOXIN IN THE TREATMENT OF AUTONOMIC DISORDERS AND PAIN (AN EVIDENCE-BASED REVIEW): REPORT OF THE THERAPEUTICS AND TECHNOLOGY ASSESSMENT SUBCOMMITTEE OF THE AMERICAN ACADEMY OF NEUROLOGY, Neurology 70:1707-1714. El bloqueo de la exocitosis de los factores asociados al dolor, como las proteínas del dolor 60 y las citocinas, puede ser útil para tratar el dolor crónico, el dolor neuropático y las afecciones inflamatorias.

BoNT/A no es capaz de bloquear la liberación exocitótica de péptidos estimulantes del dolor [p. ej., péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP) y la sustancia P] a partir de las neuronas sensoriales al ser provocada por la activación de TRPV1 (receptor de potencial transitorio Vallinoid 1), un canal de catión involucrado en la 5 señalización de la mayoría de las formas de dolor (Meng et al., 2007; Meng et al., 2009).

BoNT/E tampoco inhibe la liberación de CGRP y sustancia P en neuronas sensoriales mediada por TRPV1 estimulada por capsasina, debido a que su aceptor de superficie celular (proteína 2A de vesículas sinápticas glicosiladas (SVP2A) y SVP2B glicosilada) es escasa o está ausente en la neuronas sensoriales. Sin embargo, una 10 proteína quimérica en la que el Hc (dominio de unión al receptor) de BoNT/E es reemplazado por su homólogo de BoNT/A es capaz de bloquear la liberación de estos péptidos mediadores del dolor, lo que indica que el receptor de superficie celular BoNT/A facilita la endocitosis y la administración de LC/E en fibras C nociceptivas.

Una vez dentro de la neurona, la proteasa LC/E, elimina 26 residuos de aminoácidos de la SNAP-25, evitando así la 15 formación de un complejo SNARe estable requerido para neuroexocitosis (Meng et al., 2009). Aunque la LC/A

también escinde la SNAP-25, solo escinde 9 residuos de aminoácidos y el bloqueo de la actividad exocitótica es

menos completa y estable.

Para hacer práctico explotar clínicamente una característica tan ventajosa de la proteasa LC/E, es deseable 20 extender considerablemente su duración de acción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un esquema para la creación de una neurotoxina compuesta creando una construcción génica que

25 codifica una LC/E activa unida al resto LC/A N terminal de BoNT/A a través de un engarce, para generar neurotoxina

compuesta LC/E- BoNT/A, que contiene dos proteasas activas.

La Fig. 2A es una foto de electroforesis en SDS-PAGE que muestra la purificación de los marcados con His6 ("His6" desvelada como SEQ ID NO: 15) construcción de LC/E-BoNT/A mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC), usando resina Superflow de Talon® (fabricada por Clonetech Laboratories, Inc.), una resina de 30 agarosa cargada con Co2+ que tiene un alto grado de selectividad para la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15).

La Fig. 2B muestra la absorbancia y la conductividad frente al tiempo en un perfil de elución de fracciones de IMAC que contienen LC/E-BoNT/A posteriormente sometidas a cromatografía de intercambio catiónico.

La Fig. 3 es una fotografía de electroforesis en SDS-PAGE que muestra el tratamiento de LC/E-BoNT/A purificada con trombina biotinilada para crear toxina de doble cadena y eliminar la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15). Los símbolos 35 + y - respectivamente indican el tratamiento con o sin el agente ditiotreitol (DTT) para reducir el enlace disulfuro que une las cadenas LC/E-LC/A y HC/A.

La Fig. 4 es una foto de bandas Western en la que se analizan diluciones en serie de BoNT/A (gel superior) y LC/E- BoNT/A (gel inferior) para determinar su capacidad para escindir la proteína SNARE SNAP-25 en neuronas granulares de cerebelo de rata cultivado (CGN).

40 La Fig. 5 muestra la duración de la parálisis muscular en el músculo gastrocnemio inyectado con LC/E-BoNT/A, BoNT/E o BoNT/A, en el que la dosis máxima tolerada (TDmáx) se representa en función del tiempo en días.

La Fig. 6A es una foto de una banda Western en la que se incuban diluciones en serie de LC/E-BoNT/A con TGN de rata (neuronas ganglionares del trigémino) durante la noche, después se ensayaron los lisadosusando anticuerpos anti-SNAP-25 y anti-sintaxina para la capacidad de LC/E-BoNT/A para escindir la SNAP-25 (principalmente para 45 proporcionar el producto de escisión de la SNAP-25 truncada de 26 residuos producido por LC/E), pero sin sintaxina. La Fig. 6B es una curva de respuesta a la dosis por LC/E-BoNT/A que muestra a) la escisión de la SNAP-25 y b) la inhibición de la liberación de CGRP provocada por 60 mM KCl o c) la capsaicina en TGN de rata, y el fracaso de BoNT/A para reducir significativamente la liberación de CGRP provocada por la capsaicina en los TGN incubados con BoNT/A.

50 La Fig. 7A es una curva de la duración de la actividad antinociceptiva en un modelo de rata, la prueba de lesión nerviosa residual (SNI), en animales tratados con solución salina, BoNT/A o LC/E-BoNT/A, seguido de la colocación de la pata en una placa fría (4 °C) y midiendo el tiempo requerido para que la rata retire su pata de la placa, llevada a cabo desde 4 días antes de la cirugía hasta aproximadamente 21 días después de la cirugía.

La Fig. 7B es una curva de la duración de la actividad antinociceptiva en un modelo de rata, la prueba de lesión 55 nerviosa residual (SNI) en animales tratados con solución salina, BoNT/A o LC/E-BoNT/A, seguida de la medición de la alodinia inducida. por sensibilidad a la aplicación de filamentos von Frey calibrados en la superficie plantar de la pata trasera, llevada a cabo desde 4 días antes de la cirugía hasta aproximadamente 21 días después de la cirugía. La Fig. 8A es un esquema de un polipéptido de doble proteasa de la presente invención. Este polipéptido inactiva dos proteínas SNArE diferentes: VaMP por LC/B y SnAp-25 por LC/A. Un gen de LC/B sintético se fusiona con el 60 extremo 5 terminal de BoNT/A a través de una secuencia de engarce (que codifica residuos "DI") para generar la

neurotoxina compuesta LC/B-BoNT/A. Este último también contiene dos secuencias de reconocimiento de trombina. La Fig. 8B es gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie que ilustra la purificación de LC/B-BoNT/A etiquetado con His6 por IMAC, utilizando resina Superflow de Talon® (fabricada por Clonetech Laboratories, Inc.).

La Fig. 8C es SDS-PAGE de LC/B-BoNT/A purificada por IMAC después del tratamiento con trombina biotinilada 5 para crear toxina bicatenaria (DC). Los símbolos + y - respectivamente indican tratamiento con o sin el agente reductor ditiotreitol (DTT).

La Fig. 8D muestra una banda Western de un gel de SDS-PAGE en el que se incuban diluciones en serie de LC/B- BoNT/A con CGN de rata a 37 °C durante 24 h. Después se analizan los lisados utilizando anticuerpos anti-SNAP-25 y anti-VAMP 2 para controlar la escisión de la toxina de las dos proteínas SNARE SNAP-25 y VAMp 2. La sintaxina 10 1, probada por su anticuerpo específico y no reconocida por LC/B o LC/A, actuó como un control de carga interno.

La Fig. 8E muestra curvas de dosis/respuesta para LC/B-BoNT/A que muestra la escisión de la SNAP-25 (rectángulo) y VAMP 2 (triángulo invertido) a concentraciones más altas de la construcción LC/B-BoNT/A.

La Fig. 9 es otro ejemplo de la presente invención en la que un candidato terapéutico de escisión de múltiples SNARE tiene la capacidad de inactivar los tres tipos principales de proteínas SNARE: SNAP-25 y sintaxina 1-3 por 15 LC/C1 y VAMP1-3 por LC/D. DI es un enlazador entre LC/D and LC/C1.

La Fig. 10A muestra una curva de la duración de la actividad antinociceptiva en un modelo de rata, la prueba de lesión nerviosa residual (SNI), en animales tratados con solución salina, PK (LC/E-BoNT/A), o pregabalina seguida de la estimulación de la pata con filamentos de Von Frey y medición del umbral mecánico para que la rata retire su pata, llevada a cabo desde 4 días antes de la cirugía hasta aproximadamente 21 días después de la cirugía.

20 La Fig. 10A muestra una curva de la duración de la actividad antinociceptiva en un modelo de rata, la prueba de lesión nerviosa residual (SNI), en animales tratados con solución salina, PK (LC/ E-BoNT/A fabricada utilizando procesos adaptados para la producción conforme a GMP), o pregabalina seguida de de la colocación de la pata en un frío (4 °C) y midiendo el tiempo requerido para que la rata retire su pata de la placa, llevada a cabo desde 4 días antes de la cirugía hasta aproximadamente 21 días después de la cirugía.

25 La Fig. 11 muestra una curva de la duración de la actividad antinociceptiva en un modelo de rata, la prueba de lesión nerviosa residual (SNI), en animales tratados con solución salina o PK (LC/E-BoNT/A fabricado usando procesos adaptados para la producción conforme a GMP) seguido de estimulando la pata con filamentos de Von Frey y midiendo el umbral mecánico para que la rata retire su pata, llevada a cabo desde 4 días antes de la cirugía hasta aproximadamente 36 días después de la cirugía. Se realizó una segunda inyección de PK para un grupo de 30 animales el día 10 después de la cirugía.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a composiciones relacionadas con moléculas de polipéptidos terapéuticos 35 derivados de neurotoxinas botulínicas como se define en la reivindicación 1. En particular, las moléculas comprenden al menos dos dominios de endopeptidasa activa derivados de las cadenas ligeras de diferentes serotipos de BoNT. Muy preferentemente, los dominios de endopeptidasa reconocen y escinden diferentes secuencias de aminoácidos en su sustrato. Los dominios de endopeptidasa se derivan de dos o más serotipos de BoNT.

40

La capacidad de combinar una cadena pesada de una BoNT seleccionada con al menos dos dominios diferentes de la endopeptidasa de la cadena ligera clostrídica activa proporciona moléculas terapéuticas diseñadas que tienen propiedades mejoradas y personalizadas. Dichos tratamientos se ejemplifican primero por el diseño y la creación de una construcción génica que codifica un compuesto de dos serotipos de BoNT diferentes, y la expresión/purificación 45 procariota de la proteína recombinante que muestra actividades biológicas sinérgicas y múltiples con aplicaciones terapéuticas.

El bloqueo de exocitosis mediante dichos tratamientos multi-endopeptidasas puede tener actividades aditivas como por ejemplo bloquear el tráfico de receptores sensibles al dolor a la superficie de las neuronas sensoriales. Por lo 50 tanto, dichos tratamientos no solo inhiben la exocitosis de factores sinápticos solubles, sino que también pueden inhibir el tráfico de proteínas que son integrales a la membrana neural.

En ciertos tratamientos no ilustrados en la sección de Ejemplos el dominio de unión natural se puede alterar de manera que el tratamiento se redirija a un tipo de célula diferente o adicional. Por ejemplo, en la patente de EE. UU 55 6.776.990 Aoki et al., la región de unión de BoNT se reemplaza por colecistoquinina humana, o un análogo de la misma, dirigiendo así la toxina (que tiene solo una sola endopeptidasa) a células acinares pancreáticas. De forma similar, en el N.° de serie de la solicitud de patente n.° 13/644,386, depositada el 4 de octubre de 2012, un ligando dirigido reemplaza el dominio de unión natural en ciertos ejemplos. En un ejemplo de un gen que codifica el antagonista del receptor de interleuquina-1 humana (IL-1RA) se utiliza para reemplazar la región Hc natural o parte 60 de la misma, dirigiendo así las células secretoras de citocinas.

La molécula actualmente preferida que ejemplifica la invención se basa en un concepto novedoso para la creación de construcciones de ácido nucleico que expresan una proteína que comprende la LC de BoNT/E fusionada al resto de LC/A del recombinante activo de BoNT/A usando procedimientos de biología molecular. Esta molécula única 5 comprende LC/E-BoNT/A (que se muestra en la Fig. 1) que se une a aceptores BoNT /A neuronales (p. ej., la proteína 2 y/o gangliósidos vesiculares sinápticos), se somete a endocitosis mediada por aceptor y se transloca al citosol, donde la proteína SNARE SNAP-25 se escinde eficazmente, lo que da como resultado la inhibición de la liberación de neurotransmisores, citocinas y péptidos del dolor. Por "se escinde eficazmente" se entiende que la mayoría de las moléculas de SNAP-25 tienen un número suficiente de aminoácidos escindidos para impedir la 10 reversión del bloqueo exocitótico al elevar el influjo de Ca2+, por ejemplo, como los resultados de la escisión de la SNAP-25 por LC/E.

Las construcciones mencionadas anteriormente se diseñan preferentemente para contener una corta secuencia que codifica los residuos de aminoácidos específicos, situados entre HC y LC de /A, que se reconocen y escinden 15 selectivamente por una proteasa trombina, por lo la proteína recombinante monocatenaria (SC) obtenida se puede convertir a la forma bicatenaria (DC) in vitro por exposición a trombina.

Muy preferentemente, la presente invención se ejemplifica por LC/E vinculado al resto de LC/A de BoNT/A a través de un engarce de dos aminoácidos (por ejemplo, ácido-isoleucina aspártico; DI), proporcionando una novedosa 20 toxina compuesta. En experimentos que implican la exposición de neuronas sensoriales a esta construcción, se demostró que las proteasas se liberaban dentro de las neuronas cultivadas, y la LC/E unida se estabilizó lo que, a su vez, produjo neuroparálisis de larga duración como LC/A.

Es importante destacar que, a diferencia de LC/A, esta molécula de acción prolongada produce principalmente 25 productos proteolíticos característicos de LC/E y bloquea la liberación de los mediadores del dolor evocados por capsaicina de neuronas sensoriales cultivadas de rata, debido a la incapacidad de las SNAP-25 escindidas de /E de mediar en la liberación de neurotransmisores, citocinas y péptidos dolorosos. Además, esta proteína compuesta demostró ser más eficaz que la LC/A sola en la atenuación del comportamiento del dolor en un modelo de rata de dolor neuropático (nervio residual inducido por la lesión).

30

La molécula quimérica ejemplar ofrece por lo tanto grandes ventajas como un tratamiento para el tratamiento del dolor crónico: (a) un tiempo de vida muy deseable y muy prolongado de la proteasa E de acción transitoria, en virtud de los motivos de retención/estabilización del terminal nervioso presentes en la LC/A unida; (b) la escisión predominante de la SNAP-25 por la proteasa /E desestabiliza los complejos SNARE y (c) la inhibición de la 35 exocitosis mediada por TRPV1 de los péptidos del dolor de las neuronas sensoriales. Estos nuevos hallazgos resaltan el potencial antinociceptivo de esta proteína de ingeniería patentada que exhibe efectos compuestos sinérgicos. Sus ventajas sobre la primera generación de BoNT naturales se han demostrado de manera concluyente y, por lo tanto, deberían conducir tratamientos mucho mejores.

40 Debido a que los BoNT nativos tienen solo un dominio de proteasa, el concepto innovador de la administración de un LC adicional -que o bien escinde el mismo sustrato en una posición diferente (u otro sustrato)- no solo aumenta significativamente sus propiedades inhibidoras, sino la influencia estabilizadora adicional de la LC/A original dando como resultado una acción sinérgica sorprendente, a saber, una duración del beneficio terapéutico muy extendida en comparación con la BoNT/E.

45

En otros ejemplos, un tratamiento multi-endopeptidasa diferente se ejemplifica por una construcción de una construcción de ácido nucleico LC/B-BoNT/A usando las técnicas empleadas para la construcción del ácido nucleico LC/E-BoNT/A. Al momento de la expresión del polipéptido codificado por el marco de lectura abierto LC/E-BoNT/A, y el corte de los sitios de trombina, la proteína resultante escinde tanto SNAP-25 como VAMP-2. La escisión de dos 50 proteínas SNARE involucradas en el complejo ternario de fusión sináptica puede resultar más efectiva.

De acuerdo con un concepto general de la invención, se proporciona una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa, y un segundo dominio 55 endopeptidasa, donde cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y dicho segundo dominio endopeptidasa tiene una actividad proteolítica selectiva contra, y reconoce un sitio de escisión diferente en, una proteína SNARE como se define en la reivindicación 1.

Los ácidos nucleicos que utilizan esta composición de concepto general también se contemplan como se define en 60 la reivindicación 10. Además, una composición terapéutica que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica,

comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa, y un segundo dominio endopeptidasa, en donde cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y dicha segunda endopeptidasa dominio tiene una actividad proteolítica selectiva contra, y reconoce un sitio de escisión diferente en, una proteína SNARE para uso en el tratamiento del 5 dolor crónico también se contempla como se define en la reivindicación 12. Adicionalmente, el uso de una composición terapéutica que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa, y un segundo dominio endopeptidasa, en donde cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y dicho segundo dominio endopeptidasa tiene una actividad proteolítica selectiva contra, y reconoce 10 un sitio de escisión diferente en, una proteína SNARE para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor crónico también se contempla como se define en la reivindicación 14.

De acuerdo con la invención, se proporciona una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye:

15

a) un dominio de unión,

b) un dominio de translocación, y

c) un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A, y

d) un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E;

20

en el que cada uno del primer dominio endopeptidasa y el segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido que 25 comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho ácido nucleico un solo marco abierto de lectura que codifica, en la secuencia de carboxi terminal a amino terminal: un dominio de unión, una dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A, y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E; en el que cada uno del primer dominio endopeptidasa y el segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo.

30

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona una composición terapéutica que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa derivada de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica 35 subtipo BoNT/E para su uso en el tratamiento del dolor crónico; en el que cada uno del primer dominio endopeptidasa y el segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo. De acuerdo con otra realización más de la invención, se proporciona una composición terapéutica que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa derivada de una neurotoxina clostrídica 40 subtipo BoNT/A, y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor crónico en el que cada uno del primer dominio endopeptidasa y el segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo.

EJEMPLOS

45

Ejemplo 1

Un gen BoNT/A sintético, que tiene sus codones optimizados para la expresión mejorada en E. coli y tres nucleótidos extra (AAA) que codifican residuo de Lys, se clonó en los sitios Nde I y Sal I de un vector pET29a de 50 expresión procariota (+) para producir pET-29a-BoNT/A.

Después, pET-29a-BoNT/A se modificó más para proporcionar la capacidad de corte específico controlado y eliminación simultánea de la etiqueta hexahistadina (His6 (SEQ ID NO: 15)) codificada por el vector de clonación pET-29a. Una secuencia de nucleótidos que codifica sitios de escisión de trombina se modificó por ingeniería 55 genética en la región de ácido nucleico que codifica el bucle HC/LC de la toxina. Esto se muestra a continuación tanto en forma de ácido nucleico como de aminoácido, como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Secuencia de nucleótidos del bucle BoNT/A modificada (SEQ ID NO: 1) y su secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 2)

Sitio de corte de la trombina

*

CVRGI ITSKTK3LVPRGSNKALNDLC TGTGTCCGCGGTATTATCACCAGCAA.AACCAAATCCTTGGTGCCCCGCGGCTCT.AACA_AGGCGCTCAATGATTTATGC

Además, se insertó un sitio de trombina adicional entre las regiones que codifica las regiones HC/A y His6 (SEQ ID NO: 15) de la proteína expresada. Esto se muestra a continuación tanto en forma de ácido nucleico como de 5 aminoácido, como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Secuencia de nucleótidos fusionada al extremo 3'del gen BoNT/A (SEQ ID NO: 3) y su secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 4)

Sitio de corte de la trombina

1 i

KVDKLLVPRG5KLQLEHHHHHH*

AAAGTCGACAAGCTTCTGGTACCGCGCGGCAGCAAACTGCAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

1

Sal I HindIII Pst I Xho I

10

La secuencia de nucleótidos proporcionada anteriormente contiene las siguientes regiones, de izquierda a derecha, respectivamente:

15 a) nucleótidos 1-3: se insertó un codón AAA que codifica Lys adicional para proporcionar un sitio de escisión de tripsina opcional, para eliminar el His6 C-terminal (SEQ ID NO: 15);

b) subrayado único: Sitio de endonucleasa de restricción Sal I;

c) subrayado doble: Sitio de endonucleasa de restricción Hind III

d) negrita: secuencia de reconocimiento de trombina;

20 e) subrayado único: Sitio de endonucleasa de restricción Pst I;

f) subrayado doble: Sitio de endonucleasa de restricción Xho I;

g) nucleótidos 49-66: región de nucleótidos que codifica la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15). Las secuencias de aminoácidos alineadas se muestran por encima de los nucleótidos correspondientes. La flecha indica el sitio de escisión de la trombina, y el asterisco señala el codón de "terminación" traslacional.

25

Esta construcción de ácido nucleico, que comprende el marco de lectura abierto BoNT/A descrito anteriormente, y que comprende tanto la SEQ ID NO: 1 como la SEQ ID NO: 3, se denominó pET29a-BoNT/A-2T.

Un producto PCR (amplicón) se amplificó a partir de un ácido nucleico sintético que codifica la proteasa LC/E 30 (residuos 1-411), y dos sitios de restricción (Nde I y Eco RV) se incorporaron durante la amplificación en el extremo 5' y 3' del amplicón de ácido nucleico, respectivamente. Este amplicón de PCR se digirió después con Nde I y Eco RV y se clonó en el vector pET29a(+), también digerido con Nde I y Eco RV. La construcción del vector intermedio resultante se denominó pET29a-LC/E.

35 La región del gen de BoNT del marco de lectura abierto "monocatenario" intacta mencionada anteriormente se amplificó por PCR usando pET29a-BoNT/A-2T como plantilla con un par de cebadores (un cebador reverso terminal del bacteriófago T7 y un cebador directo que contiene una secuencia de restricción EcoRV en dirección la secuencia codificadora 5' de BoNT/A). El amplicón de PCR resultante se digirió mediante las enzimas EcoRV y Xho I, se purificó y se insertó en el plásmido pET29a-LC/E escindido con Eco RV y Xho I. Esta construcción final se denominó 40 pET29a-LC/E-BoNT/A, y el marco de lectura de ácido nucleico abierto se divulga como SEQ ID NO: 5, mientras que la secuencia de aminoácidos correspondiente se divulga en esta invención como SEQ ID NO: 6.

Ejemplo 2

45 Para la expresión de LC/E-BoNT/A, la construcción de la secuencia verificada se transformó en la cepa de E. coli

BL21 (DE3), y al expresar la proteína diana se indujo usando medio de autoinducción de Studier (Studier, F.W., 41 Protein Expr. Purif. 207 (2005)). La purificación parcial (~60%) de la proteína etiquetada de His6 (SEQ ID NO: 15) en el lisado de bacterias se logró con el cromatógrafo de afinidad de metal inmovilizado (Co2+) (IMAC), usando resina Superflow de Talon. Una proteína principal de Mr~200 kDa se eluye por imidazol mayor que o igual a 50 mM; esto 5 se demuestra en la Fig. 2A, que muestra SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie del gel. Los carriles de gel son los siguientes: Carril 1: lisado limpio antes de la aplicación a la columna IMAC; Carril 2: fracción de flujo de columna IMAC; Carril 3: fracción de lavado de columna IMAC; Carriles 4-9, fracciones eluidas usando imidazol de la columna IMAC.

10 Las fracciones eluidas de IMAC extraído eran un intercambio de tampón en tampón de 0,02 M de fosfato de sodio (pH 6,5), y después se purificó adicionalmente mediante la carga en una columna de intercambio catiónico UNO-S1, seguido de lavado con NaCl hasta 150 mM, y después la elución con un gradiente de NaCl; la toxina se eluyó con concentraciones de NaCl iguales o superiores a 220 mM. La Fig. 2B muestra el perfil de elución (absorbancia a 280 nm) del polipéptido monocatenario LC/E-BoNT/A en función del tiempo, con el aumento de la conductividad del 15 gradiente de NaCl superpuesto. La flecha muestra la ubicación del pico de absorbancia que contiene LC/E-BoNT/A.

Ejemplo 3

Después del intercambio del tampón de la toxina intacta eluida en 25 mM de HEPES/145 mM NaC (pH 7,4), la 20 proteína monocatenaria purificada ("SC") se almacenó a -80 °C, y se tomaron alícuotas para el análisis SDS-PAGE. La Fig. 3 muestra los resultados de reducir (+) y no reducir (-) SDS-PAGE y el análisis de inmunotransferencia tipo Western del polipéptido purificado, confirmando que esta proteína purificada se expresó en una forma SC, como lo revela una banda única que migra con un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kDa. Esta banda se observó en ausencia o presencia de agente reductor. Véase p. ej. los carriles SC (-) y SC (+) de la fotografía del gel 25 teñido con Coomassie Brilliant Blue de la Fig. 3.

El corte de este polipéptido SC se intentó por incubación con trombina biotinilada (1 unidad/mg de proteína) a 22 °C durante 3 horas; la proteasa trombina se elimina después tratando la muestra con agarosa estreptavidina. Aparece una banda que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 100 KDa después del tratamiento con 30 trombina de la proteína en muestras procesadas en un gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras; la banda de ~200 KDa no se ve en estas condiciones, pero está presente en geles ejecutados en condiciones no reductoras, mientras que la banda de ~100 KDa está ausente en estas últimas muestras. Véase p. ej. los carriles DC (-) y DC (+) de la fotografía del gel teñido con Coomassie Brilliant Blue de la Fig. 3.

35 La banda de ~100 KDa se cree que representa tanto las cadenas LC/E-LC/A como HC/A, que tienen tamaños similares. Las identidades de los polipéptidos en esta banda se confirman mediante inmunotransferencia tipo Western de geles de SDS-PAGE ejecutados en LC/E-BoNT/A cortado y sin cortar usando anticuerpos específicos contra cada uno de los polipéptidos monocatenarios postulados LC/E y BoNT/A.

40 Como se muestra en la Fig. 3, la muestra cortada continúa migrando a ~200 kDa en ausencia de agente reductor, lo que indica que había formado el enlace disulfuro entre cadenas entre LC/E-LC/A y HC/A, y persiste, en todas las muestras como se muestra en los carriles de las bandas Western marcadas (-) y desarrolladas usando anticuerpos anti-LC/E o anti-BoNT/A. Por lo tanto, la SDS-PAGE y la inmunotransferencia tipo Western en condiciones reductoras y no reductoras resaltan el corte específico en la región del bucle que se produce sin degradación de la 45 toxina compuesta. Una ligera diferencia en la movilidad de la proteína no cortada y cortada se debe a la eliminación de la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15) en las muestras tratadas con trombina; esto se confirmó usando un anticuerpo específico contra esta etiqueta. Véase la banda Western usando el anticuerpo anti-His6 (SEQ ID NO: 15) de la Fig. 3, en el que la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15) es indetectable. Por lo tanto, este experimento también demostró que la trombina proteasa puede cortar simultáneamente la toxina entre los residuos de cisteína unidos del enlace 50 disulfuro entre el HC y el primer LC, y eliminar la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 15).

Ejemplo 4

LC/E-BoNT/A y BoNT/A producidos recombinantemente fueron cada uno incubados durante la noche a 55 concentraciones diluidas serie de 10 veces de 0,01 pM a 1000 pM de toxina con neuronas cultivadas de gránulos cerebelosos de rata (CGN). Estas células se disocian del cerebelo de ratas de 7-8 días y se suspenden a aproximadamente 1x106/ml en 3 partes de medio de Eagle basal y 1 parte de HEPES-NaOH 40 mM, pH 7,3, KCl 78,4 mM, 37,6. D-glucosa mM, CaCh 2,8 mM, MgSO4 1,6 mM y NaH2PO4 1,0 mM, así como 1 suplemento de N2, L- glutamina 1 mM, penicilina 60 unidades/ml, estreptomicina 60 pg/ml y 2 % (v/v) de suero de caballo dializado. Se 60 agrega una alícuota (1 ml) de esta suspensión celular a cada pocillo recubierto con poli-D-lisina de 16 mm de

diámetro (es decir formato de 24 pocilios) y se agrega citosina-p-D-arabinofuranosida (40 pM) después del cultivo durante 20-24 h en 5 % (v/v) de CO2; las neuronas se mantienen por reemplazo cada 10 días con el mismo medio recién preparado. Cuando se especifica, las neuronas se exponen a BoNT/A o LC/E-BoNT/A (0,2 pm esterilizadas por filtración) en medio de cultivo durante 24 h.

5

Después de 24 h de incubación con la proteína BoNT/A o LC/E-BoNT/A, las células se recogen y se someten a SDS-PAGE e inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo anti-SNAP-25 que reconoce la SNAP-25 intacta, así como la SNAP-25 escindida por LC/A como la SNAP-25 escindida por LC/E. La sintaxina 1 de la proteína SNARE se usó como un control de carga interno positivo.

10

Se realizó la inmunotransferencia tipo Western usando anticuerpo anti-SNAP-25. Como se puede ver en la Fig. 4, LC/E-BoNT/A fue casi tan activo como BoNT/A en la escisión de la SNAP-25 intacta, produciéndose una escisión significativa a concentraciones de toxina superiores a 1 pM en cada caso. Notablemente, como se puede observar, el tratamiento de CGN con LC/E-BoNT/A también proporciona un producto de escisión de LC/A cuando se utiliza por 15 debajo de aproximadamente 1 pM de toxina. Este producto de escisión ("SNAP-25a") parece escindirse sustancialmente además en el producto de escisión de LC/E ("SNAP-25E") por la proteasa LC/E coadministrada cuando las concentraciones de la toxina LC/E-BoNT/A se elevan por encima de aproximadamente 0,01 nM (Fig. 4). Estos resultados sugieren que el dominio de translocación de cadena pesada BoNT/A es capaz de administrar la proteasas LC/A y LC/E unidas covalentemente al citosol de CGN, donde las proteasas permanecen activas para 20 escindir SNAP-25, inactivando total o parcialmente la proteína SNARE.

Ejemplo 5

La neurotoxicidad específica de LC/E-BoNT/A se determina por inyección intraperitoneal en ratones de la manera 25 descrita en Maisey, E. A., et al., 177 EUR. J. BIOCHEM. 683-691(1988). La cantidad más baja de toxina que mata al 50 % de los ratones en 4 días se define como una dosis letal mínima (mLD50). La actividad específica de las toxinas se puede expresar como el número de mLD50 en unidades/mg de toxina.

La mLD50 de la preparación de LC/E-BoNT/A se observa que es 0,7 x 108. Esta actividad específica se encuentra 30 entre la observada para BoNT/E recombinante (0,4 x 108) y la observada para BoNT/A recombinante (2 x 108). Se evaluó la duración de la acción neuroparalítica in vivo usando un ensayo de puntuación de abducción digital en ratones (DAS), descrito en, p. ej., Aoki, KR, 39 TOXICON 1815-1820 (2001).

La LC/E-BoNT/A recombinante se inyecta en el músculo gastrocnemio de ratón a una dosis de 0,5 unidades de la 35 mLD50, que es la dosis máxima tolerada que puede administrarse a animales de experimentación, sin producir síntomas sistémicos. Esta dosis de LC/E-BONT/A causó parálisis durante aproximadamente 27 días; similar al efecto inducido por 6 unidades de BoNT/A nativa; véase la Fig. 5. La acción de larga duración de la proteína LC/E- BONT/A en comparación con la BoNT/E aparentemente se debe a la capacidad del resto de la LC/A en la proteína de fusión para estabilizar el resto de la lC/E unido; BoNT/E solo proporciona una parálisis mucho más corta que 40 otras toxinas; véase la comparación de BoNT/E frente a LC/E-BoNT/A en la Fig. 5.

Ejemplo 6

Se examinó el potencial antinociceptivo de la proteína LC/E-BONT/A utilizando neuronas ganglionares del trigémino 45 (TGN). Estas células son un buen modelo para este experimento debido a su implicación en la propagación del dolor y al hecho de que estas células en cultivo proporcionan un buen modelo para investigar la liberación de péptidos del dolor (CGRP, SP) activados por diferentes estímulos; véase p. ej., Bacccaglini and Hogan, 80 PROC NATL ACAD SCI U.S.A. 594-598 (1983). La capsaicina, aislada de los chiles, activa el TRPV1, que se expresa principalmente en la fibra C de las neuronas sensoriales. Por lo tanto, la capacidad de la toxina compuesta para bloquear la liberación 50 de CGRP provocada por su agonista, la capsaicina, debería ser una buena indicación de su actividad inhibidora.

BoNT/A solo elimina 9 residuos de aminoácidos desde el extremo C terminal de la proteína SNARE SNAP-25 (el producto de escisión de SNAP-25 truncado en /A), y no afecta a la exocitosis de CGRP provocada por la capsaicina en las TGN. Por el contrario, la eliminación de 17 residuos adicionales por la proteasa LC/E (que da como resultado 55 el producto de escisión de SNAP-25 truncado en /E) bloquea esta liberación de CGRP estimulada por capsaicina; véase p. ej., Meng et al., 29 J NEUROSCI 4981-4992 (2009).

Dado que el producto de escisión de la SNAP-25 principal de la toxina de acción prolongada, LC/E-BoNT/A, es el producto de escisión de SNAP-25 truncado en /E, en lugar del producto de escisión de SNAP-25 truncado en /A en 60 los CGN (véase la Fig. 4), se espera que LC/E-BoNT/A bloqueará la liberación del péptido del dolor CGRP.

Brevemente, las TGN se extraen de ratas Wistar de 5 días postnatales después de haber sido profundamente anestesiadas con una inyección intraperitoneal de Dolethal (50 mg/kg de peso corporal). El tejido se coloca en medio L15 helado y después se lava dos veces en CMF-HBSS estéril helada antes de la centrifugación a 170 g durante 1 5 minuto. Después de trocear el tejido en piezas pequeñas y pasarlas a través de pipetas Falcon de 10 ml prerrecubiertas con medio L15, el tejido se incuba con agitación a 37 °C durante 30 minutos en una mezcla 1:1 de solución salina balanceada de Hanks exenta de calcio y magnesio (CMF-HBSS) que contiene 2,4 U/ml de dispasa II y 1 mg/ml de colagenasa I. Después, la suspensión se tritura suavemente a través de pipetas Falcon de 10 ml prerrecubiertas con medio L15 hasta que estén turbias, antes de añadir 1 mg/ml de DNasa I durante 15 minutos.

10

Después de la centrifugación a 170 g durante 5 minutos, el sedimento celular se suspendió y se lavó tres veces en medio de cultivo [solución F12 de Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que contiene 10 % (v/v) de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 100 UI/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina]. Las células se siembran en placas de 24 pocillos prerrecubiertas con poli-L-lisina (0,1 mg/ml) y laminina (20 pg/ml) en medio F12 suplementado 15 con factor de crecimiento nervioso (NGF) (50 ng/ml) y se mantienen en una incubadora de CO2 a 37 °C. Después de 24 horas (y todos los días a partir de entonces), el sobrenadante de cultivo se reemplaza por medio de cultivo nuevo que contiene el agente antimitótico citosina-p-D-arabinofuranosida (10 pM).

Después de la incubación durante la noche de kas TGN de rata a 37 °C con diluciones en serie de LC/E-BoNT/A, la 20 extensión de la escisión se monitoriza mediante SDS-PAGE seguida de inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo anti SNAP-25-anticuerpo capaz de unirse a intactos, así como productos truncados en A y truncados en E.

Como se muestra en la Fig. 6A, LC/E-BoNT/A da una escisión dependiente de la dosis de la SNAP-25 con 25 principalmente productos de escisión SNAP-25 truncados en /E.

Además, como se esperaba, los bloques de toxina compuestos de la liberación de CGRP por las TGN evocada por 60 mM KCl o capsaicina en una manera dependiente de la dosis (Fig. 6B). La liberación de CGRP dependiente de Ca2+ se estimula mediante tratamiento con 60 mM KCl en HBS (balanceado isotónicamente con NaCl). Para la 30 estimulación con capsaicina, se prepararon soluciones madre (1 mM) en etanol o dimetilsulfóxido, respectivamente, y se diluyeron en bR-HBS a las concentraciones requeridas. En todos los casos, la concentración final del vehículo se mantiene en 0,1 %; esto también se incluye en BR-HBS cuando se mide el eflujo basal.

Las células se estimularon con K+ o capsaicina y se monitorizó la liberación de CGRP durante 30 min. Para 35 determinar las cantidades de CGRP liberados, se añadió 0,1 ml de muestra a placas de 96 pocillos recubiertas con un anticuerpo monoclonal contra CGRP, y se realizó inmunoensayo enzimático siguiendo las instrucciones para el kit.

Los resultados muestran la capacidad del polipéptido LC/E-BoNT/A para inhibir la liberación de péptidos del dolor 40 desde grandes vesículas de núcleo denso, mientras que el tratamiento celular similar con BoNT/A no pudo inhibir la liberación de CGRP de la activación del canal de cationes TRPV1. Véase la Fig. 6B.

Ejemplo 7

45 La actividad antinociceptiva de LC/E-BoNT/A se evaluó en un modelo de rata de persistente dolor neuropático periférico, a saber, el ensayo de lesión nerviosa residual (SNI). Este modelo se basa en la observación de que prácticamente todo el dolor neuropático (excepto el caso especial del dolor del miembro fantasma, causado por una lesión completa por amputación) es el resultado de una lesión nerviosa parcial. Estos dolores neuropáticos incluyen neuropatía diabética, neuralgia posherpética, neuropatías tóxicas, neuropatías por compresión y traumatismo, y se 50 caracterizan por lancinante espontáneo, dolor ardiente y dolor tipo shock, así como hipersensibilidad al dolor que incluye alodinia táctil, hiperalgesia por pinchazo e hiperpatía.

La cirugía de SNI se realiza en ratas adultas anestesiadas (como por ejemplo ratas Spague-Dawley), e implica la ligadura y transección de dos de las tres ramas distales terminales del nervio ciático (los nervios tibiales y peroneos 55 comunes), que dejan la tercera rama (el nervio sural) intacta; véase Decosterd, I. & Woolf, C.J., 87 PAIN 580-587 (2000). Este modelo tiene la ventaja de ser técnicamente fácil de realizar y está sujeto a una variabilidad mínima en el grado de daño producido.

Las toxinas se inyectan en el lado plantar (palma) de la extremidad posterior distal. Las dosis máximas intraplantares 60 de LC/E-BoNT/A y BoNT/A (sin afectar la función locomotora) se encuentran entre 75 y 15 unidades/Kg de LD50 en

ratón, respectivamente. Las ratas con SNI muestran un comportamiento similar al dolor neuropático de larga duración en contraste con las ratas de control simulado (que están sujetas a la exposición del nervio ciático sin ninguna lesión).

5 Los dos modelos de dolor neuropático son pruebas de alodinia al frío y la alodinia mecánica. En la primera prueba, la de la hipersensibilidad al frío, la pata operada se pone en contacto con una placa fría a 4 °C, y la duración de la retirada de la pata se registra en varios momentos, como se indica en la Fig. 7A. Como una medida de la modulación de hipersensibilidad al frío, los valores postratamiento se expresan como un porcentaje de los valores de pretratamiento.

10

Como muestra la Fig. 7A, la hipersensibilidad al frío se reduce eficientemente por LC/E-BoNT/A durante 2 semanas después del tratamiento (P <0,001 en comparación con el tratado con solución salina), en particular para los primeros 10 días. El efecto antinociceptivo de LC/E-BoNT/A es significativamente mayor que el inducido por BoNT/A (P <0,05 a los 5 y 7 días después de la inyección). No se observa alodinia inducida por el frío en los controles 15 simulados, ya sea que se administre toxina o solución salina.

En la segunda prueba, la alodinia mecánica se mide colocando al animal en una rejilla de alambre elevado, y la estimulación de la superficie plantar de la pata tratada con un conjunto de filamentos von Frey para determinar la cantidad de estimulación sensorial que se puede tolerar antes de dolor (indicado por una rápida retirada de la pata). 20 Los filamentos Von Frey (o monofilamentos) están calibrados para proporcionar una escala aproximadamente logarítmica de la fuerza real y una escala lineal de intensidad percibida. El umbral mecánico se expresa como el 50 % del promedio de gramos mínimos de fuerza necesarios para provocar la retirada de la pata.

Como se muestra en la Fig. 7B, los umbrales mecánicos se reducen drásticamente por la lesión del nervio 25 (comparación de los controles simulados con las ratas SNI a las que solamente se dio solución salina). Es alentador que LC/E-BoNT/A comience a revertir esta hipersensibilidad mecánica dentro de los 2 días posteriores a la inyección, y se observa un efecto analgésico máximo a los 7 días después del tratamiento. Se registraron umbrales mecánicos significativamente más altos que las ratas tratadas con solución salina de 3 a 10 días después de la inyección (P<0,001 frente a la solución salina). Además, aunque el tratamiento con BoNT/A induce un aumento 30 modesto de los umbrales mecánicos posteriores a la lesión, se encuentra que LC/E-BoNT/A es significativamente más eficaz (P <0,05).

Ni la toxina ni la solución salina afectaron el comportamiento del dolor provocado por el frío y los estímulos mecánicos cuando se administraron a animales simulados (Fig. 7A, B). LC/ E-BoNT/A demostró ser mucho más 35 eficaz que BoNT/A para reducir la duración de la retirada del frío (Fig. 7A) y, especialmente, aumentar el umbral de retirada mecánica (Fig . 7B). Es importante destacar que la inyección de LC/E-BoNT/A en ratas con SNI normalizó la sensibilidad al frío y los estímulos mecánicos en los días 3 y 7 a valores similares a los de todos los controles simulados. En resumen, LC/E-BoNT/A induce potentes efectos antinociceptivos en modelos de rata de dolor neuropático crónico.

40

Ejemplo 8

El marco de lectura abierto de la neurotoxina sintética compuesta LC/E-BoNT/A y sus aminoácidos codificados (SEQ ID NO: 5 and 6, respectivamente) proporcionado a continuación contiene las siguientes regiones, respectivamente 45 (identificadas con respecto a los residuos de nucleótidos): residuos 1-1233, LC/E; residuos 1240-5130, BoNT/A. La secuencia de ADN que comprende los nucleótidos (1234-1239) se introduce como un engarce y asegura el marco de lectura apropiado. Las secuencias de aminoácidos alineadas se muestran por encima de los nucleótidos correspondientes. Se inserta una secuencia de reconocimiento de trombina proteasa en el bucle entre LC/A y HN/A; de manera similar, se modificó por ingeniería genética otro sitio de trombina para que tuviera una secuencia de 50 escisión en el sitio carboxi del gen BoNT/A; estos permiten el corte y eliminación simultáneos del His6 C-terminal (SEQ ID NO: 15).

La secuencia del gen compuesto de neurotoxina (LC / E-BoNT / A) y sus aminoácidos codificados (SEQ ID NO: 5 Y 6)

55 ___________________________________________________________________________

m p k : a ;; 3 x y n r p v >] n r t : t, y : r C- G C C:

1 ATGCCiAAAAiCAALIAGLICAACGAGAAG'GACCCCGl'GAAGGAGriGCACGAl'CCTCGAiA'GCAAGCCACCTGGATGTCA u0

F F Y K S F N T M "< lí " K T r ? F R N V T G " T P G “i Jil_______AGAA"TT"A7’?\AAT-::A""GAACATGA,7GAAAAATATTTGGATTAT-::G'7GGAAgi;r7'A-;;3-GRTCGG:::ACGAGGCCTCAAG 1 ft 3

Claims (19)

1. Una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye:

5

a) un dominio de unión,

b) un dominio de translocación, y

c) un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A, y

d) un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E;

10 en el que cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y de dicho segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo.

2. La composición de la reivindicación 1, donde dichos dominio de unión, dominio de translocación, primer dominio endopeptidasa y segundo dominio endopeptidasa están comprendidos en una sola cadena

15 polipeptídica.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, donde dicho polipéptido comprende además un sitio de escisión de endopeptidasa selectiva localizado entre una primera región que comprende dicho dominio de unión y dicho dominio de translocación, y una segunda región que comprende dichos primer dominio endopeptidasa y

20 segundo dominio endopeptidasa.

4. La composición de la reivindicación 1, donde dichos dominio de unión, dominio de translocación, primer dominio endopeptidasa y segundo dominio endopeptidasa están comprendidos en más de una cadena polipeptídica, preferentemente donde al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas están unidas mediante un

25 enlace disulfuro.

5. La composición de la reivindicación 1 comprende una primera cadena polipeptídica que comprende dicho dominio de unión y dicho dominio de translocación, y una segunda cadena polipeptídica que comprende dichos primer dominio endopeptidasa y segundo dominio endopeptidasa.

30

6. La composición de la reivindicación 4 comprende una primera cadena polipeptídica que comprende dicho dominio de unión y dicho dominio de translocación, y una segunda cadena polipeptídica que comprende dichos primer dominio endopeptidasa y segundo dominio endopeptidasa.

35 7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio de unión y el

dominio de translocación se derivan de la neurotoxina clostrídica BoNT/A.

8. La composición de la reivindicación 7 comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un primer sitio de escisión de proteasa localizado entre el dominio de translocación y el primer dominio

40 endopeptidasa.

9. La composición de la reivindicación 7 comprende además:

a) una secuencia de aminoácidos de polihistadina situada en el lado carboxilo terminal del dominio de unión, o en el extremo amino terminal de dicho segundo dominio endopeptidasa;

b) una primera secuencia de aminoácidos que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un primer sitio de escisión de proteasa localizado entre el dominio de translocación y el primer dominio endopeptidasa; y

c) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un segundo sitio de escisión de proteasa localizado entre dicho segundo dominio endopeptidasa y la secuencia de aminoácidos de la polihistadina, o entre dicho dominio de unión y la secuencia de aminoácidos de la polihistadina.

10. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho ácido nucleico una codificación de un único marco de lectura abierto, en la secuencia de

55 carboxi terminal a amino terminal: un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endoeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E, en el que cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y dicho segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo, opcionalmente en donde los codones que codifican cada uno del dominio de unión, el dominio de translocación, primer dominio endopeptidasa, y el segundo 60 dominio endopeptidasa, se optimizan para la expresión en un tipo de célula seleccionada de entre un grupo que

45

50

consiste en: una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula de levadura y una célula de insecto, preferentemente en donde los codones se eligen para la expresión mejorada en una célula bacteriana de E. coli.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 10, donde el dominio de unión, el dominio de translocación están 5 codificados por secuencias de ácido nucleico derivadas a partir de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A,

preferentemente en donde dicho marco de lectura abierto codifica al menos seis residuos de histadina entre la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de unión y el codón de terminación.

12. Una composición terapéutica que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo 10 dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye: un dominio de unión, un dominio de

translocación, un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E, donde cada uno de dicho primer dominio endopeptidasa y dicho segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo, para uso en el tratamiento del dolor crónico, preferentemente donde dicho dolor crónico se selecciona de entre el grupo que 15 consiste en dolor nociceptivo inflamatorio y dolor neuropático más preferentemente donde dicho dolor crónico es dolor neuropático, más preferentemente donde el dolor neuropático se selecciona entre el grupo formado por dolor por cáncer, dolor postoperatorio, dolor neuropático, alodinia, neuralgia posherpética, síndrome del colon irritable y otro dolor visceral, dolor óseo, neuropatía periférica, dolor relacionado con el sistema circulatorio, y dolor de cabeza.

20 13. Una composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho dolor

crónico es dolor nociceptivo inflamatorio o dolor artrítico.

14. Una composición terapéutica para su uso para el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 12, donde el dominio de unión y el dominio de translocación de dicha composición terapéutica se derivan de una

25 neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A.

15. Una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostrídica, comprendiendo dicho derivado de neurotoxina clostrídica un polipéptido que incluye:

30 un dominio de unión, un dominio de translocación, un primer dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/A y un segundo dominio endopeptidasa derivado de una neurotoxina clostrídica subtipo BoNT/E, en el que cada uno de dichos primer dominio endopeptidasa y dicho segundo dominio endopeptidasa es proteolíticamente activo, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor crónico.

imagen1

SC/DC

Anti-HiSc

V §8»

Anti-LC/E

Ant¡-BoNT/A

- • -

BoNT/E

BoNT/A

LC/E

Hn/E Hc/E

LC/A

hn/a Hc/A

í>n\\lC/I

FusiónX XLC/E a BoNT/A

LC/E - LC/A

Hn/A Hc/A

LC/E-BoNT/A

FG. 1

Inmunotransferencia tipo Western

Tenido con Coomassie

(kDa)

DTT

250 I

LC/E-LC/A y

HC/A

(no resueltas)

FG.

imagen2

00

rvj

ru

u

ro

en

imagen3

FIG. 2B

Conductividad (mS/cm—

imagen4

Liberación de CGR dep. de Ca2± e intacta

imagen5

imagen6

BoNT/A, 15 U/Kg LC/E-BoNT/A, 75 U/Kg

BoNT/A, 15 U/Kg LC/E-BoNT/A, 75 U/Kg

Prueba en placa fría

Lesión nerviosa residual

Solución salina

150

LU

100

cu +

**

Controles Sham

-A-Solucion salina

*** ns

0 f J---151 53——H—----------0---S—0—0-

LC/E-BoNT/A

Días después de la inyección

FG.

Prueba Von Frey

T ± Controles Sham

-^-Solución salina;-v-BoNT/A; ~k' 'S-S- I r/F-RoMT/A

L2.5--

LC/E-BoNT/A

QJ U)

LO.OiC^

— +

JD

5.0-

Lesion nerviosa residual

Solución salina

2.5-

Dias después de la inyección

FIG.

LC/B-BoNT/A

i-S-S-i

imagen7

Trombina Trombina

FIG. 8A

imagen8

FIG. 8B FIG. 8C

[pM] 5000 1000 200 40 Sintaxina 1—►

1.6 0.32 0

SNAP-25 - SNAP-25a-

VAMP2 —►

imagen9

imagen10

Log[LC/B+BoNT/A] (M)

O

O)

FIG. 8D

FIG. 8E

LC/D-BoNT/Cl: inactiva las tres proteínas SNARE

-S-Si

LC/D

DI

LC/Cl

hn/ci Hc/C1 H¡s6

\ A

\ Trombina

A

Trombina

Y

\

Escinde VAMP 1-3 Trunca sintaxina 1-3 y SNAP-25

FIG. 9

Fig. 10A

Fig. 10B

A Sensibilidad mecánica „ Sensibilidad al frío

imagen11

Lesión nerviosa residual:-*-solución salina, LC/E-BoNT/A (75 U/Kg), -#*■ pregabaiina (10 mg/Kg)

Los datos representan media ± ESM La pregabaiina se administró í.p. 4 horas antes se realizaron pruebas de comportamiento todos los dias *, **, *** P < 0,05; 0,01 y 0,001 frente a solución salina; t P < 0,05 frente a LC/E-BoNT/A; ns: no significativo frente a- Sham.

imagen12

Sensibilidad mecánica - Prueba Von Frey -

12,5

r

10.0

-Tñr Sham

solución salina

7.5

Lesión nerviosa residual

Solución salina

O)

5.0

Unica inyección

Dos inyecciones

2.5

Días después de la inyección

Los datos representan media ± ESM. Las líneas verticales de puntos indican el

tiempo de las inyecciones de tratamiento local. La administración de 75 U/Kg de

LC/E-BoNT/Ase repitió después de 10 días (grupo de "dos inyecciones").

FIG 11