ES2693705T3

ES2693705T3 - Neurotoxinas que muestran actividad biológica reducida

Info

Publication number: ES2693705T3
Application number: ES10726549.8T
Authority: ES
Inventors: Fred Hofmann; Jürgen Frevert
Original assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Current assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2018-12-13
Anticipated expiration: 2030-07-01
Also published as: EP2449101B1; CN102471765A; KR20120104140A; US9193771B2; US20120107362A1; JP2012531191A; RU2012103376A; KR20170016529A; IL216414A0; MX352265B; AU2010267963B2; CA2763692A1; WO2011000929A1; HK1171246A1; JP6059986B2; KR101818895B1; AU2010267963A1; JP2015231378A; BRPI1014253A2; IN2012DN00733A

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de una Neurotoxina Clostridial que muestra una duración reducida de parálisis muscular en un sujeto, en donde dicho polipéptido comprende al menos una señal de degradación en la cadena ligera, en donde dicha señal de degradación se selecciona del grupo que consiste en: a) al menos un motivo PEST introducido en la región interna o terminal; b) al menos un motivo de reconocimiento de la ligasa E3 introducido en la región interna o terminal; c) un resto de oligo-lisina N-terminal; d) una ubiquitina unida en la región N-terminal; e) una sustitución de la prolina N-terminal por un aminoácido básico; f) sustituciones de los restos de aminoácidos mostrados en la superficie por lisina; y g) una sustitución de la prolina N-terminal por un aminoácido básico en combinación con sustituciones de restos aminoácidos mostrados en la superficie por lisina; y en donde la duración de la parálisis muscular en el sujeto es menor en comparación con la del polipéptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar.

Description

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DESCRIPCION

Neurotoxinas que muestran actividad biologica reducida

La presente invencion se refiere al campo farmaceutico. Espedficamente, se contempla un polinucleotido que codifica un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial que muestra una duracion reducida del efecto biologico en un sujeto, en donde dicho polipeptido comprende al menos una senal de degradacion en la cadena ligera, asf como vectores y celulas hospedadoras que comprenden dicho polinucleotido, polipeptidos codificados en ellos y anticuerpos que se unen espedficamente a los polipeptidos. Por otra parte, la invencion se refiere a medicamentos que comprenden dichos polinucleotidos y polipeptidos, asf como aplicaciones terapeuticas espedficas de los mismos. Ademas, la presente invencion contempla metodos para la fabricacion de los polipeptidos y medicamentos.

Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir, las toxinas botulmicas (BoNTs) y las toxinas tetanicas (TeNT), respectivamente. Estas Neurotoxinas Clostridiales (CNTs) se unen espedficamente a celulas neuronales y liberan neurotransmisores alterados. Cada una de las toxinas se sintetizan como una protema inactiva sin procesar de cadena unica de 150 kDa aproximadamente. El proceso post- transduccional implica la formacion de puentes disulfuro, y una proteolisis limitada (detenida) por una proteolasa o proteolasas bacterianas. La Neurotoxina Activa consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa, y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unida mediante un puente disulfuro. Las CNTs consisten en tres dominios, es decir, la cadena ligera catalftica, la cadena pesada que incluye el dominio de translocacion (en la mitad N-terminal) y el dominio de union al receptor (en la mitad C-terminal), vease Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Las Neurotoxinas Botulfnicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la Protema de Neurotoxina de 150 kDa y protemas complejas asociadas no toxicas. Los tamanos del complejo difieren en base a la cepa Clostridial y a los serotipos de las Neurotoxinas diferentes que oscilan de 300 kDa a 900 kDa. Las protemas complejas en estos complejos estabilizan la Neurotoxina y la protegen frente la degradacion, vease Chen 1998, Infect Immun 66(6): 2420-2425.

El Clostridium botulinum secreta siete serotipos distintos antigenicamente designados de la A a la G en la neurotoxina botulfnica (BoNT). Todos los serotipos junto con la neurotoxina tetanica relacionada (TeNT) secretada por Clostridium tetani, son endoproteasas de Zn2+ que bloquean la exocitosis sinaptica mediante las protemas de fusion SNARE, vease Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Las CNTs causan la paralisis muscular flacida observada en el botulismo, vease Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

A pesar de sus efectos toxicos, las toxinas botulfnicas se han empleado como agentes terapeuticos para un gran numero de enfermedades o trastornos. El serotipo A de la toxina botulfnica se aprobo para su uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del estrabismo, el blefaroespasmo, y otros trastornos. Esta disponible comercialmente como un complejo proteico A de la toxina Botulfnica, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan Inc) o bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para aplicaciones terapeuticas, el complejo se inyecta directamente en el musculo a tratar. A pH fisiologico, la toxina se libera del complejo proteico y tiene lugar el efecto farmacologico deseado. Esta disponible una preparacion polipeptidica mejorada de Neurotoxina A libre del complejo bajo el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). El efecto de la toxina Botulfnica es solo temporal, que es la razon por la que se puede requerir la administracion repetida de la toxina Botulfnica para mantener un efecto terapeutico.

Las Neurotoxinas Clostridiales disminuyen la intensidad de los musculos voluntarios y son eficaces terapeuticos para el estrabismo, la distoma focal, incluyendo la distoma cervical, y el blefaroespasmo esencial benigno. Ademas han mostrado aliviar el espasmo hemifacial, y la espasticidad focal, y, por otra parte, ser eficaces en un amplio intervalo de otras indicaciones, tal como en trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y en cosmeticos para la correccion de arrugas, vease Jost 2007, Drugs 67, 669.

Sin embargo, las fuerzas y contracciones musculares reducidas tambien son deseables para afecciones medicas o enfermedades tales como la cicatrizacion de heridas, la inmovilizacion para el tratamiento de fracturas oseas y de tendones, inmovilizacion post quirurgica, espedficamente en relacion con hemorroidectoirna, la introduccion de implantes dentales, o el reemplazo de la articulacion de la cadera (endoprotesis), artroplastia de rodilla, cirugfa oftalmologica, acne, o la enfermedad del intestino irritable. Las Neurotoxinas normalmente muestran su efecto biologico a lo largo de un periodo de tiempo que es mayor al que se necesita realmente para el tratamiento eficaz de dichas enfermedades o afecciones. Sin embargo, una paralisis muscular prolongada es, perjudicial o al menos preferible en menor medida en la terapia de dichas afecciones medicas o enfermedades. Sin embargo, las neurotoxinas que muestran su efecto biologico solo a lo largo de un periodo de tiempo deseado aun no estan disponibles.

Por consiguiente, el problema tecnico subyacente de la presente invencion se puede ver como la provision de medios y metodos para cumplir con las necesidades anteriormente mencionadas. El problema tecnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y a continuacion en la presente memoria.

La presente invencion se refiere, por lo tanto, a un polinucleotido que codifica un polipeptido de la Neurotoxina

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Clostridial que muestra una menor duracion de la paralisis muscular en un sujeto, en donde dicho polipeptido comprende al menos una senal de degradacion en la cadena ligera, en donde dicha senal de degradacion se selecciona del grupo que consiste en:

a) al menos un motivo PEST introducido en la region interna o terminal;

b) al menos un motivo de reconocimiento de la ligasa E3 introducido en la region interna o terminal;

c) un resto de oligo-lisina N-terminal;

d) una ubiquitina unida en la region N-terminal;

e) una sustitucion de la prolina N-terminal por un aminoacido basico;

f) sustituciones de los restos de aminoacidos mostrados en la superficie por lisina; y

g) una sustitucion de la prolina N-terminal por un aminoacido basico en combinacion con sustituciones de

restos aminoacidos mostrados en la superficie por lisinas;

y en donde la duracion de la paralisis muscular en los sujetos es menor en comparacion con la del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar.

El termino “polinucleotido” como se emplea en la presente memoria, se refiere a moleculas de ADN de cadena sencilla o doble, asf como a moleculas de ARN. Dicho termino abarca el ADN genomico, ADNc, ARNhn, ARNm, asf como los derivados de tales especies moleculares que aparecen de manera natural o modificados artificialmente. El polinucleotido en un aspecto puede ser una molecula lineal o circular. Por otra parte, ademas de las secuencias de acido nucleico que codifican el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial anteriormente mencionado, un polipeptido de la presente invencion puede comprender secuencias adicionales requeridas para la transcripcion y/o traduccion adecuada, tal como secuencias 5' o 3'UTR. El polinucleotido de la presente invencion codifica un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial modificada derivable de uno de los serotipos diferentes antigenicamente de las Neurotoxinas Botulmicas, es decir, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, o de la Neurotoxina del Tetano (TeNT). En otro aspecto, dicho polinucleotido es una variante de los polinucleotidos anteriormente mencionados que comprenden una o mas sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleotidos que aun en otro aspecto pueden dar como resultado un aminoacido codificado que tiene una o mas sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoacidos. El termino “identico” como se emplea en la presente memoria se refiere a secuencias identicas caracterizadas por determinar el numero de nucleotidos o aminoacidos identicos entre dos secuencias de acido nucleico o dos secuencias de aminoacidos, en donde las secuencias se alinean para que se obtenga el mayor nivel de coincidencia. Esto se puede calcular empleando tecnicas publicadas o metodos codificados en programas informaticos, tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores del porcentaje de identidad se calculan, en un aspecto, sobre la secuencia de aminoacidos completa. Esta disponible para el trabajador experto una serie de programas basados en una variedad de algoritmos para comparar las diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman proporcionan particularmente resultados fiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencias, se puede emplear el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que son parte del paquete informatico GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison Wisconsin, EE.Uu. 53711). Los valores de identidad de secuencia en porcentaje (%) enunciados anteriormente se determinan, en otro aspecto de la invencion, empleando el programa GAP sobre la region de secuencia completa con los siguientes ajustes: Peso Gap: 50, Peso Fuerza: 3, Media de Coincidencia: 10.000 y Media de incompatibilidad: 0,000, que, a menos que se especifique de otra manera, se usaran siempre como ajustes estandar para los alineamientos de secuencias.

En otro aspecto, cada una de las variantes de polinucleotidos anteriormente mencionados codifican un polipeptido que retiene una o mas propiedades biologicas y, en otro aspecto, todas las propiedades biologicas del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial respectiva, es decir, Neurotoxina BoNT/A, BoNt/b, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, o Neurotoxina del Tetano (TeNT). Los expertos en la tecnica apreciaran que la actividad biologica completa se mantiene solo despues de la activacion proteolttica, aunque es concebible que el precursor sin procesar pueda ejercer algunas funciones biologicas o ser activo parcialmente. “Propiedades biologicas” como se emplea en la presente memoria se refiere a (a) la union, (b) internalizacion, (c) translocacion del receptor a traves de la membrana endosomal en el citosol, y/o (d) la separacion endoproteolftica de las protemas implicadas en la fusion de la membrana vesicular sinaptica. Ensayos in vivo para ensayar la actividad biologica incluye el ensayo LD50 de raton y el ensayo del hemidiafragma de raton ex vivo como se describe por Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128:69-77) y Dressler et al. (Dressler 2005, Mov Disord 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139:629-637). La actividad biologica se expresa comunmente en Unidades de Raton (MU). Como se emplea en la presente memoria, 1 MU es la cantidad de componente neurotoxico, que mata el 50% de una poblacion de raton espedfica despues de la inyeccion intraperitoneal, es decir, la LD50 i.p. de raton. En otro aspecto, las variantes de polinucleotidos pueden codificar Neurotoxinas Clostridiales que tienen propiedades biologicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de separacion que se mejoran para el reconocimiento enzimatico o se pueden mejorar para el reconocimiento o se pueden mejorar para la union al receptor o cualquier otra

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propiedad especificada anteriormente. Por otra parte, en un aspecto se engloban ademas polipeptidos de fusion que comprenden peptidos o etiquetas marcadoras detectables. En un aspecto, etiquetas adecuadas son las etiquetas FLAG, Etiquetas-Myc o etiquetas-His que tambien permiten una purificacion mas eficaz de los polipeptidos marcados. Peptidos marcadores detectables incluyen, en un aspecto, protemas fluorescentes, tales como GFP, BFP y similares. En otro aspecto, las variantes de polipeptidos deben codificar polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial de fusion que comprenden una parte de al menos dos polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial de diferentes serotipos, por ejemplo, una fusion de la Neurotoxina Clostridial que comprende una cadena pesada de BoNT/A y una cadena ligera de BoNT/E.

El polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de la invencion comprende ademas al menos una senal de degradacion en su cadena ligera. En un aspecto de la invencion, dicha cadena ligera del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificada por el polinucleotido de la invencion, se obtiene mediante modificacion a partir de una cadena ligera que se codifica por un polinucleotido que comprende secuencias de acido nucleico espedficas o variantes de las mismas descritas en la presente memoria. Las cadenas ligeras de los polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial se generan mediante separacion proteolftica de un polipeptido precursor (polipeptido de cadena unica). La cadena ligera es la porcion N-terminal del polipeptido precursor que se obtiene como resultado de la separacion proteolftica. Las secuencias de aminoacido de las cadenas ligeras de los polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial referidos anteriormente se pueden deducir, en un aspecto, a partir de los sitios de separacion indicados en la siguiente tabla.

Neurotoxina (Cepa Bacteriana): Numero de acceso Sitio de separacion Secuencia (marcada) que incluye los sitios de separacion

BoNT/A (Hall/62A): ABD 65472 K428/T429 K448/A449 KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN....DLC IKV

BoNT/B (Okra): BAE 48264 K441/A442 IQMCKSVKAPG.......................IC IDV

BoNT/C1 (C-6814): BAA 89713 R444/S445 K449/T450 TKFCHKAIDGRSL. . . . YNKEL......DCRE LLV

BoNT/D: BAA 90661 K442/N443 R445/D446 TKVCLRLTK..........NSRD.......DS TC IKV

oNT/E (Beluga): CAA 43999 K419/G420 R422/K423 IRFCKNIVSVKG......IRK..........SIC IEI

BoNT/F (NCTC10 281): CAA 73972 R435/K436 K439/A440 VKFCKS VIPRKG......TKAP.......PRLC :rv

BoNT/G: CAA 52275 IAMCKPVMYKNT......GKS.........EQC 1 i V

TeNT: P 04958 R449 (R455) IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC IKI

El termino “senal de degradacion” como se emplea en la presente memoria, se refiere a modificaciones de la cadena ligera del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial que dan como resultado una mayor degradacion del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial mediante medios de degradacion endogena presentes en un organismo en el que se ha aplicado la Neurotoxina Clostridial. En un aspecto, el medio de degradacion sera un medio de degradacion proteosomal o un medio de degradacion lisosomal. En otro aspecto, el medio de degradacion puede dar como resultado simplemente una degradacion parcial del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial, por ejemplo, mediante una o mas etapas de separacion proteolftica. Dicha senal de degradacion se puede introducir en la cadena ligera (es decir, localizarse (internamente) dentro de la cadena ligera) o unirse a ella bien en el extremo N- o en el extremo C-. El experto en la tecnica esta bien informado de las senales de degradacion adecuadas y de como introducirlas o unirlas a la cadena ligera del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial. Por otra parte, el artesano experto puede generar polinucleotidos que codifican tales polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial con al menos una senal de

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E3 ubiquitina Ligasa: Motivo de reconocimiento (consenso)

VBCCul2: ALAPYIP

MNM2: RFMDYWEGL

: FXXXL WXXL

Smurf2: ELESPPPPYSRYPM

RN181: KVGFFKR

AlfaE3: LLVRGRTLVV

SCF: DRHDSGLDSM

Siah: PXAXVXP

Itch: PPXYXXM

Nedd4-2: PPXY

degradacion aplicando tecnicas biologicas moleculares recombinantes o modificaciones quimicas. Por ejemplo, se puede usar la mutagenesis dirigida al sitio para introducir las senales de degradaciOn referidas a continuaciOn. Alternativamente, se puede disenar una secuencia de acido nucleico para el polinucleotido que comprende las secuencias codificantes para el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial, y la senal de degradaciOn prevista y el polinucleOtido completo se pueden sintetizar despues qufmicamente.

En un aspecto, dicha senal de degradaciOn se selecciona del grupo que consiste en:

a) al menos un motivo PEST introducido en la regiOn interna o terminal,

b) al menos un motivo de reconocimiento de la ligasa E3 introducido en la regiOn interna o terminal,

c) un resto de oligo-lisina N-terminal,

d) una ubiquitina unida en la regiOn N-terminal,

e) una sustituciOn de la prolina N-terminal por un aminoacido basico,

f) sustituciones de los restos de aminoacidos mostrados en la superficie por lisina, y

restos aminoacidos mostrados en la superficie por lisinas.

En un aspecto, el motivo de reconocimiento E3 ligasa tiene una secuencia de consenso como se muestra en la siguiente tabla (en donde “X” puede representar cualquier aminoacido que aparezca de manera natural):

Los motivos PEST son bien conocidos en la tecnica como senales de degradaciOn (Rogers 1986, Science 234:364368, Rechsteiner 1996, TIBS 21:267-271, Belizario 2008, Science 9:210-220). En un aspecto, el motivo PEST tiene 20 una secuencia como se describe en Rechsteiner 1996, TIBS 21:267-271, Tabla 1 (incorporada en la presente memoria mediante referencia), para cualquiera de las protefnas siguientes: GCN4, kBa, Fos, Ornitina descarboxilasa, Cactus, CLN2, ClN3 o NIMA.

El polipeptido de la Neurotoxina Clostridial modificado codificado por el polinucleOtido de la presente invenciOn mostrara una menor duraciOn del efecto biolOgico en un sujeto tras la administraciOn en comparaciOn con un 25 polipeptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar. En un aspecto, dicho efecto biolOgico observado en el sujeto causa paralisis muscular, es decir, una activaciOn (reversible) de la capacidad muscular a contraerse. En un aspecto, los efectos se pueden ensayar mediante el denominado ensayo corriente de ratOn (Keller 2006, Neuroscience 139:629-637). Los efectos biolOgicos se pueden determinar por el experto en la tecnica sin mas preambulos. Una duraciOn reducida del efecto biolOgico se refiere, en un aspecto, a una duraciOn reducida estadfsticamente. Se 30 puede determinar por los expertos en la tecnica si la duraciOn de un efecto se reduce de manera significativa estadfsticamente mediante la aplicaciOn de ensayos estadfsticos estandar, por ejemplo, la determinaciOn de intervalos de confianza, la de terminaciOn del p-valor, el ensayo t de Student, el ensayo de Mann-Whitney, etc. Intervalos de confianza preferidos son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. El p-valor es, preferiblemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, O 0,0001. Preferiblemente, la probabilidad prevista por la 35 presente invenciOn permite que el diagnOstico sea el correcto para al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de los sujetos de un grupo o poblaciOn dada. En un aspecto, dicha duraciOn reducida persiste menos

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de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 30% o menos de 20% de la duracion normal, es dedr, la duracion observada para un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar. En un aspecto, la duracion normal persiste durante aproximadamente 4 meses en el caso de BoNT/A, 2 meses en el caso de BoNT/B, aproximadamente 3 a 4 meses en el caso de BoNT/C o aproximadamente 4 semanas en el caso de BoNT/E (Foran, J Biol. Chem. 278(2):1363-1371, Eleopra 1998, Neurosci Lett. 13, 256(3):135-138, Eleopra 1997 Neurosci Lett. 14,224(2):91-94, Sloop 1997, Neurology 49(1):189- 194. Washbourne 1998, J Physiol Paris 92(2):135-139). Se entiende que la duracion del efecto depende de las influencias individuales en un sujeto, tal como los antecedentes geneticos, la edad, el estilo de vida, etc. Por lo tanto, una duracion adecuada como significa en la presente memoria se refiere a una duracion como la que se indica anteriormente para los respectivos polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial (por ejemplo, 4 meses para BoNT/A o 4 semanas para BoNT/E) con una desviacion estandar de 25%, o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos o 5% o menos.

De una manera ventajosa, se ha encontrado de acuerdo con la presente invencion que un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial se puede modifiicar para mostrar un efecto biologico reducido en un sujeto tras la administracion. En principio, esto se puede conseguir introduciendo o uniendo una senal de degradacion a la cadena ligera de dicho polipeptido de la Neurotoxina Clostridial ya que se descubrio que la persistencia de la cadena ligera se correlaciona con la duracion del efecto biologico. La duracion reducida del efecto biologico provocado por los polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial es beneficiosa para varias aplicaciones medicas que requieren una inactivacion de las acciones nerviosas, por ejemplo, paralisis muscular para facilitar la cicatrizacion de heridas.

La presente invencion contempla un vector que comprende el polinucleotido de la presente invencion.

El termino “vector”, preferiblemente, engloba a fagos, plasmidos, vectores virales o retrovirales, asf como cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos o de levaduras. Por otra parte, el termino tambien se refiere a construcciones dirigidas que permiten la integracion aleatoria o dirigida al sitio del constructo diana en el ADN genomico. Tales construcciones diana comprenden, preferiblemente, ADN de una longitud suficiente para bien una recombinacion homologa o bien heterologa como se describe en detalle a continuacion. El vector que engloba los polinucleotidos de la presente invencion, en un aspecto, comprende ademas marcadores seleccionables para la propagacion y/o seleccion en un hospedador. El vector se puede incorporar en una celula hospedadora mediante varias tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede introducir un vector plasmfdico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato calcico o un precipitado de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lfpido cargado o en grupos basados en carbono, tal como fullereno. Alternativamente, se puede introducir un vector plasmfdico mediante choque termico o tecnicas de electroporacion. Si el vector es un virus, se puede empaquetar in vitro empleando una lmea celular de empaquetamiento adecuada antes de su aplicacion a las celulas hospedadoras. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en replicacion o defectuosos de replicacion. En el ultimo caso, la propagacion viral ocurrira generalmente solo para complementar hospedadores/celulas. Por otra parte, en un aspecto de la invencion, el polinucleotido se une operativamente a secuencias de control de expresion que permiten la expresion en celulas hospedadoras procariotas o eucariotas o en fracciones aisladas de las mismas en dicho vector. La expresion del polinucleotido comprende la transcripcion del polinucleotido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresion en las celulas hospedadoras son bien conocidos en la tecnica. En un aspecto, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripcion y/o las senales poli-A que aseguran la terminacion de la transcripcion y la estabilizacion del transcrito. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales, asf como transduccionales. Posibles elementos reguladores que permiten la expresion en celulas hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac-, trp-, o tac- en E. coli, y ejemplos para elementos reguladores que permiten la expresion en celulas hospedadoras eucariotas son el promotor AOX1- o el GAL1- en levaduras o el promotor CMV-, SV40-, RSV- (virus del sarcoma de Rous), el potenciador-CMV, el potenciador SV40- o un intron de globina en mairnferos y otras celulas animales. Por otra parte, se pueden emplear secuencias de control de la expresion inducible en un vector de expresion englobado por la presente invencion. Tales vectores inducibles pueden comprender secuencias operadoras tet o lac o secuencias inducibles por choque termico u otros factores medioambientales. Secuencias de control de expresion adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Junto a los elementos que son responsables de la iniciacion de la transcripcion tales elementos reguladores pueden comprender senales de terminacion de la transcripcion, tal como el sitio poli-a-SV40 o el sitio poli-A-tk, mas adelante del polinucleotido. En este contexto, son bien conocidos en la tecnica vectores de expresion adecuados, tal como el vector de expresion pcDV1 ADNc Okayama-Berg (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pcDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORT1 (Invitrogen). Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresion y un gen de transferencia o vector diana. Para la administracion de los polinucleotidos o del vector de la invencion en poblaciones celulares diana se pueden emplear vectores de expresion derivados de virus, tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes, o virus del papiloma bovino. Para construir vectores virales recombinantes se pueden emplear metodos que son bien conocidos por los expertos en la tecnica; vease, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).

Por otra parte, la presente invencion se refiere a una celula hospedadora que comprende el polinucleotido o el vector de la presente invencion.

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El termino “celula hospedadora” como se emplea en la presente memoria engloba a celulas hospedadoras procariotas y eucariotas. En un aspecto la celula hospedadora es una celula bacteriana. En un aspecto, dicha celula hospedadora bacteriana es una celula hospedadora de E. coli. En otro aspecto, es una celula hospedadora de Clostridium. En otro aspecto, dicha celula hospedadora de Clostridium es una celula hospedadora de Clostridium botulinum, incluso en otro aspecto, es una celula de uno de los siete serotipos de Clostridium botulinum anteriormente mencionados. En otro aspecto, la celula hospedadora bacteriana es una celula hospedadora de Clostridium tetani. En otro aspecto, la celula hospedadora es una celula hospedadora de Bacillus y en un aspecto particular una celula hospedadora de Bacillus megaterium. En un aspecto, una celula hospedadora eucariota, es una celula de una lmea celular animal adecuada para la produccion de protemas toxicas o una celula hospedadora fungica, tal como una celula hospedadora de levadura.

Tambien esta englobado por la presente invencion un polipeptido codificado por el polinucleotido de la invencion.

El termino “polipeptido” como se emplea en la presente memoria abarca polipeptidos aislados o esencialmente purificados que estan esencialmente libres de otros polipeptidos que incluyen las protemas complejantes (HA70, HA17, HA33, o NTNH (NBP) de las preparaciones de la celula hospedadora o del polipeptido que comprenden otras protemas adicionales. Por otra parte, el termino incluye polipeptidos modificados qmmicamente. Tales modificaciones pueden ser modificaciones artificiales o modificaciones que ocurren de manera natural. Como se refiere anteriormente, el polipeptido de la presente invencion tendra las propiedades biologicas de los polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial referidos anteriormente. Por otra parte, mostrara una duracion reducida del efecto biologico en un sujeto tras la administracion. El polipeptido de la invencion, en un aspecto, se puede producir mediante un metodo de fabricacion de un polipeptido como se describe en mas detalle en otro lugar en la presente memoria. En un aspecto de la invencion, se contempla tambien una preparacion polipeptfdica que comprende un complejo del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial y sus protemas complejantes.

Por otra parte, la presente invencion se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido de la presente invencion.

Se pueden preparar anticuerpos contra el polipeptido de la invencion mediante metodos bien conocidos empleando como antigeno un polipeptido purificado segun la invencion o un fragmento adecuado derivado del mismo. Se puede identificar un fragmento que es adecuado como antfgeno mediante antigenicidad que determina algoritmos bien conocidos en la tecnica. Tales fragmentos se pueden obtener a partir del polipeptido de la invencion mediante digestion proteolftica o puede ser un peptido sintetico. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena unica, un anticuerpo humano o humanizado o primatizado, quimerizado o fragmento del mismo. Tambien se comprenden como anticuerpos de la presente invencion un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo sintetico, un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, Fv o scFv, etc., o un derivado de cualquiera de estos modificado qmmicamente. El anticuerpo de la presente invencion se unira espedficamente (es decir, no reaccionara con otros polipeptidos o peptidos) al polipeptido de la invencion. Espedficamente, el anticuerpo no reaccionara con el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar. La union espedfica se puede ensayar mediante varias tecnicas bien conocidas. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden obtener empleando metodos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante las tecnicas que se describen originalmente por Kohler et al. (Kohler 1975, Nature 256 (l975), 495) o Galfre. (Galfre 1981, Meth. Enzymol. 73 (1981)) que comprende la fusion de celulas de mieloma de raton a celulas esplenicas derivadas de mamfferos que se han inmunizado por el antfgeno, es decir, el polipeptido de la invencion o un fragmento inmunogenico del mismo. Los anticuerpos se pueden emplear, por ejemplo, para la inmunoprecipitacion e inmunolocalizacion de los polipeptidos de la invencion, asf como para el control de la presencia de dichos polipeptidos, por ejemplo, en organismos recombinantes, y para la identificacion de compuestos que interaccionan con las protemas segun la invencion. Por ejemplo, se puede emplear la resonancia plasmonica de superficie como se emplea en el sistema BIAcore para incrementar la eficacia de los anticuerpos fagos que se unen a un epttopo de la protema de la invencion (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97105; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183, 7-13).

El polinucleotido o polipeptido de la invencion, en general, se pueden emplear como un medicamento.

El termino “medicamento” como se emplea en la presente memoria se refiere, en un aspecto, a una composicion farmaceutica que contiene el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial activa biologicamente o un polinucleotido que lo codifica como un compuesto activo farmaceutico. Dicho medicamento se puede emplear para la terapia humana o animal de varias enfermedades o trastornos en una dosis eficaz terapeuticamente. El medicamento se puede formular mediante varias tecnicas que dependen de los propositos de la aplicacion deseada. A continuacion, en la presente memoria se especifican diferentes aspectos de un medicamento segun la presente invencion.

En un aspecto, el medicamento comprende el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial activo biologicamente de la presente invencion uno o mas veldculos aceptables farmaceuticamente como una composicion farmaceutica. El vehmulo o veldculos aceptables farmaceuticamente deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudiciales para el destinatario de los mismos. El vedculo farmaceutico empleado puede incluir un solido, un gel, o un lfquido. Ejemplos de vedculos solidos son lactosa,

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arcilla blanca, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, acido estearico, y similares. Ejemplos de vehmulos lfquidos son glicerol, la disolucion salina tamponada de fosfato, agua, emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, y similares. Los vehmulos adecuados comprenden aquellos mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. Se entendera que un vehmulo podra ser tambien un virus o retrovirus adecuado para terapia genica, en particular, si el ingrediente activo del medicamento es el polinucleotido de la invencion.

El medicamento, en un aspecto, se disolvera en un diluyente antes de la administracion. El diluyente se selecciona tambien para que no afecte la actividad biologica de la combinacion. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada y el suero fisiologico. Ademas, la composicion o formulacion farmaceutica puede incluir tambien otros vehmulos o estabilizantes no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenicos, y similares. Por tanto, el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial de la invencion se puede presentar, en un aspecto, en forma lfquida o liofilizada. En un aspecto, puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes proteicos (HSA) o estabilizantes no proteicos, tales como polivinilpirrolidona (PVP), acido hialuronico o aminoacidos libres. En un aspecto, estabilizantes no proteicos adecuados se describen en WO 2005/007185 o WO 2006/020208.

En otro aspecto, el medicamento se proporcionara como una disolucion que comprende el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial. Por otra parte, la disolucion puede comprender vehmulos o estabilizantes, asf como los anteriormente mencionados. Se puede proporcionar una formulacion lfquida estable del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial como se describe, en un aspecto, por la Patente US 7.211.261.

La composicion farmaceutica se administra, en un aspecto, de forma topica. De manera convencional el medicamento se administrara intra-muscular o subcutaneamente (cerca de glandulas) dependiendo de la indicacion medica deseada. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y del modo de accion de la composicion farmaceutica se puede administrar tambien por otras vfas.

La dosis eficaz terapeuticamente se refiere a una cantidad de polipeptido o polinucleotido de la Neurotoxina Clostridial de la invencion que previene, mejora o trata los smtomas que acompanan una afeccion o enfermedad referida en esta memoria. La eficacia terapeutica y la toxicidad del compuesto se pueden determinar en cultivos celulares o animales experimentales mediante procedimientos farmaceuticos estandar, por ejemplo ED50 (la dosis eficaz terapeuticamente para el 50% de la poblacion) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion). La tasa de dosis entre los efectos terapeuticos y los toxicos es el mdice terapeutico, y se puede expresar como el mdice, LD50/ED50. El medicamento de la presente invencion comprendera, en un aspecto, las recomendaciones de dosificacion en las instrucciones de los prescriptores o de los consumidores para anticiparse a los ajustes de la dosificacion dependiendo del destinatario individual.

El medicamento referido en la presente memoria esta desarrollado para administrarse al menos una vez para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o condicion enumerada en esta memoria. Sin embargo, dicho medicamento se puede administrar mas de una vez.

El medicamento segun la presente invencion, en otro aspecto de la invencion, puede comprender ademas del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial activo farmacologicamente, farmacos que se anaden a la composicion durante su formulacion.

Por otra parte, la presente invencion se refiere al uso del polinucleotido o del polipeptido de la presente invencion para la preparacion de un medicamento para la cicatrizacion de heridas, la inmovilizacion para el tratamiento de fracturas oseas y de tendones, inmovilizacion post quirurgica, espedficamente en relacion con hemorroidectoirna, la introduccion de implantes dentales, o el reemplazo de la articulacion de la cadera (endoprotesis), artroplastia de rodilla, cirugfa oftalmologica, acne, o la enfermedad del intestino irritable.

Los smtomas asociados con las enfermedades o afecciones medicas anteriormente mencionadas son bien conocidas por el experto en la tecnica y se describen en manuales de texto de medicina convencionales, tales como Stedman o Pschyrembl.

Por otra parte, la presente invencion se refiere tambien al uso del polinucleotido o del polipeptido de la presente invencion para la preparacion de un medicamento diagnostico para determinar si un sujeto es susceptible para una terapia con Neurotoxina Clostridial.

El medicamento diagnostico referido anteriormente es un medicamento del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial como se refiere anteriormente. Sin embargo, el medicamento se aplica durante un tiempo y a un regimen de dosificacion que permite solamente la determinacion de si un sujeto apenas responde al polipeptido de la Neurotoxina Clostridial o la determinacion de un regimen de dosificacion adecuada. Ya que el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial anterior - aunque tiene tambien potencial terapeutico - se usa esencialmente para un proposito de diagnostico, y no para tratar o mejorar en este aspecto, el medicamento que comprende esto se denomina “medicamento diagnostico”. Por tanto, dicho tiempo restringido pre-control con los polipeptidos de la Neurotoxina Clostridial modificada de la presente invencion ayudara a seleccionar los sujetos susceptibles para una terapia que emplea una Neurotoxina Clostridial sin modificar, asf como para determinar una dosificacion adecuada.

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Los efectos adversos potenciales de una terapia basada en una Neurotoxina Clostridial sin modificar, que normalmente persistira a lo largo del tiempo, se pueden reducir debido a la reducida duracion del efecto biologico provocado mediante el polipeptido de la Neuroxina Clostridial modificado de la invencion.

La presente invencion abarca un metodo para la fabricacion de un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de la invencion que comprende las etapas de:

a) cultivar la celula hospedadora de la invencion bajo condiciones que permiten la expresion del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de la invencion, y

b) obtener el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de la invencion a partir del cultivo de la celula hospedadora de a).

El polipeptido se puede obtener, en un aspecto, a partir del cultivo mediante tecnicas de purificacion convencionales que incluyen la cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa ffquida de alta eficacia (HPLC), y tecnicas de precipitacion que incluyen la precipitacion de anticuerpo. Por otra parte, en un aspecto el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial obtenido mediante el metodo de la invencion, puede ser libre de protemas complejantes. En otro aspecto, el polipeptido de la Neurotoxina se puede obtener como un complejo que comprende protemas complejantes ademas del polipeptido de la Neurotoxina. Por otra parte, en un aspecto, la obtencion como se emplea en la presente memoria incluye la activacion del polipeptido de la Neurotoxina. Esto se puede conseguir mediante separacion proteofftica del precursor del polipeptido de la Neurotoxina (cadena unica) bien dentro de la celula mediante una proteasa endogena o exogena (por ejemplo, expresados recombinantes) o fuera de la celula poniendo en contacto el polipeptido de la Neurotoxina con la proteasa, por ejemplo, antes, durante o despues de la purificacion anteriormente mencionada, bajo condiciones que permiten la separacion.

Ademas, se contempla un metodo para la fabricacion de un medicamento de acuerdo con la presente invencion, dicho metodo comprende las etapas del metodo de la invencion anteriormente mencionado y la etapa adicional de formular el polipeptido de la Neurotoxina codificado por el polinucleotido de la invencion como un medicamento.

Se entendera que tal metodo para la fabricacion de un medicamento se lleva a cabo segun las BPF estandar para medicamentos para asegurar la calidad, seguridad farmaceutica, y eficacia del medicamento.

En otro lugar en esta memoria se describen formulaciones adecuadas del medicamento. Sin embargo, el experto en la tecnica esta informado de como se pueden realizar tales formulaciones.

Se describe un metodo para la fabricacion de una composicion cosmetica que comprende las etapas del metodo de la invencion y la etapa adicional de la formulacion del polipeptido de la Neurotoxina como una composicion cosmetica.

La “Composicion cosmetica” como se emplea en la presente memoria se puede formular como se describe para una composicion farmaceutica anterior. Asimismo, para una composicion cosmetica, se contempla que el compuesto se use en un aspecto en forma pura sustancialmente. Sin embargo, las impurezas pueden ser menos cnticas que para un medicamento. En otro aspecto, las composiciones cosmeticas se aplican por via intramuscular. En otro aspecto, las composiciones cosmeticas que comprenden la Neurotoxina se pueden formular como un agente antiarrugas.

Se describe una composicion cosmetica y el uso del polinucleotido o del polipeptido de la presente invencion para la preparacion de una composicion cosmetica para usar como un agente antiarrugas.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un polinucleotido que codifica un polipeptido de una Neurotoxina Clostridial que muestra una duracion reducida de paralisis muscular en un sujeto, en donde dicho polipeptido comprende al menos una senal de degradacion en la cadena ligera, en donde dicha senal de degradacion se selecciona del grupo que consiste en:

a) al menos un motivo PEST introducido en la region interna o terminal;

b) al menos un motivo de reconocimiento de la ligasa E3 introducido en la region interna o terminal;

c) un resto de oligo-lisina N-terminal;

d) una ubiquitina unida en la region N-terminal;

e) una sustitucion de la prolina N-terminal por un aminoacido basico;

f) sustituciones de los restos de aminoacidos mostrados en la superficie por lisina; y

g) una sustitucion de la prolina N-terminal por un aminoacido basico en combinacion con sustituciones de restos aminoacidos mostrados en la superficie por lisina; y en donde la duracion de la paralisis muscular en el sujeto es menor en comparacion con la del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial sin modificar.
2. El polinucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicha duracion reducida persiste menos de 4, 3, o 2 semanas.
3. El polinucleotido de la reivindicacion 1 o 2, en donde dicha cadena ligera del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial se obtiene mediante la modificacion de una cadena ligera codificada por un polinucleotido que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica cualquiera de las Neurotoxinas Botulmicas BoNt/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, y de Neurotoxina del Tetano (TeNT).
4. Un vector que comprende el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una celula hospedadora que comprende el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de la reivindicacion 4.
6. La celula hospedadora de la reivindicacion 5, en donde dicha celula es una celula E. coli, Clostridium, o Bacillus.
7. Un polipeptido codificado por el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. Un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido de la reivindicacion 7.
9. Un polinucleotido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como un medicamento.
10. Un polipeptido segun la reivindicacion 7 para el uso como un medicamento.
11. El uso de un polinucleotido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el polipeptido de la

reivindicacion 7 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la cicatrizacion de heridas, la inmovilizacion para el tratamiento de fracturas oseas y de tendones, inmovilizacion post quirurgica, espedficamente en relacion con hemorroidectoirna, la introduccion de implantes dentales, o el reemplazo de la articulacion de la cadera, artroplastia de rodilla, cirugfa oftalmologica, acne, o la enfermedad del intestino irritable.
12. Un metodo para la fabricacion de un polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de:

a) cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 5 bajo condiciones que permitan la expresion del polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y

b) obtener el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a partir del cultivo de la celula hospedadora de a).
13. El metodo segun la reivindicacion 12 que comprende ademas la etapa de formular como un medicamento el polipeptido de la Neurotoxina Clostridial codificado por el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.