MX2011013014A - Neurotoxinas que exhiben actividad biologica acortada. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo farmacéutico. Específicamente, contempla un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neurotoxina que exhibe una duración reducida del efecto biológico en un sujeto, en donde el polipéptido comprende al menos una señal de degradación en la cadena ligera, así como también vectores y células hospederas que comprenden el polinucleótido, polipéptidos codificados de esta forma y anticuerpos específicamente enlazados a los polipéptidos. Sin embargo, la invención se refiere a medicamentos que comprenden los polinucleátidos y polipéptidos, así como también aplicaciones terapéuticas específicas de los mismos. Además, la presente invención contempla métodos para la manufactura de los polipéptidos y medicamentos.

Description

NEUROTOXINAS QUE EXHIBEN ACTIVIDAD BIOLOGICA ACORTADA Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo farmacéutico. Específicamente, contempla un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neurotoxina, que exhibe una duración reducida del efecto biológico en un sujeto, en donde el polipéptido comprende al menos una señal de degradación en la cadena ligera así como también vectores y células hospederas que comprende el polinucleótido, polipéptidos codificados de esta forma y anticuerpos específicamente enlazados a los polipéptidos. Sin embargo, la invención se refiere a medicamentos que comprenden los polinucleótidos y polipéptidos así como también aplicaciones terapéuticas específicas de los mismos. Además, la presente invención contempla métodos para la manufactura de los polipéptidos y medicamentos .

Antecedentes de la Invención Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir toxinas botulínicas (BoNTs) y toxinas tetánicas (TeNT) , respectivamente. Estas Neurotoxinas Clostridiales (CNTs) específicamente se enlazan a células neuronales e interrumpen la liberación del neurotransmisor . Cada toxina es sintetizada como una proteína de cadena única de aproximadamente 150 kDa no procesada REF.: 225561 inactiva. El procesamiento post-traduccional involucra la formación de puentes de disulfuro, y proteólisis limitada (mellado) por las proteasas bacterianas. La Neurotoxina activa consiste de dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unida por el enlace de disulfuro. La CNTs consiste de tres dominios, es decir, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio enlazante al receptor (mitad C-terminal) , véase Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Las Neurotoxinas Botulínicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la proteína de Neurotoxina de 150 kDa y proteínas que forman complejo, no tóxicas asociadas. Los tamaños del complejo difieren en base a la cepa Clostridial y los distintos serotipos de Neurotoxina que varían de 300 kDa a 900 kDa. Las proteínas que forman complejos en estos complejos estabilizan la Neurotoxina y la protegen contra la degradación, véase Chen 1998, Infect Immun 66(6): 2420-2425.

Clostridium botulinum secreta siete serotipos antigénicamente distintos designados A hasta G de la neurotoxina botulínica (BoNT) . Todos los serotipos junto con la neurotoxina tetánica liberada (TeNT) secretada por Clostridium tetani, son endoproteasas Zn2+ que bloquean exocitosinas sinápticas desdoblando proteínas SNARE, véase Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. La CNTs causa la parálisis del músculo flácido, vista en botulismo, véase Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

Debido a sus efectos tóxicos, las toxinas Botulínicas se han usado como agentes terapéuticos para un gran número de enfermedades o trastornos. La toxina Botulínica de serotipo A fue aprobada para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento de estrabismo, blefaroespasmo y otros trastornos. Está comercialmente disponible como un complejo de proteína de toxina Botulínica A, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan Inc) o bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd) . Para aplicaciones terapéuticas, el complejo es inyectado directamente en el músculo a ser tratado. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteínas y se lleva a cabo el efecto farmacológico deseado. Está disponible una preparación de polipéptido de Neurotoxina A, libre de complejo, mejorada, bajo el nombre comercial XEO IN (Merz Pharmaceuticals GmbH) . El efecto de la toxina Botulínica es únicamente temporal, lo cual es una razón por la que se puede requerir la administración repetida de la toxina Botulínica para mantener un efecto terapéutico.

Las Neurotoxinas Clostridiales debilitan voluntariamente la fuerza muscular y son terapéuticos efectivos para estrabismo, distonía focal, que incluye distonía cervical y blef roespasmo esencial benigno. Se han mostrado además para el alivio de espasmo hemifacial, y espasticidad focal, y, sin embargo, por ser efectivos en una amplia serie de otras indicaciones, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y corrección de arrugas cosméticas, véase Jost 2007, Drugs 67, 669.

Sin embargo, también es deseable el debilitamiento de la fuerza y contracción muscular para condiciones o enfermedades médicas tales como cicatrización de herida, inmovilización para tratamiento de fractura ósea y tendón, inmovilización después de la cirugía, específicamente junto con hemorroidectomia, introducción de implantes dentales, o reemplazo de la articulación de la cadera (endoprótesis ) , artroplastia de rodilla, cirugía oftalmológica, acné o enfermedad del intestino irritable. Las Neurotoxinas usualmente exhiben su efecto biológico durante un periodo de tiempo el cual es más largo que el actualmente necesario para tratamiento eficiente de las enfermedades o condiciones. Una parálisis muscular prolongada es, sin embargo, perjudicial o al menos preferible en la terapia de las condiciones o enfermedades médicas. Las Neurotoxinas que exhiben su efecto biológico únicamente por el periodo de tiempo deseado, sin embargo, aún no están disponibles.

Por consiguiente, el problema técnica fundamental de la presente invención se puede ver como la provisión de medios y métodos para cumplir con las necesidades antes mencionadas. El problema técnico es resuelto por las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente abajo.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención, por lo tanto, se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neurotoxina que exhibe una duración reducida del efecto biológico en un sujeto, en donde el polipéptido comprende al menos una señal de degradación en la cadena ligera.

El término "polinucleótido" como se usa en la presente se refiere a moléculas de ADN de hebras dobles o sencillas así como a moléculas de ARN. Abarcado por el término está ADN genómico, ADNc, ARNhn, ARNm, así como todos los derivados modificados que se originan naturalmente o artificialmente de estas especies moleculares. El polinucleótido puede ser en un aspecto una molécula lineal o circular. Además, en adición a las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de Neurotoxina antes mencionado, un polinucleótido de la presente invención puede comprender secuencias adicionales requeridas para transcripción y/o traducción apropiada tal como secuencias 5' o 3'URT. Los polinucleótidos de la presente invención codifican un polipéptido de Neurotoxina modificado derivable de uno de los serotipos antigénicamente diferentes de Neurotoxinas Botulínicas, es decir, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, o Neurotoxina Tetánica (TeNT) . En un aspecto de la presente invención, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEC ID NO: 1 (BoNT/A) , SEC ID NO: 3 (BoNT/B) , SEC ID NO: 5 (BoNT/Cl), SEC ID NO: 7 (BoNT/D) , SEC ID NO: 9 (????/?) , SEC ID NO: 11 (BoNT/F) , SEC ID NO: 13 (BoNT/G) o SEC ID NO: 15 (TeNT) . Sin embargo, abarcado está en un aspecto, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido como se muestra en cualquiera de la SEC ID NO: 2 (BoNT/A) , SEC ID NO: 4 (????/?) , SEC ID NO: 6 (BoNT/Cl), SEC ID NO: 8 (BoNT/D) , SEC ID NO: 10 (BoNT/E) , SEC ID NO: 12 (BoNT/F) , SEC ID NO: 14 (BoNT/G) o SEC ID NO: 16 (TeNT) . En otro aspecto, el polinucleótido es una variante de los polinucleótidos antes mencionados que comprende una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de nucleótido, el cual en todavía otro aspecto puede resultar en un aminoácido codificado que tiene una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácido. Asimismo, un polinucleótido variante de la invención en otro aspecto debe comprender una variante de secuencia de ácido nucleico siendo al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, o una variante de secuencia de ácido nucleico la cual codifica una secuencia de aminoácido siendo al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. El término "idéntico" como se usa en la presente, se refiere a identidad de secuencia caracterizada determinando el número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácido en donde las secuencias se alinean de forma que se obtiene el apareamiento de más alto nivel. Se puede calcular usando técnicas o métodos publicados codificados en programas de ordenador tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J MoL Biol 215, 403) . El porcentaje de valores de identidad, en un aspecto, se calcula sobre la secuencia de aminoácido completa. Una serie de programas a base de una variedad de algoritmos están disponibles a un trabajador experto para comparar secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman proporcionan resultados particularmente confiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencia, se puede usar el. programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o el programa Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482) , los cuales son parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, isconsin, USA 53711) . Los valores de identidad de secuencia descritos anteriormente en porcentaje (%) son para ser determinados, en otro aspecto de la invención, usando el programa GAP sobre la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: Peso de Apertura: 50, Longitud Peso: 3, Apareamiento Promedio: 10.000 y Desapareamiento Promedio: 0.00, los cuales, a menos que se especifique de otra forma, debe siempre ser usados como ajustes estándares para alineamientos de secuencia.

En un aspecto, cada una de los polinucleótidos variantes antes mencionadas codifica un polipéptido que retiene una o más y, en otro aspecto, todas de las propiedades biológicas del polipéptido de Neurotoxina respectivo, es decir, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o Neurotoxina Tetánica (TeNT) . Aquellos de experiencia en la técnica podrán apreciar que la actividad biológica total se mantiene únicamente después de la activación proteolítica, aún aunque sea concebible que el precursor no procesado pueda ejercer algunas funciones biológicas o ser parcialmente activo. "Propiedades Biológicas" como se usa en la presente, se refieren a (a) receptor enlazante (b) internalización, (c) traslocación a través de la membrana endosomal en el citosol, y/o (d) desdoblamiento endoprotéico de proteínas involucradas en la fusión de membrana vesicular sináptica. Ensayos in vivo para valorar la actividad biológica incluyen el ensayo LD50 de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo como se describe por Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) y Dressler et al. (Dressler 2005, Mov Disord 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). La actividad biológica es comúnmente expresada en Unidades de Ratón (MU) . Como se usa en la presente, 1 MU es la cantidad de componente neurotóxico, el cual mata 50% de una población de ratón especificada después de la inyección intraperitoneal , es decir, el LD50 por i.p. al ratón. En un aspecto adicional, los polinucleótidos variantes pueden codificar Neurotoxinas que tienen propiedades biológicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de desdoblamiento los cuales son mejorados para reconocimiento enzimático o pueden ser mejorados para receptores enlazantes o cualquier otra propiedad especificada anteriormente. Sin embargo, abarcados están en un aspecto, polipéptidos de fusión que además comprenden péptidos marcadores detectables o etiquetas. En un aspecto, etiquetas adecuadas son etiquetas FLAG, etiquetas Myc o etiquetas His las cuales también permiten una purificación más eficiente de los polipéptidos etiquetados. Los péptidos marcadores detectables, en un aspecto, incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP, BFP y similares. En aún un aspecto adicional, los polinucleótidos variantes pueden codificar polipéptidos de Neurotoxina de fusión que comprenden una parte de al menos dos polipéptidos de Neurotoxina de diferentes serotipos, por ejemplo, una Neurotoxina de fusión que comprende una cadena pesada de BoNT/A y una cadena ligera de BoNT/E.

El polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención además comprende al menos una señal de degradación en su cadena ligera. En un aspecto de la invención, la cadena ligera del polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención se obtiene por modificación de una cadena ligera siendo codificada por un polinucleótido que comprende cualquiera de alguna de las secuencias de ácido nucleico específicas antes mencionadas o variantes de las mismas descritas anteriormente. Las cadenas ligeras de los polipéptidos de Neurotoxinas son generadas por desdoblamiento proteolítico de un polipéptido precursor (polipéptido de cadena sencilla) . La cadena ligera es la porción N-terminal del polipéptido precursor el cual se obtiene como un resultado del desdoblamiento proteolítico. Se pueden deducir las secuencias de aminoácido de las cadenas ligeras de los polipéptidos de Neurotoxina referidos anteriormente, en un aspecto, de los sitios de desdoblamiento indicados en la siguiente tabla.

Neurotoxina Número de Sitio de Secuencias que incluyen (Cepa acceso Desdoblasitios de desdoblamiento Bacteriana) miento (destacadas) ????/? ABD ?428 G42 KLLCV GI ITSKTKSLDXGYNKALN ....DLCI (Ha]|/62A) 65472 V K448/A44 (SEC ID 1T0: ?) 9 BoNTVB BAE K4 I/A44 IQMC SV APG ICI (Okra) 48264 2 DV (SEC ID no: 18) BoNT/CI BAA R444/S44 TKFCHKAIDGRSL....Y KTL DCREL (C-6814) 89713 5 LV K449A45 (SEC ID 110: 19) 0 442/ 44 TKVCLRliT NSRD DSTCI BoNTD BAA 90661 3 KV R445/D44 (SEC ?» H0: 20) 6 BoNT/E CAA K419/G42 (Beluga) 43999 0 Él (SEC DD 110: 21) R422/K42 3 BoNT/F CAA R435/rK43 (NCTC10 73972 6 V 281) K439/A44 (SEC ID 110: 22) 0 BoNTG CAA IAMCKPVMyKNT GKS BQCT 52275 IV (SEC ID 110: 23) Tc'NT P 04958 R449 IGLCKKI I PPTNI ENLYWRTAS LTDLGGEIiCT CR45S) KI (SEC ID 110: 24) El término "señal de degradación" como se usa en la presente, se refiere a modificaciones de la cadena ligera del polipéptido de Neurotoxina el cual resulta en degradación incrementada del polipéptido de Neurotoxina por trayectorias de degradación endógena presentes en un organismo al cual se ha aplicado la Neurotoxina. En un aspecto, la trayectoria de degradación puede ser una trayectoria de degradación proteasomal o una trayectoria de degradación lisosomal. En otro aspecto, una trayectoria de degradación puede solamente resultar en una degradación parcial del polipéptido de Neurotoxina, por ejemplo, por una o más etapas de desdoblamiento proteolítico . La señal de degradación puede ser introducida en la cadena ligera (es decir, ser localizada (internamente) dentro de la cadena ligera) o unida a ésta ya sea N- o C-terminalmente . La persona experta en la técnica está consciente de las señales de degradación adecuadas y cómo introducir o unirlas a la cadena ligera de polipéptidos de Neurotoxina. Asimismo, el técnico experto puede generar polinucleótidos que codifican los polipéptidos de Neurotoxina con al menos una señal de degradación aplicando técnicas de biología molecular recombinante o modificaciones químicas. Por ejemplo, se puede usar mutagénesis dirigida al sitio para introducir las señales de degradación referidas posteriormente. Alternativamente, se puede diseñar una secuencia de ácido nucleico para el polinucleótido que comprende las secuencias codificantes para el polipéptido de Neurotoxina y la señal de degradación prevista y el polinucleótido completo puede subsecuentemente ser químicamente sintetizado.

En un aspecto, la señal de degradación se selecciona del grupo que consiste de: a) al menos una porción PEST internamente o terminalmente introducida, b) al menós una porción de reconocimiento de ligasa E3 internamente o terminalmente introducida, c) un residuo oligo-lisina N-terminal, d) una ubiquitina N-terminalmente unida, e) una sustitución de la prolina N-terminal con un aminoácido básico, f) sustituciones de residuos de aminoácido de despliegue de superficie por lisinas, y g) una sustitución de la prolina N-terminal con un aminoácido básico en combinación con sustituciones de residuos de aminoácido de despliegue de superficie por lisinas .

En un aspecto, la porción de reconocimiento de ligasa E3 tiene una secuencia consenso como se muestra en la siguiente tabla (en donde "X" puede representar cualquiera de los aminoácidos que se originan naturalmente) : Ligasa de ubiquitina E3 Porción de reconocimiento (consenso) VBCCul2 ALAPY1P (SEC ID NO: 25) MNM2 RFMDY EGL (SEC ID NO: 26) FXXXLWXXL (SEC ID NO: 27) Smurfi ELESPPPPYSRYPM (SEC ID NO: 28) NI 81 VGFF Jl (SEC ID No: 29) E3alpha LLVRGRTLVV (SEC ID NO 30 SCF DRHDSGLDSM (SEC ID NO: 31) Siah PXAXVXP (SEC ID NO: 32) Itch PPXYXXM (SEC ID NO: 33) Nedd4-2 PPXY (SEC ID No; 34) Las porciones PEST son bien conocidas en la técnica como señales de degradación (Rogers 1986., Science 234: 364-368, Rechsteiner 1996, TIBS 21: 267-271, Belizario 2008, Science 9: 210-220) . En un aspecto, las porciones PEST tienen una secuencia como se describe en Rechsteiner 1996, TIBS 21: 267-271, Tabla 1 (por este medio incorporado por referencia) , para cualquiera de una de las siguientes proteínas: GCN4 , ???a, Fos , descarboxilasa de ornitina, Cactus, CLN2 , CLN 3 o NIMA.

Los polipéptidos de Neurotoxina modificados codificados por el polinucleótido de la presente invención pueden exhibir una duración reducida del efecto biológico en un sujeto en la administración en comparación a un polipéptido de Neurotoxina no modificado. En un aspecto, el efecto biológico observado en el sujeto causa parálisis muscular, es decir, una inactivación (reversible) de la capacidad del músculo para contraerse. En un aspecto, los efectos pueden ser probados por el así llamado ensayo de corrida del ratón (Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Los efectos biológicos se pueden determinar por la persona experta en la técnica sin actividad adicional. Una duración reducida del efecto biológico, en un aspecto, se refiere a una duración reducida estadísticamente significante. Si la duración de un efecto es reducida estadísticamente significante, puede ser determinada por aquellos de experiencia en la técnica aplicando pruebas estadísticas estándares, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Intervalos de confianza preferidos son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. Los valores p son, preferiblemente, 0.1, 0.005, 0.01, 0.005 o 0.0001. Preferiblemente, la probabilidad prevista por la presente invención permite que el diagnóstico sea correcto por al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de los sujetos de una población o cohorte proporcionados. En un aspecto, la duración reducida persiste menos del 75%, menos del 70%, menos del 65%, menos del 60%, menos del 55%, menos del 50%, menos del 45%, menos del 40%, menos del 30% o menos del 20% de la duración normal, es decir, la duración observada para un polipéptido de Neurotoxina no modificada. En un aspecto, la duración normal persiste por aproximadamente 4 meses en el caso de BoNT/A, 2 meses en el caso de BoNT/B, aproximadamente 3 a 4 meses en el caso de BoNT/C o aproximadamente 4 semanas en el caso de BoNT/E (Foran, J Biol . Chem. 278(2): 1363-1371, Eleopra 1998, Neurosci Lett. 13, 256(3): 135-138, Eleopra 1997, Neurosci Lett. 14, 224(2): 91-94, Sloop 1997, Neurology 49(1): 189-194, Washbourne 1998, J Physiol París 92(2): 135-139). Se entenderá que la duración del efecto dependerá de las influencias individuales en un sujeto tales como antecedentes genéticos, edad, estilo de vida, etc. Por lo tanto, una duración aproximada como se entiende en la presente se refiere a una duración como se indica anteriormente para los polipéptidos de Neurotoxina respectivos (por ejemplo, 4 meses para BoNT/A o 4 semanas para BoNT/E) con una desviación estándar del 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos o 5% o menos.

Ventajosamente, se ha encontrado de conformidad con la presente invención que un polipéptido de Neurotoxina se puede modificar para exhibir un efecto biológico acortado en un sujeto en administración. En principio, esto se puede lograr introduciendo o uniendo una señal de degradación a la cadena ligera del polipéptido de Neurotoxina ya que se encontró que la persistencia de la cadena ligera se correlaciona con la duración del efecto biológico. La duración acortada del efecto biológico provocado por los polipéptidos de Neurotoxina es benéfica para varias aplicaciones médicas las cuales requieren una inactivación de acciones nerviosas, por ejemplo, parálisis muscular para facilitar curación de la herida.

La presente invención contempla un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención.

El término "vector", preferiblemente, abarca vectores fago, plásmido, viral o retroviral, así como cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Sin embargo, el término también se refiere a constructos objetivos los cuales permiten la integración dirigido al sitio o al azar del constructo objetivo en el ADN genómico. Los constructos objetivos, preferiblemente, comprenden ADN de longitud suficiente para ya sea recombinación homologa o heteróloga como se describe en detalle posteriormente. El vector que abarca los polinucleótidos de la presente invención, en un aspecto, además comprende marcadores seleccionables para propagación y/o selección en un hospedero. El vector se puede incorporar en una célula hospedera por varias técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, un vector de plásmido se puede introducir en un precipitado tal como un precipitado de fosfato de calcio o precipitado de cloruro de rubidio, o en un complejo con un llpido cargado o en agrupamientos a base de carbono, tales como fullerenos. Alternativamente, un vector de plásmido se puede introducir por golpe de calor o técnicas de electroporación . El vector debe ser un virus, puede ser empaquetado in vi tro usando una línea celular empaquetada apropiada para aplicación a las células hospederas. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral generalmente puede ocurrir únicamente en hospederos/células complementarias. Sin embargo, en un aspecto de la invención, el polinucleótido está operativamente unido a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células hospederas procarióticas o eucarióticas o fracciones aisladas de las mismas en el vector. La expresión del polinucleótido comprende transcripción del polinucleótido en un ARNm traduccionable . Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células hospederas son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de transcripción y/o señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcripto. Elementos reguladores adicionales pueden incluir mej oradores transcripcionales así como también de la traducción. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células hospederas procarióticas comprenden, por ejemplo, el promotor lac-, trp- o tac- en E. coli, y ejemplos para elementos reguladores que permiten la expresión en células hospederas eucarióticas son el promotor AOXI- o el GALI- en levadura o el promotor CMV- , SV40-, RSV (virus Rous sarcoma), mejorador CMV, mejorador SV40 o un intrón de globina en mamífero y otras células animales. De manera adicional, se pueden usar secuencias de control de expresión inducibles en un vector de expresión abarcado por la presente invención. Estos vectores inducibles pueden comprender secuencias operadoras tet o lac o secuencias inducibles por golpe de calor u otros factores ambientales . Las secuencias de control de expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. Además de los elementos los cuales son responsables para el inicio de transcripción, estos elementos reguladores pueden también comprender señales de terminación de transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo del polinucleótido . En este contexto, los vectores de expresión adecuados son conocidos en la técnica tales como el vector de expresión pcDVl de ADNc Okayama-Berg (Pharmacia), pBluescript (Stratagene) , pCDM8 , pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORTl (Invitrogen) . Preferiblemente, el vector es un vector de expresión y un vector de transferencia del gen u objetivo. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus , virus vaccinia, virus adeno asociado, virus del herpes o virus de papiloma bovino, pueden ser usados para suministrar los polinucleótidos o vectores de la invención en la población de células objetivo. Los métodos los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, se pueden usar para construir vectores virales recombinantes ; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Sptring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience , N.Y. (1994).

Asimismo, la presente invención pertenece a una célula hospedera que comprende el polinucleótido o el vector de la presente invención.

El término "célula hospedera" como se usa en la presente, abarca células hospederas procarióticas y eucarióticas . En un aspecto, la célula hospedera es una célula bacteriana y, en otro aspecto, una célula bacteriana Firmicutes. En otro aspecto, la célula hospedera bacteriana es una célula bacteriana de E. coli. En otro aspecto, es una célula hospedera de Clostridium. En un aspecto adicional, la célula hospedera de Clostridium es una célula hospedera de Clostridium botulinum, en aún un aspecto adicional, es una célula de uno de los siete diferentes serotipos antes mencionados de Clostridium botulinum. En todavía un aspecto adicional, la célula hospedera bacteriana es una célula hospedera de Clostridium tetani . En un aspecto adicional, la célula hospedera es una célula hospedera Bacillus y en un aspecto particular una célula hospedera Bacillus megaterium. Una célula hospedera eucariotica, es una célula de una línea celular animal adecuada para producción de proteínas toxicas o una célula hospedera fúngica tal como una célula hospedera de levadura.

También abarcado por la presente invención está un polipéptido codificado por el polinucleótido de la invención.

El término "polipéptido" como se usa en la presente abarca polipéptidos aislados o esencialmente purificados estando esencialmente libres de otros polipéptidos que incluyen las proteínas en complejos (HA70, HA17, HA33 o NTNH ( BP) de la célula hospedera o preparaciones del polipéptido que comprenden otras proteínas en adición. Además, el término incluye polipéptidos químicamente modificados. Estas modificaciones pueden ser modificaciones artificiales o modificaciones que se originan naturalmente. Como se ha referido anteriormente, el polinucleótido de la presente invención puede tener las propiedades biológicas de los polipéptidos de Neurotoxina referidos anteriormente. Sin embargo, pueden exhibir duración acortada del efecto biológico en un sujeto en administración. El polipéptido de la invención, es un aspecto, puede ser manufacturado por un método para manufacturar un polipéptido como se describe en otra parte en la presente en más detalle. En un aspecto de la invención, una preparación de polipéptido es también visualizada la cual comprende un complejo del polipéptido de Neurotoxina y sus proteínas en complejos.

Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo el cual específicamente se enlaza al polipéptido de la presente invención.

Se pueden preparar anticuerpos contra el polipéptido de la invención por métodos bien conocidos usando un polipéptido purificado de conformidad con la invención o un fragmento adecuado derivado de este como un antígeno. Se puede identificar un fragmento el cual es adecuado como un antígeno por algoritmos determinantes de antigenicidad bien conocidos en la técnica. Estos fragmentos se pueden obtener ya sea del polipéptido de la invención por digestión proteolítica o puede ser un péptido sintético. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo humano o humanizado o primatizado, quimerizado o fragmento del mismo. También comprendidos como anticuerpos por la presente invención están un anticuerpo biespecífico , un anticuerpo sintético, un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, Fv o scFv, etc., o un derivado químicamente modificado de cualquiera de estos. El anticuerpo de la presente invención puede enlazarse específicamente (es decir, no tiene reacción cruzada con otros polipéptidos o péptidos) al polipéptido de la invención. Específicamente, el anticuerpo puede también no tener reacción cruzada con el polipéptido de Neurotoxina no modificado. Se puede probar el enlace específico por varias técnicas bien conocidas. Se pueden obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos usando métodos los cuales se describen, por ejemplo, en Harlow and Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales por técnicas originalmente descritas por Kóhler et al., (Kóhler 1975, Nature 256 (1975), 495) o Galfré., (Galfré 1981, Meth. Enzymol . 73 (1981)) los cuales comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a células del bazo derivadas de mamíferos las cuales se han inmunizado por el antígeno, es decir, el polipéptido de la invención o un fragmento inmunogénico del mismo. Los anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de los polipéptidos de la invención, así como para el monitoreo de la presencia de los polipéptidos, por ejemplo, en organismos recombinantes , y para la identificación de compuestos que interactúan con las proteínas de conformidad con la invención. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BIAcore se puede usar para incrementar la eficiencia de anticuerpos de fago los cuales se enlazan a un epítope de la proteína de la invención (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97-105; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183, 7-13) .

En general, el polinucleótido o polipéptido de la invención se puede usar como un medicamento.

El término "medicamento" como se usa en la presente se refiere, en un aspecto, a una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de Neurotoxina biológicamente activo o un polinucleótido codificado como compuesto activo farmacéutico. El medicamento se puede usar para terapia humana o animal de varias enfermedades o trastornos en una dosis terapéuticamente efectiva. El medicamento puede ser formulado por varias técnicas dependiendo de los propósitos de aplicación deseadas. Aspectos diferentes de un medicamento de conformidad con la presente invención están especificados en la presente posteriormente.

En un aspecto, el medicamento comprende el polipéptido de Neurotoxina biológicamente activo de la presente invención, uno o más portadores farmacéuticamente aceptables como una composición farmacéutica. Los portadores farmacéuticamente aceptables deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales al receptor del mismo. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de portadores sólidos son lactosa, térra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Ejemplos de portadores líquidos son glicerol, solución salina amortiguada de fosfato, agua, emulsiones, varios tipos de agentes humectantes y similares. Portadores adecuados comprenden aquellos mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania . Se entenderá que un portador puede también ser un virus o retrovirus adecuado para terapia de gen, en particular, si el ingrediente activo del medicamento es el polinucleótido de la invención.

El medicamento, en un aspecto, puede ser disuelto en un diluyente antes de la administración. El diluyente también se selecciona por no afectar la actividad biológica de la combinación. · Ejemplos de estos diluyentes son agua destilada o salina fisiológica. Además, la composición o formulación farmacéutica puede también incluir otros portadores o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Así, el polipéptido de Neurotoxina de la invención puede estar presente, en un aspecto, en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, pueden estar presentes junto con glicerol, estabilizadores de proteína (HSA) o estabilizadores no de proteína tales como polivinilpirrolidona (PVP) , ácido hialurónico o aminoácidos libres. En un aspecto, se describen estabilizadores no proteínicos adecuados en el documento WO 2005/007185 o WO 2006/020208.

En otro aspecto, el medicamento será proporcionado como una solución que comprende el polipéptido de Neurotoxina. Adicionalmente , la solución puede comprender portadores o estabilizadores referidos anteriormente también. Se puede proporcionar una formulación líquida estable del polipéptido de Neurotoxina, en un aspecto, como se discute por el documento US 7,211,261.

La composición farmacéutica es, en un aspecto, administrada tópicamente. Convencionalmente el medicamento será administrado intramuscularmente o subcutáneamente (cerca de las glándulas) dependiendo de la indicación médica deseada. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y forma de acción de un compuesto de la composición farmacéutica se puede administrar por otras vías también.

Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad del polipéptido de Neurotoxina o el polinucleótido de la invención la cual previene, mejora o trata los síntomas que acompañan una condición o enfermedad referida en esta especificación. La eficacia terapéutica y toxicidad del compuesto se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y LD50 (la dosis letal a 50% de la población) . La proporción de dosis entre los efectos terapéutico y tóxico es el índice terapéutico, y puede ser expresada como la proporción, LD50/ED50. El medicamento de la presente invención comprenderá, en un aspecto, las dosificaciones recomendadas en las instrucciones médicas o a los usuarios para ajustes de dosificación anticipadas dependiendo del receptor individual.

El medicamento referido en la presente se desarrolla para ser administrado al menos una vez para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o condición descrita en esta especificación. Sin embargo, el medicamento puede ser administrado más de una vez.

El medicamento de conformidad con la presente invención puede en un aspecto adicional de la invención comprender fármacos en adición al polipéptido de Neurotoxina biológicamente activo los cuales se agregan a la composición farmacéutica durante su formulación.

Adicionalmente , la presente invención pertenece al uso del polinucleótido o el polipéptido de la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de curación de herida, inmovilización para tratamiento de fractura ósea o tendón, inmovilización postcirugía, específicamente en conjunto con hemorroidectomia, introducción de implantes dentales o reemplazo de articulación de cadera (endoprótesis) , artroplastia de rodilla, cirugía oftalmológica, acné o enfermedad del intestino irritable.

Los síntomas asociados con las condiciones o enfermedades médicas antes mencionadas son bien conocidos por la persona experta en la técnica y se describen en libros de texto estándares de medicina tales como Stedman o Pschyrembl.

Asimismo, la presente invención también se refiere al uso del polinucleótido o el polipéptido de la presente invención para la preparación de un medicamento de diagnóstico para determinar si un sujeto es susceptible para una terapia de Neurotoxina.

El medicamento de diagnóstico referido anteriormente es un medicamento de polipéptido de Neurotoxina como es referido anteriormente. Sin embargo, el medicamento es para ser aplicado por un tiempo y a un régimen de dosificación que permite solamente la determinación si un sujeto responde al péptido de Neurotoxina en absoluto o la determinación de un régimen de dosificación adecuado. Puesto que el polipéptido de Neurotoxina anterior -a pesar de que tiene potencial terapéutico también-, es usado pivotalmente para un propósito de diagnóstico preferentemente para tratamiento o mejoramiento en este aspecto, el medicamento que comprende es llamado "medicamento de diagnóstico". Así, la pre-selección de tiempo restringido con los polipéptidos de Neurotoxina modificados de la presente invención puede ayudar a seleccionar sujetos susceptibles para una terapia usando una Neurotoxina no modificada, así como también determinando una dosificación adecuada. Efectos laterales potenciales de una terapia a base de una Neurotoxina no modificada podrán normalmente persistir por un tiempo prolongado, pueden ser reducidos debido a la duración reducida del efecto biológico provocado por el polipéptido de Neurotoxina modificado de la invención.

La presente invención abarca un método para la manufactura de un polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención que comprende las etapas de: a) cultivar la célula hospedera de la invención bajo condiciones las cuales permiten la expresión del polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención, y b) obtener el polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención a partir del cultivo de la célula hospedera de a) .

El polipéptido puede ser obtenido del cultivo, en un aspecto, por todas las técnicas de purificación convencionales que incluyen cromatografía por afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y técnicas de precipitación que incluyen precipitación del anticuerpo. Asimismo, en un aspecto, el polipéptido de Neurotoxina obtenido por el método de la invención puede estar libre de proteínas formadas en complejos. En otro aspecto, el polipéptido de Neurotoxina se puede obtener como un complejo que comprende en adición a las proteínas formadas en complejo del polipéptido de Neurotoxina. Además, obtener como se usa en la presente, en un aspecto, incluye activación del polipéptido de Neurotoxina. Esto se puede lograr por desdoblamiento proteolítico del precursor del polipéptido de Neurotoxina (cadena única) ya sea intracelular por una proteasa endógena o exógena (por ejemplo, expresada de forma recombinante) o fuera de la célula por contacto del polipéptido de Neurotoxina, por ejemplo, antes, durante o después de la purificación antes mencionada, con la proteasa bajo condiciones que permiten el desdoblamiento.

Además, se contempla un método para la manufactura de un medicamento de conformidad con la presente invención, el método comprende las etapas del método antes mencionado de la invención y la etapa adicional para formular el polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de la invención como un medicamento.

Se entenderá que un método para la manufactura de un medicamento se lleva a cabo de conformidad a los estándares de GMP para medicamentos para asegurar calidad, seguridad farmacéutica, y eficacia del medicamento. Formulaciones adecuadas del medicamento se describen en otra parte en esta especificación. La persona experta en la técnica está, sin embargo, consiente de cómo se pueden elaborar las formulaciones.

La invención también abarca un método para la manufactura de una composición cosmética que comprende las etapas del método de la invención y la etapa adicional de formular el polipéptido de Neurotoxina como una composición cosmética.

"Composición cosmética" como se usa en la presente se puede formular como se describe para una composición farmacéutica anterior. Para una composición cosmética, igualmente, se prevé que el compuesto de la presente invención sea, en un aspecto usado en forma sustancialmente pura. Las impurezas, sin embargo, pueden ser menos críticas que para un medicamento. Las composiciones cosméticas están, en un aspecto adicional, siendo aplicadas intramuscularmente . En aún un aspecto adicional de la invención, las composiciones cosméticas que comprenden la Neurotoxina se pueden formular como un agente anti-arrugas .

La presente invención también pertenece a una composición cosmética y para el uso del polinucleótido o el polipéptido de la presente invención para la preparación de una composición cosmética a ser usada como un agente anti-arrugas .

Todas las referencias citadas en esta especificación están junto con ésta incorporadas por referencia con respecto a su contenido descrito completo y al contenido de la descripción específicamente mencionado en esta especificación.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Polinucleótido, que codifica un polipéptido de Neurotoxina que exhibe una duración reducida del efecto biológico en un sujeto, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos una señal de degradación en la cadena ligera .

2. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el efecto biológico provoca parálisis muscular en el sujeto.

3. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque la duración reducida persiste menos de 4, 3 o 2 semanas.

4. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la señal de degradación se selecciona del grupo que consiste de: a) al menos una porción PEST internamente o terminalmente introducida; b) al menos una porción de reconocimiento de ligasa E3 internamente o terminalmente introducida; c) un residuo oligo-lisina N-terminal; d) una ubiquitina N-terminalmente enlazada; e) una sustitución de la prolina N-terminal con un aminoácido básico; f) sustituciones de residuos de aminoácido de despliegue de superficie con lisina; y g) una sustitución de la prolina N-terminal con un aminoácido básico en combinación con sustituciones de residuos de aminoácido de despliegue de superficie con lisina .

5. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la cadena ligera del polipéptido se obtiene por la modificación de una cadena ligera siendo codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16; y c) una secuencia de ácido nucleico siendo al menos 40% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de a) o b) .

6. Vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Célula hospedera, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el vector de conformidad con la reivindicación 6.

8. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli o una célula de Clostridium o Bacillus.

9. Polipéptido, caracterizado porque es codificado por el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Anticuerpo, caracterizado porque específicamente se une al polipéptido de conformidad con la reivindicación 9.

11. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es para uso como un medicamento.

12. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es para uso como un medicamento .

13. Uso de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cicatrización de herida, inmovilización para tratamiento de fractura ósea y tendón, inmovilización post-cirugía, específicamente en conjunto con hemorroidectomia, introducción de implantes dentales, o reemplazo de articulación de la cadera (endoprótesis ) , artroplastia de rodilla, cirugía oftálmica, acné o enfermedad del intestino irritable.

14. Método para la manufactura de un polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende las etapas de : a) cultivar la célula hospedera de la reivindicación 7 bajo condiciones las cuales permiten la expresión del polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y b) obtener el polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a partir del cultivo bacteriano de a) .

15. Método para la manufactura de un medicamento, caracterizado porque comprende las etapas del método de conformidad con la reivindicación 14 y la etapa adicional para formular el polipéptido de Neurotoxina codificado por el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como un medicamento.