ES2749049T3 - Fabricación de neurotoxinas recombinantes de Clostridium botulinum - Google Patents

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Abstract

Un método para producir proteína BoNT/A bicatenaria soluble, que comprende: a) proporcionar una proteína BoNT/A monocatenaria soluble; b) poner en contacto dicha proteína BoNT/A con endoproteinasa Lys-C (Lys-C) en solución; y c) separar la proteína BoNT/A soluble de la Lys-C poniendo en contacto la solución que contiene la proteína BoNT/A soluble y Lys-C con una superficie hidrófoba, en donde la proteína BoNT/A soluble se une con preferencia a la superficie hidrófoba.

Description

DESCRIPCIÓN
Fabricación de neurotoxinas recombinantes de Clostridium botulinum
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir neurotoxinas recombinantes de Clostridium botulinum (C. botulinum) del serotipo A (BoNT/A).
Antecedentes de la invención
La neurotoxina botulínica (BoNT) es producida por C. botulinum en forma de un gran complejo proteico, que consiste en el propio BoNT complejado con varias proteínas accesorias. Actualmente existen al menos siete clases diferentes de neurotoxina botulínica, a saber: serotipos de neurotoxina botulínica A, B, C1, D, E, F y G, todos los cuales comparten estructuras y modos de acción similares. Recientemente se ha informado de un posible octavo serotipo, H, pero la secuencia aún no se ha publicado. Se pueden distinguir diferentes serotipos de BoNT en función de la inactivación por antisueros neutralizantes específicos, y dicha clasificación por serotipo se correlaciona con el porcentaje de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las proteínas BoNT de un serotipo dado se dividen adicionalmente en diferentes subtipos en función de la identidad de secuencia de porcentaje de aminoácidos.
Las BoNT son las toxinas más potentes conocidas, con valores de dosis letal media (LD50) para ratones que varían de 0,5 a 5 ng/kg dependiendo del serotipo. Las BoNT se adsorben en el tracto gastrointestinal y, después de ingresar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de los terminales nerviosos colinérgicos y evitan la liberación del neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden sinaptobrevina/proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP); BoNT/C, BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/C escinde la sintaxina.
En la naturaleza, las neurotoxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido monocatenario que se modifica después de la traducción mediante un evento de escisión proteolítica para formar dos cadenas de polipéptidos unidas por un enlace disulfuro. La escisión ocurre en un sitio de escisión específico, a menudo denominado sitio de activación, que se encuentra entre los residuos de cisteína que proporcionan el enlace disulfuro entre cadenas. Esta forma bicatenaria es la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan la cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L o LC), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de direccionamiento C-terminal (dominio Hc) y un componente de translocación N-terminal (dominio Hn). El sitio de escisión se encuentra entre la cadena L y los componentes de translocación, en una región de bucle expuesta (ver Tabla 1). Después de la unión del dominio Hc a su neurona diana y la internalización de la toxina unida a la célula a través de un endosoma, el dominio Hn transloca la cadena L a través de la membrana endosómica y al citosol, y la cadena L proporciona una función de proteasa (también conocida como una proteasa no citotóxica).
Las proteasas no citotóxicas actúan escindiendo proteolíticamente las proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, VAMP o sintaxina), véase Gerald K (2002) “Cell and Molecular Biology” (4a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término receptor de unión NSF soluble, donde NSF significa factor sensible a N-etilmaleimida. Las proteínas SNARE son integrales para la fusión de vesículas intracelulares y, por lo tanto, para la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. La función de proteasa es una actividad endopeptidasa dependiente de zinc y exhibe una alta especificidad de sustrato por proteínas SNARE. En consecuencia, una vez administrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular de la célula diana. Las proteasas de la cadena L de las neurotoxinas clostridiales son proteasas no citotóxicas que escinden las proteínas SNARE.
Las neurotoxinas botulínicas son bien conocidas por su capacidad de causar una parálisis muscular flácida. Dichas propiedades relajantes musculares han llevado a la utilización de neurotoxinas botulínicas (como BoNT/A) en una variedad de procedimientos médicos y cosméticos, incluido el tratamiento de líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, líneas nasolabiales, distonía cervical, blefaroespasmo y espasticidad.
Tradicionalmente, la producción de BoNT se realizaba mediante cultivo de bacterias C. botulinum, seguido de aislamiento y purificación del complejo de neurotoxinas botulínicas. Sin embargo, la producción de BoNT de esta manera es ineficiente y proporciona bajos rendimientos de proteínas. Además, C. botulinum son bacterias formadoras de esporas y, por lo tanto, requieren equipos e instalaciones de cultivo especializados, que no son necesarios para el cultivo de bacterias como Escherichia coli (E. coli). El uso creciente de BoNT condujo al desarrollo de métodos alternativos para producir y purificar BoNT. En particular, se han desarrollado métodos para producir BoNT utilizando E. coli.
La purificación de CNT de la solución de fermentación (ya sea utilizando C. botulinum o E. coli) es un desafío particular, ya que las neurotoxinas están contenidas como una mezcla de polipéptidos no procesados, parcialmente procesados y totalmente procesados, todos los cuales tienen propiedades bioquímicas y físicas muy similares. Las neurotoxinas parcialmente procesadas se generan típicamente si la actividad endoproteolítica ha hidrolizado el enlace peptídico entre la cadena ligera y el bucle, mientras que el enlace peptídico entre el bucle y el extremo N de la cadena pesada todavía está intacto. Además, la neurotoxina parcialmente procesada también se puede crear si la actividad endoproteolítica ha liberado el péptido del bucle de la cadena pesada, mientras que el enlace peptídico entre el péptido del bucle y el extremo C de la cadena ligera aún no se ha hidrolizado.
Dependiendo de las condiciones de fermentación y el tipo de neurotoxina, el polipéptido completamente procesado que carece del péptido de bucle puede contaminarse significativamente, con entre el 5% y el 90% de polipéptido parcialmente procesado o sin procesar. En algunos casos, la neurotoxina no se procesa principalmente y, antes del uso terapéutico, debe tratarse con una endopeptidasa para que sea biológicamente activa.
La técnica anterior describe varios intentos de tratar las neurotoxinas clostridiales con proteasas heterólogas para reducir la cantidad de proteína precursora no procesada o parcialmente procesada. La proteasa más utilizada para la activación de neurotoxinas clostridiales, la tripsina, a la vez que es útil para activar las neurotoxinas clostridiales de los serotipos B (BoNT/B) y E (BoNT/E), parece producir productos secundarios, presumiblemente por acción proteolítica cerca del extremo C de la subunidad pesada de BoNT/A y, por lo tanto, parece destruir la unión de toxinas a su receptor celular. Teóricamente se esperan productos de escisión más específicos a partir de proteasas endógenas, aisladas del huésped nativo, como BoNT/A que produce C. botulinum.
Los presentes inventores han identificado previamente varias proteasas, tales como proteasas endógenas de C. botulinum y proteasas exógenas, incluida la proteasa endoproteinasa Lys-C (Lys-C) (que está disponible comercialmente y puede aislarse de Lysobacter enzymogenes). Sin embargo, aunque la escisión de BoNT/A recombinante por esta endoproteinasa refleja con mayor precisión la escisión nativa, el uso de Lys-C plantea nuevas consideraciones prácticas. En particular, después de la escisión de BoNT/A recombinante, Lys-C puede permanecer activa en la mezcla de reacción durante días. Por lo tanto, los medios y métodos para reducir la cantidad de Lys-C en el producto final y así mejorar la calidad de las preparaciones de neurotoxinas son altamente deseables pero aún no están disponibles.
Por lo tanto, un problema técnico subyacente a la presente invención puede verse como el suministro de medios y métodos para mejorar la producción de polipéptidos de neurotoxinas al cumplir con las necesidades antes mencionadas. Específicamente, existe una necesidad en la técnica de métodos mejorados para producir BoNT recombinantes, en particular BoNT/A recombinante bicatenaria activada.
El problema técnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.
Compendio de la invención
La producción de subserotipos recombinantes de BoNT/A se puede lograr mediante la expresión en Escherichia coli como un polipéptido único, en el presente documento denominado proteínas de BoNT/A monocatenaria. Tras el aislamiento de esta proteína monocatenaria por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), la proteína monocatenaria se debe escindir para formar la toxina activa, que es una proteína bicatenaria unida por un enlace disulfuro único.
Los presentes inventores han encontrado previamente que los subserotipos de BoNT/A monocatenaria recombinantes pueden escindirse usando la proteasa endoproteinasa Lys-C (Lys-C) para producir la neurotoxina de proteína BoNT/A bicatenaria activa, es decir, un heterodímero de las cadenas ligera y pesada de BoNT/A. Se determinó que el sitio de escisión de Lys-C era idéntico a la proteína endógena mediante secuenciación N-terminal y espectrometría de masas. Por lo tanto, la producción de la proteína BoNT/A bicatenaria activa usando Lys-C es ventajosa, ya que da como resultado la producción de una BoNT/A bicatenaria activa auténtica, es decir, una BoNT/A bicatenaria activa que es esencialmente idéntica a la BoNT/A bicatenaria activa nativa. Por el contrario, la tripsina, otra proteasa común utilizada para producir proteínas BoNT bicatenarias activas, escinde al menos un sitio adicional dentro de la secuencia de BoNT/A monocatenarias. Esta división adicional reduce la potencia de la proteína BoNT/A bicatenaria activa producida.
Una vez que la proteína BoNT/A monocatenaria ha sido escindida por Lys-C, la proteína BoNT/A bicatenaria activa requiere purificación para eliminar las proteínas de la célula huésped restantes y la proteasa Lys-C para producir el producto puro final.
En particular, a partir de las pruebas de escisión de la endoproteinasa Lys-C, los inventores han descubierto que Lys-C escinde BoNT/A1 recombinante (rBoNT/A1) en concentraciones muy bajas y permaneció activa durante un período de días. En consecuencia, es importante desarrollar un método que pueda purificar esta proteasa lejos de la toxina activada.
Los presentes inventores han desarrollado un método eficiente para eliminar la proteasa activadora de Lys-C y las proteínas de la célula huésped del BoNT/A después de la activación mediante el uso de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que la HIC maximiza no solo la cantidad de BoNT/A bicatenaria activa recuperada en la purificación, sino que también mejora significativamente la resolución de Lys-C, es decir, la eliminación de la proteasa de Lys-C. Las propiedades ventajosas de HIC son contraintuitivas cuando se considera que las características biofísicas de Lys-C y rBoNT/A; basado en el punto isoeléctrico (pI) y la carga neta de BoNT/A y Lys-C, se predice que la cromatografía de intercambio iónico (IEX) resolvería las dos proteínas en lugar de HIC.
La presente invención resuelve uno o más de los problemas mencionados anteriormente, proporcionando métodos como se especifica en las reivindicaciones.
En consecuencia, la presente invención proporciona un método para producir proteína BoNT/A bicatenaria soluble, que comprende:
a) proporcionar una proteína BoNT/A monocatenaria soluble;
b) poner en contacto dicha proteína BoNT/A con endoproteinasa Lys-C (Lys-C) en solución; y
c) separar la proteína soluble BoNT/A de la Lys-C poniendo en contacto la solución que contiene proteína soluble BoNT/A y Lys-C con una superficie hidrófoba, en donde la proteína soluble BoNT/A se une preferiblemente a la superficie hidrófoba.
La proteína BoNT/A monocatenaria soluble se puede producir en una célula huésped, mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicha proteína BoNT/A monocatenaria en un sistema de expresión, en donde opcionalmente el sistema de expresión es un sistema de expresión bacteriano, preferiblemente en donde el sistema de expresión bacteriano es un sistema de expresión de E. coli y la célula huésped es una célula de E. coli. Dicha proteína soluble BoNT/A monocatenaria puede expresarse en el citoplasma de dicha célula huésped, o en un sistema libre de células. La proteína BoNT/A monocatenaria soluble puede expresarse a un nivel de al menos 5 mg/L de cultivo. Dicho método puede comprender la lisis de la célula huésped para proporcionar un homogeneizado de la célula huésped que contiene dicha proteína BoNT/A monocatenaria soluble (preferiblemente, la BoNT/A monocatenaria soluble está presente a una concentración de al menos 5 mg/L del homogeneizado de célula huésped).
La superficie hidrófoba utilizada en el método de la presente invención puede ser una matriz inerte a la que se une un ligando que consiste en grupos arilo o alquilo, en donde opcionalmente el ligando se selecciona del grupo que consiste en: ligandos butilo, fenilo u octilo. En una realización, se usa una superficie hidrófoba de alto rendimiento. La invención proporciona además un método para la producción de una composición farmacéutica, que comprende las etapas del método mencionado anteriormente y la etapa adicional de formular la BoNT/A bicatenaria purificada como una composición farmacéutica.
Los siguientes aspectos se describen adicionalmente aquí:
- una proteína BoNT/A bicatenaria activa obtenible por el método de la invención;
- una composición que comprende dicha proteína BoNT/A bicatenaria activa; en donde dicha composición está sustancialmente libre de endoproteinasa Lys-C. Preferiblemente, dicha composición contiene menos de 400 pg de endoproteinasa Lys-C (Lys-C) por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A. Dichas composiciones son adecuadas para su uso en tratamientos terapéuticos y cosméticos;
- una composición farmacéutica líquida que comprende: una proteína BoNT/A bicatenaria activa obtenible por el método de la invención; un agente estabilizante no proteico que es un tensioactivo; y agua; en donde dicha composición farmacéutica líquida no comprende un agente estabilizante de proteínas; y en donde dicha composición farmacéutica líquida está sustancialmente libre de endoproteinasa Lys-C (Lys-C). Preferiblemente, dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A, o menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A. Dicha composición farmacéutica líquida puede comprender además: cloruro de sodio, un tampón para mantener el pH entre 5,5 y 7,5, y un disacárido; en donde el agua es agua estéril;
- una proteína, composición o composición farmacéutica líquida BoNT/A bicatenaria activa, como se describe en el presente documento, para uso en terapia;
- el uso de una proteína BoNT/A bicatenaria activa, composición o composición farmacéutica líquida, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento; y
- un método de tratamiento que comprende la administración de una proteína BoNT/A bicatenaria activa, composición o composición farmacéutica líquida, como se describe en el presente documento, a un paciente que lo necesite.
Descripción detallada de la invención
Toxina botulínica serotipo A (BoNT/A)
El término “BoNT” significa neurotoxina botulínica y se refiere a la neurotoxina obtenible de C. botulinum como BoNT de serotipo A, B, C1, D, E, F o G. También está abarcada por el término “CNT” y “BoNT” la neurotoxina recombinante y modificada que comprende una o más modificaciones que incluyen modificación química o modificación genética. La expresión “modificación genética” significa la deleción, sustitución o adición de uno o más residuos de ácido nucleico que dan como resultado la deleción, sustitución o adición de una o más bases de aminoácidos, o la deleción, sustitución o adición de dichos uno o más residuos de aminoácidos.
El serotipo BoNT/A se divide en al menos ocho subserotipos (también conocidos como subtipos), BoNT/A1 a BoNT/A8, que comparten al menos el 84% hasta el 98% de identidad de secuencia de aminoácidos; las proteínas BoNT/A dentro de un subtipo dado comparten una identidad de secuencia en porcentaje de aminoácidos más alta. La Tabla 1 (a continuación) muestra el precursor, la neurotoxina bicatenaria nativa de los subtipos de BoNT/A e identifica el bucle expuesto (bucle de activación) que comprende la secuencia de aminoácidos escindida por Lys-C.
Tabla 1:
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En referencia a la Tabla 1, las posiciones de aminoácidos (residuos) indicadas para las regiones LC, H n , H cn y H cc corresponden a las posiciones de aminoácidos para dichas regiones en una secuencia de proteína BoNT/A de longitud completa. Los números de acceso UniProt dados en la Tabla 1 son ejemplos de los diferentes subserotipos de BoNT/A. Por lo tanto, en una realización, las posiciones de aminoácidos de las regiones LC, H n , H cn y H cc indicadas en la Tabla 1 corresponden a las posiciones de aminoácidos en las secuencias de proteína BoNT/A de longitud completa identificadas por el número de acceso.
Usando los métodos de la presente invención, ahora es posible obtener composiciones de BoNT/A bicatenaria con una contaminación significativamente menor por BoNT/A sin procesar o parcialmente procesada, ya que esos contaminantes se procesan eficientemente en BoNT/A bicatenaria. Los métodos de la presente invención también permiten la eliminación efectiva de la enzima Lys-C utilizada para procesar la proteína BoNT/A monocatenaria en la doble cadena activa. En un aspecto, la BoNT/A bicatenaria es una neurotoxina bicatenaria nativa, en la que el extremo C de la cadena ligera y el extremo N de la cadena pesada son idénticos a la correspondiente BoNT/A bicatenaria completamente procesada aislada de Clostridia de tipo salvaje.
De acuerdo con la presente invención, se puede producir una doble cadena de BoNT/A activa, que incluye una doble cadena de BoNT/A recombinante, como un polipéptido monocatenario, que se escinde para formar la forma bicatenaria activa de la proteína.
Los presentes métodos pueden usarse para producir la cadena doble de cualquier subtipo de BoNT/A o un homólogo o derivado del mismo, que incluye, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO: 1 y derivados del mismo. El término “derivado”, como se usa con respecto a este y otros aspectos de la invención, comprende mutaciones de aminoácidos tales como adición, sustitución, deleción o truncamiento de uno o más residuos de aminoácidos.
La proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender una secuencia de polipéptidos como se muestra en GenBank no: CBZ04958.1, YP_002805603.1, ZP_02994746.1, YP_001788403.1, YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP_02614241.1, YP_001392361.1, YP_001255575.1. La proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender una secuencia de polipéptidos como se muestra en:
• Subserotipo A1: número de acceso UniParc UPI0000ED909E (número de acceso UniProt P10845, versión 159), número de acceso UniParc UPI0000EF85BD (número de acceso UniProt S8B1U4, versión 3, o número de acceso UniProt A2I2R4, versión 41), número de acceso UniParc UPI0001A954C8 (número de acceso UniProt C6K838, versión 11), número de acceso UniParc UPI0000001386 (número de acceso UniProt A5HZZ9, versión 57), número de acceso UniParc UPI000003409D (número de acceso UniProt A2I2U2, versión 36), número de acceso UniParc UPI00016529B7 (número de acceso UniProt B1A2D5, versión 21), número de acceso UniParc UPI00027EE164 (número de acceso UniProt J7FGZ9, versión 6);
• Subserotipo A2: número de acceso UniParc UPI0000EF84BD (número de acceso UniProt A2I2R5, versión 28), número de acceso UniParc UPI0001C0B376 (número de acceso UniProt D2KCK3, versión 15), número de acceso UniParc UPI0001C32E84 (número de acceso UniProt3 D3IV23, versión 10), número de acceso UniParc UPI0001F3B30D (número de acceso UniProt E5F1I1, versión 11), número de acceso UniParc UPI000016EA88 (número de acceso UniProt Q45894, versión 116 o número de acceso UniProt Q58GH1, versión 51), número de acceso UniParc UPI000067C53E (número de acceso UniProt Q2PPK6, versión 33), número de acceso UniParc UPI000290BEB1 (número de acceso UniProt K4GGE0, versión 6);
• Subserotipo A3: número de acceso UniParc UPI00005B712C (número de acceso UniProt Q3LRX9, versión 38), número de acceso UniParc UPI00016DBC11 (número de acceso UniProt B1L2G5, versión 38 o número de acceso UniProt D3IV24, versión 11), número de acceso UniParc UPI000290C3D0 (número de acceso UniProt K4G3L3, versión 7);
• Subserotipo A4: número de acceso UniParc UPI00005B712D (número de acceso UniProt Q3LRX8, versión 35), número de acceso UniParc UPI00019DB885 (número de acceso UniProt C3KS13, versión 29);
• Subserotipo A5: número de acceso UniParc UPI0001AE7D6A (número de acceso UniProt C7BEA8, versión 14), número de acceso UniParc UPI000198BDAE (número de acceso UniProt E8ZMW0, versión 18 o número de acceso UniProt C1IPK2, versión 20); o
• Subserotipo A6: número de acceso UniParc UPI0001B7D251 (número de acceso UniProt C9WWY7, versión 13).
• Subserotipo A7: número de acceso UniParc UPI000290B995 (número de acceso UniProt K4LN57).
• Subserotipo A8: número de acceso UniParc UPI000559A469 (número de acceso UniProt A0A0A7PDB7); número de acceso UniParc UPI0003C9D2A1 (número de acceso UniProt V5N8R1).
La proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender una secuencia de polipéptidos que es un homólogo o derivado que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con una de las secuencias de polipéptidos de BoNT/A mencionadas anteriormente.
En un aspecto, la cadena polipeptídica de dicha proteína monocatenaria BoNT/A comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14. En un aspecto más particular, la cadena polipeptídica de dicha proteína monocatenaria BoNT/A comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14 y en la que el segundo polipéptido es escindido C-terminal a un residuo de aminoácido básico dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SeQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14. Dichas secuencias representan secuencias de aminoácidos de sustratos conocidos de la proteína monocatenaria BoNT/A de la presente invención. Las proteínas monocatenarias BoNT/A se escinden en el extremo C-terminal a un residuo de aminoácido básico contenido en la secuencia, comparar la Tabla 1, columna LC y Hn. En un aspecto preferido, dicha proteína monocatenaria BoNT/A comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2 a 7 y 13-14 (por ejemplo, serotipo BoNT/A1, SEQ ID NO: 2).
La proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender un derivado de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14, o de la SEQ ID NO: 1, o una de las secuencias de polipéptidos correspondientes a los números de acceso identificado en el presente documento, en donde dicho derivado tiene una o más mutaciones puntuales y/o uno o más residuos de aminoácidos adicionales. En otro aspecto, dicho derivado tiene hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 15 mutaciones puntuales. Al usar el ensayo de actividad para determinar la actividad de la proteasa, como se describe aquí, la persona experta puede determinar si un derivado dado es procesado por Lys-C.
El derivado puede contener una mutación puntual que cambia un residuo de aminoácido básico en un residuo de aminoácido no básico. El derivado puede tener al menos un 50% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14, SEQ ID NO: 1, o una de las secuencias de polipéptidos correspondientes a los números de acceso identificados aquí. Dicho derivado o un polipéptido que comprende el derivado puede ser un sustrato de Lys-C y ser escindible proteolíticamente por Lys-C. Un ejemplo típico es un derivado de SEQ ID NO: 1 que comprende, por ejemplo, una o más mutaciones puntuales en la cadena ligera o pesada.
Dicha proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender (a) una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el
30% de identidad de secuencia, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al meno 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más con la secuencia de SEQ ID NO: 1 (BoNT/A de ATCC 3502, acceso a Genbank AAA23262), o con una de las secuencias de polipéptidos correspondientes a los números de acceso identificados aquí. La proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 15, o una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 30% de identidad de secuencia, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al meno 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más con la secuencia de SEQ ID NO: 15.
La expresión “identidad de secuencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a la determinación de la identidad entre una secuencia de aminoácidos de referencia y una secuencia de consulta en la que las secuencias están alineadas de modo que se obtiene la coincidencia de orden más alto, y que puede calcularse usando técnicas publicadas o métodos codificados en programas de ordenador tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215:403). Los valores de porcentaje de identidad se pueden calcular sobre la secuencia de aminoácidos completa o sobre una región de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, para la proteína BoNT/A monocatenaria, la identidad de secuencia se puede calcular sobre una longitud de secuencia de hasta 50 residuos de aminoácidos (aa), hasta 100aa, hasta 150aa, hasta 250aa, 300aa, 350aa, 400aa, 450aa, 500aa, 550aa, 600aa, 650aa, 700aa, 750aa, 800aa, 850aa, 900aa, 950aa, 1000aa, 1050aa, 1100aa, 1150aa, 1200aa, 1250aa o más residuos, hasta la proteína BoNT/A de cadena completa de longitud completa secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse sobre al menos 50aa residuos, al menos 100aa, al menos 150aa o al menos 250aa residuos.
Una serie de programas basados en una variedad de algoritmos está disponible para el experto en la técnica para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith and Waterman dan resultados particularmente confiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencia y calcular los valores de identidad de secuencia que se mencionan aquí, se utilizó el programa comercialmente disponible DNASTAR Lasergene MegAlign versión 7.1.0 basado en el algoritmo Clustal W en toda la región de secuencia con los siguientes ajustes: parámetros de alineación por pares: penalización de brecha: 10.00, penalización por longitud de espacio: 0.10, matriz de peso de proteína Gonnet 250 que, a menos que se especifique lo contrario, siempre se utilizará como configuración estándar para alineaciones de secuencia.
Al menos el 30% significa al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más hasta el 100%. La identidad de secuencia de dicha secuencia de proteína monocatenaria BoNT/A que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1 puede determinarse en base a la posición de aminoácidos 420 a 466 de la SEQ ID NO: 1, o dicha secuencia la identidad puede determinarse en función de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 7 o 13 o 14. En otras palabras, una proteína monocatenaria BoNT/A puede comprender una secuencia de polipéptidos que tiene, por ejemplo, al menos el 30% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos encontrada entre las posiciones de aminoácidos 420 a 466 de la proteína monocatenaria BoNT/A o al menos el 30% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos de cualquiera de las proteínas monocatenarias BoNT/A, incluyendo cualquiera de las secuencias de polipéptidos que corresponden a los números de acceso identificados en el presente documento. Un polipéptido de acuerdo con esta definición se puede obtener, por ejemplo, de C. botulinum, C. tetani o C. sporogenes. Dicha proteína monocatenaria BoNT/A puede ser, por ejemplo, una neurotoxina natural o un derivado de la misma que comprende una o más mutaciones de aminoácidos tales como la adición, sustitución, deleción o truncamiento de uno o más residuos de aminoácidos. Están abarcados, por ejemplo, los derivados que carecen, por ejemplo, del dominio nativo de neurotoxina Hc o partes del mismo o derivados con otros residuos de aminoácidos que reemplazan el dominio de neurotoxina Hc, así como derivados con una cadena ligera adicional u otra molécula de carga proteica fusionada en forma N-terminal a la cadena ligera de BoNT.
La proteína monocatenaria BoNT/A puede contener residuos de aminoácidos adicionales en el término No C o en una posición interna. Los residuos de aminoácidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o más sitios de escisión de proteasa. La secuencia de aminoácidos adicional puede funcionar como una marca detectable y/o permite la unión a un soporte sólido. Un ejemplo es una marca His o una marca GST. Otro ejemplo es la secuencia de aminoácidos VPPTPGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 12) que contiene el Streptag, preferiblemente agregado al término C.
En otro aspecto, la actividad biológica de dicha proteína monocatenaria BoNT/A puede ser modulada por la escisión proteolítica. Los expertos en la técnica saben bien que la función de muchos polipéptidos puede modularse mediante procesamiento proteolítico. “Modulada” como se usa en el presente documento significa aumentada o disminuida, activada o inactivada. Por ejemplo, la actividad biológica de muchas neurotoxinas clostridiales aumenta o se desencadena al procesar proteolíticamente una neurotoxina monocatenaria en una neurotoxina bicatenaria, en donde la neurotoxina bicatenaria está compuesta por una cadena de polipéptidos ligera y pesada, que están unidas covalentemente a través de un puente disulfuro. La actividad biológica de la neurotoxina abarca al menos tres actividades separadas: la primera actividad es una “actividad proteolítica que reside en la cadena ligera de la neurotoxina y es responsable de hidrolizar el enlace peptídico de uno o más polipéptidos implicados en la regulación de la fusión de la membrana celular. Una segunda actividad es una “actividad de translocación”, que reside en el extremo N-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada y está implicada en el transporte de la cadena ligera a través de la membrana lisosómica y dentro del citoplasma. Una tercera actividad es una “actividad de unión al receptor”, que reside en el extremo C-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada e implica en la unión y la captación de la neurotoxina a una célula diana. En un aspecto preferido, la expresión “actividad biológica” como se usa en el presente documento significa actividad proteolítica. En un aspecto más preferido, la expresión significa actividad proteolítica incrementada.
La actividad biológica de la neurotoxina clostridial se puede medir mediante varias pruebas, todas las cuales son conocidas por el experto en la técnica. Estas pruebas permiten determinar una o más de las actividades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el ensayo LD50 de ratón o el ensayo ex vivo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón (MPN) según lo descrito por Pearce et al., 1994 (Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994), Toxicol Appl Pharmacol 128:69-77) y Habermann et al., 1980 (Habermann E, Dreyer F, Bigalke H. (1980), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 311:33-40) permiten determinar el efecto tóxico de una preparación de neurotoxina dada en un organismo vivo o una preparación neuromuscular aislada. Para establecer el efecto tóxico en un ensayo de LD50, la neurotoxina debe ser biológicamente activa en cada una de las tres actividades mencionadas anteriormente. Además, hay otros ensayos disponibles que permiten, por ejemplo, para determinar si una neurotoxina o la cadena ligera de la neurotoxina es proteolíticamente activa. Dichos ensayos se basan, por ejemplo, en poner en contacto BoNT/A con SNAP-25. Alternativamente, puede usarse un péptido que representa el sitio de escisión de SNAP-25, en el que el péptido puede marcarse para facilitar la detección. En un aspecto preferido, la actividad biológica se determina usando el ensayo de MPN descrito anteriormente en el presente documento.
Una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína monocatenaria BoNT/A puede usarse de acuerdo con la presente invención. Dicha molécula de ácido nucleico puede comprender opcionalmente elementos reguladores. La expresión “elementos reguladores”, como se usa en el presente documento, se refiere a elementos reguladores de la expresión génica, que incluyen la transcripción y la traducción, e incluye elementos tales como caja TATA, promotor, potenciador, sitio de unión a ribosomas, secuencia de Shine-Dalgarno, región IRES, señal de poliadenilación, estructura de límite terminal, y similares. Dicho elemento regulador puede comprender uno o más elementos reguladores heterólogos o uno o más elementos reguladores homólogos. Un “elemento regulador homólogo” es un elemento regulador de una célula de tipo salvaje, de la que se deriva la molécula de ácido nucleico, que está implicada en la regulación de la expresión génica de la molécula de ácido nucleico o el polipéptido en dicha célula de tipo salvaje. Un “elemento regulador heterólogo” es un elemento regulador que no está implicado en la regulación de la expresión génica de la molécula de ácido nucleico o el polipéptido en dicha célula de tipo salvaje. También se pueden usar elementos reguladores para la expresión inducible, tales como promotores inducibles.
La molécula de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, hnARN, ARNm, ARN, ADN, PNA, LNA y/o moléculas de ácido nucleico modificadas. La molécula de ácido nucleico puede ser circular, lineal, integrada en un genoma o episomal. También se incluyen los concatémeros que codifican proteínas de fusión que comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos. Además, la molécula de ácido nucleico puede contener secuencias que codifican secuencias de señal para el transporte intracelular, tales como señales para el transporte a un compartimento intracelular o para el transporte a través de la membrana celular.
Según la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica BoNT/A puede diseñarse para proporcionar ventajosamente altos niveles de expresión en las células huésped, en particular células huésped bacterianas, preferiblemente células E. coli. Los métodos para diseñar moléculas de ácido nuclei
de proteínas en células huésped, en particular células huésped bacterianas, preferiblemente células E. coli, se conocen en la técnica e incluyen la disminución de la frecuencia (número de ocurrencias) de “codones lentos” en la secuencia de ácidos nucleicos codificante.
En un aspecto, se produce una proteína BoNT/A monocatenaria usando un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína BoNT/A monocatenaria. Un vector puede ser adecuado para la expresión in vitro y/o in vivo de dicha proteína BoNT/A monocatenaria. El vector puede ser un vector para expresión génica transitoria y/o estable. El vector puede comprender adicionalmente elementos reguladores y/o marcadores de selección. Dicho vector puede ser de origen viral, de origen de fago o de origen bacteriano. Por ejemplo, dicho vector de expresión puede ser un vector pET-26b(+).
Una molécula de ácido nucleico o un vector de expresión que codifica una proteína monocatenaria BoNT/A puede estar comprendida en una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector de la presente invención. La expresión “célula huésped”, como se usa en el presente documento, abarca células procariotas y/o eucariotas adecuadas para traducir dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector y en particular la proteína monocatenaria BoNT/A. Dicha célula huésped puede ser una célula huésped que no expresa la proteína monocatenaria BoNT/A o un homólogo de la misma. El término “homólogo” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia con una secuencia de BoNT/A, por ejemplo, la secuencia de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. Sin embargo, también se incluyen las células huésped, tales como células de tipo salvaje, que expresan la proteína monocatenaria BoNT/A o un homólogo de la misma. Por ejemplo, una célula huésped puede seleccionarse de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii y C. tetani, como C. botulinum de serotipo A, B o F. La célula huésped puede ser la cepa Hall (ATCC 3502) de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A ATCC 19397, también conocida como NCTC 4587 y NCTC 7272 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A NCTC 2916 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A2 Kyoto-F o Mauritius/NCTC 9837 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A3 a 254 Loch Maree/NCTC 2012 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A4 y B c Dc657 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/A5 y B3' H04402 065 de de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/BI Okra/NCTC 7273 de C. botulinum; la cepa productora de BoNT/B y F CDC4013/NCTC 12265 de C. botulinum; o la cepa productora de BoNT/F1 Langeland/NCTC 10281 de C. botulinum. Dicha célula huésped puede ser Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoidis, B. thermoproteolyticus, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli o una célula de levadura. Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped de E. coli, particularmente una célula BL21 (DE3) o BLR (DE3) de E. coli.
En un aspecto, la proteína monocatenaria BoNT/A se modifica dentro de la célula huésped (es decir, se glicosila, se fosforila, se procesa por proteasas, etc.). La modificación también incluye la adición de cofactores no proteináceos que incluyen iones metálicos. La célula huésped puede comprender un inductor de expresión de la proteína monocatenaria BoNT/A. Tal inductor de expresión puede ser una molécula de ácido nucleico o un polipéptido o una entidad química, que incluye una pequeña entidad química, que tiene el efecto de aumentar la cantidad de la proteína monocatenaria BoNT/A en cultivos de células huésped o lisados de los mismos. El inductor de expresión puede aumentar, por ejemplo, la transcripción o traducción de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína monocatenaria BoNt/A. El inductor puede expresarse, por ejemplo, por medios recombinantes conocidos por el experto en la técnica. Alternativamente, el inductor puede aislarse de una célula, por ejemplo, una célula clostridial.
Se puede producir una proteína BoNT/A monocatenaria mediante un método que comprende introducir un vector de expresión como se describe aquí y expresar dicha proteína BoNT/A monocatenaria en dicha célula huésped. Se puede producir una proteína BoNT/A monocatenaria proporcionando una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica dicha proteína BoNT/A monocatenaria y que expresa dicha proteína BoNT/A monocatenaria en dicha célula huésped. Típicamente, la célula huésped es una célula bacteriana, preferiblemente una célula de E. coli. La célula huésped de E. coli puede ser una célula BL21 (DE3) o BLR (DE3) de E. coli.
Preferiblemente, la proteína monocatenaria BoNT/A se traduce en una célula. La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En un aspecto, la celda se selecciona entre E. coli, B. subtilis o levadura; E. coli es una célula huésped altamente preferida. La presente invención también abarca la traducción de la proteína monocatenaria BoNT/A en una célula de tipo salvaje, es decir, una célula aislada de la naturaleza, como cualquier aislado conocido de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii y Clostridium tetani. Cualquier célula huésped adecuada como se describe en el presente documento puede usarse de acuerdo con la presente invención.
Varios expertos y métodos estándar están disponibles para la persona experta para llevar una molécula de ácido nucleico o un vector a una célula huésped y para expresar la proteína monocatenaria BoNT/A como proteína recombinante en una célula. Además, la persona experta conoce muchas técnicas estándar para extraer proteínas y polipéptidos de células o lisados celulares (por ejemplo, Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Cualquiera de estos medios y métodos puede usarse en los métodos de la presente invención.
Los métodos típicos para extraer las proteínas de una célula huésped o lisado de la célula huésped incluyen centrifugación (clarificación) de lisado celular, precipitación de proteínas con sulfato de amonio, resuspensión de proteínas, centrifugación de proteínas resuspendidas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, hidrofóbico cromatografía de interacción, y similares. Según la presente invención, pueden ser útiles varias combinaciones de tales etapas, en orden diferente, para purificar la proteína monocatenaria BoNT/A. Como se describe con más detalle a continuación, la proteína monocatenaria BoNT/A puede ponerse en contacto con Lys-C para producir la cadena doble de BoNT/A activa. Los inventores han desarrollado ahora un método ventajoso para purificar la cadena doble de BoNT/A a partir de la mezcla de reacción de BoNT/A y Lys-C.
Endoproteinasa Lys-C
Como se describe en el presente documento, una proteína BoNT/A monocatenaria se escinde para formar la forma bicatenaria activa de la proteína BoNT/A usando endoproteinasa Lys-C (Lys-C). El término “Lys-C” se refiere a la serina endoproteinasa Lys-C de 33 kDa de Lysobacter enzymogenes (lisil endopeptidasa, LeK, acceso a Genbank Q7M135) que escinde específicamente los enlaces peptídicos en forma C-terminal a lisina o un homólogo de la misma con al menos el 50% de identidad de secuencia. En una realización, el homólogo del mismo que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con Lys-C conserva la funcionalidad (es decir, la actividad proteolítica) de Lys-C.
De acuerdo con la presente invención, la enzima Lys-C es un polipéptido proteolíticamente activo que puede comprender o consistir en una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8. En un aspecto, la enzima Lys-C utilizada según la presente invención es un polipéptido proteolíticamente activo que consiste en una secuencia de polipéptidos como se muestra en la SEQ ID NO: 8.
Típicamente, los homólogos de Lys-C son capaces de hidrolizar una neurotoxina botulínica monocatenaria (por ejemplo, serotipo A (BoNT/A)) para producir la neurotoxina botulínica bicatenaria (por ejemplo, serotipo A (BoNT/A)). En una realización, el término “Lys-C” también abarca proteasas funcionalmente equivalentes, tales como aquellas proteasas que reconocen la misma secuencia de escisión que Lys-C e hidrolizan en el lado carboxilo de Lys. El término también abarca los homólogos de dicha proteasa que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia. La expresión “polipéptido proteolíticamente activo”, como se usa en el presente documento, se refiere a la función catalítica del polipéptido y significa que el polipéptido es capaz de hidrolizar un enlace peptídico. En un aspecto, “polipéptido proteolíticamente activo” se refiere a un polipéptido que es capaz de hidrolizar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 7.
La expresión “polipéptido inactivo proteolíticamente”, como se usa en el presente documento, se refiere a la función catalítica del polipéptido y significa que el polipéptido es incapaz de hidrolizar un enlace peptídico.
Un experto en la técnica puede determinar si un polipéptido Lys-C de acuerdo con la definición de secuencia mencionada aquí es un polipéptido para usar de acuerdo con la presente invención, probando la actividad proteolítica de dicho polipéptido. Un sistema de ensayo o prueba para determinar la actividad proteolítica comprende poner en contacto un polipéptido Lys-C que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de s Eq ID NO: 8 con un sustrato de prueba.
Un sustrato de prueba es típicamente un polipéptido que se sabe que es escindible por Lys-C. Preferiblemente, el sustrato de prueba es una neurotoxina clostridial (CNT), tal como BoNT o un fragmento de la misma. El sustrato de prueba puede ser, por ejemplo, BoNT sin cortar/sin procesar, designado aquí como BoNT monocatenaria (scBoNT) y puede ser, por ejemplo, del serotipo A, B, C1, D, E, F o G (por ejemplo, scBoNT/A, scBoNT/B, etc.) o el sustrato de prueba puede ser neurotoxina tetánica (TNT). Alternativamente, el sustrato de prueba puede ser un fragmento de neurotoxina clostridial, donde dicho fragmento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 7. El fragmento puede ser un polipéptido de 50 o más residuos de aminoácidos o un péptido de hasta 49 residuos de aminoácidos. Como se usa en toda la presente memoria descriptiva, el término “polipéptido” se refiere a moléculas con 50 o más residuos de aminoácidos, mientras que el término “péptido” se refiere a moléculas con 2 a 49 residuos de aminoácidos
El sustrato de prueba puede ser un fragmento de neurotoxina soluble llamado LHn que comprende el polipéptido de cadena ligera, la región peptídica del bucle expuesta y la mitad N-terminal del polipéptido de cadena pesada, el dominio de translocación Hn. El sustrato de prueba puede ser o comprender un péptido seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 8 (véase la Tabla 1). El sustrato de prueba puede ser una neurotoxina quimérica que comprende residuos de aminoácidos derivados de dos o más serotipos.
Un ensayo para determinar la actividad proteolítica de una enzima Lys-C, un homólogo o un derivado de la misma comprende típicamente una etapa de determinar el grado de conversión del sustrato de prueba en su(s) producto(s) de escisión. La observación de uno o más productos de escisión generados después de poner en contacto el polipéptido con el sustrato de prueba o la observación de un aumento en la cantidad de producto(s) de escisión es indicativo de actividad proteolítica del polipéptido. Dicha etapa de determinación puede implicar comparar sustrato y producto(s) de escisión. Dicha comparación puede implicar determinar la cantidad de sustrato y/o la cantidad de uno o más productos de escisión y también puede implicar calcular la proporción de sustrato y producto(s) de escisión. Además, el ensayo para determinar la actividad proteolítica puede comprender una etapa de comparación de una muestra de prueba con una muestra de referencia, en donde la muestra de referencia típicamente comprende (a) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8 y que se sabe que es proteolíticamente activo y (b) un sustrato de prueba que se separa por el polipéptido de (a).
El ensayo para determinar la actividad proteolítica puede comprender la separación del sustrato (por ejemplo, proteína monocatenaria BoNT/A) y el producto o los productos de escisión (por ejemplo, doble cadena de BoNT/A activa) por electroforesis o por cromatografía en columna y, opcionalmente, un análisis espectrométrico. Puede ser conveniente etiquetar el sustrato de prueba con una o más etiquetas para detectar más fácilmente la disminución del sustrato de prueba y/o el aumento de los productos. El término “etiqueta”, como se usa en el presente documento, significa un marcador detectable e incluye, por ejemplo, una etiqueta radiactiva, un anticuerpo y/o una etiqueta fluorescente. La cantidad de sustrato de prueba y/o producto de escisión puede determinarse, por ejemplo, por métodos de autorradiografía o espectrometría, incluidos los métodos basados en la transferencia de resonancia de energía entre al menos dos etiquetas. Alternativamente, se pueden usar métodos inmunológicos tales como transferencia Western o ELISA para la detección.
En un aspecto preferido, un polipéptido es proteolíticamente activo, si más del 20%, preferiblemente más del 95% del sustrato de prueba se convierte en los productos de escisión como la cadena ligera y la cadena pesada en 120 minutos a 37 °C usando un tampón seleccionado de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 o PBS (Na2HPO450 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4). Se aplican las mismas condiciones, si el sustrato de prueba no es BoNT/A de longitud completa, sino que, por ejemplo, es un fragmento de BoNT/A de longitud completa o un derivado de BoNT/A. Es evidente que los productos de escisión serán diferentes en este caso. Sin embargo, el experto puede cuantificar los productos de escisión correspondientes.
Típicamente, se usan 100 ng de polipéptido Lys-C proteolíticamente activo y una relación molar de 1:100 con respecto al sustrato en el ensayo.
Se puede tomar una muestra a intervalos para seguir la actividad catalítica a lo largo del tiempo.
El ensayo puede modificarse, por ejemplo, mediante el uso de múltiples cantidades del polipéptido Lys-C proteolíticamente activo.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de polipéptidos de un polipéptido inactivo proteolíticamente derivado de una cepa de Clostridium botulinum ATCC 3502, número de acceso de GenBank: CAL82988.1, que tiene una longitud de aminoácidos de 581 residuos. La SEQ ID NO: 8 muestra un derivado proteolíticamente activo de la SEQ ID NO: 9, que carece de los residuos de aminoácidos 1 a 248 de la SEQ ID NO: 9.
La expresión “polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8” se refiere a un polipéptido que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8 Además, la expresión se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8. Dicho polipéptido puede tener aminoácidos adicionales, por ejemplo, en una posición interna o en el término No C de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8 o en una posición interna o en el término N o C a una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 8, en donde una metionina puede estar presente en el término N del polipéptido. Además, la expresión se refiere a un polipéptido que carece de uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, en una posición interna o en el término N o C de la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 8 o en una posición interna o en el término N o C de una secuencia que es al menos un 50% idéntica en secuencia a la SEQ ID NO: 8. La expresión “identidad de secuencia” y los medios para calcular la identidad de secuencia se definen aquí en relación con BoNT/A, y las mismas definiciones y medios también se aplican al análisis de Lys-C.
Típicamente, la identidad de secuencia de la enzima Lys-C se determina en toda la longitud de la SEQ ID NO: 8 o 9, es decir, a lo largo de 333aa o 581aa, respectivamente. La expresión “al menos un 50% de identidad de secuencia” como se usa en el presente documento significa al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% de identidad de secuencia.
El polipéptido Lys-C proteolíticamente activo puede tener el mismo número de aminoácidos que la secuencia de polipéptidos de referencia que se muestra en la SEQ ID NO: 8. Alternativamente, el polipéptido puede tener residuos de aminoácidos adicionales o menos residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido proteolíticamente activo de la presente invención puede consistir o comprender un mutante de truncamiento de la SEQ ID NO: 8 o 9 o de un polipéptido que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 8 o 9. El mutante de truncamiento de la SEQ ID NO: 9 puede carecer, por ejemplo, de uno o más residuos de aminoácidos N-terminales a la posición de aminoácido 249. Un mutante de truncamiento puede ser un mutante de truncamiento N-o-C-terminal y/o un mutante de truncamiento interno que es proteolíticamente activo. El mutante de truncamiento de la SEQ ID NO: 9 puede carecer de las posiciones de aminoácidos 1 a 248 de la SEQ ID NO: 9. Alternativamente, el mutante de truncamiento de la SEQ ID NO: 9 puede ser un mutante de truncamiento C-terminal. El mutante de truncamiento puede carecer de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150 o hasta 170 residuos de aminoácidos consecutivos. El polipéptido proteolíticamente activo puede tener una longitud de aminoácido de al menos 200 residuos de aminoácidos (aa), de al menos 250 residuos aa, de al menos 300 residuos aa o de al menos 333 residuos aa. Alternativamente, el polipéptido proteolíticamente activo puede tener hasta 333 residuos aa, hasta 350 residuos aa, hasta 573 residuos aa, hasta 581 residuos aa, hasta 592 residuos aa, hasta 600 residuos aa o hasta 617 residuos aa.
El polipéptido proteolíticamente activo puede abarcar un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos adicionales en el término N o C y/o en una posición interna de la cadena de polipéptidos de la SEQ ID NO: 8 o de una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8. Estos residuos de aminoácidos adicionales pueden comprender hasta 5, hasta 10 o incluso hasta 200, 300 o hasta 400 residuos de aminoácidos consecutivos. Los residuos de aminoácidos adicionales pueden funcionar como un inhibidor de la actividad proteolítica. Estos residuos de aminoácidos adicionales pueden eliminarse mediante una proteasa. Alternativamente, se excluyen residuos adicionales que inhiben la actividad proteolítica del polipéptido. Los residuos de aminoácidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o más sitios de escisión de proteasa. En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos adicional funciona como una etiqueta detectable y/o permite la unión a un soporte sólido.
En otro aspecto, la cadena de polipéptidos de la SEQ ID NO: 8 o una de una secuencia de polipéptidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8 se modifica intercambiando uno o más residuos de aminoácidos. El término “intercambio”, como se usa en el presente documento, significa reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente. Por ejemplo, pueden reemplazarse hasta 1 aminoácido (aa), 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 15 aa, 20 aa o hasta 50 aa dentro de la secuencia de polipéptidos. Los intercambios pueden implicar cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores, con el objetivo, por ejemplo, al aumentar o disminuir la unión del sustrato o la actividad proteolítica del polipéptido.
Típicamente, el polipéptido proteolíticamente activo abarca un polipéptido que es capaz de hidrolizar un sustrato (por ejemplo, proteína BoNT/A monocatenaria) en dos o más productos de escisión nativos. El polipéptido de la presente invención puede hidrolizar el sustrato en dos o más productos de escisión que son iguales o diferentes de los productos de escisión nativos. Preferiblemente, los productos de escisión son los mismos que los productos de escisión nativos.
La expresión “productos de escisión nativos” o “productos nativos”, como se usa en el presente documento, se refiere a productos que son idénticos en la secuencia de aminoácidos en comparación con los productos generados a partir del mismo sustrato en cultivos de células de tipo salvaje, a partir de los cuales se origina el sustrato. En una realización preferida, el producto de escisión es la neurotoxina bicatenaria de una neurotoxina botulínica o de neurotoxina tetánica. En una realización más preferida, la neurotoxina de bicatenaria es una neurotoxina aislada de C. botulinum de serotipo A, B, C1, D, E, F o G. En otro aspecto más, dicha neurotoxina de bicatenaria es una neurotoxina BoNT/A bicatenaria nativa.
Debe entenderse que las definiciones y explicaciones de los términos hechos arriba y abajo se aplican mutatis mutandis para todos los aspectos descritos en esta especificación a menos que se indique lo contrario.
Métodos de producción de BoNT
La presente invención se refiere al uso de Lys-C en un método para procesar proteolíticamente un polipéptido, específicamente una proteína monocatenaria BoNT/A, y un medio para purificar la doble cadena de BoNT/A activa producida a partir de Lys-C utilizando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una doble cadena de BoNT/A activa, que comprende la etapa de poner en contacto: (a) Lys-C con (b) una proteína monocatenaria BoNT/A, donde dicha proteína monocatenaria BoNT/A es susceptible a la proteólisis por Lys-C, en donde dicho contacto da como resultado el procesamiento proteolítico de dicha proteína monocatenaria BoNT/A en al menos dos productos de escisión, preferiblemente incluyendo la doble cadena de BoNT/A activa, y purificar dicha doble cadena activa usando HIC. El método de la invención puede usarse para fabricar neurotoxina clostridial procesada proteolíticamente (CNT) o neurotoxina botulínica (BoNT), específicamente BoNT/A procesada proteolíticamente, es decir, la doble cadena activa de BoNT/A, como se describe en el presente documento. Usando el método de la presente invención, ahora es posible obtener composiciones activas bicatenarias de BoNT/A con una contaminación significativamente menor por BoNT/A sin procesar o parcialmente procesada, ya que esos contaminantes se procesan eficientemente en BoNT/A bicatenaria. Los métodos de la presente invención también permiten la eliminación efectiva de la enzima Lys-C utilizada para procesar la proteína BoNT/A monocatenaria en la doble cadena activa, es decir, una purificación mejorada de la doble cadena de BoNT/A activa.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a la purificación (resolución) de la doble cadena de BoNT/A de Lys-C que comprende la separación por cromatografía de interacción hidrófoba. Por consiguiente, la invención proporciona un método para producir una proteína BoNT/A bicatenaria, que comprende proporcionar una proteína BoNT/A monocatenaria, poner en contacto dicha proteína BoNT/A con endoproteinasa Lys-C en solución y separar la proteína BoNT/A de Lys-C poniendo en contacto la solución que contiene la proteína BoNT/A y Lys-C con una superficie hidrófoba, en donde la proteína BoNT/A se une preferiblemente a la superficie hidrófoba. Típicamente, poner en contacto la proteína BoNT/A monocatenaria con Lys-C da como resultado la escisión de la proteína BoNT/A monocatenaria en una forma bicatenaria soluble. Preferiblemente, el producto de escisión de la proteína BoNT/A monocatenaria por Lys-C es el mismo que el producto de escisión de BoNT/A nativa. Típicamente, las formas tanto monocatenaria como bicatenaria de BoNT/A son solubles.
Una o más fracciones recogidas de una columna de cromatografía pueden concentrarse, por ejemplo, por precipitación o ultrafiltración.
En una realización, en la que la invención proporciona un método (como se describió anteriormente) para producir la proteína BoNT/A bicatenaria soluble, la proteína BoNT/A monocatenaria soluble se proporciona mediante un método como se describió anteriormente para producir la proteína BoNT/A monocatenaria soluble en una célula huésped, preferiblemente una célula huésped bacteriana, con máxima preferencia, una célula huésped de E. coli.
Se puede usar cualquier sistema de expresión adecuado para producir la proteína BoNT/A monocatenaria soluble. Un sistema de expresión según la presente invención puede ser un sistema de expresión in vivo o in vitro (libre de células). En la técnica se conocen ejemplos de sistemas de expresión in vivo e in vitro adecuados. Como se define en el presente documento, un sistema de expresión puede comprender una célula huésped adecuada y/o un vector de expresión adecuado para su uso en dicha célula huésped. Por ejemplo, un sistema de expresión adecuado puede comprender una célula huésped bacteriana y/o un vector de expresión adecuado para expresar la proteína BoNT/A monocatenaria soluble en dicha célula huésped bacteriana.
La proteína BoNT/A monocatenaria se puede producir en cualquier célula huésped adecuada como se describe en este documento, tal como una célula bacteriana. Típicamente, se usa una célula huésped de Escherichia coli (E. coli). La proteína BoNT/A monocatenaria puede producirse mediante un método que comprende: expresar una secuencia de ácido nucleico en un sistema de expresión de célula huésped (por ejemplo, una célula de E. coli). Dicha expresión puede implicar la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína BoNT/A monocatenaria en dicha célula huésped, y traducir dicha molécula de ácido nucleico para producir proteína BoNT/A monocatenaria. Métodos y técnicas utilizados para expresar proteínas heterólogas en sistemas de expresión, incluyendo sistemas de expresión de E. coli, son bien conocidos en la técnica.
Típicamente, dicha proteína BoNT/A monocatenaria soluble se expresa en el citoplasma de dicha célula huésped de E. coli.
La proteína BoNT/A monocatenaria soluble puede expresarse en un nivel (concentración) de al menos 5 mg/L (por ejemplo, al menos 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 mg/L, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml o más). Típicamente, el nivel de expresión de la proteína BoNT/A monocatenaria se refiere al nivel de BoNT/A monocatenaria en un cultivo celular. En una realización, dicho nivel de expresión se refiere al homogeneizado de la célula huésped cruda (por ejemplo, célula huésped bacteriana), es decir, un homogeneizado bruto de las células huésped (por ejemplo, células huésped bacterianas) usado para expresar la proteína BoNT/A monocatenaria. Por lo tanto, en una realización, el nivel de expresión de la proteína BoNT/A monocatenaria en el homogeneizado de la célula huésped cruda, por ejemplo, el homogeneizado de la célula huésped bacteriana cruda es de al menos 5 mg/L (como se define en el presente documento).
El método para producir la proteína BoNT/A monocatenaria soluble, como se describió anteriormente, puede comprender la lisis de la célula huésped, preferiblemente una célula huésped bacteriana, con máxima preferencia, una célula huésped de E. coli para proporcionar un homogeneizado de la célula huésped, más preferiblemente un homogeneizado de la célula huésped bacteriana, con máxima preferencia, un homogeneizado de la célula huésped de E. coli que contiene dicha proteína BoNT/A monocatenaria soluble. Métodos y técnicas utilizados para lisar células huésped, tales como células bacterianas, particularmente células huésped de E. coli son conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen ultrasonido o el uso de una prensa francesa.
La purificación de C. botulinum o proteína monocatenaria BoNT/A expresada en E. coli se puede hacer, por ejemplo, como se describe esencialmente en la técnica anterior (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461). En particular, la purificación de la neurotoxina puede contener una o más etapas de precipitación y extracción, una o más etapas de concentración y otras etapas cromatográficas distintas. La BoNT/A monocatenaria recombinante y su purificación se describen en la técnica anterior (Rummel et al., 2004, Mol Microbiol. 51:631-43).
La célula huésped bacteriana utilizada para producir la proteína monocatenaria BoNT/A, o un derivado de la misma, puede ser C. botulinum o E. coli. Para la fermentación, se puede utilizar el proceso descrito por DasGupta B. R. et al. en Toxicon, vol. 22, n.° 3, pág. 414 a 424, 1984. Por lo tanto, se agrega 0,5% de extracto de levadura y 0,6% de pasta de levadura autoclavada al 2% del medio N-Zamina tipo A, y se ajustará un pH de 7,2 con la ayuda de NaOH 4 M, y el medio preparado de tal manera luego se autoclavará. A este medio se le puede agregar glucosa autoclavada por separado (20% en peso por volumen), para llegar a una concentración final de glucosa del 0,5% en el medio. La incubación puede ocurrir, por ejemplo, a 37 °C sin agitación, en donde la fermentación se interrumpe, por ejemplo, después de 96 horas. Se puede usar fermentación discontinua, fermentación semicontinua, fermentación por lotes repetidos o fermentación continua.
Después de la fermentación real y la separación del medio de fermentación de las células, el medio de fermentación puede experimentar una primera precipitación con el objetivo de eliminar proteínas grandes. La precipitación es preferiblemente una precipitación ácida. Las condiciones de reacción para tal precipitación ácida son conocidas por los expertos en la técnica. Típicamente, se puede usar H2SO4 1,5 M para acidificar el sobrenadante a un pH de 3,5. La centrifugación generalmente ocurre durante 20 minutos a 2400x ga 4 °C. El pellet recibido por centrifugación puede lavarse con agua, preferiblemente en forma repetida. Posteriormente, el pellet se puede extraer con un tampón de citrato trisódico de ácido cítrico 0,1 M, pH 5,5, por ejemplo, por una hora. Posteriormente, se puede realizar una etapa de centrifugación adicional, por ejemplo, a 9800x g durante 20 minutos a 4 °C. El pellet así obtenido opcionalmente se puede extraer otra vez como se describió con anterioridad. El sobrenadante de la extracción, y ambos sobrenadantes en caso de repetición de la extracción, pueden someterse a precipitación con sulfato de protamina. La precipitación puede continuar durante la noche, por ejemplo, a 8 °C. Posteriormente, el precipitado se puede centrifugar, por ejemplo, durante 20 minutos a 4 °C y a 12000xg. El sobrenadante de centrifugación puede estar sujeto a una precipitación tal como una precipitación con sulfato de amonio, por lo que se pueden eliminar otras proteínas más grandes. Después de la etapa de precipitación con sulfato de amonio, puede agregarse otra etapa de centrifugación y, posteriormente, el pellet así obtenido puede redisolverse y, opcionalmente, someterse a diálisis. El extracto que preferiblemente se dializa y centrifuga nuevamente, puede someterse a una sucesión de etapas de cromatografía con el objetivo de purificar la neurotoxina. Cada una de las etapas de la cromatografía sirve para eliminar contaminantes como el sulfato de protamina, el ADN restante, partes de proteínas más pequeñas y proteínas de tamaño mediano, así como las hemaglutininas del complejo proteico de la neurotoxina botulínica. Para este propósito, se pueden usar una o más etapas de cromatografía en una realización preferida. Opcionalmente, el eluato de, por ejemplo, la última etapa de cromatografía puede filtrarse para eliminar microorganismos. Opcionalmente, el eluato se puede diluir antes de la filtración y se pueden agregar adyuvantes adecuados. Durante las etapas posteriores, se puede llevar a cabo otra filtración estéril después de la adición de los adyuvantes. En un aspecto, la filtración se lleva a cabo en recipientes de reacción que luego pueden estar sujetos a una etapa de liofilización.
La proteína monocatenaria BoNT/A puede ponerse en contacto con Lys-C después de que se haya aislado de la célula huésped o del lisado de la célula huésped y luego se haya sometido al método de la presente invención. Cuando la proteína BoNT/A monocatenaria de la invención se pone en contacto con Lys-C, la acción proteolítica de Lys-C escinde la proteína monocatenaria en un sitio entre el componente de proteasa de cadena L y el componente de translocación para producir una proteína bicatenaria, donde las dos cadenas están unidas por un puente disulfuro. Por ejemplo, las dos cadenas formadas después de la escisión de BoNT/A1, A2 y A4-A6 monocatenaria en el sitio de activación son una primera cadena de residuos de aminoácidos 1-438 y una segunda cadena de residuos de aminoácidos 449-1296 (excepto en A6, en donde la segunda cadena tiene residuos de aminoácidos 449-1297), con los residuos 439447 eliminados por el evento de escisión. Las dos cadenas formadas después de la escisión de BoNT/A3 monocatenaria en el sitio de activación son una primera cadena de residuos de aminoácidos 1-434 y una segunda cadena de residuos de aminoácidos 445-1292, con los residuos 435-444 eliminados por el evento de escisión. Por lo tanto, Lys-C se puede usar para activar el polipéptido monocatenario al convertirlo en la forma de cadena doble activa. Ventajosamente, por lo tanto, el uso de Lys-C significa que no es necesario diseñar un sitio de escisión exógeno (no nativo) en una BoNT/A, y también permite la producción de la doble cadena de BoNT/A nativa. En una realización, la referencia a Lys-C abarca enzimas similares a Lys-C y variantes que se escinden en el mismo sitio de escisión de proteasa que Lys-C, como se describe en el presente documento.
La expresión “poner en contacto”, como se usa en el presente documento, se refiere a poner al menos dos compuestos diferentes en proximidad física para permitir la interacción física y/o química de dichos compuestos. De acuerdo con el método de esta invención, dichos dos compuestos diferentes son una proteína monocatenaria BoNT/A y Lys-C, que están comprendidos en una solución. El contacto se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo es suficiente para permitir la interacción de la proteína monocatenaria BoNT/A y Lys-C.
La expresión “ser susceptible a proteólisis” se refiere a una característica o requisito de la proteína monocatenaria BoNT/A y se usa en el presente documento, lo que significa que dicha proteína monocatenaria BoNT/A es escindible proteolíticamente por Lys-C. En otras palabras, la expresión “ser susceptible a proteólisis” significa que la proteína monocatenaria BoNT/A comprende un sitio de escisión y reconocimiento de proteasas que le permite funcionar como un sustrato de la Lys-C. Como se describe en el presente documento, la proteína monocatenaria BoNT/A es un sustrato de Lys-C y se procesa proteolíticamente en dos o más productos de escisión (preferiblemente solo dos péptidos: la cadena L o fragmento de la misma y la cadena H o fragmento de la misma unidos juntos a través de un enlace disulfuro). Usando el ensayo descrito anteriormente en el presente documento, la persona experta puede probar si una proteína monocatenaria BoNT/A dada es un sustrato del primer polipéptido y, por lo tanto, un “segundo polipéptido” según la definición de la presente invención. La expresión “al menos dos productos de escisión” incluye, por ejemplo, hasta dos, tres, cuatro, cinco y hasta seis productos de escisión.
Este método puede usarse, por ejemplo, para preparar una composición farmacéutica que comprende una doble cadena de BoNT/A o para generar fragmentos de polipéptidos usados en un método de espectrometría de masas. Lys-C y la proteína monocatenaria BoNT/A pueden ponerse en contacto en varias etapas en el proceso de producción de la doble cadena de BoNT/A. Por ejemplo, la etapa de poner en contacto Lys-C y la proteína monocatenaria BoNT/A puede estar dentro de una célula, tal como mediante la expresión de Lys-C y la proteína monocatenaria BoNT/A en dicha célula.
Alternativamente, dicha etapa de puesta en contacto está en un lisado celular o en un lisado celular purificado. Esto incluye agregar Lys-C al lisado o al lisado purificado. Lys-C se puede agregar en varias etapas durante la purificación de la proteína monocatenaria BoNT/A del lisado celular. Por ejemplo, Lys-C se puede agregar antes o después de: precipitación de proteínas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y/o cromatografía de exclusión por tamaño.
La etapa de contactar requiere la incubación en condiciones y durante un tiempo suficiente para que Lys-C escinda la proteína monocatenaria BoNT/A. Las condiciones de ejemplo pueden comprender la adición de un tampón seleccionado del grupo que consiste en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 o PBS (Na2HPO4, 150 mM, pH 7,4 mM). Las condiciones de tampón preferidas incluyen Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. El “tiempo suficiente para escindir” puede determinarse usando el ensayo descrito anteriormente en el presente documento. En un aspecto, dicho “tiempo suficiente para escindir” depende del grado de escisión que el polipéptido procesado proteolíticamente o una composición que lo comprenda debería tener. En un aspecto, el método comprende una etapa de incubación de la proteína monocatenaria BoNT/A y Lys-C durante al menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos o al menos 240 minutos. En otro aspecto, la proteína monocatenaria BoNT/A y Lys-C se incuba durante hasta 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos, 480 minutos o hasta 600 minutos. En otro aspecto, el método comprende una etapa de incubación de la proteína monocatenaria BoNT/A y Lys-C a 4 °C o a 37 °C. En otro aspecto, el método comprende una etapa de incubación de hasta 1 h, hasta 2 h, 4 h, 6 h, 10 h o hasta 16 h.
En una realización, en la que la invención proporciona un método (como se describió anteriormente) para producir proteína BoNT/A bicatenaria soluble, el método comprende separar la proteína BoNT/A soluble de la Lys-C poniendo en contacto la solución que contiene proteína BoNT/soluble y Lys-C con una superficie hidrófoba, en donde la proteína soluble BoNT/Lys-C se une preferiblemente a la superficie hidrófoba.
Los presentes inventores han encontrado que se pueden obtener altos rendimientos de la proteína BoNT/A bicatenaria activada mediante el uso de un proceso de purificación hidrófoba para separar el polipéptido bicatenario activado de Lys-C. Sorprendentemente, este proceso proporciona una purificación superior a la purificación estándar mediante cromatografía de intercambio iónico, que los presentes inventores han encontrado que es menos eficaz para separar el polipéptido bicatenario activado de Lys-C. Además, el proceso proporciona ventajosamente una proteína BoNT/A bicatenaria activada que está libre de la proteasa activadora y, por lo tanto, adecuada para su uso en terapia, como parte de un proceso de purificación general.
Como se describe en el presente documento, la producción de BoNT/A recombinante activa requiere una etapa proteolítica que escinde la molécula en la forma bicatenaria activa. Esta escisión se puede lograr mediante una etapa de activación in vitro utilizando la endoproteinasa Lys-C. Después de la etapa de activación, es importante eliminar la Lys-C del producto final, lo que también evita cualquier escisión no específica de BoNT/A.
Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, los puntos isoeléctricos calculados (pI) de Lys-C y BoNT/A son 6,70 y 6,05, respectivamente, lo que indica que la separación de las dos proteínas debe lograrse mediante cromatografía de intercambio iónico (IEX), explotando la diferencia de carga entre las dos moléculas. La carga neta de una proteína se ve afectada por el pH de su entorno y se cargará de manera más positiva o negativa dependiendo de si gana o pierde protones. El pI es el valor de pH en el que una molécula no lleva carga eléctrica y, por lo tanto, no interactuará con un medio de IEX cargado. Esto significa que si una proteína está a un pH por encima de su pI, entonces llevará una carga negativa neta y se unirá a un medio cargado positivamente, como un intercambiador de aniones. De manera similar, si el pH del tampón está por debajo de pI, la proteína llevará una carga positiva neta y no se unirá a un intercambiador de aniones.
Además, como se ilustra en la Tabla 2, BoNT/A y Lys-C tienen hidropatías medias similares, pero grandes diferencias de carga a pH 4,5 y 8,0. En base a este principio, se esperaría que la cromatografía de intercambio iónico (IEX) se pudiera usar para resolver (separar) BoNT/A y Lys-C. IEX es un método de cromatografía simple y económico, ya que no requiere que la proteína cargada en la columna esté en un tampón con alto contenido de sal, lo que puede provocar pérdidas de proteínas por precipitación.
Los presentes inventores han probado una variedad de columnas de intercambio aniónico, utilizando grupos funcionales fuertes y débiles unidos a perlas de agarosa reticuladas, a pH 8. En comparación con la elución de BoNT/A, se descubrió que, inesperadamente, Lys-C se eluyó a una fuerza iónica similar (Tabla 3; Figuras 7 a 10), lo que indica que Lys-C no se separó como se predijo y estaría presente en el producto de BoNT/A purificado final con la posibilidad adicional de una mayor degradación de BoNT/A.
Los presentes inventores han resuelto el problema anterior. Con más detalle, los inventores han identificado sorprendentemente que la separación óptima de Lys-C-BoNT/A se logra mediante el uso de una superficie de separación hidrófoba (por ejemplo, mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), que separa las proteínas de acuerdo con las diferencias en su hidrofobicidad superficial utilizando una interacción reversible entre estas proteínas y la superficie hidrófoba de una matriz de HIC /resina).
Típicamente, la cadena doble activa de BoNT/A se une preferiblemente a la superficie hidrófoba de la resina/matriz de HIC (estos términos se usan de manera indistinta en el presente documento) en comparación con la unión de Lys-C a la superficie hidrófoba. La unión “preferencial” se puede definir como una unión aumentada o mejorada de la bicatenaria de BoNT/A activa a la superficie hidrófoba en comparación con la unión de Lys-C a la superficie hidrófoba. Por ejemplo, la doble cadena de BoNT/A activa puede unirse a la superficie hidrófoba con al menos dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces o más la afinidad de Lys-C a la superficie hidrófoba. En una realización preferida, la cadena doble de BoNT/A activa se une a la superficie hidrófoba con al menos cinco veces, o al menos diez veces la afinidad de Lys-C a la superficie hidrófoba.
En una realización, la superficie hidrófoba es una matriz/resina inerte a la que se une un ligando que comprende o que consiste en grupos arilo o alquilo.
El término “arilo” se refiere a grupos aromáticos, por ejemplo fenilo, naftilo, tienilo e indolilo.
El término “alquilo” se refiere a grupos alifáticos que incluyen grupos de cadena lineal, cadena ramificada, cíclicos y combinaciones de los mismos. Un grupo alquilo puede tener de 1 a 12 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a grupos tales como metilo, etilo, propilo (por ejemplo, n-propilo, isopropilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo), pentilo, hexilo, heptilo y octilo.
En una realización, la superficie hidrófoba comprende uno o más ligandos seleccionados del grupo que consiste en: ligandos butilo, fenilo u octilo.
En una realización, la superficie hidrófoba comprende ligandos butilo. En una realización, la superficie hidrófoba comprende ligandos fenilo. En una realización, la superficie hidrófoba comprende ligandos octilo.
La superficie hidrófoba puede contener cualquier matriz/resina inerte adecuada con un ligando hidrófobo apropiado unido. Por ejemplo, la matriz/resina inerte puede seleccionarse de sílice, dextrano reticulado, poliacrilamida reticulada o agarosa reticulada, y similares. También se incluyen en particular polipéptidos, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, polietilenglicol (PEG), dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros y magnetita. La matriz inerte es, por ejemplo, una matriz de polisacárido seleccionada del grupo que consiste en: sefarosa, sephadex, agarosa, sephacell, microcelulosa y perlas de alginato. En otro aspecto, dicha matriz/resina inerte puede consistir en perlas de vidrio y/o matrices de polipéptidos.
La matriz/resina inerte puede tener cualquier configuración o disposición estructural adecuada. Por ejemplo, la matriz/resina puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la matriz puede ser irregular o plana, como una lámina o tira de prueba.
Los presentes inventores han descubierto que se obtienen resultados particularmente preferibles para separar Lys-C de BoNT/A con HIC usando matrices de cromatografía/resinas que contienen grupos alquilo o arilo, por ejemplo ligandos butilo, fenilo y octilo, acoplados a un inerte matriz/resina, como perlas de agarosa reticulada o de poliestireno (Tabla 4; Figuras 1 a 3).
El uso de HIC proporciona una resolución mejorada de Lys-C a partir de la doble cadena de BoNT/A activa en comparación con la cromatografía de intercambio iónico (IEX).
Las resinas/matrices de cromatografía HIC de “flujo rápido” pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Una resina/matriz de “flujo rápido” puede definirse como una resina/matriz con un tamaño de partícula promedio más uniforme que una resina/matriz HIC estándar y utilizará partículas más pequeñas. Específicamente, una resina/matriz de “flujo rápido” tendrá un intervalo más estrecho de tamaños de partículas más pequeños. El tamaño de partícula puede cuantificarse de cualquier manera apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, en términos de diámetro medio de partícula. Típicamente, una resina/matriz de “flujo rápido” comprenderá partículas (por ejemplo, perlas) de un diámetro promedio de menos de 100 pm, menos de 95 pm, menos de 90 pm o menos. En una realización preferida, el diámetro promedio de una resina/matriz de “flujo rápido” es inferior a 90 pm. Típicamente, la dispersión promedio de partículas de una resina/matriz de “flujo rápido” será de aproximadamente 20 a aproximadamente 180 pm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 170 pm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 170 pm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 165 pm. En una realización preferida, la dispersión media de partículas de una resina/matriz de “flujo rápido” es de aproximadamente 44 a aproximadamente 165 pm.
En una realización preferida, se usan resinas de HIC de alto rendimiento, tales como resinas de fenilo de alto rendimiento (PhHP) o de butilo de alto rendimiento (BuHP). Dichas matrices/resinas de HIC de alto rendimiento suelen proporcionar una resolución mejorada de Lys-C de la doble cadena de BoNT/A activa en comparación con la cromatografía de intercambio iónico (IEX), incluso cuando se utilizan las matrices/resinas de IEX de alto rendimiento, como la matriz/resina de amina cuaternaria de alto rendimiento (QHP). Como se analiza en el presente documento, la principal diferencia entre las resinas/matrices de alto rendimiento y otras es que el tamaño promedio de partícula (nuevamente, esto puede cuantificarse de cualquier manera apropiada conocida en la técnica, por ejemplo, el diámetro promedio de partícula) es menor (34 frente a 90 pm) y más uniforme (24-44 vs. 44-165 pm), lo que resulta en una resolución mejorada.
Una resina/matriz de HIC de alto rendimiento generalmente tiene un tamaño de partícula promedio más uniforme que una resina/matriz de HIC estándar, o incluso una resina/matriz de “flujo rápido” como se define en el presente documento y utilizará partículas más pequeñas. Específicamente, una resina/matriz de HIC de alto rendimiento tendrá un intervalo más estrecho de tamaños de partículas más pequeños que una resina/matriz de HIC estándar, o incluso una resina/matriz de “flujo rápido” como se define en el presente documento.
Por lo tanto, la invención proporciona el uso de resinas/matrices de HIC de alto rendimiento. Típicamente, una resina/matriz de HIC de alto rendimiento tiene un diámetro de partícula promedio de menos de 70 |jm, menos de 60 |jm, menos de 50 jm, menos de 40 jm, menos de 30 jm, o menos. En una realización preferida, una resina/matriz de HIC de alto rendimiento tiene un diámetro de partícula promedio de menos de 40 jm, más preferiblemente menos de 35 jm, por ejemplo, de 34 jm.
Típicamente, la dispersión promedio de partículas de una resina/matriz de HIC de alto rendimiento será de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 jm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 jm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 jm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 44 jm. En una realización preferida, la dispersión promedio de partículas de una resina/matriz de alto rendimiento es de aproximadamente 22 a aproximadamente 44 jm.
Típicamente, el proceso de purificación hidrófoba para separar la proteína BoNT/A bicatenaria activada de Lys-C reduce la concentración de Lys-C al menos dos veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces o al menos 50 veces. En una realización preferida, el proceso de purificación hidrófoba para separar la proteína BoNT/A bicatenaria activada de Lys-C reduce la concentración de Lys-C al menos 10 veces.
La capacidad de la purificación hidrófoba para separar la cadena BoNT/A bicatenaria activa de Lys-C también se puede cuantificar en términos del porcentaje de la Lys-C contenida en la solución de partida que comprende la BoNT/A bicatenaria activa y Lys-C que queda después de la etapa de purificación hidrófoba. Típicamente, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 45%, menos del 40%, menos del 35%, menos del 30%, menos del 25%, menos del 20%, menos del 19%, menos del 18%, menos del 17%, menos del 16%, menos del 15%, menos del 14%, menos del 13%, menos del 12%, menos del 11%, menos del 10%, menos del 9%, menos del 8%, menos del 7%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1% o menos, incluyendo el 0% de Lys-C queda en el producto de BoNT/A bicatenaria después de la etapa de purificación hidrófoba. Preferiblemente, menos del 50%, más preferiblemente, menos del 25%, incluso más preferiblemente menos del 10% de Lys-C queda en el producto de BoNT/A bicatenaria después de la etapa de purificación hidrófoba. Los aspectos relacionados también se describen aquí:
- una proteína BoNT/A bicatenaria activa obtenible por un método (como se describió con anterioridad) para producir proteína BoNT/A bicatenaria soluble;
- una composición que comprende una proteína BoNT/A bicatenaria activa (como se describió con anterioridad), en donde dicha composición está sustancialmente libre de Lys-C.
Por lo tanto, la composición está, de modo ventajoso, sustancialmente libre de proteasa Lys-C (utilizada para activar el polipéptido monocatenario mediante la conversión a la forma bicatenaria activa), evitando así la escisión no específica no deseada de la proteína BoNT/A.
Cuando la composición (como se describió anteriormente) está sustancialmente libre de Lys-C, la composición típicamente contiene menos de 400 picogramos (pg) de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A; por ejemplo, menos de 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 5, 4, 3, 2, 1 pg o menos de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A. En una realización, la composición (como se describió con anterioridad) contiene menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 350 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 300 pg Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 250 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 150 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 40 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 30 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A, menos de 14 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A, menos de 13 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A, menos de 12 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A proteína, menos de 11 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 10 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 9 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A proteína, menos de 8 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 7 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 6 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 5 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos. En una realización preferida, la composición (como se describió con anterioridad) contiene menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A o menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A o menos de 10 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A.
Los métodos para determinar la concentración de Lys-C en una composición son conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, la concentración de Lys-C en una composición de la invención puede determinarse usando ELISA en sándwich (Ensayo inmunosorbente ligado a enzima) o un ensayo colorimétrico como se describe en el presente documento.
Composiciones farmacéuticas e indicaciones terapéuticas
La presente solicitud también describe una composición obtenible por el método de la presente invención para la producción de una doble cadena de BoNT/A. En un aspecto, dicha composición comprende una mezcla de BoNT/A procesada (cadena doble) y no procesada (cadena simple), en donde dicha mezcla puede contener menos del 5%, 4%, 3%, 2% o menos del 1% de BoNT/A sin procesar (cadena simple). En un aspecto de dicha composición, las referencias a BoNT/A abarcan un derivado del mismo como se define en el presente documento. La composición puede ser, por ejemplo, una composición líquida o sólida y puede contener uno o más portadores, adyuvantes y/o excipientes.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método para la fabricación de un medicamento, es decir, una composición farmacéutica, que comprende las etapas del método mencionado anteriormente y la etapa adicional de formular la BoNT/A bicatenaria purificada como medicamento. Típicamente, dicho medicamento comprende una mezcla de BoNT/A procesada (cadena doble) y no procesada (cadena simple), en donde dicha mezcla contiene menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5% o menos de BoNT/A sin procesar (cadena simple). En una realización preferida, la mezcla contiene menos del 5% de BoNT/A sin procesar (cadena simple), tal como menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1% de BoNT/A sin procesar (cadena simple).
La presente solicitud también describe varios usos médicos y estéticos (cosméticos) de los compuestos y composiciones descritos en el presente documento. De acuerdo con esto, la presente solicitud describe una doble cadena de BoNT/A activa que se puede obtener mediante el método de la invención o una composición que comprende dicha doble cadena de BoNT/A activa para usar como medicamento o en una composición farmacéutica. También describe el uso de una doble cadena de BoNT/A activa obtenible por el método de la invención o una composición que comprende dicha doble cadena de BoNT/A activa en la fabricación de un medicamento.
La presente solicitud también describe una doble cadena de BoNT/A activa obtenible por el método de la invención o una composición que comprende dicha doble cadena de BoNT/A activa para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. También describe un método de tratamiento que comprende la administración de una doble cadena de BoNT/A activa obtenible por el método de la invención o una composición que comprende dicha doble cadena de BoNT/A activa a un paciente que lo necesite.
El término “composición” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier composición formulada en forma sólida, líquida, en aerosol (o gaseosa), y similares. Dicha composición comprende, por ejemplo, un compuesto terapéuticamente activo opcionalmente junto con compuestos auxiliares adecuados tales como diluyentes o portadores o ingredientes adicionales. En un aspecto, el compuesto terapéuticamente activo es la cadena de BonT/A activa obtenible por el método de la presente invención. Típicamente, las composiciones, en particular las composiciones farmacéuticas, están sustancialmente libres de Lys-C como se define en el presente documento. Por lo tanto, el presente método para la preparación de una composición farmacéutica puede proporcionar una composición farmacéutica sólida o líquida que comprende:
(a) una proteína BoNT/A bicatenaria activa como se describió con anterioridad, y
(b) un agente estabilizante.
En una realización, la composición (como se describió con anterioridad) está sustancialmente libre de Lys-C. Por ejemplo, la composición (como se describió con anterioridad) puede contener menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 10 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A.
Los agentes estabilizantes que pueden usarse en estas composiciones incluyen estabilizantes de proteínas, tales como albúmina, en particular albúmina sérica humana (HSA), y estabilizantes no proteicos.
Los agentes estabilizantes no proteicos que pueden usarse en la composición incluyen tensioactivos, en particular tensioactivos no iónicos. Los ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen polisorbatos, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80, y copolímeros de bloque tales como poloxámeros (es decir, copolímeros de polietileno y propilenglicol).
En una realización particular, la composición no comprende una proteína como agente estabilizante.
De acuerdo con una realización particular de la invención, el método para la preparación de una composición farmacéutica puede proporcionar una composición farmacéutica líquida que comprende:
(a) una proteína BoNT/A bicatenaria activa, como se describió con anterioridad;
(b) un agente estabilizante no proteico que es un tensioactivo; y
(c) agua;
en donde dicha composición farmacéutica líquida no comprende un agente estabilizante de proteínas; y en donde dicha composición farmacéutica líquida está sustancialmente libre de Lys-C, en donde “sustancialmente libre de Lys-C” es como se define en el presente documento (por ejemplo, dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 10 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A).
En una realización, la proteína BoNT/A bicatenaria activa está presente en la composición (como se describió con anterioridad) en una concentración de 1-1000 ng/ml o más. Por lo tanto, la proteína BoNT/A bicatenaria activa puede estar presente en la composición (como se describió con anterioridad) en una concentración de aproximadamente 1­ 500 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 ng/ml o más. En una realización preferida, la proteína BoNT/A bicatenaria activa está presente en una concentración de aproximadamente 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml o 700 ng/ml.
En una realización, el tensioactivo (como se describió anteriormente) es un polisorbato, tal como un polisorbato que tiene un grado de polimerización medio que varía de 20 a 100 unidades de monómero, y puede ser, por ejemplo, polisorbato 80. En una realización preferida, el polisorbato es de origen vegetal. La concentración del tensioactivo es preferiblemente inferior al 1% v/v, por ejemplo de aproximadamente 0,005% a 0,02% v/v en el caso del polisorbato 80.
La composición farmacéutica también puede comprender un agente cristalino.
Por agente cristalino se entiende un agente que, entre otras cosas, mantiene una estructura de torta mecánicamente fuerte frente a un complejo de neurotoxina botulínica liofilizada (tipo A, B, C1, D, E, F o G) o una neurotoxina botulínica de alta pureza (tipo A, B, C1, D, E, F o G). Cuando se incluyen en formulaciones sólidas, los agentes cristalinos también tienen un efecto de aumento de volumen. Los agentes cristalinos incluyen notablemente cloruro de sodio. La concentración de agente cristalino puede ser, por ejemplo, de 0,1 a 0,5 M, preferiblemente de 0,1 a 0,4 M, notablemente de aproximadamente 0,15 a 0,3 M.
La composición farmacéutica también puede comprender un tampón para mantener el pH a un nivel comprendido entre 5,5 y 7,5, o entre 6,0 y 7,0. El tampón puede ser cualquier tampón capaz de mantener el pH adecuado. Por ejemplo, el tampón para dichas composiciones se puede elegir del grupo que consiste en succinato, fosfato disódico/ácido cítrico y un aminoácido tal como histidina. La concentración del tampón puede ser, por ejemplo, de 1 a 50 mM, preferiblemente de 5 a 20 mM, con preferencia, de aproximadamente 10 mM.
La composición farmacéutica también puede comprender un disacárido.
El disacárido utilizado en dichas composiciones se puede elegir del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y lactosa. En una realización específica, el disacárido es sacarosa. La concentración del disacárido puede ser, por ejemplo, de 5 a 50 mM, preferiblemente de 5 a 25 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, y, con máxima preferencia, de aproximadamente 11,7 mM.
En una realización particular, el método para la fabricación de una composición farmacéutica puede proporcionar una composición farmacéutica líquida que comprende:
(a) una proteína BoNT/A bicatenaria activa, como se describió con anterioridad;
(b) un agente estabilizante no proteico que es un tensioactivo;
(c) cloruro de sodio,
(d) un tampón para mantener el pH entre 5,5 y 7,5
(e) un disacárido, y
(f) agua estéril,
en donde dicha composición farmacéutica líquida no comprende un agente estabilizante de proteínas; y en donde dicha composición farmacéutica líquida está sustancialmente libre de Lys-C, en donde “sustancialmente libre de Lys-C” es como se define en el presente documento (por ejemplo, dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 10 pg Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A).
Según una realización específica, la composición farmacéutica en forma líquida se sella en un vial o en un dispositivo listo para usar, como una jeringa, sin interfaz líquida/gaseosa, y es estable durante al menos tres meses o al menos seis meses a 23-27 °C y durante al menos doce meses a 2-8 °C. Las composiciones farmacéuticas de ejemplo se describen en los Ejemplos.
Las tasas de degradación mensuales para las composiciones o formulaciones farmacéuticas pueden ser inferiores al 5% por mes durante 12 semanas, lo que significa que la función de la proteasa BoNT bicatenaria de las composiciones o formulaciones permanece estable a 25 °C durante al menos 12 semanas.
Las composiciones farmacéuticas pueden almacenarse en forma liofilizada, secada al vacío en recipientes a presión de vacío o como líquidos estables. Antes de la liofilización, la proteína BoNT/A bicatenaria activa se puede combinar con excipientes, estabilizantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables, como la albúmina. El material liofilizado se puede reconstituir con solución salina o agua para crear una solución o composición que contenga la proteína BoNT/A bicatenaria activa para administrar a un paciente.
En este contexto, se distingue entre compuestos auxiliares, es decir, compuestos que no contribuyen a los efectos provocados por el compuesto descrito en el presente documento tras la aplicación de la composición para su propósito deseado, y otros ingredientes, es decir, compuestos que contribuyen a un efecto adicional o modular el efecto del compuesto descrito aquí. Los diluyentes y/o portadores adecuados dependen del propósito para el que se usará la composición y los otros ingredientes. El experto en la técnica puede determinar tales diluyentes y/o portadores adecuados sin más preámbulos.
El o los vehículos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Los ejemplos de portadores sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico, y similares. Los ejemplos de portadores líquidos son solución salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes, y similares. De manera similar, el portador o diluyente puede incluir material de retardo de tiempo bien conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Los diluyentes se seleccionan para no afectar la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank, además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, y similares.
En un aspecto, el método para la fabricación de una composición farmacéutica puede proporcionar una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina biológicamente activa obtenida por el método de la presente invención (es decir, la doble cadena BoNT/A activa), opcionalmente, uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. La neurotoxina activa puede estar presente en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes de proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA)) o estabilizantes no proteicos tales como polivinilpirrolidona o ácido hialurónico. La composición farmacéutica se administra, en un aspecto, por vía tópica. La administración convencional de fármacos se realiza mediante administración intramuscular o subcutánea (típicamente cerca de las glándulas sebáceas). Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de acción de un compuesto, la composición farmacéutica también puede administrarse por otras vías. El polipéptido de neurotoxina de doble cadena es el ingrediente activo de la composición, y en un aspecto se administra en formas de dosificación convencionales preparadas combinando el fármaco con portadores farmacéuticos estándar de acuerdo con procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable está dictado por la cantidad de ingrediente activo con el que se combinará, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto, la neurotoxina, que se utilizará en una composición farmacéutica que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección mencionada en esta especificación. La eficacia terapéutica y la toxicidad del compuesto pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, LD50/ED50.
El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos. Como es bien sabido en la técnica médica, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros medicamentos administrados simultáneamente. El progreso puede ser monitoreado por evaluación periódica. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas a las que se hace referencia en el presente documento se administran al menos una vez para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o afección mencionada en esta especificación. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse más de una vez.
Como se describe en el presente documento, las proteínas BoNT/A bicatenarias activas obtenibles por el método de la invención, y las composiciones y composiciones farmacéuticas líquidas de las mismas, pueden usarse en terapia. Las terapias adecuadas pueden incluir tratamientos cosméticos y métodos de tratamiento médico.
La composición mencionada anteriormente puede ser un medicamento o una composición cosmética. En un aspecto, dicho medicamento que comprende la neurotoxina biológicamente activa (es decir, doble cadena de BoNT/A activa) puede usarse para la prevención y/o el tratamiento de al menos una de las siguientes enfermedades y trastornos: fuerza muscular voluntaria, distonía focal, incluyendo distonía cervical craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y corrección cosmética de arrugas, en otro aspecto también blefaroespasmo, distonía oromandibular, tipo de apertura de la mandíbula, tipo de cierre de la mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonía lingual, apraxia de los párpados, distonía cervical de apertura, antecollis, retrocollis, laterocollis, tortícolis, distonía faríngea, distonía laríngea, disfonía espasmódica/de tipo aductor, disfonía espasmódica/de tipo abductor, disnea espasmódica, distonía de las extremidades, distonía del brazo, distonía de tarea específica, calambre del escritor, calambre del músico, calambre del golfista, distonía de pierna, aducción de muslo, abducción de muslo, flexión de rodilla, extensión de rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovaro, deformidad, distonía del pie, dedo del pie estriado, flexión del dedo del pie, extensión del dedo del pie, distonía axial, síndrome de Pisa, distonía de bailarina del vientre, distonía segmentaria, hemidistonía, distonía generalizada, distonía en lubag, distonía en degeneración corticobasal, distonía tardía, distonía en ataxia espinocerebelar, distonía en la enfermedad de Parkinson, distonía en la enfermedad de Huntington, distonía en la enfermedad de Hallervorden Spatz, disquinesias inducidas por dopa/distonía inducida por dopa, disquinesias tardías/distonía tardía, disquinesias/distonías paroxísticas, mioclono palatal inducido por la acción kinesiogénica, no kinesiogénica, mioquimia mioclónica, rigidez, calambres musculares benignos, temblor hereditario del mentón, actividad muscular de la mandíbula paradójica, espasmos hemimasticadores, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia masetéica, hipertrofia tibial anterior, nistagmo, oscilopsia supranuclear, parálisis visual, epilepsia, partialis continua, planificación de la operación de tortícolis espasmódica, parálisis de la cuerda vocal abductora, disforia mutacional recalcitrante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma de cuerdas vocales, tartamudeo, síndrome de Gilles de la Tourette, mioclono del oído medio, cierre laríngeo protector, poslaringectomía, falla del habla, ptosis protectora, entropión, disfunción del esfínter de Odii, pseudoacalasia, no acalasia, trastornos motores esofágicos, vaginismo, temblor de inmovilización posoperatoria, disfunción de la vejiga, disinergia del esfínter detrusor, espasmo del esfínter de la vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervación, uso cosmético de los pies de gateo, asimetrías faciales fruncidas, hoyuelos del mentón, síndrome de persona rígida, tétanos, hiperplasia de próstata, adiposidad, tratamiento infantil de parálisis cerebral, estrabismo, concomitante paralítico mixto, después de cirugía de desprendimiento de la retina, después de cirugía de cataratas, en afaquia, estrabismo miosítico, estrabismo miopático, desviación vertical disociada, como un complemento a la cirugía de estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frey, síndrome de lágrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar palmar axilar, hiperesalivación relativa en apoplejía, en Parkinson, en condiciones espásticas de esclerosis lateral amiotrófica, en procesos de encefalitis y mielitis autoinmunes, esclerosis múltiple, mielitis transversa, síndrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, en paraparesia espástica hereditaria, síndrome posapoplético, infarto hemisférico, infarto del tronco encefálico, infarto de mielón, migraña, en traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tronco encefálico, lesión de mielón, en hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intraespinal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tronco encefálico, tumores de mielón, ronquidos (documento WO 2000/033863). Para detalles y síntomas, ver, por ejemplo, Jost 2007, Drugs 67(5), 669 o Dressler 2000 en Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de una composición cosmética que puede formularse como se describe para una composición farmacéutica anterior. Del mismo modo, para una composición cosmética, se prevé que el compuesto como se describe en el presente documento esté en un aspecto usado en forma sustancialmente pura. Las composiciones cosméticas son, en otro aspecto, para aplicarse por vía intramuscular. En un aspecto aún más, las composiciones cosméticas que comprenden la neurotoxina pueden formularse como una solución antiarrugas.
Clave para las SEQ ID NOs
SEQ ID NO: 1 BoNT/A de ATCC 3502, acceso a Genbank. “AAA23262”
SEQ ID NO: 2: bucle de activación de BoNT/A1
SEQ ID NO: 3: bucle de activación de BoNT/A2/A6
SEQ ID NO: 4: bucle de activación de BoNT/A3
SEQ ID NO: 5: bucle de activación de BoNT/A3
SEQ ID NO: 6: bucle de activación de BoNT/A4
SEQ ID NO: 7: bucle de activación de BoNT/A5
SEQ ID NO: 8: polipéptido proteolíticamente activo derivado de una cepa de Clostridium botulinum ATCC 3502, acceso a GenBank N.°: “CAL82988.1”, que carece de 248 residuos de aminoácidos N-terminales
SEQ ID NO:9: polipéptido proteolíticamente inactivo derivado de una cepa de Clostridium botulinum ATCC 3502, acceso a GenBank N.°: “CAL82988.1”
SEQ ID NO: 10: secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 11: secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 12: secuencia de ácido nucleico “Streptag”
SEQ ID NO: 13: bucle de activación de BoNT/A7
SEQ ID NO: 14: bucle de activación de BoNT/A8
SEQ ID NO: 15: secuencia de aminoácidos de n derivado de subserotipo A1 de neurotoxina botulínica catiónica, recombinante monocatenaria (mrBoNT/A1)
Listado de Figuras
Figura 1: Perfiles de elución de la columna de fenilo de alto rendimiento (PhHP) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 2: Perfiles de elución de la columna de alta sustitución de fenilo de flujo rápido (PhFF-Hi) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 3: Perfiles de elución de la columna de butilo de alto rendimiento (BuHP) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 4: Perfiles de elución de la columna sulfopropilo de alto rendimiento (SPHP) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 5: Perfiles de elución de la columna de sulfopropilo de flujo rápido (SPFF) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 6: Perfiles de elución de la columna de carboxilmetilo de flujo rápido (CMFF) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 7: Perfiles de elución de la columna de alto rendimiento de amina cuaternaria (QHP) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 8: Perfiles de elución de la columna de flujo rápido de amina cuaternaria (QFF) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 9: Perfiles de elución de la columna de dietilaminopropilo (DEAP, “ANX”) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 10: Perfiles de elución de la columna de dietilaminoetilo (DEAE) en la que se evaluó la separación de Lys-C (barras A405) de BoNT/A (línea de puntos A280).
Figura 11: Eliminación de Lys-C de rBoNT/A1 por HP HIC de fenilo. Las fracciones tomadas de la etapa de pulido por PhHP HIC se analizaron mediante SDS-PAGE (arriba). La BoNT/A1 recombinante tiene un peso molecular de ~149 kiloDaltons (kDa) y los marcadores de peso molecular (Benchmark) están marcados en kDa. También se analizaron muestras de las mismas fracciones en el ensayo colorimétrico de Lys-C (parte inferior) donde la escisión del sustrato libera un cromóforo amarillo (en el recuadro negro).
Figura 12: Eliminación de Lys-C de rBoNT/A2(0) por HP HIC de fenilo. Las fracciones tomadas de la etapa de pulido por HP HIC de fenilo se analizaron mediante SDS-PAGE (arriba). La BoNT/A1 recombinante tiene un peso molecular de ~149 kDa y los marcadores de peso molecular (Benchmark) están marcados en kDa. También se analizaron muestras de las mismas fracciones en el ensayo colorimétrico de Lys-C (parte inferior) donde la escisión del sustrato libera un cromóforo amarillo (en el recuadro negro).
Figura 13: Eliminación de Lys-C de rBoNT/A5(0) por HP HIC de fenilo. Las fracciones tomadas de la etapa de pulido por HP HIC de fenilo se analizaron mediante SDS-PAGE (arriba). La BoNT/A5(0) recombinante tiene un peso molecular de ~149 kDa y los marcadores de peso molecular (Benchmark) están marcados en kDa. También se analizaron muestras de las mismas fracciones en el ensayo colorimétrico de Lys-C (parte inferior) donde la escisión del sustrato libera un cromóforo amarillo (en el recuadro negro).
Figura 14: Eliminación de Lys-C de rBoNT/A6(0) por HP HIC de fenilo. Las fracciones tomadas de la etapa de pulido por HP HIC de fenilo se analizaron mediante SDS-PAGE (arriba). La BoNT/A6(0) recombinante tiene un peso molecular de ~149 kDa y los marcadores de peso molecular (Benchmark) están marcados en kDa. También se analizaron muestras de las mismas fracciones en el ensayo colorimétrico de Lys-C (parte inferior) donde la escisión del sustrato libera un cromóforo amarillo (en el recuadro negro).
Figura 15: Eliminación de Lys-C de mrBoNT/A1 por HP HIC de butilo. Las fracciones tomadas de la etapa de pulido por HP HIC de butilo se analizaron mediante SDS-PAGE (arriba). La mrBoNT/A1 recombinante tiene un peso molecular de ~149 kDa y los marcadores de peso molecular (Benchmark) están marcados en kDa. También se analizaron muestras de las mismas fracciones en el ensayo colorimétrico de Lys-C (parte inferior) donde la escisión del sustrato libera un cromóforo amarillo (en el recuadro negro).
Ejemplos
EJEMPLO 1 Cultivo del huésped y expresión de la proteína rBoNT/A soluble
Se utiliza una sola colonia de BoNT/A transformada en células BLR (DE3) para inocular un matraz cónico de 250 ml que contiene 100 ml de Caldo Terrific Broth modificado (mTB) suplementado con glucosamina al 0,2% y 30 g/ml de kanamicina. Este método sería igualmente aplicable cuando se utiliza una perla de Microbank o una solución madre de glicerol (10-100 j L) para inocular el matraz.
El matraz se incuba durante 16 horas a 37 °C con agitación a 250 RPM. Se usan 10 mL de este cultivo iniciador para inocular matraces cónicos de 2 litros, cada uno de los cuales contiene 1 litro suplementado con glucosamina al 0,2% y 30 jg/mL de kanamicina. Las células se cultivan a 37 °C durante 2 horas a 225 RPM hasta que se alcanza una OD600 de 0,5. En este punto, la temperatura de cultivo se reduce a 16 °C. Después de 1 hora, se induce a las células a expresar BoNT/A mediante la adición de IPTG 1 mM durante 20 horas. Las células se cosechan por centrifugación durante 20 minutos a 4 °C, se pesan y luego se almacenan a -20 °C.
EJEMPLO 2 Extracción de la proteína BoNT/A del huésped y análisis del nivel de expresión
Las pastas celulares de expresión de rBoNT/A se descongelan a temperatura ambiente y se resuspenden pipeteando en 3 mL de tampón de resuspensión Tris-NaCI por gramo de células suplementadas con 10 jL de benzonasa. Las células se lisan por sonicación a 100 W 10x 30 s encendido 45 s apagado. El lisado se centrifuga a 4000x g durante 1 ha 4 °C para obtener la rBoNT/A soluble en el sobrenadante.
Ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína total de lisados preparados
Se agrega una muestra (50 j L) de lisado de rBoNT/A diluido o estándar de BSA a cubetas desechables de 1 mL. Se añaden 450 jL de reactivo de ensayo Coomassie Bradford a cada cubeta y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de leer A600. Los valores obtenidos para los estándares BSA se utilizan para determinar la cantidad de proteína en las muestras de lisado.
Análisis de transferencia Western semicuantitativa
Una muestra comercial de proteína BoNT/A comprada de Metabiologics se usa para preparar los estándares de SDS-PAGE. Las muestras de SDS-PAGE de las muestras de lisado de los cultivos celulares expresados se preparan luego a una concentración de proteína total conocida. Estas muestras se cargan en un gel de poliacrilamida y se ejecutan a 200 V durante 50 minutos. Las bandas de proteínas se electrotransfieren sobre membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia libre de metanol a 0,4 mA durante 1 hora. Las membranas se bloquean durante 1 hora con 0,5% de BSA en PBS-0,1% Tween 20 y luego se sondean con un anticuerpo contra BoNT/A durante 1 hora. Las transferencias se sondean adicionalmente con un anticuerpo secundario conjugado con HRP, desarrollado con sustrato SuperSignal DuraWest, y se obtienen imágenes usando un instrumento de imagen Syngene.
EJEMPLO 3 Activación de neurotoxina A botulínica (BoNT/A) por Lys-C
BoNT/A1 recombinante monocatenaria (0,5 mg/ml) disuelta en tampón (Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCI 125 mM) se activó proteolíticamente por Lys-C (a una relación enzima:sustrato de 1:500 a 1:2500) a 37 °C o 4 °C, durante un período de 2-20 h, antes de que la reacción se inhibiera con 0,4 jM de AEBSF (clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencensulfonilo), un inhibidor específico de la serina proteasa. Esto produce la forma madura bicatenaria de BoNT/A1, donde la cadena pesada está unida a la cadena ligera por un enlace disulfuro simple (datos no mostrados).
Se determinó que el sitio de escisión era idéntico a la proteína endógena mediante secuenciación N-terminal y espectrometría de masas, confirmando que Lys-C es la enzima activadora de elección (datos no mostrados).
Las pruebas de escisión con endoproteinasa Lys-C demostraron que Lys-C escindió rBoNT/A1 a concentraciones muy bajas y permaneció activo durante un período de días (datos no mostrados).
EJEMPLO 4 Purificación de la proteína BoNT/A diana libre de la proteasa activadora
Utilizando la secuencia de proteína primaria BoNT/A, se investigaron las propiedades de BoNT/A y Lys-C (ver Tabla 2). Las propiedades predichas sugirieron que tanto Lys-C como BoNT/A tienen una hidropatía media similar (valor GRAVY), pero una gran diferencia de carga a pH 4,5 y 8 (ver Tabla 2).
Tabla 2: Propiedades predichas de Lys-C y BoNT/A
Figure imgf000024_0001
Basándose solo en esta información, se predijo que la cromatografía de intercambio iónico (IEX) resolvería la Lys-C de BoNT/A. Por lo tanto, se investigaron diversos medios cromatográficos de purificación, incluida la cromatografía IEX (véase más adelante).
EJEMPLO 5 Detección de columnas de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para separar Lys-C de BoNT/A
Purificación FPLC
Después de la activación de BoNT/A 1 con Lys-C, se probaron varias columnas de FPLC para pulir y eliminar Lys-C:
• tres columnas de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC): fenilo de alto rendimiento (PhHP), alta sustitución de fenilo de flujo rápido (PhFF-Hi) y HP de butilo (BuHP) se probaron con Tris pH 8;
• tres columnas de cromatografía de intercambio catiónico (CEC): sulfopropilo de alto rendimiento (SPHP), sulfopropilo de flujo rápido (SPFF) y carboxilmetilo de flujo rápido (CMFF) se probaron con acetato de sodio pH 4,5; y
• cuatro columnas de cromatografía de intercambio aniónico (AEC): amina cuaternaria de alto rendimiento (QHP), flujo rápido de amina cuaternaria (QFF), dietilaminopropilo (DEAP, “ANX”) y dietilaminoetilo (DEAE)) se probaron con Tris pH 8.
Una vez que se cargó una muestra en una columna, la columna se lavó con tampón para eliminar cualquier molécula unida específicamente antes de aplicar un gradiente de elución lineal de concentración creciente o decreciente de sal (HIC y CEC/AEC, respectivamente).
Las condiciones de reacción y las ejecuciones de purificación varían entre los diferentes tipos de columna (véase la Tabla 3 a continuación).
Tabla 3: Condiciones de detección para todas las columnas probadas para resolución Lys-C
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
Las Figuras 1 a 10 muestran los perfiles de elución (A280) de la proteína BoNT/A1 de las diversas columnas cromatográficas (líneas de puntos). Las diferentes condiciones de reacción y corridas de purificación utilizadas para las diferentes columnas explican las diferentes escalas utilizadas.
Las fracciones recogidas durante el gradiente de elución se analizaron con un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad de Lys-C.
Ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C
Este ensayo implicó escindir un sustrato incoloro para producir un cromóforo amarillo que puede detectarse fotométricamente mediante la absorción de luz de 405 nm (A405). Por lo tanto, este ensayo proporcionó un método simple para determinar si Lys-C estaba presente en cada fracción.
Cada fracción de elución se analizó utilizando dicho ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C y se midió A405 nm. La cantidad (medida en términos de A405) de Lys-C en cada una de las fracciones de elución se muestra como barras en las Figuras 1 a 10.
Resultados
Al comparar los datos de A405 y A280 (en los gráficos de las Figuras 1 a 10), fue posible deducir qué columna/s proporcionan la mejor resolución de Lys-C de BoNT/A.
Los diferentes grupos alquilo/arilo (Bu y Ph) de las tres columnas HIC utilizadas proporcionan diferentes ligandos con los que diversas proteínas pueden interactuar a través del efecto hidrófobo. Esta interacción está influenciada por la densidad (grado de sustitución (Hi/Lo) y el tamaño del cordón (FF/HP)) de estos grupos hidrófobos. Para las columnas CEC, el pH de la muestra se ajusta por debajo del pI de la proteína diana para que alcance una carga positiva neta general y, por lo tanto, pueda unirse a la columna. Los diferentes ligandos presentes en cada tipo de columna proporcionan diferentes densidades de carga, y la interacción con diferentes proteínas también está influenciada por la densidad del ligando. Estas variables se aplican de manera similar a las columnas AEC donde los diferentes grupos químicos muestran distintas densidades de carga. En este caso, el pH de la muestra se ajusta por encima del pI de la proteína diana para que alcance una carga negativa neta general.
Los datos gráficos de las Figuras 1 a 10 se resumen cualitativamente en la Tabla 4.
Tabla 4: Resumen de datos cualitativos de resolución de Lys-C/BoNT
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
Porcentaje de recuperaciones de Lys-C y purificación después de la elución de cada tipo de columna
La señal total de Lys-C en cada fracción se normalizó al valor medio de A405 de las últimas 5 fracciones de la etapa cromatográfica. A partir de esto, se calculó el porcentaje de Lys-C presente en las fracciones de pico de proteína para indicar el grado de separación de Lys-C de la proteína en base a las fracciones de elución (Tabla 5, % de Lys-C en las fracciones de pico de proteína (normalizado)).
Con respecto a la proteína diana, se supone que toda la molécula de BoNT/A se eluye bajo el pico principal (es decir, 100% de recuperación); por lo tanto, el grado de purificación puede expresarse como el porcentaje de la proteína total cargada que no se recupera en el pico principal (Tabla 5, % de purificación).
Una buena separación de Lys-C de BoNT/A sería aquella en la que se vio un valor bajo para el porcentaje de Lys-C en las fracciones máximas de las proteínas. A partir de esto, parece que CEC es notable para resolver Lys-C de BoNT/A1. La columna AEC de alto rendimiento, QHP, mostró cierta capacidad para resolver Lys-C de BoNT/A1. Sin embargo, fue significativamente menos efectiva que las dos columnas HIC de alto rendimiento. Por lo tanto, los resultados demuestran que, comparando el tipo similar (es decir, rendimiento estándar frente a rendimiento estándar y alto rendimiento frente a alto rendimiento), las columnas HIC mostraron una mejor resolución de Lys-C de BonT/A1 que las columnas CEC o AEC.
Los dos candidatos más prometedores involucran a HIC PhHP y BuHP. Curiosamente, estas columnas usan perlas de alto rendimiento.
La principal diferencia entre los medios de alto rendimiento y otros es que el tamaño promedio de las partículas es más pequeño (34 vs. 90 pm) y más uniforme (24-44 vs. 44-165 pm). Esto es consistente con las mejoras reportadas en el rendimiento con columnas analíticas que usan perlas de menor tamaño (tamaños medios entre 3-30 pm) (manuales de GE Healthcare 11-0004-21 y 11-0012-69 y archivos de datos 18-1172-87 AE y 18-1172-88 AD).
Tabla 5: Resumen del rendimiento de la columna
Figure imgf000026_0002
Se eligió PhHP HIC como la etapa final de pulido para resolver el Lys-C de BoNT/A (véase el Ejemplo 6 a continuación).
Ejemplo 6 Activación y purificación final del subserotipo A1 de neurotoxina botulínica recombinante (rBoNT/A1) La rBoNT/A1 monocatenaria se purificó por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando cromatografía de interacción hidrófoba de butilsefarosa de alto rendimiento (HP HIC de butilo) para la captura, seguida de una etapa de purificación intermedia con cromatografía de intercambio aniónico de sefarosa de amonio cuaternario de alto rendimiento (Q HP AEC). Esta molécula se incubó luego con 0,4 pg/mL de Lys-C a 37 °C durante 2 h para producir la doble cadena activa.
La Lys-C se resolvió a partir de la rBoNT/A1 activada usando cromatografía de interacción hidrófoba de fenilsefarosa de alto rendimiento (PhHP HIC). Esto implicó ajustar la mezcla de reacción con un tampón Tris con alto contenido de sal antes de cargarla en la columna PhHP, seguido de un lavado con alto contenido de sal y posterior elución de proteínas con un gradiente lineal a un tampón Tris bajo en sal. Las fracciones de elución se analizaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS PAGE, Figura 11 arriba) y un ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C (Figura 11 abajo). Se demostró que Lys-C se eluía temprano en el gradiente (F16-F21, resaltado en el cuadro negro) antes de la molécula de BoNT activada (F21-F29). Por lo tanto, esto muestra una buena separación de la Lys-C de la rBoNT/A1. La intensidad máxima de las fracciones parece ser similar a 30 ng/ml de Lys-C, lo que sugiere que cualquier Lys-C residual presente en las fracciones de rBoNT/A1 sería menor que esta concentración.
EJEMPLO 7 Activación y purificación final de la neurotoxina botulínica negativa de endopeptidasa recombinante subserotipo A2 (rBoNT/A2(0))
La rBoNT/A2(0) monocatenaria se purificó mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando cromatografía de interacción hidrófoba de butilsefarosa de alto rendimiento (Hp HIC de butilo) para la captura, seguida de una etapa de purificación intermedia con cromatografía de intercambio aniónico de sefarosa de amonio cuaternario de alto rendimiento (Q HP AEC). Esta molécula se incubó luego con 4 pg/mL de Lys-C a 37 °C durante 2 h para producir la doble cadena activa.
La Lys-C se resolvió a partir de rBoNT/A2(0) activada usando cromatografía de interacción hidrófoba de fenilsefarosa de alto rendimiento (PhHP HIC). Esto implicó ajustar la mezcla de reacción con un tampón Tris con alto contenido de sal antes de cargarla en la columna de HP de fenilo, seguido de un lavado con alto contenido de sal y posterior elución de proteínas con un gradiente lineal a un tampón Tris con bajo contenido de sal. Las fracciones de elución se analizaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS PAGE) y un ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C (Figura 12), esto mostró que la Lys-C se eluyó temprano en el gradiente (F5-F11) justo antes de la molécula de BoNT activada (F12- F15). Por lo tanto, esta columna muestra una buena separación de la Lys-C de la rBoNT/A2(0).
EJEMPLO 8 Activación y purificación final del subserotipo A5 de neurotoxina botulínica recombinante negativa para endopeptidasa (rBoNT/A5(0))
La rBoNT/A5(0) monocatenaria se purificó por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando cromatografía de interacción hidrófoba de butilsefarosa de alto rendimiento (HP HIC de butilo) para la captura, seguida de una etapa de purificación intermedia con cromatografía de intercambio aniónico de sefarosa de amonio cuaternario de alto rendimiento (Q HP AEC). Esta molécula se incubó luego con 2,5 pg/mL de Lys-C a 37 °C durante 2 h para producir la doble cadena activa. La Lys-C se resolvió a partir de rBoNT/A5(0) activada usando cromatografía de interacción hidrófoba de fenilsefarosa de alto rendimiento (HP HIC de fenilo). Esto implicó ajustar la mezcla de reacción con un tampón Tris con alto contenido de sal antes de cargarla en la columna de HP de fenilo, seguido de un lavado con alto contenido de sal y posterior elución de proteínas con un gradiente lineal a un tampón Tris con bajo contenido de sal. Las fracciones de elución se analizaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS PAGE) y un ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C (Figura 13) que mostró que Lys-C se eluyó temprano en el gradiente (F10-F39) antes de la molécula de BoNT activada (F51-F65) Por lo tanto, esta columna muestra una buena separación de Lys-C de rBoNT/A5(0).
EJEMPLO 9 Activación y purificación final del subserotipo A6 de neurotoxina botulínica recombinante negativa para endopeptidasa (rBoNT/A6(0))
La rBoNT/A6(0) monocatenaria se purificó primero mediante precipitación con sulfato de sodio y resolubilización en acetato de sodio antes de la captura con cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando cromatografía de intercambio catiónico de sulfopropilsefarosa de alto rendimiento (SP HP CEC) seguido de intercambio de tampón en tampón Tris a pH 8. Esta molécula se incubó luego con 0,3 pg/ml de Lys-C a 37 °C durante 2 h para producir la doble cadena activa. La Lys-C se resolvió a partir de rBoNT/A6(0) activada usando cromatografía de interacción hidrófoba de fenilsefarosa de alto rendimiento (HP HIC de fenilo). Esto implicó ajustar la mezcla de reacción con un tampón Tris con alto contenido de sal antes de cargarla en la columna de HP de fenilo, seguido de un lavado con alto contenido de sal y posterior elución de proteínas con un gradiente lineal a un tampón Tris con bajo contenido de sal. Las fracciones de elución se analizaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante (SDS PAGE) y un ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C (Figura 14) que mostró que Lys-C se eluyó temprano en el gradiente (F6-F13) antes de la molécula BoNT activada (F16-F27) Esto muestra una excelente separación de la Lys-C de la rBoNT/A6(0).
EJEMPLO 10 - Purificación de un derivado del subserotipo A1 de neurotoxina botulínica recombinante, catiónica, monocatenaria (mrBoNT/A1)
La mrBoNT/A1 monocatenaria (SEQ ID NO: 15) se purificó por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) usando cromatografía de intercambio catiónico de sulfopropilsefarosa de alto rendimiento (SPHP CEX) para captura. Se empleó una etapa de purificación intermedia usando cromatografía de interacción hidrófoba de butilsefarosa de alto rendimiento (BuHP HIC) para eliminar adicionalmente las proteínas de la célula huésped. Las fracciones de elución de BuHP se analizaron mediante SDS-PAGE y las que contenían mrBoNT/A1 monocatenaria se agruparon como mrBoNT/A1 monocatenaria purificada.
EJEMPLO 11 Activación y purificación final de un derivado del subserotipo A1 de neurotoxina botulínica recombinante, catiónica (mrBoNT/A1)
Se incubó mrBoNT/A1 monocatenaria (SEQ ID NO: 15) con 0,4 pg/mL de Lys-C a 37 °C durante 2 h para producir la doble cadena activa. Lys-C se resolvió a partir de mrBoNT/A1 activada usando cromatografía de interacción hidrófoba de butilsefarosa de alto rendimiento (BuHP HIC). Esto implicó ajustar la mezcla de reacción con un tampón Bis-Tris con alto contenido de sal antes de cargarla en la columna BuHP, seguido de un lavado con alto contenido de sal y posterior elución de proteínas con un gradiente lineal a un tampón Bis-Tris con bajo contenido de sal. Las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE (Figura 15 arriba) y un ensayo colorimétrico de actividad de Lys-C (Figura 15 abajo). Lys-C eluyó en el flujo de la columna y temprano en el gradiente de elución (F1-6, resaltado en el cuadro negro, Figura 15 abajo) antes de la molécula BoNT activada (F10-F12). Por lo tanto, esto muestra una buena separación de Lys-C de mrBoNT/A1.
Ejemplo 12 Formulación que comprende BoNT/A bicatenaria activa sustancialmente libre de Lys-C
Se preparan las siguientes seis composiciones líquidas que comprenden BoNT/A bicatenaria activa (Tabla 6).
Tabla 6: Formulaciones de BoNT/A de ejemplo
Figure imgf000028_0001
Las seis composiciones se almacenan a 25 °C durante 12 semanas. La estabilidad de la función de proteasa de BoNT/A bicatenaria se evalúa durante ese período usando un ensayo de endopeptidasa libre de células.
Ejemplo 13 Ensayo de actividad de Lys-C de alta sensibilidad
La determinación cuantitativa de la concentración final de Lys-C en muestras purificadas de BoNT/A se realizó midiendo la escisión de un sustrato de péptido fluorescente. El sustrato fluorescente (sal de trifluoroacetato Tos-GPK-7-amino-4, también llamado Tos-GPK-AMC) se reconstituyó en DMSO para dar una solución madre de 20 mg/ml (32,7 mM). Esto se diluyó adicionalmente a 10 mM con agua y alícuotas preparadas y almacenadas a -20 °C. El día del ensayo, se tomó una cantidad apropiada de sustrato y se diluyó adicionalmente con Tris 25 mM pH 8, NaCl 125 mM para dar una solución de trabajo de Lys-C 0,5 mM; luego se prepararon patrones de Lys-C (concentraciones conocidas) diluyendo la solución de trabajo en tampón de ensayo (Tris 25 mM, NaCl 125 mM, BSA 0,1 mg/ml, pH 8). Los estándares, los blancos (solo tampón de ensayo) y las muestras de prueba (lotes de rBoNT/A purificada) se dispensaron en placas negras OptiPlate, por triplicado (180 pL por pocilio) y se equilibraron a 37 °C durante 10-15 minutos. A continuación, se añadieron 20 pL de sustrato y la placa se transfirió inmediatamente a un lector de placas donde se realizó una lectura cinética. La placa se leyó usando filtros de excitación/emisión 360/40 y 485/20, a 37 °C, cada 20 minutos durante 5 horas. Los datos se trazaron como tiempo en minutos (eje x) frente a absorbancia/fluorescencia (eje y). Los valores de pendiente para cada concentración de Lys-C se usaron para generar una curva estándar para la concentración de Lys-C. Las muestras de rBoNT/A purificadas se trataron de la misma manera y la concentración de Lys-C en cada muestra de rBoNT/A se interpoló a partir de la curva estándar. Con base en el análisis de cuatro lotes independientes o rBoNT/A, se midió la concentración promedio de Lys-C en el material final en 7,3 ± 1,5 pg de Lys-C por 100 ng de BoNT/A.
SEQ ID NO:1
Met t r o Phe V a l A s n L y s Gln Phe Asn. T y r Lys Asp P r o V a l As L"_ : 5 1C 15 Vtll A s p 11 * A l ti T y i I_-r Ly-s 11 * Plv A s n A le . 3 i y G l n C-_[L ? r o ¿li ¿ 5 3D
V a l Lys A l e Pile Lya l i e H i a Asn Lya I _ e T t p V a l l i e P ro G l a A r g 35 40 45
Asp Ti' i Pine Til j; Asr. F r o 31 j Glu G l y A ap Leu Asii P r o P ro F r o 31 j SO 55 6 0
A _ a Lys Gln V a l P r o V a l S e r Ty r T y r A s p S e r T h r T y r L e a S e r T h r E5 00 00 Asp As n j l u Lys A s p A s n Ty r Leu Lys G_y V a l T h r Lys L e a Uhe Glu
«5 90 95
Are; : i t T y r 5 « i T h r A s p La j Gly A i j fi^L I a j Lfcu T h r S e r H e V a l 1 nc 1 Db 110
A r g Gl y l i e P r o P h e T r p 31 y G l y 3 e r Til L l i e Asp T h r G l a L ea Lys 115 120 125
V a l l i e Asp Til r Asr. Cya- l i e Asn V e l I i .e Glr , T r o As p G l y S e t T y r 120 135 n o
A r g S e r Glu G l a L e u Aso Leri V a l l i a l i e G l y T r c S e r A l a A sp l i e 145 150 155 160 l i e Gln Prje G l a Cya L y s s e r Fine G l y Mis ■Gln V a l L e a Asr . L ea ■:T.r
1&5 1T0 13 5
A c i : Asn s i y Ty i G l y O e t T h r Glu Ty i H e A t y P b * S e r P r o As p 100 1 0b 1 40
Til L Phe 31 y File G l a G l u S e r Leu G l u V a l Aap T h r Asn P ro L ea Leu I 45 200 ¿ 05
G l y A l a 31 y Lya P h e A l a Tlr r Asp P ro A_a V a l T h r L e a A l e H_2 31 j 213 215 220
Leu l i e Hí b A l a G l y K l s A r g Leu T y r G_y L i e A l a L i e Asr . Uro Asn 225 230 2 35 240 A r g V a l Phe Lys V a l Asn Tl : r Asn A l a T y r T y r 31 u Mer S e r C-ly Leri
21 5 2 50 255
G i h Vn 1 5 e r Ph* G l u G l u T.e-.j Ai-y Thr F he G l y Gi y 13 i r¡ As p Al S T.ys
£ 60 £55 £ 70
Fhe l i e Asn S e r Leu G l n 31 j Asn G l a Fl ie A r g Leu T y r T y r T y r Aar.
£75 s e o ¿ 05
Lya Phe Lya A s p H e A l a S e r T h r Lea Aair Lys A l e Lya S e r I _ e V a l 290 295 300
G l y T h r T h r A l a 5 e r Leo Gln Ty r Mer L y a Asn V a l i’h e Lys G l a Lys 305 310 315 320 T y e Leri Leu S e r G l u Asp Tl-.r S e r G l y L y a Pire S e r V a l A s p Lya Leri
325 330 335
:.ys Phe Aflu T.ya L*H Ty r Lys M«L L*u T h r G lu T le Tyr T h r G l y Aap
34 0 3 J 5 350
Aatr Phe V a l Lya P h e Flie Lys Va 1 Lea Aair A r g Lya Tiir T y r L ea Aar.
355 3É0 3f¡5
Flie A.ip Lya A l a ■/el Flie Lys l i e Asn H e V a l ? r o Lya V e l Aa ir T y r 003 335 380
T h r l i e T y r Asp- G l y L:h e Asn Leu A r g A sl: TLrr Asn L e a A l a A l a Asn 305 300 395 400 Phe Asn G l y G l n Asr . T h e 31 -.i l i e A s n Asr . Met Asn Phe T h r l y s Leri
105 A 10 4 15
I.y* Aí: i P h e T h i G l y L e u Phe Glu Phe T y r Lys T.eu T.eu C y í Va 1 A t y
4 ¿ 0 430
G l y l i e l i e Til £ S e l Lye Tlr r Lya 3 e r L,ea Aap Lya G l y T y r Aa ir Lys i 55 440 H 5
A l a Le' j Aan A s p Leu. C y s l i e Lya V e l Aair Aan T r p As p Lea Fhe ?l re 453 455 460
S e r PrQ 3-91 C lu Asp Asn I-h.e T h r Asn Asp Leu Asr. ly s C ly Clu Clu 415 1 j D ■1/5 ■100 l i e Tl".r S e r A i p Til t Aih l i e G l u A la A la Gl ü Glu Air, H e Ser Leu
405 -196 495
Aip L f j H e Gli, G_Il T yr T y r Leu Thr Phe A i ,1 ?l-.e Aip Asr, G lu Pre 500 505 510
G I u h a n TI i S í r I l í G lu A í h Lev Ser 5 ír Ai]: : i i T 1 í Gl y Gln l.tu 5_5 52 C 523
C lu Leu V z q Asr. l i e G lu A r g Pho Pro Asr, CU y ly s Ly-s Tyr Glu ÚÍO b ¿5 bao
Leu Aap l y s T y r T h r Met The Hia Tyr Leu Ar-g A la Gln Glu Che Glu 545 550 55b 5ha :h ü Gl y Ly s S e r Ar g l i e A l a Leu Thr Asn Ser V a l Air, Gi-J A la Leu
505 570 575
LíU h a n Pr:> S í r A r S Vi, l Typ Thr Phí, Phe 5 « í Sttt A ir Ty/ VuL T.yi 5B0 505 590
T Y * V.i 1 A=n T.yü A'-a T hr e i u A l a A la H it Phe L í u 01 y Trp Val Gl u 50b <MiU r-ub
Gln Leu V a l T y r Aap L'he T h r A s p Glu Thr Ser Glu V a l Ser Thr Th r 610 615 620
A i p Lys l i e A l a A.ap H e T h r l i e H e l i e Tro- Ty t l i e Gl y Cro A le 525 530 535 640 L í u h a n r u Gl y Asi: MH. T.tu Tyr Lys A=P R¿|: Phtt v a l Gl y A is l.tu
645 65C 65;
T 1 ' Ph-i S f . r 51 y A la Val I l í > u l iU H u Ph i T 1 i P r r Glu T-.s A la 660 665 670
11-5 V l-q V al Leu í - y T hr VV.Q A l a Leu Vnl Sor Ty L- l i e A la Asn Lys 575 .-.un r.Ub
V e l Leu T h r '-.■'al Gil í T h r l i e A i p Asn A la Leu Ser Lya Arg Asn Glu 690 695 700
Lya T t p Asp Glu v a l T y r Lye T y r l i e V a l T.Tr Aa r. Trp Leu A la Ly i 705 710 715 720 Vnl Asn T h r Cln TI c- Ar.p Leu TI rí Arq : .y r, T.y s H *t Lys Glu Aln L í u
705 730 735
C L i.i Asn C1 n A l a Gil.:. A l a T h r l y s A la l i o I le Asr. Tyr Cln Tyr Asn 7 '1 ü 7 45 7 50 Gln T y r T h r Glu Glu Glu Lya Asn Asn l i e Asr, TT.e Asn l i e Asp Asp 755 7l;C Ti;5
Leu S e r S e r Ly 3 Leu Ai ,1 Glu S e r l i e A i t'L L y i A la Mer l i e A.3:l H e 770 775 750
Asn Lyts Phe Leu A=r: Gl i, cyn 3e r Val í l i r Ty r T.kll Mil. AiU Gir MiL.
765 70O 7?5 600 11-5 V l-q T y r t i y Vn l Lys A rg Leu Clu Asp Eb« Asp ALn 0c r leu Lys 0U5 010 01b Asp A l a Leu Leu Lya T yr l i e T y r Asp As Ll Arg Gl y Thr Leu H e Gl y $£0 S25 630
Gln v a l Asp A rg Leu Lys Aa-p Lys v a l AS Ll Asr, Thr Leu Ser Thr Asp 005 04C 845
T 1 « P r c Phe 51 n Lí u 3 e r Ly-í Tyr V al A=p A i i. G ln Arq Ti í '.J L íu í t r 050 055 800
Til r Vhf. Thr 51 IJ T y r T 1 í Lys Aí n T lr T le Ai,. Thr 3er Tle L^u A í M 865 070 070 É 00 Leu A rg T y r Glu S e r Asn Hi 5 Le u H e As p Leu Ser Arg Ty r A la Ser 005 090 B9b Lys l i e A.tn l i e c-_y .Sei Lys v a l As-n Che Asp Sro H e Asp Lys Asn 500 905 917
G L ii l i e G ln Leu I h e Ai ,1 Leu G l u Ser Se c Lys l i e Glu Va 1 l i e Leu 015 ?2C 925
T- A?ri ALn -lie Vül T yr Asr- S f . r M ít Tyr Gl u A ; n pha í « r Thr r H 0 5 i 5 5-10
L:ne T rp l i e Arg l _ e Tro Lys T y r L:he Aan Ser l i e Ser Leu Aan A sl:
9A5 050 955 36Q
C_u T y r Thr IL e I l c Asn Gya k-at C_u Asn Asn S e r G ly T rp Lys V a l
9G5 970 ’ 975
ser T.eu f l ín T y j g ; y s i -.j t i *+ i l e T rp T hr T.eu G ig A?p T h í Gin G lu
90Q 905 <590
I _ e Lya Gln Arg V a l V a l Phe Lya T y r Ser G li: M et l i e Asi: l i e Ser
595 IODO 1005
Asp T y r l i e 9.a n A rg T rp l i e P h e V a l T h l H e T h r A s p A a n A r g 1010 1015 1020
le u Asn As r. S e r Lya l i e T y r 11 * A s n G l y A r g L e u l i o A s p G l n 1025 1030 1035
Lya I-l-o I Le S e r Asn Le- i.i CLy A s n H e H i s A l a S e r A s r . A s n l i e 10 A 0 1045 1050
Met- ?he T.ys L íU Ak :: G ly Cy.-i
1055 1CÉ I _e Lya T y r Fhe Aa n Leu Phe
Figure imgf000032_0001
1070 1075 1060
H e Lya Asp le : i T y r Asp Asl: G l n S e r A s l : P e r G l y H e L e : i L y s 10S5 1090 1035
Asp I-h.e T rp G ly As p Tyr L-s v G l n T y r A s p L y s P r o T y r T y r M c t 1100 1105 1110
le v Asn Lo ll T y r Ass Pro As r. L y s T y r V a l A s p V a l A s r . A s n V a l 1115 1120 1125
G ly 7 le Afir G ly Tyr M í 5 Tyr i . i u T .ya G l y P n i A r g G l y 3 e r V e l 1130 1.3 5 11-10
Wet ■l'L-.r T h r Aan l i e Tyr Leu A a n S e r S e r L e u T y r A r g G l y T h r 1115 1.5 0 1150
Lya Phe 1 Le L ie Lys Lys T y r A l a S e r G l y A a n L y s A s p A s n H e 1150 11G5 I L t C
V a l Arg A 3 r. Asn Asp A r g V a l T y r H e A s r . V a l V a l V a l L y s A s n 1175 l : S 0 1105
Lya 01 j T y r A rg Leu Alci T h r A s n A L n S e r G l n A l a G l y V a l G l u 11 so 1195 1200
Lya H e Leu Ser A le Leu GLu H e P r o A a p V a l G l y A a i : L e a S e r 1205 1210 1210
G ln V a l V a l V a l Met Lys S e r L y s A s n A s p G l n G l y H e T h r A a n 1220 1225 1260
Lya Gya Lya he t Asn Leu G L n A s p A s n A s l : G l y A a n A s p H e G l y 1275 124 0 12-15
Phe 11 * CLy Phe H 15 G ln Phe A s n A s n E l o A l a L y s 1.CLL V a l A l a 1250 1255 1200
í l t r A i ti T r E> Tyr As ii A tg g i n
Figure imgf000032_0002
r A r g T h r T.eu 1255 1270 1275
G ly Cya Ser T rp Gl u Phe l i e ? r a V a l A a p A a p G l y T r p s i y G l u 1260 1205 1290
Arg Tro Leu
1235
SEO ID NO: 2
Gys V a l Arg G ly l i e l i e T h r Ser Lys T h r Lya S er Leu Asp I-ye G ly
1 5 10 15
T y r Aan Lys A la Leu Aan Aap Leu Cys
20 " 25
SEO ID NO: 3
Gys VaL Arg Gl y L i e l i e Trc The Lya Thr Ly& S e r Leu A s p t l u Gly i 5 ’ 1C 15 ' Tyr Asn Lys A l a l e u Asn Asp Leu L y s
20 25
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Gys V a l Arg G ly L i e l i e Prc The L y s Thr Lys S e r Leu A s p G-lu Gly 1 5 1C 15
Ty- Aeti Lys A l a Leu Asn A s p Leu L y s
" 20 " 25
O: 5
Gys V a l Arg G1 y L i e l i e Tro The Lys Thr Lys S e r Leu A s p t l u Gly 1 5 1C 15
Tyr Airi Lys A la Leu Asn Tyr Leu Cys
" 20 ' 25
O: G
Gys V a l Arg G1 y L i e l i e Thr S e r Lys Thr Lys S e r Leu A s p t l u Gly 1 5 _C _5
l 'yr1 Airi Lys
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Leu Asn Glu C L yesu
" " 20 25
O: 7
Gys V a l Arg G1 y L i e l i e Thr S e r Lys Thr Lys S e r Leu A s p t l u Gly 1 ' 10 15 ' Tyr Asn Lys
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Asn Asp L L y e s u
" " 25
O: G
Val Gln GLy GLn. S e r V a l Lys GLy Val G ly l y s Thr S e r Leu Asp Gly 1 5 1C 15 ' l e u Val Asn l i e A sp V a l Thr Tyr GLy Aan G ly Lys Tyr Tyr l e u Lys £0 25~ 30
Asp Ocr Asn Lys As r. l i o Tyr Leu T^i A s p I c j Lys A sn CLr. Val Asp 35 ■ y . ) qs
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Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys A s i Lj's Leu Asr. Arg Asn S e r l i e Asp A s i 10C L05 L_0
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115 120 125
Asi: A l a Phe T r p T y r o l y r r o T y r A sp G ly Met Phe P h e G ly Asp G ly 133 135 140
Asp G ly l i e T y r Phe Se r S e r Lev A la LY5 S-er Leu As p V al V nl G ly 1 4 Í : b ü :.5b Iftl) 1114 3 I : j T.tíij 3* r ]11k <31 v Va 1 Th r Aso Lys G lu ■cr ASn L eu L y í T y r 155 n '-25 CU: A4P SI u $* r SI y A la T.a-.j A i |i Gl u St
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135 230 235
A la ■31 y 31 y V a l Met A rq A sp Met G lü As f: P ro 3 e r A ig G ly G ly 31:.
213 215 220
L; JLO A l a Hí b Met Lys Asp T y r Lye T y r Lya T tir Met A sn A sp Asp A sn
225 230 235 243
01 y G ly V a l t: Í 5 T h r A sn S e r G ly l i e E l e As n K is A l a A la T y r Lev
24 5 250 255
V a l A l a Asp G ly H e G lu Lys T h r G ly A l a Ly-s Aon S e r L^rs A sp l i e 2fiC 2 6S 270
H i t SI y T,ya; 11 e Phe T y r T h r A la Asn Cys T yr T.y.s T r p Asp G lu T h r
2?!3 230 235
T h r A íh Ph* A la T.ys c y s At<j A i ii AJJ> Va 1 Vi ;i 31 ii v a l TI, r L y í SI-.j 2$0 295 300
l e u T y r 31 y G lü Asi: 3 e r A.sn T y r V a l Lya l i e V a l G lü Lya A la Phe
3C5 310 315 323
A sp G ln V a l G ly l i e T h r A l a T h r P r o Gl l: l e : i T rc L eü
32 5 330
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2 11 2:5 30
l y s V a l G ln P ro Lys T h r T h r T h r I L e T h r T r p G l u L y s A s r . G l v G l n
35 40 45
A ; | t T t - T,y-^ Ly= A la A1a- T h r A*P T 1 t í T h r S I - . j T.y.-r L y = P h e A ? h A 4M IO 53 60
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B5 9C 95
G ly Lys T h r A sn T y r HlS Met l i e T y r G l u V a l G l u G l y l i e U r o V a l
10C 105 110
T y r T y r G ly A rg l i e v a l Phe T h r T h r G l u L y a A a p S e r S e r M e t A s p
115 120 125
Se r l i e Asn G ly A r g l i e Aop T h r V a l P h e S i n A o n G l y A s r . T r p L V -5 130 155 14Q
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T h t A sp Aan G ly Se t T r p T h r V a l
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A s p G l y S e r
105 200 205
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Gln Lya Leu P ío Ase: A la Lyi Lys l i e Lyí Asp 31 u A la Lys ly s A la 225 230 255 240 S e t Asn A la Aon A ir V5J 7 le A it : V al G i r: G 1 y Glu Ser v a l ly s Gly
.345 LISO 705
Val Gl y Lya Tli j; Se t Leu A.ip Gly Leu Val Asa l i e AS p Val Tli t Ty r
26C 265 270
Gly Asn 51 y Lys Tyr Tyr Lea Lys Asp Se t Asn Lys Asn I Le Tyr Les 275 2 EO 2E5 T y r Asp Leu Lys Asi: Gln Val Asp Glu T yr Asp Leu Tyr Asr. T y r Les 200 295 300
Oer Ai y ? : o /■lísti Tyi Lys 31 :i l i e Leu Kev Se: Lys 5 e i Glu l e u H e 305 310 315 320 S e t Asn T y r Aon Ain Ash ?1:e T le Ala Asn A sr Glu v a l Asn 3er Va 1
3 i$ 330 335 Asp A la Tyr Val Asr. T Ot­ A± Si Lys Tlir Tyr Asp Tyr Tyr Lys ASO Lys
14C 345 350
le u A.3 :'j Arg Asn Se l i l e A.ip Asn Lys G_y H et Asn l i e Asn. Gly The 155 360 365 V al Hi a V al Gly Arg Asn T yr Gly Asn A la Ote Trp Tyr GLy Pro Tyr 310 37.5 380
Asp 3 ly Mel, Phe Plie Gly Asp n i y Asp Gly H e Ty r Pire 3 e r 3er L e í 305 300 395 400 Ala T.ys Ser T.eu Aip V5J Va 1 ni y ili = Glu :,e-.j 3er r: i u ni y Va 1 Thr
40.4 410 415
Asr. Lys Glu £ e r Asr. Leu Lys Tyr Glu Asr. Gl'J S er Gly ALa l e u Ai ti
42C 425 430
C-lU Sei1 Plie S i i Asp l i e Met Gly Val A._a Val Glu Gly Lys Asr. Phe 435 440 446 V al Le.i Gly Glu Asp Cys T rp VaL Ala Gly Gly VaL Met A rg Asp Met 450 455 460
Glu AíH Pro Se r A r n Gly e l y n i n P ro Ala II i i He L T.ye Aip Tyr T.yi 455 4^0 4n 5 490 Tyr Lye T h l WeV Aí O JV= p Asp Ain ni y Gly va l f f i i Thr Ain 3er Gly
40.1 400 40.3
l i e l i e Asn KL3 A la A la T yr Leu Val A.la Asp Gly l i e GLu Lys Thr
50C 505 510
Gly A la Lya Asn Se t Lys A.ip l i e Met Gly Lys l i e Phe Tyr Tli t A.la 515 520 525 Asi: Cys T y i Lys T ip Asp Gl'J Tnr Thr Asn CT.e A la Lys l y s Arg Asn 530 575 540
Aíp Va 1 v a l OI n Va 1 Thir Lys e l u Leu Tyr Gly Glu Ain 3 e r A;|t Tyr 545 550 55.5 560 Va 1 T.ys 7 le Va 1 ni u Ly# A la Piie Ai p G i n Val Gly t i e Thr Ala Thr ó fió 670 67.3 F i l o Gln Leu F r o Lev
5EC
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Val Uto lfro Thr i'i;- Gly Ser Ala 'J'zp- .'ür His l’-rc crin l'ha GLt Lya 1 5 10 25
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GV3 Val Azg Gly l i e Lie Thr Ser Lys Thr Lya Ser Leu Asp t i ti Gly Tyr 1 _ 5 1C 15
Asi: Lya Ala Leu Asi: Asp Leu Cys
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Cys Val Azg t i y l i e l i e Src fhe Lys Thr Ly& Ser Leu Asp t i ti Gly Tyr l " " 5 10 15
Asi: Lya Ala Leu Asi: Aap Leu Cys
' 20 ’
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V a l Asp l i e A l a T y r l i e Lys l i e P í a Asr. A l a 31 y G l n Meo Glr. ? r o
20 25 30
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A J P Tt l t P he T h r Ait: P r u 3I-.j ni u Gl y Ai f) Leu ASIn Pt:> Pr:> P r t) Gl-.j 50 55 60
A l a Lys Gln ve 1 P r o v a l S e r Tyr Tyr Aap 3 e r TTir Tyr Leu s e t Th r
70 75 00
A.sp Asn Glu Lys A s p A s n T y r Leu Lys G ly V a l T h r Lyrs Leu L;he Glu
B5 30 95
A.rg l i e Ty i S e r T h r Aap Leu G ly Arg t t e t Le.i Leu Thr S e r l _ e Val
100 105 110
A i g 31y : i * Pi v Plie T i p 31 y G ly Gí í i Thr r i t Asp Thr GLu Lí u Lys 115 12 □ 125
Va 1 11« Ai|p Th r Airt Cy-, 7 l e A i ii V i l T . t ■31 n ?t<: f l i p Gl y Oer T y t 150 135 Mu
Arg S t i ' Gil í Gil í Leu AS tJ Len v a L H e I _e G ly P r o 3 e r A l a Aap H e H 5 .5 0 _ 55 153 l i e Gln Iahe Glu. Gys Lys S e r Phe G L y :h! s G lu Val Leu A s r Leu T h r
LOS 170 175
Arg Asn G ly T y r G ly S e r Th r Gln Tyr H e Arg Phe S e r P r o Asp Phe
100 105 150
T h i Pire G l y Phe C l u C l u P e r Leu GLu Vnl A sp T h r A sn P r o l e u Leu 145 200 2 1)5
C-_y A l ¿ 31 y Lys Plie A l a T h r A*p P í a A_a V u l T h r L tu AL a l i l i 31 J 7 i 0 7 13 220
Leu l i e n í a A l a G ly HlS Arg Leu Tyr G ly r í e A l e l i e Asr. P r o Aan
230 235 210
Arg Val Iahe Lys Val Asn Th r Asn A l a T y r T y t Glu Meo S e r G ly Len
215 250 2 55
G lu v a l S e r iahe Glu. Glt l Leu Arg Thr L:he G ly G ly biis A sp A l a Lys
2 ¡;C 205 2 70
Phic 21* Asp P-Cr Leu C l n G lu Asn Glu Phc Arg Leu Tyr T y r T y r Asn 235 2$Q 235
L ys Phe Lys A s p H e ­ A l a Oer Thr Leu Asr. L y s A l a Lys S e r I _ e V a l 290 295 300
C l y Th.:- T h r Al a s e r Leu Gln Tyr Tfet Lys Asn V a l Phe Lys G lu Lys 305 310 3 i 5 320 T y r Leu Leu S e r G lu Aap Th r S e r G ly Lys Phe P e r Va l A sp Lys Len
325 350 335
LV'3 Phe Asp Lys Leu T y r Lys Met Leu T h r G lu l i e T y r T h r G lu Aap
3 *4 C 345 350
A s r Pb.fl V a l Lys Phe Phe Lys Va L Leu A s r Arg Lys Thr T y r l e u Asn 355 3 a n 355
Phe Asp Lys A ln Val Phe Lys H e A sn l i e V a l P r o Lys Val Asr. T y r 550 355 :■!&□
Thr l i e " y r Afljj Gl y F M n Ai ti T.e u A i g Air: T h r ASIn Leu Al a Ala Ai h 395 300 3*5 400 L:he Asn G ly G ln Asr. T h r Gln l i e A sn As r. Met Asn l’h e T h r Lys Le'j
■105 4 10 415
Lv'3 Asn Ia he Thr G ly l e u Phe Glu L'he T y r Lys Leu Leu Gys Val Arg 120 ■125 400 GLy l ie I La Th.r Ser Lya Thr Lys Ser Lea Asp Lys G.y Tyr AS h. Lys 105 143 ■145
Al s T.^ u Mn Asp Lev l-YA TI s T.y* vB: A*n A*n Trp Asp T.fíii :-h (i P5® 4 SO ■155 460
■Ser ?L-Í Ser Glu Asp Asa Ph® Thr Asn Asp leu Asn Lys Cly Glu Glu 465 '170 ■175 ■100 11® Th.L- Ser Asp Thr Asa l ie Glu Ala Ala C_n Glu Asn 11® Se i: Leu
400 ISO ¿7.5
As? Leu Lie Gln Gln iy - Tyr Leu Thr Phe Asn Phe P.sp A¿n Glu Pro 000 5Ü5 510 Glu Alh. Ha Se: l ia Glu AS 11 Leu Ser Ser As p Ha l ia Gly Gln Leu 515 .523 525
ni u T.tLi M*t Pro Mn T le ni u Arg Pht Pío A=n ni y l.ys T.yis Tyr ni ii 530 505 540
LtU Asp W* Tyr Til r Mal. Fli* TE i * Tyr Leu Arg Ala 01 n Glu Phe ni u 545 550 555 560 H¡* G] v W* íc r Arg n « Al* Leu Thr M r Ser V.-.l A#h Gl u A l* T.«u
565 573 075
Leu Asr. L'iS 3er Arg Val Tyr Thr Uhe l’he Ser Ser .Asp Tyr Val Lys 5 ¡i 3 000 040 Lys Val Asn Ly 3 Ala Ttir Glu Ala Ala Me C L:h.e Leu Gly Trp Val Glu 645 000 Í.CS
G LII Leu val Tyr Asp Pl-.a Thr Aip C-lu Thr Ser Gl u val Ser Th t T.or 610 615 620
As? Lya I La Ala Asp l ia Thr l ie l ie l ie Pro Tyr ría Gl y Tro Ala 625 030 635 640 Leu Asp. I La Gly1 Mn Hí L Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gl y Ala Leu
615 £53 £50
I Lo Pto Ser Gly Ala Val ríe Leu Ir-ii C1j Ph.® l ie Ore Glu l ie Ala ÉÉ0 ¿65 670
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Vil L Leu Thr Val Gln Tl-.r Ha Aap Aan Ala Leu Ser Lys Arg as ir Gl u 650 645 730
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr l ie Val Thr Asm Trp Leu Ala Lys “ 05 713 715 “ 20 V¿L ASI'. Thr Gis l ie Asp Leu lie Ar -j Lys Lys Mer Lya Gl u Ala Leu
725 703 735
ni u AjJCi ni n Ala ni U M í-. Thr Ly* Al* 1 l« ríe Mn Tyr Gil, Tyr Mn 740 U S 750 m n Tyr Thr Glu ni u Glu Ly= Asn Asn T lr Asn p:-,« Asn TI® Asp Mp 755 763 765
L-ST.I ser Se L Lys leu Asa Glu Ser Asa Lys Ala Mat He Asr. He 770 775 7 ríO
Asn Lys L'he Leí Asn Gla Cys Ser Val Ser T vr Leu Hat Asn Bar Met 705 750 770 530 1 Le Pro T /r Gly Val Ly s Arg Leu Glu Asp Uh.e As-ti Ala Ser Leu Lys
005 513 015
Asp Ala Leu Leu Lys Tyi l ie Tyr Asp As:i Arg Gl y Th t Leu I_e Gly 020 025 eoo ni i. Va 1 Mj: AL(_: LtU Ly* Mp Ly* Val M il A=n Thr Lííu S«r Thr M|:
B35 ai3 s í ;
11® Pro Phu Gln Le u Sor Lys Tyr Val Aep Asn. Gln Arg Leu Leu Ser 050 055 060
Thr Ptie Thr Glu Tyr l ie Lys Asa l ie 11® Asn. The 3 C L l ie Leu Asn t¿5 670 070 tBO Leu Arg Tyr Glu Ser Ly.s HÍS Leu Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
BR5 $43 04.5
Lys l ie Asn l ie GLv Ser Lys Va 1 AS h Phe Asp Pro ría Ai? Lys Aso
90C 905 913
C_r. l i o Cln Leu Ehe Asn Leu 01 u 3 e r 3er Lys ILe C_u V a l l i e Leu
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Lys Lys A la l i e Vnl Tv: Asn Ser f-.ct Tyr Clu Asn Ehe 3er Tnr 5c r
$50 $35
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965 573 $75
Ser Leu Asn Tyr t i y Olu l i e l i e Trp Thr Leu Oln Asp Thr Lys Olu
99C 995 553
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1155 1150 1135 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
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1295 1290 1295

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir proteína BoNT/A bicatenaria soluble, que comprende:
a) proporcionar una proteína BoNT/A monocatenaria soluble;
b) poner en contacto dicha proteína BoNT/A con endoproteinasa Lys-C (Lys-C) en solución; y
c) separar la proteína BoNT/A soluble de la Lys-C poniendo en contacto la solución que contiene la proteína BoNT/A soluble y Lys-C con una superficie hidrófoba, en donde la proteína BoNT/A soluble se une con preferencia a la superficie hidrófoba.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la proteína BoNT/A monocatenaria soluble se produce (i) en una célula huésped, mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicha proteína BoNT/A monocatenaria en un sistema de expresión; o (ii) en un sistema de expresión in vitro.
3. El método según la reivindicación 2, en donde la célula huésped es una célula huésped bacteriana y el sistema de expresión es un sistema de expresión bacteriano.
4. El método según la reivindicación 3, en donde el sistema de expresión bacteriano es un sistema de expresión de E. coli y la célula huésped es una célula de E. coli.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicha proteína BoNT/A monocatenaria soluble se expresa en el citoplasma de dicha célula huésped.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde dicha proteína BoNT/A monocatenaria soluble se expresa a un nivel de al menos 5 mg/l.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que comprende la lisis de la célula huésped bacteriana o de E. coli para proporcionar un homogeneizado de la célula huésped bacteriana o de E. coli que contiene dicha proteína soluble BoNT/A monocatenaria.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la superficie hidrófoba es una matriz inerte a la que se une un ligando que consiste en grupos arilo o alquilo.
9. El método según la reivindicación 8, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en: ligandos butilo, fenilo u octilo.
10. El método según la reivindicación 9, en donde se usa una superficie hidrófoba de alto rendimiento.
11. Un método para la producción de una composición farmacéutica o cosmética, que comprende las etapas de: a) producir una proteína BoNT/A bicatenaria soluble de acuerdo con el método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;
b) formular la proteína BoNT/A bicatenaria como una composición farmacéutica o cosmética.
12. El método según la reivindicación 11, en donde dicha composición comprende menos del 5% de BoNT/A monocatenaria, preferiblemente menos del 2% de BoNT/A monocatenaria.
13. El método según la reivindicación 11 o 12, en donde dicha composición contiene endoproteinasa Lys-C (Lys-C) en una concentración de menos de 400 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 300 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 200 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 100 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 50 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 20 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 15 pg de Lys-C por 100 ng de proteína BoNT/A, o menos de 10 pg de Lys-C por 100 ng de la proteína BoNT/A.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicha composición es una composición líquida o sólida.
15. El método según la reivindicación 14, en donde dicha composición comprende un agente estabilizante, siendo dicho agente preferiblemente un agente estabilizante no proteico.
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