KR20230152778A - 재조합 클로스트리디움 보툴리눔 신경독의 제조 - Google Patents

재조합 클로스트리디움 보툴리눔 신경독의 제조 Download PDF

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KR20230152778A
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Abstract

본 발명은 가용성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법을 제공한다.

Description

재조합 클로스트리디움 보툴리눔 신경독의 제조 {MANUFACTURE OF RECOMBINANT CLOSTRIDIUM BOTULINUM NEUROTOXINS}
본 발명은 혈청형 A의 재조합 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) [씨. 보툴리눔 (C. botulinum)] 신경독 (BoNT/A)의 생성 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 신경독 (BoNT)은 수많은 보조 단백질과 복합체를 형성한 BoNT 그 자체로 이루어진 대형 단백질 복합체의 형태로 씨. 보툴리눔에 의해 생산된다. 현재에는 적어도 7가지 상이한 부류의 보툴리눔 신경독, 즉 보툴리눔 신경독 혈청형 A, B, C1, D, E, F 및 G가 있는데, 이들 모두는 유사한 구조와 작용 방식을 공유하고 있다. 가능한 8번째 혈청형인 H가 최근에 보고되었지만, 그 서열은 아직까지 공개되지 않았다. 상이한 BoNT 혈청형은 특이적 중화성 항혈청에 의한 불활성화에 근거하여 구별될 수 있는데, 이러한 혈청형에 의한 분류는 아미노산 수준에 있어서의 서열 동일성 비율 (%)과 상관이 있다. 소정의 혈청형의 BoNT 단백질은 아미노산 서열 동일성 비율 (%)을 근거로 하여 상이한 아형으로 추가로 나눠진다.
BoNT는 공지된 가장 강력한 독소인데, 그의 마우스에 대한 중앙 치사 용량 (LD50) 값은 혈청형에 따라서 0.5 내지 5 ng/kg의 범위이다. BoNT는 위장관에서 흡수되고, 전신 순환계 내로 유입된 후에는, 콜린 작동성 신경 말단의 시냅스이전 막과 결합하여 신경전달물질인 아세틸콜린의 방출을 방지시킨다. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토브레빈(synaptobrevin)/소포-관련 막 단백질 (VAMP)을 절단하고; BoNT/C, BoNT/A 및 BoNT/E는 25 kDa의 시냅토솜-관련 단백질 (SNAP-25)을 절단하며; BoNT/C는 신탁신(syntaxin)을 절단한다.
자연에서는, 클로스트리디움성 신경독이 단일-쇄 폴리펩티드로서 합성되는데, 이는 단백질 분해적 절단 사건에 의해 번역후에 변형되어 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄를 형성한다. 절단은 특이적 절단 부위에서 일어나는데, 이는 종종 활성화 부위로서 지칭되고 쇄간 디술피드 결합을 제공하는 시스테인 잔기들 사이에 위치한다. 상기 독소의 활성 형태가 바로 이러한 2-쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자량을 갖는 중쇄 (H-쇄), 및 대략 50 kDa의 분자량을 갖는 경쇄 (L-쇄 또는 LC)라고 일컬어진다. H-쇄는 C-말단 표적화 성분 (HC 도메인) 및 N-말단 전위 성분 (HN 도메인)을 포함한다. 상기 절단 부위는 노출된 루프 영역 내에 있는, 상기 L-쇄와 전위 성분 사이에 위치한다 (표 1 참조). HC 도메인이 그의 표적 뉴런과 결합하고, 이와 같이 결합된 독소가 엔도솜을 통하여 세포 내로 내재화된 후, 상기 HN 도메인은 L-쇄를 엔도솜 막을 가로 질러 시토졸 내로 전위시키고, 이러한 L-쇄는 프로테아제 기능을 제공한다 (비-세포독성 프로테아제로도 알려짐).
비-세포독성 프로테아제는 SNARE 단백질 (예를 들어, SNAP-25, VAMP, 또는 신탁신)로서 공지된, 단백질 분해적으로 절단되는 세포내 수송 단백질에 의해 작용한다 (문헌 [Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.] 참조). 두문자어 SNARE는 용어 가용성 NSF 부착 수용체 (Soluble NSF Attachment Receptor)로부터 유래되는데, 여기서 NSF는 N-에틸말레이미드-감수성 인자를 의미한다. SNARE 단백질은 세포내 소포 융합에 필수적이므로, 소포 수송을 통하여 특정 세포로부터 분자를 분비하는 데 필수적이다. 프로테아제 기능은 아연-의존성 엔도펩티다제 활성이고, SNARE 단백질에 대한 높은 기질 특이성을 나타낸다. 따라서, 일단 목적하는 표적 세포로 전달되면, 비-세포독성 프로테아제는 표적 세포로부터의 세포성 분비를 억제할 수 있다. 클로스트리디움성 신경독의 L-쇄 프로테아제는 SNARE 단백질을 절단하는 비-세포독성 프로테아제이다.
보툴리눔 신경독은 이완성 근육 마비를 유발시킬 수 있는 능력이 있는 것으로 널리 공지되어 있다. 이러한 근육 이완 특성으로 인해, 보툴리눔 신경독 (예컨대 BoNT/A)이 각종 의학 및 미용 수술에 이용되어 왔는데, 이는 미간 라인 또는 운동과다 얼굴 라인, 두통, 반축 안면 경련, 방광의 과잉활동, 다한증, 코 입술 라인, 자궁경부 긴장이상, 안검 경련, 및 경직을 치료하는 것을 포함한다.
전통적으로, BoNT의 생성은 씨. 보툴리눔 박테리아를 배양한 다음, 보툴리눔 신경독 복합체를 단리 및 정제함으로써 수행되었다. 그러나, 이러한 방식으로 BoNT를 생성하는 것은 비효율적이고 낮은 단백질 수율을 제공한다. 또한, 씨. 보툴리눔은 포자-형성성 박테리아이므로, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) [이. 콜라이 (E. coli)]와 같은 박테리아의 배양에는 요구되지 않는 특수 배양 장비와 설비가 필요하다. BoNT의 사용이 증가함에 따라, BoNT를 생성하고 정제하기 위한 대체 방법을 개발하게 되었다. 특히, 이. 콜라이를 이용하여 BoNT를 생성시키는 방법이 개발되었다.
CNT를 발효 용액으로부터 정제하는 것은 (씨. 보툴리눔을 사용하든지 아니면 이. 콜라이를 사용하든지 간에) 특별한 도전과제인데, 이는 상기 신경독이 그 내부에, 프로세싱되지 않은 폴리펩티드, 부분적으로 프로세싱된 폴리펩티드 및 완전히 프로세싱된 폴리펩티드 (이들 모두는 매우 유사한 생화학적 및 물리적 특성을 갖고 있다)의 혼합물로서 함유되기 때문이다. 세포내 단백질 분해 활성이 경쇄와 루프 간의 펩티드 결합은 가수분해시켰지만, 루프와 중쇄의 N-말단 간의 펩티드 결합은 여전히 무손상인 채로 있다면, 부분적으로 프로세싱된 신경독이 전형적으로 생성된다. 더욱이, 세포내 단백질 분해 활성이 상기 중쇄로부터 루프 펩티드를 방출시켰지만, 이러한 루프 펩티드와 경쇄의 C-말단 간의 펩티드 결합이 아직 가수분해되지 않았다면, 부분적으로 프로세싱된 신경독이 또한 창출될 수 있다. 발효의 조건과 신경독의 유형에 따라서, 루프 펩티드가 결여된 완전하게 프로세싱된 폴리펩티드는 5% 내지 90%의 부분적으로 프로세싱되거나 또는 프로세싱되지 않은 폴리펩티드로 상당히 오염될 수 있다. 일부 경우에, 신경독은 주로 프로세싱되지 않았으므로, 치료적으로 사용하기에 앞서, 생물학적으로 활성이 되도록 하기 위해 엔도펩티다제로 처리할 필요가 있다.
선행 기술분야에는 프로세싱되지 않거나 또는 부분적으로 프로세싱된 전구체 단백질의 양을 감소시키기 위하여 이종 프로테아제를 이용하여 클로스트리디움성 신경독을 처리하기 위한 각종 시도가 기재되어 있다. 클로스트리디움성 신경독을 활성화시키는 데 가장 광범위하게 사용되며, 혈청형 B의 클로스트리디움성 신경독 (BoNT/B) 및 혈청형 E의 클로스트리디움성 신경독 (BoNT/E)을 활성화시키는 데 유용한 프로테아제인 트립신은 아마도 BoNT/A의 중쇄 서브유닛의 C-말단 근처에서의 단백질 분해 작용에 의해 부산물을 생성하는 것으로 여겨지며, 따라서 독소가 그의 세포성 수용체와 결합하는 것을 파괴하는 것으로 여겨진다. 이론상, 천연 숙주, 예컨대 BoNT/A를 생산하는 씨. 보툴리눔으로부터 단리된 내인성 프로테아제로부터 보다 특이적 절단 생성물이 예상된다.
본 발명자들은 기존에 각종 프로테아제, 예컨대 씨. 보툴리눔으로부터의 내인성 프로테아제 및 외인성 프로테아제 [프로테아제 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C) (이는 시판되고 있고 리소박터 엔자이모게네스 (Lysobacter enzymogenes)로부터 단리될 수 있다) 포함]를 확인하였다. 그러나, 이러한 엔도프로테이나제에 의한 재조합 BoNT/A의 절단이 천연 절단을 보다 정교하게 반영하긴 하지만, Lys-C를 사용하면, 실제적으로 고려해야 하는 새로운 사항이 대두된다. 특히, 재조합 BoNT/A의 절단 후에도, Lys-C는 반응 혼합물 내에 수일 동안 여전히 활성일 수 있다. 따라서, 최종 생성물 내의 Lys-C의 양을 감소시킴으로써, 신경독 제제의 질을 개선시키기 위한 수단 및 방법이 고도로 바람직하지만, 아직까지 이용 가능하지 않다.
따라서, 본 발명의 근원적인 기술적 문제는 전술된 필요성에 부합함으로써 신경독 폴리펩티드의 제조를 개선시키기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것으로서 보여질 수 있다. 구체적으로 언급하면, 관련 기술분야에서는 재조합 BoNT, 특히 활성화된 2-쇄 재조합 BoNT/A를 생성하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
이러한 기술적 문제는 다음의 청구범위 및 본원에서 명확히 규명된 실시양태들에 의해 해결된다.
재조합 BoNT/A 하위-혈청형의 생성은 본원에서 단일-쇄 BoNT/A 단백질로서 지칭된 단일 폴리펩티드로서 에스케리키아 콜라이에서 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 단일-쇄 단백질을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 단리시키면, 상기 단일-쇄 단백질이 절단되어 활성 독소를 형성해야만 하는데, 이러한 활성 독소는 단일 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 2-쇄 단백질이다.
본 발명자들은 기존에, 프로테아제 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)를 이용하여 재조합 단일-쇄 BoNT/A 하위-혈청형을 절단하면 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질 신경독, 즉 BoNT/A 경쇄와 중쇄의 이종이량체가 생성될 수 있다는 사실을 밝혀내었다. Lys-C 절단 부위는 N-말단 서열 분석 및 질량 분광측정법에 의해 내인성 단백질과 동일한 것으로 결정되었다. 따라서, Lys-C를 이용하여 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 생성하는 것이 유리한데, 이는 이로써, 진정한 활성 2-쇄 BoNT/A, 즉 천연 활성 2-쇄 BoNT/A와 본질적으로 동일한 2-쇄 BoNT/A가 생성되기 때문이다. 이와는 달리, 활성 2-쇄 BoNT 단백질을 생성하기 위해 사용되어 온 또 다른 통상적 프로테아제인 트립신은 상기 BoNT/A 단일-쇄 서열 내의 적어도 하나의 추가적 부위를 절단한다. 이러한 추가적 절단으로 인해, 생성된 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 효력이 저하된다.
일단 단일-쇄 BoNT/A 단백질이 Lys-C에 의해 절단되면, 최종적으로 순수한 생성물을 생성하도록 임의의 잔여 숙주 세포 단백질 및 Lys-C 프로테아제를 제거하기 위해 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 정제할 필요가 있다.
특히, 엔도프로테이나제 Lys-C 절단 시험으로부터, 본 발명자들은 Lys-C가 재조합 BoNT/A1 (rBoNT/A1)을 극히 저 농도에서 절단시키고 수일에 걸쳐 활성을 유지하였다는 사실을 밝혀내었다. 결과적으로, 상기 활성화된 독소를 벗어나 상기 프로테아제를 정제해낼 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
본 발명자들은 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)를 이용함으로써 활성화한 후 BoNT/A로부터 활성화 Lys-C 프로테아제 및 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 효율적인 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 놀랍게도, HIC가 상기 정제에서 회수된 활성 2-쇄 BoNT/A의 양을 최대화시켜 줄 뿐만 아니라 Lys-C 분해능, 즉 Lys-C 프로테아제의 제거를 상당히 개선시켜 준다는 사실을 밝혀내었다. HIC의 유리한 특성은 Lys-C 및 rBoNT/A의 생물물리학적 특징을 고려해 볼 때 직관에 반대되는 것인데; BoNT/A 및 Lys-C의 등전점 (pI) 및 순전하(net charge)에 근거해 보면, HIC가 아닌 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)가 상기 두 단백질을 분해시킬 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명은 청구범위에 명시된 바와 같은 방법을 제공함으로써, 상기 언급된 문제점들 중 한 가지 이상을 해결한다.
따라서, 본 발명은
a) 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 제공하는 단계;
b) 상기 BoNT/A 단백질을 용액 중에서 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)와 접촉시키는 단계; 및
c) 가용성 BoNT/A 단백질 및 Lys-C를 함유하는 용액을 소수성 표면과 접촉시킴으로써 상기 가용성 BoNT/A 단백질을 Lys-C로부터 분리시키는 단계 (여기서, 가용성 BoNT/A 단백질은 상기 소수성 표면과 우선적으로 결합된다)
를 포함하는, 가용성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법을 제공한다.
상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 이러한 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 시스템에서 발현시킴으로써 특정 숙주 세포에서 생성시킬 수 있는데, 여기서 임의로 상기 발현 시스템은 박테리아 발현 시스템이고, 바람직하게 상기 박테리아 발현 시스템은 이. 콜라이 발현 시스템이며, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 상기 숙주 세포의 세포질에서 또는 세포-무함유 시스템에서 발현될 수 있다. 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 배양물 1 L당 5 mg 이상의 수준으로 발현될 수 있다. 상기 방법은 숙주 세포를 용해시켜, 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 함유하는 숙주 세포 균질물을 제공하는 것을 포함할 수 있다 (바람직하게 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A는 숙주 세포 균질물 1 L당 5 mg 이상의 농도로 존재한다).
본 발명의 방법에 사용된 소수성 표면은 아릴 또는 알킬 기로 이루어진 리간드가 부착된 불활성 매트릭스일 수 있는데, 여기서 임의로 상기 리간드는 부틸, 페닐 또는 옥틸 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서 고 성능 소수성 표면이 사용된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 제공한다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 엔도프로테이나제 Lys-C가 실질적으로 없다. 바람직하게 상기 조성물은 100 ng BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C), 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C를 함유한다. 이러한 조성물은 치료적 및 미용적 처치에 사용하기 적합하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질; 계면활성제인 비-단백질 안정화제; 및 물을 포함하는 액상 제약 조성물을 제공하는데, 여기서 이러한 액상 제약 조성물은 단백질 안정화제를 포함하지 않고; 상기 액상 제약 조성물은 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)가 실질적으로 없다. 바람직하게 상기 액상 제약 조성물은 100 ng BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C를 함유한다. 상기 액상 제약 조성물은 염화나트륨, pH 5.5 내지 7.5를 유지하기 위한 완충제, 및 디사카라이드를 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 물은 멸균수이다.
본 발명은 또한, 요법에 사용하기 위한, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질, 조성물 또는 액상 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 의약을 제조하는 데 있어서의, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질, 조성물 또는 액상 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질, 조성물 또는 액상 제약 조성물을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A)
용어 "BoNT"는 보툴리눔 신경독을 의미하고 씨. 보툴리눔으로부터 수득 가능한 신경독, 예컨대 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 BoNT를 지칭한다. 또한 용어 "CNT" 및 "BoNT"에는 화학적 변형 또는 유전적 변형을 포함한 한 가지 이상의 변형을 포함하는 변형된 및 재조합 신경독이 포괄된다. 용어 "유전적 변형"은 하나 이상의 아미노산 염기의 결실, 치환 또는 부가를 초래하거나, 또는 상기 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 부가를 초래하는 하나 이상의 핵산 잔기의 결실, 치환 또는 부가를 의미한다.
BoNT/A 혈청형은 적어도 8개의 하위-혈청형 (아형으로서 공지되기도 함), 즉 BoNT/A1 내지 BoNT/A8로 나눠지는데, 이들은 84% 이상 98% 이하의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 있고; 소정의 아형 내의 BoNT/A 단백질은 보다 높은 아미노산 서열 동일성 비율 (%)을 공유한다. 표 1 (하기)은 전구체인 BoNT/A 아형의 천연 2-쇄 신경독을 나타내고, Lys-C에 의해 절단된 아미노산 서열을 포함하는 노출된 루프 (활성화 루프)를 확인시켜 준다.
<표 1>
표 1을 언급하면, LC, HN, HCN 및 HCC 영역에 대하여 표시된 아미노산 위치 (잔기)는 완전한 길이의 BoNT/A 단백질 서열 내의 상기 영역에 대한 아미노산 위치에 상응한다. 표 1에 제공된 유니프로트(UniProt) 고유 번호는 상이한 BoNT/A 하위-혈청형의 예이다. 따라서, 한 실시양태에서, 표 1에 표시된 LC, HN, HCN 및 HCC 영역의 아미노산 위치는 고유 번호로써 확인된, 완전한 길이의 BoNT/A 단백질 서열 내의 아미노산 위치에 상응한다.
본 발명의 방법을 이용하여, 프로세싱되지 않거나 또는 부분적으로 프로세싱된 BoNT/A에 의한 오염이 상당히 덜한 BoNT/A 2-쇄 조성물을 수득하는 것이 본 발명에 의해 가능한데, 이는 이들 오염물이 2-쇄 BoNT/A로 효율적으로 프로세싱되기 때문이다. 본 발명의 방법은 또한, 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 활성 2-쇄로 프로세싱하기 위해 사용된 Lys-C 효소를 효과적으로 제거시켜 줄 수 있다. 한 측면에서, 상기 2-쇄 BoNT/A는 천연 2-쇄 신경독인데, 여기서, 경쇄의 C-말단과 중쇄의 N-말단은 야생형 클로스트리디아(clostridia)로부터 단리된, 상응하는 완전하게 프로세싱된 2-쇄 BoNT/A와 동일하다.
본 발명에 따라서, 재조합 BoNT/A 2-쇄를 포함한 활성 BoNT/A 2-쇄는 단일-쇄 폴리펩티드로서 생성될 수 있는데, 이는 절단되어 단백질의 활성 2-쇄 형태를 형성한다.
본 방법을 이용하여, 임의의 BoNT/A 아형의 2-쇄 또는 그의 동족체 또는 유도체 [예를 들어, 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 폴리펩티드 및 그의 유도체 포함]를 생성할 수 있다. 본 발명의 상기 측면 및 다른 측면과 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 아미노산 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 결실 또는 말단절단을 포함한다.
BoNT/A 단일-쇄 단백질은 다음 유전자은행 번호에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다: CBZ04958.1, YP_002805603.1, ZP_02994746.1, YP_001788403.1, YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP_02614241.1, YP_001392361.1, YP_001255575.1. BoNT/A 단일-쇄 단백질은 다음에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다:
● A1 하위-혈청형: 유니파르크(UniParc) 고유 번호 UPI0000ED909E (유니프로트 고유 번호 P10845, 버전 159), 유니파르크 고유 번호 UPI0000EF85BD (유니프로트 고유 번호 S8B1U4, 버전 3, 또는 유니프로트 고유 번호 A2I2R4, 버전 41), 유니파르크 고유 번호 UPI0001A954C8 (유니프로트 고유 번호 C6K838, 버전 11), 유니파르크 고유 번호 UPI0000001386 (유니프로트 고유 번호 A5HZZ9, 버전 57), 유니파르크 고유 번호 UPI000003409D (유니프로트 고유 번호 A2I2U2, 버전 36), 유니파르크 고유 번호 UPI00016529B7 (유니프로트 고유 번호 B1A2D5, 버전 21), 유니파르크 고유 번호 UPI00027EE164 (유니프로트 고유 번호 J7FGZ9, 버전 6);
● A2 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI0000EF84BD (유니프로트 고유 번호 A2I2R5, 버전 28), 유니파르크 고유 번호 UPI0001C0B376 (유니프로트 고유 번호 D2KCK3, 버전 15), 유니파르크 고유 번호 UPI0001C32E84 (유니프로트 고유 번호 D3IV23, 버전 10), 유니파르크 고유 번호 UPI0001F3B30D (유니프로트 고유 번호 E5F1I1, 버전 11), 유니파르크 고유 번호 UPI000016EA88 (유니프로트 고유 번호 Q45894, 버전 116 또는 유니프로트 고유 번호 Q58GH1, 버전 51), 유니파르크 고유 번호 UPI000067C53E (유니프로트 고유 번호 Q2PPK6, 버전 33), 유니파르크 고유 번호 UPI000290BEB1 (유니프로트 고유 번호 K4GGE0, 버전 6);
● A3 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI00005B712C (유니프로트 고유 번호 Q3LRX9, 버전 38), 유니파르크 고유 번호 UPI00016DBC11 (유니프로트 고유 번호 B1L2G5, 버전 38 또는 유니프로트 고유 번호 D3IV24, 버전 11), 유니파르크 고유 번호 UPI000290C3D0 (유니프로트 고유 번호 K4G3L3, 버전 7);
● A4 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI00005B712D (유니프로트 고유 번호 Q3LRX8, 버전 35), 유니파르크 고유 번호 UPI00019DB885 (유니프로트 고유 번호 C3KS13, 버전 29);
● A5 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI0001AE7D6A (유니프로트 고유 번호 C7BEA8, 버전 14), 유니파르크 고유 번호 UPI000198BDAE (유니프로트 고유 번호 E8ZMW0, 버전 18 또는 유니프로트 고유 번호 C1IPK2, 버전 20); 또는
● A6 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI0001B7D251 (유니프로트 고유 번호 C9WWY7, 버전 13).
● A7 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI000290B995 (유니프로트 고유 번호 K4LN57).
● A8 하위-혈청형: 유니파르크 고유 번호 UPI000559A469 (유니프로트 고유 번호 A0A0A7PDB7); 유니파르크 고유 번호 UPI0003C9D2A1 (유니프로트 고유 번호 V5N8R1).
BoNT/A 단일-쇄 단백질은 상기 언급된 BoNT/A 폴리펩티드 서열 중 하나와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 상동체 또는 유도체인 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함한다. 보다 특별한 측면에서, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하고, 여기서 두 번째 폴리펩티드가 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나의 서열 내의 염기성 아미노산 잔기가 되도록 C-말단 절단된다. 상기 서열은 본 발명의 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 공지된 기질의 아미노산 서열을 나타낸다.
BoNT/A 단일-쇄 단백질은 상기 서열 내에 함유된 염기성 아미노산 잔기가 되도록 C-말단 절단된다 (표 1, 칼럼 LC 및 HN을 비교한다). 바람직한 측면에서, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질은 서열식별번호: 2 내지 7 및 13 내지 14로부터 선택된 서열 (예를 들어 혈청형 BoNT/A1, 서열식별번호: 2)을 포함한다.
BoNT/A 단일-쇄 단백질은 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나의 유도체, 또는 서열식별번호: 1의 유도체, 또는 본원에서 확인된 고유 번호에 상응하는 폴리펩티드 서열 중 하나를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 유도체는 하나 이상의 점 돌연변이 및/또는 하나 이상의 부가의 아미노산 잔기를 갖는다. 또 다른 측면에서, 상기 유도체는 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 10개 이하, 15개 이하의 점 돌연변이를 갖는다. 본원에 기재된 바와 같이, 프로테아제 활성을 결정하기 위한 활성 검정을 이용함으로써, 통상의 기술자는 소정의 유도체가 Lys-C에 의해 프로세싱되는 지를 결정할 수 있다.
상기 유도체는 염기성 아미노산 잔기를 비-염기성 아미노산 잔기로 변화시키는 점 돌연변이를 함유할 수 있다. 유도체는 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나, 서열식별번호: 1, 또는 본원에서 확인된 고유 번호에 상응하는 폴리펩티드 서열 중 하나와 50% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 유도체 또는 이러한 유도체를 포함하는 폴리펩티드는 Lys-C의 기질일 수 있고 Lys-C에 의해 단백질 분해적으로 절단 가능할 수 있다. 전형적인 예는, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄 내에 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 서열식별번호: 1의 유도체이다.
상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질은 (a) 서열식별번호: 1의 서열 (ATCC 3502, 유전자은행 수탁 번호 AAA23262의 BoNT/A), 또는 본원에서 확인된 고유 번호에 상응하는 폴리펩티드 서열 중 하나와 30% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. BoNT/A 단일-쇄 단백질은 서열식별번호: 15의 폴리펩티드 서열를 포함하거나, 또는 서열식별번호: 15의 서열과 30% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성"은 참조 아미노산 서열과 조회 서열 간의 동일성을 결정하는 것을 지칭하는데, 여기서 이들 서열은 최상위 매치가 수득되도록 정렬되고, 이는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 예를 들어, BLASTP, BLASTN, FASTA에서 성문화된 공개된 기술 또는 방법을 이용하여 계산할 수 있다 (Altschul 1990, J MoI Biol 215: 403). 동일성 % 값은 전체 아미노산 서열에 걸쳐 또는 아미노산 서열의 특정 영역에 걸쳐 계산할 수 있다. 예를 들어, 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 경우, 서열 동일성은 50개 이하 아미노산 (aa) 잔기, 100개 이하 aa, 150개 이하 aa, 250개 이하 aa, 300개 aa, 350개 aa, 400개 aa, 450개 aa, 500개 aa, 550개 aa, 600개 aa, 650개 aa, 700개 aa, 750개 aa, 800개 aa, 850개 aa, 900개 aa, 950개 aa, 1000개 aa, 1050개 aa, 1100개 aa, 1150개 aa, 1200개 aa, 1250개 aa 또는 그 초과의 잔기 내지 완전한 길이까지의 단일-쇄 BoNT/A 단백질 서열의 서열 길이 전반에 걸쳐 계산할 수 있다. 서열 동일성은 50개 이상 aa 잔기, 100개 이상 aa 잔기, 150개 이상 aa 잔기 또는 250개 이상 aa 잔기 전반에 걸쳐 계산할 수 있다.
각종 알고리즘에 근거한 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위하여 통상의 기술자에게 입수 가능하다. 이러한 맥락에서, 니들만과 분쉬(Needleman and Wunsch)의 알고리즘 또는 스미스와 워터만(Smith and Waterman)의 알고리즘이 특별히 신뢰 가능한 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하고 본원에 언급된 서열 동일성 값을 계산하기 위하여, 알고리즘 클러스탈(Clustal) W에 근거한 시판용 프로그램 DNASTAR 라저진 메갈라인(Lasergene MegAlign) 버전 7.1.0을, 다음 설정을 수반한 전체 서열 영역 전반에 걸쳐 사용하였다: 쌍을 이룬 정렬 파라미터: 갭 페널티: 10.00, 갭 길이 페널티: 0.10, 단백질 중량 매트릭스 고넷(Gonnet) 250 (달리 명시되지 않는 한, 서열 정렬에 대한 표준 설정으로서 항상 사용되어야 한다).
30% 이상은 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 100% 이하를 의미한다. 서열식별번호: 1의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질 서열의 서열 동일성은 서열식별번호: 1의 아미노산 위치 420 내지 466에 근거하여 결정할 수 있거나, 또는 상기 서열 동일성은 서열식별번호: 2 내지 7 또는 13 또는 14 중 어느 하나에 근거하여 결정할 수 있다. 달리 언급하면, BoNT/A 단일-쇄 단백질은, 예를 들어 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 아미노산 위치 420 내지 466 사이에서 발견된 폴리펩티드 서열과 30% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 또는 본원에서 확인된 고유 번호에 상응하는 폴리펩티드 서열 중 어느 하나를 포함한, BoNT/A 단일-쇄 단백질 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열과 30% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 정의에 따르는 폴리펩티드는, 예를 들어 씨. 보툴리눔, 씨. 테타니 (C. tetani) 또는 씨. 스포로게네스 (C. sporogenes)로부터 수득 가능하다. 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질은, 예를 들어, 자연 발생적 신경독이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 결실 또는 말단절단을 포함하는 그의 유도체일 수 있다. 예를 들어, 천연 신경독 HC 도메인 또는 그의 부분이 결여된 유도체, 또는 신경독 HC 도메인을 대체하는 다른 아미노산 잔기를 수반한 유도체 뿐만 아니라 부가의 경쇄, 또는 BoNT의 경쇄와 N-말단적으로 융합된 또 다른 단백질성 적하 분자를 수반한 유도체가 포괄된다.
BoNT/A 단일-쇄 단백질은 N- 또는 C-말단에 또는 내부 위치에 부가의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 부가의 아미노산 잔기는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 부가의 아미노산 서열은 검출 가능한 태그로서 기능할 수 있고/있거나 고체 지지체와의 결합을 허용해줄 수 있다. 특정 예는 His 태그 또는 GST 태그이다. 또 다른 예는, 바람직하게 C-말단에 부가된 스트렙태그(Streptag)를 함유하는 아미노산 서열 VPPTPGSAWSHPQFEK (서열식별번호: 12)이다.
또 다른 측면에서, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 생물학적 활성은 단백질 분해적 절단에 의해 조정될 수 있다. 많은 폴리펩티드의 기능이 단백질 분해적 프로세싱에 의해 조정될 수 있다는 사실은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "조정된"은 증가 또는 감소되거나, 활성화 또는 불활성화되는 것을 의미한다. 예를 들어, 많은 클로스트리디움성 신경독의 생물학적 활성은 단일 쇄 신경독을 2-쇄 신경독으로 단백질 분해적으로 프로세싱함으로써 증가되거나 촉발되는데, 여기서 2-쇄 신경독은 디술피드-브릿지를 통하여 공유적으로 연결되는 경쇄와 중쇄 폴리펩티드로 구성된다. 상기 신경독의 생물학적 활성은 적어도 3가지 별도의 활성을 포괄한다: 첫 번째 활성은 신경독의 경쇄에 의해 야기되는 "단백질 분해적 활성"이고, 이는 세포성 막 융합의 조절에 관여한 하나 이상의 폴리펩티드의 펩티드 결합을 가수분해시키는 데 책임이 있다. 두 번째 활성은 프로세싱된 신경독의 중쇄의 N-말단 끝에 의해 야기되는 "전위 활성"이고, 이는 경쇄를 리소좀 막을 가로질러 세포질 내로 수송하는 것에 관여한다. 세 번째 활성은 프로세싱된 신경독의 중쇄의 C-말단 끝에 의해 야기되는 "수용체 결합 활성"이고, 이는 표적 세포에 대한 신경독의 결합과 흡수에 관여한다. 바람직한 측면에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 생물학적 활성은 단백질 분해적 활성을 의미한다. 보다 바람직한 측면에서, 상기 용어는 증가된 단백질 분해적 활성을 의미한다.
클로스트리디움성 신경독의 생물학적 활성은 각종 시험 (이들 모두는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다)에 의해 측정할 수 있다. 이들 시험은 상기 언급된 활성들 중 한 가지 이상을 결정할 수 있게 해준다. 예를 들어, 문헌 ([Pearce et al., 1994 (Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994), Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77)]; 및 [Habermann et al., 1980 (Habermann E, Dreyer F, Bigalke H. (1980), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 311:33-40)])에 기재된 바와 같은 마우스 LD50 검정 또는 생체외 마우스 횡경막 신경 반격막 (MPN) 검정은 살아있는 유기체 상에서의 소정의 신경독 제제, 또는 단리된 신경근육 제제의 독성 효과를 결정할 수 있게 해준다. LD50 검정에서의 독성 효과를 확립하기 위하여, 신경독은 상기 언급된 세 가지 활성 각각에서 생물학적으로 활성이어야만 한다. 더욱이, 각종 기타 검정이 이용 가능하므로, 예를 들어 특정 신경독이 단백질 분해적으로 활성인지 아니면 이러한 신경독의 경쇄가 단백질 분해적으로 활성인지를 결정할 수 있게 해준다. 이러한 검정은, 예를 들어 BoNT/A를 SNAP-25와 접촉시키는 것에 근거한다. 또 다른 한편으론, SNAP-25의 절단 부위를 나타내는 펩티드를 사용할 수 있는데, 여기서 이러한 펩티드는 표지시켜 검출을 용이하게 할 수 있다. 바람직한 측면에서, 생물학적 활성은 상기 본원에 기재된 MPN 검정을 이용함으로써 결정된다.
상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 상기 핵산 분자는 임의로, 조절성 요소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 " 조절성 요소 "는 전사 및 번역을 포함한 유전자 발현의 조절성 요소를 지칭하고, tata 박스, 프로모터, 증강인자, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)-서열, IRES-영역, 폴리아데닐화 시그널, 말단 캡핑 구조 등과 같은 요소를 포함한다. 상기 조절성 요소는 하나 이상의 이종 조절성 요소 또는 하나 이상의 상동 조절성 요소를 포함할 수 있다. "상동 조절성 요소"는 그로부터 핵산 분자가 유래되는 야생형 세포의 조절성 요소인데, 이는 이러한 야생형 세포 내의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 유전자 발현을 조절하는 데 관여한다. "이종 조절성 요소"는 상기 야생형 세포 내의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 유전자 발현을 조절하는 데 관여하지 않는 조절성 요소이다. 유도성 발현을 위한 조절성 요소, 예컨대 유도성 프로모터를 사용할 수도 있다.
핵산 분자는, 예를 들어, hnRNA, mRNA, RNA, DNA, PNA, LNA, 및/또는 변형된 핵산 분자일 수 있다. 핵산 분자는 환상, 선형이거나, 게놈 또는 에피솜 내로 통합될 수 있다. 또한, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 콘카테머(concatemer)가 포괄된다. 더욱이, 핵산 분자는 세포내 수송을 위한 시그널 서열, 예컨대 세포내 구획 내로 수송하기 위한 또는 세포성 막을 가로질러 수송하기 위한 시그널을 코딩하는 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에 따라서, BoNT/A를 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포, 특히 박테리아 숙주 세포, 바람직하게 이. 콜라이 세포에서 고 수준의 발현을 유리하게 제공하도록 설계할 수 있다. 숙주 세포, 특히 박테리아 숙주 세포, 바람직하게 이. 콜라이 세포에서의 단백질 발현을 증가시키도록 핵산 분자를 설계하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 코딩 핵산 서열 내의 "느린 코돈"의 빈도 (발생 수)를 감소시키는 것을 포함한다.
한 측면에서, 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 이러한 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 생성시킨다. 특정 벡터가 상기 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 시험관내 및/또는 생체내 발현에 적합할 수 있다. 이러한 벡터는 일시적 및/또는 안정적 유전자 발현을 위한 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 조절성 요소 및/또는 선별 마커를 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 기원, 파지 기원, 또는 박테리아 기원일 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 pET-26b(+) 벡터일 수 있다.
BoNT/A 단일-쇄 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 내에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터 및 특히 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 번역하는 데 적합한 원핵 세포 및/또는 진핵 세포를 포괄한다. 상기 숙주 세포는 BoNT/A 단일-쇄 단백질 또는 그의 상동체를 발현하지 않는 숙주 세포일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동체"는 BoNT/A 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1의 BoNT/A 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러나, BoNT/A 단일-쇄 단백질 또는 그의 상동체를 발현하는 숙주 세포, 예컨대 야생형 숙주가 포괄되기도 한다. 예를 들어, 숙주 세포는 씨. 보툴리눔, 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 씨. 바라티이 (C. baratii) 및 씨. 테타니, 예컨대 혈청형 A, B 또는 F의 씨. 보툴리눔으로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포는 씨. 보툴리눔의 홀(Hall) 균주 (ATCC 3502); 씨. 보툴리눔의 NCTC 4587 및 NCTC 7272로서 공지되기도 한, BoNT/A 생산 균주 ATCC 19397; 씨. 보툴리눔의 BoNT/A 생산 균주 NCTC 2916; 씨. 보툴리눔의 BoNT/A2 생산 균주 교토(Kyoto)-F 또는 마우리티우스(Mauritius) / NCTC 9837; 씨. 보툴리눔의 BoNT/A3 생산 균주 A254 로치 마레(Loch Maree) / NCTC 2012; 씨. 보툴리눔의 BoNT/A4 및 B 생산 균주 CDC657; 씨. 보툴리눔의 BoNT/A5 및 B3' 생산 균주 H04402 065; 씨. 보툴리눔의 BoNT/B1 생산 균주 오크라(Okra) / NCTC 7273; 씨. 보툴리눔의 BoNT/B 및 F 생산 균주 CDC4013 / NCTC 12265; 또는 씨. 보툴리눔의 BoNT/F1 생산 균주 랑엘란섬(Langeland) / NCTC 10281일 수 있다. 상기 숙주 세포는 클로스트리디움 스포로게네스 (Clostridium sporogenes), 클로스트리디움 페르프린겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 비. 세레우스 (B. cereus), 비. 투링기엔시스 (B. thuringiensis), 비. 미코이디스 (B. mycoidis), 비. 더모프로테오리티쿠스 (B. thermoproteolyticus), 비. 안트라시스 (B. anthracis), 비. 메가테리움 (B. megaterium), 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 이. 콜라이, 또는 효모 세포일 수 있다. 바람직하게 숙주 세포는 이. 콜라이 숙주 세포, 특히 이. 콜라이 BL21 (DE3) 또는 BLR (DE3) 세포이다.
한 측면에서, BoNT/A 단일-쇄 단백질은 숙주 세포 내부에서 변형된다 (즉, 글리코실화되거나, 인산화되거나, 프로테아제에 의하여 프로세싱된다). 변형은 또한, 금속 이온을 포함한 비-단백질성 조인자를 부가하는 것을 포함한다. 숙주 세포는 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 발현의 유도인자를 포함할 수 있다. 이러한 발현의 유도인자는 숙주 세포 배양물 또는 그의 용해물 중에서의 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 양을 증가시키는 효과를 갖는 핵산 분자 또는 폴리펩티드 또는 화학적 실체 (작은 화학적 실체 포함)일 수 있다. 발현의 유도인자는, 예를 들어 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 전사 또는 번역을 증가시킬 수 있다. 상기 유도인자는, 예를 들어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 수단에 의해 발현될 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 유도인자는 특정 세포, 예를 들어 클로스트리디움성 세포로부터 단리될 수 있다.
단일-쇄 BoNT/A 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 상기 숙주 세포 내로 도입하고, 이러한 세포에서 상기 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 발현시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 이러한 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 상기 숙주 세포에서 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 전형적으로 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 바람직하게 이. 콜라이 세포이다. 이. 콜라이 숙주 세포는 이. 콜라이 BL21 (DE3) 또는 BLR (DE3) 세포일 수 있다.
바람직하게, BoNT/A 단일-쇄 단백질은 특정 세포에서 번역된다. 이러한 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 한 측면에서 상기 세포는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 또는 효모로부터 선택되는데; 이. 콜라이가 고도로 바람직한 숙주 세포이다. 또한, BoNT/A 단일-쇄 단백질을 야생형 세포, 즉 자연으로부터 단리된 세포, 예컨대 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 클로스트리디움 바라티이 (Clostridium baratii), 및 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani)의 임의의 공지된 단리물에서 번역시키는 것이 본 발명에 포괄된다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 숙주 세포가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
핵산 분자 또는 벡터를 숙주 세포 내로 운반하고 재조합 단백질로서의 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 특정 세포에서 발현시키기 위한 각종 표준 수단 및 방법이 통상의 기술자에게 입수 가능하다. 더욱이, 통상의 기술자는 세포 또는 세포 용해물로부터 단백질 및 폴리펩티드를 추출하기 위한 많은 표준 기술을 알고 있다 (예를 들어, 문헌 [Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998]; [The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2006]; [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000]). 이들 수단 및 방법 중 임의의 것이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
숙주 세포 또는 숙주 세포 용해물로부터 단백질을 추출하기 위한 전형적인 방법은 세포 용해물의 원심분리 (정화), 단백질의 황산암모늄 침전, 단백질의 재현탁, 재현탁된 단백질의 원심분리, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 등을 포함한다. 이러한 단계들을 상이한 순서로 여러 번 조합하는 것이 본 발명에 따라서 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 정제하는 데 유용할 수 있다.
다음에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, BoNT/A 단일-쇄 단백질을 Lys-C와 접촉시켜 활성 BoNT/A 2-쇄를 생성시킬 수 있다. 본 발명자들은 BoNT/A와 Lys-C의 반응 혼합물로부터 BoNT/A 2-쇄를 정제하기 위한 유리한 방법을 본 발명에 의해 개발하였다.
엔도프로테이나제 Lys-C
본원에 기재되는 바와 같이, 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)를 이용하여 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 절단하여 BoNT/A 단백질의 활성 2-쇄 형태를 형성한다. 용어 "Lys-C"는 리신에 대하여 C-말단적으로 펩티드 결합을 특이적으로 절단하는, 리소박터 엔자이모게네스로부터의 33 kDa 세린 엔도프로테이나제 Lys-C (리실 엔도펩티다제, LeK, 유전자은행 수탁 번호 Q7M135), 또는 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 상동체를 지칭한다. 한 실시양태에서, Lys-C와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 상동체는 Lys-C의 기능성 (즉, 단백질 분해 활성)을 보유하고 있다.
본 발명에 따라서, Lys-C 효소는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열로 이루어질 수 있는, 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드이다. 한 측면에서, 본 발명에 따라서 사용된 Lys-C 효소는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리펩티드 서열로 이루어진, 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드이다.
전형적으로, Lys-C의 상동체는 단일-쇄 보툴리눔 신경독 [예를 들어, 혈청형 A (BoNT/A)]을 가수분해시켜 2-쇄 보툴리눔 신경독 [예를 들어, 혈청형 A (BoNT/A)]을 생성시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "Lys-C"는 또한, 기능상 등가인 프로테아제, 예컨대 Lys-C와 동일한 절단 서열을 인식하고 Lys의 카르복실 측에서 가수분해시키는 프로테아제를 포괄한다. 또한, 상기 용어에는 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 프로테아제의 상동체가 포괄된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드"는 이러한 폴리펩티드의 촉매적 기능을 지칭하고, 상기 폴리펩티드가 특정 펩티드 결합을 가수분해시킬 수 있다는 것을 의미한다. 한 측면에서, "단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드"는 서열식별번호: 1 내지 7 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 가수분해시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 분해적으로 불활성인 폴리펩티드"는 이러한 폴리펩티드의 촉매적 기능을 지칭하고, 상기 폴리펩티드가 특정 펩티드 결합을 가수분해시킬 수 없다는 것을 의미한다.
통상의 기술자는 본원에 언급된 서열 정의에 따르는 Lys-C 폴리펩티드가 본 발명에 따라서 사용하기 위한 폴리펩티드인지를 결정할 수 있는데, 이는 상기 폴리펩티드의 단백질 분해 활성을 시험함으로써 수행된다. 단백질 분해 활성을 결정하기 위한 검정 또는 시험 시스템은 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 Lys-C 폴리펩티드를 시험 기질과 접촉시키는 것을 포함한다.
시험 기질은 전형적으로, Lys-C에 의해 절단 가능한 것으로 공지되어 있는 폴리펩티드이다. 바람직하게, 이러한 시험 기질은 클로스트리디움성 신경독 (CNT), 예컨대 BoNT 또는 그의 단편이다. 시험 기질은, 예를 들어 본원에서 단일-쇄 BoNT (scBoNT)로서 지명된, 절단되지 않고/프로세싱되지 않은 BoNT일 수 있고, 예를 들어 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 것 (예를 들어, scBoNT/A, scBoNT/B 등)일 수 있거나 또는 시험 기질은 파상풍 신경독 (TNT)일 수 있다. 또 다른 한편으론, 시험 기질은 클로스트리디움성 신경독의 특정 단편일 수 있는데, 이러한 단편은 서열식별번호: 1 내지 7 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 단편은 50개 이상 아미노산 잔기의 폴리펩티드 또는 49개 이하 아미노산 잔기의 펩티드일 수 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 50개 이상 아미노산 잔기를 수반한 분자를 지칭하는 반면, 용어 "펩티드"는 2개 내지 49개 아미노산 잔기를 수반한 분자를 지칭한다.
시험 기질은 경쇄 폴리펩티드, 즉 노출된 루프 펩티드 영역과 중쇄 폴리펩티드의 N-말단 절반, 즉 전위 도메인 HN을 포함하는 LHN으로 불리는 가용성 신경독 단편일 수 있다. 시험 기질은 서열식별번호: 2 내지 8 중 어느 하나로부터 선택된 펩티드일 수 있거나 또는 이러한 펩티드를 포함할 수 있다 (표 1 참조). 시험 기질은 2개 이상의 혈청형으로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 신경독일 수 있다.
Lys-C 효소, 그의 상동체 또는 유도체의 단백질 분해 활성을 결정하기 위한 검정은 전형적으로, 시험 기질을 그의 절단 생성물(들)로 전환시키는 정도를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩티드를 시험 기질과 접촉시킨 후에 생성된 하나 이상의 절단 생성물(들)이 관찰되거나 또는 절단 생성물(들)의 양에 있어서의 증가가 관찰되는 것이 이러한 폴리펩티드의 단백질 분해 활성을 시사한다. 상기 결정 단계는 기질과 절단 생성물(들)을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 비교는 기질의 양 및/또는 하나 이상의 절단 생성물(들)의 양을 결정하는 것을 포함할 수 있고, 또한 기질과 절단 생성물(들)의 비를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 단백질 분해 활성을 결정하기 위한 검정은 시험 샘플을 참조 샘플과 비교하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 참조 샘플은 전형적으로, (a) 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고 단백질 분해적으로 활성인 것으로 공지되어 있는 폴리펩티드 및 (b) (a)의 폴리펩티드에 의해 절단 가능한 것으로 공지된 시험 기질을 포함한다.
단백질 분해 활성을 결정하기 위한 검정은 전기영동에 의해 또는 칼럼 크로마토그래피, 및 임의로 분광측정 분석에 의해, 기질 (예를 들어, BoNT/A 단일-쇄 단백질)과 절단 생성물(들) (예를 들어, 활성 BoNT/A 2-쇄)을 분리시키는 것을 포함할 수 있다. 시험 기질의 감소 및/또는 생성물(들)의 증가를 보다 용이하게 검출하기 위하여, 시험 기질을 하나 이상의 표지로 표지시키는 것이 편리할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지"는 검출 가능한 마커를 의미하고, 이는, 예를 들어 방사성 표지, 항체 및/또는 형광성 표지를 포함한다. 시험 기질 및/또는 절단 생성물의 양은, 예를 들어 적어도 2개의 표지 간의 에너지 공명 전이에 근거한 방법을 포함한, 자가방사선 촬영술 또는 분광측정법의 방법에 의해 결정할 수 있다. 또 다른 한편으론, 면역학적 방법, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 검출에 사용할 수 있다.
바람직한 측면에서, 100 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.0 또는 PBS (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4)로부터 선택된 완충제를 이용하여 37℃ 하에 120분 내에 20% 초과, 바람직하게 95% 초과의 시험 기질이 절단 생성물, 예컨대 경쇄 및 중쇄로 전환되는 경우에, 특정 폴리펩티드는 단백질 분해적으로 활성이다. 시험 기질이 완전한 길이의 BoNT/A가 아니지만, 대신 예를 들어, 완전한 길이의 BoNT/A의 단편 또는 BoNT/A의 유도체인 경우에도, 동일한 조건이 적용된다. 이러한 경우에는 절단 생성물이 상이할 것이란 사실은 명백하다. 그러나, 통상의 기술자는 상응하는 절단 생성물을 정량화할 수 있다.
전형적으로, 100 ng의 단백질 분해적으로 활성인 Lys-C 폴리펩티드, 및 기질에 대하여 1:100의 몰 비가 상기 검정에 사용된다.
시간 경과에 따른 촉매 활성을 추적하기 위해 샘플을 일정 간격으로 취할 수 있다.
상기 검정은, 예를 들어 여러 가지 양의 단백질 분해적으로 활성인 Lys-C 폴리펩티드를 이용함으로써 변형될 수 있다.
서열식별번호: 9는 581개 잔기의 아미노산 길이를 갖는, 클로스트리디움 보툴리눔 균주 ATCC 3502, 유전자은행 수탁 번호: CAL82988.1로부터 유래된 단백질 분해적으로 불활성인 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 서열식별번호: 8은 서열식별번호: 9의 아미노산 잔기 1 내지 248이 결여된, 서열식별번호: 9의 단백질 분해적으로 활성인 유도체를 나타낸다.
용어 "서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드"는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 또한, 상기 용어는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 폴리펩티드는, 예를 들어 서열식별번호: 8에 제시된 서열에 대해 N- 또는 C-말단에 또는 내부 위치에, 또는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상 동일한 아미노산 서열에 대해 N- 또는 C-말단에 또는 내부 위치에 부가의 아미노산을 가질 수 있는데, 메티오닌이 상기 폴리펩티드의 N-말단에 존재할 수 있다. 또한, 상기 용어는, 예를 들어 서열식별번호: 8에 제시된 서열의 N- 또는 C-말단에 또는 내부 위치에, 또는 서열식별번호: 8과 서열상 50% 이상 동일한 서열의 N- 또는 C-말단에 또는 내부 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여된 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "서열 동일성" 및 서열 동일성을 계산하는 수단은 BoNT/A와 관련하여 본원에 정의되어 있고, 동일한 정의 및 수단이 또한, Lys-C의 논의에도 적용된다.
전형적으로, Lys-C 효소의 서열 동일성은 서열식별번호: 8 또는 9의 전체 길이에 걸쳐, 즉 각각 333 aa 또는 581 aa의 길이에 걸쳐 결정한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "50% 이상의 서열 동일성"은 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 서열 동일성을 의미한다.
단백질 분해적으로 활성인 Lys-C 폴리펩티드는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 참조 폴리펩티드 서열과 동일한 수의 아미노산을 가질 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 폴리펩티드는 부가의 아미노산 잔기 또는 더 적은 수의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드는 서열식별번호: 8 또는 9의 말단절단 돌연변이체, 또는 서열식별번호: 8 또는 9의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지거나 또는 이를 포함할 수 있다. 서열식별번호: 9의 말단절단 돌연변이체는, 예를 들어 아미노산 위치 249에 대한 N-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 말단절단 돌연변이체는 단백질 분해적으로 활성인 내부 말단절단 돌연변이체 및/또는 N- 또는 C-말단 말단절단 돌연변이체일 수 있다. 서열식별번호: 9의 말단절단 돌연변이체는 서열식별번호: 9의 아미노산 위치 1 내지 248이 결여될 수 있다. 또 다른 한편으론, 서열식별번호: 9의 말단절단 돌연변이체는 C-말단 말단절단 돌연변이체일 수 있다. 이러한 말단절단 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150개 이하 또는 170개 이하의 연속되는 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드는 200개 이상 아미노산 (aa) 잔기, 250개 이상 aa 잔기, 300개 이상 aa 잔기 또는 333개 이상 aa 잔기의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 또 다른 한편으론, 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드는 333개 이하 aa 잔기, 350개 이하 aa 잔기, 573개 이하 aa 잔기, 581개 이하 aa 잔기, 592개 이하 aa 잔기, 600개 이하 aa 잔기 또는 617개 이하 aa 잔기를 가질 수 있다.
단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드는 서열식별번호: 8의 폴리펩티드 쇄, 또는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열의 N- 또는 C-말단에 및/또는 내부 위치에 부가의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포괄할 수 있다. 이들 부가의 아미노산 잔기는 5개 이하, 10개 이하 또는 심지어 200개, 300개 이하 또는 400개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 부가의 아미노산 잔기는 단백질 분해 활성의 억제제로서 기능할 수 있다. 이들 부가의 아미노산 잔기는 프로테아제에 의해 제거될 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 폴리펩티드의 단백질 분해 활성을 억제하는 부가의 잔기는 배제된다. 부가의 아미노산 잔기는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 또 다른 측면에서, 부가의 아미노산 서열은 검출 가능한 태그로서 기능하고/하거나 고체 지지체와의 결합을 허용해 준다.
또 다른 측면에서, 서열식별번호: 8의 폴리펩티드 쇄, 또는 서열식별번호: 8의 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기를 교환시킴으로써 변형된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "교환시키는 것"은 특정 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 1개 아미노산 (aa), 2개 aa, 3개 aa, 4개 aa, 5개 aa, 6개 aa, 7개 aa, 8개 aa, 9개 aa, 10개 aa, 15개 aa, 20개 이하 aa 또는 50개 이하 aa를 상기 폴리펩티드 서열 내에서 대체시킬 수 있다. 이러한 교환은, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 기질 결합성 또는 단백질 분해 활성을 증가 또는 감소시킬 목적으로, 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다.
전형적으로, 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드는 기질 (예를 들어, 단일-쇄 BoNT/A 단백질)을 2개 이상의 천연 절단 생성물(들)이 되도록 가수분해시킬 수 있는 폴리펩티드를 포괄한다. 본 발명의 폴리펩티드는 기질을 2개 이상의 절단 생성물이 되도록 가수분해시킬 수 있는데, 이는 천연 절단 생성물과 동일하거나 상이하다. 바람직하게 상기 절단 생성물은 천연 절단 생성물과 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 절단 생성물" 또는 "천연 생성물"은 야생형 세포 배양물 (그로부터 기질이 유래된다) 내에서 동일한 기질로부터 생성된 생성물과 비교한 경우에 아미노산 서열에 있어서 동일한 생성물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 절단 생성물은 보툴리눔 신경독 또는 파상풍 신경독의 2-쇄 신경독이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 상기 2-쇄 신경독은 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 씨. 보툴리눔으로부터 단리된 신경독이다. 또한 또 다른 측면에서, 상기 2-쇄 신경독은 천연 2-쇄 BoNT/A 신경독이다.
상기 및 하기의 용어의 정의 및 설명은 필요한 부분만 약간 수정하여, 달리 표시되지 않는 한 본 명세서에 기재된 모든 측면에 적용된다는 사실을 이해해야 한다.
BoNT 생성 방법
본 발명은 폴리펩티드, 구체적으로 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 단백질 분해적으로 프로세싱하는 방법 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)를 이용하여 Lys-C로부터 생성된 활성-BoNT/A 2-쇄를 정제하는 수단에 있어서의 Lys-C의 용도에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 (a) Lys-C를 (b) BoNT/A 단일-쇄 단백질 (이러한 BoNT/A 단일-쇄 단백질은 Lys-C에 의한 단백질 분해의 영향을 받기 쉽다)과 접촉시키는 단계 (여기서, 이러한 접촉으로 인해, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질이 단백질 분해적으로 프로세싱되어, 바람직하게 활성 BoNT/A 2-쇄를 포함한 적어도 2가지 절단 생성물이 생성된다), 및 HIC를 이용하여 상기 활성 2-쇄를 정제하는 단계를 포함하는, 활성 BoNT/A 2-쇄를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 사용하여, 단백질 분해적으로 프로세싱된 클로스트리디움성 신경독 (CNT) 또는 보툴리눔 신경독 (BoNT), 구체적으로는 단백질 분해적으로 프로세싱된 BoNT/A, 즉 본원에 기재된 바와 같은 활성 BoNT/A 2-쇄를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여, 프로세싱되지 않거나 또는 부분적으로 프로세싱된 BoNT/A에 의한 오염이 상당히 덜한 활성 BoNT/A 2-쇄 조성물을 수득하는 것이 본 발명에 의해 가능한데, 이는 이들 오염물이 2-쇄 BoNT/A로 효율적으로 프로세싱되기 때문이다. 본 발명의 방법은 또한, 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 활성 2-쇄로 프로세싱하기 위해 사용된 Lys-C 효소를 효과적으로 제거시켜 줄 수 있는데, 즉 활성 BoNT/A 2-쇄의 정제를 개선시켜 준다.
따라서, 본 발명은 Lys-C로부터 BoNT/A 2-쇄를 정제 (분해)하는 것이 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 분리를 포함하는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 제공하는 단계; 상기 BoNT/A 단백질을 용액 중에서 엔도프로테이나제 Lys-C와 접촉시키는 단계; 및 BoNT/A 단백질 및 Lys-C를 함유하는 용액을 소수성 표면과 접촉시킴으로써 상기 BoNT/A 단백질을 Lys-C로부터 분리시키는 단계 (여기서, BoNT/A 단백질은 상기 소수성 표면과 우선적으로 결합된다)를 포함하는, 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법을 제공한다. 전형적으로, 단일-쇄 BoNT/A 단백질과 Lys-C를 접촉시키면, 단일-쇄 BoNT/A 단백질이 절단되어 가용성 2-쇄 형태가 발생된다. 바람직하게, Lys-C에 의한 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 절단 생성물은 천연 BoNT/A 절단 생성물과 동일하다. 전형적으로, BoNT/A의 단일-쇄 형태와 2-쇄 형태 둘 다는 가용성이다.
크로마토그래피 칼럼으로부터 수집된 하나 이상의 분획을, 예를 들어 침전 또는 한외여과에 의해 농축시킬 수 있다.
본 발명이 가용성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법 (상기 언급된 바와 같음)을 제공하는 한 실시양태에서, 이러한 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 숙주 세포, 바람직하게 박테리아 숙주 세포, 가장 바람직하게 이. 콜라이 숙주 세포에서 생성시키기 위한 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 제공된다.
임의의 적합한 발현 시스템을 사용하여 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 생성시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 발현 시스템은 생체내 또는 시험관내 (세포-무함유) 발현 시스템일 수 있다. 적합한 생체내 및 시험관내 발현 시스템의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 정의된 바와 같은 발현 시스템은 적합한 숙주 세포 및/또는 이러한 숙주 세포에 사용하기 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 발현 시스템은 박테리아 숙주 세포 및/또는 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 상기 박테리아 숙주 세포에서 발현시키는 데 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다.
단일-쇄 BoNT/A 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포에서 생성될 수 있다. 전형적으로 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이) 숙주 세포가 사용된다. 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 핵산 서열을 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 세포) 발현 시스템에서 발현시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 발현은 상기 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 상기 숙주 세포 내로 도입하고; 상기 핵산 분자를 번역하여 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 이. 콜라이 발현 시스템을 포함한 발현 시스템에서 이종 단백질을 발현시키는 데 사용되는 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 상기 이. 콜라이 숙주 세포의 세포질에서 발현된다.
가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질은 5 mg/L 이상 (예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500 mg/L, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL 또는 그 초과)의 수준 (농도)으로 발현될 수 있다. 전형적으로, 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 발현 수준은 세포 배양물 내에서의 단일-쇄 BoNT/A의 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 발현 수준은 조악한 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 숙주 세포) 균질물, 즉 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 발현하기 위해 사용된 숙주 세포 (예를 들어 박테리아 숙주 세포)의 조악한 균질물을 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, 조악한 숙주 세포 균질물, 예를 들어 조악한 박테리아 숙주 세포 균질물에서의 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 발현 수준은 5 mg/L 이상 (본원에 정의된 바와 같음)이다.
상기 언급된 바와 같은, 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법은 숙주 세포, 바람직하게 박테리아 숙주 세포, 가장 바람직하게 이. 콜라이 숙주 세포를 용해시켜, 상기 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 함유하는 숙주 세포 균질물, 보다 바람직하게 박테리아 숙주 세포 균질물, 가장 바람직하게 이. 콜라이 숙주 세포 균질물을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포, 특히 이. 콜라이 숙주 세포를 용해시키기 위해 사용된 방법 및 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그 예는 초음파처리 또는 프렌치 프레스(French press)의 사용을 포함한다.
씨. 보툴리눔 또는 이. 콜라이 발현된 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 정제는, 예를 들어 본질적으로 선행 기술분야에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다 (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461). 특히, 신경독의 정제는 한 가지 이상의 침전 및 추출 단계, 한 가지 이상의 농축 단계, 및 추가의 별개의 크로마토그래피 단계를 함유할 수 있다. 재조합 단일 쇄 BoNT/A 및 그의 정제는 선행 기술분야에 기재되어 있다 (Rummel et al., 2004, Mol Microbiol. 51:631-43).
BoNT/A 단일-쇄 단백질, 또는 그의 유도체를 생성하기 위해 사용된 박테리아 숙주 세포는 씨. 보툴리눔 또는 이. 콜라이일 수 있다. 발효시키는 경우에는, 문헌 [DasGupta B. R. et al. in Toxicon, vol. 22, No.3, p. 414 to 424, 1984]에 기재된 공정을 사용할 수 있다. 따라서, 0.5% 효모 추출물 및 0.6% 오토클레이브 처리된 효모 페이스트를 2%의 N-Z-아민 유형 A 배지에 가하고, 4 M NaOH의 도움으로 7.2의 pH가 조정될 것이며, 이러한 방식으로 제조된 배지는 나중에 오토클레이브 처리될 것이다. 상기 배지에 별도로 오토클레이브 처리된 글루코스 (용적당 20 중량%)를 가하여, 상기 배지 중에서의 글루코스의 최종 농도가 0.5%가 되도록 할 수 있다. 인큐베이션은, 예를 들어 37℃ 하에 교반하지 않으면서 일어날 수 있는데, 여기서 발효는, 예를 들어 96시간 후에 중단된다. 배치식 발효, 반-배치식 발효, 반복된 배치식 발효 또는 연속식 발효를 사용할 수 있다.
실제적 발효가 발생하고 발효 배지를 세포로부터 분리시킨 후, 상기 발효 배지는 큰 단백질을 제거할 목적으로 첫 번째 침전을 진행할 수 있다. 이러한 침전은 바람직하게 산 침전이다. 이러한 산 침전에 대한 반응 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 전형적으로 1.5 M H2SO4를 사용하여, 상등액을 3.5의 pH가 되도록 산성화시킬 수 있다. 원심분리는 통상적으로 4℃에서 2400x g로 20분 동안 일어난다. 원심분리를 통하여 수득한 펠릿은 물로 세척할 수 있는데, 바람직하게는 반복해서 세척한다. 연속해서, 상기 펠릿을 0.1 M 시트르산-트리소듐 시트레이트 완충제, pH 5.5를 이용하여, 예를 들어 1시간 동안 추출할 수 있다. 연속해서, 추가의 원심분리 단계, 예를 들어 4℃에서 9800x g로 20분 동안 원심분리를 수행할 수 있다. 이어서, 이로써 수득된 펠릿은 임의로, 앞서 기재된 바와 같이 다시 추출할 수 있다. 그 다음, 이러한 추출 상등액, 및 추출을 반복하는 경우의 양 상등액을 프로타민 술페이트 침전시킬 수 있다. 이러한 침전은, 예를 들어 8℃에서 밤새 지속될 수 있다. 연속해서, 침전물을, 예를 들어 4℃에서 12,000x g로 20분 동안 원심분리시킬 수 있다. 원심분리의 상등액을 침전, 예컨대 황산암모늄 침전시킴으로써, 보다 큰 다른 단백질을 제거할 수 있다. 황산암모늄 침전 단계 후, 또 다른 원심분리 단계를 가할 수 있고, 연속해서 이와 같이 수득된 펠릿을 재용해시킬 수 있으며, 임의로 이를 투석시킬 수 있다. 바람직하게는 투석되고 다시 원심분리된 추출물을 대상으로 하여, 상기 신경독을 정제할 목적으로 연속해서 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다. 각각의 크로마토그래피 단계는 오염물질, 예컨대 프로타민 술페이트, 잔여 DNA, 보다 작은 단백질 및 중간 크기 단백질의 일부뿐만 아니라 보툴리눔 신경독 단백질 복합체의 적혈구응집소를 제거하기 위해 제공된다. 이러한 목적을 위하여, 한 가지 이상의 크로마토그래피 단계를 바람직한 실시양태에서 사용할 수 있다. 임의로, 예를 들어 마지막 크로마토그래피 단계의 용출액을 여과시켜 미생물을 제거할 수 있다. 임의로, 이러한 용출액을 희석시킨 후에 여과하고 적합한 아주반트를 가할 수 있다. 추가의 단계 동안, 아주반트를 부가한 후에 또 다른 멸균성 여과를 수행할 수 있다. 한 측면에서, 여과는 반응 용기에서 수행한 다음, 동결건조의 단계를 수행할 수 있다.
상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 숙주 세포 또는 숙주 세포 용해물로부터 단리시킨 후에, 이를 Lys-C와 접촉시킨 다음, 본 발명의 방법을 수행할 수 있다.
본 발명의 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 Lys-C와 접촉시키는 경우, Lys-C의 단백질 분해 작용이 L-쇄 프로테아제 성분과 전위 성분 사이의 부위에서 상기 단일-쇄 단백질을 절단하여 2-쇄 단백질을 생성시키는데, 여기서 2개의 쇄는 디술피드 브릿지에 의해 연결된다. 예를 들어, 활성화 부위에서 단일-쇄 BoNT/A1, A2 및 A4-A6의 절단 후에 형성된 2개의 쇄는 아미노산 잔기 1 내지 438의 첫 번째 쇄 및 아미노산 잔기 449 내지 1296의 두 번째 쇄 (A6에서는 제외되므로, 두 번째 쇄는 아미노산 잔기 449 내지 1297을 갖는다)인데, 잔기 439 내지 447이 절단 사건에 의해 제거된다. 활성화 부위에서 단일-쇄 BoNT/A3의 절단 후에 형성된 2개의 쇄는 아미노산 잔기 1 내지 434의 첫 번째 쇄 및 아미노산 잔기 445 내지 1292의 두 번째 쇄인데, 잔기 435 내지 444가 절단 사건에 의해 제거된다. 따라서, Lys-C를 사용하여, 단일-쇄 폴리펩티드를 활성 2-쇄 형태로 전환시킴으로써 이러한 단일-쇄 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 유리하게도, Lys-C를 사용하는 것은 BoNT/A 내로 외인성 (비-천연) 절단 부위를 조작할 필요가 없다는 것을 의미하고, 또한 천연 BoNT/A 2-쇄의 생성을 가능하게 해준다.
한 실시양태에서, Lys-C에 대한 언급은 본원에 기재된 바와 같은, Lys-C와 동일한 프로테아제 절단 부위에서 절단시키는 Lys-C-유사 및 변이체 효소를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "접촉시키는 것"은 적어도 2가지 상이한 화합물이 이러한 화합물들의 물리적 및/또는 화학적 상호 작용을 허용하도록 물리적으로 근접하게 되는 것을 지칭한다. 본 발명의 방법에 따라서, 상기 2가지 상이한 화합물은 BoNT/A 단일-쇄 단백질 및 Lys-C인데, 이들은 용액 내에 포함된다. 접촉시키는 것은 BoNT/A 단일-쇄 단백질과 Lys-C의 상호 작용을 허용하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 수행한다.
용어 "단백질 분해의 영향을 받기 쉬운" 것은 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 특정 특색 또는 요구 사항을 지칭하고, 상기 BoNT/A 단일-쇄 단백질이 Lys-C에 의해 단백질 분해적으로 절단 가능하다는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 달리 언급하면, 용어 "단백질 분해의 영향을 받기 쉬운" 것은 BoNT/A 단일-쇄 단백질이, Lys-C의 기질로서 기능하도록 허용해 주는 프로테아제 인식 및 절단 부위를 포함한다는 것을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, BoNT/A 단일-쇄 단백질은 Lys-C의 기질이고, 단백질 분해적으로 프로세싱되어 2개 이상의 절단 생성물로 된다 (바람직하게 단지 2개의 펩티드 - L-쇄 또는 그의 단편과 H-쇄 또는 그의 단편이 디술피드 결합을 통하여 함께 연결된다). 상기 본원에 기재된 검정을 이용하여, 통상의 기술자는 소정의 BoNT/A 단일-쇄 단백질이 첫 번째 폴리펩티드의 기질인지의 여부와, 이에 따라 본 발명의 정의에 따르는 "두 번째 폴리펩티드"인지를 시험할 수 있다. 용어 " 적어도 2개의 절단 생성물 "은, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개 이하 및 6개 이하 절단 생성물을 포함한다.
상기 방법은, 예를 들어 BoNT/A 2-쇄를 포함하는 제약 조성물을 제조하기 위하여 또는 질량 분광측정법의 방법에 사용된 폴리펩티드 단편을 생성시키기 위하여 사용될 수 있다. Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질은 BoNT/A 2-쇄의 제조 공정 내의 각종 단계에서 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질의 접촉 단계는 특정 세포 내에서, 예컨대 이러한 세포에서 Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 발현시킴으로써 일어날 수 있다.
또 다른 한편으론, 상기 접촉 단계는 세포 용해물 또는 정제된 세포 용해물에서 일어난다. 이는 Lys-C를 상기 용해물 또는 정제된 용해물에 부가하는 것을 포괄한다. BoNT/A 단일-쇄 단백질을 세포 용해물로부터 정제하는 동안 각종 단계에서 Lys-C를 부가할 수 있다. 예를 들어, Lys-C는 다음 과정 이전 또는 후에 부가할 수 있다: 단백질 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피.
상기 접촉 단계는 Lys-C가 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 절단시키기에 충분한 시간 동안 및 조건하에 인큐베이션하는 것을 필요로 한다. 예시되는 조건은 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0 또는 PBS (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4)로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제를 부가하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 완충제 조건은 100 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 포함한다. "절단시키기에 충분한 시간"은 상기 본원에 기재된 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 한 측면에서, 상기 "절단시키기에 충분한 시간"은 단백질 분해적으로 프로세싱된 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 조성물이 가져야 하는 절단 정도에 좌우된다. 한 측면에서, 상기 방법은 Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 30분, 60분, 120분 이상 또는 240분 이상 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질은 30분, 60분, 120분, 240분, 480분 이하 또는 600분 이하 동안 인큐베이션한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 Lys-C와 BoNT/A 단일-쇄 단백질을 4℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 1시간 이하, 2시간, 4시간, 6시간, 10시간 이하 또는 16시간 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
본 발명이 가용성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법 (상기 언급된 바와 같음)을 제공하는 한 실시양태에서, 상기 방법은 가용성 BoNT/A 단백질 및 Lys-C를 함유하는 용액을 소수성 표면과 접촉시킴으로써 가용성 BoNT/A 단백질을 Lys-C로부터 분리시키는 것을 포함하는데, 여기서 가용성 BoNT/A 단백질은 상기 소수성 표면과 우선적으로 결합된다.
본 발명자들은 활성화된 2-쇄 폴리펩티드를 Lys-C로부터 분리시키기 위해 소수성 정제 공정을 이용함으로써 활성화된 2-쇄 BoNT/A 단백질을 고 수율로 수득할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 놀랍게도, 이러한 공정은 이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 표준 정제 (본 발명자들은 이러한 표준 정제가 활성화된 2-쇄 폴리펩티드를 Lys-C로부터 분리시키는 데 덜 유효하다는 사실을 밝혀내었다)에 비해 탁월한 정제를 제공한다. 또한, 상기 공정은 유리하게도, 활성화 프로테아제가 없는, 활성화된 2-쇄 BoNT/A 단백질을 제공하므로, 일반적인 정제 공정의 일부로서, 요법에 사용하기 적합하다.
본원에 기재된 바와 같이, 활성 재조합 BoNT/A를 생성하기 위해서는, 상기 분자를 활성 2-쇄 형태로 절단시키는 단백질 분해 단계가 필요하다. 이러한 절단은 엔도프로테이나제 Lys-C를 이용하는 시험관내 활성화 단계에 의해 달성될 수 있다. 이러한 활성화 단계 후, 최종 생성물로부터 Lys-C를 제거하는 것이 중요한데, 이는 또한 BoNT/A의 임의의 추가 비-특이적 절단을 방지시켜 준다.
다음 표 2에 제시된 바와 같이, Lys-C 및 BoNT/A의 계산된 등전점 (pI)은 각각 6.70 및 6.05인데, 이는 상기 두 단백질의 분리가 두 분자 간의 전하 차이를 활용하는 이온 교환 (IEX) 크로마토그래피에 의해 달성되어야 한다는 것을 나타낸다. 단백질의 순전하는 그의 주변 환경의 pH에 의해 영향을 받고, 그것이 양성자를 획득하는지 아니면 상실하는지에 따라 보다 양으로 하전되거나 또는 음으로 하전될 것이다. pI는 특정 분자가 전기적 전하를 전혀 수반하지 않는 pH 값이므로, 하전된 IEX 매질과 상호 작용하지 않을 것이다. 이는 특정 단백질이 그의 pI를 초과하는 pH 하에 있는 경우에는, 순 음전하를 수반하게 될 것이고 양으로 하전된 매질, 예컨대 음이온 교환제와 결합될 것이란 사실을 의미한다. 유사하게, 완충제 pH가 상기 pI 미만인 경우, 상기 단백질은 순 양전하를 수반하게 될 것이고 음이온 교환제와 결합하지 않을 것이다.
더욱이, 표 2에 예시되는 바와 같이, BoNT/A와 Lys-C는 유사한 평균 소수친수도 (hydropathicity)를 갖고 있지만, pH 4.5 및 8.0에서 큰 전하 차이를 나타낸다. 이러한 원리에 근거하여, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)를 이용하여 BoNT/A와 Lys-C를 분해 (분리)할 수 있는 것으로 예상될 것이다. IEX는 간단하고도 저렴한 크로마토그래피 방법인데, 이는 칼럼 상으로 부하된 단백질이 침전에 의한 단백질 상실을 초래할 수 있는 고 염 완충제 내에 반드시 있을 필요가 없기 때문이다.
본 발명자들은 pH 8에서 가교 결합된 아가로스 비드에 부착된 강한 관능기와 약한 관능기 둘 다를 이용하여, 각종 음이온 교환 칼럼을 시험하였다. BoNT/A의 용출과 비교한 경우, 예상치 못하게도 Lys-C가 유사한 이온 강도에서 용출된 것으로 밝혀졌는데 (표 3; 도 7 내지 10), 이는 Lys-C가 예상된 대로 분리되지 않았고 최종 정제된 BoNT/A 생성물 내에 존재할 것이므로 추가의 BoNT/A 분해 가능성이 더 있다는 것을 표시한다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하였다. 보다 상세히 언급하면, 본 발명자들은 놀랍게도, 최적의 Lys-C-BoNT/A 분리가 소수성 분리 표면을 사용함으로써 [예를 들어, 이들 단백질과 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 매트릭스/수지의 소수성 표면 간의 가역적 상호 작용을 활용함으로써 단백질의 표면 소수성 상의 차이에 따라서 단백질을 분리시키는 HIC에 의해] 달성된다는 사실을 확인하였다.
전형적으로, 활성 BoNT/A 2-쇄는, HIC 수지/매트릭스 (이들 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다)의 소수성 표면에 대한 Lys-C의 결합과 비교해 이러한 소수성 표면과 우선적으로 결합된다. "우선적" 결합은 상기 소수성 표면에 대한 Lys-C의 결합과 비교해 소수성 표면에 대한 활성 BoNT/A 2-쇄의 결합이 증가되거나 개선된 것으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 활성 BoNT/A 2-쇄는 상기 소수성 표면에 대한 Lys-C의 친화도의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 100배 또는 그 초과로 상기 소수성 표면과 결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성 BoNT/A 2-쇄는 상기 소수성 표면에 대한 Lys-C의 친화도의 적어도 5배, 또는 적어도 10배로 상기 소수성 표면과 결합된다.
한 실시양태에서, 소수성 표면은 아릴 또는 알킬 기를 포함하거나 또는 이로 이루어진 리간드가 부착되는 불활성 매트릭스/수지이다.
용어 "아릴"은 방향족 기, 예를 들어 페닐, 나프틸, 티에닐, 및 인돌릴을 지칭한다.
용어 "알킬"은 직쇄, 측쇄, 사이클릭 기, 및 그의 조합을 포함한 지방족 기를 지칭한다. 알킬 기는 1개 내지 12개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필 (예를 들어, n-프로필, 이소프로필), 부틸 (예를 들어, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸), 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸과 같은 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 소수성 표면은 부틸, 페닐 또는 옥틸 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드를 포함한다.
한 실시양태에서, 소수성 표면은 부틸 리간드를 포함한다. 한 실시양태에서, 소수성 표면은 페닐 리간드를 포함한다. 한 실시양태에서, 소수성 표면은 옥틸 리간드를 포함한다.
소수성 표면은 적당한 소수성 리간드가 부착된 임의의 적합한 불활성 매트릭스/수지를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 불활성 매트릭스/수지는 실리카, 가교결합된 덱스트란, 가교결합된 폴리아크릴아미드 또는 가교결합된 아가로스 등으로부터 선택될 수 있다. 또한, 특히 폴리펩티드, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 자연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암(gabbro), 및 자철석(magnetite)이 포함된다. 불활성 매트릭스는, 예를 들어 세파로스, 세파덱스, 아가로스, 세파셀, 마이크로-셀룰로스, 및 알지네이트-비드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리사카라이드 매트릭스이다. 또 다른 측면에서, 상기 불활성 매트릭스/수지는 유리-비드, 및/또는 폴리펩티드 매트릭스로 이루어질 수 있다.
불활성 매트릭스/수지는 임의의 적합한 구조적 입체 배치 또는 배열을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 매트릭스/수지는 비드에서와 같은 구형, 또는 시험 튜브의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면에서와 같은 원통형일 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 매트릭스는 불규칙하거나 또는 편평할 수 있는데, 예컨대 시트 또는 시험 스트립일 수 있다.
본 발명자들은 불활성 매트릭스/수지, 예컨대 가교 결합된 아가로스 또는 폴리스티렌 비드와 커플링된, 알킬 또는 아릴 기, 예를 들어 부틸, 페닐, 및 옥틸 리간드를 함유하는 크로마토그래피 매트릭스/수지를 이용하는 HIC를 사용하는 경우에, BoNT/A로부터 Lys-C를 분리시키는 데 특히 바람직한 결과가 수득된다는 사실을 밝혀내었다 (표 4; 도 1 내지 3).
HIC를 사용하면, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)와 비교해 활성 BoNT/A 2-쇄로부터의 Lys-C의 분해가 개선된다.
"고속 유량(fast flow)" HIC 크로마토그래피 수지/매트릭스가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. "고속 유량" 수지/매트릭스는 표준 HIC 수지/매트릭스보다 더 균일한 평균 입자 크기를 갖는 수지/매트릭스로서 정의될 수 있고, 보다 작은 입자를 사용할 것이다. 구체적으로 언급하면, "고속 유량" 수지/매트릭스는 보다 작은 입자 크기의 더 협소한 범위를 가질 것이다. 입자 크기는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적당한 방식, 예를 들어 평균 입자 직경의 측면에서 정량화할 수 있다. 전형적으로, "고속 유량" 수지/매트릭스는 100 μm 미만, 95 μm 미만, 90 μm 미만 또는 그 이하의 평균 직경의 입자 (예를 들어, 비드)를 포함할 것이다. 바람직한 실시양태에서, "고속 유량" 수지/매트릭스의 평균 직경은 90 μm 미만이다. 전형적으로, "고속 유량" 수지/매트릭스의 평균 입자 확산은 약 20 내지 약 180 μm, 약 30 내지 약 170 μm, 약 40 내지 약 170 μm, 약 40 내지 약 165 μm일 것이다. 바람직한 실시양태에서, "고속 유량" 수지/매트릭스의 평균 입자 확산은 약 44 내지 약 165 μm이다.
바람직한 실시양태에서, 고 성능 HIC 수지, 예컨대 페닐 고 성능 (PhHP) 또는 부틸 고 성능 (BuHP) 수지가 사용된다. 이러한 고 성능 HIC 매트릭스/수지는 전형적으로, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX), 심지어 고 성능 IEX 매트릭스/수지, 예컨대 4급 아민 고 성능 (QHP) 매트릭스/수지가 사용되는 경우와 비교해, 활성 BoNT/A 2-쇄로부터의 Lys-C의 분해를 개선시켜 준다. 본원에 논의된 바와 같이, 고 성능 수지/매트릭스와 다른 것과의 주요 차이점은 평균 입자 크기 (이는 또한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적당한 방식, 예를 들어 평균 입자 직경으로 정량화될 수 있다)가 더 작고 (34 μm 대 90 μm) 더 균일하여 (24 내지 44 μm 대 44 내지 165 μm), 개선된 분해를 초래한다는 것이다.
고 성능 HIC 수지/매트릭스는 전형적으로, 표준 HIC 수지/매트릭스, 또는 심지어 본원에 정의된 바와 같은 "고속 유량" 수지/매트릭스보다 더 균일한 평균 입자 크기를 가지며 더 작은 입자를 사용할 것이다. 구체적으로 언급하면, 고 성능 HIC 수지/매트릭스는 표준 HIC 수지/매트릭스, 또는 심지어 본원에 정의된 바와 같은 "고속 유량" 수지/매트릭스보다 더 작은 입자 크기의 더 협소한 범위를 가질 것이다.
따라서, 본 발명은 고 성능 HIC 수지/매트릭스의 사용을 제공한다. 전형적으로, 고 성능 HIC 수지/매트릭스는 70 μm 미만, 60 μm 미만, 50 μm 미만, 40 μm 미만, 30 μm 미만 또는 그 이하의 평균 입자 직경을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 고 성능 HIC 수지/매트릭스는 40 μm 미만, 보다 바람직하게 35 μm 미만, 예를 들어 34 μm의 평균 입자 직경을 갖는다.
전형적으로, 고 성능 HIC 수지/매트릭스의 평균 입자 확산은 약 10 내지 약 60 μm, 약 10 내지 약 50 μm, 약 20 내지 약 50 μm, 약 20 내지 약 44 μm일 것이다. 바람직한 실시양태에서, 고 성능 수지/매트릭스의 평균 입자 확산은 약 22 내지 약 44 μm이다.
전형적으로, 활성화된 2-쇄 BoNT/A 단백질을 Lys-C로부터 분리시키는 소수성 정제의 공정은 Lys-C의 농도를 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 또는 50배 이상 감소시킨다. 바람직한 실시양태에서, 활성화된 2-쇄 BoNT/A 단백질을 Lys-C로부터 분리시키는 소수성 정제의 공정은 Lys-C의 농도를 10배 이상 감소시킨다.
활성화된 2-쇄 BoNT/A를 Lys-C로부터 분리시킬 수 있는 소수성 정제의 능력은 또한, 소수성 정제 단계 후에 남아 있는 상기 활성화된 2-쇄 BoNT/A 및 Lys-C를 포함하는 출발 용액 중에 함유된 Lys-C의 비율(%) 면에서 정량화할 수 있다. 전형적으로, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 그 아래 (0% 포함)의 Lys-C가 소수성 정제 단계 후에 BoNT/A 2-쇄 생성물에 남아있다. 바람직하게, 50% 미만, 보다 바람직하게 25% 미만, 보다 더 바람직하게 10% 미만의 Lys-C가 소수성 정제 단계 후에 BoNT/A 2-쇄 생성물에 남아있다.
관련 측면에서, 본 발명은 가용성 2-쇄 BoNT/A 단백질의 생성 방법 (상기 언급된 바와 같음)에 의해 수득 가능한 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질 (상기 언급된 바와 같음)을 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 이러한 조성물은 Lys-C가 실질적으로 없다.
따라서, 상기 조성물은 유리하게도, Lys-C 프로테아제 (단일-쇄 폴리펩티드를 활성 2-쇄 형태로 전환시킴으로써 단일-쇄 폴리펩티드를 활성화시키기 위하여 사용됨)가 실질적으로 없으므로, BoNT/A 단백질의 불필요한 비-특이적 절단이 방지된다.
조성물 (상기 언급된 바와 같음)에 Lys-C가 실질적으로 없는 경우, 이러한 조성물은 전형적으로, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400 피코그램 (pg) 미만의 Lys-C, 예를 들어 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 5, 4, 3, 2, 1 pg 미만 또는 그 아래의 Lys-C를 함유한다. 한 실시양태에서, 조성물 (상기 언급된 바와 같음)은 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 350 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 250 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 150 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 40 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 30 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 14 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 13 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 12 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 11 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 9 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 8 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 7 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 6 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 5 pg 미만의 Lys-C, 또는 그 아래를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 (상기 언급된 바와 같음)은 100 ng의 BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C 또는 100 ng의 BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C 또는 100 ng의 BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C를 함유한다.
조성물 중의 Lys-C의 농도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 예로서, 본 발명의 조성물 중의 Lys-C의 농도는 본원에 기재된 바와 같은 샌드위치 ELISA (효소-결합 면역흡착 검정) 또는 비색 검정을 이용하여 결정할 수 있다.
제약 조성물 및 치료적 적응증
본 발명은 또한, BoNT/A 2-쇄를 제조하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 프로세싱된 (2-쇄) BoNT/A와 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A의 혼합물을 포함하는데, 여기서 이러한 혼합물은 5%, 4%, 3%, 2% 미만 또는 1% 미만의 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A를 함유할 수 있다. 상기 조성물의 측면에서, BoNT/A에 대한 언급은 본원에 정의된 바와 같은 그의 유도체를 포괄한다. 조성물은, 예를 들어 액상 또는 고형 조성물일 수 있고, 하나 이상의 담체, 아주반트 및/또는 부형제를 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한, 전술된 방법의 단계들; 및 정제된 2-쇄 BoNT/A를 의약으로서 제제화하는 추가 단계를 포함하는, 의약, 즉 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 전형적으로 상기 의약은 프로세싱된 (2-쇄) BoNT/A와 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A의 혼합물을 포함하는데, 여기서 이러한 혼합물은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 그 아래의 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 혼합물은 5% 미만의 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A, 예컨대 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 프로세싱되지 않은 (단일-쇄) BoNT/A를 함유한다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 화합물 및 조성물의 각종 의학적 및 미적 (화장품) 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 의약으로서 사용하거나 또는 제약 조성물에 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 활성 BoNT/A 2-쇄 또는 이러한 활성 BoNT/A 2-쇄를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 의약을 제조하는 데 있어서의, 본 발명의 활성 BoNT/A 2-쇄 또는 이러한 활성 BoNT/A 2-쇄를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 활성 BoNT/A 2-쇄 또는 이러한 활성 BoNT/A 2-쇄를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 활성 BoNT/A 2-쇄 또는 이러한 활성 BoNT/A 2-쇄를 포함하는 조성물을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조성물"은 고형, 액상, 에어로솔 (또는 기상) 형태 등으로 제제화되는 임의의 조성물을 지칭한다. 상기 조성물은, 예를 들어 본 발명의 치료상 활성 화합물을, 임의로 적합한 보조 화합물, 예컨대 희석제 또는 담체 또는 추가의 성분과 함께 포함한다. 한 측면에서, 치료상 활성 화합물은 본 발명의 활성 BoNT/A 2-쇄이다. 본 발명의 조성물, 특히 제약 조성물은 전형적으로, 본원에 정의된 바와 같은 Lys-C가 실질적으로 없다.
따라서, 본 발명은
(a) 상기 언급된 바와 같은 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질, 및
(b) 안정화제
를 포함하는, 고형 또는 액상 제약 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 조성물 (상기 언급된 바와 같음)은 Lys-C가 실질적으로 없다. 예를 들어, 조성물 (상기 언급된 바와 같음)은 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng의 BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C를 함유할 수 있다.
본 발명에 따르는 조성물에 사용될 수 있는 안정화제는 단백질 안정화제, 예컨대 알부민, 특히 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 비-단백질 안정화제를 포함한다.
본 발명에 따르는 조성물에 사용될 수 있는 비-단백질 안정화제는 계면활성제, 특히 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 비-이온성 계면활성제의 예는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 및 블록 공중합체, 예컨대 폴록사머 (즉, 폴리에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체)를 포함한다.
특별한 실시양태에서, 상기 조성물은 안정화제로서의 단백질을 포함하지 않는다.
본 발명의 특별한 실시양태에 따르면, 제약 조성물은
(a) 상기 언급된 바와 같은 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질;
(b) 계면활성제인 비-단백질 안정화제; 및
(c) 물
을 포함하는 액상 제약 조성물인데, 여기서 이러한 액상 제약 조성물은 단백질 안정화제를 포함하지 않고;
상기 액상 제약 조성물은 Lys-C가 실질적으로 없는데, 여기서 "Lys-C가 실질적으로 없다"는 것은 본원에 정의된 바와 같다 (예를 들어, 상기 액상 제약 조성물은 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng의 BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C를 함유한다).
한 실시양태에서, 상기 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질은 1 내지 1,000 ng/ml 이상의 농도로 조성물 (상기 언급된 바와 같음)에 존재한다. 따라서, 상기 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질은 약 1 내지 500 ng/mL, 예를 들어 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1,000 ng/mL 또는 그 초과의 농도로 조성물 (상기 언급된 바와 같음)에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질은 약 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL, 500 ng/mL, 600 ng/mL 또는 700 ng/mL의 농도로 존재한다.
한 실시양태에서, 계면활성제 (상기 언급된 바와 같음)는 폴리소르베이트, 예컨대 20 내지 100 단량체 단위의 범위의 평균 중합도를 갖는 폴리소르베이트이고, 예를 들어 폴리소르베이트 80일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리소르베이트는 식물성 유래된다. 계면활성제의 농도는 바람직하게 1% v/v 미만, 예를 들어 폴리소르베이트 80의 경우에 약 0.005% 내지 0.02% v/v이다.
본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 결정성 작용제를 포함할 수 있다.
결정성 작용제는 특히, 동결건조된 보툴리눔 신경독 복합체 (유형 A, B, C1, D, E, F 또는 G) 또는 고 순도 보툴리눔 신경독 (유형 A, B, C1, D, E, F 또는 G)에 대한 기계적으로 강한 케이크 구조를 유지시켜 주는 작용제를 의미한다. 고형 제형 내에 포함되는 경우, 결정성 작용제는 또한 벌킹 효과를 갖는다. 결정성 작용제는 특히 염화나트륨을 포함한다. 결정성 작용제의 농도는 예를 들어, 0.1 내지 0.5 M, 바람직하게 0.1 내지 0.4 M, 특히 약 0.15 내지 0.3 M일 수 있다.
본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, pH를 5.5 내지 7.5, 또는 6.0 내지 7.0으로 구성된 수준으로 유지시켜 주는 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 완충제는 적당한 pH를 유지시켜 줄 수 있는 임의의 완충제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 조성물에 대한 완충제는 숙시네이트, 인산이나트륨/시트르산, 및 아미노산, 예컨대 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 완충제의 농도는, 예를 들어 1 내지 50 mM, 바람직하게 5 내지 20 mM, 바람직하게 약 10 mM일 수 있다.
본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 디사카라이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 조성물에 사용된 디사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 디사카라이드는 수크로스이다. 디사카라이드의 농도는, 예를 들어 5 내지 50 mM, 바람직하게 5 내지 25 mM, 보다 바람직하게 10 내지 20 mM, 및 가장 바람직하게 약 11.7 mM일 수 있다.
특별한 실시양태에서, 제약 조성물은
(a) 상기 언급된 바와 같은 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질;
(b) 계면활성제인 비-단백질 안정화제;
(c) 염화나트륨;
(d) pH를 5.5 내지 7.5로 유지시켜 주는 완충제;
(e) 디사카라이드; 및
(f) 멸균수
를 포함하는 액상 제약 조성물인데, 여기서 이러한 액상 제약 조성물은 단백질 안정화제를 포함하지 않고;
상기 액상 제약 조성물은 Lys-C가 실질적으로 없는데, 여기서 "Lys-C가 실질적으로 없다"는 것은 본원에 정의된 바와 같다 (예를 들어, 상기 액상 제약 조성물은 100 ng의 BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 100 ng의 BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng의 BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C를 함유한다).
구체적 실시양태에 따라서, 액상 형태의 본 발명에 따르는 제약 조성물은 액체/기체 계면이 없는 바이알 또는 즉시 사용 가능한 장치, 예컨대 주사기에 밀봉시고, 23 내지 27℃ 하에 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 안정적이고 2 내지 8℃ 하에 적어도 12개월 동안 안정적이다. 본 발명의 예시되는 제약 조성물은 본 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 제약 조성물 또는 제형에 대한 월간 분해율은 12주에 걸쳐 매달 5% 아래일 수 있는데, 이는 상기 조성물 또는 제형의 2-쇄 BoNT 프로테아제 기능이 적어도 12주 동안 25℃ 하에 여전히 안정적이라는 사실을 의미한다.
본 발명의 제약 조성물은 진공 압력하에 용기 내에 동결건조된, 진공 건조된 형태로 저장하거나 또는 안정한 액상물로서 저장할 수 있다. 동결건조시키기 전에, 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 제약상 허용되는 부형제, 안정화제 및/또는 담체, 예컨대 알부민과 조합할 수 있다. 동결건조된 물질은 식염수 또는 물과 재구성하여, 환자에게 투여하고자 하는 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질을 함유하는 용액 또는 조성물을 창출시킬 수 있다.
이러한 맥락에서, 본 발명은 보조 화합물, 즉 상기 조성물을 그의 원하는 목적을 위해 적용하는 경우에 본 발명의 화합물에 의해 유발된 효과에 기여하지 않는 화합물과, 추가 성분, 즉 추가의 효과에 기여하거나 또는 본 발명의 화합물의 효과를 조정하는 화합물 간을 구별한다. 적합한 희석제 및/또는 담체는 상기 조성물을 사용하고자 하는 목적과 기타 성분들에 좌우된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 적합한 희석제 및/또는 담체를 지체없이 결정할 수 있다.
상기 담체(들)는 제형의 다른 성분들과 화합성이고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 허용되어야만 한다. 이용된 제약 담체는 고체, 겔 또는 액체를 포함할 수 있다. 예시되는 고형 담체는 락토스, 백토(terra alba), 수크로스, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이다. 예시되는 액상 담체는 인산염 완충 식염수 용액, 시럽, 오일, 물, 에멀젼, 각종 유형의 습윤제 등이다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 관련 기술분야에 널리 공지된 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노-스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 단독을 포함하거나, 또는 이를 왁스와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 적합한 담체는 상기 언급된 것과, 관련 기술분야에 널리 공지된 기타를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania] 참조).
희석제(들)는 상기 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리학적 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 한크스(Hank's) 용액이고, 또한 상기 제약 조성물 또는 제형은 기타 담체, 아주반트, 또는 비-독성, 비-치료적, 비-면역원성 안정화제 등을 포함할 수도 있다.
한 측면에서, 본원에 사용된 바와 같은 제약 조성물은 본 발명의 방법에 의해 수득된 생물학적으로 활성인 신경독 (즉, 활성 BoNT/A 2-쇄), 및 임의로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 활성 신경독은 액상 형태 또는 동결건조된 형태로 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 화합물은 글리세롤, 단백질 안정화제 [예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA)] 또는 비-단백질성 안정화제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 또는 히알루론산과 함께 존재할 수 있다. 제약 조성물은 한 측면에서, 국소적으로 투여된다. 통상적으로 사용되는 약물 투여는 근육내 또는 피하 (전형적으로 피지선 근처) 투여를 통해서이다. 그러나, 화합물의 성질과 작용 방식에 따라서, 제약 조성물은 다른 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 2-쇄 신경독 폴리펩티드가 상기 조성물의 활성 성분이고, 한 측면에서 약물을 통상적인 과정에 따라서 표준 제약 담체와 조합함으로써 제조된 통상적인 투여 형태로 투여된다. 이들 과정은 상기 성분들을 적당히 혼합, 과립화 및 압축, 또는 용해시켜 목적하는 제제로 만드는 것을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특질은 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로, 및 기타 널리 공지된 변수에 의해 영향을 받는다는 것을 인지해야 할 것이다.
치료상 유효 용량은 본 명세서 내에 언급된 질환 또는 병태를 동반하는 증상을 방지, 완화 또는 치료하는, 본 발명의 제약 조성물 내에 사용될 화합물, 즉 신경독의 양을 지칭한다. 상기 화합물의 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에게서 치료상 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50%에게 치사적인 용량)은 세포 배양물 또는 실험용 동물 내에서의 표준 제약 과정에 의해 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 간의 용량 비가 치료 지수인데, 이는 LD50/ED50 비로서 표현될 수 있다.
투여량 요법은 담당 의사와 기타 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 널리 공지되는 바와 같이, 임의의 하나의 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 특별한 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강, 및 공동으로 투여되는 기타 약물을 포함한 많은 요인들에 좌우된다. 진행은 주기적으로 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 본원에 언급된 제약 조성물 및 제형은 본 명세서 내에 나열된 질환 또는 병태를 치료 또는 완화 또는 예방하기 위하여 적어도 1회 투여한다. 그러나, 상기 제약 조성물은 2회 이상 투여할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질, 및 그의 조성물 및 액상 제약 조성물이 요법에 사용될 수 있다. 적합한 요법은 화장품 처치 및 의학적 치료 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서, 전술된 조성물은 의약 또는 화장품 조성물이다. 한 측면에서 생물학적으로 활성인 신경독 (즉, 활성 BoNT/A 2-쇄)을 포함하는 상기 의약은 다음 질환 및 장애 중 적어도 한 가지의 예방 및/또는 치료를 위하여 사용될 수 있다: 수의 근력, 국소성 근긴장이상, 예를 들어 자궁경부, 두개골 근긴장이상, 및 양성 필수 안검 경련, 반축 안면 경련, 및 국소성 경직, 위장 장애, 다한증, 및 화장품 주름 교정; 추가 측면에서 또한, 안검 경련, 경구 하악 근긴장이상, 턱 개방형, 턱 폐쇄형, 이갈기, 메이그(Meige) 증후군, 혀 근긴장이상, 눈꺼풀의 운동 불능, 개방 자궁 경부 근긴장이상, 전굴(anterocollis), 목후굴(retrocollis), 목이 측면으로 기움(laterocollis), 사경, 인두 근긴장이상, 후두 근긴장이상, 경련 발성 장애/내전근 유형, 경련 발성 장애/외전근 유형, 경련 호흡 곤란, 사지 근긴장이상, 팔 근긴장이상, 작업 특이적 근긴장이상, 작가의 경련, 음악가의 경련, 골퍼의 경련, 다리 근긴장이상, 허벅지 내전, 허벅지 외전 무릎 굴곡, 무릎 확장, 발목의 굴곡, 발목 확장, 내반첨족(equinovarus), 기형 발 근긴장이상, 선조체 발가락, 발가락 굴곡, 발가락 확장, 축 근긴장이상, 피사(pisa) 증후군, 벨리 댄서(belly dancer) 근긴장이상, 분절 근긴장이상, 편측 근긴장이상, 전신 근긴장이상, 루박(lubag)에서의 근긴장이상, 피질 변성에서의 근긴장이상, 루박에서의 근긴장이상, 지발성 근긴장이상, 척수소뇌 실조에서의 근긴장이상, 파킨슨병(Parkinson's disease)에 있어서의 근긴장이상, 헌팅턴병(Huntington's disease)에 있어서의 근긴장이상, 할러포르덴 스파츠병(Hallervorden Spatz disease)에 있어서의 근긴장이상, 도파-유도된 운동 장애/도파-유도된 근긴장이상, 지발성 운동 장애/지발성 근긴장이상, 발작성 운동 장애/근긴장이상, 운동 유발성 비-운동 유발성 작용-유도된 구개 간대성 근경련, 간대성 근경련의 근파동증, 강직, 양성 근육 경련, 유전 턱 떨림, 역설적 턱 근육 활성, 편측저작근 경련, 비후성 인두 근육병증, 교근 비대, 정강 뼈 앞쪽 비대, 안진, 진동시의 핵상 시선 마비, 지속성 부분 간질, 경련성 사경 수술의 계획, 외전근 성대 마비, 불치의 돌연변이성 발성 장애, 상부 식도 괄약근 기능 장애, 성대 육아종, 말더듬 질레 드 라 투렛 증후군(Gilles de Ia Tourette syndrome), 중이 간대성 근경련증, 보호 후두 폐쇄, 후두절제술 후, 음성 장애, 보호 안검하수, 안검 괄약근 오디이(Odii) 장애, 거짓 이완 불능증, 노나칼시아(nonachalsia), 식도 운동 장애, 질 경련, 수술후 고정화 떨림, 방광 기능 장애, 배뇨근 괄약근 근실조, 방광 괄약근의 경련, 반축 안면 경련, 신경재분포 운동 장애, 화장품 사용 눈가의 잔주름, 얼굴 비대칭, 턱끝근 보조개, 근육강직 증후군, 파상풍 전립선 비대증, 지방증, 치료 유아 뇌성 마비 사시; 무수 정체 외안근 사시에서 백내장 수술 후, 망막 박리 수술 후 수반되는 혼합 마비; 근병성 사시, 해리 수직 편위, 사시 수술에 대한 보조로서, 내사시, 외사시, 식도 이완 불능증, 항문 균열, 외분비선 활동항진, 프레이 증후군(Frey syndrome), 악어 눈물 증후군, 다한증, 겨드랑이 손바닥 발바닥 비루; 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 경련성 병태, 뇌염 및 척수염 자가면역 과정에 있어서의 상대적 과다침분비; 다발성 경화증, 횡단 척수염, 데빅 증후군(Devic syndrome), 바이러스 감염, 박테리아성 감염, 기생충 감염, 진균성 감염, 유전성 경련성 하반신 마비 중풍 발작후 반구성 경색에서, 뇌간 경색, 척수 경색, 편두통, 중추신경계 외상에서, 반구성 병변, 뇌간 병변, 척수 병변, 중추신경계 출혈에서, 뇌척수내 출혈, 지주막하 출혈, 경막하 출혈, 척수내 출혈, 신생물에서, 반구성 종양, 뇌간 종양, 골수 종양, 코골이 (WO 2000/033863). 세부 사항 및 증상에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Jost 2007, Drugs 67(5), 669 or Dressler 2000 in Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, New York]을 참조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 조성물은 상기 제약 조성물에 대해 기재된 바와 같이 제제화될 수 있는 화장품 조성물이다. 화장품 조성물의 경우에도 마찬가지로, 본 발명의 화합물이 특정 측면에서, 실질적으로 순수한 형태로 사용되는 것으로 예상된다. 화장품 조성물은 추가 측면에서, 근육내 적용되어야 한다. 본 발명의 더 추가 측면에서, 상기 신경독을 포함하는 화장품 조성물은 주름 방지 용액제로서 제제화될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그들의 전체 개시내용 및 본 명세서에 구체적으로 언급된 개시내용과 관련하여 본원에 참조로 포함된다.
서열식별번호에 대한 요점
서열식별번호: 1: ATCC 3502, 유전자은행 수탁 번호 "AAA23262"의 BoNT/A
서열식별번호: 2: BoNT/A1의 활성화 루프
서열식별번호: 3: BoNT/A2/A6의 활성화 루프
서열식별번호: 4: BoNT/A3의 활성화 루프
서열식별번호: 5: BoNT/A3의 활성화 루프
서열식별번호: 6: BoNT/A4의 활성화 루프
서열식별번호: 7: BoNT/A5의 활성화 루프
서열식별번호: 8: 248개 N-말단 아미노산 잔기가 결여된, 클로스트리디움 보툴리눔 균주 ATCC 3502, 유전자은행 수탁 번호: "CAL82988.1"로부터 유래된, 단백질 분해적으로 활성인 폴리펩티드
서열식별번호: 9: 클로스트리디움 보툴리눔 균주 ATCC 3502, 유전자은행 수탁 번호: "CAL82988.1"로부터 유래된, 단백질 분해적으로 불활성인 폴리펩티드
서열식별번호: 10: 서열식별번호: 8을 코딩하는 핵산 서열
서열식별번호: 11: 서열식별번호: 9를 코딩하는 핵산 서열
서열식별번호: 12: "스트렙태그" 아미노산 서열
서열식별번호: 13: BoNT/A7의 활성화 루프
서열식별번호: 14: BoNT/A8의 활성화 루프
서열식별번호: 15: 단일 쇄, 재조합, 양이온성, 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A1 유도체 (mrBoNT/A1)의 아미노산 서열.
도 1: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 페닐 고 성능 (PhHP) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 2: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 페닐 고속 유량 고 치환 (PhFF-Hi) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 3: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 부틸 고 성능 (BuHP) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 4: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 술포프로필 고 성능 (SPHP) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 5: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 술포프로필 고속 유량 (SPFF) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 6: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 카르복실메틸 고속 유량 (CMFF) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 7: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 4급 아민 고 성능 (QHP) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 8: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 4급 아민 고속 유량 (QFF) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 9: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 디에틸아미노프로필 (DEAP, "ANX") 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 10: 그 위에서 BoNT/A로부터 Lys-C의 분리 (A405 - 막대)를 평가한 디에틸아미노에틸 (DEAE) 칼럼으로부터의 용출 프로파일 (A280 - 점선).
도 11: 페닐 HP HIC에 의한 rBoNT/A1로부터의 Lys-C의 제거. PhHP HIC 폴리시(polish) 단계로부터 취한 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (상단). 재조합 BoNT/A1은 약 149 킬로달톤 (kDa)의 분자량을 가지며, 분자량 마커 (벤치마크)는 kDa로 표지된다. 동일한 분획의 샘플을 또한, 비색 Lys-C 검정 (하단)에서 시험하였는데, 여기서 기질의 절단으로 인해, 황색 발색단 (블랙 박스 내에 있음)이 방출된다.
도 12: 페닐 HP HIC에 의한 rBoNT/A2(0)로부터의 Lys-C의 제거. 페닐 HP HIC 폴리시 단계로부터 취한 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (상단). 재조합 BoNT/A1은 약 149 kDa의 분자량을 가지며, 분자량 마커 (벤치마크)는 kDa로 표지된다. 동일한 분획의 샘플을 또한, 비색 Lys-C 검정 (하단)에서 시험하였는데, 여기서 기질의 절단으로 인해, 황색 발색단 (블랙 박스 내에 있음)이 방출된다.
도 13: 페닐 HP HIC에 의한 rBoNT/A5(0)로부터의 Lys-C의 제거. 페닐 HP HIC 폴리시 단계로부터 취한 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (상단). 재조합 BoNT/A5(0)는 약 149 kDa의 분자량을 가지며, 분자량 마커 (벤치마크)는 kDa로 표지된다. 동일한 분획의 샘플을 또한, 비색 Lys-C 검정 (하단)에서 시험하였는데, 여기서 기질의 절단으로 인해, 황색 발색단 (블랙 박스 내에 있음)이 방출된다.
도 14: 페닐 HP HIC에 의한 rBoNT/A6(0)으로부터의 Lys-C의 제거. 페닐 HP HIC 폴리시 단계로부터 취한 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (상단). 재조합 BoNT/A6(0)은 약 149 kDa의 분자량을 가지며, 분자량 마커 (벤치마크)는 kDa로 표지된다. 동일한 분획의 샘플을 또한, 비색 Lys-C 검정 (하단)에서 시험하였는데, 여기서 기질의 절단으로 인해, 황색 발색단 (블랙 박스 내에 있음)이 방출된다.
도 15: 부틸 HP HIC에 의한 mrBoNT/A1로부터의 Lys-C의 제거. 부틸 HP HIC 폴리시 단계로부터 취한 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (상단). 재조합 mrBoNT/A1은 약 149 kDa의 분자량을 가지며, 분자량 마커 (벤치마크)는 kDa로 표지된다. 동일한 분획의 샘플을 또한, 비색 Lys-C 검정 (하단)에서 시험하였는데, 여기서 기질의 절단으로 인해, 황색 발색단 (블랙 박스 내에 있음)이 방출된다.
실시예
실시예 1 - 숙주의 배양 및 가용성 rBoNT/A 단백질의 발현
BLR (DE3) 세포에서 형질전환된 BoNT/A의 단일 집락을 사용하여, 0.2% 글루코사민 및 30 μg/mL 카나마이신이 보충된 100 mL 변형 테리픽 브로쓰(Terrific Broth, mTB)를 함유하는 250 mL용 원뿔형 플라스크에 접종한다. 이 방법은 상기 플라스크에 접종하기 위하여 마이크로뱅크(Microbank) 비드 또는 글리세롤 스톡 (10 내지 100 μL)을 이용하는 경우에도 동등하게 적용할 수 있을 것이다.
상기 플라스크를 250 RPM 진탕시키면서 37℃ 하에 16시간 동안 인큐베이션한다. 이러한 종균 배양물 10 mL을 사용하여, 각각 0.2% 글루코사민 및 30 μg/mL 카나마이신이 보충된 1 L를 함유하는 2 L용 원뿔형 플라스크에 접종한다. 세포를 0.5의 OD600에 도달할 때까지 225 RPM 하에 2시간 동안 37℃에서 성장시킨다. 이 시점에서, 배양 온도를 16℃로 떨어뜨린다. 1시간 후, 1 mM IPTG를 20시간 동안 부가함으로써 상기 세포가 BoNT/A를 발현하도록 유도시킨다. 세포를 4℃ 하에 20분 동안 원심분리시킴으로써 수거하고, 칭량한 다음 -20℃ 하에 저장한다.
실시예 2 - 숙주로부터 BoNT/A 단백질의 추출 및 발현 수준의 분석
rBoNT/A의 발현 세포 페이스트를 실온 하에 융해시키고, 10 μL 벤조나제가 보충된 세포 1그램당 3 mL의 트리스-NaCl 재현탁 완충액에 피펫팅함으로써 재현탁시킨다. 세포를 100 W에서 초음파처리 (10x 30 s 온 + 45 s 오프)함으로써 용해시킨다. 이러한 용해물을 4℃ 하에 1시간 동안 4000x g로 원심분리시켜 상등액 중의 가용성 rBoNT/A를 수득한다.
제조된 용해물의 총 단백질 농도를 결정하기 위한 브래드포드(Bradford) 검정
희석된 rBoNT/A 용해물 또는 BSA 표준물의 샘플 (50 μL)을 1 mL 1회용 큐벳에 가한다. 450 μL의 쿠마시(Coomassie) 브래드포드 검정 시약을 각 큐벳에 가하고, 실온 하에 10분 동안 인큐베이션한 후 A600를 판독한다. BSA 표준물에 대하여 수득된 값을 이용하여, 상기 용해물 샘플 중의 단백질의 양을 결정한다.
반-정량적 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석
메타바이오로직스(Metabiologics)로부터 구입한 BoNT/A 단백질의 상업적 샘플을 이용하여, SDS-PAGE 표준물을 형성한다. 이어서, 상기 발현된 세포 배양물로부터의 용해물 샘플의 SDS-PAGE 샘플을 기지의 총 단백질 농도가 되도록 제조한다. 이들 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 상으로 부하하고, 200 V 하에 50분 동안 수행한다. 단백질 밴드를 0.4 mA 하에 1시간 동안 메탄올 무함유 블롯팅 완충액 중의 니트로셀룰로스 막 상으로 전기블롯팅한다. 상기 막을 PBS-0.1% 트윈(Tween) 20 중의 0.5% BSA로 1시간 동안 차단시킨 다음, BoNT/A에 대한 항체로 1시간 동안 프로빙한다. 블롯을 HRP 접합된 2차 항체로 추가로 프로빙하고, 슈퍼시그널 두라웨스트(SuperSignal DuraWest) 기질로 전개한 다음, 신진(Syngene) 영상화 기기를 이용하여 영상화한다.
실시예 3 - Lys-C에 의한 보툴리눔 신경독 A (BoNT/A)의 활성화
완충액 (50 mM 트리스/HCl pH 8.0, 125 mM NaCl)에 용해된 단일 쇄 재조합 BoNT/A1 (0.5 mg/mL)을 2 내지 20시간에 걸쳐 37℃ 또는 4℃ 하에 Lys-C에 의해 단백질 분해적으로 활성화시킨 후 (1:500 내지 1:2500 효소:기질 비), 반응물을 특이적 세린 프로테아제 억제제인 0.4 μM AEBSF [4-(2-아미노에틸) 벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드]로 억제하였다. 이로써 성숙한 2-쇄 형태의 BoNT/A1이 산출되는데, 여기서 중쇄는 단일 디술피드 결합에 의해 경쇄와 연결된다 (데이터는 제시되지 않음).
절단 부위는 N-말단 서열 분석 및 질량 분광측정법에 의해 내인성 단백질과 동일한 것으로 결정되었는데, 이는 Lys-C가 선택 활성화 효소라는 것을 확증시켜 준다 (데이터는 제시되지 않음).
엔도프로테이나제 Lys-C 절단 시험 결과, Lys-C가 극히 낮은 농도에서 rBoNT/A1을 절단하였고 수일에 걸쳐 활성을 유지하였다는 사실이 입증되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 4 - 활성화 프로테아제가 없는 표적 BoNT/A 단백질의 정제
BoNT/A 1차 단백질 서열을 이용하여, BoNT/A 및 Lys-C의 특성을 조사하였다 (표 2 참조). 예측된 특성은 Lys-C와 BoNT/A 둘 다가 유사한 평균 소수친수도 (GRAVY 값)을 갖고 있지만, pH 4.5 및 8에서 큰 전하 차이를 나타낸다는 것을 나타내었다 (표 2 참조).
<표 2>
Lys-C 및 BoNT/A의 예측된 특성
[* GRAVY = 분자의 잔기당 평균 소수친수도 (양의 값은 소수성 분자를 나타낸다)]
상기 정보만을 근거로 하여, 이온 교환 (IEX) 크로마토그래피가 BoNT/A로부터 Lys-C를 분해시킬 것으로 예측되었다. 따라서, IEX 크로마토그래피를 포함한, 각종 크로마토그래피를 이용한 정제 수단을 조사하였다 (하기 참조).
실시예 5 - Lys-C를 BoNT/A로부터 분리하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 칼럼의 스크리닝
FPLC 정제
Lys-C를 이용하여 BoNT/A1을 활성화시킨 후, 수많은 FPLC 칼럼을 대상으로 하여 Lys-C의 폴리싱 및 제거에 관하여 시험하였다:
● 3개의 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 칼럼: 페닐 고 성능 (PhHP), 페닐 고속 유량 고 치환 (PhFF-Hi), 및 부틸 HP (BuHP)는 트리스 pH 8로 시험하였고;
● 3개의 양이온 교환 크로마토그래피 (CEC) 칼럼: 술포프로필 고 성능 (SPHP), 술포프로필 고속 유량 (SPFF), 및 카르복실메틸 고속 유량 (CMFF)은 소듐 아세테이트 pH 4.5로 시험하였으며;
● 4개의 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 칼럼: 4급 아민 고 성능 (QHP), 4급 아민 고속 유량 (QFF), 디에틸아미노프로필 (DEAP, "ANX"), 및 디에틸아미노에틸 (DEAE)은 트리스 pH 8로 시험하였다.
일단 특정 샘플을 칼럼 상으로 부하하면, 이러한 칼럼을 완충제로 철저히 세척하여 비-특이적으로 결합된 임의의 분자를 제거한 후, 증가 또는 감소 농도의 염의 선형 용출 구배를 적용하였다 (각각 HIC 및 CEC/AEC).
반응 조건과 정제 수행은 상이한 칼럼 유형들 간에 다양하다 (하기 표 3 참조).
<표 3>
Lys-C 분해에 관하여 시험된 모든 칼럼에 대한 스크리닝 조건
도 1 내지 10은 각종 크로마토그래피 칼럼으로부터의 BoNT/A1 단백질의 용출 프로파일 (A280)을 보여준다 (점선). 상이한 칼럼에 대해 사용된 상이한 반응 조건과 정제 수행은 사용된 상이한 규모를 설명해준다.
용출 구배 동안 수집된 분획을, 비색 검정을 이용하여 분석하여 Lys-C 활성을 평가하였다.
Lys-C 활성 비색 검정
상기 검정은 무색 기질을 절단하여, 405 nm 하에서의 흡광도 (A405)에 의해 측광적으로 검출될 수 있는 황색 발색단을 생성하는 것을 포함하였다. 따라서, 상기 검정은 Lys-C가 각 분획에 존재하였는 지를 결정하기 위한 간단한 방법을 제공하였다.
상기 비색 Lys-C 활성 검정을 이용하여 각 용출 분획을 분석하였고 A405 nm를 측정하였다.
각 용출 분획 내의 Lys-C의 양 (A405 면에서 측정됨)이 도 1 내지 10에서 막대로서 도시된다.
결과
A405 데이터와 A280 데이터 (도 1 내지 10의 그래프에 제시됨)를 비교함으로써, 칼럼(들)이 BoNT/A로부터의 Lys-C의 최상의 분해를 제공한다는 것을 추론할 수 있었다.
상기 사용된 3개의 HIC 칼럼의 상이한 알킬/아릴 기 (Bu 및 Ph)는 소수성 효과를 통하여 각종 단백질과 상호 작용할 수 있는 상이한 리간드를 제공한다. 이러한 상호 작용은 이들 소수성 기의 밀도 [치환도 (Hi/Lo) 및 비드 크기 (FF/HP)]에 의해 추가로 영향을 받는다. CEC 칼럼의 경우에는, 샘플의 pH를 표적 단백질 pI의 아래가 되도록 조정하여, 전반적인 순 양전하를 획득하도록 함으로써, 상기 칼럼과 결합할 수 있게 된다. 각 유형의 칼럼 상에 존재하는 상이한 리간드는 상이한 전하 밀도를 제공하고, 상이한 단백질과의 상호 작용은 또한, 리간드 밀도에 의해 영향을 받는다. 이들 변수는 AEC 칼럼에도 유사하게 적용되는데, 여기서 상이한 화학적 기가 상이한 전하 밀도를 표시한다. 이러한 경우에는, 샘플의 pH를 표적 단백질 pI 위로 조정하여, 전반적인 순 음전하를 획득하도록 한다.
도 1 내지 10으로부터의 그래프로 나타낸 데이터가 표 4에 정성적으로 요약되어 있다.
<표 4>
정성적 Lys-C/BoNT 분해 데이터의 요약
* rBoNT/A1과 관련한 Lys-C의 겉보기 분해. = 좋음, = OK, = 나쁨
a 페닐 고 성능 (PhHP), 페닐 고속 유량 고 치환 (PhFF-Hi), 부틸 HP (BuHP)
b 술포프로필 고 성능 (SPHP), 술포프로필 고속 유량 (SPFF), 카르복실메틸 고속 유량 (CMFF), 4급 아민 고 성능 (QHP), 4급 아민 고속 유량 (QFF), 디에틸아미노프로필 (DEAP, "ANX"), 및 디에틸아미노에틸 (DEAE)
Lys-C의 회수 % 및 각 칼럼 유형으로부터의 용출 후 정제
각 분획에서의 총 Lys-C 시그널을 크로마토그래피 단계의 마지막 5개 분획으로부터의 평균 A405 값에 대하여 정규화하였다. 이로부터, 단백질 피크 분획 내에 존재하는 % Lys-C를 계산하여, 용출 분획에 근거하여 단백질로부터 Lys-C의 분리 정도를 표시하였다 [표 5, 단백질 피크 분획 내의 % Lys-C (정규화됨)].
표적 단백질과 관련하여, BoNT/A 분자 모두가 주요 피크 하에 용출되는 것으로 추정되므로 (즉, 100% 회수율); 정제도는 주요 피크 하에 회수되지 않은, 부하된 총 단백질의 %로서 표현될 수 있다 (표 5, % 정제).
BoNT/A로부터의 Lys-C의 양호한 분리는, 단백질 피크 분획에서 Lys-C의 비율(%)에 대하여 낮은 값이 관찰된 경우일 것이다. 이로부터, CEC는 BoNT/A1로부터 Lys-C를 분해시킬 수 없는 것으로 여겨진다. 고 성능 AEC 칼럼인 QHP는 BoNT/A1로부터 Lys-C를 분해시킬 수 있는 일부 능력을 보여주었다. 그러나, 상기 2개의 고 성능 HIC 칼럼보다 상당히 덜 유효하였다. 따라서, 그 결과, 동등하게 비교하면 (즉, 표준 성능 대 표준 성능 및 고 성능 대 고 성능), HIC 칼럼이 CEC 칼럼 또는 AEC 칼럼보다 개선된, BoNT/A1로부터의 Lys-C의 분해를 나타냈다는 사실이 입증되었다.
가장 두드러진 2가지 후보는 HIC - PhHP 및 BuHP를 포함한다. 흥미롭게도, 이들 칼럼 둘 다는 고 성능 비드를 이용한다.
고 성능 매질과 다른 것과의 주요 차이점은 평균 입자 크기가 더 작고 (34 μm 대 90 μm) 더 균일하다는 (24 내지 44 μm 대 44 내지 165 μm) 것이다. 이는 더 작은 크기의 비드 (평균 크기 3 내지 30 μm)를 이용하는 분석적 칼럼을 사용한 경우에 보고된 성능 상의 개선과 일치한다 [GE 헬스케어(Healthcare) 핸드북 11-0004-21 & 11-0012-69 및 데이터 파일 18-1172-87 AE & 18-1172-88 AD].
<표 5>
칼럼 성능의 요약
PhHP HIC가 최종 폴리시 단계로서 선택되어, BoNT/A로부터 Lys-C를 분해 제거하였다 (하기 실시예 6 참조).
실시예 6 - 재조합 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A1 (rBoNT/A1)의 활성화 및 최종 정제
포획을 위하여 고 성능 부틸 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (부틸 HP HIC)를 이용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)한 다음, 고 성능 4급 암모늄 세파로스 음이온성 교환 크로마토그래피 (Q HP AEC)를 이용한 중간 정제 단계에 의해 단일 쇄 rBoNT/A1을 정제하였다. 이어서, 상기 분자를 37℃ 하에 2시간 동안 0.4 μg/mL Lys-C와 함께 인큐베이션하여 활성 2-쇄를 산출하였다.
고 성능 페닐 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (PhHP HIC)를 이용하여 Lys-C를 활성화된 rBoNT/A1로부터 분해하였다. 이는 고-염 트리스 완충제를 이용하여 상기 반응 혼합물을 조정한 후, 이를 PhHP 칼럼 상으로 부하한 다음, 고-염 세척하고, 연속해서 저-염 트리스 완충제에 대한 선형 구배를 이용하여 단백질 용출시키는 것을 포함하였다. 용출 분획을 변성 겔 전기영동 (SDS PAGE - 도 11 상단) 및 비색 Lys-C 활성 검정 (도 11 하단)에 의해 분석하였다. Lys-C는 활성화된 BoNT 분자가 용출되기 (F21-F29) 전에 상기 구배에서 초기에 용출되는 것으로 입증되었다 (F16-F21, 블랙 박스 내에 강조됨). 따라서, 이는 rBoNT/A1로부터의 Lys-C의 양호한 분리를 보여준다. 상기 분획의 최대 세기는 30 ng/mL Lys-C와 유사한 것으로 여겨지는데, 이는 rBoNT/A1 분획에 존재하는 임의의 잔류 Lys-C가 상기 농도 미만일 것이란 사실을 제시한다.
실시예 7 - 재조합 엔도펩티다제-음성 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A2 (rBoNT/A2(0))의 활성화 및 최종 정제
포획을 위하여 고 성능 부틸 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (부틸 HP HIC)를 이용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)한 다음, 고 성능 4급 암모늄 세파로스 음이온성 교환 크로마토그래피 (Q HP AEC)를 이용한 중간 정제 단계에 의해 단일 쇄 rBoNT/A2(0)를 정제하였다. 이어서, 상기 분자를 37℃ 하에 2시간 동안 4 μg/mL Lys-C와 함께 인큐베이션하여 활성 2-쇄를 산출하였다.
고 성능 페닐 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (PhHP HIC)를 이용하여 Lys-C를 활성화된 rBoNT/A2(0)로부터 분해하였다. 이는 고-염 트리스 완충제를 이용하여 상기 반응 혼합물을 조정한 후, 이를 페닐 HP 칼럼 상으로 부하한 다음, 고-염 세척하고, 연속해서 저-염 트리스 완충제에 대한 선형 구배를 이용하여 단백질 용출시키는 것을 포함하였다. 용출 분획을 변성 겔 전기영동 (SDS PAGE) 및 비색 Lys-C 활성 검정 (도 12)에 의해 분석하였는데, 이는 Lys-C가 활성화된 BoNT 분자가 용출되기 (F12-F15) 바로 전에 상기 구배에서 초기에 용출되었다는 사실을 나타냈다 (F5-F11). 따라서, 상기 칼럼은 rBoNT/A2(0)로부터의 Lys-C의 양호한 분리를 보여준다.
실시예 8 - 재조합 엔도펩티다제-음성 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A5 (rBoNT/A5(0))의 활성화 및 최종 정제
포획을 위하여 고 성능 부틸 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (부틸 HP HIC)를 이용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)한 다음, 고 성능 4급 암모늄 세파로스 음이온성 교환 크로마토그래피 (Q HP AEC)를 이용한 중간 정제 단계에 의해 단일 쇄 rBoNT/A5(0)를 정제하였다. 이어서, 상기 분자를 37℃ 하에 2시간 동안 2.5 μg/mL Lys-C와 함께 인큐베이션하여 활성 2-쇄를 산출하였다. 고 성능 페닐 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (페닐 HP HIC)를 이용하여 Lys-C를 활성화된 rBoNT/A5(0)로부터 분해하였다. 이는 고-염 트리스 완충제를 이용하여 상기 반응 혼합물을 조정한 후, 이를 페닐 HP 칼럼 상으로 부하한 다음, 고-염 세척하고, 연속해서 저-염 트리스 완충제에 대한 선형 구배를 이용하여 단백질 용출시키는 것을 포함하였다. 용출 분획을 변성 겔 전기영동 (SDS PAGE) 및 비색 Lys-C 활성 검정 (도 13)에 의해 분석하였는데, 이는 Lys-C가 활성화된 BoNT 분자가 용출되기 (F51-F65) 전에 상기 구배에서 초기에 용출되었다는 사실을 나타냈다 (F10-F39). 따라서, 상기 칼럼은 rBoNT/A5(0)로부터의 Lys-C의 양호한 분리를 보여준다.
실시예 9 - 재조합 엔도펩티다제-음성 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A6 (rBoNT/A6(0))의 활성화 및 최종 정제
고 성능 술포프로필 세파로스 양이온성 교환 크로마토그래피 (SP HP CEC)를 이용한 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)로 포획하기 전에, 단일 쇄 rBoNT/A6(0)을 먼저, 황산나트륨 침전시키고 소듐 아세테이트 내로 재가용화한 다음, pH 8 하의 트리스 완충제로 완충제 교환시킴으로써 정제하였다. 이어서, 상기 분자를 37℃ 하에 2시간 동안 0.3 μg/mL Lys-C와 함께 인큐베이션하여 활성 2-쇄를 산출하였다. 고 성능 페닐 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (페닐 HP HIC)를 이용하여 Lys-C를 활성화된 rBoNT/A6(0)으로부터 분해하였다. 이는 고-염 트리스 완충제를 이용하여 상기 반응 혼합물을 조정한 후, 이를 페닐 HP 칼럼 상으로 부하한 다음, 고-염 세척하고, 연속해서 저-염 트리스 완충제에 대한 선형 구배를 이용하여 단백질 용출시키는 것을 포함하였다. 용출 분획을 변성 겔 전기영동 (SDS PAGE) 및 비색 Lys-C 활성 검정 (도 14)에 의해 분석하였는데, 이는 Lys-C가 활성화된 BoNT 분자가 용출되기 (F16-F27) 전에 상기 구배에서 초기에 용출되었다는 사실을 나타냈다 (F6-F13). 이는 rBoNT/A6(0)으로부터의 Lys-C의 탁월한 분리를 보여준다.
실시예 10 - 단일 쇄, 재조합, 양이온성, 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A1 유도체 (mrBoNT/A1)의 정제
포획을 위하여 고 성능 술포프로필 세파로스 양이온 교환 크로마토그래피 (SPHP CEX)를 이용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)함으로써 단일 쇄 mrBoNT/A1 (서열식별번호: 15)을 정제하였다. 고 성능 부틸 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (BuHP HIC)를 사용한 중간 정제 단계를 이용하여 숙주 세포 단백질을 추가로 제거하였다. BuHP 용출 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였는데, 이는 정제된 단일 쇄, mrBoNT/A1로서 풀링된 단일 쇄 mrBoNT/A1을 함유하는 것이었다.
실시예 11 - 재조합, 양이온성, 보툴리눔 신경독 하위-혈청형 A1 유도체 (mrBoNT/A1)의 활성화 및 최종 정제
단일 쇄 mrBoNT/A1 (서열식별번호: 15)을 37℃ 하에 2시간 동안 0.4 μg/mL Lys-C와 함께 인큐베이션하여 활성 2-쇄를 산출하였다. 고 성능 부틸 세파로스 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (BuHP HIC)를 이용하여 Lys-C를 활성화된 mrBoNT/A1로부터 분해하였다. 이는 고-염 비스-트리스 완충제를 이용하여 상기 반응 혼합물을 조정한 후, 이를 BuHP 칼럼 상으로 부하한 다음, 고-염 세척하고, 연속해서 저-염 비스-트리스 완충제에 대한 선형 구배를 이용하여 단백질 용출시키는 것을 포함하였다. 용출 분획을 SDS-PAGE (도 15 상단) 및 비색 Lys-C 활성 검정 (도 15 하단)에 의해 분석하였다. Lys-C는 활성화된 BoNT 분자가 용출되기 (F10-F12) 전에 칼럼에서 관류 용출되었고 상기 용출 구배에서 초기에 용출되었다 (F1-6, 블랙 박스 내에 강조됨, 도 15 하단). 따라서, 이는 mrBoNT/A1로부터의 Lys-C의 양호한 분리를 보여준다.
실시예 12 - Lys-C가 실질적으로 없는 활성 2-쇄 BoNT/A를 포함하는 제제
활성 2-쇄 BoNT/A를 포함하는 다음 6개의 액상 조성물을 제조한다 (표 6).
<표 6>
예시되는 BoNT/A 제제
6개 조성물 모두를 25℃ 하에 12주 동안 저장한다. 세포-무함유 엔도펩티다제 검정을 이용하여 상기 기간 동안 2-쇄 BoNT/A 프로테아제 기능의 안정성을 평가한다.
실시예 13 - 고 감수성 Lys-C 활성 검정
정제된 BoNT/A 샘플 중에서의 최종 Lys-C 농도의 정량적 결정은 형광성 펩티드 기질의 절단을 측정함으로써 수행하였다. 이러한 형광성 기질 (Tos-GPK-7-아미노-4-트리플루오로아세테이트 염; Tos-GPK-AMC로 지칭되기도 함)을 DMSO에서 재구성하여 20 mg/ml (32.7 mM) 스톡을 수득하였다. 이를, 물을 이용하여 10 mM이 되도록 추가로 희석시키고, 분취액을 제조하며 -20℃ 하에 저장하였다. 검정 당일, 적당한 양의 기질을 취하고, 25 mM 트리스 pH 8, 125 mM NaCl을 이용하여 추가로 희석시켜 0.5 mM Lys-C 작업 용액을 수득한 다음, 이러한 작업 용액을 검정 완충제 (25 mM 트리스, 125 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, pH 8)에 희석시킴으로써 Lys-C 표준물 (공지된 농도)을 제조하였다. 표준물, 블랭크 (검정 완충제만 함유), 및 시험 샘플 (정제된 rBoNT/A의 배치)을 블랙 옵티플레이트(OptiPlate) 판 내로 삼중으로 (웰당 180 μl) 제공하고, 10 내지 15분 동안 37℃로 평형시켰다. 이어서, 20 μl의 기질을 가하고, 상기 판을 판 판독기 내로 즉시 옮겼는데, 여기서 동력학적 판독이 수행되었다. 상기 판을 37℃ 하에 여기/방출 필터 - 360/40 및 485/20를 이용하여 5시간 동안 20분마다 판독하였다. 데이터를 흡수/형광 (y 축)에 대항한 시간 (분) (x 축)으로서 플롯하였다. 각 Lys-C 농도에 대한 기울기 값을 이용하여 Lys-C 농도에 대한 표준 곡선을 생성하였다. 정제된 rBoNT/A의 샘플을 동일한 방식으로 처리하고, 각 rBoNT/A 샘플 중에서의 Lys-C 농도를 상기 표준 곡선으로부터 보간하였다. 4개의 독립적인 배치 또는 rBoNT/A의 분석에 근거하여, 본 발명자들은 최종 물질 내에서의 평균 Lys-C 농도가 100 ng BoNT/A당 7.3 ± 1.5 pg Lys-C인 것으로 측정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Ipsen Bionnovation Limited <120> Manufacture of recombinant Clostridium botulinum neurotoxins <130> P42342GB <150> GB1407525.3 <151> 2014-04-29 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium Botulinum <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu 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aacggtggtg ttcatacaaa ttcaggtata ataaaccatg ctgcttattt agttgcagat 780 ggaatagaaa aaactggtgc aaaaaatagt aaagatatta tgggaaaaat attctataca 840 gctaattgct ataaatggga tgaaacaaca aattttgcta agtgcagaaa tgatgtagtc 900 caagttacta aagaacttta tggcgaaaat agcaactatg taaaaattgt tgaaaaagct 960 tttgaccaag ttggaataac tgctacacct caattaccat tataa 1005 <210> 11 <211> 1746 <212> DNA <213> Clostridium Botulinum <400> 11 atgaaaagta aaaaattatt agctacagtg ctaagtgccg tgatcacttt ttctactgtt 60 tctgcagttt atgctgcgcc tgtaggaaaa gaaagtaaag ttgaaccaaa aactacaaca 120 ataacttggg aaaaaaatga acaaaatact aaaaaagctg ctactgatat aactgaaaag 180 aaatttaaca attctgagga gataactaaa ttctttgaaa aaaatatatc taaatttggt 240 gtacaaaaag gttctcttaa aaacaccaag actgtaaaag acgaaaaagg taaaactaac 300 tatcatatga tttatgaagt agaaggtata cctgtatact atggaagaat tgtttttaca 360 actgaaaaag actcctccat ggattctata aacggtagaa ttgatactgt ttttgaaaat 420 gggaattgga aaaacaaaat caaactatca aaagaagatg ctatagcaaa agctaaaaat 480 gatattaaag atgaaaaagc aactagtaaa aagaccgatt tatatctgta taattttgag 540 ggcaaacctt atgtagttta tttagtagat ctaattacag acaacgggag ttggacggtt 600 ttcgttaatg ctgaggatgg ttctatagta aataaattta ataatactcc tactttaatt 660 gatactaaag atcaaaaatt acccaatgct aaaaaaatta aagatgaagc taaaaaagct 720 agtaatgcaa ataatgtaat tgatgttcaa ggtcaaagcg ttaaaggagt aggaaaaact 780 agcttggatg gactagtaaa tattgatgta acttatggaa atggaaaata ctatttaaaa 840 gatagcaaca aaaatattta tctatatgac ttaaaaaatc aagttgatga atatgatcta 900 tacaattatc ttagtagacc taactataaa caaatattaa tgagcaaatc tgaattaata 960 tctaattaca ataataattt tatagccaac aatcaggtta attctgtaga tgcttatgta 1020 aacacaaata aaacctatga ttattataaa aacaaattaa atagaaacag tattgataat 1080 aagggtatga atattaatgg gtttgttcat gtaggtagaa attatggtaa tgctttttgg 1140 tacggtccat atgatgggat gttctttggc gatggcgacg gaatatactt ctcttccctt 1200 gcaaaatctt tagatgttgt aggccacgaa ttaagtcatg gtgtaacaaa taaagagtct 1260 aatcttaaat atgaaaatga atctggtgcc ctaaatgaat ctttctcaga tattatggga 1320 gtagctgttg agggtaaaaa ctttgtacta ggtgaagatt 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Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu 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Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295

Claims (21)

  1. (a) (i) 가용성 단일-쇄 BoNT/A 단백질을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 BoNT/A 단백질을 용액 중에서 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)와 접촉시키는 단계; 및
    (iii) 가용성 BoNT/A 단백질 및 Lys-C를 소수성 표면을 사용하여 분리시키는 단계이며, 여기서 가용성 BoNT/A 단백질은 소수성 표면과 우선적으로 결합하는 것인 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 활성 2-쇄 BoNT/A 단백질; 및
    (b) 안정화제
    를 포함하는 고형 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 2% 미만의 단일-쇄 BoNT/A를 포함하는 것인, 고형 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 1% 미만의 단일-쇄 BoNT/A를 포함하는 고형 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 엔도프로테이나제 Lys-C (Lys-C)를 100 ng BoNT/A 단백질당 400 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 300 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 200 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 100 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 50 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 20 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 15 pg 미만의 Lys-C, 또는 100 ng BoNT/A 단백질당 10 pg 미만의 Lys-C의 농도로 함유하는 고형 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 동결건조된 형태인 고형 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 물 또는 식염수와 재구성된 고형 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결정성 작용제를 추가로 포함하는 고형 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 결정성 작용제가 염화나트륨인 고형 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 결정성 작용제가 0.1 내지 0.5 M의 농도로 존재하는 것인 고형 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서:
    (a) 안정화제가 비-단백질 안정화제, 바람직하게는 계면활성제, 보다 더 바람직하게는 비-이온성 계면활성제이고/이거나;
    (b) 상기 고형 제약 조성물이 단백질 안정화제를 포함하지 않는 것인
    고형 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안정화제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머로부터 선택된 비-이온성 계면활성제인 고형 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 안정화제가 폴리소르베이트 80인 고형 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서:
    (a) 상기 안정화제가 1% v/v 미만의 농도로 존재하거나; 또는
    (b) 상기 안정화제가 0.005% 내지 0.02% v/v 농도의 폴리소르베이트 80인,
    고형 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH를 5.5 내지 7.5로 구성된 수준으로 유지시켜 주는 완충제를 추가로 포함하는 고형 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 완충제가 숙시네이트, 인산이나트륨/시트르산, 및 아미노산, 예컨대 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 고형 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 완충제의 농도가 1 내지 50 mM, 바람직하게는 5 내지 20 mM인 고형 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 디사카라이드를 추가로 포함하는 고형 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 디사카라이드가 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 디사카라이드는 수크로스인, 고형 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 디사카라이드의 농도가 5 내지 50 mM인 고형 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 2-쇄 BoNT/A 프로테아제 기능이 적어도 12주 동안 25℃ 하에 여전히 안정적인 것인 고형 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 고형 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미간 라인 또는 운동과다 얼굴 라인, 두통, 반축 안면 경련, 방광의 과잉활동, 다한증, 코 입술 라인, 자궁경부 긴장이상, 안검 경련, 또는 경직의 치료에 사용하기 위한 고형 조성물.
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