CN106414759A - 重组肉毒梭菌神经毒素的制造 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法。

Description

重组肉毒梭菌神经毒素的制造
发明领域
本发明涉及用于产生重组血清型A肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神经毒素(BoNT/A)的方法。
发明背景
肉毒神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌以巨大蛋白质复合物的形式产生，由本身复合于众多辅助蛋白的BoNT组成。目前存在至少7个不同类别的肉毒神经毒素，即：肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它们均共有相似的结构和作用模式。最近报告了一种可能的第八血清型，H，但是序列尚未公开。不同的BoNT血清型可以基于被特异性中和性抗血清失活而区分开，而借助血清型的这种分类与氨基酸水平的序列同一性百分数相关。基于氨基酸序列同一性百分数，将给定血清型的BoNT蛋白进一步划分成不同亚型。
BoNT是已知最强效的毒素，取决于血清型，小鼠的中位数致死剂量(LD50)值范围从0.5ng/kg至5ng/kg。BoNT在胃肠道中吸收，并且在进入体循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合并阻止神经递质乙酰胆碱释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割小突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa突触小体相关蛋白(SNAP-25)；并且BoNT/C切割突触融合蛋白。
在自然界中，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，所述单链多肽通过蛋白酶剪切事件受到翻译后修饰，以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割过程在位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的特异性切割位点(经常称作活化位点)发生。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称作重链(H-链)，其具有大约100kDa分子质量，和轻链(L-链或LC)，其具有大约50kDa分子质量。H-链包含C末端靶向组分(HC结构域)和N末端易位组分(HN结构域)。切割位点位于暴露的环区域内的L-链和易位组分之间(参见表1)。在HC结构域与其靶神经元结合并且结合的毒素借助内体内化入细胞后，HN结构域使L-链跨过内体膜易位并进入细胞溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称作非细胞毒蛋白酶)。
非细胞毒蛋白酶通过蛋白水解切割称作SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用–参见Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc。首字母缩略词SNARE衍生自术语可溶性NSF接合受体，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白对胞内小泡融合不可或缺，并且因此对分子借助小泡运输从细胞分泌不可或缺。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白显示出高度的底物特异性。因此，一旦输送至所需的靶细胞，非细胞毒蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒蛋白酶。
肉毒神经毒素因其引起肌肉松弛麻痹的能力著称。所述肌肉松弛特性已经导致肉毒神经毒素(如BoNT/A)用于多种医学手术和美容手术，包括治疗眉间纹或运动过多面纹、头痛、半侧面肌痉挛，膀胱过兴奋、多汗症、鼻唇沟线、颈肌张力障碍、睑痉挛和强直。
传统上，通过培养肉毒梭菌细菌，随后分离和纯化肉毒神经毒素复合物，实施BoNT的生产。然而，以这种方式生产BoNT低效并且提供低的蛋白质产率。此外，肉毒梭菌是形成孢子的细菌并且因此需要专用培养设备和设施，培养诸如大肠杆菌(Escherichia coli)之类的细菌不需要所述设备和设施。BoNT的使用增加导致用于产生和纯化BoNT的替代性方法开发。特别地，已经开发了使用大肠杆菌产生BoNT的方法。
从发酵液(无论是否使用肉毒梭菌或大肠杆菌)纯化CNT是一项特殊挑战，因为其中含有多种神经毒素作为未加工、部分加工和完全加工的多肽的混合物，其均具有非常相似的生物化学特性和物理特性。如果内切蛋白水解活性已经水解轻链和环之间的肽键，而环和重链N末端之间的肽键仍然完整，则一般生成部分加工的神经毒素。另外，如果内切蛋白水解活性已经从重链释放环肽，而环肽和轻链C末端具之间的肽键尚未水解，则也可以产生部分加工的神经毒素。取决于发酵条件和神经毒素的类型，缺少环肽的完全加工的多肽能遭受5％至90％之间部分加工的多肽或未加工的多肽显著污染。在一些情况下，神经毒素主要地是未加工的并且在治疗性使用之前，需要用内肽酶处理以变得有生物活性。
现有技术描述了用异源蛋白酶处理梭菌神经毒素以减少未加工的或部分加工的前体蛋白数量的多种尝试。尽管可用于活化血清型B(BoNT/B)和E(BoNT/E)梭菌神经毒素，最广泛用于活化梭菌神经毒素的蛋白酶，胰蛋白酶，似乎推定地在BoNT/A的重链亚基的C末端通过蛋白水解作用产生产生次级产物，并且因此似乎摧毁毒素与其细胞受体的结合作用。理论上从分离自天然宿主(如产生BoNT/A的肉毒梭菌)的内源蛋白酶预期了更多的特异性切割产物。
发明人先前已经鉴定各种蛋白酶，如来自肉毒梭菌的内源蛋白酶和包括内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)(其为市售并可以从产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)分离)的外源蛋白酶。但是，虽然由这种内切蛋白酶切割重组BoNT/A更精确地反映天然切割过程，但是Lys-C的使用提出了新的实践考虑问题。特别地，在切割重组BoNT/A后，Lys-C能够在反应混合物中数天仍有活性。因此，用于减少终产物中Lys-C的量并因而改善神经毒素制备物品质的手段和方法是迫切需要但是尚未可得的。
因此，作为本发明基础的技术问题可以视为通过满足前述需要提供用于改善神经毒素多肽制造的工具和方法。具体而言，本领域需要用于产生重组BoNT、尤其活化的双链重组BoNT/A的改进方法。
这个技术问题通过权利要求中及下文表征的实施方案来解决。
发明简述
可以通过大肠杆菌中作为单一多肽(本文中称作单链BoNT/A蛋白)表达，实现重组BoNT/A亚血清型的产生。一旦通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)分离这种单链蛋白，则必须切割单链蛋白以形成活性毒素，所述活性毒素是由单个二硫键连接在一起的双链蛋白质。
发明人先前已经发现，可以使用蛋白酶内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)切割重组单链BoNT/A亚血清型以产生活性双链BoNT/A蛋白神经毒素，即BoNT/A轻链和重链的异二聚体。通过N端测序和质谱法确定Lys-C切割位点与内源蛋白相同。因此，使用Lys-C产生活性双链BoNT/A蛋白是有利的，因为它导致产生有真实活性的双链BoNT/A，即基本上与天然活性双链BoNT/A相同的双链BoNT/A。相反，胰蛋白酶，另一种用来产生活性双链BoNT蛋白的常见蛋白酶，切割BoNT/A单链序列内部的至少一个额外位点。这种额外切割降低所产生的活性双链BoNT/A蛋白的效力。
一旦单链BoNT/A蛋白已经由Lys-C切割，则活性双链BoNT/A蛋白需要纯化以移除任何剩余的宿主细胞蛋白和Lys-C蛋白酶以产生最终的纯产物。
特别地，从内切蛋白酶Lys-C切割试验中，发明人已经发现，Lys-C在很低的浓度切割重组BoNT/A1(rBoNT/A1)并且在数天时间内仍保持活性。因此，重要的是开发可以从活化的毒素纯化除去这种蛋白酶的方法。
发明人已经开发了一种在活化后通过使用疏水相互作用色谱(HIC)从BoNT/A移除活化的Lys-C蛋白酶和宿主细胞蛋白的高效方法。发明人令人惊讶地发现，HIC不仅使得纯化中回收的活性双链BoNT/A的量最大化，还显著改善Lys-C分辨率，即Lys-C蛋白酶的移除。当考虑Lys-C和rBoNT/A的生物物理特征时，HIC的有利特性是违反直觉的；基于BoNT/A和Lys-C的等电点(pI)和净电荷，预测离子交换色谱(IEX)而非HIC本将解析两种蛋白质。
通过提供如权利要求中详述的方法，本发明解决了上文提到的一个或多个问题。
因此，本发明提供用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供可溶性单链BoNT/A蛋白；
b)使所述BoNT/A蛋白与溶液中的内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)接触；并且
c)通过使含有可溶性BoNT/A蛋白和Lys-C的溶液与疏水表面接触，将可溶性BoNT/A蛋白与Lys-C分离，其中可溶性BoNT/A蛋白偏好地与疏水表面结合。
可以通过在表达系统中表达编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸，在宿主细胞中产生可溶性单链BoNT/A蛋白，其中表达系统任选地是细菌表达系统，优选地其中细菌表达系统是大肠杆菌表达系统并且宿主细胞是大肠杆菌细胞。所述可溶性单链BoNT/A蛋白可以在所述宿主细胞的细胞质中或在无细胞系统中表达。可溶性单链BoNT/A蛋白可以按以至少5mg/L培养物的水平表达。所述方法可以包括裂解宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/A蛋白的宿主细胞匀浆(优选地，可溶性单链BoNT/A以至少5mg/L宿主细胞匀浆的浓度存在)。
本发明方法中使用的疏水表面可以是附着有由芳基或烷基组成的配体的惰性基质，其中配体任选地选自丁基、苯基或辛基配体。在一个实施方案中，使用高性能疏水表面。
本发明也提供通过本发明方法可获得的活性双链BoNT/A蛋白。
本发明还提供组合物，所述组合物包含本发明的活性双链BoNT/A蛋白；其中所述组合物基本上不含内切蛋白酶Lys-C。优选地，所述组合物含有少于400pg内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)每100ng BoNT/A蛋白、或少于300pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于200pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。这类组合物适用于治疗性疗法和美容疗法中。
本发明也提供液态药物组合物，所述液态药物组合物包含：本发明的活性双链BoNT/A蛋白；是表面活性剂的非蛋白质稳定剂；和水；其中所述液态药物组合物不包含蛋白质稳定剂；并且其中所述液态药物组合物基本上不含内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)。优选地，所述液态药物组合物含有少于400pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于300pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于100pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、或少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。所述液态药物组合物还可以包含：氯化钠，维持pH在5.5和7.5之间的缓冲剂，和二糖；其中水是无菌水。
本发明也提供本发明的活性双链BoNT/A蛋白、组合物或液态药物组合物用于治疗。
本发明进一步提供本发明的活性双链BoNT/A蛋白、组合物或液态药物组合物用于制造药物的用途。
本发明也提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的患者施用本发明的活性双链BoNT/A蛋白、组合物或液态药物组合物。
发明详述
肉毒毒素血清型A(BoNT/A)
术语“BoNT”意指肉毒神经毒素并且指从肉毒梭菌可获得的神经毒素如血清型A、B、C1、D、E、F或G的BoNT。术语“CNT”和“BoNT”还涵盖包含一个或多个修饰(包括化学修饰或基因修饰)的重组和修饰的神经毒素。术语“基因修饰”意指导致缺失、置换或添加一个或多个氨基酸碱基或缺失、置换或添加所述一个或多个氨基酸残基的一个或多个核酸残基的缺失、置换或添加。
BoNT/A血清型划分成至少8个亚血清型(也称作亚型)，BoNT/A1至BoNT/A8，所述亚血清型共有至少84％、至多98％的氨基酸序列同一性；给定亚型内部的BoNT/A蛋白共有更高的氨基酸序列同一性百分数。表1(下文)显示BoNT/A亚型的前体、天然双链神经毒素并且鉴定了包含由Lys-C切割的氨基酸序列的暴露环(活化环)。
表1:
参考表1，对LC、HN、HCN和HCC区域所示的氨基酸位置(残基)对应于全长BoNT/A蛋白序列中所述区域的氨基酸位置。表1中给出的UniProt登录号是不同BoNT/A亚血清型的例子。因此，在一个实施方案中，表1中所示的LC、HN、HCN和HCC区域的氨基酸位置对应于通过登录号鉴定的全长BoNT/A蛋白序列中的氨基酸位置。
使用本发明的方法，现在可以获得受未加工的或部分加工的BoNT/A污染显著较少的BoNT/A双链组合物，因为那些污染物被高效加工成双链BoNT/A。本发明的方法还允许有效移除用来将单链BoNT/A蛋白加工成活性双链的Lys-C酶。在一个方面，双链BoNT/A是天然双链神经毒素，其中轻链的C末端和重链的N末端与分离自野生型梭菌的相应的完全加工的双链BoNT/A相同。
根据本发明，活性BoNT/A双链，包括重组BoNT/A双链，可以作为单链多肽产生，所述单链多肽经切割以形成蛋白质的活性双链形式。
本发明的方法可以用来产生任何BoNT/A亚型的双链或同源物或其衍生物，包括例如SEQ ID NO:1的多肽及其衍生物。如相对于本发明的这个方面和其他方面使用，术语“衍生物”包含氨基酸突变如添加、置换、缺失或截短一个或多个氨基酸残基。
BoNT/A单链蛋白可以包含如以下GenBank编号中所示的多肽序列：CBZ04958.1、YP_002805603.1、ZP_02994746.1、YP_001788403.1、YP_001782718.1、ZP_02616437.1、ZP_02614241.1、YP_001392361.1、YP_001255575.1。BoNT/A单链蛋白可以包含如下文中所示的多肽序列：
·A1亚血清型：UniParc登录号UPI0000ED909E(UniProt登录号P10845，第159版)、UniParc登录号UPI0000EF85BD(UniProt登录号S8B1U4，第3版，或UniProt登录号A2I2R4，第41版)、UniParc登录号UPI0001A954C8(UniProt登录号C6K838，第11版)、UniParc登录号UPI0000001386(UniProt登录号A5HZZ9，第57版)、UniParc登录号UPI000003409D(UniProt登录号A2I2U2，第36版)、UniParc登录号UPI00016529B7(UniProt登录号B1A2D5，第21版)、UniParc登录号UPI00027EE164(UniProt登录号J7FGZ9，第6版)；
·A2亚血清型：UniParc登录号UPI0000EF84BD(UniProt登录号A2I2R5，第28版)、UniParc登录号UPI0001C0B376(UniProt登录号D2KCK3，第15版)、UniParc登录号UPI0001C32E84(UniProt登录号D3IV23，第10版)、UniParc登录号UPI0001F3B30D(UniProt登录号E5F1I1，第11版)、UniParc登录号UPI000016EA88(UniProt登录号Q45894，第116版，或UniProt登录号Q58GH1，第51版)、UniParc登录号UPI000067C53E(UniProt登录号Q2PPK6，第33版)、UniParc登录号UPI000290BEB1(UniProt登录号K4GGE0，第6版)；
·A3亚血清型：UniParc登录号UPI00005B712C(UniProt登录号Q3LRX9，第38版)、UniParc登录号UPI00016DBC11(UniProt登录号B1L2G5，第38版，或UniProt登录号D3IV24，第11版)、UniParc登录号UPI000290C3D0(UniProt登录号K4G3L3，第7版)；
·A4亚血清型：UniParc登录号UPI00005B712D(UniProt登录号Q3LRX8，第35版)、UniParc登录号UPI00019DB885(UniProt登录号C3KS13，第29版)；
·A5亚血清型：UniParc登录号UPI0001AE7D6A(UniProt登录号C7BEA8，第14版)、UniParc登录号UPI000198BDAE(UniProt登录号E8ZMW0，第18版，或UniProt登录号C1IPK2，第20版)；或
·A6亚血清型：UniParc登录号UPI0001B7D251(UniProt登录号C9WWY7，第13版)。
·A7亚血清型：UniParc登录号UPI000290B995(UniProt登录号K4LN57)。
·A8亚血清型：UniParc登录号UPI000559A469(UniProt登录号A0A0A7PDB7)；UniParc登录号UPI0003C9D2A1(UniProt登录号V5N8R1)。
BoNT/A单链蛋白可以包含这样的多肽序列，所述多肽序列是与上文提到的BoNT/A多肽序列之一具有至少50％序列同一性的同源物或衍生物。
在一个方面，所述BoNT/A单链蛋白的多肽链包含选自SEQ ID NO:2至7或13或14中任一者的序列。在一个更具体的方面，所述BoNT/A单链蛋白的多肽链包含选自SEQ ID NO:2至7或13或14中任一者的序列并且其中第二多肽在SEQ ID NO:2至7或13或14中任一者的所述序列内部的碱性氨基酸残基的C末端受到切割。所述序列代表本发明BoNT/A单链蛋白的已知底物的氨基酸序列。
BoNT/A单链蛋白在序列，比较表1，列LC和HN中所含的碱性氨基酸残基的C末端切割。在优选的方面，所述BoNT/A单链蛋白包含选自SEQ ID NO:2至7和13-14的序列(例如血清型BoNT/A1，SEQ ID NO:2)。
BoNT/A单链蛋白可以包含SEQ ID NO:2至7或13或14中任一者的衍生物、或SEQ IDNO:1的衍生物，或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列之一的衍生物，其中所述衍生物具有一个或多个点突变和/或一个或多个额外的氨基酸残基。在另一个方面，所述衍生物具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个点突变。通过使用如本文所述的确定蛋白酶活性的活性测定，技术人员可以确定给定的衍生物是否由Lys-C加工。
衍生物可以含有将碱性氨基酸残基变成非碱性氨基酸残基的点突变。衍生物可以与SEQ ID NO:2至7或13或14、SEQ ID NO:1或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列之一具有至少50％序列同一性。所述衍生物或包含该衍生物的多肽可以是Lys-C的底物并且以蛋白水解方式可被Lys-C切割。常见例子是SEQ ID NO:1的衍生物，所述衍生物例如包含一个或多个在轻链或重链中的点突变。
所述BoNT/A单链蛋白可以包含(a)多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO:1的序列(ATCC3502的BoNT/A，Genbank登录号AAA23262)或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列之一具有至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性。BoNT/A单链蛋白可以包含SEQ ID NO:15的多肽序列，或者与SEQ ID NO:15的序列具有至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性的多肽序列。
如本文所用的术语“序列同一性”指确定参考氨基酸序列和查询序列之间的同一性，其中将序列如此比对，从而获得最高级级别的匹配，并且所述序列同一性可以使用计算机程序(例如，BLASTP、BLASTN、FASTA)中代码化的公开技术或方法计算(Altschul 1990,JMoI Biol 215:403)。同一性百分数值可以在完整氨基酸序列范围内或氨基酸序列的某个区域内计算。例如，对于单链BoNT/A蛋白，可以在至多50个氨基酸(aa)残基、至多100个氨基酸残基、至多150个氨基酸残基、至多250个氨基酸残基、300个氨基酸残基、350个氨基酸残基、400个氨基酸残基、450个氨基酸残基、500个氨基酸残基、550个氨基酸残基、600个氨基酸残基、650个氨基酸残基、700个氨基酸残基、750个氨基酸残基、800个氨基酸残基、850个氨基酸残基、900个氨基酸残基、950个氨基酸残基、1000个氨基酸残基、1050个氨基酸残基、1100个氨基酸残基、1150个氨基酸残基、1200个氨基酸残基、1250个氨基酸残基或更多个残基的序列长度、至多全长单链BoNT/A蛋白序列范围内计算序列同一性。序列同一性可以在至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少150个氨基酸残基或至少250个氨基酸残基范围内计算。
对于技术人员，一系列基于多种算法的程序可用于比较不同的序列。在这种情况下中，Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman算法产生特别可靠的结果。为了实施序列比对并计算本文中描述的序列同一性值，将基于算法Clustal W的市售程序DNASTARLasergene MegAlign 7.1.0版在整个序列区域范围内按以下设置使用：两两比对参数：空位罚分：10.00，空位长度罚分：0.10，蛋白质权重矩阵Gonnet 250，除非另外说明，否则应当总是使用所述设置作为序列比对的标准设置。
至少30％意指至少30％、至少40％、至少50％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大，至多100％。可以基于SEQ ID NO:1的氨基酸位置420至466确定与SEQ ID NO:1的序列具有至少50％序列同一性的所述BoNT/A单链蛋白序列的序列同一性，或可以基于SEQ ID NO:2至7或13或14中的任一项确定所述序列同一性。换句话说，BoNT/A单链蛋白可以包含这样的多肽序列，所述多肽序列与BoNT/A单链蛋白的氨基酸位置420至466之间存在的多肽序列具有例如至少30％序列同一性或与任一种BoNT/A单链蛋白的多肽序列(包括与本文中确定的登录号相对应的任一个多肽序列)具有至少30％序列同一性。根据这个定义的多肽例如从可获得肉毒梭菌，破伤风梭菌(C.tetani)或产芽胞梭菌(C.sporogenes)。所述BoNT/A单链蛋白可以例如是天然存在的神经毒素或其包含一个或多个氨基酸突变如一个或多个氨基酸残基添加、置换、缺失或截短的衍生物。例如涵盖缺少例如天然神经毒素HC结构域或其部分的衍生物或者其他氨基酸残基替换神经毒素HC结构域的衍生物以及额外轻链或另一个蛋白质载货分子与BoNT轻链N末端融合的衍生物。
BoNT/A单链蛋白可以在N末端或C末端或在内部位置含有额外的氨基酸残基。额外的氨基酸残基可以旁侧分布有一个或多个蛋白酶切割位点。额外的氨基酸序列可以作为可检测标签发挥作用和/或允许与固相支持物结合。例子是His标签或GST标签。另一个例子是优选地添加至C末端的含有Streptag的氨基酸序列VPPTPGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:12)。
在另一个方面，可以通过蛋白酶切割调节所述BoNT/A单链蛋白的生物学活性。技术人员熟知，可以通过蛋白水解加工调节许多多肽的功能。如本文所用的“调节”意指增加或降低、活化或失活。例如，通过将单链神经毒素以蛋白水解方式加工成双链神经毒素，增加或触发许多梭菌神经毒素的生物学活性，其中双链神经毒素由多肽轻链和重链组成，所述轻链和重链通过二硫桥共价连接。神经毒素的生物学活性涵盖至少三种独立的活性：第一种活性是存于神经毒素轻链中的“蛋白水解活性”并负责水解涉及调节细胞膜融合的一种或多种多肽的肽键。第二种活性是“易位活性”，存在于加工的神经毒素的重链N末端处，并且涉及运输轻链跨过溶酶体膜并进入细胞质。第三种活性是“受体结合活性”，存在于加工的神经毒素的重链C末端处，并且涉及神经毒素结合和摄取至靶细胞。在优选的方面，如本文所用的术语“生物学活性”意指蛋白水解活性。在更优选的方面，该术语意指增加的蛋白水解活性。
梭菌神经毒素的生物学活性可以通过各种试验测量，所述试验均是本领域技术人员已知的。这些试验允许确定上文提到的一种或多种活性。例如，如Pearce等人,1994(Pearce LB,Borodic GE,First ER,MacCallum RD(1994)、Toxicol Appl Pharmacol 128:69-77)和Habermann等人,1980(Habermann E,Dreyer F,Bigalke H.(1980),NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol.311:33-40)所描述的小鼠LD50测定或离体小鼠膈神经偏侧膈(MPN)测定允许确定给定的神经毒素制备物对活生物或分离的神经肌肉制备物的毒性作用。为了在LD50测定中确立毒性作用，神经毒素必须在上文提及的所述三种活性的每一者都具有生物活性。另外，各种其他测定可用，允许例如确定神经毒素或神经毒素的轻链是否具有蛋白水解活性。此类测定法例如基于BoNT/A与SNAP-25接触。备选地，可以使用代表SNAP-25的切割位点的肽，其中可以标记肽以易于检测。在优选的方面，通过使用上文所述的MPN测定法确定生物学活性。
编码所述BoNT/A单链蛋白的核酸分子可以根据本发明使用。所述核酸分子可以任选地包含调节元件。如本文所用的术语“调节元件”指基因表达的调节元件，包括转录和翻译，并且包括元件如TATA框、启动子、增强子、核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列、IRES区、多聚腺苷化信号、末端加帽结构等。所述调节元件可以包含一个或多个异源调节元件或一个或多个同源调节元件。“同源调节元件”是从中衍生核酸分子的野生型细胞的调节元件，所述调节元件涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节。“异源调节元件”是不涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节的调节元件。也可以使用诱导型表达的调节元件，如诱导型启动子。
核酸分子可以例如是hnRNA、mRNA、RNA、DNA、PNA、LNA和/或修饰的核酸分子。核酸分子可以是环形、线性的、整合入基因组或是附加体的。还涵盖编码融合蛋白的连环体，所述融合蛋白包含3、4、5、6、7、8、9或10种多肽。另外，核酸分子可以含有编码胞内运输信号序列(如转运入胞内区室或跨细胞膜转运的信号)的序列。
根据本发明，编码BoNT/A的核酸分子可以设计成有利地在宿主细胞、特别地细菌宿主细胞、优选地大肠杆菌细胞中提供高水平表达。设计核酸分子以在宿主细胞、特别地细菌宿主细胞、优选地大肠杆菌细胞中增加蛋白质表达的方法是本领域已知的，并且包括降低编码核酸序列中“慢密码子”的频率(出现次数)。
在一个方面，使用包含编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸分子的表达载体，产生单链BoNT/A蛋白。载体可以适于在体外和/或在体内表达所述单链BoNT/A蛋白。载体可以是用于瞬时和/或稳定基因表达的载体。载体可以另外包含调节元件和/或选择标记。所述载体可以是病毒来源的、噬菌体来源或细菌来源的。例如，所述表达载体可以是pET-26b(+)载体。
编码BoNT/A单链蛋白的核酸分子或表达载体可以包含于包含本发明核酸分子或载体的宿主细胞中。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖适合翻译所述核酸分子或所述载体和尤其BoNT/A单链蛋白的原核细胞和/或真核细胞。所述宿主细胞可以是不表达BoNT/A单链蛋白或其同源物的宿主细胞。如本文所用的术语“同源物”指包含下述多肽序列的多肽，所述多肽序列与BoNT/A序列(例如SEQ ID NO:1的BoNT/A序列)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的序列同一性。然而，还涵盖表达BoNT/A单链蛋白或其同源物的宿主细胞，如野生型细胞。例如，宿主细胞可以选自肉毒梭菌、丁酸梭菌(C.butyricum)、巴氏梭菌(C.baratii)和破伤风梭菌，如血清型A)、B或F的肉毒梭菌。宿主细胞可以是肉毒梭菌Hall菌株(ATCC3502)；产生BoNT/A的菌株ATCC19397，也称作肉毒梭菌NCTC 4587和NCTC 7272；产生BoNT/A的肉毒梭菌菌株NCTC2916；产生的BoNT/A2的肉毒梭菌菌株Kyoto-F或毛里求斯/NCTC9837；产生BoNT/A3的肉毒梭菌菌株A254Loch Maree/NCTC2012；产生BoNT/A4和B的肉毒梭菌菌株CDC657；产生BoNT/A5和B3'的肉毒梭菌菌株H04402065；产生BoNT/B1的肉毒梭菌菌株Okra/NCTC7273；产生BoNT/B和F的肉毒梭菌菌株CDC4013/NCTC12265；或产生BoNT/F1的肉毒梭菌菌株Langeland/NCTC10281。所述宿主细胞可以是产孢子梭菌、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、嗜热溶蛋白芽胞杆菌(B.thermoproteolyticus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coli)或酵母细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)细胞。
在一个方面，BoNT/A单链蛋白在宿主细胞内部修饰(即糖基化、磷酸化、由蛋白酶加工等)。修饰还包括添加非蛋白质辅因子，包括金属离子。宿主细胞可以包含表达BoNT/A单链蛋白的诱导物。这种表达诱导物可以是具有增加宿主细胞培养物中BoNT/A单链蛋白或其裂解物数量的作用的核酸分子或多肽或化学实体，包括小化学实体。表达诱导物可以例如增加编码BoNT/A单链蛋白的核酸分子的转录或翻译。诱导物可以例如通过本领域技术人员已知的重组手段表达。备选地，诱导物可以是从细胞(例如梭菌细胞)分离。
单链BoNT/A蛋白可以是通过下述方法产生，所述方法包括引入如本文所述的表达载体至所述宿主细胞中并且在所述宿主细胞中表达所述单链BoNT/A蛋白。可以通过提供包含编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸的宿主细胞并且在所述宿主细胞中表达所述单链BoNT/A蛋白，产生单链BoNT/A蛋白。一般，宿主细胞是细菌细胞，优选地大肠杆菌细胞。大肠杆菌宿主细胞可以是大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)细胞。
优选地，BoNT/A单链蛋白在细胞中翻译。细胞可以是原核或真核细胞。在一个方面，细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或酵母；大肠杆菌是高度优选的宿主细胞。本发明也包括在野生型细胞(即从自然界分离的细胞，如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)的任何已知分离株)中翻译BoNT/A单链蛋白。如本文所述的任何合适的宿主细胞可以根据本发明使用。
技术人员可获得用于引起核酸分子或载体进入宿主细胞并在细胞中将BoNT/A单链蛋白表达为重组蛋白的各种标准手段和方法。另外，技术人员知道从细胞或细胞裂解物提取蛋白质和多肽的许多标准技术(例如Recombinant DNA Principles andMethodologies,J.Green,Marcel Dekker Inc.,1998；The Condensed Protocols:FromMolecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人,Cold Spring HarborLaboratory,2006；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人,ColdSpring Harbor Laboratory,2000)。这些手段和方法的任一者可以在本发明的方法中使用。
从宿主细胞或宿主细胞裂解物提取蛋白质的常见方法包括离心(澄清)细胞裂解物、硫酸铵沉淀蛋白质、重悬蛋白质，离心重悬的蛋白质、离子交换色谱、大小排阻色谱、疏水相互作用色谱等。这类步骤按不同顺序的几种组合可以根据本发明用于纯化BoNT/A单链蛋白。
如下文更详细地描述，BoNT/A单链蛋白可以与Lys-C接触以产生活性BoNT/A双链。发明人现在已经开发了从BoNT/A和Lys-C的反应混合物纯化BoNT/A双链的有利方法。
内切蛋白酶Lys-C
如本文所述，使用内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)，切割单链BoNT/A蛋白以形成BoNT/A蛋白的活性双链形成。术语“Lys-C”指来自产酶溶杆菌的特异性切割赖氨酸C末端肽键的33kDa丝氨酸内切蛋白酶Lys-C(Lysyl内肽酶，LeK，Genbank登录号Q7M135)或其具有至少50％序列同一性的同源物。在一个实施方案中，其与Lys-C具有至少50％序列同一性的同源物保留Lys-C的功能(即蛋白水解活性)。
根据本发明，Lys-C酶是可以包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列的或由所述多肽序列组成的蛋白水解活性多肽。在一个方面，根据本发明使用的Lys-C酶是由如SEQ ID NO:8中所示的多肽序列组成的蛋白水解活性多肽。
一般，Lys-C的同源物能够水解单链肉毒神经毒素(例如血清型A(BoNT/A))以产生双链肉毒神经毒素(例如血清型A(BoNT/A))。在一个实施方案中，术语“Lys-C”还包括功能等同的蛋白酶，如与Lys-C识别相同的切割序列并且在Lys的羧基侧处水解的那些蛋白酶。本术语还涵盖是所述蛋白酶的具有至少60％序列同一性的同源物。
如本文所用的术语“蛋白水解活性多肽”指多肽的催化功能并且意指多肽能够水解肽键。在一个方面，“蛋白水解活性多肽”指一种多肽，所述多肽能够水解包含选自SEQ IDNO:1至7任一者的氨基酸序列的多肽。
如本文所用的术语“无蛋白水解活性多肽”指多肽的催化功能并且意指多肽不能够水解肽键。
通过检验所述多肽的蛋白水解活性，技术人员可以确定根据本文中提到的序列定义的Lys-C多肽是否为根据本发明使用的多肽。确定蛋白水解活性的测定或检验系统包使Lys-C多肽与检验底物接触，所述Lys-C多肽包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列。
检验底物一般是已知由Lys-C可切割的多肽。优选地，检验底物是梭菌神经毒素(CNT)，如BoNT或其片段。检验底物可以例如是未切割的/未加工的BoNT，本文中命名为单链BoNT(scBoNT)并且可以例如是血清型A、B、C1、D、E、F或G的(例如scBoNT/A，scBoNT/B等)或检验底物可以是破伤风神经毒素(TNT)。备选地，检验底物可以是梭菌神经毒素的片段，所述片段包含选自SEQ ID NO:1至7任一者的氨基酸序列。片段可以是50个或更多个氨基酸残基的多肽或至多49个氨基酸残基的肽。如本说明书中自始至终使用，术语“多肽“指具有50个或更多个氨基酸残基的分子，而术语“肽”指具有2至49个氨基酸残基的分子。
检验底物可以是可溶性神经毒素片段，称作LHN，所述片段包含括轻链多肽、暴露的环肽区域和重链多肽N端半侧、易位结构域HN。检验底物可以是或包含选自SEQ ID NO:2至8任一者的肽(参见表1)。检验底物可以是包含衍生自两种或更多种血清型的氨基酸残基的嵌合神经毒素。
用于确定Lys-C酶、其同源物或衍生物的蛋白水解活性的测定一般包括确定检验底物转化为其切割产物的程度的步骤。观察到在多肽与检验底物接触后生成的一种或多种切割产物或观察到切割产物数量增加提示了多肽的蛋白水解活性。所述确定步骤可以涉及比较底物和切割产物。所述比较可以涉及确定底物的量和/或一种或多种切割产物的量并且还可以涉及计算底物和切割产物的比率。此外，用于确定蛋白水解活性的测定可以包括步骤：比较测试样品与参比样品，其中参比样品一般包含(a)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列并且已知具有蛋白水解活性的多肽，和(b)已知由(a)的多肽可切割的检验底物。
用于确定蛋白水解活性的测定可以包括通过电泳法或通过柱色谱和，任选地，光谱测定分析，分离底物(例如BoNT/A单链蛋白)和切割产物(例如活性BoNT/A双链)。可能便利的是用一种或多种标签标记检验底物以更容易地检测检验底物的下降和/或产物的增加。如本文所用，术语“标签”意指可检测标记物并且例如包括放射性标签、抗体和/或荧光标签。可以例如通过放射自显影法或光谱测定法(包括基于至少两种标签之间能量共振转移的方法)确定检验底物和/或切割产物的量。备选地，免疫学方法如蛋白质印迹法或ELISA可以用于检测。
在优选的方面，如果使用选自100mM Tris-HCl，pH 8.0或PBS(50mM Na2HPO4，150mMNaCl，pH 7.4)的缓冲液，超过20％、优选地超过95％的检验底物在120分钟内在37℃转化成切割产物如轻链和重链，则多肽具有蛋白水解活性。如果检验底物不是全长BoNT/A反而例如是全长BoNT/A的片段或BoNT/A的衍生物，则相同情况适用。显而易见在这种情况下，切割产物将不同。但是，技术人员可以对相应的切割产物定量。
一般，测定中使用100ng具有蛋白水解活性的Lys-C多肽和相对于底物1:100的摩尔比。
样品按多个时间间隔取得以跟踪随时间推移的催化活性。
可以调整测定，例如通过使用多个量的具有蛋白水解活性的Lys-C多肽。
SEQ ID NO:9显示无蛋白水解活性的多肽的多肽序列，所述无蛋白水解活性的多肽衍生自肉毒梭菌菌株ATCC3502，GenBank登录号：CAL82988.1，具有581个残基的氨基酸长度。SEQ ID NO:8显示SEQ ID NO:9的具有蛋白水解活性的衍生物，所述衍生物缺少SEQ IDNO:9的氨基酸残基1至248。
术语“包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列的多肽”指与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽。此外，该术语指包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列的多肽。所述多肽可以具有(例如在SEQ IDNO:8中所示序列的内部位置或其N末端或C末端处或在与SEQ ID NO:8的序列至少50％相同的氨基酸序列的内部位置或其N末端或C末端处)额外的氨基酸，其中甲硫氨酸可以在多肽的N末端存在。此外，该术语指缺少(例如在SEQ ID NO:8中所示序列的内部位置或其N末端或C末端处或在序列中与SEQ ID NO:8至少50％相同的序列的内部位置或其N末端或C末端处)一个或多个氨基酸残基的多肽。术语“序列同一性”和计算序列同一性的手段在本文中相对于BoNT/A而限定，并且相同的定义和手段还适用于Lys-C的讨论。
一般，在SEQ ID NO:8或9的整个长度范围内，即分别在333aa或581aa的长度范围内确定Lys-C酶的序列同一性。如本文所用的术语“至少50％序列同一性”意指至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性。
具有蛋白水解活性的Lys-C多肽可以具有与如SEQ ID NO:8中所示的参考多肽序列相同数目的氨基酸。备选地，多肽可以具有额外的氨基酸残基或更少的氨基酸残基。例如，本发明的蛋白水解活性多肽可以由SEQ ID NO:8或9的截短突变体或与SEQ ID NO:8或9的序列具有至少50％序列同一性的多肽组成或包含所述截短突变体或多肽。SEQ ID NO:9的截短突变体可以例如缺少氨基酸位置249的N末端的一个或多个氨基酸残基。截短突变体可以是具有蛋白水解活性的N或C末端截短突变体和/或内部截短突变体。SEQ ID NO:9的截短突变体可以缺少SEQ ID NO:9的氨基酸位置1至248。备选地，SEQ ID NO:9的截短突变体可以是C末端截短突变体。截短突变体可以缺少至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、150个或至多170个连续氨基酸残基。蛋白水解活性多肽可以具有至少200个氨基酸(aa)残基，至少250个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基或至少333个氨基酸残基的氨基酸长度。备选地，蛋白水解活性多肽可以具有至多333个氨基酸残基、至多350个氨基酸残基、至多573个氨基酸残基、至多581个氨基酸残基、至多592个氨基酸残基、至多600个氨基酸残基或至多617个氨基酸残基。
蛋白水解活性多肽可以涵盖这样的多肽，所述多肽在SEQ ID NO:8的多肽链或与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列的N末端或C末端处和/或在内部位置包含额外氨基酸残基。这些额外的氨基酸残基可以包含至多5个、至多10个或甚至至多200个、300个或至多400个连续氨基酸残基。额外的氨基酸残基可以作为蛋白水解活性的抑制剂发挥作用。可以通过蛋白酶移除这些额外的氨基酸残基。备选地，排除抑制多肽的蛋白水解活性的额外残基。额外的氨基酸残基可以旁侧分布有一个或多个蛋白酶切割位点。在另一个方面，额外的氨基酸序列作为可检测标签发挥作用和/或允许与固相支持物结合。
在另一个方面，通过交换一个或多个氨基酸残基，修饰SEQ ID NO:8的多肽链或与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％序列同一性的多肽序列。如本文所用，术语“交换”意指将氨基酸替换为不同的氨基酸。例如，可以将多肽序列中至多1个氨基酸(aa)、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸或至多50个氨基酸替换。交换可以涉及保守的或非保守的氨基酸变化，例如旨在增加或减少多肽的底物结合或蛋白水解活性。
一般，蛋白水解活性多肽涵盖能够将底物(例如单链BoNT/A蛋白)水解成两种或更多种天然切割产物的多肽。本发明的多肽可以将底物水解成与天然切割产物相同或不同的两种或更多种切割产物。优选地，切割产物与天然切割产物相同。
如本文所用的术语“天然切割产物”或“天然产物”指这样的产物，所述产物与从底物源于其中的野生型细胞培养物中的相同底物产生的产物相比时氨基酸序列相同。在一个优选实施方案中，切割产物是肉毒神经毒素或破伤风神经毒素的双链神经毒素。在一个更优选的实施方案中，双链神经毒素是从A、B、C1、D、E、F或G血清型肉毒梭菌分离的神经毒素。在又一个方面，所述双链神经毒素是天然双链BoNT/A神经毒素。
应当理解，除非另外说明，否则上文和下文做出的定义和术语解释在已作必要修正情况下适用于本说明书中描述的全部方面。
产生BoNT的方法
本发明涉及Lys-C在用于蛋白水解加工多肽、具体是BoNT/A单链蛋白的方法中的用途，以及使用疏水相互作用色谱(HIC)纯化从Lys-C产生的活性BoNT/A双链的手段。在一个方面，本发明涉及一种用于制造活性BoNT/A双链的方法，所述方法包括步骤使(a)Lys-C与(b)BoNT/A单链蛋白接触，所述BoNT/A单链蛋白易受Lys-C的蛋白水解，其中所述接触导致将所述BoNT/A单链蛋白蛋白水解加工成至少两种切割产物，优选地包括活性BoNT/A双链，并且使用HIC纯化所述活性双链。
如本文所述，本发明的方法可以用来制造蛋白水解加工的梭菌神经毒素(CNT)或肉毒神经毒素(BoNT)，具体是蛋白水解加工的BoNT/A，即活性BoNT/A双链。使用本发明的方法，现在可以获得受未加工的或部分加工的BoNT/A污染显著较少的活性BoNT/A双链组合物，因为那些污染物被高效加工成双链BoNT/A。本发明的方法还允许有效移除用来将单链BoNT/A蛋白加工成活性双链的Lys-C酶，即改进活性BoNT/A双链的纯化。
因此，本发明涉及从Lys-C纯化(解析)BoNT/A双链，包括通过疏水相互作用色谱分离。因此，本发明提供一种用于产生双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括提供单链BoNT/A蛋白，使所述BoNT/A蛋白与溶液中的内切蛋白酶Lys-C接触并且通过使含有BoNT/A蛋白和Lys-C的溶液与疏水表面接触，将BoNT/A蛋白与Lys-C分离，其中BoNT/A蛋白偏好地与疏水表面结合。通常，单链BoNT/A蛋白与Lys-C接触导致单链BoNT/A蛋白裂解成可溶性双链形式。优选地，Lys-C所致的单链BoNT/A蛋白的切割产物与天然BoNT/A切割产物相同。通常，BoNT/A的单链形式和双链形式均是可溶的。
可以浓缩从色谱柱采集的一个或多个级分，例如通过沉淀或超滤。
在一个实施方案中，其中本发明提供(如上文所述的)产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，通过如上文所述的在宿主细胞、优选地细菌宿主细胞、最优选地大肠杆菌宿主细胞中产生可溶性单链BoNT/A蛋白的方法提供溶性单链BoNT/A蛋白。
任何合适的表达系统可以用来产生可溶性单链BoNT/A蛋白。本发明的表达系统可以是体内或体外(无细胞)表达系统。合适的体内和体外表达系统的例子是本领域已知的。如本文定义，表达系统可以包含合适的宿主细胞和/或用于所述宿主细胞中的合适表达载体。例如，合适的表达系统可以包含细菌宿主细胞和/或适于在所述细菌宿主细胞中表达可溶性单链BoNT/A蛋白的表达载体。
可以在如本文所述的任何合适宿主细胞(如细菌细胞)中产生单链BoNT/A蛋白。通常，使用大肠杆菌宿主细胞。可以通过下述方法产生单链BoNT/A蛋白，所述方法包括在宿主细胞(例如，大肠杆菌细胞)表达系统中表达核酸序列。这种表达可以涉及将编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸分子引入所述宿主细胞中，并翻译所述核酸分子以产生单链BoNT/A蛋白。用来在表达系统(包括大肠杆菌表达系统)中表达异源蛋白的方法和技术是本领域熟知的。
通常，在所述大肠杆菌宿主细胞的细胞质中表达所述可溶性单链BoNT/A蛋白。
可溶性单链BoNT/A蛋白可以按至少5mg/L(例如，至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、25、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500mg/L、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL或更高)的水平(浓度)表达。通常，单链BoNT/A蛋白的表达水平指细胞培养物中单链BoNT/A的水平。在一个实施方案中，所述表达水平指粗制宿主细胞(例如细菌宿主细胞)匀浆，即用来表达单链BoNT/A蛋白的宿主细胞(例如细菌宿主细胞)的粗制匀浆。因此，在一个实施方案中，粗制宿主细胞匀浆(例如粗制细菌宿主细胞匀浆)中单链BoNT/A蛋白的表达水平是至少5mg/L(如本文定义)。
如上文所述，用于产生可溶性单链BoNT/A蛋白的方法可以包括裂解宿主细胞、优选地细菌宿主细胞、最优选地大肠杆菌宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/A蛋白的宿主细胞匀浆、更优选地细菌宿主细胞匀浆、最优选地大肠杆菌宿主细胞匀浆。用来裂解宿主细胞如细菌细胞、尤其大肠杆菌宿主细胞的方法和技术是本领域已知的。例子包括超声处理或使用弗氏压碎器。
肉毒梭菌或大肠杆菌表达的BoNT/A单链蛋白的纯化例如可以基本上如现有技术中描述那样进行(DasGupta 1984,Toxicon 22,415；Sathyamoorthy 1985,J BiolChemistry 260,10461)。特别地，神经毒素的纯化可以含有一个或多个沉淀和提取步骤，一个或多个浓缩步骤，和其他不同的色谱步骤。现有技术中描述了重组单链BoNT/A及其纯化(Rummel等人,2004,Mol Microbiol.51:631-43)。
用来产生BoNT/A单链蛋白或其衍生物的细菌宿主细胞可以是肉毒梭菌或大肠杆菌。对于发酵，可以使用DasGupta B.R.等人在Toxicon,第22卷,第3期,第414页至第424页,1984中描述的方法。因此，将0.5％酵母提取物和0.6％高压灭菌酵母糊膏添加至2％的N-Z-胺A型培养基，并将借助4M NaOH调节pH至7.2，并且以如此方式制备的培养基此后将高压灭菌。可以向这种培养基单独添加高压灭菌的葡萄糖(每体积以重量计20％)至达到培养基中葡萄糖终浓度0.5％。温育可以例如在37℃在不搅拌的情况下进行，其中例如在96小时后停止发酵。可以使用分批发酵法、半分批发酵法、重复分批发酵法或连续发酵法。
在实际发酵和分离发酵培养基与细胞后，发酵培养基可以接受第一沉淀，目的是移除大蛋白质。沉淀优选地是酸沉淀法。这种酸沉淀法的反应条件是本领域技术人员已知的。通常，1.5M H2SO4可以用来酸化上清液至pH 3.5。离心通常以2400x g在4℃进行20分钟。可以用水洗涤通过离心收到的沉淀物，优选地反复洗涤。随后，沉淀物可以用0.1M柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH5.5萃取例如1小时。随后，可以进行又一个离心步骤，例如在4℃按9800x g持续20分钟。如此获得的沉淀物任选地随后可以再次如之前所述那样萃取。提取过程的上清液和重复提取过程情况下的两次上清液随后可以经历硫酸鱼精蛋白沉淀。沉淀可以持续过夜，例如在8℃。随后，可以将沉淀物离心，例如在4℃并以12,000x g持续20分钟。离心的上清液可以经历沉淀如硫酸铵沉淀，因而可以移除其他较大的蛋白质。在硫酸铵沉淀步骤后，可以增加另一个离心步骤并且随后可以将如此获得的沉淀物重溶并且任选地进行透析。优选地经透析和再次离心的提取物可以经历连续的色谱步骤，目的是纯化神经毒素。每个色谱步骤起到移除污染物如硫酸鱼精蛋白、剩余的DNA、部分更小的蛋白质和中等大小的蛋白质以及肉毒神经毒素蛋白质复合物的血凝素。为此目的，可以在优选实施方案中使用一个或多个色谱步骤。任选地，可以是过滤(例如最后色谱步骤的)洗脱物，以移除微生物。任选地，例如最后一个色谱步骤的洗脱物可以在过滤前稀释并且可以添加合适的辅助剂。在其他步骤期间，另一次无菌过滤可以在添加佐剂后实施。在一个方面，过滤在反应容器中实施，所述反应容器随后可以经历冻干步骤。
BoNT/A单链蛋白可以在它已经从宿主细胞或宿主细胞裂解物分离后与Lys-C接触并且随后经历本发明的方法。
当本发明的单链BoNT/A蛋白与Lys-C接触时，Lys-C的蛋白水解作用在L-链蛋白酶组分和易位组分之间的位点切割单链蛋白以产生双链蛋白质，其中两条链由二硫桥连接。例如，在活化位点处切割单链BoNT/A1、A2和A4-A6后形成的两条链是氨基酸残基1-438的第一链和氨基酸残基449-1296的第二链(在A6中例外，其中第二链具有氨基酸残基449-1297)，残基439-447因切割事件而移除。在活化位点处切割单链BoNT/A3后形成的两条链是氨基酸残基1-434的第一链和氨基酸残基445-1292的第二链，残基435-444因切割事件而移除。因此，Lys-C可以用来通过将单链多肽转化成活性双链形式令其活化。有利地，因此，Lys-C的使用意味着不需要将外源(非天然)切割位点改造入BoNT/A，并且还使得产生天然BoNT/A双链成为可能。
在一个实施方案中，如本文所述，提及Lys-C包括在与Lys-C相同的蛋白酶切割位点切割的Lys-C样酶和变体酶。
如本文所用的术语“接触”指使得至少两种不同化合物在物理上接近，从而引起所述化合物的物理和/或化学相互作用。根据本发明的方法，所述两种不同化合物是溶液中包含的BoNT/A单链蛋白和Lys-C。接触以足以允许BoNT/A单链蛋白和Lys-C相互作用的条件和时间实施。
术语“易受蛋白水解”指BoNT/A单链蛋白的特征或要求并且本文中用来意指所述BoNT/A单链蛋白是可由Lys-C蛋白水解切割的。也就是说，术语“易受蛋白水解”意指BoNT/A单链蛋白包含允许其作为Lys-C的底物发挥作用的蛋白酶识别及切割位点。如本文所述，BoNT/A单链蛋白是Lys-C的底物并且经蛋白水解加工成两种或更多种切割产物(优选地，仅两种肽–借助二硫键连接在一起的L-链或其片段和H-链或其片段)。使用上文所述的测定，技术人员可以检验给定的BoNT/A单链蛋白是否为第一多肽的底物并且因此是否为根据本发明定义的“第二多肽”。术语“至少两种切割产物”例如包括至多2、3、4、5种和至多6种切割产物。
这种方法可以例如用于制备包含BoNT/A双链的药物组合物或用于产生在质谱法中使用的多肽片段。Lys-C和BoNT/A单链蛋白可以在BoNT/A双链生产过程中的多个步骤接触。例如，Lys-C和BoNT/A单链蛋白接触的步骤可以是在细胞内部，如通过在所述细胞中表达Lys-C和BoNT/A单链蛋白。
备选地，所述接触步骤是在细胞裂解物中或在纯化的细胞裂解物中。这涵盖了添加Lys-C至裂解物或纯化的裂解物。可以在从细胞裂解物纯化BoNT/A单链蛋白期间在多个步骤处添加Lys-C。例如，Lys-C可以在蛋白质沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和/或大小排阻色谱之前或之后添加。
接触步骤需要以足以使Lys-C切割BoNT/A单链蛋白的条件和时间温育。示例性条件可以包括添加选自100mM Tris-HCl，pH 8.0或PBS(50mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4)的缓冲液。优选的缓冲液条件包括100mM Tris-HCl，pH 8.0。可以使用上文所述的测定确定“足以切割的时间”。在一个方面，所述“足以切割的时间”取决于蛋白水解加工的多肽或包含它的组合物应当具有的切割程度。在一个方面，该方法包括温育Lys-C和BoNT/A单链蛋白至少30分钟、60分钟、120分钟或至少240分钟的步骤。在另一个方面，将Lys-C和BoNT/A单链蛋白温育至多30分钟、60分钟、120分钟、240分钟、480分钟或至多600分钟。在另一个方面，该方法包括在4℃或在37℃温育Lys-C和BoNT/A单链蛋白的步骤。在另一个方面，该方法包括温育至多1小时、至多2小时、4小时、6小时、10小时或至多16小时的步骤。
在一个实施方案中，其中本发明提供(如上文所述的)产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括通过使含有可溶性BoNT/A蛋白和Lys-C的溶液与疏水表面接触，将可溶性BoNT/A蛋白与Lys-C分离，其中可溶性BoNT/Lys-C蛋白偏好地与疏水表面结合。
发明人已经发现，可以通过使用疏水性纯化方法分离活化的双链多肽与Lys-C，获得活化的双链BoNT/A蛋白的高产率。令人惊讶地，相对于使用离子交换色谱的标准纯化法，这种方法提供优越的纯化作用，其中发明人已经发现所述标准纯化法分离活化的双链多肽与Lys-C的效率较低。此外，该方法有利地提供不含活化性蛋白酶的活化的双链BoNT/A蛋白并且因此适用于疗法中，作为通用纯化方法的部分。
如本文所述，活性重组BoNT/A的产生需要将该分子切割成活性双链形式的蛋白水解步骤。这种切割可以由使用内切蛋白酶Lys-C的体外活化步骤实现。在活化步骤后，重要的是从终产物移除Lys-C，这还阻止对BoNT/A的任何其他非特异性切割。
如下表2中所示，Lys-C和BoNT/A的计算等电点(pI)分别是6.70和6.05，这表明应当利用两种分子之间的电荷差异，通过离子交换(IEX)色谱实现两种蛋白质的分离。蛋白质的净电荷受其周围环境的pH影响并且将变得带有更多正电荷或负电荷，这取决于它是否取得或丢失质子。pI是分子不携带电荷并且将因此不与带电荷的IEX介质相互作用的pH值。这意味着如果蛋白质处于其pI以上的pH，则它将携带净负电荷并且将与带正电荷的介质如阴离子交换剂结合。类似地，如果缓冲液pH低于pI，则蛋白质将携带净正电荷并且将不与阴离子交换剂结合。
另外，如表2中所示，BoNT/A和Lys-C具有相似的平均疏水性，但在pH 4.5和8.0处具有巨大的电荷差异。基于这种原理，将预计离子交换色谱(IEX)可以用来解析(分离)BoNT/A和Lys-C。IEX是一种简单和价廉的色谱方法，因为它不需要加载于柱上的蛋白质处于高盐缓冲液中，所述高盐缓冲液可能导致蛋白质因沉淀而损失。
发明人已经使用与交联琼脂糖珠结合的强官能团和弱官能团，在pH 8测试过多种阴离子交换柱。与BoNT/A的洗脱相比时，发现，Lys-C出乎意料地在相似的离子强度洗脱(表3；图7至图10)，这表明Lys-C并未如预测那样分离并且将在最终纯化的BoNT/A产物中存在，伴有BoNT/A进一步降解的额外可能性。
发明人已经解决以上问题。更详细地，发明人已经令人惊讶地鉴定了，通过使用疏水性分离表面实现了最佳Lys-C-BoNT/A分离(例如，通过疏水相互作用色谱(HIC)，所述疏水相互作用色谱通过利用这些蛋白质之间的可逆性相互作用和HIC基质/树脂的疏水表面，根据这些蛋白质的表面疏水性差异分离蛋白质)。
通常，与Lys-C结合至疏水表面相比，活性BoNT/A双链偏好地与HIC树脂/基质(本文中这些术语可互换使用)的疏水表面结合。“偏好的”结合可以定义为与Lys-C结合至疏水表面相比，活性BoNT/A双链与疏水表面的结合增加或改善。例如，活性BoNT/A双链可以与疏水表面以至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍于Lys-C对疏水表面的亲和力结合。在一个优选实施方案中，活性BoNT/A双链与疏水表面以至少5倍或至少10倍于Lys-C对疏水表面的亲和力结合。
在一个实施方案中，疏水表面是附着有包含芳基或烷基或由其组成的配体的惰性基质/树脂。
术语“芳基”指芳族基团，例如苯基、萘基、噻吩基和吲哚基。
术语“烷基”指脂族基团，包括直链、分枝链、环状基团及其组合。烷基可以具有1至12个碳原子。烷基的例子包括但不限于如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔-丁基)、戊基、己基、庚基和辛基的基团。
在一个实施方案中，疏水表面包含选自丁基、苯基或辛基配体的一种或多种配体。
在一个实施方案中，疏水表面包含丁基配体。在一个实施方案中，疏水表面包含苯基配体。在一个实施方案中，疏水表面包含辛基配体。
疏水表面可以含有附着有适宜疏水性配体的任何合适的惰性基质/树脂。例如，惰性基质/树脂可以选自二氧化硅、交联葡聚糖、交联聚丙烯酰胺或交联琼脂糖等。尤其还包括多肽、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。惰性基质例如是选自琼脂糖凝胶、sephadex、琼脂糖、sephacell、微晶纤维素和藻酸盐珠的多糖基质。在另一个方面，所述惰性基质/树脂可以由玻璃珠和/或多肽基质组成。
惰性基质/树脂可以具有任何合适的结构构造或布局。例如，基质/树脂可以为球状，如在珠中，或圆柱状，如在试管的内表面或杆的外表面中。备选地，基质可以是不规则的或呈扁平状如薄片或试纸条。
发明人已经发现，使用含有与惰性基质/树脂偶联的烷基或芳基(例如丁基、苯基和辛基配体)的色谱基质/树脂如交联琼脂糖或聚苯乙烯珠，用HIC获得了分离Lys-C与BoNT/A的特别优选的结果(表4；图1至图3)。
与离子交换色谱(IEX)相比，HIC的使用提供改善的Lys-C与活性BoNT/A双链的解析度。
根据本发明可以使用“快速流动”HIC色谱树脂/基质。“快速流动”树脂/基质可以定义为具有比标准HIC树脂/基质更均匀的平均颗粒大小的树脂/基质并且将采用更小的颗粒。具体而言，“快速流动”树脂/基质将具有更狭窄的更小颗粒大小的范围。颗粒大小可以按本领域已知的任何适宜方式定量，例如根据平均颗粒直径定量。通常，“快速流动”树脂/基质将包含平均直径小于100μm、小于95μm、小于90μm或更小的颗粒(例如珠)。在一个优选实施方案中，“快速流动”树脂/基质的平均直径是小于90μm。通常，“快速流动”树脂/基质的平均颗粒分布将是从约20至约180μm、从约30至约170μm、从约40至约170μm、从约40至约165μm。在一个优选实施方案中，快速流动”树脂/基质的平均颗粒分布是从约44至约165μm。
在一个优选实施方案中，使用高效HIC树脂，如苯基高效(PhHP)或丁基高效(BuHP)树脂。与离子交换色谱(IEX)相比，这类高效HIC基质/树脂通常提供改善的Lys-C与活性BoNT/A双链的解析度，甚至当使用高效IEX基质/树脂，如季胺高效(QHP)基质/树脂时也是如此。如本文中讨论，高效树脂/基质和其他树脂/基质之间的主要差异是平均颗粒大小(再次，这可以按本领域已知的任何适宜方式，例如平均颗粒直径定量)更小(34μm对比90μm)并且更均匀(24-44μm对比44-165μm)，导致改善的解析度。
高效HIC树脂/基质通常具有比标准HIC树脂/基质或甚至如本文定义的“快速流动”树脂/基质更均匀的平均颗粒大小并且将采用更小的颗粒。具体而言，高效HIC树脂/基质将具有比标准HIC树脂/基质或甚至如本文定义的“快速流动”树脂/基质更狭窄的更小颗粒大小的范围。
因此，本发明提供高效HIC树脂/基质的用途。通常，高效HIC树脂/基质具有小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm、小于30μm或更小的平均颗粒直径。在一个优选实施方案中，高效HIC树脂/基质具有小于40μm、更优选小于35μm(例如34μm)的平均颗粒直径。
通常，高效HIC树脂/基质的平均颗粒分布将是从约10至约60μm、从约10至约50μm、从约20至约50μm、从约20至约44μm。在一个优选实施方案中，高效树脂/基质的平均颗粒分布是从约22至约44μm。
通常，将活化的双链BoNT/A蛋白与Lys-C分离的疏水性纯化降低Lys-C的浓度至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、或至少50倍。在一个优选实施方案中，将活化的双链BoNT/A蛋白与Lys-C分离的疏水性纯化降低Lys-C的浓度至少10倍。
也可以就包含活化的双链BoNT/A和Lys-C的起始溶液中所含的Lys-C在疏水性纯化步骤后保留的百分数方面，对疏水性纯化分离活化的双链BoNT/A与Lys-C的能力定量。通常，在疏水性纯化步骤后，少于80％、70％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％或更少(包括0％)的Lys-C留在BoNT/A双链产物中。优选地，在疏水性纯化步骤后，少于50％、更优选地少于25％、甚至更优选地少于10％的Lys-C留在BoNT/A双链产物中。
在一个相关方面，本发明提供通过(如上文所述的)产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法可获得的活性双链BoNT/A蛋白。
在一个方面，本发明提供一种包含(如上文所述的)活性双链BoNT/A蛋白的组合物，其中所述组合物基本上不含Lys-C。
因此，该组合物有利地基本上不含Lys-C蛋白酶(用来通过将单链多肽转化成活性双链形式令其活化)，因此防止不想要的BoNT/A蛋白非特异性切割。
在(如上文所述的)组合物基本上不含Lys-C时，组合物通常含有少于400皮克(pg)Lys-C每100ng BoNT/A蛋白；例如，少于400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、5、4、3、2、1pg或更少的Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。在一个实施方案中，(如上文所述的)组合物含有少于400pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于350pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于300pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于250pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于150pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于40pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于30pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于15pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于14pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、少于13pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于12pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于11pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于9pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于8pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于7pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、少于6pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于5pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白或更小。在一个优选实施方案中，(如上文所述的)组合物含有少于100pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白或少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于15pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。
用于确定Lys-C在组合物中浓度的方法是本领域已知的。以举例方式，Lys-C在本发明组合物中的浓度可以使用如本文所述的夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)或比色测定确定。
药物组合物和治疗适应证
本发明还涉及通过用于产生BoNT/A双链的本发明方法可获得的组合物。在一个方面，所述组合物包含加工的(双链)和未加工的(单链)BoNT/A的混合物，其中所述混合物可以含有少于5％、4％、3％、2％或少于1％未加工的(单链)BoNT/A。在所述组合物的一个方面，对BoNT/A的提及涵盖如本文定义的其衍生物。组合物可以例如是液态或固态组合物并且可以含有一种或多种载体、佐剂和/或赋形剂。
在另一个方面，本发明还涉及一种用于制造药物(即药物组合物)的方法，所述方法包括前述方法的步骤和将纯化的双链BoNT/A配制为药物的其他步骤。通常，所述组合物包含加工的(双链)和未加工的(单链)BoNT/A的混合物，其中所述混合物含有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或更少的未加工(单链)BoNT/A。在一个优选实施方案中，混合物含有少于5％的未加工(单链)BoNT/A，如少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的未加工(单链)BoNT/A.
本发明还涉及本文公开的化合物和组合物的多种医学和美学(化妆)用途。因此，本发明涉及用作药物或用于药物组合物中的活性BoNT/A双链或包含本发明活性BoNT/A双链的组合物。本发明还涉及活性BoNT/A双链或包含本发明活性BoNT/A双链的组合物在制造药物中的用途。本发明也涉及用于通过疗法治疗人类或动物身体的方法中的活性BoNT/A双链或包含本发明活性BoNT/A双链的组合物。本发明还涉及一种治疗方法，所述方法包括向有需要的患者施用活性BoNT/A双链或包含本发明的活性BoNT/A双链的组合物。
如本文所用，术语“组合物”指以固体、液体、气溶胶(或气体)形式等配制的任何组合物。所述组合物包含例如本发明的治疗活性化合物，任选地连同合适的辅助化合物如稀释剂或载体或其他成分。在一个方面，治疗活性化合物是本发明的活性BonT/A双链。本发明的组合物、尤其药物组合物通常基本上不含如本文定义的Lys-C。
因此，本发明提供固体或液态药物组合物，所述组合物包含：
(a)如上文所述的活性双链BoNT/A蛋白，和
(b)稳定剂。
在一个实施方案中，(如上文所述的)组合物基本上不含Lys-C。例如，(如上文所述的)组合物可以含有少于400pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于300pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于15pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。
可以用于本发明组合物中的稳定剂包括蛋白质稳定剂，如白蛋白、尤其人血清白蛋白(HSA)，和非蛋白质稳定剂。
可以用于本发明组合物中的非蛋白质稳定剂包括表面活性剂、尤其非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的例子包括聚山梨醇酯如聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80，和嵌段共聚物如泊洛沙姆(即聚乙烯和丙二醇的共聚物)。
在一个具体实施方案中，组合物不包含蛋白质作为稳定剂。
根据本发明的一个具体实施方案，药物组合物是液态药物组合物，其包含：
(a)如上文所述的活性双链BoNT/A蛋白；
(b)是表面活性剂的非蛋白质稳定剂；和
(c)水；
其中所述液态药物组合物不包含蛋白质稳定剂；并且
其中所述液态药物组合物基本上不含Lys-C，其中“基本上不含Lys-C”是如本文定义(例如，所述液态药物组合物含有少于400pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于300pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于15pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白)。
在一个实施方案中，活性双链BoNT/A蛋白以1-1000ng/ml或更大的浓度存在于(如上文所述的)组合物中。因此，活性双链BoNT/A蛋白可以约1-500ng/mL，例如约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL或更大的浓度存在于(如上文所述的)组合物中。在一个优选实施方案中，活性双链BoNT/A蛋白以约100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL或700ng/mL的浓度存在。
在一个实施方案中，表面活性剂(如上文所述的)是聚山梨醇酯，如具有范围从20个至100个单体单元的平均聚合度的聚山梨醇酯，并且可以例如是聚山梨醇酯-80。在一个优选实施方案中，聚山梨醇酯是植物来源的。在聚山梨醇酯-80情况下，表面活性剂的浓度优选地低于1％v/v，例如约0.005％v/v至0.02％v/v。
本发明的药物组合物还可以包含结晶剂。
结晶剂意指尤其维持冻干肉毒神经毒素复合物(A、B、C1、D、E、F或G型)或高纯度肉毒神经毒素(A、B、C1、D、E、F或G型)的力学牢固饼结构的物质。在固态制剂中包含时，结晶剂还具有蓬松作用。结晶剂尤其包括氯化钠。结晶剂的浓度可以例如是从0.1至0.5M，优选地从0.1至0.4M，尤其约0.15至0.3M。
本发明的药物组合物还可以包含缓冲剂以维持pH在5.5和7.5之间或6.0和7.0之间所包含的水平。缓冲剂可以是能够维持足够pH的任何缓冲剂例如，本发明组合物的缓冲剂可以选自琥珀酸盐、磷酸氢二钠/柠檬酸和氨基酸如组氨酸。缓冲剂的浓度可以例如是1至50mM、优选地5至20mM、优选地约10mM。
本发明的药物组合物还可以包含二糖。
本发明组合物中使用的二糖可以选自蔗糖、海藻糖、甘露醇和乳糖。在一个具体实施方案中，二糖是蔗糖。二糖的浓度可以例如是5至50mM、优选地5至25mM、更优选地10至20mM以及最优选地约11.7mM。
在一个具体实施方案中，药物组合物是液态药物组合物，所述液态药物组合物包含：
(a)如上文所述的活性双链BoNT/A蛋白；
(b)是表面活性剂的非蛋白质稳定剂；
(c)氯化钠，
(d)维持pH在5.5和7.5之间的缓冲剂
(e)二糖，和
(f)无菌水。
其中所述液态药物组合物不包含蛋白质稳定剂；并且
其中所述液态药物组合物基本上不含Lys-C，其中“基本上不含Lys-C”是如本文定义(例如，所述液态药物组合物含有少于400pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于300pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、少于15pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白)。
根据一个具体实施方案，液态形式的本发明药物组合物密封在小瓶中或即用型装置(如注射器)中，无液/气界面，并且在23℃至27℃稳定至少3个月或至少6个月以及在2-8℃稳定至少12个月。实施例中描述了本发明的示例性药物组合物。
本发明的药物组合物或制剂的每月降解率可以在12周范围内每月低于5％，这意指组合物或制剂的双链BoNT蛋白酶功能在25℃保持稳定至少12周。
本发明的药物组合物可以按冻干、真空干燥形式在真空压力下或作为稳定液体贮存在容器中。在冻干之前，活性双链BoNT/A蛋白可以与可药用赋形剂、稳定剂和/或载体如白蛋白组合。冻干的材料可以用盐水或水重构以产生含有活性双链BoNT/A蛋白的溶液或组合物以施用至患者。
在本文背景下，对于本发明，在辅助化合物(即当施加组合物用于其所需目的时并不有助于本发明化合物激发的作用的化合物)和其他成分(即有助于本发明化合物的又一种作用或调节其作用的化合物)之间可区分。合适的稀释剂和/或载体取决于组合物待使用的目的和其它成分。本领域技术人员可以在不另外费力的情况下确定这类合适的稀释剂和/或载体。
载体必须在兼容于制剂的其他成分的意义上是可接受的并且对其接受者无害。所用的药用载体可以包括固体、凝胶或液体。固体载体的示例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿位伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液态载体的示例是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油、水、乳液、多种类型的润湿剂等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域熟知的延时材料，如单独或连同蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上文提到的那些和本领域熟知的其他，参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。
稀释剂如此选择，从而不影响组合的生物学活性。这类稀释剂的例子是蒸馏水、生理盐水、林格液、右旋糖溶液和Hank溶液，额外地，药物组合物或制剂还可以包含其他载体、佐剂或无毒、无治疗性、无免疫原性稳定剂等。
在一个方面，如本文所用的药物组合物包含通过本发明方法获得的生物活性神经毒素(即活性BoNT/A双链)，任选地，一种或多种可药用载体。活性神经毒素可以在液体中或以冻干形式存在。在一个方面，所述化合物可以与甘油，蛋白质稳定剂(例如，人血清白蛋白(HSA))或非蛋白质稳定剂如聚乙烯吡咯烷酮或透明质酸一起存在。在一个方面，局部地施用药物组合物。常规使用的药物施用法是借助肌内或皮下(一般靠近皮脂腺)施用。但是，取决于化合物的性质和作用模式，药物组合物也可以通过其他途径施用。双链神经毒素多肽是组合物的有效成分，并且在一个方面在通过将药物根据常规程序与标准药用载体合并而制备的常规剂型中施用。这些程序可以涉及混合、造粒和压制或(如果适宜)溶解这些成分至所需的制品。将可以理解，可药用载体或稀释剂的形式和特征由与它待合并的有效成分的量、施用途径和其他熟知变量决定。
治疗有效剂量指本发明药物组合物中待使用的化合物(神经毒素)的量，所述量预防、改善或治疗本说明书中提到的疾病或病状的症状。可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法确定化合物的治疗功效和毒性，例如，ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数并且它可以表述为LD50/ED50比。
剂量方案将由主治医生和其他临床因素决定。如医学领域中熟知，针对任一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体格大小、身体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和正在共同施用的其他药物。可以通过定期评定监测进展。施用本文中提及的药物组合物和制剂至少一次，以治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病状。但是，可以施用所述药物组合物多于一次。
如本文所述，本发明的活性双链BoNT/A蛋白及其组合物和液态药物组合物可以用于疗法中。合适的疗法可以包括美容治疗和医学治疗方法。
在本发明的又一个方面，前述的组合物是药物或化妆品组合物。在一个方面，包含生物活性神经毒素(即活性BoNT/A双链)的所述药物可以用于预防和/或治疗以下疾病和病症中的至少一种：随意肌力量、局灶性肌张力障碍，包括颈部、颅部肌张力障碍、和良性特发性睑痉挛、半侧面肌痉挛和局灶性强直、肠胃病、多汗症和美容性去皱，在又一个方面中还用于睑痉挛、口下颌肌张力障碍、开颌型、闭颌型、磨牙症、Meige综合征、舌肌张力障碍、眼睑失用症、开型颈肌张力障碍、颈项前屈、颈后倾、颈侧倾(laterocollis)、斜颈、咽肌张力障碍、喉肌张力障碍、痉挛性发声困难/内收肌型、痉挛性发声困难/外展肌型、痉挛性呼吸困难、肢体肌张力障碍、臂肌张力障碍、任务特异性肌张力障碍、书写痉挛、音乐家痉挛、高尔夫球者痉挛、腿肌张力障碍、大腿内收、大腿外展膝部屈曲、膝部伸展、踝部屈曲、踝部伸展、马蹄内翻足、畸形足肌张力障碍、纹状趾、趾屈曲、趾伸展、轴性肌张力障碍、比萨综合征、肚皮舞肌张力障碍、节段性肌张力障碍、偏侧肌张力障碍、泛发性肌张力障碍、Lubag肌张力障碍、皮质基底节变性中的肌张力障碍、Lubag肌张力障碍、迟发性肌张力障碍、脊髓小脑性共济失调中的肌张力障碍、帕金森病中的肌张力障碍、亨廷顿病中的肌张力障碍、Hallervorden Spatz病中的肌张力障碍、多巴所致运动失调/多巴所致肌张力障碍、迟发性运动障碍/迟发性肌张力障碍、阵发性运动失调/肌张力障碍、运动源性、非运动源性动作诱导的腭肌阵挛、肌阵挛性肌颤搐、僵直、良性肌肉痉挛、遗传性下颚颤抖、反常颌肌活动、半侧咀嚼肌痉挛、肥大性鳃肌病、咬肌肥大、胫骨前肌肥大、眼球震颤、核上性振动幻视凝视麻痹、持续性部分癫痫、计划痉挛性斜颈手术、外展肌声带麻痹、顽固性突变病理性心境恶劣、上食管括约肌功能障碍、声带肉芽肿、口吃Gilles de Ia Tourette综合征、中耳肌阵挛、保护性的喉闭合、喉切除术后、言语失误、保护性上睑下垂、睑内翻Oddi功能障碍、假性贲门失弛缓症、非贲门失弛缓症、食管运动障碍、阴道痉挛、术后固定颤栗、膀胱功能障碍、逼尿肌括约肌协同失调、膀胱括约肌痉挛、半侧面肌痉挛、复神经化运动失调、使用化妆品所致的鱼尾纹、皱眉面部不对称、颏肌窝、僵人综合征、破伤风前列腺增生、肥胖症、治疗小儿脑性瘫痪混合麻痹性共同性斜视、视网膜脱离手术后、白内障手术后、无晶状体肌炎性斜视、肌病性斜视、分离性垂直斜视，作为斜视手术的辅助、内斜视、外斜视、贲门失弛缓症、肛裂、外分泌腺亢进、Frey综合征、鳄鱼泪综合征、腋下手掌、足底多汗、鼻漏、在卒中、在帕金森病中、肌萎缩侧索硬化痉挛病、脑炎和脊髓炎自身免疫过程、多发性硬化、横贯性脊髓炎、Devic综合征、病毒性感染、细菌性感染、寄生虫感染、真菌性感染中、在遗传性痉挛性轻截瘫、卒中后综合征、半球梗死、脑干梗死、脊髓梗死、偏头痛中、在中枢神经系统创伤、半球损害、脑干损害、脊髓损害中、在中枢神经系统出血、脑内出血、蛛网膜下出血、硬膜下出血、椎管内出血中、在瘤形成、半球肿瘤、脑干肿瘤、脊髓肿瘤、鼻鼾中的相对多涎(WO 000/033863)。对于细节和症状，参见，例如Jost 2007,Drugs 67(5),669或者Dressler 2000引自Botulinum Toxin Therapy,Thieme Verlag,Stuttgart,New York。
在本发明的另一个方面，组合物是可以如对以上药物组合物描述那样配制的化妆品组合物。对于化妆品组合物，同样地，构思在一个方面，本发明的化合物以基本上纯的形式使用。在又一个方面中，化妆品组合物待肌内施加。在本发明的甚至又一个方面，可以将包含神经毒素的化妆品组合物配制为抗皱纹溶液。
将本说明书中援引的全部参考文献在此就其完整公开内容和本说明书中具体提到的公开内容而言均通过引用的方式并入。
SEQ ID NO的要点
SEQ ID NO:1ATCC3502的BoNT/A，Genbank登录号“AAA23262”
SEQ ID NO:2：BoNT/A1的活化环
SEQ ID NO:3：BoNT/A2/A6的活化环
SEQ ID NO:4：BoNT/A3的活化环
SEQ ID NO:5：BoNT/A3的活化环
SEQ ID NO:6：BoNT/A4的活化环
SEQ ID NO:7：BoNT/A5的活化环
SEQ ID NO:8：衍生自肉毒梭菌菌株ATCC3502的蛋白水解活性多肽，GenBank登录号：“CAL82988.1”，缺少248个N端氨基酸残基
SEQ ID NO:9：衍生自肉毒梭菌菌株ATCC3502的非蛋白水解活性多肽，GenBank登录号：“CAL82988.1”
SEQ ID NO:10：编码SEQ ID NO:8的核酸序列
SEQ ID NO:11：编码SEQ ID NO:9的核酸序列
SEQ ID NO:12：“Streptag”氨基酸序列
SEQ ID NO:13：BoNT/A7的活化环
SEQ ID NO:14：BoNT/A8的活化环
SEQ ID NO:15：单链、重组、阳离子肉毒神经毒素亚血清型A1衍生物(mrBoNT/A1)的氨基酸序列
插图目录
图1:来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的苯基高效(PhHP)柱的洗脱图(A280-点线)。
图2:来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的苯基快速流动高置换(PhFF-Hi)柱的洗脱图(A280-点线)。
图3：来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的丁基高效(BuHP)柱的洗脱图(A280-点线)。
图4：来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的磺丙基高效(SPHP)柱的洗脱图(A280-点线)。
图5：来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的磺丙基快速流动(SPFF)柱的洗脱图(A280-点线)。
图6：来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的羧甲基快速流动(CMFF)柱的洗脱图(A280-点线)。
图7：来自在其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的季胺高效(QHP)柱的洗脱图(A280-点线)。
图8：来自其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的季胺快速流动(QFF)柱的洗脱图(A280-点线)。
图9：来自其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的二乙基氨基丙基(DEAP，“ANX”)柱的洗脱图(A280-点线)。
图10:来自其上评定Lys-C(A405-条状图)与BoNT/A分离的二乙基氨乙基(DEAE)柱的洗脱图(A280-点线)。
图11:通过苯基HP HIC从rBoNT/A1移除Lys-C。通过SDS-PAGE分析取自PhHP HIC整饰步骤的级分(顶部)。重组BoNT/A1具有约149千道尔顿(kDa)的分子量并且分子量标记(基准)以kDa标记。还在比色Lys-C测定中检验相同级分的样品(底部)，其中底物的切割释放出黄色发色团(在黑色框中)。
图12：通过苯基HP HIC从rBoNT/A2(0)移除Lys-C。通过SDS-PAGE分析取自苯基HPHIC整饰步骤的级分(顶部)。重组BoNT/A1具有约149kDa的分子量并且分子量标记(基准)以kDa标记。还在比色Lys-C测定中检验相同级分的样品(底部)，其中底物的切割释放出黄色发色团(在黑色框中)。
图13：通过苯基HP HIC从rBoNT/A5(0)移除Lys-C。通过SDS-PAGE分析取自苯基HPHIC整饰步骤的级分(顶部)。重组BoNT/A5(0)具有约149kDa的分子量并且分子量标记(基准)以kDa标记。还在比色Lys-C测定中检验相同级分的样品(底部)，其中底物的切割释放出黄色发色团(在黑色框中)。
图14：通过苯基HP HIC从rBoNT/A6(0)移除Lys-C。通过SDS-PAGE分析取自苯基HPHIC整饰步骤的级分(顶部)。重组BoNT/A6(0)具有约149kDa的分子量并且分子量标记(基准)以kDa标记。还在比色Lys-C测定中检验相同级分的样品(底部)，其中底物的切割释放出黄色发色团(在黑色框中)。
图15：通过丁基HP HIC从mrBoNT/A1移除Lys-C。通过SDS-PAGE分析取自丁基HPHIC整饰步骤的级分(顶部)。重组mrBoNT/A1具有约149kDa的分子量并且分子量标记(基准)以kDa标记。还在比色Lys-C测定中检验相同级分的样品(底部)，其中底物的切割释放出黄色发色团(在黑色框中)。
实施例
实施例1-宿主的培养和可溶性rBoNT/A蛋白的表达
将BLR(DE3)细胞中转化的BoNT/A单菌落用来接种含有100mL补充有0.2％葡萄糖胺和30μg/mL卡那霉素的改良Terrific培养液(mTB)的250mL锥形瓶。当使用Microbank珠或甘油储液(10-100μL)接种烧瓶时，这种方法将同等地适用
将烧瓶在37℃伴以250转/分钟振摇下温育16小时。10mL这种起子培养物用来接种2L锥形瓶，所述锥形瓶各自含有1L补充有0.2％葡萄糖胺和30μg/mL卡那霉素的改良Terrific培养液。将细胞在37℃按225转/分钟培育2小时直至达到OD600 0.5。在此时，降低培养温度至16℃。在1小时后，通过添加1mM IPTG诱导细胞表达BoNT/A20小时。将细胞通过在4℃离心20分钟收获，称重并且随后贮存在-20℃。
实施例2-从宿主提取BoNT/A蛋白并分析表达水平
将rBoNT/A的表达细胞糊在室温解冻并通过在每克细胞3mL补充有10μL核酸酶的Tris-NaCl重悬缓冲液中抽吸进行重悬。通过在100W–10x 30秒开启+45秒关闭超声处理，裂解细胞。将裂解物在4℃以4000x g离心1小时以在上清液中获得可溶性rBoNT/A。
确定制备的裂解物的总蛋白浓度的Bradford测定
将稀释的rBoNT/A裂解物或BSA标准物的样品(50μL)添加至1mL一次性比色皿。添加450μL考马斯Bradford测定试剂至每个比色皿并且允许在室温温育10分钟，之后读取A600。对BSA标准物获得的值用来确定裂解物样品中蛋白质的量。
半定量蛋白质印迹分析
从Metabiologics购买的BoNT/A蛋白商业样品用来构成SDS-PAGE标准物。随后制备来自表达的细胞培养物中的裂解物样品的SDS-PAGE样品至已知的总蛋白浓度。将这些样品加载于聚丙烯酰胺凝胶上并且在200V运行50分钟。将蛋白质条带在0.4mA电印迹到无甲醇的印迹缓冲液中的硝酸纤维素膜上1小时。将膜用PBS-0.1％Tween20中的0.5％BSA封闭1小时并且随后用针对BoNT/A的抗体探测1小时。印迹物进一步用HRP缀合的第二抗体探测，用SuperSignal DuraWest底物显色并且使用Syngene成像仪成像。
实施例3-由Lys-C活化肉毒神经毒素A(BoNT/A)
由Lys-C(按1:500至1:2500酶:底物比率)在37℃或4℃经2-20小时时间，蛋白水解活化溶解于缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中的单链重组BoNT/A1(0.5mg/mL)，之后用0.4μM特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)抑制反应。这产生BoNT/A1的成熟双链形式，其中重链通过单个二硫键与轻链连接(数据未显示)。
通过N端测序和质谱法确定切割位点与内源蛋白相同，证实Lys-C是所选择的活化酶(数据未显示)。
内切蛋白酶Lys-C切割试验显示，Lys-C在很低的浓度切割rBoNT/A1(rBoNT/A1)并且经历数天时间仍保持活性(数据未显示)。
实施例4-纯化不含活化性蛋白酶的靶BoNT/A蛋白
使用BoNT/A一级蛋白质序列，研究BoNT/A和Lys-C的特性(参见表2)。预测的特性提示，Lys-C和BoNT/A均具有相似的平均疏水性(GRAVY值)，但是在pH 4.5和pH 8时电荷差异巨大(参见表2)。
表2：Lys-C和BoNT/A的预测特性
(*GRAVY＝分子的平均疏水性/残基(正值表示疏水性分子))
单独基于这种信息，预测离子交换(IEX)色谱将从BoNT/A解析Lys-C。因此，研究了多种色谱纯化手段，包括IEX色谱(参见下文)。
实施例5-筛选蛋白质快速液相色谱(FPLC)柱以从BoNT/A分离Lys-C FPLC纯化
用Lys-C活化BoNT/A1后，对多个FPLC柱测试对Lys-C的处理和移除：
·三种疏水相互作用色谱(HIC)柱：用Tris pH 8测试苯基高效(PhHP)柱、苯基快速流动高置换(PhFF-Hi)柱和丁基HP(BuHP)柱；
·三种阳离子交换色谱(CEC)柱：用pH4.5乙酸钠测试磺丙基高效(SPHP)柱、磺丙基快速流动(SPFF)柱和羧甲基快速流动(CMFF)柱；并且
·四种阴离子交换色谱(AEC)柱：用Tris pH 8测试季胺高效(QHP)柱、季胺快速流动(QFF)柱、二乙基氨基丙基(DEAP，“ANX”)柱和二乙基氨乙基(DEAE))柱。
一旦样品加载于柱上，则用缓冲液透彻洗涤柱以移除任何非特异性结合的分子，之后施加渐增或渐减的盐浓度的线性洗脱梯度(分别是HIC和CEC/AEC)。
反应条件和纯化运行在不同的柱类型之间变动(参见下表3)。
表3：针对Lys-C解析所测试的全部柱的筛选条件
图1至图10显示来自多种色谱柱的BoNT/A1蛋白的洗脱图(A280)(点线)。用于不同柱的不同反应条件和纯化运行解释了所用的不同规模。
用比色测定分析洗脱梯度期间收集的级分以评估Lys-C活性。
Lys-C活性的比色测定
这种测定涉及切割无色底物以产生可以提供吸收405nm光(A405)以光度测定方式检出的黄色发色团。因此，这种测定提供简单方法以确定Lys-C是否存在于每个级分中。
使用所述比色Lys-C活性测定分析每个洗脱级分并测量A405nm。
每个洗脱级分中Lys-C的量(以A405测量)显示为图1至图10中的条状图。
结果
通过比较A405数据和A280数据(在图1至图10的曲线中)，可以推断哪个柱提供Lys-C与BoNT/A的最佳解析。
所用三种HIC柱的不同烷基/芳基(Bu和Ph)提供了多种蛋白质可以通过疏水效应与之相互作用的不同配体。这种相互作用进一步受这些疏水基团的密度(取代度(Hi/Lo)和珠大小(FF/HP))影响。对于CEC柱，调节样品的pH至靶蛋白质pI的pH以下，从而它实现总体净正电荷并且因此能够与柱结合。每种类型柱上存在的不同配体提供不同电荷密度，并且与不同蛋白质的相互作用也受配体密度影响。这些变量类似地适用于其中不同化学基团显示不同电荷密度的AEC柱。在这个情形中，调节样品的pH至靶蛋白质pI的pH以上，从而它实现总体净负电荷。
表4中定性总结来自图1至图10的曲线数据。
表4：定性Lys-C/BoNT解析数据的总结
*Lys-C相对于rBoNT/A1的表观解析。√√√＝良好，√√＝尚可，√＝低劣
a苯基高效(PhHP)柱、苯基快速流动高置换(PhFF-Hi)柱、丁基HP(BuHP)柱
b磺丙基高效(SPHP)柱、磺丙基快速流动(SPFF)柱、羧甲基快速流动(CMFF)柱、季胺高效(QHP)柱、季胺快速流动(QFF)柱、二乙基氨基丙基(DEAP，“ANX”)柱和二乙基氨乙基(DEAE)柱
从每种柱类型洗脱后的Lys-C回收和纯化的百分数
每个级分中的总Lys-C信号对来自色谱步骤最后5个级分的平均A405值归一化。从这里，计算蛋白质峰级分中存在的Lys-C的百分数，以基于洗脱级分显示Lys-C与蛋白质的分离程度(表5，蛋白质峰级分中的LysC％(归一化))。
就靶蛋白而言，假定全部BoNT/A分子均在主峰下洗脱(即，100％回收)；因此，纯化程度可以表述为在主峰中未回收的所加载的总蛋白的百分数(表5，纯化％)。
Lys-C与BoNT/A的良好分离将是在其中我们看到蛋白质峰级分中LysC百分数的低数值的那种分离。从这里，似乎CEC不能够解析Lys-C与BoNT/A1。高效AEC柱，QHP，显示一些解析Lys-C与BoNT/A1的能力。然而，它比这两种高效HIC柱的效率显著更低。因此，结果显示，同类比较(即标准性能对标准性能和高效对高效)，与CEC柱或AEC柱相比，HIC柱显示Lys-C与BoNT/A1的解析改善。
两个最有前景的候选柱涉及HIC–PhHP和BuHP。有趣地，这两种柱均使用高效珠。
高效介质和其他介质之间的主要差异是平均颗粒大小更小(34μm对比90μm)并且更均匀(24-44μm对比44-165μm)。这与使用较小尺寸珠(平均尺寸在3-30μm之间)的分析柱时报告的改善的性能一致(GE Healthcare手册11-0004-21与11-0012-69和数据文件18-1172-87AE和18-1172-88AD)。
表5：柱性能的总结
选择PhHP HIC作为从BoNT/A移出Lys-C的最终润色步骤(参见下文实施例6)。
实施例6-重组肉毒神经毒素亚血清型A1(rBoNT/A1)的活化和最终纯化
使用高效丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(丁基HP HIC)用于捕获，随后是中间纯化步骤采用高效季铵琼脂糖凝胶阴离子交换色谱(Q HP AEC)，通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化单链rBoNT/A1。将这种分子随后在37℃与0.4μg/mL Lys-C温育2小时以产生活性双链。
使用高效苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(PhHP HIC)，从活化的rBoNT/A1解析Lys-C。这涉及在装载到PhHP柱上前，用高盐TRIS缓冲液调节反应混合物，随后进行高盐洗涤及后续用线性梯度至低盐TRIS缓冲液洗脱蛋白质。通过变性凝胶电泳(SDS PAGE–图11顶部)和Lys-C活性比色测定(图11底部)分析洗脱级分。显示Lys-C先于活化的BoNT分子(F21-F29)在梯度中早期洗脱(F16-F21，以黑色框突出显示)。因此，这显示Lys-C从rBoNT/A1的良好分离。级分的最大强度似乎相似于30ng/m LLys-C，从而显示rBoNT/A1级分中存在的任何残余Lys-C将小于这个浓度。
实施例7-重组内肽酶阴性肉毒神经毒素亚血清型A2(rBoNT/A2(0))的活化和最终纯化
使用高效丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(丁基HP HIC)用于捕获，随后是中间纯化步骤采用高效季铵琼脂糖凝胶阴离子交换色谱(Q HP AEC)，通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化单链rBoNT/A2(0)。将这种分子随后在37℃与4μg/mL Lys-C温育2小时以产生活性双链。
使用高效苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(PhHP HIC)，从活化的rBoNT/A2(0)解析Lys-C。这涉及在装载到苯基HP柱上前，用高盐TRIS缓冲液调节反应混合物，随后进行高盐洗涤及后续用线性梯度至低盐TRIS缓冲液洗脱蛋白质。通过变性凝胶电泳(SDS PAGE)和Lys-C活性比色测定(图12)分析洗脱级分-这显示Lys-C就在活化的BoNT分子(F12-F15)之前在梯度中早期洗脱(F5-F11)。因此，该柱显示Lys-C从rBoNT/A2(0)良好分离。
实施例8-重组内肽酶阴性肉毒神经毒素亚血清型A5(rBoNT/A5(0))的活化和最终纯化
使用高效丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(丁基HP HIC)用于捕获，随后是中间纯化步骤采用高效季铵琼脂糖凝胶阴离子交换色谱(Q HP AEC)，通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化单链rBoNT/A5(0)。将这种分子随后在37℃与2.5μg/mL Lys-C温育2小时以产生活性双链。使用高效苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(苯基HP HIC)，从活化的rBoNT/A5(0)解析Lys-C。这涉及在装载到苯基HP柱上前，用高盐TRIS缓冲液调节反应混合物，随后进行高盐洗涤及后续用线性梯度至低盐TRIS缓冲液洗脱蛋白质。通过变性凝胶电泳(SDSPAGE)和Lys-C活性比色测定(图13)分析洗脱级分-这显示Lys-C先于活化的BoNT分子(F51-F65)在梯度中早期洗脱(F10-F39)。因此，该柱显示Lys-C从rBoNT/A5(0)良好分离。
实施例9-重组内肽酶阴性肉毒神经毒素亚血清型A6(rBoNT/A6(0))的活化和最终纯化
首先通过硫酸钠沉淀和再溶入乙酸钠缓冲液中，之后以使用高效磺丙基琼脂糖凝胶阳离子交换色谱(SP HP CEC)的快速蛋白质液相色谱(FPLC)捕获，随后交换缓冲液成pH8的TRIS缓冲液，纯化单链rBoNT/A6(0)。将这种分子随后在37℃与0.3μg/mL Lys-C温育2小时以产生活性双链。使用高效苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(苯基HP HIC)，从活化的rBoNT/A6(0)解析Lys-C。这涉及在装载到苯基HP柱上前，用高盐TRIS缓冲液调节反应混合物，随后进行高盐洗涤及后续用线性梯度至低盐TRIS缓冲液洗脱蛋白质。通过变性凝胶电泳(SDS PAGE)和Lys-C活性比色测定(图14)分析洗脱级分-这显示Lys-C先于活化的BoNT分子(F16-F27)在梯度中早期洗脱(F6-F13)。这显示Lys-C从rBoNT/A6(0)优异分离。
实施例10-单链、重组、阳离子性肉毒神经毒素亚血清型A1衍生物(mrBoNT/A1)的纯化
使用高效磺丙基琼脂糖凝胶阳离子交换色谱(SPHPCEX)用于捕获，通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化单链mrBoNT/A1(SEQ ID NO:15)。使用高效丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(BuHP HIC)的中间纯化步骤用来进一步除去宿主细胞蛋白。通过SDS-PAGE分析BuHP洗脱级分并且汇集含有单链mrBoNT/A1的那些级分作为纯化的单链mrBoNT/A1。
实施例11-重组、阳离子性肉毒神经毒素亚血清型A1衍生物(mrBoNT/A1)的活化和最终纯化
将单链mrBoNT/A1(SEQ ID NO:15)在37℃与0.4μg/mL Lys-C温育2小时以产生活性双链。使用高效丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用色谱(BuHP HIC)，从活化的mrBoNT/A1分离Lys-C。这涉及在装载到BuHP柱上前，用高盐Bis-Tris缓冲液调节反应混合物，随后进行高盐洗涤及后续用线性梯度至低盐Bis-Tris缓冲液洗脱蛋白质。通过SDS PAGE(图15顶部)和Lys-C活性比色测定(图15底部)分析洗脱级分。Lys-C先于活化的BoNT分子(F10-F12)在柱流通液中并在洗脱梯度中早期洗脱(F1-F6，以黑色框突出显示，图15底部)。因此，这显示Lys-C从mrBoNT/A1良好分离。
实施例12-基本上不含Lys-C的包含活性双链BoNT/A的制剂
制备了以下6种包含活性双链BoNT/A的液态组合物(表6)。
表6：示例性BoNT/A制剂
全部6种组合物均在25℃贮存12周。使用无细胞内肽酶测定在这段时间期间评估双链BoNT/A蛋白酶功能的稳定性。
实施例13-高灵敏度Lys-C活性测定
通过测量荧光肽底物的切割，定量确定纯化的BoNT/A样品中的最终Lys-C浓度。荧光底物(Tos-GPK-7-氨基-4-三氟乙酸盐，也称作Tos-GPK-AMC)于DMSO中重构以产生20mg/ml(32.7mM)储液。这种储液进一步用水稀释至10mM并且制备等分试样及贮存在-20℃。在测定当日，取得适宜量的底物并用25mM Tris pH 8，125mM NaCl进一步稀释以产生0.5mMLys-C工作液；随后通过在测定缓冲液(25mM Tris，125mM NaCl，0.1mg/ml BSA，pH 8)中稀释工作液制备Lys-C标准物(浓度已知)。将标准物、空白(仅测定缓冲液)和测试样品(纯化的rBoNT/A各批次)分配入黑色OptiPlate平板，一式三份(180μl/孔)，并且平衡至37℃持续10-15分钟。接下来，添加20μl底物并且将平板立即地转移至平板读数仪，在那里取得动力学读数。在37℃每20分钟持续5小时使用激发/发射滤光片-360/40和485/20读取平板。将数据作为按分钟计的时间(x轴)对吸光度/荧光(y轴)作图。每种Lys-C浓度的斜率值用来生成Lys-C浓度的标准曲线。纯化的rBoNT/A的样品以相同方式处理并且每个rBoNT/A样品中的Lys-C浓度从标准曲线内插而来。基于4个独立批次或rBoNT/A的分析，我们测得最终材料中的平均Lys-C浓度是7.3±1.5pg Lys-C每100ng/BoNT/A。

Claims (20)

1.用于产生可溶性双链BoNT/A蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供可溶性单链BoNT/A蛋白；
b)在溶液中使所述BoNT/A蛋白与内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)接触；并且
c)通过使含有可溶性BoNT/A蛋白和Lys-C的溶液与疏水表面接触，从Lys-C分离可溶性BoNT/A蛋白，其中可溶性BoNT/A蛋白偏好地与疏水表面结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)通过在表达系统中表达编码所述单链BoNT/A蛋白的核酸在宿主细胞中；或(ii)在体外表达系统中产生可溶性单链BoNT/A蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中宿主细胞是细菌宿主细胞并且表达系统是细菌表达系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其中细菌表达系统是大肠杆菌表达系统并且宿主细胞是大肠杆菌细胞。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述可溶性单链BoNT/A蛋白在所述宿主细胞的细胞质中表达。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述可溶性单链BoNT/A蛋白以至少5mg/L的水平表达。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，包括溶解细菌或大肠杆菌宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/A蛋白的细菌或大肠杆菌宿主细胞匀浆。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中疏水表面是附着有由芳基或烷基组成的配体的惰性基质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中配体选自丁基、苯基或辛基配体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用高性能疏水表面。
11.通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法可获得的活性双链BoNT/A蛋白。
12.组合物，包含根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白；其中所述组合物基本上不含内切蛋白酶Lys-C。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含少于5％的单链BoNT/A或少于2％的单链BoNT/A。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述组合物含有少于400pg内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)每100ng BoNT/A蛋白、或少于300pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于50pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于15pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。
15.液态药物组合物，包含：
根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白；
是表面活性剂的非蛋白质稳定剂；和
水；
其中所述液态药物组合物不包含蛋白质稳定剂；并且
其中所述液态药物组合物基本上不含内切蛋白酶Lys-C(Lys-C)。
16.根据权利要求15所述的液态药物组合物，其中所述液态药物组合物含有少于400pgLys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于300pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于200pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于100pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于50pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于20pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白、或少于15pg Lys-C每100ngBoNT/A蛋白、或少于10pg Lys-C每100ng BoNT/A蛋白。
17.根据权利要求15或16所述的液态药物组合物，其中所述液态药物组合物还包含：
氯化钠，
维持pH在5.5和7.5之间的缓冲剂，和
二糖；
其中水是无菌水。
18.根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白、或根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，或根据权利要求15至17中任一项所述的液态药物组合物，其用于治疗。
19.根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白、或根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，或根据权利要求15至17中任一项所述的液态药物组合物用于制造药物的用途。
20.治疗方法，包括向有需要的患者施用根据权利要求11所述的活性双链BoNT/A蛋白、或根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，或根据权利要求15至17中任一项所述的液态药物组合物。
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