CN110499321A

CN110499321A - 重组的肉毒梭菌神经毒素

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Publication number: CN110499321A
Application number: CN201910795176.3A
Authority: CN
Inventors: A·克辛斯; M·比尔得; P·马克斯
Original assignee: Yi Pusen Biology Pharmacy Co Ltd; Syntaxin Ltd
Current assignee: Yi Pusen Biology Pharmacy Co Ltd; Syntaxin Ltd; Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2019-11-26
Also published as: AU2013340610B2; TWI673361B; ES2662402T3; HUE036764T2; EP3326644B1; US10030238B2; TW202012622A; PL2914282T3; EA201590794A1; EP2914282B1; HUE048802T2; ZA201501449B; EA201590794A8; DK3326644T3; MX2015005156A; KR20150094590A; AU2013340610A1; EP3673914A1; WO2014068317A1; EP2914282A1

Abstract

重组的肉毒梭菌神经毒素。本发明提供了一种包含连续核苷酸的序列的核酸序列，所述连续核苷酸的序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性，且所述连续核苷酸的序列编码单链BoNT/E1蛋白。本发明还提供了用于在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性单链BoNT/E1蛋白的方法，以及用于生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法。

Description

重组的肉毒梭菌神经毒素

本专利申请要求2012年10月31日提交的GB 1219602.8的优先权，其通过引用全文纳入本文。

本发明涉及编码血清型E的肉毒梭菌(Clostridium botulinum(C.botulinum))神经毒素(BoNT/E)的核酸序列，以及用于生产重组BoNT/E的方法。本发明还涉及重组BoNT/E的相应医疗应用。

肉毒菌神经毒素由肉毒梭状芽孢杆菌以大蛋白复合体的形式生成，由与多种辅助蛋白复合的BoNT本身组成。目前存在七种不同类型的肉毒菌神经毒素，即：肉毒菌神经毒素血清型A、B、C₁、D、E、F和G，其都共有类似的结构和作用模式。可基于通过特异性中和抗血清的灭活来区分不同的BoNT血清型，这类通过血清型的分类与氨基酸水平的序列相同性百分比相关。基于氨基酸序列相同性百分比，给定血清型的BoNT蛋白还可进一步分为不同的亚型。

BoNT是已知最强力的毒素，对小鼠的半数致死量(LD50)范围为0.5-5ng/kg(取决于血清型)。BoNT在胃肠道内吸收并在进入全身循环后结合胆碱能神经末梢的突触前膜并避免其神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割突触小泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)；且BoNT/C切割突触融合蛋白。

天然情况下，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，所述单链多肽通过蛋白酶水解切割进行翻译后修饰以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点(通常称作激活位点)，其位于提高链间二硫键的半胱氨酸残基之间。该双链形式即毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链，其分子量为约100kDa)和轻链(L链，其分子量为约50kDa)。H链包含C末端靶向组分(H_C结构域)和N末端易位组分(H_N结构域)。该切割位点位于L链和易位组分之间。在H_C结构域结合其目标神经元并通过内体将结合的毒素内化至细胞中后，H_N结构域将L链跨内体膜易位至细胞溶质中，且L链提供了蛋白酶功能(也称作非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割的胞内转运蛋白(称作SNARE蛋白，例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)发挥作用，参见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology(《细胞和分子生物学》)”(第4版)，约翰威力和桑斯公司(John Wiley&Sons Inc.)。缩写SNARE来源于术语可溶性NSF连接受体，其中NSF指N-乙基马来酰亚胺敏感型因子。SNARE蛋白是胞内囊泡融合所不可或缺的，且因此是分子经由囊泡转运分泌出细胞所不可或缺的。蛋白酶功能是锌依赖的内肽酶活性且表现出针对SNARE蛋白的高底物特异性。因此，一旦递送至所需靶细胞，该非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自该靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

已知肉毒菌神经毒素能够导致松弛性肌肉麻痹。所述肌肉松弛特性导致肉毒菌神经毒素(如BoNT/A)被用于多种医疗和美容过程，包括治疗眉间皱纹或运动亢进的面部皱纹(hyperkinetic facial line)、头痛、偏侧面肌痉挛、膀胱功能亢进、多汗、鼻唇皱纹(nasallabial line)、宫颈肌张力障碍、睑痉挛和痉挛。

通常，BoNT的生产是通过培养肉毒梭菌并随后分类和纯化梭菌神经毒素复合体来进行的。然而，以该方式生产BoNT是低效的且蛋白产量低。此外，肉毒梭菌是产芽孢细菌并因此需要专业的培养设备和装置，这些设备和装置是细菌(如大肠杆菌)培养中不需要的。因此，增多的BoNT应用导致需要替代性和/或改善的生产和纯化BoNT的方法。

US 20080103098描述了一种生产双链形式重组BoNT蛋白的方法，该方法包括在大肠杆菌宿主细胞中表达重组核酸构建体。然而，所述方法需要在神经毒素的环结构域中插入特异性、非天然的(即非梭菌的)五肽序列。插入的五肽序列形成激活切割位)在细胞裂解后由内源性大肠杆菌蛋白酶切割。因此，US20080103098的方法指出，为实现优化的BoNT表达，必须通过插入非天然的切割位点对BoNT序列进行修饰。

US 7132259描述了编码BoNT蛋白的重组核酸分子。然而，US 7132259的核酸分子经过修饰以使用非天然的切割位点代替天然的切割位点。因此，US 7132259的方法也指出，需要插入非天然的切割位点以进行优化的BoNT表达。

US 6495143描述了编码BoNT的重链(H_C)的片段的重组核酸分子，用于诱导免疫应答(例如在疫苗接种中)。然而，该核酸分子不编码全长BoNT序列。在大肠杆菌中表达并纯化破伤风毒素和BoNT的单个H和L链是可实现的，这些分离的链本身是无毒的。单独生产这些肽链后并在严格控制的条件下，可通过氧化型二硫键连接使H和L亚基结合以形成活性双链。不幸的是，该策略具有若干不足。首先，难以表达和分离大量的单个链，具体而言，在不存在H链的情况下，分离的L链在水溶液中完全不可溶且非常易于受到蛋白水解降解。其次，体外氧化单独表达并纯化的H和L链以生成活性双链的过程是非常低效的，并导致活性毒素的产量低并产生许多无活性的非正确折叠或氧化的形式。对含有正确折叠和氧化的H和L链的毒素进行纯化是困难的，将其与这些非活性形式和未反应的单独的H和L链分离也是困难的。因此，US 6495143的方法具有大量缺点。

因此，本领域中需要改善的方法以生产重组BoNT，特别是活性双链BoNT重组BoNT/E。

通过提供权利要求中说明的核酸序列和方法，本发明解决了上述问题中的一个或多个。

在一个方面，本发明提供了一种包含连续核苷酸序列的核酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少80％(例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或100％)的序列相同性且所述连续核苷酸序列编码单链BoNT/E1蛋白。

BoNT/E血清型可分为八种亚型，BoNT/E1至BoNT/E8，其共有至少90％的氨基酸序列相同性；给定亚型中的BoNT/E蛋白共有较高的氨基酸序列相同性百分比(例如至少95％或更高)。如上文所述，本发明的核酸序列编码BoNT/E1蛋白。BoNT/E1蛋白的一个示例是由UniParc氨基酸序列UPI000016EA7F编码的蛋白。BoNT/E1蛋白的另一个示例是由SEQ IDNO：2的氨基酸序列编码的蛋白。

本发明的核酸序列被设计为优选在大肠杆菌细胞中提供高水平的表达。

多种因素影响给定蛋白的表达水平。一种这类因素是编码该蛋白的mRNA序列的翻译速率。该因素本身受mRNA使用何种特定密码子以指定该蛋白的各氨基酸所影响。一些密码子的翻译比其他的快。针对各氨基酸的密码子的选择可以变化，因为在天然的情况下mRNA密码子可以简并。若干不同密码子可全部指定相同的氨基酸；因此若干不同mRNA序列可编码相同的蛋白。指定相同氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。特定mRNA中同义密码子的精确混合影响了编码的蛋白的翻译速率。

存在多种不同原因用于解释为什么一些密码子的翻译速率比其他的快。各密码子通过招募与氨基酸相连的tRNA来指定氨基酸。翻译速度受各种不同tRNA分子的相对丰度的影响，受各特定tRNA分子与招募其的密码子结合亲和性的影响，还受其他因素(如密码子-tRNA分子对与翻译机制的其他元件相互作用程度)的影响。可通过测定高度表达的基因中不同密码子的频率来预测近似的密码子翻译速率。然而，不是所有频繁出现的密码子都会导致最优的表达。

不希望受到特定理论的约束，发明人相信通过降低某些密码子(下文中称作“慢密码子”并在下文中列出)的频率(即序列中出现的数目)可实现BoNT/E1核酸序列的最优表达。在这方面，发明人认为所述慢密码子与降低的翻译速率相关。

氨基酸	慢密码子(RNA)	慢密码子(DNA等价物)
			苯丙氨酸	UUU	TTT
酪氨酸	UAU	TAT
			半胱氨酸	UGU	TGT
组氨酸	CAU	CAT
			谷氨酰胺	CAA	CAA

脯氨酸	CCA和/或CCG	CCA和/或CCG
			丝氨酸	UCA和/或UCG	TCA和/或TCG
精氨酸	CGG	CGG
			亮氨酸	UUA和/或CUA	TTA和/或CTA

发明人使用了合理的序列设计方法以生产本发明的核酸序列。一种方法是通过使用经优化数目的慢密码子(例如减少序列中慢密码子出现的频率)，其中本发明的核酸序列提供了高表达水平的编码的BoNT/E1蛋白。

在一个实施方式中，所述核酸序列具有最多160个慢密码子(例如最多160、150、140、130、120、110、100、90、95、94、93、92、91、90、89、88或87个慢密码子)。

因此，在一个实施方式中，所述核酸序列具有0-160个慢密码子(例如0-160、0-150、0-140、0-130、0-120、0-110、0-100、0-90、0-95、0-94、0-93、0-92、0-91、0-90、0-89、0-88或0-87个慢密码子)。

在一个实施方式中，所述核酸序列具有60-160个慢密码子(例如60-160、60-150、60-140、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、80-130、80-120、80-110、80-100或80-90个慢密码子)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列的第一个50％中的慢密码子少于所述核酸序列的第二个50％中的慢密码子。核酸序列的第一个50％根据核苷酸位置数目1作为起始位点来定义，因此包含翻译起始位点；核酸序列的第二个50％包含翻译终止位点。例如，参考SEQ ID NO：1(其总长度为3759个核苷酸)，所述序列的第一个一半可以是1-1881位核苷酸(包含627个核苷酸三联体)，而所述序列的第二个一半可以是1882-3759位核苷酸(包含626个核苷酸三联体)；或者，所述序列的第一个一半可以是1-1878位核苷酸(包含626个核苷酸三联体)，而所述序列的第二个一半可以是1879-3759位核苷酸(包含627个核苷酸三联体)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含最多30个(例如30、25、20、15或10个)苯丙氨酸慢密码子(RNA＝UUU；DNA＝TTT)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含最多10个苯丙氨酸慢密码子(RNA＝UUU；DNA＝TTT)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多30个(例如30、25、20、19或18个)酪氨酸慢密码子(RNA＝UAU；DNA＝TAT)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多18个酪氨酸慢密码子(RNA＝UAU；DNA＝TAT)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸和/或酪氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多19个(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5个)亮氨酸慢密码子(RNA＝UUA和/或CUA；DNA＝TTA和/或CTA)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸和/或酪氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多5个亮氨酸慢密码子(RNA＝UUA和/或CUA；DNA＝TTA和/或CTA)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸和/或亮氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多14个(例如14、12、10、8、6、5、4或3个)谷氨酰胺慢密码子(RNA＝CAA；DNA＝CAA)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸和/或亮氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多3个谷氨酰胺慢密码子(RNA＝CAA；DNA＝CAA)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和/或谷氨酰胺慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多20个(例如20、19、18、17或16个)丝氨酸慢密码子(RNA＝UCA和/或UCG；DNA＝TCA和/或TCG)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和/或谷氨酰胺慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多16个丝氨酸慢密码子(RNA＝UCA和/或UCG；DNA＝TCA和/或TCG)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多23个(例如23、22、21、20或19个)脯氨酸慢密码子(RNA＝CCA和/或CCG；DNA＝CCA和/或CCG)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多19个脯氨酸慢密码子(RNA＝CCA和/或CCG；DNA＝CCA和/或CCG)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和/或脯氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多3个(例如3或2个)半胱氨酸慢密码子(RNA＝UGU；DNA＝TGT)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和/或脯氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多2个半胱氨酸慢密码子(RNA＝UGU；DNA＝TGT)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸和/或半胱氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多5个(例如5或4个)组氨酸慢密码子(RNA＝CAU；DNA＝CAT)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸和/或半胱氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含最多4个组氨酸慢密码子(RNA＝CAU；DNA＝CAT)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和/或组氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含5-10个(例如5、6、7、8、9或10个)精氨酸慢密码子(RNA＝CGG；DNA＝CGG)。在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用(包括前文所述涉及苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和/或组氨酸慢密码子的实施方式)，所述核酸序列(如上文所述)包含10个精氨酸慢密码子(RNA＝CGG；DNA＝CGG)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含最多30个(例如30、25、20、15或10个；优选10个)苯丙氨酸慢密码子(RNA＝UUU；DNA＝TTT)和最多30个(例如30、25、20、19或18个；优选18个)酪氨酸慢密码子(RNA＝UAU；DNA＝TAT)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含最多30个(例如30、25、20、15或10个；优选10个)苯丙氨酸慢密码子(RNA＝UUU；DNA＝TTT)、最多30个(例如30、25、20、19或18个；优选18个)酪氨酸慢密码子(RNA＝UAU；DNA＝TAT)和最多19个(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5个；优选5个)亮氨酸慢密码子(RNA＝UUA和/或CUA；DNA＝TTA和/或CTA)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含最多30个(例如30、25、20、15或10个；优选10个)苯丙氨酸慢密码子(RNA＝UUU；DNA＝TTT)、最多30个(例如30、25、20、19或18个；优选18个)酪氨酸慢密码子(RNA＝UAU；DNA＝TAT)、最多19个(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5个：优选5个)亮氨酸慢密码子(RNA＝UUA和/或CUA；DNA＝TTA和/或CTA)和最多14个(例如14、12、10、8、6、5、4或3个；优选3个)谷氨酰胺慢密码子(RNA＝CAA；DNA＝CAA)。

在一个实施方式中，任选与上述实施方式中任何一项或多项联用，所述核酸序列(如上文所述)包含：

最多10个苯丙氨酸慢密码子；

最多18个酪氨酸慢密码子；

最多2个半胱氨酸慢密码子；

最多4个组氨酸慢密码子；

最多3个谷氨酰胺慢密码子；

最多19个脯氨酸慢密码子；

最多16个丝氨酸慢密码子；以及

最多5个亮氨酸慢密码子。

最多10个苯丙氨酸慢密码子；

最多18个酪氨酸慢密码子；

最多2个半胱氨酸慢密码子；

最多4个组氨酸慢密码子；

最多3个谷氨酰胺慢密码子；

最多19个脯氨酸慢密码子；

最多16个丝氨酸慢密码子；

最多5个亮氨酸慢密码子，以及

最多10个精氨酸慢密码子。

在一个实施方式中，所述核酸序列是上文所述核酸序列，所述单链BoNT/E1蛋白包含连续氨基酸的序列，且所述连续氨基酸的序列与SEQ ID N0：2的氨基酸序列具有至少95％(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)的序列相同性。

在一个实施方式中，所述核酸序列是上文所述核酸序列，所述单链BoNT/E1蛋白包含由特定氨基酸序列提供的天然激活位点，所述氨基酸序列选自：KGIRK、VKGIRKS、SVKGIRKSI、VSVKGIRKSI、IVSVKGIRKSI、NIVSVKGIRKSI、KNIVSVKGIRKSI、CKNIVSVKGIRKSI、KNIVSVKGIRKSIC和CKNIVSVKGIRKSIC。

在一个实施方式中，所述核酸序列是上文所述核酸序列，前提是上文所述单链BoNT/E1或上文所述连续氨基酸的序列包含一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个或者八个)以下氨基酸(其中氨基酸位置编号起始自BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：

177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸、1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸以及1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)177位的甘氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸以及1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)177位的甘氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸、1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)198位的甘氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)340位的丙氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)773位的亮氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)963位的亮氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)964位的谷氨酰胺以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)967位的丙氨酸以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸包含(或由以下组成)1195位的天冬酰胺以及以下氨基酸中的一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸。

在一个实施方式中，如上文所述，所述一个或多个氨基酸的存在提供了与缺少所述氨基酸的BoNT/E1相比、溶解度提高的BoNT/E1蛋白。所述溶解度提高增加了蛋白在异源(大肠杆菌)表达系统中的产量。

在一个实施方式中，所述核酸序列是上文所述核酸序列，与野生型BoNT/E1的氨基酸序列相比(SEQ ID NO：3)，所述连续核苷酸的序列具有至少770个(例如至少770、775、780、785、790、795、800、810、820、830、840、850、860、870或880个)同义密码子。因此，在一个实施方式中，所述核酸序列包含至少770个与野生型BoNT/E1(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列中相应密码子不同但编码相同氨基酸的密码子。

在一个实施方式中，所述核酸序列(如上文所述)的G-C含量为至少41％(例如至少41或42％)。在一个实施方式中，所述核酸序列(如上文所述)的G-C含量为42％。核酸G-C含量(也称为GC含量或G+C含量)的概念涉及给定核酸序列中G(鸟嘌呤)或C(胞嘧啶)核苷酸的比例。因此，在一个实施方式中，改变了本发明的核酸序列的G-C含量(例如通过同义密码子的替换)以更接近大肠杆菌宿主细胞中优选表达的核酸的G-C含量，从而提高所述序列的表达并提高蛋白产量。

在一个方面，本发明提供了一种编码上文所述核酸序列的表达载体。在一个实施方式中，所述表达载体是pET-26b(+)载体。

在一个方面，本发明提供了一种包含上文所述核酸序列或上文所述表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌BLR(DE3)细胞。

在一个方面，本发明提供了一种在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性BoNT/E1单链蛋白的方法，所述方法包括在大肠杆菌表达系统中表达(如上文所述的)核酸序列。

用于在大肠杆菌表达系统中表达异源蛋白的方法和技术是本领域熟知的。

在一个实施方式中，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白在所述大肠杆菌宿主细胞的细胞质中表达。

在一个实施方式中，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的表达水平为至少3mg/L(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、25、40、45或50mg/L)

在一个实施方式中，用于表达上文所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的方法包括裂解大肠杆菌宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的大肠杆菌宿主细胞匀浆。用于裂解宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)的方法和技术是本领域已知的。示例包括超声和使用法式压制(French press)。

在一个方面，本发明提供了一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：提高包含连续氨基酸的序列的可溶性单链BoNT/E1蛋白，所述连续氨基酸的序列与SEQID N0：2的氨基酸序列具有至少95％(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)的序列相同性，并且使所述BoNT/E1蛋白在溶液中接触胰蛋白酶。

当本发明的单链BoNT/E1蛋白接触胰蛋白酶时，胰蛋白酶的蛋白水解作用在L链蛋白酶组分和易位组分之间的位点处切割单链蛋白以生成双链蛋白，其中两条链通过二硫桥连接(更详细地说，在活性位点处切割单链BoNT/E1后形成的两条链是氨基酸残基1-419的第一链和氨基酸残基423-1252的第二链，其中切割事件除去了残基420、421和422)。因此，胰蛋白酶可用于通过将单链多肽转化为活性双链形式来激活该单链多肽。因此，优选地，胰蛋白酶的使用意味着无需将外源性(非天然)切割位点工程改造至本发明的BoNT/E1中。

在一个实施方式中，胰蛋白酶包括在与胰蛋白酶相同的蛋白酶切割位点进行切割的胰蛋白酶样酶。

胰蛋白酶切割蛋白序列，该蛋白序列中特定氨基酸位于切割的肽链两侧某些位置。这类序列可以表示为P4-P3-P2-P1-切割的键-P’1-P’2-P’3-P’4；其中P1至P4分别表示切割的肽键的N末端侧的1至4位氨基酸，而P’1至P’4分别表示切割的肽键的C末端侧的1至4位氨基酸。

更重要的是，胰蛋白酶切割Arg或Lys氨基酸占据P1位置的蛋白序列。当Lys位于P1位置时，存在三种主要类型的序列，其对胰蛋白酶不敏感：

(1)P’1位置的Pro通常降低了易受胰蛋白酶切割的程度(但当位置P2是Trp时不是这样)。

(2)P2位置的Cys或Asp与P’1位置的Asp降低了易受胰蛋白酶切割的程度。

(3)P2位置的Cys与P’1位置的His或Try降低了易受胰蛋白酶切割的程度。

当Arg位于P1位置时，存在三种主要类型的序列，其对胰蛋白酶不敏感：

(1)P’1位置的Pro通常降低了易受胰蛋白酶切割的程度(但当位置P2是Met或可能是Glu时不是这样)。

(2)P2位置的Cys与P’1位置的Lys降低了易受胰蛋白酶切割的程度。

(3)P2位置的Arg与P’1位置的His或Arg降低了易受胰蛋白酶切割的程度。

在一个实施方式中，本发明提供了一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法(如上文所述)，前提是所述连续氨基酸的序列包含一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或者七个)以下氨基酸(其中氨基酸位置编号起始自BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸、1195位的天冬酰胺。

在一个实施方式中，如上文所述，所述一个或多个氨基酸的存在(并参考上文所述一个或多个氨基酸的多重排列)提供了与缺少所述氨基酸的BoNT/E1相比、溶解度提高的BoNT/E1蛋白。所述溶解度提高可以增加蛋白在异源表达系统中的产量。

在一个实施方式中，本发明提供了一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法(如上文所述)，通过上文所述方法提供可溶性单链BoNT/E1蛋白以在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性单链BoNT/E1蛋白。

在一个实施方式中，本发明提供了一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法(如上文所述)，所述方法包括通过使含有可溶性BoNT/E1蛋白和胰蛋白酶的溶液接触疏水性表面来分离可溶性BoNT/E1蛋白与胰蛋白酶，其中所述可溶性BoNT/E1蛋白优先结合疏水性表面。

发明人发现，通过使用疏水性纯化的方法以分离活化的双链多肽和胰蛋白酶，可获得高产量的活化的双链BoNT/E1蛋白。令人惊讶的是，该方法的纯化效果优于使用离子交换色谱的标准纯化方法，发明人发现所述标准纯化方法无法有效地分离活化的双链多肽和胰蛋白酶。此外，作为总纯化方法的一部分，该方法还优选提供了不含活性蛋白酶的活化的双链BoNT/E1蛋白。

活性重组BoNT/E1的生产需要将分子切割为活性双链形式的蛋白水解步骤。该切割可通过使用蛋白酶(胰蛋白酶)的体外激活步骤来实现。激活步骤后，重要的是从最终产物中除去蛋白酶，这还避免了BoNT/E1的任何其他的非特异性切割。

胰蛋白酶和BoNT/E1的等电点(pI)分别为9.32和6.2，其表明应通过利用两种分子制剂电荷差的离子交换(IEX)色谱来实现两种蛋白的分离。蛋白的净电荷受到其周围环境pH的影响，并且取决于其得到或失去质子，其会带有更多的正电荷或负电荷。pI是分子不携带电荷并因此不会与带电的IEX介质相互作用时的pH值。这表明如果蛋白处于高于其pI的pH中，则其会携带净负电荷并结合带正点的介质(如阴离子交换剂)。类似地，如果缓冲液pH低于pI，则该蛋白会携带净正电荷且不会结合阴离子交换剂。

基于该理论，在pH8处，预期BoNT/E(其pI为6.2)将结合阴离子交换介质，而pI为9.32的胰蛋白酶不结合，从而使两种蛋白分离。IEX是一种种单且不昂贵的色谱方法，因为其不需要加载在柱上的蛋白为高盐缓冲液，该缓冲液会导致蛋白因沉淀而损失。

在pH 8下，本发明测试了多种阴离子交换柱，使用了与交联的琼脂糖珠相连的强和弱官能团。在各种情况下，都发现大部分的胰蛋白酶不结合柱(正如预测的那样)并处于流出液中。然而，在使用离子强度递增的线性梯度对柱进行洗脱时，胰蛋白酶从柱上洗脱下来，表明一部分胰蛋白酶能够结合柱。在与BoNT/E1的洗脱相比较时，出乎意料的发现胰蛋白酶在类似的离子强度下洗脱(表1；图1)，表明胰蛋白酶没有如预测的那样分离，其存在于最终纯化的BoNT/E1产物中，BoNT/E1存在发生进一步降解的可能性。

表1：来自评估胰蛋白酶与BoNT/E1分离效果的阳离子交换柱的洗脱组分。各峰以柱体积(CV)的数目显示，F/T：来自柱的流出液，FF：快速流动树脂。

发明人解决了上述问题。具体而言，发明人出乎意料地鉴定到，通过使用疏水性分离表面可实现最优的胰蛋白酶-BoNT/E1分离(例如通过疏水相互作用色谱(HIC)，其利用蛋白与HIC介质的疏水性表面之间的可逆相互作用根据这些蛋白的表面疏水性差别对其进行分离)。

在一个实施方式中，所述疏水性表面是配体连接的惰性基质，所述配体由芳基或烷基组成。

术语“芳基”指芳族基团，例如苯基、萘基、噻吩基和吲哚基。

术语“烷基”指脂族基团，包括直链、支链、环状基团及其组合。烷基可具有1-12个碳原子。烷基的示例包括但不限于甲基、乙基、丙基(例如正丙基、异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基、己基、庚基和辛基。

在一个实施方式中，所述疏水性表面选自下组：丁基、苯基或辛基配体。

在一个实施方式中，所述疏水性表面包含丁基配体。在一个实施方式中，所述疏水性表面包含苯基配体。在一个实施方式中，所述疏水性表面包含辛基配体。

发明人发现，使用含有与惰性基质(如交联的琼脂糖或聚苯乙烯珠)偶联的烷基或芳基(例如丁基、苯基和辛基配体)的色谱树脂进行HIC时获得了特别优选的胰蛋白酶与BoNT/E的分离结果。

表2：来自评估胰蛋白酶与BoNT/E分离效果的商品化疏水相互作用柱的洗脱组分。各峰以柱体积(CV)的数目显示，F/T：来自柱的流出液，FF：快速流动树脂，HP：高效树脂，(LS)：低取代疏水基团，(HS)：高取代疏水基团。

在一个实施方式中，分离活化双链BoNT/E1蛋白与胰蛋白酶的疏水纯化方法将胰蛋白酶的浓度降低了至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少450倍或至少500倍。在优选的实施方式中，分离活化双链BoNT/E1蛋白与胰蛋白酶的疏水纯化方法将胰蛋白酶的浓度降低了至少350倍。

在另一个方面，本发明提供了一种活性双链BoNT/E1蛋白，其中，第一链包含连续氨基酸的序列，所述连续氨基酸的序列与SEQ ID NO：2的1-419位的氨基酸序列具有至少95％(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)的序列相同性；第二链包含连续氨基酸的序列，所述连续氨基酸的序列与SEQ IDNO：2的423-1252位的氨基酸序列具有至少95％(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)的序列相同性；所述第一和第二链通过第一链上的半胱氨酸412和第二链上的半胱氨酸426之间的二硫键连接在一起；前提是所述连续氨基酸的序列包括一个或多个(例如一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个或者八个)以下氨基酸(其中氨基酸位置编号起始自BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸、1195位的天冬酰胺。

在一个相关方面，本发明提供了一种活性双链BoNT/E1蛋白，其可通过生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法(如上文所述)获得。

在一个方面，本发明提供了一种包含活性双链BoNT/E1蛋白(如上文所述)的组合物，所述组合物基本不含胰蛋白酶。

因此，优选地，所述组合物基本不含胰蛋白酶(用于通过将单链多肽转化为活性双链形式来将其激活)，从而避免产生了不需要的BoNT/E1蛋白的非特异性切割体。

在一个实施方式中，所述组合物(如上文所述)基本不含胰蛋白酶，所述组合物中每100纳克(ng)的BoNT/E1蛋白含有少于100皮克(pg)胰蛋白酶：例如每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶。在一个实施方式中，所述组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶。在优选实施方式中，所述组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶。

因此，在一个实施方式中，术语“基本不含胰蛋白酶”表示每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于100pg胰蛋白酶，例如每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶，优选地每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶。

测定组合物中胰蛋白酶浓度的方法是本领域已知的。例如，可通过使用夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)测定本发明的组合物中胰蛋白酶的浓度。

在其他方面，本发明提供了一种固体或液体药物组合物，其包含：

(a)上文所述活性双链BoNT/E1蛋白，以及

(b)稳定剂。

在一个实施方式中，所述组合物(如上文所述)基本不含胰蛋白酶。在一个实施方式中，所述组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于100pg胰蛋白酶，例如每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶。在一个实施方式中，所述组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶。

可用于本发明所述组合物的稳定剂包括蛋白稳定剂(如白蛋白，特别是人血清白蛋白(HSA))和非蛋白稳定剂。

可用于本发明所述组合物的非蛋白稳定剂包括表面活性剂，特别是非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的示例包括聚山梨醇(如聚山梨醇20或聚山梨醇80)和嵌段共聚物(如泊洛沙姆，即聚乙烯和丙二醇的共聚物)。

在具体的实施方式中，所述组合物不包含作为稳定剂的蛋白。

根据本发明的具体实施方式，所述药物组合物是液体药物组合物，其包含：

(a)上文所述活性双链BoNT/E1蛋白；

(b)作为非蛋白稳定剂的表面活性剂；以及

(c)水；

所述液体药物组合物不包含蛋白稳定剂；且

所述液体药物组合物基本不含胰蛋白酶(例如，所述液体药物组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于100pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶；优选地，所述液体药物组合物中每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng的BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶)。

在一个实施方式中，所述组合物(如上文所述)中活性双链BoNT/E1蛋白的浓度为1-100ng/ml。在一个实施方式中，所述组合物(如上文所述)中活性双链BoNT/E1蛋白的浓度为5-50ng/ml，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。在优选实施方式中，活性双链BoNT/E1蛋白的浓度为约20ng/ml。

在一个实施方式中，所述表面活性剂(如上文所述)是聚山梨醇，如平均聚合度范围为20-100单体单元的聚山梨醇，并且可以是例如聚山梨醇80。在优选实施方式中，所述聚山梨醇是植物来源的。所述表面活性剂的浓度优选低于1％v/v，例如对于聚山梨醇80，其浓度为约0.005％-0.02％v/v。

本发明所述的药物组合物还包含成核剂。

成核剂指对冻干的梭菌神经毒素复合体(A、B、C、D、E、F或G型)或高纯度梭菌神经毒素(A、B、C、D、E、F或G型)特别地维持具有机械强度的块状结构的试剂。包含于固体制剂中时，成核剂还具有膨化效应(bulking effect)。成核剂主要包括氯化钠。成核剂的浓度可以是例如0.1-0.5M，优选0.1-0.4M，特别是约0.15-0.3M。

本发明所述的药物组合物还可包含缓冲剂以将所含pH水平维持在5.5-7.5，或6.0-7.0。所述缓冲剂可以是能够维持合适pH的任何缓冲剂。例如，用于本发明所述药物组合物的缓冲剂可选自琥珀酸盐、磷酸二钠/柠檬酸和氨基酸(如组氨酸)。缓冲剂剂的浓度可以是例如1-50mM，优选5-20mM，优选约10mM。

本发明所述药物组合物还可包含二糖。

本发明所述药物组合物中所用二糖可以选自蔗糖、海藻糖、甘露醇和乳糖。在特定实施方式中，所述二糖是蔗糖。所述二糖的浓度可以是例如5-50mM，优选5-25mM，更优选10-20mM，且最优选约11.7mM。

在具体实施方式中，所述药物组合物是液体药物组合物，其包含：

(a)上文所述活性双链BoNT/E1蛋白；

(b)作为非蛋白稳定剂的表面活性剂；

(c)氯化钠，

(c)将pH维持在5.5-7.5的缓冲剂

(e)二糖，以及

(f)无菌水。

所述液体药物组合物不含蛋白稳定剂；且

根据特定实施方式，本发明所述药物组合物事包封在药品或不具有液气界面的即用型装置(入注射器)中的药物组合物，并且在23-27℃下稳定至少三个月或至少六个月并在2-8℃下稳定至少十二个月。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗的上文所述活性双链BoNT/E1蛋白，或者上文所述通过蛋白水解切割单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白，或者上文所述组合物，或者上文所述液体药物组合物。

发明人确定，所述活性双链BoNT/E1蛋白及其组合物和液体药物组合物可用于治疗。合适的治疗包括美容治疗和医疗治疗方法。

SEQ ID NO的要点

SEQ ID NO：1优化的BoNT/E1核酸序列

SEQ ID NO：2BoNT/E1氨基酸序列

SEQ ID NO：3野生型BoNT/E1核酸序列

SEQ ID NO：1优化的BoNT/E1核酸序列

SEQ ID NO：2BoNT/E1氨基酸序列

SEQ ID NO：3野尘型BoNT/E1核酸序列

附图说明

图1

来自评估胰蛋白酶与BoNT/E1分离效果的阳离子交换柱的洗脱组分。标记了胰蛋白酶、BoNT/E1的峰和盐梯度。图1A：Q-琼脂糖(Sepharose)HP；图1B：DEAE琼脂糖。

图2

来自评估胰蛋白酶与BoNT/E1分离效果的疏水相互作用柱的洗脱组分。标记了胰蛋白酶、BoNT/E1的峰和盐梯度。图2A：苯基琼脂糖HP；图2B：丁基琼脂糖HP；图2C：辛基琼脂糖FF。

图3

与商品化BoNT/E1相比，由western印迹测定的rBoNT/E1培养物的可溶性表达水平。

图4

确定双链结构形成的非还原和还原条件下rBoNT/E1的SDS-PAGE。

实施例

实施例1

优化的BoNT/E1核酸序列的构建

最初通过BoNT/E1氨基酸序列(SEQ ID N0：2)的回译(back translation)来设计DNA序列。将限制性序列(PstI)添加至N末端并将终止子和其他限制性序列(XbaI-终止子-HindIII)添加至C末端。随后基于慢密码子的数目和位置(如上文所定义)优化DNA序列的表达。

优化序列以针对慢密码子进行选择。这特别适用于序列的开始部分以获得良好的起始并开始翻译。在包括慢密码子时(用于根据表达宿主密码子偏好来使用)，其针对序列末端(其中序列的开始部分定义为翻译起始处)。

一旦完成序列设计，就以两个部分的形式合成优化的DNA序列，其中使用独特/天然的PstI位点用于之后组成成全长毒素基因。第一基因的序列包含位于氨基末端的NdeI位点和位于羧基末端的PstI位点。该部分的基因长度为2895bp，编码BoNT/E1 LC和HC的氨基部分。第二基因的序列包含位于N末端的PstI位点和位于羧基末端的HindIII位点，其长度为882bp并编码BoNT/E1 HC的羧基部分。

实施例2

表达载体BoNT/E1核酸序列的构建

使用了基于载体pET-26b(+)(诺瓦基公司(Novagen))的表达载体，其包含位于编码BoNT/E1 ORF的DNA的起点和末尾的克隆限制性位点NdeI和HindIII。pET-26b(+)载体是移动缺陷型的但在与其他可移动质粒共存时可以移动。对pET-26b(+)载体进行修饰以除去移动性基因病使其不可移动。

使用NdeI和PstI消化表达载体并使用BoNT/E1 DNA的第一片段连接纯化的载体骨架，所述第一片段已经过相同的限制性酶的消化以生成中间体产物。在第二克隆步骤中，将来自使用PstI和HindIII消化的第二片段的BoNT/E1 DNA克隆至第一步的中间体产物(其经过相同的限制性酶的消化)中。这导致在表达载体中生成BoNT/E1 DNA的终产物。

实施例3

将BoNT/E1表达载体插入宿主

该实施例基于使用大肠杆菌BLR(DE3)细胞，但各过程和方法等同地适用于任何其他大肠杆菌表达菌株。大肠杆菌BLR(DE3)感受态细胞储存于-70℃以下直至需要使用。使用生产商实验方案的改编方案进行细胞转化。在冰上解冻细胞并制备10μL的等分试样。使用1μL的质粒DNA并在42℃下热击80秒来转化一份等分试样。在冰上恢复5分钟后，向转化物中添加90μL无动物来源SOC液体培养基并随后转移至震荡培养箱中并在37℃和250rpm下孵育1小时。孵育后，将90μL的各转化物转移并涂布在添加了50μg/mL卡那霉素的无动物来源LB琼脂平板上。将平板在37℃下孵育16小时。

实施例4

宿主的培养和可溶性rBoNT/E1蛋白的表达

转化进BLR(DE3)细胞的BoNT/E1的单克降用于接种含附加有0.2％葡萄糖胺和30μg/ml卡那霉素的100ml经修饰Terrific肉汤(mTB)的250ml锥形瓶中。该方法等同地适用于在使用Microbank珠或甘油储液(10-100μl)以接种烧瓶。

将烧瓶在37℃和250RPM震荡下孵育16小时。10ml的该起始培养物用于接种各自含有1L附加有0.2％葡萄糖胺和30μg/ml卡那霉素的2L锥形瓶。将细胞在37℃和225RPM震荡下孵育约2小时直至OD₆₀₀达到0.5。此时，将培养温度下降至16℃。1小时后，通过加入1mM IPTG来诱导细胞以表达BoNT/E1，持续20小时。通过在4℃下离心20分钟来收获细胞，称重并随后在-20℃下储存。

实施例5

从宿主中提取BoNT/E1蛋白并分析表达水平

使rBoNT/E1的表达细胞平板在室温下解冻并通过每克细胞加入附加有10μl核酸酶(benzonase)的3mlTris-NaCL重悬缓冲液将其重悬。在4μm幅度-10x30秒开+＞45秒关的条件下通过超声裂解细胞。将裂解物在4℃下4000g离心1小时以在上清液中获得可溶性rBoNT/E1。

测定制备的裂解物中总蛋白浓度的Bradford试验

将稀释的裂解物或BSA标准品的样品(50μL)添加至1mL塑料比色皿中。向各比色皿中加入450μL的考马斯Bradford试验试剂并在室温下孵育10分钟，之后读取OD₆₀₀。BSA标准品所获得的数值用于测定裂解物样品中的蛋白量。

制备裂解物样品用于半定量Western印迹分析

购自梅塔生物公司(Metabiologics)的BoNT/E1蛋白商品化样品用于建立SDS-PAGE标准。随后从来自表达的细胞培养物的裂解物样品中制备SDS-PAGE样品至已知的总蛋白浓度。

Western印迹

加载凝胶并在200V下运行55分钟并在不含甲醇的印迹缓冲液中0.4mA印迹1小时至硝酸纤维素膜上。使用含0.5％BSA的PBS-0.1％吐温20对硝酸纤维素印迹膜进行封闭并使用针对BoNT/E1的抗体杂交1小时。使用由SuperSignal DuraWest底物显影的HRP偶联的二抗检测印迹膜。使用Syngene成像仪器对显影的印迹膜进行成像(图3)。

实施例6

目标BoNT/E1蛋白的初始纯化并激活为双链形式

该实施例基于捕获和中间体柱步骤的组合，但可改变或颠倒该组合从而以不同顺序进行。对澄清的上清液给予高盐浓度并加载至疏水性捕获柱(丁基琼脂糖)上。使用低盐Tris缓冲液的梯度将结合的rBoNT/E1从柱上洗脱下来。随后使用离子交换柱(如Q-琼脂糖)对洗脱的蛋白进行进一步纯化，使用高盐Tris缓冲液的梯度进行洗脱。随后向洗脱的rBoNT/E1样品中加入胰蛋白酶至2.5μg/ml的终浓度并在37℃下孵育40分钟。该步骤在BoNT/E1激活环上产生缺口并形成了最终的BoNT/E1双链结构，如还原性SDS-PAGE所确认的那样(图4)。

实施例7

最终从激活蛋白酶中纯化目标BoNT/E1蛋白

将活化的rBoNT/E1样品立即在高盐缓冲液中加载至疏水柱(丁基琼脂糖)上。使用高盐缓冲液对柱进行清洗以除去弱结合的胰蛋白酶，之后使用低盐Tris缓冲液的梯度以进一步从柱及结合的rBoNT/E1蛋白中除去胰蛋白酶。随后梯度洗脱rBoNT/E1蛋白，使之与胰蛋白酶分离。

测定胰蛋白酶水平的试验

进行胰蛋白酶ELISA以测定柱组分和最终BoNT/E1样品中存在的水平。在37℃下将抗胰蛋白酶捕获抗体包被至微滴定平板上，持续1小时。将胰蛋白酶标准品和测试样品添加至平板上(100μL/孔)并在37℃下孵育1小时，之后使用第二抗胰蛋白酶抗体检测。从标准品中通过内插法确定各样品/柱组分中胰蛋白酶的量并进行纯化色谱确认胰蛋白酶与BoNT/E1的分离(图2B)。

实施例8

包含基本不含胰蛋白酶的活性双链BoNT/E1的制剂

制备了以下六种包含活性双链BoNT/E1的液体组合物(表3)。

所有六种组合物都在25℃下储存12周。在此期间使用无细胞内肽酶试验评估双链BoNT/E1蛋白酶功能的稳定性。在12周内，六种制剂的月降解率都低于每月5％，这表明在25℃下，六种组合物的双链BoNT/E1蛋白酶功能保持稳定至少12周。

实施方案：

在一些方面，本发明涉及以下实施方案：

1.一种包含连续核苷酸的序列的核酸序列，所述连续核苷酸的序列与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％序列相同性，且所述连续核苷酸的序列编码单链BoNT/E1蛋白。

2.如实施方案1所述的核酸序列，所述核酸具有最多160个慢密码子。

3.如实施方案1或2所述的核酸序列，所述单链BoNT/E1蛋白包含连续氨基酸的序列，所述连续氨基酸的序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列相同性。

4.如实施方案1-3中任一项所述的核酸序列，前提是实施方案1或2所述的单链BoNT/E1蛋白或实施方案3所述的连续氨基酸的序列包含一个或多个以下氨基酸(其中，氨基酸位置编号起始自所述BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于所述BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：177位的甘氨酸198位的丝氨酸340位的丙氨酸773位的亮氨酸963位的亮氨酸964位的谷氨酰胺967位的丙氨酸1195位的天冬酰胺。

5.如前述实施方案中任一项所述的核酸序列，其中，与野生型BoNT/E1的核酸序列(SEQID NO：3)相比，所述连续核苷酸的序列具有至少785个同义密码子。

6.一种在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性单链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：在大肠杆菌表达系统中表达前述实施方案中任一项所述的核酸序列。

7.如实施方案6所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白在所述大肠杆菌宿主细胞的细胞质中表达。

8.如实施方案6或7所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的表达水平为至少5mg/L。

9.如实施方案6-8中任一项所述的方法，所述方法包括裂解所述大肠杆菌宿主细胞以提供含有所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的大肠杆菌宿主细胞匀浆。

10.一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：提供包含连续氨基酸的序列的可溶性单链BoNT/E1蛋白，且所述连续氨基酸的序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列相同性，并使所述BoNT/E1蛋白在溶液中接触胰蛋白酶。

11.如实施方案10所述的方法，前提是所述连续氨基酸的序列包含一个或多个以下氨基酸(其中，氨基酸位置编号起始自所述BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于所述BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：177位的甘氨酸198位的丝氨酸340位的丙氨酸773位的亮氨酸963位的亮氨酸964位的谷氨酰胺967位的丙氨酸1195位的天冬酰胺。

12.如实施方案10或11所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白由实施方案6-9中任一项所述的方法提供。

13.如实施方案10-12中任一项所述的方法，所述方法包括通过使含有可溶性BoNT/E1蛋白和胰蛋白酶的溶液接触疏水性表面来分离所述可溶性BoNT/E1蛋白和所述胰蛋白酶，其中，所述可溶性BoNT/E1蛋白优先结合所述疏水性表面。

14.如实施方案13所述的方法，所述疏水性表面是惰性基质，其上连接有由芳基或烷基组成的配体。

15.如实施方案14所述的方法，所述疏水性表面选自下组：丁基、苯基或辛基配体。

16.一种活性双链BoNT/E1蛋白，其中，第一链包含连续氨基酸的序列，且所述连续氨基酸的序列与SEQ ID NO：2的1-419位氨基酸序列具有至少95％序列相同性；第二链包含连续氨基酸的序列，且所述连续氨基酸的序列与SEQ ID NO：2的423-1252位氨基酸序列具有至少95％序列相同性；所述第一和第二链通过所述第一链上半胱氨酸412与所述第二链上半胱氨酸426之间的二硫键连接在一起；前提是所述连续氨基酸的序列包含一个或多个以下氨基酸(其中，氨基酸位置编号起始自所述BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于所述BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：177位的甘氨酸198位的丝氨酸340位的丙氨酸773位的亮氨酸963位的亮氨964位的谷氨酰胺967位的丙氨酸1195位的天冬酰胺。

17.一种活性双链BoNT/E1蛋白，其能通过实施方案10-15中任一项所述方法获得。

18.一种组合物，其包含实施方案16或17所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割实施方案6-9中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；其中，所述组合物基本不含胰蛋白酶。

19.如实施方案18所述的组合物，所述组合物中每100ng BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶。

20.一种液体药物组合物，所述液体药物组合物包含：实施方案16或17所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割权利要求6-9中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；作为表面活性剂的非蛋白稳定剂；以及水；所述液体药物组合物不包含蛋白稳定剂；且所述液体药物组合物基本不含胰蛋白酶(例如，所述液体药物组合物中每100ng BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶)。

21.如实施方案20所述的液体药物组合物，所述液体药物组合物还包含：氯化钠，将pH维持在5.5-7.5的缓冲剂，以及二糖；其中，所述水是无菌水。

22.用于治疗的实施方案16或17所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割实施方案6-9中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白，或实施方案18或19所述的组合物，或实施方案20或21所述的液体药物组合物。

在一些方面，本发明还涉及以下实施方案：

1.一种包含连续核苷酸的序列的核酸序列，所述连续核苷酸的序列具有SEQ ID NO：1的核酸序列，

其中在第一个50％的核酸序列中的慢密码子少于第二个50％核酸序列中的慢密码子，

且所述连续核苷酸的序列编码单链BoNT/E1蛋白。

2.如实施方案1所述的核酸序列，其中所述核酸具有最多160个慢密码子，选自TTT、TAT、TGT、CAT、CAA、CCA、CCG、TCA、TCG、CGG、TTA和CTA。

3.如实施方案1或2所述的核酸序列，其包含：

(a)最多30个苯丙氨酸慢密码子(TTT)；

(b)最多30个酪氨酸慢密码子(TAT)；

(c)最多19个亮氨酸慢密码子(TTA)；

(d)最多14个谷氨酰胺慢密码子(CAA)；

(e)最多20个丝氨酸慢密码子(TCA和/或TCG)；

(f)最多23个脯氨酸慢密码子(CCA和/或CCG)；

(g)最多3个半胱氨酸慢密码子(TGT)；

(h)最多5个组氨酸慢密码子(CAT)；和/或

(i)从5到10个精氨酸慢密码子(CGG).

4.如实施方案1至3中任一项所述的核酸序列，所述单链BoNT/E1蛋白包含连续氨基酸的序列，所述连续氨基酸的序列具有SEQID NO：2的氨基酸序列。

5.如实施方案I-4中任一项所述的核酸序列，前提是实施方案1-3中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白或实施方案4所述的连续氨基酸的序列包含一个或多个以下氨基酸(其中，氨基酸位置编号起始自所述BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于所述BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基)：

177位的甘氨酸

198位的丝氨酸

340位的丙氨酸

773位的亮氨酸

963位的亮氨酸

964位的谷氨酰胺

967位的丙氨酸

1195位的天冬酰胺。

6.如前述实施方案中任一项所述的核酸序列，其中，与野生型BoNT/E1的核酸序列(SEQID NO：3)相比，所述连续核苷酸的序列具有至少785个同义密码子。

7.一种在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性单链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：

在大肠杆菌表达系统中表达前述实施方案中任一项所述的核酸序列。

8.如实施方案7所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白在所述大肠杆菌宿主细胞的细胞质中表达。

9.如实施方案7或8所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的表达水平为至少5mg/L，优选地至少8mg/ml。

10.如实施方案7-9中任一项所述的方法，所述方法包括裂解所述大肠杆菌宿主细胞以通过含有所述可溶性单链BoNT/E1蛋白的大肠杆菌宿主细胞匀浆。

11.一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：

提供包含连续氨基酸的序列的可溶性单链BoNT/E1蛋白，所述连续氨基酸的序列与SEQID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列相同性，

使所述BoNT/E1蛋白在溶液中接触胰蛋白酶，以及

通过使含有可溶性BoNT/E1蛋白和胰蛋白酶的溶液接触疏水性表面来分离所述可溶性BoNT/E1蛋白和所述胰蛋白酶，其中，所述可溶性BoNT/E1蛋白优先结合所述疏水性表面；并且

其中所述分离减少了胰蛋白酶浓度至少350倍。

12.如实施方案11所述的方法，前提是所述连续氨基酸的序列包含一个或多个以下氨基酸(其中，氨基酸位置编号起始自所述BoNT/E1蛋白的N末端氨基酸残基并终止于所述BoNT/E1蛋白的C末端氨差酸残基)：

177位的甘氨酸

198位的丝氨酸

340位的丙氨酸

773位的亮氨酸

963位的亮氨酸

964位的谷氨酰胺

967位的丙氨酸

1195位的天冬酰胺。

13.如实施方案11或12所述的方法，所述可溶性单链BoNT/E1蛋白由实施方案7-10中任一项所述的方法提供。

14.如实施方案11-13中任一项所述的方法，所述疏水性表面是惰性基质，其上连接有由芳基或烷基组成的配体。

16.一种活性双链BoNT/E1蛋白，其能通过实施方案11-15中任一项所述方法获得。

17.一种组合物，其包含实施方案16所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割实施方案7-10中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；其中，所述组合物基本不含胰蛋白酶。

18.如实施方案17所述的组合物，所述组合物中每100ng BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ngBoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶。

19.一种液体药物组合物，所述组合物包含：

实施方案16所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割实施方案7-10中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；

作为表面活性剂的非蛋白稳定剂；以及

水；

所述液体药物组合物不包含蛋白稳定剂：且

所述液体药物组合物基本不含胰蛋白酶(例如，所述液体药物组合物中每100ng BoNT/E1蛋白含有少于10pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于7pg胰蛋白酶，或者每100ng BoNT/E1蛋白含有少于5pg胰蛋白酶)。

20.如实施方案19所述的液体药物组合物，所述液体药物组合物还包含：

氯化钠，

将pH维持在5.5-7.5的缓冲剂，以及

二糖；

其中，所述水是无菌水。

21.用于治疗的实施方案17所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割实施方案7-10中任一项所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白，或实施方案17或18所述的组合物，或实施方案19或20所述的液体药物组合物。

在一些方面，本发明还涉及以下实施方案：

1.一种固体药物组合物，包括：

(a)活性双链BoNT/E1蛋白，其中第一链包含连续氨基酸序列，并且其中所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-419位氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；其中第二条链包含连续氨基酸序列，并且其中所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO：2的423-1252位氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；其中第一和第二链通过第一链上的半胱氨酸412和第二链上的半胱氨酸426之间的二硫键连接在一起；条件是所述连续氨基酸序列包括一个或多个下列氨基酸(其中氨基酸位置编号以N末端氨基酸残基开始并以BoNT/E1蛋白的C末端氨基酸残基结束)：

177位的甘氨酸

198位的丝氨酸

340位的丙氨酸

773位的亮氨酸

963位的亮氨酸

964位的谷氨酰胺

967位的丙氨酸

1195位的天冬酰胺，

并且其中所述连续氨基酸序列不包括SEQ ID NO：2的残基420、421和422；和

(b)稳定剂。

2.根据实施方案1的固体药物组合物，其中所述固体组合物含有每100ng BoNT/E1蛋白少于10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少于7pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少于5pg胰蛋白酶。

3.根据实施方案1或2的固体药物组合物，其中：

(a)所述稳定剂是非蛋白质稳定剂，优选表面活性剂；和/或

(b)所述固体药物组合物不包含蛋白质稳定剂。

4.根据实施方案3的固体药物组合物，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂，优选聚山梨醇或泊洛沙姆。

5.根据实施方案4的固体药物组合物，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇80。

6.根据实施方案3至5中任一项所述的固体药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度低于1％v/v。

7.根据实施方案6所述的固体药物组合物，其中所述表面活性剂是浓度为0.005％至0.02％v/v的聚山梨醇80。

8.根据前述实施方案中任一项的固体药物组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂以维持pH在5.5和7.5之间。

9.根据实施方案8的固体药物组合物，其中所述缓冲剂选自：(i)柠檬酸；(ii)琥珀酸盐；(iii)磷酸二钠；和/或(iv)氨基酸，任选组氨酸。

10.根据实施方案8或9的固体药物组合物，其中所述缓冲液的浓度为1至50mM，优选5至20mM，更优选约10mM。

11.根据前述实施方案中任一项的固体药物组合物，其中所述组合物还包含二糖。

12.根据实施方案11的固体药物组合物，其中所述二糖选自：蔗糖，海藻糖，甘露醇和乳糖，优选其中所述二糖是蔗糖。

13.根据实施方案11或12的固体药物组合物，其中所述二糖的浓度为5至50mM，优选5至25mM，更优选10至20mM，最优选约11.7mM。

14.根据前述实施方案中任一项的固体药物组合物，其中：

(a)表面活性剂是聚山梨醇80；

(b)选自柠檬酸和/或组氨酸的缓冲液；

(c)二糖是蔗糖。

15.根据前述实施方案中任一项的固体药物组合物，其用于治疗。

序列表

<110> 突触融合蛋白有限公司(SYNTAXIN LIMITED)

易普森生物制药有限公司(IPSEN BIOPHARM LIMITED)

<120> 重组的肉毒梭菌神经毒素

<130> P39711WO

<150> GB 1219602.8

<151> 2012-10-31

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3759

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的BoNT/E1核酸序列

<400> 1

atgccgaaaa tcaactcttt caactacaac gacccggtta acgaccgtac catcctgtat 60

atcaaaccgg gtggttgcca ggagttctac aaatctttca acatcatgaa aaacatctgg 120

atcatcccgg aacgtaacgt tatcggtacc accccgcagg acttccaccc gccgacctct 180

ctgaaaaacg gtgactcttc ttactacgac ccgaactacc tccagtctga cgaagaaaaa 240

gaccgtttcc tgaaaatcgt taccaaaatc ttcaaccgta tcaacaacaa cctgtctggt 300

ggtatcctgc tggaagaact gtctaaagct aacccgtacc tgggtaacga caacaccccg 360

gacaaccagt tccacatcgg tgacgcttct gctgttgaaa tcaaattctc taacggttct 420

caggacatcc tgctgccgaa cgttatcatc atgggtgctg aaccggacct gttcgaaacc 480

aactcttcta acatctctct gcgtaacaac tacatgccgt ctaaccacgg tttcggttct 540

atcgctatcg ttaccttctc tccggaatac tctttccgtt tcaacgacaa cagcatgaac 600

gagttcatcc aggacccggc tctgaccctg atgcacgaac tgatccactc tctgcacggt 660

ctgtacggtg ctaaaggtat caccaccaaa tacaccatca cccagaaaca gaacccgctg 720

atcaccaaca tccgtggtac caacatcgaa gagttcctga ccttcggtgg taccgacctg 780

aacatcatca cctctgctca gtctaacgac atctacacca acctgctggc tgactacaaa 840

aaaatcgctt ctaaactgtc taaagttcag gtttctaacc cgctgctgaa cccgtacaaa 900

gacgttttcg aagctaaata cggtctggac aaagacgctt ctggtatcta ctctgttaac 960

atcaacaaat tcaacgacat cttcaaaaaa ctgtactctt tcaccgagtt cgacctggcg 1020

accaaattcc aggttaaatg ccgtcagacc tacatcggtc agtacaaata cttcaaactg 1080

tctaacctgc tgaacgactc tatctacaac atctctgaag gttacaacat caacaacctg 1140

aaagttaact tccgtggtca gaacgctaac ctgaacccgc gtatcatcac cccgatcacc 1200

ggtcgtggtc tggttaaaaa aatcatccgt ttctgcaaga atattgtaag cgttaaagga 1260

ataagaaaaa gtatctgcat cgaaatcaac aacggtgaac tgttcttcgt tgcttctgaa 1320

aactcttaca acgacgacaa catcaacacc ccgaaagaaa tcgacgacac cgttacctct 1380

aacaacaact acgaaaacga cctggaccag gttatcctga acttcaactc tgaatctgct 1440

ccgggtctgt ctgacgaaaa actgaacctg accatccaga acgacgctta catcccgaaa 1500

tacgactcta acggtacctc tgacatcgaa cagcacgacg ttaacgaact gaacgttttc 1560

ttctacctgg acgctcagaa agttccggaa ggtgaaaaca acgttaacct gacctcttct 1620

atcgacaccg ctctgctgga acagccgaaa atctacacct tcttctcttc tgagttcatc 1680

aacaacgtta acaaaccggt tcaggctgct ctgttcgttt cttggattca gcaggttctg 1740

gttgacttca ccaccgaagc taaccagaaa tctaccgttg acaaaatcgc tgacatctct 1800

atcgttgttc cgtacatcgg tctggctctg aacatcggta acgaagctca gaaaggtaac 1860

ttcaaagacg ctctggaact gctgggtgct ggtatcctgc tggagttcga accggaactg 1920

ctgatcccga ccatcctggt tttcaccatc aaatctttcc tgggttcttc tgacaacaaa 1980

aacaaagtta tcaaagctat caacaacgct ctgaaagaac gtgacgaaaa atggaaagaa 2040

gtttactctt tcatcgtttc taactggatg accaaaatca acacccagtt caacaaacgt 2100

aaagaacaga tgtaccaggc tctccagaac caggttaacg ctatcaaaac catcatcgaa 2160

tctaaataca actcttacac cctggaagaa aaaaacgaac tgaccaacaa atacgacatc 2220

aaacagatcg aaaacgaact gaaccagaaa gtttctatcg ctatgaacaa catcgaccgt 2280

ttcctgaccg aatcttctat ctcttacctg atgaaactca tcaacgaagt taaaatcaac 2340

aaactgcgtg aatacgacga aaacgttaaa acctacctgc tgaactacat catccagcac 2400

ggttctatcc tgggtgaatc tcagcaggaa ctgaactcta tggttaccga caccctgaac 2460

aactctatcc cgttcaaact gtcttcttac accgacgaca aaatcctgat ctcttacttc 2520

aacaaattct ttaaacgcat taagagttca tcggttctga atatgcggta caaaaatgat 2580

aaatatgtcg atacttctgg atatgatagc aatatcaaca ttaacggcga cgtgtataaa 2640

tatccgacaa ataaaaacca gtttgggata tataacgaca agctgtcgga ggtcaatatt 2700

tctcaaaacg actatatcat ttacgataat aaatataaaa actttagcat tagtttttgg 2760

gttcgtatac ctaattatga caataaaatt gtaaatgtga ataacgagta taccattata 2820

aactgtatgc gcgacaataa cagtggttgg aaggtatcgc tgaaccataa tgagattatc 2880

tggaccctgc aggataatgc aggtataaac cagaaactgg cttttaacta tggaaacgca 2940

aatgggatct cagattacat taataaatgg atttttgtta ccattacgaa cgatcgctta 3000

ggcgactcaa aactttatat taatggcaat ctgatagatc agaaatcaat cttaaatttg 3060

ggcaatattc atgtctctga taacatcttg ttcaagatcg ttaattgcag ttacactcgt 3120

tatattggca ttcgttactt taatatcttc gataaagaac tggacgagac ggaaatccag 3180

actctgtatt caaacgagcc caatactaat atattgaaag atttttgggg taactatctt 3240

ttatatgata aagaatacta tctcctgaat gtattgaagc caaacaattt catagataga 3300

cgcaaggata gcacattaag tatcaacaat atcagatcta ctatactgtt agcaaatcgc 3360

ctctactccg gtattaaagt gaagattcag cgggttaata actccagtac caatgataat 3420

ctggtccgta agaacgatca ggtatacatc aatttcgtcg cgagcaaaac tcatctcttc 3480

ccgctttacg ccgatacagc tacgacaaac aaggaaaaaa ccataaaaat ttccagctcc 3540

ggaaacagat tcaatcaagt agttgtaatg aactctgtgg gtaataattg tacgatgaac 3600

tttaagaata acaatgggaa caatattgga cttttgggct tcaaagccga cacagtggtg 3660

gcgtccacct ggtattacac gcacatgcgg gaccatacga attcgaacgg ttgcttctgg 3720

aactttatct cggaagaaca cgggtggcaa gaaaaataa 3759

<210> 2

<211> 1252

<212> PRT

<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）

<400> 2

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 3

<211> 3759

<212> DNA

<213> 肉毒梭菌

<400> 3

atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat 60

attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg 120

ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca 180

ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag 240

gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga 300

gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca 360

gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc 420

caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact 480

aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca 540

atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat 600

gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga 660

ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta 720

ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta 780

aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa 840

aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa 900

gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat 960

ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca 1020

actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt 1080

tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta 1140

aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca 1200

ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc 1260

ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag 1320

aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca 1380

aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca 1440

cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa 1500

tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt 1560

ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca 1620

attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt 1680

aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta 1740

gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct 1800

atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat 1860

tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt 1920

ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa 1980

aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa 2040

gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga 2100

aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa 2160

tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt 2220

aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg 2280

ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat 2340

aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat 2400

ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat 2460

aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt 2520

aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat 2580

aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa 2640

tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata 2700

tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg 2760

gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata 2820

aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt 2880

tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca 2940

aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta 3000

ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta 3060

ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga 3120

tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa 3180

actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg 3240

ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg 3300

agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga 3360

ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat 3420

cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt 3480

ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct 3540

ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat 3600

tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt 3660

gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg 3720

aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa 3759

Claims

1.一种包含连续核苷酸的序列的核酸序列，所述连续核苷酸的序列具有SEQ ID NO:1的核酸序列，

且所述连续核苷酸的序列编码单链BoNT/E1蛋白。

2.一种在大肠杆菌宿主细胞中生产可溶性单链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：

在大肠杆菌表达系统中表达前述权利要求中任一项所述的核酸序列。

3.一种生产可溶性双链BoNT/E1蛋白的方法，所述方法包括：

提供包含连续氨基酸的序列的可溶性单链BoNT/E1蛋白，所述连续氨基酸的序列与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列相同性，

使所述BoNT/E1蛋白在溶液中接触胰蛋白酶，以及

其中所述分离减少了胰蛋白酶浓度至少350倍。

4.一种活性双链BoNT/E1蛋白，其能通过权利要求3所述方法获得。

5.一种组合物，其包含权利要求4所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割权利要求2所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；其中，所述组合物基本不含胰蛋白酶。

6.一种液体药物组合物，所述组合物包含：

权利要求4所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割权利要求2所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白；

作为表面活性剂的非蛋白稳定剂；以及

水；

所述液体药物组合物不包含蛋白稳定剂：且

7.用于治疗的权利要求5所述的活性双链BoNT/E1蛋白，或通过蛋白水解切割权利要求2所述的单链BoNT/E1蛋白能获得的活性双链BoNT/E1蛋白，或权利要求5所述的组合物，或权利要求6所述的液体药物组合物。