KR101454273B1

KR101454273B1 - 페그화된 돌연변이 클로스트리디움 보툴리눔 독소

Info

Publication number: KR101454273B1
Application number: KR1020087023540A
Authority: KR
Inventors: 유르겐 프레베르트; 볼카 슈페흐트
Original assignee: 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2014-10-28
Also published as: JP2009531026A; US8912140B2; EP1994048B1; DE502007001546D1; US20090118193A1; ES2334283T3; WO2007104567A2; CA2638862A1; US8003601B2; RU2426739C2; MX2008011495A; ZA200807284B; EP1834962A1; WO2007104567A3; US20110294747A1; RU2008140368A; CN101432296A; HK1128929A1; US8298550B2; CN101432296B

Abstract

본 발명은 자연 중쇄 및 변형 경쇄를 갖는 변형 보툴리눔 독소에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 경쇄의 변형은, (i) N-말단에 사슬의 연장부를 가지며, 이 연장부는 N-말단에서 C-말단에로의 방향에서 -(C)_n-(태그)_m-(X)_l- 구조를 가지며, 상기 C는 시스테인 잔기이며, 상기 태그는 임의의 태그이고, 상기 X는 자연 발생의 임의의 아미노산의 잔기이며, n은 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고, m은 0 또는 1이며, l은 0 또는 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고, 상기 사슬의 연장부 내 하나 이상의 시스테인 잔기가 하나 이상의 PEG사슬에 결합되는 것이다.

페그화, 돌연변이, 클로스트리디움 보툴리눔 독소, 안정성, 디스토니아

Description

페그화된 돌연변이 클로스트리디움 보툴리눔 독소{PEGYLATED MUTATED CLOSTRIDIUM BOTULINUM TOXIN}

본 발명은 상응하는 자연 그대로의 보툴리눔 독소와 비교하여 보다 향상된 안정성 및 보다 연장된 치료적 작용 지속 시간을 갖는 변형(modified) 보툴리눔 독소(BoNT)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 변형 보툴리눔 독소를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 변형된 보툴리눔 독소를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

클로스트리디움 보툴리눔은 포자를 형성하는 박테리아로서, 혐기성 성장을 하며 매우 유해한 단백질을 형성한다. 이 이른바 보툴리눔 독소는 식중독인 보툴리누스 중독증의 원인이며, 이는 응급 조치가 없는 경우 환자가 치사할 수도 있다. 7 개의 혈청형(타입 A∼G, 간략히 BoNT/A, BoNT/B 등으로 불린다)으로 구분되며, 이 혈청형들은 유사한 아미노산 서열(서열)을 가지지만 상이한 항체 반응을 유발한다. 독소(하기에서 신경독소 및 보툴리눔 독소로 지칭한다)는 2 개의 기능적 사슬(chain), 즉 경쇄(∼ 50 kD)와 중쇄(∼ 100 kD)로 구성되며, 이들은 몇 개의 클로스트리디움 균주에서 단일 사슬의 전구체 단백질이 단백분해에 의해 절단되어 생성된다. 다른 균주들은 상응하는 프로테아제가 없기 때문에 사슬로의 절단은 우선 환자의 위-장관에서 행해진다(예컨대 트립신에 의해). 이중 사슬의 형태에서, 하위 단위(즉, 중쇄 및 경쇄)들은 이황화물 가교(disulfide bridge)에 의해 연결되어 있다(이 이외에, 예컨대 BoNT/A에서는 이황화물 가교가 분자 내에, 즉 중쇄의 2 개의 시스테인 잔기들 사이에 존재한다).

생체 내 산 조건 하에서, 순수한 신경독소는 자유형으로 존재하지 않고, 다른 방추형(clostridial) 단백질과 복합체, 이른바 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체를 형성한다. 이 복합체에는, 특히 적혈구를 응집시키는 특성을 갖는 여러 단백질이 들어 있다. 복합체의 조성은 혈청형마다 다르다. 이러한 복합체로의 통합에 의해 신경독소는 위장관을 통과하는 동안 보호된다. 이 방추형 단백질들(복합체를 형성하는 단백질 또는 복합체 단백질)은 신경독소의 재흡수시에도 역할을 한다. 즉, 이러한 복합체로서의 통합은 신경독소가 구강을 통해 생체이용가능하게 하고, 이로써 식중독을 일으키게 한다. 신경독소의 작용 장소는 근육이 신경에 의해 활성화되는 운동 뉴런 말단이다. 운동 뉴런은 근육을 활성화하기 위해 아세틸콜린(acetylcholine)을 방출한다. 보툴리눔 독소는 이 방출을 저지한다. 저지 작용은 3 개의 순차 단계로 실행된다: 결합, 전위(translocation), 단백분해. 보툴리눔 독소의 중쇄는 매우 특이적으로 운동 뉴런에 결합하고, 그 후 세포내이입에 의해 신경 세포내로 수용된다. 중쇄 C 말단에 위치하는 결합 영역의 상부 즉 중쇄의 N 말단에 전위 영역이 있고, 이 전위 영역은 지금까지도 정확히 알려져 있지 않은 기전에 의해 경쇄를 신경세포의 시토졸(cytosol)내로 운반하거나 또는 전위되게 한다. 시토졸에서 경쇄는 소위 SNARE 단백질을 매우 특이적으로 절단하는 프로테아제로 활성화된다. 개별 보툴리눔 독소 타입들의 단백분해 특이성을 표 1에 요약하였다. 이 SNARE 단백질은 아세틸콜린을 적재한 분비 소낭과 운동 뉴런의 세포막이 융합하도록 한다. 이 SNARE 단백질을 단백분해하여 절단하면 융합복합체의 형성 및 더 이상의 아세틸콜린의 방출을 저지한다. 침범된 근육은 더 이상 활성화되지 않는다. 그 전에 과활동성이던 근육들은 마비된다.

[표 1]

보툴리눔 독소 타입	SNARE 단백질 프로테아제 활성 기질	쥐의 SNARE 서열에서 절단 부위
타입 A	SNAP 25	EANQ¹⁹⁷ RATK
타입 B	VAMP 2	GASQ⁷⁶ FETS
타입 C	Syntaxin SNAP 25	DTKK²⁵⁴ AVKY ANQR¹⁹⁸ ATK
타입 D	VAMP 2	RDQK⁶¹ LSED
타입 E	SNAP 25	QIDR¹⁸⁰ IMEK
타입 F	VAMP 2	ERDQ⁶⁰ KLSE
타입 G	VAMP 2	ETSA⁸³ AKLK

이 작용 기전은 아세틸콜린의 제어되지 않은 방출을 특징으로 하는 다수의 디스토니아(dystonia) 및 경련(예컨대 안검 경련, 사경(torticollis), 강직(spasticity))의 치료에 이용된다. 디스토니아를 치료하기 위해 극히 소량의 신경독소(pg 내지 ng 범위)를 과활동성 근육 안으로 주입한다. 신경독소는 운동신경말단쪽으로 확산되고, 뉴런의 시토졸 내에 도달하여 아세틸콜린의 방출을 저지한다. 하루 이틀 후에 근육은 마비된다.

다양한 얼굴 주름은 피부 아래 근육의 경련에 의해, 즉 마찬가지로 아세틸콜린의 제어되지 않은 방출에 의해 생긴다. 보툴리눔 독소는 이와 같은 맥락으로 미용에 응용된다: 극히 소량의 보툴리눔 독소를 주입함으로써 주름살은 약 3 개월 동안 제거될 수 있다.

현재, 보툴리눔 독소를 포함하는 4 가지의 제제가 허가되어 있다: 보톡스^® (Allergan), 제오민^® (Merz), 디스포트^® (Ipsen) 및 뉴로블록^® (Solstice Neurosciences). 보톡스^®, 제오민^® 및 디스포트^®는 보툴리눔 독소 타입 A의 동결 건조물이며(각각 복합체, 신경독소 또는 복합체로서), 보톡스^® 및 제오민^®는 각기 주사 용기당 100 유닛(unit)을 함유하고, 디스포트^®는 500 유닛을 함유한다. 뉴로블록^®은 보툴리눔 독소 B를 포함하며(복합체로서), 액상 포뮬레이션으로 5,000 또는 10,000 유닛을 함유한다.

뉴로블록을 제외한 상기 제제들은 동결 건조물로 존재하며, 이는 식염수로 재구성되어, 제제 및 증상에 따라 맞춰진 복용량으로 해당 근육 안으로 주입된다. 처치된 근육은 48 시간 내에 마비된다. 효과는 약 3 개월 동안 지속하며, 그 후에도 근육이 계속 마비된 상태로 있으려면, 즉 디스토니아가 치료되려면, 추가적으로 주입되어야 한다. 지금까지도 어떤 과정이 이러한 효과 감소를 조절하는지 명확히 규명되지 않았다. 경쇄가 프로테아제로서 활성인 한, 상응하는 SNARE 단백질은 절 단된다(예컨대 신경독소 타입 A의 경쇄에 의해 SNAP 25). 그 결과, 이 조건하에서, 분비성 소낭과 세포막과의 융합 및 이로 인한 아세틸콜린의 방출은 저지되고, 근육은 마비된 상태로 존재한다. 세포 내 경쇄의 프로테아제 활성을 더욱 연장된 시간 동안 유지시킬 수 있다면, 상응하는 약제의 작용 지속시간도 연장될 것이다.

많은 저분자 활성 물질과는 달리, 단백질 활성 물질은 안정성이 매우 낮다. 혈액 순환에서의 반감기는 몇몇의 단백질 활성 물질에서는 예컨대 몇 분이며, 따라서 치료적 작용 지속시간은 매우 제한되고, 짧은 간격 내에 새로이 주입되어야만 한다. 단백질이 분해 및 제거되는 것에서 보호되면 반감기가 연장될 수 있다. 이론적으로 가능한 일 방법은 특히 진핵성 단백질에 대해 존재하는데 더 많이 글리코실화(많은 탄수화물 부분)하고, 탄수화물 구조를 인간 당단백질의 구조에 맞추는 것이다. 일련의 허가된 활성 물질에서 사용된 그외 방법은 단백질을 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 연결하는 것이다. PEG는 다양한 아미노산 잔기, 예컨대 리신 잔기들(아미노 기능기) 또는 시스테인 잔기(SH 기능기)에 공유 결합할 수 있다. PEG는, 작용 물질에 대한 항체의 형성을 유도하는 면역원성 구조를 만들지 않으면서, 단백질의 분자 무게를 증가시킨다. 오히려 페그화(pegylation)는 작용 물질의 면역원성(immunogenicity)을 감소시킨다. 분자 무게가 증가됨으로써 단백질은 보다 느리게 제거되고, 혈청 반감기가 현저히 상승된다. 요구되는 특정 혈청 농도를 유지하기 위해, 약제는 덜 자주 주입되어야 한다.

페그화된 단백질 활성 물질은 이미 몇몇의 허가된 약제에서 가공된바 있다(표 2 참조). 본래 형태 즉, 변형되지 않은 일부 작은 단백질들(예컨대 인터페론α 2a: Mr = 19.3 kD)은 매우 신속하게 혈청에서 제거되었다. 페그화는 분자 무게를 현저히 상승시키고, 이로써 본질적으로 보다 긴 혈청 반감기를 초래한다. 예컨대 인터페론α2의 혈청 반감기는 9 시간인 반면, 40 kD PEG 사슬로 페그화한 경우 분자 무게가 현저히 상승하고 반감기가 9 시간에서 72 시간으로 연장된다.

[표 2]

상품명	출발 작용물질	PEG의 커플링(coupling)
페가시스(Pegasys)	인터페론α2a	분지PEG-N-하이드록시숙산이미드; 4 리신 잔기에 연결
뉴라스타(Neulasta)	G-CSF	PEG 알데히드(aldehyde); N 말단 메티오닌에 연결
페글루트론(Peglutron)	인터페론α2b	숙신이미딜카보네이트-PEG; 히스티딘 및 리신잔기에 연결
소마베스트(Somavest)	성장 호르몬 길항제(antagonist)	4-6 PEG; 리신 잔기 및 N 말단에 연결
온카스파(Oncaspar)	아스파라기나아제	N-하이드록시숙신이미드활성화된 PEG

그러나, 하나 이상의 PEG 사슬과의 연결은 하기 제한에 종속된다:

1. PEG 사슬은 변형 단백질의 생물학적 활성을 (변형되지 않은 자연 그대로의 단백질과 비교하여) 바람직하게는 전혀 감소시키기 않거나 또는 단지 약간 감소시켜야 한다(본 발명에 있어, 변형 단백질의 약간 감소된 생물학적 활성이란 변형되지 않은 자연 그대로의 단백질의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 30-40% 또는 50-70% 또는 심지어 75-95%에 해당하는 생물학적 활성을 말한다). 활성의 감소는 많은 경우에서 용인된다: 예를 들면, 페그화 인터페론의 항바이러스성 활성은 페그화되지 않은 인터페론α2b 활성의 25-35%이다. 심지어 페그화 인터페론α2a는 페그화되지 않은 형태의 활성의 단지 1-7%만을 가질 수도 있다.

2. 치료적으로 이용되는 다수의 단백질은 특정 수용체와의 결합을 통해 작용을 나타내기 때문에, 페그화는 수용체와의 상호 작용에 있어서 바람직하게는 영향을 끼치지 않거나 또는 약간만 영향을 끼쳐야 한다(상호 작용은 예컨대 결합 영역에서 공간 방해에 의해 직접적으로 영향을 받거나 또는 결합 영역에 영향을 주는 따라서 결합에 영향을 주는 단백질의 공간 구조의 변경에 의해 영향을 받을 수 있다).

3. 치료적 단백질의 약물학적 작용이 (또한) 효소 활성을 통해 전달되는 경우(예컨대 아스파라기나아제(asparaginase)의 경우와 같이), 페그화는 효소 활성을 바람직하게는 차단하지 않거나 또는 약간 차단하여야 한다.

보툴리눔 독소의 페그화는 바람직하게는 상기 3 가지 기준을 충족시킨다. 동시에 PEG로의 보툴리눔 독소의 변형은 바람직하게 (a) 중쇄의 결합 영역에도 영향을 끼치지 않으며 (b) 경쇄의 효소 활성에도 영향을 끼치지 않으며, 즉 PEG사슬은 기질(SNARE 단백질)과 경쇄 상의 촉매 영역의 상호 작용을 저지하지 않는다. 짧은 펩티드를 절단하는 다른 프로테아제와 달리, 보툴리눔 독소는 보다 긴 펩티드를 기질로 요구한다. 예를 들면 보툴리눔 독소 타입 B의 기질로 작용하는 펩티드는 바람직하게 SNARE 단백질 VAMP 2의 약 40 개의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 보다 짧은 SNARE 서열을 갖는 펩티드도 절단되기는 하나, 훨씬 더 적은 효율을 갖는다. 약 40 개의 아미노산 잔기의 인식 서열과 유사한 길이를 갖는 보툴리눔 독소의 경쇄 상의 절단 영역은 바람직하게는 PEG 사슬에 의해 영향을 받지 않는다. 게다가 고려할 점은, 기질(SNARE 단백질, 또는 대략 40 개의 아미노산 잔기의 SNARE 서열을 갖 는 펩티드)과 경쇄가 직접 접촉하는 절단 영역 이외에, 촉매 영역에서 원격 위치하는 경쇄 상 서열들을 갖는 부가적 접촉 위치들이 보툴리눔 독소의 최적의 활성을 위해 필요하다는 것이다. 기질 SNAP 25에 대한 5개의 부가적 접촉 위치가 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄 상에 국재화되어 있는 것이 증명되었다: 4α 엑소사이트''(AS 102-113, 310-321, 335-348. 351-358) 및 β 엑소사이트''(AS 242-259). 바람직하게 상기 접촉은 경쇄와 PEG와의 콘쥬게이션에 의해 방해받지 않거나 또는 약간 방해를 받는다. 게다가, 중쇄의 C 말단, 전위 영역은 작동가능하여야 하며, 즉 경쇄가 엔도좀(endosome)으로부터 시토졸(cytosol) 안으로 확실히 수송되어야 한다. 작용을 위해 절대적으로 필요한 이 운반 과정은 페그화된 경쇄의 공간 방해에 의해서 저지될 수 있는데, 특히 전위 영역이 아마도 엔도좀의 막내에 미세한 구멍을 형성하고, 이 구멍을 '부피가 큰' 페그화된 경쇄는 관통할 수 없기 때문이다.

US 특허출원(2002/0197278)에는 보툴리눔 독소에의 PEG의 결합이 기술되어 있다. 이 커플링은 항원성(antigenicity) 또는 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 그리고 분자 무게를 늘려 확산을 감소시키기 위해 사용되었다. 페그화에 적합한 위치(항원 결정기) 또는 아미노산 잔기의 선정은 Bavari et al.의 논문(Vaccine 16: 1850-1856, 1998)을 참조할 수 있다. 이 논문에는 중화 항체를 유도하는 보툴리눔 독소 중쇄 서열들이 개시되어 있다. 상기 특허출원에는 단지 (1)페그화는 중요한 에피토프(epitope)로서 작용하는 위치 그러나 촉매 영역에서는 떨어져 있는(즉, 경쇄로부터 떨어져 있는) 위치에서 또는 이 위치에 가까이 행해져야 하고, (2) PEG는 자유 말단 카복실기 또는 아미노산기 또는 리신(lysine) 측쇄의 아미노산기에 콘쥬게이트될 수 있다고 기술하고 있다. (3) PEG를 독소 안으로 도입하는 그 밖의 수단으로 자연 발생 또는 특별히 삽입된 시스테인 잔기들의 SH기를 사용하는 것이 제안되었으나, 그러나 이때 이 변이체(variant)(3)에 대해 조심해야 하는데, 왜냐하면 보툴리눔 독소의 중쇄와 경쇄 사이의 이황화물 가교는 분자의 공간적 형태에 있어 역할을 하기 때문이다. 페그화된 신경독소의 구조를 나타내는 예, 또는 어떤 아미노산 잔기(들)에 어떤 길이의 PEG 분자들이 부착되는지를 나타내는 예는 제시되어 있지 않다.

지속성의 변경에 관한 그 밖의 특허출원(WO 02/40506)에는, 보툴리눔 독소의 안정성을 선택적으로 높이거나 또는 감소시키기 위해, 보툴리눔 독소에서 생체내 글리코실화, 생체내 인산화 및 무엇보다 생체내 미리스틸화(myristoylation)를 위한 위치(site)의 삽입, 변경 또는 제거가 제안되었다. 이러한 일련의 잠재적인 변형 위치들이 제시되고, 이들은 신경독소 경쇄상에 그 N 및 C 말단에서 상당한 거리를 두고 위치한다. 이를 위해 추가적인 서열들이 폴리펩티드 사슬내 삽입되며, 탄수화물 사슬 또는 인산염 또는 미리스티레이트(myristylate) 부분들이 세포 효소에 의해 경쇄에 연결된다. 그러나, 이에 따라 변형된 신경독소 또는 그 제조는 제시되어 있지 않다.

그 밖에 US 특허출원(2003/0027752)에는, 신경세포 안에서 경쇄의 지속성을 높이기 위하여, 신경독소 내 또는 경쇄 내로 이른바 류신(leucine) 모티브를 갖는 펩티드 잔기(예컨대 XEXXXLL)를 삽입하는 것이 기술되어 있다. 상기 경쇄는 이 모티브를 갖춤으로써, 막에서 기질 가까이에 확실히 국재화될 수 있다. 그외 경쇄 안 으로 삽입된 후 지속성을 높이는 이른바 '티로신 기반 모티브'(YXXHy, Y = 티로신, Hy = 소수성 아미노산)이 개시되어 있다. 최종적으로, 상기 출원은 경쇄가 돌연변이된 변형 보툴리눔 독소 타입 A를 제안하였다(427 위치 및 428위치에서 알라닌에서 류신으로 변경).

상기 기술된 선행기술들을 배경으로 하여 본 발명은 부가적이고 명확히 기술된 모든 혈청형(serotype), 바람직하게는 타입 A, B, 및 C1의 보툴리눔 독소의 안정화 형태를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이에 수반하여, 본 발명은 상응하는 변형되지 않은 보툴리눔 독소와 비교하여 생체내에서 향상된 안정성을 갖는, 자연 보툴리눔 독소의 변종/유사물(analogs)을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 첫째로 보툴리눔 독소 변종/유사물의 생물학적 활성(본 발명에 따르면 생물학적 활성이란 경쇄의 효소 활성/촉매 활성과, 이를 위해 필요한 타겟 세포와 신경독소의 결합 활성, 및 경쇄의 타겟 세포 안으로의 전위활성을 포함하는 전체적인 활성을 말한다)은 기껏해야 약간(상기 정의에 따라) 감소되고, 바람직하게는 전혀 감소되지 않으며, 둘째로 변형에도 불구하고 경쇄가 그 작용 장소인 운동 뉴런의 시토졸내로 전이되는 것을 의미한다.

전술한 US 20020197278과는 달리, 본 출원의 발명은 항원 결정기를 차단하거나 독소의 항원성을 감소시키거나 또는 주입 장소에서 멀리 확산되는 것을 제한하는 것을 목적으로 하지 않는다.

놀랍게도 본 출원의 발명가는, 보툴리눔 독소의 생물학적 활성(상기 정의에 따라)이 손상되지 않거나 또는 전혀 방해받지 않으면서, 하나 이상의 시스테인(cystein) 잔기를 삽입함으로써 보툴리눔 독소의 경쇄의 N 말단을 특이적으로 페그화할 수 있다는 것을 발견하였다. 이렇게 페그화된 보툴리눔 독소는 놀랍게도 높은 생체내 안정성(반감기의 현저한 상승 및 이로써 연장된 (약물학적) 작용 지속시간)을 나타낸다.

환자에 있어 자연 보툴리눔 독소의 (치료적인) 작용 지속시간은 혈청형에 좌우된다. 보툴리눔 타입 A는 약 3 개월의 가장 긴 작용 지속시간을 나타낸다. 보툴리눔 타입 C는 타입 A와 거의 동일한 시간 동안 작용하는 반면, 보툴리눔 타입 B는 그보다 약간 짧게 작용한다. 보툴리눔 타입 E 및 F의 작용 기간은 각기 단지 약 2 주이다. 이 양 타입은 짧은 작용 기간으로 인해 디스토니아를 치료하기 위한 임상에 적용되지 않는다. 본 발명은 (1) 지금까지 단지 단기적인 작용을 나타내는 보툴리눔 독소들을 비롯하여 모든 보툴리눔 독소들을 임상적으로 적용할 수 있게 하고(2) 이미 치료에 이용된 독소들, 즉 타입 A 및 B에 있어 더욱 바람직한 치료를 가능하게 하는데, 왜냐하면 이 보툴리눔 독소들은 더 이상 3개월 마다 투여될 필요가 없고 예컨대 반년마다 투여될 수 있게 된다.

상기 목적(상기 참조)을 달성하기 위해 본 발명자들은 변형 보툴리눔 독소를 개발했다.

따라서, 본 발명의 관점 및 대상은 변형 보툴리눔 독소이며, 이 변형 보툴리눔 독소는 자연 중쇄(natural heavy chain) 및 변형 경쇄(modified light chain)를 포함하고, 이 경쇄의 변형은 (1) 상기 경쇄가 그 N-말단에 사슬(chain)의 연장부(extension)를 가지며, 이 연장부는 N-말단에서 C-말단에로의 방향에서 하기의 구조를 가지며: -(C)_n-(태그)_m-(X)_l-, 이때

C는 시스테인(cystein) 잔기이며,

태그(tag)는 임의의 태그, 예컨대 스트렙-태그(Strep-tag) 또는 히스-태그(His-tag)이고,

X는 자연 발생의 임의의 아미노산의 잔기이며,

n은 1 내지 50 중 어느 하나의 정수(integer)이고,

m은 0 또는 1이며,

l은 0 또는 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고,

(2) 상기 사슬의 연장부 내 하나 이상의 시스테인 잔기가 하나 이상의 PEG사슬에 결합되는 것을 포함한다. 이렇게 변형된 보툴리눔 독소는 하기에서 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소 또는 신경독소라 지칭한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 하기의 조건들이 유효하다:

n = 1, 2 또는 3, m = 0 또는 1, l = 0 또는 l ≠0,

n = 1, m = 1, l = 0; n = 2, m = 1, l = 0; n = 3, m = 1, l = 0;

n = 1, m = 0, l = 0; n = 2, m = 0, l = 0; n = 3, m = 0, l = 0;

n = 1, m = 1, ㅣ≠0; n = 2, m = 1, l ≠0; n = 3, m = 1, l ≠0;

n = 1, m = 0, l ≠0; n = 2, m = 0, l ≠0; n = 3, m = 0, l ≠0,

이때, 분자(molecule)당 독소는 n = 1, 2 또는 3인지에 따라 1 개, 2 개 또는 3 개의 PEG 분자에 결합된다.

그러므로, 바람직하게 경쇄가 하기 중 어느 한 서열을 갖는 사슬 연장부를 갖도록 변형된 보툴리눔 독소(특히 타입 A, B 및 C1)는 본 발명의 전술한 변형 보툴리눔 독소에 속한다:

-(C)₁-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₄- 등등,

상기 열거된 25 개의 바람직한 각 실시형태를 위해 m은 1 대신 0일 수도 있고, 및/또는 각각 상기 경쇄의 연장부에 존재하는 모든 시스테인 잔기들도 페그화된다.

물론, l은 11 내지 50의 모든 임의의 정수일 수 있고, 또는 50을 넘을 수도, 특히 100을 넘을 수도 또는 250을 넘을 수도 있다. l이 커질수록 경쇄는 더욱 길어지며, 경쇄의 길이를 특정 상한으로 하지 않더라도 효소 작용/촉매 작용 또는 신경독소의 생물학적 (전체적인) 활성(상기 정의에 따라)은 위태로와 지지 않는다. 그러나 실용성을 이유로 l의 상한은 10∼20로 하는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 l은 0이며, 0가 아닌 경우에는 l은 바람직하게 1∼10이다.

n도 마찬가지이며, 그 상한은 본 발명에 따르면 오직 실용적인 것과 경제적인 이유로 50에 확정되었다. 너무 많은 PEG 분자를 삽입하지 않도록 또는 삽입해야만 하지 않도록(왜냐하면 삽입된 모든 시스테인 잔기들은 바람직하게 페그화되기 때문이다), 그리고 생성된 페그화 돌연변이 보툴리눔 독소/신경독소에서 상기 정의에 따른 생물학적 활성을 박탈하지 않도록, n은 1∼10의 범위에, 더 좋게는 1∼5의 범위에 있다. 너무 많은 시스테인 잔기들 및 PEG 잔기들이 삽입되거나 잘못된 위치에 삽입되는 경우 생물학적 활성의 박탈이 쉽게 생길 수 있는데, 타겟 세포에 독소가 결합하여도 경쇄가 타겟 세포 내로 전위되지 않을 수 있기 때문이다.

보툴리눔 타입 A의 구조는 Lacy & Stevens에 의해 1998년에 출판되었고(Nat. Struct. Biol. 5, 898-902), 보툴리눔 타입 B의 구조는 Swaninathan & Eswaramoorthy에 의해(Nat. Struct. Biol 7, 693-699(2000) 출판되었다. 따라서 경쇄의 구조도 알려지고, 중쇄 또는 경쇄의 어떤 영역들이 단백질 표면에 놓이는지, PEG과의 결합을 위해 적합한지를 알아낼 수 있다. 자주 선택된 방식, 즉 적합하게 활성화된 PEG(예컨대 PEG 숙신이미딜 프로피오네이트)를 리신(lysine) 잔기들의 ε 아미노 그룹에 결합하는 것은 본 출원의 발명자에게는 성공 가망성이 높은 것으로 여겨지지 않았다. 활성화된 PEG는 수많은 리신(lysine) 잔기, 중쇄의 결합 영역에 있는 리신 잔기와도 반응할 수 있고, 이는 실험적으로 강력한 비활성화를 초래할 수 있다.

그 대신, 본 발명자들은 경쇄의 아미노산 잔기들을 확인했고, 이 아미노산 잔기들은 우선 적어도 하나의 시스테인 잔기에 의해 교환되고, 이후 삽입된 적어도 하나의 시스테인 잔기에서 페그화되는데 적합하였다. 하기에서 더 상세히 그 특성이 기술되는 변형된 이 보툴리눔 독소도 본 발명의 바람직한 형태이며, PEG와 함께 콘쥬게이트(conjugates)로서 충분한 생물학적(효소적인/촉매적인) 활성(상기 생물학적 활성은 본 발명에 따르면 변형되지 않은 단백질의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 30-40% 또는 50-70% 또는 심지어 75-95%에 일치한다) 및 동시에 향상된 안정성(상응하는 자연 그대로의 신경독소와 비교하여)을 갖고, 하기에서도 마찬가지로 본 발명의 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소 또는 신경독소라고 불리운다.

본 발명의 상기 언급된 변형된 보툴리눔 독소는 PEG를 갖는 돌연변이 보툴리눔 독소의 콘쥬게이트(conjugate)이다. 이 변형된 보툴리눔 독소도, 분리되어 도입된 시스테인 잔기들을 통해 PEG에 연결된다. 이를 위해, 상응하는 보툴리눔 독소의 경쇄의 N-말단의 처음 20 개 아미노산 잔기들 중 적어도 하나, 경우에 따라서는 2, 3, 4, 5, 10 또는 심지어 모든 20 개가 각각 시스테인 잔기로 대체된다. 이 변형된 보툴리눔 독소들도 자연 중쇄 및 변형 경쇄를 가지며, 이 경쇄의 변형은, N-말단에 존재하는 자연 발생의 아미노산 잔기 중 하나 이상, 최대한 20 개의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 돌연변이된다. 경우에 따라서는 추가로 N-말단 연장부를 가지며, 따라서 경쇄의 서열은 N-말단에서 C-말단에로의 방향에서 하기의 구조를 가지며: -(태그)_m-(X)_l-BoNT(X1-20C), 이때

C는 시스테인 잔기이고,

태그은 임의의 태그, 예컨대 Strep 태그 또는 His 태그이며,

X는 자연 발생의 임의의 아미노산 잔기이고,

m은 0 또는 1이며,

l은 0 또는 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이다.

N-말단의 최대 20 개 시스테인 잔기들 중 적어도 하나가 적어도 하나의 PEG 사슬에 결합된다.

그러므로, BoNT/A에 대해 하나 이상 20개 이하의 아미노산 잔기가 대체된 것을 특징으로 하는 돌연변이체가 생기며, 따라서, 삽입된 시스테인 잔기들에서 페그화가 행해질 수 있다:

P1C, F2C, V3C, N4C, K5C, Q6C, F7C, N8C, Y9C, K10C, D11C, P12C, V13C, N14C, G15C, V16C, D17C, I18C, A19C, Y20C.

바람직한 실시형태에 따르면 하기의 조건들이 유효하다:

m = 1, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만 대체된다;

m = 0, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만 대체된다;

m = 1, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만 대체된다;

m = 0, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만 대체된다;

m = 1, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6에서의 잔기만 대체된다;

m = 0, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 1, 1 ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 0, 1 ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 1, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 0, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 1, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만 대체된다;

m = 0, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 하나의 시스테인 잔기로 대체되고, 특히 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만 대체되고,

이때 독소는 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기가 (하나의) 시스테인 잔기(들) N-말단에서 대체되었는가에 따라 분자당 1 개 또는 2 개의 PEG 분자에 결합된다.

그러므로, 경쇄가 그의 N-말단에 사슬의 연장부를 갖고, 이때 상기 연장된 사슬은 하기의 서열들 중 하나를 갖는, 바람직한 이 보툴리눔 독소(특히 타입 A, B 및 C1)는 본 발명의 상기 언급된 변형된 보툴리눔 독소에 속한다:

-(태그)₁-(X)₀-BoNT(PIC), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₀-BoNT(K5C),

-(태그)₁-(X)₁-BoNT(PIC), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₁-BoNT(K5C),

-(태그)₁-(X)₂-BoNT(PIC), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₂-BoNT(K5C),

-(태그)₁-(X)₃-BoNT(PIC), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₃-BoNT(K5C),

-(태그)₁-(X)₄-BoNT(PIC), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₄-BoNT(K5C) 등등,

상기 열거된 25 개의 바람직한 각 실시형태를 위해 m은 1 대신 0일 수도 있고, 및/또는 각각 N-말단에 삽입된 모든 시스테인 잔기들은 페그화된다.

하기 설명은 본 발명의 변형된 모든 보툴리눔 독소에 적용되며, 명백히 달리 표시되지 않는 한, 경쇄의 N-말단 연장부 안에 시스테인 잔기/들이 삽입된 변형체이든, 경쇄의 N-말단에 시스테인 잔기/들이 삽입된 변형체이든 관계없이 적용된다.

바람직하게는, 본 발명의 변형 보툴리눔 독소는 BoNT/A, BoNT/B 또는 BoNT/C1에서 유래한 변형 보툴리눔 독소이나 타입 D, E, F 또는 G의 보툴리눔 독소일 수도 있다. 또한 바람직하게는 인공적으로 삽입된 모든 시스테인 잔기들(바람직하게는 1∼10 시스테인 잔기들이 삽입된다)은 적어도 하나의 PEG 사슬을 포함하는 한편, 보툴리눔 독소의 중쇄 및 경쇄에 자연 발생 시스테인 잔기들은 어느 것도 페그화되지 않는다.

태그(m = 1)는 재조합으로(예컨대 E. coli에서) 제조되는 본 발명의 변형 보툴리눔 독소를 보다 쉽게 정제하기 위함임은 본 발명의 전문가들은 쉽게 이해한다. 즉, 태그는 신경독소 또는 상기 신경독소의 생물학적 활성의 안정성을 높이기 위해 필요한 것이 아니라, 박테리아 배양에서 상기 변형 보툴리눔 독소을 간단하게 그리고 거의 정량적인 분리를 허용한다.

n의 적합한 선택(경쇄의 N-말단 연장부 안에 시스테인 잔기/들이 삽입된 변형체의 경우)에 있어서 또는 시스테인 잔기들로 대체되어야 하는 아미노산 잔기들(경쇄의 N-말단에 시스테인 잔기/들이 삽입되는 변형체의 경우)의 수량 및 위치에 있어서, 바람직하게는 페그화가 행해져야만 하는 만큼의 시스테인 잔기가 도입되는 것이 고려되어야 한다(마찬가지로 1 ≠0이고 적어도 하나의 아미노산 잔기 X가 시스테인 잔기인 경우에 적용된다). 이 모든 삽입된 시스테인 잔기는 바람직하게 페그화되며, 완전히 페그화되는데, 놀랍게도 보툴리눔 독소의 중쇄 또는 경쇄(각기 분자 내의 및 분자 사이의 이황화물 가교 이외에 예컨대 보툴리눔 독소 타입 A의 중쇄의 3개의 시스테인 잔기(C₇₉₁, C₉₆₇, C₁₀₆₀) 및 경쇄의 2개의 추가적인 시스테인 잔기(C₁₃₄ 및 C₁₆₅))의 자연발생적 시스테인 잔기는 전혀 페그화되지 않는다. 이러한 식으로, 단일한(균일한) 생성물이 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소의 형태로 수득될 수 있다. 이 이외에, 너무 많은 시스테인 잔기들 및 PEG 잔기들이 잘못된 위치들에 삽입되는 것을 저지하는 것은 또 다른 이유로 인해 의미가 있다. 왜냐하면 (i) 독소는 아마 너무 부피가 커져 타겟 세포에의 결합이 불가능해지고 및/또는 (ii) 경우에 따라 타겟 세포에 독소가 결합됨에도 불구하고 경쇄가 타겟 세포로 전위되지 않거나 또는 충분한 정도로 전위되지 않을 수 있기 때문이다. 달리 말하면, 이 변형 또는 저 변형에서 단 하나의 시스테인 잔기의 도입 및 그 페그화는 본 발명에 따른 목표를 규칙적으로 충족시키고, 그러므로 특히 바람직하다.

결과적으로, 본 발명에 따른 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소/신경독소는 상응하는 자연적인(자연 그대로의) 보툴리눔 독소/신경독소처럼 생물학적으로 및 효소적으로(즉, 촉매적으로) 활성적이고, 또는 상기 정의의 의미에서 기껏해야 아주 약간 감소된 생물학적 및 효소적/촉매적 활성을 가지며, 그러나 유래된 그의 자연 전구체(predecessor) 독소보다 더욱 안정적이며, 부분적으로는 심지어 훨씬 더 안정적이다. 또한 페그화된 돌연변이(변형된) 경쇄는 운동 뉴런의 시토졸 안에서 상응하는 자연 보툴리눔 독소의 변형되지 않은 경쇄보다 더 높은 안정성을 갖는 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소가 바람직하다.

경쇄의 페그화는 상기 기술된 바와 같이, 변형되지 않은 경쇄와 비교하여 향상된 안정성을 초래한다. 즉, 본 발명에 따라 PEG 사슬은 경쇄에 부착되고, 따라서 1. 효소 활성은 변하지 않거나 또는 기껏해야 아주 약간 감소되고(상기 정의에 따르면), 2. 변형된 경쇄는 변형되지 않은 사슬과 마찬가지로 운동 뉴런의 시토줄 안으로 전위된다.

His 태그 및 예컨대 Strep 태그와 같은 다른 태그는 변환된 박테리아(예컨대 E. coli )의 용해물에서 돌연변이 신경독소를 간단하게 분리할 수 있도록 한다. 이들은 DNA 수준에서 가장 간단하게 신경독소 유전자의 코딩 영역에 5' 방향으로 부착된다. His 태그의 경우, 분리는 Ni-NTA-세파로즈상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 행해진다. 이렇게 분리된 돌이변이 신경독소는 다음 단계에서, 활성화된 PEG와 결합된다. Nektar Therapeutics사는 예컨대 PEG-말레이미드(PEG-Maleimide), PEG-비닐설폰(PEG-Vinylsulfon), PEG-아이오드아세타미드(PEG-Iodacetamide) 및 PEG-오르토피리딜디설파이드(PEG-Orthopyridyl disulfide)와 같은 일련의 활성화된 PEG 유도체(derivate) 및 페그화를 위한 사용 설명서를 제공한다. 이 PEG 유도체들은 본 발명에 따르면 상이한 사슬 길이를 가질 수 있다: 예컨대 5000 달톤, 10000 달톤, 20000 달톤 및 30000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 유도체를 구입할 수 있으며, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

돌연변이되고 이후 페그화된 보툴리눔 독소의 프로테아제 활성을 결정하기 위해서, 혈청형에 일치하는 SNARE 단백질의 절단을 정량적으로 파악하였다. 그 후, 활성은 (i) 자연 그대로의 신경독소의(상응하는 혈청형의) 활성, (ii) 간단하게 분리하기 위한 태그를 갖는 돌연변이 신경독소의 활성, 및/또는 (iii) 태그를 갖지 않은 돌연변이 신경독소의 활성과 비교하였다. 본 발명에 따른 돌연변이되고 페그화된 돌연변이 신경독소의 활성은 자연 그대로의(돌연변이되지 않은) 신경독소의 활성과 유사하다(즉, 본 발명에 따른 돌연변이 신경독소 및 변형된 신경독소의 생물학적 활성은 자연 그대로의 신경독소의 생물학적 활성과 비교하여 상기 정의의 의미에서 기껏해야 아주 약간 감소했다).

페그화된 돌연변이 신경독소의 전체적인 활성은 우선 엑스-비보(ex-vivo) 모델에서, 이른바 횡격막 어세이 또는 헤미-횡격막 어세이(hemidiaphragma assay)에서 결정된다. 이 경우, 마비 활성은 신경-근육-제제에서 결정된다. 본 발명에 따르면, 변형된, 즉 돌연변이된 후 페그화된 신경독소의 생물학적 활성은 변형되지 않은 (자연 그대로의) 단백질의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 30-40% 또는 50-70% 또는 심지어 75-95%이다(생물학적 활성은 여기에서도 상기 정의에 따라 이해되어야 한다).

본 발명에 따라 페그화된 돌연변이 신경독소의 독성은 쥐를 사용한 LD₅₀ 어세이에서 검사될 수 있으며, 이때, 복강내 투여 후 쥐 그룹의 절반을 치사시키는 용량이 결정된다.

본 발명에 따라 페그화된 돌연변이 신경독소의 작용 지속 시간은 생체내에서 마찬가지로 쥐를 사용하여 결정된다. 본 발명에 따른 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소 타입 A 또는 이에 상응하는 자연 그대로의 보툴리눔 독소의 치사량 이하의 용량을 뒷다리의 비복근에 주입한 후, 근육 마비 시간을 결정한다. 이때, 마비 강도는 등급으로 분류한다. 작용 지속 시간은, 사람에서보다 쥐에서 더 짧은데, 사용된 변형 보툴리눔 독소 타입 A에 의해 30∼150% 만큼 더 연장되었다(페그화되지 않고 변형되지 않은 보툴리눔 독소 타입 A와 비교하여 측정됨).

본 발명에 따른 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소는 적합한 포뮬레이션(formulation)으로 약제로 가공될 수 있고, 이 약제는 치료적인 복용량(예컨대 주사 1 바이알 당 100 LD₅₀-유닛)의 범위에서의 일 용량(또는 상기 용량의 정수 배)을 포함한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 약학적인 조성물은 인간 혈청 알부민(human serum albumin;HSA)의 첨가 없이 안정화된다. 그러나 인간 혈청 알부민(HSA)과 함께 안정화될 수도 있다. 이와 관련하여 특히 바람직한 것은, WO 2005/007185에 기술되어 있는 바와 같이 단백질 작용 물질을 안정화하기 위한 HSA-프리(HSA-free) 조성물의 사용이다. 그 밖의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 약제 조성물은 동결 건조된(lyophilized) 형태로 또는 액상으로 존재한다. 이들은 모두 경우에 따라 적합한 용매 안에 수용된 후, 치료될 하는 근육에 근육 주사(i.m.)용으로 적합하다.

보다 큰 안정성 및 반감기를 갖는 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소, 또는 상기 보툴리눔 독소를 갖는 약제는 여러 디스토니아(dystonia), 예컨대 경련성 디스토니아(spasmodic dystonia), 후두 디스토니아(laryngeal dystonia), 경부 디스토니아(cervical dystonia), 국소성 손 디스토니아(focal hand dystonia), 안검 경련(blepharospasm), 사시(strabism), 대뇌 마비(cerebral paresis), 안면 경련증(hemifacial spasm), 강직(spasticity), 경련성 대장염(spasmodic colitis), 항문경(anismus), 틱증(TICS), 진전(tremors), 이갈이(bruxism), 항문열창(anal fissure), 이완 불능증(achalasia), 연하 곤란(dysphagia), 다한증(hyperhidrosis)을 치료하기 위해 및 얼굴 주름을 제거하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 그 밖의 관점은 (1) 향상된 안정성을 갖는 상기 기술된 변형된 보툴리눔 독소을 위해 코딩(암호화)하는 핵산(핵산은 특히 DNA이다); (2) (1)에 따른 핵산을 포함하는 벡터; (3) (2)에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다(숙주 세포는 특히 원핵(prokaryotic), 특히 E. coli 숙주 세포이다).

하기의 실시예들은 본 발명을 상세히 설명하고 있으나, 본 발명을 하기의 실시예들에 언급된 특수 파라미터들에 제한하지는 않는다.

도 1은 재조합 독소 및 독소 단편의 클로닝에 이용된 올리고뉴클레오타이드(서열번호:1 내지 14)의 구성을 나타낸 것이다. 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)에 대한 인식 서열에 밑줄이 그어져 있다. 서열번호:16 및 15의 긴 서열들은, 히스티딘 태그(10 개의 히스티딘 잔기들로 구성됨)가 부착된 시스테인 잔기 N 말단을 갖는 재조합(돌이변이 된) 보툴리눔 신경독소 타입 A를 위한 일 예 및 이를 코딩하는 DNA를 나타낸 것이다. 단일 시스트론성으로 발현되고 번역되는 자연 그대로의 독소(위치 1)의 N 말단에서의 프롤린 잔기는 알라닌 잔기로 대체되어 벡터의 다클로닝부위(MCS)에서의 절단 위치를 생성하였다. 벡터는 정확하게 MCS-5' 근접위치에 His 태그 코딩 서열을 포함한다. 이 이외에, 미리 경쇄와 중쇄 사이의 자연 그대로의 루프 위치에 E. coli 세포에 의해 인식되는 서열을 도입하고, 이후 자연 그대로의 전펩타이드(N-경쇄-루프-중쇄-C)는 외인성 프로테아제의 첨가 없이활성 이중 사슬의 신경독소로 절단되고, 신경독소의 재조합형 제조 동안 그대로 유지된다.

도 2는 비환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 내 C-H₁₀-BoNT/A(제 5 실시예)의 대조 배치 및 페그화 배치를 분석 결과이다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 대조 배치; 레인 3: 페그화 배치.

제 1 실시예 : 보툴리눔 신경독소 타입 A( BoNT /A)의 클로닝 및 발현

경쇄 및 전위 영역의 DNA 서열을 클로닝하기 위해, 클로스트리디움 보툴리눔타입 A(균주 ATCC 3502)의 배양에서 염색체 DNA를 분리하였다. 서열: 1 및 서열: 2의 프라이머로 PCR 증폭하여, BoNT/A의 경쇄에 대해 변형된 Loop 서열을 갖는 코딩 유전자 단편을 수득하였다. Nco I 및 Bgl II를 위한 제한 절단 부위를 통해, pQE-6-에서 유래한 것으로 클로닝 사이트 5'-말단에 His 태그(10 개의 히스티딘 잔기로 구성됨)를 코딩하는 발현 플라스미드pQE-H₁₀내로 상기 PCR-증폭 생성물을 클로닝하였다. 이 클로닝 방법으로 플라스미드 pQE-H₁₀-BoNT/A-L을 생성하였다. BoNT/A의 중쇄를 코딩하는 유전자 단편은 서열: 3 및 서열: 4 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을 통해 수득하였다. 이는 Stu I 및 Bgl II를 위한 제한 절단 부위를 통해, pQE-H₁₀-BoNT/A-L 내 경쇄 루프 서열의 3'-말단내로 클로닝하였다(플라스미드 pQE-H₁₀-BoNT/A). E. coli 발현 균주 M15[pREP4] (Qiagen)을 플라스미드 pQE-H₁₀-BoNT/A로 형질전환하였다. 25℃에서 500 μM(최종 농도) IPTG로 단계화 유도(induction)하여 재조합 독소를 발현시켰다. 50 mM 인산염 버퍼 안에서 pH 8.0에서 300 mM NaCl과 함께 리소자임(lysozyme) 및 초음파 처리하여 세포들을 용해시켰다. 용해물을 원심기로 분리하고 실온에서 5 시간 동안 인큐베이션하고, 중간에 -20℃에서 저장한 후 Ni-NTA-아가로스 컬럼상에서 크로마토그라피하였다. 최종적으로, 용출 분획을 결합 (coupling buffer)(100 mM 소듐디하이드로젠포스페이트 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA)에 대해 투석하고, 단백질 농도를 분석하였다. SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 분석한 결과 환원조건하에서는 쿠마시(Coomassie)에 의해 약 50 kD 및 100 kD에서 2 개의 강한 밴드 및 150 kD에서 하나의 약한 밴드가 염색된 반면, 비환원 조건하에서는 대략 150 kD에서 단지 하나의 밴드만이 관찰되었고, 이 밴드는 우세한 이중 사슬의, 이황화물 가교된 구조의 보툴리눔 신경독소 타입 A의 밴드 패턴과 일치하였다.

제 2 실시예 : 보툴리눔 신경독소 타입 B( BoNT /B)의 클로닝 및 발현

N-말단에 히스티딘 태그(10 개의 히스티딘 잔기로 구성됨)를 갖는 보툴리눔 신경독소 타입 B의 클로닝 및 발현은 타입 A 독소와 유사하게 행해졌다. 클로스트리디움 보툴리눔 타입 B(균주 Okra)로부터의 염색체 DNA 및 서열: 5 및 서열: 6 또는 서열: 7 및 서열: 8의 프라이머를 사용하여 경쇄 및 중쇄를 증폭하였다.

제 3 실시예 : 보툴리눔 신경독소 타입 C1 ( BoNT / C1 )의 클로닝 및 발현

N-말단에 히스티딘 태그(10 개의 히스티딘 잔기로 구성됨)를 갖는 보툴리눔 신경독소 타입 C1의 클로닝 및 발현은 타입 A 독소와 유사하게 행해졌다. 클로스트 리디움 보툴리눔 타입 C(균주 205)로부터의 염색체 DNA 및 서열: 9 및 서열: 10 또는 서열: 11 및 서열:12의 프라이머를 사용하여 경쇄 및 중쇄를 증폭하였다.

제 4 실시예 : C- H ₁₀ - BoNT /A의 클로닝 및 발현

N-말단 페그화를 위해, 아미노서열 N-말단에 히스티딘 태그(10 개의 히스티딘 잔기로 구성됨)에 시스테인 잔기를 부착하였다. 이는, His 태그를 코딩하는 pQE-H₁₀-BoNT/A의 서열 영역에 점돌연변이(site-directed mutagenesil)를 통해 수행하였다. 이를 위해, 스트라테이진(Stratagene)사의 QuickChange Site Directed Mutagenesis 키트가 사용되었다. 돌연변이 반응은 서열: 13 및 서열: 14의 프라이머로 수행되었다. DNA 서열 내 뉴클레오티드교환은 분리된 클론의 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. 돌연변이 독소의 발현 및 정제는 제 1 실시예에 개시된 바와 유사 하게 수행하였다.

제 5 실시예 : C- H ₁₀ - BoNT /A의 페그화( pegylation )

이황화물 가교된(disulfide bridged) 이합체(dimer)를 환원하기 위해 1.2 mg C-H₁₀-BoNT/A를 30분 동안 1 mM DTT와 함께 인큐베이션하였다. 환원제를 분리하기 위해, PD-10-칼럼을 통해 커플링 버퍼로 버퍼를 교환하였다. 원심분리하여 독소 용액을 3.6 mg/ml로 농축하였다. 대조 샘플로 소량의 분획은 미처리로 인큐베이션하고, 나머지 용액은 5배의 몰(molar) 과량 mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)과 혼합하여 밤새도록 상온에서 회전시켰다. SDS-PAGE를 위한 샘플 준비 동안 추가적인 시스테인 잔기의 가능한 유도체화 반응을 피하기 위해, 페그화 시약을 5 배 과량의 L-시스테인으로 포화시켰다. SDS 겔상에는 비환원 조건하에서는 대조 배치와 비교하여 약간 감소한 이동성을 갖는 강한 추가적인 밴드가 나타난 반면, 150 kD의 본래의 독소 밴드의 강도는 분명히 감소하였다(도 2).

제 6 실시예 : 생체외 -활성 테스트

페그화된 돌연변이 BoNT/A-유도체의 특이적 프로테아제 활성(즉, 결합 또는 전위가 없는 촉매 활성)을 ELISA 포멧에서 결정하였다. 이를 위해, N-영역의 공통 융합 파터너 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)와 C-말단 펩타이드 서열로 이루어지고, SNAP-25의 C-말단 17 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 클로닝하였다. 이 17 아미노산 잔기들은 BoNT/A가 특이적으로 절단하는 기질 단백질 SNAP-25의 영역을 나타낸다. 마이크로 티터 플레이트를 융합단백질로 코팅한 후, 대조 샘플로서 H₁₀-BoNT/A와 함께, 페그화된 돌연변이체와 함께, 그리고 페그화되지 않은 돌연변이체와 함께 각각 인큐베이션하였다. 각각 발생된 절단 생성물은 새로이 생긴 C-말단을 특이적으로 인식하는 항체로 검출하였다. 페그화되지 않은 H₁₀-BoNT/A 및 페그화된 H₁₀-BoNT/A 및 H₁₀-BoNT/A(참조 샘플)에 대해 얻어진 값들을 표 3에 나타내었다. 어세이의 편차 폭을 고려하면서, 돌연변이 및 후속의 페그화를 도입함으로써 보톨리눔 독소의 촉매 활성은 감소되는 것이 아니라 오히려 더욱 상승됨이 확인되었다.

[표 3]

	상대적인 활성[%]
H₁₀ _-BoNT/A	100
C-H₁₀ _-BoNT/A	100
mPEG-C-H₁₀-BoNT/A	121.1

특이적 활성은 프로테아제-유닛(unit)/ng 단백질에서 결정되었다.

제 7 실시예 : 헤미 -횡격막 어세이에서 엑스-비보 활성의 결정

독소 유도체의 전체적인 활성, 즉 타겟 세포들의 수용체에 대한 변형된 신경독소의 결합 및 신경세포내로의 전이 및 SNARE 기질에 대한 단백분해능을 결정하기 위해, 중독(intoxitication) 후 쥐에서 신경-근육 제제의 마비 시간을 측정하였다. 대조 샘플로는 H₁₀-BoNT/A를 사용하였다. 상대적인 활성 값을 표 4에 나타내었다. 대조 샘플에 비해 본 발명에 따른 변형 보툴리눔 독소의 활성이 20∼30 %로 감소함은 명백히, 타겟 세포들에 대한 독소의 결합 능력 감소 및 타겟 세포내로의 독소의 전위 감소에 기인한다.

[표 4]

	상대적인 활성[%]
H₁₀-BoNT/A	100
C-H₁₀-BoNT/A	22.5
mPEG-C-H₁₀-BoNT/A	30

제 8 실시예 : 페그화된 보툴리눔 독소 타입 A의 작용 기간

페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소(mPEG-C-H₁₀-BoNT/A)의 작용 지속시간은 CD 1 쥐들에서 테스트 되었다. 각기 10 마리의 쥐에 대해 뒷다리의 비복근에 (i) 돌연변이 보툴리눔 독소, (ii) 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소 또는 (iii) 자연 그대로의 보툴리눔 독소를 각각 용량 0.4 또는 0.6 LD₅₀-유닛/쥐(생리학적 식염 용액 + 1 mg/mL HSA)로 근육내 주사(2 x 0.05 mL)하였다. 그 후, 매일 근육의 마비 정도를 등급(최소의 마비, 약한 마비, 심각한 마비)으로 평가하였다. 25일 후, 자연 그대로의 신경독소로 처리된 동물에서는 근육의 마비가 더 이상 관찰되지 않았다. 돌연변이된 보툴리눔 독소 또는 페그화된 돌연변이 보툴리눔 독소로 처리되었던 동물들에서는 작용 지속 시간이 7∼20일 연장되었다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOTECON THERAPEUTICS GMBH <120> PEGYLATED MUTATED CLOSTRIDIUM BOTULINUM TOXIN <130> IP20081203DE <140> <141> <150> EP 06 005 300.6 <151> 2006-03-15 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 accactccat ggcatttgtt aataaacaat ttaat 35 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 accaccagat ctatttaagg ccttggatcc acgcggaact aatgatttag ttttagaagt 60 tattatc 67 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 3 accaccaggc cttaaatgat ttatgtatca aagttaa 37 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 accaccagat ctttacagtg gcctttctcc ccatccatc 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 accactccat ggcagttaca ataaataatt ttaattata 39 <210> 6 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 6 accactaggc cttggatcca cgtggaacca atgatttagt tttagaagtt attatcccac 60 ttttacacat ttgtatctta tatac 85 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 7 accactaggc ctcaggaata tgtattgatg ttga 34 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 8 accaccagat ctttattcag tccacccttc atc 33 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 9 accactccat ggcaataaca attaacaact ttaattattc 40 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 gagaataggc cttggatcca cgcggaacta atgatttagt tttagaagtt attatccctc 60 tatgacaaaa ttttgt 76 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 accactaggc cttagattgt agagagcttt tag 33 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 accaccagat ctttaagaaa taaatttcca aaaagatgaa gttg 44 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 gaggagaaat taactatggg atgtggatcg catcaccatc ac 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 gtgatggtga tgcgatccac atcccatagt taatttctcc tc 42 <210> 15 <211> 3939 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> mutiertes Botulinum-Neurotoxin Typ A <400> 15 atgggatgtg gatcgcatca ccatcaccac catcatcacc atcactccat ggcatttgtt 60 aataaacaat ttaattataa agatcctgta aatggtgttg atattgctta tataaaaatt 120 ccaaatgcag gacaaatgca accagtaaaa gcttttaaaa ttcataataa aatatgggtt 180 attccagaaa gagatacatt tacaaatcct gaagaaggag atttaaatcc accaccagaa 240 gcaaaacaag ttccagtttc atattatgat tcaacatatt taagtacaga taatgaaaaa 300 gataattatt taaagggagt tacaaaatta tttgagagaa tttattcaac tgatcttgga 360 agaatgttgt taacatcaat agtaagggga ataccatttt ggggtggaag tacaatagat 420 acagaattaa aagttattga tactaattgt attaatgtga tacaaccaga tggtagttat 480 agatcagaag aacttaatct agtaataata ggaccctcag ctgatattat acagtttgaa 540 tgtaaaagct ttggacatga agttttgaat cttacgcgaa atggttatgg ctctactcaa 600 tacattagat ttagcccaga ttttacattt ggttttgagg agtcacttga agttgataca 660 aatcctcttt taggtgcagg caaatttgct acagatccag cagtaacatt agcacatgaa 720 cttatacatg ctggacatag attatatgga atagcaatta atccaaatag ggtttttaaa 780 gtaaatacta atgcctatta tgaaatgagt gggttagaag taagctttga ggaacttaga 840 acatttgggg gacatgatgc aaagtttata gatagtttac aggaaaacga atttcgtcta 900 tattattata ataagtttaa agatatagca agtacactta ataaagctaa atcaatagta 960 ggtactactg cttcattaca gtatatgaaa aatgttttta aagagaaata tctcctatct 1020 gaagatacat ctggaaaatt ttcggtagat aaattaaaat ttgataagtt atacaaaatg 1080 ttaacagaga tttacacaga ggataatttt gttaagtttt ttaaagtact taacagaaaa 1140 acatatttga attttgataa agccgtattt aagataaata tagtacctaa ggtaaattac 1200 acaatatatg atggatttaa tttaagaaat acaaatttag cagcaaactt taatggtcaa 1260 aatacagaaa ttaataatat gaattttact aaactaaaaa attttactgg attgtttgaa 1320 ttttataagt tgctatgtgt aagagggata ataacttcta aaactaaatc attagttccg 1380 cgtggatcca aggccttaaa tgatttatgt atcaaagtta ataattggga cttgtttttt 1440 agtccttcag aagataattt tactaatgat ctaaataaag gagaagaaat tacatctgat 1500 actaatatag aagcagcaga agaaaatatt agtttagatt taatacaaca atattattta 1560 acctttaatt ttgataatga acctgaaaat atttcaatag aaaatctttc aagtgacatt 1620 ataggccaat tagaacttat gcctaatata gaaagatttc ctaatggaaa aaagtatgag 1680 ttagataaat atactatgtt ccattatctt cgtgctcaag aatttgaaca tggtaaatct 1740 aggattgctt taacaaattc tgttaacgaa gcattattaa atcctagtcg tgtttataca 1800 tttttttctt cagactatgt aaagaaagtt aataaagcta cggaggcagc tatgttttta 1860 ggctgggtag aacaattagt atatgatttt accgatgaaa ctagcgaagt aagtactacg 1920 gataaaattg cggatataac tataattatt ccatatatag gacctgcttt aaatataggt 1980 aatatgttat ataaagatga ttttgtaggt gctttaatat tttcaggagc tgttattctg 2040 ttagaattta taccagagat tgcaatacct gtattaggta cttttgcact tgtatcatat 2100 attgcgaata aggttctaac cgttcaaaca atagataatg ctttaagtaa aagaaatgaa 2160 aaatgggatg aggtctataa atatatagta acaaattggt tagcaaaggt taatacacag 2220 attgatctaa taagaaaaaa aatgaaagaa gctttagaaa atcaagcaga agcaacaaag 2280 gctataataa actatcagta taatcaatat actgaggaag agaaaaataa tattaatttt 2340 aatattgatg atttaagttc gaaacttaat gagtctataa ataaagctat gattaatata 2400 aataaatttt tgaatcaatg ctctgtttca tatttaatga attctatgat cccttatggt 2460 gttaaacggt tagaagattt tgatgctagt cttaaagatg cattattaaa gtatatatat 2520 gataatagag gaactttaat tggtcaagta gatagattaa aagataaagt taataataca 2580 cttagtacag atataccttt tcagctttcc aaatacgtag ataatcaaag attattatct 2640 acatttactg aatatattaa gaatattatt aatacttcta tattgaattt aagatatgaa 2700 agtaatcatt taatagactt atctaggtat gcatcaaaaa taaatattgg tagtaaagta 2760 aattttgatc caatagataa aaatcaaatt caattattta atttagaaag tagtaaaatt 2820 gaggtaattt taaaaaatgc tattgtatat aatagtatgt atgaaaattt tagtactagc 2880 ttttggataa gaattcctaa gtattttaac agtataagtc taaataatga atatacaata 2940 ataaattgta tggaaaataa ttcaggatgg aaagtatcac ttaattatgg tgaaataatc 3000 tggactttac aggatactca ggaaataaaa caaagagtag tttttaaata cagtcaaatg 3060 attaatatat cagattatat aaacagatgg atttttgtaa ctatcactaa taatagatta 3120 aataactcta aaatttatat aaatggaaga ttaatagatc aaaaaccaat ttcaaattta 3180 ggtaatattc atgctagtaa taatataatg tttaaattag atggttgtag agatacacat 3240 agatatattt ggataaaata ttttaatctt tttgataagg aattaaatga aaaagaaatc 3300 aaagatttat atgataatca atcaaattca ggtattttaa aagacttttg gggtgattat 3360 ttacaatatg ataaaccata ctatatgtta aatttatatg atccaaataa atatgtcgat 3420 gtaaataatg taggtattag aggttatatg tatcttaaag ggcctagagg tagcgtaatg 3480 actacaaaca tttatttaaa ttcaagtttg tataggggga caaaatttat tataaaaaaa 3540 tatgcttctg gaaataaaga taatattgtt agaaataatg atcgtgtata tattaatgta 3600 gtagttaaaa ataaagaata taggttagct actaatgcat cacaggcagg cgtagaaaaa 3660 atactaagtg cattagaaat acctgatgta ggaaatctaa gtcaagtagt agtaatgaag 3720 tcaaaaaatg atcaaggaat aacaaataaa tgcaaaatga atttacaaga taataatggg 3780 aatgatatag gctttatagg atttcatcag tttaataata tagctaaact agtagcaagt 3840 aattggtata atagacaaat agaaagatct agtaggactt tgggttgctc atgggaattt 3900 attcctgtag atgatggatg gggagaaagg ccactgtaa 3939 <210> 16 <211> 1312 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mutiertes Botulinum-Neurotoxin Typ A <400> 16 Met Gly Cys Gly Ser His His His His His His His His His His Ser 1 5 10 15 Met Ala Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 20 25 30 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro 35 40 45 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 50 55 60 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 65 70 75 80 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 85 90 95 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 100 105 110 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 115 120 125 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 130 135 140 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 145 150 155 160 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 165 170 175 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 180 185 190 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 195 200 205 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 210 215 220 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 225 230 235 240 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 245 250 255 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 275 280 285 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 290 295 300 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 305 310 315 320 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 325 330 335 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 340 345 350 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 355 360 365 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 370 375 380 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 385 390 395 400 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 405 410 415 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 420 425 430 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 435 440 445 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys 450 455 460 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 465 470 475 480 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 485 490 495 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 500 505 510 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 515 520 525 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 530 535 540 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 565 570 575 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 580 585 590 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 595 600 605 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 610 615 620 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 625 630 635 640 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 645 650 655 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 660 665 670 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 675 680 685 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 690 695 700 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 705 710 715 720 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 725 730 735 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 740 745 750 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 755 760 765 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 770 775 780 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 785 790 795 800 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 805 810 815 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 820 825 830 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 835 840 845 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 850 855 860 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 865 870 875 880 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 885 890 895 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 900 905 910 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 915 920 925 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 930 935 940 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 945 950 955 960 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 965 970 975 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 980 985 990 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 995 1000 1005 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile 1010 1015 1020 Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn 1025 1030 1035 Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp 1040 1045 1050 Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn 1055 1060 1065 Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile 1070 1075 1080 Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys 1085 1090 1095 Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu 1100 1105 1110 Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr 1115 1120 1125 Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn 1130 1135 1140 Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser 1145 1150 1155 Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly 1160 1165 1170 Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn 1175 1180 1185 Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys 1190 1195 1200 Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val 1205 1210 1215 Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu 1220 1225 1230 Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr 1235 1240 1245 Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile 1250 1255 1260 Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val 1265 1270 1275 Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr 1280 1285 1290 Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly 1295 1300 1305 Glu Arg Pro Leu 1310

Claims

자연 중쇄 및 변형 경쇄를 포함하는 변형 보툴리눔 독소로서,

상기 경쇄의 변형은

(i) N-말단에 사슬의 연장부를 가지며, 이 연장부는 N-말단에서 C-말단에로의 방향에서 -(C)_n-(태그)_m-(X)_l- 구조를 가지며,

상기 C는 시스테인 잔기이며,

상기 태그는 임의의 태그이고,

상기 X는 자연 발생의 임의의 아미노산의 잔기이며,

n은 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고,

m은 0 또는 1이며,

l은 0 또는 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고,

(ii) 상기 사슬의 연장부 내 하나 이상의 시스테인 잔기가 하나 이상의 PEG사슬에 결합되는 것임을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
자연 중쇄 및 변형 경쇄를 갖는 변형 보툴리눔 독소로서,

상기 경쇄의 변형은,

(i) N-말단에 존재하는 자연 아미노산 중 하나 이상의 아미노산 잔기, 최대 20 개의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 돌연변이 되고,

(ii) 경우에 따라 추가적인 N 말단 연장부를 가지며, 따라서 상기 경쇄의 서열은 N-말단에서 C-말단에로의 방향에서 -(태그)_m-(X)_l-BoNT(X1-20C) 구조를 가지며,

상기 C는 시스테인 잔기이며,

상기 태그는 임의의 태그이고,

상기 X는 자연 발생의 임의의 아미노산의 잔기이며,

m은 0 또는 1이며,

l은 0 또는 1 내지 50 중 어느 하나의 정수이고,

(iii) 상기 N 말단의 최대 20 개의 시스테인 잔기들 중 하나 이상이 하나 이상의 PEG 사슬에 결합되는 것임을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

보툴리눔 독소의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 자연 발생 시스테인 잔기들 중 어느 것도 페그화되지 않는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 태그는 히스-태그(His-태그) 또는 스트렙 태그(strep-태그)인 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소는 타입 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 보툴리눔 독소이며, 하기의 조건들이 유효하고:

(a) n = 1, 2 또는 3, m = 0 또는 1, l = 0 또는 l ≠0,

(b) n = 1, m = 1, l = 0; n = 2, m = 1, l = 0; n = 3, m = 1, l = 0;

(c) n = 1, m = 0, l = 0; n = 2, m = 0, l = 0; n = 3, m = 0, l = 0;

(d) n = 1, m = 1, l ≠0; n = 2, m = 1, l ≠0; n = 3, m = 1, l ≠0;

(e) n = 1, m = 0, l ≠0; n = 2, m = 0, l ≠0; n = 3, m = 0, l ≠0,

이때, 독소는 n = 1, 2 또는 3인지에 따라 분자당 1 개, 2 개 또는 3 개의 PEG 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항에 있어서,

상기 경쇄의 연장부는 하기의 서열들 중 하나를 가지며:

-(C)₁-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₄-,

상기 25 개의 각 서열에 있어서 m은 0일 수도 있거나, 또는 각각 상기 경쇄의 연장부의 모든 시스테인 잔기들이 페그화되는 것을 특징으로 하는, 변형 보툴리눔 독소.
제1항에 있어서,

상기 경쇄의 연장부는 하기의 서열들 중 하나를 가지며:

-(C)₁-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₀-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₁-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₂-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₃-,-(C)₁-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₂-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₃-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₄-(태그)₁-(X)₄-,-(C)₅-(태그)₁-(X)₄-,

상기 25 개의 각 서열에 있어서 m은 0일 수도 있고, 그리고 각각 상기 경쇄의 연장부의 모든 시스테인 잔기들이 페그화되는 것을 특징으로 하는, 변형 보툴리눔 독소.
제2항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소는 타입 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 보툴리눔 독소이며, 하기의 조건들이 유효하고:

(a) m = 1, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(b) m = 0, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(c) m = 1, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(d) m = 0, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 하나만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(e) m = 1, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(f) m = 0, l = 0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(g) m = 1, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 시스테인 잔기로 대체됨;

(h) m = 0, l ≠0, 20 개의 N-말단 아미노산 잔기들 중 단지 2 개만이 시스테인 잔기로 대체됨;

이때, 독소는 1 개 또는 2 개의 시스테인 잔기가 N-말단에 도입되었는 지에 따라 분자당 1 개 또는 2 개의 PEG 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제8항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소는 타입 A, B, C1, D, E, F 또는 G의 보툴리눔 독소이며, 하기의 조건들이 유효하고:

(a) m = 1, l = 0, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만이 하나의 시스테인 잔기로 대체됨;

(b) m = 0, l = 0, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만이 하나의 시스테인 잔기로 대체됨;

(c) m = 1, l ≠0, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만이 하나의 시스테인 잔기로 대체됨;

(d) m = 0, l ≠0, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 잔기만이 하나의 시스테인 잔기로 대체됨;

(e) m = 1, l = 0, 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(f) m = 0, l = 0, 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(g) m = 1, l ≠0, 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(h) m = 0, l ≠0, 위치 1 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 또는 4 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(i) m = 1, l = 0, 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(j) m = 0, l = 0, 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(k) m = 1, l ≠0, 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

(l) m = 0, l ≠0, 위치 1 및 2, 2 및 3, 3 및 4, 4 및 5, 또는 5 및 6의 잔기만이 2 개의 시스테인 잔기로 대체됨;

이때, 독소는 1 개 또는 2 개의 시스테인 잔기가 N-말단에 도입되었는 지에 따라 분자당 1 개 또는 2 개의 PEG 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제2항에 있어서,

상기 변형 보툴리눔 독소는, 그 경쇄가 N-말단에 사슬 연장부를 가지며, 이때 상기 연장된 사슬의 N-말단은 하기의 서열들 중 하나를 갖도록 변형된 보툴리눔 독소이고:

(a) -(태그)₁-(X)₀-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₀-BoNT(K5C),

(b) -(태그)₁-(X)₁-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₁-BoNT(K5C),

(c) -(태그)₁-(X)₂-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₂-BoNT(K5C),

(d) -(태그)₁-(X)₃-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₃-BoNT(K5C),

(e) -(태그)₁-(X)₄-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₄-BoNT(K5C),

상기 열거된 25 개의 바람직한 각 실시형태를 위해 m은 1 대신 0일 수도 있거나, 또는 각각 N-말단에 도입된 모든 시스테인 잔기들이 페그화되는 것을 특징으로 하는, 변형 보툴리눔 독소.
제2항에 있어서,

상기 변형 보툴리눔 독소는, 그 경쇄가 N-말단에 사슬 연장부를 가지며, 이때 상기 연장된 사슬의 N-말단은 하기의 서열들 중 하나를 갖도록 변형된 보툴리눔 독소이고:

(a) -(태그)₁-(X)₀-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₀-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₀-BoNT(K5C),

(b) -(태그)₁-(X)₁-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₁-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₁-BoNT(K5C),

(c) -(태그)₁-(X)₂-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₂-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₂-BoNT(K5C),

(d) -(태그)₁-(X)₃-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₃-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₃-BoNT(K5C),

(e) -(태그)₁-(X)₄-BoNT(P1C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(F2C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(V3C), -(태그)₁-(X)₄-BoNT(N4C), (태그)₁-(X)₄-BoNT(K5C),

상기 열거된 25 개의 바람직한 각 실시형태를 위해 m은 1 대신 0일 수도 있고, 그리고 각각 N-말단에 도입된 모든 시스테인 잔기들이 페그화되는 것을 특징으로 하는, 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 보툴리눔 독소는 타입 A, B 또는 C1의 보툴리눔 독소인 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 변형 보툴리눔 독소는 상응하는 자연적인(변형되지 않은, 자연 그대로의) 보툴리눔 독소의 생물학적 활성의 20% 이상의 생물학적 활성을 가지며, 또한 상기 자연적인 보툴리눔 독소에 비해 향상된 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제13항에 있어서,

상기 변형 보툴리눔 독소는 상응하는 자연적인(변형되지 않은, 자연 그대로의) 보툴리눔 독소의 생물학적 활성의 30-40%, 50-70% 또는 75-95%의 생물학적 활성을 가지며, 또한 상기 자연적인 보툴리눔 독소에 비해 향상된 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 변형된 경쇄는 생체내에서 운동 뉴런의 시토졸내로 전위되는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 변형 경쇄는 운동 뉴런의 시토졸 안에서 상응하는 자연 그대로의 보툴리눔 독소보다 높은 안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 변형 보툴리눔 독소.
제1항 또는 제2항에 따른 변형 보툴리눔 독소를 포함하는, 디스토니아 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 조성물은 인간 혈청 알부민(HSA)의 첨가 없이 안정화되는, 디스토니아 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 조성물은 동결 건조된 형태 또는 액상으로 존재하며, 경우에 따라 적합한 용매 안에 수용된 후 근육 주사(i.m)에 적합하게 된 것인, 디스토니아 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 디스토니아는 경련성 디스토니아, 후두 디스토니아, 경부 디스토니아, 국소성 손(hand) 디스토니아, 안검 경련, 사시, 대뇌 마비, 안면 경련증, 강직, 경련성 대장염, 항문경, 틱증(TICS), 진전, 이갈이, 항문열창, 이완 불능증, 연하 곤란 또는 다한증인, 디스토니아 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 변형 보툴리눔 독소를 포함하는, 얼굴 주름 제거용 화장품 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 변형 보툴리눔 독소를 코딩하는 핵산.
제22항에 있어서,

상기 핵산이 DNA인 핵산.
제22항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제24항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제25항에 있어서,

상기 숙주 세포는 원핵(prokaryotic) 세포인 숙주 세포.
제26항에 있어서,

상기 숙주 세포는 E. coli 세포인 숙주 세포.