ES2334283T3

ES2334283T3 - Toxina mutada y pegilada de clostridium botelinum.

Info

Publication number: ES2334283T3
Application number: ES07723281T
Authority: ES
Inventors: Jurgen Frevert; Volker Specht
Original assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Current assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2007-03-15
Publication date: 2010-03-08
Anticipated expiration: 2027-03-15
Also published as: JP5232021B2; BRPI0708907A2; WO2007104567A3; RU2426739C2; EP1994048B1; AU2007224669A1; US20150166977A1; RU2008140368A; JP2009531026A; US8912140B2; IL193777A; US20110294747A1; US8298550B2; US20090118193A1; HK1128929A1; AU2007224669B2; IL193777A0; CN101432296B; KR101454273B1; US20130156747A1

Abstract

Toxina botulínica modificada que presenta una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, caracterizada porque la modificación de la cadena ligera consiste en que (a) (i) esta presenta en su extremo N un alargamiento de la cadena que tiene la estructura, -(C)n-(tag)m-(X)k-, en la dirección del extremo N al extremo C y (ii) al menos uno de los restos de cisteína en el alargamiento de la cadena está acoplado a al menos una cadena de PEG, o en que (b) al menos un resto de aminoácido y como máximo 20 restos de aminoácido de los restos de aminoácido que se hallan naturalmente en su extremo N está/n mutado/s en un resto de cisteína, estando al menos uno de los, como máximo, 20 restos de cisteína en el extremo N acoplado a al menos una cadena de PEG y la cadena ligera, dado el caso, presenta adicionalmente un alargamiento N-terminal, de modo que la secuencia de la cadena ligera tiene la estructura -(tag)m-(X)k-BoNT(X1-20C), en la dirección del extremo N al extremo C, en la que C representa un resto de cisteína tag representa una marca cualquiera y X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural; en la que n es un número entero de 1 a 50; en la que m = 0 o m = 1 y k = 0 o k es un número entero de 1 a 50.

Description

Toxina mutada y pegilada de Clostridium botulinum.

La presente invención se refiere a toxinas botulínicas (BoNT) modificadas que, en comparación con las correspondientes toxinas botulínicas nativas, presentan una mayor estabilidad y, por lo tanto, una duración prolongada del efecto terapéutico. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen estas toxinas botulínicas modificadas. Finalmente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican estas toxinas botulínicas modificadas.

Antecedentes de la invención

Clostridium botulinum es una bacteria formadora de esporas de crecimiento anaerobio, que forma una proteína de alta toxicidad. Esta, así denominada, toxina botulínica es la causa del botulismo, una intoxicación alimentaria que, sin la aplicación de medidas médicas intensivas, puede conducir a la muerte del paciente de botulismo. Se distinguen siete serotipos (tipos A-G, abreviados como BoNT/A, BoNT/B, etc.), que tienen una secuencia de aminoácidos similar pero inducen una respuesta de anticuerpos diferente. Las toxinas (denominadas también neurotoxinas y toxinas botulínicas en lo sucesivo) constan de dos cadenas funcionales, la cadena ligera (\sim50 kDa) y la cadena pesada (\sim100 kDa), que en algunas cepas de clostridios se producen por escisión proteolítica de la proteína precursora de una sola cadena. Otras cepas no disponen de la correspondiente proteasa y, por lo tanto, la escisión en las dos cadenas tiene lugar solamente en el tracto gastrointestinal del paciente (por ejemplo, mediante tripsina). En la forma de dos cadenas, las dos subunidades (es decir, las cadenas pesada y ligera) están unidas mediante un puente disulfuro (además, en BoNT/A, por ejemplo, hay un puente disulfuro intramolecular, es decir, entre dos restos de cisteína de la cadena pesada).

Las neurotoxinas puras no se hallan libres en condiciones ácidas in vivo, sino que forman complejos con otras proteinas clostrídicas, los así denominados complejos de toxinas (Clostridium botulinum). En estos complejos participan distintas proteínas, por ejemplo, con propiedades hemoaglutinantes. La composición de los complejos es diferente entre serotipos. La integración en un complejo protege la neurotoxina a su paso por el tracto gastrointestinal. Posiblemente, estas otras proteínas clostrídicas (las proteínas complejantes o bien las proteínas del complejo) desempeñan también un papel en la resorción de la neurotoxina. Así, la incorporación en el complejo consigue que la neurotoxina sea biodisponible por vía oral y por lo tanto sea una toxina alimentaria. El sitio de acción de la neurotoxina se halla en la placa motora terminal, donde el nervio activa el músculo. La motoneurona segrega acetilcolina para la activación del músculo. La toxina botulínica impide esta segregación. El efecto inhibidor de la neurotoxina se lleva a cabo en tres etapas secuenciales: unión, translocación, proteolisis. La cadena pesada de la toxina botulínica se une a la motoneurona con gran especificidad y a continuación es absorbida por la célula nerviosa en endosomas. El dominio de translocación se encuentra en la región N-terminal de la cadena pesada, delante del dominio de unión que se encuentra localizado en el extremo C de la cadena pesada, y transporta o bien hace posible la translocación de la cadena ligera en el citosol de la célula nerviosa por un mecanismo que no se conoce exactamente hasta ahora. La cadena ligera se activa como proteasa en el citosol, escindiendo de manera muy específica las proteínas denominadas SNARE. La especificidad proteolítica de cada tipo de toxina botulínica se resume en la tabla 1. Estas proteínas SNARE son responsables de la fusión de las vesículas secretoras cargadas con acetilcolina con la membrana celular de la motoneurona. La escisión proteolítica de una de estas proteínas SNARE impide la formación de un complejo de fusión y, por tanto, la segregación
posterior de acetilcolina. El músculo afectado ya no se activa. Los músculos previamente hiperactivos se paralizan.

TABLA 1

1

Este mecanismo de acción se aprovecha en la terapia de numerosas distonías o bien espasmos que se caracterizan por una segregación incontrolada de acetilcolina (por ejemplo, blefaroespasmo, tortícolis, espasticidad). Para la terapia de la distonía se inyectan cantidades extremadamente bajas de la neurotoxina (en el intervalo de pg hasta ng) en los músculos hiperactivos. La neurotoxina se difunde hasta la placa motora terminal y alcanza el citosol de la neurona para impedir allí la secreción de la acetilcolina. Después de 1-2 días el músculo queda paralizado.

Diversas arrugas faciales se producen por el agarrotamiento de músculos que se encuentran bajo la piel, es decir, asimismo por una secreción irregular de acetilcolina. Aquí es donde las toxinas botulínicas tienen su aplicación cosmética: mediante la inyección de cantidades extremadamente pequeñas de la toxina botulínica pueden eliminarse las arrugas durante 3 meses, aproximadamente.

En la actualidad hay cuatro preparados que contienen la toxina botulínica autorizados legalmente como medicamentos: Botox® (Allergan), Xeomin® (Merz), Dysport® (Ipsen) y NeuroBloc® (Solstice Neurosciences). Botox®, Xeomin® y Dysport® son liofilizados de la toxina botulínica de tipo A (como complejo, neurotoxina o bien complejo), Botox® y Xeomin®, con 100 unidades por vial de inyección, respectivamente, Dysport® con 500 unidades. NeuroBloc® contiene la toxina botulínica de tipo B (como complejo) con 5.000 o bien 10.000 unidades en una formulación líquida.

Con la excepción de NeuroBloc, los preparados se presentan como liofilizados, que se reconstituyen con disolución salina y se inyectan en los músculos afectados en las dosis adecuadas según el preparado y la indicación. El músculo tratado se paraliza en el plazo de 48 h. El efecto dura 3 meses, aproximadamente, después debe realizarse otra inyección en caso de que el músculo deba continuar paralizado, es decir, deba seguir tratándose la distonía. Hasta ahora no se ha aclarado definitivamente qué procesos controlan la disminución del efecto. Mientras la cadena ligera esta activa como proteasa, se escinde la proteína SNARE correspondiente (por ejemplo SNAP 25 por la cadena ligera de la neurotoxina de tipo A). Como consecuencia, en estas condiciones se impide la fusión de las vesículas setretoras con la membrana plasmática y, por lo tanto, la secreción de acetilcolina, el músculo permanece paralizado. Si se consiguiera mantener la actividad proteasa de la cadena ligera en la célula por un tiempo prolongado, también se prolongaría de este modo la duración del efecto de un medicamento correspondiente.

A diferencia de muchos principios activos de bajo peso molecular, los principios activos proteínicos se caracterizan por una estabilidad considerablemente inferior. La semivida de algunos principios activos proteínicos en la circulación sanguínea es, por ejemplo, de solo unos pocos minutos, de modo que la duración del efecto (terapéutico) es muy limitada y es necesario inyectar de nuevo a cortos intervalos de tiempo. La semivida puede prolongarse si se consigue proteger la proteína contra los procesos de degradación y eliminación. Un modo teóricamente posible, en particular para proteínas eucarióticas, consiste en una mayor glicosilación (más restos de hidratos de carbono) o bien en adaptar las estructuras de hidratos de carbono a las estructuras de las glicoproteínas humanas. Otro modo, que ha sido aplicado para una serie de principios activos autorizados, consiste en enlazar la proteína con polietilenglicol (PEG). El PEG puede unirse covalentemente a los restos de distintos aminoácidos, por ejemplo, a restos de lisina (función amino) o de cisteína (función SH). El PEG incrementa el peso molecular de la proteína sin que se generen estructuras inmunogénicas que induzcan la formación de anticuerpos contra el principio activo. Por el contrario: la PEGilación reduce la inmunogenicidad del principio activo. Debido al aumento del peso molecular, la proteína se elimina más lentamente y se consigue un claro aumento de la semivida en el suero. El medicamento debe inyectarse con menor frecuencia para mantener un determinado nivel requerido en el suero.

Los principios activos proteínicos PEGilados se procesan ya para obtener algunos medicamentos autorizados (véase la tabla 2). El empleo de, en parte, proteínas pequeñas (por ejemplo, interferón \alpha 2a: Mr = 19,3 kDa) en la forma nativa, es decir, sin modificar, había demostrado que estas proteínas se eliminan del suero con gran rapidez. La PEGilación resultó en un peso molecular claramente mayor y, por lo tanto, en una semivida en el suero considerablemente más larga. Así, por ejemplo, la semivida en suero para el interferón \alpha 2a es de 9 h, la PEGilación con una cadena de PEG de 40 kDa aumenta drásticamente el peso molecular y prolonga la semivida de 9 a 72 h.

TABLA 2

2

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Sin embargo, el enlace a una o varias cadenas de PEG está sometido a limitaciones:

1. La cadena de PEG no reduce o solo reduce mínimamente la actividad biológica de la proteína modificada (en comparación con la proteína nativa sin modificar) (como actividad biológica de la proteína modificada mínimamente reducida se entiende según la invención una actividad biológica de la proteína modificada que corresponde, al menos, al 20%, preferentemente al 30-40% o al 50-70% o incluso al 75-95% de la actividad biológica de la proteína nativa sin modificar). Sin embargo, una actividad reducida es perfectamente tolerable en muchos casos: la actividad antivírica del interferón PEGilado es, por ejemplo, del 25-35% de la actividad de un interferón \alpha 2a sin PEGilar. El interferón \alpha 2a PEGilado incluso, tiene solamente el 1-7% de la actividad de la forma sin PEGilar.

2. Dado que numerosas proteínas empleadas terapéuticamente desarrollan su efecto a través de la unión a un receptor específico, preferentemente, la PEGilación no influye o solo influye mínimamente en la interacción con el receptor (la interacción puede ser perjudicada, por ejemplo, por impedimento estérico directamente en el dominio de unión o por cambios en la estructura espacial de la proteína que repercuten en el dominio de unión y, por tanto, en la unión).

3. En caso de que el efecto farmacológico de la proteína terapéutica se ejerza (también) a través de una actividad enzimática (por ejemplo, como en el caso de la asparraginasa), preferentemente, la PEGilación no reduce la actividad enzimática o la reduce solo mínimamente.

Preferentemente, la PEGilación de la toxina botulínica satisface estos tres criterios. A este respecto, preferentemente la modificación de la toxina botulínica con PEG no influye ni (a) en el dominio de unión de la cadena pesada ni (b) en la actividad enzimática de la cadena ligera, es decir, preferentemente, la cadena de PEG no inhibe la interacción del dominio catalítico de la cadena ligera con el sustrato (proteína SNARE). A diferencia de otras proteasas que escinden péptidos cortos, las toxinas botulínicas requieren péptidos de mayor longitud como sustratos. De este modo, un péptido que sirve de sustrato para la toxina botulínica de tipo B tiene preferentemente una secuencia de aproximadamente 40 restos de aminoácido de la proteína SNARE, VAMP 2. Los péptidos con secuencias SNARE más cortas también se escinden, de hecho, pero con una eficiencia considerablemente inferior. Preferentemente, el dominio de escisión en la cadena ligera de la toxina botulínica, que tiene una longitud comparable a la de la secuencia de reconocimiento de aproximadamente 40 restos de aminoácido, no se ve afectado por la cadena de PEG. Además hay que considerar que, aparte del dominio de escisión que es responsable del contacto directo del sustrato (proteína SNARE o bien péptido con la secuencia SNARE de aproximadamente 40 restos de aminoácido) con la cadena ligera, para la actividad óptima de la toxina botulínica todavía se requieren otros sitios de contacto con secuencias de la cadena ligera alejadas del dominio catalítico. Así, se ha demostrado que en la cadena ligera de la toxina botulínica de tipo A hay otros cinco sitios de contacto para su sustrato SNAP 25: cuatro "exositios \alpha" (AA 102-113, 310-321, 335-348, 351-358) y un "exositio \beta" (AA 242-259). Preferentemente, una conjugación de la cadena ligera con PEG no impide o apenas impide el contacto. Además, la parte C-terminal de la cadena pesada, el dominio de translocación, debe ser capaz de realizar su función, es decir, ocuparse de que la cadena ligera sea transportada desde los endosomas al citosol. Este proceso de transporte, indispensable para el efecto, puede quedar también inhibido por impedimentos estéricos de una cadena ligera PEGilada, especialmente porque el dominio de translocación forma probablemente un poro en la membrana del endosoma a través del cual no podría hacerse pasar una cadena ligera PEGilada voluminosa.

En una solicitud de patente de los EEUU (2002/0197278) se describe un acoplamiento de PEG a la toxina botulínica. El acoplamiento sirve para disminuir la antigenicidad o bien la inmunogenicidad, así como para aumentar el peso molecular para reducir la difusión. Para la selección de los sitios (determinantes antigénicos) o bien de los restos de aminoácido adecuados para la PEGilación se hace referencia al trabajo de Bavari y col. (Vaccine 16: 1850-1856, 1998). En este trabajo se exponen secuencias de la cadena pesada de la toxina botulínica que inducen anticuerpos neutralizantes. En la solicitud de patente mencionada solamente se indica que (1) la PEGilación debe tener lugar en, o bien cerca de un sitio o en, o bien cerca de los sitios que actúa(n) como (un) epítopo(s) importante(s), pero que está(n) alejado(s) del dominio catalítico (es decir, alejado(s) de la cadena ligera) y que (2) el PEG puede conjugarse a los grupos carboxilo o amino terminales libres o a los grupos amino de cadenas laterales de lisina. (3) Como posibilidad adicional de incorporar PEG en la toxina se propone el uso de los grupos SH de los restos de cisteína presentes de manera natural o incorporados especialmente, en lo que, sin embargo, se advierte en contra de esta variante (3), ya que los puentes disulfuro entre las cadenas pesada y ligera de la toxina botulínica desempeñan un papel en la configuración espacial de la molécula. No se expone ningún ejemplo del que pueda deducirse la estructura de la neurotoxina PEGilada ni a qué resto(s) de aminoácido se ha acoplado una molécula de PEG de qué longitud.

En otra solicitud de patente (WO 02/40506), que se refiere a la modificación de la persistencia, se propone la incorporación, la variación o la eliminación de sitios para la glicosilación in vivo, la fosforilación in vivo y, sobre todo, la miristilación in vivo de la toxina botulínica, para aumentar o disminuir, a elección, la estabilidad de la toxina botulínica. Se indica un gran número de estos sitios de modificación potenciales que se hallan en la cadena ligera de la neurotoxina, a clara distancia de los extremos N y C. Además deben incorporarse secuencias adicionales a la cadena polipeptídica en las que las enzimas celulares acoplen cadenas de hidratos de carbono o bien restos de fosfato o bien de miristato a la cadena ligera. Sin embargo, faltan datos sobre una neurotoxina modificada de la manera correspondiente o bien de su preparación.

En otra solicitud de patente de los EEUU (2003/0027752) se incorpora en la neurotoxina o bien en la cadena ligera un resto peptídico con un, así denominado, motivo de leucina (por ejemplo XEXXXLL), con el fin de aumentar la persistencia de la cadena ligera en la célula nerviosa. Mediante el equipamiento de la cadena ligera con este motivo debe conseguirse que esta se localice en la membrana, cerca de su sustrato. Además se indica un, así denominado, "motivo a base de tirosina" (YXXHy, Y = tirosina, Hy = aminoácido hidrófobo) que debe aumentar la persistencia de la cadena ligera tras su incorporación en esta. Finalmente, esta solicitud propone una toxina botulínica de tipo A modificada en la que la cadena ligera está mutada (respectivamente de alanina a leucina en las posiciones 427 y 428).

Por consiguiente, el objetivo que se plantearon los inventores, a la vista del estado de la técnica descrito anteriormente, consistió en hacer disponible una forma adicional o bien concretamente descrita de estabilización de la toxina botulínica de cualquier serotipo, pero preferentemente de los tipos A, B y C1. Por consiguiente, en relación con lo anterior, el objetivo de los inventores consistió en hacer disponibles variantes/análogos estables de las toxinas botulínicas naturales que presentaran una mayor estabilidad in vivo, en comparación con las correspondientes toxinas botulínicas sin modificar. Esto quiere decir, en primer lugar, que la actividad biológica (la actividad biológica se define según la invención como la actividad total, comprendiendo la actividad enzimática/catalítica de la cadena ligera, así como la unión de la neurotoxina a la célula diana necesaria para dicha actividad y la translocación de la cadena ligera al interior de la célula diana) de la variante/del análogo debe reducirse en todo caso mínimamente (según la definición anterior) y preferentemente no debe reducirse en absoluto y, en segundo lugar, que la cadena ligera, a pesar de su modificación, se transloca a su lugar de acción, el citosol de las motoneuronas.

Por consiguiente, a diferencia de la solicitud de patente anteriormente mencionada, US 20020197278, el objetivo en que se basa la presente solicitud de patente no pretende bloquear determinantes antigénicos, reducir la toxicidad de la toxina o limitar su difusión más allá del lugar de inyección.

De manera sorprendente, los inventores de la presente solicitud han encontrado que la cadena ligera de las toxinas botulínicas puede PEGilarse específicamente en su extremo N mediante la incorporación de al menos un resto de cisteína, sin que simultáneamente se reduzca la actividad biológica (según la definición dada anteriormente) de la toxina botulínica o incluso se inhiba. Una toxina botulínica PEGilada de tal manera se caracteriza por una estabilidad in vivo sorprendentemente mayor (claro incremento de la semivida y, por tanto, una duración prolongada del efecto (farmacológico)).

La duración del efecto (terapéutico) de la toxina botulínica natural en el paciente depende del serotipo. La toxina botulínica A se caracteriza por la máxima duración del efecto de 3 meses, aproximadamente. La toxina botulínica de tipo C tiene un efecto de la misma duración, aproximadamente, que el tipo A, mientras que la duración del efecto de la toxina botulínica de tipo B es algo menor. El efecto de las toxinas botulínicas de tipo E y F es en cada caso de solo 2 semanas, aproximadamente. La corta duración del efecto de estos dos tipos no permite su aplicación clínica para el tratamiento de distonías. La presente invención hace posible (1) el empleo clínico de todas las toxinas botulínicas, incluso de las que hasta ahora solo presentaban un efecto de corta duración y (2) una terapia más ventajosa con las toxinas de los tipos A y B, ya empleadas terapéuticamente, dado que estas ya no tienen que administrarse cada tres meses sino, por ejemplo, solo cada medio año.

Descripción de las figuras y secuencias

Fig. 1 Compilación de los oligonucleótidos (ID SEC N^{os}: 1 a 14) empleados en la clonación de las toxinas y fragmentos de toxinas recombinantes. Las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción están subrayadas. Las secuencias largas, ID SEC N^{os}: 16 y 15, representan ejemplos de una neurotoxina botulínica de tipo A recombinante (mutada) con un resto de cisteína incorporado en posición N-terminal respecto a una marca de histidina (marca His) (compuesta de 10 restos de histidina) o bien un ADN que codifica para esta. El resto de prolina en el extremo N de la toxina nativa expresada y traducida monocistrónicamente (posición 1) se sustituyó por un resto de alanina, para crear un sitio de corte en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector. El vector comprende la secuencia codificante de la marca His exactamente en la vecindad del extremo 5' de este MCS. Además, en lugar del lazo nativo entre las cadenas ligera y pesada se incluyó ya una secuencia que es reconocida por las células de E. coli, con lo que el propéptido nativo (N-cadena ligera-lazo-cadena pesada-C) se escinde ya en la neurotoxina activa de dos cadenas y se mantiene como tal durante la preparación recombinante de la neurotoxina y sin la adición de proteasas exógenas.

Fig. 2 Análisis de las preparaciones de PEGilación y de control de C-H_{10}-BoNT/A (ejemplo 5) en un gel de SDS-poliacrilamida en condiciones no reductoras. Carril 1: marcador de peso molecular; carril 2: preparación de control; carril 3: preparación de PEGilación.

Descripción de la invención

Para conseguir el objetivo propuesto (véase anteriormente), los inventores han desarrollado toxinas botulínicas modificadas. Por lo tanto, un aspecto y objeto de la invención es una toxina botulínica modificada que presenta una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, en la que la modificación de la cadena ligera consiste (1) en que presenta un alargamiento de la cadena en su extremo N que tiene la siguiente estructura en la dirección del extremo N al extremo C:

-(C)_{n}-(tag)_{m}-(X)_{k}-,

en la que

C representa un resto de cisteína

tag representa una marca cualquiera, por ejemplo una marca de unión a estreptavidina (marca Strep) o una marca His y

X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural;

n es un número entero de 1 a 50;

m = 0 o m = 1 y

k = 0 o k es un número entero de 1 a 50,

y (2) en la que al menos uno de los restos de cisteína en el alargamiento de la cadena está acoplado a al menos una cadena de PEG. Una toxina botulínica modificada de tal manera se denomina también en lo sucesivo, toxina botulínica o neurotoxina mutada y PEGilada.

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Según una forma de realización preferida se cumplen las condiciones siguientes: \neq

n = 1, 2 ó 3, m = 0 ó 1, k = 0 ó 1 \neq 0,

n = 1, m = 1, k = 0; n = 2, m = 1, k = 0 ; n = 3, m = 1, k = 0;

n = 1, m = 0, k = 0; n = 2, m = 0, k = 0; n = 3, m = 0, k = 0;

n = 1, m = 1, k \neq 0; n = 2, m = 1, k \neq 0; n = 3, m = 1, k \neq 0;

n = 1, m = 0, k \neq 0; n = 2, m = 0, k \neq 0; n = 3, m = 0, k \neq 0,

estando la toxina acoplada a una, dos o tres moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que n = 1, 2 ó 3.

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Por lo tanto, entre las toxinas botulínicas modificadas de la presente invención mencionadas anteriormente se encuentran preferentemente aquellas toxinas botulínicas modificadas (en particular de los tipos A, B y C1), cuya cadena ligera está modificada de tal modo que presenta un alargamiento de la cadena en su extremo N, cadena alargada que tiene una de las secuencias siguientes:

-(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{1}-,
-(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{3}-
(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{4}-
(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{5}-
(tag)_{1}-(X)_{4}-, etc., en las que para cada una de las 25 formas de realización preferidas listadas anteriormente (tag)_{1} puede ser también (tag)_{0} y/o, en cada caso, todos los restos de cisteína que se hallan en el alargamiento de la cadena ligera están también PEGilados.

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También es posible que k sea también cualquier número entero de 11 a 50, o también mayor que 50, en particular mayor que 100 o mayor que 250. Sin embargo, cuanto mayor sea k, más larga será la cadena ligera, sin que un límite superior determinado de la longitud de la cadena ligera ponga en peligro la actividad enzimática/catalítica o bien la actividad (total) biológica (según la definición anterior) de la neurotoxina. Según la invención, se propone un límite superior para k de 10-20, de modo que los valores preferidos para k se hallan en el intervalo de 1-10, siempre que, con preferencia especial, k no sea 0.

Las mismas consideraciones afectan también a n, en el que su límite superior según la invención se fijó en 50 únicamente por razones prácticas y económicas. Sin embargo, preferentemente n se halla en el intervalo de 1-10, mejor de 1-5, para no incorporar o bien tener que incorporar demasiadas moléculas de PEG (ya que preferentemente todos los restos de cisteína incorporados también se PEGilan) y no privar a la toxina botulínica/neurotoxina mutada y PEGilada resultante de su actividad biológica según la definición anterior. Esto puede ocurrir fácilmente si se incorporan demasiados restos de cisteína y PEG o bien demasiados restos de cisteína y PEG en posiciones erróneas, ya que la cadena ligera, dado el caso, a pesar de la unión de la toxina a la célula diana, no se transloca al interior de dicha célula diana.

La estructura de la toxina botulínica de tipo A se publicó en 1998 por Lacy y Stevens (Nat. Struct. Biol. 5, 898-902), la estructura de la toxina botulínica de tipo B por Swaninathan y Eswaramoorthy (Nat. Struct. Biol. 7, 693-699 (2000)). De este modo se conoce también la estructura de las cadenas ligeras y puede determinarse qué regiones de las cadenas pesada o bien ligera se hallan en la superficie de la proteína y, por lo tanto, pueden ser adecuadas para un enlace con PEG. El procedimiento elegido con frecuencia, la unión de un PEG activado adecuadamente (por ejemplo, propionato de PEG-succinimidilo) al grupo \varepsilon-amino de los restos de lisina no les pareció prometedor de resultados a los inventores. Un PEG activado puede atacar a numerosos restos de lisina, también en la región de unión de la cadena pesada, lo que condujo, experimentalmente, a una inactivación drástica.

En su lugar, los inventores han identificado restos de aminoácido de la cadena ligera que son adecuados para, primeramente, ser sustituidos por al menos un resto de cisteína y, a continuación, ser PEGilados en el, al menos un resto de cisteína incorporado. También estas toxinas botulínicas modificadas, que se aún se caracterizarán seguidamente con más detalle, son una configuración preferida de la presente invención, presentan como conjugados con PEG una actividad biológica (incluyendo enzimática/catalítica) suficiente (que según la definición corresponde a al menos el 20%, preferentemente el 30-40%, el 50-70% o incluso el 75-95% de la actividad biológica de la proteína sin modificar) para, simultáneamente, una mayor estabilidad (en comparación con las neurotoxinas nativas correspondientes) y en lo sucesivo se denominan asimismo toxinas botulínicas o neurotoxinas mutadas y PEGiladas de la presente invención.

Estas toxinas botulínicas modificadas de la invención mencionadas en último lugar son asimismo conjugados de toxinas botulínicas mutadas con PEG. Estas toxinas botulínicas modificadas también están acopladas a PEG mediante restos de cisteína incorporados separadamente. Para ello, al menos uno, pero dado el caso también 2, 3, 4, 5, 10 o incluso todos los 20, de los primeros 20 restos de aminoácido del extremo N de la cadena ligera de la correspondiente toxina botulínica se sustituye en cada caso por un resto de cisteína. Estas toxinas botulínicas modificadas presentan asimismo una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, en que la modificación de la cadena ligera consiste precisamente en que al menos uno hasta 20, como máximo, de los restos de aminoácido presentes de manera natural en su extremo N está mutado o bien están mutados para dar un resto de cisteína. Dado el caso, estas cadenas presentan adicionalmente un alargamiento N-terminal, de modo que la secuencia de la cadena ligera tiene la siguiente estructura en la dirección del extremo N al extremo C:

-(tag)_{m} (X)_{k}-BoNT(X1-20C),

en que

C representa un resto de cisteína

tag representa una marca cualquiera, por ejemplo una marca Strep o una marca His y

X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural;

m = 0 o m = 1 y

k = 0 o k es un número entero de 1 a 50.

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Al menos uno de los, como máximo, 20 restos de cisteína en el extremo N está acoplado a al menos una cadena de PEG.

Por lo tanto, para la toxina BoNT/A resultan mutantes que se caracterizan por al menos una y como máximo veinte de las siguientes sustituciones de restos de aminoácido, de modo que en los restos de cisteína incorporados pueda tener lugar una PEGilación:

P1C, F2C, V3C, N4C, K5C, Q6C, F7C, N8C, Y9C, K10C, D11C, P12C, V13C, N14C, G15C, V16C, D17C, I18C, A19C, Y20C.

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Según una forma de realización preferida se cumplen las condiciones siguientes:

m = 1, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

m = 0, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

m = 1, k \neq 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

m = 0, k \neq 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

m = 1, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

m = 0, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

m = 1, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

m = 0, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6,

estando las toxinas acopladas a una o dos moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que se haya sustituido solo uno o dos restos de aminoácido por (un) resto(s) de cisteína en el extremo N.

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Por lo tanto, entre las toxinas botulínicas modificadas de la presente invención mencionadas anteriormente se encuentran preferentemente aquellas toxinas botulínicas (en particular de los tipos A, B y C1) cuya cadena ligera está modificada de tal modo que presenta un alargamiento de la cadena en su extremo N, extremo N de la cadena ligera alargada que presenta una de las secuencias siguientes:

-(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(N4C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(K5C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-
(X)_{1}-BoNT(N4C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(K5C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(N4C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(K5C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(F2C),
-(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(N4C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(K5C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-
(X)_{4}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(N4C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(K5C), etc.,

en las que para cada una de las 25 formas de realización preferidas listadas anteriormente (tag)_{1} puede ser también (tag)_{0} y/o, en cada caso, todos los restos de cisteína incorporados en el extremo N también están PEGilados.

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También es posible que k sea también cualquier número entero de 11 a 50, o también mayor que 50, en particular mayor que 100 o mayor que 250. Sin embargo, cuanto mayor sea k, más larga será la cadena ligera, sin que un límite superior determinado de la longitud de la cadena ligera ponga en peligro la actividad enzimática/catalítica o bien la actividad (total) biológica de la neurotoxina en el sentido de la definición anterior. Según la invención, se propone un límite superior para k de 10-20, de modo que los valores preferidos para k se hallan en el intervalo de 1-10, siempre que, con preferencia especial, k no sea 0.

Siempre que no se indique explícitamente lo contrario, las siguientes formas de realización son válidas para las toxinas botulínicas modificadas de la presente invención, independientemente de que se trate de la variante con un resto(s) de cisteína incorporado(s) en el alargamiento N-terminal de la cadena ligera o de la variante con un resto(s) de cisteína incorporado(s) en el extremo N de la cadena ligera.

Preferentemente, la toxina botulínica modificada es una toxina botulínica modificada derivada de las toxinas BoNT/A, BoNT/B o BoNT/C1, pero igualmente puede ser también una toxina botulínica de los tipos D, E, F o G. Asimismo se prefiere que, por un lado, todos los restos de cisteína incorporados de manera artificial (preferentemente se incorporan 1-10 restos de cisteína) presenten al menos una cadena de PEG, pero por otro lado, ninguno de los restos de cisteína presentes de forma natural en las cadenas pesada y ligera de la toxina botulínica esté PEGilado.

Por supuesto, el experto comprende sin más que la importancia de la marca (m = 1) reside en la mayor facilidad de purificación de la toxina botulínica modificada preparada de manera recombinante (por ejemplo, en E. coli) de la presente invención. Por consiguiente, la marca no se necesita para aumentar la estabilidad de la neurotoxina o su actividad biológica, sino que permite el aislamiento simplificado y casi cuantitativo de la toxina botulínica modificada a partir del cultivo bacteriano.

En la cuestión de la elección adecuada de n (en el caso de la variante con un resto(s) de cisteína incorporado(s) en el alargamiento N-terminal de la cadena ligera) o bien del número y posición de los restos de aminoácido para sustituir por restos de cisteína (en el caso de la variante con un resto(s) de cisteína incorporado(s) en el extremo N de la cadena ligera) ha de tenerse en cuenta que, preferentemente, solo se incorporan tantos restos de cisteína como PEGilaciones deban tener lugar (lo mismo se aplica para el caso de que k \neq 0 y al menos un resto de aminoácido X es un resto de cisteína). Estos restos de cisteína incorporados pueden PEGilarse, preferentemente todos y totalmente, sin que, y esto es una conclusión sorprendente de los inventores, se PEGile ni uno de los restos de cisteína presentes de manera natural en la toxina botulínica, ni en la cadena pesada ni en la ligera (además de un puente disulfuro intramolecular y otro intermolecular, la toxina botulínica de tipo A, por ejemplo, tiene otros tres restos de cisteína en la cadena pesada (C_{791}, C_{967}, C_{1060}), así como otros dos restos de cisteína en la cadena ligera (C_{134} y C_{165})). De esta manera puede obtenerse un producto uniforme (homogéneo) en forma de una toxina botulínica mutada y PEGilada. Además, por otra razón adicional tiene sentido evitar que se incorporen demasiados restos de cisteína y PEG o bien que se incorporen demasiados restos de cisteína y PEG en posiciones erróneas. Esto es porque (i) la toxina es entonces probablemente demasiado voluminosa para unirse a la célula diana y/o (ii) la cadena ligera, dado el caso a pesar de la unión de la toxina a la célula diana, no se transloca o se transloca insuficientemente al interior de la célula diana. En otras palabras, la incorporación de solo un resto de cisteína en esta o en aquella variante, y su PEGilación, satisface regularmente la finalidad según la invención y por lo tanto se prefiere especialmente.

Como consecuencia, las toxinas botulínicas/neurotoxinas mutadas y PEGiladas según la presente invención son tan activas biológica y enzimáticamente (es decir, catalíticamente) como las toxinas botulínicas/neurotoxinas naturales (nativas) correspondientes o presentan una actividad biológica y enzimática/catalítica en todo caso reducida mínimamente en el sentido de la definición dada anteriormente, pero son más estables, en parte incluso considerablemente más estables, que sus toxinas predecesoras naturales, de las que se han derivado. Así, en adelante se prefiere una toxina botulínica mutada y PEGilada, cuya cadena ligera mutada (modificada) y PEGilada presenta una mayor estabilidad en el citosol de las motoneuronas que la cadena ligera sin modificar de la toxina botulínica nativa correspondiente.

La PEGilación de la cadena ligera, como se ha descrito anteriormente, conduce a una mayor estabilidad en comparación con la cadena ligera sin modificar. La cadena de PEG se coloca en la cadena ligera según la invención de tal modo que 1. Su actividad enzimática no cambia o en todo caso se reduce mínimamente (según la definición dada anteriormente) y 2. la cadena ligera modificada se transloca, como también la cadena sin modificar, al citosol de las motoneuronas.

La marca His, como también otras marcas, por ejemplo la marca Strep, permiten el fácil aislamiento de la neurotoxina mutada a partir del lisado de bacterias transformadas (por ejemplo, E. coli). De la manera más sencilla, se coloca a nivel de ADN en dirección 5' de la región codificante del gen de la neurotoxina. En el caso de la marca His, el aislamiento tiene lugar mediante cromatografía de afinidad en sefarosa Ni-NTA. La neurotoxina mutada aislada de este modo se acopla en la etapa siguiente con PEG activado. La empresa Nektar Therapeutics pone a disposición una serie de derivados activados de PEG, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida, así como disulfuro de PEG-ortopiridilo y proporciona además instrucciones para la PEGilación. Estos derivados de PEG pueden presentar según la invención distintas longitudes de cadena: por ejemplo hay derivados de PEG con pesos moleculares de 5.000 dalton, 10.000 dalton, 20.000 dalton y 30.000 dalton disponibles comercialmente y han de emplearse según la invención.

Para determinar la actividad proteasa de la toxina botulínica mutada y, a continuación, PEGilada se mide cuantitativamente la escisión de las proteínas SNARE correspondientes al serotipo. Dado el caso, la actividad se compara después con la actividad (i) de la neurotoxina nativa (del serotipo correspondiente), (ii) de la neurotoxina mutada con una marca para la simplificación del aislamiento y/o (iii) de la neurotoxina mutada sin marca. La actividad de la neurotoxina mutada y de la neurotoxina mutada y PEGilada según la presente invención es similar a la actividad de la neurotoxina nativa (no mutada) (es decir, la actividad biológica, según la definición anterior, de la neurotoxina mutada y de la neurotoxina modificada según la invención, en comparación con la actividad biológica de la neurotoxina nativa, solo está en todo caso mínimamente reducida en el sentido de la definición dada anteriormente).

La actividad total de la neurotoxina mutada y PEGilada se determina primeramente en un modelo ex vivo, el así denominado ensayo de diafragma o bien de hemidiafragma. En este se determina la actividad paralizante en un preparado de nervio y músculo. Según la invención, la actividad biológica de la neurotoxina modificada, es decir, de la neurotoxina mutada y a continuación PEGilada, es al menos del 20%, preferentemente del 30-40% o del 50-70% o incluso del 75-95% de la actividad biológica de la proteína nativa (sin modificar) (la actividad biológica ha de entenderse aquí también según la definición anterior).

La toxicidad de la neurotoxina mutada y PEGilada según la invención puede analizarse en un ensayo de DL_{50} en ratones, en el que se determina la dosis que, después de su administración por vía intraperitoneal tiene un efecto letal en la mitad de un grupo de ratones.

La duración del efecto de las neurotoxinas mutadas y PEGiladas según la invención se determina in vivo, asimismo en ratones. Después de la inyección de una dosis subletal de una toxina botulínica de tipo A mutada y PEGilada según la presente invención o bien de la toxina botulínica nativa correspondiente en el músculo gastrocnemio de la pata trasera se determina el tiempo que el músculo permanece paralizado. En ello, la intensidad de la parálisis se clasifica por medio de una escala. La duración del efecto, que en ratones es menor que en humanos, se prolongó, dependiendo de la toxina botulínica de tipo A modificada usada, en el 30-150% (medida en comparación con una toxina botulínica de tipo A no mutada y sin PEGilar).

La toxina botulínica mutada y PEGilada según la presente invención puede procesarse en una formulación adecuada para obtener un medicamento preparado que contiene una dosis (o un múltiplo entero de la dosis) en el intervalo de la dosis terapéutica (por ejemplo, 100 unidades de DL_{50} por vial de inyección). Según una forma de realización preferida, la composición farmacéutica se estabiliza sin la adición de albúmina de suero humano (HSA). Sin embargo, también puede estabilizarse con albúmina de suero humano (HSA). A este respecto, se prefiere especialmente el uso de una composición sin HSA para la estabilización de principios activos proteínicos, como se describe en el documento WO 2005/007185. Según otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica de la presente invención se halla en forma liofilizada o líquida. Las dos formas son adecuadas, dado el caso después de su disolución en un disolvente adecuado, para la inyección intramuscular en el músculo por tratar.

La toxina botulínica mutada y PEGilada de mayor estabilidad y semivida o bien el producto farmacéutico que presenta dicha toxina pueden emplearse para la terapia de distintas distonías, como distonía espasmódica, distonía laríngea, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, paresia cerebral, espasmos hemifaciales, espasticidad, colitis espasmódica, anismo, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia, hiperhidrosis, así como para la eliminación de arrugas faciales.

Los ejemplos siguientes explican la invención en detalle, pero sin limitarla a los parámetros específicos mencionados en estos.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión de la neurotoxina botulínica de tipo A (BoNT/A)

Para la clonación de las secuencias de ADN de la cadena ligera así como del dominio de translocación se aisló el ADN cromosómico de un cultivo de Clostridium botulinum de tipo A (cepa ATCC 3502). Mediante amplificación por PCR con los cebadores ID SEC Nº:1 e ID SEC Nº:2 se obtuvo un fragmento génico codificante de la cadena ligera de BoNT/A con una secuencia del lazo modificada. El producto amplificado por PCR se clonó por medio de los sitios de restricción para NcoI y BglII en el plásmido de expresión pQE-H_{10}, que se derivó de pQE-60 y que codifica una marca His (compuesta de 10 restos de histidina) en el lado 5' del sitio de clonación. Con esta clonación se generó el plásmido pQE-H_{10}-BoNT/A-L. Mediante amplificación por PCR con los cebadores ID SEC Nº:3 e ID SEC Nº:4 se obtuvo el fragmento génico codificante de la cadena pesada de BoNT/A. Este se clonó por medio de los sitios de restricción StuI y BglII en el extremo 3' de la secuencia del lazo de la cadena ligera en pQE-H_{10}-BoNT/A-L (plásmido pQE-H_{10}-BoNT/A). La cepa de expresión de E. coli, M15[pREP4] (Qiagen), se transformó con el plásmido pQE-H_{10}-BoNT/A. La expresión de la toxina recombinante se realizó mediante una inducción escalonada con 500 \muM (concentración final) de IPTG a 25ºC durante la noche. Las células se rompieron en un tampón fosfato 50 mM a pH 8,0 con NaCl 300 mM mediante el tratamiento con lisozima y ultrasonidos. El lisado centrifugado se incubó a temperatura ambiente durante 5 h y después de un almacenamiento temporal a -20ºC se sometió a cromatografía en una columna de agarosa Ni-NTA. Finalmente se realizaron una diálisis de las fracciones de elución frente a un tampón de acoplamiento (dihidrogenofosfato de sodio 100 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM) y una determinación de la concentración de proteína. Un análisis en un gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado la tinción por azul de Coomassie en condiciones reductoras de dos bandas intensas a 50 kDa y 100 kDa, aproximadamente, así como de una banda débil a 150 kDa, mientras que en condiciones no reductoras solamente se observó un banda a 150 kDa, aproximadamente, lo que se corresponde con el patrón de bandas de una neurotoxina botulínica de tipo A en su estructura principalmente de dos cadenas unidas por puentes disulfuro.

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Ejemplo 2 Clonación y expresión de la neurotoxina botulínica de tipo B (BoNT/B)

La clonación y expresión de una neurotoxina botulínica de tipo B con una marca de histidina (compuesta de 10 restos de histidina) en el extremo N tuvo lugar de manera análoga a la toxina de tipo A. Para la amplificación de las cadenas ligera y pesada se empleó ADN cromosómico de Clostridium botulinum de tipo B (cepa Okra), así como los cebadores ID SEC Nº:5 e ID SEC Nº:6 o bien ID SEC Nº:7 e ID SEC Nº:8.

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Ejemplo 3 Clonación y expresión de la neurotoxina botulínica de tipo C1 (BoNT/C1)

La clonación y expresión de una neurotoxina botulínica de tipo C1 con una marca His (compuesta de 10 restos de histidina) en el extremo N tuvo lugar de manera análoga a la toxina de tipo A. Para la amplificación de las cadenas ligera y pesada se empleó ADN cromosómico de Clostridium botulinum de tipo C (cepa 205), así como los cebadores ID SEC Nº:9 e ID SEC Nº:10 o bien ID SEC Nº:11 e ID SEC Nº:12.

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Ejemplo 4 Clonación y expresión de C-H_{10}-BoNT/A

Para hacer posible una PEGilación N-terminal se añadió a la secuencia de aminoácidos un resto de cisteína en posición N-terminal respecto a la marca de histidina (compuesta de 10 restos de histidina). Esto se consiguió mediante mutagénesis dirigida en la región de la secuencia de pQE-H_{10}BoNT/A que codifica la marca His. Para ello se empleó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange de la empresa Stratagene. La reacción de mutagénesis se realizó con los cebadores ID SEC Nº:13 e ID SEC Nº:14. La sustitución de nucleótidos en la secuencia de ADN se verificó mediante secuenciación de ADN de los clones aislados. La expresión y purificación de la toxina mutada se realizaron de manera análoga al ejemplo 1.

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Ejemplo 5 PEGilación de C-H_{10}-BoNT/A

Se incubaron 1,2 mg de C-H_{10}-BoNT/A durante 30 minutos en DTT 1 mM para reducir los dímeros unidos por puentes disulfuro. El tampón se sustituyó por tampón de acoplamiento mediante una columna PD-10 para separar el agente reductor. La disolución de toxina se concentró a 3,6 mg/ml por medio de ultrafiltración. Una pequeña parte se incubó sin tratar como muestra de control, al resto de la disolución se añadió mPEG-Mal-5000 (Nektar Therapeutics) en un exceso molar de 5 veces y se agitó por rotación a temperatura ambiente durante la noche. Con el fin de evitar posibles reacciones de derivatización en otros restos de cisteína durante la preparación de la muestra para el análisis de SDS-PAGE, el agente de PEGilación se saturó con L-cisteína en un exceso de 5 veces. En el gel de SDS se observó, en comparación con la preparación de control en la aplicación no reductora, una banda intensa adicional con una movilidad ligeramente inferior, mientras que la intensidad de la banda original de la toxina a 150 kDa se mostró claramente disminuida (fig. 2).

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Ejemplo 6 Prueba de actividad in vitro

La determinación de la actividad proteasa específica (es decir, de la actividad catalítica sin unión o bien translocación) de los derivados mutados y PEGilados de BoNT/A tuvo lugar en formato ELISA. Para ello se clonó un polipéptido recombinante, compuesto de glutation-S-transferasa (GST), de uso corriente en proteínas de fusión, en la región N-terminal y de una secuencia peptídica C-terminal que comprende los 17 restos de aminoácido C-terminales de SNAP 25. Estos 17 restos de aminoácido representan la región de la proteína sustrato SNAP 25 en la que BoNT/A escinde específicamente. Después de revestir una placa de microtitulacióncon con la proteína de fusión se incubó con H_{10}-BoNT/A como muestra de referencia o bien con el mutante en forma PEGilada y sin PEGilar. La detección de los productos de escisión generados respectivamente se realizó con un anticuerpo, que reconoce específicamente el extremo C producido nuevamente. Los valores para C-H_{10}-BoNT/A en su forma sin PEGilar, así como en su forma PEGilada, así como para H_{10}-BoNT/A (muestra de referencia) se exponen en la tabla 3. Teniendo en cuenta el margen de fluctuación del ensayo, puede observarse que, mediante la introducción de la mutación y la subsiguiente PEGilación, la actividad catalítica de la toxina botulínica no disminuyó, sino que más bien incluso aumentó.

TABLA 3

3

La actividad específica se determinó en unidades de proteasa/ng de proteína.

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Ejemplo 7 Determinación de la actividad ex vivo en un ensayo de hemidiafragma

Para determinar la actividad total de los derivados de la toxina, es decir, la unión de las neurotoxinas modificadas al receptor de las células diana y la translocación en el interior de la célula nerviosa, y la proteolisis del sustrato SNARE, se determinó el tiempo de parálisis de un preparado de nervio y músculo de ratón después de la intoxicación. Como muestra de referencia se usó de nuevo H_{10}-BoNT/A. Los valores de las actividades relativas se exponen en la tabla 4. Por consiguiente, la disminución de la actividad de las toxinas botulínicas modificadas según la presente invención al 20-30% en relación con la muestra de referencia se basa, evidentemente, en una disminución de la capacidad de unión de la toxina a las células diana y en la disminución de la capacidad de translocar la toxina al interior de las células diana.

TABLA 4

4

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Ejemplo 8 Duración del efecto de la toxina botulínica de tipo A PEGilada

La duración del efecto de la toxina botulínica mutada y PEGilada (mPEG-C-H_{10}-BoNT/A) se analizó en ratones CD 1. En cada caso, 10 ratones recibieron inyecciones intramusculares (2 x 0,05 ml) de toxina botulínica (i) mutada, (ii) mutada y PEGilada o bien (iii) nativa en una dosis respectiva de 0,4 ó 0,6 unidades de DL_{50}/ratón (en disolución salina fisiológica + 1 mg/ml de HSA) en el músculo gastrocnemio de la pata trasera. A continuación se valoró diariamente la parálisis del músculo mediante una escala (parálisis mínima, ligera, intensa). Después de 25 días, en los animales tratados con la neurotoxina nativa ya no se observó ninguna parálisis del músculo. La duración del efecto se prolongó durante 7-20 días en los animales tratados con la toxina botulínica mutada o bien PEGilada.

<110> BioteCon Therapeutics GmbH

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<120> Toxina mutada y PEGilada de Clostridium botulinum

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<130> BIO-009 PCT

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<140> desconocido

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<141> 15-03-2007

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<150> EP 06005300.6

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<151> 15-03-2006

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<160> 16

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 1

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\hskip1cm

100

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<210> 2

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<211> 67

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 2

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\hskip1cm

5

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<210> 3

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 3

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\hskip1cm

101

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<210> 4

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 4

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\hskip1cm

102

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<210> 5

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<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3939

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Neurotoxina botulínica de tipo A mutada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Neurotoxina botulínica de tipo A mutada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

10

11

12

13

14

Claims

1. Toxina botulínica modificada que presenta una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, caracterizada porque la modificación de la cadena ligera consiste en que

(a) (i) esta presenta en su extremo N un alargamiento de la cadena que tiene la estructura, -(C)_{n}-(tag)_{m}-(X)_{k}-, en la dirección del extremo N al extremo C y (ii) al menos uno de los restos de cisteína en el alargamiento de la cadena está acoplado a al menos una cadena de PEG, o en que

(b) al menos un resto de aminoácido y como máximo 20 restos de aminoácido de los restos de aminoácido que se hallan naturalmente en su extremo N está/n mutado/s en un resto de cisteína, estando al menos uno de los, como máximo, 20 restos de cisteína en el extremo N acoplado a al menos una cadena de PEG y la cadena ligera, dado el caso, presenta adicionalmente un alargamiento N-terminal, de modo que la secuencia de la cadena ligera tiene la estructura -(tag)_{m}-(X)_{k}-BoNT(X1-20C), en la dirección del extremo N al extremo C,

en la que

C representa un resto de cisteína

tag representa una marca cualquiera y

X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural;

en la que

n es un número entero de 1 a 50;

en la que

m = 0 o m = 1 y

k = 0 o k es un número entero de 1 a 50.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La toxina botulínica según la reivindicación 1, caracterizada porque ninguno de los restos de cisteína presentes de manera natural en las cadenas pesada y ligera de la toxina botulínica está PEGilado.

3. La toxina botulínica según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la marca es una marca His o una marca Strep.

4. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B, C1, D, E, F o G y se cumple una de las condiciones siguientes:

(a) n = 1, 2 ó 3, m = 0 ó 1, k = 0 o k \neq 0,

(b1) n = 1, m = 1, k = 0; (b2) n = 2, m = 1, k = 0 ; (b3) n = 3, m = 1, k = 0;

(c1) n = 1, m = 0, k = 0; (c2) n = 2, m = 0, k = 0; (c3) n = 3, m = 0, k = 0;

(d1) n = 1, m = 1, k \neq 0; (d2) n = 2, m = 1, k \neq 0; (d3) n = 3, m = 1, k \neq 0;

(e1) n = 1, m = 0, k \neq 0; (e2) n = 2, m = 0, k \neq 0; (e3) n = 3, m = 0, k \neq 0,

estando la toxina acoplada a una, a dos o a tres moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que n = 1, 2 ó 3.

\vskip1.000000\baselineskip

5. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el alargamiento de la cadena ligera tiene una de las secuencias siguientes:

-(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{0}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{1}-,
-(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{1}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{2}-,
-(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{2}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{4}-
(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{5}-(tag)_{1}-(X)_{3}-, -(C)_{1}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{2}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{3}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{4}-(tag)_{1}-(X)_{4}-, -(C)_{5}-
(tag)_{1}-(X)_{4}-,

en las que para cada una de estas 25 secuencias m también puede ser 0 y/o, en cada caso, todos los restos de cisteína presentes en el alargamiento de la cadena ligera también están PEGilados.

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6. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B, C1, D, E, F o G y se cumple una de las condiciones siguientes:

(a) m = 1, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

(b) m = 0, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

(c) m = 1, k \neq 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

(d) m = 0, k \neq 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;

(e) m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

(f) m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

(g) m = 1, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

(h) m = 0, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;

(i) m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

(j) m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

(k) m = 1, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;

(l) m = 0, k \neq 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6,

estando las toxinas acopladas a una o dos moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que se hayan incorporado solo uno o dos restos de cisteína en el extremo N.

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7. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3 y 6, caracterizada porque la toxina botulínica modificada es una toxina botulínica cuya cadena ligera está modificada de tal modo que presenta un alargamiento de la cadena en su extremo N, presentando el extremo N de la cadena alargada una de las secuencias siguientes:

(a) -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(N4C),
-(tag)_{1}-(X)_{0}-BoNT(K5C),

(b) -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(N4C),
-(tag)_{1}-(X)_{1}-BoNT(K5C),

(c) -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(N4C),
-(tag)_{1}-(X)_{2}-BoNT(K5C),

(d) -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(N4C),
-(tag)_{1}-(X)_{3}-BoNT(K5C),

(e) -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(P1C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(F2C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(V3C), -(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(N4C),
-(tag)_{1}-(X)_{4}-BoNT(K5C),

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8. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B o C1.

9. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la toxina botulínica modificada presenta al menos el 20%, preferentemente el 30-40%, el 50-70% o el 75-95% de la actividad biológica de la toxina botulínica natural (sin modificar, nativa) correspondiente y una mayor estabilidad en comparación con esta.

10. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cadena ligera modificada se transloca in vivo en el citosol de las motoneuronas.

11. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cadena ligera modificada presenta una estabilidad en el citosol de las motoneuronas mayor que la de la toxina botulínica nativa correspondiente.

12. Composición farmacéutica, comprendiendo la composición la toxina botulínica modificada según una de las reivindicaciones precedentes.

13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, composición que se estabiliza sin la adición de albúmina de suero humano (HSA).

14. La composición farmacéutica según las reivindicaciones 12 ó 13, la composición que se halla en forma liofilizada o líquida y siendo las dos formas, dado el caso después de su disolución en un disolvente adecuado, adecuadas para la inyección intramuscular.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, estando prevista la composición para su uso en la terapia de distonías, así como en la eliminación de arrugas faciales.