ES2380677T3 - Expresión recombinante de proteínas en una forma bicatenaria, con puente disulfuro - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de polipéptidos o proteínas en forma bicatenaria en las que las dos cadenas están unidas por puente disulfuro por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli, en el que (i) el polipéptido o la proteína ejerce su actividad biológica como polipéptido o proteína bicatenaria con puente disulfuro. (ii) el resto de aminoácido C terminal de la primera cadena es un resto de aminoácido básico; (iii) la segunda cadena de la proteína/del polipéptido presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr; y (iv) el procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) modificar el polipéptido o la proteína, al nivel de ácido nucleico, de modo que el polipéptido o la proteína en su forma modificada en su región de bucle presente la secuencia VPXGS y en dirección N terminal de esta secuencia PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido un resto de aminoácido básico, siendo X, V, P, G y S tal como se definen anteriormente, y estando definida la región de bucle como la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre los dos restos de cisteína que participan en el puente disulfuro; (b) introducir el constructo modificado al nivel de ácido nucleico en células de E. coli; (c) cultivar y a continuación lisar las células huésped; y (d) aislar el polipéptido o la proteína bicatenaria con puente disulfuro.

Description

Expresión recombinante de proteínas en una forma bicatenaria, con puente disulfuro

Un objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas en forma bicatenaria por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli. Otro aspecto de la presente invención se refiere a proteínas o polipéptidos en forma bicatenaria y biológicamente activa que pueden producirse por medio del procedimiento mencionado.

La ventaja esencial con respecto a proteínas/polipéptidos recombinantes correspondientes que no presentan las características según la invención consiste en que no deben tratarse con una proteasa específica para la escisión dirigida de la cadena de polipéptido, de modo que se simplifica esencialmente el procedimiento de producción. Otros objetos de la presente invención son ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos/las proteínas según la invención, vectores que contienen tales ácidos nucleicos o secuencias de ácido nucleico, células huésped que contienen a su vez los vectores mencionados y por último preparaciones farmacéuticas que contienen las proteínas/los polipéptidos bicatenarios y biológicamente activos.

Las neurotoxinas clostridiales son fuertes inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependientes del calcio en células neuronales. Tras la ingestión oral de toxinas botulínicas (BoNT), por ejemplo a través de alimentos en mal estado se produce un cuadro clínico denominado como botulismo, que se caracteriza por la parálisis de distintos músculos. Una parálisis de la musculatura respiratoria puede llevar en último lugar a la muerte del afectado. A este respecto se interrumpe la transmisión de señales del nervio al músculo en la placa terminal motora, dado que las neuronas motoras ya no pueden distribuir nada de acetilcolina. Las toxinas botulínicas muestran su efecto inhibidor mediante la escisión proteolítica de proteínas que participan en los procesos de secreción, las denominadas proteínas SNARE. A este respecto las neurotoxinas de distintos serotipos tienen diferentes especificidades con respecto a las proteínas SNARE y los sitios de escisión en las respectivas secuencias de aminoácidos. BoNT(A) y BoNT(E) escinden la proteína SNARE SNAP-25, mientras que BoNT(C) reconoce tanto SNAP-25 como sintaxina-1 como sustrato. Por último, las toxinas de los serotipos B, D, F y G así como la toxina tetánica (TeNT) escinden VAMP-2 (sinaptobrevina-2) (Schiavo y col., 1997).

En el caso de las neurotoxinas clostridiales se trata de los venenos conocidos más potentes. Así, la dosis letal administrada por vía intravenosa, a la que mueren de botulismo la mitad de todos los ratones del grupo de dosis, asciende únicamente a 5 pg. El hecho de que las toxinas de la mayoría de los serotipos actúen también por vía oral, ha de atribuirse a proteínas complejas en las que están encapsuladas y que protegen por lo tanto en el paso gastrointestinal frente a la degradación por enzimas digestivas. A ellas se atribuye también una función en la reabsorción de las toxinas por el epitelio del intestino delgado (Fujinaga, 1997).

En el transcurso de las últimas décadas se han aprovechado terapéuticamente las toxinas botulínicas de los serotipos A y B. Así, mediante la inyección controlada de sólo pequeñas dosis se relajan músculos individuales, crónicamente contraídos. Una ventaja especial es la larga duración de efecto de por ejemplo BoNT(A) y BoNT(B) durante tres a seis meses. Las primeras áreas de indicación han sido, entre otras, distonías tales como tortícolis, blefaroespasmo y estrabismo, han de sumarse otras tales como la hiperhidrosis o tratamientos cosméticos para el suavizado de arrugas. El mercado para la toxina butulínica como agente terapéutico crece rápidamente, no en último termino por el desarrollo de otras áreas de indicación y el aprovechamiento intensivo en aplicaciones ya existentes. A este respecto se están haciendo esfuerzos para mejorar las propiedades de las neurotoxinas con respecto a la duración de acción, la fuerza de acción y el potencial antigénico. Ensayos han mostrado que las proteínas complejas que están contenidas en las preparaciones comercialmente disponibles hasta el momento (BOTOX de Allergan y Dysport de Ipsen-Beaufort como preparaciones de BoNT(A) así como Myobloc/Neurobloc de Elan como preparación de BoNT(B)), no tienen ningún efecto positivo sobre la duración y la intensidad de acción, pero debido a la mayor cantidad de proteína en comparación con una preparación de la neurotoxina pura con la misma actividad, pueden contribuir a desencadenar una reacción inmunitaria en el paciente que puede hacer ineficaces inyecciones adicionales.

Es decir, dado que las proteínas complejas no se necesitan en la formulación de principio activo e incluso son desventajosas y algunas modificaciones para la mejora de las propiedades sólo pueden conseguirse mediante rutas de ingeniería genética, existe una gran necesidad de producir las neurotoxinas de manera recombinante, por ejemplo mediante expresión en Escherichia coli (las neurotoxinas así generadas están libres de las proteínas complejas mencionadas anteriormente). Además se explotarán nuevas áreas de indicación de manera que se confiera a las toxinas botulínicas una especificidad celular distinta. Para ello se preferirá también la ruta a través de una toxina recombinante o un derivado de toxina.

Las toxinas botulínicas así como la toxina tetánica presentan altas homologías en su secuencia de aminoácidos y se asemejan especialmente en su estructura de dominios. Están compuestas por un dominio de unión a receptor (HC), un dominio de translocación (HN) y una subunidad catalítica (L), que en la célula nerviosa provoca la escisión de la proteína SNARE correspondiente. HC es responsable de la unión específica de las neurotoxinas a las placas terminales motoras, mientas que el dominio de translocación se ocupa de que L llegue desde los endosomas hasta el citoplasma de las neuronas. HN (extremo N terminal) y HC (extremo C terminal) forman la cadena pesada de 100

kDa, mientras que L es la cadena ligera y constituye la subunidad catalítica de 50 kDa. Ambas cadenas de polipéptido están unidas entre sí mediante un puente disulfuro. Entre los restos de cisteína implicados se extiende una región de conector o de bucle (sinónimos de ellos también secuencia de conector o secuencia de bucle o de forma simplificada conector o bucle), cuya longitud entre las toxinas botulínicas de los serotipos individuales varía considerablemente. A más tardar durante la liberación de las toxinas de los clostridios en el curso de la lisis celular se escinde el bucle mediante una endopeptidasa clostridial no caracterizada hasta el momento, variando la relación de especies escindidas y no escindidas entre los serotipos. Para la actividad de las neurotoxinas, es esencial la escisión del bucle con respecto a la toxina bicatenaria (Schiavo y col., 1997). Por ejemplo, en el caso de la neurotoxina botulínica A se corta un decapéptido del bucle, es decir, en la secuencia de bucle VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL, que tiene de manera N terminal así como C terminal un resto de cisteína como vecinos inmediatos, no se corta sólo una unión peptídica, sino que se corta dos veces de forma proteolítica. Por lo tanto el peso molecular de la neurotoxina botulínica A biológicamente se encuentra por naturaleza por debajo del de la toxina originalmente traducida por clostridios.

Dado que la proteasa clostridial no está presente en otros organismos huésped tales como Escherichia coli, en ellos se expresan toxinas botulínicas recombinantes y sus fragmentos o derivados como polipéptidos monocatenarios. Esto es válido de manera correspondiente también para cualquier otra proteína que ejerza su actividad biológica/bioquímica normal como proteína bicatenaria: en general tales proteínas se obtienen por medio de la tecnología de ADN recombinante como proteínas monocatenarias, su actividad biológica/bioquímica, que ejercen de manera natural como proteínas bicatenarias, no está por lo tanto apenas presente o no lo está en absoluto.

Para generar una proteína activa, especialmente una toxina butulínica activa, es necesaria por lo tanto hasta el momento la incorporación de una secuencia de reconocimiento para una proteasa específica de secuencia tal como por ejemplo trombina, factor Xa o genenasa, de modo que tras la purificación puede realizarse una escisión y con ello una activación mediante la adición de una de estas endoproteasas. Esto se describe por ejemplo en el documento WO 2004/024909. El uso de una de tales endoproteasas tiene esencialmente dos desventajas: por un lado no siempre puede descartarse que existan aún otros sitios de escisión en la secuencia de aminoácidos además del sitio de escisión insertado por ingeniería genética. Asimismo, cuando en estos sitios de escisión secundarios se desea cortar de manera esencialmente ineficiente, tras el tratamiento con proteasa puede generarse una mezcla de distintas variantes de escisión de la toxina que sólo se separaría con dificultad. Por otro lado, en el caso de preparaciones farmacéuticas es considerablemente desventajoso por motivos de la legislación de fármacos (regulatorios), añadir posteriormente una proteína o dejar entrar en contacto la preparación con una proteína adicional, dado que en el tratamiento adicional debe detectarse la eliminación completa de esta proteína y sus impurezas eventualmente presentes, lo que por regla general está relacionado con un gasto considerable.

Una activación mediante escisión proteolítica en un polipéptido bicateriano con puente disulfuro es necesaria también en el caso de otras toxinas bacterianas, tales como por ejemplo la exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica, para que el dominio enzimático pueda ejercer el efecto tóxico (por ejemplo mediante ADP-ribosilación de un factor de elongación y con ello la inhibición de la síntesis de proteína). Estas toxinas se usan en la producción de las denominadas inmunotoxinas que se usan especialmente en terapia antitumoral. Para ello se cambia el dominio de unión celular de la toxina por un dominio de proteína que presenta una alta afinidad de unión hacia una proteína de superficie específica de tumor (antígeno de diferenciación o antígeno asociado a tumor). Mientras que en las inmunotoxinas clásicas este dominio de proteína consiste en un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, la especificidad por determinadas células tumorales puede conferirse también mediante citocinas, factores de crecimiento así como proteínas mutadas y seleccionadas de la familia de las afilinas, proteínas de repetición de anquirina o anticalinas, por mencionar sólo algunos ejemplos. En el caso de la expresión recombinante de proteínas de fusión de este tipo se obtienen polipéptidos monocatenarios. Mientras que por ejemplo ricina no tiene ningún sitio de procesamiento para proteasas además del de Ricinus communis y debe introducirse uno tal, los fragmentos de toxina diftérica y exotoxina de Pseudomonas se escinden como componente de las inmunotoxinas tras la internalización en el compartimento endosómico mediante una proteasa de la célula diana. Esto se produce en la región de bucle entre los restos de cisteína que forman un puente disulfuro. No obstante no se procesan de este modo todas las moléculas de inmunotoxina internalizadas, sino sólo una pequeña parte (Ogata y col., 1990).

Para obtener proteínas recombinantes, especialmente polipéptidos de menor tamaño, en cantidades suficientes y en forma soluble, es en muchos casos necesario expresar los mismos en E. coli como proteína de fusión o proteína híbrida con por ejemplo glutatión-S-transferasa o proteína de unión a maltosa. Asimismo en el mercado se encuentran numerosos sistemas de expresión, mediante los que se expresa el polipéptido deseado con una marca N terminal o C terminal para la purificación por afinidad tal como la marca de His, marca Strep o marca FLAG. Con frecuencia se encuentra en el plásmido de expresión entre los múltiples sitios de clonación, en los que se inserta la secuencia DNS que codifica por la proteína deseada, y la secuencia codificante para el componente de fusión o lamarca de afinidad, una secuencia de reconocimiento de proteasa. Ésta debe posibilitar que tras la expresión y purificación de la proteína de fusión pueda liberarse por la región peptídica adicional la proteína deseada mediante la adición de una endoproteasa específica de secuencia correspondiente (por ejemplo trombina, factor Xa o genenasa). Si los dos componentes de fusión no estuvieran unidos covalentemente entre sí mediante una unión peptídica, sino a través de un puente disulfuro, tras la purificación podría tener lugar una separación de uno de otro mediante una reducción sencilla con sustancias que contienen tiol tales como β-mercaptoetanol, DTT o glutatión

reducido. Por ejemplo, la proteína deseada podría eluirse por una matriz de afinidad tal como por ejemplo Ni-NTAagarosa o StrepTactin-Sepharose con los agentes de reducción mencionados, mientras que las marcas de afinidad permanecen unidas a la matriz. Por lo tanto podría no tener lugar una etapa de purificación adicional para la separación de la marca de afinidad o de una endoproteasa añadida.

Sería deseable por lo tanto un procedimiento para la expresión recombinante de proteínas/polipéptidos en general, especialmente de neurotoxinas así como de fragmentos y derivados de estas neurotoxinas, y de proteínas de fusión

o proteínas híbridas, especialmente de inmunotoxinas, que ya tras la lisis de las células huésped existen en su estructura bicatenaria (biológicamente) activa, estando unidas las dos cadenas por puentes disulfuro. Un procedimiento de este tipo para la producción de tales proteínas y polipéptidos se proporciona por la invención descrita en el presente documento.

Sorprendentemente el inventor ha descubierto ahora que el fragmento LHN de BoNT(A) tal como también la neurotoxina A completa, que se obtienen de forma bicatenaria de manera recombinante, ejercen su actividad biológica/bioquímica normal también en forma bicatenaria, con puente disulfuro, se obtienen de manera recombinante en forma bicatenaria, el fragmento LHN o la toxina completa, preferentemente al nivel de ácido nucleico, se someten al menos a una modificación determinada tal como se representa en la reivindicación 1. Ensayos posteriores del inventor han dado como resultado que lo correspondiente vale también para cualquier otra proteína/polipéptido, siempre que se obtengan en forma monocatenaria según procedimientos recombinantes convencionales, pero ejerzan su actividad biológica en forma bicatenaria, con puente disulfuro.

En el caso de la mencionada “al menos una modificación”, en el caso de BoNT(A) o en el caso del fragmento LHN de BoNT(A), se trata de la incorporación (inserción) de una secuencia de pentapéptido denominada en el presente documento como PRS (por protease recognition site (sitio de reconocimiento de proteasa)) tal como se representa en la reivindicación 1. En el caso general de la proteína/del polipéptido, una secuencia de pentapéptido, que está presente en la proteína/el polipéptido que va a modificarse, (preferentemente al nivel de ácido nucleico) puede modificarse alternativamente (por ejemplo mediante al menos un cambio de un resto de aminoácido o mediante inserción de sólo algunos restos de aminoácido de PRS o mediante deleción de restos de aminoácido), que corresponde a la secuencia de pentapéptido insertada mediante la inserción en la secuencia existente. Del mismo modo puede insertarse también una secuencia de hexa/hepta/octa (etc.)péptido, con o sin que deban delecionarse uno o dos o tres o varios restos de aminoácido. Según la invención es ventajoso únicamente que el polipéptido expresado en último lugar presente la secuencia (de pentapéptido) PRS su región de bucle, estando definida la región de bucle según la invención como la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre los dos restos de cisteína que participan en el puente disulfuro. Si esta secuencia PRS se encuentra en la región de bucle, esto lleva a que en el caso de la escisión del polipéptido monocatenario, en las proximidades a la secuencia de polipéptido PRS (al nivel de aminoácido) se encuentren también en dos cadenas distintas las secuencias que se encuentra de manera natural en dos cadenas distintas. En el caso de la neurotoxina botulínica A (BoNT(A) estas secuencia PRS se introduce en el bucle preferentemente con la deleción del pentapéptido Asp443 - Asn447 de BoNT(A) (véase la figura 3-1). En el caso de otras proteínas/polipéptidos (por ejemplo en el caso de BoNT(B), BoNT(C1), BoNT(D), BoNT(E), en el caso de ricina, en el caso de PE40 de la exotoxina de Pseudomonas o en el caso de la toxina diftérica (DT)) se prefiriere por el contrario introducir un bucle modificado de BoNT(A) (véanse las figuras 3-2 a 3-5) en la secuencia de bucle (pudiendo delecionarse restos de aminoácido de la secuencia de bucle natural o también no). Las secuencias de bucle modificadas en las figuras 3-2 a 3-5 son las secuencias respectivas sin los dos restos de Cys de extremo, pudiendo ser el aminoácido central de la secuencia PRS no sólo R, Y, H o Q, sino cualquiera de los aminoácidos de origen natural. En el caso de las otras proteínas/polipéptidos recién mencionadas se prefiere especialmente introducir sólo una parte del bucle modificado de BoNT(A), especialmente la secuencia GIITSKTKSLVPXGSKALNDL (X = un aminoácido de origen natural), en la secuencia de bucle (pudiendo delecionarse restos de aminoácido de la secuencia de bucle natural o también no). Las secuencias de bucle modificadas en las figuras 3-2 a 3-5 son las secuencias respectivas sin los dos restos de Cys de extremo.

Para el fragmento LHN de BoNT(A) o para la toxina recombinante completa quiere decir que la modificación de secuencia es una modificación en la región de bucle entre L y HN que proporciona la presencia de una secuencia PRS. La secuencia PRS es según la invención, y no sólo para BoNT(A), la secuencia de pentapéptido Val-Pro-Xaa-Gly-Ser. Xaa representa cualquier aminoácido de origen natural. No importa si Xaa es Arg u otro aminoácido de origen natural, la secuencia de pentapéptido Val-Pro-Xaa-Gly-Ser se denomina en cada caso como secuencia de pentapéptido PRS. Por el contrario si uno de los otros cuatro restos de aminoácido de la secuencia PRS está cambiado, lo que puede ser de enteramente en el contexto de la invención, especialmente por restos polares o no polares hidrófilos/hidrófobos de manera correspondiente, se habla en este caso y en adelante de una variante de la secuencia de pentapéptido PRS. Las variantes se producen por ejemplo cuando Val se sustituye por Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly. Además se producen variantes cuando (también o sólo) prolina en la segunda posición de PRS, visto desde el extremo N terminal, se sustituye por, por ejemplo, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly. También la glicina en la cuarta posición de PRS, por último, puede sustituirse por ejemplo por Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val, lo que lleva a su vez a otras variantes. Y cuando la serina en la quinta posición de PRS se sustituye por ejemplo por Tyr, Trp o Thr, dado el caso también por Cys o Met, se produce un tipo adicional de variantes. Es decir, según la invención se denominan como variantes de la secuencia de pentapéptido aquellas secuencias que en al menos una de las posiciones 1, 2, 4 y 5 de la secuencia PRS contienen un resto de aminoácido que es diferente de Val-1, Pro-2, Gly-4 y/o Ser-5.

Si el fragmento LHN de BoNT(A) (o la toxina completa) o cualquier otra proteína/polipéptido, que se obtiene normalmente de manera recombinante como proteína/polipéptido monocatenario, está contenido en forma biológicamente/bioquímicamente activa pero (sólo) en forma bicatenaria, la secuencia de pentapéptido Val-Pro-Xaa-Gly-Ser (en la que Xaa representa cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural, y también pueden cambiarse los otros cuatro restos de aminoácido en el sentido del párrafo anterior) se encuentra en el lisado de las células huésped de E. coli (por ejemplo K12 de E. coli, especialmente células huésped K12 de E. coli de las cepas M15[pREP4], XL1-BLUE o UT5600) en la forma bicatenaria, en la que en el caso de BoNT(A) la cadena ligera permanece covalentemente unida mediante un puente disulfuro con HN o con la cadena pesada completa (figura 7). La escisión de la cadena de polipéptido tiene lugar o bien inmediatamente tras la lisis celular o se concluye en gran parte tras una incubación de varias horas del lisado celular. Puede descartarse una autoproteolisis por la actividad del dominio de proteasa de la toxina o fragmento de toxina, dado que se producen también en la estructura bicatenaria mutantes inactivos por proteasa y modificados de manera correspondiente en la región de bucle tras la expresión y digestión de las células huésped de E. coli. Evidentemente una proteasa de la cepa huésped de E. coli es responsable de la escisión de la secuencia de pentapéptido PRS.

Una modificación según la invención adicional según el párrafo “Sorprendentemente el inventor ha ....” cuatro párrafos más arriba (en la página 5) consiste en que de manera N terminal de la secuencia PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido (la dirección de aminoácido del extremo N terminal, que se encuentra inmediatamente adyacente al resto de valina de la secuencia de pentapéptido PRS, en el caso de las figuras 3-2 a 3-5 un resto de leucina, tiene una distancia de 1 resto de aminoácido con respecto a la secuencia PRS), especialmente a una distancia de 3 a 15 restos de aminoácido, especialmente a una distancia de 3 a 10 restos de aminoácido, de manera especialmente preferente a una distancia de 3 a 8 restos de aminoácido, y de manera muy especialmente preferente a una distancia de 3 restos de aminoácido, un resto de aminoácido básico, se encuentra preferentemente un resto de lisina o de arginina, en cuyo extremo C terminal la proteasa de la célula huésped de E. coli escinde la secuencia de bucle. Es decir, tras la escisión se obtiene un polipéptido que presenta por ejemplo dos restos de aminoácido (cuando la distancia recién definida asciende a 3 restos de aminoácido) de manera N terminal con respecto al resto de valina de la secuencia PRS. En el presente caso “variación” no significa necesariamente una variación en el sentido real, es decir por ejemplo una inserción o sustitución de un resto de aminoácido, de modo que a continuación de manera N terminal de la secuencia PRS a la distancia indicada anteriormente de 1 a 20 restos de aminoácido se encuentra un resto de aminoácido básico (por ejemplo un resto de lisina). Tan sólo es decisivo que se encuentre un resto de aminoácido básico (tal como un resto de lisina o de arginina) de manera N terminal de la secuencia PRS a la distancia indicada anteriormente.

Una variación adicional, igualmente no necesaria, pero preferida según el párrafo “Sorprendentemente el inventor ha ....” cinco párrafos más arriba consiste en que la secuencia de bucle, en la que escinde la proteasa de las células huésped de E. coli, tienen una longitud de al menos nueve restos de aminoácido. Longitudes preferidas de la secuencia de bucle son al menos doce, al menos 15, al menos 18, al menos 20 y al menos 23 restos de aminoácido. Longitudes especialmente preferidas de la secuencia de bucle son de 1,5 a 22, especialmente de 18 a 22 restos de aminoácido.

Es decir el procedimiento según la invención es muy en general un procedimiento para la producción de proteínas/polipéptidos en forma bicatenaria, en la que las dos cadenas están unidas por puente disulfuro, por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli, en el que (i) la proteína/el polipéptido ejerce su actividad biológica como proteína/polipéptido bicatenario, con puente disulfuro, (ii) el resto de aminoácido C terminal de la primera cadena es un resto de Arg o Lys, (iii) la segunda cadena de la proteína/del polipéptido, de manera N terminal con respecto a un resto de cisteína como extremo N terminal presenta de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val

o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr; y (iv) el procedimiento comprende las siguientes etapas: (a) modificar la proteína/del polipéptido, al nivel de ácido nucleico, de modo que la proteína/el polipéptido en su forma modificada en su región de bucle presenta la secuencia de pentapéptido mencionada (VPXGS); (b) introducir el constructo modificado al nivel de ácido nucleico en células de E. coli; (c) cultivar y a continuación lisar las células huésped; y (d) aislar la proteína/el polipéptido bicatenario.

La primera cadena de la proteína/del polipéptido es según la invención de manera preferente la cadena que se codifica por el extremo N terminal del ADN correspondiente, mientras que la segunda cadena de la proteína/del polipéptido es por consiguiente la cadena que se codifica por el extremo C terminal del ADN correspondiente. Es decir, dado que la expresión de 5’-ADN-3’ lleva a N-polipéptido-C, quiere decir que para caso de la invención preferido mencionado anteriormente que la expresión puede representarse tal como sigue: 5’-ADN-3’ expresa para dar N-primera cadena de polipéptido-C-bucle-N-segunda cadena de polipéptido-C. El bucle se escinde según la presente invención ya in situ, de modo que por último se obtiene el polipéptido/la proteína según la invención Nprimera cadena de polipéptido-C-N-segunda cadena de polipéptido-C en estructura bicatenaria.

Con la expresión “la segunda cadena de la proteína/del polipéptido presenta de manera N terminal con respecto a un resto de cisteína como extremo N terminal de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS” se quiere expresar que el extremo N terminal no se forma por ejemplo por el resto de valina de la secuencia de pentapéptido VPXGS, sino por otro resto de aminoácido (cualquiera). Entre éste y el

resto de valina de PRS pueden encontrarse entonces aún de 1 a 19 restos de aminoácido más, pero el resto de aminoácido N terminal puede unirse por ejemplo con el resto de valina también directamente por medio de unión peptídica, es decir, estar directamente adyacente al resto de valina de PRS.

Las proteínas/polipéptidos según la invención que pueden aislarse en su estructura bicatenaria (biológicamente) activa son proteínas cuyo extremo C terminal de la primera cadena es un resto de aminoácido básico, especialmente un resto de Arg o de Lys, y suya segunda cadena presenta de manera N terminal de 1 a 20 restos de aminoácido y la secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X, V, P, G y S se definen tal como anteriormente.

Según de la presente invención, por ejemplo en el caso de las inmunotoxinas que se basan en ricina recombinante, no es necesario un tratamiento mediante una proteasa específica de secuencia tal como trombina o factor Xa para la activación. En el caso de por ejemplo inmunotoxinas a base de toxina diftérica o exotoxina de Pseudomonas era de esperar un claro aumento de eficacia, que también se consigue realmente, dado que ya no es necesario el procesamiento mediante una proteasa de la célula diana como etapa determinante de la velocidad para la translocación del dominio enzimático de las toxinas en el citoplasma. Las inmunotoxinas de este tipo, que se encuentran ya como polipéptidos bicatenarios, con puente disulfuro, pueden usarse en pequeñas dosis y no obstante conseguir el mismo efecto citotóxico. Esto baja por un lado los costes de la terapia, por otro lado reduce el riesgo de formación de anticuerpos que podían hacer ineficaz a la inmunotoxina en otras aplicaciones. Un procedimiento para la producción de inmunotoxinas bicatenarias, con puente disulfuro y por lo tanto activadas se proporciona por la presente invención.

Con el procedimiento proporcionado según la invención pueden producirse también proteínas de fusión o proteínas híbridas, es decir por ejemplo proteínas con una marca peptídica para la purificación por afinidad, en una forma bicatenaria, cuyas dos cadenas de polipéptido están unidas covalentemente por un puente disulfuro y pueden separarse una de otra según un método de cromatografía de afinidad u otro método de purificación mediante reducción simple con sustancias que contienen tiol tales como β-mercaptoetanol, DTT o glutatión reducido.

La expresión recombinante de neurotoxinas clostridiales y sus fragmentos (por ejemplo un fragmento LHN o un derivado de una neurotoxina clostridial, por ejemplo especificidad celular modificada) en cepas de expresión de E. coli tales como M15[pREP4] o BL21(DE3) lleva a polipéptidos monocatenarios. Mediante el tratamiento de estos polipéptidos con tripsina tiene lugar una escisión en la región de la secuencia de bucle en la región de transición del domino de proteasa al dominio de translocación. Dado que en el caso de tripsina no se trata de una proteasa específica de secuencia, es probable una escisión, en la mayoría de los casos indeseada, en otras regiones de los polipéptidos. Así BoNT(A) se escinde mediante tripsina adicionalmente entre HN y HC, generándose un fragmento bicatenario LHN y un fragmento HC. Para garantizar una escisión selectiva deseada en la mayoría de los casos en la región de bucle, es necesaria la presencia, dado el caso tras su introducción, de una secuencia de reconocimiento para endoproteasas específicas.

La escisión de proteínas de fusión/proteínas híbridas producidas de manera recombinante por medio de endoproteasas específicas de secuencia tales como trombina, factor Xa, genenasa etc. pertenece al espectro de métodos generalmente conocidos. Así es posible separar tras la purificación un componente de fusión que ayuda a la proteína/el polipéptido recombinante a conseguir una solubilidad y/o expresión mejorada o que sirve como marca peptídica para la purificación por afinidad. Para ello se incuba la disolución de proteína con la endoproteasa adecuada en forma soluble o inmovilizada en una matriz.

Esta técnica puede aprovecharse también en el caso de la expresión de las proteínas/los polipéptidos recombinantes mencionados anteriormente que ejercen su actividad biológica/bioquímica normal como proteínas/polipéptidos bicatenarios, por medio de la tecnología de ADN recombinante pero se obtienen como proteínas/polipéptidos monocatenarios inactivos (por ejemplo en el caso de la expresión de neurotoxinas clostridiales, fragmentos de neurotoxinas clostridiales tales como fragmentos LHN o de derivados de neurotoxinas clostridiales, por ejemplo con especificidad celular modificada): en el polipéptido, preferentemente al nivel de los ácidos nucleicos, se clona por ejemplo en la región de bucle entre L y HN una secuencia de reconocimiento para una endoproteasa, y además se clona en el polipéptido en el extremo N o C terminal una secuencia de reconocimiento adicional para la misma u otra endoproteasa, flanqueada por una marca peptídica para la purificación por afinidad. La proteína/el polipéptido expresado de forma monocatenaria se activa entonces mediante tratamiento con la o las endoproteasa(s) correspondientes al mismo tiempo o de forma sucesiva mediante la escisión en la región de bucle entre L y HN y se libera por la marca peptídica.

A excepción de los costes del uso de tales endoproteasas y las etapas de trabajo adicionales relacionadas con el mismo, su uso en preparaciones farmacéuticas (por ejemplo en el caso de uso de toxinas botulínicas recombinantes

o sus derivados) es sumamente problemático por motivos de la legislación de fármacos (regulatorios). Por un lado la pureza de la endoproteasa usada debe estar experimentalmente comprobada, por otro lado su agotamiento completo y especialmente la ausencia de virus de la preparación en el transcurso adicional del protocolo de purificación ha de documentarse con la máxima exactitud, lo que por regla general significa un enorme esfuerzo analítico. Dado que en el futuro se producirán también toxinas botulínicas por ejemplo con propiedades mejoradas o especificidades celulares modificadas en rutas recombinantes, existe una gran necesidad de un procedimiento de

expresión que posibilite la provisión de las proteínas/los polipéptidos recombinantes mencionados anteriormente, que ejercen su actividad biológica/bioquímica normal como proteínas bicatenarias/ polipéptidos, por medio de la tecnología de ADN recombinante pero que se obtienen como proteínas/polipéptidos monocatenarios, especialmente la provisión de toxinas botulínicas o sus derivados, como polipéptidos/proteínas bicatenarios, con puente disulfuro y por lo tanto biológicamente activos, sin que deban usarse endoproteasas.

La invención explicada en detalle en las secciones siguientes proporciona por tanto en el sentido más amplio procedimientos con los que pueden expresarse proteínas tales como neurotoxinas clostridiales así como sus fragmentos y derivados de manera recombinante en células huésped de E. coli y pueden aislarse en su forma bicatenaria, con puente disulfuro y por lo tanto biológicamente activa, sin que para su activación se requiera una endoproteasa añadida.

En una primera forma de realización preferida de la invención, la secuencia de aminoácidos de la región de bucle de BoNT(A) está modificada entre los restos de cisteína 430 y 454 (véanse las figuras 3-1 a 3-5) de manera que la toxina expresada, o sus fragmentos/derivados, se encuentran en el lisado de las células huésped de E. coli ya como polipéptidos bicatenarios. A este respecto las dos cadenas están unidas covalentemente entre sí a través de puente disulfuro con la participación de los restos de cisteína 430 y 454. En una forma de realización especialmente preferida de la invención, tal como se explica en la figura 3, puede sustituirse el pentapéptido Asp443 - Asn447 (DKGYN) por Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS). En formas de realización preferidas adicionales de la invención el pentapéptido Asp443 - Asn447 (DKGYN) se sustituye también por Val-Pro-Tyr-Gly-Ser (VPYGS), Val-Pro-His-Gly-Ser (VPHGS) o Val-Pro-Gln-Gly-Ser (VPQGS). En este caso es también válido que no sólo el resto de aminoácido central puede ser un aminoácido de origen natural cualquiera, sino también, que los otros cuatro restos de aminoácido pueden estar asimismo cambiados, tal como se explicó adicionalmente con todo detalle anteriormente (con el cambio de al menos uno de estos restos se produce una variante de la secuencia PRS en el sentido de la invención). Además para éstos es válido tal como para todas las formas de realización preferidas adicionales, que se describen a continuación, que se prefiere adicionalmente que la secuencia de bucle presente de manera N terminal con respecto a la PRS a una distancia de 1 a 20 aminoácidos un resto de aminoácido básico, especialmente un resto de lisina o de arginina.

Para el experto es sin más evidente que cambios adicionales de restos de aminoácido individuales o varios restos de aminoácido o la inserción o deleción de restos de aminoácido adicionales en la región del bucle caracterizado anteriormente de BoNT(A) conducen asimismo al resultado de que la toxina expresada según la invención o los fragmentos/derivados que se derivan de la misma se encuentran el lisado como polipéptidos bicatenarios. Estas variantes posibles son asimismo objeto de la invención.

Pero igualmente para el experto es sin más evidente que el pentapéptido Asp443 - Asn447 (DKGYN) presente en el tipo natural de BoNT(A) puede sustituirse por un hexapéptido, por un heptapéptido, por un octapéptido, etc., siempre que en el polipéptido/proteína expresado y traducido en forma monocatenaria la secuencia de pentapéptido PRS o una de sus variantes concebibles se encuentre en la región de bucle. Tal como ya se estableció además anteriormente se prefiere que de manera N terminal con respecto al pentapéptido esté presente un resto de aminoácido básico (preferentemente lisina).

El experto apreciará además que en el caso de la forma de realización preferida del pentapéptido (Val-Pro-Arg-Gly-Ser) de PRS se trata de una parte de una secuencia de reconocimiento posible para la proteasa trombina, que desempeña un papel importante en la cascada de coagulación sanguínea y presenta una alta especificidad de secuencia. Se indica expresamente que, 1. ni el en caso de la neurotoxina botulínica de tipo A ni en el caso de otros polipéptidos es necesaria una escisión mediante trombina para obtener la forma bicatenaria, con puente disulfuro deseada, y que 2. si bien la secuencia de reconocimiento de trombina como tal, es decir su forma no modificada, es conveniente para la escisión mediante la actividad proteasa del lisado de E. coli, en cambio no es en absoluto necesaria. Las formas de realización de las secuencias de pentapéptido PRS insertadas en los polipéptidos correspondientes (mejor dicho: en sus bucles) o generadas en los mismos, que no contienen el resto de arginina (sino en su lugar otro de los aminoácidos de origen natural), en su extremo C terminal puede escindir trombina, llevan, tal como ya se mencionó, asimismo a la escisión en el bucle. A este respecto la escisión tiene lugar de manera preferente en un resto de lisina del bucle de manera N terminal con respecto al pentapéptido, tal como anteriormente se explicó adicionalmente (véase también el ejemplo 2; figura 3).

Dado que también otros serotipos de las toxinas botulínicas tales como BoNT(B) y BoNT(C1) pueden aprovecharse terapéuticamente como neurotoxina de acción prolongada y BoNT(E) como neurotoxina de acción corta, y otros polipéptidos/proteínas muy diferentes, que se generan en forma monocatenaria de manera recombinante, pero sólo desarrollan actividad biológica en forma bicatenaria, sería deseable que estas neurotoxinas así como fragmentos o derivados de las mismas (y también los polipéptidos/proteínas distintos) puedan obtenerse asimismo como polipéptidos/proteínas bicatenarios, con puente disulfuro, a partir de lisados de E. coli. Especialmente en el caso de BoNT(B) una escisión completa de la toxina recombinante en el lisado de E. coli en el polipéptido/proteína bicatenario traería una clara ventaja con respecto a la neurotoxina nativa secretada en Clostridium botulinum, que por regla general se encuentra en al menos el 40 % como polipéptido monocatenario y por lo tanto inactivo y que no puede separarse de la forma activa bicatenaria. Es sorprendente que las regiones de bucle de las neurotoxinas de los serotipos B, C1 y E son claramente más cortas entre los restos de cisteína que participan en el puente disulfuro

con respecto al bucle de BoNT(A) (figuras 3 y 4). Mientras que en el caso de BoNT(A) son 23 restos de aminoácido (Val431 - Leu453), en el caso de BoNT(B) se encuentran únicamente 8 (Lys438 - Ile445), en el caso de BoNT(C1) 15 (His438 - Asp452) y en el caso de BoNT(E) 13 restos de aminoácido (Lys413 - Ile425) en esta región. No obstante se mostró, a excepción de BoNT(B), que estas regiones acortadas en comparación son suficientemente largas para permitir la escisión de la cadena y la formación de puentes disulfuro, cuando presentan la secuencia PRS según la invención. Aunque también la BoNT(B) en el caso de un cambio de un pentapéptido en el bucle mediante una secuencia de pentapéptido PRS (con ello la longitud total de la secuencia de bucle es de sólo ocho restos de aminoácido) en el sentido de la invención se escindió en dos cadenas (ligera y pesada), se obtuvieron sin embargo mejores resultados, es decir, según la invención se prefiere tener un bucle de al menos 9, al menos 15, al menos 20

o incluso al menos 22 restos de aminoácido. Una de las últimas formas de realización mencionadas, en la que el bucle presenta 22 restos de aminoácido, puede deducirse a modo de ejemplo de las secuencias en las figuras 4-1 y 4-2 o una comparación entre ambas.

Por lo tanto se comprobó también experimentalmente que se preferiría un cambio de las regiones de bucle en los subtipos B, C1, etc., o partes esenciales de las mismas, frente a la región de bucle de BoNT(A), o partes esenciales de la misma, lo que afecta a la escisión de las neurotoxinas para dar polipéptidos/proteínas bicatenarias, con puente disulfuro, especialmente cuando mediante esta medida el bucle se alarga al menos 9, mejor 15 restos y/o de manera N terminal de PRS podía introducirse un resto de aminoácido básico (por ejemplo y preferentemente un resto de Lys) (siempre que previamente no hubiera tampoco ningún resto de Lys o básico N terminal). Se preferían especialmente variaciones, tal como se representan en la figura 4 (siendo las secuencias PRS en la figura 4 VPRGS, igualmente, y se prefieren de igual modo también las secuencias VPYGS, VPHGS, VPQGS, VPKGS, VPIGS y VPAGS).

En otras formas de realización de la invención las secuencias de aminoácidos y los segmentos génicos que codifican las mismas de las regiones de bucle en las toxinas botulínicas de los serotipos B, C1, D, E, F y G así como de toxina tetánica están modificadas entre los restos de cisteína que participan en el puente disulfuro entre L y HN de tal manera que las toxinas expresadas o los fragmentos/derivados derivados de las mismas en el lisado de las células huésped de E. coli se encuentran ya como polipéptidos bicatenarios, en los que las dos cadenas están unidas covalentemente a través de un puente disulfuro (de manera correspondiente es válido también para cualquier otro polipéptido/proteína que se genere en forma monocatenaria de manera recombinante, pero sólo muestre actividad biológica en forma bicatenaria). En formas de realización preferidas de la invención las regiones de bucle completas (o partes de las mismas) de las neurotoxinas o de los fragmentos/derivados de toxina que se derivan de las mismas pueden cambiarse por la región de bucle completa de BoNT(A), tal como se caracteriza en la figura 3, o partes de la región de bucle de BoNT(A), en las que el pentapéptido Asp443 - Asn447 se sustituye preferentemente por ejemplo por Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS). En formas de realización preferidas adicionales de la invención el pentapéptido Asp443 - Asn447 puede sustituirse también por Val-Pro-Tyr-Gly-Ser, Val-Pro-His-Gly-Ser o Val-Pro-Gln-Gly-Ser. En formas de realización especialmente preferidas de la invención las regiones de bucle o partes de las regiones de bucle de las neurotoxinas mencionadas y de los fragmentos/derivados que se derivan de las mismas pueden sustituirse por el oligopéptido Arg/Ser-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (18-mero: R/SGIITSKT KSLVPRGSKA). Otros cambios, inserciones o deleciones de restos de aminoácido individuales o de varios restos de aminoácido en la región de la secuencia de bucle caracterizada anteriormente, tal como puede verse por ejemplo en la figura 4, y que asimismo llevan a que la neurotoxina expresada o su fragmento/derivado tras la expresión en E. coli (por ejemplo en células huésped K12 de E. coli o sus derivados) se encuentre como polipéptido/proteína bicatenario, con puente disulfuro, expresamente con un componente de esta invención (de manera correspondiente es válido también para cualquier otro polipéptido/proteína que se generen en forma monocatenaria de manera recombinante, pero que sólo muestren actividad biológica en forma bicatenaria).

Tal como ya se explicó repetidamente, con el procedimiento según la invención según una forma de realización adicional de la invención pueden producirse también proteínas de fusión o proteínas híbridas que presentan por ejemplo los siguientes componentes A, B y C:

-

un dominio efector que, mediante su actividad enzimática puede por ejemplo inhibir la secreción en células

diana o destruir las mismas (A); -una secuencia de bucle que está modificada según la invención, tal como se describió anteriormente, y que

presenta la secuencia de pentapéptido PRS VPXGS definida anteriormente (por ejemplo una de las

secuencias de bucle de BoNT(A) modificadas, representadas en la figura 3 o variantes de las mismas) y a

la que puede añadirse de manera N y/o C terminal un resto de cisteína (B), así como -un dominio de unión celular que confiere a la proteína de fusión/híbrida una especificidad celular (C).

El componente B (secuencia de bucle) puede ser en cambio en las dos formas de realización mencionadas de manera inmediatamente anterior preferente igualmente (i) una de las secuencias de bucle modificadas representadas en la figura 4, (ii) cualquier secuencia derivada de las mismas, como el resto central de PRS puede ser el resto de un aminoácido cualquiera de origen natural, o (iii) una variante (para la definición de variante véase anteriormente) de (i) o (ii). En la figura 4 se delecionaron las secuencias de bucle de BoNT(B), BoNT(C1) o BoNT(E) respectivas hasta uno o dos restos de aminoácido N terminales y los dos C terminales y los restos de aminoácido delecionados se sustituyeron por el 17-mero GIITSKTKSLVPRGSKA (figuras 4-2 y 4-6) o el 18-mero RGIITSKTKSLVPRGSK A (figura 4-4) a partir de la secuencia de bucle modificada de BoNT(A).

Además de los componentes A, B y C mencionados anteriormente las proteínas de fusión/proteínas híbridas pueden presentar un dominio de translocación (que en el caso de las neurotoxinas botulínicas se encuentra entre la secuencia de bucle y el dominio de unión celular). Este dominio adicional es de ayuda en la inclusión del dominio efector en el citoplasma de la célula diana. La expresión de proteínas de fusión de este tipo en E. coli (por ejemplo K12 de E. coli o derivados de la misma) lleva a polipéptidos/proteínas bicatenarios en los que un dominio se encuentra en una cadena y los dos otros dominios se encuentran en la segunda cadena (en el caso de las toxinas botulínicas el dominio efector está unido covalentemente en la cadena ligera a través de un puente disulfuro con los otros dos dominios en la cadena pesada.

En el caso de estas proteínas de fusión o proteínas híbridas según la invención puede tratarse de las denominadas inmunotoxinas que se emplean especialmente en la terapia antitumoral. A este respecto se confiere a un dominio de toxina mediante la adición de un dominio de unión celular una especificidad por un tipo celular determinado, por regla general una célula tumoral. Como dominios de toxina se usan sobre todo los dominios enzimáticos de toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y ricina. Estas toxinas pertenecen a las toxinas AB bicatenarias, en las que la cadena A contiene la actividad enzimática, está unida mediante un puente disulfuro covalentemente con la cadena B, que reúne la actividad de translocación y de unión celular. Pueden concebirse también otras toxinas o fragmentos de toxina en inmunotoxinas, siempre que desarrollen el efecto deseado (por ejemplo la destrucción de células tumorales) en las células diana. Mientras que la primera generación de inmunotoxinas se produjo mediante acoplamiento químico de un dominio de toxina tal como por ejemplo la cadena A de ricina con un anticuerpo monoclonal, las inmunotoxinas de la segunda generación se expresaron principalmente en E. coli de manera recombinante como toxinas Fab, toxinas Fv monocatenarias (toxinas scFv) o toxinas Fv estabilizadas por disulfuro (toxinas dsFv), pero también como proteínas de fusión con factores de crecimiento o citocinas (Reiter, 2001). En generaciones futuras de inmunotoxinas la especificidad celular puede conferirse también por polipéptidos modificados y seleccionados tras unión de alta afinidad por ejemplo a una proteína de superficie específica de tumor por ejemplo de las familias de proteínas de las afilinas, proteínas de repetición de anquirina o anticalinas.

En todas las variantes concebibles de las inmunotoxinas debe estar garantizado que el dominio enzimático de toxina llega al citoplasma de la célula diana, para poder desplegar allí el efecto tóxico. Dado que las inmunotoxinas se expresan en E. coli como polipéptidos monocatenarios, son necesarias una escisión proteolítica así como una reducción de un puente disulfuro para separar en cadenas el dominio enzimático de toxina de la unidad de translocación y el dominio de unión celular. En el caso del fragmento de toxina diftérica recombinante y del fragmento de exotoxina de Pseudomonas recombinante tiene lugar una escisión tras la internalización en el compartimento endosómico de la célula diana mediante una proteasa celular tal como furina (Williams y col., 1990). Por el contrario, la ricina no tiene ningún sitio de procesamiento de este tipo y necesita por lo tanto una secuencia de reconocimiento de proteasa introducida artificialmente, para poder aplicarse ya como una inmunotoxina bicatenaria, con puente disulfuro. Pero también en el caso de las inmunotoxinas que se basan en toxina diftérica y exotoxina de Pseudomonas, sólo se escinde una pequeña parte de las proteínas de fusión internalizadas, de modo que también sólo una parte igualmente pequeña de los dominios enzimáticos puede llegar al citoplasma (Ogata y col., 1990). Las formas de realización preferidas de la invención presentadas a continuación describen procedimientos y constructos, pudiendo expresarse con los procedimientos, de manera recombinante en células huésped de E. coli, variantes de inmunotoxinas, tal como se describieron en las secciones anteriores, y aislarse en su forma activa bicatenaria, con puente disulfuro y por lo tanto biológicamente (enzimáticamente) activa, sin que para su activación necesite una endoproteasa celular o una endoproteasa añadida in vitro. Estas inmunotoxinas pueden llevar los dominios enzimáticos de toxina en una forma competente de translocación a la célula diana, de modo que no es necesaria una escisión mediante una proteasa celular y deben usar esencialmente menores dosis de la inmunotoxina para alcanzar los mismos efectos citotóxicos deseados.

Una forma de realización preferida adicional de la invención comprende por consiguiente adicionalmente una proteína de fusión o proteína híbrida que presenta los siguientes componentes A, B y C:

-

un dominio de toxina o su fragmento/derivado (A),

-

una secuencia de bucle, que según la invención, tal como se describió anteriormente, está modificada y presenta la secuencia de pentapéptido PRS VPXGS definida anteriormente (por ejemplo una de las secuencias de bucle de BoNT(A) modificadas representadas en la figura 3 o variantes de las mismas) y puede añadirse de manera N y/o C terminal un resto de cisteína (B), así como

-

un dominio de unión celular que puede derivarse de un representante de las familias de proteínas de los anticuerpos monoclonales, de sus fragmentos, de las afilinas, de las proteínas de repetición de anquirina, de las anticalinas, de los factores de crecimiento (por ejemplo TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1) o de las citocinas (por ejemplo IL2, IL4 o IL6) (C).

El componente B (secuencia de bucle) puede ser según esta última forma de realización preferida igualmente (i) una de las secuencias de bucle modificadas representadas en la figura 4, (ii) cualquier secuencia derivada de las mismas, como el resto central de PRS puede ser el resto de un aminoácido de origen natural, o (iii) una variante (para la definición de variante véase anteriormente) de (i) o (ii).

El dominio de toxina puede ser la cadena A de ricina, un fragmento de la exotoxina de Pseudomonas tal como PE40

o PE38 (dominios II y III con o sin comprender el dominio Ib; figura 2) o un fragmento de la toxina diftérica. Los

dominios efector, de toxina y de unión celular mencionados han de entenderse como ejemplos. La invención incluye todas las proteínas o fragmentos de proteína, que por un lado confieren a la proteína de fusión/proteína híbrida una actividad de unión específica en un antígeno superficial de una célula diana, por ejemplo de una célula tumoral, y por otro lado en una célula diana tras la internalización ejercen un efecto determinado, por ejemplo la destrucción de la célula, llevando la expresión de tales proteínas de fusión/proteínas híbridas según la invención en E. coli a polipéptidos/proteínas bicatenarios, en los que el dominio de toxina o derivados del mismo está covalentemente unido mediante un puente disulfuro con el dominio de unión celular.

Para mejorar la eficacia y especificidad de inmunotoxinas a base de exotoxina de Pseudomonas se seleccionaron en el pasado distintos planteamientos. Así se cambió por ejemplo el dominio de unión a receptor (dominio Ia con los restos de aminoácido 1 - 152) por fragmentos de un anticuerpo monoclonal y al mismo tiempo se modificó la región de bucle (figura 2 y 5) en el dominio de translocación (dominio II) entre los restos de cisteína 13 y 35 (numeración con respecto al dominio II) de tal manera que éste ya no era sensible a la escisión de la proteasa celular ubicua furina, sino que en su lugar a proteasas especiales que sólo se expresan por células tumorales determinadas en mayor medida y se secretan parcialmente (patente estadounidense 6.426.075). Esta sensibilidad a proteasa modificada debería conferir a la inmunotoxina además del dominio de unión a receptor cambiado una especificidad celular elevada. No obstante no se puede suponer que mediante otras proteasas celulares se produce una escisión aumentada en el bucle y con ello una eficacia de translocación mejorada del dominio enzimático III.

En un planteamiento adicional para una inmunotoxina se eliminan el dominio de unión a receptor y la región N terminal del dominio de translocación hasta el resto de arginina 27 en la región de bucle. La especificidad celular necesaria se confería a una inmunotoxina de este tipo por ejemplo mediante inserción de un domino VH de un anticuerpo monoclonal, al que estaba unido a través de un puente disulfuro el domino VL, en el sitio del dominio Ib entre los dominios II y III o mediante inserción en el extremo C terminal del dominio III (patente estadounidense 5.980.895). En tales constructos ya no es necesaria una activación mediante una proteasa, lo que por un lado provocaría una eficacia de translocación claramente elevada. No obstante ha de temerse que por otro lado la translocación se impida mediante los dominios de unión a receptor que se encuentran de manera N o C terminal del dominio enzimático III tal como el domino VH de un anticuerpo monoclonal o TGF-alfa. Dado que estos dominios de unión a receptor no se separan del dominio enzimático, ha de contarse también con efectos negativos sobre la actividad enzimática y por lo tanto la toxicidad en las células diana. Un máximo relativo en actividad citotóxica se obtiene con una inmunotoxina a base de exotoxina de Pseudomonas, cuando por un lado el bucle entre los restos de cisteína 13 y 35 se encuentra ya durante la aplicación en la forma escindida, con puente disulfuro y por lo tanto no es necesaria una activación mediante una proteasa celular, por otro lado el dominio de unión a receptor en el sitio del dominio I de la exotoxinas está fusionado al extremo N terminal del dominio de translocación, de modo que se separa de los dominios de toxina tras la reducción en el citoplasma y por lo tanto no puede verse afectada la actividad enzimática del dominio III.

Una forma de realización especialmente preferida de la invención comprende por lo tanto una proteína de fusión/proteína híbrida que comprende un dominio de unión celular que puede tomarse de un representante de las familias de proteínas de los anticuerpos monoclonales, de sus fragmentos, de las afilinas, de las proteínas de repetición de anquirina, de las anticalinas, de los factores de crecimiento (por ejemplo TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF1) o de las citocinas (por ejemplo IL2, IL4 o IL6), al que está fusionado de manera C terminal un fragmento PE38 modificado que puede portar en C terminal la señal de retención para el retículo endoplasmático, Lys-Asp-Glu-Leu, o variantes de la misma. La modificación del fragmento PE38 consiste en que la secuencia de bucle completa (o también sólo una parte de la misma) entre los restos de cisteína 13 y 35 se cambió por la secuencia de pentapéptido PRS VPXGS, preferentemente por la secuencia de bucle de BoNT(A) modificada, representada en la figura 3 o de la misma, especialmente por la secuencia peptídica Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (figura 5) (con respecto a la definición de las variantes, véase anteriormente). Preferentemente también en esta forma de realización se ocupa de que de manera N terminal con respecto a PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido se encuentre un resto de aminoácido básico, tal como en la secuencia representada en la figura 5. Un fragmento PE-38 modificado de manera correspondiente así como proteínas de fusión/proteínas híbridas, que contiene este fragmento modificado, se encuentran en el lisado de las células huésped de E. coli (por ejemplo M15 [pREP4]) en la forma bicatenaria, con puente disulfuro.

A diferencia del caso de la exotoxina de Pseudomonas el dominio enzimático de la toxina diftérica, la cadena A, se encuentra en el extremo N terminal. En la cadena B C terminal se encuentran los dominios de translocación y de unión a receptor. Ambas cadenas están unidas mediante una secuencia de bucle, en la que en el resto de arginina 193 durante la secreción a partir de células de Corynebacterium diphtheriae mediante una proteasa tiene lugar una escisión proteolítica (Collier, 2001). Las dos cadenas permanecen unidas entre sí covalentemente tras la escisión mediante un puente disulfuro entre los restos de cisteína 186 y 201. En este sentido la toxina diftérica se parece en su estructura de dominios a las toxinas botulínicas y a la toxina tetánica.

Para la producción de inmunotoxinas recombinantes se cambió el dominio de unión a receptor o una parte del mismo por ejemplo por VEGF o IL2 (Arora y col., 1999; Williams y col., 1990), para conferir a la proteína de fusión una nueva especificidad celular. Para que la cadena A pueda llegar al citoplasma de las células diana, por un lado debe escindirse la cadena de polipéptido de la inmunotoxina expresada en forma monocatenaria en E. coli en la región del bucle entre la cadena A y B, por otro lado reducirse el puente disulfuro. Mientras que esto último tiene

lugar en el transcurso del proceso de translocación, la escisión proteolítica mediante una proteasa celular es incompleta, de modo que sólo puede liberarse un pequeño porcentaje de la cadena A en el citoplasma (Williams y col., 1990). Si la inmunotoxina se encontrara ya durante la aplicación en la forma bicatenaria, con puente disulfuro, cabría esperar un claro aumento de eficacia, dado que todas las cadenas A se proporcionarían en una forma competente de translocación.

Una forma de realización especialmente preferida adicional de la invención comprende por lo tanto una proteína de fusión o proteína híbrida que comprende un dominio de unión celular que puede tomarse de un representante de las familias de proteínas de los anticuerpos monoclonales, de sus fragmentos, de las afilinas, de las proteínas de repetición de anquirina, de las anticalinas, de los factores de crecimiento (por ejemplo TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF1) o de las citocinas (por ejemplo IL2, IL4 o IL6), al que está fusionado de manera N terminal un fragmento de toxina diftérica modificado. Este fragmento de toxina puede comprender la cadena A así como al menos el dominio de translocación de la cadena B (Gly1 - Phe389 o Gly1 - Asn486). La modificación del fragmento de toxina diftérica consiste en que la secuencia de bucle completa (o también sólo una parte de la misma) entre los restos de cisteína 186 y 201 se cambió por la secuencia de bucle de BoNT(A) modificada representada en la figura 3 o variantes de la misma, especialmente por la secuencia peptídica Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (figura 5) (con respecto a la definición de las variantes, véase anteriormente). Un fragmento de toxina diftérica modificado de manera correspondiente así como proteínas de fusión que contienen este fragmento modificado, se encuentran en el lisado de las células huésped de E. coli tal como por ejemplo M15[pREP4] en la forma bicatenaria, con puente disulfuro.

Las inmunotoxinas a base de ricina de la primera generación se producían mediante la unión de la cadena A de la ricina con un anticuerpo monoclonal. Esto sucedía hasta el momento mediante derivatización del anticuerpo con una molécula de conector químico, que con la función tiol del resto de cisteína que se encuentra en el extremo C terminal de la cadena A formaba un puente disulfuro. Los conjugados de este tipo eran heterogéneos debido a la derivatización no controlada del anticuerpo. La eficacia contra tumores resultó no ser suficiente, no en último lugar, debido al tamaño del conjugado y a la ausencia del dominio de translocación localizado en la cadena B. Si la cadena B en la forma nativa es también componente de la inmunotoxina, es decir se aumenta la toxicidad claramente, se produce en cambio debido a las propiedades de unión celular de tipo lectina de la cadena B para la captación no específica también en otras distintas de las células diana deseadas. Este conflicto de diana se encontró con una estrategia en al que la cadena B se modificó de tal manera que si bien se mantenía la actividad de translocación, en cambio se aumentaba la afinidad de unión para glicoestructuras en las superficies celulares (solicitud de patente WO 89/04839). Las inmunotoxinas expresadas de manera recombinante que contienen una cadena B modificada de este tipo, están en cambio en forma monocatenaria, de modo que debido a la ausencia de secuencia de reconocimiento para una proteasa celular en el péptido conector entre la cadena A y la cadena B no es posible o sólo de manera muy ineficaz una liberación y translocación de la cadena A en caso de la captación de la inmunotoxina en la célula diana. En la patente estadounidense 6.593.132 se documentan modificaciones de este péptido conector nativo, que representan las secuencias de reconocimiento para proteasas diferentes, específicas de células. Las variantes de ricina con modificaciones de este tipo presentarán una especificidad celular correspondiente, siempre que la proteasa respectiva, que puede escindir proteolíticamente el péptido conector modificado, sólo se expresa en las células diana correspondientes en comparación con otros tipos celulares en cantidades significativamente elevadas. No obstante puede suponerse que la escisión tiene lugar sólo en una fracción de la molécula de toxina internalizada y por lo tanto también sólo puede translocarse una cantidad correspondientemente pequeña de cadenas A en el citoplasma. Serían deseables inmunotoxinas bicatenarias a base de ricina, en las que la cadena A está unida a través de un puente disulfuro con una cadena B modificada, en la que se mantiene la actividad de translocación, que contienen en cambio las propiedades de unión celular inespecífica, de tipo lectina, y que están fusionadas en su extremo C terminal con un dominio de unión celular específico. Las inmunotoxinas de este tipo reunirían especificidad celular y alta toxicidad.

Aún una forma de realización especialmente preferida adicional de la invención comprende por lo tanto una proteína de fusión que presenta los siguientes componentes A, B y C:

-

la cadena A de la ricina (A),

-

una secuencia de bucle, que según la invención, tal como se describió anteriormente, está modificada y que presenta la secuencia de pentapéptido PRS VPXGS definida anteriormente (por ejemplo una de las secuencias de bucle de BoNT(A) modificadas, representadas en la figura 3, o variantes de las mismas) y a la que puede añadirse de manera N y/o C terminal un resto de cisteína (B), así como

-

un dominio de unión celular que puede tomarse de un representante de las familias de proteínas de los anticuerpos monoclonales, de sus fragmentos, de las afilinas, de las proteínas de repetición de anquirina, de las anticalinas, de los factores de crecimiento (por ejemplo TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1) o de las citocinas (por ejemplo IL2, IL4 o IL6) (C).

El componente B puede ser según esta última forma de realización preferida igualmente (i) una de las secuencias de bucle modificadas representadas en la figura 4, (ii) cualquier secuencia derivada de las mismas, como el resto central de PRS puede ser el resto de un aminoácido de origen natural cualquiera, o (iii) una variante (para la definición de variante véase anteriormente) de (i) o (ii).

Especialmente la secuencia de bucle puede presentar la secuencia peptídica Ala-Pro-Pro-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys- Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Asp-Val (figura 5-6), es decir puede ser un bucle modificado de la cadena A de la ricina. En la secuencia de bucle se coloca de manera preferente adicionalmente de manera terminal un resto de cisteína. En la secuencia PRS Val-Pro-Arg-Gly-Ser contenida en la misma Arg puede ser sin embargo también cualquier otro aminoácido natural Xaa. A ambos lados la secuencia de bucle puede ampliarse mediante restos de aminoácido adicionales (por ejemplo restos de glicina y de serina). Además la cadena A de la ricina puede estar unida con la cadena B completa o partes o variantes de la misma a través de una secuencia de bucle, que sustituye completa o parcialmente los restos de aminoácido entre los restos de cisteína 259 y 283 de la secuencia de tipo natural de la Pro-ricina y comprende al menos la región del bucle de BoNT(A) modificado, descrito en la figura 3 o variantes de la misma. A este respecto se forma un puente disulfuro por los restos de cisteína 259 y 283 (con respecto a la secuencia de tipo natural de la Pro-ricina). En el extremo C terminal de la cadena B está fusionado un dominio de unión celular que puede derivarse de las familias de polipéptidos mencionados anteriormente. Las proteínas de fusión/proteínas híbridas correspondientes se encuentran en el lisado de las células huésped de E. coli, por ejemplo de células de la cepa M15[pREP4], en la forma bicatenaria, con puente disulfuro.

Una forma de realización adicional de la invención se refiere a proteínas de fusión recombinantes que presentan los siguientes componentes A, B y C:

-

una proteína o un oligopéptido que confiere a la proteína de fusión una mejor solubilidad, provoca una mayor tasa de expresión y/o posibilita una purificación por afinidad (por ejemplo glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), marca de His, marca Strep, marca FLAG) (A),

-

una secuencia de bucle, que según la invención, tal como se describió anteriormente, está modificada y que presenta la secuencia de pentapéptido PRS VPXGS definida anteriormente (por ejemplo una de las secuencias de bucle de BoNT(A) modificadas, representadas en la figura 3, o variantes de las mismas) y a la que puede añadirse de manera N y/o C terminal un resto de cisteína, así como

-

un polipéptido cualquiera (C).

El componente B (secuencia de bucle) puede ser según esta última forma de realización preferida igualmente (i) una de las secuencias de bucle modificadas representadas en la figura 4, (ii) cualquier secuencia derivada de las mismas, como el resto central de PRS puede ser el resto de un aminoácido de origen natural cualquiera, o (iii) una variante (para la definición de variante véase anteriormente) de (i) o (ii).

Especialmente el bucle puede presentar la secuencia peptídica Val-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-Asn-Asp-Leu, en la que Arg en el centro de PRS ha de entenderse de nuevo como Xaa. A ambos lados puede ampliarse mediante otros restos de aminoácido (por ejemplo restos de glicina y de serina). La expresión de tales proteínas de fusión en E. coli lleva a polipéptidos/proteínas bicatenarios, cuyas dos cadenas están unidas covalentemente mediante un puente disulfuro y tras tener lugar la purificación pueden separarse una de otra sin la adición de una proteasa tras la reducción simple mediante sustancias que contienen tiol (por ejemplo β-mrcaptoetanol, DTT o glutatión reducido). Un sistema de expresión de este tipo es especialmente adecuado para proteínas recombinantes en las que se introducirá en uno de los dos extremos terminales un resto cisteína, para tras la purificación y separación del componente de fusión con el grupo tiol reactivo tener un punto de partida por ejemplo para reacciones de acoplamiento con moléculas de conector reactivas con tiol o modificaciones con por ejemplo polietilenglicol.

Además se proporcionan todos los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos según la invención descritos en las secciones anteriores considerando las distintas posibilidades de la utilización de codones. Además se proporcionan plásmidos de expresión y de clonación construidos individualmente o comercialmente disponibles que contienen las secuencias ADN codificantes para los polipéptidos según la invención respectivos, así como cepas de expresión y de clonación adecuadas de E. coli, que se han transformado con los plásmidos de expresión correspondientes y que pueden expresar los polipéptidos según la invención respectivos en su forma activa, bicatenaria y con puente disulfuro. Un ejemplo de un sistema de expresión de este tipo es un plásmido de expresión de la serie pQE en conexión con la cepa huésped de E. coli M15[pREP4].

Para el experto en la técnica que se dedica especialmente al desarrollo de polipéptidos/proteínas que van a usarse farmacéuticamente, son claramente evidentes las ventajas que están relacionadas con que para la activación de estos polipéptidos/proteínas no debe añadirse ninguna endoproteasa. La mayor parte de los polipéptidos/proteínas según la invención descritos en las secciones anteriores son especialmente específicos para el uso farmacéutico. Por lo tanto también son parte componente de la invención preparaciones farmacéuticas que contienen uno de los polipéptidos/proteínas según la invención o una mezcla de los polipéptidos/proteínas según la invención como componente de principio activo así como aditivos útiles, que confieren a la preparación una estabilidad suficiente y cuya composición está adaptada a la presentación farmacéutica deseada.

Las figuras y secuencias adjuntas del protocolo de secuencias se describen tal como sigue:

La figura 1 muestra una representación esquemática de la liberación de neurotoxina botulínica de tipo A con bucle de tipo natural o bucle modificado según la invención de Clostridium botulinum o K12 de Escherichia coli.

A: Durante la lisis de células de Clostridium botulinum se escinde la neurotoxina en la región de bucle entre

cadena ligera (L) y cadena pesada (H) mediante una endoproteasa clostridial. Ambas cadenas están unidas entre sí mediante un puente disulfuro. B: Tras la expresión de una neurotoxina recombinante con bucle de tipo natural en E. coli y lisis de las células ésta se encuentra en la forma monocatenaria. C: durante la liberación de una neurotoxina recombinante con bucle modificado según la invención a partir de células de E. coli tiene lugar una escisión en la región de bucle mediante una endoproteasa.

La figura 2 muestra una representación esquemática de distintas toxinas recombinantes con regiones de bucle de tipo natural así como regiones de bucle modificadas según la invención en comparación tras su liberación a partir de células de E. coli. A: neurotoxina botulínica; B: exotoxina de Pseudomonas; C: toxina diftérica.

La figura 3 muestra una comparación del bucle de tipo natural con una selección de secuencias de bucle de BoNT(A) modificadas según la invención. Están representadas las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos derivadas que incluyen los restos de cisteínas limitantes de la cadena ligera y pesada. La flecha marca el sitio de escisión para la endoproteasa en el lisado de E. coli.

La figura 4 muestra una comparación de los bucles de tipo natural con en cada caso una secuencia de bucle modificada según la invención, a modo de ejemplo, de las neurotoxinas botulínicas de los serotipos B, C1 y E. Están representadas las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos derivadas que incluyen los restos de cisteína limitantes de la cadena ligera y pesada. La flecha marca el sitio de escisión para la endoproteasa en el lisado de E. coli.

La figura 5 muestra una comparación de los bucles de tipo natural con en cada caso una secuencia de bucle modificada según la invención, a modo de ejemplo, del fragmento PE40 de la exotoxina de Pseudomonas, toxina diftérica (DT) y ricina. Están representadas las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos derivadas que incluyen los restos de cisteína limitantes. La flecha marca el sitio de escisión para la endoproteasa en el lisado de E. coli.

La figura 6 muestra una lista de los oligonucleótidos que se usaron en las clonaciones de las toxinas recombinantes y fragmentos de toxina. Las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción están subrayadas.

La figura 7 muestra un análisis del fragmento LHN recombinante de BoNT(A) con secuencia de bucle modificada según la invención en gel de SDS-poliacrilamida. La expresión del fragmento LHN tuvo lugar en células de M15[pREP4], que se habían transformado con el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1HN. Carriles 2 y 5: fragmento LHN purificado sobre Ni-NTA; Carriles 1 y 4: fragmento LHN tras incubación con trombina; Carril 3: marcador de peso molecular. Aplicación de muestra en condiciones reductoras (carriles 1 y 2) o condiciones no reductoras (carriles 4 y 5).

La figura 8 muestra un análisis del fragmento LHN recombinante de BoNT(B) con secuencia de bucle modificada según la invención en gel de SDS-poliacrilamida. La expresión del fragmento LHN tuvo lugar en células de M15[pREP4], que se habían transformado con el plásmido pQE-BoNT(B)-Lmod1HN. Carriles 1 y 4: fragmento LHN purificado sobre Ni-NTA-agarosa; Carril 2: marcador de peso molecular; Carril 3: ninguna aplicación. Aplicación de muestras en condiciones reductoras (carril 1) o condiciones no reductoras (carril 4).

la figura 9 muestra un análisis de BoNT(C1) recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención en gel de SDS-poliacrilamida. La expresión de la toxina tuvo lugar en células de M15[pREP4] que se habían transformado con el plásmido pQE-BoNT (C1)-Lmod1HNHC. Carriles 1 y 4: toxina purificada sobre Ni-NTAagarosa; Carril 2: marcador de peso molecular; Carril 3: ninguna aplicación. Aplicación de muestras en condiciones reductoras (carril 1) o condiciones no reductoras (carril 4).

SEC ID Nº:1 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por una neurotoxina botulínica de tipo A recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-mod1).

SEC ID Nº:2 es un ejemplo de una neurotoxina botulínica de tipo A recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-mod1).

SEC ID Nº:3 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo A con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-Lmod1HN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:1, en la que están delecionados los nucleótidos 2620 - 3888.

SEC ID Nº:4 es un ejemplo de un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo A con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-Lmod1HN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:2, en la que están delecionados los restos de aminoácido 874 - 1296.

SEC ID Nº:5 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento LHNHCN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo A con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de

hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-Lmod1HNHCN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:1, en la que están delecionados los nucleótidos 3286 - 3888.

SEC ID Nº:6 es un ejemplo de un fragmento LHNHCN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo A con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(A)-Lmod1HNHCN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:2, en la que están delecionados los restos de aminoácido 109 - 1296.

SEC ID Nº:7 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por una neurotoxina botulínica de tipo B recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(B)-mod1).

SEC ID Nº:8 es un ejemplo de una neurotoxina botulínica de tipo B recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(B)-mod1).

SEC ID Nº:9 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo B con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(B)-Lmod1HN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:7, en la que están delecionados los nucleótidos 2623 - 3915.

SEC ID Nº:10 es un ejemplo de un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo B con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(B)-Lmod1HN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:8, en la que están delecionados los restos de aminoácido 875 - 1305.

SEC ID Nº:11 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por una neurotoxina botulínica de tipo C1 recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(C1)-mod1).

SEC ID Nº:12 es un ejemplo de una neurotoxina botulínica de tipo C1 recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(C1)-mod1).

SEC ID Nº: 13 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo C1 con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(C1)-Lmod1HN). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:11, en la que están delecionados los nucleótidos 2599 - 3858.

SEC ID Nº:14 es un ejemplo de un fragmento LHN recombinante de la neurotoxina botulínica de tipo C1 con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(C1)-Lmod1)HN.). La secuencia corresponde a la SEC ID Nº:12, en la que están delecionados los restos de aminoácido 867 1286.

SEC ID Nº:15 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por una neurotoxina botulínica de tipo E recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(E)-mod1).

SEC ID Nº:16 es un ejemplo de una neurotoxina botulínica de tipo E recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rBoNT(E)-mod1).

SEC ID Nº:17 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento de 40 kDa, recombinante, que comprende los dominios II, Ib y III de la exotoxina de Pseudomonas con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (PE40-mod1).

SEC ID Nº:18 es un ejemplo de un fragmento de 40 kDa, recombinante, que comprende los dominios II, Ib y III de la exotoxina de Pseudomonas con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C terminal (PE40-mod1).

SEC ID Nº: 19 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por un fragmento recombinante, que comprende la cadena A y un fragmento N terminal de la cadena B de la toxina diftérica con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (DT389-mod1).

SEC ID Nº:20 es un ejemplo de un fragmento recombinante, que comprende la cadena A y un fragmento N terminal de la cadena B de la toxina diftérica con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (DT389-mod1).

SEC ID Nº:21 es un ejemplo de un ácido nucleico (ADN) que codifica por una toxina ricina recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rRicin-mod1).

SEC ID Nº:22 es un ejemplo de una toxina ricina recombinante con secuencia de bucle modificada según la invención y marca de hexahistidina C-terminal (rRicin-mod1).

Ejemplos

Ejemplo 1: Clonación y expresión del fragmento LHN de neurotoxina botulínica de tipo A con bucle modificado

Para la clonación de las secuencias de ADN de la cadena ligera así como del dominio de translocación se aisló ADN cromosómico a partir de un cultivo de Clostridium botulinum tipo A (cepa ATCC 3502). Mediante amplificación por PCR con los cebadores Nº 1 y Nº 2 (figura 6) se obtuvo un fragmento génico que codifica por la cadena ligera de BoNT(A) con secuencia de bucle modificada y marca de His C terminal. El amplificado de PCR se clonó en el plásmido de expresión pQE- 60 a través de los sitios de restricción para Nco I y Sal I, mediante lo cual resultó el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1. Mediante amplificación por PCR con los cebadores Nº 3 y Nº 4 (figura 6) se generó el fragmento génico que codifica por el dominio de translocación de BoNT(A). A través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I se clonó entre la secuencia de bucle y la secuencia para la marca de His en pQE-BoNT(A)-Lmod1 (plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1HN; secuencia Nº 2; figura 3, Nº 2). La cepa de expresión de E. coli M15[pREP4] (Qiafen) se transformó con el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1HN. La expresión del fragmento LHN modificado se realizó mediante una inducción escalonada con 500 μM de concentración final de IPTG a 25 ºC durante la noche. Las células se disgregaron en un tampón fosfato 50 mM a pH 8,0 con NaCl 300 mM mediante tratamiento con lisozima y ultrasonidos. El lisado centrifugado se sometió a cromatografía a través de una columna de Ni-NTA-agarosa. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado que mediante Coomassie en condiciones reductoras se tiñeron dos bandas a aproximadamente 50 kDa así como una banda a 100 kDa, mientras que en condiciones no reductoras sólo podía observarse la banda a aproximadamente 100 kDa (figura 7). Con ello se muestra claramente que el fragmento LHN se liberó en > 75 % como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí mediante un puente disulfuro. El tratamiento posterior con trombina llevó por un lado a la escisión de la forma monocatenaria, por otro lado a un acortamiento del dominio de translocación en el polipéptido bicatenario (figura 7). Una incubación de dos horas del lisado de E. coli antes de la purificación del fragmento LHN llevó al polipéptido bicatenario en el caso de la escisión completa.

Un fragmento LHN expresado y purificado de manera correspondiente con la secuencia de bucle nativa (figura 3, Nº 1) mostró en gel de SDS-poliacrilamida tanto en condiciones no reductoras como en condiciones reductoras una banda a 100 kDa. El péptido monocatenario sólo pudo transformarse mediante escisión con tripsina en el fragmento LHN bicatenario, con puente disulfuro.

Ejemplo 2: Clonación y expresión del fragmento LHNHCN de neurotoxina botulínica de tipo A con bucle modificado y caracterización del sitio de escisión

El fragmento HNHCN (dominio de translocación con mitad N terminal del dominio de unión a receptor de BoNT(A)) se generó mediante amplificación por PCR con los cebadores Nº 3 y Nº 5 (figura 6) y se clonó a través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I en el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1 (plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1HNHCN; secuencia Nº 3). La expresión y la purificación tuvieron lugar según el esquema descrito en el ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado además de una banda más débil que correspondía al polipéptido monocatenario, y otras bandas no definidas, una banda a 50 kDa así como una a 75 kDa, que correspondían a la cadena ligera o al fragmento HNHCN: La secuenciación N terminal de los cuatro primeros restos de aminoácido del fragmento HNHCN dio como resultado la secuencia Ser-Leu-Val-Pro. La escisión mediante la actividad proteasa en el lisado de E. coli tuvo lugar por lo tanto detrás de Lys440 y con ello de manera N terminal con respecto al pentapéptido Val-Pro-Arg-Gly-Ser introducido en el bucle.

Ejemplo 3: Clonación y expresión del fragmento LHN de neurotoxina botulínica de tipo B con bucle modificado

Para la clonación de las secuencias ADN de la cadena ligera así como del dominio de translocación se aisló ADN cromosómico a partir de un cultivo de Clostridium botulinum tipo B (cepa Okra). Mediante amplificación por PCR con los cebadores Nº 6 y Nº 7 (figura 6) se generó un fragmento génico que codifica por la cadena ligera de BoNT(B) con secuencia de bucle modificada de BoNT(A). Con los cebadores Nº 8 y Nº 9 (figura 6) se generó el fragmento génico que codifica por el dominio de translocación de BoNT(B). La clonación en el plásmido de expresión pQE-60 se realizó en primer lugar mediante cambio del fragmento génico de BoNT(A)-L en pQE-BoNT(A)-Lmod1 por el amplificado de BoNT(B)-Lmod1 a través de los sitios de restricción para Nco I y Stu I. A continuación se clonó detrás del amplificado de BoNT(B)-HN a través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I, mediante lo cual resultó el plásmido pQE-BoNT(B)-Lmod1HN (secuencia Nº 5). La expresión en la cepa huésped M15[pREP4] y la purificación del fragmento LHN se realizaron de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado que se tiñeron mediante Coomassie en condiciones reductoras dos bandas a aproximadamente 50 kDa y 55 kDa, mientras que en condiciones no reductoras pudo observarse una banda a aproximadamente 105 kDa (figura 8). Con ello se muestra claramente que el fragmento LHN se liberó en su mayor parte como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí en > 80 % mediante un puente disulfuro.

Ejemplo 4: Clonación y expresión del fragmento LHN de neurotoxina botulínica de tipo C1 con bucle modificado y caracterización del sitio de escisión

Para la clonación de las secuencias ADN de la cadena ligera así como del dominio de translocación se preparó ADN cromosómico a partir de un cultivo de Clostridium botulinum tipo C1 (cepa C205). Mediante amplificación por PCR con los cebadores Nº 10 y Nº 11 (figura 6) se generó un fragmento génico que codifica por la cadena ligera de BoNT(C1) con secuencia de bucle modificada de BoNT(A). Con los cebadores Nº 12 y Nº 13 (figura 6) se generó el fragmento génico que codifica por el dominio de translocación de BoNT(C1). La clonación en el plásmido de expresión pQE-60 se realizó en primer lugar mediante cambio del fragmento génico de BoNT(A)-L en pQE-BoNT(A)-Lmod1 por el amplificado de BoNT(C1)-Lmod1 a través de los sitios de restricción para Nco I y Stu I. A continuación se clonó detrás del amplificado de BoNT(C1)-HN a través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I, mediante lo cual resultó el plásmido pQE-BoNT(C1)-Lmod1HN (secuencia Nº 7). La expresión en la cepa huésped M15[pREP4] y la purificación del fragmento LHN se realizaron de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDSpoliacrilamida dio como resultado que en condiciones reductoras se tiñeron mediante Coomassie dos bandas a aproximadamente 50 kDa y 55 kDa, mientras que en condiciones no reductoras pudo observarse una banda a aproximadamente 105 kDa. Con ello se muestra claramente que el fragmento LHN se liberó en > 90 % como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí mediante un puente disulfuro. La secuenciación N terminal de los cuatro primeros restos de aminoácido del fragmento HN dio como resultado la secuencia Ser-Leu-Val-Pro. La escisión mediante la actividad proteasa en el lisado de E. coli tuvo lugar por lo tanto detrás de Lys447 y con ello de manera N terminal con respecto al pentapéptido Val-Pro-Arg-Gly-Ser introducido en el bucle de BoNT(A). Mediante mutagénesis dirigida se cambió el resto de arginina del pentapéptido introducido por histidina, tirosina o glutamina. Los fragmentos LHN mutagenizados, expresados de la misma manera se encontraban tras una incubación de dos horas del lisado celular de E. coli en > 90 % en la forma bicatenaria, con puente disulfuro, siendo la eficacia de la escisión ligeramente inferior a la del fragmento LHN que contiene el bucle de BoNT(A) modificado con el pentapéptido Val-Pro-Arg-Gly-Ser.

Ejemplo 5: Clonación y expresión de una neurotoxina botulínica de tipo C1 recombinante con bucle modificado

Usando ADN cromosómico de la cepa C205 de Clostridium botulinum se amplificó por medio de PCR con los cebadores Nº 12 y Nº 14 (figura 6) el fragmento génico que codifica por la cadena pesada. A través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I se clonó entre el fragmento de secuencia que codifica por la cadena ligera y la secuencia para la marca de His en el plásmido BoNT(C1)-Lmod1HN (plásmido pQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC; secuencia Nº 6). La cepa de expresión de E. coli M15[pREP4] (Qiagen) se transformó con el plásmido de expresión correspondiente. La expresión en la cepa huésped M15[pREP4] y la purificación tuvieron lugar de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado que se tiñeron mediante Coomassie en condiciones reductoras dos bandas a aproximadamente 50 kDa y 105 kDa, mientras que en condiciones no reductoras pudo observarse una banda a aproximadamente 155 kDa (figura 9). Con ello se muestra claramente que la neurotoxina recombinante se liberó en > 90 % como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí mediante un puente disulfuro. Una prueba de actividad en el ensayo de hemidiafragma dio como resultado una toxicidad elevada en comparación tal como la de la neurotoxina de tipo 1 nativa, aislada a partir de Clostridium botulinum. La modificación de la región de bucle entre la cadena ligera y el dominio de translocación no tenía por lo tanto ningún efecto sobre la toxicidad.

Ejemplo 6: Clonación y expresión de un fragmento recombinante de la exotoxina de Pseudomonas (PE40) con bucle modificado

Usando ADN cromosómico de la cepa Pseudomonas aeruginosa 103 se amplificó por medio de PCR con los cebadores Nº 17 y Nº 18 (figura 6) un fragmento génico que codifica por la región del dominio II, que se encuentra de manera C terminal con respecto al bucle entre los restos de cisteína 13 y 36, así como para el dominio III. El amplificado se clonó a través de Nco I y Mlu I en el cambio por el fragmento génico BoNT(A)-Lmod1 en el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1 (plásmido pQE-PEII3·III). El segmento de secuencia para la región del dominio II de manera N terminal con respecto al bucle se introdujo mediante hibridación de los oligonucleótidos Nº 15 y Nº 16 (figura 6) y clonación a través de los sitios de restricción para Nco I y Kpn I en el plásmido pQE-PEII3·III (plásmido pQE-PEIImodIII; secuencia Nº 9). La cepa de expresión de E. coli M15 [pREP4] (Qiagen) se transformó con el plásmido de expresión correspondiente. La expresión en la cepa huésped M15[pREP4] y la purificación se realizaron de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS en condiciones reductoras dio como resultado una banda más débil a 40 kDa así como una más intensa a 37 kDa. En condiciones no reductoras pudo observarse por el contrario sólo una banda a 40 kDa. Si se incubaba el lisado celular antes de la purificación por cromatografía de afinidad durante al menos dos horas a temperatura ambiente, ya no podía detectarse la banda de 40 kDa en condiciones reductoras. Mediante el cambio de la región de bucle entre los restos de cisteína 13 y 36 en el dominio II del fragmento PE40 por un bucle de BoNT(A) modificado tuvo lugar por lo tanto una escisión de la cadena de polipéptido, formando los restos de cisteína mencionados un puente disulfuro. El fragmento N terminal, de aproximadamente 3 kDa de tamaño no podía detectarse tras la reducción en gel de SDS al 12 %.

Ejemplo 7: Clonación y expresión de un fragmento recombinante de la toxina diftérica (DT389) con bucle modificado

Usando ADN cromosómico de la cepa NCTC 13129 de Corynebacterium diphtheriae se amplificó por medio de PCR con los cebadores Nº 19 y Nº 20 (figura 6) el fragmento génico que codifica por la cadena A de la toxina diftérica. A través de los sitios de restricción para Nco I y Stu I se clonó (plásmido pQE-DT-Amod1) el amplificado en el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1 (véase el ejemplo 1). De la misma manera se amplificó el fragmento génico que codifica por un fragmento N terminal de la cadena B con los cebadores Nº 21 y Nº 22 (figura 6) y se clonó a través de los sitios de restricción para Stu I y Xho I en pQE-DT-Amod1 (plásmido pQE-DT389-mod1; secuencia Nº 10). La cepa de expresión de E. coli M15[pREP4] (Qiagen) se transformó con el plásmido de expresión correspondiente. La expresión en la cepa huésped M15 [pREP4] y la purificación se realizaron de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado que se tiñeron mediante Coomassie en condiciones reductoras dos bandas a aproximadamente 22 kDa, mientras que en condiciones no reductoras pudo observarse una banda a aproximadamente 43 kDa. Con ello se muestra claramente que el fragmento de toxina diftérica recombinante se liberó en > 90 % como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí mediante un puente disulfuro.

Ejemplo 8: Clonación y expresión de ricina recombinante con bucle modificado

Usando ARNm de semillas de Ricinus communis se amplificó por medio de RT-PCR con los cebadores Nº 23 y Nº 24 (figura 6) el fragmento génico que codifica por la cadena A de ricina. A través de los sitios de restricción para Nco I y Xho I se clonó (plásmido pQE-ricina-A) en el plásmido pQE-BoNT(A)-Lmod1 (véase el ejemplo 1). De la misma manera se amplificó el fragmento génico que codifica por la cadena B con los cebadores Nº 25 y Nº 26 (figura 6) y se clonó a través de los sitios de restricción para Kpn I y Xho I en pQE-ricina-A (plásmido pQE-ricina-mod1; secuencia Nº 11). La cepa de expresión de E. coli M15[pREP4] (Qiagen) se transformó con el plásmido de expresión correspondiente. La expresión en la cepa huésped M15[pREP4] y la purificación de la parte soluble de la ricina expresada se realizaron de manera análoga al ejemplo 1. Un análisis en gel de SDS-poliacrilamida dio como resultado que se tiñeron mediante Coomassie en condiciones reductoras dos bandas a aproximadamente 19 kDa y 42 kDa, mientras que en condiciones no reductoras pudo observarse una banda a aproximadamente 62 kDa. Con ello se muestra claramente que la parte soluble de la ricina recombinante se liberó en > 90 % como polipéptido bicatenario a partir de las bacterias, en el que las dos cadenas estaban unidas covalentemente entre sí mediante un puente disulfuro.

Bibliografía científica

Arora y col. (1999), Cancer Res. 59: 183-8 Collier (2001), Toxicon 39(11): 1793-803 Fujinaga (1997), Microbiology 143: 3841-47 Ogata y col. (1990), J. Biol. Chem. 265(33): 20678-85 Reiter (2001), Adv. Cancer Res. 81: 93-124 Schiavo y Montecucco (1997), The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic Press, San Diego: 295 – 322 Williams y col., (1990), J. Biol. Chem. 265(33): 20673-77

Bibliografía de patentes

Borgford, patente estadounidense 6.593.132

Brown y Jones, documento WO 89/04839

Fitzgerald y col., patente estadounidense 6.426.075

Pastan y col., patente estadounidense 5.980.895

Health Protection Agency, documento WO2004/024909

LISTA DE SECUNCIAS

<110> BioteCon Therapeutics GmbH

<120> Expresión recombinante de proteínas en una forma bicatenaria con puente disulfuro

<130> BIO-008 PCT

<140> desconocido

<141>

<150> 10 2005 002978.7

<151>

<160> 22

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 3915

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

<210> 2

<211> 1304

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

<210> 3

<211> 2646

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

<210> 4

<211> 881

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

<210> 5

<211> 3312

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

<210> 6

<211> 1103

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 6

<210> 7

<211> 3942

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 7

<210> 8

<211> 1313

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 8

<210> 9

<211> 2649

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 9

<210> 10

<211> 882

<212> PRT 10 <213> Clostridium botulinum

<400> 10

<210> 11

<211> 3885

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 11

<210> 12

<211> 1294

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 12

<210> 13

<211> 2625

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 13

<210> 14

<211> 874

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 14

<210> 15

<211> 3810

<212> ADN

<213> Clostridium botulinum

<400> 15

<210> 16

<211> 1269

<212> PRT

<213> Clostridium botulinum

<400> 16

<210> 17

<211> 1116

<212> ADN

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 17

<210> 18

<211> 371

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 18

<210> 19

<211> 1215

<212> ADN

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 19

<210> 20

<211>

404 10 <212> PRT

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 20

<210> 21

<211> 1650

<212> ADN

<213> Ricinus communis

<400> 21

<210> 22

<211>

549 10 <212> PRT

<213> Ricinus communis

<400> 22

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la producción de polipéptidos o proteínas en forma bicatenaria en las que las dos cadenas están unidas por puente disulfuro por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli, en el que

   (i)

   el polipéptido o la proteína ejerce su actividad biológica como polipéptido o proteína bicatenaria con puente disulfuro.

   (ii)

   el resto de aminoácido C terminal de la primera cadena es un resto de aminoácido básico;

   (iii) la segunda cadena de la proteína/del polipéptido presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr; y

   (iv) el procedimiento comprende las siguientes etapas:

   (a)

   modificar el polipéptido o la proteína, al nivel de ácido nucleico, de modo que el polipéptido o la proteína en su forma modificada en su región de bucle presente la secuencia VPXGS y en dirección N terminal de esta secuencia PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido un resto de aminoácido básico, siendo X, V, P, G y S tal como se definen anteriormente, y estando definida la región de bucle como la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre los dos restos de cisteína que participan en el puente disulfuro;

   (b)

   introducir el constructo modificado al nivel de ácido nucleico en células de E. coli;

   (c)

   cultivar y a continuación lisar las células huésped; y

   (d)

   aislar el polipéptido o la proteína bicatenaria con puente disulfuro.

2. 2.

   El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el resto de aminoácido básico en (ii) es un resto de Arg o Lys.

3. 3.

   El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera cadena del polipéptido/de la proteína es la cadena ligera del polipéptido/de la proteína y la segunda cadena es la cadena pesada del polipéptido/de la proteína, especialmente en el que la proteína es una proteína híbrida.

4. 4.

   El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido o la proteína es una neurotoxina botulínica, especialmente la neurotoxina botulínica del serotipo A (BoNT(A)), y especialmente el fragmento LHN de BoNT(A).

5. 5.

   El procedimiento según la reivindicación 4, en el que la secuencia PRS VPXGS se inserta entre los aminoácidos Leu442 y Lys448 de BoNT(A) con la deleción de los aminoácidos 443-447, insertándose especialmente la secuencia PRS VPRGS, VPYGS, VPHGS o VPQGS.

6. 6.

   El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia PRS VPXGS se inserta en el octapéptido Lys438 - Ile445 de BoNT(B), en el 15-mero His438 - Asp452 de BoNT(C1) o en el 13-mero Lys413 - Ile425 de BoNT(E) con la deleción de al menos un aminoácido, insertándose especialmente la secuencia PRS VPXGS en forma del 17-mero GIITSKTKSLVPRGSKA o del 18-mero RGIITSKTKSLVPRGSKA.

7. 7.

   El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína híbrida presenta los siguientes componentes A, B y C:

   -

   un dominio efector que, mediante su actividad enzimática, puede inhibir la secreción en células diana o destruir las mismas o un dominio de toxina (componente A);

   -

   una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B), así como

   -

   un dominio de unión celular que confiere a la proteína de fusión/híbrida una especificidad celular (componente C); y el componente D opcional:

   -

   un dominio de translocación.

8. 8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que el dominio de toxina (A) es el dominio de la toxina diftérica, de la exotoxina de Pseudomonas o de ricina, especialmente en el que el dominio de toxina (A) es el fragmento PE40 (dominio III, dominio II y dominio Ib) o el fragmento PE38 (dominio III y dominio II) de la exotoxina de Pseudomonas

   o la cadena A de ricina.

9. 9.

   El procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que el dominio de unión celular (C) es un anticuerpo monoclonal, una afilina, una proteína de repetición de anquirina, una anticalina, un factor de crecimiento tal como TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1 o una citocina tal como IL2, IL4 o IL6.

10. 10.

    El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína híbrida presenta los siguientes componentes A, B y C:

    -

    una proteína o un oligopéptido que confiere a la proteína de fusión una mejor solubilidad, provoca una mayor tasa de expresión y/o posibilita una purificación por afinidad (componente A),

    -

    una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B), así como

    -

    un polipéptido cualquiera (componente C).

11. 11.

    El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el componente A es la glutatión-S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa (MBP), una marca de His, una marca Strep o una marca FLAG.

12. 12.

    El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de E. coli son células K12 de

    E. coli, especialmente células K12 de E. coli de las cepas M15[pREP4], XL1-BLUE o UT5600.

13. 13.

    Polipéptido o proteína, encontrándose el polipéptido/la proteína como polipéptido/proteína bicatenaria con puente disulfuro y siendo biológicamente activo, caracterizado porque el extremo C terminal de la primera cadena del polipéptido/de la proteína es un resto de aminoácido básico y la segunda cadena del polipéptido/de la proteína presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr.

14. 14.

    El polipéptido o la proteína según la reivindicación 13, en el que el resto de aminoácido básico es un resto de Arg

    o Lys.

15. 15.

    El polipéptido o la proteína según la reivindicación 13 ó 14, en el que la primera cadena del polipéptido/de la proteína es la cadena ligera del polipéptido/de la proteína y la segunda cadena es la cadena pesada del polipéptido/de la proteína, especialmente en el que el extremo C terminal de la primera cadena es un resto de Lys.

16. 16.

    El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la segunda cadena presenta de manera N terminal la secuencia de pentapéptido VPXGS, la secuencia de hexapéptido XVPXGS o la secuencia de heptapéptido XXVPXGS.

17. 17.

    El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13, 14 y 16, siendo el polipéptido/la proteína una neurotoxina botulínica, un derivado o un fragmento de la neurotoxina botulínica, especialmente el fragmento LHN, o presenta la actividad biológica de una neurotoxina botulínica, especialmente siendo el polipéptido/la proteína la neurotoxina botulínica del serotipo A (BoNT(A)) o presentando la actividad biológica de BoNT(A), especialmente, siendo el polipéptido o la proteína el fragmento LHN de BoNT(A) o presentando la actividad biológica del fragmento LHN de BoNT(A).

18. 18.

    El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la segunda cadena de manera N terminal presenta la secuencia de heptapéptido SLVPXGS, especialmente en la que X es R, Y, H o Q.

19. 19.

    El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 16 ó 18, siendo la proteína una proteína híbrida, especialmente presentando la proteína híbrida los siguientes componentes A, B y C:

    -

    un dominio efector que, mediante su actividad enzimática, puede inhibir la secreción en células diana o destruir las mismas o un dominio de toxina (componente A);

    -

    una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B), así como un dominio de unión celular que confiere a la proteína de fusión/híbrida una especificidad celular (componente C); y el componente D opcional:

    un dominio de translocación

20. 20.

    El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19, en el que el dominio de toxina (A) es el dominio de la toxina diftérica, de la exotoxina de Pseudomonas o de ricina, especialmente en el que el dominio de toxina (A) es el fragmento PE40 (dominio III, dominio II y dominio Ib) o el fragmento PE38 (dominio III y dominio II) de la exotoxina de Pseudomonas o la cadena A de ricina.

21. 21.

    El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19 ó 20, en el que el dominio de unión celular (C) es un anticuerpo monoclonal, una afilina, una proteína de repetición de anquirina, una anticalina, un factor de crecimiento tal como TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1 o una citocina tal como IL2, IL4 o IL6.

22. 22.

    El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19, presentando la proteína híbrida los siguientes componentes A, B y C:

    -

    una proteína o un oligopéptido que confiere a la proteína de fusión una mejor solubilidad, provoca una mayor tasa de expresión y/o posibilita una purificación por afinidad (componente A),

    -

    una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B), así como

    -

    un polipéptido cualquiera (componente C), especialmente en el que el componente A es la glutatión-Stransferasa (GST), la proteína de unión a maltosa (MBP), una marca de His, una marca Strep o una marca FLAG.

23. 23. Preparación farmacéutica que comprende el polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 22.