JP5107055B2 - ジスルフィド架橋二重鎖型のタンパク質の組換え発現法 - Google Patents
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Description
−その酵素活性によって、例えば標的細胞において分泌を阻害するか、またはそれらを死滅させることが可能である、エフェクタードメイン(A);
−前述したように本発明に従って改変され、上記の定義されたPRSペンタペプチド配列VPXGS(例えば図3に図示したような、BoNT(A)またはその変種の改変ループ配列)を有し、N末端および/またはC末端にシステイン残基を結合し得る、ループ配列(B);ならびに
−融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質に細胞特異性を与える、細胞結合ドメイン(C)。
−毒素ドメインまたはその断片/誘導体(A);
−上記のように本発明に従って改変され、上記の定義されたPRSペンタペプチド配列VPXGS(例えば図3に図示されるBoNT(A)またはその変種の改変ループ配列の一つ)を有し、そのN末端および/またはC末端にシステイン残基を接着してもよい、ループ配列(B);ならびに
−モノクローナル抗体、それらの断片、アフィリン、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン、増殖因子(例えばTGFα、FGF、VEGF、またはIGF-1)、またはサイトカイン(例えばIL2、IL4、またはIL6)のタンパク質ファミリーの代表から得られる細胞結合ドメイン(C)。
−リシンのA鎖(A);
−上記のように本発明に従って改変され、上記の定義されたPRSペンタペプチド配列VPXGS(例えば図3に図示されるBoNT(a)またはその変種のループ配列の一つ)を有し、N末端および/またはC末端にシステイン残基を接着してもよい、ループ配列(B);ならびに
−モノクローナル抗体、それらの断片、アフィリン、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン、増殖因子(例えばTGFα、FGF、VEGF、またはIGF-1)、またはサイトカイン(例えばIL2、IL4、またはIL6)のタンパク質ファミリーの代表から得られる細胞結合ドメイン(C)。
−融合タンパク質により良好な可溶性を与え、より高い発現率をもたらし、および/もしくはアフィニティ精製を可能にするタンパク質またはオリゴペプチド(例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグ、StrepTag、FLAGタグ(A);
−上記のように本発明に従って改変され、上記の定義されたPRSペンタペプチド配列VPXGS(例えば図3に図示されるBoNT(a)またはその変種の改変ループ配列)を含み、N末端および/またはC末端にシステイン残基を接着してもよい、ループ配列;ならびに
−任意のタイプのポリペプチド(C)。
実施例1:改変ループを有するボツリヌス神経毒A型のLHN断片のクローニングおよび発現
軽鎖および転位ドメインのDNA配列のクローニングのために、染色体DNAを、ボツリヌス菌A型(菌株ATCC 3502)の培養培地から単離した。プライマー#1および#2(図6)によるPCR増幅によって、改変ループ配列およびC末端のHisタグを有するBoNT(A)の軽鎖をコードする遺伝子断片が得られた。PCR増幅産物を、Nco 1およびSal 1に対する制限部位を介して、発現プラスミドpQE-60にクローニングし、プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1を結果として得た。プライマー#3および#4(図6)によるPCR増幅によって、BoNT(A)の転位ドメインをコードする遺伝子断片を生成した。Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介して、pQE-BoNT(A)-Lmod1内のループ配列とHisタグに対する配列との間に、それをクローニングした(プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1HN;配列#2、図3、No.2)。大腸菌発現株M15[pREP4](Qiagen)を、プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1HNによって形質転換した。改変LHN断片の発現は、500 Mの最終濃度IPTGによる段階的誘導によって、摂氏25℃で一晩実行した。細胞を、300 mMのNaClを含む50 mMリン酸緩衝液中pH 8.0で、リゾチーム処理および超音波処理によって溶解した。遠心分離した溶解物を、Ni-NTAアガロースカラム上で色層分析した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約50kDAの2つのバンドおよび100kDAのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では100kDaのバンドのみが観察されたことを示した(図7)。このような方法で、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって共有結合する二鎖のポリペプチドとして、75パーセント以上、LHN断片が細菌から放出されたことが明解に示される。トロンビンによるその後の処理は、一方では、単鎖形態の切断、および他方では、二鎖のポリペプチドにおける転位ドメインの短縮をもたらした(図7)。LHN断片の精製前2時間の大腸菌溶解物のインキュベーションは、二鎖ポリペプチドにおける完全な切断をもたらした。
HNHCN断片(BoNT(A)の受容体結合ドメインのN末端半分を有する転位ドメイン)を、プライマー#3および#5(図6)によるPCR増幅によって生成し、Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介してプラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1にクローンニングした(プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1HNHCN;配列#3)。実施例1に記載のスキームに従って、発現および精製を実施した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、単鎖ポリペプチドに相当する弱いバンドおよびさらなる未決定のバンドに加えて、軽鎖およびHNHCN断片に相当する50kDaのバンドならびに75kDaのバンドを示した。HNHCN断片の最初の4つのアミノ酸残基のN末端シークエンシングは、配列Ser-Leu-Val-Proを提供した。したがって、大腸菌溶解物内のプロテアーゼ活性による切断がLys440の後で生じ、したがってペンタペプチドVal-Pro-Arg-Gly-SerのN末端がループに挿入された。
軽鎖および転位ドメインのDNA配列のクローニングのために、染色体DNAを、ボツリヌス菌B型(菌株Okra)の培養培地から単離した。プライマー#6および#7(図6)によるPCR増幅によって、BoNT(A)の改変ループ配列を有するBoNT(B)の軽鎖をコードする遺伝子断片を生成した。プライマー#8および#9(図6)により、BoNT(B)の転位ドメインをコードする遺伝子断片を生成した。発現プラスミドpQE-60へのクローニングは最初に、Nco IおよびStu Iに対する制限部位を介したpQE-BoNT(A)-Lmod1におけるBoNT(A)-L遺伝子断片と、BoNT(B)-Lmod1増幅産物との置換によって実現した。その後、BoNT(B)-HN増幅産物を、Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介してその後ろにクローニングし、結果としてプラスミドpQE-BoNT(B)-Lmod1HNを得た(配列#5)。宿主株M15[pREP4]内の発現およびLHN断片の精製は、実施例1と同様に実行した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約50kDaおよび55kDaの2つのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では約105kDaのバンドが観察されたことを示した(図8)。これらは、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって80パーセント以上共有結合する、実質的に二鎖のポリペプチドとして、LHN断片が細菌から放出されたことを明解に示す。
軽鎖および転位ドメインのDNA配列のクローニングのために、染色体DNAを、ボツリヌス菌C1型(菌株C205)の培養培地から調製した。プライマー#10および#11(図6)によるPCR増幅によって、BoNT(A)の改変ループ配列を有するBoNT(C1)の軽鎖をコードする遺伝子断片を生成した。プライマー#12および#13(図6)により、BoNT(C1)の転位ドメインをコードする遺伝子断片を生成した。発現プラスミドpQE-60へのクローニングは最初に、Nco IおよびStu Iに対する制限部位を介したpQE-BoNT(A)-Lmod1におけるBoNT(A)-L遺伝子断片と、pQE-BoNT(C1)-Lmod1増幅産物との置換によって実現した。その後、BoNT(C1)-HN増幅産物を、Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介してその後ろにクローニングし、結果としてプラスミドpQE-BoNT(C1)-Lmod1HNを得た(配列#7)。宿主株M15[pREP4]内の発現およびLHN断片の精製は、実施例1と同様に実行した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約50kDaおよび55kDaの2つのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では約105kDaのバンドが観察されたことを示した。これは、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって共有結合する二鎖のポリペプチドとして、LHN断片が90パーセント以上細菌から放出されたことを明解に示す。HN断片の最初の4つのアミノ酸残基のN末端シークエンシングは、配列Ser-Leu-Val-Proをもたらした。大腸菌溶解物内のプロテアーゼ活性による切断がLys447の後で生じ、したがってペンタペプチドVal-Pro-Arg-Gly-SerのN末端がBoNT(A)ループに挿入された。定方向突然変異誘発により、挿入されたペンタペプチドのアルギニン残基は、ヒスチジン、チロシン、およびグルタミンによって置換された。同様に発現される突然変異誘発されたLHN断片は、大腸菌溶解物の2時間のインキュベーション後、二鎖のジスルフィド架橋型で90パーセント以上存在し、ここで切断の効率は、ペンタペプチドVal-Pro-Arg-Gly-Serによって改変されたBoNT(A)ループを含むLHN断片に対するよりわずかに少ない。
ボツリヌス菌株C205の染色体DNAを使用することにより、重鎖をコードする遺伝子断片を、プライマー#12および#14(図6)によって増幅した。Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介して、プラスミドBoNT(C1)-Lmod1HNの軽鎖をコードする配列セクションとHisタグに対する配列との間に、それをクローニングした(プラスミドpQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC;配列#6)。大腸菌発現株M15[pREP4](Qiagen)を、対応する発現プラスミドによって形質転換した。宿主株M15[pREP4]内の発現およびその精製は、実施例1と同様に実行した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約50kDaおよび105kDaの2つのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では約155kDaのバンドのみが観察されたことを示した(図9)。このような方法で、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって共有結合した二鎖のポリペプチドとして、90パーセント以上、組換え神経毒が細菌から放出されたことが明解に示される。半横隔膜分析における活性試験は、毒性がボツリヌス菌から単離された天然神経毒C1型と同等に高いという結果になった。軽鎖と転位ドメインの間のループ領域の改変はしたがって、毒性に対する効果を有しなかった。
株シュードモナス-アエルギノーザ103の染色体DNAを使用することにより、ループのC末端、システイン残基13と36の間に位置するドメインIIの領域、およびドメインIIIをコードする遺伝子断片を、プライマー#17および#18(図6)によるPCRによって増幅した。増幅産物は、Nco IおよびMlu Iを介して、遺伝子断片BoNT(A)-Lmod1との置換により、プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1にクローンニングした(プラスミドpQE-PEII3 III)。ループのN末端であるドメインIIの領域に対する配列セクションを、オリゴヌクレオチド#15および#16(図6)のハイブリダイゼーション、ならびにNco IおよびKpn Iに対する制限部位を経たクローニングによって、プラスミドpQE-PEII3 IIIに挿入した(プラスミドpQE-PEIImod III;配列#9)。大腸菌発現株M15[pREP4](Qiagen)を、対応する発現プラスミドによって形質転換した。宿主株M15[pREP4]内の発現およびその精製は、実施例1と同様に実行した。還元性条件下でのSDSゲル上の分析は、40kDaのより弱いバンドおよび37kDaのより強いバンドをもたらした。しかしながら非還元の条件下では、40kDaの単一バンドのみが観察された。アフィニティクロマトグラフィーによる精製の前に、室温で少なくとも2時間細胞溶解物をインキューベートする場合、還元性条件下で40kDaのバンドはもはや検出可能でなかった。改変BoNT(A)ループと、PE40断片(fragrant)のドメインIIにおけるシステイン残基13と36の間のループ領域との置換によって、ポリペプチド鎖の切断はしたがって、上述のシステイン残基がジスルフィド架橋を形成した位置で生じた。約3kDaのN末端断片は、還元の後12%SDSゲルにおいて、もはや検出されなかった。
ジフテリア菌株NCTC 13129の染色体DNAを使用することにより、ジフテリア毒素のA鎖をコードする遺伝子断片を、プライマー#19および#20(図6)によるPCRによって増幅した。Nco IおよびStu Iに対する制限部位を介して、増幅産物を、プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1にクローニングした(実施例1を参照されたい)(プラスミドpQE-DT-Amod1)。同様の方法で、B鎖のN末端断片をコードする遺伝子断片を、プライマー#21および#22(図6)によって増幅し、Stu IおよびXho Iに対する制限部位を介してpQE-DT-Amod1にクローンニングした(プラスミド(プラスミドpQE-DT389-mod1;配列#10)。大腸菌発現株M15[pREP4](Qiagen)を、対応する発現プラスミドによって形質転換した。宿主株M15[pREP4]内の発現およびその精製は、実施例1と同様に実行した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約22kDaの2つのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では約43kDaの単一バンドが観察されたことを示した。これは、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって共有結合する二鎖のポリペプチドとして、組換えジフテリア毒素断片が90パーセント以上細菌から放出されたことを明解に示す。
トウゴマの種のmRNAを使用することにより、リシンのA鎖をコードする遺伝子断片を、プライマー#23および#24(図6)によるRT-PCRによって増幅した。Nco IおよびXho Iに対する制限部位を介して、それを、プラスミドpQE-BoNT(A)-Lmod1にクローニングした(実施例1を参照されたい)(プラスミドpQE-ricin-A)。同様の方法で、B鎖をコードする遺伝子断片を、プライマー#25および#26(図6)によって増幅し、Kpn IおよびXho Iに対する制限部位を介してpQE-ricin-Aにクローンニングした(プラスミドpQE-ricin-mod1;配列#11)。大腸菌発現株M15[pREP4](Qiagen)を、対応する発現プラスミドによって形質転換した。宿主株M15[pREP4]内の発現および発現したリシンの可溶性タンパク質の精製は、実施例1と同様に実行した。SDSポリアクリルアミドゲル上の分析は、還元性条件下で約19kDaおよび42kDaの2つのバンドが、クーマシーによって染色された一方、非還元性条件下では約62kDaのバンドが観察されたことを示した。これは、2つの鎖が互いにジスルフィド架橋によって共有結合する二鎖のポリペプチドとして、組換えリシンの可溶性タンパク質が90パーセント以上細菌から放出されたことを明解に示す。
Borgford, 米国特許第6,593,132号
Brown and Jones, WO 89/04839
Fitzgerald et al., 米国特許第6,426,075号
Pastan et al., 米国特許第5,980,895号
SEQ ID NO:2は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒A型(rBoTN(A)-mod1)の例である。
SEQ ID NO:3は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒A型の組換えLHN断片(rBoTN(A)-Lmod1HN)をコードする核酸(DNA)の例である。配列は、ヌクレオチド2620〜3888が欠失したSEQ ID NO:1に相当する。
SEQ ID NO:4は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒A型の組換えLHN断片(rBoTN(A)-Lmod1HN)の例である。配列は、アミノ酸残基874〜1296が欠失したSEQ ID NO:2に相当する。
SEQ ID NO:5は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒A型の組換えLHNHCN断片(rBoTN(A)-Lmod1HNHCN)をコードする核酸(DNA)の例である。配列は、ヌクレオチド3286〜3888が欠失したSEQ ID NO:1に相当する。
SEQ ID NO:6は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒A型の組換えLHNHCN断片(rBoTN(A)-Lmod1HNHCN)の例である。配列は、アミノ酸残基1096〜1296が欠失したSEQ ID NO:2に相当する。
SEQ ID NO:7は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒B型(rBoTN(B)-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:8は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒B型(rBoTN(B)-mod1)の例である。
SEQ ID NO:9は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒B型の組換えLHN断片(rBoTN(B)-Lmod1HN)をコードする核酸(DNA)の例である。配列は、ヌクレオチド2623〜3915が欠失したSEQ ID NO:7に相当する。
SEQ ID NO:10は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒B型の組換えLHN断片(rBoTN(B)-Lmod1HN)の例である。配列は、アミノ酸残基875〜1305が欠失したSEQ ID NO:8に相当する。
SEQ ID NO:11は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒C1型(rBoTN(C1)-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:12は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒C1型(rBoTN(C1)-mod1)の例である。
SEQ ID NO:13は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒C1型の組換えLHN断片(rBoTN(C1)-Lmod1HN)をコードする核酸(DNA)の例である。配列は、ヌクレオチド2599〜3858が欠失したSEQ ID NO:11に相当する。
SEQ ID NO:14は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、ボツリヌス神経毒C1型の組換えLHN断片(rBoTN(C1)-Lmod1HN)の例である。配列は、アミノ酸残基867〜1296が欠失したSEQ ID NO:12に相当する。
SEQ ID NO:15は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒E型(rBoTN(E)-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:16は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えボツリヌス神経毒E型(rBoTN(E)-mod1)の例である。
SEQ ID NO:17は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有し、ドメインII、Ib、およびIIIを含むシュードモナス外毒素の組換え40kDaの断片(PE40-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:18は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有し、ドメインII、Ib、およびIIIを含むシュードモナス外毒素の組換え40kDaの断片(PE40-mod1)の例である。
SEQ ID NO:19は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有し、A鎖およびB鎖のN末端断片を含むジフテリア毒素の組換え断片(DT389-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:20は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有し、A鎖およびB鎖のN末端断片を含むジフテリア毒素の組換え断片(DT389-mod1)の例である。
SEQ ID NO:21は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えリシン毒素(rRicin-mod1)をコードする核酸(DNA)の例である。
SEQ ID NO:22は、本発明に従って改変されるループ配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグを有する、組換えリシン毒素(rRicin-mod1)の例である。
Claims (18)
- 二鎖(dichain)型のポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であって、2つの鎖が大腸菌(E. coli)宿主細胞内の組換え発現によってジスルフィド架橋され、以下である、方法:
(i)ポリペプチドまたはタンパク質が、二鎖のジスルフィド架橋ポリペプチドまたはタンパク質として、その生物学的活性を発揮し;
(ii)第一の鎖のC末端アミノ酸残基が、Arg残基またはLys残基であり;
(iii)タンパク質/ポリペプチドの第二の鎖が、N末端に、NからCの方向で、1〜20のアミノ酸残基、およびPRSと呼ばれるペンタペプチド配列VPXGSを有し、式中XがArg、 His、 Gln または Tyrであり、V、P、およびGがGly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe、またはValであり、SがSer、Tyr、Trp、またはThrであり;ならびに
(iv)以下の段階を含む:
(a)ジスルフィド架橋の形成に関与する2つのシステイン残基間に配置されるアミノ酸配列として規定されるそのループ領域内で、その改変形態でのポリペプチドまたはタンパク質が、X、V、P、G、およびSが上記の通りである配列VPXGSを有し、1〜20アミノ酸残基の間隔でPRS配列のN末端方向にArg残基またはLys残基が存在するような、核酸レベルでのポリペプチドまたはタンパク質の改変;
(b)核酸レベルで改変された構築物の大腸菌細胞への挿入;
(c)宿主細胞を培養し、その後溶解する段階;ならびに
(d)二鎖のジスルフィド架橋ペプチドまたはタンパク質を単離する段階。 - ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖がポリペプチド/タンパク質の軽鎖であり、第二の鎖がポリペプチド/タンパク質の重鎖であり、特に、タンパク質がハイブリッドタンパク質である、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドまたはタンパク質がボツリヌス神経毒であり、特に、ポリペプチドまたはタンパク質が血清型Aのボツリヌス神経毒(BoNT(A))であり、特に、BoNT(A)のLHN断片である、請求項1または2記載の方法。
- PRS配列VPXGSが、アミノ酸443〜447 (DKGYN)の欠失を伴い、BoNT(A)の7 mer LDKGYNKのアミノ酸Leu442とLys448の間に挿入される、請求項3記載の方法。
- PRS配列VPXGSが、少なくとも一つのアミノ酸の欠失を伴い、BoNT(B)のオクタペプチドLys438〜Ile445 (KSVKAPGI)に、BoNT(C1)の15mer His438〜Asp452 (HKAIDGRSLYNKTLD)に、またはBoNT(E)の13mer Lys413〜Ile425 (KNIVSVKGIRKSI)に挿入され、特に、PRS配列VPXGSが、17mer GIITSKTKSLVPRGSKAまたは18mer RGIITSKTKSLVPRGSKAの形態で挿入される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項2記載の方法:
−その酵素活性によって、標的細胞において分泌を阻害するか、もしくはそれらを死滅させることが可能であるエフェクタードメイン、または毒素ドメイン(成分A);
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B);ならびに
−融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質に細胞特異性を与える、細胞結合ドメイン(成分C)
ならびに、成分Dとして以下のものを含んでもよく
−転位ドメイン、
特に、毒素ドメイン(A)が、ジフテリア毒素、シェードモナス外毒素、またはリシンのドメインであり、特に、毒素ドメイン(A)が、シェードモナス外毒素の断片PE40(ドメインIII、ドメインII、およびドメインIb)もしくは断片PE38(ドメインIIIおよびドメインII)、またはリシンのA鎖である、方法。 - 細胞結合ドメイン(C)が、モノクローナル抗体、アフィリン(affilin)、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン(anticalin)、TGFα、FGF、VEGF、もしくはIGF-1のような増殖因子、またはIL2、IL4、もしくはIL6のようなサイトカインである、請求項6記載の方法。
- ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項2記載の方法:
−融合タンパク質により良好な可溶性を与え、より高い発現率をもたらし、および/もしくはアフィニティ精製を可能にするタンパク質またはオリゴペプチド(成分A);
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B);ならびに
−任意のタイプのポリペプチド(成分C)、
ここで、特に、成分Aが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグ、StrepTag、またはFLAGタグである、方法。 - 大腸菌細胞が、大腸菌K12細胞、特に菌株M15[pREP4]、XL1-BLUE、またはUT5600の大腸菌K12細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 二鎖のジスルフィド架橋ポリペプチド/タンパク質として存在し、生物学的に活性であるポリペプチドまたはタンパク質であって、ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖のC末端終末が、Arg残基またはLys残基であり、ポリペプチド/タンパク質の第二の鎖が、N末端に1〜20アミノ酸残基、およびPRSと呼ばれるペンタペプチド配列VPXGSを含む点で特徴付けられ、式中、XがArg、 His、 Gln または Tyrであり、V、P、およびGがGly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe、またはValであり、SがSer、Tyr、Trp、またはThrである、ポリペプチドまたはタンパク質。
- ポリペプチド/タンパク質の第一の鎖がポリペプチド/タンパク質の軽鎖であり、第二の鎖がポリペプチド/タンパク質の重鎖であり、特に、第一の鎖のC末端終末がLys残基である、請求項10記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 第二の鎖が、N末端にペンタペプチド配列VPXGS、ヘキサペプチド配列XVPXGS、またはヘプタペプチド配列XXVPXGSを有する、請求項10または11記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- ボツリヌス神経毒、ボツリヌス神経毒の誘導体もしくは断片、特にLHN断片を含むか、またはボツリヌス神経毒の生物学的活性を有し、特に、血清型Aのボツリヌス神経毒(BoNT(A))を含むか、または BoNT(A)の生物学的活性を有し、特に、BoNT(A)のLHN断片であるか、または BoNT(A)の生物学的活性を有する、請求項10または12記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 第二の鎖が、N末端にヘプタペプチド配列SLVPXGSを有する、請求項10〜13のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- タンパク質がハイブリッドタンパク質である、請求項10〜12、および14のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質であり、特に、ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する:
−その酵素活性によって、標的細胞において分泌を阻害するか、もしくはそれらを死滅させることが可能であるエフェクタードメイン、または毒素ドメイン(成分A);
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B);ならびに
−融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質に細胞特異性を与える、細胞結合ドメイン(成分C)
ならびに、以下のものを含んでもよく
−転位ドメインとして成分D、
特に、毒素ドメイン(A)が、ジフテリア毒素、シェードモナス外毒素、またはリシンのドメインであり、特に、毒素ドメイン(A)が、シェードモナス外毒素の断片PE40(ドメインIII、ドメインII、およびドメインIb)もしくは断片PE38(ドメインIIIおよびドメインII)、またはリシンのA鎖である、ポリペプチドまたはタンパク質。 - 細胞結合ドメイン(C)が、モノクローナル抗体、アフィリン、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン、TGFα、FGF、VEGF、もしくはIGF-1のような増殖因子、またはIL2、IL4、もしくはIL6のようなサイトカインである、請求項15記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- ハイブリッドタンパク質が以下の成分A、B、およびCを有する、請求項15記載のポリペプチドまたはタンパク質:
−融合タンパク質により良好な可溶性を与え、より高い発現率をもたらし、および/もしくはアフィニティ精製を可能にするタンパク質またはオリゴペプチド(成分A);
−配列VPXGSを含むループ配列(成分B);ならびに
−任意のタイプのポリペプチド(成分C)
特に、成分Aが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグ、StrepTag、またはFLAGタグである。 - 請求項10〜17のいずれか一項記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、薬学的調製物。
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