KR20240038789A - 재조합 보툴리눔 신경독소 a형 및 이의 제조 방법 - Google Patents

재조합 보툴리눔 신경독소 a형 및 이의 제조 방법 Download PDF

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유바오 센
구오칭 바오
리밍 구오
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Abstract

본 발명은 재조합 보툴리눔 신경독소 A형 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 보툴리눔 신경독소 A형은 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체이고, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되는 제1 펩타이드 세그먼트와 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하되; 여기서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및/또는 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060 중 적어도 하나의 돌연변이 위치를 갖는다. 상기 방법은, 제1 펩타이드 세그먼트를 1차 변성 처리하여 1차 변성 생성물을 얻는 단계; 제2 펩타이드 세그먼트를 2차 변성 처리하여 2차 변성 생성물을 얻는 단계; 및 상기 1차 변성 생성물과 2차 변성 생성물을 재생 및 조립 처리하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 얻는 단계를 포함한다.

Description

재조합 보툴리눔 신경독소 A형 및 이의 제조 방법
본 발명은 바이오 제약 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로는 재조합 보툴리눔 신경독소 A형 및 이의 제조 방법에 관한 것이며, 구체적으로는 보툴리눔 신경독소 A형, 이의 돌연변이체 및 제조 방법에 관한 것이다.
혐기성 클로스트리디움 보툴리눔(약칭: "클로스트리디움 보툴리눔")에 의해 생성되는 신경독소인 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin, BoNT)는 세상에 알려진 가장 독성이 강한 물질 중 하나이다. 보툴리눔 신경독소는 7가지 혈청형(A형~G형)으로 구분되며, 그 중 가장 흔한 것은 보툴리눔 신경독소 A형(Botulinum neurotoxin of type A, BoNT/A)으로 불리는 A형이다.
BoNT/A의 구조는 두 부분, 즉 경쇄(LC, 50 kD)와 중쇄(HC, 100 kD)로 구분되고, 경쇄와 중쇄는 아미드 결합이 아닌 한 쌍의 사슬 간 이황화 결합(C430-C454)으로 연결된다. 경쇄는 활성 도메인이고, 아연 의존성 메탈로엔도펩티다제 활성을 가지며, 보툴리눔 신경독소의 독성 부분이다. 중쇄는 2개의 도메인, 즉 결합 도메인과 전위 도메인을 포함하고, 결합 도메인은 신경 세포막의 해당 수용체와 결합하여 엔도솜 막에 이온 채널을 형성하는 역할을 담당하며, 전위 도메인은 경쇄의 전위를 담당하여 경쇄를 세포 내로 이송하며, 경쇄는 SNAP-25(시냅스 소포 관련 단백질)의 Q197-R198 위치를 인식하고 이를 특이적으로 절단한다.
여러 연구에 따르면, BoNT/A는 의료 미용 분야뿐만 아니라 다양한 질병의 치료에도 광범위한 응용 전망을 가지고 있음이 밝혀졌는데, 근긴장 이상증, 수족 다한증, 통증 등 어렵고 복잡한 질병 등 다양한 분야에 임상적용이 가능해져 질병 치료 범위가 지속적으로 확대되고 있다. BoNT/A의 치료 메커니즘은 신경근 접합부에서 BoNT/A가 신경세포 표면의 해당 수용체와 결합하여 중쇄의 N-말단을 통해 막을 횡단하여 경쇄를 세포 내로 이송하고, SNAP-25를 절단하여 아세틸콜린의 방출을 차단하며, 근육의 지속적인 이완 마비를 유발한다.
천연 구조의 활성 BoNT/A 단백질은 중쇄 내에 한 쌍의 이황화 결합(C1235-C1280)을 갖고, 경쇄와 중쇄 사이에 한 쌍의 이황화 결합(C430-C454)을 갖는다. 사슬 내 및 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 4개의 시스테인 외에도, 보툴리눔 신경독소 A형의 분자 구조에는 여전히 5개의 유리 시스테인(비-페어링으로 이황화 결합을 형성하며, 이하 동일함)이 존재하여 재조합 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 과정에서 이황화 결합의 불일치이 발생하기 쉽고, 잘못된 구조의 보툴리눔 신경독소 A형 단백질이 형성되어 보툴리눔 신경독소 A형의 활성이 저하되며, 인체에 적용한 후 면역 반응까지 나타나게 된다.
따라서, 정확한 공간 구조와 높은 생물학적 활성을 갖는 보툴리눔 신경독소 A형의 개발이 시급하다.
본 발명은 관련 기술의 기술적 과제 중 하나를 적어도 어느 정도 해결하는 것을 목적으로 한다. 이에, 본 발명은 이황화 결합의 불일치율이 낮고 생물학적 활성(독성)이 높은 등 장점을 갖는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 제공한다.
본 발명은 발명자의 다음과 같은 발견을 기반으로 완성되었다.
천연 구조의 활성 BoNT/A 분자는 1296개의 아미노산으로 구성되고, 경쇄와 중쇄로 구분되며, 그 중 경쇄는 448개의 아미노산(1~448)을 함유하고, 중쇄는 848개의 아미노산(449~1296)을 함유하며, 중쇄 내에 형성된 한 쌍의 이황화 결합(C1235-C1280)은 중쇄 아미노산 서열의 근위 C-말단에 위치하고, 경쇄와 중쇄 사이에는 한 쌍의 이황화 결합(C430-C454)이 형성되며, 상기 이황화 결합을 구성하는 시스테인은 각각 경쇄 아미노산 서열의 근위 C-말단 및 중쇄 아미노산 서열의 근위 N-말단에 위차하고, 상기 이황화 결합에 의존하여 경쇄와 중쇄 사이에 완전한 BoNT/A 분자의 정확한 아키텍처가 형성되어 BoNT/A 분자가 수용체 결합, 막 횡단 수송, 독성 발휘 등 생물학적 기능을 갖게 된다.
중쇄 내 이황화 결합(C1235-C1280) 및 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합(C430-C454)을 구성하는 4개의 시스테인 외에도 경쇄와 중쇄의 주요 구조 구성에는 다른 유리 시스테인이 짝을 이루지 않은 상태로 존재한다. 자연계에서 클로스트리디움 보툴리눔에 의한 보툴리눔 신경독소 A형의 생성은 느린 과정으로, 천연 구조를 형성하려는 보툴리눔 신경독소 분자 작용력 경향으로 인해 자연계의 보툴리눔 신경독소 A형은 정확한 고차 형태를 형성하게 되는데, 클로스트리디움 보툴리눔을 인위적으로 배양하거나 다른 발현 방식(예: 대장균 발현)으로 BoNT/A를 제조하는 과정에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 자연적인 성장 패턴 또는 다른 숙주 박테리아 내 BoNT/A의 형성 속도에 대한 인위적인 간섭으로 인해 일부 세포 내 BoNT/A는 자연 상태와 일치하는 정확한 고차 형태를 형성할 수 없으므로 BoNT/A의 독성에 영향을 미친다. 그 이유는 분자 간 힘(예: 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성, 이온 간 힘 등)의 작용 외에도 유리 시스테인 간의 공간적 불일치로 인해 잘못된 이황화 결합이 형성되고, 이 역시 BoNT/A의 공간 구조 형태를 어느 정도 변화시켜 완전한 BoNT/A 분자 중쇄C-말단 수용체 결합 영역, 또는 중쇄N-말단 전위 영역, 또는 경쇄 효소 활성 영역이 더 이상 천연 BoNT/A 분자의 하위 단위 구조의 고차 공간 형태를 가지지 않아 BoNT/A 분자의 생체 내 생물학적 효과를 감소시키거나 약화시키고, 심지어 완전한 분자 또는 하위 단위 고차 구조 또는 공간 형태의 변화로 인해 인체에 적용한 후 이러한 비천연 고차 구조 또는 공간 형태에 대한 항단백질 항체(anti-protein antibody, 약칭: APA)가 생성된다.
분자 구조 내 작용력의 형성은 BoNT/A 분자가 형성되는 동안의 전사 속도, 번역 효율 및 숙주 세포 내의 산화 환원 환경 상황과 밀접한 관련이 있는 바, 너무 빠르거나 불일치한 전사 속도, 번역 효율 및 부적합한 숙주 세포 내 환경은 쉽게 BoNT/A 분자의 잘못된 구조로 이어질 수 있다. 분자의 생체 내 재생 및 조립 과정에서, 유리 시스테인의 존재는 시스테인 분자 사이의 이황화 결합 불일치로 쉽게 이어질 수 있으며, 이는 천연 구조 위치의 유리 시스테인 사이에서 발생하거나, 천연 구조 위치의 유리 시스테인과 천연 구조 위치에서 일치한 위치를 갖는 시스테인 사이에서 발생하거나, 천연 구조 위치에서 서로 다른 일치한 위치를 갖는 시스테인 사이에서 발생하며, 어떤 상황이 발생하더라도 BoNT/A 분자의 고차 형태를 어느 정도 변경하고, BoNT/A 분자의 생체 내 생물학적 효과에 영향을 미치며, 인체 적용이 증가되면 이러한 "비천연" 구조에 대한 APA가 생성되어 약물 효능을 감소시킨다.
이에 기반하여, 본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되는 제1 펩타이드 세그먼트와 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하되; 여기서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및/또는 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060 중 적어도 하나의 돌연변이 위치를 갖는다. 발명자는 천연 BoNT/A의 분자 구조를 분석하고 수많은 실험을 통해 보툴리눔 신경독소 A형의 상기 아미노산을 돌연변이시키면 이황화 결합의 불일치를 줄이고, 이의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산 분자는 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체의 제1 펩타이드 세그먼트 및/또는 제2 펩타이드 세그먼트를 코딩한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산 분자는 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 전술한 핵산 분자를 보유한다. 발명자는 실험을 통해, 상기 발현 벡터를 적합한 숙주 박테리아로 형질전환시킨 후, 조절계의 매개 하에 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체의 발현을 효과적으로 구현하여 다량의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 획득할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 조작 박테리아를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 유전자 조작 박테리아는 전술한 핵산 분자 또는 전술한 발현 벡터를 보유하거나; 또는, 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 발현시킨다. 발명자는 실험을 통해, 상기 유전자 조작 박테리아를 적합한 조건에서 배양시키면 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 고효율적으로 발현할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 재조합을 통한 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 경쇄 단백질을 1차 변성 처리하여 1차 변성 생성물을 얻는 단계; 중쇄 단백질을 2차 변성 처리하여 2차 변성 생성물을 얻는 단계; 및 상기 1차 변성 생성물과 2차 변성 생성물을 재생 및 조립 처리하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 제조 방법은 형태가 정확하고 서열 이질성이 없는 단일 아형, 단일 성분 BoNT/A 단백질을 제조할 수 있으며, 상기 BoNT/A는 클로스트리디움 보툴리눔 추출물에 포함된 HA, NTNH, 및 완전한 BoNT/A 단백질을 먼저 발현시킨 후 프로테아제로 보툴리눔 신경독소 독성을 활성화시킬 때 생성되는 효소 잔기 등 비-BoNT/A 성분을 포함하지 않고, 배치 간 품질이 안정적인 등 장점이 있어 상업적 규모 생산에 더 적합하다. 또한, 상기 제조 방법은 공정이 간단하고, 고효율적이며, 제조 프로세스가 짧아 전체 제조 프로세스를 완료하는 데 8단계, 4~5일밖에 소요되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 높은 생물학적 활성(독성)을 가져 의료 미용뿐만 아니라 근긴장 이상증, 손발 다한증 또는 통증 등의 병태를 치료하거나 개선하는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제안하며, 상기 약물은 의료 미용에 사용되거나; 또는 상기 약물은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 치료하거나 개선하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선에 있어서 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제안하며, 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선을 위한 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물을 제안하며, 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 질병의 개선 및/또는 치료 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 의료 미용 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은, 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 본 발명의 실시예 2에서 BoNT/A-LC, BoNT/A-HC 발현 및 봉입체의 SDS-PAGE 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 재생 및 조립된 샘플의 SDS-PAGE 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 BoNT/A 단백질의 SDS-PAGE 이미지이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 BoNT/A 단백질의 SEC 크로마토그래피 순도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3의 구조적 동정에서 완전한 분자량 데이터 분석 다이어그램이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3의 구조적 동정에서 환원된 분자량 데이터 분석 다이어그램이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3의 구조적 동정에서 이황화 결합 위치 분석 다이어그램이다.
도 8은 본 발명의 실시예 6에서 경쇄 돌연변이체 플라스미드의 이중 효소 분해 아가로스 전기영동 및 중쇄 돌연변이체 플라스미드의 이중 효소 분해 아가로스 전기영동을 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7에서 야생형 보툴리눔 신경독소 A형에서 시스테인의 위치 및 이황화 결합의 연결 위치를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 이하에서 설명되는 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 명시되어 있지 않은 경우 당업계의 문헌에 기술된 기술이나 조건이나 제품 지침에 따라 수행된다. 사용된 시약이나 기구의 제조사를 명시하지 않은 경우 모두 시중에서 구입할 수 있는 일반 제품이다.
설명해야 할 것은, 용어 "제1", "제2"는 설명의 목적으로만 사용될 뿐 상대적인 중요성을 나타내거나 암시하거나 지시된 기술적 특징의 수를 암시적으로 나타내는 것을 이해해서는 안된다. 따라서 "제1", "제2"로 제한된 특징은 이러한 특징 중 하나 이상을 명시적 또는 암시적으로 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명을 설명함에 있어서, 달리 명시하지 않는 한, "복수"는 2개 이상을 의미한다.
본 명세서에 개시된 범위의 끝점 및 임의의 값은 모두 상기 정확한 범위 또는 값으로 한정되지 않으며, 이러한 범위 또는 값은 그러한 범위 또는 값에 접근하는 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 범위의 경우, 각 범위의 끝점 값, 각 범위의 끝점 값과 개별 포인트 값, 개별 포인트 값을 서로 결합하여 하나 이상의 새로운 수치 범위를 얻을 수 있으며, 이러한 수치 범위는 본 명세서에 구체적으로 개시된 것으로 간주된다.
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해 이하에서는 특정 기술 및 과학 용어를 구체적으로 정의한다. 본 명세서의 다른 부분에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서, 용어 "포함" 또는 "포괄"은 개방형 표현으로, 즉 본 발명에 명시된 내용을 포함하되 다른 측면의 내용을 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "선택적으로", "선택적인" 또는 "선택적"은 일반적으로 아래에 설명되는 사건이나 조건이 반드시 발생할 수는 있지만 반드시 발생하는 것은 아니며, 설명에는 사건이나 조건이 발생하는 상황뿐만 아니라 해당 사건이나 조건이 발생하지 않는 상황도 포함됨을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 보툴리눔 신경독소 A형의 아미노산 넘버링은 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링되는데, 예를 들어, 위치 134는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링된 위치 134를 의미하고; 상기 "C134G"는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링된 위치 134의 시스테인이 글리신으로 대체된 것을 의미하며; "C791A"는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링된 위치 791의 시스테인이 알라닌으로 대체된 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "발현 벡터"는 일반적으로 자가 복제 핵산 분자가 삽입되거나 적합한 숙주에 삽입될 수 있고, 삽입된 핵산 분자를 숙주 박테리아 내로 및/또는 숙주 박테리아 사이에 전달할 수 있는 벡터를 의미한다. 상기 발현 벡터는 DNA 또는 RNA를 세포 내로 삽입하는 데 주로 사용되는 벡터, DNA 또는 RNA를 복제하는 데 주로 사용되는 벡터, DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA의 전사 및/또는 번역에 주로 사용되는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 상기 다양한 기능을 갖는 벡터를 더 포함하고, 발현 벡터의 종류에는 플라스미드, 선형 DNA 단편, 바이러스, 박테리아 파지, 프로바이러스, 파지미드, 트랜스포손, 인공 염색체 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 상기 발현 벡터는 발현 벡터가 적합한 숙주 유기체로 형질전환될 때 폴리펩티드를 구성하는 아미노산으로 전사되고 번역될 수 있는 표적 유전자 단편을 포함한다. 일반적으로, 상기 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 박테리아를 배양함으로써, 상기 발현 벡터는 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "유전자 조작 박테리아"는 일반적으로 원하는 단백질을 발현하고 생산할 수 있도록 표적 유전자를 숙주 박테리아로 변형시키는 박테리아를 의미한다. 여기서, 용어 "숙주 박테리아"는 대장균과 같이 재조합 발현 벡터가 형질전환될 수 있는 박테리아 또는 세포를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "약학적 조성물"은 일반적으로 단위 투여 형태를 의미하며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 벡터와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 활성 화합물을 액체 벡터, 미분된 고체 벡터 또는 둘 모두와 균일하고 완전하게 결합시켜 조성물을 제조한다.
본 명세서에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 보조제"는 특정 표적 제형에 적합한 임의의 용매, 고체 부형제, 희석제 또는 기타 액체 부형제 등을 포함할 수 있다. 임의의 일반적인 보조제가 임의의 불리한 생물학적 효과를 생성하거나 약학적으로 허용 가능한 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호 작용함으로써 본 발명의 화합물과 상용화될 수 없는 정도를 제외하고, 이들의 용도도 본 발명의 고려 범위이다.
본 명세서에서, 용어 "치료"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기 위한 치료를 의미한다. 상기 효과는 질병이나 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 치료하거나 개선하는 한 치료적일 수 있거나, 및/또는 질병 및/또는 질병으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치료하는 한 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "치료"는 (a) 질병에 걸리기 쉬우나 질병 진단을 받지 않은 개체의 질병 또는 병태 발생의 예방; (b) 질병의 진행을 저지하는 것과 같은 질병의 억제; 또는 (c) 질병과 관련된 증상을 경감시키는 것과 같은 질병의 완화;를 포함한 포유동물, 특히 인간의 질병을 내포한다. 본 명세서에 사용된 "치료"는 본 명세서에 기술된 화합물의 약물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하여 개체의 질병을 치료, 완치, 완화, 호전, 경감 또는 억제하기 위해 개체에게 약물 또는 화합물을 투여하는 것을 내포한다.
본 명세서에서, 용어 "BoNT/A", "BoNT/A 단백질", "BoNT/A 성분", "BoNT/A 분자" 및 "보툴리눔 신경독소 A형 단백질"은 모두 보툴리눔 신경독소 A형을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "LC", "BoNT/A-LC", "BoNT/A-LC 단백질", "경쇄 단백질" 및 "경쇄"는 동의어이다. 용어 "HC", "BoNT/A-HC", "BoNT/A-HC 단백질", "중쇄 단백질" 및 "중쇄"는 동의어이다. 용어 "경쇄 단백질" 및 "경쇄"는 동의어이다. 용어 "중쇄 단백질" 및 "중쇄"는 동의어이다. 용어 "경쇄 돌연변이체 단백질" 및 "경쇄 돌연변이체"는 동의어이고, 용어 "중쇄 돌연변이체 단백질" 및 "중쇄 돌연변이체"는 동의어이다.
본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 핵산 분자, 발현 벡터, 유전자 조작 박테리아, 유전자 재조합을 통한 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 방법, 약학적 조성물 및 이의 용도를 제안하며, 이하에서는 이들 각각에 대해 자세히 설명한다.
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되는 제1 펩타이드 세그먼트와 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하되; 여기서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및/또는 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060 중 적어도 하나의 돌연변이 위치를 갖는다. 발명자는 천연 BoNT/A의 분자 구조를 분석하고 수많은 실험을 통해 보툴리눔 신경독소 A형의 상기 아미노산을 돌연변이시키면 이황화 결합의 불일치를 줄이고, 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 높은 생물학적 활성(독성)을 가짐을 발견하였다.
야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1이다.
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO: 1).
야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2이다.
ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO: 2).
야생형 보툴리눔 신경독소 A형 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7이다.
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACTGCATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAATGCAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO: 7).
야생형 보툴리눔 신경독소 A형 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8이다.
ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACTGCATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCTGCCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO: 8).
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 사슬 간 이황화 결합은 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 430에서의 시스테인과 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 454에서의 시스테인에 의해 형성된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060에서 돌연변이를 갖는다. 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 내 이황화 결합 불일치율을 감소시키고, 이의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 위치 134, 위치 165, 위치 791, 위치 967 또는 위치 1060의 시스테인은 G, A, S, E 및 P 중 하나의 아미노산으로 돌연변이된다. 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 내 이황화 결합 불일치율을 더욱 감소시키고, 이의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 134의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 134의 C는 G로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 134의 C는 A로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 134의 C는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 G, A, P 또는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 G로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 A로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 P로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 791의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 791의 C는 G로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 791의 C는 A로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 791의 C는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 967의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 967의 C는 G로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 967의 C는 A로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 967의 C는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 G, A, E 또는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 G로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 A로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 E로 돌연변이된다.
본 발명의 선택적인 일 실시예에서, 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 S로 돌연변이된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 P로 돌연변이되거나; 또는 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 E로 돌연변이된다.
발명자는 수많은 실험을 통해, 제1 펩타이드 세그먼트와 제2 펩타이드 세그먼트의 상기 위치를 돌연변이시키는 과정에서, 상기 돌연변이 위치를 모두 아미노산G 또는 A 또는 S로 돌연변이시켜 얻은 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여, 표 12, 표 14의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2와 같이 이황화 결합의 불일치가 감소하고, 생물학적 활성(독성)이 향상되었음을 발견하였다. 또한 발명자는 상기 돌연변이 방식 하에 아미노산 크기, 소수성, 가능한 수소 결합 형성 및 전하 상태와 같은 돌연변이 위치 근처의 펩타이드 사슬의 조성을 충분히 고려하여 야생형 A가 고기 P 또는 E에 이황화 결합 불일치 가능성이 높은 독소 중 시스테인(C165, C1060)의 돌연변이는 이황화 결합 불일치를 더 큰 정도로 제거하거나 심지어 완전히 제거할 수 있으며, 생물학적 활성도 유의하게 향상되어 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 활성과 비교하여 표 11, 표 14의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 활성이 1배 이상 향상되었음을 예기치 않게 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 C134G 및 C165P에서 돌연변이를 갖는다. 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 내 이황화 결합 불일치율을 더욱 감소시키고, 이의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 C791A, C967A 및 C1060E에서 돌연변이를 갖는다. 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 내 이황화 결합 불일치율을 더욱 감소시키고, 이의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 C134G 및 C165P에서 돌연변이를 갖고; 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 C791A, C967A 및 C1060E에서 돌연변이를 갖는다. 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여 높은 독성을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 펩타이드 세그먼트는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNGINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFEPKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO: 3);
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNGINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFEGKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO: 5).
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제2 펩타이드 세그먼트는 SEQ ID NO: 4 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQASVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINAMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGERDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO: 4);
ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQASVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINAMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGGRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO: 6).
본 발명의 일부 선택적인 실시예에서, 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 세그먼트와 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하거나; 또는 상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 세그먼트와 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드 세그먼트를 포함한다.
핵산 분자, 발현 벡터 및 유전자 조작 박테리아
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산 분자는 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체의 제1 펩타이드 세그먼트 및/또는 제2 펩타이드 세그먼트를 코딩한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 코딩할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산 분자는 DNA이다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 제2 양태에 따른 핵산 분자를 보유한다. 본 발명의 발현 벡터를 적합한 숙주 박테리아로 형질전환시킨 후, 조절계의 매개 하에 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체의 발현을 효과적으로 구현하여 다량의 제1 양태의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 획득할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 플라스미드 발현 벡터이다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 유전자 조작 박테리아를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 유전자 조작 박테리아는 제2 양태에 따른 핵산 분자 또는 제3 양태에 따른 발현 벡터를 보유하거나; 또는, 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 발현한다. 본 발명의 유전자 조작 박테리아는 적합한 조건에서 제1 양태의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 고효율적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 유전자 조작 박테리아는 제3 양태에 따른 발현 벡터를 숙주 박테리아로 형질전환시켜 획득된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 숙주 박테리아는 대장균이다.
유전자 재조합을 통한 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 방법
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 유전자 재조합을 통한 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 경쇄 단백질을 1차 변성 처리하여 1차 변성 생성물을 얻는 단계; 중쇄 단백질을 2차 변성 처리하여 2차 변성 생성물을 얻는 단계; 및 상기 1차 변성 생성물과 2차 변성 생성물을 재생 및 조립 처리하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형을 얻는 단계를 포함한다.
발명자는 BoNT/A 단백질의 고차 구조, 단백질 특성을 연구 분석하고 수많은 실험을 통해, 경쇄 단백질 및 중쇄 단백질을 변성 처리한 후 시험관 내에서 재생 및 조립 처리함으로써 최종적으로 완전하고 활성이 있는 보툴리눔 신경독소 A형이 형성됨을 발견하였다. 이 방법은 추가 프로테아제를 사용하여 독성 활성화를 수행할 필요가 없어, 외인성 도구 효소의 잔류물을 피할 수 있으며, 불완전하거나 비특이적 절단으로 인한 불활성 이성질체 불순물의 발생을 피할 수도 있고; 아울러 완전한 BoNT/A 단백질 분자를 별도로 발현할 필요가 없어, 과도하게 큰 단백질 분자로 인해 잘못된 고차 구조를 형성하는 경향과 위험을 방지한다. 따라서, 상기 방법은 단일 아형, 단일 성분 BoNT/A를 제조할 수 있으며, 상기 BoNT/A는 클로스트리디움 보툴리눔 추출물에 포함된 HA, NTNH, 및 완전한 BoNT/A 단백질을 먼저 발현시킨 후 프로테아제로 보툴리눔 신경독소 독성을 활성화시킬 때 생성되는 효소 잔기 등 비-BoNT/A 성분을 포함하지 않고, 배치 간 품질이 안정적인 등 장점이 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 경쇄 단백질은 제1 양태에 따른 제1 펩타이드 세그먼트 또는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는, 상기 중쇄 단백질은 제1 양태에 따른 제2 펩타이드 세그먼트 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
설명해야 할 것은, 본 명세서의 "보툴리눔 신경독소 A형"은 야생형 보툴리눔 신경독소 A형을 포함할 수 있고, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 포함할 수도 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 경쇄 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 중쇄 단백질은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질은, 상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질을 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 대장균으로 형질전환시키는 단계; 및 상기 플라스미드가 형질전환된 대장균을 단백질 발현에 적합한 조건에서 배양, 유도, 원심분리하여 균체를 수확하고, 균체를 분쇄하며, 원심분리 등 과정을 거쳐 상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질을 얻는 단계를 통해 획득된다. 이에 따라, BoNT/A 단백질 분자를 구성하는 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 1차 변성 처리 또는 상기 2차 변성 처리는 변성 완충액에서 수행되고, 상기 변성 완충액은 5~10 M 요소, 5~15 mM 디티오트레이톨 및 10~30 mM Tris 또는 Tris-HCl을 포함한다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 제형을 얻음으로써, 경쇄 단백질의 아미노산 사슬과 중쇄 단백질의 아미노산 사슬이 완전히 신장된 상태가 되도록 하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 변성 완충액의 pH값은 9.5~10.5이다. 이에 따라, 경쇄 단백질 및 중쇄 단백질의 아미노산 사슬의 신장에 더욱 유리하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재생 및 조립 처리를 수행하기 전에, 미리 상기 1차 변성 생성물과 상기 2차 변성 생성물을 혼합 처리하여 변성 혼합액을 얻는다. 발명자는 수많은 실험을 통해, 1차 변성 생성물과 2차 변성 생성물을 먼저 혼합한 후 동시에 재생시키면 단일 사슬 재생 및 중쇄와 경쇄 간의 조립이 동시에 이루어질 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 혼합 처리 과정에서 상기 1차 변성 생성물 대 상기 2차 변성 생성물의 부피비는 1:(1~10)이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재생 및 조립 처리는 재생 및 조립 완충액에서 수행되고, 상기 재생 및 조립 완충액은 50~150mM NaCl, 0.1~1.0mM ZnCl2, 0.1~1.0mM CaCl2, 1.0~10.0mM 환원 글루타티온(GSH), 1.0~10.0mM 산화 글루타티온(GSSG), 40~50 mM Tris-HCl 및 0.4~0.6%(w/v) 트윈 20(Tween-20)을 포함한다. 발명자는 수많은 스크리닝 실험을 통해 상기 바람직한 제형을 얻었으며, 상기 재생 및 조립 완충액은 변성되고 신장 상태인 경쇄 단백질과 중쇄 단백질을 접고 조립할 수 있도록 하며, 접힘, 조립 과정에서 경쇄 또는 중쇄 단백질 내 및 경쇄 단백질과 중쇄 단백질 사이의 이황화 결합 불일치율을 감소시킬 수 있고, 단일 사슬(경쇄, 중쇄)의 정확한 재생률과 이중 사슬 간의 조립 효율이 높으며, 얻어진 조립액은 표적 단백질(BoNT/A) 함량이 높아 정확한 사슬 내 이황화 결합 및 사슬 간 이황화 결합을 갖는 후속 제조된 BoNT/A 단백질이 더 높은 순도, 더 우수한 활성(독성)을 갖도록 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재생 및 조립 완충액의 pH값은 9.5~10.5이다. 이에 따라, 중쇄 내 및 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합의 정확한 일치율을 더욱 향상시키고, 조립액 내 표적 단백질의 함량을 향상시킨다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 변성 혼합액 대 상기 재생 및 조립 완충액의 부피비는 1: (1~10)이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 비율을 얻었으며, 이에 따라, 재생 및 조립 처리 과정에서 중쇄 내 및 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합의 정확한 일치율을 향상시키고, 조립액 내 표적 단백질의 함량을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재생 및 조립 처리의 처리 시간은 12~16h이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 재생 및 조립 처리 조건을 얻었으며, 이에 따라, 중쇄 단백질 내 또는 경쇄 단백질과 중쇄 단백질 사이의 이황화 결합을 정확하게 연결하고 조립하여 정확한 고차 구조를 갖는 보툴리눔 신경독소 A형을 형성하는 데 유리하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재생 및 조립 처리의 교반 속도는 50~200rpm이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 재생 및 조립 처리 조건을 얻었으며, 이에 따라, 중쇄 단백질 내 또는 경쇄 단백질과 중쇄 단백질 사이의 이황화 결합을 정확하게 연결하고 조립하여 정확한 고차 구조를 갖는 보툴리눔 신경독소 A형을 형성하는 데 유리하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 상기 재생 및 조립 처리를 통해 얻은 조립액에 대해 순차적으로 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석, 음이온 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피 처리를 수행하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형을 얻는 단계를 더 포함한다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 정제 단계를 얻었고, 발명자는 상기 정제 단계 및 정제 시스템에서 조립액 내 불순물 제거에 유리하여 얻어진 보툴리눔 신경독소 A형 순도가 98.0% 이상에 도달할 수 있음을 발견하였다. 또한, 발명자는 상기 5 가지 정제 처리 순서를 바꾸거나, 그 중 하나 이상의 정제 처리를 제거하면 최종적으로 얻어진 보툴리눔 신경독소 A형의 순도가 유의하게 저하됨을 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 소수성 크로마토그래피 처리의 이동상 A1은 10~30 mmol/L Tris-HCl, 2~8 mmol/L EDTA 및 1~3 mol/L NaCl을 포함하고, 이동상 B1은 10~30 mmol/L Tris 및 2~8 mmol/L EDTA를 포함하며, 상기 이동상 A1 및 이동상 B1의 pH값은 모두 8.0~9.0이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 정제 조건을 얻었으며, 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형을 함유한 조립액의 정제 효과가 우수하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 황산암모늄 염석 처리는 상기 소수성 크로마토그래피 처리를 통해 얻은 용리액에 황산암모늄의 포화 농도가 80%가 될 때까지 황산암모늄을 천천히 첨가하고, 2~8℃ 조건에서 12~24h 동안 교반하여 염석액을 얻은 후, 염석액을 2~8℃ 10,000~15,000rpm 조건에서 20~40min 동안 원심분리하여 상층액을 버리고, 침전물을 얻는 단계를 포함한다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 정제 조건을 얻었으며, 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형의 순도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 투석 처리는 상기 침전물을 1차 완충액에 용해시켜 투석 대상액을 얻는 단계; 상기 투석 대상액과 1차 투석액에 대해 1차 투석 처리를 수행하는 단계; 및 얻어진 1차 투석 처리 생성물과 2차 투석액에 대해 2차 투석 처리를 수행하는 단계를 포함하고, 여기서, 1차 완충액은 40~60 mM Tris-HCl 완충액으로부터 선택되며, 1차 투석액은 40~60 mM Tris-HCl 염 함유 투석액으로부터 선택되고, 2차 투석액은 40~60 mM Tris-HCl투석액으로부터 선택된다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 정제 조건을 얻었으며, 이에 따라, 얻어진 보툴리눔 신경독소 A형의 순도가 높다. 또한, 발명자는 수많은 실험을 통해 1차 투석 처리 과정에서, 염의 존재는 용해된 단백질의 지속적인 용해성을 보장하고, 아울러 불순물이 표적 단백질 표면에 비특이적으로 흡착되는 것을 방지할 수 있으므로, 1차 투석액으로 염 함유 투석액을 선택하면, 투석 처리를 통해 얻은 보툴리눔 신경독소 A형의 순도를 더욱 향상시킬 수 있다.
설명해야 할 것은, "40~60 mM Tris-HCl 염 함유 투석액"은 염이 함유된 Tris-HCl 투석액을 의미하며, 여기서 상기 투석액 내 Tris-HCl의 농도는 40~60 mM이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 침전물의 중량(g) 대 상기 1차 완충액의 부피(ml)의 비율은 1:(5~15)이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 비율을 얻었으며, 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형의 순도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 1차 투석 처리의 투석 시간은 2~5 h이고, 상기 2차 투석 처리의 투석 시간은 12~24 h이다. 이에 따라, 투석 처리의 효과가 우수하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 Tris-HCl 염 함유 투석액은 200~300 mM NaCl을 더 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 1차 투석 처리 및 상기 2차 투석 처리의 투석 백의 분자량 컷오프는 80~120 kDa이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 음이온 크로마토그래피 처리는 DEAE 셀룰로오스 음이온 크로마토그래피로부터 선택된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 DEAE 셀룰로오스 음이온 크로마토그래피의 이동상 A2는 10~30 mmol/L Tris-HCl을 포함하고, 이동상 B2는 10~30 mmol/L Tris-HCl 및 0.5~1.5 mol/L NaCl을 포함하며, 상기 이동상 A2 및 이동상 B2의 pH값은 8.5이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 정제 조건을 얻었으며, 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형의 순도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 분자체 크로마토그래피 처리는 G-25M 분자체 크로마토그래피를 사용한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 G-25M 분자체 크로마토그래피의 이동상 C는 10~30 mmol/L Tris-HCl을 포함하고, 상기 이동상 C의 pH값은 8.0~9.0이다. 발명자는 수많은 실험을 통해 상기 바람직한 정제 조건을 얻었으며, 이에 따라, 보툴리눔 신경독소 A형의 순도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 G-25M 분자체 크로마토그래피의 로딩 용량은 ≤30% 컬럼 부피/cycle이고, 선형 유속은 250~350 cm/h이다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형 또는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형은 제5 양태에 따른 방법에 따라 제조된다. 발명자는 실험을 통해, 제5 양태에 따른 방법을 사용하여 정확한 형태를 갖는 단일 아형, 단일 성분 BoNT/A를 제조할 수 있으며, 상기 BoNT/A에는 HA, NTNH, 효소 잔기 등 비-BoNT/A 성분이 포함되지 않고, 배치 간 품질이 안정적인 등 장점이 있음을 발견하였다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형의 LD50은 1~20pg/마리이며, 상기 보툴리눔 신경독소 A형의 순도는 98% 이상이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄 단백질은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
약학적 조성물
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 또는 제5 양태에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 높은 생물학적 활성(독성)을 가져 의료 미용뿐만 아니라 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 치료하거나 개선하는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 약학적으로 허용 가능한 보조제를 더 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학적으로 허용 가능한 보조제는 완충액, 보호제, 활성제 및 부형제로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
설명해야 할 것은, 완충액은 일반적으로 완충 역할을 할 수 있는 액체 용액을 의미하며, 여기서는 넓은 의미로 이해되어야 한다. 예시적으로, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 히스티딘, 글루탐산, 시트레이트/아세테이트, 레몬산/히스티딘, 숙시네이트/히스티딘, 인산염, 트리히드록시메틸아미노메탄 완충 시스템 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 생리학적으로 상용화된 완충 시스템 및/또는 완충 시스템 조성물일 수 있다.
설명해야 할 것은, 보호제는 일반적으로 약학적 조성물을 보호할 수 있는 시약을 의미하며, 여기서는 넓은 의미로 이해되어야 한다. 예시적으로, 예에는 비환원당인 트레할로스, 수크로스, 인간 알부민 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 활성제는 비이온성 계면활성제이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 액체 조성물이고, 상기 보호제는 비환원당인 트레할로스 및/또는 수크로스를 포함하며, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 동결건조 조성물이고, 상기 보호제는 비환원당인 트레할로스, 수크로스 및 인간 알부민으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하며, 상기 부형제는 폴리올계 부형제이다.
용도
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제5 양태에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제8 양태에 따른 약학적 조성물의 용도를 제안하며, 상기 약물은 의료 미용에 사용되거나; 또는 상기 약물은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 치료하거나 개선하는 데 사용된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 주름 제거 및/또는 얼굴 슬리밍을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명은 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선에 있어서 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제안하며; 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 주름 제거 및/또는 얼굴 슬리밍을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제11 양태에서, 본 발명은 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선을 위한 전술한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 전술한 방법에 따라 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 전술한 약학적 조성물을 제안하며; 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 주름 제거 및/또는 얼굴 슬리밍을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
방법
본 발명의 제12 양태에서, 본 발명은 의료 미용 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제5 양태에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제8 양태에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 방법은 의료 미용에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 주름 제거 및/또는 얼굴 슬리밍을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 투여는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함한다.
본 발명의 제13 양태에서, 본 발명은 질병의 개선 및/또는 치료 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 제1 양태에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제5 양태에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제8 양태에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
설명해야 할 것은, 본 명세서에서, "약학적으로 허용 가능한 양"은 투여 방식 및 치료하려는 질병의 중증도에 따라 달라질 수 있지만 바람직하게는 유효량이다. 약학적으로 허용 가능한 양의 선택은 다양한 요인에 기반하여(예를 들어, 임상 시험을 통해) 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 요인에는 생체 이용률, 대사, 반감기 등과 같은 활성 성분의 약동학적 매개변수; 환자가 치료할 질병의 중증도, 환자의 체중, 환자의 면역 상태, 약물 투여 방법 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황의 긴급성에 따라 매일 여러 번 나누어 투여하거나 비례적으로 투여량을 줄일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 투여는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함한다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 해결수단을 해석한다. 당업자는 하기 실시예가 본 발명의 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 명시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 기술된 기술, 조건 또는 제품 지침에 따라 수행된다. 사용된 시약 또는 기구의 제조사가 명시되지 않은 경우, 모두 시중에서 구입할 수 있는 일반 제품이다.
실시예 1: 야생형 보툴리눔 신경독소 A형 경쇄 단백질(BoNT/A-LC), 중쇄 단백질(BoNT/A-HC) 발현 플라스미드의 설계 및 구축
1. 표적 유전자의 설계 및 합성
표적 단백질의 아미노산 서열에 따라 표적 유전자 뉴클레오티드 서열을 설계하고, 이를 대장균 선호 코돈에 따라 최적화하여 경쇄 단백질, 중쇄 단백질의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 여기서, 설계된 뉴클레오티드 서열은 Bao Bioengineering (Dalian) Co., Ltd.에 위탁하여 합성하였으며, 경쇄 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 중쇄 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2이며, 코딩 경쇄 단백질의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7이고, 코딩 중쇄 단백질의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8이다.
2. 발현 플라스미드의 구축 및 표적 유전자 조작 박테리아의 획득
경쇄, 중쇄 표적 유전자의 두 말단에는 각각 XbaI 및 BamHI 효소 절단 부위가 있는데, XbaI 및 BamHI를 각각 사용하여 경쇄, 중쇄 표적 유전자 서열과 pET-28a(+) 벡터를 이중 효소 절단하고, 겔 절단 및 회수 후, 효소 절단된 표적 유전자 단편을 효소 절단된 pET-28a(+)의 긴 단편에 연결하고, 형질전환 및 스크리닝을 거쳐 경쇄 및 중쇄 표적 단백질을 발현하는 유전자 조작 박테리아를 각각 얻었다.
실시예 2: 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 제조
1. 경쇄 단백질, 중쇄 단백질의 발현
경쇄, 중쇄 유전자를 탑재한 유전자 조작 박테리아를 각각 LB 배지가 담긴 진탕 플라스크에 넣어 배양하고, OD600이 1.6~2.0에 도달하면, 5L 발효조로 옮겨 초기 배양 부피 2.5L, 배양 온도 37℃ 교반 속도 800rpm으로 배양하고, OD600이 30으로 상승하면 유도를 시작하되, 유도제는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)이고, 농도 0.5mM, 유도 시간 4~8h이다.
발효액 내 유전자 조작 박테리아의 성장을 현미경으로 검사하고, 발현 상황을 관찰하였으며, 단백질 발현이 관찰되고 4~8h의 유도 시간이 지나면, 발효액을 수집하고, 4℃, 10000rpm 조건에서 30분간 원심분리하여 유전자 조작 박테리아를 수집하였다.
수집된 유전자 조작 박테리아를 고압 균질화 및 분쇄하되, 분쇄 압력은 700~800Bar이고, 적어도 두 주기 동안 수행되며, 현미경 검사에서 완전한 세포가 발견되지 않으면, 원심분리하여 봉입체를 수집하고, 봉입체를 각각 1:20(w/v, g/ml) 초순수로 2회 세척한 후, 경쇄 단백질(BoNT/A-LC), 중쇄 단백질(BoNT/A-HC)을 발현시키고 봉입체의 SDS-PAGE 이미지를 도 1에 나타내었다.
2. BoNT/A-LC 단백질, BoNT/A-HC 단백질의 변성
실온에서, 1:4의 중량비로 BoNT/A-LC 봉입체 및 BoNT/A-HC 봉입체를 각각 칭량하고, 1:20(w/v, g/ml)의 비율로 각각 변성 완충액에 용해시킨 후, 200rpm의 회전 속도 조건에서 교반하고, 모두 용해될 때까지 60min 동안 계속 교반하였다. 여기서, 변성 완충액의 조성은 8M 요소, 10mM 디티오트레이톨(DTT) 및 20mM Tris-HCl이고, pH값은 10.0이다.
3. BoNT/A 단백질의 재생 및 시험관 내 조립
단계 2에서 얻은 용해된 경쇄 변성 생성물과 중쇄 변성 생성물을 동일한 부피로 혼합하여 변성 혼합액을 얻은 후, 변성 혼합액과 재생 및 조립 완충액을 부피비 1:10으로 혼합하고, 200rpm의 회전 속도 조건에서 계속 교반하였으며, 밤새 재생 및 조립하여 조립액을 얻었다.
재생 및 조립 완충액의 조성은 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl 및 0.5% Tween-20이고, pH값은 10.0이다.
소량의 조립액을 취하여 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 재생 및 조립 상황을 관찰하여 결과를 도 2에 나타내었다.
아울러, 겔 전기영동 이미저(BIO-RAD, 모델: ChemiDocTMXRS+) Image Lab 소프트웨어를 사용하여 표적 단백질 함량을 스캔하고 분석하였다. 분석 결과는 상기 시스템에서 얻은 표적 단백질(즉, 표 1의 4번에 대응되는 BoNT/A 단백질) 함량이 30.2%임을 보여준다. 실험 과정에서, 상기 재생 및 조립 완충액 시스템의 조성을 최적화하기 위해, 금속 이온, 산화-환원 쌍, 시스템 pH 등과 같은 수많은 성분 조성 및 성분 농도 탐색 실험을 수행하였으며, 각 실험 과정에서, 실험 변수를 조사하는 동안 실험 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 BoNT/A-LC 단백질 및 BoNT/A-HC 단백질의 동일한 양과 비율의 추가를 제어하였다. 실험 결과는 표 1에 나타내었다.
다양한 재생 및 조립 시스템의 조성이 재생 및 조립 결과에 미치는 영향
번호 재생 및 조립 시스템의 조성 조립액 내 표적 단백질(BoNT/A) 함량(%)
1 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG,
50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 26.5
2 100 mM NaCl, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG,
50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 21.8
3 100 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG,
50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 29.3
4 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 30.2
5 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 28.9
6 100 mM NaCl, 0.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 28.2
7 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0 28.9
8 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 1 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 25.8
9 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH,
1 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH10.0		 27.6
10 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH9.0		 27.2
11 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH,
5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl, 0.5% Tween-20, pH 8.0		 24.3
4. BoNT/A 단백질의 정제
단계 3에서 얻은 조립액(4번 조립액)에 대해 순차적으로 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석, DEAE 음이온 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피 처리를 수행하였다. 구체적인 처리 과정은 다음과 같다.
소수성 크로마토그래피: 단계 3에서 얻은 조립액에 조립액 내 NaCl의 최종 농도가 2mol/L이 될 때까지 4mol/L NaCl을 첨가하여 로딩 원액으로 사용하였다. 크로마토그래피 조건: 이동상 A1의 조성은 20 mmol/L Tris+5 mmol/L EDTA+2.0 mol/L NaCl이고, pH값은 8.5이며; 이동상 B1의 조성은 20 mmol/L Tris+5 mmol/L EDTA이고, pH값은 8.5이다. 크로마토그래피 단계: 이동상 A1을 3개 컬럼 부피(CV)로 평형화하고, 로딩 용량까지 로딩하였으며, 이동상 A1을 6CV로 헹구고, 0%~100% 이동상 B1을 10CV 구배로 용리시켰으며, 200mAU 이상을 흡수하는 샘플을 수집하여 소수성 크로마토그래피 용리액을 얻었다.
황산암모늄 염석: 황산암모늄의 포화 농도가 80%가 될 때까지 황산암모늄을 상기 소수성 크로마토그래피 용리액에 천천히 첨가하고, 4℃ 조건에서 20h 동안 교반하여 염석액을 얻었으며, 염석액을 4℃, 12000rpm 조건에서 30min 동안 원심분리하여 상층액을 버리고, 침전물을 얻었다.
투석: 침전물 대 완충액 비율 1:10(w/v, g/ml)으로 50mM Tris-HCl 완충액(pH값 8.5)을 취하여 침전물을 용해시켜 투석 대상액을 얻었다. 얻어진 투석 대상액을 투석 백(분자량 컷오프: 100kDa)에 옮기고, 4℃ 조건에서, 부피가 투석 대상액의 20배인 50 mM Tris-HCl 완충액(100mM NaCl 함유, pH값 8.5)과 교반(100rpm)하여 3 h 동안 투석하였다. 그 후 부피가 투석 대상액의 20배인 50mM Tris-HCl 완충액(pH값 8.5)과 교반(100rpm)하여 24 h 동안 투석하였다.
DEAE 음이온 크로마토그래피: 상기 투석 처리를 통해 얻은 투석액을 크로마토그래피에 직접 로딩하였다. 이동상 A2의 조성은 20mmol/L Tris이고, pH값은 8.5이며; 이동상 B2의 조성은 20mmol/L Tris+1.0mol/L NaCl이고, pH값은 8.5이다. 크로마토그래피 단계: 이동상 A2로 3CV를 평형화하고, 로딩 용량까지 로딩하였으며, 이동상 A2로 3CV를 헹구고, 0%~50% 이동상 B1을 20CV 구배로 용리시켜 용리액을 얻었다.
G-25M 분자체 크로마토그래피: DEAE 음이온 크로마토그래피 처리 과정에서 얻은 용리액을 직접 로딩하여 분자체 크로마토그래피를 수행하였다. 이동상 C: 20mmol/L Tris이고, pH값은 8.5이며, 로딩 용량 ≤30% 컬럼 부피/cycle이고, 선형 유속은 300cm/h이다. 각 용리 피크를 수집하고, 샘플을 결합한 후 SDS-PAGE로 순도를 검출하여 BoNT/A 샘플을 얻었으며, 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 도 3에 나타내고, 표적 단백질(즉, 표 2의 6번에 대응되게 제조된 BoNT/A 단백질)의 SEC 크로마토그래피 순도는 98.8%(도 4)이었다.
상기 최적화된 정제 공정을 얻기 위해, 발명자는 정제 과정의 최적화 및 고순도 BoNT/A 샘플 획득을 목적으로 영향 요인에 대한 수많은 실험을 수행하였으며, 정제 단위 작업의 구성, 정제 단위 작업 순서에 중점을 두었다. 여기서 각 실험 과정, 각 단위 작업은 로딩 완충액 조성, 용리 조건, pH값, 패킹량, 로딩 유속, 컬럼 높이, 컬럼 직경, 컬럼 부피 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 거의 동일한 실험 조건을 수행하며, 실험 결과는 표 2에 나타내었다.
정제 과정이 표적 단백질 순도에 미치는 영향
번호 정제 과정/단계 표적 단백질 순도(%)
1 황산암모늄 염석, 소수성 크로마토그래피,
DEAE 음이온 크로마토그래피, pH 8.5		 83.7
2 황산암모늄 염석, DEAE 음이온 크로마토그래피,
소수성 크로마토그래피, pH 8.5		 85.8
3 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석,
DEAE 음이온 크로마토그래피, pH 8.5		 92.7
4 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석,
DEAE 음이온 크로마토그래피, 투석, pH 8.5		 98.5
5 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석,
DEAE 음이온 크로마토그래피, pH 8.5		 98.5
6 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석,
DEAE 음이온 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, pH 8.5		 98.8
7 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석,
DEAE 음이온 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, pH7.5		 95.2
실시예 3: BoNT/A 단백질의 구조적 동정
1. 완전한 분자량 검출
1.1 샘플 처리: 실시예 2에서 제조한 BoNT/A 단백질 샘플 1ml를 취하여 5배 농축한 후 균일하게 혼합하여 로딩하였다.
1.2 UPLC 조건:
크로마토그래피 컬럼: BioResolve RP mAb 2.7 μm, 2.1mmХ100 mm, Waters 01093809916819; 컬럼 온도: 50℃ 검출 파장: 280 nm; 유속: 0.3 ml/min; 로딩 용량: 10μl.
이동상 A: 0.05% TFA·H2O(트리플루오로아세트산 수용액); 이동상 B: 0.05% TFA·ACN(트리플루오로아세트산·아세토니트릴).
1.3 MS 조건: 이온화 방식: ESI positive; 질량 스캔 범위: 300~4000 Da; 모세관 전압: 3.0 KV; 소스 온도: 100℃ 콘 전압: 150 KV; 탈용매 가스 온도: 450℃ 콘 백플러시 가스 유속: 50 L/H; 탈용매 가스 유속: 800 L/H.
1.4 데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였으며, 분석 결과는 표 3 및 도 5를 참조할 수 있다.
완전한 분자량 데이터 분석
피크 동정된 성분 이론적 분자량(Da) 실측 분자량(Da) 오차(ppm) 비율
1 BoNT/A 149306.7636 149311.9349 34.6 97.2%
2 BoNT/A(탈아미드 변형) 149308.7795 149313.0812 28.8 2.8%
2. 환원된 분자량 검출
2.1 샘플 처리: 실시예 2에서 제조한 BoNT/A 단백질 샘플 150 μl를 취하여 7mol/L 구아디닌 염산염 150 μl, 0.1 mol/L Tris(pH값 8.0) 및 1mol/L DTT 3μl에 첨가하고, 70℃의 일정한 온도에서 30min 동안 인큐베이션한 후, 균일하게 혼합하였다.
2.2 UPLC 조건은 단계 1.2와 동일하다.
2.3 MS 조건은 콘 전압이 40 KV라는 점을 제외하고 단계 1.3과 동일하다.
2.4 데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였으며, 분석 결과는 표 4 및 도 6을 참조할 수 있다.
환원된 분자량 데이터 분석
피크 동정된 성분 이론적 분자량(Da) 실측 분자량(Da) 오차(ppm)
1 BoNT/A-LC 51159.5785 51160.3744 15.6
2 BoNT/A-HC 98151.2169 98153.5471 28.8
3 BoNT/A-HC(탈아미드 변형) 98152.3632 98155.2075 30.0
3. 이황화 결합 분석
3.1 샘플 처리: 실시예 2에서 제조한 BoNT/A 단백질 샘플 1 ml를 취하여 5배 농축한 후, 각 농축관에 0.05 mol/L 중탄산암모늄 350μl를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 100 μl로 농축한 후, 각 농축관에 1mol/L 요오도아세트아미드 용액(IAM) 4 μl 및 0.05mol/L 중탄산암모늄 350 μl를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 100 μl로 농축한 후, 농축된 샘플 180 μl를 취하여 1% RapiGest SF 계면활성제 20μl에 첨가하고, 60℃의 일정한 온도에서 30min 동안 인큐베이션한 후, 8 μg의 트립신을 첨가하여 37℃의 일정한 온도에서 밤새 인큐베이션한 후 꺼내고, 그 다음 1 μl의 포름산을 첨가하여 37℃의 일정한 온도에서 45min 동안 인큐베이션하고, 꺼낸 후 13000rpm 조건에서 10min 동안 원심분리하였으며, 상층액을 취하여 균일하게 혼합하여 주입하였다.
3.2 UPLC 조건:
크로마토그래피 컬럼: UPLC BEH C18 1.7 μm, 2.1 mmХ150 mm, Waters 01443804318321; 컬럼 온도: 60℃ 검출 파장: 215 nm; 유속: 0.3 ml/min; 로딩 용량: 10 μl.
이동상 A: 0.05% TFA·H2O; 이동상 B: 0.05% TFA·ACN.
3.3. MS 조건:
이온화 방식: ESI positive; 질량 스캔 범위: 100~2000 Da; 모세관 전압: 3.0 KV; 소스 온도: 100℃; 콘 전압: 40 KV; 탈용매 가스 온도: 450℃; 콘 백플러시 가스 유속: 50 L/H; 탈용매 가스 유속: 800 L/H.
3.4. 데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였으며, 분석 결과는 표 5 및 도 7을 참조할 수 있다.
이황화 결합 데이터 분석표
시스테인 위치 구조 동정된 펩타이드
세그먼트		 이론적 분자량(Da) 실측 분자량(Da) 오차(ppm)
C3-C4 이황화 결합 LLCVR=ALNDLCIK 1489.8229 1489.8216 0.9
C8-C9 이황화 결합 CK=TLGCSWEFIPVDDGWGERPL 2524.1635 2524.1568 2.7
C1 유리 티올 VIDTNCINVIQPDGSYR 1963.9542 1963.9492 2.5
C2 유리 티올 SEELNLVIIGPSADIIQFECK 2375.2163 2375.2229 2.8
C5 유리 티올 FLNQCSVSYLMNSMIPYGVKR 2351.1233 2351.1138 4.0
C6 유리 티올 YFNSISLNNEYTIINCMENNSGWK 2911.3026 2911.2913 3.9
C7 유리 티올 LDGCR 620.2821 620.2825 0.7
4. 데이터 분석 결과:
표 3~5의 분석 데이터로부터, BoNT/A 단백질의 완전한 분자량, 환원된 분자량 및 이황화 결합 연결이 이론값과 일치함으로 알 수 있는데, 이는 정제된 BoNT/A 단백질 서열이 정확하고, 정확한 고차 형태를 가짐을 나타낸다.
실시예 4: BoNT/A 단백질의 생체 내 활성(독성)의 예비 측정
실험 동물: ICR 마우스, 4~5주령, 17~22g.
실시예 2의 방법으로 제조된 서로 다른 배치의 BoNT/A 샘플을 시험 샘플로 선택하고, 각각 1#, 2#, 3# 및 4#로 넘버링하였으며, 각 시험 샘플의 부피는 0.5ml이고, 그 후 4.5 ml의 생리식염수를 첨가하여 10배로 구배 희석하고, 3~4회 진탕하여 균일하게 혼합한 후, 얼음물 혼합물에 넣었다. 복강내 접종 방식으로 각각 4개의 시험 샘플을 4개 군의 마우스 체내에 각 군당 5마리, 마리당 0.1 ml씩 접종하여 3일간 연속 관찰하고, 동물의 사망 상황을 매일 기록하였으며, 분석 결과는 표 6을 참조할 수 있다.
다양한 군의 동물 사망 상황
실험 날짜 관찰 시간 배치 번호: 1#
0h 10: 00 ― ― ― ― ―
6h 16: 00 발병, 호흡 촉박, 행동 지연 발병, 호흡 촉박, 행동 지연 발병, 호흡 촉박, 행동 지연 ― ―
22h 8: 30 +사망 +사망 +사망 +사망 +사망
실험 날짜 관찰 시간 배치 번호: 2#
0h 10: 00 ― ― ― ― ―
6h 16: 00 +사망 +사망 +사망 +사망 +사망
실험 날짜 관찰 시간 배치 번호: 3#
0h 10: 00 ― ― ― ― ―
6h 16: 00 +사망 +사망 +사망 +사망 +사망
실험 날짜 관찰 시간 배치 번호: 4#
0h 10: 00 ― ― ― ― ―
6h 16: 00 +사망 +사망 +사망 +사망 +사망
참고: "-"는 실험 동물이 건강하고 살아있음을 의미하고, "+"는 실험 동물의 이상 상태에서 자세히 설명된 바와 같이 실험 동물이 사망되었음을 의미한다. 실험 결과로부터,
주어진 시험 샘플 농도에서, 각 배치의 시험 샘플(1#, 2#, 3#, 4#)은 모두 우수한 생체 내 활성(독성)을 나타내고, 그 중 2#, 3#, 4# 시험 샘플은 상대적으로 더 우수한 생체 내 활성(독성)을 가짐을 알 수 있다.
실시예 5: BoNT/A 단백질의 독성 측정
60마리의 ICR 마우스(30숫컷 30암컷)를 취하여 체중을 측정하고, 체중에 따라 무작위로 10개 군, 각 군에 6마리(3숫컷 3암컷)씩 나누었다. 실시예 2의 방법에 따라 제조된 BoNT/A 단백질을 시험 샘플로 선택하고, 300 pg/마리의 용량을 시작 용량으로 하였으며, 2배 구배로 10가지 용량 구배: 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.375, 4.6875, 2.34375, 1.171875 및 0.5859375 pg/마리를 설정하여 투여하였다. 각 마우스에게 군별로 각각 해당 농도의 시험 샘플을 투여하고, 각 마우스의 복강내에 실시예 2의 방법에 따라 제조된 BoNT/A 단백질 0.1 ml를 주사하여 연속 4일 동안 각 군의 사망수를 매일 관찰하고 기록하였다. graphpad26을 사용하여 변환된 용량 로그 및 사망률로 logstic 회귀 피팅을 수행하여 LD50값을 계산하였다. 그 결과, 시험 샘플의 LD50은 4.023pg/마리이고, 샘플의 환산 독성은 1.06Х108 LD50/mg이였으며, 분석 결과는 표 7을 참조할 수 있다.
구배 농도에서의 동물 사망률
샘플 양(pg) 1일차 군 내 사망 2일차 군 내 사망 3일차 군 내 사망 4일차 군 내 사망 총
사망 수		 총
동물 수		 사망률
300 6 6 6 6 6 6 100%
150 6 6 6 6 6 6 100%
75 6 6 6 6 6 6 100%
37.5 6 6 6 6 6 6 100%
18.75 4 6 6 6 6 6 100%
9.375 0 5 5 5 5 6 83.3%
4.6875 0 3 4 4 4 6 66.7%
2.34375 0 1 1 1 1 6 16.7%
1.171875 0 0 0 0 0 6 0%
0.5859375 0 0 0 0 0 6 0%
실시예 6: 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 경쇄 돌연변이체, 중쇄 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아의 구축
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 경쇄 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3이고; 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9임) 및 중쇄 돌연변이체를 코딩한 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4이고; 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10임)의 두 말단에 각각 XbaI, BamHI 효소 절단 부위를 추가하고, 서열을 Bao Bioengineering (Dalian) Co., Ltd.에 위탁하여 합성하여 각각 경쇄 돌연변이체 및 중쇄 돌연변이체의 표적 유전자 뉴클레오티드 서열을 얻었다.
경쇄 돌연변이체 및 중쇄 돌연변이체의 표적 유전자 뉴클레오티드 서열을 각각 XbaI 및 BamHI로 이중 효소 절단하고, 벡터pET-5a(+)도 각각 XbaI 및 BamHI로 이중 효소 절단하였으며, 표적 유전자 및 벡터를 이중 효소 절단하여 얻어진 표적 단편을 겔 절단하여 회수하였다. 경쇄 돌연변이체 및 중쇄 돌연변이체의 이중 효소 절단 단편을 각각 벡터의 이중 효소 절단 단편에 연결하고, 연결 시스템을 형질전환시킨 후, 표적 단백질에 대해 클론 스크리닝 및 플라스미드 효소 절단 검증을 수행한 후, 최종적으로 보툴리눔 신경독소 A형 경쇄 돌연변이체 단백질 및 중쇄 돌연변이체 단백질을 발현하는 유전자 조작 박테리아를 각각 얻었다. 여기서, 경쇄 돌연변이체 단백질 및 중쇄 돌연변이체 단백질의 유전자 조작 박테리아 플라스미드 검증은 도 8에 나타내었으며, 왼쪽 사진은 경쇄 돌연변이체 플라스미드의 이중 효소 분해 아가로스 전기영동을 나타내고, 오른쪽 사진은 중쇄 돌연변이체 플라스미드의 이중 효소 분해 아가로스 전기영동을 나타낸다.
여기서, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 경쇄 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9이다.
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACGGTATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAACCTAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO: 9);
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 중쇄 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10이다.
ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGGCAAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACGCAATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCGAGCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO: 10).
실시예 7: 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 제조
실시예 6에서 제조된 경쇄 돌연변이체 단백질을 발현하는 유전자 조작 박테리아를 각각 배양하고, 발효 발현, 변성 재생, 시험관 내 조립 및 정제를 통해 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1(본 실시예에서는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 단백질1, 또는 돌연변이체 1로도 지칭됨)을 얻었으며, 여기서, 야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여, 돌연변이체 1의 돌연변이 위치는 C134G, C165P, C791A, C967A 및 C1060E이며, 구체적인 단계는 다음과 같다.
(1) 경쇄 돌연변이체 단백질, 중쇄 돌연변이체 단백질의 발효 발현
실시예 6에서 제조된 경쇄 돌연변이체 단백질 및 중쇄 돌연변이체 단백질을 발현하는 유전자 조작 박테리아를 각각 LB 배지가 담긴 진탕 플라스크에 넣어 배양하고, OD600이 1.6~2.0에 도달하면, 5L 발효조로 옮겨 배양하되, 초기 배양 부피는 2.5L이고, 배양 온도는 37℃이며, 교반 속도는 800rpm이고, OD600이 30으로 상승하면 유도를 시작하되, 이소프로필티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 유도제로 선택하여 유도하고, 농도는 0.5mM이며, 유도 시간은 4~8h이다.
발효액 내 유전자 조작 박테리아의 성장을 현미경으로 검사하고, 발현 상황을 관찰하였으며, 단백질 발현이 관찰되고 4~8h의 유도 시간이 지나면, 발효 배양을 종료하고, 발효액을 수집하였으며, 회전 속도 10000rpm, 온도 4℃의 조건에서 원심분리하여 균체를 수집하였다. 수집된 균체를 광학 현미경으로 관찰하여 균체의 형태가 전형적인 대장균 형태인지, 다른 미생물 오염이 없는지 결정하였다.
균체를 수집하고 현미경 검사에서 완전한 세포가 발견되지 않을 때까지 적어도 두 주기 동안 700~800Bar의 분쇄 압력으로 고압 균질화 및 분쇄하였다.
원심분리하여 봉입체를 수집하고, 봉입체를 각각 1:20(w/v, g/ml)의 초순수로 2회 세척하여 경쇄 돌연변이체 봉입체 단백질(약칭: 경쇄 돌연변이체 봉입체), 중쇄 돌연변이체 봉입체 단백질(약칭: 중쇄 돌연변이체 봉입체)을 얻었다.
(2) 경쇄 돌연변이체 단백질, 중쇄 돌연변이체 단백질의 변성
실온에서, 경쇄 돌연변이체 봉입체 대 중쇄 돌연변이체 봉입체의 중량비 1:4(g/g)에 따라 경쇄 돌연변이체 봉입체와 중쇄 돌연변이체 봉입체를 각각 칭량한 후, 경쇄 돌연변이체 봉입체 또는 중쇄 돌연변이체 봉입체 대 변성 완충액의 중량 부피비 1: 20(w/v, g/ml)에 따라 경쇄 돌연변이체 봉입체 또는 중쇄 돌연변이체 봉입체를 각각 pH값이 10.0인 변성 완충액(8M 요소 및 10mM DTT를 함유한 20mM Tris)에 용해시키고, 교반 속도는 200rpm이며, 완전히 용해시켜 변성액(즉, 경쇄 돌연변이체 변성 생성물 또는 중쇄 돌연변이체 변성 생성물)을 얻었다.
(3) 경쇄 돌연변이체 단백질, 중쇄 돌연변이체 단백질의 재생 및 시험관 내 조립
단계 (2)에서 얻어진 용해된 경쇄 돌연변이체 변성 생성물 및 중쇄 돌연변이체 변성 생성물을 동일 부피로 혼합하여 변성 혼합액을 얻은 후, 변성 혼합액과 재생 및 조립 완충액을 부피비 1:10으로 혼합하고, 회전 속도 200rpm 조건에서 계속 교반하였으며, 밤새 재생 및 조립하여 조립액을 얻었다.
재생 및 조립 완충액의 조성: 100 mM NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM GSH, 5 mM GSSG, 50 mM Tris-HCl 및 0.5% Tween-20, pH값 10.0이다.
소량의 조립액을 부피비 5:1(ml/ml)로 농축하고, SDS-PAGE 전기영동으로 조립 상황을 관찰하여 SDS-PAGE 전기영동에서 단일 150KD 표적 밴드가 나타나면 조립을 중지하고, 하류 정제에 진입하였다.
(4) 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 단백질의 정제
순차적으로 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석, DEAE 음이온 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피를 수행하여 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1을 얻었다.
소수성 크로마토그래피: NaCl 최종 농도가 2mol/L이 될 때가지 상기 시험관 내 조립액에 4mol/L NaCl을 첨가하여 로딩 원액으로 사용하였다. 이동상 A로 3CV를 평형화하고, 로딩 용량까지 로딩하였으며, 이동상 A로 6CV를 헹구고, 0% B~100% B로 10CV 구배로 용리하였으며;
이동상 A: 20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA+2.0mol/L NaCl, pH값은 8.5이고;
이동상 B: 20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA, pH 8.5이다.
황산암모늄 염석: 황산암모늄의 포화 농도 80%에 따라 황산암모늄 적당량을 칭량하여 소수성 크로마토그래피 용리액에 첨가하고, 황산암모늄이 완전히 용해될 때까지 교반한 후, 2~8℃ 냉장고에 넣어 24h 동안 100rpm의 교반 속도로 계속 교반하였다. 4℃ 12000rpm 조건에서 30min 동안 원심분리하여 침전물을 분리하였다.
투석: 침전물 대 완충액 비율 1:10(w/v, g/ml)으로 50mM Tris-HCl 완충액(pH값은 8.5)을 취하여 침전물을 용해시킨 후, 투석 백(분자량 컷오프: 100kDa)에 옮기고, 4℃에서, 부피가 투석 대상액의 20배인 50mM Tris-HCl 완충액(250mM NaCl 함유, pH값 8.5)과 교반(100rpm)하여 3시간 동안 투석하였다. 그 후 부피가 투석 대상액의 20배인 50mM Tris-HCl 완충액(pH값 8.5)과 교반(100rpm)하여 24시간 동안 투석하였다.
DEAE 음이온 크로마토그래피: 상기 투석액을 크로마토그래피에 직접 로딩하고;
이동상 A: 20mmol/L Tris, pH값 8.5이며;
이동상 B: 20mmol/L Tris+1.0mol/L NaCl, pH값 8.5이고;
크로마토그래피 단계: A로 3CV를 평형화하고, 로딩 용량까지 로딩하였으며, A로 3CV를 헹구고, 0% B~50% B를 20CV 구배로 용리시켰다.
G-25M 분자체 크로마토그래피: DEAE 음이온 크로마토그래피 용리액을 직접 로딩하여 분자체 크로마토그래피를 수행하고;
이동상: 20mmol/L Tris, pH값 8.5, 로딩 용량≤30% 컬럼 부피/cycle, 선형 유속 300cm/h이며,
각 용리 피크를 수집하고, 샘플을 결합한 후 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 순도를 검출하여 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1을 얻었다.
실시예 8: 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 구조적 동정
1. 완전한 분자량 검출
샘플 처리: 실시예 7에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1 샘플 1ml를 취하여 5배 농축한 후 균일하게 혼합하여 로딩하였다.
UPLC 조건:
크로마토그래피 컬럼: BioResolve RP mAb 2.7μm, 2.1mmХ100mm, Waters 01093809916819; 컬럼 온도: 50℃; 검출 파장: 280nm; 유속: 0.3ml/min; 로딩 용량: 10μl.
MS 조건:
이온화 방식: ESI positive; 질량 스캔 범위: 300~4000Da; 모세관 전압: 3.0KV; 소스 온도: 100℃; 콘 전압: 150KV; 탈용매 가스 온도: 450℃; 콘 백플러시 가스 유속: 50L/H; 탈용매 가스 유속: 800L/H;
데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 완전한 분자량 데이터 분석은 표 8에 나타내었다.
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 완전한 분자량 데이터 분석
피크 동정된 성분 이론적 분자량(Da) 실측 분자량(Da) 오차(ppm) 비율
1 BoNT/A 돌연변이체 149216.3987 149218.3271 12.9 99.3%
2 BoNT/A 돌연변이체
(탈아미드 변형)		 149218.4025 149220.3026 12.7 0.7%
2. 환원된 분자량 검출
샘플 처리: 실시예 7에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1 샘플 150μl 를 취하여 7mol/L 구아디닌 염산염/0.1mol/LTris(pH값 8.0) 150μl 및1mol/L DTT 3μl에 첨가하고, 70℃의 일정한 온도에서 30min 동안 인큐베이션한 후, 균일하게 혼합하였다.
UPLC 조건:
크로마토그래피 컬럼: BioResolve RP mAb 2.7μm, 2.1mmХ100mm, Waters 01093809916819; 컬럼 온도: 50℃ 검출 파장: 280nm; 유속: 0.3ml/min; 로딩 용량: 10μl;
MS 조건:
이온화 방식: ESI positive; 질량 스캔 범위: 300~4000Da; 모세관 전압: 3.0KV; 소스 온도: 100℃; 콘 전압: 40KV; 탈용매 가스 온도: 450℃; 콘 백플러시 가스 유속: 50L/H; 탈용매 가스 유속: 800L/H;
데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 환원된 분자량 데이터 분석은 표 9에 나타내었다.
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 환원된 분자량 데이터 분석
피크 동정된 성분 이론적 분자량(Da) 실측 분자량(Da) 오차(ppm)
1 경쇄 돌연변이체 51107.6307 51108.1112 9.4
2 중쇄 돌연변이체 98113.7816 98115.5619 18.1
3. 이황화 결합 분석
샘플 처리: 실시예 7에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1 샘플 1ml를 취하여 5배 농축한 후, 각 농축관에 0.05mol/L 중탄산암모늄 350μl를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 100 μl로 농축한 후, 각 농축관에 1mol/L 요오도아세트아미드 용액(IAM) 4μl 및 0.05mol/L 중탄산암모늄 350μl를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 100 μl로 농축한 후, 농축된 샘플 180μl를 취하여 1% RapiGest SF 20μl에 첨가하고, 60℃의 일정한 온도에서 30min 동안 인큐베이션한 후, 8μg의 트립신을 첨가하여 37℃의 일정한 온도에서 밤새 인큐베이션한 후 꺼내고, 1μl의 포름산을 첨가하여 37℃의 일정한 온도에서 45min 동안 인큐베이션하여 꺼낸 후, 13000rpm으로 10min 동안 원심분리하였으며, 상층액을 취하여 균일하게 혼합하여 주입하였다.
UPLC 조건:
크로마토그래피 컬럼: UPLC BEH C18 1.7μm, 2.1mmХ150mm, Waters 01443804318321; 컬럼 온도: 60℃, 검출 파장: 215nm; 유속: 0.3ml/min; 로딩 용량: 10μl;
MS 조건:
이온화 방식: ESI positive; 질량 스캔 범위: 100~2000Da; 모세관 전압: 3.0KV; 소스 온도: 100℃; 콘 전압: 40KV; 탈용매 가스 온도: 450℃; 콘 백플러시 가스 유속: 50L/H; 탈용매 가스 유속: 800L/H;
야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 구조적 동정: 구조적 동정의 내용 및 방법은 본 실시예 3(야생형 보툴리눔 신경독소 A형 샘플의 제조, 구체적인 제조 방법은 실시예 1 및 실시예 2 참조)과 동일하다.
데이터 수집 및 처리: Masslynx V4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고, UNIFI 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 구체적인 결과는 표 10 및 표 11을 참조할 수 있는데, 표 10은 야생형 보툴리눔 신경독소 A형 샘플의 검출 결과이고, 표 11은 실시예 7에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1 샘플의 검출 결과이며, 여기서, C1-C9의 위치는 구체적으로 도 9를 참조할 수 있는데, 여기서 Cn은 야생형 보툴리눔 신경독소 A형 서열에서 N-말단부터 C-말단까지의 n 번째 시스테인을 나타내고, C1은 첫 번째 시스테인을 나타내며, C2는 두 번째 시스테인????C9는 아홉 번째 시스테인을 나타낸다.
야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 이황화 결합 분석
이황화 결합
연결 방식		 전체 신호 응답값 총 비율
이황화 결합의
정확한 연결		 C3=C4 512932919 94.80%
C8=C9
이황화 결합의
불일치한 연결

 C1=C2 28133240

 5.20%
C1=C3
C1=C8
C2=C3
C2=C8
C2=C9
C3=C5
C3=C6
C3=C7
C3=C8
C3=C9
C4=C8
C4=C9
C5=C7
C5=C8
C6=C8
C7=C8
C7=C9
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 이황화 결합 분석
이황화 결합
연결 방식		 전체 신호 응답값 총 비율
이황화 결합의
정확한 연결 		C3=C4 619401425 100.00%
C8=C9
이황화 결합의
불일치한 연결 		C3=C8 - -
C3=C9 - -
C4=C8 - -
C4=C9 - -
이로부터, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 이황화 결합의 연결 정확도는 100.00%로, 이황화 결합 불일치가 발견되지 않음을 알 수 있다. 반면 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 이황화 결합의 연결 정확도는 94.80%로, 불일치율은 5.20%이고, 그 중 C3=C8의 불일치율은 0.67%이며, C3=C9의 불일치율은 0.23%이다. 따라서, 야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여, 본 발명의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 이황화 결합 불일치율은 크게 감소되고, C3=C8 및 C3=C9의 불일치가 발생하지 않았다.
실시예 9: 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 제조 및 이황화 결합의 구조적 동정
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2(약칭: 돌연변이체 2)의 제조에 대한 구체적인 제조 방법은 실시예 6 및 실시예 7을 참조하고, 구조적 동정의 내용 및 방법은 돌연변이체 2의 아미노산 서열이 상이하고(야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여, 돌연변이체 2의 돌연변이 위치는 C134G, C165G, C791A, C967A 및 C1060G임), 상응하게, 돌연변이체 2의 경쇄 돌연변이체의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5이고; 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11임) 및 중쇄 돌연변이체의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6이고; 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12임)이라는 구별점만 제외하고 실시예 8을 참조한다. 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 이황화 결합을 검출하였으며, 구체적인 검출 방법은 실시예 8을 참조할 수 있고, 검출 데이터는 표 12에 나타내었다.
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 이황화 결합 분석
이황화 결합
연결 방식		 전체 신호 응답값 총 비율
이황화 결합의
정확한 연결		 C3=C4 583222471 99.71%
C8=C9
이황화 결합의
불일치한 연결		 C3=C8 1111346 0.19%
C3=C9 584919 0.10%
C4=C8 - -
C4=C9 - -
여기서, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 경쇄 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11이다.
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACGGTATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAAGGTAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO: 11);
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 중쇄 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12이다.
ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGGCAAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACGCAATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCGGTCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO: 12).
실시예 10: 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 단백질의 활성 측정
시험 샘플:
실시예 7에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1, 실시예 9에서 제조한 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2 및 실시예 2의 6번에서 제조한 야생형 보툴리눔 신경독소 A형.
실험 설계 및 군별 투여:
적응급식 후 162마리의 마우스 중 54마리씩 취하여 3개의 시험 대상 샘플 시험에 사용하였으며, 투여 후 연속 4일 동안 각 군별 마우스의 독성 반응과 동물의 사망 상황을 면밀히 관찰하였다.
실험 전 실험 마우스의 체중을 칭량하고, 체중에 따라 각 군에 균등하게 분배하여 각 군의 동물 평균 체중에 통계적 차이가 없도록 보장하였다. 각 실험을 각 군에 6마리, 암수 반반씩 9개 군으로 나누었다. 다음과 같이 복강 주사 방식으로 시험 샘플을 투여하였다. 한 사람이 시험 샘플 용액을 추출하고, 다른 사람이 확인하며; 한 사람이 동물을 고정시키고, 다른 사람이 동물 투여 작업을 완료하였으며, 각 군의 주사가 완료된 후 투여 시간을 기록하였다. 시험 샘플인 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 그룹화 및 투여량 정보는 표 13에 나타내었다.
시험 샘플인 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 마우스 사망 상황 기록 통계표
용량
(pg/마리)		 용량 로그 동물
수(마리)		 총 사망 수(마리) 생존 동물 수(마리) 누적 사망 수(마리) 누적 생존 수(마리) 누적 사망률(%)
17.85714 1.25181 6 6 0 49 0 100
12.75510 1.10568 6 6 0 43 0 100
9.11079 0.95956 6 6 0 37 0 100
6.50771 0.81343 6 6 0 31 0 100
4.64836 0.66730 6 6 0 25 0 100
3.32026 0.52117 6 5 1 19 1 93.75
2.37161 0.37504 6 5 1 14 2 83.33333
1.69401 0.22892 6 2 4 5 6 45.45455
1.21001 0.08279 6 3 3 3 9 25
상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 50% 누적 사망률은 45.45455%~83.33333% 사이이다.
본 실험 조건에서, Reed-Muench법에 따라 계산한 결과, 시험 샘플인 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1의 LD50은 1.76381 pg/마리이고, 샘플의 환산 독성은 5.67Х108 LD50/mg이었다.
동일한 실험 조건에서, Reed-Muench법에 따라 계산한 결과, 시험 샘플인 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2의 LD50은 3.0770 pg/마리이고, 샘플의 환산 독성은 3.25Х108 LD50/mg이었다.
동일한 실험 조건에서 , Reed-Muench법에 따라 계산한 결과, 시험 샘플인 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 LD50은 4.5662 pg/마리이고, 샘플의 환산 독성은 2.19Х108 LD50/mg이었다.
3개의 상이한 시험 샘플의 독성 비교는 표 14에 나타내었다.
시험 샘플인 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1, 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2 및 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 독성 비교표
시험 샘플(배치 번호) LD50(pg/마리) 독성(LD50/mg)
야생형 보툴리눔 신경독소 A형 4.5662 2.19Х108
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1 1.7638 5.67Х108
보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 2 3.0770 3.25Х108
상기 표 14로부터, 본 발명의 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 1는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형과 비교하여 야생형 보툴리눔 신경독소 A형 독성의 2.6배인 더 높은 생물학적 활성(독성)을 가짐을 알 수 있다.
이상, 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였지만, 이상에서 언급한 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 당업자는 본 발명의 범위 내에서 전술한 실시예를 변경, 수정, 대체 및 변형할 수 있다.

Claims (55)

  1. 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체로서,
    사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되는 제1 펩타이드 세그먼트와 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하되;
    상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및/또는 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는
    상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060 중 적어도 하나의 돌연변이 위치를 갖는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사슬 간 이황화 결합은 상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 430에서의 시스테인과 상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 454에서의 시스테인에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 위치 134 및 위치 165에서 돌연변이를 갖고; 및/또는
    상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 위치 791, 위치 967 및 위치 1060에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 위치 134, 위치 165, 위치 791, 위치 967 또는 위치 1060의 시스테인은 G, A, S, E 및 P 중 하나의 아미노산으로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 134의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 세그먼트의 위치 165의 C는 G, A, P 또는 S로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 791의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 967의 C는 G, A 또는 S로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2 펩타이드 세그먼트의 위치 1060의 C는 G, A, E 또는 S로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 경쇄와 비교하여 C134G 및 C165P에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제2 펩타이드 세그먼트는 야생형 보툴리눔 신경독소 A형의 중쇄와 비교하여 C791A, C967A 및 C1060E에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 세그먼트는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는
    상기 제2 펩타이드 세그먼트는 SEQ ID NO: 4 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 세그먼트와 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하거나; 또는
    상기 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체는 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 세그먼트와 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체.
  14. 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체의 제1 펩타이드 세그먼트 및/또는 제2 펩타이드 세그먼트를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 DNA인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  16. 발현 벡터로서,
    제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자를 보유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 플라스미드 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 유전자 조작 박테리아로서,
    제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 보유하거나; 또는,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체를 발현시키는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 박테리아.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 유전자 조작 박테리아는 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 숙주 박테리아로 형질전환함으로써 획득되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 박테리아.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 숙주 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 박테리아.
  21. 유전자 재조합을 통한 보툴리눔 신경독소 A형의 제조 방법으로서,
    경쇄 단백질을 1차 변성 처리하여 1차 변성 생성물을 얻는 단계;
    중쇄 단백질을 2차 변성 처리하여 2차 변성 생성물을 얻는 단계; 및
    상기 1차 변성 생성물과 2차 변성 생성물을 재생 및 조립 처리하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 경쇄 단백질은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 펩타이드 세그먼트 또는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
    상기 중쇄 단백질은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제2 펩타이드 세그먼트 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질은,
    상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질을 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 대장균으로 형질전환시키는 단계; 및
    상기 플라스미드가 형질전환된 대장균을 단백질 발현에 적합한 조건에서 배양, 유도, 원심분리하여 균체를 수확하고, 균체를 분쇄하며, 생성물을 원심분리로 분쇄하여 상기 경쇄 단백질 또는 중쇄 단백질을 얻는 단계를 통해 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 1차 변성 처리 및 상기 2차 변성 처리는 변성 완충액에서 수행되고, 상기 변성 완충액은,
    5~10 M 요소, 5~15 mM 디티오트레이톨 및 10~30 mM Tris 또는 Tris-HCl을 포함하며;
    선택적으로, 상기 변성 완충액의 pH값은 9.5~10.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 처리를 수행하기 전에, 미리 상기 1차 변성 생성물과 상기 2차 변성 생성물을 혼합 처리하여 변성 혼합액을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 혼합 처리 과정에서 상기 1차 변성 생성물 대 상기 2차 변성 생성물의 부피비는 1:(1~10)인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 변성 혼합액 대 재생 및 조립 완충액의 부피비는 1:(1~10)인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 처리는 재생 및 조립 완충액에서 수행되고, 상기 재생 및 조립 완충액은,
    50~150 mM NaCl, 0.1~1.0 mM ZnCl2, 0.1~1.0 mM CaCl2, 1.0~10.0 mM 환원 글루타티온, 1.0~10.0 mM 산화 글루타티온, 40~50 mM Tris-HCl 및 0.4~0.6% 트윈 20을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 완충액의 pH값은 9.5~10.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 처리의 처리 시간은 12~16h인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 처리의 교반 속도는 50~200rpm인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재생 및 조립 처리를 통해 얻은 조립액에 대해 순차적으로 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석, 투석, 음이온 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피 처리를 수행하여 상기 보툴리눔 신경독소 A형을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 소수성 크로마토그래피 처리의 이동상 A1은 10~30 mmol/L Tris-HCl, 2~8 mmol/L EDTA 및 1~3 mol/L NaCl을 포함하고, 이동상 B1은 10~30 mmol/L Tris-HCl 및 2~8 mmol/L EDTA를 포함하며, 상기 이동상 A1 및 이동상 B1의 pH값은 모두 8.0~9.0인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 황산암모늄 염석 처리는,
    황산암모늄 및 상기 소수성 크로마토그래피 처리를 통해 얻은 용리액을 2~8℃ 조건에서 12~24h 동안 혼합한 후, 혼합 생성물을 2~8℃ 10000~15000rpm 조건에서 20~40min 동안 원심분리 처리하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 투석 처리는,
    상기 침전물을 1차 완충액에 용해시켜 투석 대상액을 얻는 단계;
    상기 투석 대상액과 1차 투석액에 대해 1차 투석 처리를 수행하는 단계; 및
    얻어진 1차 투석 처리 생성물과 2차 투석액에 대해 2차 투석 처리를 수행하는 단계를 포함하되;
    1차 완충액은 40~60 mM Tris-HCl 완충액으로부터 선택되고, 1차 투석액은 40~60 mM Tris-HCl 염 함유 투석액으로부터 선택되며, 2차 투석액은 40~60 mM Tris-HCl투석액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 침전물의 중량(g) 대 상기 1차 완충액의 부피(ml)의 비율은 1:(5~15)인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 1차 투석 처리의 투석 시간은 2~5 h이고, 상기 2차 투석 처리의 투석 시간은 12~24 h인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 Tris-HCl 염 함유 투석액은 200~300 mM NaCl를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 1차 투석 처리 및 상기 2차 투석 처리의 투석 백의 분자량 컷오프는 80~120 kDa인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제32항에 있어서,
    상기 음이온 크로마토그래피 처리는 DEAE 셀룰로오스 음이온 크로마토그래피로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제32항에 있어서,
    상기 DEAE 셀룰로오스 음이온 크로마토그래피의 이동상 A2는 10~30 mmol/L Tris를 포함하고, 이동상 B2는 10~30 mmol/L Tris 및 0.5~1.5 mol/L NaCl를 포함하며, 상기 이동상 A2 및 이동상 B2의 pH값은 8.0~9.0인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제32항에 있어서,
    상기 분자체 크로마토그래피 처리는 G-25M 분자체 크로마토그래피를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 약학적 조성물로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체 또는 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용 가능한 보조제는 완충액, 보호제, 활성제 및 부형제로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  46. 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
    상기 약물은 의료 미용에 사용되거나; 또는
    상기 약물은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 치료하거나 개선하는 데 사용되는 용도.
  47. 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선에 있어서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
    상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함하는 용도.
  48. 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선을 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물로서,
    상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함하는, 의료 미용 또는 질병의 치료 또는 개선을 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물.
  49. 제46항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 의료 미용은,
    미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  50. 질병의 개선 및/또는 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고;
    상기 질병은 사시, 경부근 긴장 이상, 후두근 긴장 이상, 상지초점근 긴장 이상, 본태성 손떨림, 타액 흘림, 눈꺼풀 경련, 반쪽 안면 경련, 뇌졸중으로 인한 상하지 경련, 뇌성마비로 인한 상하지 경련, 겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증, 배뇨근-괄약근 실조증, 만성 편두통 및 신경성 및 특발성 과민성 방광 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 투여는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 의료 미용 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 신경독소 A형 돌연변이체, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 보툴리눔 신경독소 A형 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 의료 미용은 주름 제거 및/또는 얼굴 슬리밍을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52항에 있어서,
    상기 의료 미용은 미간 주름, 눈가 주름 및 이마 주름 중 적어도 하나를 개선 및/또는 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제52항에 있어서,
    상기 투여는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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