TW202339791A - 一種肉毒毒素蛋白組合物、製備方法及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明公開了一種肉毒毒素蛋白組合物,主要包含肉毒毒素蛋白、糖類、鹽類、人血清白蛋白組分。本發明的肉毒毒素蛋白的組合物活性好,性狀穩定,可以維持其肉毒毒素蛋白的活性在長期儲存的條件下仍保持較高活性。
Description
本發明涉及膽鹼能神經支配的藥物或醫學美容技術領域,具體涉及一種肉毒毒素蛋白組合物及其製備方法和應用。
天然肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)是由梭菌屬厭氧肉毒桿菌產生的毒素蛋白。BoNTs通過切割乙醯膽鹼能神經末梢囊泡相關膜蛋白,抑制膽鹼能神經遞質釋放,導致受膽鹼能支配的組織出現鬆弛性麻痹,其在醫療和美容領域有廣泛的應用。
目前已經發現了七種類型的BoNTs,分別命名為BoNT/A到BoNT/G。BoNTs由於獨特的藥理學特性,如對神經系統的高特異性,局部注射有限的擴散性,以及其作用的可逆性,已經迅速發展成為了一類治療膽鹼能過度興奮的藥物。從20世紀80年代美國藥監局正式批准BoNTs用於臨床治療以來,BoNTs的適應症一直在不斷擴大,特別是在醫美中的應用,增長非常迅速。
BoNTs的作用效果與其蛋白結構特點有關,其蛋白結構分為三個結構區, 由梭菌屬厭氧肉毒桿菌產生的BoNTs的基因編碼折疊形成,分別為結合神經末梢細胞膜的結合區、內化肉毒素到神經突觸末梢內的轉運區、具有酶切神經末梢囊泡相關膜蛋白的酶活性區。肉毒桿菌首先產生150kDa的非活性單鏈多肽(progenitor toxin),多肽在菌內蛋白酶作用下被酶切形成兩個肽段。具有生物活性的肉毒毒素由一個輕鏈(L,50kDa)和一個重鏈(H,100kDa)組成,重鏈和輕鏈通過二硫鍵連接。
BoNTs具有神經末梢結合特性,能夠使局部肌肉癱瘓,該特性使BoNTs能夠廣泛應用於醫美領域。具體的,BoNTs與神經末梢突觸前膜受體相互作用,隨後由轉運區完成BoNTs的內化,形成囊泡進入突觸前膜的胞漿,當BoNTs進入神經末梢後,BoNTs的蛋白酶對突觸前膜構成神經介質釋放的一個25kDa 突觸體相關蛋白(SNAP-25)具有高度特異性,可以特異性地切掉SNAP-25羧基末端9個胺基酸,從而造成SNAP-25 蛋白失去介導神經介質向突觸間隙釋放的功能。在神經肌肉接頭處由於缺少了神經介質的釋放而導致局部肌肉無法獲得神經系統的支配從而形成局部肌肉的癱瘓。
由梭菌屬厭氧肉毒桿菌產生的BoNTs與肉毒桿菌菌內產生的血凝素蛋白和非血凝素蛋白共同表達並形成複合體。複合體的形成對肉毒毒素經胃腸道侵襲人體或動物體起到保護作用。這些非肉毒毒素蛋白不具備肉毒毒素的活性,沒有治療作用,經肌肉注射後也不具有對肉毒毒素的保護作用。相反,還增加了在肌肉注射肉毒毒素時製劑中雜蛋白的攝入量,從而增加了機體對這些異源蛋白產生免疫反應的風險。目前雖已有從肉毒桿菌表達的多蛋白複合體中提取純化的肉毒毒素蛋白先例,但採用上述方法所獲得較高純度的肉毒毒素蛋白不僅步驟複雜、耗時、低效、成本較高,而且依舊不能解決保存、發酵和擴增肉毒桿菌所存在的生物風險,因而工業化生產面臨較大困難。
同時,現有技術中對於肉毒毒素蛋白製劑的保存還存在活性持久力差,使得使用時,肉毒毒素蛋白活性變差的問題,從而影響其治療效果。
針對背景技術中提到的技術問題,本發明提供一種重組肉毒毒素蛋白組合物及其製備方法和應用。
為了實現本發明的上述目的,本發明所採取的技術方案如下:
本發明提供一種肉毒毒素蛋白組合物,包括以下組分:
肉毒毒素蛋白和人血清白蛋白和糖類、鹽類;
優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.2-2%;
優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%。
優選的,所述糖類品質百分比範圍為0.5-6%;
優選的,所述糖類品質百分比範圍為0.5-2%;
更優選的,所述糖類品質百分比範圍為:0.5-1%;
優選的,所述糖類選自海藻糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖中的一種或多種;
優選的,所述糖選自蔗糖、乳糖中的一種或多種。
優選的,所述鹽類品質百分比範圍為:0.4-1%;
更優選的,所述鹽類品質百分比範圍為:0.4-0.9%;
特別優選的,所述鹽類品質百分比範圍為0.45-0.9%。
優選的,所述鹽類選自無機鹽或有機鹽中任一種;
更優選的,所述無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鎂、乙酸鈉、丙酸鈉和磷酸鉀中的一種或多種;
更優選的,所述有機鹽選自乳酸鈉、琥珀酸鈉中的一種或多種;
在本發明的一個實施例中,所述無機鹽為氯化鈉。
需說明的是,本發明可以根據肉毒毒素蛋白的毒性效價、使用的目的、目標物的體重確定肉毒毒素蛋白的用量。
優選的,所述肉毒毒素蛋白為重組肉毒毒素蛋白。可有效降低生產環節中的生物風險。
優選的,所述組合物包括肉毒毒素蛋白、人血清白蛋白、蔗糖、氯化鈉。
優選的,所述組合物包含如下組分:
所述人血清蛋白質量百分比範圍為:0.2-2%;
所述蔗糖品質百分比範圍為:0.5-6%;
所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.4-1%;
餘量為水。
更優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%;
所述蔗糖品質百分比範圍為0.5-2%;
所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.4-0.9%;
餘量為水。
特別優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%;
所述蔗糖品質百分比範圍為0.5-1%;
所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.45-0.9%;
餘量為水。
優選的,所述重組肉毒毒素蛋白由單鏈多肽經蛋白酶切割後形成多肽組成的至少一個二聚體結構;
所述的單鏈多肽包含:
(I)第一多肽片段,所述第一多肽片段包含:
(a) 標籤蛋白,
(b)包含第一蛋白酶切割位元點的結構區;
(c)連接短肽,
(II)第二多肽片段,所述第二多肽片段包含:
(d)第一功能胺基酸結構區,其包含金屬離子依賴的蛋白酶活性域;
(e)包含第二蛋白酶切割位元點的結構區;
(f)第二功能胺基酸結構區,其包含可與靶細胞表面受體結合的受體結合域和/或可以介導多肽跨囊泡膜轉移的易位域。
術語“標籤蛋白”是指可以與特定的配基結合的一類蛋白分子。
優選的,所述的標籤蛋白選自本領域技術人員已知的標籤蛋白或者經過電腦程式設計的標籤蛋白,所述的標籤蛋白能夠與已知基質特異結合。
更優選的,所述的標籤蛋白選自但不限於以下蛋白:谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)、C-myc、幾丁質結合結構域、麥芽糖結合蛋白(MBP)、SUMO異源親和部分、單克隆抗體或蛋白A、鏈黴親和素結合蛋白(SBP)、纖維素結合結構域、鈣調蛋白結合肽、S標籤、Strep標籤II、FLA、蛋白A、蛋白G、組胺酸親和標籤(HAT)、多聚組胺酸。
優選的,所述的“標籤蛋白”可以增加毒素多肽前體的在宿主中的可溶性。
優選的,所述的“標籤蛋白”使得毒素多肽前體以可溶的方式存在於宿主細胞中。
在一個具體實施例中,所述的標籤蛋白位於單鏈多肽的N端。
在一個具體實施例中,所述的標籤蛋白為谷胱甘肽s-轉移酶(GSTs),更優選的,所述谷胱甘肽s-轉移酶的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
優選的,所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點均不能被人蛋白酶或表達所述單鏈多肽的宿主細胞自身產生的蛋白酶切割。
更優選的,所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點相同或不同。
所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點不被表達時的宿主細胞或使用時機體內源性的蛋白酶識別和切割。
更優選的,所述的特定的蛋白酶選自但不限於以下蛋白酶的一種或兩種的組合:非人腸激酶、煙草蝕刻病毒蛋白酶、來源於枯草芽孢桿菌的蛋白酶、來源於解澱粉芽孢桿菌的蛋白酶、來源於鼻病毒的蛋白酶、木瓜蛋白酶、昆蟲木瓜蛋白酶的同源物或甲殼動物木瓜蛋白酶的同源物。
在一個具體實施例中,所述的特異地識別第一蛋白酶和所述的特異地識別第二蛋白酶切割位點的蛋白酶均為來源於鼻病毒的蛋白酶。
優選的,第二酶切位元點嵌入、部分替換或全部替換第一功能肽段和第二功能肽段之間的天然存在的環狀區域。所述的嵌入是指插入在所述的環狀區域的某兩個胺基酸之間;所述的部分替換是指所述的第二酶切位點替換了所述的環狀區域的部分胺基酸序列;所述的完全替換是指天然的環狀區域的胺基酸序列完全被第二酶切位點所取代。
更優選的,所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區選自但不限於以下酶切位點的一種或兩種的組合:DDDDK(SEQ ID NO:12)、EXXYXQS/G(其中EXXYXQS為SEQ ID NO:13;EXXYXQG為SEQ ID NO:14)、HY、YH或LEVLFQGP(SEQ ID NO:4)。
在一個具有實施例中,所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區均為LEVLFQGP(SEQ ID NO:4),切割位點在Q-G之間。
優選的,所述的連接短肽不超過5個胺基酸。
優選的,所述連接短肽能夠使第一蛋白酶切割位點更容易被其蛋白酶識別或結合。
更優選的,所述的連接短肽不影響單鏈多肽的功能。
更優選的,所述的第一蛋白酶切割位點被切開後,保留在第二多肽片段N端的連接短肽不會影響第二多肽片段的功能。
更優選的,所述的連接短肽GS部分不超過5個胺基酸殘基,更優選的,所述的連接短肽選自甘胺酸-絲胺酸(Glycine-Serine,簡稱GS)短肽,GGS,GGGS(SEQ ID NO:16), GGGGS(SEQ ID NO:17), GSGS(SEQ ID NO:18),GGSGS(SEQ ID NO:19),GSGGS(SEQ ID NO:20),GGGSS(SEQ ID NO:22)等連接短肽。
在一個具體實施例中,所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和連接短肽的胺基酸序列為LEVLFQGPLGS(SEQ ID NO:15)。
優選的,所述的金屬離子依賴的蛋白酶活性域為Zn
2+依賴的蛋白酶活性域。
優選的,所述的第一功能胺基酸結構區和/或第二功能胺基酸結構區由天然序列和/或人工合成的序列編碼。更優選的,所述的單鏈多肽的第一功能胺基酸結構區包含梭菌毒素輕鏈的Zn
2+蛋白酶活性域。
優選的,所述的第二功能胺基酸結構區中的能夠結合人體細胞表面抗原的受體結合域的靶細胞是指存在SNARE複合體的靶細胞。例如:神經細胞、胰腺細胞或其他存在SNARE複合體的細胞。
更優選的,所述的第二功能胺基酸結構區中的靶細胞是指人神經細胞或胰腺細胞,所述的受體結合域為能夠特定結合人神經細胞或胰腺細胞的受體結合域。
更優選的,所述的第二功能胺基酸結構區的受體結合域為梭菌毒素的重鏈的細胞表面抗原結合結構域,所述的第二功能胺基酸結構區的介導多肽跨囊泡膜轉移的易位域為介導梭菌毒素跨囊泡膜轉移的結構域。
更優選的,所述的梭菌毒素為肉毒桿菌毒素或破傷風毒素。
更優選的,所述的肉毒桿菌毒素選自現有技術已知的血清型BoNT/A-BoNT/H以及它們的衍生物中的任意一種。
更優選的,所述的梭菌毒素選自破傷風毒素或其衍生物中的任意一種。更優選的,所述的第一功能胺基酸結構區包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風毒素的輕鏈的部分或全部。
更優選的,所述的第二功能胺基酸結構區包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風毒素的重鏈的部分或全部。
在一個具體實施例中,所述的第一功能胺基酸結構區為BoNT/A的輕鏈,所述的第二功能胺基酸結構區為BoNT/A的重鏈。
更優選的,所述的第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區可以來自不同的血清型。可以是上述血清型的任意組合,例如,所述的第一功能胺基酸結構區衍生自BoNT/A的輕鏈,所述的第二功能胺基酸結構區衍生自BoNT/B的重鏈,或者,所述的第一功能胺基酸結構區衍生自BoNT/A的輕鏈,所述的第二功能胺基酸結構區衍生自BoNT/C的重鏈等等。
更優選的,所述的第二多肽片段的胺基酸序列包含SEQ ID NO:7所示的片段。
在一個具體實施例中,所述的單鏈多肽從N端開始依次包含:谷胱甘肽S-轉移酶、LEVLFQGPLGS(SEQ ID NO:15)、BoNT/A的輕鏈、LEVLFQGP(SEQ ID NO:4)和BoNT/A的重鏈。
更優選的,所述的單鏈多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
更優選的,重組肉毒素蛋白選取重組A型肉毒素蛋白,通過將單鏈多肽的經第一蛋白酶切割去除標籤蛋白,和經第二蛋白酶切割後第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區形成至少一個二聚體來製備。可從根本上規避了傳統肉毒桿菌中提取肉毒毒素過程中非活性肉毒桿菌毒素蛋白攝入人體的免疫風險,有效降低生產環節中的生物風險。
優選的,所述第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區經過二硫鍵連接成二聚體結構。
本發明的重組A型肉毒毒素蛋白前體,由特定的單鏈多肽形成,其中,所涉及的單鏈多肽具有特定的結構,該結構的單鏈多肽具有特異性強、毒性低的特點,具體的,從特異性強的角度來說,該單鏈多肽中的標籤蛋白其能夠與特異的配體結合,再經過與配體的脫離,使得與標籤蛋白共表達的分子更易於從不同的多肽或蛋白產物中被選擇出來,在製備過程中,可以顯著的提升產品的純度,使得產品得率更高、純度更高;從毒性低的角度來說,該單鏈多肽中的標籤蛋白使得多肽中第一功能胺基酸結構區的蛋白酶結構域不能發揮蛋白酶的功能,通過將第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區之間的天然酶切位點替換為僅特定的酶才可以識別的位點,從而使得該單鏈多肽的分子活性(神經毒性)降低至天然毒素的萬分之一以下,有效的降低了毒性,由於其毒性被大幅降低,從而提高了生產過程中的安全性,使得整個工業化生產更易於進行。也就是說,本發明所涉及到重組A型肉毒毒素蛋白中的單鏈多肽,由於得率更高、純度更高以及安全性也更高,相比於現有技術,更易於進行工業化的生產和純化操作。
由現有技術可知,市場上的肉毒毒素產品均為肉毒桿菌中提取,而肉毒桿菌本身具有致病性,屬於生化武器範疇,因此對於從肉毒桿菌提取製備肉毒毒素來說,保存和發酵擴增肉毒桿菌具有一定的風險。和天然A型肉毒毒素不同,本發明提供的重組肉毒毒素蛋白來自非致病性大腸桿菌表達,不僅降低了生產環節中的生物風險,而且重組蛋白的製備方法簡單,安全,高效、穩定性好。
本發明還提供一種肉毒毒素蛋白組合物的製備方法,所述製備方法為將上述組分與水進行混合後,凍乾,製得;
優選的,上述製備方法的步驟包括:
(a)製備、純化肉毒毒素蛋白;
(b)向所述肉毒毒素蛋白中加入人血清白蛋白、糖類、鹽類和水;
(c)凍乾。
所述水為注射用水或生理鹽水。
其中,所述肉毒毒素蛋白、人血清白蛋白、糖類和/或鹽類如上所限定。
在一個具體的實施方式中,所述製備方法包括:
(a)製備、純化重組A型肉毒毒素蛋白;
(b)向所述重組A型肉毒毒素蛋白中加入人血清蛋白、蔗糖和氯化鈉、水;
(c)凍乾。
或,
所述水為注射用水或生理鹽水。
所述重組A型肉毒毒素蛋白組合物的形式為凍乾製劑。
本發明還提供一種上述製備方法製備的肉毒毒素蛋白凍乾製劑。
本發明還提供一種美容方法,所述的方法包括施用本發明所述的任一項組合物。
優選的,本發明所述的美容方法可以是治療目的,也可以是非治療目的。
優選的,所述美容方法包括平滑或預防皺紋、瘦臉、形體塑形、疤痕修復。
本發明還提供一種肉毒毒素蛋白組合物在製備用於預防和/或治療與支配肌肉或外分泌腺的膽鹼能神經支配相關疾病的藥物中的應用,
或,
在製備用於醫學美容藥物中的應用;
優選的,本發明所述的膽鹼能神經相關疾病選自:
弗雷綜合症、鱷魚淚綜合症、腋下多汗症、足底多汗症、頭頸多汗症、身體多汗症、鼻漏、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、多涎、垂涎、流涎、痙攣狀況、齶肌陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、僵直、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、反常性下顎肌肉活動、半側咀嚼肌痙攣、肥大型鰓肌病、嚼肌肥大、脛骨前肌肥大、眼球震顫、振動幻視、核上凝視麻痹、持續狀態部分性癲癇、痙攣性斜頸手術計畫、展肌聲帶麻痹、頑固性突變性發音障礙、上食道括約肌功能障礙、聲帶肉芽腫、口吃、抽動穢語綜合症、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術後言語失敗、保護性上瞼下垂、瞼內翻、奧狄氏括約肌功能障礙、假性食道弛緩不能、非失弛緩性食道運動障礙、陰道痙攣、術後臥床、震顫、膀胱功能障礙、半面痙攣、神經支配恢復術運動障礙、僵人綜合症、破傷風、前列腺增生、肥胖治療、嬰兒大腦性麻痹、失弛緩症、肛裂、過敏性鼻炎、抑鬱症、牙科疾病和神經性疼痛中的一種或多種。
所述醫學美容包括平滑或預防皺紋、瘦臉、形體塑形、疤痕修復。
所述皺紋可被視為皮膚中的褶皺、脊或褶痕。優選人類的面部中可見的皺紋。皺紋的例子包括溝、眉間紋、魚尾紋、頰連合處、下顎紋、口周皺紋、頰褶皺、木偶紋、唇紋、前額皺紋、皺眉紋、兔紋、鼻唇溝、眼下皺紋和下巴褶皺。
與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:
(1)本發明提供一種肉毒毒素蛋白組合物,該組合物通過採用白蛋白、糖類以及鹽類的特定組合以及特定的組分配比,使得其保存週期長,不僅可以維持肉毒毒素蛋白的活性,尤其適合於凍乾製劑,而且在凍乾復蘇後,仍可有效保持肉毒毒素蛋白活性,具有較好的治療效果,有效解決了現有技術中肉毒毒素蛋白複溶後活性變差的問題。
(2)本發明優選技術方案還採用了特定單鏈多肽製備的高純度、低毒性的肉毒毒素蛋白前體,尤其是本優選的技術方案所提供的重組A型肉毒毒素蛋白組合物,不僅能夠大大提升肉毒毒素蛋白的純度,同時還從根本上規避了傳統肉毒桿菌中提取肉毒毒素過程中非活性肉毒桿菌毒素蛋白攝入人體的免疫風險,有效降低了生產環節中的生物風險,而且本發明重組蛋白組合物的製備方法簡單,安全,高效、穩定性好,為擴大肉毒毒素蛋白的應用範圍及毒毒素蛋白產品的大規模工業化生產提供了技術支援。
除非另有定義,本發明中所使用的所有科學和技術術語具有與本發明涉及技術領域的技術人員通常理解的相同的含義。
本發明中,術語“U”是指國際單位,用來計量肉毒毒素的常用單位,藥劑學上使用的(表示)生物學能力的多樣的單位。因為這些藥物的化學成分不恒定或至今還不能用理化方法檢定其品質規格,往往採用生物實驗方法並與標準品加以比較來檢定其效價。通過這種生物檢定,具有一定生物效能的最小效價單元就叫“單位”(U)。本發明中小鼠單位(U)表示殺死50%小鼠所需的腹膜內注射重組A型肉毒毒素蛋白量。
術語“BoNT/A”是指A型肉毒毒素蛋白;
術語“標籤蛋白”是指利用DNA體外重組技術,與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白,以便於目的蛋白的表達、檢測;
術語“人血清白蛋白”(Human serum albumin),簡稱HSA,是指人血漿中的一種蛋白質,在體液中HSA可以運輸脂肪酸、膽色素、胺基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等:同時維持血液正常的滲透壓。在臨床上HSA可用於治療休克與燒傷,用於補充因手術、意外事故或大出血所致的血液丟失,也可以作為血漿增容劑。
術語“二聚體結構”是指為由兩個分子組合而成的高分子配合物,常以非共價鍵鍵結。
下面將結合本發明實施例,對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬於本發明保護的範圍。
實施例1 重組A型肉毒毒素蛋白的製備
具體分為以下8個步驟:
1、設計和構建編碼經修飾的肉毒素的單鏈多肽的核酸分子:
核酸分子從5’端起依次包含:
(a)編碼谷胱甘肽s-轉移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其編碼的谷胱甘肽s-轉移酶的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
(b)編碼第一蛋白酶切割位元點的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
(c)編碼GS連接短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,為GGATCC;
(d)編碼第二多肽片段的核苷酸序列,其包含BoNT/A輕鏈、第二蛋白酶切割位點和BoNT/A重鏈的核苷酸序列,如SEQ ID NO:6所示,其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示;其中,編碼第二蛋白酶切割位元點的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示;
BoNT/A輕鏈和BoNT/A重鏈之間也可以不存在天然的環狀區域,例如去除輕鏈和重鏈之間的如SEQ ID NO:21所示的KTKSLDKGYNK連接序列,以減少非特異性蛋白酶切割。
編碼單鏈多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,其編碼的單鏈多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2、構建包含步驟1序列的核酸分子的質粒
在上述人工合成基因工程優化後的GSTs-BoNT/A,兩端合成加入NdeI和NotI酶切位點,經過NdeI和NotI 37攝氏度酶切(New England Biolabs),使用QIquick gel extraction kit(Qiagen)純化,使用T4 DNA ligase(NEB)插入pET28a(Novagen)質粒載體中的NdeI和NotI的位點。
3、轉染步驟2構建的質粒到宿主細胞
(a)感受態細胞的製備:取一管大腸桿菌細胞E.coli BL21 DE3 (New England Biolabs),接種至含有3ml LB培養液的試管中,37℃振盪培養過夜。次日取菌液0.5ml接種至含有50ml LB培養基的250ml燒瓶中,37℃劇烈震盪培養約3-5小時(250rpm), 當菌落600nm OD值達到0.3-0.4時,將燒瓶取出放置冰上10-15分鐘。在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4℃,1000g離心10分鐘。棄上清,收集加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中,振盪混勻,懸浮菌體,冰浴30分鐘,4℃,1000g離心10分鐘, 棄上清,收集加4ml冰預冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體。每管0.2ml分裝,至4℃保存備用,24小時內使用,其餘保存於-70℃的低溫冰箱中。
(b)轉染:適量DNA(ng)和感受態大腸桿菌混合放置冰浴15分鐘,42℃熱擊30秒,放置冰浴5分鐘,放入SOC培養基250rpm搖晃1小時,塗抹在有抗生素的平板上,37℃隔夜培養。
4、培養宿主細胞和誘導表達單鏈多肽
培養基的組分和配比:11.8 g/L 胰蛋白腖、23.6 g/L 酵母提取物、9.4 g/L K2HPO4、2.2 g/L KH2PO4、4 ml/L 甘油。
培養條件:37℃隔夜250rpm震盪培養細胞。
誘導表達:當大腸桿菌生長到OD600=1的時候,加入1mM IPTG 誘導表達在25℃表達5個小時。OD600可以選用0.2-1.5,溫度可以選用37℃到10℃,表達時間可以是5-16個小時。
收穫細胞:3000 rpm 30分鐘離心收集大腸桿菌。
5、單鏈多肽表達水準的鑒定
使用金斯瑞谷胱甘肽純化樹脂製備一根直徑1釐米,高1釐米的谷胱甘肽純化樹脂層析柱,緩慢地傾倒25毫升裂解液到層析柱上層,注意不要衝起樹脂,經過一小時緩慢過柱吸附裂解液中的GSTs-BoNT/A。按照常規方法洗脫獲得GSTs-BoNT/A。
常規方法如下:使用20倍柱體積的磷酸緩衝液洗滌層析柱,用10倍柱體積的新鮮製備的10 mM谷胱甘肽洗脫緩衝液(0.154 g還原的谷胱甘肽溶解在50 ml 50 mM Tris-HCl(pH 8.0))進行GSTs-BoNT/A洗脫,使用280 nm處的吸光度讀數監控融合蛋白的洗脫。洗脫後的蛋白在Rinovirus 3C Proteas作用下切除GSTs標籤蛋白。
取去除GSTs標籤蛋白之前的產物和之後的產物進行常規的SDS-PAGE實驗,如圖1所示,與沒有標籤蛋白去除的第1泳道相比,在Rinovirus 3C Protease的作用下,第1泳道的GSTs標籤蛋白被切除,得到沒有GSTs的BoNT/A分子。
GSTs-BoNT/A在總蛋白水準中所占的比例的測定:使用4-12% SDS-PAGE(Biorad)對純化的GSTs-BoNT/A在200伏電壓下電泳分離,175kd分子量主要條帶是GSTs-BoNT/A。
6、標籤蛋白的去除以及提純
對將步驟5的產物進行GSTs標籤蛋白的去除和有毒多肽的提純:
用金斯瑞3C酶處理重新吸附在谷胱甘肽純化樹脂層析柱上的GSTs-BoNT/A,在3C酶的作用下,GSTs和BoNT/A之間的第一酶切位點被斷開,GSTs脫離,同時BoNT/A的輕鏈和重鏈之間的第二酶切位點被斷開。
以磷酸緩衝液處理谷胱甘肽純化樹脂層析柱,GSTs標籤蛋白留在柱子上,被去除掉,而BoNT/A的輕鏈和重鏈被磷酸緩衝液洗脫下來。
取去除了GSTs的產物進行常規的SDS-PAGE實驗,如圖2所示,得到的條帶中不再有GSTs標籤蛋白,說明GSTs標籤蛋白已經被完全去除。使用SDS-PAGE掃描圖片,根據條帶灰色密度來計算所得BoNT/A為90%純度以上。
採用GSS、GSGS、GGSGS多肽代替連結短肽GS部分,其效果和GS相似,標籤蛋白可以很好得暴露,從而能被完全切除。
7、二聚體BoNT/A的雙鏈在還原條件下的解離
將步驟6的產物進行還原實驗:
使用100mM的二硫蘇糖醇, 在100攝氏度下處理樣品五分鐘,使樣品還原,樣品經過4-12% SDS-PAGE (Biorad)200伏電壓電泳分離,分離出重鏈和輕鏈。如圖3所示,將步驟6得到的產物在還原條件下進行還原,得到的產物進行常規的SDS-PAGE實驗,得到兩條不同的條帶,分子量分別在100Kda和50Kda,證明步驟6形成的產物是以二硫鍵連結兩個肽段的二聚體結構。
8、GSTs-BoNT/A的毒性試驗
用步驟5獲得的GSTs-BoNT/A經小鼠腹腔注射的LD50在45ng-450ng之間;考慮到所注射的肉毒素蛋白純度,折算的LD50在22.5ng-225ng之間, 中間值為123.75ng。用步驟5獲得的BoNT/A經小鼠腹腔注射藥的LD50在0.02ng–0.05 ng之間。考慮到所注射的肉毒毒素蛋白純度,折算的LD50在0.006ng-0.015ng之間, 中間值為0.0105ng(見表1)。
表1:GSTs-BoNT/A和BoNT/A分子在小鼠生物毒性實驗中的毒性比較
測試品 | 給藥量(ng) | 給藥72小時後小版致死率(粉 |
GST-BoNT/A (純度50%) | 450 | 100 |
45 | 50 | |
4.5 | 0 | |
0.45 | 0 | |
BoNT/A (純度30%) | 0.05 | 100 |
0.02 | 0 | |
0.01 | 0 | |
0.005 | 0 |
GSTs-BoNT/A具有肉毒素的活性,經小鼠腹腔注射後,其半數致死量(LD50)大約比BoNT/A的蛋白LD50高11786倍,表明GSTs-BoNT/A重組蛋白毒素多肽前體分子活性弱于最終產品BoNT/A大約11786倍。由此可見,GSTs-BoNT/A重組蛋白毒素多肽前體分子高純度、低毒性、具有肉毒素的活性,從而可使得肉毒毒素蛋白純度可有效提升,同時本實施例所製備的重組A型肉毒毒素蛋白不含非活性肉毒桿菌毒素蛋白,從而從根本上避免人體免疫風險,有效降低生產環節中的生物風險,為擴大肉毒毒素蛋白的應用範圍及毒毒素蛋白產品的大規模工業化生產提供了技術支援。
實施例2
凍乾製劑製備
針對小鼠,選取2U的實施例1所製備的重組A型肉毒素蛋白,然後按照表2中所列出的凍乾配方(序號1-5)向重組A型肉毒毒素蛋白中加入人血清蛋白、蔗糖、氯化鈉、水,然後凍乾。可見本申請重組蛋白組合物的製備方法簡單,安全且高效。
需說明的是,本實施例配方中重組A型肉毒素蛋白的量為根據重組A型肉毒毒素蛋白的毒性效價、小鼠的體重選取的有效治療量。
凍乾製劑複溶
向步驟1中所製備的一系列凍乾製劑中加入注射用水或生理鹽水(具體見表2),對步驟1所製備的凍乾製劑進行複溶。
複溶後凍乾製劑的活性試驗
3.1選種分組
選取相等數量的CD-1品種的成年小鼠雌雄各半,分組,每組10只小鼠,稱重、編號、分組,保證每組小鼠數量相等、體重相近。
3.2 給藥
給藥開始前,每只小鼠稱量一次體重(第一天給藥前)並記錄,將步驟2中所複溶後凍乾製劑對實驗小鼠進行給藥,給藥過程中,腹腔單次注射給予CD-1小鼠不同製劑配方重組A型肉毒素蛋白凍乾製劑均為0.5mL。經小鼠腹腔注射藥的重組A型肉毒毒素蛋白LD50在12±3pg之間。給藥後,每24h稱量一次體重,在給藥後24h (±1h)、48h(±1h)、72h(±1h)、96 h(±1h),檢查死亡率,實驗結果參見表2。
其中“藥物活性”指小鼠腹腔注射肉毒素蛋白組合物後的致死率。
3.3 結果分析
由表2可看出,除序號1的實驗外,其他凍乾製劑配方複溶後組合物的藥物活性達到了70%以上,序號2的藥物活性更是高達90%。可見本實施例表2序號2-5中所採用的組分可以有效維持肉毒毒素蛋白的活性,而且複溶後的凍乾製劑樣品仍保持了較強的肉毒毒素蛋白活性,有效解決了現有技術中肉毒毒素蛋白複溶後活性變差的問題,從而說明本發明的肉毒毒素蛋白組合物具有較好的治療效果。
此外,本實施例還意外發現氯化鈉的含量對於本發明組合物凍乾製劑的藥物活性具有較大影響,對比序號1-3的實驗結果可看出,不含氯化鈉組分的組合物其複溶後的藥物活性遠低於含氯化鈉組分的組合物的藥物活性。分別對比序號2和3、序號4和5可看出,當組合物配方中蔗糖含量較低時,複溶採用生理鹽水(氯化鈉含量0.9%)時,組合物的藥物活性得到較大提升,而在蔗糖含量較高時,複溶採用生理鹽水還是注射用水對藥物活性沒有顯著影響。優選複溶後鹽濃度處於等滲狀態,從而避免引起注射部位不利刺激(如疼痛等)。
表2 實施例2所採用的不同組合物配方及藥物活性結果
序號 | 實施例1所製備的重組A型肉毒素蛋白 | 凍乾配方 | |||||
HSA(%) | 蔗糖(%) | 氯化鈉(%) | 凍乾體積(mL) | 複溶 | 藥物活性*(%) | ||
1 | 2U | 0.2 | 0.94 | 0 | 0.5 | 生理鹽水 | 0 |
2 | 2U | 0.2 | 0.94 | 0.9 | 0.5 | 生理鹽水 | 90 |
3 | 2U | 0.2 | 0.94 | 0.9 | 0.5 | 注射用水 | 70 |
4 | 2U | 1 | 4.7 | 0.9 | 0.1 | 生理鹽水 | 70 |
5 | 2U | 1 | 4.7 | 0.9 | 0.1 | 注射用水 | 70 |
實施例3
本實施例採用實施例1所製備的重組A型肉毒毒素蛋白以及如表3所示的組分配方,且本實施例與實施例2相同的凍乾製劑製備、複溶及活性實驗方法相同。
本實施例考察了表3不同配方體系下分別採用2U及1.54U重組A型肉毒素蛋白時的藥物活性情況,其藥物活性均達到70%以上。特別的,在凍乾配方選取HSA 1%、蔗糖1%、0.8-0.9%氯化鈉、重組A型肉毒素蛋白2U及1.54U時,複溶後藥物活性更是高達90%,甚至100%,反映了本實施例組合物配方具有極強的藥物活性。
表3實施例3所採用的不同組合物配方及藥物活性結果
序號 | 凍乾配方 | 藥物活性 | |||
HSA(%) | 蔗糖(%) | 氯化鈉(%) | 2U | 1.54U | |
1 | 1 | 1 | 0.4 | 0.8 | 0.7 |
2 | 1 | 1 | 0.5 | 0.8 | 0.7 |
3 | 1 | 1 | 0.6 | 0.7 | 0.7 |
4 | 1 | 1 | 0.7 | 0.8 | 0.9 |
5 | 1 | 1 | 0.8 | 1 | 0.9 |
6 | 1 | 1 | 0.9 | 0.9 | 0.9 |
實施例4
本實施例採用實施例1所製備的重組A型肉毒毒素蛋白以及如表4所示的組分配方,且本實施例與實施例2的凍乾製劑製備、複溶及活性實驗方法相同。
考慮到樣本灌裝中管道吸附和無菌過濾過程中濾器等的損失,本實施例優選罐裝體積為1mL,其中肉毒毒素蛋白活性為120U/mL,採用表4所示出的組合物配方,同時考察了序號1-9組配方配置後凍乾前肉毒毒素蛋白活性情況。由表4資料可看出,當組分中不含有氯化鈉或HSA時,肉毒毒素蛋白活性已經測定不出活性,表明組分中的氯化鈉和HSA對維持肉毒毒素蛋白活性起了關鍵作用。而當其他組分含量相同,HSA採用0.1%時,LD50值與HSA含量為0.5%和1%時變化較大,而HSA含量為0.5%和1%時LD50值差別不大,說明HSA採用0.5%還是1%對於配置後凍乾前的肉毒毒素蛋白的活性的影響不大,但是降低到0.1%時,配置後凍乾前的肉毒毒素蛋白的活性明顯降低。另外,當其他組分含量相同,組分中氯化鈉的含量降低至到0.3%時,配置後凍乾前的肉毒毒素蛋白的活性也明顯降低。
由此,針對序號1組分配方生物組合物在配置後凍融一次後、灌裝結束及凍乾複溶後等不同步驟樣品進行活性檢測,具體檢測資料參見表5。由表5資料可知,凍乾實驗過程中,序號1組的凍乾不同步驟的樣品的LD50值變化不大,同時凍乾前肉毒毒素蛋白活性為120U/mL,經凍乾複溶後,肉毒毒素蛋白活性為97U/mL,可見採用本發明的組合物配方及凍乾製備方法,可有效控制凍乾、複溶後具有肉毒毒素蛋白活性保持在凍乾前的80%以上,充分說明本發明的組合物及凍乾製劑具有較強的穩定性,保持有較高的藥物活性,從而表明本發明的肉毒毒素蛋白組合物及凍乾製劑產品進行擴大化、或大規模工業化生產,以及為本發明肉毒毒素蛋白應用範圍的擴大提供了強有力的技術支援。
表4實施例4組合物凍乾配方以及凍乾前配置後LD50值
序號 | 凍乾配方 | 配置後LD50 | ||
HSA(%) | 蔗糖(%) | 氯化鈉(%) | ||
1 | 0.5 | 1 | 0.9 | 11.8pg/U |
2 | 1 | 1 | 0.9 | 11.4pg/U |
3 | 0.5 | 2 | 0.6 | 11.8 pg/U |
4 | 0.5 | 2 | 0.45 | 13.8 pg/U |
5 | 0.5 | 0.5 | 0.45 | 13.8 pg/U |
6 | 0.5 | 2 | 0.3 | 16.6 pg/U |
7 | 0.5 | 2 | 0 | 0pg/U |
8 | 0.1 | 2 | 0.6 | 17.3 pg/U |
9 | 0 | 2 | 0.6 | 0pg/U |
表5凍乾實驗過程中不同步驟樣品活性檢測結果
取樣點 | LD50 | 折算為效價 |
配置過濾後凍融一次後 | 13.1pg/U | 108U/mL |
灌裝結束後取樣 | 13.2pg/U | 107U/mL |
凍乾複溶後 | 14.6pg/U | 97U/mL |
實施例5
本實施例採用實施例1所製備的重組A型肉毒毒素蛋白以及如表6所示的組分配方進行成型性研究。首先按表6所示的組分配方配製溶液,按灌裝規格(0.25ml)灌裝至2ml西林瓶,放入真空冷凍乾燥機進行冷凍乾燥。
凍乾過程包括:
冷凍階段:凍乾箱降溫至-45~-50℃冷凍120~150min;
一次乾燥階段:控制凍乾箱真空度6~12Pa,冷凍溫度-45℃以下,升溫至-38攝氏度,乾燥15~25h;接著控制凍乾箱真空度6~12Pa,冷凍溫度-45℃以下,升溫至-20攝氏度,乾燥5~10h;
二次乾燥:控制凍乾箱真空度6~12Pa,冷凍溫度-45℃以下,升溫至25攝氏度,乾燥5~10h;接著控制凍乾箱真空度1-3Pa,冷凍溫度-45℃以下,升溫至25攝氏度,乾燥2~5h完成。
表6實施例5組合物凍乾配方以及凍乾後成型性考察
序號 | 凍 乾配方 | 成型性 | ||
HSA(%) | 蔗糖(%) | 氯化鈉(%) | ||
1 | 0.5 | 1 | 0.9 | 外觀成型良好 |
2 | 0.5 | 1 | 0.3 | 出現不成型狀 |
3 | 0.5 | 4 | 0.9 | 出現不成型狀 |
由表6資料可看出,製劑組分中不同含量比例的蔗糖和氯化鈉導致凍乾後製劑的成型性不同,序號1的製劑組合物外觀成型良好(參見附圖4)。序號2的製劑組合物將組分中的NaCl含量從0.9%降低至0.3%,HSA和蔗糖濃度不變,凍乾後成型性降低(參見附圖5)。根據一般規則,增加賦形劑蔗糖濃度可以提高成型性,因此序號3的製劑組合物把蔗糖含量增加到4%,但成型性沒有改善(參見附圖6)。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已,並不用以限制本發明,凡在本發明的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換等,均應包含在本發明的保護範圍之內。
本文描述的前述實施例和方法可以基於本領域技術人員的能力、經驗和偏好而有所不同。
本發明中,僅按一定順序列出方法的步驟並不構成對方法步驟順序的任何限制。
無
圖1:GSTs-BoNT/A初步純化和進一步去除GSTs標籤的SDS-PAGE結果,其中第1泳道為經過GSTs親和層析柱初步純化得到的GSTs-BoNT/A,第2泳道為初步純化的蛋白經過Rinovirus 3C Protease的酶切去除GSTs標籤蛋白得到切除GSTs後的BoNT/A。
圖2:切除了GSTs標籤的產物經過離子交換柱進一步純化得到高純度的BoNT/A蛋白的SDS-PAGE結果。
圖3:BoNT/A在還原條件下雙鏈解離的驗證結果。
圖4-圖6:本發明實施例5序號1-3的製劑組合物凍乾後製劑外觀圖。
無
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Claims (15)
- 一種肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,包括以下主要組分: 肉毒毒素蛋白、人血清白蛋白、糖類和鹽類。
- 如請求項1所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.2-2%; 優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%。
- 如請求項1所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述糖類品質百分比範圍為:0.5-6%; 優選的,所述糖類品質百分比範圍為:0.45-2%。
- 如請求項1至3任一項所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述糖類選自海藻糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖中的一種或多種; 優選的,所述糖選自蔗糖、乳糖中的一種或多種。
- 如請求項1至3任一項所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述鹽類品質百分比範圍為:0.4-1%; 優選的,所述鹽類品質百分比範圍為:0.4-0.9%; 更優選的,所述鹽類品質百分比範圍為:0.45-0.9%。
- 如請求項1至3任一項所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述鹽類選自無機鹽或有機鹽中任一種; 優選的,所述無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鎂、乙酸鈉、丙酸鈉和磷酸鉀中的一種或多種; 優選的,所述有機鹽選自乳酸鈉、琥珀酸鈉中的一種或多種; 更優選的,所述無機鹽為氯化鈉。
- 如請求項1至3所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述肉毒毒素蛋白為重組肉毒毒素蛋白。
- 如請求項7所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述組合物包括重組肉毒毒素蛋白、人血清白蛋白、蔗糖、氯化鈉。
- 如請求項8所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述組合物包含如下組分: 所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.2-2%; 所述蔗糖品質百分比範圍為:0.5-6%; 所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.4-1%; 優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%; 所述蔗糖品質百分比範圍為0.5-2%; 所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.4-0.9%; 更優選的,所述人血清白蛋白品質百分比範圍為:0.5-1%; 所述蔗糖品質百分比範圍為0.5-1%; 所述氯化鈉的品質百分比範圍為:0.45-0.9%。
- 如請求項8或9所述的肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述重組肉毒毒素蛋白通過將單鏈多肽經第一蛋白酶切割去除標籤蛋白,經第二蛋白酶切割後形成至少一個二聚體來製備; 所述的單鏈多肽包含: (I)第一多肽片段,所述第一多肽片段包含: (a)標籤蛋白; (b)包含第一蛋白酶切割位元點的結構區; (c)連接短肽; (II)第二多肽片段,所述第二多肽片段包含: (d)第一功能胺基酸結構區,其包含金屬離子依賴的蛋白酶活性域; (e)包含第二蛋白酶切割位元點的結構區; (f)第二功能胺基酸結構區,其包含可與靶細胞表面受體結合的受體結合域和/或可以介導多肽跨囊泡膜轉移的易位域; 優選的,所述的第一功能胺基酸結構區為BoNT/A的輕鏈,所述的第二功能胺基酸結構區為BoNT/A的重鏈。
- 如請求項10所述肉毒毒素蛋白組合物,其特徵在於,所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區選自以下酶切位點的一種或兩種的組合:DDDDK、EXXYXQS/G、HY、YH或LEVLFQGP; 優選的,所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區均為LEVLFQGP,切割位點在Q-G之間;所述的單鏈多肽從N端開始依次包含:谷胱甘肽S-轉移酶、LEVLFQGPLGS、BoNT/A的輕鏈、LEVLFQGP和BoNT/A的重鏈; 優選的,所述單鏈多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
- 一種如請求項1至11任一項所述的肉毒毒素蛋白組合物的製備方法,其特徵在於,將所述組分與水進行混合後,凍乾,製得; 所述水為注射用水或生理鹽水; 所述組合物的形式為凍乾製劑。
- 如請求項12所述的製備方法製備的包含重組肉毒毒素蛋白的凍乾製劑。
- 一種美容方法,所述的方法包括施用如請求項1-11任一項所述組合物,優選的,所述美容方法包括平滑或預防皺紋、瘦臉、形體塑形、疤痕修復,更優選的,所述的美容方法為非治療目的。
- 一種如請求項1至11任一項所述肉毒毒素蛋白組合物在製備用於預防和/或治療與支配肌肉或外分泌腺的膽鹼能神經相關疾病的藥物中的應用, 或, 在製備用於醫學美容藥物中的應用; 優選的,所述醫學美容包括平滑或預防皺紋、瘦臉、疤痕修復; 優選的,所述的膽鹼能神經相關疾病選自: 弗雷綜合症、鱷魚淚綜合症、腋下多汗症、足底多汗症、頭頸多汗症、身體多汗症、鼻漏、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、多涎、垂涎、流涎、痙攣狀況、齶肌陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、僵直、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、反常性下顎肌肉活動、半側咀嚼肌痙攣、肥大型鰓肌病、嚼肌肥大、脛骨前肌肥大、眼球震顫、振動幻視、核上凝視麻痹、持續狀態部分性癲癇、痙攣性斜頸手術計畫、展肌聲帶麻痹、頑固性突變性發音障礙、上食道括約肌功能障礙、聲帶肉芽腫、口吃、抽動穢語綜合症、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術後言語失敗、保護性上瞼下垂、瞼內翻、奧狄氏括約肌功能障礙、假性食道弛緩不能、非失弛緩性食道運動障礙、陰道痙攣、術後臥床、震顫、膀胱功能障礙、半面痙攣、神經支配恢復術運動障礙、僵人綜合症、破傷風、前列腺增生、肥胖治療、嬰兒大腦性麻痹、失弛緩症、肛裂、過敏性鼻炎、抑鬱症、牙科疾病和神經性疼痛中的一種或多種。
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