TW202327640A - 一種肉毒毒素蛋白組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種肉毒毒素蛋白組合物，主要包含肉毒毒素蛋白和蛋白穩定劑組分，可作為液體製劑應用於醫療和美容領域。本發明的肉毒毒素蛋白組合物可以保持肉毒毒素蛋白長期儲存在液體狀態下活性穩定。

Description

一種肉毒毒素蛋白組合物
本發明涉及藥物製劑領域，具體涉及一種肉毒毒素蛋白組合物及其製備方法。
天然肉毒桿菌神經毒素（BoNTs）是由梭菌屬厭氧肉毒桿菌產生的毒素蛋白，通過阻斷神經肌肉接點神經遞質乙醯膽鹼的突觸前釋放引起哺乳類動物肌肉麻痹。目前已經發現了七種類型的BoNTs，分別命名為BoNT/A到BoNT/G。BoNTs由於獨特的藥理學特性，包括對神經系統高度特異性，局部注射有限的擴散，以及作用的可逆性，已經迅速發展成為了一類治療膽鹼能過度興奮的藥物，在醫療和美容領域中具有廣泛的應用。
一般說來，治療用藥物活性蛋白通常在液體溶液中配製，特別是用於注射劑。治療用活性蛋白通常製備成組合物，在商業上以即用溶液形式出售或以用液體溶液重構的凍乾形式提供。例如市場上的BoNT/A產品均為真空乾燥或冷凍乾燥後的固體製劑，在使用時需要醫護人員進行複溶，因此需要精確地控制複溶體積。此外，由於不同的治療目的以及患者間在需用劑量上存在個體差異，每個治療所需的劑量差別相當大，市場產品所含的藥物量在按照廠家要求的體積複溶後，臨床醫生往往將瓶中的含量的一小部分給藥於患者，其餘放置冰箱再用。有研究估計，當複溶的BoNT/A在冰箱（約4℃）下儲藏12小時後，其效力損失至少44%，所以一般在實際操作中，建議複溶後4小時內使用，這會導致藥品的浪費和患者承擔了不必要的經濟損失。
此外，由於肉毒毒素使用濃度極低，為了在極低濃度下保持肉毒毒素蛋白質的穩定性，同時避免藥物在固態表面的吸附，一般會添加高濃度外源蛋白進行配製。在肉毒毒素配方中大多數使用白蛋白或明膠用作穩定劑，不但會引起免疫反應，並有引入污染源的可能。
針對背景技術中提到的技術問題，本發明提供一種肉毒毒素蛋白組合物及其製備方法。
本發明的技術方案如下：
本發明提供一種肉毒毒素蛋白組合物，包括以下組分：
肉毒毒素蛋白和蛋白穩定劑。
所述蛋白穩定劑選自胺基酸或類胺基酸化合物中任一種；
優選的，所述類胺基酸化合物為左旋卡尼汀（別名：維生素Bt，左旋肉鹼）。
更優選的，所述左旋卡尼汀的摩爾含量為5-20mM，在一個具體的實施方式中，所述左旋卡尼汀的摩爾含量為10mM。
優選的，所述胺基酸的摩爾含量為5-20mM；在一個具體的實施方式中，所述胺基酸的摩爾含量為10mM。
更優選的，所述胺基酸選自L-組胺酸、L-甘胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-組胺酸、L-賴胺酸中的一種或多種。
一般說來，蛋白在低濃度時(＜0.1mg/ml)極易降解而失活，本申請的一些胺基酸以及類胺基酸化合物，可以增加蛋白質在特定pH的溶解度，並可提高其穩定性，另外胺基酸及類胺基酸結構化合物除了可以降低表面吸附和保護蛋白質的構象之外，還可以防止蛋白質的變性與聚集，另外，當本發明的蛋白穩定劑為左旋卡尼汀時，與常用的輔料相比，左旋卡尼汀使配方具有低粘度的特點、並且能夠減少肉毒毒素蛋白聚集和沉澱，有利於維持肉毒毒素蛋白穩定。
優選的，所述肉毒毒素蛋白選自A型肉毒毒素蛋白、B型肉毒毒素蛋白、C1型肉毒毒素蛋白、C2型肉毒毒素蛋白、D型肉毒毒素蛋白、E型肉毒毒素蛋白、F型肉毒毒素蛋白或G型肉毒毒素蛋白中的任一種；更優選的，所述肉毒毒素蛋白為A型肉毒毒素蛋白。
更優選的，所述肉毒毒素為重組肉毒毒素。
更為優選的，所述重組肉毒毒素蛋白由單鏈多肽經蛋白酶切割後形成多肽組成的至少一個二聚體結構；
所述的單鏈多肽包含：
(I)第一多肽片段，所述第一多肽片段包含：
（a）標籤蛋白，
（b）包含第一蛋白酶切割位元點的結構區；
（c）連接短肽，
(II)第二多肽片段，所述第二多肽片段包含：
（d）第一功能胺基酸結構區，其包含金屬離子依賴的蛋白酶活性域；
（e）包含第二蛋白酶切割位元點的結構區；
（f）第二功能胺基酸結構區，其包含可與靶細胞表面受體結合的受體結合域和/或可以介導多肽跨囊泡膜轉移的易位域。
術語“標籤蛋白”是指可以與特定的配基結合的一類蛋白分子。
優選的，所述的標籤蛋白選自本領域技術人員已知的標籤蛋白或者經過電腦程式設計的標籤蛋白，所述的標籤蛋白能夠與已知底物特異結合。
更優選的，所述的標籤蛋白選自但不限於以下蛋白：谷胱甘肽S－轉移酶（GSTs）、C-myc、幾丁質結合結構域、麥芽糖結合蛋白（MBP）、SUMO異源親和部分、單克隆抗體或蛋白A、鏈黴親和素結合蛋白(SBP)、纖維素結合結構域、鈣調蛋白結合肽、S標籤、Strep標籤II、FLA、蛋白A、蛋白G、組胺酸親和標籤(HAT)、多聚組胺酸。
優選的，所述的“標籤蛋白”可以增加毒素多肽前體的在宿主中的可溶性。
優選的，所述的“標籤蛋白”使得毒素多肽前體以可溶的方式存在於宿主細胞中。
在一個具體實施例中，所述的標籤蛋白位於單鏈多肽的N端。
在一個具體實施例中，所述的標籤蛋白為谷胱甘肽s－轉移酶（GSTs），更優選的，所述谷胱甘肽s－轉移酶的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
優選的，所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點均不能被人蛋白酶或表達所述單鏈多肽的宿主細胞自身產生的蛋白酶切割。
更優選的，所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點相同或不同。
所述的第一蛋白酶切割位點和第二蛋白酶切割位點不被表達時的宿主細胞或使用時機體內源性的蛋白酶識別和切割。
更優選的，所述的特定的蛋白酶選自但不限於以下蛋白酶的一種或兩種的組合：非人腸激酶、煙草蝕刻病毒蛋白酶、來源於枯草芽孢桿菌的蛋白酶、來源於解澱粉芽孢桿菌的蛋白酶、來源於鼻病毒的蛋白酶、木瓜蛋白酶、昆蟲木瓜蛋白酶的同源物或甲殼動物木瓜蛋白酶的同源物。
在一個具體實施例中，所述的特異地識別第一蛋白酶和所述的特異地識別第二蛋白酶切割位點的蛋白酶均為來源於鼻病毒的蛋白酶。
優選的，第二酶切位元點嵌入、部分替換或全部替換第一功能肽段和第二功能肽段之間的天然存在的環狀區域。所述的嵌入是指插入在所述的環狀區域的某兩個胺基酸之間；所述的部分替換是指所述的第二酶切位點替換了所述的環狀區域的部分胺基酸序列；所述的完全替換是指天然的環狀區域的胺基酸序列完全被第二酶切位點所取代。
更優選的，所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區選自但不限於以下酶切位點的一種或兩種的組合：DDDDK、EXXYXQS/G、HY、YH或LEVLFQGP。
在一個具有實施例中，所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和包含第二蛋白酶切割位元點的結構區均為LEVLFQGP，切割位點在Q-G之間。
優選的，所述的連接短肽不超過5個胺基酸。
優選的，所述連接短肽能夠使第一蛋白酶切割位點更容易被其蛋白酶識別或結合。
更優選的，所述的連接短肽不影響單鏈多肽的功能。
更優選的，所述的第一蛋白酶切割位點被切開後，保留在第二多肽片段N端的連接短肽不會影響第二多肽片段的功能。
更優選的，所述的連接短肽GS部分不超過5個胺基酸殘基，更優選的，所述的連接短肽選自甘胺酸-絲胺酸（Glycine-Serine,簡稱GS）短肽，GGS,GGGS, GGGGS, GSGS,GGSGS, GSGGS, GGSGS, GGGSS等連接短肽。
在一個具體實施例中，所述的包含第一蛋白酶切割位元點的結構區和連接短肽的胺基酸序列為LEVLFQGPLGS。
優選的，所述的金屬離子依賴的蛋白酶活性域為Zn2+依賴的蛋白酶活性域。
優選的，所述的第一功能胺基酸結構區和/或第二功能胺基酸結構區由天然序列和/或人工合成的序列編碼。更優選的，所述的單鏈多肽的第一功能胺基酸結構區包含梭菌毒素輕鏈的Zn2+蛋白酶活性域。
優選的，所述的第二功能胺基酸結構區中的能夠結合人體細胞表面抗原的受體結合域的靶細胞是指存在SNARE複合體的靶細胞。例如：神經細胞、胰腺細胞或其他存在SNARE複合體的細胞。
更優選的，所述的第二功能胺基酸結構區中的靶細胞是指人神經細胞或胰腺細胞，所述的受體結合域為能夠特定結合人神經細胞或胰腺細胞的受體結合域。
更優選的，所述的第二功能胺基酸結構區的受體結合域為梭菌毒素的重鏈的細胞表面抗原結合結構域，所述的第二功能胺基酸結構區的介導多肽跨囊泡膜轉移的易位域為介導梭菌毒素跨囊泡膜轉移的結構域。
更優選的，所述的梭菌毒素為肉毒桿菌毒素或破傷風毒素。
更優選的，所述的肉毒桿菌毒素選自現有技術已知的血清型BoNT/A-BoNT/H以及它們的衍生物中的任意一種。
更優選的，所述的梭菌毒素選自破傷風毒素或其衍生物中的任意一種。
更優選的，所述的第一功能胺基酸結構區包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風毒素的輕鏈的部分或全部。
更優選的，所述的第二功能胺基酸結構區包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風毒素的重鏈的部分或全部。
在一個具體實施例中，所述的第一功能胺基酸結構區為BoNT-/A的輕鏈，所述的第二功能胺基酸結構區為BoNT-/A的重鏈。
更優選的，所述的第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區可以來自不同的血清型。可以是上述血清型的任意組合，例如，所述的第一功能胺基酸結構區衍生自BoNT-/A的輕鏈，所述的第二功能胺基酸結構區衍生自BoNT-/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G 的重鏈，或者，所述的第一功能胺基酸結構區衍生自BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G的輕鏈，所述的第二功能胺基酸結構區衍生自BoNT/A的重鏈等。
更優選的，所述的第二多肽片段的胺基酸序列包含SEQ ID NO:7所示的片段。
在一個具體實施例中，所述的單鏈多肽從N端開始依次包含：谷胱甘肽S-轉移酶、LEVLFQGPLGS、BoNT/A的輕鏈、LEVLFQGP和BoNT/A的重鏈。
更優選的，所述的單鏈多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
更優選的，重組A型肉毒毒素蛋白通過將單鏈多肽的經第一蛋白酶切割去除標籤蛋白，和經第二蛋白酶切割後第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區形成至少一個二聚體來製備。
優選的，所述第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區經過二硫鍵連接成二聚體結構。
本發明的重組A型肉毒毒素蛋白，由特定的單鏈多肽形成，其中，所涉及的單鏈多肽具有特定的結構，該結構的單鏈多肽具有特異性強、毒性低的特點。 具體的，從特異性強的角度來說，該單鏈多肽中的標籤蛋白其能夠與特異的配體結合，再經過與配體的脫離，使得與標籤蛋白共表達的分子更易於從不同的多肽或蛋白產物中被選擇出來，在製備過程中，可以顯著的提升產品的純度，使得產品得率更高、純度更高；從毒性低的角度來說，該單鏈多肽中的標籤蛋白使得多肽中第一功能胺基酸結構區的蛋白酶結構域不能發揮蛋白酶的功能，通過將第一功能胺基酸結構區和第二功能胺基酸結構區之間的天然酶切位點替換為僅特定的酶才可以識別的位點，從而使得該單鏈多肽的分子活性（神經毒性）降低至天然毒素的萬分之一以下，有效的降低了毒性，由於其毒性被大幅降低，從而提高了生產過程中的安全性，使得整個工業化生產更易於進行。也就是說，本發明所涉及到重組肉毒毒素蛋白中的單鏈多肽，由於得率更高、純度更高以及安全性也更高，相比於現有技術，更易於進行工業化的生產和純化操作。
優選的，所述組合物還包括增溶劑和/或鹽類化合物。
更優選的，所述增溶劑的體積百分比濃度為0.05%-0.2%。
更優選的，所述鹽類的品質百分比濃度為0.9%。
更優選的，所述增溶劑選自吐溫類、司盤類、十二烷基硫酸鈉；
更優選的，所述吐溫類選自吐溫20、吐溫40、吐溫60、或吐溫80中的一種或多種；
進一步優選的，所述司盤類選自司盤 20、司盤40、司盤60、司盤80、或司盤85中的一種或多種；
在一個具體的實施方式中，所述增溶劑為吐溫80。
優選的，所述鹽類選自無機鹽或有機鹽中任一種；
更優選的，所述無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鎂、乙酸鈉、丙酸鈉和磷酸鉀中的一種或多種；
進一步優選的，所述有機鹽選自乳酸鈉、琥珀酸鈉中的一種或多種；
在一個具體的實施方式中，所述無機鹽為氯化鈉。
優選的，所述組合物包括肉毒毒素蛋白、左旋卡尼汀、吐溫80、氯化鈉；
或，
所述組合物包括肉毒毒素蛋白、胺基酸、吐溫80、氯化鈉。
更優選的，所述左旋卡尼汀的摩爾含量為5-20mM，優選為10mM；
或，所述胺基酸的摩爾含量為5-20mM；優選為10mM。
更優選的，所述吐溫80的體積百分比濃度為0.05%-0.2%。
在一個具體的實施方式中，所述吐溫80的體積百分比濃度為0.1%。
更優選的，所述氯化鈉的品質百分比濃度為0.9%。
所述組合物為液體製劑。
本發明還提供肉毒毒素蛋白組合物的製備方法，所述製備方法包括將各組分混合的步驟。
優選的，上述製備方法的步驟包括：
（a）製備、純化肉毒毒素蛋白；
（b）向所述肉毒毒素蛋白中加入蛋白穩定劑水。
所述水為注射用水。
更優選的，所述步驟（b）中還包括加入增溶劑和/或鹽類。
其中，所述肉毒毒素蛋白、蛋白穩定劑、增溶劑和/或鹽類如上所限定。
在一個具體的實施方式中，所述製備方法包括：
（a）製備、純化重組A型肉毒毒素蛋白；
（b）向所述重組A型肉毒毒素蛋白中加入蛋白穩定劑水、吐溫80和氯化鈉、水。
所述水為注射用水。
本發明還提供了上述肉毒毒素蛋白組合物在製備用於預防和/或治療與支配肌肉或外分泌腺的膽鹼能神經相關的疾病、醫學美容的藥物中的用途。
所述與支配肌肉或外分泌腺的膽鹼能神經相關的疾病或病症包括：與膽鹼能神經支配相關的肌肉或外分泌腺過度活躍的示例性疾病或病症包括，例如弗雷綜合征、鱷魚淚綜合征、腋下多汗症、足底多汗症、頭頸多汗症、身體多汗症、鼻漏、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、多涎、垂涎、流涎、痙攣狀況、顎肌陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、僵直、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、反常性下頜肌肉活動、半側咀嚼肌痙攣、肥大型鰓肌病、嚼肌肥大、脛骨前肌肥大、眼球震顫、振動幻視、核上凝視麻痹、持續狀態部分性癲癇、痙攣性斜頸手術計畫、展肌聲帶麻痹、頑固性突變性發音障礙、上食道括約肌功能障礙、聲帶肉芽腫、口吃、抽動穢語綜合征、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術後言語失敗、保護性上瞼下垂、瞼內翻、奧狄氏括約肌功能障礙、假性食道弛緩不能、非失弛緩性食道運動障礙、陰道痙攣、術後臥床、震顫、膀胱功能障礙、半面痙攣、神經支配恢復術運動障礙、僵人綜合征、破傷風、前列腺增生、肥胖治療、嬰兒大腦性麻痹、失弛緩症和肛裂。
所述醫學美容包括平滑或預防皺紋、瘦臉、疤痕修復。
所述皺紋可被視為皮膚中的褶皺、脊或褶痕。優選人類的面部中可見的皺紋。皺紋的例子包括淚溝、眉間紋、魚尾紋、頰連合處紋、下頜紋、口周皺紋、頰褶皺、木偶紋、唇紋、前額皺紋、皺眉紋、兔紋、鼻唇溝、眼下皺紋和下巴褶皺。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
（1）本發明提供了一種穩定的肉毒毒素蛋白組合物。其組合物中使用胺基酸或類胺基酸取代了人源蛋白（例如人血白蛋白），杜絕了人源病毒的威脅，同時配合吐溫80防止吸附，能在標準冰箱（約4℃）內以液體狀態穩定儲藏1年或更長，能在室溫（25℃）以液體狀態穩定儲藏6個月或更長。
（2）本發明提供一種重組肉毒毒素蛋白組合物，採用特定單鏈多肽製備的高純度重組A型肉毒毒素蛋白，能夠提升製劑中A型肉毒毒素蛋白的純度，避免了從肉毒桿菌提取A型肉毒毒素所包含的非活性肉毒桿菌蛋白攝入人體可能產生的免疫風險，為擴大重組A型肉毒毒素蛋白的應用範圍提供了新的選擇。
（3）本發明的肉毒毒素蛋白組合物作為液體製劑使用時，增加了臨床使用方便性，改善了凍乾或真空產品複溶後通常保存時間較短，易造成使用浪費以及複溶過程中人為污染或複溶不準確等缺陷。
除非另有定義，本發明中所使用的所有科學和技術術語具有與本發明涉及技術領域的技術人員通常理解的相同的含義。
本發明中，術語“U”是指效價單位，藥劑學上使用的（表示）生物學能力的多樣的單位。因為這些藥物的化學成分不恒定或至今還不能用理化方法檢定其品質規格，往往採用生物實驗方法並與標準品加以比較來檢定其效價。通過這種生物檢定，具有一定生物效能的最小效價單元就叫“單位”（U）；經由國際協商規定出的標準單位，稱為“國際單位”（IU）；
術語“BoNT/A”是指A型肉毒毒素蛋白；
術語“標籤蛋白”是指利用DNA體外重組技術，與目標蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便於目標蛋白的表達、檢測。
術語“人血清白蛋白”（Human serum albumin），簡稱HSA，是指人血漿中的蛋白質，在體液中HSA可以運輸脂肪酸、膽色素、胺基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等：同時維持血液正常的滲透壓。在臨床上HSA可用於治療休克與燒傷，用於補充因手術、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑。
術語“二聚體結構”是指為由兩個分子組合而成的高分子配合物，常以非共價鍵鍵結。
下面將結合本發明實施例，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實驗例1 重組A型肉毒毒素蛋白的製備
具體分為以下8個步驟：
1、設計和構建編碼經修飾的肉毒毒素的單鏈多肽的核酸分子：
核酸分子從5’端起依次包含：
（a）編碼谷胱甘肽s-轉移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼的谷胱甘肽s-轉移酶的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
（b）編碼第一蛋白酶切割位元點的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
（c）編碼GS連接短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，為GGATCC；
（d）編碼第二多肽片段的核苷酸序列，其包含BoNT/A輕鏈、第二蛋白酶切割位點和BoNT/A重鏈的核苷酸序列，如SEQ ID NO:6所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其中，編碼第二蛋白酶切割位元點的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
BoNT/A輕鏈和BoNT/A重鏈之間也可以不存在天然的環狀區域，例如去除輕鏈和重鏈之間的KTKSLDKGYNK連接序列，以減少非特異性蛋白酶切割。
編碼單鏈多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，其編碼的單鏈多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2、構建包含步驟1序列的核酸分子的質粒
在上述人工合成基因工程優化後的GSTs-BoNT/A，兩端合成加入NdeI和NotI酶切位點，經過NdeI和NotI 37攝氏度酶切 (New England Biolabs)，使用QIquick gel extraction kit(Qiagen)純化，使用T4 DNA ligase(NEB)插入pET28a（Novagen）質粒載體中的NdeI和NotI的位點。
3、轉染步驟2構建的質粒到宿主細胞
（a）感受態細胞的製備：取一管大腸桿菌細胞E.coli BL21 DE3 (New England Biolabs)，接種至含有3ml LB培養液的試管中，37℃振盪培養過夜。次日取菌液0.5ml接種至含有50ml LB培養基的250ml燒瓶中，37℃劇烈震盪培養約3-5小時（250rpm），當菌落600nm OD值達到0.3-0.4時，將燒瓶取出放置冰上10-15分鐘。在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4℃，1000g離心10分鐘。棄上清，收集加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中，振盪混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘，4℃，1000g離心10分鐘，棄上清，收集加4ml冰預冷的0.1M的CaCl2，重懸浮菌體。每管0.2ml分裝，至4℃保存備用，24小時內使用，其餘保存於-70℃的低溫冰箱中。
（b）轉染：適量DNA（ng）和感受態大腸桿菌混合放置冰浴15分鐘，42℃熱擊30秒，放置冰浴5分鐘，放入SOC培養基250rpm搖晃1小時，塗抹在有抗生素的平板上，37℃隔夜培養。
4、培養宿主細胞和誘導表達單鏈多肽
培養基的組分和配比：11.8 g/L 胰蛋白腖、23.6 g/L 酵母提取物、9.4 g/L K2HPO4、2.2 g/L KH2PO4、4 ml/L 甘油。
培養條件：37℃隔夜250rpm震盪培養細胞。
誘導表達：當大腸桿菌生長到OD600=1的時候，加入1mM IPTG 誘導表達在25℃表達5個小時。OD600可以選用0.2-1.5，溫度可以選用37℃到10℃，表達時間可以是5-16個小時。
收穫細胞：3000 rpm 30分鐘離心收集大腸桿菌。
5、單鏈多肽表達水準的鑒定
使用金斯瑞谷胱甘肽純化樹脂製備一根直徑1釐米，高1釐米的谷胱甘肽純化樹脂層析柱，緩慢地傾倒25毫升裂解液到層析柱上層，注意不要衝起樹脂，經過一小時緩慢過柱吸附裂解液中的GSTs-BoNT/A。按照常規方法洗脫獲得GSTs-BoNT/A。
常規方法如下：使用20倍柱體積的磷酸緩衝液洗滌層析柱，用10倍柱體積的新鮮製備的10 mM谷胱甘肽洗脫緩衝液（0.154 g還原的谷胱甘肽溶解在50 ml 50 mM Tris-HCl（pH 8.0））進行GSTs-BoNT/A洗脫，使用280 nm處的吸光度讀數監控融合蛋白的洗脫。洗脫後的蛋白在Rinovirus 3C Proteas作用下切除GSTs標籤蛋白。
取去除GSTs標籤蛋白之前的產物和之後的產物進行常規的SDS-PAGE實驗，如圖1所示，與沒有標籤蛋白去除的第1泳道相比，在Rinovirus 3C Protease的作用下，第1泳道的GSTs標籤蛋白被切除，得到沒有GSTs的BoNT/A分子。
GSTs-BoNT/A在總蛋白水準中所占的比例的測定：使用4-12% SDS-PAGE（Biorad）對純化的GSTs-BoNT/A在200伏電壓下電泳分離，175kd分子量主要條帶是GSTs-BoNT/A。
6、標籤蛋白的去除以及提純
對將步驟5的產物進行GSTs標籤蛋白的去除和有毒多肽的提純：
用金斯瑞3C酶處理重新吸附在谷胱甘肽純化樹脂層析柱上的GSTs-BoNT/A，在3C酶的作用下，GSTs和BoNT/A之間的第一酶切位點被斷開，GSTs脫離，同時BoNT/A的輕鏈和重鏈之間的第二酶切位點被斷開。
以磷酸緩衝液處理谷胱甘肽純化樹脂層析柱，GSTs標籤蛋白留在柱子上，被去除掉，而BoNT/A的輕鏈和重鏈被磷酸緩衝液洗脫下來。
取去除了GSTs的產物進行常規的SDS-PAGE實驗，如圖2所示，得到的條帶中不再有GSTs標籤蛋白，說明GSTs標籤蛋白已經被完全去除。使用SDS-PAGE掃描圖片，根據條帶灰色密度來計算所得BoNT/A為90%純度以上。
採用GSS、GSGS、GGSGS多肽代替連結短肽GS部分，其效果和GS相似，標籤蛋白可以很好得暴露，從而能被完全切除。
7、二聚體BoNT/A的雙鏈在還原條件下的解離
將步驟6的產物進行還原實驗：
使用 100mM的二硫蘇糖醇，在100攝氏度下處理樣品五分鐘，使樣品還原，樣品經過4-12% SDS-PAGE (Biorad)200伏電壓電泳分離，分離出重鏈和輕鏈。如圖3所示，將步驟6得到的產物在還原條件下進行還原，得到的產物進行常規的SDS-PAGE實驗，得到兩條不同的條帶，分子量分別在100Kda和50Kda，證明步驟6形成的產物是以二硫鍵連結兩個肽段的二聚體結構。
8、GSTs-BoNT/A的毒性試驗
用步驟5獲得的GSTs-BoNT/A 經小鼠腹腔注射的LD50在45ng-450ng之間；考慮到所注射的肉毒毒素蛋白純度，折算的LD50在22.5ng-225ng之間，中間值為123.75ng。用步驟5獲得的BoNT/A經小鼠腹腔注射的LD50在0.02ng–0.05 ng之間。考慮到所注射的肉毒毒素蛋白純度，折算的LD50在0.006ng-0.015ng之間，中間值為0.0105ng（見表1）。
表1：GSTs-BoNT/A和BoNT/A分子在小鼠生物毒性實驗中的毒性比較
測試品 說明 給藥量（ng） 給藥72小時候小鼠致死率（％）
GSTs-BoNT/A（純度50％） GSTs-BoNT/A（純度50％） 450 100
45 50
4.5 0
0.45 0
BoNT/A（純度30％） BoNT/A（純度30％） 0.05 100
0.02 0
0.01 0
0.005 0
GSTs-BoNT/A具有肉毒毒素的活性，經小鼠腹腔注射後，其半數致死量（LD50）大約比BoNT/A的蛋白LD50高11786倍，表明GSTs-BoNT/A重組蛋白毒素多肽前體分子活性弱於最終產品BoNT/A大約11786倍。這個實驗證明，GSTs-BoNT/A重組蛋白毒素多肽前體分子具有肉毒毒素的活性。由於肉毒毒素的超高毒性，因此生產過程中，在未對前體分子作活化處理前就需要高度安全操作防護。
實施例2重組A型肉毒毒素蛋白組合物的優化
通過小鼠半數致死量評估肉毒毒素蛋白（實施例1製備）的活性，並以小鼠單位（U）顯示，一個單位定義為殺死小鼠總體數量50%所需的腹腔注射重組A型肉毒毒素蛋白量。
一、動物實驗過程：
1、選種分組：
選取CD-1品種的成年小鼠，分組，稱重、編號、保證每組小鼠數量相等，體重相近。
2、給藥：
表2中不同配方製劑給藥，給藥過程中，腹腔單次注射給予CD-1小鼠不同製劑配方重組A型肉毒毒素蛋白製劑均為0.5mL。經小鼠腹腔注射藥的重組A型肉毒毒素蛋白量為2 X LD50（2U）。
3、觀察：
試驗開始前，每只動物稱量一次體重（第一天給藥前）並記錄，給藥後，每24h稱量一次體重，在給藥後24h （±1h）、48h（±1h）、72h（±1h）、96 h（±1h），檢查死亡率。
二、實驗結果
選取表2中所列的含有2U肉毒毒素的各組分配方（1-4）注射小鼠腹腔，觀察各製劑儲存在4oC條件下0 至211天後2U肉毒毒素對每組小鼠的致死率，實驗過程同上述動物實驗，實驗結果如表2所示。
表2.各組分配方製劑儲存不同時間後的活性測定
編號 配方內容 各組分配方製劑在4 oC儲存的時間（天）
0 9 36 44 75 211
1 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM左旋卡尼汀，生理鹽水 80% 80% 80% 80% 70% 90%
2 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM L-色胺酸，生理鹽水 80% 70% 80% 90% 80% -
3 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM L-組胺酸，生理鹽水 80% 100% 80% - - -
4 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM L-甲硫胺酸，生理鹽水 80% 80% 70% - - -
從表2的結果中可以看出，表中4個配方在4℃ 條件下放置0至211天後，重組A型肉毒毒素對小鼠的致死作用（藥物活性）沒有減弱，仍然保持重組A型肉毒毒素蛋白在放置4℃保存前的生物活性，證明本發明所選擇的配方能夠維持重組A型肉毒毒素的長期穩定性。
選取表2中兩個製劑測定了重組A型肉毒毒素儲存在4℃ 44，75和211天後的小鼠半數致死量（LD50）。實驗結果見表3。
表3. 重組A型肉毒毒素在4oC 保存44，75和211天後的小鼠LD50測定值
編號 配方 44天 70天 211 天
1 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM左旋卡尼汀，生理鹽水 11.0 pg 11.4 pg 12.5 pg
2 2U重組A型肉毒毒素， 0.1%吐溫80，10mM L-組胺酸，生理鹽水 13.7 pg 13.5 pg -
從表3中可以看出，配方1在4℃放置211天後，能保持重組A型肉毒毒素蛋白的活性，配方2在4℃放置70天後，能保持重組A型肉毒毒素蛋白的活性，經過多劑量-活性關係計算的重組A型肉毒毒素的小鼠半數致死量（LD50）經過4℃分別放置44，70和211天後沒有明顯變化，半數致死量仍然保持基本不變，充分證明本發明的製劑配方能夠有效維持重組A型肉毒毒素的生物活性長期穩定。
本發明採用重組肉毒毒素，使用胺基酸或類胺基酸化合物作為蛋白穩定劑，可以在低溫條件（如4℃下）長時間儲存（如4℃下儲存70天以上），本發明的製劑配方也可保持天然肉毒素蛋白（A型肉毒毒素蛋白、B型肉毒毒素蛋白、C1型肉毒毒素蛋白、C2型肉毒毒素蛋白、D型肉毒毒素蛋白、E型肉毒毒素蛋白）的活性。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
本文描述的前述實施例和方法可以基於本領域技術人員的能力、經驗和偏好而有所不同。
本發明中，僅按一定順序列出方法的步驟並不構成對方法步驟順序的任何限制。
無
圖1:GSTs-BoNT/A初步純化和進一步去除GSTs標籤的SDS-PAGE結果，其中第1泳道為經過GSTs親和層析柱初步純化得到的GSTs-BoNT/A，第2泳道為初步純化的蛋白經過Rinovirus 3C Protease的酶切去除GSTs標籤蛋白得到切除GSTs後的BoNT/A。 圖2：切除了GSTs標籤的產物經過離子交換柱進一步純化得到高純度的BoNT/A 蛋白的SDS-PAGE結果。 圖3：BoNT/A在還原條件下雙鏈解離的驗證結果。
無
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Claims (17)

  1. 一種肉毒毒素蛋白組合物，其特徵在於，包括以下組分： 肉毒毒素蛋白和蛋白穩定劑； 所述蛋白穩定劑選自胺基酸或類胺基酸化合物中任一種。
  2. 如請求項1所述的組合物，其特徵在於，所述類胺基酸化合物包括左旋卡尼汀（L-carnitine）。
  3. 如請求項2所述的組合物，其特徵在於，所述左旋卡尼汀的摩爾含量為5-20mM。
  4. 如請求項1所述的組合物，其特徵在於，所述胺基酸的摩爾含量為5-20mM。
  5. 如請求項4所述的組合物，其特徵在於，所述胺基酸選自L-組胺酸、L-甘胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-組胺酸和L-賴胺酸中的一種或多種。
  6. 如請求項1至5任一項所述的組合物，其特徵在於，所述肉毒毒素蛋白選自A型肉毒毒素蛋白、B型肉毒毒素蛋白、C1型肉毒毒素蛋白、C2型肉毒毒素蛋白、D型肉毒毒素蛋白、E型肉毒毒素蛋白、F型肉毒毒素蛋白、G型肉毒毒素蛋白或H型肉毒毒素蛋白中的任一種；優選的，所述肉毒毒素蛋白為A型肉毒毒素蛋白，更優選的，所述肉毒毒素為重組肉毒毒素。
  7. 如請求項1至6任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包括增溶劑和/或鹽類。
  8. 如請求項7所述的組合物，其特徵在於，所述增溶劑的體積百分比濃度為0.01%-0.2%。
  9. 如請求項7及8任一項所述的組合物，其特徵在於，所述的鹽類的品質百分比為0.9%。
  10. 如請求項7至9任一項所述的組合物，其特徵在於，所述增溶劑選自吐溫類、司盤類、十二烷基硫酸鈉； 其中，所述吐溫類選自吐溫20、吐溫40、吐溫60、或吐溫80中的一種或多種； 所述司盤類選自司盤 20、司盤40、司盤60、司盤80、或司盤85中的一種或多種； 所述增溶劑為吐溫80。
  11. 如請求項7至10任一項所述的組合物，其特徵在於，所述鹽類選自無機鹽或有機鹽中任一種； 其中，所述無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鎂、乙酸鈉、丙酸鈉和磷酸鉀中的一種或多種； 所述有機鹽選自乳酸鈉、琥珀酸鈉中的一種或多種； 更優選的，所述無機鹽類為氯化鈉。
  12. 如請求項1至11任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包括肉毒毒素蛋白、左旋卡尼汀、吐溫80、氯化鈉； 或， 所述組合物包括肉毒毒素蛋白、胺基酸、吐溫80、氯化鈉。
  13. 如請求項12所述的組合物，其特徵在於，所述吐溫80 的體積百分比濃度為0.05%-0.2%； 優選的，所述吐溫80的體積百分比濃度為0.1%。
  14. 如請求項12至13任一項所述的組合物，其特徵在於，所述氯化鈉的品質百分比濃度為0.9%。
  15. 如請求項1至14任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物為液體製劑。
  16. 一種請求項1至15任一項所述的組合物的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括將各組分混合的步驟。
  17. 如請求項1至15任一項所述的組合物在製備用於預防和/或治療支配肌肉或外分泌腺的膽鹼能神經相關疾病的藥物中的用途， 或， 在製備用於醫學美容中藥物的用途； 優選的，所述醫學美容包括平滑或預防皺紋、瘦臉、形體塑型、疤痕修復； 優選的，所述的膽鹼能神經相關疾病選自： 弗雷綜合征、鱷魚淚綜合征、腋下多汗症、足底多汗症、頭頸多汗症、身體多汗症、鼻漏、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、多涎、垂涎、流涎、痙攣狀況、顎肌陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、僵直、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、反常性下頜肌肉活動、半側咀嚼肌痙攣、肥大型鰓肌病、嚼肌肥大、脛骨前肌肥大、眼球震顫、振動幻視、核上凝視麻痹、持續狀態部分性癲癇、痙攣性斜頸手術計畫、展肌聲帶麻痹、頑固性突變性發音障礙、上食道括約肌功能障礙、聲帶肉芽腫、口吃、抽動穢語綜合征、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術後言語失敗、保護性上瞼下垂、瞼內翻、奧狄氏括約肌功能障礙、假性食道弛緩不能、非失弛緩性食道運動障礙、陰道痙攣、術後臥床、震顫、膀胱功能障礙、半面痙攣、神經支配恢復術運動障礙、僵人綜合征、破傷風、前列腺增生、肥胖治療、嬰兒大腦性麻痹、失弛緩症和肛裂中的一種或多種。
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CN101687046B (zh) * 2007-07-10 2012-12-26 株式会社美地拓斯 稳定性改善的肉毒毒素药物液体组合物
US9480731B2 (en) * 2013-12-12 2016-11-01 Medy-Tox, Inc. Long lasting effect of new botulinum toxin formulations
KR101506204B1 (ko) * 2014-01-13 2015-03-27 김삼 지방분해 기능을 포함한 보톡스 기능이 강화된 약물 조성물
KR102259423B1 (ko) * 2018-11-30 2021-06-02 주식회사 휴온스바이오파마 보툴리눔 독소의 안정화 액상 조성물
CN114222754A (zh) * 2020-03-31 2022-03-22 台湾浩鼎生技股份有限公司 A型肉毒杆菌毒素复合物、其配制剂和使用方法
CN113876936B (zh) * 2021-11-09 2022-08-16 达尔文新研(北京)生物科技有限公司 一种高稳定性的注射用肉毒毒素组合物及其制备方法和其应用

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