KR20230144618A - 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230144618A
KR20230144618A KR1020237031001A KR20237031001A KR20230144618A KR 20230144618 A KR20230144618 A KR 20230144618A KR 1020237031001 A KR1020237031001 A KR 1020237031001A KR 20237031001 A KR20237031001 A KR 20237031001A KR 20230144618 A KR20230144618 A KR 20230144618A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
asn
ile
lys
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020237031001A
Other languages
English (en)
Inventor
옌 장
Original Assignee
충칭 클라루비스 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충칭 클라루비스 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 filed Critical 충칭 클라루비스 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20230144618A publication Critical patent/KR20230144618A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22002—Papain (3.4.22.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24068—Tentoxilysin (3.4.24.68), i.e. tetanus neurotoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86—Products or compounds obtained by genetic engineering
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는 태그 단백질, 링커 숏 펩티드 등을 포함한다. 상기 링커 숏 펩티드는 태그 단백질의 절단에 유리하여 단일 사슬 폴리펩티드의 정제를 향상시키고, 동시에, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는 활성화 후 신경독성을 갖지만 그 자체가 경미한 독성을 가지고 있기 때문에 단일 사슬 폴리펩티드의 수율을 크게 향상시킴과 동시에 생산 안전성을 향상시키고 생산 공정의 비용을 절감한다.

Description

변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도
본 발명은 생명 공학 기술 분야에 속하는 것으로, 구체적으로 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
관련 출원의 상호 참조
본원 발명은 출원번호가 202110217647.X이고 출원일이 2021년 2월 26일인 출원을 본원 발명의 우선권으로 주장하는 바, 우선권 문서의 내용은 그 전체가 참조로서 여기에 인용된다.
신경독소는 예를 들어 보툴리눔 신경독소(Botuliumtoxin, 약칭 BoNTs) 및 파상풍 독소(Tenanustoxin, Clostridiumtenani, 약칭 tetX 또는 TeNT)를 포함하고, 모두 클로스트리듐 신경독소(CNTs)에 속하며 전형적인 고효율 신경독소로, 인간에 대한 치사량은 체중 1kg당 0.1ng 내지 1ng이다(Tonello et al., Adv.Exp.Med.&Biol.389: 251-260(1996)). 클로스트리듐 신경독소는 신경 세포에 특이적으로 결합하여 신경전달물질의 방출을 파괴할 수 있다.
보툴리누스균은 항원이 상이한 7가지 혈청형을 분비하며, 이러한 혈청형은 A형 내지 G형 보툴리눔 신경독소(BoNTs)로 설계된다. 보툴리눔 신경독소(BoNTs, 보툴리눔 독소)와 파상풍 독소(tetX)는 상동성이 65%에 불과하지만 분자 구조와 분자 질량은 거의 동일하며, 모두 이황화 결합으로 연결된 각각 약 50KDa의 경쇄(L) 및 약 100KDa의 중쇄(H)인 2개의 아미노산 사슬을 포함하고, 경쇄는 프로테아제 활성 도메인을 포함하며, 중쇄는 전위 도메인(N-말단) 및 수용체 결합 도메인(C-말단)을 포함한다. 홀로톡신은 생체 내에서 단일 사슬로 합성되며, 중쇄를 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드는 이어서 루프라고 하는 노출된 영역의 단백질 분해에 관한 번역 후 변형에서 절단되어 최종적으로 이황화 결합으로 연결된 L 사슬과 H 사슬을 포함하는 활성 신경독소를 형성한다. 모든 혈청형의 보툴리눔 신경독소(BoNTs) 및 클로스트리듐 테타니에 의해 분비된 관련 파상풍 신경독소(TexT)는 모두 세포막 융합을 제어하는 SNARE 복합체의 형성에 관여하는 단백질을 절단하여 시냅스 엑소시토시스를 방지하고 신경전달물질의 방출을 억제하며 신경 신호 전달을 차단하는 Zn2+ 프로테아제이다. 여기서, 보툴리눔 신경독소는 말초 신경에서 흥분성 전달 물질의 방출을 억제하여 근육 마비를 일으키고, 파상풍 신경독소는 중추 신경에서 억제성 전달 물질의 방출을 억제하여 근육 경련을 일으킨다. 또한, CNTs 활성은 선 분비에 영향을 미치는 것으로 증명되었다.
A형 보툴리눔 신경독소(BoNT/A)는 1989년 미국에서 사시, 안검 경련 및 다른 질환의 치료용으로 승인되었다. 일부 응용에서, 보툴리눔 독소는 추가적인 박테리아 단백질과의 복합체 형태로 치료하고자 하는 근육에 직접 주사되고, 생리학적 pH값에서, 독소는 단백질 복합체로부터 방출되어(Eisele et al.2011, Toxicon 57(4): 555-65), 원하는 약리학적 효과를 생성한다. 다른 일부 응용에서, 개선된 BoNT/A 제제는 복합 단백질을 포함하지 않는다. BoNT의 작용은 일시적이므로 환자는 치료 효과를 유지하기 위해 BoNT를 반복적으로 복용해야 한다. 또한, FDA는 B형 보툴리눔 독소를 경부 근육 긴장 이상 치료용으로 승인하였다.
보툴리눔 신경독소를 사용한 다양한 치료적 응용에서, 미국 특허 6,113,915 및 미국 특허 5,721,215에서는 통증 치료를 위한 응용에 관하여 개시하였고; 미국 특허 제5,053,005호에서는 신경근 질환의 치료에서 보툴리눔 신경독소의 응용을 개시하였으며; Elston, J.S. 등은 사시의 치료에서 BoNT/A의 응용(British Journal of Ophthalmology, 1985, 69, 718-724 및 891-896)을 개시하였고; Adenis, J.P. 등은 안검 경련의 치료에서 BoNT/A의 응용(Ophthalmol., 1990, 13(5), 259-264)을 개시하였으며; Jankovic 등은 경련성 구강 하악 근육 긴장 이상성 사경의 치료에서 BoNT/A의 응용(Neurology, 1987, 37, 616-623) 을 개시하였고; Blitzer 등은 BoNT/A를 이용한 경련성 발성 장애 치료의 구현예(Ann.Otol.Rhino.Laryngol, 1985, 94, 591-594)를 개시하였으며; Brin 등은 혀 근육 긴장 이상의 치료에서 BoNT/A의 응용(Adv.Neurol.(1987)50, 599-608)을 개시하였고; Cohen 등은 쓰기 경련((writer's cramp)의 치료에서 BoNT/A의 응용(Neurology(1987)37(Suppl 1), 123-4)을 개시하였다.
보툴리눔 신경독소는 의학적 및 미용적 치료 효과가 분명하지만, 이 독소의 산업적 생산에는 많은 어려움이 있으며, 직면한 문제는 주로 순도와 안전성(저독성 또는 무독성) 이 두 가지 측면에 집중되어 있다.
순도 측면에서, 재조합 단백질, 특히 작은 폴리펩티드를 양과 가용성 형태로 얻기 위해, 많은 경우 이들을 융합 단백질 또는 하이브리드 단백질로 사용할 수 있는데, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 말토스 결합 단백질과 융합 또는 하이브리드된 단백질은 대장균에서 발현된다. 또한, 친화성 정제를 위해 N-말단 또는 C-말단 태그(예를 들어, His 태그, Strep 태그 또는 FLAG 태그)로 원하는 폴리펩티드를 발현하기 위한 많은 발현 시스템이 시장에 나와 있다. 그러나 제약 산업에서 후속적으로 단백질을 첨가하려면 해당 단백질 및 존재할 수 있는 오염물이 추가 처리에서 완전히 제거되었음을 증명해야 하는데, 이는 일반적으로 상당한 비용이 든다. 따라서, 순도를 향상시키는 동시에 태그 단백질을 최대한 제거하는 방법이 산업화 폴리펩티드 제제의 생산에 요구된다.
클로스트리듐 신경독소의 중쇄와 경쇄는 이황화 결합을 통해 서로 연결된다. 참여하는 시스테인 잔기 사이에 링커 영역 또는 루프(loop, 업계에서 링커 서열 또는 루프 서열로도 정의됨)가 있으며, 그 길이는 다양한 혈청형의 클로스트리듐 신경독소 사이에서 크게 변화된다. 이 루프는 늦어도 세포 용해 과정에서 클로스트리듐에서 독소가 방출될 때 아직 특성화되지 않은 클로스트리듐 엔도펩티다아제에 의해 절단되며, 여기서 절단된 종류와 절단되지 않은 종류의 비율은 혈청형에 따라 다르다. 예를 들어, BoNT/A의 경우 루프 서열 VRGI ITSKTKSLDKGYNKALNDL은 절단 과정에서 2개의 절단 부위가 프로테아제에 의해 절단되고, 하나의 데카펩티드를 잘라내며, 절단된 경쇄 및 중쇄는 N-말단 및 C-말단에서 시스테인 잔기에 의해 이황화 결합을 통해 연결된다. 그러나 이 과정에서, 프로테아제의 절단(루프 및 중쇄의 말단에서)은 무작위적이기 때문에 원하지 않는 중간 생성물이 많이 생성되어 정제의 어려움을 증가시키고 제품의 수율을 감소시킨다.
고독성으로 인한 안전성 측면에서는 대장균에서 TeTx 및 BoNTs의 중쇄 및 경쇄를 각각 발현하고 정제하는 방법이 있다(Li, et al., Biochemistry 33: 7014-7020(1994); Zhou, et al., Biochemistry, 34: 15175-15181(1995) 참조). 대장균에서 분리된 이러한 사슬은 그 자체가 비독성이며, 산화적 이황화 결합을 사용하여 H 및 L 서브유닛을 결합하여 이중 사슬을 형성한다. 그러나 이러한 방법은 실용적이지 못한데, 그 이유는, 첫째, L 사슬이 없는 경우 분리된 H 사슬은 수용성이 좋지 않고 단백질 가수분해에 의해 매우 쉽게 분해되고, 둘째, 체외 산화에 의해 별도로 발현 및 정제된 H 및 L 사슬이 활성 이중 사슬을 생성하는 효율이 높지 않으며, 잘못 접히거나 산화된 비활성 분자가 많이 생성되어 올바르게 접히고 산화된 H 및 L 사슬을 분리하고 정제하는 것이 매우 어렵기 때문이다.
따라서, 신경독소를 비활성(또는 저활성) 단일 사슬 형태로 발현하고, 단백질 사슬의 용해성을 유지하며, 단백질의 잘못된 접힘 및 이에 따른 프로테아제 공격에 대한 감수성을 감소시키고, 독소 수율을 개선할 수 있는 것이 보다 실용적인 방법이다. 한 가지 방법은 신경독소의 환상 구조의 부위를 특정 프로테아제에 의해서만 인식 및 가수분해될 수 있는 부위로 변형시키는 것이다. 특허 US7709228에서는 변형 가능한 절단 분위 및 이러한 부위를 특이적으로 인식할 수 있는 프로테아제를 개시하였다. 상기 특허는 구체적인 실시형태에서 EK 효소 절단 부위로 TeTx의 루프를 변형시켰지만, 그 재조합 제품의 독성은 천연 TeTx의 2/5로 그 감소폭이 현저하지 않았다. 상기 특허는 또한 절단되지 않은 재조합 BoNT/E와 천연 BoNT/E의 단백질 가수분해 활성 및 그 독성을 비교하였으며, 그 결과 절단되지 않은 재조합 BoNT/E의 활성이 현저히 낮았지만 그 독성이 크게 감소하지 않았다.
재조합 신경독소 폴리펩티드의 생산에서 존재하는 순도를 향상시키는 동시에 태그 단백질을 완전히 제거하는 문제, 및 독성 감소와 안전 생산 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 변형된 신경독성의 단일 사슬 폴리펩티드 및 용도를 제공하며, 구체적으로 다음과 같다.
본 발명의 제1 양태에서, 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드를 제공하며, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는,
(I) 제1 폴리펩티드 단편;
(II) 제2 폴리펩티드 단편을 포함하고,
상기 제1 폴리펩티드 단편은,
(a) 태그 단백질;
(b) 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역;
(c) 링커 숏 펩티드를 포함하며;
상기 제2 폴리펩티드 단편은,
(d) 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인을 포함하는 제1 기능성 아미노산 구조 영역;
(e) 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역;
(f) 표적 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 제2 기능성 아미노산 구조 영역을 포함한다.
용어 "태그 단백질”은 특정 리간드에 결합할 수 있는 한 종류의 단백질 분자를 의미한다.
바람직하게는, 상기 태그 단백질은 당업자에게 공지된 태그 단백질 또는 컴퓨터 프로그램에 의해 설계된 태그 단백질로부터 선택될 수 있고, 상기 태그 단백질은 공지된 기질에 특이적으로 결합할 수 있다.
더 바람직하게는, 상기 태그 단백질은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSTs), C-myc, 키틴 결합 도메인, 말토스 결합 단백질(MBP), SUMO 이종 친화성 부분, 단클론 항체 또는 단백질 A, 스트렙타비딘 결합 단백질(SBP), 셀룰로오스 결합 도메인, 칼모듈린 결합 펩티드, S 태그, Strep 태그 II, FLA, 단백질 A, 단백질 G, 히스티딘 친화성 태그(HAT), 폴리히스티딘으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 "태그 단백질”은 숙주에서 독소 폴리펩티드 전구체의 가용성을 증가시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 "태그 단백질”은 독소 폴리펩티드 전구체가 가용성 형태로 숙주 세포에 존재하도록 한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 태그 단백질은 단일 사슬 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 태그 단백질은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSTs)이고, 더 바람직하게는, 상기 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시된다.
바람직하게는, 상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 모두 인간 프로테아제, 또는 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포 자체에 의해 생성된 프로테아제에 의해 절단될 수 없다.
더 바람직하게는, 상기 제1 프로테아제 절단 부위와 제2 프로테아제 절단 부위는 동일하거나 상이하다.
상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 발현 시 숙주 세포 또는 사용 시 유기체 내인성 프로테아제에 의해 인식 및 절단되지 않는다.
더 바람직하게는, 상기 특정 프로테아제는 비인간 엔테로키나제, 담배 식각 바이러스 프로테아제, 고초균 유래 프로테아제, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래 프로테아제, 리노바이러스 유래 프로테아제, 파파인, 곤충 파파인의 동족체 또는 갑각류 파파인의 동족체 중 하나 또는 둘의 조합으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제1 프로테아제 절단 부위를 특이적으로 인식하는 프로테아제 및 상기 제2 프로테아제 절단 부위를 특이적으로 인식하는 프로테아제는 모두 리노바이러스 유래 프로테아제이다.
바람직하게는, 제2 절단 부위는 제1 기능성 펩티드 단편과 제2 기능성 펩티드 단편 사이의 자연 발생 루프에 삽입되거나 이를 부분적으로 대체하거나 완전히 대체한다. 상기 삽입은 상기 루프의 특정 두 아미노산 사이에 삽입되는 것을 의미하고; 상기 부분적으로 대체한다는 것은 상기 제2 절단 부위가 상기 루프의 일부 아미노산 서열을 대체하는 것을 의미하며; 상기 완전히 대체한다는 것은 자연 발생 루프의 아미노산 서열이 제2 절단 부위에 의해 완전히 대체되는 것을 의미한다.
더 바람직하게는, 상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 DDDDK, EXXYXQS/G, HY, YH 또는 LEVLFQGP 중 하나 또는 둘의 조합으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 모두 LEVLFQGP이다.
바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드는 5개의 아미노산을 초과하지 않는다.
바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드는 제1 프로테아제 절단 부위가 프로테아제에 의해 더 쉽게 인식되거나 결합되도록 할 수 있다.
더 바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드는 단일 사슬 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는다.
더 바람직하게는, 상기 제1 프로테아제 절단 부위가 절단된 후, 제2 폴리펩티드 단편의 N-말단에 보존된 링커 숏 펩티드는 제2 폴리펩티드 단편의 기능에 영향을 미치지 않는다.
더 바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드의 GS 부분은 5개의 아미노산 잔기를 초과하지 않으며, 더 바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드는 글리신-세린(Glycine-Serine, 약칭 GS) 숏 펩티드, GGS, GGGS, GGGGS, GSGS, GGSGS, GSGGS, GGSGS, GGGSS 등 링커 숏 펩티드로부터 선택된다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역 및 링커 숏 펩티드의 아미노산 서열은 LEVLFQGPLGS이다.
바람직하게는, 상기 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인은 Zn2+ 의존성 프로테아제 활성 도메인이다.
바람직하게는, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역 및/또는 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 천연 서열 및/또는 인공 합성 서열에 의해 코딩된다. 더 바람직하게는, 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 클로스트리듐 독소 경쇄의 Zn2+ 프로테아제 활성 도메인을 포함한다.
바람직하게는, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역에서 인체 세포 표면 항원의 수용체 결합 도메인에 결합할 수 있는 표적 세포는 SNARE 복합체에 존재하는 표적 세포를 의미한다. 예를 들어, 신경 세포, 췌장 세포 또는 다른 SNARE 복합체에 존재하는 세포이다.
더 바람직하게는, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역에서 표적 세포는 인간 신경 세포 또는 췌장 세포를 의미하며, 상기 수용체 결합 도메인은 인간 신경 세포 또는 췌장 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인이다.
더 바람직하게는, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역의 수용체 결합 도메인은 클로스트리듐 독소의 중쇄의 세포 표면 항원 결합 도메인이고, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역의 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개하는 전위 도메인은 소포 막을 가로지르는 클로스트리듐 독소의 전위를 매개하는 도메인이다.
더 바람직하게는, 상기 클로스트리듐 독소는 보툴리눔 독소 또는 파상풍 독소이다.
더 바람직하게는, 상기 보툴리눔 독소는 선행기술에 공지된 혈청형 BoNT/A-BoNT/H 및 이들의 유도체 중 임의의 하나로부터 선택된다.
더 바람직하게는, 상기 클로스트리듐 독소는 파상풍 독소 또는 이의 유도체 중 임의의 하나로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 파상풍 독소의 경쇄의 일부 또는 전부를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 파상풍 독소의 중쇄의 일부 또는 전부를 포함한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A의 경쇄이고, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A의 중쇄이다.
더 바람직하게는, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역 및 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 상기 혈청형의 임의의 조합일 수 있으며, 예를 들어, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A의 경쇄로부터 유래되고, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/B의 중쇄로부터 유래되거나, 또는, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/A의 경쇄로부터 유래되고, 상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 BoNT/C의 중쇄로부터 유래된다.
더 바람직하게는, 상기 제2 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되는 단편을 포함한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는 N-말단으로부터 시작하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제, LEVLFQGPLGS, BoNT/A의 경쇄, LEVLFQGP 및 BoNT/A의 중쇄를 순차적으로 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
본 발명의 제2 양태에서, 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 각 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 태그 단백질을 코딩하는 서열은 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함한다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 제2 폴리펩티드 단편을 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 제2 폴리펩티드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
본 발명의 제3 양태에서, 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 상기 핵산 분자, 또는 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
바람직하게는, 상기 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 벡터 등이다.
본 발명의 제4 양태에서, 세포를 제공하며, 상기 세포는 상기 벡터를 포함하거나 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 발현한다.
바람직하게는, 상기 세포는 진핵 생물 세포 또는 원핵 생물 세포이다.
더 바람직하게는, 상기 세포는 대장균, 효모, 시아노박테리아 또는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 양서류 세포로부터 선택된다.
더 바람직하게는, 상기 세포는 대장균이다.
본 발명의 제5 양태에서, 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은, 상기 임의의 하나의 핵산, 벡터 또는 세포를 사용하여 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 방법은, (1) 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 설계하는 단계; (2) 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 구축하는 단계; (3) 상기 핵산 벡터를 적합한 숙주 세포에 형질전환하는 단계; (4) 상기 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포가 상기 핵산 벡터에 의해 코딩된 단일 사슬 폴리펩티드를 발현하도록 허용 또는 유도하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은, (5) 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 발현하는 세포를 용해시켜 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해 생성물을 얻는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제6 양태에서, 단일 사슬 폴리펩티드 유도체를 제공하며, 상기 단일 사슬 폴리펩티드 유도체는,
(I) 링커 숏 펩티드;
(II) 제2 폴리펩티드 단편을 포함하고,
상기 제2 폴리펩티드 단편은,
(a) 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인을 포함하는 제1 기능성 아미노산 구조 영역;
(b) 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역;
(c) 표적 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 제2 기능성 아미노산 구조 영역을 포함한다.
바람직하게는, 상기 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인은 Zn2+ 의존성 프로테아제 활성 도메인이다.
바람직하게는, 상기 표적 세포는 인간 신경 세포, 췌장 세포 또는 다른 SNARE 복합체에 존재하는 세포이다.
바람직하게는, 상기 단일 사슬 폴리펩티드 유도체는 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 제1 프로테아제 절단 부위가 절단된 후의 생성물이다.
바람직하게는, 상기 링커 숏 펩티드의 길이는 5개의 아미노산을 초과하지 않는다.
본 발명의 제7 양태에서, 상기 단일 사슬 폴리펩티드 유도체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은, 제1 프로테아제로 제1 프로테아제 절단 부위를 절단하여 상기 어느 하나의 단일 사슬 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 제8 양태에서, 독소 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은, 제1 프로테아제로 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 절단하여 태그 단백질을 제거하고, 제2 프로테아제로 절단한 후 제1 기능성 아미노산 구조 영역 및 제2 기능성 아미노산 구조 영역으로 적어도 하나의 이량체를 형성하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역과 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 이황화 결합으로 연결되어 이량체 구조를 형성한다.
본 발명의 제9 양태에서, 독소 폴리펩티드를 제공하며, 상기 독소 폴리펩티드는,
(a) 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인을 포함하는 제1 기능성 아미노산 구조 영역;
(b) 표적 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 제2 기능성 아미노산 구조 영역을 포함한다.
상기 (a)와 (b)는 펩티드 결합으로 연결되지 않으며, 바람직하게는 하나의 이황화 결합으로 연결된다.
바람직하게는, 상기 독소 폴리펩티드의 (a)와 (b) 사이에 이량체 구조가 형성된다.
바람직하게는, 상기 독소 폴리펩티드의 (a)와 (b) 사이에 제2 프로테아제에 의해 절단된 아미노산 잔기가 포함된다.
바람직하게는, 상기 독소 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 독소 폴리펩티드는 상기 독소 폴리펩티드의 제조 방법으로 제조되어 얻어진다.
바람직하게는, 활성화 후 고독성 독소 폴리펩티드에 비해, 상기 독소 폴리펩티드 전구체(단일 사슬 폴리펩티드 또는 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 포함)는 저독성을 가지며, 보다 더 바람직하게는, 상기 저독성은 활성화 후 고독성에 비해 상대적이며, 구체적인 일 실시형태에서, 상기 활성화된 독소 폴리펩티드의 활성은 독소 폴리펩티드 전구체의 활성보다 적어도 5000배 더 높고, 더 나아가, 활성화된 독소 폴리펩티드의 활성은 독소 폴리펩티드 전구체의 활성보다 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 12000, 15000배, 심지어 더 높다.
본 발명의 제10 양태에서, 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 상기 변형된 단일 사슬 폴리펩티드, 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 또는 독소 폴리펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 부형제 또는 희석제를 더 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 조성물은 트립신을 거의 포함하지 않는다.
바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물이다.
본 발명의 제11 양태에서, 조성물의 제조에서 상기 단일 사슬 폴리펩티드, 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 또는 독소 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물이고, 상기 약학적 조성물은 신경전달물질의 방출을 방해하여 관련 질환을 치료하며, 바람직하게는, 상기 질환은 신경 근육성 질환, 자율 신경 장애 또는 통증을 포함하고, 상기 질환의 증상은 경련성 발성 장애, 경련성 사경, 후두 근육 긴장 이상, 구강 하악 발성 장애, 혀 근육 긴장 이상, 경부 근육 긴장 이상, 국소성 근육 긴장 이상, 안검 경련, 사시, 반측성 안면 경련, 눈꺼풀 장애, 뇌성 마비, 국소성 경련 및 다른 언어 장애, 경련성 결장염, 신경인성 방광, 항문 연축증, 사지경련, 경련, 떨림, 이갈이, 항문 균열, 이완불능증, 연하곤란과 기타 근육 긴장 이상 및 근육군의 비자발적 움직임을 특징으로 하는 기타 장애, 눈물흘림, 다한, 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 경련으로 인한 통증, 두통 및 피부 병증을 포함한다.
본 발명의 제12 양태에서, 신경전달물질의 방출을 방해하여 관련 증상을 개선하는데 있어서 상기 단일 사슬 폴리펩티드, 단일 사슬 폴리펩티드 유도체, 독소 폴리펩티드의 비치료적 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 용도는 얼굴 주름을 줄이고 얼굴 근육을 수축시켜 얼굴 슬리밍 효과를 얻는 것과 같은 미용 용도이다.
본 발명의 유익한 효과:
본 발명에 의해 제공되는 단일 사슬 폴리펩티드는 링커 숏 펩티드를 첨가하여 태그 단백질이 보다 쉽게 절단되도록 함으로써, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는 더 높은 수율을 갖는 동시에 순도도 더 높다.
본 발명에 따른 단일 사슬 폴리펩티드의 경우 태그 단백질은 제1 기능성 아미노산 구조 영역의 프로테아제 도메인이 프로테아제의 기능을 발휘할 수 없도록 하므로, 제1 기능성 아미노산 구조 영역과 제2 기능성 아미노산 구조 영역 사이의 천연 절단 부위를 특정 효소만이 인식할 수 있는 부위로 대체함으로써, 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 분자 활성(신경독성)을 천연 독소의 1/10000 이하로 감소시켜 활성화 분자를 생산하는 단계를 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 생산과 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 활성화로 나누되, 상기 단일 사슬 폴리펩티드의 활성화는 이를 특정 프로테아제와 접촉시켜 2개의 기능성 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 절단하여 활성화 분자로 만드는 것을 의미한다. 전체 생산 과정에서, 단일 사슬 폴리펩티드의 생산이 생산 과정의 대부분을 차지하지만, 그 독성이 크게 감소하여 생산 과정에서의 위험성을 감소시킴으로써, 전체 산업적 생산이 보다 쉽게 수행되도록 한다.
본 발명에 따른 태그 단백질은 특이성 리간드에 결합한 후 리간드에서 탈리되어 태그 단백질과 공동 발현된 분자가 상이한 폴리펩티드 또는 단백질 생성물로부터 쉽게 선택될 수 있도록 하는 이종 친화성 분자를 의미한다.
본 발명에서 생산한 단일 사슬 폴리펩티드는 천연 유래의 신경독소와 비교하여 변경될 수 있는 표적 특이적 결합 영역 또는 변경된 활성 영역 또는 둘 모두를 갖는다.
수율이 더 높고 순도가 더 높으며 안전성도 더 높기 때문에 본 발명에 의해 제공되는 변형된 활성화 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드는 선행기술에 비해 생산 및 정제 조작을 더 쉽게 수행할 수 있으므로, 임상 사용을 위해 적절하게 접히고 순도가 높은 독소 폴리펩티드를 대규모로 제조할 수 있다.
도 1은 GSTs-BoNT/A 예비 정제 및 GSTs 태그 추가 제거의 SDS-PAGE 결과이며, 여기서, 제1 레인은 GSTs 친화성 크로마토그래피 컬럼에 의한 예비 정제를 통해 얻은 GSTs-BoNT/A이고, 제2 레인은 예비 정제된 단백질을 리노바이러스 3C 프로테아제(Rinovirus 3C Protease)로 절단하여 GSTs 태그 단백질을 제거하여 얻은 GSTs가 절제된 BoNT/A이다.
도 2는 GSTs 태그가 절제된 생성물을 이온 교환 컬럼으로 추가 정제하여 얻은 고순도 BoNT/A 단백질의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 환원 조건에서 BoNT/A의 이중 가닥 해리의 검증 결과이다.
아래 구체적인 실시예와 결부하여 본 발명을 추가로 설명하며, 본 발명의 장점 및 특징은 설명과 함께 더욱 명확해질 것이다. 그러나 이러한 실시예는 단지 예시적인 것으로 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 기술적 해결수단의 세부 내용 및 형태를 수정 또는 대체할 수 있지만 이러한 수정 및 대체는 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속하는 것으로 이해해야 한다.
하기 실시예에서, 주요 장비 및 재료는 아래에 언급된 몇몇 회사에서 구입하였다.
5리터 발효조(Shanghai Bailun에서 주문 제작), 글루타티온 정제 수지(L00206)(젠스크립트 생명공학 주식회사(GenScript Biotechnology Co., Ltd.)), 3C 효소(Z03092)(젠스크립트 생명공학 주식회사(GenScript Biotechnology Co., Ltd.)).
실시예 1: 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 설계 및 구축:
1. 핵산 분자는 5' 말단으로부터 시작하여 다음을 순차적으로 포함한다.
(a) 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되고, 이에 의해 코딩된 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며;
(b) 제1 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 표시되고, 이에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며;
(c) GS 링커 숏 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5로 표시되며 GGATCC이고;
(d) 제2 폴리펩티드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 BoNT/A경쇄, 제2 프로테아제 절단 부위 및 BoNT/A중쇄의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열번호 6으로 표시되며, 이에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; 여기서, 제2 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8로 표시되며, 이에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시되고;
제1 기능성 아미노산 구조 영역과 제2 기능성 아미노산 구조 영역 사이에는 자연 발생 루프가 존재하지 않을 수도 있으며, 예를 들어, 경쇄와 중쇄 사이의 KTKSLDKGYNK 연결 서열을 제거하여 비특이적 프로테아제 절단을 감소시킨다.
단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10으로 표시되고, 이에 의해 코딩된 단일 사슬 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
실시예 2: 실시예 1의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드의 구축
실시예 1에서 유전공학에 의해 최적화된 GSTs-BoNT/A를 인공 합성하고, 양 말단을 합성하여 NdeI 및 NotI 절단 부위를 추가하며, 37℃에서 NdeI 및 NotI를 통해 절단하고(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), QIquick 젤 추출 키트(QIquick gel extraction kit)(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 정제하며, T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)(NEB)를 사용하여 pET28a(노바겐(Novagen)) 플라스미드 벡터의 NdeI 및 NotI 부위에 삽입하였다.
실시예 3: 실시예 2에서 구축된 플라스미드를 숙주 세포에 형질감염
1. 컴피턴트 세포의 제조: 한 튜브의 대장균 세포 E.coli BL21 DE3(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))을 취하여 3ml LB 배양액이 함유된 시험관에 접종하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 다음날 균액 0.5ml를 취하여 50ml LB 배지가 함유된 250ml 플라스크에 접종하고, 37℃에서 약 3~5시간 동안(250rpm) 격렬하게 진탕 배양하며, 콜로니 600nm OD 값이 0.3~0.4에 도달했을 때 플라스크를 꺼내 얼음 위에 10~15분 동안 두었다. 무균 조건에서 균액을 50ml 원심분리관에 부었다. 4℃, 1000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 수집하여 0.1M의 CaCl2 10ml를 원심분리관에 넣고 흔들어 균일하게 혼합하며, 균체를 현탁하고, 아이스배스에 30분 동안 방치하며, 4℃, 1000g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리며, 수집하여 얼음으로 사전 냉각된 0.1M의 CaCl2 4ml를 넣고, 균체를 재현탁하였다. 각 튜브에 0.2ml씩 나누어 넣고, 나중에 사용하기 위해 4℃에서 보관하여 24시간 이내에 사용하였으며, 나머지는 -70℃의 저온 냉장고에 보관하였다.
2. 형질감염: 적당량의 DNA(ng)와 컴피턴트 대장균을 혼합하여 아이스배스에 15분 동안 방치하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가하며, 아이스배스에 5분 동안 방치하고, SOC 배지에 넣어 250rpm으로 1시간 동안 진탕하며, 항생제가 있는 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
실시예 4: 숙주 세포의 배양 및 단일 사슬 폴리펩티드 발현의 유도
배지의 성분 및 배합비: 11.8g/L 트립톤, 23.6g/L효모 추출물, 9.4g/L K2HPO4, 2.2g/L KH2PO4, 4ml/L 글리세린.
배양 조건: 37℃에서 250rpm으로 세포를 밤새 진탕 배양하였다.
발현 유도: 대장균이 OD600=1로 성장했을 때 1mM IPTG를 첨가하여 25℃에서 5시간 동안 발현하도록 발현을 유도하였다. OD600은 0.2~1.5로 선택할 수 있고, 온도는 37℃~10℃로 선택할 수 있으며, 발현 시간은 5~16시간일 수 있다.
세포 수확: 3000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 대장균을 수집하였다.
실시예 5: 단일 사슬 폴리펩티드 발현 수준의 동정
GSTs-BoNT/A에 대해 젠스크립트(GenScript)의 글루타티온 정제 수지를 사용하여 직경 1cm, 높이 1cm의 글루타티온 정제 수지 크로마토그래피 컬럼을 제조하며, 수지가 씻겨 나가지 않도록 주의하면서 크로마토그래피 컬럼의 상층에 용해 버퍼 25ml를 천천히 붓고, 1시간 후 용해 버퍼에 흡착된 GSTs-BoNT/A를 컬럼에 천천히 통과시켰다. 통상적인 방법에 따라 용출하여 GSTs-BoNT/A를 얻었다.
통상적인 방법은 방법은 다음과 같은 바, 20배 컬럼 부피의 인산 완충액을 사용하여 크로마토그래피 컬럼을 세척하고, 10배 컬럼 부피의 새로 제조한 10mM 글루타티온 용출 완충액(50ml 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해된 0.154g 환원된 글루타티온)을 사용하여 GSTs-BoNT/A 용출을 수행하며, 280nm에서의 흡광도 판독값을 사용하여 융합 단백질의 용출을 모니터링하였다. 용출된 단백질은 리노바이러스 3C 프로테아제(Rinovirus 3C Protease)의 작용 하에 GSTs 태그 단백질이 절제되었다.
GSTs 태그 단백질을 제거하기 전의 생성물 및 제거된 후의 생성물을 취하여 통상적인 SDS-PAGE 실험을 수행하였으며, 도 1에 도시된 바와 같이, 태그 단백질이 제거되지 않은 제1 레인과 비교하여, 리노바이러스 3C 프로테아제(Rinovirus 3C Protease)의 작용 하에 제1 레인의 GSTs 태그 단백질이 절제되어 GSTs가 없는 BoNT/A 분자가 얻어졌다.
총 단백질 수준에서 GSTs-BoNT/A가 차지하는 비율의 측정: 200 볼트의 전압 하에, 정제된 GSTs-BoNT/A에 대해 4~12% SDS-PAGE(Biorad)를 사용하여 전기영동 분리를 수행하고, 175kd 분자량 주요 밴드는 GSTs-BoNT/A이다.
실시예 6: 태그 단백질의 제거 및 정제
실시예 5의 생성물에 대한 GSTs 태그 단백질 제거 및 독성 폴리펩티드 정제:
젠스크립트(GenScript)의 3C 효소를 사용하여 글루타티온 정제 수지 크로마토그래피 컬럼에 재흡착된 GSTs-BoNT/A를 처리하면, 3C 효소의 작용 하에, GSTs와 BoNT/A 사이의 제1 절단 부위가 끊어지고, GSTs가 탈리되며, 동시에 BoNT/A의 경쇄와 중쇄 사이의 제2 절단 부위도 끊어진다.
인산 완충액으로 글루타티온 정제 수지 크로마토그래피 컬럼을 처리하면, 컬럼에 남아있는 GSTs 태그 단백질이 제거되고, BoNT/A의 경쇄 및 중쇄는 인산 완충액에 의해 용출된다.
GSTs가 제거된 생성물을 취하여 통상적인 SDS-PAGE 실험을 수행하였으며, 도 2에 도시된 바와 같이, 얻은 밴드에 GSTs 태그 단백질이 더 이상 없었는데, 이는 GSTs 태그 단백질이 완전히 제거되었음을 보여준다. SDS-PAGE를 사용하여 사진을 스캔하고, 밴드의 회색 밀도에 따라 계산한 결과 얻은 BoNT/A의 순도가 90% 이상이었다.
링커 숏 펩티드의 GS 부분 대신 GSS, GSGS, GGSGS 폴리펩티드를 사용하면, GS와 유사한 효과를 낼 수 있고, 태그 단백질은 잘 노출될 수 있어 완전히 절제될 수 있다.
실시예 7: 환원 조건에서 이량체 BoNT/A의 이중 사슬의 해리
실시예 6의 생성물에 대한 환원 실험:
100mM의 디티오트레이톨을 사용하여 100℃에서 샘플을 5분 동안 처리하여 샘플을 환원시키고, 200 볼트의 전압 하에 4~12% SDS-PAGE(Biorad)를 사용하여 샘플에 대해 전기영동 분리를 수행하여 중쇄와 경쇄를 분리하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 6에서 얻은 생성물을 환원 조건에서 환원시키고, 얻은 생성물에 대해 통상적인 SDS-PAGE 실험을 수행하여 2개의 상이한 밴드를 얻었으며, 분자량은 각각 100Kda 및 50Kda인데, 이는 실시예 6에서 형성된 생성물이 2개의 펩티드 단편이 이황화 결합으로 연결된 이량체 구조임을 증명한다.
실시예 8: GSTs-BoNT/A의 독성 시험
실시예 5에서 얻은 GSTs-BoNT/A를 마우스에 복강내 주사했을 때 LD50은 45ng~450ng 사이이고; 주사된 보툴리눔 독소 단백질의 순도를 고려하면, 환산된 LD50은 22.5ng~225ng 사이이며, 중앙값은 123.75ng이다. 실시예 5에서 얻은 BoNT/A를 마우스에 복강내 주사했을 때 LD50은 0.02ng~0.05ng 사이이다. 주사된 보툴리눔 독소 단백질의 순도를 고려하면, 환산된 LD50은 0.006ng~0.015ng 사이이고, 중앙값은 0.0105ng이다(표 1 참조).
GSTs-BoNT/A는 보툴리눔 독소의 활성을 가지고 있으며, 마우스에 복강내 주사 후 반수 치사량(LD50)은 BoNT/A의 단백질 LD50보다 약 11786배 높은데, 이는 GSTs-BoNT/A 재조합 단백질 독소 폴리펩티드 전구체 분자의 활성이 최종 생성물 BoNT/A보다 약 11786배 약함을 보여준다. 이 실험은 GSTs-BoNT/A 재조합 단백질 독소 폴리펩티드 전구체 분자가 보툴리눔 독소의 활성을 가지고 있음을 증명한다. 보툴리눔 독소의 초고독성으로 인해 생산 과정에서 전구체 분자를 활성화 처리하기 전에 높은 수준의 안전 조작 보호가 필요하다.
표 1: 마우스 생물학적 독성 실험에서 GSTs-BoNT/A와 BoNT/A 분자의 독성 비교
본 발명은 GSTs, 제1 프로테아제 절단 부위, 링커 숏 펩티드, 및 BoNT/A의 경쇄, 제2 프로테아제 절단 부위 및 BoNT/A의 중쇄를 포함하는 핵산 분자를 구축하고; 상기 핵산 분자를 포함하는, E.coli에서 GSTs-BoNT/A를 발현할 수 있는 플라스미드를 추가로 구축하는 것을 예로 들어 설명하였으며; 상기 플라스미드가 형질감염된 E.coli은 단일 사슬 GSTs-BoNT/A를 발현하고, 상기 단일 사슬 폴리펩티드는 독성이 활성화된 후의 최종 제품 BoNT/A의 독성의 1/10000 이하인 것으로 증명되었으며; 단백질 정체 및 GSTs 용출 후, 링커 숏 펩티드의 첨가로 인해 절단 부위가 링커 숏 펩티드가 없는 것에 비해 프로테아제에 의해 더 쉽게 인식 및 절단될 수 있는 것으로 증명되었고; 제1 프로테아제 절단 부위와 제2 프로테아제 절단 부위는 동일하므로, GSTs가 제거되는 동시에 제2 프로테아제 절단 부위도 절단되고, 제1 기능성 아미노산 구조 영역과 제2 기능성 아미노산 구조 영역 사이의 펩티드 결합이 끊어져 하나의 이황화 결합으로 연결되어 활성이 있는 BoNT/A로 형성되며, 이 생성물은 천연 제품의 독성을 갖는 것으로 증명되었다.
위에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시형태의 구체적인 세부 내용에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 구상 범위 내에서 본 발명의 기술적 해결수단에 대해 다양한 간단한 변형이 이루어질 수 있으며, 이러한 간단한 변형은 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
또한, 상기 구체적인 실시형태에 설명된 각 구체적인 기술적 특징은 모순되지 않는 한 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있으며, 불필요한 반복을 피하기 위해, 본 발명은 다양한 가능한 조합 방식을 더 이상 설명하지 않음에 유의해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CHONGQING CLARUVIS PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> MODIFIED NEUROTOXIN SINGLE-CHAIN POLYPEPTIDE AND USE THEREOF <130> 1 <140> PCT/CN2022/077631 <141> 2022-02-24 <150> 202110217647.X <151> 2021-02-26 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaa 654 <210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys 210 215 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ctggaagttc tgttccaggg gccc 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggatcc 6 <210> 6 <211> 3882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 atgcctttcg ttaacaaaca gtttaactat aaggacccgg ttaacggtgt ggatattgca 60 tacattaaga tccctaacgc tggtcagatg cagccggtga aagcattcaa gatccacaat 120 aagatttggg tgatcccgga acgcgatacc tttaccaacc cggaagaagg cgatctgaac 180 ccccctccgg aggccaagca agttcccgtt agctattacg acagtaccta tttaagcacc 240 gataatgaga aagataacta tctgaagggt gttaccaaac tgttcgagcg catctacagc 300 acagacttag gccgcatgct gctgaccagt atcgttcgtg gtattccgtt ctggggcggc 360 agtaccatcg acaccgagct gaaagtgatc gacaccaatt gcattaacgt gatccagccc 420 gatggcagct atcgtagcga agagctgaat ctggttatca tcggccctag tgccgacatt 480 attcaattcg agtgtaaaag cttcggccat gaggtgctga atttaacccg taatggctat 540 ggcagtaccc agtacatccg cttcagcccg gattttacct tcggcttcga ggaatcttta 600 gaagtggata ccaatccgct gctgggcgcc ggcaaatttg caacagaccc cgctgttact 660 ttagcccatg agctgattca tgctggtcat cgtctgtacg gcatcgccat taacccgaac 720 cgtgtgttta aggttaacac caacgcctat tatgaaatga gtggtttaga ggtgagcttc 780 gaggagctgc gtacctttgg tggccatgat gccaagttca tcgatagtct gcaagaaaac 840 gagtttcgtc tgtattatta caacaagttc aaagatatcg caagcacctt aaataaagcc 900 aagagcatcg ttggcaccac cgcctcttta caatatatga aaaacgtttt caaggagaaa 960 tatctgctga gcgaggacac cagtggtaaa tttagtgttg acaaactgaa gttcgataaa 1020 ctgtataaga tgctgaccga gatctatacc gaagacaatt tcgtgaaatt ttttaaagtt 1080 ctgaatcgca aaacatattt aaacttcgac aaagcagtgt ttaaaatcaa catcgttccg 1140 aaggttaatt acacaatcta cgatggcttc aatttacgca acaccaattt agccgcaaac 1200 ttcaacggcc aaaataccga gatcaataac atgaatttca ccaaactgaa aaactttact 1260 ggtttatttg agttctacaa actgctgtgc gtgcgtggca ttatcaccag tttagaagtg 1320 ctgtttcaag gtccggcctt aaacgatctg tgtattaaag ttaacaattg ggatctgttt 1380 ttcagcccta gcgaggacaa ttttaccaac gatttaaaca aaggcgagga gatcaccagc 1440 gataccaata ttgaggccgc agaggagaat atcagtctgg atttaatcca gcaatattat 1500 ctgaccttta attttgacaa tgagccggag aacattagta tcgaaaattt aagtagcgac 1560 atcattggtc agctggagct gatgccgaac attgagcgct tcccgaatgg caaaaagtat 1620 gaattagata agtacaccat gtttcactat ttacgcgccc aagaatttga acacggtaaa 1680 agccgtattg ccttaaccaa cagcgtgaat gaagcactgc tgaacccgag ccgcgtgtat 1740 acctttttca gtagtgacta tgttaagaag gtgaataagg ccaccgaagc cgccatgttc 1800 ttaggctggg tggagcagct ggtgtatgat ttcaccgatg agaccagcga ggtgagcacc 1860 acagataaaa tcgcagatat tacaattatt attccgtaca tcggcccggc tttaaatatc 1920 ggtaacatgc tgtacaaaga tgatttcgtg ggcgctttaa tctttagcgg tgccgttatt 1980 ctgttagaat tcattcccga aattgcaatc ccggtgctgg gcacctttgc tttagttagc 2040 tatatcgcaa ataaagtgtt aaccgttcag accattgaca atgctttaag caagcgtaat 2100 gaaaagtggg atgaggttta taaatacatc gttacaaatt ggttagccaa agtgaacacc 2160 cagattgatt taatccgtaa gaaaatgaaa gaagccttag agaatcaagc tgaggccaca 2220 aaagcaatta tcaattacca gtacaatcag tataccgaag aagaaaagaa caatatcaac 2280 tttaatattg atgatttaag cagcaagctg aacgaaagca ttaataaagc catgattaat 2340 attaacaagt ttttaaacca gtgcagcgtg agctatttaa tgaacagcat gatcccttac 2400 ggtgtgaagc gtctggaaga tttcgatgcc tctttaaaag acgcactgtt aaagtatatt 2460 tatgacaatc gcggcacact gatcggtcaa gttgatcgtc tgaaagataa agttaataac 2520 acattaagca cagacattcc tttccagctg agtaaatacg tggacaatca acgtctgctg 2580 agcaccttta ccgaatacat taaaaacatt attaacacca gcattctgaa tttacgctac 2640 gagagcaacc atttaattga tctgagccgt tacgccagca agatcaatat cggtagcaag 2700 gttaacttcg acccgattga caaaaaccag atccagttat tcaatttaga gagtagtaag 2760 attgaggtta ttttaaaaaa cgccatcgtt tataacagca tgtacgaaaa ttttagcaca 2820 agcttttgga ttcgtatccc gaagtatttc aatagcatct ctttaaataa tgaatacaca 2880 atcattaatt gcatggaaaa caacagcggc tggaaggtgt ctttaaacta cggtgagatc 2940 atctggactt tacaagatac ccaagaaatc aagcagcgcg ttgtgttcaa atatagtcag 3000 atgatcaaca ttagtgacta tattaaccgc tggatttttg tgaccatcac aaataaccgt 3060 ttaaacaaca gcaaaattta tattaacggt cgtctgattg accagaagcc gattagcaat 3120 ttaggtaata tccatgccag caacaacatt atgttcaaac tggatggttg tcgcgatacc 3180 catcgctaca tctggattaa gtactttaac ttattcgaca aagaactgaa tgaaaaggag 3240 atcaaggact tatatgataa tcaaagcaat agcggcattt taaaagactt ttggggtgac 3300 tatctgcagt atgacaaacc ttactatatg ctgaacttat atgacccgaa caaatacgtt 3360 gacgtgaaca atgtgggtat tcgtggctac atgtatctga aaggcccgcg cggcagtgtt 3420 atgaccacaa atatttattt aaacagctct ttatatcgtg gcaccaagtt tatcatcaag 3480 aagtacgcaa gcggcaataa agacaatatt gtgcgtaaca acgatcgtgt gtacatcaac 3540 gttgtggtga agaacaaaga gtatcgttta gccaccaatg ccagccaagc tggtgtggaa 3600 aaaattttaa gcgcactgga gatccccgat gtgggcaatt taagtcaagt tgttgtgatg 3660 aaaagtaaga atgatcaagg catcaccaac aaatgtaaga tgaatttaca agacaataac 3720 ggcaatgaca ttggttttat tggtttccat cagttcaaca atatcgcaaa gctggtggcc 3780 agcaactggt acaaccgtca gatcgaacgt agcagccgta ctttaggttg cagctgggaa 3840 tttattccgg tggatgatgg ttggggtgag cgccctttat aa 3882 <210> 7 <211> 1293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Leu Asn 435 440 445 Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser 450 455 460 Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser 465 470 475 480 Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile 485 490 495 Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile 500 505 510 Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met 515 520 525 Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys 530 535 540 Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys 545 550 555 560 Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro 565 570 575 Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn 580 585 590 Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val 595 600 605 Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile 610 615 620 Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile 625 630 635 640 Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser 645 650 655 Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val 660 665 670 Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr 675 680 685 Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp 690 695 700 Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr 705 710 715 720 Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln 725 730 735 Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr 740 745 750 Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser 755 760 765 Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe 770 775 780 Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr 785 790 795 800 Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 805 810 815 Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp 820 825 830 Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe 835 840 845 Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr 850 855 860 Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr 865 870 875 880 Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn 885 890 895 Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln 900 905 910 Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala 915 920 925 Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile 930 935 940 Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr 945 950 955 960 Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn 965 970 975 Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln 980 985 990 Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile 995 1000 1005 Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn 1010 1015 1020 Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile 1025 1030 1035 Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys 1040 1045 1050 Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr 1055 1060 1065 Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp 1070 1075 1080 Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp 1085 1090 1095 Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu 1100 1105 1110 Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg 1115 1120 1125 Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr 1130 1135 1140 Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile 1145 1150 1155 Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn 1160 1165 1170 Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr 1175 1180 1185 Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu 1190 1195 1200 Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val 1205 1210 1215 Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys 1220 1225 1230 Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly 1235 1240 1245 Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp 1250 1255 1260 Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser 1265 1270 1275 Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1280 1285 1290 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ttagaagtgc tgtttcaagg tccg 24 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 10 <211> 4575 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccatgcctt tcgttaacaa acagtttaac 720 tataaggacc cggttaacgg tgtggatatt gcatacatta agatccctaa cgctggtcag 780 atgcagccgg tgaaagcatt caagatccac aataagattt gggtgatccc ggaacgcgat 840 acctttacca acccggaaga aggcgatctg aacccccctc cggaggccaa gcaagttccc 900 gttagctatt acgacagtac ctatttaagc accgataatg agaaagataa ctatctgaag 960 ggtgttacca aactgttcga gcgcatctac agcacagact taggccgcat gctgctgacc 1020 agtatcgttc gtggtattcc gttctggggc ggcagtacca tcgacaccga gctgaaagtg 1080 atcgacacca attgcattaa cgtgatccag cccgatggca gctatcgtag cgaagagctg 1140 aatctggtta tcatcggccc tagtgccgac attattcaat tcgagtgtaa aagcttcggc 1200 catgaggtgc tgaatttaac ccgtaatggc tatggcagta cccagtacat ccgcttcagc 1260 ccggatttta ccttcggctt cgaggaatct ttagaagtgg ataccaatcc gctgctgggc 1320 gccggcaaat ttgcaacaga ccccgctgtt actttagccc atgagctgat tcatgctggt 1380 catcgtctgt acggcatcgc cattaacccg aaccgtgtgt ttaaggttaa caccaacgcc 1440 tattatgaaa tgagtggttt agaggtgagc ttcgaggagc tgcgtacctt tggtggccat 1500 gatgccaagt tcatcgatag tctgcaagaa aacgagtttc gtctgtatta ttacaacaag 1560 ttcaaagata tcgcaagcac cttaaataaa gccaagagca tcgttggcac caccgcctct 1620 ttacaatata tgaaaaacgt tttcaaggag aaatatctgc tgagcgagga caccagtggt 1680 aaatttagtg ttgacaaact gaagttcgat aaactgtata agatgctgac cgagatctat 1740 accgaagaca atttcgtgaa attttttaaa gttctgaatc gcaaaacata tttaaacttc 1800 gacaaagcag tgtttaaaat caacatcgtt ccgaaggtta attacacaat ctacgatggc 1860 ttcaatttac gcaacaccaa tttagccgca aacttcaacg gccaaaatac cgagatcaat 1920 aacatgaatt tcaccaaact gaaaaacttt actggtttat ttgagttcta caaactgctg 1980 tgcgtgcgtg gcattatcac cagtttagaa gtgctgtttc aaggtccggc cttaaacgat 2040 ctgtgtatta aagttaacaa ttgggatctg tttttcagcc ctagcgagga caattttacc 2100 aacgatttaa acaaaggcga ggagatcacc agcgatacca atattgaggc cgcagaggag 2160 aatatcagtc tggatttaat ccagcaatat tatctgacct ttaattttga caatgagccg 2220 gagaacatta gtatcgaaaa tttaagtagc gacatcattg gtcagctgga gctgatgccg 2280 aacattgagc gcttcccgaa tggcaaaaag tatgaattag ataagtacac catgtttcac 2340 tatttacgcg cccaagaatt tgaacacggt aaaagccgta ttgccttaac caacagcgtg 2400 aatgaagcac tgctgaaccc gagccgcgtg tatacctttt tcagtagtga ctatgttaag 2460 aaggtgaata aggccaccga agccgccatg ttcttaggct gggtggagca gctggtgtat 2520 gatttcaccg atgagaccag cgaggtgagc accacagata aaatcgcaga tattacaatt 2580 attattccgt acatcggccc ggctttaaat atcggtaaca tgctgtacaa agatgatttc 2640 gtgggcgctt taatctttag cggtgccgtt attctgttag aattcattcc cgaaattgca 2700 atcccggtgc tgggcacctt tgctttagtt agctatatcg caaataaagt gttaaccgtt 2760 cagaccattg acaatgcttt aagcaagcgt aatgaaaagt gggatgaggt ttataaatac 2820 atcgttacaa attggttagc caaagtgaac acccagattg atttaatccg taagaaaatg 2880 aaagaagcct tagagaatca agctgaggcc acaaaagcaa ttatcaatta ccagtacaat 2940 cagtataccg aagaagaaaa gaacaatatc aactttaata ttgatgattt aagcagcaag 3000 ctgaacgaaa gcattaataa agccatgatt aatattaaca agtttttaaa ccagtgcagc 3060 gtgagctatt taatgaacag catgatccct tacggtgtga agcgtctgga agatttcgat 3120 gcctctttaa aagacgcact gttaaagtat atttatgaca atcgcggcac actgatcggt 3180 caagttgatc gtctgaaaga taaagttaat aacacattaa gcacagacat tcctttccag 3240 ctgagtaaat acgtggacaa tcaacgtctg ctgagcacct ttaccgaata cattaaaaac 3300 attattaaca ccagcattct gaatttacgc tacgagagca accatttaat tgatctgagc 3360 cgttacgcca gcaagatcaa tatcggtagc aaggttaact tcgacccgat tgacaaaaac 3420 cagatccagt tattcaattt agagagtagt aagattgagg ttattttaaa aaacgccatc 3480 gtttataaca gcatgtacga aaattttagc acaagctttt ggattcgtat cccgaagtat 3540 ttcaatagca tctctttaaa taatgaatac acaatcatta attgcatgga aaacaacagc 3600 ggctggaagg tgtctttaaa ctacggtgag atcatctgga ctttacaaga tacccaagaa 3660 atcaagcagc gcgttgtgtt caaatatagt cagatgatca acattagtga ctatattaac 3720 cgctggattt ttgtgaccat cacaaataac cgtttaaaca acagcaaaat ttatattaac 3780 ggtcgtctga ttgaccagaa gccgattagc aatttaggta atatccatgc cagcaacaac 3840 attatgttca aactggatgg ttgtcgcgat acccatcgct acatctggat taagtacttt 3900 aacttattcg acaaagaact gaatgaaaag gagatcaagg acttatatga taatcaaagc 3960 aatagcggca ttttaaaaga cttttggggt gactatctgc agtatgacaa accttactat 4020 atgctgaact tatatgaccc gaacaaatac gttgacgtga acaatgtggg tattcgtggc 4080 tacatgtatc tgaaaggccc gcgcggcagt gttatgacca caaatattta tttaaacagc 4140 tctttatatc gtggcaccaa gtttatcatc aagaagtacg caagcggcaa taaagacaat 4200 attgtgcgta acaacgatcg tgtgtacatc aacgttgtgg tgaagaacaa agagtatcgt 4260 ttagccacca atgccagcca agctggtgtg gaaaaaattt taagcgcact ggagatcccc 4320 gatgtgggca atttaagtca agttgttgtg atgaaaagta agaatgatca aggcatcacc 4380 aacaaatgta agatgaattt acaagacaat aacggcaatg acattggttt tattggtttc 4440 catcagttca acaatatcgc aaagctggtg gccagcaact ggtacaaccg tcagatcgaa 4500 cgtagcagcc gtactttagg ttgcagctgg gaatttattc cggtggatga tggttggggt 4560 gagcgccctt tataa 4575 <210> 11 <211> 1524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu 210 215 220 Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro 245 250 255 Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys 260 265 270 Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly 275 280 285 Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr 290 295 300 Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys 305 310 315 320 Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg 325 330 335 Met Leu Leu Thr Ser Ile Val Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser 340 345 350 Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val 355 360 365 Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile 370 375 380 Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly 385 390 395 400 His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr 405 410 415 Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu 420 425 430 Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro 435 440 445 Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr 450 455 460 Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala 465 470 475 480 Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr 485 490 495 Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu 500 505 510 Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu 515 520 525 Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met 530 535 540 Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly 545 550 555 560 Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu 565 570 575 Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu 580 585 590 Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn 595 600 605 Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg 610 615 620 Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn 625 630 635 640 Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe 645 650 655 Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Leu Glu Val Leu 660 665 670 Phe Gln Gly Pro Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp 675 680 685 Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn 690 695 700 Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu 705 710 715 720 Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe 725 730 735 Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile 740 745 750 Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly 755 760 765 Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala 770 775 780 Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val 785 790 795 800 Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 805 810 815 Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu 820 825 830 Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu 835 840 845 Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr 850 855 860 Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe 865 870 875 880 Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile 885 890 895 Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr 900 905 910 Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser 915 920 925 Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn 930 935 940 Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met 945 950 955 960 Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn 965 970 975 Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe 980 985 990 Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala 995 1000 1005 Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr 1010 1015 1020 Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp 1025 1030 1035 Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp 1040 1045 1050 Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys 1055 1060 1065 Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys 1070 1075 1080 Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile 1085 1090 1095 Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser 1100 1105 1110 Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile 1115 1120 1125 Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln 1130 1135 1140 Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn 1145 1150 1155 Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe 1160 1165 1170 Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 1175 1180 1185 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys 1190 1195 1200 Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr 1205 1210 1215 Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile 1220 1225 1230 Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr 1235 1240 1245 Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu 1250 1255 1260 Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser 1265 1270 1275 Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg 1280 1285 1290 Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn 1295 1300 1305 Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly 1310 1315 1320 Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro 1325 1330 1335 Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val 1340 1345 1350 Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg 1355 1360 1365 Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr 1370 1375 1380 Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys 1385 1390 1395 Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val 1400 1405 1410 Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala 1415 1420 1425 Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly 1430 1435 1440 Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly 1445 1450 1455 Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn 1460 1465 1470 Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys 1475 1480 1485 Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser 1490 1495 1500 Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly 1505 1510 1515 Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1520

Claims (20)

  1. 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드로서,
    상기 단일 사슬 폴리펩티드는,
    (I) 제1 폴리펩티드 단편;
    (II) 제2 폴리펩티드 단편을 포함하고;
    상기 제1 폴리펩티드 단편은,
    (a) 태그 단백질;
    (b) 제1 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역;
    (c) 링커 숏 펩티드를 포함하며;
    상기 제2 폴리펩티드 단편은,
    (d) 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인을 포함하는 제1 기능성 아미노산 구조 영역;
    (e) 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역;
    (f) 표적 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 제2 기능성 아미노산 구조 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 프로테아제 절단 부위와 제2 프로테아제 절단 부위는 동일한 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 링커 숏 펩티드는 5개의 아미노산 잔기를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 발현 시 숙주 세포 또는 사용 시 유기체 내인성 프로테아제에 의해 인식 및 절단되지 않으며, 바람직하게는, 상기 제1 프로테아제 절단 부위 및 제2 프로테아제 절단 부위는 비인간 엔테로키나제, 담배 식각 바이러스 프로테아제, 고초균 유래 프로테아제, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 유래 프로테아제, 리노바이러스 유래 프로테아제, 파파인, 곤충 파파인의 동족체 또는 갑각류 파파인의 동족체 중 어느 하나의 프로테아제에 의해 인식 및 절단되는 부위로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 기능성 아미노산 구조 영역은 신경독소의 경쇄로부터 유래되거나 신경독소의 경쇄의 Zn2+ 프로테아제 활성 도메인을 적어도 포함하고;
    상기 제2 기능성 아미노산 구조 영역은 신경독소의 중쇄로부터 유래되거나 신경독소의 중쇄의 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개하는 전위 도메인을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  7. 벡터로서,
    상기 벡터는 제6항에 따른 핵산 분자, 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 세포로서,
    상기 세포는 제7항 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하거나 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포는 임의의 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포로부터 선택되고, 바람직하게는, 상기 세포는 대장균, 효모, 시아노박테리아 또는 포유동물 세포계로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    상기 제조 방법은,
    제6항에 따른 핵산 분자, 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 세포를 사용하여 상기 단일 사슬 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 단일 사슬 폴리펩티드 유도체로서,
    상기 단일 사슬 폴리펩티드 유도체는,
    (I) 링커 숏 펩티드; 및
    (II) 제2 폴리펩티드 단편을 포함하고,
    상기 제2 폴리펩티드 단편은,
    (a) 금속 이온 의존성 프로테아제 활성 도메인을 포함하는 제1 기능성 아미노산 구조 영역;
    (b) 제2 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조 영역; 및
    (c) 표적 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인 및/또는 소포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 전위를 매개할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 제2 기능성 아미노산 구조 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 사슬 폴리펩티드 유도체.
  13. 제12항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드 유도체의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    제1 프로테아제로 제1 프로테아제 절단 부위를 절단하여 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 독소 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    상기 제조 방법은,
    제1 프로테아제로 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드를 절단하여 태그 단백질을 제거하고, 제2 프로테아제로 절단한 후 제1 기능성 아미노산 구조 영역 및 제2 기능성 아미노산 구조 영역으로 적어도 하나의 이량체 구조를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 독소 폴리펩티드로서,
    상기 독소 폴리펩티드는 제14항에 따른 제조 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 독소 폴리펩티드.
  16. 조성물로서,
    상기 조성물은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드, 제12항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 또는 제15항에 따른 독소 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물이고, 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 조성물의 제조에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드, 제12항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 또는 제15항에 따른 독소 폴리펩티드의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물이고, 상기 약학적 조성물은 신경전달물질의 방출을 방해하여 관련 질환을 치료하며, 바람직하게는, 상기 질환은 신경 근육성 질환을 포함하고, 상기 질환의 증상은 경련성 발성 장애, 경련성 사경, 후두 근육 긴장 이상, 구강 하악 발성 장애, 혀 근육 긴장 이상, 경부 근육 긴장 이상, 국소성 근육 긴장 이상, 안검 경련, 사시, 반측성 안면 경련, 눈꺼풀 장애, 뇌성 마비, 국소성 경련 및 다른 언어 장애, 경련성 결장염, 신경인성 방광, 항문 연축증, 사지경련, 경련, 떨림, 이갈이, 항문 균열, 이완불능증, 연하곤란과 기타 근육 긴장 이상 및 근육군의 비자발적 움직임을 특징으로 하는 기타 장애, 눈물흘림, 다한, 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 경련으로 인한 통증, 두통 또는 피부 병증 중 하나 또는 다수를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  20. 신경전달물질의 방출을 방해하여 관련 증상을 개선하는데 있어서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드, 제12항에 따른 단일 사슬 폴리펩티드 유도체 또는 제15항에 따른 독소 폴리펩티드의 비치료적 용도로서,
    바람직하게는, 상기 용도는 미용 용도인 것을 특징으로 하는 용도.
KR1020237031001A 2021-02-26 2022-02-24 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도 KR20230144618A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110217647.X 2021-02-26
CN202110217647.XA CN114957482B (zh) 2021-02-26 2021-02-26 一种经修饰的神经毒素的单链多肽及其用途
PCT/CN2022/077631 WO2022179552A1 (zh) 2021-02-26 2022-02-24 一种经修饰的神经毒素的单链多肽及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230144618A true KR20230144618A (ko) 2023-10-16

Family

ID=82973637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237031001A KR20230144618A (ko) 2021-02-26 2022-02-24 변형된 신경독소의 단일 사슬 폴리펩티드 및 이의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240226250A9 (ko)
EP (1) EP4289868A4 (ko)
KR (1) KR20230144618A (ko)
CN (1) CN114957482B (ko)
WO (1) WO2022179552A1 (ko)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5053005A (en) 1989-04-21 1991-10-01 Gary E. Borodic Chemomodulation of curvature of the juvenile spine
US5721215A (en) 1996-03-20 1998-02-24 Allergan Injectable therapy for control of muscle spasms and pain related to muscle spasms
EP2267010B1 (en) 1999-08-25 2014-05-07 Allergan, Inc. Activatable recombinant neurotoxins
US6113915A (en) 1999-10-12 2000-09-05 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pain
DE102005002978B4 (de) * 2005-01-21 2013-04-25 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Rekombinante Expression von Proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen Form
GB0903006D0 (en) * 2009-02-23 2009-04-08 Syntaxin Ltd Modified non-cytotoxic proteases
AU2017277905B2 (en) * 2016-06-08 2022-04-14 Children's Medical Center Corporation Engineered Botulinum neurotoxins
FI3481852T3 (fi) * 2016-07-08 2023-03-19 Childrens Medical Center Uusi botulinum-neurotoksiini ja sen johdannaisia
CN112105379A (zh) * 2017-09-29 2020-12-18 儿童医学中心公司 神经毒素样毒素及其用途
SE542539C2 (en) * 2018-02-26 2020-06-02 Toxotech Ab Chimeric botulinum neurotoxin heavy chain binding domain

Also Published As

Publication number Publication date
CN114957482B (zh) 2024-09-24
US20240131127A1 (en) 2024-04-25
US20240226250A9 (en) 2024-07-11
CN114957482A (zh) 2022-08-30
EP4289868A1 (en) 2023-12-13
WO2022179552A1 (zh) 2022-09-01
EP4289868A4 (en) 2024-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7811584B2 (en) Multivalent clostridial toxins
EP1999142B1 (en) Multivalent clostridial toxins
US8273865B2 (en) Multivalent clostridial toxins
RU2582266C2 (ru) Нейротоксины, проявляющие сокращенную биологическую активность
JP2008535486A (ja) クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された標的能力を有する修飾クロストリジウム毒素
US20040220386A1 (en) Clostridial neurotoxin compositions and modified clostridial neurotoxins
US11897921B2 (en) Propeptide fusion comprising a mutated clostridium botulinum neurotoxin and a VHH domain
CA3111962A1 (en) Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop
KR20070104605A (ko) 이황화 가교된 이쇄형 단백질의 재조합 발현
US10648045B2 (en) Chimeric polypeptides
JP2008538902A (ja) 神経細胞をターゲッティングするための担体
TW201718627A (zh) 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
KR20200127175A (ko) 보툴리눔 신경독소 바이오하이브리드
CN114957482B (zh) 一种经修饰的神经毒素的单链多肽及其用途
KR102174197B1 (ko) 생산성이 향상된 비독성 프로테아제
CA3026366A1 (en) Production of activated clostridial neurotoxins
CN114958887B (en) Preparation method of modified toxin polypeptide
KR20230145411A (ko) 변형된 독소 폴리펩티드의 제조 방법
TWI849677B (zh) 一種肉毒毒素蛋白組合物
TWI852454B (zh) 一種肉毒毒素蛋白組合物、製備方法及其應用
TW201814045A (zh) 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
CN118215495A (zh) 一种肉毒毒素蛋白组合物、制备方法及其应用