CN112105379A - 神经毒素样毒素及其用途 - Google Patents

Abstract

本文中提供了在细菌物种屎肠球菌(Enterococcus faecium)中鉴定的新的肉毒梭菌神经毒素(BoNT)同源物(BoNT/EN)。还提供了包含来自BoNT/EN和其他BoNT的结构域的BoNT/EN变体和嵌合毒素。本文中还提供了产生BoNT/EN的方法及其用途(例如在治疗应用中)。

Description

神经毒素样毒素及其用途

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2017年9月29日提交的并且标题为“NEUROTOXIN-LIKE TOXIN AND USES THEREOF”的美国临时申请No.62/566,171的权益，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持

本公开内容是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R01NS080833、R01AI132387的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

肉毒神经毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是最强效的细菌毒素家族和潜在的生物恐怖剂(bioterrorism agent)。BoNT还已被用于治疗越来越多的医学病症(从肌痉挛到慢性疼痛)以及用于美容应用。随着BoNT的应用不断增长，已报道了多种限制和不良作用。主要的限制是在患者中产生中和抗体，这使得将来的治疗无效。终止使用BoNT常常使患者没有其他有效的方法来治疗/缓解他们的疾病。与BoNT使用相关的不良作用范围从短暂的非严重事件(例如上睑下垂(ptosis)和复视)直到危及生命的事件甚至死亡。BoNT的限制和不良作用在很大程度上与剂量相关。对于开发新的BoNT类型作为治疗性毒素存在相当大的兴趣。在除梭菌(Clostridium)之外的细菌物种中尚未鉴定出BoNT基因簇。

发明内容

在一些方面，本文中提供了在屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株中的质粒上编码的BoNT家族的新成员(称为BoNT/EN)。BoNT/EN切割VAMP1/2/3和数种其他SNARE蛋白(包括SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白(syntaxin)1B和突触融合蛋白4)。提供了具有经修饰接头区的BoNT/EN变体。本文中还提供了嵌合毒素，其包含BoNT/EN的蛋白酶结构域和易位结构域以及来自另外的BoNT(例如，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G)的受体结合结构域。在一些方面，提供了用于使用新BoNT/EN来治疗疾病的组合物和方法。在另一些方面，提供了产生全长BoNT/EN或嵌合毒素的方法。

本公开内容的一些方面涉及分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQ ID NO：1至3中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：1至3中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：1至3中任一种的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽进入细胞。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。在一些实施方案中，SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP1。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP2。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP3。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-23。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-25。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白1。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白4。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN在对应于SEQID NO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

在一些实施方案中，细胞是分泌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽抑制神经元活动(neuronal activity)。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪(flaccid paralysis)。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的细胞(cultured cell)。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

本公开内容的另一些方面提供了分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

本公开内容的另一些方面提供了经修饰屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含：(a)蛋白酶结构域；(b)经修饰接头区；以及(c)易位结构域；其中经修饰接头区包含蛋白酶切割位点。

在一些实施方案中，蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶(Sortase)、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。在一些实施方案中，经修饰接头区包含SEQ ID NO：41至47中任一种的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经修饰接头来自肉毒梭菌神经毒素。在一些实施方案中，经修饰接头区包含SEQ ID NO：48至55的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽还包含受体结合结构域。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：5至22中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：5至22中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：5至22中任一种的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽进入细胞。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。在一些实施方案中，SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP1。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP2。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP3。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-23。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-25。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白1B。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白4。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN在对应于SEQID NO：37中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

在一些实施方案中，细胞是分泌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽抑制神经元活动。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的细胞。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

本文中还提供了嵌合神经毒素多肽，其包含：(a)蛋白酶结构域；(b)易位结构域；以及(c)受体结合结构域；其中蛋白酶结构域和易位结构域来自屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)，并且其中受体结合结构域来自肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。

在一些实施方案中，蛋白酶结构域与易位通过接头区连接。在一些实施方案中，接头区包含CPNPHFSSQRGLSSC(SEQ ID NO：56)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头区包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。在一些实施方案中，接头区包含SEQ ID NO：41至47的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头区来自肉毒梭菌神经毒素。在一些实施方案中，接头区包含SEQ ID NO：48至55的氨基酸序列。在一些实施方案中，受体结合结构域来自BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X。在一些实施方案中，受体结合结构域来自BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/X。

在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽包含与SEQ ID NO：23至30中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽包含SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽由SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽进入细胞。在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。在一些实施方案中，SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP1。在一些实施方案中，嵌合神经毒素在对应于SEQ ID NO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP2。在一些实施方案中，嵌合神经毒素在对应于SEQ ID NO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是VAMP3。在一些实施方案中，嵌合神经毒素在对应于SEQ ID NO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-23。在一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-25。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白1。在一些实施方案中，嵌合神经毒素在对应于SEQ ID NO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。在一些实施方案中，SNARE蛋白是突触融合蛋白4。在一些实施方案中，嵌合神经毒素在对应于SEQ ID NO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

在一些实施方案中，细胞是分泌细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽抑制神经元活动。在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽诱导松弛性瘫痪。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是培养的细胞。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是大鼠。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。

在一些实施方案中，嵌合神经毒素多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

本文中还提供了核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合神经毒素多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。还提供了包含这样的核酸分子的核酸载体。提供了包含所述核酸分子或所述核酸载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合神经毒素多肽。

本公开内容的另一些方面提供了产生本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合神经毒素多肽的方法，所述方法包括在其中产生所述BoNT/EN多肽的条件下培养表达这些多肽的细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物中回收BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合神经毒素多肽。

本文中还提供了组合物，其包含本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合神经毒素多肽。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物还包含可药用载体。

药盒(kit)，其包含本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽、或嵌合神经毒素多肽、编码这样的多肽的核酸、包含这样的核酸的载体、细胞或者组合物。

本公开内容的另一些方面提供了治疗病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽、或嵌合神经毒素多肽、核酸、载体或者组合物以治疗所述病症。

在一些实施方案中，所述病症与过度活动的神经元或腺体相关。在一些实施方案中，所述病症选自：痉挛性发声障碍(spasmodic dysphonia)、痉挛性斜颈(spasmodictorticollis)、喉肌张力障碍(laryngeal dystonia)、口下颌发声困难(oromandibulardVsphonia)、舌肌张力障碍(lingual dystonia)、颈肌张力障碍(cervical dystonia)、局灶性手肌张力障碍(focal hand dystonia)、眼睑痉挛(blepharospasm)、斜视(strabismus)、偏侧面肌痉挛(hemifacial spasm)、眼睑疾病(eyelid disorder)、大脑性瘫痪(cerebral palsy)、局灶性痉挛状态(focal spasticity)和其他发声障碍(voicedisorder)、痉挛性结肠炎(spasmodic colitis)、神经源性膀胱(neurogenic bladder)、肛门痉挛(anismus)、肢体痉挛状态(limb spasticity)、抽搐(tic)、震颤(tremor)、夜磨牙症(bruxism)、肛裂(anal fissure)、失弛缓症(achalasia)、吞咽困难(dysphagia)和其他肌张力障碍(muscle tone disorder)以及特征为肌肉群不自主运动(involuntarymovement)的其他障碍、流泪(lacrimation)、多汗(hyperhydrosis)、过度流涎(excessivesalivation)、过度胃肠分泌(excessive gastrointestinal secretion)、分泌紊乱(secretory disorder)、肌痉挛引起的疼痛、头痛、皮肤病学或美学/美容病症(dermatological or aesthetic/cosmetic condition)、肥胖/食欲减退(obesiMreducedappetite)。在一些实施方案中，所述病症与不期望的神经元活动无关。在一些实施方案中，所述病症选自：银屑病(psoriasis)、变态反应(allergy)、嗜红细胞淋巴组织细胞增生症(haemophagocytic lymphohistiocytosis)和酒精性胰腺疾病(alcoholic pancreaticdisease)。在一些实施方案中，施用是通过注射至存在不期望的神经元活动的地方。

本公开内容的另一些方面提供了分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽、嵌合神经毒素多肽、核酸、载体或者组合物，其用于治疗与不期望的神经元活动相关的病症或用于医学。

本公开内容的另一方面提供了产生神经毒素多肽的方法，所述方法包括：i)获得包含重链的N端结构域(H_N)和轻链(LC)的第一神经毒素片段，其中第一神经毒素片段包含C端LPXTGG(SEQ ID NO：57)基序；ii)获得包含重链的C端结构域(H_C)的第二神经毒素片段；其中第二神经毒素片段在其N端包含特异性蛋白酶切割位点；iii)用特异性蛋白酶切割第二神经毒素片段，其中所述切割在N端产生游离的甘氨酸残基；以及iv)在存在转肽酶的情况下使第一神经毒素片段与来自(iii)的第二神经毒素片段接触，从而将第一神经毒素片段与第二BoNT/EN片段连接以形成连接的神经毒素。

在一些实施方案中，第一神经毒素片段还包含亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签与第一神经毒素片段在N端融合。在一些实施方案中，亲和标签与第一神经毒素片段在C端融合。在一些实施方案中，亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。在一些实施方案中，第二神经毒素片段还包含亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签与第二神经毒素片段在N端融合。在一些实施方案中，亲和标签与第二神经毒素片段在C端融合。在一些实施方案中，亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。在一些实施方案中，蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission(3C蛋白酶)、肠激酶和SUMO蛋白酶。在一些实施方案中，相应(cognate)蛋白酶是凝血酶。在一些实施方案中，第一神经毒素片段来自屎肠球菌。在一些实施方案中，第二神经毒素片段来自屎肠球菌。在一些实施方案中，第二神经毒素片段来自BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X。在一些实施方案中，转肽酶是定位酶。在一些实施方案中，e来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SrtA)。

附图说明

附图并非旨在按比例绘制。在附图中，在多个附图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，不是每个组件都可在每个附图中标出。在附图中：

图IA至1C.BoNT/EN与已知BoNT血清型的比较。(图1A)BoNT血清型的最大似然系统发生表明BoNT/EN形成了独特的谱系，与BoNT/X最紧密地进行分组。(图1B)上图：BoNT/EN的三个结构域的示意图。下图：显示BoNT/EN与其他BoNT之间的同一性百分比的滑动序列比较窗口(sliding sequence comparison window)。(图1C)BoNT/EN基因簇包含BoNT基因簇的其他标志，包括邻近的ntnh样基因以及上游orfX-样基因。与其他BoNT基因簇类似，该区两侧是假定的转座酶。

图2A至2G.BoNT/EN的LC在独特位点处切割VAMP1/2/3。(图2A)在具有或不具有EDTA的情况下将EN-LC与BDE一起孵育。进行免疫印迹分析以检测突触融合蛋白1(Syx 1)、SNAP-25和VAMP2。并行地分析A-LC和X-LC。通过X-LC切割VAMP2导致丧失免疫印迹信号，而通过A-LC切割SNAP-25产生仍可在免疫印迹上检测到的SNAP-25的较小片段。与EN-LC孵育导致丧失VAMP2免疫印迹信号。其还降低了Syx 1的信号。EDTA阻断了EN-、A-和X-LC的活性。(图2B)将VAMP2(第1至93位残基)纯化为His6标记的重组蛋白并与EN-LC一起孵育。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。EN-LC将VAMP2(1至93)转化为两个较小的片段，表明EN-LC切割VAMP2。(图2C)将VAMP2(1至93)与EN-LC一起孵育。然后通过质谱(LC-MS/MS)分析全蛋白样品以确定切割片段的精确分子量。对两种切割产物的质谱数据分别进行了颜色编码，其中对于每个信号标记了质荷比(mass-to-charge ratio，m/z)。通过用m乘以z，然后减去z来推出分子量。(图2D)VAMP家族成员之间的序列比对，其中BoNT/B、D、F、G、X、破伤风神经毒素(tetanus neurotoxin，TeNT)和En的切割位点用浅灰色标记。(图2E)HA标记的VAMP1、3、7和8，以及Myc标记的Sec22b和Ykt6通过瞬时转染在HEK293细胞中表达。将细胞裂解物与EN-LC一起孵育并进行检测HA或Myc标签的免疫印迹分析。肌动蛋白用作上样对照。EN-LC切割VAMP1和3，但不切割其他同种型。(图2F和2G)Syx 1A、1B、2、3、4，SNAP-23，SNAP-25和SNAP-29在HEK293细胞中表达。将细胞裂解物与EN-LC一起孵育并进行免疫印迹分析。EN-LC切割Syx 1B、Syx 4、SNAP-23和SNAP-25。

图3A至3C.BoNT/EN包含链间二硫键并切割神经元中的VAMP2和SNAP-25二者。(图3A)八个BoNT加上BoNT/EN的LC与HC之间的接头区的序列比对。为了实现对BoNT/EN的LC-H_N结构域更好的蛋白水解活化，将凝血酶切割位点插入到其接头区中。(图3B)用凝血酶处理BoNT/EN的LC-H_N并随后在有或没有DTT的情况下通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。(图3C)将培养的大鼠皮质神经元暴露于BoNT/EN的LC-H_N持续12小时。收获细胞裂解物并进行免疫印迹分析以检测Syx 1、SNAP-25和VAMP2。肌动蛋白用作上样对照。凝血酶活化的EN-LC-H_N比未活化的蛋白质更高效地切割SNAP-25和VAMP2。用识别N端区但不检测任何切割产物的CI71.1(SNAP-N)来检测SNAP-25。为了进一步确认SNAP-25的切割，使用识别SNAP-25的C端(第195至206位残基，SNAP-C)的第二抗体来检测C端切割片段(下图)。

图4A至4H.在培养的神经元上和在小鼠体内测试全长BoNT/EN。(图4A)使用定位酶连接方法合成全长BoNT/EN的示意图。(图4B)在有或没有DTT的情况下通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对定位酶连接反应混合物和指定的对照组分进行分析。分子量标志物在泳道1中(从左侧开始)。标记全长BoNT/EN(EN-FL)。在存在DTT的情况下，其分离成两个较小的条带，证实其已被活化。(图4C)在介质中暴露于相同量(15μl)的定位酶连接混合物或指定的对照组分12小时的培养的大鼠皮质神经元。通过免疫印迹分析细胞裂解物。与没有定位酶的EN-LC-H_N/EN-H_C混合物和单独的EN-LC-H_N相比，通过定位酶将EN-LC-H_N和EN-H_C连接在一起仅略微增强了VAMP2和SNAP-25的切割，因为以仅1∶1.75滴定定位酶连接的混合物就消除了任何增强作用。(图4D)将通过定位酶反应连接的EN-FL(1μg)注射到小鼠(N＝4)右后肢的腓肠肌中。没有观察到瘫痪。左侧肢体没有注射毒素，用作对照。(图4E)通过定位酶将EN-LC-H_N与A-H_C连接产生EN-A嵌合毒素，类似于产生EN-FL。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对定位酶连接混合物和指定的对照组分进行分析。(图4F)在介质中将大鼠皮质神经元中暴露于指定的对照组分或定位酶连接的EN-A混合物12小时。通过免疫印迹分析细胞裂解物。与在没有定位酶的情况下EN-LC-H_N与A-H_C连接的混合物相比，连接的EN-A导致VAMP2和SNAP-25的切割显著增强了约1,000倍。(图4G)将通过定位酶反应连接的EN-A(1ng)注射到小鼠(N＝4)右后肢的腓肠肌中。注射的肢体发生典型的松弛性瘫痪，并且脚趾在12小时内未伸展。(图4H)使用四种马抗血清(三价抗BoNT/A、B和E，抗BoNT/C，抗BoNT/DC和抗BoNT/F)，两种山羊抗血清(抗BoNT/G和抗BoNT/D)以及针对BoNT/X的兔多克隆抗血清对BoNT/A至G、BoNT/X和BoNT/EN进行斑点印迹分析(每种毒素0.2μg，点在硝酸纤维素膜上)。BoNT/EN由纯化的EN-LC-H_N和EN-H_C以1∶1的比例构成。这些抗血清识别其相应的靶毒素，但它们都不识别BoNT/EN。

图5A至5C.通过EN-LC鉴定GST-VAMP2(33至86)上的切割位点。(图5A)将GST标记的VAMP2(33至86)与或不与EN-LC一起孵育。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。(图5B和5C)将GST标记的VAMP2(33至86)与EN-LC一起孵育。然后通过LC-MS/MS质谱对样品进行分析。在图B中为由EN-LC产生的C端片段的质谱数据，并且在图C中为N端片段的质谱数据。

图6A至6F.EN-LC在保守位点处切割Syx 1B和Syx 4，但效率低。(图6A和6B)对重组的GST-VAMP2、Syx 1B和Syx 4进行纯化并与EN-LC一起孵育指定的时间。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。(图6C)将重组的Syx 1A、Syx 1B和Syx 4与高浓度的EN-LC一起孵育指定的时间。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色对样品进行分析。用星号标记切割产物。(图6D和6E)通过MS-LS/LS对Syx 1B(图6D)和Syx 4(图6E)的图C中所述的切割产物进行分析。(图6F)在BoNT/EN切割位点处的Syx 1A、1B和Syx 4的序列比对。BoNT/C切割位点也被标记。

图7A至7C.EN-LC在体外无法高效切割重组的SNAP-25和SNAP-23。(图7A和7B)将重组的SNAP-25和SNAP-23与低水平或高水平的EN-LC一起孵育指定的时间。低水平的EN-LC仅切割SNAP-25，而高水平的EN-LC产生多个切割条带。(图7C)在其N端具有HA的SNAP-25在HEK293细胞中表达。将细胞裂解物与EN-LC一起孵育并随后使用三种抗体：SNAP-N Ab、SNAP-C Ab和抗HA进行免疫印迹分析。只有SNAP-C Ab能够检测切割产物，其表示由EN-LC产生的SNAP-25的C端片段。

具体实施方式

肉毒梭菌神经毒素(BoNT)是最强效的细菌毒素家族和潜在的生物恐怖剂。BoNT仅已在梭菌属(Clostridium species)中被鉴定并且其进化起源仍然是谜。最近的研究揭示了在稻魏斯氏菌(Weissella oryzae，革兰氏阳性细菌)中的BoNT同源物^22，23。已表明，该同源物的LC是活性金属蛋白酶并且在体外条件下切割重组VAMP2。因此，该同源物已被暂且定名为BoNT/Wo²²。然而，BoNT/Wo与BoNT相差甚远。首先，BoNT/Wo与其他BoNT之间的序列同一性为仅约14％至16％，这远低于BoNT家族成员的正常范围(约30％至63％)。其次，形成BoNT中必需的二硫键的两个半胱氨酸在BoNT/Wo中是不保守的，表明其可具有不同的作用模式。第三，BoNT/Wo基因与任何典型的BoNT辅助蛋白都无关并且不在BoNT基因簇中。

在一些方面，本文中描述了存在于屎肠球菌细菌菌株中的质粒上的BoNT家族的新成员。该菌株最初分离自美国科德角地区(Cape Cod region)的牛粪便。2017年5月对其基因组进行了测序，揭示了存在于BoNT基因簇中的新的BoNT。其代表了在屎肠球菌(E.faecium)中鉴定的首个蛋白质毒素，以及在除梭菌属之外的细菌物种中的首个BoNT基因簇。新的毒素多肽与肉毒梭菌神经毒素(BoNT)家族具有序列同源性，并且在本文中定名为“BoNT/EN”。如本文中所表明的，BoNT/EN切割VAMP1/2/3，其是与BoNT/B、D、F、G和X相同的底物，但在新的位点(D68至L93，在VAMP2中)处。另外，BoNT/EN在体外条件下切割多种其他SNARE蛋白，包括SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1B和突触融合蛋白4，并在神经元内有效地切割SNAP-25。尽管BoNT/EN天然靶向的宿主种类/细胞类型仍有待确定，但BoNT/EN代表了在屎肠球菌中鉴定的首个蛋白质毒素。这些发现展示了屎肠球菌获得BoNT基因簇的能力，其可能对这样的在人和动物中适应良好的共生生物体造成显著的生物安全威胁并且是医院获得的多种抗生素抗性感染的首要原因。

术语“屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽”涵盖来自本文中所述的屎肠球菌神经毒素的任何多肽或片段。在一些实施方案中，术语BoNT/EN是指全长BoNT/EN。在一些实施方案中，术语BoNT/EN是指可执行BoNT/EN进入神经元和/或抑制神经递质释放的总细胞机制的BoNT/EN片段。在一些实施方案中，术语BoNT/EN仅指全长BoNT/EN或BoNT/EN片段的片段或变体，而不需要该片段或变体具有任何特定的功能或活性。例如，在一些实施方案中，BoNT/EN多肽是指BoNT/EN的轻链(LC)。在一些实施方案中，BoNT/EN多肽是指BoNT/EN的重链(HC)。

像其他BoNT一样，将BoNT/EN合成为包含通过接头区连接的重链(HC，在本文中称为“BoNT/EN-HC”)和轻链(LC，在本文中称为“BoNT/EN-LC”)的一种多肽(例如，在图1A中)，当BoNT/EN被加工成其成熟形式时在所述接头区处发生蛋白水解切割。BoNT/EN-LC包含切割BoNT/EN底物的蛋白酶结构域，而BoNT/EN-HC包含介导BoNT/EN进入细胞中的易位结构域和受体结合结构域。

本文中使用的术语“屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)蛋白酶结构域”与“BoNT/EN-LC”同义。该术语意指可执行中毒过程的酶促靶标修饰步骤的BoNT结构域。BoNT/EN蛋白酶结构域特异性地靶向BoNT/EN底物并进行肉毒梭菌(C.Botulinum)毒素底物(包括例如SNARE蛋白)的蛋白水解切割。在BoNT/EN中，蛋白酶结构域或LC对应于BoNT/EN的约第1至433位氨基酸。结构域边界可变化约25个氨基酸。例如，蛋白酶结构域可对应于BoNT/EN的第1至408或1至458位氨基酸。在一些实施方案中，蛋白酶结构域对应于BoNT/EN的第1至433、1至432、1至431、1至430、1至429、1至428、1至427、1至426、1至425、1至424、1至434、1至435、1至436、1至437、1至438、1至439、1至440、1至441、1至442、1至443或1至444位氨基酸。

本文中使用的术语“屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)易位结构域”与“BoNT/EN-H_N结构域”同义并且意指可执行中毒过程的易位步骤(其介导BoNT轻链易位)的BoNT/EN结构域。“H_N”是指BoNT/EN的重链的N端。H_N结构域有助于BoNT/EN轻链移动穿过膜进入到细胞的细胞质中。

本文中使用的术语“接头区”是指BoNT/EN蛋白酶结构域(LC)与易位结构域(H_N)之间的氨基酸序列。BoNT/EN接头区在第424和438位包含两个半胱氨酸，所述半胱氨酸在LC与HC之间以BoNT/EN的成熟形式形成分子间二硫键，这种二硫键的形成对于BoNT/EN的活性是必不可少的。与其他BoNT(例如，BoNT/A、BoNT/B或BoNT/X)的接头区不同，BoNT/EN的接头区不包含赖氨酸。本文中还考虑了BoNT/EN接头区的修饰，其中将蛋白酶切割位点插入到BoNT/EN接头区以有助于其加工。

本文中使用的术语“BoNT/EN-LC-H_N”是指涵盖蛋白酶结构域、接头区和易位结构域的BoNT/EN多肽。LC-H_N多肽被认为对应于BoNT/EN的约第1至862位氨基酸。结构域边界可变化约25个氨基酸。例如，BoNT/EN-LC-H_N多肽可对应于BoNT/EN的约第1至837或1至887位氨基酸。在一些实施方案中，LC-H_N多肽可对应于BoNT/EN的第1至862、1至863、1至864、1至865、1至866、1至867、1至868、1至869、1至870、1至871、1至861、1至860、1至859、1至858、1至857、1至856、1至855、1至854、1至853或1至852位氨基酸。

本文中使用的术语“屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)受体结合结构域”与“BoNT/EN-H_C结构域”同义并且意指执行中毒过程的细胞结合(包括例如BoNT-EN与位于靶细胞质膜表面上的BoNT/EN特异性受体系统的结合)步骤的结构域。受体结合结构域或H_C被认为对应于BoNT/EN的约第863至1279位氨基酸。结构域边界可变化约25个氨基酸。例如，受体结合结构域或H_C可对应于BoNT/EN的第838至1279或888至1279位氨基酸。在一些实施方案中，受体结合结构域或H_C可对应于BoNT/EN的第863至1279、864至1279、865至1279、866至1279、867至1279、868至1279、869至1279、700至1279、701至1279、702至1279、862至1279、861至1279、860至1279、859至1279、858至1279、857至1279、856至1279、855至1279、854至1279或853至1279位氨基酸。

在一些方面，本公开内容提供了分离的BoNT/EN多肽。“分离的”意指对于在天然状态下存在的通常与其相伴的组分具有不同游离度的物质(例如，核酸或蛋白质)。“分离”表示与原始来源或周围环境的分隔度(degree of separation)，例如，与细胞或与物质(例如，核酸或蛋白质)的天然来源的分隔度。分离的多肽是指多肽相对于制剂的其他组分(例如，其他多肽)而言是“基本上纯的”。例如，在一些实施方案中，其是指多肽相对于其他组分而言是至少约50％、60％＞、70％＞或75％、优选至少约85％、更优选至少约90％、并且最优选至少约95％纯的。在一些实施方案中，分离的多肽是指包含少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％，或少于1％的一种或更多种其他组分(例如，其他多肽或细胞组分)的多肽制剂。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽是全长BoNT/EN多肽，并且包含与SEQ IDNO：1(参见表1)具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的BoNT/EN多肽可包含与SEQID NO：1具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：1具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽是BoNT/EN轻链(LC)多肽，并且包含与SEQID NO：2(参见表1)具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的BoNT/EN多肽可包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ IDNO：2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

可通过本领域中任何已知的表达外源蛋白质的技术(例如，通过慢病毒载体、通过AAV载体将LC编码序列直接转染到细胞中，或将BoNT/EN-LC与细胞穿透肽融合)将BoNT/EN-LC多肽单独引入到其中出于研究或治疗目的期望切割BoNT底物(例如，SNARE蛋白)的细胞中。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽是包含BoNT/EN的轻链和易位结构域的BoNT/EN-LC-H_N多肽。易位结构域是重链的N端一半。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：3(参见表1)具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的BoNT/EN多肽可包含与SEQ ID NO：3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽是BoNT/EN的受体结合结构域，其是BoNT/EN重链多肽的C端一半。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：4(参见表1)具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，分离的BoNT/EN多肽可包含与SEQ ID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：4具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

使用在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993中修改的Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990的算法来确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。这样的算法被并入到Altschul，等J.Mol.Biol.215：403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位时，可如Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数(default parameter)。

本公开内容的另一些方面提供了经修饰BoNT/EN多肽，其包含：(a)蛋白酶结构域；(b)经修饰接头区；以及(c)易位结构域；其中经修饰接头区包含蛋白酶切割位点。“经修饰BoNT/EN”涵盖了在氨基酸序列中包含任何修饰(例如，截短、添加、氨基酸替换及其任何组合)的BoNT。在一些实施方案中，连接BoNT/EN的轻链和重链的接头区被修饰。

如本文中所述，BoNT/EN的天然接头区包含两个半胱氨酸并且在两个半胱氨酸之间存在13个残基，这一长度类似于其他BoNT中的接头区。然而，与其他BoNT不同，BoNT/EN接头不包含任何赖氨酸。由于可有效活化BoNT/EN的内源性蛋白酶仍然未知，因此可在BoNT/EN接头区中插入针对位点特异性蛋白酶(例如，凝血酶)的切割位点，作为蛋白水解分离EN-LC和H_N的方式(例如，参见图3A)。经修饰BoNT/EN可被切割位点插入到接头区中的位点特异性蛋白酶蛋白水解活化。根据本公开内容可使用的位点特异性蛋白酶的一些非限制性实例包括：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。表2中提供了位点特异性蛋白酶的切割位点序列。另外，经修饰BoNT/EN的经修饰接头区包含SEQ ID NO：41至47的氨基酸序列。

在一些实施方案中，BoNT/EN的接头区被来自肉毒梭菌神经毒素(BoNT)，例如BoNT血清型A(BoNT/A)、BoNT血清型B(BoNT/B)或BoNT血清型X(BoNT/X，如在Zhang等，NatureCommunications，8，Article number：14130(2017)中所述，通过引用并入本文)的接头区替代。表2中提供了其他BoNT的天然存在的接头区。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN的经修饰接头区包含SEQ ID NO：48至55的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN是在LC与HN之间具有经修饰接头区的经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽包含与SEQ ID NO：5至13(参见表3)中任一种具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽可包含与SEQ ID NO：5至13中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽包含与SEQ ID NO：5至13中任一种具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽包含SEQ ID NO：5至13中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN-LC-H_N多肽由SEQ ID NO：5至13中任一种的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN多肽还包含受体结合结构域。在一些实施方案中，受体结合结构域也来自BoNT/EN。因此，经修饰BoNT/EN是包含如本文中所述的经修饰接头区的经修饰全长BoNT/EN多肽。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽包含与SEQID NO：14至22(参见表3)中任一种具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰全长BoNT/EN多肽可包含与SEQ ID NO：14至22中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽包含与SEQ ID NO：14至22中任一种具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：14至22中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：14至22中任一种的氨基酸序列组成。

本公开内容的另一些方面提供了嵌合毒素，其包含：(a)蛋白酶结构域；(b)易位结构域；以及(c)受体结合结构域；其中蛋白酶结构域和易位结构域来自屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)，并且其中受体结合结构域来自肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。例如，本文中所述的嵌合毒素可包含BoNT/EN-LC-H_N多肽和来自BoNT的受体结合结构域(H_C)，所述BoNT选自但不限于：BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和BoNT/X。在一些实施方案中，BoNT/EN-LC-H_N多肽可以是未经修饰的或经修饰的(例如，包含如本文中所述的经修饰接头区)。例如，在一些实施方案中，未经修饰BoNT/EN-LC-H_N包含含有PNPHFSSQRGLSS(SEQ ID NO：56)的氨基酸序列的接头区。在一些实施方案中，经修饰BoNT/EN-LC-H_N包含含有SEQ ID NO：41至55中任一种的氨基酸序列的接头区。

在一些实施方案中，嵌合毒素包含与SEQ ID NO：23至30(参见表4)中任一种具有至少85％同一性的氨基酸序列。例如，经修饰全长BoNT/EN多肽可包含与SEQ ID NO：23至30中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽包含与SEQ IDNO：23至30中任一种具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽包含SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰全长BoNT/EN多肽由SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列组成。

为了产生嵌合毒素，例如BoNT/EN-LC-H_N-A1-H_C毒素，将BoNT/EN-LC-H_N片段(具有或不具有经修饰接头区)与BoNT/A(例如，BoNT/A1或BoNT/A2)、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G中任一个的受体结合结构域(H_C)融合。本领域技术人员熟悉产生融合蛋白的方法，例如使用重组DNA技术。

本公开内容的另一些方面提供了BoNT/EN多肽的功能表征。本公开内容的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合BoNT多肽可结合并且进入靶细胞(例如，神经元)并切割其底物蛋白质，例如SNARE蛋白。本文中使用的术语“SNARE蛋白”是指SNAP(可溶性NSF附着蛋白(Soluble NSF Attachment Protein))受体，其是在酵母和哺乳动物细胞中由多于60个成员组成的大的蛋白质超家族。SNARE蛋白的主要作用是介导囊泡融合，即囊泡与其靶膜结合区室(例如溶酶体)的融合。研究最充分的SNARE蛋白是介导神经元中突触囊泡与突触前膜对接的那些，例如SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7、VAMP8、突触融合蛋白1和Ykt6。这些SNARE蛋白中的数种是BoNT的底物。例如，已表明VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25和突触融合蛋白1被已知的BoNT(例如BoNT/A和BoNT/B)切割。本文中表明BoNT/EN切割至少VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。

当用于描述BoNT/EN多肽的作用时，术语“进入细胞”涵盖BoNT/EN与细胞的结合、毒素的内在化、毒素轻链进入细胞质中的易位和BoNT底物(例如，SNARE蛋白)的酶促修饰。

本公开内容的另一个出乎意料的发现是BoNT/EN在先前未描述的新的位点切割VAMP蛋白(例如，VAMP1、VAMP2或VAMP3)。在本文中发现BoNT/EN在VAMP1(SEQ ID NO：31)的A69和D70氨基酸之间、在VAMP2(SEQ ID NO：32)的A67和D68氨基酸之间以及在VAMP3(SEQID NO：33)的A54和D55氨基酸之间切割。在一些实施方案中，BoNT/EN在突触融合蛋白1B(SEQ ID NO：37)的M182和D183氨基酸之间切割，并且在突触融合蛋白4(SEQ ID NO：38)的K191和D192氨基酸之间切割。

在一些实施方案中，本公开内容的BoNT/EN多肽切割靶细胞中的SNARE蛋白。本文中使用的“靶细胞”意指BoNT/EN能够进入或使其中毒的天然存在的细胞的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是分泌细胞，例如神经元或分泌性免疫细胞。可以是BoNT靶细胞的神经元的一些实例包括但不限于运动神经元；感觉神经元；自主神经元；例如如交感神经元和副交感神经元；非肽能神经元，例如如胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、血清素能神经元、GABA能神经元；以及肽能神经元，例如如物质P神经元、降钙素基因相关肽神经元、血管活性肠肽神经元、神经肽Y神经元、缩胆囊素神经元。

本公开内容的BoNT/EN多肽能够靶向除神经元之外的其他类型的分泌细胞。在一些实施方案中，由BoNT/EN多肽靶向的分泌细胞是分泌性免疫细胞。本文中使用的“分泌性免疫细胞”是指分泌细胞因子、趋化因子或抗体的免疫细胞。这样的分泌性免疫细胞可以是固有免疫细胞，包括但不限于自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。本公开内容的BoNT多肽也可靶向分泌抗体的分泌性免疫细胞(例如，白细胞)。抗体分泌细胞的非限制性实例包括但不限于血浆B细胞、浆细胞(plasmocyte)、浆细胞(plasmacyte)和效应B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是培养的细胞，例如培养的神经元或培养的分泌性免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是体内的。在一些实施方案中，靶细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在实施方案中，哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，靶细胞是昆虫细胞。

在一些实施方案中，BoNT/EN多肽抑制神经元活动。“抑制神经元活动”意指当使神经元细胞(由BoNT/EN靶向的细胞类型之一)与BoNT/EN接触时，其活动(例如，传递神经元信号中的活动)与没有BoNT/EN相比降低了至少20％。例如，当与BoNT/EN接触时，神经元细胞的活动与没有BoNT/EN相比可降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，当与BoNT/EN接触时，神经元细胞的活动与没有BoNT/EN相比降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

在一些实施方案中，BoNT多肽诱导松弛性瘫痪。“松弛性瘫痪”是指临床表现的特征为无力或瘫痪并且肌张力降低而没有其他明显原因(例如，创伤)。

在一些实施方案中，BoNT多肽调节免疫应答。“调节免疫应答”意指当分泌性免疫细胞与BoNT/EN接触时，其活性(例如，产生免疫应答中的活性)与没有BoNT/EN相比变化(例如，降低)了至少20％。例如，当与BoNT/EN接触时，分泌性免疫细胞的活性与没有BoNT/EN相比可变化(例如，降低)了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，当与BoNT/EN接触时，分泌性免疫细胞的活性与没有BoNT/EN相比变化(例如，降低)了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

在一些实施方案中，BoNT/EN多肽与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体具有降低的反应性。“具有降低的反应性”意指与BoNT(例如，血清型A、B、C、D、E、F、G或X)与针对这样的BoNT的抗体之间的反应性相比，BoNT/EN与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体之间的反应性降低了至少20％。例如，与BoNT(例如，血清型A、B、C、D、E、F、G或X)与针对这样的BoNT的抗体之间的反应性相比，BoNT/EN与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F或G的抗体之间的反应性可降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。在一些实施方案中，与BoNT(例如，血清型A、B、C、D、E、F、G或X)与针对这样的BoNT的抗体之间的反应性相比，BoNT/EN与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体之间的反应性降低了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。在一些实施方案中，BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

本公开内容的另一些方面提供了编码本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合毒素的核酸。编码本公开内容的分离的多肽片段的核酸可以是双链或单链的DNA或RNA。在某些方面，编码分离的多肽片段的主题核酸进一步理解为包含编码本文中所述的任一个经修饰BoNT多肽之变体的多肽的核酸。

变体核苷酸序列包括通过一个或更多个核苷酸替换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。在一些实施方案中，核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合毒素具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容的分离的核酸分子包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQID NO：1至30中任一种具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，可将这样的核酸并入到载体(例如，克隆载体或表达载体)中。在一些实施方案中，载体可适于在细胞(例如，细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达编码的多肽。

在一些实施方案中，编码BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合毒素的多核苷酸与启动子可操作地连接。多种启动子可用于表达本文中所述的多肽，包括但不限于巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)中间早期启动子(intermediate early promoter)、病毒LTR(例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、大肠杆菌(E.coli)lac UV5启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。还可使用可调节启动子。这样的可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节子来调节来自携带lac操纵基因(lac operator)的哺乳动物细胞启动子的转录的那些[Brown，M.等，Cell，49：603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些[Gossen，M.，和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao，F.等，Human Gene Therapy，9：1939-1950(1998)；Shockelt，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。

其他系统包括FK506二聚体、使用astradiol、RU486、diphenol murislerone的VP16或p65或雷帕霉素(rapamycin)。可诱导的系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad获得。可使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌(Escherichia coli)的lac阻遏物可作为转录调节子发挥作用以调节来自携带lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等，Cell，49：：603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen等，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP16)，与来源于人巨细胞病毒(HCMV)主要立即早期启动子的携带tetO的最小启动子组合以产生tetR-tet操纵基因系统从而控制在哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关(Yao等，Human Gene Therapy；Gossen等，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Shockett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995))。

另外，载体可包含例如以下的一些或全部：选择标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平的转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于合适的附加体复制(episomal replication)的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(internal ribosome binding site，IRES)、多功能多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。合适载体和用于产生包含转基因之载体的方法是本领域中公知且可获得的。

可通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含核酸的表达载体转移至宿主细胞，并随后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文中所述的多肽。在一些实施方案中，本文中所述多肽的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子的调节。

还提供了包含核酸或核酸载体的细胞，以及表达本文中所述的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合毒素的细胞。本文中所述的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合毒素通常将通过在合适的细胞(例如，大肠杆菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达形成重组核酸来产生并分离。

用于表达本文中所述的分离的多肽的宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌)，或优选真核细胞。特别地，与例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体联合的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等(1986)“Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For MammalianExpression Vectors，”Gene 45：101-106；Cockett等(1990)“High Level Expression OfTissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells UsingGlutamine Synthetase Gene Amplification，”Biotechnology 8：662-667)。多种宿主表达载体系统可用来表达本文中所述的分离的多肽。这样的宿主表达系统代表可通过其产生和随后纯化本文中所述的分离的多肽的编码序列的载剂，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文中所述的分离的多肽的细胞。这些包括但不限于用含有本文中所述的分离的多肽的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有编码本文中所述的分离的多肽的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，Saccharomyces pichia)；用含有编码本文中所述的分离的多肽的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有编码本文中所述的分离的多肽的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus，TMV))感染的或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利No.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)，所述重组表达构建体包含来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒(vaccinia virus)7.5K启动子)。

在细菌系统中，根据所表达的多肽的预期用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生本文中所述的多肽的药物组合物，可期望指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther等(1983)“Easy Identification OfcDNA Clones，”EMBO J.2：1791-1794)，其中编码序列可单个地连接到载体中并与lac Z编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of EscherichiaColi，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等(1989)“Expression Of HumanAsparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等。pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。

设计pGEX载体以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可从GST部分(GST moiety)中释放。在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。在其中使用腺病毒作为表达载体的情况下，目的编码序列可连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列(tripartite leader sequence)。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区)将产生重组病毒，其可存活并且能够在受感染的宿主中表达免疫球蛋白分子(例如，参见Logan等(1984)“Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAsLate After Infection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。为了高效翻译插入的抗体编码序列，还可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所期望编码序列的阅读框同相(in phase)，以确保整个插入片段(insert)的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源，天然的和合成的二者。

通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可增强表达效率(参见Bitter等(1987)“Expression And Secretion Vectors For Yeast，”Methods in Enzymol.153：516-544)。另外，可选择调节插入序列的表达，或以所期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可以是重要的。例如，在某些实施方案中，本文中所述的多肽可表达为单基因产物(例如，作为单多肽链，即作为多蛋白前体(polyprotein precursor))，这需要通过天然或重组细胞机制进行蛋白水解切割以形成本文中所述的单独多肽。

因此，本公开内容涵盖工程改造核酸序列以编码包含本文中所述的多肽的多蛋白前体分子，其包含能够指导所述多蛋白前体的翻译后切割的编码序列。多蛋白前体的翻译后切割产生本文中所述的多肽。包含本文中所述的多肽的前体分子的翻译后切割可在体内发生(即，在宿主细胞内通过天然或重组细胞系统/机制，例如在适当位点的弗林蛋白酶(furin)切割)，或可在体外发生(例如，在包含已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知促进所期望的蛋白水解作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。

重组蛋白的纯化和修饰是本领域中公知的，使得多蛋白前体的设计可包括技术人员容易理解的许多实施方案。本领域中已知的任何已知蛋白酶或肽酶均可用于前体分子的所述修饰，所述前体分子例如凝血酶或因子Xa(Nagai等(1985)“Oxygen BindingProperties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA82：7252-7255，并在Jenny等(2003)“A Critical Review Of TheMethods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa，”ProteinExpr.Purif.31：1-11中进行了综述，其各自通过引用整体并入本文)、肠激酶(Collins-Racie等(1995)“Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic SubunitIn Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA，”Biotechnology 13：982-987其通过引用在此整体并入本文)、弗林蛋白酶、和AcTEV(Parks等(1994)“Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using ARecombinant Plant Virus Proteinase，”Anal.Biochem.216：413-417，其通过引用在此整体并入本文)以及口蹄疫病毒蛋白酶C3。

不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于正确加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。

对于重组蛋白的长期高产率产生，优选稳定表达。例如，可工程改造稳定表达本文中所述多肽的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，而是可以用适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择标志控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，可使工程改造细胞在富集培养基中生长1至2天，并随后转换至选择性培养基。重组质粒中的选择标志赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长以形成灶(foci)，其进而可被克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于工程改造表达本文中所述多肽的细胞系。这样的工程改造细胞系可特别地用于筛选和评价与本文中所述多肽直接或间接相互作用的多肽。

可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等(1977)“Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured MouseCells，”Cell 11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等(1992)“UseOf The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-MediatedTransformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing HybridomaTechniques And Gene Therapy，”Bioessays 14：495-500)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster aprt Gene，”Cell 22：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等(1980)“Transformation OfMammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O′Hare等(1981)“Transformation Of MouseFibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing AProkaryotic Dihydrofolate Reductase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等(1981)“Selection For Animal Cells ThatExpress The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current TrialsAnd Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science OfGene Therapy，”Science 260：926-932；以及Morgan等(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells，”Gene 30：147-156)。可使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编辑)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12和13章，Dracopoli等(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin等(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker ForHigher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14中。

本文中所述多肽的表达水平可通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，NewYork，1987)。当表达本文中所述多肽的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与本文中所述多肽的核苷酸序列或本文中所述的多肽相关，多肽的产生也将提高(Crouse等(1983)“Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate ReductaseMinigenes，”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。

一旦重组表达本文中所述的多肽，可通过本领域中已知的用于纯化多肽、多蛋白或抗体的任何方法(例如，类似于基于抗原选择性的抗体纯化方案)，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对特异性抗原的亲和力(任选地在其中多肽包含Fc结构域(或其部分)的蛋白A选择之后)和尺寸柱色谱法(sizing column chromatography))、离心、差异溶解度，或通过用于纯化多肽或抗体的任何其他标准技术。本公开内容的另一些方面涉及包含本文中所述核酸或本文中所述载体的细胞。

所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本文中描述了示例性细胞类型。本公开内容的另一些方面涉及表达本文中所述的经修饰BoNT多肽的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。本文中描述了示例性细胞类型。细胞可用于核酸的扩增(propagation)或用于核酸的表达，或这二者。这样的细胞包括但不限于原核细胞，包括但不限于需氧、微需氧、嗜二氧化碳的(capnophilic)、兼性、厌氧的菌株，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞，例如来源于例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚梭菌(Clostridiaperfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningirulls)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)的那些；以及真核细胞，包括但不限于酵母菌株，例如如来源于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的那些；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，例如如来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些；以及哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，例如如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类和人的那些。细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)获得。用于选择、制备和使用合适细胞系的特定方案的一些非限制性实例描述于例如INSECT CELLCULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编辑，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELLCULTURES：FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等编辑，Kluwer AcademicPublishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OF CELLCULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORYPROCEDURES(Alan Doyle等编辑，John Wiley and Sons，1998)；R.Ian Freshney，CULTUREOF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4补充版.2000)；ANIMALCELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John R.W Masters编辑，Oxford UniversityPress，第3补充版.2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASICCELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2补充版.2002)；以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)中。

这些方案是本领域技术人员范围内和根据本文中教导的常规操作。本公开内容的另一些方面涉及产生本文中所述多肽的方法，所述方法包括获得本文中所述的细胞并在所述细胞中表达本文中所述的核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和纯化本文中所述的多肽。

在一些实施方案中，肉毒神经毒素可通过在发酵罐中建立和培养肉毒梭菌培养物并随后根据已知操作收获和纯化经发酵混合物来获得。所有肉毒毒素血清型最初都被合成为无活性单链蛋白，其必须被蛋白酶切割或切开以变得具有神经活性。

制造肉毒毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，并因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反，肉毒毒素血清型C、D和E由非蛋白水解菌株合成，并因此当从培养物中回收时通常是无活性的。血清型B和F由蛋白水解和非蛋白水解菌株二者产生，并因此可以以活性或无活性形式回收。产生例如B型肉毒毒素血清型的蛋白水解菌株可仅切割一部分所产生的毒素。本文中考虑了使用这些菌株产生BoNT/EN多肽。

带切口与未带切口的分子的确切比例取决于孵育的长度和培养物的温度。因此，一定百分比的例如B型毒素肉毒毒素的制备物可以是无活性的。在一个实施方案中，本公开内容的神经毒素处于活性状态。在一个实施方案中，神经毒素处于无活性状态。在一个实施方案中，考虑了活性和无活性神经毒素的组合。

本公开内容的一个方面提供了通过连接两个无毒BoNT片段的体外转肽酶反应产生全长BoNT/EN多肽(在接头区中有或没有修饰)或嵌合毒素的替代方法。这样的方法包括以下步骤：(i)获得包含重链的N端结构域(H_N)和轻链(LC)的第一BoNT片段，其中第一BoNT片段包含C端LPXTGG基序；(ii)获得包含重链的C端结构域(H_C)的第二BoNT片段；其中第二BoNT片段在其N端包含特异性蛋白酶切割位点；(iii)用特异性蛋白酶切割第二BoNT片段，其中所述切割在N端产生游离的甘氨酸残基；以及(iv)在存在转肽酶的情况下，使第一BoNT片段与第二BoNT片段接触，从而将第一BoNT片段与第二BoNT片段连接以形成连接的BoNT。

在一些实施方案中，第一BoNT片段包含与C端LPXTGG基序(例如，SEQ ID NO：57)或其任何变体融合的本文中所述的BoNT/EN-LC-H_N多肽。在一些实施方案中，第二BoNT片段包含本文中所述的H_C多肽或其任何变体(例如，SEQ ID NO：4)。应理解，可使用本文中所述的方法连接任何BoNT片段或结构域。

本文中所述的方法也可用于产生嵌合毒素。例如，第一BoNT片段可来自BoNT/EN，而第二BoNT片段可来自BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X。本领域技术人员将能够辨别可进行的组合。

在一些实施方案中，转肽酶是定位酶。在一些实施方案中，定位酶来自金黄色葡萄球菌(SrtA)。

本领域中可用的其他肽连接系统也可用于连接两个无毒BoNT片段。例如，内含肽介导的蛋白质连接反应允许通过天然肽键将合成肽或具有N端半胱氨酸残基的蛋白质连接至经细菌表达的蛋白质的C端(Evans等，(1998)Protein Sci.7，2256-2264，Dawson等，(1994)Science266，776-779；Tam等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，12485-12489，Muir等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，6705-6710；Severinov和Muir(1998)J.Biol.Chem.273，16205-16209，其全部内容通过引用并入本文)。用于内含肽介导的蛋白质连接反应的试剂盒可商购获得(例如，来自New England Biolabs)。

在一些实施方案中，第一BoNT片段还包含亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签与第一BoNT片段在N端融合。在一些实施方案中，亲和标签与第一BoNT片段在C端融合。在亲和标签与第一BoNT片段的C端融合的情况下，转肽酶在LPXTGG基序中的T与G之间切割并除去亲和标签，然后将第一BoNT片段与第二BoNT片段连接。

在一些实施方案中，第二BoNT片段还包含亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签与第一BoNT片段在N端融合。在一些实施方案中，亲和标签与第二BoNT片段在C端融合。在亲和标签与第一BoNT片段的N端融合的情况下，特异性蛋白酶在特异性蛋白酶切割位点处切割并除去亲和标签，然后通过转肽酶将第一BoNT片段与第二BoNT片段连接。

本文中使用的“亲和标签”是指可与物质或部分特异性结合的多肽序列，例如包含与Ni²⁺特异性结合的六个组氨酸的标签。可将亲和标签附加至蛋白质以有助于其分离。亲和标签通常通过本领域技术人员已知的重组DNA技术与蛋白质融合。使用亲和标签来有助于蛋白质分离也是本领域中公知的。根据本公开内容可使用的合适的亲和标签包括但不限于His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Soffag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

第二BoNT片段在N端具有特异性蛋白酶切割。通过特异性蛋白酶切割位点导致在第二BoNT片段的N端的游离甘氨酸残基。根据本公开内容可使用的合适的特异性蛋白酶包括但不限于：凝血酶、TEV、PreScission、肠激酶和SUMO蛋白酶。在一些实施方案中，特异性蛋白酶是凝血酶，并且切割位点是：LVPR|GS(SEQ ID NO：41)。

本文中所述的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽和嵌合毒素提供了治疗用途的潜力。例如，在一些实施方案中，与其他BoNT血清型相比，BoNT/EN更强效。在另一些实施方案中，BoNT/EN更通用并且由于其能够切割比其他BoNT血清型更多的底物，因此可在很多种细胞中更有效。

因此，本公开内容还提供了包含本文中所述的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽或嵌合毒素的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。如在后面的本公开内容中也变得清楚的，所述药物组合物还可包含适合于这种组合物被设计用于治疗的特定疾病的其他治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含可药用载体。

本文中使用的术语“可药用载体”意指可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)、或参与将多肽从身体的一个部位(例如，递送部位)携带或运输至另一个部位(例如，器官、组织或身体的一部分)的溶剂包封材料。

可药用载体在与制剂的其他成分相容方面是“可接受的”并且对对象的组织无害(例如，生理学相容的、无菌的、生理pH等)。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可豆脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇类，例如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。制剂中也可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。术语例如“赋形剂”、“载体”、“可药用载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方案中，组合物中本公开内容的BoNT多肽通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜(sialastic membrane)或纤维。

通常来说，当施用所述组合物时，使用本公开内容的多肽不吸收的材料。在另一些实施方案中，本公开内容的多肽在控释系统中递送。这样的组合物和施用方法在美国专利公开No.2007/0020295中提供，其内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，可使用泵(参见例如Langer，1990，Science 249：1527-1533；Sefton，1989，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。(参见例如MedicalApplications of Controlled Release(Langer和Wise编辑，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance(Smolen和Ball编辑，Wiley，New York，1984)；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61。另参见Levy等，1985，Science 228:190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105.)。其他控释系统在例如Langer(同上)中讨论。

本公开内容的多肽可作为药物组合物施用，所述药物组合物包含治疗有效量的黏合剂和一种或更多种药学上相容的成分。在一些典型的实施方案中，药物组合物根据常规操作配制成适合于向对象(例如，人)进行静脉内或皮下施用的药物组合物。

通常来说，通过注射施用的组合物是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常来说，成分单独地或混合在一起，以单位剂量形式在表明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小袋(sachette))中(例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物)供应。当药物通过输注施用时，其可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当药物通过注射施用时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便可在施用之前将各成分混合。用于全身施用的药物组合物可以是液体，例如无菌盐水、乳酸林格液或汉克氏液(Hank’s solution)。另外，药物组合物可以是固体形式并且在使用前立即再溶解或混悬。还考虑了冻干形式。药物组合物可包含在脂质颗粒或囊泡例如脂质体或微晶内，其也适用于肠胃外施用。颗粒可以是任何合适的结构，例如单层或多层，只要其中包含组合物即可。

本公开内容的多肽可包埋在含有促融性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、低水平(5mol％至10mol％)的阳离子脂质的‘稳定化质粒-脂质颗粒’(stabilized plasmid-lipidparticle，SPLP)中，并通过聚乙二醇(PEG)包衣稳定化(Zhang Y.P.等，Gene Ther.1999，6：1438-47)。带正电荷的脂质(例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵或“DOTAP”)特别优选地用于这样的颗粒和囊泡。这样的脂质颗粒的制备是公知的。参见例如，美国专利No.4,880,635、4,906,477、4,911,928、4,917,951、4,920,016和4,921,757。例如，本公开内容的药物组合物可作为单位剂量施用或包装。

当用于提及本公开内容的药物组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于对象的单位剂量的物理上离散的单元，每个单元包含预定量的经计算与所需稀释剂(即，载体或载剂)联合产生所期望治疗效果的活性物质。在一些实施方案中，本文中所述的多肽(例如，经修饰或未经修饰BoNT/EN或嵌合毒素)可与治疗性部分(例如抗生素)缀合。用于将这样的治疗性部分与多肽(包括例如Fc结构域)缀合的技术是公知的；参见例如Amon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，1985，第243-56页，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，1987，第623-53页，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，inMonoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，1985，第475-506页)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，1985，第303-16页，Academic Press；以及Thorpe等(1982)“The Preparation And Cytotoxic PropertiesOfAntibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-158。此外，药物组合物可作为药盒(pharmaceutical kit)提供，所述药盒包含(a)含有冻干形式的本公开内容的多肽的容器和(b)含有用于注射的可药用稀释剂(例如，无菌水)的第二容器。可药用稀释剂可用于重构或稀释本公开内容的冻干多肽。任选地，这样的容器可伴随具有由管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知反映了该机构对用于人施用的生产、使用或销售的批准。在另一方面，包括含有可用于治疗上述疾病的物质的制品。在一些实施方案中，制品包括容器和标签。

合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器容纳有效治疗本文中所述疾病的组合物并且可具有无菌进入口。例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是本公开内容的分离的多肽。在一些实施方案中，容器上或与容器相关联的标签表明该组合物用于治疗所选择的疾病。所述制品还可包含第二容器，所述第二容器包含可药用缓冲液，例如磷酸缓冲盐水、林格液或葡萄糖溶液。其还可包含从商业和使用者的角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插件(package insert)。

BoNT/EN多肽(经修饰或未经修饰)、嵌合毒素、编码这些多肽的核酸或包含这样的多肽的组合物的用途可以是用于医学。在一些实施方案中，BoNT/EN多肽(经修饰或未经修饰)、嵌合毒素、编码这些多肽的核酸或包含这样的多肽的组合物用于治疗与不期望的神经元活动相关的病症。

因此，本文中还提供了治疗与不期望的神经元活动相关的病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的经修饰或未经修饰BoNT/EN、或嵌合毒素多肽、或者包含这些的药物组合物从而治疗所述病症。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰或未经修饰BoNT/EN、或嵌合毒素多肽或药物组合物与表现出不期望的神经元活动的一个或更多个神经元接触。

通常用神经毒素治疗的病症(例如，骨骼肌病症、平滑肌病症、腺体病症、神经肌肉病症、自主神经病症、疼痛或美学/美容病症)与不期望的神经元活动相关，如技术人员所确定的。通过使有效量的组合物与表现出不期望活性的神经元相接触的途径施用。在一些实施方案中，所述病症可与过度活动的神经元或腺体相关。考虑通过本文中讨论的方法进行治疗的具体病症包括但不限于：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发声困难、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、偏侧面肌痉挛、眼睑疾病、大脑性瘫痪、局灶性痉挛状态和其他发声障碍、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛状态、抽搐、震颤、夜磨牙症、肛裂、失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍以及特征为肌肉群的不自主运动的其他障碍、流泪、多汗、过度流涎、过度胃肠分泌以及其他分泌紊乱、肌痉挛引起的疼痛、头痛。另外，本公开内容可用于治疗皮肤病学或美学/美容病症，例如减轻眉头皱纹(brow furrow)、减轻皮肤皱纹(skin wrinkle)。

在一些实施方案中，经修饰或未经修饰BoNT/EN、或嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物用于治疗与很多种细胞中的不期望的分泌活动相关的病症。在一些实施方案中，不期望的分泌是免疫分泌。与不期望的免疫分泌相关的病症包括但不限于：炎症、银屑病、变态反应、嗜红细胞淋巴组织细胞增生症和酒精性胰腺疾病。

经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物也可用于治疗运动损伤。Borodic美国专利No 5,053,005公开了使用A型肉毒用于治疗幼年脊柱弯曲(即脊柱侧弯)的方法。Borodic的公开内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，使用与Borodic公开的基本类似的方法，可将BoNT多肽施用于哺乳动物(优选人)以治疗脊柱弯曲。

在一些实施方案中，使用通常用A型肉毒进行的公知技术来施用经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物以治疗神经肌肉病症。例如，本公开内容可用于治疗疼痛，例如头痛、肌痉挛引起的疼痛以及多种形式的炎性疼痛。例如，Aoki美国专利No.5,721,215和Aoki美国专利No.6,113,915公开了使用A型肉毒毒素治疗疼痛的方法。这两个专利的公开内容通过引用整体并入本文。

自主神经系统病症也可用经修饰神经毒素进行治疗。例如，腺体功能障碍是自主神经系统病症。腺体功能障碍包括过度出汗和过度流涎。呼吸功能障碍是自主神经系统病症的另一个实例。呼吸功能障碍包括慢性阻塞性肺病和哮喘。Sanders等公开了用于治疗自主神经系统的方法；例如，使用天然存在的肉毒毒素治疗自主神经系统病症，例如过度出汗、过度流涎、哮喘等。Sander等的公开内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可使用基本上类似于Sanders等的方法，但是使用经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物来治疗自主神经系统病症，例如上述讨论的病症。例如，经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这样的多肽的药物组合物可以以足以使自主神经系统的胆碱能神经元(其控制鼻腔中的黏液分泌)退化的量局部施用于哺乳动物的鼻腔。可通过经修饰神经毒素治疗的疼痛包括由肌紧张或痉挛引起的疼痛，或与肌痉挛无关的疼痛。例如，Binder在美国专利No.5,714,468中公开了由血管紊乱、肌紧张、神经痛和神经病变引起的头痛可用天然存在的肉毒毒素(例如A型肉毒)进行治疗。Binder的公开内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可使用基本上类似于Binder的方法，但是使用本文中所述的经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物来治疗头痛，尤其是由血管紊乱、肌紧张、神经痛和神经病变引起的头痛。由肌痉挛引起的疼痛还可通过施用本文中所述的经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物来治疗。例如，与基于亮氨酸的基序融合的E型肉毒(优选在E型肉毒轻链的羧基端)可在疼痛/痉挛位置肌内施用以减轻疼痛。此外，可将经修饰神经毒素施用于哺乳动物以治疗与肌肉病症(例如痉挛)无关的疼痛。

在一个广泛的实施方案中，治疗非痉挛相关疼痛的本公开内容的方法包括中枢施用或外周施用经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物。例如，Foster等在美国专利No.5,989,545中公开了可在中枢(鞘内)施用的与靶向部分缀合的肉毒毒素以减轻疼痛。Foster等的公开内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可使用基本上类似于Foster等的方法，但使用本文中所述的组合物来治疗疼痛。待治疗的疼痛可以是急性疼痛或慢性疼痛。与肌痉挛无关的急性或慢性疼痛也可通过将经修饰神经毒素局部、外周施用至哺乳动物的实际或感知的疼痛位置来减轻。

在一个实施方案中，经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物在疼痛位置处或附近(例如，在切口处或切口附近)皮下施用。在一些实施方案中，经修饰神经毒素在哺乳动物的疼痛位置处或附近(例如，在挫伤(bruise)位置处或附近)肌内施用。在一些实施方案中，将经修饰或未经修饰BoNT/EN、嵌合毒素多肽或包含这些的药物组合物直接注射到哺乳动物的关节中用于治疗或减轻由关节炎病症引起的疼痛。而且，频繁地将经修饰神经毒素重复注射或输注至外周疼痛位置也在本公开内容的范围内。这样方法的施用途径是本领域中已知的并且本领域技术人员容易对本文中所述的方法进行修改(例如参见，例如Harrison′s Principles of Internal Medicine(1998)，由AnthonyFauci等编辑，第14版，由McGraw Hill出版)。

作为非限制性实例，神经肌肉病症的治疗可包括向肌肉或肌肉群局部施用有效量的分子的步骤，自主神经病症的治疗可包括向腺体或一些腺体局部施用有效的分子的步骤，并且疼痛的治疗可包括向疼痛部位施用有效量的分子的步骤。另外，疼痛的治疗可包括向脊髓施用有效量的经修饰神经毒素的步骤。

本文中使用的“治疗有效量”是指本公开内容的每种治疗剂单独或与一种或更多种其他治疗剂组合赋予对象治疗效果所需的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、身材大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体的施用途径等在健康从业者的知识和专长中的相似因素。这些因素是本领域普通技术人员所公知的，并且可仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的各组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，对象可出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因坚持较低剂量或可耐受剂量。经验考虑因素(例如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，可使用与人免疫系统相容的治疗剂，例如包含来自人源化抗体或完全人抗体的区域的多肽来延长多肽的半衰期并防止多肽被宿主的免疫系统攻击。

施用的频率可在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，多肽的持续连续释放制剂可以是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置是本领域中已知的。在一些实施方案中，剂量是每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更长时间一次。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。

给药方案(包括使用的多肽)可随时间变化。在一些实施方案中，对于正常体重的成年对象，可施用范围为约0.01至1000mg/kg的剂量。在一些实施方案中，剂量为1至200mg。具体的剂量方案(即剂量、时机和重复)将取决于具体的对象和对象的病史，以及多肽的性质(例如多肽的半衰期以及本领域中公知的其他考虑因素)。

为了本公开内容的目的，如本文中所述的治疗剂的合适剂量将取决于所使用的具体药剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度、所述多肽是用于预防还是治疗目的、先前的治疗、对象的临床病史和对拮抗剂的响应以及主治医师的判定。通常来说，临床医生将施用多肽直至达到实现所期望结果的剂量。

一种或更多种多肽的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及技术人员已知的其他因素。多肽的施用可在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在疾病发生之前、期间或之后。本文中使用的术语“治疗”是指将多肽或包含所述多肽的组合物应用或施用于有此需要的对象。

“有此需要的对象”是指患有疾病、疾病的症状或对疾病有倾向的个体，其目的是治疗、治愈、缓和、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或对疾病的倾向。在一些实施方案中，对象患有CDI。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是非人灵长类。在一些实施方案中，对象是人。减轻疾病包括延迟疾病的发生或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈性结果。

其中使用的“延迟”疾病的发生意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可具有不同的时间长度，这取决于病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发生或延迟疾病发作的方法是，与不使用该方法相比，在给定时间框架内降低发生一种或更多种疾病症状的可能性和/或在给定的时间框架内降低症状程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著性结果的许多对象。

疾病的“发生(development)”或“进展(progression)”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可使用本领域中公知的标准临床技术来检测和评估疾病的发生。然而，发生也指可以是不可检出的进展。对于本公开内容的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括发生、复发和发作。

本文中使用的疾病的“发作(onset)”或“发生(occurence)”包括初始发作和/或复发。可使用医学领域普通技术人员已知的常规方法将分离的多肽或药物组合物施用于对象，这取决于待治疗疾病的类型或疾病的部位。该组合物还可通过其他常规途径施用，例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、表面、经直肠、经鼻、口含(buccally)、经阴道或通过植入的储库(implanted reservoir)施用。

本文中使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，其可通过可注射的储库(injectable depoit)施用途径施用于对象，例如使用1个月、3个月或6个月储库可注射或可生物降解的材料和方法。

本文中使用的“对象”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类、啮齿动物、家畜或狩猎动物(game animal)。灵长类包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴(Rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠(woodchuck)、雪貂(ferret)、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛(bison)、水牛、猫科动物(例如，家猫)、犬科动物(例如，狗、狐狸、狼)、鸟类(例如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或对象包括前述的任何子集，例如上述所有，但不包括一个或更多个组或物种，例如人、灵长类或啮齿动物。在本文中所述一些方面的某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类(例如，人)。

术语“患者”和“对象”在本文中可互换使用。对象可以是雄性或雌性。对象可以是完全发育的对象(例如，成人)或经历发育过程的对象(例如，儿童、婴儿或胎儿)。优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可有利地用作代表与不期望的神经元活动相关的病症的动物模型的对象。另外，本文中所述的方法和组合物可用于治疗家养动物和/或宠物。

还提供了药盒，所述药盒包含本文中所述的分离的BoNT/EN多肽、经修饰BoNT/EN多肽、或嵌合神经毒素多肽、编码这样的多肽的核酸、包含这样的核酸的载体、细胞或者组合物。本文中所述的药盒可包含一个或更多个容纳组分的容器。特别地，这样的药盒可包含本文中所述的一种或更多种试剂(例如，多肽、核酸、载体、细胞或组合物)以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明。在某些实施方案中，所述药盒可适合用于治疗目的。所述药盒还可包含使用所述试剂所需的组分。

在适用的情况下，药盒的每种组分可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组分可以是可构成的或在其他情况下可加工的(例如，成为活性形式)，例如，通过添加合适的可与或可不与药盒一起提供的溶剂或其他物质(例如，水或某些有机溶剂)。

在一些实施方案中，药盒可任选地包含使用所提供的组分的说明和/或宣传。本文中使用的“说明”可定义一种说明性和/或宣传性的组件，并且通常涉及在本公开内容的包装上或与其相关的书面说明。说明还可包含以使得使用者将清楚地认识到该说明与该药盒相关的任何方式提供的任何口头或电子说明，例如音像(例如，录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的通信等。书面说明可以是以由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式，其也可反映动物管理的制造、使用或销售机构的批准。本文中使用的“宣传”包括与本发明相关的所有经商方法，其包括教育方法、医院和其他临床指导、科学探究、药物发现或开发、学术研究、制药工业活动(包括药物销售)以及任何广告或其他促销活动，包括任何形式的书面、口头和电子通信。另外，如本文中所述，根据具体应用，药盒可包含其他组分。

药盒可在一个或更多个容器中包含本文中所述的任意一种或更多种组分。组分可被无菌制备，包装在注射器中并冷藏运输。或者可将其容纳在小瓶或其他容器中用于储存。第二容器可具有无菌制备的其他组分。或者药盒可在小瓶、管或其他容器中包含预先混合并运输的活性剂。

药盒可具有多种形式，例如泡罩袋、收缩包装袋、真空可密封袋、可密封的热成型托盘、或类似的袋或托盘形式，其中配件松散地包装在袋、一个或更多个管、容器、盒或袋内。在添加配件之后可对药盒进行灭菌，从而允许容器中的各个配件以其他方式打开。可使用任何合适的灭菌技术例如辐射灭菌、加热灭菌或本领域中已知的其他灭菌方法对药盒进行灭菌。根据具体应用，药盒还可以包含其他组件，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针、用于施加或去除消毒剂的织物(例如纱布)、一次性手套、在施用之前用于试剂的支持件等。

无需进一步阐述，认为本领域技术人员可基于以上描述以其最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是举例说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。本文中引用的所有出版物出于本文中引用的目的或主题通过引用并入。

表1至5中提供了本文中所述的蛋白质和多肽序列。

表1 BoNT/EN序列(接头区具有下划线)

表2蛋白酶切割位点和天然BoNT接头区(“|”指示切割位点)

表3非限制性的示例性经修饰BoNT/EN多肽

表4非限制性的示例性嵌合毒素

表5底物(切割位点具有下划线)

通过以下实施例，将更充分地理解本文中公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在举例说明本公开内容的一些益处并描述一些特定实施方案，但不旨在示例本公开内容的全部范围，并且因此不限制本公开内容的范围。

实施例

屎肠球菌中肉毒神经毒素样毒素的鉴定和表征

肉毒神经毒素(BoNT)是已知最强效的细菌毒素和疾病肉毒中毒(botulism)的致病试剂^1-3。与许多其他致命毒素不同，由于肉毒中毒是罕见的疾病，因此一般人群针对BoNT不免疫。这种免疫力的缺乏结合BoNT的极强效力，是BoNT被美国疾病控制和预防中心(Center for Disease Control and Prevention)视为六种最危险的潜在生物恐怖剂(A类和第1级)之一的原因⁴。在另一方面，免疫力的缺乏也允许利用BoNT来治疗越来越多的医学病症(从肌痉挛到慢性疼痛)以及用于美容应用^5，6。

BoNT被合成为约150kDa的单一多肽，其需要进一步蛋白水解切割以将其分成两条链：N端轻链(LC，约50kDa)和C端重链(HC，约100kDa)^1-3。两条链通过单个链间二硫键保持连接，这对于BoNT的活性必不可少。LC作为锌依赖性金属蛋白酶发挥作用。HC包含两个功能性结构域：N端易位结构域(H_N，约50kDa)和C端受体结合结构域(H_C，约50kDa)。BoNT首先通过其H_C与其特异性神经元受体结合，通过受体介导的内吞作用进入神经元，然后通过H_N将LC穿过内体膜递送到胞质溶胶中来发挥作用。二硫键在胞质溶胶的还原环境中被还原并且LC被释放以切割其细胞靶蛋白。

基于缺乏通过其特异性抗血清的交叉中和作用，存在七种公认的主要BoNT血清型(BoNT/A至G)。它们具有相同的作用模式^1-3。BoNT/A、C和E的LC切割外周膜蛋白SNAP-25。BoNT/B、D、F和G的LC切割同源的囊泡膜蛋白VAMP1、2和3。另外，BoNT/C的LC还切割质膜蛋白突触融合蛋白1(Syx 1)。这三组蛋白质形成介导突触囊泡膜与质膜融合的核心机制并且是SNARE蛋白质家族(可溶性NSF附着蛋白受体)的原型，其介导真核细胞中的多种膜融合事件^7，8。切割这三种蛋白质中的任何一种足以阻断释放神经递质所需的突触囊泡胞吐作用。除这七种血清型之外，最近还鉴定出了新的血清型，暂且命名为BoNT/X⁹。其不仅切割VAMP1、2和3，而且还切割另外的SNARE蛋白成员VAMP4、VAMP5和Ykt6。切割这些另外的SNARE蛋白的生理结果仍有待确定。

BoNT基因总是存在于两种类型的保守基因簇中并与辅助蛋白一起共表达¹⁰。这两个簇在毒素之前均表达约150kDa蛋白质NTNHA(无毒非血细胞凝集素蛋白)，该蛋白质与BoNT形成pH依赖性复合物并保护其免受胃肠(gastrointestinal，GI)道中蛋白酶的破坏¹¹。一个基因簇包含称为HA17、HA33和HA70的另外的蛋白质，其与BoNT/NTNHA形成复合物并有助于毒素穿过上皮屏障的吸收^12-14。另一种类型的基因簇编码具有未知功能的数种蛋白质，定名为OrfX1、OrfX2、OrfX3和P47¹⁰。

BoNT簇存在于梭菌属内的多个革兰氏阳性芽孢形成细菌组群中¹⁰。尽管这些菌株在系统发生上可以是不同的，但基于其产生毒素的能力大多数被称为肉毒梭菌。另外，BoNT/E也见于称为丁酸梭菌(C.butyricum)的菌株中并且BoNT/F可见于分类为巴氏梭菌(C.baratii)的菌株中。多种机制有助于不同菌株之间BoNT簇的水平基因转移和重组，包括位于质粒或噬菌体上以及易位酶或插入序列(Insertion Sequence，IS)的存在。BoNT基因的移动性为使毒素基因在不同遗传背景和生态位中多样化和进化提供了机会。最近的基因组研究揭示了越来越多的亚型和镶嵌毒素(mosaic toxin)^15-21。

BoNT仅已在梭菌属中被鉴定并且其进化起源仍然是谜。最近的研究揭示了在稻魏斯氏菌(革兰氏阳性细菌)中的BoNT同源物^22，23。已表明，该同源物的LC是活性金属蛋白酶并在体外条件下切割重组VAMP2。因此，该同源物已被暂且定名为BoNT/Wo²²。然而，BoNT/Wo与BoNT相差甚远。首先，BoNT/Wo与其他BoNT之间的序列同一性为仅约14％至16％，这远低于BoNT家族成员的正常范围(约30％至63％)。其次，形成BoNT中必需的二硫键的两个半胱氨酸在BoNT/Wo中是不保守的，表明其可具有不同的作用模式。第三，BoNT/Wo基因与任何典型的BoNT辅助蛋白都无关并且不在BoNT基因簇中。

本文中报道了存在于屎肠球菌菌株中的质粒上的BoNT的新成员。该菌株最初分离自美国科德角地区的牛粪便。2017年5月对其基因组进行了测序，揭示了存在于BoNT基因簇中的新的BoNT。发现该毒素在不同于针对其他BoNT的已知切割位点的新位点切割VAMP2。还发现其在神经元中有效地切割SNAP-25。其代表了在屎肠球菌中鉴定的首个蛋白质毒素和在除梭菌属之外的细菌物种中的首个BoNT基因簇。

结果

屎肠球菌菌株包含新的BoNT基因

为了监测新BoNT的出现，已使用已知的BoNT序列作为探针对公共序列数据库进行了定期调查。2017年5月的最近检索揭示了在屎肠球菌菌株(菌株DIV0629，GenBank：OTO22244.1)的草案基因组中的新BoNT基因，暂且定名为BoNT/EN。BoNT/EN的蛋白质序列显示出与其他BoNT具有29％至38.7％的同一性并且其在系统发生分析中与BoNT/X最密切相关(图1A)。低水平的同一性分布在整个BoNT/EN的长度上，表明其不是镶嵌毒素(图1B)。整体BoNT结构域排列和所有关键的功能性基序在BoNT/EN中是保守的(图1B)，包括LC中的锌依赖性蛋白酶基序HExxH(残基H225至H229)²⁴、潜在地形成链间二硫键的两个半胱氨酸(C424和C438)，以及H_C(残基S1250至Y1253)中的神经节苷脂结合基序SxWY²⁵。

类似于其他BoNT，BoNT/EN基因位于基因簇内并且其前面是潜在的NTNHA基因(图1C)。BoNT/EN簇类似于BoNT/X、E、F和BoNT/A的成员的OrfX簇，包含潜在的orfX2、orfX3和p47基因(图1D)。尽管同源性低，但位于orfX2 N端的基因显示出与orfX1的一些相似性，其被定名为orfX1样基因。有趣的是，三个orfX基因的阅读框处于与NTNHA和BoNT/EN基因相同的方向。这种定向排列在BoNT/X簇中是相同的⁹，而其通常与其他OrfX簇中的NTNHA/BoNT基因相反。

BoNT/EN的LC在新位点处切割VAMP1/2/3

为了实验性地表征BoNT/EN的功能，首先检查其LC(EN-LC)是否能够切割神经元SNARE蛋白。产生重组EN-LC(第1至434位残基)作为His6标记的重组蛋白并将其与大鼠脑洗涤剂提取物(brain detergent extract，BDE)一起孵育。将BoNT/X的LC(X-LC)(其切割VAMP2)和BoNT/A的LC(A-LC)(其切割SNAP-25)平行作为对照进行分析。类似于X-LC，BDE与EN-LC的孵育导致VAMP2免疫印迹信号消失(图2A)。EN-LC与EDTA(其抑制金属蛋白酶活性)的预孵育保护VAMP2²⁴。除VAMP2之外，EN-LC还降低了Syx 1的免疫印迹信号，表明EN-LC可能能够切割另外的SNARE蛋白。

接下来使用重组产生的His6标记的VAMP2片段(第1至93位残基)分析EN-LC对VAMP2的切割。如图2B中所示，与EN-LC一起孵育产生两个较小的片段，这证实VAMP2被切割。为了确定切割位点，通过液相色谱-串联质谱(lipid chromatography-tandem massspectrometry，LC-MS/MS)对样品进行分析(图2C)。在与EN-LC一起孵育之后出现单个主肽峰，其与D68至L93的序列匹配(图2C，下图)。还鉴定出相应的N端片段(图2C，上图)。为了进一步证实这些发现，使用LC-MS/MS对不同的VAMP2重组蛋白：谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的VAMP2(第33至86位残基)进行了分析。与EN-LC一起孵育产生了与D68至R86匹配的单主肽，同时还鉴定出相应的N端片段(图5)。这些发现一起表明EN-LC在A67与D68之间切割VAMP2一次。

A67-D68是与由已知BoNT靶向的所有其他位点不同的新切割位点(图2D)。其是BoNT/X切割位点右侧的一个氨基酸⁹。还检查了其他VAMP家族成员(包括VAMP1、3、4、5、7、8、Sec22b和Ykt6)是否可被EN-LC切割。这些VAMP成员通过瞬时转染在HEK293细胞中表达。将细胞裂解物与EN-LC一起孵育。VAMP1和VAMP3与VAMP2高度同源，并且它们二者均被EN-LC切割(图2E)。其他VAMP成员中没有一个被切割，这表明EN-LC的特异性程度。

EN-LC能够在体外切割另外的SNARE蛋白

接下来检查了EN-LC是否可切割Syx 1，其包含两种同源同种型Syx 1A和Syx 1B。图2A中使用的抗体识别两种同种型。Syx 1A和Syx 1B分别在HEK293细胞中表达。然后将细胞裂解物与EN-LC一起孵育。还检查了其他紧密相关的Syx家族成员，包括Syx 2、3和4。如图2F中所示，在本发明的测定条件下，Syx 1A、2和3未被切割，而Syx 1B和Syx 4被切割。使用相同方法进一步检查了SNAP-25及其紧密相关的两个家族成员SNAP-23和SNAP-29是否可被EN-LC切割。如图2G中所示，SNAP-25和SNAP-23二者均被EN-LC切割，而SNAP-29未被切割。SNAP-25被EN-LC切割这一发现是出乎意料的，因为观察到在与EN-LC一起孵育之后BDE中SNAP-25未显著降低(图2A)。对于BDE与HEK293细胞裂解物之间的这种差异的原因尚不清楚。

为了直接比较EN-LC对不同SNARE蛋白的切割效力，产生了Syx 1B和Syx 4的His6标记的胞质片段，以及全长SNAP-25和SNAP-23。将相同量的这些重组蛋白与相同量的EN-LC一起孵育。用考马斯蓝染色在SDS-PAGE凝胶上监测这些蛋白质随时间的切割。将GST-VAMP2(33至86)平行作为对照进行分析。尽管VAMP2在数分钟内被切割，但观察到Syx 1B和SNAP-25的仅少量切割，并且在二十分钟内未检测到Syx 4和SNAP-23的切割(图5A、5B和7A)。这些结果表明，EN-LC在体外比其他SNARE远远更高效地切割重组VAMP2。

提高EN-LC的浓度和孵育时间增强了Syx 1B的切割并且还导致可检测Syx 4的切割(图6C)。通过质谱分析完整蛋白质与其由EN-LC产生的其片段，将切割位点定位在Syx 1B中M182-D183与Syx 4中K191-D192之间(图6D和6E)。这两个位点在Syx 1B与Syx 4之间的同源位置处，表明对切割事件的特异性程度(图6F)。所有SNARE蛋白均包含形成SNARE复合物的4螺旋束所需的SNARE结构域。BoNT的切割位点通常位于SNARE结构域内²⁶，而Syx 1B和Syx4上的BoNT/EN切割位点位于Syx的N端结构域(称为Habc结构域)与其C端SNARE结构域之间。

对SNAP-25和SNAP-23中切割位点的鉴定的结果是有问题的，因为提高EN-LC浓度和孵育时间产生了多个弥散(smear)条带，其通过质谱分析未产生任何清晰的切割位点(图7A至7C)。可能是高水平的EN-LC可导致体外SNAP-25中的多次切割事件，或者切割产物易于降解。由于使用高水平的EN-LC和长的孵育时间来切割SNAP-23、SNAP-25、Syx 1B和Syx 4，需要在细胞中验证在体外观察到的这些低效率切割事件的生理相关性。

BoNT/EN中的链间二硫键

接下来检查了EN-LC是否通过链间二硫键与其HC连接。序列比对显示出在预期位置处的两个半胱氨酸残基，其中一个在EN-LC的C端，且另一个在EN-H_N的N端(图3A)。两个半胱氨酸之间的接头区包含13个残基，这一长度类似于其他BoNT中的接头区，但BoNT/EN接头是唯一不含单个赖氨酸的接头。由于可有效活化BoNT/EN的内源蛋白酶仍然未知，因此在BoNT/EN接头区中插入了凝血酶切割位点，作为蛋白水解分离EN-LC和H_N的方式(图3A)。在与凝血酶一起孵育之后该经修饰EN-LC-H_N表现如预期：在没有还原剂(-DTT)的情况下其保持为单条带，并且在存在DTT的情况下分离成两个条带(图3B)，这确认了链间二硫键的存在。

BoNT/EN切割神经元中的VAMP2和SNAP-25二者

在培养基中孵育纳摩尔浓度的BoNT的LC-H_N通常导致一些LC-H_N非特异性地进入到神经元中^9，27，这以比体外测定更具生理相关的方式提供了检查神经元内EN-LC的作用的便捷方式。将原代培养的大鼠皮质神经元用作模型。将神经元暴露于EN-LC-H_N导致VAMP2和SNAP-25二者免疫印迹信号均以浓度依赖性方式丢失(图3C)，表明这两个SNARE蛋白被有效切割。如所预期的，用凝血酶对EN-LC-H_N进行蛋白水解活化提高了EN-LC-H_N的效力(图3C)。

此处使用的SNAP-25抗体(CI 71.1，)的表位位于N端第20至40位残基(定名为SNAP-N)内，其不检测任何切割产物(图3C)。为了进一步评价神经元中SNAP-25的切割，接下来使用针对其C端序列(第195至206位残基)产生的不同的SNAP-25抗体(定名为SNAP-CAb)。该抗体检测全长SNAP-25和具有较小分子量的切割产物二者(图3C)。这种切割产物的免疫印迹的强度最终达到与未曾暴露于任何毒素的神经元中的内源性SNAP-25类似的水平，表明该片段是稳定的并且在神经元中未被进一步加工。该片段的分子量为约12至13kDa，表明该切割位点位于SNAP-25的中间附近。

令人困惑的是没有可通过SNAP-N Ab检测的相应N端片段。为了进一步确认该发现，用三种不同的抗体：SNAP-N Ab、抗HA标签和SNAP-C Ab对在HEK293细胞中表达的SNAP-25(其在其N端包含HA标签)进行重新分析。尽管SNAP-C Ab如预期识别了SNAP-25的C端片段，但71.1和抗HA在免疫印迹分析中均未检测到任何N端切割片段(图7C)。可能N端区被降解成较小的碎片。

有趣的是，尽管重组SNAP-25几乎不被EN-LC切割(图7A)，但是SNAP-25以类似于在神经元中VAMP2的速率被BoNT/EN切割(图3C)。这并非没有先例：BoNT/C在细胞中也有效切割SNAP-25，但在体外效率低²⁸。已提出，BoNT/C对SNAP-25的最佳切割需要适当膜环境的存在，这也可以是BoNT/EN的要求²⁸。与SNAP-25相反，Syx 1(包含Syx 1A和1B二者)在神经元中没有被BoNT/EN切割(图3C)。这可能是因为Syx 1的切割效率低并且需要可仅在体外孵育下实现的高水平的EN-LC(图6A至6F)，尽管不能排除在皮质神经元中可能缺少Syx 1切割的最佳条件的可能性。总之，VAMP2和SNAP-25(而不是Syx 1)是皮质神经元中BoNT/EN的生理相关靶标。

在大鼠和小鼠神经元上测试连接的BoNT/EN

接下来寻求评估全长BoNT/EN的活性。出于生物安全考虑，决定不克隆全长毒素基因。代替的是利用定位酶介导的连接方法在试管中产生有限量的全长BoNT/EN，如先前所述^9，29，30。简单地说，在大肠杆菌中分开产生了BoNT/EN、EN-LC-H_N和En的H_C(EN-H_C)的两个无毒片段。EN-LC-H_N在其C端包含LPETGG基序和His6标签。EN-H_C在其N端包含GST标签和凝血酶切割位点(图4A)。与凝血酶一起孵育在其N端释放具有游离甘氨酸的EN-H_C，其随后可通过转肽酶定位酶与EN-LC-H_N中的LPETGG基序连接(图4A)。通过控制反应中前体蛋白的水平，可严格限制连接的全长毒素的量以确保生物安全。这种方法的缺点是连接毒素的毒性可能无法准确反映天然毒素的效力，因为分离的毒素结构域可能遇到折叠问题。事实上，EN-H_C一旦从GST标签切割其就表现出差的溶解性，这限制了定位酶介导的连接的效率。尽管如此，使用这种方法可产生低水平的全长BoNT/EN(图4B)。

首先评价在培养的大鼠皮质神经元上的连接毒素。将神经元暴露于定位酶介导的连接混合物以及分别缺少EN-H_C、EN-LC-H_N或定位酶的三种对照混合物。通过免疫印迹对VAMP2和SNAP-25的切割进行分析。如图4C中所示，由于EN-LC-H_N在反应混合物中的高浓度，其存在导致神经元中VAMP2的一些切割。与不含定位酶的混合物相比，通过定位酶进行的连接仅略微提高了神经元中VAMP2和SNAP-25的切割，其中估计的增强少于2倍(图4C)。这些结果使人怀疑是否存在针对在大鼠皮质神经元中表达的BoNT/EN的特异性高亲和力受体。

接下来利用称为趾外展评分(Digit Abduction Score，DAS)测定的公认的非致死性测定³¹评估连接的BoNT/EN在小鼠体内是否具有毒性。该测定测量将毒素注射到小鼠后肢腓肠肌中之后的局部瘫痪的程度。典型的肉毒中毒型松弛性瘫痪可通过在惊吓响应(startle response)中无法伸展脚趾来检测。发现注射高达1μg的连接的BoNT/EN在小鼠中不诱导任何瘫痪，表明连接的BoNT/EN在该水平下在小鼠中没有毒性(图4D)。

为了确定连接的BoNT/EN缺乏活性是否是由于其LC-H_N部分或H_C，接下来通过使用定位酶介导的连接(其切割神经元中的VAMP2和SNAP-25)将EN-LC-H_N与BoNT/A的H_C(A-HC)连接来产生嵌合毒素(图4E和4F)。BoNT/A利用突触囊泡蛋白SV2作为其蛋白受体并利用复合神经节苷脂作为辅助受体(co-receptor)，其在皮质神经元中大量表达^32，33。这种嵌合毒素中A-H_C的存在以至少1,000倍促进进入到培养的大鼠皮质神经元中：估计的1∶1000稀释的嵌合毒素混合物切割与在没有定位酶的未经稀释的EN-LC-H_N与A-H_C混合物类似的VAMP2和SNAP-25水平(图4F)。一致地，在DAS测定中注射低至1ng的嵌合毒素使小鼠肢体肌肉瘫痪(图4G)。这些结果表明单独纯化的EN-H_C具有折叠问题或者在大鼠皮质神经元和小鼠运动神经中不存在针对BoNT/EN的高亲和力受体。

BoNT/EN未被针对其他BoNT的抗血清识别

为了将BoNT/EN进一步确立为新的BoNT血清型，使用针对其他BoNT(包括所有七种主要血清型(BoNT/A至G)以及新鉴定的BoNT/X)产生的抗血清进行斑点印迹测定。使用先前已验证的四种马抗血清(三价抗BoNT/A、B和E，抗BoNT/C，抗BoNT/F)和两种山羊抗血清(抗BoNT/D和抗BoNT/G)⁹。还使用无活性全长BoNT/X作为抗原开发了针对BoNT/X的兔多克隆抗体。如图4H中所示，这些抗血清识别其相应的BoNT，但没有一个识别BoNT/EN(EN-LC-H_N与EN-H_C的混合物)，确定了BoNT/EN是新的BoNT血清型。

讨论

BoNT/EN代表第一种情况：BoNT簇存在于除梭菌属之外的细菌物种中。BoNT/EN与最近在肉毒梭菌菌株111中鉴定的BoNT/X最相似⁹。BoNT/EN和BoNT/X的基因簇也具有这两种毒素所特有的相同的方向排列，这进一步表明BoNT/EN和BoNT/X可在BoNT家族中形成独特的分支。该分支的另外的成员可在自然界中存在。

BoNT/EN以在神经元中类似的速率切割VAMP2和SNAP-25，这表明VAMP2和SNAP-25二者都是相关的毒素靶标。这种双底物现象与切割SNAP-25和Syx 1二者的BoNT/C类似^28，34，35。BoNT/EN在体外切割重组SNAP-25中显示出低效力。这也类似于BoNT/C，其可仅在细胞中而不在体外有效切割SNAP-25²⁸。尽管针对这种差异的机理仍有待完全建立，但可能需要将SNAP-25正确定位在神经元膜上以为BoNT/EN和BoNT/C提供最佳的识别/切割条件。

在体外测定条件下，BoNT/EN能够切割细胞裂解物中的Syx 1B和Syx 4。其在Syx1B与Syx 4之间空间上保守的位点处切割Syx 1B和Syx 4的重组胞质结构域，这表明特异性程度。然而，神经元中的Syx 1B未被BoNT/EN切割。这可能是因为成功易位到神经元中的低水平毒素不足以切割Syx 1B。在另一方面，不能排除皮质神经元中Syx 1B的细胞环境阻止其被BoNT/EN切割的可能性。在体外条件下与在神经元中观察到的SNAP-25和Syx 1B二者的巨大差异表明了通过将毒素加载到活神经元中而不是仅仅依赖于具有高水平毒素LC蛋白的体外分析来验证任何毒素介导的切割事件的重要性。SNAP-23和Syx 4在大鼠皮质神经元中未以可检测的水平表达³⁶。它们和其他SNARE蛋白是否可在相关细胞类型中被有效切割仍有待确定。

与EN-LC-H_N相比，连接的BoNT/EN增强进入到皮质神经元中的程度相当小。相反，将EN-LC-H_N与A-H_C连接导致皮质神经元上的效力提高至少1,000倍。一致地，由定位酶介导的连接产生的全长BoNT/EN在高达1μg的剂量下不诱导任何瘫痪，而包含A-H_C的嵌合毒素在1ng下诱导松弛性瘫痪。这些数据表明，大鼠/小鼠神经元可不包含BoNT/EN的合适的高亲和力受体。然而，不能排除单独纯化的EN-H_C可能具有折叠问题的可能性。为了充分评价其潜在毒性和生物安全风险，生产天然的全长BoNT/EN将是重要的。在双受体模型中，大多数BoNT需要神经节苷脂作为低亲和力附着因子和特异性蛋白受体二者^37，38。BoNT/EN在其H_C内具有典型的神经节苷脂结合基序(SxWY)，其可介导与大鼠/小鼠神经元的低亲和力附着。除神经节苷脂之外，BoNT/EN可需要在大鼠/小鼠神经元中不表达或具有改变序列的另外的高亲和力受体。

VAMP2和SNAP-25也参与许多非神经元细胞中的分泌事件，并且VAMP2和SNAP-25的同源物存在于整个真核生物物种中，BoNT/EN还可通过其独特的H_C靶向除皮质神经元和运动神经元之外的细胞类型，或者甚至除哺乳动物之外的物种。肠球菌广泛分布于自然界中并在大多数陆生动物(包括昆虫和其他无脊椎动物)的GI道中定植^39-42。了解BoNT/EN的受体结合特性将对建立BoNT/EN的确切物种和细胞类型特异性至关重要。

BoNT/EN还代表在屎肠球菌中鉴定的首个蛋白质毒素⁴⁰。具有在可移动元件上迅速获得新特性的能力，肠球菌已获得了对革兰氏阳性物种和革兰氏阴性物种二者的多种抗生素抗性并将其传递⁴⁰。从理论上讲肠球菌通常也可获得/传递致命毒素。目前对BoNT/EN的发现被树立为证明这种可能性的首个实例。包括BoNT/EN的进化起源以及BoNT/EN靶向的特定宿主物种/细胞类型的问题仍然未知。屎肠球菌获得功能性BoNT基因簇的能力可产生新兴菌株，其对这种适应良好的共生生物体产生不期望的后果，并成为多抗生素抗性感染的首要原因^40，43。

方法

材料：针对Syx 1(HPC-1)、SNAP-25(C171.2)、VAMP2(C169.1)的小鼠单克隆抗体由E.Chapman(Madison，WI)慷慨提供并且可从Synaptic Systems(Goettingen，Germany)获得。针对VAMP4、Sec22b、Syx 2、Syx 3和Syx 4的兔多克隆抗体购自Synaptic Systems(目录编号分别为No.136002、No.186003、No.110022、No.110032和No.110042)。以下小鼠单克隆抗体购自指定供应商：肌动蛋白(Sigma，AC-15)；抗HA(Covance，16B12)；抗Myc(Millipore，9E10)；抗SNAP-25(Abcam，ab5666)。针对BoNT/A/B/E、BoNT/C、BoNT/DC、BoNT/F的马多克隆抗血清和针对BoNT/G的山羊多克隆抗血清由S.Sharma(FDA)慷慨提供。针对BoNT/D的山羊多克隆抗体购自Fisher Scientific(NB10062469)。BoNT购自Metabiologics(Madison，WI)。

cDNA和构建体：通过GenScript(New Brunswick，NJ)合成编码EN-LC(第1至434位残基)、EN-H_C(第863至11279位残基)、EN-H_N(第436至862位残基)和X-LC(第1至439位残基，GenBank No.WP045538952.1)的cDNA。使用Gibson组装方法用在Q432与L435之间插入的凝血酶蛋白酶切割位点在内部(in-house)产生编码EN-LC-H_N的cDNA。将EN-LC、X-LC、A-LC(第1至425位残基)克隆到在其N端具有His6标签的pET28载体中。将EN-H_C和A-H_C(第875至1297位残基，GenBank No.AF488749)克隆到pGEX4T中用于作为GST标记的蛋白质表达。将EN-LC-H_N克隆到pET22b载体中(其中肽序列LPETGG与其C端融合，随后是His6标签)，并将其纯化为His6标记的蛋白质。将VAMP2(1至93)克隆到pGEX4T载体和在N端具有His6标签的pET28载体中并GST标记的蛋白质表达。将全长小鼠VAMP1、3和大鼠VAMP7、8克隆到经修饰pcDNA3.1载体中，其中HA标签与其C端融合。在具有N端Myc标签的pcDNA3.1载体中表达全长大鼠Ykt6和小鼠Sec22b的构建体由J.Hay((Missoula，MT)慷慨提供。将全长Syx 1A、Syx 1B、Syx 2、Syx3、Syx 4、SNAP-23和SNAP-29克隆到BamHI/NotI之间的Syn-lox载体中，不同之处在于突触融合蛋白1B在其N端与HA标签融合。将全长SNAP-25克隆到BamHI/NotI之间的pcDNA3.1载体中，其中HA标签与其N端融合。将Syx 1A(1至265)、Syx 1B(1至251)、Syx 4(1至273)、SNAP-23和SNAP-25克隆到pET28a中的NheI/NotI位点之间并作为His6标记的蛋白质表达。编码His6标记的定位酶(SrtA*)的构建体由B.Pentelute(Boston，MA)慷慨提供并且先前已有描述³⁰。

生物信息学分析：BoNT/EN是使用blastp用BoNT/X作为针对具有缺省参数(BLOSUM62，空位存在＝11，空位延伸＝1，具有条件组分得分矩阵调整)的nr数据库的查询序列发现的。截至2017年4月，该检索空间覆盖了总共231,827,651,552个碱基和200,877,884个序列。使用HMMER软件包的hmmsearch命令针对Pfam数据库(v31.0，引用)对结构域进行注释。使用R(v3.4.1)中的genoplotR(v0.8.6，引用)使基因组架构可视化。使用ClustalO(v1.2.1)将代表所有主要谱系(A至G、F5A和X)的BoNT序列以多重比对进行比对，然后以1的步长在跨多重比对的长度为50个氨基酸的滑动窗口中计算BoNT/EN与其他之间的成对同一性。使用R中的样条基础软件包计算回归样条(regression spline)。

BoNT/X多克隆抗体的产生：使用在其C端具有His6标签的编码BoNT/X_RY的pET22b载体如前所述⁹表达和纯化无活性全长BoNT/X突变体(R360A/Y363F、BoNT/X_RY)用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。抗体产生由EZBiolab Inc.(USA)进行。将免疫原(BoNT/X_RY)用生理盐水稀释并随后与相应的佐剂(弗氏完全佐剂)1∶1混合。将抗原和佐剂完全混合以形成稳定的乳剂并随后使用背部多点注射方法(每点0.1ml)将该乳剂注射到新西兰白兔中。2周的间隔之后，在不同点上用弗氏不完全佐剂进行后续免疫接种。每次免疫接种的抗原量为100μg。免疫接种的次数是四次。在免疫接种四次之后用ELISA测试效价。从颈动脉收集兔血。将血清通过蛋白A色谱进行纯化并随后针对PBS缓冲液进行透析并随后冻干。

蛋白质纯化：利用大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达。一般来说，在22℃下过夜用0.1mM IPTG进行诱导表达。通过超声处理使细菌沉淀物在裂解缓冲液(50mM Tris pH7.5，150mM NaCl)中破碎，并在4℃下以20,000g离心30分钟之后收集上清液。使用AKTAPrime FPLC系统(GE)进行蛋白质纯化，并将经纯化的蛋白质用PD-10柱(GE，17-0851-01)进一步脱盐。

大鼠脑洗涤剂提取物(BDE)中SNARE蛋白的切割：将大鼠脑在15ml 320mM蔗糖缓冲液中匀浆，然后在4℃下以5000rpm离心2分钟。收集上清液并以11,000rpm离心12分钟。收集沉淀物并在15ml Tris缓冲盐水(TBS：20mM Tris，150mM NaCl)加2％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物(Roche，CA)中溶解30分钟。随后将样品以17,000rpm离心20分钟以除去不溶物质。最终的BDE浓度为约2mg/ml蛋白质。在37℃下将BDE(60μl)与EN-LC(2μM)、X-LC(2μM)或A-LC(2μM)一起孵育1小时，并随后通过使用增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ECL)方法(Pierce)的免疫印迹对其进行分析。作为对照，将LC在室温(RT)下与20mM EDTA一起预孵育20分钟，然后添加至BDE。

通过EN-LC切割重组的VAMP、突触融合蛋白和SNAP：将VAMP2(1至93)作为His6标记的蛋白质并且也作为GST标记的蛋白质表达并纯化。将Syx 1A(1至265)、Syx 1B(1至251)、Syx 4(1至273)、SNAP-23和SNAP-25作为His6标记的蛋白质表达并纯化。在37℃下将这些蛋白质(0.3mg/ml)与在TBS缓冲液中的0.1或6μM EN-LC一起孵育指定的时间。通过SDS-PAGE凝胶和考马斯蓝染色对样品进行分析，或者对样品进行质谱分析。

细胞裂解物中VAMP、突触融合蛋白和SNAP的切割：按照制造商的说明书，使用PolyJet转染试剂(SignaGen，MD)将全长HA标记的VAMP1、3、7、8，Syx 1B，SNAP-25和Myc标记的Sec22b，以及Ykt6和在syn-lox载体中无任何标签的Syx 1A、Syx 2、Syx 3、Syx 4、SNAP-23和SNAP-29转染到HEK293细胞中。48小时之后在RIPA缓冲液(50mM Tris，1％NP40、150mMNaCl，0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，每10em皿400μl)加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)中收获细胞裂解物。在37℃下将细胞裂解物(250μl)与X-LC(2μM)一起孵育1小时。然后通过免疫印迹对样品进行分析。

通过LC-MS/MS鉴定VAMP中的切割位点：在哈佛医学院(Harvard Medical School)的Taplin Biological Mass Spectrometry Core Facility处对样品进行分析。对于VAMP2，使用压力元件(pressure cell)将全蛋白样品加载到100μm内径C18反相HPLC柱上，该柱用3cm离线珠填充。将柱重新附接至Accela 600泵(Thermo Fisher Scientific)。使用迅速递增梯度的乙腈从HPLC柱洗脱蛋白质/肽。当洗脱肽时，将其进行电喷射离子化并随后放置在LTQ Orbitrap Velos Pro离子阱质谱仪中以获得在60,000分辨率的高分辨率FTMS扫描、离子阱中在低分辨率的第二扫描以及最终的扫描以进行数据依赖性的MS/MS。人工对电荷状态包络(charge state envelope)进行去卷积以在可能时获得单同位素质量或以获得蛋白质的平均质量。肽和蛋白质的同一性使用软件程序Sequest(Thermo FisherScientific)通过将蛋白质数据库与所获得的片段化模式进行匹配而确定。所有数据库均包含所有序列的反转版本(reversed version)并且数据被过滤到1％至2％的肽错误发现率。

对于Syx 1B、Syx 4、SNAP-23和SNAP-25，首先在SDS-PAGE上分离样品。将蛋白质条带切下并切成约1mm³的块。将凝胶块与包含12.5ng/μl经修饰测序级的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶(Roche Diagnostics)的50mM碳酸氢铵溶液一起孵育。在室温下将样品消化过夜。然后提取肽并用反相HPLC分离。当洗脱肽时，对其进行电喷射离子化并转移到LTQ OrbitrapVelos Pro离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific)中。对洗脱的肽进行检测、分离和片段化以产生针对每种肽的特定片段离子的串联质谱。

神经元培养和免疫印迹分析：如先前所述，使用木瓜蛋白酶解离试剂盒(Worthington Biochemical)从E18-19胚胎制备原代大鼠皮质神经元⁴⁴。将神经元暴露于添加至培养基的BoNT/EN片段或定位酶连接混合物持续12小时。然后用RIPA缓冲液(50mMTris、1％NP40、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)使神经元裂解。在4℃下使用微型离心机以最大速度将裂解物离心10分钟。对上清液进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

斑点印迹：将BoNT(在1μl中0.2μg)点在硝酸纤维素膜上并干燥(在室温下10分钟)。用含5％乳的TBST(TBS加0.05％吐温20)封闭膜30分钟并随后与合适的抗血清(1∶500稀释)一起孵育30分钟。然后将膜用TBST洗涤三次并与经HRP(辣根过氧化物酶)缀合的二抗一起孵育30分钟，用TBST再洗涤三次，并通过ECL法进行分析。注意到，BoNT/EN样品由EN-LC-H_N和GST-EN-H_C以1∶1比例构成。

定位酶介导的连接：将GST-EN-H_C或GST-A-H_C在4℃下由凝血酶切割过夜，然后将其添加到连接反应混合物中。在RT下，在具有用或未用凝血酶预处理的EN-LC-H_N(5μM)、EN-H_C(15μM)或A-H_C(15μM)、Ca²⁺(10mM)和定位酶(2μM)的50μl TBS缓冲液中建立连接反应持续40分钟。

DAS测定：通过定位酶介导的连接产生EN-FL和EN-A嵌合毒素(EN-LC-H_N-A-H_C)。将小鼠(CD-1品系，21至25g，n＝4)用异氟烷(3％至4％)麻醉，并使用附接至无菌Hamilton注射器的30号针将EN-FL(1μg)和EN-A(1ng)注射到右后肢的腓肠肌中。在注射之后24小时检查肌肉瘫痪和在惊吓响应中后爪的伸展。

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在本文中(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)所提及的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)均通过引用在此整体并入如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目均通过引用特别地和单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案和范围

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求书中所阐述的那样。

没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或者以其他方式从上下文中显而易见。除非相反地指出或在其他情况下从上下文中明显看出，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述应被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包含“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案、其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为了简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

应当理解的是，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或者来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求中的所有改变、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，应理解的是，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文中所公开的任何制备或使用方法或者根据本领域中已知的方法制备或使用组合物的方法(如果有的话)。

在要素以列表(例如，以马库什组格式)表示的情况下，应理解的是，还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可从该组中移除。还应注意的是，术语“包括/含”旨在是开放性的并允许包含另外的要素或步骤。应理解的是，一般来说，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成的或基本上由其组成的一些实施方案、产品或方法。为了简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地详细说明，但应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值在一些实施方案中可假定为所述范围内的任何特定值至所述范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为了简洁起见，每个范围内的值在本文中没有被单独地详细说明，但应理解的是，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点为以与该范围下限的单位的十分之一相同的准确度表示。

在提供网站地方，URL地址以非浏览器可执行代码提供，括号中带有相应网址的句点。实际的网址不包含括号。

另外，应理解的是，本公开内容的任何特定实施方案可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，在该范围内的任何值可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或更多个权利要求中排除。为了简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims (149)

1.分离的屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQ ID NO：1至3中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的分离的BoNT/EN多肽，其包含SEQ ID NO：1至3中任一种的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的分离的BoNT/EN多肽，其由SEQ ID NO：1至3中任一种的氨基酸序列组成。

4.权利要求1至3中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽进入细胞。

5.权利要求4所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。

6.权利要求5所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。

7.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP1。

8.权利要求7所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。

9.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP2。

10.权利要求9所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。

11.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP3。

12.权利要求11所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。

13.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-23。

14.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25。

15.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白1。

16.权利要求15所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。

17.权利要求6所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白4。

18.权利要求17所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

19.权利要求4至18中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是分泌细胞。

20.权利要求19所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是神经元细胞。

21.权利要求20所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽抑制神经元活动。

22.权利要求20或21所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪。

23.权利要求19所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是免疫细胞。

24.权利要求4至23中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是培养的细胞。

25.权利要求4至24中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞是体内的。

26.权利要求4至25中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述细胞来自哺乳动物。

27.权利要求26所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是人。

28.权利要求26所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

29.权利要求28所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述啮齿动物是小鼠。

30.权利要求28所述的分离的BoNT/EN，其中所述啮齿动物是大鼠。

31.权利要求4至25中任一项所述的分离的BoNT/EN，其中所述细胞是昆虫细胞。

32.权利要求1至31中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽，其中所述分离的BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

33.分离的屎肠球菌(Enterococcus faecium)神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含与SEQID NO：4具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

34.权利要求33所述的分离的BoNT/EN多肽，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

35.权利要求34所述的分离的BoNT/EN多肽，其由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

36.经修饰屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)多肽，其包含：

(a)蛋白酶结构域；

(b)经修饰接头区；以及

(c)易位结构域；

其中所述经修饰接头区包含蛋白酶切割位点。

37.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。

38.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头区包含SEQ ID NO：41至47中任一种的氨基酸序列。

39.权利要求36所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头来自肉毒梭菌(Clostridium Botulinum)神经毒素。

40.权利要求39所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头区包含SEQ ID NO：48至55的氨基酸序列。

41.权利要求36至40中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其还包含受体结合结构域。

42.权利要求36至41中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其包含与SEQ ID NO：5至22中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

43.权利要求42所述的经修饰BoNT/EN多肽，其包含SEQ ID NO：5至22中任一种的氨基酸序列。

44.权利要求43所述的经修饰BoNT/EN多肽，其由SEQ ID NO：5至22中任一种的氨基酸序列组成。

45.权利要求36至44中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽进入细胞。

46.权利要求45所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽切割所述细胞中的SNARE蛋白。

47.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。

48.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP1。

49.权利要求48所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。

50.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP2。

51.权利要求50所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。

52.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP3。

53.权利要求52所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。

54.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-23。

55.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25。

56.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白1B。

57.权利要求56所述的经修饰BoNT多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQ ID NO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。

58.权利要求46所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白4。

59.权利要求58所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN在对应于SEQ IDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

60.权利要求45至59中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是分泌细胞。

61.权利要求60所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是神经元细胞。

62.权利要求61所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽抑制神经元活动。

63.权利要求62所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽诱导松弛性瘫痪。

64.权利要求60所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是免疫细胞。

65.权利要求45至64中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是培养的细胞。

66.权利要求45至64中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是体内的。

67.权利要求45至66中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞来自哺乳动物。

68.权利要求67所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是人。

69.权利要求67所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

70.权利要求69所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述啮齿动物是小鼠。

71.权利要求69所述的经修饰BoNT/EN，其中所述啮齿动物是大鼠。

72.权利要求45至66中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述细胞是昆虫细胞。

73.权利要求36至72中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰BoNT/EN多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

74.嵌合神经毒素多肽，其包含：

(a)蛋白酶结构域；

(b)易位结构域；以及

(c)受体结合结构域；

其中所述蛋白酶结构域和所述易位结构域来自屎肠球菌神经毒素(BoNT/EN)，并且其中所述受体结合结构域来自肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。

75.权利要求74所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述蛋白酶结构域和所述易位通过接头区连接。

76.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含CPNPHFSSQRGLSSC(SEQID NO：56)的氨基酸序列。

77.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含蛋白酶切割位点。

78.权利要求77所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission、定位酶、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20、颗粒酶-B、肠激酶、SUMO蛋白酶、LysC和胰蛋白酶。

79.权利要求77或权利要求78所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区包含SEQ IDNO：41至47的氨基酸序列。

80.权利要求75所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述接头区来自肉毒梭菌神经毒素。

81.权利要求80所述的经修饰BoNT/EN多肽，其中所述经修饰接头区包含SEQ ID NO：48至55的氨基酸序列。

82.权利要求74至81中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述受体结合结构域来自BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X。

83.权利要求74至81中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述受体结合结构域来自BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/X。

84.权利要求74至83中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其包含与SEQ ID NO：23至30中任一种具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

85.权利要求84所述的嵌合神经毒素多肽，其包含SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列。

86.权利要求85所述的嵌合神经毒素多肽，其由SEQ ID NO：23至30中任一种的氨基酸序列组成。

87.权利要求74至86中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素多肽进入细胞。

88.权利要求87所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素多肽在所述细胞中切割SNARE蛋白。

89.权利要求88所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白选自：VAMP1、VAMP2、VAMP3、SNAP-25、SNAP-23、突触融合蛋白1和突触融合蛋白4。

90.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP1。

91.权利要求90所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素在对应于SEQ IDNO：31中A69和D70的氨基酸残基之间切割。

92.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP2。

93.权利要求92所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素在对应于SEQ IDNO：32中A67和D68的氨基酸残基之间切割。

94.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是VAMP3。

95.权利要求94所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素在对应于SEQ IDNO：33中A54和D55的氨基酸残基之间切割。

96.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-23。

97.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25。

98.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白1。

99.权利要求98所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素在对应于SEQ IDNO：37中M182和D183的氨基酸残基之间切割。

100.权利要求89所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述SNARE蛋白是突触融合蛋白4。

101.权利要求100所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素在对应于SEQ IDNO：38中K191和D192的氨基酸残基之间切割。

102.权利要求87至101中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是分泌细胞。

103.权利要求102所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是神经元细胞。

104.权利要求103所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素多肽抑制神经元活动。

105.权利要求104所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素多肽诱导松弛性瘫痪。

106.权利要求102所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是免疫细胞。

107.权利要求87至106中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是培养的细胞。

108.权利要求87至106中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是体内的。

109.权利要求87至108中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞来自哺乳动物。

110.权利要求109所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述哺乳动物是人。

111.权利要求109所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

112.权利要求111所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述啮齿动物是小鼠。

113.权利要求111所述的嵌合神经毒素，其中所述啮齿动物是大鼠。

114.权利要求87至108中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述细胞是昆虫细胞。

115.权利要求74至114中任一项所述的嵌合神经毒素多肽，其中所述嵌合神经毒素多肽不与针对BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X的抗体交叉反应。

116.核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽、或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％、或100％同一性的氨基酸序列。

117.核酸载体，其包含权利要求116所述的核酸分子。

118.细胞，其包含权利要求116所述的核酸分子或权利要求117所述的核酸载体。

119.细胞，其表达权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽。

120.产生权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽的方法，所述方法包括在其中产生所述BoNT/EN多肽的条件下培养权利要求119所述细胞的步骤。

121.权利要求120所述的方法，其还包括从培养物中回收所述BoNT/EN多肽、所述经修饰BoNT/EN多肽或所述嵌合神经毒素多肽。

122.组合物，其包含权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽。

123.权利要求122所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

124.权利要求123所述的组合物，其还包含可药用载体。

125.药盒，其包含权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽、或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽、权利要求116所述的核酸、权利要求117所述的载体、权利要求118所述的细胞或者权利要求122至124中任一项所述的组合物。

126.治疗病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽、或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽、权利要求116所述的核酸、权利要求117所述的载体或者权利要求122至124中任一项所述的组合物以治疗所述病症。

127.权利要求126所述的方法，其中所述病症与过度活动的神经元或腺体相关。

128.权利要求126或权利要求127所述的方法，其中所述病症选自：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发声困难、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性手肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、偏侧面肌痉挛、眼睑疾病、大脑性瘫痪、局灶性痉挛状态和其他发声障碍、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛状态、抽搐、震颤、夜磨牙症、肛裂、失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍以及特征为肌肉群不自主运动的其他障碍、流泪、多汗、过度流涎、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌痉挛引起的疼痛、头痛、皮肤病学或美学/美容病症、肥胖/食欲减退。

129.权利要求126所述的方法，其中所述病症与不期望的神经元活动无关。

130.权利要求129所述的方法，其中所述病症选自：银屑病、变态反应、嗜红细胞淋巴组织细胞增生症和酒精性胰腺疾病。

131.权利要求126至130中任一项所述的方法，其中所述施用通过注射至存在不期望的神经元活动的地方。

132.权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽、或权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽、权利要求116所述的核酸、权利要求117所述的载体或者权利要求122至124中任一项所述的组合物，其用于治疗与不期望的神经元活动相关的病症。

133.权利要求1至35中任一项所述的分离的BoNT/EN多肽、权利要求36至73中任一项所述的经修饰BoNT/EN多肽、权利要求74至115中任一项所述的嵌合神经毒素多肽、权利要求116所述的核酸、权利要求117所述的载体或者权利要求122至124中任一项所述的组合物，其用于医学。

134.产生神经毒素多肽的方法，所述方法包括：

(i)获得包含重链的N端结构域(H_N)和轻链(LC)的第一神经毒素片段，其中所述第一神经毒素片段包含C端LPXTGG(SEQ ID NO：57)基序；

(ii)获得包含重链的C端结构域(H_C)的第二神经毒素片段；其中所述第二神经毒素片段在其N端包含特异性蛋白酶切割位点；

(iii)用特异性蛋白酶切割所述第二神经毒素片段，其中所述切割在N端产生游离的甘氨酸残基；以及

(iv)在存在转肽酶的情况下使所述第一神经毒素片段与来自(iii)的所述第二神经毒素片段接触，从而将所述第一神经毒素片段与所述第二BoNT/EN片段连接以形成连接的神经毒素。

135.权利要求134所述的方法，其中所述第一神经毒素片段还包含亲和标签。

136.权利要求135所述的方法，其中所述亲和标签与所述第一神经毒素片段在N端融合。

137.权利要求135所述的方法，其中所述亲和标签与所述第一神经毒素片段在C端融合。

138.权利要求135至137中任一项所述的方法，其中所述亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

139.权利要求134至138中任一项所述的方法，其中所述第二神经毒素片段还包含亲和标签。

140.权利要求139所述的方法，其中所述亲和标签与所述第二神经毒素片段在N端融合。

141.权利要求139所述的方法，其中所述亲和标签与所述第二神经毒素片段在C端融合。

142.权利要求139至141中任一项所述的方法，其中所述亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

143.权利要求134至142中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：凝血酶、TEV、PreScission(3C蛋白酶)、肠激酶和SUMO蛋白酶。

144.权利要求143所述的方法，其中相应蛋白酶是凝血酶。

145.权利要求134至144中任一项所述的方法，其中所述第一神经毒素片段来自屎肠球菌。

146.权利要求134至145中任一项所述的方法，其中所述第二神经毒素片段来自屎肠球菌。

147.权利要求134至145中任一项所述的方法，其中所述第二神经毒素片段来自BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G或X。

148.权利要求134至147中任一项所述的方法，其中所述转肽酶是定位酶。

149.权利要求148所述的方法，其中所述定位酶来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SrtA)。

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