JP2018525021A - 疼痛の治療を目的とする組成物及び方法 - Google Patents

疼痛の治療を目的とする組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、侵害受容ニューロンに結合及びそれを標的とする操作された融合タンパク質、こうした操作された融合タンパク質を含む組成物、ならびにこうした操作された融合タンパク質または操作された融合タンパク質を含む組成物を使用した疼痛の治療方法が具体化される。操作された融合タンパク質は、炭疽毒素、クロストリジウムボツリヌスファミリーの毒素、ジスルフィド含有毒素、及びＡＢ成分型の毒素などのタンパク質毒素に由来するドメインを含む。【選択図】図７Ａ及び図７Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１５年８月２７日出願の米国仮出願第６２／２１０，６１０号の利益を主張し、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
配列リスト
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列リストを含み、当該配列リストは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年８月２６日に作成されたものであり、その名称は、００２８０６−０８４９５２−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは、１６５，７３２バイトである。
発明の分野
我々は、疼痛の治療を目的とする新規の組成物及び方法について説明する。
発明の背景
変形性関節症、関節リウマチ、筋痙縮、及び癌を含む慢性疾患病状における疼痛は、大きな社会経済的負担であり、それに対する有効かつ利用可能な治療はほとんど存在しない。
オピオイドなどの現在の慢性疼痛治療は、そのほとんどが有効ではなく、他のニューロンサブタイプに作用することから、依存性などの重度の非特異的作用を有する。
侵害受容感覚ニューロンは、有害性／傷害性の刺激の検出を媒介するものであり、それが異常に活性化すると慢性疼痛が生じる。感覚運動反射の過活動に寄与し得る筋痙縮では、こうしたニューロンは調節不全となっており、骨関節病状を有する関節を神経刺激することで疼痛も媒介する。
本発明は、疼痛の治療を目的とする新規の組成物及び方法を提供する。本発明の少なくとも一部は、疼痛感受性侵害受容ニューロンが炭疽毒素の受容体であるＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２としても知られる）を高レベルで特異的に発現する一方で、他のニューロンサブタイプは、この受容体を実質的に発現しないという我々の発見に基づく。炭疽毒素に固有のエンドソーム送達機構を使用することによって、我々は、他の神経学的副作用を引き起こすことなく、疼痛を特異的に遮断することになる積み荷分子を侵害受容器に特異的に送達することができる。例えば、積み荷分子は、細胞のシグナル伝達経路をインビボで阻害もしくは遮断するか、またはシナプス神経伝達物質の放出を阻害もしくは遮断する細胞内作用毒素であり得る。
したがって、１つの態様では、我々は、融合タンパク質を提供し、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、当該結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、侵害受容ニューロンが、ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含み、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分は、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む。
別の態様では、融合タンパク質を含む組成物が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、当該結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、侵害受容ニューロンが、ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含み、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分は、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む。
異種性起源は、融合タンパク質の（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分が同一のタンパク質に由来しないことを意味する。本明細書で使用される「切断する能力を有する」という語句は、切断を意味する。侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼの非限定例は、本明細書に記載のＢＴｘ（セロタイプを含む）、ＴＴｘ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素である。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、融合タンパク質組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、プロテアーゼによって融合タンパク質をそこで切断することが可能なプロテアーゼ切断部位をさらに含み、プロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質における非細胞傷害性プロテアーゼのＣ末端に位置する。切断に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む。本明細書に記載の操作された融合タンパク質の構築における使用に適したクロストリジウム神経毒素のＬ鎖の非限定例については、表１を参照のこと。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、Ｌ鎖は、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇ、及び第１の非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘ軽鎖から選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、Ｌ鎖は、表１に開示のＢＴｘ軽鎖またはＴＴｘ軽鎖から選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、クロストリジウム神経毒素は、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である。表１を参照のこと。例えば、ＢＴｘは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇである。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＬは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン（クロストリジウム神経毒素のＨＮドメインとしても知られる）、または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素の転位ドメインを含む。
１つの実施形態では、転位ドメインは、表１に記載のＨＮを含む。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＨＮは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇ、及び第１の非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘのＨＮドメインから選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＨＮは、表１に開示のＢＴｘのＨＮドメインから選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＭは、侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＭは、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、またはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片（例えば、ＰＡｄ４）、または侵害受容ニューロン結合タンパク質である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、抗体であり、例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在する受容体またはイオンチャネルに結合する抗体である。例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在する受容体は、ＡＮＴＸＲ２またはＮＧＦＲである。例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在するイオンチャネルは、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の変異（ｍｕｔａｎｔ）ＰＡまたは変異（ｖａｒｉａｎｔ）ＰＡである。例えば、アミノ酸残基ＲＫＫＲを含むフーリン切断部位は、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換されている。例えば、フーリン抵抗性のアミノ酸配列は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）である。ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、カルシウムとの結合、ならびにＬＦとの結合及びＥＦとの結合にも関与するＰＡｄ１ドメインを含む。ＰＡｄ１は、ＰＡ（配列番号１）の残基１〜２５８に位置する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、膜への挿入及び７量体化に関与するＰＡｄ２を含む。
１つの実施形態では、ＰＡｄ２は、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７に位置する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、オリゴマー化に関与するＰＡｄ３を含む。ＰＡｄ３は、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜５９４に位置する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、宿主細胞の受容体への結合に関与するＰＡｄ４を含む。１つの実施形態では、ＰＡｄ４は、ＰＡ（配列番号１）の残基５９５〜７３５に位置する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ３ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン、ＰＡｄ３ドメイン、及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＭは、複数のＰＡｄ４ドメインを含み、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個のＰＡｄ４ドメインを含む。１つの実施形態では、複数のＰＡｄ４ドメインは、直列に配置され、本明細書に記載のペプチドリンカーによって連結され得る。
ＰＡｄ４ドメインを含む本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、２〜１０個のＰＡｄ４ドメインを直列で含む。
例えば、ＰＡｄ４、ＰＡ、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインといったＰＡｄ４ドメインを含む本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数がＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されており、この番号付けは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いた後の配列番号１のものを指す。
例えば、ＰＡまたはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインといったＰＡｄ４ドメインを含む本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数が、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されている。
１つの態様では、融合タンパク質は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）と、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインと、を含み、（ａ）部分と（ｂ）部分とは、共に連結または融合される。本明細書では、「融合タンパク質」という用語は、「キメラタンパク質」という用語と互換的に使用される。
１つの実施形態では、ＢＴｘまたはＴＴｘは、ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分及び転位ペプチドまたは転位ドメインを含む。
１つの実施形態では、ＢＴｘ部分または転位ペプチド／ドメインは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘ軽鎖ドメイン及びＢＴｘ重鎖ドメインから選択される。アルファベットが後に続くバックスラッシュ（／Ａ、／Ｂ、／Ｃ等）は、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）ファミリー内のさまざまなセロタイプを示す。
１つの実施形態では、ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分または転位ペプチド／ドメインは、表１に示されるＢｔｘ毒素またはＴＴｘ毒素の酵素部分及び転位ドメインから選択される。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含み、ＰＡまたはそのＰＡ断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。言い換えれば、ここでの融合タンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。
１つの実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖を含む。１つの実施形態では、クロストリジウム神経毒素は、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である。
１つの実施形態では、ＢＴｘは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つから選択される。
１つの実施形態では、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖は、表１に示されるクロストリジウム神経毒素のＬ鎖から選択される。１つの実施形態では、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖は、配列番号２０〜２８から選択される。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）イオンチャネル（例えば、ナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方）をそこで発現する侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と、を含む。言い換えれば、ここでのジスルフィド含有ペプチド毒素は、侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断し、ＴＭは、侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含む。言い換えれば、ここでのジスルフィド含有ペプチド毒素は、侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、または両方の型のチャネルを遮断し、（ｂ）部分は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはＰＡ断片に結合するタンパク質である。
１つの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に含まれるジスルフィド含有ペプチド毒素は、システインノットモチーフ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ ｍｏｔｉｆ）を含む。
１つの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に含まれるジスルフィド含有ペプチド毒素は、コノトキシン、アガトキシン、デルタパウルトキシン（ｄｅｌｔａ ｐａｕｌｕｔｏｘｉｎ）、フエントトキシン（ｈｕｗｅｎｔｏｔｏｘｉｎ）、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である。
１つの実施形態では、侵害受容ニューロンに発現したＰＡ結合受容体は、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である。
１つの実施形態では、ＰＡまたはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する。
１つの実施形態では、ＴＭは、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、（ｉｉ）ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）侵害受容ニューロン結合タンパク質からなる群から選択される。
１つの実施形態では、ＰＡは、フーリン（ｆｕｒｉｎ）による切断に抵抗性の変異ＰＡである。
１つの実施形態では、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ６３またはＰＡｄ４である。
１つの実施形態では、ＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡｄ４、ＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、修飾されるか、または変異導入される。
１つの実施形態では、ＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡｄ４、ＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＬｙｓＣなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性である。
１つの実施形態では、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、抗体である。
１つの実施形態では、抗体は、侵害受容ニューロンに存在する神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、ＡＮＴＸＲ２受容体、またはイオンチャネルタンパク質に特異的に結合する。
１つの実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９から選択される。
１つの実施形態では、ＰＡに結合する能力を有するタンパク質は、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）または炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）である。言い換えれば、ここでのタンパク質は、ＰＡに結合するものであり、ＬＦまたはＥＦである。
１つの実施形態では、ＬＦのＰＡ結合ドメインは、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である。
１つの実施形態では、ＥＦのＰＡ結合ドメインは、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ＡＢ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って毒素（プロテアーゼ）を侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む。言い換えれば、ＴＬは、侵害受容ニューロンのサイトゾルに毒素を転位させる。
１つの実施形態では、ＡＢ毒素は、リシン毒素、コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびにジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分から選択される。
１つの実施形態では、侵害受容ニューロンに発現したＰＡ結合受容体は、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である。
１つの実施形態では、ＰＡ断片は、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインである。
１つの実施形態では、ＴＬは、クロストリジウム神経毒素に由来する転位ドメイン、もしくはホロ毒素であるか、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態である。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）のＣ末端受容体結合ドメインに連結された、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）のＮ末端酵素ドメイン（ＬＣまたはＬ鎖）及び中間ポア形成／転位ドメイン（ＨＮ）を含むＢＴｘ部分を含む。炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインは、例えば、ＰＡｄ４ドメインであり得る。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＢＴｘ部分と、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインまたはＰＡｄ４ドメインとの間にリンカーペプチドをさらに含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）部分のボツリヌス神経毒素Ｎ末端酵素ドメインと、（ｂ）オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、またはオリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含み、（ａ）部分は、（ｂ）部分に対して、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方で連結される。
ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、融合タンパク質は、ＢＴｘのＨＮドメインのＮ末端部分に対応するベルトを定義するアミノ酸配列をさらに含み得、ＢＴｘのＨＮは、ＢＴｘ部分のＣ末端側に位置する。ベルトが存在することでＬ鎖が安定化する。
ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及びＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖とＨＮドメインとの間のＳ−Ｓ架橋は還元されない。
ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及び非ＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖におけるＣｙｓ残基、及びＢＴｘのＨＮドメインのＮ末端部分に対応するベルトにおけるＣｙｓ残基は、存在するのであれば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒに変更され得る。
１つの実施形態では、ＢＴｘのＬ部分と、ＬＦｎドメインまたはＥＦｎドメインとを含む融合タンパク質については、融合タンパク質は、ＢＴｘのＬ部分と、ＬＦｎドメインまたはＥＦｎドメインとの間にリンカーペプチドをさらに含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、ジスルフィド含有ペプチド毒素に連結された、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）、または侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む。１つの実施形態では、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、阻害剤システインノット毒素（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ ｔｏｘｉｎ）である。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＡ、ＰＡｄ４、または侵害受容器結合タンパク質と、ジスルフィド含有ペプチド毒素（例えば、阻害剤システインノット毒素）との間にリンカーペプチドをさらに含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、またはオリゴマー形態のＰＡ６３に結合する、炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）に対して、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方で機能可能なように連結されるか、あるいは１つまたは複数の部位で化学的に架橋されたジスルフィド含有ペプチド毒素を含む。
毒素がＬＦｎまたはＥＦｎに融合した記載の融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、融合タンパク質は、ＬＦｎと毒素との間またはＥＦｎと毒素との間にリンカーペプチドをさらに含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）に連結されたリンカーペプチドに融合したＡＢ毒素を含み、融合タンパク質は、転位ドメイン、ホロ毒素、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態をさらに含む。
ＡＢ毒素を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＡＢ毒素は、リシン毒素、コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、緑膿菌の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびにジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分から選択される。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）に連結された、クロストリジウム神経毒素または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来する転位／ポア形成ドメインと一緒になったＮ末端酵素ドメイン（Ａ鎖）を含む。クロストリジウム神経毒素の例は、破傷風神経毒素（科学文献では、ＴＴｘまたはＴｅＮＴと略されることが多い）である。
１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＴＴｘ部分とＰＡｄ４ドメインとの間にリンカーペプチドをさらに含む。
リンカーを有すると記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。
リンカーを有すると記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、ヒト血清において少なくとも１分間安定である。
リンカーを有すると記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、ＧｌｙまたはＳｅｒであるアミノ酸を少なくとも１個含む。
リンカーを有すると記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、Ｌｙｓ及び／またはＡｒｇを含まない。
ＢＴｘ部分を含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇのいずれか１つのＢＴｘ軽鎖ドメイン及びＢＴｘ重鎖ドメインから選択される。例えば、ＢＴｘ軽鎖ドメイン及びＢＴｘ重鎖ドメインは、本明細書に記載の配列番号２９〜３１または表１から選択される。非クロストリジウムのボツリヌス様毒素も使用することができると特に企図される。
ＰＡｄ４ドメインを含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、融合タンパク質は、２〜１０個のＰＡｄ４ドメインを直列で含む。
ＰＡｄ４ドメイン及びＢＴｘ部分を含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、天然のＰＡｄ４ドメインに隣接する、ＰＡのＮ末端側に由来する約１〜６０個の連続アミノ酸が、ＢＴｘ部分とＰＡｄ４との間にさらに組み込まれる。
ＰＡｄ４ドメイン及びＡＢ毒素を含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、天然のＰＡｄ４ドメインに隣接する、ＰＡのＮ末端側に由来する約１〜６０個の連続アミノ酸が、ＡＢ毒素とＰＡｄ４との間にさらに組み込まれる。
１つの実施形態では、例えば、ＰＡｄ４、ＰＡ、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインといったＰＡｄ４ドメインを含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数がＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されており、この番号付けは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いた後の配列番号１のものを指す。言い換えれば、配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡのＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数（それぞれを含めた最大数を含む）を、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換することができる。
ＰＡｄ４ドメインを含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数が、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されている。
全ＰＡタンパク質を含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、配列番号１（配列番号１における２９残基のシグナルペプチドを差し引いたもの）のアミノ酸残基１６４ＲＫＫＲ１６７を含む、フーリンによるＰＡの切断部位は、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換されている。１つの実施形態では、フーリン抵抗性のアミノ酸配列は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）である。
ＰＡｄ４ドメインを含むと記載される融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、配列番号１（配列番号１における２９アミノ酸残基のシグナルペプチドを差し引いたもの）の位置６０１、位置７１３、位置７１９で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＡｓｎ残基の１つまたは複数がＡｓｐによって交換されている。
本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に少なくとも１個のＤ−アミノ酸をさらに含む。
ＢＴｘのＬ鎖及びＨ鎖のすべてまたは一部を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘのＬ鎖とＢＴｘのＨ鎖との接合部に対応する残基は切断されている。
侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、抗体である。１つの実施形態では、抗体は、侵害受容ニューロンに存在するＮＧＦ受容体またはイオンチャネルタンパク質に特異的に結合する。１つの実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９から選択される。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、先行パラグラフに記載の融合タンパク質のいずれか１つを含む。１つの実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。
記載の組成物のいずれかの実施形態の１つでは、組成物は、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）をさらに含む。１つの実施形態では、ＰＡは、オリゴマーＰＡである。１つの実施形態では、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合される。
別の態様では、核酸が本明細書で提供され、当該核酸は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかをコードする。
別の態様では、ベクターが本明細書で提供され、当該ベクターは、先行パラグラフに記載の核酸を含む。例えば、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス粒子、またはウイルスベクターである。例えば、プラスミドは、細菌における組換えタンパク質の発現を目的とする発現プラスミドであり、こうした細菌は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。別の態様では、ウイルス粒子が本明細書で提供され、当該ウイルス粒子は、先行パラグラフに記載の核酸を含むベクターを含む。別の態様では、ウイルス粒子が本明細書で提供され、当該ウイルス粒子は、先行パラグラフに記載の核酸を含む。
別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターを含む。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。例えば、核酸にコードされる融合タンパク質の組換えタンパク質発現を目的とする。別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、先行パラグラフに記載の核酸を含むベクターを含むウイルス粒子を含む。別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、先行パラグラフに記載の核酸を含むウイルス粒子を含む。
別の態様では、融合タンパク質の産生方法が本明細書で提供され、当該方法は、融合タンパク質が発現する条件下での本明細書の上記の細胞の培養と、融合タンパク質の回収と、を含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、先行パラグラフに記載の方法によって産生される。
１つの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか、または本明細書に記載の方法によって産生される融合タンパク質は、グリコシル化される。別の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか、または本明細書に記載の方法によって産生される融合タンパク質は、グリコシル化されない。
融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、細菌などの原核細胞である。融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、細菌細胞である。１つの実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ））である。別の実施形態では、細菌は、弱毒化されたＢ．アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株であり、例えばＣＤＣ６８４である。融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、酵母細胞である。１つの実施形態では、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、酵母細胞は、グリコシル化能を欠損している。
融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、酵母細胞は、グリコシル化能及びプロテアーゼを欠損している。
融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、哺乳類細胞である。１つの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＮＳＯ細胞である。
１つの実施形態では、疼痛の治療を目的とする本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかの使用が本明細書で提供される。
１つの実施形態では、疼痛の治療を目的とする薬物の製造を目的とする本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかの使用が本明細書で提供される。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、例えば、コノトキシン（ＣＴｘ）といった阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む。別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む。１つの実施形態では、この融合タンパク質は、クロストリジウム神経毒素のＨ鎖のベルトをさらに含み得、ベルトは、Ｈ鎖のＮ末端セグメントである。別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、細胞内作用毒素（例えば、ＡＢ型毒素）と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。言い換えれば、分子は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、ＰＡは、１つまたは複数の受容体への結合が増進するようにさらに操作され得る。言い換えれば、分子は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする。
１つの実施形態では、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子、またはそれを特異的に標的とする分子は、ＮＧＦ受容体に特異的に結合する抗体もしくは抗体模倣物、またはＮａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、もしくはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体もしくは抗体模倣物から選択される。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネルを特異的に標的とする能力を有する分子は、１つまたは複数の受容体への結合が増進するようにさらに操作され得る。
１つの実施形態では、細胞内作用毒素の触媒ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）、破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、炭疽菌致死毒素（致死因子、ＬＦ）、及び／または炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子、ＥＦ）から選択される。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、天然の防御抗原（ＰＡ）、またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容ニューロンの表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽菌致死因子（ＬＦ）と組み合わせて含む。
先行パラグラフのいずれかの操作された融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡまたはｍＰＡは、共有結合性または非共有結合性のオリゴマー形態である。１つの実施形態では、オリゴマー形態は、例えば、共有結合性または非共有結合性に分子に結合される。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、例えば、コノトキシン（ＣＴｘ）といった阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含む。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質を含む。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネルを特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された、操作された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む操作された融合タンパク質を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、ＰＡは、１つまたは複数の受容体への結合が増進するようにさらに操作され得る。
１つの実施形態では、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネルを特異的に標的とする能力を有する分子は、ＮＧＦと、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体と、から選択される。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネルを特異的に標的とする能力を有する分子は、１つまたは複数の受容体への結合が増進するようにさらに操作され得る。
別の実施形態では、細胞内作用毒素の触媒ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、炭疽菌致死毒素（致死因子、ＬＦ）、及び／または炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子、ＥＦ）から選択される。
別の態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、天然の防御抗原（ＰＡ）、またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容ニューロンの表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）と組み合わせて含む操作された融合タンパク質を含む。
１つの実施形態では、ＰＡまたはｍＰＡは、オリゴマー形態である。１つの実施形態では、オリゴマー形態は、分子に結合される。
１つの実施形態では、融合タンパク質含有組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書で提供され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物の投与を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書で提供され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、天然の成熟炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、及び炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、またはそれらの任意の組み合わせの投与を含む。
別の態様では、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、または筋肉の疼痛の治療方法が本明細書で提供され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物の、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、神経内注射、または関節内注射による末梢性投与を含む。
別の態様では、糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物の硬膜外注射、くも膜下腔内注入、または脳室内注入による、それを必要とする対象の中枢神経系への投与を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該組成物は、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含み、操作された融合タンパク質は、侵害受容ニューロンに送達され、その結果、侵害受容ニューロンにおける細胞内シグナル伝達事象が低減されるか、または侵害受容ニューロンからの神経伝達物質の放出が低減される。
１つの実施形態では、細胞内作用毒素の触媒ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、炭疽菌致死毒素（致死因子）、及び／または炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子）から選択される。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該組成物は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（Ｐａｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、組成物の有効量での投与を含み、当該組組成物は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素致死因子（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質を含む。あるいは、疼痛の治療は、それを必要とする対象に対する、組成物の有効量での投与によって実施され、当該組成物は、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質、または細胞内作用毒素（例えば、ＡＢ型毒素）と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質を含む。１つの実施形態では、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖を含む融合タンパク質は、クロストリジウム神経毒素のＨ鎖のベルトをさらに含み得、ベルトは、Ｈ鎖のＮ末端セグメントである。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された、操作された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）との、それを必要とする対象への、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含む。
１つの実施形態では、分子は、ＮＧＦ受容体に特異的に結合する抗体と、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体と、から選択される。
別の実施形態では、細胞内作用毒素の触媒ドメインは、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）、破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、炭疽菌致死毒素（致死因子）、及び／または炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子）から選択される。
いくつかの態様では、先行パラグラフに記載の組成物のいずれか、または先行パラグラフに記載の融合タンパク質を含む組成物のいずれかは、疼痛の治療に使用される。疼痛の治療は、先行パラグラフに記載の複数の異なる組成物、すなわち、いくつかの異なる組成物の投与を含み得る。
別の態様では、それを必要とする対象における疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、天然の防御抗原（ＰＡ）、またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容器の表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽菌致死因子（ＬＦ）と組み合わせて含む操作された融合タンパク質の対象への投与を含む。
１つの実施形態では、ＰＡまたはｍＰＡは、オリゴマー形態で投与され、オリゴマーＰＡまたはオリゴマーｍＰＡは、タンパク質分解性に活性化したＰＡもしくはｍＰＡ（またはその変異体）から形成されることで、受容体を有する細胞に対する親和性の増加が達成される。１つの実施形態では、オリゴマー形態は、投与前に分子に結合される。
１つの実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤に炭疽菌防御抗原（ＰＡ）を含む組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に、別に投与される。
１つの実施形態では、投与は、中枢神経系へのくも膜下腔内注入もしくは脳室内注入もしくは硬膜外注射によって実施されるか、または皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、神経内注射、もしくは関節内注射を使用する末梢性投与によって実施される。
別の実施形態では、疼痛は、糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、他の全身性疼痛障害、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、及び筋肉の疼痛から選択される。
別の態様では、医薬組成物の製造方法が本明細書で提供され、当該医薬組成物は、先行パラグラフに記載の融合タンパク質の１つまたは複数と、医薬的に許容可能な担体または賦形剤と、を含む。
別の態様では、疼痛の治療を目的とする薬物の製造における使用を目的とする、先行パラグラフに記載の融合タンパク質が本明細書で提供される。１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化される。
別の態様では、疼痛の治療における使用を目的とする、先行パラグラフに記載の融合タンパク質が本明細書で提供される。１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化される。
図１Ａ及び図１Ｂは、他の神経系組織と比較して、炭疽毒素受容体が後根神経節に特異的に発現していることを示す。（図１Ａ）１１の神経組織型の発現プロファイルデータであり、侵害受容ニューロンが見られる場所である後根神経節組織のみにＡｎｔｘｒ２転写物の発現が存在することを示している。（図１Ｂ）Ａｎｔｘｒ２のインサイチュハイブリダイゼーション画像であり、後根神経節には強い発現が見られるが、周辺組織または脊髄には発現は見られないことを示す。 自己受容感覚ニューロン（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｏｒ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎ）と比較して、Ａｎｔｘｒ２が侵害受容ニューロンに高度に濃縮されていることを示す（大きなドット及び矢印）。火山型プロット（Ｐ値と差異の倍数変化との対比）は、自己受容ニューロン（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）と比較して、Ａｎｔｘｒ２が疼痛感受性侵害受容ニューロンに強く濃縮されていることを示す。 防御抗原（ＰＡ）が、単独ではニューロンにおけるタンパク質合成を阻害しないことを示す。 ＰＡが、単独ではニューロンにおけるタンパク質合成を阻害しないことを示す。 融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴＸによるニューロンにおけるタンパク質合成の阻害がＰＡの存在に依存するものであり、ＬＦｎ−ＤＴＸが、侵害受容ニューロンにおけるタンパク質合成を細胞内においてピコモル濃度で遮断できることを示す。 ＰＡと、融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴＸが、ニューロンにおけるタンパク質合成を阻害することを示す。 図７Ａは、ＢｏＴＸタンパク質のさまざまなドメインと、ＰＡ由来の異なるタンパク質とを使用した、ＢｏＴＸ−ＰＡ融合タンパク質の実施形態のモジュール式の構築を示す。ＰＡ由来のタンパク質は、Ｐａｄ４ドメイン、またはフーリンプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性のＰＡである。図７Ｂは、ＴＴＸタンパク質のさまざまなドメインと、ＰＡ由来の異なるタンパク質とを使用した、ＴＴＸ−ＰＡ融合タンパク質の実施形態のモジュール式の構築を示す。ＰＡ由来のタンパク質は、Ｐａｄ４ドメイン、またはフーリンプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性のＰＡである。 図８Ａは、ＢｏＴＸと、ＰＡ結合ドメインであるＬＦｎまたはＥＦｎと、を含む融合タンパク質の実施形態のモジュール式の構築を示す。融合タンパク質は、２つのＰＡ結合タンパク質（ＬＦ及びＥＦ）のＰＡ結合ドメインと共に、さまざまなＢｏＴＸセロタイプに由来する軽鎖／触媒ドメインを使用して調製した。こうしたＢｏＴＸ−ＰＡ結合融合タンパク質は、疼痛の治療を目的として、天然のＰＡタンパク質と組み合わせて使用されることになる。図８Ｂは、ＴＴＸまたは他の細胞内作用毒素と、ＰＡ結合ドメインであるＬＦｎまたはＥＦｎと、を含む融合タンパク質の実施形態のモジュール式の構築を示す。こうした融合タンパク質は、２つのＰＡ結合タンパク質（ＬＦ及びＥＦ）のＰＡ結合ドメインと共に、ＴＴＸタンパク質またはさまざまな他の細胞内作用毒素の軽鎖／触媒ドメインを使用して調製した。 小型のジスルフィド含有毒素または阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と、ＰＡ由来のタンパク質と、を含む融合タンパク質の実施形態のモジュール式の構築を示す。ＰＡ由来のタンパク質は、Ｐａｄ４ドメイン、またはフーリンプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性のＰＡである。
発明の詳細な説明
略語：ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）＝炭疽毒素の細胞表面受容体。ＰＡ＝炭疽毒素防御抗原（８３ｋＤａ）。ＰＡ６３＝フーリンによる切断で生じる６３ｋＤａの活性ＰＡ断片であり、自己会合して環状の７量体または８量体となることで受容体結合型のプレポア（ｐｒｅｐｏｒｅ）を形成する。ＰＡ６３プレポアは、最大３つまたは４つのＥＦ、ＬＦ、ＬＦｎ、またはＥＦｎと結合し、エンドサイトーシスによる取り込みが後に生じる複合体を形成する。ＰＡｄ１＝ＬＦ／ＥＦ結合成分またはＰＡ断片。ＰＡｄ２＝膜転位成分またはＰＡ断片、炭疽菌由来の転位ドメインまたはペプチド。ＰＡｄ３＝オリゴマー化成分またはＰＡ断片。ＰＡｄ４＝ＡＮＴＸＲ１受容体及びＡＮＴＸＲ２受容体（ＰＡの天然受容体）に対するＰＡの宿主細胞受容体結合ドメイン。ＰＡフーリン−＝フーリンプロテアーゼの認識部位が修飾または変異したフーリン抵抗性ＰＡであり、多量体化及び転位の能力は有さず、ＬＦｎまたはＥＦｎに結合しないが、宿主細胞の受容体には依然として結合することができる。ＩＣＫ＝阻害剤システインノット。ＬＦｎ＝炭疽毒素致死因子のＮ末端ＰＡ結合ドメイン（「炭疽毒素転位ペプチド」）。ＥＦｎ＝炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ＰＡ結合ドメイン（「炭疽菌転位シグナルペプチド」とも）。ＬＦ＝炭疽菌致死毒素（致死因子）。ＥＦ＝炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子）。ｍＰＡ＝その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原部分。Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９＝イオンチャネルタンパク質。ＤＴｘ＝毒素のＡ成分及びＢ成分を含むジフテリア毒素、ＤＴＡ＝毒素のＡ成分（酵素成分であり、細胞内作用毒素である成分）のみのジフテリア毒素。ＰＥまたはＰＴｘ＝緑膿菌の外毒素Ａ。ＢＴｘまたはＢｏＴＸまたはＢｏＮＴ＝ボツリヌス毒素。ＴＴｘ＝破傷風毒素。ＣＴｘ＝コノトキシン。ＣＮＴ＝クロストリジウム神経毒素ファミリー。ＬＣまたはＬ＝クロストリジウム神経毒素ファミリーの神経毒素メンバーの５０ｋＤａの軽鎖であり、Ｌは、亜鉛依存性エンドペプチダーゼとして機能する。ＨＣ＝２つの機能性ドメイン（それぞれ約５０ｋＤａ）を含む重鎖（ＨＣ＝ＨＮ＋ＨＣ）。ＨＮ＝ＨＣのＮ末端側半分であり、クロストリジウム神経毒素ファミリーの神経毒素メンバーの転位ドメインである。ＨＮは、脂質二重層にイオンチャネルを形成することが知られる。ＨＣ＝ＨＣのＣ末端側半分であり、クロストリジウム神経毒素ファミリーの神経毒素メンバーの受容体結合ドメインである。ＬＨＮ＝Ｌ＋ＨＮ。
本明細書に別段の定義がない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、及び試薬等に限定さるものではなく、したがって、変わり得るものであると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、本発明の範囲の限定は意図されず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。分子生物学の一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．出版，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．出版，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ出版，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５、９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ、９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５、９７８０４７１１４２７３７）において見つけることができ、こうした文献の内容はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願を通じて引用される参考文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願を含む特許及び他の刊行物はすべて、例えば、本明細書に記載の技術と関連して使用される可能性のある、そのような刊行物に記載の方法論の説明及び開示を目的として、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。こうした刊行物は、本出願の出願日より前の、その開示内容のみを対象として提供される。この点に関して、先行発明であるという理由または任意の他の理由によって、そのような開示に先行する権利が本発明者らに付与されないことの承認であると解釈されるべきことは何もない。日付に関する記載またはこうした文書の内容に関する表現はすべて、本出願者らが利用可能な情報に基づいており、こうした文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認にもならない。
本開示の実施形態の説明は、完全網羅、または詳細な開示形態への本開示の限定を意図するものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例は、例示を目的として本明細書に記載されるが、さまざまな同等の改変が本開示の範囲内で可能であると当業者であれば認識するであろう。例えば、方法の段階または機能は、所与の順序で示されるが、代替の実施形態では、異なる順序で機能を実施してよく、または機能は、実質的に同時に実施してよい。本明細書で提供される本開示の教示内容は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載のさまざまな実施形態は、追加の実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、上記の参考文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いるために必要に応じて改変することで、本開示の実施形態をさらに追加で提供することができる。さらに、生物学的機能的同等性を考慮すると、生物学的または化学的な作用に本質的または全体的に影響を与えることなく、タンパク質構造に何らかの変更を施すことができる。説明が詳細であることを踏まえると、本開示に対してこうした変更及び他の変更を施すことができる。そのような改変はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
我々は、疼痛感受性侵害受容器への、疼痛鎮静化分子の特異的送達を利用し、疼痛の新規治療方法を同定した。
炭疽の原因病原体であるバチルス・アントラシスによって引き起こされる皮膚病変は、無痛であるという特徴を有する。疼痛感受性侵害受容ニューロンは、炭疽毒素の受容体であるＡＮＴＸＲ２を高レベルで特異的に発現する一方で、他のニューロンサブタイプはこの受容体を発現しないか、または実質的に発現しないことを我々は発見した。関節リモデリングに関与する造血系細胞（マクロファージ、破骨細胞、骨芽細胞）も炭疽毒素受容体を発現する。理論に拘束されるものではないが、炭疽毒素は、侵害受容感覚ニューロンに存在するＡＮＴＸＲ２を介した作用によって感染の間に疼痛を鎮静化しており、関節リモデリングに関与する免疫細胞を標的とするためにも使用できるということを我々は提唱する。
その天然の標的受容体に対する炭疽受容体結合性が除去された系（米国特許出願公開第２０１５００４４２１０号）を含む、炭疽毒素に基づく異なる送達系を使用した、抗原（米国特許出願公開第２００３０２０２９８９号）及びタンパク質（ＷＯ２０１２０９６９２６）の標的指向化送達系について我々は以前に説明した。こうした系では、細胞への試薬の流入を可能にするために炭疽毒素のポア形成能力が利用された。使用者が所望する細胞結合特異性の操作を可能にするために、炭疽毒素の受容体結合部分は除去された。
簡潔には、防御抗原（ＰＡ）と呼ばれる、炭疽毒素の受容体結合成分は、ＡＮＴＸＲ２に結合し、エンドサイトーシスによって取り込まれ、それに続いて炭疽菌致死因子（ＬＦ）もしくは炭疽菌浮腫因子（ＥＦ）のいずれか、またはそれらの両方を、エンドソーム膜を横切ってサイトゾルに転位させる。本明細書に記載されるように、本発明者らは、主要な炭疽毒素受容体であるＡＮＴＸＲ２が、すべての神経組織の中で侵害受容ニューロンに限定して高度かつ特異的に発現しており、すなわち炭疽毒素は、ＡＮＴＸＲ２への結合を介して侵害受容ニューロンを選択的に標的にするという驚くべき発見をした。天然の炭疽毒素のこの選択的結合を発見したことにより、炭疽毒素及びそのサイトゾルへの送達機構を使用して侵害受容ニューロンを特異的に標的とすることで、高度に特異的かつ効果的に疼痛を遮断することが可能である。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、標的ニューロンは、炭疽系が本来結合する受容体を発現するため、受容体結合性を改変する必要はない。実施形態のいずれかの態様のいくつかでは、炭疽毒素−ＡＮＴＸＲ２相互作用と協調して追加のリガンド−受容体相互作用を使用することによって特異性を増加させ、副作用を低減することができる。本明細書では、慢性疼痛の特異的遮断、筋痙縮の鎮静化、ならびに変形性関節症における疼痛と関節破壊との両方の標的化及び予防のためのプラットフォームとして我々は炭疽毒素を利用した。毒素のポア形成活性のみを使用することで任意の天然の炭疽毒素結合活性とは独立した手段によって標的とした細胞への試薬の流入を可能にする代わりに、炭疽毒素の受容体結合部分を利用することで特定の細胞型に送達を指向化するという点で、本明細書に記載の方法及び組成物は以前の炭疽毒素送達系とは異なる。
慢性疼痛は、社会における大きな社会経済的負担であり、それに対する利用可能な標的指向化治療はほとんど存在しない。侵害受容感覚ニューロンは、侵害性／傷害性の刺激の検出を媒介し、痛覚及び回避行動を生じさせる。炎症の間または神経損傷後に、侵害受容器の活性化が持続すると、慢性疼痛が生じる。我々は、疼痛を治療する新たな標的指向化分子実体を創出するためにタンパク質分解性毒素の使用を提供する。
他のニューロンサブタイプと比較して、炭疽毒素受容体であるＡＮＴＸＲ２が侵害受容器に高度に発現しており、こうしたニューロンに特異的であることを我々は見出した。この知見は、侵害受容器を殺傷する構築物、または中枢神経系（ＣＮＳ）にシグナルを伝達するその能力をその他の形で遮断する構築物の創出を目的とする細胞特異性決定因子として、炭疽毒素の防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を我々が使用できるということを示唆している。
他の疼痛治療では他のニューロンサブタイプに対する非特異的作用が多発することと比較して、この驚くべき方針の利点は、末梢の疼痛感受性ニューロンを特異的に標的とする点である。
標的指向化された鎮痛剤としての使用を目的とする、炭疽毒素などの細胞内作用毒素、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素などのジスルフィド含有ペプチド毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）などのＡＢ型毒素、ならびに破傷風毒素（ＴＴｘ）及び／またはボツリヌス毒素（ＢＴｘ）などのＳＮＡＲＥ標的毒素の操作について我々は説明する。いくつかの実施形態では、こうした毒素は、こうした毒素の細胞内酵素活性の侵害受容ニューロンへのＰＡ介在性送達に依存する。
操作された融合（キメラ）タンパク質のモジュール式の構築に有用な毒素ならびにその成分、部分、及び断片
炭疽毒素
炭疽毒素は、病原性細菌株であるバチルス・アントラシスによって分泌される３つのタンパク質成分の３量体複合体である。この３つのタンパク質成分は、防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）、及び致死因子（ＬＦ）である。ＰＡは、受容体への特異的な標的指向化及び結合を媒介する８３ｋＤａのタンパク質である。その受容体である腫瘍内皮マーカー−８（Ｔｕｍｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ Ｍａｒｋｅｒ−８）（ＴＥＭ８もしくは「ＡＮＴＲＸ１」）または毛細管形態形成タンパク質２（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ＣＭＧ２もしくは「ＡＮＴＸＲ２」）のいずれかに結合すると、ＰＡ８３は、フーリンまたは他のフーリン様プロテアーゼによってタンパク質分解性に活性化し、Ｎ末端断片（ＰＡ２０）が除去され、残存断片（ＰＡ６３）が受容体に結合して残る。これによってＰＡが活性化し、それが多量体化することで、最大４つのＥＦ／ＬＦ分子と結合する７量体／８量体の形成が可能になる。ＰＡ６３は、自発的にオリゴマー化することで環状の７量体または８量体の「プレポア」を形成する。この「プレポア」は、ｎＭという高親和性でＬＦまたはＥＦに結合する能力を有する結合部位を含む。ＬＦ及びＥＦ（それぞれ約９０ｋＤａ）は、プレポアに結合する相同性の約２６０残基のＮ末端ドメインを有する。ＬＦ及びＥＦの酵素部分は、Ｃ末端に位置する。得られた複合体は、エンドサイトーシスによって内部移行し、エンドソームの低ｐＨ下に置かれる。ＰＡ６３プレポアは立体構造を変化させ、膜に突き刺さり、結合積み荷分子（ＬＦ／ＥＦ）をサイトゾルに輸送する。サイトゾルでは、ＬＦ／ＥＦはリフォールディングされ、そのそれぞれの反応を触媒する。ＬＦは、ある特定のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＡＰキナーゼキナーゼとしても知られる））の加水分解（切断）を触媒する亜鉛依存性エンドペプチダーゼであり、これによって細胞のシグナル伝達経路の多くが破壊されることで、最終的に細胞死が引き起こされる。ＥＦは、細胞におけるｃＡＭＰを異常レベルに増加させるカルモジュリン及びカルシウム依存性のアデニル酸シクラーゼである。細胞内ｃＡＭＰが変化すると、膜透過性に影響し、浮腫の原因となり得る。マクロファージ及び好中球では、貪食プロセスに必要なＡＴＰ貯蔵の欠乏が追加作用として生じる。下記のものは、炭疽毒素で生じ得る可能のある組み合わせのリストである：ＰＡ＋ＬＦ（致死活性を引き起こす）、ＥＦ＋ＰＡ（浮腫を引き起こす）、ＥＦ＋ＬＦ（細胞に対する毒性作用を有さない）、及びＰＡ＋ＬＦ＋ＥＦ（対象細胞において致死活性及び浮腫を引き起こす）。ＬＦは、Ｎ末端ＰＡ結合ドメイン（本明細書では、「ＬＦＰＡＢＤ」または「ＬＦｎ」と略される）及びＣ末端タンパク質分解成分からなる。ＬＦは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼを切断することによって作用する。ＥＦは、Ｎ末端ＰＡ結合ドメイン（本明細書では、「ＥＦＰＡＢＤ」または「ＥＦｎ」と略される）、中心酵素成分、及びＣ末端カルモジュリン結合成分からなる。ＥＦは、細胞のｃＡＭＰレベルを上昇させるカルシウム依存性アデニル酸シクラーゼである。ＭＡＰキナーゼ及びｃＡＭＰシグナル伝達は共に、侵害受容器によるシグナル伝達の媒介に非常に重要であることが明らかとなっている。
ＰＡは、４つの構造的に異なるドメインにまたがって分布する４つの主要な機能を有する。こうした４つのドメインは、ＬＦ／ＥＦ結合成分（ＰＡｄ１）、膜転位成分（ＰＡｄ２）、オリゴマー化成分（ＰＡｄ３）、及び宿主細胞受容体結合成分（ＰＡｄ４）である。
本明細書で使用される「炭疽毒素防御抗原」または「ＰＡ」は、ＡＮＴＸＲ２受容体に特異的かつ選択的に結合した後、細胞膜にポアを形成し、積み荷毒素を転位させる、オリゴマー形態をとるポリペプチドを指す。ＰＡの配列は、当該技術分野において知られており、例えば、（ＮＣＢＩ遺伝子番号：３３６１７１４（配列番号１）（Ｎ末端に位置する２９アミノ酸残基のペプチド配列は、シグナルペプチド：
Figure 2018525021
）である。アミノ酸残基の番号付けは、シグナルペプチドを有する配列番号１に対する参照を用いたものであり得る。あるいは、アミノ酸残基の番号付けは、シグナルペプチドを有さないＰＡ配列に対する参照を用いたものであり得る。ＰＡは、宿主細胞表面のＡＮＴＸＲ２受容体に結合し、フーリンファミリーのプロテアーゼによって切断されることで、受容体結合型のプレポアを形成する環状の７量体または８量体へと自己会合する６３ｋＤａの活性ＰＡ形態（ＰＡ６３）となる。ＰＡ６３プレポアは、例えば、炭疽菌致死因子といった、最大３つまたは４つの分子と結合し、エンドサイトーシスによる取り込みが後に生じる複合体を形成する。エンドソームが酸性化すると、防御抗原プレポアに立体構造の再編成が生じ、膜貫通型のイオン電導性ポアが形成される。このポアによって炭疽菌致死因子及び／または炭疽菌浮腫因子がエンドソームからサイトゾルに輸送される。炭疽菌致死因子のＮ末端ドメインであるＬＦｎは、ポアに対するナノモル濃度の結合親和性を有し、このドメイン（または対応するＥＦドメインであるＥＦｎ）は、化学部分の転位に単独で使用することができる。
フーリンファミリーのプロテアーゼによる切断部位は、１６４ＲＫＫＲ１６７に含まれ、切断は、１６７ＲＳ１６８の間で生じる。アミノ酸残基のこの番号付けは、配列番号１から２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いたものに対する参照である。フーリン部位を除去してフーリン抵抗性のＰＡを調製するために、ＲＫＫＲ（配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７）をＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）と交換することができる（結果的にすべての塩基性残基が除去される）。フーリンによる切断部位を除去することで、フーリン抵抗性のＰＡ（ＰＡフーリン−）が得られ、多量体化及び転位が阻止されることになる。
本明細書で使用される「炭疽毒素浮腫因子」または「ＥＦ」は、カルモジュリン及びＣａ２＋依存性のアデニリルシクラーゼを指し、当該アデニリルシクラーゼは、細胞内のｃＡＭＰレベルを上昇させる。ＥＦの配列は知られており、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：３３６１７２６（配列番号６）である。
本明細書で使用される「炭疽毒素致死因子」または「ＬＦ」は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーのほとんどを切断するメタロプロテアーゼを指す。ＬＦの配列は知られており、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：３３６１７１１（配列番号７）である。ＥＦ及びＬＦのさらなる考察については、例えば、Ｌｅｐｐｌａ，７９ ＰＮＡＳ，３１６２（１９８２）、Ｄｕｅｓｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７３４（１９９８）、Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２４８ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．７０６（１９９８）を参照のこと。こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「炭疽菌転位シグナルペプチド」または「炭疽毒素転位ペプチド」は、ポリペプチドに含まれる及び／または連結されると、そのポリペプチドがＰＡまたはｍＰＡ（任意選択でオリゴマー複合体のＰＡまたはｍＰＡ）に結合し、成熟ＰＡ／ｍＰＡポアによって標的細胞の細胞質に転位されるようになる、炭疽菌由来のドメインまたはペプチドを指す。いくつかの実施形態では、炭疽毒素転位ペプチドは、ＬＦｎ（例えば、配列番号７（そのＮ末端シグナルペプチドを有する全長ＬＦ）のアミノ酸３４〜２６７、アミノ酸３４〜２９３、もしくはアミノ酸３４〜２９７）、ＥＦｎ（例えば、配列番号６のアミノ酸５９〜２７７もしくはアミノ酸３４〜２９０）、またはその変異体であり得る。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ＰＡポアまたはｍＰＡポアを介する積み荷分子の転位を促進するために、ＬＦｎまたはＥＦｎを模倣する正に荷電した小型のペプチドセグメントを使用することができる。こうした模倣物は、少なくとも１つの非天然アミノ酸から構成され得るものであり、例えば、国際特許公開ＷＯ２０１２／０９６９２６、米国特許第９０７９９５２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３３６９７４号及び第ＵＳ２０１５／０２６７１８６号においてより詳細に説明されており、こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「ＰＡｄ４」または「防御抗原ドメイン４」は、宿主細胞の細胞受容体（例えば、ＡＮＴＸＲ１及び／またはＡＮＴＸＲ２）を認識して結合するＰＡのドメインを指す。ＰＡｄ４は、配列番号１（シグナルペプチドを含めた配列）のおよそアミノ酸６２１〜およそアミノ酸７６４の配列を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ＰＡｄ４は、配列番号１（シグナルペプチドを有するＰＡのアミノ酸配列）のアミノ酸６２１〜７６４を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ＰＡｄ４は、配列番号１のアミノ酸５９６〜７３５を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、配列番号１のアミノ酸６２５〜７６４を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の別の実施形態では、ＰＡｄ４は、配列番号１のアミノ酸６１６〜７６４を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の別の実施形態では、ＰＡｄ４は、配列番号１のアミノ酸６０９〜７６４を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
から本質的になる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
から本質的になる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、
Figure 2018525021
から本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質のすべての態様の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、リンカーペプチドによって他のタンパク質または毒素に融合または連結される。リンカーペプチドの例には、
Figure 2018525021
が含まれる。
ＰＡｄ４のＮ末端に付加されるリンカーペプチドの例は、下記に示されるものであり、リンカーペプチドの配列は、太字で示される。
Figure 2018525021
ＳＮＡＲＥ標的毒素（ＢＴｘ及びＴＴｘを含む）
ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ（ＢｏＴＸまたはＢｏＮＴとも略される））は、神経筋接合部におけるアセチルコリン放出が阻害される結果として生じる下行性弛緩性麻痺によって特徴付けられるボツリヌス中毒を引き起こす。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の細菌によって産生されるボツリヌス神経毒素には、７つのセロタイプ（Ａ〜Ｇ）が存在する。さらに、非クロストリジウム種であるワイセラ・オリゼ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｏｒｙｚａｅ） ＳＧ２５Ｔに由来するボツリヌス様神経毒素が最近発見された（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏ．Ｒｔｓ｜６：３０２５７｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３０２５７）。ＢＴｘは、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）によって産生される破傷風神経毒素（ＴＴｘ）と共に、クロストリジウム神経毒素（ＣＮＴ）ファミリーを構成する。ＴＴｘは、ＢＴｘ、特に、ＢＴｘ／Ｂに対して高度の配列相同性及び構造相同性を示すと共に、破傷風の原因因子であり、破傷風は、痙性麻痺によって特徴付けられる。臨床徴候は異なるものの、神経伝達の基本的な阻害作用様式は、すべてのＣＮＴで共通している。ＣＮＴによる神経伝達物質の放出阻害は、開口分泌プロセスに不可欠な一群のタンパク質であるＳＮＡＲＥタンパク質（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体）が特異的に切断されることによって引き起こされる。１つまたは複数のＳＮＡＲＥタンパク質が切断されると、細胞外環境への小胞内容物の放出が遮断される。
ＳＮＡＲＥを標的とするこうした毒素は、類似の基礎ＣＮＴ構造を共有している。ＣＮＴは、約１５０ｋＤａの単鎖ポリペプチド（ホロ毒素）として合成された後に切断されることで、単一のジスルフィド結合によって連結された軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とから構成される２つの鎖を含む分子を形成する。５０ｋＤａのＬＣは、亜鉛依存性エンドペプチダーゼとして作用する。重鎖は、それぞれが約５０ｋＤａの２つの機能性ドメインを含む。Ｎ末端側半分（ＨＮ）は、転位ドメインであり、この転位ドメインは、脂質二重層にイオンチャネルを形成することが知られている。Ｃ末端側半分（ＨＣ）は、ガングリオシド及びタンパク質に対する結合ドメインであり、この結合ドメインは、標的細胞の膜への結合、及びコリン作動性ニューロンへの毒素分子の内部移行において重要な役割を有する。これらの３つの機能性ドメインは、構造的に異なり、直線状に配置されており、その結果、ＬＣドメインとＨＣドメインとの間で接触は生じない。全体的に見て、ＢＴｘとＴＴｘとは、約３５％の配列同一性を共有する。ＢＴｘの触媒ＬＣドメインは、最大３６％の配列同一性を共有し［２］、ＢＴｘ／ＢのＬＣドメインとＴＴｘのＬＣドメインとは、５０％を超える同一性を有する。（Ｒｅｖｉｅｗ“Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ ｔｅｔａｎｕｓ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｔｉｌｉｔｙ”ｂｙ Ｋ．Ｔｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２７：５５２−５５８を参照のこと）。２つの鎖を含む毒素を形成するための、ホロ毒素の切断に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
ＢＴｘは、クロストリジウム・ボツリヌムという細菌によって産生される神経毒性タンパク質であり、３つの異なるドメインを有する大型の単一ポリペプチド分子として発現する。これら３つの異なるドメインは、５０ｋＤａのタンパク質分解性Ｎ末端（ＬＣ）、中間に位置する５０ｋＤａの転位ドメイン（ＨＮ）、及び５０ｋＤａの宿主細胞受容体結合Ｃ末端（ＨＣ）である。毒素が機能性となるためには、最初にタンパク質分解性に切断されなくてはならず、切断の結果、単一のジスルフィド結合によって共に保持された軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ＝ＨＮ＋ＨＣ）とからなる２つの鎖を含むタンパク質が生成する。タンパク質分解性の活性化は、非常に重要である。この理由は、受容体への結合、及びエンドサイトーシスによる内部移行が生じた後、エンドソームが続いて酸性化することが、タンパク質の立体構造変化を引き起こし、ＨＮドメインのエンドソーム膜への挿入、転位ポアの形成、及びＬＣの細胞質（ここでジスルフィド結合が還元され、ＬＣが放出される）への送達につながると考えられているためである。ＬＣは、高度に特異的な基質特異性を有する亜鉛依存性プロテアーゼである。ＢＴｘには、複数のセロタイプ（Ａ〜Ｇ）及びサブセロタイプ（任意の所与のセロタイプについて最大１２）が存在する。セロタイプは、ボツリヌス神経毒素を中和する中和抗体の能力に基づくものである。今日までに同定されたボツリヌス神経毒素のセロタイプは７つ存在し、こうしたセロタイプは、Ａ〜Ｇ（ＢＴｘ／Ａ〜ＢＴｘ／Ｇ）と分類された。次世代の配列決定法の出現に伴って、セロタイプの中には、サブタイプのＢｏＮＴが存在することが同定され、こうしたものは、他の毒素との配列差異がタンパク質レベルで＞２．５％の毒素として定義される。今日までに４０を超えるサブタイプのＢｏＮＴが７つのセロタイプにまたがって同定されている。異なるセロタイプは、異なる基質特異性を有しており、ＢＴｘ／Ａ及びＢＴｘ／Ｅは、ＳＮＡＰ−２５を切断し、セロタイプ／Ｂ、セロタイプ／Ｄ、セロタイプ／Ｆ、及びセロタイプ／Ｇは、シナプトブレビン／ＶＡＭＰを切断する。ＢＴｘ／Ｃは、ＳＮＡＰ−２５とシンタキシン１Ａとの両方を切断する。こうした基質は、ＳＮＡＲＥ（ＳＮＡＰ（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質）受容体）タンパク質であり、このタンパク質は、シナプス前神経終末における神経伝達物質の放出において非常に重要な役割を担い、すべての真核細胞からの小胞分泌に非常に重要なものである。
ＢＴｘの３つドメイン（ＬＣ、ＨＮ、ＨＣ）は、機能的及び構造的に異なり、それぞれのサブセロタイプについてそれぞれのドメインの境界が当該技術分野において定義されている（Ｒｅｖｉｅｗ“Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ ｔｅｔａｎｕｓ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｔｉｌｉｔｙ”ｂｙ Ｋ．Ｔｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２７：５５２−５５８を参照のこと。この参考文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。５０ｋＤａのドメインのそれぞれが、例えば、キメラタンパク質において互いに独立して機能することができる。ＨＮドメインは、ＬＣの周りを包む「ベルト」領域を有する。これは、偽阻害剤として挙動し、ＬＣによる転位の間にシャペロン機能を有すると考えられている。さまざまなセロタイプのＢＴｘのＨＮのベルト領域またはＴＴｘのＨＮのベルト領域が、表１に示される。
ボツリヌス神経毒素配列の誘導
構造が公開されていないＢＴｘ分子及びＴＴｘ分子については、ｌｏｏｐｐ機関のウェブサイトで利用可能な構造相同性モデリングツールであるＬＯＯＰＰを使用することで、ＢＴｘ／Ａ１（３ＢＴＡ．ｐｄｂ）に基づく予測構造を得た。これによって、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａによるＢＴｘのすべてのサブセロタイプの配列アライメントに加えて、ドメイン間の切り替わり点を決定することが可能であった。ＣｌｕｓｔａｌによるＢＴｘの配列アライメントは、これまでに同定されたＢＴｘのセロタイプ及びサブタイプを対象としてこの文書の最後に示される。
ＬＨＮ＝ボツリヌス神経毒素触媒ドメイン（ＬＣ）＋転位ドメイン（ＨＮ）
それぞれのサブセロタイプのＬＨＮドメインは、当該技術分野において知られており、例えば、Ｌ ＨＮ／Ａ１（残基１〜８７２）及びＬＨＮ／Ｂ１（残基１〜８５９）である。
ＬＣまたはＬ＝ボツリヌス神経毒素触媒ドメイン、（５０ｋＤａ、ｐＩ約６．３〜８．１）
それぞれのサブセロタイプのＬＣドメインは、ＵＳ２００７／０１６６３３２（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）において以前に定義されており、例えば、ＬＣ／Ａ１（残基１〜４４８）及びＬＣ／Ｂ１（残基１〜４４１）であり、以下の表１に要約される。
Figure 2018525021
Figure 2018525021
サブセロタイプに応じて軽微な差異が生じ得るため、上記の参照配列は、指針であると考えられるべきである。例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）では、僅かに異なるクロストリジウム配列が引用されている：
ＬＣ（ＳＮＡＲＥに対する触媒活性または酵素活性を有する）：
ボツリヌスＡ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｋ４４８
ボツリヌスＢ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｋ４４１
ボツリヌスＣ１型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｋ４４９
ボツリヌスＤ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｒ４４５
ボツリヌスＥ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｒ４２２
ボツリヌスＦ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｋ４３９
ボツリヌスＧ型神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ｋ４４６
破傷風神経毒素：アミノ酸残基Ｍ１〜Ａ４５７
ＨＮドメイン：
ボツリヌスＡ型神経毒素：アミノ酸残基Ａ４４９〜Ｋ８７１
ボツリヌスＢ型神経毒素：アミノ酸残基Ａ４４２〜Ｓ８５８
ボツリヌスＣ１型神経毒素：アミノ酸残基Ｔ４５０〜Ｎ８６６
ボツリヌスＤ型神経毒素：アミノ酸残基Ｄ４４６〜Ｎ８６２
ボツリヌスＥ型神経毒素：アミノ酸残基Ｋ４２３〜Ｋ８４５
ボツリヌスＦ型神経毒素：アミノ酸残基Ａ４４０〜Ｋ８６４
ボツリヌスＧ型神経毒素：アミノ酸残基Ｓ４４７〜Ｓ８６３
破傷風神経毒素：アミノ酸残基Ｓ４５８〜Ｖ８７９。
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素
本明細書で使用される「阻害剤システインノット毒素」または「ＩＣＫ毒素」は、システインノットモチーフを含む毒素を指し、これは、受容体及び／またはイオンチャネル標的の活性を調節するものである。阻害剤システインノット（ＩＣＫ）は、３つのジスルフィド架橋を含むタンパク質構造モチーフである。それらの間のポリペプチドセクションと共に、第３のジスルフィド結合（配列における第３システインと第６システインとを連結する）が通り抜けるループを２つのジスルフィドが形成することでノットを形成する（したがって、別名はノッチンである）。このモチーフは、クモ類及び軟体類に由来するものなどの無脊椎動物の毒素に共通している。このモチーフは、植物において見られる阻害剤タンパク質のいくつかにおいても見られるが、植物及び動物のモチーフは、収束進化の産物であると考えられる。ＩＣＫモチーフは、熱変性及びタンパク質分解に抵抗性の非常に安定なタンパク質構造である。毒液のＩＣＫペプチド成分は、電位開口型イオンチャネルを標的とするが、このファミリーのメンバーは、抗菌剤及び溶血剤としても作用する。植物のＩＣＫタンパク質は、プロテアーゼ阻害剤であることが多い。ＩＣＫ毒素は、典型的には、例えば、イモガイ、クモ、及びサソリの毒液において見られる。いくつかの実施形態では、ＩＣＫ毒素は、ジスルフィド含有ペプチド毒素である。こうしたジスルフィド含有ペプチド毒素は、３０〜７０のアミノ酸残基を有する。本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、ＩＣＫ毒素は、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン（ｄｅｌｔａ−ｐａｌｕｔｏｘｉｎ）、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である。
フエントトキシンは、電位開口型カルシウムチャネルに対して作用する、チャイニーズバードスパイダー（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｂｉｒｄ ｓｐｉｄｅｒ）由来の７つの型のＩＣＫ毒素（ＨＷＴＸ−１、ＨＷＴＸ−ＩＩＩ、ＨＷＴＸ−ＩＶ、ＨＷＴＸ−Ｘ、ＨＷＴＸ−ＩＩ、ＨＷＴＸ−ＶＩＩ、ＨＷＴＸ−ＶＩＩＩ）である。
デルタ−パルトキシンは、電位開口型ナトリウムチャネルに対して作用する、クモ由来の４つの型のＩＣＫ毒素（ＩＴ１、ＩＴ２、ＩＴ３、ＩＴ４）からなる。
コノトキシンは、電位開口型のカルシウムチャネル及びナトリウムチャネルに作用する、イモガイ由来の小型の１０〜３０残基のペプチドＩＣＫ毒素である。こうした毒素のいくつかは、イオンチャネルの活性を細胞外で調節する作用を有することが知られている。例としては、Ｗ−コノトキシンＧＶＩＡ及びＷ−コノトキシンＭＶＩＩＣが挙げられる。
本明細書で使用される「コノトキシン」は、海洋イモガイ（例えば、Ｃｏｎｕｓ属）によって産生される毒素を指す。コノトキシンのいくつかは、イオンチャネル活性を調節することができる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、コノトキシンは、イオンチャネル調節因子であり得る。コノトキシンの例には、限定はされないが、δ−コノトキシン（例えば、ＮＣＢＩ番号：ＡＫＤ４３１８５（配列番号１０）であり、さらなる考察については、例えば、Ｌｅｉｐｏｌｄ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００５ ５７９：３８８１−４を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）（電位依存性ナトリウムチャネルを遮断することが知られる）、μ−コノトキシン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号：Ｐ１５４７２．１（配列番号９）であり、さらなる考察については、例えば、Ｌｉ ａｎｄ Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００４ ４４：１１７−１２２を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）（これもまた、電位依存性ナトリウムチャネルを遮断する）、またはω−コノトキシンＭ ＶＩＩ Ａ（例えば、ＮＣＢＩ番号：ＡＤＢ９３０８１（配列番号８）であり、さらなる考察については、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ２０００ １３：５５−７０を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）（例えば、ジコノチド）（Ｎ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断することが知られる）が含まれ得る。ＩＣＫ毒素の追加の例には、限定はされないが、例えば、プサルモトキシン−１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ−１）、β−ＴＲＴＸ−Ｔｐ２ａ、及びピューロトキシン−１（ｐｕｒｏｔｏｘｉｎ−１）が含まれ、こうしたものは、文献において説明されている（例えば、米国特許公開第２０１２０２７７１６６号、第２０１２０２２０５３９号、第２０１２００８７９６９号、第２００５０２１４９０３号、及び第２００５０１４３５６０号、Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｎ ２００１ ３９：４３−６０、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００３ １７：１７６５−７、Ｄａｌｙ ａｎｄ Ｃｒａｉｋ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１ １５：３６２−３６８、Ｇｒｉｓｈｉｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ２６４：２７６−２８０、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｎ ２００４ ４３：５７５−５８５、Ｋｏｌｍａｒ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００８ ２７５：２６８４−２６９０、Ｓａｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｎｓ ２０１０ ２：２８５１−２８７１、Ｖｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２０１１ ４０：１５−２８、Ａｌｅｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３ ５６：７６９−７７４、Ｋｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ １１：１４６９−１４８４、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｎ ２００８ ５２：２６４−２７６、Ｈｅｒｚｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１０、Ｓｚｅｔｏ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０００ ４７０：２０３−２９９、ならびにＢｅｒｇｅｒｏｎ ａｎｄ Ｂｉｎｇｈａｍ．Ｔｏｘｉｎｓ ２０１２ ４：１０８２−１１１９を参照のこと。こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
下記のものは、侵害受容ニューロンへの送達を目的として、ＰＡｄ４、ｍＰＡ、ＰＡフーリン−、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または他の侵害受容器結合タンパク質等に付加することができる、ＩＣＫ毒素由来のシステインノット配列の例である。
Ｗ−コノトキシンＧＶＩＡ：
Figure 2018525021
（修飾：Ｘ＝Ｈｙｐ、１−１６、８−１９、１５−２６の間のジスルフィド架橋、Ｔｙｒ−２７＝Ｃ末端アミド）
Ｗ−コノトキシンＭＶＩＩＣ：
Figure 2018525021
（修飾：１−１６、８−２０、１５−２６の間のジスルフィド架橋、Ｃｙｓ−２６＝Ｃ末端アミド）
Ｗ−アガトキシンＩＶＡ：
Figure 2018525021
（修飾：４−２０、１２−２５、１９−３６、２７−３４の間のジスルフィド架橋）
Ｗ−アガトキシンＴＫ：
Figure 2018525021
（修飾：４−２０、１２−２５、１９−３６、２７−３４の間のジスルフィド架橋）
フエントトキシンＩＶ：
Figure 2018525021
（修飾：ジスルフィド架橋：２−１７、９−２４、１６−３１）（修飾：Ｉｌｅ−３５＝Ｃ末端アミド）
ＰｒｏＴｘ ＩＩ：
Figure 2018525021
（修飾：ジスルフィド架橋：２−１６、９−２１、１５−２５）
ＡＢ毒素
ＡＢ毒素は、多数の病原性細菌によって分泌される、２成分のタンパク質複合体である。そうしたものは、その成分が理由でＡＢ毒素と呼ばれる：「Ａ」成分は、通常、「活性」部分であり、「Ｂ」成分は、通常、「結合」部分である。「Ａ」サブユニット（触媒ドメインまたは触媒活性が見られる場所）は、酵素活性を有し、膜結合型の輸送「Ｂ」サブユニットにおける立体構造変化に続いて宿主細胞に移行する。ある特定のクロストリジウム種によって産生される毒素の中には、２成分外毒素（ｂｉｎａｒｙ ｅｘｏｔｏｘｉｎ）が存在する。こうしたタンパク質は、２つの独立したポリペプチドからなり、これらのポリペプチドは、Ａ／Ｂサブユニット部分に対応する。酵素成分（Ａ）は、オリゴマー結合／転位タンパク質（Ｂ）によって産生されるエンドソームを介して細胞に侵入し、単量体Ｇ−アクチンのＡＤＰリボシル化を介してアクチンの重合を阻止する。
２成分毒素ファミリーの「Ａ」成分の例には、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のイオタ毒素Ｉａ、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のＣ２毒素ＣＩ、及びクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼが含まれる。クロストリジウム・スピノホルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ）では、他の相同タンパク質が見つかっている。
２成分毒素ファミリーの「Ｂ」成分（結合成分または輸送成分としても知られる）の例には、本明細書に記載のバチルス・アントラシスの防御抗原（ＰＡ）タンパク質が含まれる。
ジフテリア毒素（ＤＴ）もまた、ＡＢ毒素である。ジフテリア毒素（ＤＴ）は、真核生物伸長因子２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）のリン酸化を介して宿主細胞におけるタンパク質合成を阻害する。真核生物伸長因子２は、タンパク質合成に必須の成分である。緑膿菌の外毒素Ａは、真核生物伸長因子２を標的とするＡＢ毒素の別の例である。
操作された融合キメラタンパク質
ＢＴｘ／ＴＴｘ−ＰＡｄ４／ＰＡ融合タンパク質
ＴＴｘまたは１つもしくは別のＢＴｘの作用を、ＰＡｄ４結合を介して侵害受容器へと再指向化することを可能にする、ＰＡｄ４に融合したＢＴｘまたはＴＴｘが本明細書に含まれる。これには、受容体結合ドメインが炭疽菌ＰＡの受容体結合機能によって交換されたＢＴｘが含まれる。この構築物では、我々は、ＢＴｘのＣ末端ドメインと、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、ＰＡｄ４、もしくはＰＡ６３、または受容体であるＡＮＴＸＲ２に依然として結合することができる任意のＰＡ断片と、を交換する。ＢＴｘの軽鎖（Ｌ鎖には、酵素部分が含まれる）及び転位ドメイン（ＨＮ）は、ＰＡの受容体結合ドメインに連結される（図７Ａを参照のこと）。例えば、ＰＡｄ４といった、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、侵害受容器に存在するＡＮＴＸＲ２受容体に構築物／融合タンパク質を結合させ、エンドソームへの輸送を媒介することになり、この時点で、ＢＴｘのポア形成ドメイン（ＨＮ）は膜に突き刺さり、ＢＴｘのＬ鎖のサイトゾルへの転位を媒介することになり、サイトゾルでは、Ｌ鎖がＳＮＡＲＥを切断し、神経伝達物質の放出を遮断することになる。ＰＡは、その受容体であるＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）を標的とすることになり、ボツリヌス毒素のＨＮドメインは、ポア形成、転位、及び酵素部分によるシナプス機能の遮断を引き起こすことになる。いくつかの実施形態では、この方針には、ボツリヌス毒素または破傷風毒素が細胞外と細胞内との両方で作用することが必要になる。いくつかの実施形態では、この方針には、Ｌｙｓ−Ｃ酵素による毒素の事前活性化が必要になる。この手法は、破傷風毒素の重鎖における転位ドメイン及び軽鎖ドメインに同様に適用し得る（図７Ｂを参照のこと）。接合部の切断に適した他のプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
したがって、１つの態様では、我々は、融合タンパク質を提供し、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、当該結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、侵害受容ニューロンが、ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含み、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分は、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む。異種性起源は、融合タンパク質の（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分が同一のタンパク質に由来しないことを意味する。本明細書で使用される「切断する能力を有する」という語句は、切断を意味する。侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼの非限定例は、本明細書に記載のＢＴｘ（セロタイプを含む）、ＴＴｘ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素である。
１つの実施形態では、融合タンパク質を含む組成物が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、当該結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、侵害受容ニューロンが、ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含み、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分は、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む。異種性起源は、融合タンパク質の（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分が同一のタンパク質に由来しないことを意味する。本明細書で使用される「切断する能力を有する」という語句は、切断を意味する。侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼの非限定例は、本明細書に記載のＢＴｘ（セロタイプを含む）、ＴＴｘ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素である。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、融合タンパク質組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、プロテアーゼによって融合タンパク質をそこで切断することが可能なプロテアーゼ切断部位をさらに含み、プロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質における非細胞傷害性プロテアーゼのＣ末端に位置する。切断に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む。本明細書に記載の操作された融合タンパク質の構築における使用に適したクロストリジウム神経毒素のＬ鎖の非限定例については、表１を参照のこと。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、Ｌ鎖は、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇ、及び第１の非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘ軽鎖から選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、Ｌ鎖は、表１に開示のＢＴｘ軽鎖またはＴＴｘ軽鎖から選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、クロストリジウム神経毒素は、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である。表１を参照のこと。例えば、ＢＴｘは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇである。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＬは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素の転位ドメインを含む。例えば、転位ドメインは、クロストリジウム神経毒素のＨＮまたは非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のＨＮを含む。１つの実施形態では、転位ドメインは、表１に記載のＨＮを含む。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＨＮは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、またはＢＴｘ／Ｇ、及び第１の非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘのＨＮドメインから選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＨＮは、表１に開示のＢＴｘのＨＮドメインから選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＭは、侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＭは、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、またはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片、または侵害受容ニューロン結合タンパク質である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、抗体であり、例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在する受容体またはイオンチャネルに結合する抗体である。例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在する受容体は、ＡＮＴＸＲ２またはＮＧＦＲである。例えば、侵害受容ニューロンの細胞表面に存在するイオンチャネルは、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の変異ＰＡである。例えば、アミノ酸残基ＲＫＫＲを含むフーリン切断部位は、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換されている。例えば、フーリン抵抗性のアミノ酸配列は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）である。ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、カルシウムとの結合、及びＬＦとの結合及びＥＦとの結合にも関与するＰＡｄ１ドメインを含む。ＰＡｄ１は、ＰＡ（配列番号１）の残基１〜２５８に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、膜への挿入及び７量体化に関与するＰＡｄ２を含む。１つの実施形態では、ＰＡｄ２は、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、オリゴマー化に関与するＰＡｄ３を含む。ＰＡｄ３は、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜５９４に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、宿主細胞の受容体への結合に関与するＰＡｄ４を含む。１つの実施形態では、ＰＡｄ４は、ＰＡ（配列番号１）の残基５９５〜７３５に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ３ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン、ＰＡｄ３ドメイン、及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡ、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、もしくはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片、または侵害受容ニューロン結合タンパク質（例えば、ＰＡｄ４ドメイン）は、例えば、ＬｙｓＣまたはフーリンなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性となるように修飾または変異導入される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡ、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、もしくはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、ＬｙｓＣまたはフーリンなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性である。例えば、位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０で、ＰＡのＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つもしくは複数がＡｒｇもしくはＨｉｓによって交換されているか（この番号付けは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いた後の配列番号１のものを指す）、または配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、Ｌｙｓ残基の１つもしくは複数が、例えば、ＡｒｇもしくはＨｉｓによって交換され得る。ＰＡ、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、もしくはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片、または侵害受容ニューロン結合タンパク質を切断することができる他のプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＰＡｄ４と、（ｂ）ＢＴｘまたはＴＴｘと、を含み、ＰＡｄ４は、ＢＴｘまたはＴＴｘと融合または連結される。ＢＴｘまたはＴＴｘは、ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼである。１つの実施形態では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＰＡｄ４と、（ｂ）ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと、を含み、ＰＡｄ４は、ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと融合または連結される。操作された融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４ドメインは、ＰＡと交換される。１つの実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態である。別の態様では、我々は、（ａ）ＰＡｄ４と、（ｂ）ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと、を含む操作された融合タンパク質を含む組成物を提供し、ＰＡｄ４は、ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと融合または連結される。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＰＡｄ４と、（ｂ）ＢＴｘまたはＴＴｘと、を含む操作された融合タンパク質を含み、ＰＡｄ４は、ＢＴｘまたはＴＴｘと融合または連結される。組成物の別の実施形態では、操作された融合タンパク質のＰＡｄ４ドメインは、ＰＡｄ４の代わりにＰＡを含む。１つの実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態である。本明細書に記載の融合ポリペプチド組成物のいずれかの別の実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４またはＰＡは、ＴＴｘ、ＢＴｘ、またはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼとペプチドリンカーで連結される。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４またはＰＡは、ＢＴｘ神経毒素もしくはＴＴｘ神経毒素の天然の受容体結合ドメインと交換することができるか、または天然の受容体結合機能が変異によって除去されたＢＴｘ神経毒素もしくはＴＴｘ神経毒素の１つの形態に融合される。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素を含み、天然の受容体結合機能は、変異によって除去されている。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素から本質的になり、天然の受容体結合機能は、変異によって除去されている。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素からなり、天然の受容体結合機能は、変異によって除去されている。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、例えば、ホロ毒素タンパク質の１つまたは２つのドメインといった、ホロ毒素ではない、タンパク質の一部のみを含むか、タンパク質の一部のみから本質的になるか、またはタンパク質の一部のみからなる。例えば、ＴＴｘ要素もしくはＢＴｘ要素またはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼ要素は、ＴＴｘ、ＢＴｘ、またはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼのＬＣ及びＨＮ（ＬＨＮ）から本質的になり得る。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書に記載され、当該融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端酵素ドメイン（ＬＣ）を含むボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）部分と、（ｂ）ＢＴｘの中間ポア形成／転位ドメイン（ＨＮ）と、（ｃ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）と、を含み、（ａ）〜（ｃ）部分は、共に連結され、例えば、本明細書に記載のリンカーペプチドによって共に連結される。言い換えれば、ＢＴｘのＬＨＮは、リンカーペプチドによってＰＡのＰＡｄ４ドメインに融合され、ＰＡｄ４は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインである。融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４の代わりにＰＡが含まれる。１つの実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態である。別の態様では、組成物が本明細書に記載され、当該組成物は、（ａ）Ｎ末端酵素ドメイン（ＬＣ）を含むボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）部分と、（ｂ）ＢＴｘの中間ポア形成／転位ドメイン（ＨＮ）と、（ｃ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）と、を含む融合タンパク質を含み、（ａ）〜（ｃ）部分は、共に連結される。１つの実施形態では、組成物は、融合タンパク質において、ＰＡｄ４ドメインの代わりにＰＡを含む。別の実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態である。本明細書に記載のすべての態様の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、クロストリジウムＢＴｘセロタイプであるＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘ軽鎖（ＬＣ）ドメイン及びＢＴｘ重鎖（ＨＣ）ドメインから選択される。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書に記載され、当該融合タンパク質は、（ａ）破傷風神経毒素（ＴＴｘ）のＮ末端酵素ドメイン（ＬＣ）と、（ｂ）ＴＴｘの転位／ポア形成ドメイン（ＨＮ）と、（ｃ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）と、を含み、融合タンパク質の（ａ）〜（ｃ）部分は、共に連結され、例えば、本明細書に記載のリンカーペプチドによって機能可能なように共に連結される。言い換えれば、ＴＴｘのＬＨＮは、リンカーペプチドによってＰＡのＰＡｄ４ドメインに融合され、ＰＡｄ４は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインである。１つの実施形態では、組成物が本明細書に記載され、当該組成物は、（ａ）破傷風神経毒素（ＴＴｘ）のＮ末端酵素ドメイン（ＬＣ）と、（ｂ）ＴＴｘの転位／ポア形成ドメイン（ＨＮ）と、（ｃ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）と、を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質の（ａ）〜（ｃ）部分は、共に連結される。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＴＴｘの軽鎖とＴＴｘの重鎖との間の接合部に対応するアミノ酸残基は切断されている。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＢＴｘ（セロタイプを含む）のＬＣとＨＣとの接合部、またはＴＴｘのＬＣとＨＣとの接合部に対応するアミノ酸残基は切断されている。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＢＴｘ（セロタイプを含む）のＬＣとＨＮとの接合部、またはＴＴｘのＬＣとＨＮとの接合部に対応するアミノ酸残基は切断されている。切断は、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃなどのプロテアーゼによって実施される。
ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分及び転位ペプチド／ドメインを含む。１つの実施形態では、酵素部分と転位ペプチド／ドメインとは、リンカーペプチドによって連結される。ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分及び転位ペプチド／ドメインを含むＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、酵素部分と転位ペプチド／ドメインとは、プロテアーゼでの切断によって分離され、こうしたプロテアーゼは、例えば、Ｌｙｓ−Ｃである。リンカーペプチドによって連結されたＢＴｘまたはＴＴｘの酵素部分及び転位ペプチド／ドメインを含むＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、酵素部分と転位ペプチド／ドメインとは、例えば、プロテアーゼでの切断によって分離され、こうしたプロテアーゼは、例えば、Ｌｙｓ−Ｃである。切断は、融合タンパク質における酵素部分及び転位ペプチド／ドメインを活性化するために機能する。
ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及びＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖とＨＮドメインとの間のＳ−Ｓ架橋は還元されない。ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及び非ＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖におけるＣｙｓ残基、及びホロ毒素におけるＢＴｘのＨＮドメインのＮ末端部分に対応するベルトにおけるＣｙｓ残基は、存在するのであれば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒに変更され得る。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に少なくとも１個のＤ−アミノ酸をさらに含む。Ｎ末端におけるＤ−アミノ酸残基は、融合タンパク質の潜在的な免疫原性の低減に役立つ。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、ＬＨＮとペプチドリンカーで連結される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。１つの実施形態では、天然のＰＡｄ４ドメインに隣接する、ＰＡのＮ末端側に由来する約１〜６０個の連続アミノ酸が、融合タンパク質の酵素／ポア形成ドメインと、受容体結合ＰＡｄ４融合パートナーとの間にさらに組み込まれる。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＣ末端に位置し、ＬＨＮは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＬＨＮ（ＬＣ及びＨＮ）は、２つのＰＡｄ４ドメインの間に挟まれる。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、融合タンパク質には複数のＰＡｄ４ドメインが存在し、例えば、２〜１０個のＰＡｄ４ドメイン、１〜５個のＰＡｄ４ドメイン、または２〜５個のＰＡｄ４ドメインが融合タンパク質に存在する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、複数のＰＡｄ４ドメインが存在し、複数のＰＡｄ４ドメインは、直列に配置される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、複数のＰＡｄ４ドメインは、ペプチドリンカーによって連結される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。
したがって、ＢＴｘと炭疽毒素との融合タンパク質またはＢＴｘとＰＡ由来のものとの融合タンパク質における組み合わせには、限定はされないが、下記のものが含まれる：
ＬＣ／Ｘ−ＨＮ／Ｙ−（リンカー）−ＰＡフーリン−
ＬＣ／Ｘ−ＨＮ／Ｙ−（リンカー）−ＰＡｄ２−ｄ４
ＬＣ／Ｘ−ＨＮ／Ｙ−（リンカー）−ＰＡｄ４
ＬＣ／Ｘ−（リンカー）−ＬＦｎ
ＬＣ／Ｘ−（リンカー）−ＥＦｎ。
Ｘ及びＹは、ＢＴｘのサブセロタイプを指し、同一（好ましい）または異なるセロタイプに由来し得る。括弧で括った「リンカー」の存在は、良くない立体作用が観測されるのであれば、必要となり得ることを示すことに留意されるべきである。リンカーの非限定例は、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号５７）（ｎ＝１〜８）である。
下記のものは、本発明の融合タンパク質の構築物の例である（（ＧＧＳ）２は、配列番号５８として開示される）：
「ＬＨＮ／Ａ−ＧＳ２−ＰＡフーリン−」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜８７２）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡＲ１６４Ｓ，Ｋ１６５Ｓ，Ｋ１６６Ｓ
「ＬＨＮ／Ａ−ＧＳ２−ＰＡフーリン−ΔＮ」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜８７２）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡＲ１６４Ｓ，Ｋ１６５Ｓ，Ｋ１６６Ｓ（１５〜７３５）
「ＬＨＮ／Ａ−ＧＳ２−ＰＡｄ４」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜８７２）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡ（５９５〜７３５）
「ＬＣ／Ａ−ＧＳ２−ＬＦＰＡＢＤ」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜４４８）＋（ＧＧＳ）２＋ＬＦ（１〜２６２）
「ＬＣ／Ａ−ＧＳ２−ＬＦＰＡＢＤΔＮ」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜４４８）＋（ＧＧＳ）２＋ＬＦ（２９〜２６２）
「ＬＣ／Ａ−ＧＳ２−ＥＦＰＡＢＤ」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜４４８）＋（ＧＧＳ）２＋ＥＦ（１〜２５９）
「ＬＣ／Ａ−ＧＳ２−ＥＦＰＡＢＤΔＮ」： ＢＴｘ／Ａ１（１〜４４８）＋（ＧＧＳ）２＋ＥＦ（３１〜２５９）
「ＬＨＮ／Ｂ−ＧＳ２−ＰＡフーリン−」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜８５９）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡＲ１６４Ｓ，Ｋ１６５Ｓ，Ｋ１６６Ｓ
「ＬＨＮ／Ｂ−ＧＳ２−ＰＡフーリン−ΔＮ」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜８５９）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡＲ１６４Ｓ，Ｋ１６５Ｓ，Ｋ１６６Ｓ（１５〜７３５）
「ＬＨＮ／Ｂ−ＧＳ２−ＰＡｄ４」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜８５９）＋（ＧＧＳ）２＋ＰＡ（５９５〜７３５）
「ＬＣ／Ｂ−ＧＳ２−ＬＦＰＡＢＤ」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜４４１）＋（ＧＧＳ）２＋ＬＦ（１〜２６２）
「ＬＣ／Ｂ−ＧＳ２−ＬＦＰＡＢＤΔＮ」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜４４１）＋（ＧＧＳ）２＋ＬＦ（２９−２６２）
「ＬＣ／Ｂ−ＧＳ２−ＥＦＰＡＢＤ」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜４４１）＋（ＧＧＳ）２＋ＥＦ（１〜２５９）
「ＬＣ／Ｂ−ＧＳ２−ＥＦＰＡＢＤΔＮ」： ＢＴｘ／Ｂ１（１〜４４１）＋（ＧＧＳ）２＋ＥＦ（３１〜２５９）。
ＢＴｘ／ＴＴｘ−ＬＦｎ／ＥＦｎ融合タンパク質
天然のＰＡと、ＴＴｘの触媒ドメインに融合したＬＦｎ、または１つもしくは別のさまざまな形態／セロタイプのＢＴｘの触媒ドメインに融合したＬＦｎを含む融合タンパク質と、を組み合わせて使用すると、侵害受容ニューロンにおける細胞内シグナル伝達の妨害、または神経伝達物質を介したシナプス伝達の遮断に指向化することができる（図８Ａ及び図８Ｂを参照のこと）。こうした構築物では、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断するために触媒ドメインのタンパク質分解活性を利用しており、それによって、侵害受容器またはバイスタンダー細胞を殺傷することなく、神経伝達物質の放出が遮断される。ＴＴｘ、または１つもしくは別のさまざまな形態／セロタイプのＢＴｘ、あるいはＣＮＴファミリーの毒素は、ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼである。
したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと、を含む。１つの実施形態では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＴＴｘまたはＢＴｘと、を含む。本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、ＴＴｘ、ＢＴｘ、またはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼとペプチドリンカーで連結される。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＴＴｘまたはＢＴｘと、を含む操作された融合タンパク質を含む。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼと、を含む操作された融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、融合タンパク質組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、ＴＴｘ、ＢＴｘ、またはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼとペプチドリンカーで連結される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、２つのＬＦｎの間に挟まれる。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎの代わりにＥＦｎが含まれる。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素を含む。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素から本質的になる。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、全タンパク質、すなわちホロ毒素からなる。融合タンパク質がホロ毒素を含むのであれば、タンパク質切断による活性化の必要性が生じることになる。ホロ毒素の活性化に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。接合部の切断に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、例えば、ホロ毒素のドメインといった、ホロ毒素ではない、タンパク質の一部のみを含むか、タンパク質の一部のみから本質的になるか、またはタンパク質の一部のみからなる。例えば、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼのＬＣまたはＬＣ及びＨＮ（ＬＨＮ）から本質的になり得る。例えば、ＴＴｘもしくはＢＴｘまたはＳＮＡＲＥ標的プロテアーゼは、ホロ毒素のＮ末端に位置するベルトセグメントをＬＣに付加したものから本質的になり得、ベルトセグメントは、Ｌ鎖とＨＮ鎖との間に見られる。記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＢＴｘは、セロタイプであるＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、及び非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のいずれか１つのＢＴｘのＬＣドメイン及びＨＮドメインから選択される。記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＢＴｘは、表１のＢＴｘのＬＣドメイン及びＨＮドメインから選択され、非限定例として、配列番号２９〜３１を参照のこと。
したがって、１つの態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）の酵素部分、または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）の酵素部分と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含む。ＢＴｘの酵素部分は、ボツリヌス神経毒素ホロ毒素のＮ末端に位置する。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）の酵素部分、または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）の酵素部分と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含む融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
１つの態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。１つの実施形態では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖（ＬＣ）または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のＬ鎖を含む。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖（ＬＣ）または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素のＬ鎖は、酵素部分である。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＢＴｘ／Ａ、ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｅ、ＢＴｘ／Ｆ、ＢＴｘ／Ｇ、第１の非クロストリジウムのボツリヌス様毒素、及びＴＴｘのいずれか１つのＢＴｘ軽鎖ドメインからなる群から選択される。例えば、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＢＴｘ／ＡのＬＣ（アミノ酸１〜４４８）、ＢＴｘ／ＢのＬＣ（アミノ酸１〜４４１）、ＢＴｘ／ＣのＬＣ（アミノ酸１〜４４９）、ＢＴｘ／ＤのＬＣ（アミノ酸１〜４４２）、ＢＴｘ／ＥのＬＣ（アミノ酸１〜４２２）、ＢＴｘ／ＦのＬＣ（アミノ酸１〜４３６）、及びＢＴｘ／ＧのＬＣ（アミノ酸１〜４４２）からなる群から選択され得る。例えば、ＢＴｘの軽鎖は、本明細書に記載の配列番号２０〜２８または表１から選択され得る。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、クロストリジウム神経毒素は、ＢＴｘまたはＴＴｘである。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、侵害受容ニューロンに発現したＰＡ結合受容体は、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡに結合する能力を有するタンパク質は、（ｉ）炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、または（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）である。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦのＰＡ結合ドメインは、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＥＦのＰＡ結合ドメインは、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である。
融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎ及びＥＦｎは、オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合するドメインである。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、酵素ドメインは、本明細書に記載のＢＴｘまたはＴＴｘのＬＣである。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、酵素ドメインは、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方で、ＬＦｎまたはＥＦｎに連結される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、ＢＴｘまたはＴＴｘの酵素ドメインまたはＬＣと、ペプチドリンカーによって連結される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＢＴｘまたはＴＴｘのＮ末端酵素ドメインまたはＬＣは、２つのＬＦｎまたはＥＦｎの間に挟まれる。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、ＢＴｘのＨＮドメインのＮ末端部分に対応するベルトを定義するアミノ酸配列をさらに含み得、ＨＮドメインは、ＢＴｘのＣ末端側に位置する。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、例えば、アミノ酸１〜８７２（配列番号２９）といった、ＢＴｘまたはＴＴｘのＬとＨＮとの両方を含み、ＢＴｘのＬＣとＨＮとの接合部に対応するアミノ酸残基は切断されている。接合部の切断に適したプロテアーゼには、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及びＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖とＨＮドメインとの間のＳ−Ｓ架橋は還元されない。ＢＴｘ部分を含む融合タンパク質のいずれかの実施形態の１つでは、ＢＴｘ部分は、ＢＴｘのＬ鎖及び非ＨＮドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、Ｌ鎖におけるＣｙｓ残基、及びホロ毒素におけるＢＴｘのＨＮドメインのＮ末端部分に対応するベルトにおけるＣｙｓ残基は、存在するのであれば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒに変更されている。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に少なくとも１個のＤ−アミノ酸をさらに含む。Ｄ−アミノ酸は、ソルターゼによる反応によって付加することができ、例えば、国際特許公開ＷＯ２０１２／０９６９２６、米国特許第９０７９９５２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３３６９７４号及び第ＵＳ２０１５／０２６７１８６号において、より詳細に説明されており、こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、こうした融合タンパク質は、非融合ＰＡと共に使用されるか、または（ａ）ＬＦｎもしくはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡもしくはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡもしくはＰＡ断片が、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質が、疼痛を治療するために毒素を侵害受容ニューロンに指向化する第２の融合タンパク質と共に使用される。言い換えれば、１つの実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、独立した非融合ＰＡポリペプチドと共に対象に同時投与される。別の実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、第２の融合タンパク質と共に対象に同時投与される。第２の融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、疼痛を治療するために、毒素を含む第１の融合タンパク質を侵害受容ニューロンに指向化する。第２の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、ＰＡは、本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２受容体に結合しない変異体（ｍＰＡ）、修飾（例えば、化学的なもの）形態、または変異形態である。
１つの態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、
（Ｉ）（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）部分のボツリヌス神経毒素Ｎ末端酵素ドメイン（酵素ドメイン）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）部分（酵素ドメイン）、及び（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）を含む第１の融合タンパク質と、
（ＩＩ）（ｃ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片、及び任意選択で、（ｄ）侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む第２のタンパク質と、
を含み、
（ａ）部分と（ｂ）部分とは、ペプチドリンカーによって連結され、（ｄ）部分が存在するとき、（ｃ）部分と（ｄ）部分ともまた、ペプチドリンカーによって連結される。記載の組成物の実施形態の１つでは、第２のタンパク質が、融合タンパク質であるとき、ＰＡは、ＰＡが変異した変異体（ｍＰＡ）である。
本明細書に記載の毒素タンパク質、毒素融合タンパク質、または融合タンパク質組成物のいずれかの実施形態の１つでは、組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。リンカーペプチドを含む組成物の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡ断片の非限定例は、ＰＡ６３である。１つの実施形態では、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。１つの実施形態では、ＰＡは、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質である。本明細書に記載の組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、オリゴマーＰＡであり、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合され得る。１つの実施形態では、この組成物は、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、または筋肉の疼痛、及び糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害などの疼痛の治療に有用である。別の実施形態では、この組成物は、疼痛の治療を目的とする薬物の製造において有用である。
ＡＢ毒素−ＬＦｎ／ＥＦｎ融合タンパク質
ジフテリア毒素（ＤＴ）の触媒ドメイン（「Ａ」成分または「Ａ」部分としても知られる）を使用し、天然のＰＡと、融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴとを組み合わせることで、侵害受容ニューロンへと指向化してタンパク質合成を遮断することができる。ＤＴは、ＡＢ型毒素である。したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎと（ｂ）ＤＴとを含む。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＬＦｎと（ｂ）ＤＴとを含む操作された融合タンパク質を含む。融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、ＤＴにペプチドリンカーで連結される。融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＤＴは、配列番号２に見られるＡ部分とＢ部分との両方を含む。１つの実施形態では、ＤＴは、ＤＴＡであり、ＤＴＡは、配列番号２に見られるＡ部分（活性な触媒／酵素ドメイン）を含む。ＤＴＡのアミノ酸配列は、ジフテリア毒素の残基１〜１９３を含む。ＬＦｎを含む操作された融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。ＬＦｎを含む操作された融合タンパク質の別の実施形態では、ＬＦｎは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。ＬＦｎを含む操作された融合タンパク質の別の実施形態では、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＤＴは、２つのＬＦｎの間に挟まれる。別の実施形態では、ＬＦｎは、ＥＦｎと交換される。したがって、１つの実施形態では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＥＦｎと（ｂ）ＤＴとを含む。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＥＦｎと（ｂ）ＤＴとを含む操作された融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態のいくつかでは、植物毒素、リシン、またはＩＣＫ毒素などのジスルフィド含有ペプチド毒素などの他の細胞内作用毒素の触媒ドメインを、ＤＴの代わりにＬＦｎに融合し得ることで、ＬＦｎ−ＰＥ（ＰＴｘ）、ＬＦｎ−コノトキシン、ＬＦｎ−リシン、ＬＦｎ−コレラ毒素、ＬＦｎ−アガトキシン、ＬＦｎ−デルタ−パルトキシン、ＬＦｎ−フエントトキシン、ＬＦｎ−サソリ長鎖毒素、及び／またはＬＦｎ−志賀毒素などの、操作された融合タンパク質が得られる。したがって、本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、１つの他の毒素と連結され、他の毒素は、細胞内作用毒素である。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、細胞内作用毒素は、リシン、ＰＥ、コノトキシン、コレラ毒素、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、志賀毒素、サソリ長鎖毒素、及びサソリ短鎖毒素からなる群から選択される。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、他の毒素とペプチドリンカーで連結される。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎは、炭疽毒素に由来しない、少なくとも１つの他の毒素と連結される。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎは、ＡＢ毒素のＡ成分、または活性ドメイン、触媒ドメイン、もしくは酵素ドメインに連結され、例えば、ＰＥのアミノ酸残基３６４〜６１３の間のＡ成分残基に連結され、Ａ部分の残基は、ＤＴでは１〜１９３である。
本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎは、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、細胞内作用毒素は、２つのＬＦｎの間に挟まれる。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎの代わりにＥＦｎが含まれる。例えば、これによって、ＥＦｎ−ＰＥ（ＰＴｘ）、ＥＦｎ−コノトキシン、ＥＦｎ−リシン、ＥＦｎ−コレラ毒素、ＥＦｎ−アガトキシン、ＥＦｎ−デルタ−パルトキシン、ＥＦｎ−フエントトキシン、またはＥＦｎ−志賀毒素などの、操作された融合タンパク質が得られる。
ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、こうした融合タンパク質は、疼痛を治療するために、非融合ＰＡもしくは独立したＰＡと共に使用されるか、または第２の融合タンパク質と共に使用される。言い換えれば、１つの実施形態では、ＬＦｎポリペプチドもしくはＥＦｎポリペプチド、またはＬＦポリペプチドもしくはＥＦポリペプチドを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するためにＰＡと共に対象に同時投与される。別の実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、第２の融合タンパク質と共に対象に同時投与される。第２の融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、疼痛を治療するために、毒素を含む第１の融合タンパク質を侵害受容ニューロンに指向化する。第２の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、ＰＡは、天然のＰＡが変異した変異体（ｍＰＡ）であり、本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２受容体に結合しない形態である。
１つの態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、
（Ｉ）（ａ）ＤＴ、細胞内作用毒素、ＩＣＫ毒素、またはジスルフィド含有ペプチド毒素、及び（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）を含む第１の融合タンパク質と、
（ＩＩ）（ｃ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片、及び任意選択で、（ｄ）侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む第２のタンパク質と
を含み、
（ａ）部分と（ｂ）部分とは、ペプチドリンカーによって連結され、
（ｄ）が存在するとき、（ｃ）部分と（ｄ）部分ともまた、ペプチドリンカーによって連結される。記載の組成物の実施形態の１つでは、第２のタンパク質が融合タンパク質であるとき、ＰＡは、ＰＡが変異した変異体（ｍＰＡ）である。
組成物の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡ断片の非限定例は、ＰＡ６３である。ＰＡタンパク質を含む本明細書に記載の組成物の実施形態の１つでは、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。別の実施形態では、ＰＡは、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質である。別の実施形態では、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合される。
１つの実施形態では、毒素及び／または毒素融合体を含む本明細書に記載の組成物は、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、もしくは筋肉の疼痛、糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害などの疼痛の治療に有用である。別の実施形態では、こうした組成物は、疼痛の治療を目的とする薬物の製造において有用である。
ＡＢ毒素−ＰＡｄ４／ＰＡ融合タンパク質
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、ＰＡのＰＡｄ４ドメインにその次に連結されるリンカーペプチドに融合したＡＢ毒素を含み、ＰＡｄ４は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインであり、融合タンパク質は、転位ドメイン、ホロ毒素、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態をさらに含む。融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４ドメインの代わりＰＡが使用される。１つの実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態（ＰＡフーリン−）である。
１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、ＰＡのＰＡｄ４ドメインに機能可能なように連結されたリンカーペプチドに融合したＡＢ毒素を含み、Ｐａｄ４は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメインであり、融合タンパク質は、転位ドメイン、ホロ毒素、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態をさらに含む。融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４ドメインの代わりＰＡが使用される。１つの実施形態では、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性の、変異したＰＡ変異形態（ＰＡフーリン−）である。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
１つの態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ＡＢ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む。
１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＡＢ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って毒素（プロテアーゼ）を侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＡＢ毒素は、リシン毒素、コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、緑膿菌の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびにジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分から選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、侵害受容ニューロンに発現したＰＡ結合受容体は、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡ断片は、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインであり、例えば、ＰＡ６３またはＰＡｄ４であるが、こうした例に限定はされない。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、配列番号３５〜４０のアミノ酸配列を有するドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡ断片は、配列番号３５〜４０のアミノ酸配列を有するドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、カルシウムとの結合、ならびにＬＦとの結合及びＥＦとの結合にも関与するＰＡｄ１ドメインを含む。ＰＡｄ１は、ＰＡ（配列番号１）の残基１〜２５８に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、膜への挿入及び７量体化に関与するＰＡｄ２を含む。１つの実施形態では、ＰＡｄ２は、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、オリゴマー化に関与するＰＡｄ３を含む。ＰＡｄ３は、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜５９４に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、宿主細胞の受容体への結合に関与するＰＡｄ４を含む。１つの実施形態では、ＰＡｄ４は、ＰＡ（配列番号１）の残基５９５〜７３５に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ３ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。あるいは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜４８７及び残基４８８〜７６４を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡのＰＡｄ２ドメイン、ＰＡｄ３ドメイン、及びＰＡｄ４ドメインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。例えば、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＰＡ（配列番号１）の残基２５９〜７３５を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４またはＰＡ断片は、ＡＢ毒素とペプチドリンカーで連結される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、天然のＰＡｄ４ドメインのＮ末端側隣接部に由来するおよそ約１〜６０個の連続アミノ酸が、ＡＢ毒素とＰＡｄ４との間にさらに組み込まれる。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＣ末端に位置し、ＡＢ毒素は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＰＡｄ４は、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＡＢ毒素は、２つのＰＡｄ４ドメインの間に挟まれる。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、融合タンパク質には複数のＰＡｄ４ドメインが直列で存在し、例えば、２〜１０個のＰＡｄ４ドメイン、１〜５個のＰＡｄ４ドメイン、２〜５個のＰＡｄ４ドメインが融合タンパク質に直列で存在する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、複数のＰＡｄ４ドメインが存在し、複数のＰＡｄ４ドメインは、直列に配置される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、複数のＰＡｄ４ドメインは、ペプチドリンカーによって連結される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＬ（転位ドメイン）、ホロ毒素、またはホロ毒素の変異形態は、ＡＢ毒素と、ＰＡｄ４またはＰＡ断片との間に挟まれる。
本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＡＢ毒素は、リシン毒素、コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、緑膿菌の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびにジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分から選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＴＬは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、ホロ毒素、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態のいくつかでは、転位ドメインは、ＢＴｘもしくはＴＴｘに由来し、例えば、表１に開示のＢＴｘもしくはＴＴｘのＨＮ（クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン）であるか、または転位ドメインは、炭疽毒素に由来し、例えば、ＬＦｎもしくはＥＦｎであるか、または本明細書に記載のポリカチオン性配列である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態のいくつかでは、ホロ毒素またはホロ毒素の変異形態は、リシン毒素、コレラ毒素、ＰＥ、志賀毒素、ＤＴ、及びサソリの長鎖毒素または短鎖毒素から選択される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態のいくつかでは、ホロ毒素またはホロ毒素の変異形態は、ＰＡ、ｍＰＡ、またはＰＡフーリン−であり、例えば、全ＰＡタンパク質については、アミノ酸残基ＲＫＫＲを含むフーリン切断部位は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）などの、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換されている。ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸残基のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。
ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、こうした融合タンパク質は、非融合ＰＡもしくは独立したＰＡと共に使用することができるか、または（ａ）ＬＦｎもしくはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡもしくはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡもしくはＰＡ断片が、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質が、疼痛を治療するために毒素を侵害受容ニューロンに指向化する第２の融合タンパク質と共に使用することができる。言い換えれば、１つの実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、ＰＡ単独と共に対象に同時投与される。別の実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、第２の融合タンパク質と共に対象に同時投与される。そのような実体では、第２の融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、疼痛を治療するために、毒素を含む第１の融合タンパク質を侵害受容ニューロンに指向化する。第２の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、ＰＡは、本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２受容体に結合しないように修飾（例えば、化学的に）または変異導入された変異形態（ｍＰＡ）である。
１つの態様では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、
（Ｉ）（ａ）ＡＢ毒素及び（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）を含む第１の融合タンパク質と、
（ＩＩ）（ｃ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片、及び任意選択で、（ｄ）侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む第２のタンパク質と
を含み、（ａ）部分と（ｂ）部分とは、ペプチドリンカーによって連結され、（ｄ）部分が存在するとき、（ｃ）部分と（ｄ）部分ともまた、ペプチドリンカーによって連結される。記載の組成物の実施形態の１つでは、第２のタンパク質が、融合タンパク質であるとき、ＰＡは、ＰＡが変異した変異体（ｍＰＡ）である。
組成物の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡ断片の例は、ＰＡ６３である。本明細書に記載の組成物のいずれか１つの実施形態の１つでは、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。本明細書に記載の組成物のいずれか１つの実施形態の１つでは、ＰＡは、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質である。１つの実施形態では、ＰＡは、オリゴマーＰＡである。１つの実施形態では、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合される。１つの実施形態では、この組成物は、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、または筋肉の疼痛、及び糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害などの疼痛の治療に有用である。別の実施形態では、この組成物は、疼痛の治療を目的とする薬物の製造において有用である。
ＩＣＫ毒素−ＰＡｄ４／ＰＡ融合タンパク質
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））を用いた炭疽毒素成分の操作も本明細書に記載される。いくつかのＩＣＫ毒素は、イオンチャネルの活性を調節することが知られているため、疼痛の治療に使用されてきたが、侵害受容器以外の細胞型への作用が生じることが全身治療を阻んできた。こうした毒素が、ＰＡｄ４もしくは天然のＰＡに融合されるか、またはその他の形でＰＡｄ４もしくは天然のＰＡの修飾に使用されるのであれば、こうした毒素を侵害受容器へと特異的に標的指向化することができる（図９を参照のこと）。したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質は、（ａ）ＰＡｄ４または天然のＰＡもしくはその受容体結合断片と、（ｂ）ＩＣＫ毒素と、を含む。別の実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＰＡｄ４または天然のＰＡもしくはその受容体結合断片と、（ｂ）ＩＣＫ毒素と、を含む操作された融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。ＰＡｄ４または天然のＰＡもしくはその受容体結合断片は、ペプチドリンカーによってＩＣＫ毒素に融合させることができる。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。
ＩＣＫ毒素−ＬＦｎ／ＥＦｎ融合タンパク質
あるいは、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦｎもしくはＥＦｎを含む融合タンパク質にＩＣＫ毒素を融合させることができ、その後、これを、ＰＡまたはＰＡが修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された形態と組み合わせて使用することで、侵害受容器に特異的に影響を与えることができる。したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＩＣＫ毒素とを含む。別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、（ａ）ＥＦｎと、（ｂ）ＩＣＫ毒素とを含む。別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書で提供され、当該操作された融合タンパク質は、（ａ）ＩＣＫ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質とを含む。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＬＦｎと、（ｂ）ＩＣＫ毒素とを含む操作された融合タンパク質を含む。別の実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＥＦｎと、（ｂ）ＩＣＫ毒素とを含む操作された融合タンパク質を含む。別の実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）ＩＣＫ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質とを含む操作された融合タンパク質を含む。侵害受容ニューロン結合タンパク質は、侵害受容ニューロンへのＩＣＫ毒素の特異的な指向化に役立つ。同様に、ＬＦｎまたはＥＦｎは、ＰＡまたはＰＡの変異形態またはその受容体結合断片と共に使用することで、侵害受容ニューロンへの毒素の直接的な送達、及びそのサイトゾルへの導入に役立つ。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、ペプチドリンカーによってＩＣＫ毒素に融合される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の操作された融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。別の実施形態では、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ＩＣＫ毒素は、ＬＦｎ、ＥＦｎ、または侵害受容ニューロン結合タンパク質の間に挟まれる。
ジスルフィド含有ペプチド毒素−ＬＦｎ／ＥＦｎ融合タンパク質
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含む。１つの実施形態では、組成物が提供され、当該組成物は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含む融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方でＬＦｎまたはＥＦｎに連結されるか、あるいは１つまたは複数の部位でＬＦｎまたはＥＦｎに化学的に架橋される。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、ＬＦｎまたはＥＦｎに連結される。ＬＦｎは、オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素致死因子のドメインである。ＥＦｎは、炭疽毒素浮腫因子のドメインであり、当該ドメインは、オリゴマー形態のＰＡ６３に結合する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、阻害剤システインノット毒素（ＩＣＫ）毒素である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、（ａ）部分は、（ｂ）部分とリンカーペプチドで融合される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０残基のアミノ酸長である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。融合タンパク質または組成物の別の実施形態では、ＬＦｎまたはＥＦｎは、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、２つのＬＦｎまたはＥＦｎの間に挟まれる。
１つの態様では、融合タンパク質が本明細書に記載され、当該融合タンパク質は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含み、断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。１つの実施形態では、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有する、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素である。１つの実施形態では、組成物が提供され、当該組成物は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含む融合タンパク質を含み、ＰＡ断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、システインノットモチーフを含み得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素であり得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、侵害受容ニューロンに発現したＰＡ結合受容体は、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）であり得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＰＡに結合する能力を有するタンパク質は、（ｉ）炭疽毒素致死因子（ＬＦ）または（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）であり得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＬＦのＰＡ結合ドメインは、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＥＦのＰＡ結合ドメインは、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である。
ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、こうした融合タンパク質は、非融合ＰＡと共に使用もしくは投与されるか、または（ａ）ＬＦｎもしくはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡもしくはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡもしくはＰＡ断片が、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質が、疼痛を治療するために毒素を侵害受容ニューロンに指向化する第２の融合タンパク質と共に使用もしくは投与される。言い換えれば、１つの実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、非融合ＰＡまたは天然のＰＡと共に対象に同時投与される。別の実施形態では、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、疼痛を治療するために、第２の融合タンパク質と共に対象に同時投与される。第２の融合タンパク質は、（ａ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片と、（ｂ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含み、ＰＡまたはＰＡ断片は、侵害受容ニューロン結合タンパク質に融合され、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、疼痛を治療するために、毒素を含む第１の融合タンパク質を侵害受容ニューロンに指向化する。第２の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、ＰＡは、本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２受容体に結合しない、修飾（例えば、化学的に）または変異導入された変異形態（ｍＰＡ）である。
１つの態様では、組成物が本明細書に記載され、当該組成物は、
（Ｉ）（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素、及び（ｂ）（ｉ）炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）を含む第１の融合タンパク質と、
（ＩＩ）（ｃ）ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡまたはＰＡ断片、及び任意選択で、（ｄ）侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む第２のタンパク質と、
を含み、（ａ）部分と（ｂ）部分とは、ペプチドリンカーによって連結され、（ｃ）部分と（ｄ）部分ともまた、ペプチドリンカーによって連結される。記載の組成物の実施形態の１つでは、第２のタンパク質が、融合タンパク質であるとき、ＰＡは、ＰＡが変異した変異体（ｍＰＡ）である。本明細書に記載のすべての態様の実施形態の１つでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。ＬＦｎまたはＥＦｎに結合する能力を有するＰＡ断片の非限定例は、ＰＡ６３である。本明細書に記載の組成物の実施形態の１つでは、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。本明細書に記載の組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質である。本明細書に記載の組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、オリゴマーＰＡであり、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合され得る。１つの実施形態では、そのような組成物は、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、または筋肉の疼痛、及び糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害などの疼痛の治療に有用である。別の実施形態では、この組成物は、疼痛の治療を目的とする薬物の製造において有用である。
ジスルフィド含有ペプチド毒素−ＰＡｄ４／ＰＡ融合タンパク質
１つの態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）または（ｂ）（ｉｉｉ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含む（図９を参照のこと）。１つの実施形態では、組成物が提供され、当該組成物は、（ａ）ジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）または（ｂ）（ｉｉ）炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）または（ｂ）（ｉｉｉ）侵害受容ニューロン結合タンパク質と、を含む融合タンパク質を含む。融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、（ａ）部分は、（ｂ）部分にリンカーペプチドで融合される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。別の実施形態では、ＰＡ、ＰＡｄ４、または侵害受容ニューロン結合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端とＣ末端との両方に位置し、その結果、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、２つのＰＡ、ＰＡｄ４、または侵害受容ニューロン結合タンパク質によって挟まれる。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、阻害剤システインノット毒素（ＩＣＫ）毒素である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ（ＰＥ）毒素である。本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、ＰＡ、ＰＡｄ４、または侵害受容器結合タンパク質と、阻害剤システインノット毒素との間にリンカーペプチドを含む。
別の態様では、融合タンパク質が本明細書で提供され、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と、を含み、侵害受容ニューロンは、ナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を発現する。１つの実施形態では、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有する、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素である。別の実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）ナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方をそこで発現する侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と、を含む融合タンパク質を含む。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、システインノットモチーフを含み得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ジスルフィド含有ペプチド毒素は、例えば、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素であり得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＴＭは、例えば、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、（ｉｉ）ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、もしくは（ｉｉｉ）例えば、ＰＡｄ４といったそのＰＡ断片、または（ｉｖ）侵害受容ニューロン結合タンパク質からなる群から選択され得る。
記載の融合タンパク質または組成物のそれぞれの実施形態の１つでは、ＴＭ、ＰＡもしくはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、またはＰＡ断片もしくは侵害受容ニューロン結合タンパク質は、侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合することができる。１つの実施形態では、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、ＡＮＴＸＲ２受容体に特異的に結合する抗体である。１つの実施形態では、抗体は、ＡＮＴＸＲ２受容体に結合することができる抗体断片である。別の実施形態では、抗体は、侵害受容ニューロンに存在するＮＧＦ受容体またはイオンチャネルタンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、イオンチャネルタンパク質は、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９から選択される。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＰＡは、例えば、本明細書に記載及び当該技術分野において知られる、フーリンによる切断に抵抗性の変異ＰＡであり得る。例えば、アミノ酸残基ＲＫＫＲを含むフーリン切断部位は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）などの、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換することができる。ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、例えば、ＰＡ６３またはＰＡｄ４であり得る。
記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、ＰＡｄ４、ＰＡ、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、例えば、ＬｙｓＣなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性となるように修飾または変異導入することができる。記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のすべてで、記載の融合タンパク質のＰＡｄ４、ＰＡ、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、Ｌｙｓ−Ｃ、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、キモトリプシン、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性である。例えば、配列番号１（配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いたもの）の位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０におけるＬｙｓ残基の１つまたは複数（それぞれを含めた最大数を含む）を、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換することができる。言い換えれば、配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数（それぞれを含めた最大数を含む）を、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換することができる。
ＰＡｄ４をプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、こうしたプロテアーゼの他の例は、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃである。
（ｍＰＡ−侵害受容器結合タンパク質）融合タンパク質
例えば、米国特許出願公開第２０１５００４４２１０号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）において説明されるようにその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）または変異導入されており、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネルを特異的に標的とすることができる分子と融合されることになる変異ＰＡであるｍＰＡの操作が本明細書にさらに記載される。したがって、１つの態様では、操作された融合タンパク質は、（ａ）操作ｍＰＡと、（ｂ）侵害受容器結合タンパク質とを含む。１つの実施形態では、組成物が本明細書で提供され、当該組成物は、（ａ）操作ｍＰＡと、（ｂ）侵害受容器結合タンパク質とを含む操作された融合タンパク質を含む。例として、侵害受容器結合タンパク質は、侵害受容器に存在するＡＮＴＲＡＸ受容体に結合する能力を有する非ＰＡタンパク質、または侵害受容器の細胞表面に存在する受容体もしくはイオンチャネルタンパク質に結合する抗体、または侵害受容器の細胞表面に存在する受容体のタンパク質リガンドであり得る。記載の操作された融合タンパク質の例として、ｍＰＡは、ＮＧＦ受容体を標的として結合するＮＧＦに融合させることができるか、またはｍＰＡは、侵害受容器にナトリウムイオンポアを創出するＮａｖ１．７チャネルに特異的に結合する抗体もしくは抗体断片に融合させることができる。Ｎａｖ１．７は、通常、後根神経節（ＤＲＧ）及び三叉神経節における侵害受容（痛覚）ニューロン、ならびに交感神経節ニューロンという２つの型のニューロンに高レベルで発現しており、交感神経節ニューロンは、自律（不随意）神経系の一部である。侵害受容器結合タンパク質に融合したｍＰＡを含むそのような融合タンパク質が、例えば、ＢＴｘに融合したＬＦｎ、またはＴＴｘに融合したＬＦｎ、またはＢＴｘに融合したＥＦｎ、またはＴＴｘに融合したＥＦｎといった、ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＥＦもしくはＬＦを含む別の融合タンパク質と組み合わせて使用され、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との間にｍＰＡ／ＬＦｎ相互作用またはｍＰＡ／ＥＦｎ相互作用が生じるとき、融合タンパク質の侵害受容器結合タンパク質によって毒素が侵害受容器に特異的に指向化され、毒素は、ｍＰＡ／ＬＦｎ相互作用またはｍＰＡ／ＥＦｎ相互作用によってサイトゾルに導入される。
ＬＦまたはＥＦと組み合わせて侵害受容器の表面分子を標的とすることができる分子と融合された天然のＰＡまたは変異ＰＡ（ｍＰＡであり、これはその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）または変異導入されたＰＡである）も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、侵害受容器結合タンパク質に融合したｍＰＡを含む融合タンパク質は、特に、ＬＦまたはＥＦと組み合わせて使用される。ＭＡＰキナーゼ及びそのシグナル伝達経路は、慢性疼痛の発症に重要であることがマウスモデルで示されている。ＬＦは、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達を特異的に阻害する。１つの実施形態では、ＰＡまたはｍＰＡは、ＬＦと組み合わせると、侵害受容器におけるＭＡＰキナーゼシグナル伝達を特異的に標的として疼痛を遮断するために使用することができる。ＥＦは、アデニル酸シクラーゼを活性化するものであり、アデニル酸シクラーゼもまた、疼痛の発症と関連付けられている。ＰＡまたはｍＰＡをＥＦと組み合わせて使用することによって、疼痛におけるアデニル酸シクラーゼを標的とすることもできる。
Ｎａｖ１．８及びＮａｖ１．９を、本明細書に記載の融合タンパク質の侵害受容器結合タンパク質の標的受容体として使用することもできる。本明細書に記載の操作された融合タンパク質の他の実施形態では、融合タンパク質の侵害受容器結合タンパク質部分は、Ｎａｖ１．８またはＮａｖ１．９に結合する。
ＬＦｎもしくはＥＦｎ、またはＬＦもしくはＥＦを含む、本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の上記の態様及び実施形態のいずれか、及びＰＡまたはＰＡ断片を含む、本明細書に記載の融合タンパク質または組成物の実施形態のいずれかでは、受容体を有する細胞に対する親和性を増加させるために、タンパク質分解性に活性化したＰＡ（例えば、ＰＡ６３）またはｍＰＡから形成されたオリゴマー形態のＰＡを単量体ＰＡの代わりに使用することができる。毒素エフェクター部分は、投与前にＰＡのオリゴマー形態に結合され得るか、または別に注射され得る。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書に記載され、当該操作された融合タンパク質は、
（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分、または
（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分
からなる群から選択されるポリペプチドを含む第１のドメインと、
（ｉｉｉ）炭疽毒素転位ペプチドと任意選択で融合した阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））、
（ｉｖ）炭疽毒素転位ペプチドと任意選択で融合した、細胞内作用毒素の触媒ドメイン、または
（ｖ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／もしくは炭疽毒素致死因子（ＬＦ）
からなる群から選択されるポリペプチドを含む第２のドメインと、
を含む。
１つの実施形態では、第１のドメインと第２のドメインとは、リンカーペプチドで共に融合される。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。別の実施形態では、リンカーペプチドは、ヒト血清において少なくとも１分間安定である。
別の実施形態では、融合タンパク質の第１のドメインは、融合タンパク質の標的指向化部分（ＴＭ）として働く。標的指向化部分は、侵害受容器に濃縮されて存在する細胞表面マーカーを介して侵害受容ニューロンに毒素を指向化するために機能する。非限定例には、限定はされないが、侵害受容器の表面に発現し、豊富に存在するＡＮＴＸＲ２受容体、ＮＧＦ受容体、及び／またはＮａｖ１．７イオンチャネル、Ｎａｖ１．８イオンチャネル、もしくはＮａｖ１．９イオンチャネルが含まれる。１つの実施形態では、標的指向化部分は、侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有するものであり、当該結合部位は、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロンに入る能力を有し、侵害受容ニューロンは、第２のドメインの毒素によって続いてタンパク質分解性に切断されるＳＮＡＲＥタンパク質を発現する。別の実施形態では、標的指向化部分は、侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有するものであり、侵害受容ニューロンは、ナトリウムイオンチャネルもしくはカルシウムイオンチャネル、またはナトリウムイオンチャネルとカルシウムイオンチャネルとの両方（例えば、Ｎａｖ１．７イオンチャネル、Ｎａｖ１．８イオンチャネル、及びＮａｖ１．９イオンチャネル）を発現するか、あるいはＡＮＴＸＲ２受容体またはＮＧＦ受容体を発現する。したがって、１つの実施形態では、侵害受容ニューロンに存在する結合部位は、ＡＮＴＸＲ２受容体、ＮＧＦ受容体、Ｎａｖ１．７イオンチャネル、Ｎａｖ１．８イオンチャネル、またはＮａｖ１．９イオンチャネルである。
ＡＮＴＸＲ２などの侵害受容器の表面受容体、またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子は、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、アプタマー）、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、またはアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）であり得る。アフィボディ分子は、モノクローナル抗体を模倣し、大多数の標的タンパク質または標的ペプチドに高親和性で結合するように操作された小型のタンパク質であり、それ故に、抗体模倣物のファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、分子は、抗体試薬であり得、例えば、抗体、モノクローナル抗体、及び／またはその抗原結合部分である。侵害受容器の表面受容体及び／または侵害受容器のイオンチャネル型受容体は、当該技術分野において知られおり、例えば、Ｇｏｈａｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ２００５ １９：９−１３、Ｂｅｎｎａｒｏｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５ １０、Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２０１１において説明されており、こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。侵害受容器の表面受容体及び／または侵害受容器のイオンチャネル型受容体の例には、限定はされないが、例えば、ＮＧＦ受容体（ＮＧＦＲ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：４８０４）、Ｎａｖ１．７（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：６３３５）、Ｎａｖ１．８（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：６３３６）、またはＮａｖ１．９（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：１１２８０）が含まれる。配列参照番号によって本明細書のこの箇所及び全体を通じて参照されるデータベース配列はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。データベースの参照番号及び配列は、この出願の出願日にデータベースに示されていたものである。侵害受容器の表面受容体を特異的に標的とする能力を有する分子が関与する態様のいずれかの実施形態の１つでは、分子は、ＮＧＦ受容体に特異的に結合する抗体試薬、及び／またはＮａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、もしくはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体試薬であり得る。そのような態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、非特異的作用を低減するために、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する複数の分子が同一の融合タンパク質及び／または組成物に存在し得る。組成物は、異なる標的指向化部分を有する２つ、３つ、または４つ以上の融合タンパク質も含み得る。
ＰＡポリペプチドが関与する本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、ＡＮＴＸＲ２に特異的に結合するＰＡ能力を使用することなく、ＰＡのポア形成能力を対象とすることが望まれる。したがって、ＰＡポリペプチドが関与する態様のいずれかの実施形態の１つでは、組成物は、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然のＡＮＴＸＲ２結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含み得る。非限定例として、ＰＡのＰＡｄ４ドメインは、受容体結合機能が遮断されるように欠失及び／または改変することができる。追加の非限定例として、ｍＰＡは、Ｎ６８２Ａ及び／またはＤ６８３Ａ（アミノ酸残基１〜２９のシグナルペプチドを除去した後の配列番号１の配列に対するもの）（例えば、Ｒｏｓｏｖｉｔｚ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｏｍａｉｎ ４ ｏｆ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＡｄ４）ｒｅｖｅａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｏ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３０９３６−３０９４４を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を含み得る。所望の変異を含めるための、さまざまなポリペプチド配列改変方法及び／またはタンパク質操作方法が当該技術分野において知られており、それらの例は、本明細書の他の箇所に記載される。
本明細書に記載の操作された融合タンパク質の実施形態の１つでは、融合タンパク質の第２のドメインは、融合タンパク質の毒素エフェクター部分である。毒素タンパク質に応じて、毒素エフェクター部分は、侵害受容器での細胞シグナル伝達を妨害するために機能し、及び／または侵害受容器からの神経伝達物質の放出を遮断し、または侵害受容器を殺傷する。毒素エフェクター部分は、小胞に存在するＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＢＴｘ及びＴＴｘ）、ＭＡＰキナーゼ（ＥＦ及びＬＦ）等の１つまたは複数を標的とする非細胞傷害性プロテアーゼであり得る。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、炭疽菌防御抗原が侵害受容ニューロンを選択的に標的とし、それに結合して、膜輸送能力を有するポアを形成できることを発見した。炭疽毒素防御抗原と、適切な毒素とを（物理的にまたは機能的に）組み合わせることによって、侵害受容ニューロンの殺傷及び／または無効化、または疼痛シグナルの遮断が可能である。そのような組成物は、例えば、残りの神経系に対して実質的な非特異的作用を生じさせることなく侵害受容ニューロンにおける細胞シグナル伝達またはシナプス伝達を無効化することによって、例えば、疼痛を治療するために使用することができる。さらに、この系を使用することで、物質乱用による衰弱性の副作用を伴うことなく疼痛を治療することが可能になる。
ある特定の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は毒素を含み得る。本明細書で使用される「毒素」は、その毒素に曝露された宿主細胞において侵害性作用、毒性作用、または有害性作用の発生を引き起こすか、または誘起する、生物によって産生される化合物を指す。そのような有害性の状態には、重要な細胞機能の阻害、細胞代謝の阻害、及び／または細胞死が含まれ得る。
毒素が関与する本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、毒素は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素であり得、例えば、コノトキシン（ＣＴｘ）であり得る。
毒素が関与する本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、毒素は、細胞内作用毒素及び／または細胞内作用毒素の触媒ドメインであり得る。適した細菌毒素には、例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質に対するタンパク質分解活性を有することで神経伝達物質の放出を阻止するもの、またはニューロンに対して細胞傷害性である毒素が含まれ得る。適した毒素の例には、限定はされないが、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：２６５０４９１（配列番号２））、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘまたはＰＥ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：８７７８５０（配列番号３））、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：５３９８４８７（配列番号４））、破傷風毒素（ＴＴｘ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：１７５８３２３７（配列番号５））志賀毒素（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｔｘ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ０５６２２及びＣＡＣ０５６２３）Ｓｔｘ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３２４００３００及び３２４００２９９）及び／またはＳｔｘ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１６１５１１８８２及び１６１５１１８８３））、炭疽菌致死毒素（致死因子）、及び／または炭疽菌浮腫毒素（浮腫因子）などの細菌毒素が含まれ得る。適した毒素の追加の例は、限定はされないが、リシン毒素（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子番号：８２８７９９３）である。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、毒素は、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽毒素致死因子（ＬＦ）であり得る。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の同一の融合タンパク質及び／または組成物には複数の毒素が存在し得る。
いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、そこに転位ドメイン（ＴＬ）を含む毒素を含む。１つの実施形態では、ＴＬは、エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って融合タンパク質を侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する。いくつかの実施形態では、ＴＬは、本明細書で炭疽毒素転位ペプチドとも称される炭疽菌転位シグナルペプチド（ＬＦｎもしくはＥＦｎ）、ＢＴｘ（セロタイプを含む）のＨＮドメインもしくはＴＴｘのＨＮドメイン、またはＫＫＫ、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号５９）、ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号６０）、ＨＨＨ、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１）、ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）、ＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号６３）、もしくはＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６４）などのポリカチオン性配列である。米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２０２９８９号を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、ＴＬは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン（ＨＮ）であり、クロストリジウム神経毒素（ＣＮＴ）ファミリーのメンバータンパク質に由来する。こうしたものには、ＢＴｘセロタイプ、ＴＴｘ、及び新たに発見された非クロストリジウムのボツリヌス様毒素が含まれる。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、例えば、ＰＡ及び／またはｍＰＡが毒素を認識し、それを侵害受容細胞に輸送することが可能となるように、毒素を炭疽毒素転位ペプチドと融合させることができる。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、転位ドメインは、ポリカチオン性配列であり得る。そのような配列は、当該技術分野において考察されており、例えば、Ｂｌａｎｋｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，ｐｐ．８４３７−８４４２，１９９６、及び米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０２０２９８９号を参照のこと。こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ポリカチオン性配列は、例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジンといった、少なくとも２個のカチオン性アミノ酸を含み得る。転位機能を得るためにポリカチオン性配列を用いる本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ポリカチオン性配列は、少なくとも約３個、約６個、または約８個のカチオン性アミノ酸を含み得る。転位機能を得るためにポリカチオン性配列を用いる本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ポリカチオン性配列は、ＫＫＫ、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号５９）、またはＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号６０）という配列を含み得る。転位機能を得るためにポリカチオン性配列を用いる本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ポリカチオン性配列は、ＨＨＨ、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１）、またはＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）という配列を含み得る。転位機能を得るためにポリカチオン性配列を用いる本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、ポリカチオン性配列は、ＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号６３）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６４）という配列を含み得る。
本明細書に記載の毒素融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、第１の融合タンパク質ドメインは、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分を含み、第２の融合タンパク質ドメインは、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素転位ペプチドを含む。第１の融合タンパク質ドメインの他の実施形態では、炭疽毒素転位ペプチドは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン（ＨＮ）、またはポリカチオン性配列と交換される。
本明細書に記載の毒素融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、第１のドメインは、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含み、第２のドメインは、細胞内作用毒素の触媒ドメインと融合した炭疽毒素転位ペプチドを含む。第１の融合タンパク質ドメインの他の実施形態では、炭疽毒素転位ペプチドは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン（ＨＮ）、またはポリカチオン性配列と交換される。
本明細書に記載の毒素融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、第１のドメインは、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分、または（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含み、第２のドメインは、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽毒素致死因子（ＬＦ）を含む。
別の態様では、操作された融合タンパク質が本明細書に記載され、当該操作された融合タンパク質は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（Ｐａｄ４）を含む。
機能性ポアを形成するためには、ＰＡ及び／またはｍＰＡは、オリゴマー化しなくてはならない。したがって、ＰＡポリペプチドが関与する本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、ＰＡまたはｍＰＡは、オリゴマー形態であり得る。ＰＡポリペプチドが関与する本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態のいくつかでは、ＰＡまたはｍＰＡは、対象への投与前及び／または侵害受容細胞との接触実現前にオリゴマー形態であり得る。
リンカー−本明細書に記載のポリペプチドの２つ以上のドメインまたは部分の連結にリンカーを使用してよい。リンカー分子（「リンカー」）は、ペプチド（１個〜複数個のアミノ酸からなる）または非ペプチド分子であり得る。本明細書に記載のポリペプチドにおいて有用なペプチドリンカー分子の例には、高グリシン含量のペプチドリンカー（例えば、ＵＳ５，９０８，６２６を参照のこと）が含まれ、こうしたペプチドリンカーでは、半数を超えるアミノ酸残基がグリシンである。好ましくは、そのような高グリシン含量のペプチドリンカーは、約２０個以下のアミノ酸からなる。
リンカー分子には、非ペプチド分子または部分ペプチド分子も含まれ得る。例えば、ペプチドは、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）などの、よく知られた架橋分子を使用し、ペプチドまたは他の分子に連結することができる。
本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態のいくつかでは、それぞれの融合タンパク質において、さまざまなドメイン及び部分、ＴＭ、ＴＬ、ＰＡｄ４、ＰＡ断片、ＬＦ、ＬＦｎ、ＥＦ、ＥＦｎ、ｍＰＡ、さまざまな型の毒素（さまざまなセロタイプを含むＢＴｘ、ＴＴｘ、ＡＢ毒素、リシン毒素、コレラ毒素、ＰＥ、志賀毒素、ＤＴ、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素）等がリンカーペプチドで共に連結される。リンカーペプチドの例には、限定はされないが、
Figure 2018525021
が含まれる。
可動性リンカーは、一般に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒなどの、小型の非極性残基または極性残基からなる。リンカーを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、ＧｌｙまたはＳｅｒであるアミノ酸を少なくとも１個含む。リンカーを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、リンカーは、長さが１〜２５残基の可動性ポリペプチドである。可動性ペプチドリンカーの一般的な例には、（ＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜８）、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの繰り返し（ｎ＝１〜８（配列番号５７）、好ましくは、ｎ＝３、４、５、もしくは６）、すなわち（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、モチーフが繰り返す回数を示す）が含まれる。例えば、可動性リンカーは、（ＧＧＳ）２、すなわち、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号５８）である。
リンカーを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸長である。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、ヒト血清において少なくとも１分間安定である。１つの実施形態では、リンカーペプチドは、Ｌｙｓ及び／またはＡｒｇを含まない。
リンカー及びＰＡｄ４を含む融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４のＮ末端に付加されるリンカーは、長さが２０個未満のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、及びＡｌａという少なくとも３つのアミノ酸から構成される。
リンカー及びＰＡｄ４を含む融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡｄ４のＮ末端に付加されるリンカーは、長さが２０個未満のアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＡｌａという少なくとも４つのアミノ酸から構成される。
リンカーを含む融合タンパク質の実施形態の１つでは、リンカーは、ヒト血清において少なくとも１分間安定であり、長さが２０個未満のアミノ酸である。
二官能性の架橋分子は、２つの異なる反応部位を有するリンカー分子である。例えば、二官能性のリンカー分子の反応部位の一方は、ペプチドに存在する官能基と反応して共有結合を形成し得、もう一方の反応部位は、別の分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成し得る。架橋分子を対象とする一般的な方法は概説されている（例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１：２−１２（１９９０）を参照のこと）。
ホモ二官能性の架橋分子は、化学的に同一の２つの反応部位を有する。ホモ二官能性の架橋分子の例には、限定はされないが、グルタルアルデヒド、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレイミド−プロピオニル−２−ヒドロキシ−ｌ，３−プロパンジオール（スルフヒドリルに特異的なホモ二官能性の架橋剤）、ある特定のＮ−スクシンイミドエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル（ｄｉｓｃｕｃｃｉｎｉｍｙｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））、ならびに可溶性のビス−スルホン酸及びその塩（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉを参照のこと）が含まれる。
好ましくは、二官能性の架橋分子は、ヘテロ二官能性のリンカー分子であり、このことは、リンカーが少なくとも２つの異なる反応部位を有し、そのそれぞれを、ペプチドまたは他の分子に別々に連結できることを意味する。そのようなヘテロ二官能性のリンカーを使用することで、選択ペプチド配列に対して、それぞれの反応部位を化学的に別々かつ段階的に付加すること（ベクトル結合（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ））が可能になる。本発明において有用なヘテロ二官能性のリンカー分子には、限定はされないが、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２８：４７７−４８７（１９８２）、Ｐａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８４：２４７９−２４８３（１９８７）を参照のこと）、ｍ−マレイミド−ベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、マレイミドブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸（例えば、Ｃａｒｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉを参照のこと）が含まれる。
ＰＡｄ４ドメイン−本明細書に記載のＰＡｄ４ドメインを含む融合タンパク質の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、約２〜１０個のＰＡｄ４ドメイン、または１〜５個のＰＡｄ４ドメイン、または２〜５個のＰＡｄ４ドメイン等を直列で含む。融合タンパク質の実施形態の１つでは、天然のＰＡｄ４ドメインに隣接する、ＰＡのＮ末端側に由来する約１〜６０個の連続アミノ酸が、毒素部分（例えば、ＢＴｘ部分、ＴＴｘ部分、ジスルフィド含有ペプチド毒素部分、ＡＢ毒素部分等）と、ＰＡｄ４ドメイン（複数可）と、の間にさらに組み込まれる。
本明細書に記載のＰＡｄ４ドメインを含む融合タンパク質またはＰＡｄ４ドメインを含む組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、ＰＡのドメイン２（ＰＡｄ２）をさらに含む。ＰＡｄ２ドメインは、ＰＡ配列（配列番号１）のアミノ酸残基２５９〜４８７において見られ得る。本明細書に記載のＰＡｄ４ドメインを含む融合タンパク質またはＰＡｄ４ドメインを含む組成物の別の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＡのドメイン３（ＰＡｄ３）をさらに含む。
本明細書に記載のＰＡｄ４ドメインを含む融合タンパク質またはＰＡｄ４ドメインを含む組成物の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、未変化のＰＡの変異形態をさらに含み、当該変異形態は、ＰＡがタンパク質分解性の活性化に抵抗性となるように変異（Ｍ）によってフーリン切断部位が除去されており、したがって、オリゴマー化しない。
本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む融合タンパク質の実施形態の１つ、あるいは本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む融合タンパク質を含む組成物の実施形態の１つでは、ＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡ由来のタンパク質）は、修飾または変異導入される。
１つの実施形態では、ＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡｄ４、ＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインは、ＬｙｓＣなどのプロテアーゼによる切断に抵抗性である。ＰＡをプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、こうしたプロテアーゼの他の例には、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２ ＰＡに結合するＰＡｄ４、ＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む融合タンパク質、あるいは本明細書に記載のＡＮＴＸＲ２に結合するＰＡｄ４、ＰＡもしくはそのＰＡ断片、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む融合タンパク質を含む組成物の実施形態の１つでは、ＰＡ由来のタンパク質は、キモトリプシン／サーモリシンによる切断に抵抗性である。これは、キモトリプシンによる潜在的な切断を防止するために、任意選択で変異導入することもできる。キモトリプシン／サーモリシンに感受性の部位は、３１３ＦＦＤ３１５に位置する。
ＰＡをプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、こうしたプロテアーゼの他の例には、限定はされないが、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃが含まれる。
１つの実施形態では、位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０で、ＰＡｄ４ドメインもしくはＰＡ、またはｍＰＡにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数が、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されている（この番号付けは、Ｎ末端の２９アミノ酸のシグナルペプチドを除去した後の配列番号１を指しており、配列番号１は、２９アミノ酸のシグナルペプチドを有する配列Ｐ１３４２３である）。言い換えれば、配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡのＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数（それぞれを含めた最大数を含む）を、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換することができる。
１つの実施形態では、配列番号１の位置６３０、位置７４２、及び／または位置７４８で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＡｓｎ残基の１つまたは複数がＡｓｐによって交換されている。
ＰＡ−ＰＡドメインを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つ、またはそのような融合タンパク質を含む組成物の実施形態の１つでは、ＰＡは、フーリンによる切断に抵抗性のＰＡ変異体もしくはＰＡ変異形態（ＰＡフーリン−）であるか、またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように変異導入される（ｍＰＡ）。１つの実施形態では、アミノ酸残基ＲＫＫＲを含む、ＰＡのフーリン切断部位は、フーリン抵抗性のアミノ酸配列によって交換されており、ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。１つの実施形態では、フーリン抵抗性のアミノ酸配列は、ＳＳＳＲ（配列番号３２）、ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはＲＲＳＳ（配列番号１４９）である。１つの実施形態では、ＰＡは、Ｎ７１１Ａ及び／またはＤ７１２Ａという、ＰＡの受容体結合機能を遮断する１つまたは２つの変異を有し、アミノ酸のこの番号付けは、配列番号１（２９残基のシグナルペプチドを含む全ＰＡ）によるものである。これらの２つの変異は、２９残基のシグナルペプチドを含めずに番号付けされたＰＡ配列では、Ｎ６８２Ａ／Ｄ６８３Ａである。
ＰＡを含む本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、ＰＡは、例えば、例えばＬｙｓ−Ｃまたはフーリンといったプロテアーゼによる切断に抵抗性となるように修飾または変異導入される。例えば、位置５９４、位置６１３、位置６３３、位置６３７、位置６５３、位置６７３、位置６７９、位置６８０、位置６８４、位置６９５、位置７０３、位置７２２、位置７２３、位置７２９、及び位置７３０（この番号付けは、配列番号１における２９アミノ酸のシグナルペプチドを差し引いた後の配列番号１のものを指す）、または配列番号１の位置６２３、位置６４２、位置６６２、位置６６６、位置６８２、位置７０２、位置７０８、位置７０９、位置７１３、位置７２４、位置７３２、位置７５１、位置７５２、位置７５８、及び位置７５９で、ＰＡｄ４ドメインにおけるＬｙｓ残基の１つまたは複数が、ＡｒｇまたはＨｉｓによって交換されている。プロテアーゼによる切断に抵抗性のＰＡを含む本明細書に記載の融合タンパク質の他の実施形態では、プロテアーゼは、Ｌｙｓ−Ｃ、リシルペプチダーゼ、トリプシン、エンテロキナーゼ、クロストリパイン、エラスターゼ、キモトリプシン、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃから選択される。
本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に少なくとも１個のＤ−アミノ酸をさらに含む。
本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、グリコシル化される。
本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、融合タンパク質は、グリコシル化されない。
操作された融合タンパク質の産生
本明細書に記載のさまざまなポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドまたは第１のポリペプチドもしくは第２のポリペプチド）は、天然源から精製し、かつ／または当該技術分野おいて知られる任意の方法を使用して組換えで産生させることができる。例えば、本明細書に記載の操作された融合タンパク質は、当該技術分野において知られる組換え分子クローン化によって産生させることができる。非限定例として、ＰＡは、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のＳｔｅｒｎｅ株から精製するか、または他の既知の手段によって合成することができる。Ｂ．アントラシスでは、ＰＡの遺伝子は、ｐＸＯ１と称されるプラスミドに位置する（Ｍｉｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３２）：２０６０７−２０６１２、当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。組換え発現の方法は、当該技術分野においてよく知られている。いくつかの実施形態では、全長ＰＡの代わりにＰＡ６３を使用することができる。ＰＡ６３断片は、トリプシン処理したＰＡから、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製され得る（前出のＭｉｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＰＡをコードする遺伝子は、クローン化され、配列決定されており（Ｖｏｄｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ ３４：６９３−６９７、当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）、精製ＰＡポリペプチドを得るために使用してよい。
２つのポリペプチド部分の融合は、組換えＤＮＡ技術、もしくはソルターゼによる反応（例えば、ＷＯ２０１２０９６９２６、ＷＯ２０１３１７７２３１、ＷＯ２０１４０８８９２８、米国特許第９０７９９５２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３３６９７４号及び第ＵＳ２０１５／０２６７１８６号を参照のこと。こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）の使用、または当該技術分野において知られる他の化学的連結方法／生化学的複合化方法のいずれかによって達成される。
記載の操作された融合タンパク質を産生するために、組換えＤＮＡ及び分子生物学の手法を使用することができる。例えば、ＴＭ、ＴＬ、ＰＡｄ４、ＰＡ断片、ＬＦ、ＬＦｎ、ＥＦ、ＥＦｎ、ｍＰＡ、さまざまな型の毒素（ＢＴｘ、ＴＴｘ、ＡＢ毒素、リシン毒素、コレラ毒素、ＰＥ、志賀毒素、ＤＴ、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素）等といった、それぞれのタンパク質ドメイン及びタンパク質部分をコードするｃＤＮＡセグメント及び配列をクローン化するプロセス、さまざまなペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列の産生、異なるｃＤＮＡ配列の連結、さまざまな操作された融合タンパク質の発現ベクター（例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、またはウイルスベクター）の構築、ならびにさまざまな組換えの操作された融合タンパク質のタンパク質発現及び精製は、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ、９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５において説明されるものものなどの、通常の組換え分子生物学及びタンパク質生化学の手法によって実施することができ、こうした文献はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
操作された融合タンパク質及びペプチドリンカーは、融合タンパク質の合成を目的とする、当該技術分野において知られる任意の方法、具体的には、化学合成または組換え発現の手法によって産生させることができる。
本発明の操作された融合タンパク質は、組換えタンパク質の発現及び精製を目的とする、当該技術分野において知られる任意の方法によって産生させることができる。
操作された融合タンパク質の組換え発現には、本明細書に記載の操作された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。ポリヌクレオチドは、タンパク質精製、または発現系中もしくはタンパク質の精製プロセスの間の、操作された融合タンパク質の同定もしくは位置決めを目的として、追加のアミノ酸をコードする配列をさらに含み得る。操作された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが得られると、融合タンパク質の産生のためのベクターは、当該技術分野においてよく知られる手法を使用し、組換えＤＮＡ技術によって産生させることができる。したがって、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法が本明細書に記載される。タンパク質をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、当該技術分野においてよく知られる方法を使用することができる。こうした方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ手法、合成手法、及びインビボの遺伝的組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに機能可能なように連結され、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。発現ベクターは、通常の手法によって宿主細胞に導入され、その後、遺伝子導入細胞を通常の手法によって培養することで、本発明の操作された融合タンパク質が産生される。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能可能なように連結され、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。
本発明の融合タンパク質を発現させるために、さまざまな宿主−発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主−発現系は、関心対象のコード配列をそれによって産生させ、その後に精製することができる媒体に相当するが、適切なヌクレオチドコード配列を形質転換または遺伝子導入すると本発明の融合タンパク質をインサイチュで発現することができる細胞にも相当する。こうしたものには、限定はされないが、融合タンパク質をコードする配列を含む組換えのバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡの発現ベクターを形質転換した原核細菌（例えば、弱毒化されたバチルス・アントラシス株、大腸菌、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物、融合タンパク質をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターを形質転換した酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ），ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））、融合タンパク質をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させるか、もしくは融合タンパク質をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を形質転換した植物細胞系、または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれる。大腸菌及び弱毒化されたＢ．アントラシス株などの細菌細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質の発現に特に有用である。
細菌系では、融合タンパク質の発現が意図される使用に応じて、多数の発現ベクター有利に選択することができる。例えば、そのようなタンパク質が大量に産生されることになるとき、融合タンパク質の医薬組成物を生成するには、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベル発現を生じさせるベクターが望ましくあり得る。そのようなベクターには、限定はされないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１（１９８３））（ｌａｃＺをコードする領域を有するフレーム内に、融合タンパク質をコードする配列を融合タンパク質が産生されるようにベクターに個々に連結することができる）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０９（１９８９））、及び同様のものが含まれる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来性のポリペプチドを発現させるために、ｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合させた後、遊離のグルタチオンを存在させて溶出することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼによる切断部位を含む設計となっており、その結果、クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができる。あるいは、ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質を産生させるためにｐＥＴ発現ベクターを使用することができ、ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質は、ニッケルカラムによって親和性による精製を実施することができる。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換えタンパク質の発現がＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（２００２）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８：３４９−５７によって説明されており、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。操作された炭疽含有融合タンパク質及びＢＴｘ含有融合タンパク質またはＴＴｘ含有融合タンパク質の組換え発現及び精製の例は、当該技術分野において知られており、例えば、国際特許公開ＷＯ２０１２／０９６９２６及びＷＯ２０１５／１６６２４２、米国特許第９０７９９５２号、第９２３４０１１号、第９２４３３０１号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３３６９７４号、第ＵＳ２０１５／０２６７１８６号、第ＵＳ２０１５／００４４２１０号において、より詳細に説明されている。こうした文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
昆虫系では、外来遺伝子を発現させるために、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）がベクターとして使用される。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。融合タンパク質をコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へと個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
藻類であるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける異種タンパク質の大スケールでの発現は、Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．２００６ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：２１３−３３、Ｍａｎｕｅｌｌ ＡＬ ｅｔ．ａｌ．２００７ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．Ｅｐｒｉｎｔ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＳＥ ａｎｄ Ｍａｙｆｉｅｌｄ ＳＰ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．Ｆｅｂ；５（２）：２２５−３５、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ＳＰ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＳＥ，２００５ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｍａｒ ７；２３（１５）：１８２８−３２、及びＦｕｈｒｍａｎｎ Ｍ．２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．９４：１９１−５によって説明されている。外来性の異種コード配列は、相同組換えによって、核、葉緑体、及びミトコンドリアのゲノムに挿入される。葉緑体において外来タンパク質を発現させるために、最も汎用性の葉緑体選択可能マーカーであるアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）（スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を与える）を保有する葉緑体発現ベクターｐ６４を使用することができる。藻類にベクターを導入するために、微粒子遺伝子銃法（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｍｅｔｈｏｄ）が使用される。外来ＤＮＡが葉緑体に入ると、遺伝子銃粒子から放出され、相同組換えを介して葉緑体ゲノムに組み込まれる。
哺乳類宿主細胞では、ウイルスに基づく多数の発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、例えば、後期プロモーター及び３要素リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）といった、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体に融合タンパク質のコード配列を連結することができる。その後、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボの組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）に挿入することで、感染宿主において生存可能であり、融合タンパク質を発現する能力を有する組換えウイルスが生じることになる。例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと。融合タンパク質をコードする挿入配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要となり得る。こうしたシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、全挿入断片の翻訳を確保するためには、所望のコード配列のリーディングフレームと開始コドンが同調しなくてはならない。こうした外来性の翻訳制御シグナル及び開始コドンの起源はさまざまであり得、天然起源及び合成起源の両方があり得る。適切な転写促進要素、転写ターミネーター等を含めることによって発現効率を増進させることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
さらに、挿入配列の発現調節、または特定の所望様式での遺伝子産物の修飾及びプロセシングを行う宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾に対して特徴的かつ特異的な機構を有する。発現する外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確保するたるために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的を達成するために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化を行うための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＮＳＯ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ならびに特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、及びＴ４７Ｄなどの乳癌細胞株、ならびに例えば、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常乳腺細胞株が含まれる。
組換えタンパク質を長期にわたって高収率で産生させるためには、安定発現が好ましい。例えば、融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を操作設計することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、転写促進因子、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されたＤＮＡ、及び選択可能マーカーを宿主細胞に形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を濃縮培地で１〜２日間増殖させてから選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞の、その染色体へのプラスミドの安定的な組み込み、及び細胞の増殖によるフォーカス形成を可能にし、形成されたこのフォーカスは、次々にクローン化され、細胞株に広がり得る。この方法は、融合タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。そのような操作された細胞株は、融合タンパク質と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
多数の選択系を使用することができ、こうした選択系には、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２（１９９２））遺伝子、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８１７（１９８０））遺伝子が含まれ、これらの遺伝子は、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また、下記の遺伝子の選択基礎として代謝拮抗剤抵抗性を使用することができる：ｄｈｆｒ（メトトレキサートに対する抵抗性を与える）（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））、ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する抵抗性を与える）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））、ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２（１９９３）、及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−２１７（１９９３）、Ｃａｎ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）、ならびにｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））。所望の組換えクローンを選択するために、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に知られる方法を日常的に適用することができ、そのような方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ １９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ １９９４），Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１）において説明されている。こうした文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の操作された融合タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。融合タンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加することになる。増幅される領域は、本明細書に記載の操作された融合タンパク質をコードする核酸配列と関連しているため、操作された融合タンパク質の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２５７（１９８３））。
本発明の発現ベクターを２つ同時に宿主細胞に遺伝子導入することができ、第１のベクターは、第１の融合タンパク質をコードし、第２のベクターは、第２の融合タンパク質をコードする。これら２つのベクターは、融合ポリペプチドの同等発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含み得る。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードし、それらを発現する能力を有する単一のベクターを使用することができる。両方の融合ポリペプチドをコードする２シストロン性の発現カセットが発現ベクターに挿入される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１９７（１９８０））。
本発明の融合タンパク質が、動物または組換えでの発現によって産生されると、当該技術分野において知られる任意のタンパク質精製方法によって精製することができ、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡによる精製後の、特異的抗原に対する親和性によるもの、及びサイジングカラムによるクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の差異、またはタンパク質の精製を目的とする任意の他の標準的な手法によって精製することができる。さらに、本明細書に記載の操作された融合タンパク質は、精製を容易にするために、本明細書に記載されるか、またはその他の形で当該技術分野において知られる異種ポリペプチド配列に融合させることができる。
親和性による精製目的では、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッケルまたはコバルトが複合化した樹脂などの、親和性クロマトグラフィーを目的とする関連マトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、ＰｈａｒｍａｃｉａのＧＳＴ精製システム、及びヒスチジンタグを有する融合タンパク質で有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））などの、「キット」形態において利用可能である。タグもまた、発現した組換え融合タンパク質の検出を容易にすることができる。そのようなタグの例には、さまざまな蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに「エピトープタグ」が含まれ、「エピトープタグ」は、通常、それに対する特異的な抗体が利用可能な短いペプチド配列である。それに対して特異的なモノクローナル抗体が容易に利用可能なエピトープタグの中でよく知られているものには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。いくつかの場合では、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどを対象とする、プロテアーゼによる切断部位を有しており、こうした切断部位を有することで、関連プロテアーゼによる融合タンパク質の部分的な消化、及びそれによるそこからの組換えタンパク質の遊離が可能になる。その後、遊離したタンパク質は、続けて実施するクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。
したがって、１つの実施形態では、核酸配列が本明細書に含まれ、当該核酸配列は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする。
１つの実施形態では、ベクターが本明細書で提供され、当該ベクターは、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含む。例えば、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子であり得る。こうしたベクターは、当該技術分野において知られている。１つの実施形態では、プラスミドが本明細書で提供され、当該プラスミドは、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含む。例えば、プラスミドは、細菌プラスミドである。記載のベクターの実施形態の１つでは、ベクターは、発現ベクターである。例えば、プラスミド（ベクター）は、細菌における組換えタンパク質の発現を目的とする発現プラスミドであり、こうした細菌は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。記載の発現ベクターの実施形態の１つでは、発現ベクターは、細菌発現ベクターである。記載の発現ベクターの実施形態の１つでは、発現ベクターは、原核生物発現ベクターである。記載の発現ベクターの実施形態の１つでは、発現ベクターは、真核生物発現ベクターである。記載の発現ベクターの実施形態の１つでは、発現ベクターは、哺乳類発現ベクターである。１つの実施形態では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。
別の実施形態では、ウイルス粒子が本明細書で提供され、当該ウイルス粒子は、先行パラグラフに記載の核酸を含むベクターを含む。別の態様では、ウイルス粒子が本明細書で提供され、当該ウイルス粒子は、先行パラグラフに記載の核酸を含む。
１つの実施形態では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列、または本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクターを含む。細胞は、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞等であり得る。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉである。例えば、核酸にコードされる融合タンパク質の組換えタンパク質発現を目的とする。
別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクターを含むウイルス粒子を含む。別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むプラスミドを含む。別の態様では、細胞が本明細書で提供され、当該細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むウイルス粒子を含む。
１つの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つの産生方法が本明細書で提供され、当該方法は、（ａ）本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含む細胞の培養、または本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、プラスミド）を含む細胞の培養、または記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクターを含むウイルス粒子を含む細胞の培養、または本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むウイルス粒子を含む細胞の培養と、（ｂ）融合タンパク質の回収と、を含み、培養は、記載の融合タンパク質が発現する条件下で実施される。
１つの実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される融合タンパク質が本明細書で提供され、具体的には、当該方法は、（ａ）本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含む細胞の培養、または本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、プラスミド）を含む細胞の培養、または記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクターを含むウイルス粒子を含む細胞の培養、または本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むウイルス粒子を含む細胞の培養と、（ｂ）融合タンパク質の回収と、を含み、培養は、記載の融合タンパク質が発現する条件下で実施される。
融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、細菌などの原核細胞である。融合タンパク質の産生を目的として記載される方法の実施形態の１つでは、細胞は、細菌細胞である。１つの実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ））である。別の実施形態では、細菌は、弱毒化されたＢ．アントラシス株（例えば、ＣＤＣ６８４）である。
本明細書に記載の融合タンパク質の産生方法の実施形態の１つでは、細胞は、酵母細胞である。１つの実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエである。１つの実施形態では、酵母は、細胞におけるグリコシル化能を欠損している。
本明細書に記載の融合タンパク質の産生方法の実施形態の１つでは、酵母は、グリコシル化能及びプロテアーゼを欠損している。１つの実施形態では、プロテアーゼは、フーリンまたはフーリン様プロテアーゼである。
本明細書に記載の融合タンパク質の産生方法の実施形態の１つでは、細胞は、哺乳類細胞である。１つの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＮＳＯ細胞である。
組成物
１つの態様では、組成物が本明細書に記載され、当該組成物は、本明細書に記載の操作された融合タンパク質を少なくとも１つ含む。１つの実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。
いくつかの態様では、先行パラグラフに記載の組成物のいずれか、または先行パラグラフに記載の融合タンパク質を含む組成物のいずれかは、疼痛の治療に使用される。疼痛の治療は、先行パラグラフに記載の複数の異なる組成物、すなわち、いくつかの異なる組成物の投与を含み得る。例えば、組成物が、ＬＦｎ、ＬＦ、ＥＦｎ、またはＥＦを含む融合タンパク質を含み、侵害受容器受容体結合タンパク質が融合タンパク質に存在する場合、組成物は、ＰＡ、ＰＡ断片、ＰＡｄ４含有ＰＡ断片、またはＰＡのＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む組成物と組み合わせて使用されることが好ましいであろう。
いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の異なる操作された融合タンパク質を含み得、こうした融合タンパク質は、例えば、異なる第１及び／または第２のドメインを有する融合タンパク質である。そのようなタンパク質混合物は、例えば、非特異的作用を低減し、及び／または侵害受容器の阻害機構を複数提供することで、効力を向上させることができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる操作された融合タンパク質は、オリゴマー形態であり得、その結果、オリゴマー複合体は、少なくとも２つの異なる操作された融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１の操作された融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分を含む第１のドメインを有し、第２の操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含む第１のドメインを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。
ポリペプチドが炭疽毒素転位ペプチドを含むとき、転位ペプチドは、存在するＰＡ及び／またはｍＰＡにポリペプチドを結合させ、当該ＰＡ及び／またはｍＰＡによる膜を横切る転位を生じさせることができる。したがって、ＰＡ及び／またはｍＰＡと、転位されることになるポリペプチド（例えば、毒素）と、は別々のポリペプチドとして存在し得る。１つの態様では、組成物が本明細書に記載され、当該組成物は、
（Ｉ）
ａ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分、及び任意選択で、
ｂ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分
からなる群から選択される第１のポリペプチドと、
（ＩＩ）
ｃ）阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽菌転位シグナルペプチド、
ｄ）細胞内作用毒素の触媒ドメインと融合した炭疽菌転位シグナルペプチド、及び／または
ｅ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽毒素致死因子（ＬＦ）
からなる群から選択される第２のポリペプチドと、
を含む。
そのような組成物の実施形態の１つでは、第１のポリペプチドは、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分を含み、第２のポリペプチドは、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素転位ペプチドを含む。
そのような組成物の別の実施形態では、第１のポリペプチドは、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含み、第２のポリペプチドは、細胞内作用毒素の触媒ドメインと融合した炭疽毒素転位ペプチドを含む。第２のポリペプチドの他の実施形態では、炭疽毒素転位ペプチドは、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン（ＨＮ）、またはポリカチオン性配列と交換される。
そのような組成物の別の実施形態では、第１のポリペプチドは、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分、または（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分を含み、第２のポリペプチドは、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽毒素致死因子（ＬＦ）を含む。
第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むそのような組成物の別の実施形態では、ＰＡまたはｍＰＡは、オリゴマー形態である。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むそのような組成物の別の実施形態では、組成物は、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分と、（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分と、の両方を含む。１つの実施形態では、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分と、（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分という、２つの異なる第１のポリペプチドは、オリゴマー形態であり、その結果、オリゴマー複合体は、両方のポリペプチドを含む。１つの実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、組成物は、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。別の実施形態では、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合される。
本明細書に記載の、ＬＦｎ、ＬＦ、ＥＦ、またはＥＦｎを含む融合タンパク質を含む組成物のいずれかの実施形態の１つでは、組成物は、天然の炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）タンパク質をさらに含む。１つの実施形態では、ＰＡタンパク質は、オリゴマーＰＡである。別の実施形態では、オリゴマーＰＡは、融合タンパク質に結合される。
疼痛の治療を目的とする操作された融合タンパク質及び組成物の使用
個々または組み合わせて使用される、本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物はいずれも、疼痛の治療に使用することができる。同様に、本明細書に記載の融合タンパク質はいずれも、疼痛の治療に使用することができる。さらに、記載の組成物のさまざまな組み合わせ、または記載の操作された融合タンパク質のさまざまな組み合わせが、疼痛の治療において使用されることになると想定される。本明細書に記載の融合タンパク質及び組成物は、侵害受容器に選択的に結合し、侵害受容細胞を殺傷及び／または阻害する毒素を送達することができる。いくつかの実施形態では、他のニューロンは、本明細書に記載の融合タンパク質及び／または組成物による影響を受けない。
別の態様では、先行パラグラフに記載の融合タンパク質の１つまたは複数と、医薬的に許容可能な担体または賦形剤と、を含む医薬組成物の製造方法が本明細書で提供される。
別の態様では、疼痛の治療を目的とする薬物の製造における使用を目的とする、先行パラグラフに記載の融合タンパク質が本明細書で提供される。１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化される。
別の態様では、疼痛の治療における使用を目的とする、先行パラグラフに記載の融合タンパク質が本明細書で提供される。１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化される。
したがって、１つの態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、本明細書に記載の組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含む。複数の組成物を、同時または逐次的のいずれでも投与することができる。例えば、組成物が、ＬＦｎ、ＬＦ、ＥＦｎ、またはＥＦを含む融合タンパク質を含み、侵害受容器受容体結合タンパク質が融合タンパク質に存在する場合、組成物は、ＰＡ、ＰＡ断片、ＰＡｄ４含有ＰＡ断片、またはＰＡのＰＡのＣ末端受容体結合ドメインを含む組成物と組み合わせて使用されることが好ましいであろう。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）と、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインと、を含み、（ａ）部分と（ｂ）部分とは、共に連結もしくは融合される。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）当該侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、当該結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて当該侵害受容ニューロンに入る能力を有し、当該侵害受容ニューロンが、当該ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってプロテアーゼを当該侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含み、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分は、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含み、ＰＡまたはそのＰＡ断片は、侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）イオンチャネルをそこで発現する侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と、を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）ＡＢ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはその断片と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って毒素（プロテアーゼ）を侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）のＣ末端受容体結合ドメインに連結された、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）のＮ末端酵素ドメイン（ＬＣまたはＬ鎖）及び中間ポア形成／転位ドメイン（ＨＮ）を含むＢＴｘ部分を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、（ａ）ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）部分のボツリヌス神経毒素Ｎ末端酵素ドメインと、（ｂ）オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、またはオリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）と、を含み、（ａ）部分は、（ｂ）部分に対して、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方で連結される。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、ジスルフィド含有ペプチド毒素に連結された、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）、または侵害受容ニューロン結合タンパク質を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、オリゴマー形態のＰＡ６３（炭疽菌ＰＡがタンパク質分解性に活性化した形態）に結合する、炭疽毒素致死因子のＮ末端ドメイン（ＬＦｎ）、またはオリゴマー形態のＰＡ６３に結合する、炭疽毒素浮腫因子のＮ末端ドメイン（ＥＦｎ）に対して、Ｎ末端もしくはＣ末端またはＮ末端とＣ末端との両方で機能可能なように連結されるか、あるいは１つまたは複数の部位で化学的に架橋されたジスルフィド含有ペプチド毒素を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）に連結されたリンカーペプチドに融合したＡＢ毒素を含み、融合タンパク質は、転位ドメイン、ホロ毒素、またはＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された、ホロ毒素の変異形態をさらに含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該融合タンパク質は、炭疽毒素防御抗原のＣ末端受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４ドメイン）に連結された、クロストリジウム神経毒素または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来する転位／ポア形成ドメインと一緒になったＮ末端酵素ドメイン（Ａ鎖）を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、天然の防御抗原（ＰＡ）、またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように修飾（例えば、化学的に）もしくは変異導入された変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容ニューロンの表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽菌致死因子（ＬＦ）と組み合わせて含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体、または操作された融合タンパク質を含む組成物である。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体、または操作された融合タンパク質を含む組成物である。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、例えば、コノトキシン（ＣＴｘ）といった阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む。１つの実施形態では、この融合タンパク質は、クロストリジウム神経毒素のＨ鎖のベルトをさらに含み得、ベルトは、Ｈ鎖のＮ末端セグメントである。
本明細書に記載の方法に従って治療することができる疼痛の例には、限定はされないが、慢性疼痛、慢性神経障害性疼痛、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、チャネル病、原発性肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、脊髄損傷による疼痛、多発性硬化症による疼痛、幻肢痛、脳卒中後疼痛、慢性背部痛、変形性関節症による疼痛、癌関連疼痛、ＨＩＶ関連疼痛、慢性炎症性疼痛、中枢性ニューロパチー、末梢性ニューロパチー、有痛性知覚脱失、痛覚過敏、ヒペルパチー、錯感覚、心因性疼痛、背部痛、突出痛、紅痛症、神経圧迫、及び／または絞扼［例えば、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼、圧迫神経根症（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｄｉｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、神経根性腰痛（ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ）、脊髄神経根病変（ｓｐｉｎａｌ ｒｏｏｔ ｌｅｓｉｏｎ）、脊髄神経根圧迫、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫、及び／または肋間神経痛］、神経炎、化学療法に起因する疼痛、慢性アルコール依存（アルコール性多発ニューロパチー）、関節リウマチによる疼痛、熱傷と関連する疼痛、脳炎による疼痛、骨折による疼痛、神経炎による疼痛、自己免疫疾患による疼痛、術後疼痛、歯痛、例えば、細菌感染症といった細菌感染症またはウイルス感染症と関連する疼痛、放射線療法と関連する疼痛、痛風及び過敏性腸症候群と関連する疼痛、外傷に起因する疼痛（裂傷、切り傷、熱傷、異物、または弾丸及び／もしくは銃弾の破片による損傷、脊髄損傷、腕神経叢裂離、神経挫滅及び／もしくは絞扼に起因するものなど）、神経切断、内臓痛（腎疝痛または尿管疝痛、過敏性腸症候群、狭心痛または心臓痛、不整脈、生理痛、間質性膀胱炎、直腸痛、下痢、虫垂炎、胆嚢炎、及び膵炎と関連する疼痛など）、尿毒症による疼痛、甲状腺機能低下症と関連する疼痛、ビタミン欠乏症と関連する疼痛、頭痛（例えば、緊張型頭痛、片頭痛、及び群発頭痛）、特発性疼痛（例えば、三叉神経痛、複合性局所疼痛症候群［例えば、複合性局所疼痛症候群Ｉ型及び／もしくは複合性局所疼痛症候群ＩＩ型］、アロディニア、または線維筋痛症）、呼吸器痛（例えば、喘息と関連する疼痛、喘息における気道過敏性、例えば、喘息及び／または慢性閉塞性肺障害における慢性咳嗽）、線維筋痛症、ホルモン療法による疼痛、甲状腺機能低下症による疼痛、てんかん性疼痛、運動失調、周期性四肢麻痺、急性そう痒疼痛及び／または慢性そう痒疼痛が含まれ得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用することによって治療される疼痛は、糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、及び他の全身性疼痛障害から選択される。
１つの実施形態では、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用することによって治療される疼痛は、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、及び筋肉の疼痛から選択される。
１つの実施形態では、投与されることになる組成物は、第１のポリペプチド（または融合タンパク質）と、第２のポリペプチド（または融合タンパク質）と、を含み、第１のポリペプチドは、投与前に第２のポリペプチドに結合される。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、第１の組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、
当該第１の組成物は、
ａ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分、及び／または
ｂ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分、ならびに
ｃ）下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む第２の組成物：
（ｉ）阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素転位シグナルペプチド、
（ｉｉ）細胞内作用毒素の触媒ドメインと融合した炭疽毒素転位ペプチド、及び／または
（ｉｉｉ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または炭疽毒素致死因子（ＬＦ）
を含む。
疼痛の治療方法と関連する態様のいずれかでは、投与は、中枢神経系へのくも膜下腔内注入、脳室内注入、硬膜外注射によって実施するか、または皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、神経内注射、もしくは関節内注射を使用する末梢性投与によって実施することができる。
したがって、１つの実施形態では、神経、関節、皮膚、内臓、膀胱、または筋肉の疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、本明細書に記載の組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、神経内注射、または関節内注射による末梢性投与を含む。
別の実施形態では、糖尿病性の神経障害性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛症、または他の全身性疼痛障害の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、本明細書に記載の組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での、硬膜外注射、くも膜下腔内注入、または脳室内注入による、それを必要とする対象の中枢神経系への投与を含む。
本明細書に記載の疼痛の治療方法のいずれかの実施形態の１つでは、本明細書に記載の組成物は、有効かつ疼痛を低減する量で、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤に炭疽菌防御抗原（ＰＡ）を含む組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に、別に投与される。
本明細書に記載の疼痛の治療方法の実施形態の１つでは、方法は、それを必要とする対象に対する、天然の成熟炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、及び炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、またはそれらの任意の組み合わせの投与を含む。
ＰＡが、疼痛治療を目的として投与される融合タンパク質または組成物の一部である、本明細書に記載の態様の実施形態の１つでは、ＰＡまたはｍＰＡは、オリゴマー形態で投与される。１つの実施形態では、オリゴマーＰＡまたはオリゴマーｍＰＡは、タンパク質分解性に活性化したＰＡもしくはｍＰＡ（またはその変異体）から形成されることで、受容体を有する細胞に対する親和性の増加が達成される。非限定例として、ＰＡをトリプシンで処理することで切れ目を入れた後、その２つの断片（例えば、ＰＡ６３及びＰＡ２０）をイオン交換カラムで分離することができる。ＰＡ６３は、オリゴマー（例えば、７量体）として溶出することになり、ｐＨが約ｐＨ８．０を上回るように保たれるのであれば、タンパク質分解性に活性化したプレポア状態に留まることになる。オリゴマーＰＡ及び／またはタンパク質分解性に活性化したＰＡの調製は、当該技術分野において説明されており、例えば、Ｍｉｌｎｅ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ ２６９：２０６０７−２０６１２，１９９４において説明されている。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
第１の組成物及び第２の組成物の投与を含む態様の実施形態の１つでは、第１の組成物は、（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分と、（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分と、の両方を含む。（ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分と、（ｉｉ）侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽毒素防御抗原（ｍＰＡ）部分と、を含む第１の組成物の投与を含む別の実施形態では、２つの異なる第１のポリペプチドは、オリゴマー形態であり、その結果、オリゴマー複合体は、両方のポリペプチドを含む。１つの実施形態では、第１の組成物は、第２の組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に、独立した注射で投与される。
本明細書に記載の組成物及び方法は、疼痛を有するか、または疼痛を有すると診断された対象に投与することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、疼痛を軽減するための、本明細書に記載の組成物の有効量での対象への投与を含む。本明細書で使用される「疼痛の軽減」は、疼痛と関連する任意の病状または症状の寛解である。同等の未治療対照と比較すると、そのような低減は、任意の標準的な手法によって測定すると、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはそれを上回る。本明細書に記載の組成物の、対象への投与手段としては、さまざまなものが当業者に知られている。そのような方法には、限定はされないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、局所、注射、または腫瘍内への投与が含まれ得る。投与は、局所性または全身性であり得る。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも１つまたは複数の症状の軽減に必要な組成物量を指し、所望の作用を得るために十分な量の薬理学的組成物に関する。したがって、「治療上有効な量」という用語は、典型的な対象に投与されると、特定の抗疼痛作用を得るために十分な組成物量を指す。本明細書で使用される有効量は、さまざまな文脈において、疾患の症状の発症の遅延に十分な量、疾患症状の経過の変更（例えば、限定はされないが、疾患の症状の進行の鈍化）に十分な量、または疾患の症状の好転に十分な量も含むことになる。したがって、一般に、正確な「有効量」を明記することは現実的に不可能である。しかしながら、任意の所与の症例について、適切な「有効量」は、日常的な実験方法を使用するだけで当業者が決定することができる。
有効量、毒性、及び治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができる。投与量は、用いられる剤形、及び利用される投与経路に応じて変わり得る。毒性作用と治療作用との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。また、用量を動物モデルにおいて定めることで、細胞培養または適切な動物モデルにおいて決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する活性成分濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。適したバイオアッセイによって任意の特定の投与量の作用を監視することができる。投与量は、医師によって決定され、観測される治療作用に適合するように必要に応じて調節することができる。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載の医薬組成物に関し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体と組み合わせられる。医薬的に許容可能な担体及び希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒、及び／または分散媒体が含まれる。そのような担体及び希釈剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。医薬的に許容可能な担体として働き得る材料のいくつかの例には、限定はされないが、（１）ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖、（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクなどの潤滑剤、（８）カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含有しない水、（１７）等張性生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／またはポリ酸無水物、（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの嵩増し剤、（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、及びＬＤＬなどの血清成分、（２２）エタノールなどのＣ２−Ｃ１２アルコール、ならびに（２３）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤も製剤に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「医薬的に許容可能な担体」、または同様のものなどの用語は、本明細書で互換的に使用される。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、担体は、例えば、本明細書に記載の組成物といった活性薬剤の分解を抑制する。
医薬組成物を含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、医薬組成物は、非経口剤形であり得る。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御能を迂回するという理由から、非経口剤形は、好ましくは、無菌であるか、または患者への投与前に無菌化することが可能である。非経口剤形の例には、限定はされないが、注射の準備が整った溶液、医薬的に許容可能な注射用媒体に溶解または懸濁する準備が整った乾燥製品、注射の準備が整った懸濁液、及び乳濁液が含まれる。さらに、患者投与を目的として、制御放出性の非経口剤形を調製することができ、こうした剤形には、限定はされないが、ＤＵＲＯＳ（登録商標）型剤形及び用量ダンピングが含まれる。
非経口剤形を得るために使用することが可能な適した媒体は当業者によく知られている。例には、限定はされないが、滅菌水、ＵＳＰ注射用水、生理食塩水、グルコース溶液、限定はされないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液などの水性媒体、限定はされないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールなどの水混和性媒体、ならびに限定はされないが、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルなどの非水性媒体が含まれる。本明細書に開示の組成物の医薬的に許容可能な塩の溶解性を改変または変更する化合物もまた、通常の非経口剤形及び制御放出性の非経口剤形を含む、本開示の非経口剤形に組み込むことができる。
通常の剤形では、一般に、製剤から薬物が迅速放出または即時放出される。通常の剤形を使用すると、薬物の薬理学及び薬物動態に応じて患者の血液及び他の組織において大幅な薬物濃度変動が生じ得る。こうした変動は、用量頻度、作用の発現、効力の持続期間、治療血液レベルの維持、毒性、副作用、及び同様のものなどの、多数のパラメーターに影響を与え得る。薬物の作用発現、作用の持続期間、治療濃度域内の血漿中レベル、及びピーク血中レベルを制御するために、制御放出製剤を有利に使用することができる。具体的には、潜在的な有害作用及び安全性への懸念を最小限にしつつ、薬物の最大有効性が確実に達成されるように制御放出性または持続放出性の剤形または製剤を使用することができる。こうした潜在的な有害作用及び安全性への懸念は共に、薬物の過小量投与（すなわち、最小治療レベルを下回るもの）ならびに薬物の毒性レベルの超過に起因して生じ得るものである。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、組成物は、持続放出製剤において投与することができる。
制御放出性の医薬製品は、その非制御放出性の対応物によって達成されるものに勝って薬物治療を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医学的治療における、最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の時間で病状を治癒または制御するために用いられる薬物物質が最小限であることによって特徴づけられるものである。制御放出製剤の利点には、１）薬物活性の持続、２）投与頻度の低減、３）患者コンプライアンスの向上、４）総薬物使用量の低減、５）局所性または全身性の副作用の低減、６）薬物蓄積の最小化、７）血中レベル変動の低減、８）治療効力の改善、９）薬物活性の増大化または損失の低減、及び１０）疾患または病状の制御スピードの改善が含まれる。Ｋｉｍ，Ｃｈｅｒｎｇ−ｊｕ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ，２（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．：２０００）。
制御放出製剤のほとんどが、所望の治療作用が迅速に得られる量の薬物（活性成分）を初期に放出し、長期にわたってこのレベルの治療作用または予防作用を維持する別の量の薬物をゆっくりかつ連続的に放出するように設計される。この一定レベルの薬物を体において維持するために、代謝されていく薬物量及び体からの排出されていく薬物量を置き換えることになる速度で剤形から薬物が放出されなくてはならない。活性成分の制御放出は、限定はされないが、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは化合物を含む、さまざまな条件によって刺激され得る。
さまざまな制御放出性または持続放出性の剤形、製剤、及び機器が知られており、こうしたものを本開示の塩及び組成物との使用に適合させることができる。例には、限定はされないが、米国特許第３，８４５，７７０号、第３，９１６，８９９号、第３，５３６，８０９号、第３，５９８，１２３号、第４，００８，７１９号、第５６７４，５３３号、第５，０５９，５９５号、第５，５９１，７６７号、第５，１２０，５４８号、第５，０７３，５４３号、第５，６３９，４７６号、第５，３５４，５５６号、第５，７３３，５６６号、及び第６，３６５，１８５Ｂ１号において説明されるものが含まれ、こうした文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。こうした剤形は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透性膜、浸透圧系（ＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）など）、または所望の放出プロファイルが得られるようにさまざまな比率でそれらを組み合わせたものを使用し、１つまたは複数の活性成分の放出を鈍化または制御するために使用することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、組み合わせ治療の一部として、対象に対する第２の薬剤及び／または治療の付与をさらに含み得る。第２の薬剤及び／または治療の例には、限定はされないが、鎮痛剤、抗炎症剤、ならびに疼痛及び／または疼痛を引き起こす病状を治療する他の薬剤が含まれ得る。
有効用量の組成物の投与を含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、有効用量の本明細書に記載の組成物の患者への投与回数は１回であり得る。別の実施形態では、有効用量の組成物が患者に反復投与され得る。全身性投与については、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれを超える量などの治療量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することができる。
疼痛の治療を目的とする組成物の投与を含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、最初の治療レジメンの後に、頻度を落として治療を実施することができる。例えば、隔週の治療を３ヶ月間実施した後、１ヶ月に１回の治療を６ヶ月間もしくは１年間またはそれより長い期間、繰り返すことができる。例えば、疼痛といった病状のマーカーまたは症状のレベルを本明細書に記載の方法に従う治療が低減することができる割合は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、またはそれを超える割合である。
本明細書に記載の組成物の投与量は、医師が決定することができ、観測される治療作用に適合するように必要に応じて調節される。治療の継続期間及び頻度に関して、治療から治療上の恩恵が得られる時期の決定、及び投与量の増減、投与頻度の増減、治療の中止、治療の再開、または治療レジメンの他の変更の実施の決定を行うために、技術を有する臨床医が対象を監視することが典型的である。投薬スケジュールは、組成物に対する対象の感受性などの、多数の臨床因子に応じて、１週間に１回から毎日まで変わり得る。所望の活性化用量または活性化量は、一度に投与するか、または例えば、２〜４つの部分用量といった部分用量に分割して投与することができると共に、例えば、１日の中での適切な間隔、または他の適切なスケジュールで、一定期間にわたって投与することができる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、投与は長期的であり得、例えば、数週間または数ヶ月という期間にわたって、１つまたは複数の用量及び／または治療が毎日実施され得る。投薬及び／または治療スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月以上という期間にわたる、１日に１回、１日に２回、１日に３回、または１日に４回以上の投与である。組成物は、５分、１０分、１５分、２０分、または２５分にわたる期間などの一定期間にわたって投与することができる。
本明細書に記載の方法に従う本明細書に記載の組成物の投与の投与量範囲は、例えば、活性成分の形態、その効力、及び例えば、所望の疼痛低減割合といった、本明細書に記載の病状の症状、マーカー、または指標の所望の低減度に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、病状、及び性別で変わることになり、当業者が決定することができる。投与量は、任意の合併症が生じた場合、各医師が調節することもできる。
例えば、本明細書に記載の病状の治療における組成物の効力、または本明細書に記載の応答（例えば、疼痛の低減）を誘導するための組成物の効力は、技術を有した臨床医が決定することができる。しかしながら、本明細書に記載の方法に従う治療の後、例えば、少なくとも１０％、本明細書に記載の病状の徴候もしくは症状の１つもしくは複数が有利な様式で変化するか、他の臨床的に許容可能な症状が改善もしくは寛解さえするか、または所望の応答が誘導されるのであれば、治療は、その用語が本明細書で使用されるように「有効な治療」であると考えられる。効力は、例えば、本明細書に記載の方法に従って治療される病状のマーカー、指標、症状、及び／または発生率の測定によって評価するか、または任意の他の適切な測定可能パラメーターの測定によって評価することができる。効力は、入院、または医療行為の必要性によって評価したときに個体に悪化が生じないこと（すなわち、疾患の進行の停止）によっても測定することができる。こうした指標の測定方法は、当業者に知られ、及びかつ／または本明細書に記載される。治療には、個体または動物（いくつかの例には、限定はされないが、ヒトまたは動物が含まれる）における疾患の任意の治療が含まれ、（１）例えば、症状（例えば、疼痛もしくは炎症）の悪化の予防といった、疾患の抑制、または（２）例えば、症状の退縮誘起といった、疾患の重症度の緩和が含まれる。疾患の治療に対する有効量は、それを必要とする対象に投与されると、その用語が本明細書に定義されるように、その疾患に対する有効な治療となるために十分な量であることを意味する。薬剤の効力は、病状の物理的指標または所望の応答の評価によって決定することができる。当業者であれば、そのようなパラメーターのいずれか１つ、またはパラメーターの任意の組み合わせの測定によって投与及び／または治療の効力を容易に監視することができる。効力は、例えば、疼痛のマウスモデルの治療といった、本明細書に記載の病状の動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルが使用されるとき、治療の効力は、例えば、患部における刺激に対する応答または患部における刺激の回避といったマーカーにおいて、統計学的に有意な変化が観測されたときに証明される。
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語及び語句の意味が以下に提供される。別段の記載がない限り、または文脈から暗示されない限り、下記の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の実施形態の説明を補助するために提供され、請求される発明の限定は意図されない。この理由は、本発明の範囲は、請求の範囲によってのみ限定されるためである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。当該技術分野における用語の用法と、本明細書で提供されるその定義との間に明らかな相異が存在するのであれば、本明細書内で提供される定義が優先されるものとする。
定義
便宜上、この箇所、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において用いられるある特定の用語がここに収載される。
本明細書で使用される「能力を有する」という用語は、動詞と共に使用されるとき、対応する動詞の行為を包含または意味する。例えば、「遮断する能力を有する」は、遮断することも意味し、「切断する能力を有する」は、切断することも意味し、「結合する能力を有する」は、結合することも意味し、「転位させる能力を有する」は、転位させることも意味し、「・・・・を特異的に標的とする能力を有する」は、特異的に標的とすることも意味する。
本明細書で使用される「侵害受容ニューロン結合タンパク質」または「侵害受容器結合タンパク質」は、本明細書に記載の融合タンパク質に関して使用されるとき、侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有するポリペプチド標的指向化部分（ＴＭ）を指し、相互作用の結果、ニューロンの結合部位は、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて侵害受容ニューロン内に入る。１つの実施形態では、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、侵害受容ニューロンの細胞表面に発現した受容体またはイオンチャネルに結合する抗体またはその抗体断片である。こうした受容体またはイオンチャネルは、例えば、神経成長因子受容体もしくはＡＮＴＸＲ２、またはＮａｖ１．７イオンチャネルタンパク質、Ｎａｖ１．８イオンチャネルタンパク質、及びＮａｖ１．９イオンチャネルタンパク質である。１つの実施形態では、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、侵害受容ニューロンの細胞表面受容体のリガンドであり、例えば、神経成長因子受容体の神経成長因子リガンドである。１つの実施形態では、侵害受容ニューロン結合タンパク質は、その受容体であるＡＮＴＸＲ２に結合する能力を有するＰＡまたはＰＡの変異形態もしくはそのＰＡ断片である。１つの実施形態では、ＴＭは、侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体を標的として結合する。
１つの実施形態では、その受容体に結合する能力を有するか、またはそれに結合するＰＡの変異形態は、フーリンプロテアーゼ及びフーリン様プロテアーゼに対して抵抗性である。１つの実施形態では、ＰＡの変異形態は、フーリン切断部位において修飾（例えば、化学的に）または変異導入される。いくつかの実施形態では、ＰＡフーリン−では、フーリン切断部位である１６４ＲＫＫＲ１６７が変異導入によってアミノ酸残基ＳＳＳＲ（配列番号３２）、アミノ酸残基ＳＳＳＳ（配列番号３３）、またはアミノ酸残基ＲＲＳＳ（配列番号１４９）とされ、ＲＫＫＲは、配列番号１における２９アミノ酸残基のシグナルペプチドを配列番号１から差し引いたものの残基１６４〜１６７である。アミノ酸のこの番号付けは、Ｎ末端における２９残基のシグナルペプチドを含まないＰＡポリペプチドに対する参照である。１つの実施形態では、その受容体に結合する能力を有するそのＰＡ断片は、ＰＡ６３（全長のＰＡタンパク質がフーリンによって切断されることよって産生される断片）、及びＰＡｄ４（全長の天然のＰＡのＣ末端受容体結合部分）である。１つの実施形態では、その受容体に結合する能力を有するそのＰＡ断片は、天然のＰＡにおけるＰＡｄ４ドメインに対してＮ末端に位置する少なくとも１〜６０の連続アミノ酸残基をＰＡｄ４に付加したものであり、このことは、推定ＰＡｄ４配列に追加の上流配列を付加したものが、ＰＡのＣ末端受容体結合セクションであることを意味する。
「低減する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の低減を意味するために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、「ｒｅｄｕｃｅ（低減する）」、「ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ（低減）」、もしくは「ｄｅｃｒｅａｓｅ（低減する）」、または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の治療を実施しない場合）と比較した際の少なくとも１０％の低減を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える割合の低減を含み得る。本明細書で使用される「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較した際の完全な阻害または低減は包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較した際の１００％の阻害である。低減は、好ましくは、所与の障害を伴うことなく、個体にとって正常の範囲内として許容されるレベルに至る減少であり得る。
「増加した」、「増加する」、「増進する」、または「活性化する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、「増加した」「増加する」、「増進する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較した際の少なくとも１０％の増加を意味し得、例えば、参照レベルと比較した際の少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大１００％までの増加、または１０〜１００％の間の任意の増加を意味し得るか、あるいは参照レベルと比較した際の少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍〜１０倍以上の間の任意の増加を意味し得る。マーカーまたは症状との関連では、「増加」は、そのようなレベルの統計学的に有意な増加である。
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカクを含み、例えば、アカゲザルである。げっ歯類には、マウス、ラット、マーモット、ケナガイタチ、ウサギ、及びハムスターが含まれる。飼育動物及び狩猟動物には、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、例えば、飼育ネコといったネコ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミといったイヌ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウといったトリ種、ならびに例えば、マス、ナマズ、及びサケといったサカナが含まれる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、対象は、哺乳類であり、例えば、霊長類であり、例えば、ヒトである。「個体」、「患者」、及び「対象」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、または雌ウシであり得るが、こうした例に限定はされない。ヒト以外の哺乳類は、疼痛の動物モデルとなる対象として有利に使用することができる。対象は、雄性または雌性であり得る。
対象は、治療を必要とする病状（例えば、疼痛）またはそのような病状と関連する１つもしくは複数の合併症に苦しむか、またはそれを有しているとこれまでに診断または同定されたことがある者であり得、任意選択で、疼痛または疼痛と関連する１つもしくは複数の合併症の治療を既に受けたことがある者であり得る。あるいは、対象は、疼痛または疼痛と関連する１つもしくは複数の合併症を有しているとこれまでに診断されたことのない者でもあり得る。例えば、対象は、疼痛または疼痛と関連する１つもしくは複数の合併症の１つまたは複数の危険因子を示す者であり得るか、または危険因子を示さない対象であり得る。
特定の病状の治療を「必要とする対象」は、その病状を有するか、その病状を有すると診断されるか、またはその病状を発症する危険を有する対象であり得る。
本明細書で使用される「操作された」は、人為的に操作されている態様を指す。例えば、融合ポリペプチドは、ポリペプチド配列及び／またはコード核酸配列が人為的に操作されることで、それが天然に存在するときのポリペプチド配列とは異なるものであるとき、「操作された」と考えられる。一般的なことであり、当業者であれば理解していることであるが、操作されたポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドの子孫及びコピーは、実際の操作はそれより前の実体に対して実施されたものであるが、典型的には、依然として「操作された」と称される。
本明細書で使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指すために本明細書で互換的に使用される。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能を問わず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）及びアミノ酸アナログを含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大型のポリペプチドに関して使用されることが多い一方で、「ペプチド」という用語は、小型のポリペプチドに関して使用されることが多いが、当該技術分野におけるこうした用語の用法には重複が存在する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物及びその断片を指すとき、本明細書で互換的に使用される。したがって、ポリペプチドまたはタンパク質の例には、遺伝子産物、天然起源のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、断片、ならびにこうしたもののアナログが含まれる。
本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、例えば、融合ポリペプチドまたはその部分（例えば、ドメイン）といったポリペプチドは、本明細書に記載の配列の変異体であり得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、変異体は、保存的な置換を有する変異体である。本明細書で称される「変異体」は、天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同性のポリペプチドであるが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換が存在するため、天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然のＤＮＡ配列または参照ＤＮＡ配列と比較すると、ヌクレオチドに１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、参照タンパク質と比較すると、関連する生物学的活性を保持し、例えば、野生型の参照タンパク質の少なくとも５０％の関連する生物学的活性を保持する変異タンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。アミノ酸配列に関して、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加であって、コードされる配列におけるアミノ酸の単一アミノ酸または僅かな割合（すなわち、例えば、５％以下であり、例えば、４％以下、または３％以下、または１％以下である）を改変する個々の置換、欠失、または付加は、改変の結果、化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸置換が生じる「保存的に改変された変異体」をもたらすことを当業者であれば認識するであろう。関連活性を潜在的に改善することができる何らかの変更が企図され、その結果、変異体は、保存的であるか否かを問わず、野生型の活性の１００％を超える活性を有し、例えば、野生型の活性の１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、５００％、１０００％、またはそれを超える活性を有する。
類似の生理化学的特性を有する残基によって所与のアミノ酸を交換することができ、例えば、別のものに対する、ある脂肪族残基での置換（別のものに対するＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａでの置換など）、または別のものに対する、ある極性残基での置換（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、またはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）である。例えば、類似の疎水性の特性を有する全領域の置換といった、他のそのような保存的な置換が知られている。天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドの所望の活性が残存しているかを確認するために、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つにおいて、保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを試験することができる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的な置換の表が当該技術分野においてよく知られている。そのような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間ホモログ、及び本開示と一致する対立遺伝子に加えられるものであり、それらを除外するものではない。典型的には、互いに保存的な置換には、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が含まれる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋の阻止するために、ポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を置換することもでき、こうした置換は、一般に、セリンで実施される。対照的に、その安定性を改善、またはオリゴマー化を促進するために、ポリペプチドにシステイン結合（複数可）を付加することができる。
ポリペプチドの投与を含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、対象に投与されるポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の置換または修飾を含み得る。１つの実施形態では、置換及び／または修飾によって、対象におけるポリペプチドのタンパク質分解の阻止もしくは低減、及び／または半減期の延長が可能である。１つの実施形態では、ポリペプチドは、それを他のポリペプチドまたはポリペプチドドメインに複合化または融合させることによって修飾することができ、こうしたポリペプチドまたはポリペプチドドメインの例は、限定はされないが、トランスフェリン（ＷＯ０６０９６５１５Ａ２）、アルブミン（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、成長ホルモン（ＵＳ２００３１０４５７８ＡＡ）、セルロース（Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｓｈｏｓｅｙｏｖ，２００２）、及び／またはＦｃ断片（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，１９９７）などである。先行パラグラフにおける参考文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ポリペプチドを含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、本明細書に記載のポリペプチドは、少なくとも１つのペプチド結合交換を含み得る。単一のペプチド結合、または例えば、２つの結合、３つの結合、４つの結合、５つの結合、もしくは６つ以上の結合といった複数のペプチド結合、あるいはすべてのペプチド結合を交換することができる。本明細書に記載の単離されたペプチドは、１つの型のペプチド結合交換、または例えば、２つの型、３つの型、４つの型、５つの型、もしくはそれを超える数の型のペプチド結合交換といった、複数の型のペプチド結合交換を含み得る。ペプチド結合交換の例には、限定はされないが、ウレア、チオウレア、カルバメート、スルホニルウレア、トリフルオロエチルアミン、オルト−（アミノアルキル）−フェニル酢酸、パラ−（アミノアルキル）−フェニル酢酸、メタ−（アミノアルキル）−フェニル酢酸、チオアミド、テトラゾール、ボロン酸エステル、オレフィン基、及びそれらの誘導体が含まれる。
ポリペプチドを含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、本明細書に記載のポリペプチドは、生物によって産生されるポリペプチド及び／またはタンパク質に一般に見られる天然起源のアミノ酸を含み得る。こうした天然起源のアミノ酸は、例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、及びＨｉｓ（Ｈ）である。ポリペプチドを含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、本明細書に記載のポリペプチドは、代替のアミノ酸を含み得る。代替のアミノ酸の例には、限定はされないが、Ｄ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン（３−メルカプト−Ｄ−バリン）、オルニチン、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）、アルファ−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、パラ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、ジアミノブタン酸、７−ヒドロキシ−テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、アミノ−イソブタン酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、２、２−ジエチルグリシン、１−アミノ−ｌ−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−ｌ−シクロヘキサンカルボン酸、アミノ−安息香酸、アミノ−ナフトエ酸、ガンマ−アミノブタン酸、ジフルオロフェニルアラニン、ニペコ酸、アルファ−アミノブタン酸、チエニル−アラニン、ｔ−ブチルグリシン、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロロイシン、フッ素化アナログ、アジド修飾アミノ酸、アルキン修飾アミノ酸、シアノ修飾アミノ酸、ならびにそれらの誘導体が含まれる。
ポリペプチドを含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、ポリペプチドは、例えば、１個または複数個のアミノ酸を含むペプチドに１つの部分を付加することによって修飾することができる。１つの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１つまたは複数の部分分子（ｍｏｉｅｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含み得、例えば、ペプチド当たり１つもしくは複数の部分分子、ペプチド当たり２つ以上の部分分子、ペプチド当たり５つ以上の部分分子、ペプチド当たり１０個以上の部分分子、またはペプチド当たりにそれを超える数の部分分子を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載のポリペプチドは、１つ複数の修飾及び／または部分を含み得、例えば、１つの型の修飾、２つの型の修飾，３つの型の修飾、またはそれを超える数の型の修飾を含み得る。修飾及び／または部分の例には、限定はされないが、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、ＥＬＰ化、脂質修飾、アセチル化、アミド化、エンドキャッピング修飾、シアノ基、リン酸化、アルブミン、及び環化が含まれる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、エンドキャッピング修飾には、Ｎ末端のアセチル化、Ｎ末端のアシル化、及びＮ末端のホルミル化が含まれ得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、エンドキャッピング修飾には、Ｃ末端のアミド化、アルコール部分、アルデヒド部分、エステル部分、及びチオエステル部分のＣ末端への導入が含まれ得る。ポリペプチドの半減期は、例えば、ＰＥＧまたはアルブミンといた部分の付加によって増加させることができる。
ポリペプチドの投与（またはポリペプチドをコードする核酸の投与）を含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、投与されるポリペプチドまたはコードされるポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列の１つの機能性断片であり得る。本明細書で使用される「機能性断片」は、本明細書で後述されるアッセイによる活性の残存割合が、野生型の参照ポリペプチドの少なくとも５０％である、ペプチドの断片またはセグメントである。機能性断片は、本明細書に開示の配列の保存的な置換または非保存的な置換を含み得る。
元のアミノ酸配列の改変は、当業者に知られる多数の手法のいずれかによって達成することができる。アミノ酸置換は、例えば、変更されることになるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列にコドンの変更を含み、元の配列の断片への連結を可能にする制限部位が隣接するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の位置に導入することができる。連結の後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って改変された特定のコドンを有するように改変されたヌクレオチド配列を得るために、オリゴヌクレオチドに対する部位特異的変異誘発手順を用いることができる。そのような改変の実施手法には、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）、Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）、ならびに米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号によって開示されるものが含まれ、こうした文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載のポリペプチドは、化学的に合成することができ、変異は、化学合成プロセスの一部として組み込むことができる。
本明細書で使用される「抗体」は、ＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、もしくはＩｇＥ分子、またはその抗原特異的抗体断片（限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、閉構造多特異性抗体、ジスルフィドで連結されたｓｃｆｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む）を指し、こうしたものが、抗体を天然に産生する種のいずれに由来するか、または組換えＤＮＡ技術によって創出されるか、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌から単離されるかは問われない。
本明細書に記載の「抗原」は、抗体物質に存在する結合部位が結合する分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドが結合するものであり、インビボで抗体応答を生じさせる能力を有する。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子もしくはそれらの一部であり得る。「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子が認識する、抗原に存在するエピトープを指し、より具体的には、分子の抗原結合部位が認識する、抗原に存在するエピトープを指す。
本明細書で使用される「抗体試薬」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬には、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドが含まれ得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、抗体試薬には、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドが含まれ得る。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨと略される）、及び軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域、及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ断片及びｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６（３）：６２９−３９を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））、ならびに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ及び組み合わせ）の構造的特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）を含む任意の供給源に由来し得るもの、及びプリマタイズド（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体であり得る。抗体には、ミディボディ（ｍｉｄｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び同様のものも含まれる。
ＶＨ領域及びＶＬ領域は、より保存された「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる領域に挟まれて存在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分類することができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照のこと。こうした文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、典型的には、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと下記の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書で互換的に使用され、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持する、全長抗体の１つまたは複数の断片を指すために使用される。全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）、及び（ｖｉ）特定の抗原結合機能性を保持する、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、２つの分子、化合物、細胞、及び／または粒子の間の化学的相互作用であって、第１の実体が第３の非標的実体に結合する場合と比較して、第１の実体が高い特異性及び親和性で第２の標的実体に結合する化学的相互作用を指す。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、特異的結合は、第２の標的実体に対する第１の実体の親和性であって、第３の非標的実体に対する親和性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれより高い親和性を指し得る。
さらに、及び本明細書に記載されるように、ヒトにおける治療を目的として、機能活性を維持しつつ、潜在的な免疫原性を低減するために、抗体をさらに最適化することができる。この点に関して、機能活性は、ポリペプチドが本明細書に記載の組換え抗体またはその抗体試薬と関連する既知の機能活性の１つまたは複数を示す能力を有することを意味する。そのような機能活性には、例えば、標的分子に結合する能力が含まれる。
本明細書で使用される「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそのアナログが組み込まれた単位である任意の分子を指し、好ましくは、ポリマー分子を指す。核酸は、１本鎖または２本鎖のいずれかであり得る。１本鎖の核酸は、変性した任意の２本鎖ＤＮＡの核酸鎖の１つであり得る。あるいは、１本鎖の核酸は、いずれの２本鎖ＤＮＡにも由来しない１本鎖の核酸であり得る。１つの態様では、核酸は、ＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸は、ＲＮＡであり得る。適した核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の適した核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。
本明細書で使用される「治療する」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「寛解」という用語は、例えば、疼痛といった疾患または障害と関連する病状の進行または重症度の好転、軽減、寛解、抑制、鈍化、または停止が目的である治療的な治療を指す。「治療」という用語は、疼痛と関連する病状、疾患、または障害の有害作用または症状の少なくとの１つの低減または軽減を含む。一般に、１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されるのであれば、治療は「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減されるか、または停止するのであれば、治療は「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善を含むだけでなく、治療を実施しない場合に予測されるであろうものと比較して、症状の進行または悪化が休止または少なくとも鈍化することも含む。有利なまたは所望の臨床結果には、限定はされないが、検出の可能または不可能を問わず、１つもしくは複数の症状（複数可）の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患の進行の遅延もしくは鈍化、疾患状態の寛解もしくは緩和、軽快（部分的もしくは全体的を問わず）、及び／または死亡率の低減が含まれる。疾患の「治療」という用語には、疾患の症状または副作用の緩和の提供も含まれる（対症療法を含む）。
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、例えば、医薬産業において一般に使用される担体といった医薬的に許容可能な担体と組み合わせた活性薬剤を指す。「医薬的に許容可能な」という語句は、合理的な利点／危険比に見合い、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織との接触使用に適した化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために本明細書で用いられる。
本明細書で使用される「投与」という用語は、所望の部位に対して薬剤を少なくとも部分的に送達する方法または経路による、対象への、本明細書の開示の化合物の導入を指す。本明細書に開示の化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）を意味するか、または差異が大きいことを意味する。
実験操作例または別段の記載ある場合を除き、本明細書で使用される成分量または反応条件を示す数字はすべて、いかなる場合も「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。
本明細書で使用される「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」という用語は、組成物、方法、及び方法または組成物に必須となるそれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用されるが、必須または非必須を問わず、非特定の要素を含むことを許容する。
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指し、こうしたものは、その実施形態のその説明に列挙されない要素をいずれも除外する。
本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。用語は、その実施形態の基礎及び新規または機能的な特性（複数可）に実質的に影響を与えない要素が存在することを許容する。
「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形の用語は、別段の明確な記載がない限り、複数の参照対象を含む。同様に「または（ｏｒ）」という言葉は、別段の明確な記載がない限り、「及び（ａｎｄ）」を含むことが意図される。本開示の実施または試験では、本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料を使用することができるが、適した方法及び材料が後述される。「ｅ．ｇ．（例えば）」という略語は、ラテン語の例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ）に由来し、非限定例を示すために本明細書で使用される。したがって、「ｅ．ｇ．（例えば）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。
融合タンパク質に含まれる、本明細書で使用されるプロテアーゼ活性は、真核細胞におけるエキソサイトーシス融合装置の１つまたは複数のタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼのすべてを包含する。プロテアーゼは、好ましくは、細菌のプロテアーゼ（またはその断片）である。より好ましくは、細菌のプロテアーゼは、クロストリジウム属またはナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）／ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、クロストリジウムＬ鎖、または好ましくは、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）もしくは肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するナイセリアＩｇＡプロテアーゼ）から選択される。非細胞傷害性プロテアーゼの別の例には、ブラジルのサソリであるティティウス・セルラタス（Ｔｉｔｙｕｓ ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ）の毒液に由来するものなどの、サソリの毒液プロテアーゼ、またはプロテアーゼであるアンタレアーゼ（ａｎｔａｒｅａｓｅ）が含まれる。
プロテアーゼ活性は、変異した非細胞傷害性プロテアーゼ（すなわち、天然起源のプロテアーゼ分子の変異体）の活性も包含するが、但し、変異プロテアーゼが、必要なプロテアーゼ活性を依然として示すことが条件である。例として、変異体は、参照プロテアーゼ配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、及び最も好ましくは、少なくとも９５％または少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、変異体という用語は、増進（または減少）したエンドペプチダーゼ活性を有する非細胞傷害性プロテアーゼを含み、本明細書で言及されるものは特に、ＢＴｘ／Ａの変異体であるＱ１６１Ａ、Ｅ５４Ａ、及びＫ１６５ＬのＫｃａｔ／Ｋｍの増加に対する言及である。Ａｈｍｅｄ，Ｓ．Ａ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１０９３０−００７−９１１８−８を参照のこと。当該文献は、その参照によって組み込まれる。断片という用語は、プロテアーゼに関して使用されるとき、典型的には、参照プロテアーゼの少なくとも１５０アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも２００アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも２５０アミノ酸残基、及び最も好ましくは、少なくとも３００アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。ＴＭ「断片」成分（上で考察）と同様に、本発明のプロテアーゼ「断片」は、参照配列に基づく変異プロテアーゼの断片を包含する。
本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、融合タンパク質に含まれるプロテアーゼ活性は、セリンプロテアーゼ活性またはメタロプロテアーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ活性）を示す。１つの実施形態では、プロテアーゼは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、またはシンタキシン）に特異的である。
特に言及されるものは、例えば、細菌神経毒素の神経毒素のプロテアーゼドメインといった、神経毒素のプロテアーゼドメインである。したがって、本明細書に記載のさまざまな態様は、天然起源の神経毒素ドメイン、ならびに組換えで調製されたバージョンのそのような天然起源の神経毒素の使用を包含する。
神経毒素の例は、クロストリジウムによって産生されるものであり、クロストリジウム神経毒素という用語は、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）によって産生される神経毒素（ＴＴｘ）、及びＣ．ボツリヌムによって産生される神経毒素（ＢＴｘ）のセロタイプＡ〜Ｇ、ならびにＣ．バラティ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）及びＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）によって産生される高関連性のＢＴｘ様神経毒素を包含する。上述の略語は、本明細書を通じて使用される。例えば、ＢＴｘ／Ａという命名法は、神経毒素源がＢＴｘ（セロタイプＡ）であることを示す。他のＢＴｘセロタイプには、対応する命名法が適用される。
ＢＴｘは、知られている中で最も強力な毒素であり、マウスに対するその半致死量（ＬＤ５０）値は、セロタイプに応じて０．５〜５ｎｇ／ｋｇの範囲である。ＢＴｘは、胃腸管に吸収され、全身循環に侵入した後、コリン作動性神経終末のシナプス前膜に結合し、その神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を阻止する。ＢＴｘ／Ｂ、ＢＴｘ／Ｄ、ＢＴｘ／Ｆ、及びＢＴｘ／Ｇは、シナプトブレビン／小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断し、ＢＴｘ／Ｃ、ＢＴｘ／Ａ、及びＢＴｘ／Ｅは、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を切断し、ならびにＢＴｘ／Ｃは、シンタキシンを切断する。
ＢＴｘは、共通構造を共有しており、この共通構造は、単一のジスルフィド結合によって約５０ｋＤａの軽鎖（Ｌ鎖）に共有結合で連結された約１００ｋＤａの重鎖（Ｈ鎖）からなる、２つの鎖を含む約１５０ｋＤａのタンパク質である。Ｈ鎖は、それぞれ約５０ｋＤａの２つのドメインからなる。Ｃ末端ドメイン（ＨＣ）は、ニューロンに高親和性で結合するために必要であり、Ｎ末端ドメイン（ＨＮ）は、膜転位に関与することが提唱されている。Ｌ鎖は、基質であるＳＮＡＲＥタンパク質の切断を担う亜鉛依存性のメタロプロテアーゼである。
Ｌ鎖断片という用語は、神経毒素のＬ鎖の構成成分であることを意味し、この断片は、メタロプロテアーゼ活性を示すと共に、細胞のエキソサイトーシスに関与する小胞及び／または細胞膜結合タンパク質をタンパク質分解性に切断する能力を有する。
適したプロテアーゼ（参照）配列の例には、下記のものが含まれる：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４４８）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４４０）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４４１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４４５）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４２２）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４３９）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（１〜４４１）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（１〜４５７）
ＩｇＡプロテアーゼ−アミノ酸残基（１〜９５９）Ｐｏｈｌｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）．Ｎａｔｕｒｅ ３２５，ｐｐ．４５８−４６２（当該文献は、その参照によって本明細書に組み込まれる）
非細胞毒プロテアーゼを有する本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、非細胞毒プロテアーゼは、本明細書に記載のＩｇＡプロテアーゼまたはアンタレアーゼであり得る。非細胞毒プロテアーゼを有する本明細書に記載の融合タンパク質の実施形態の１つでは、非細胞毒プロテアーゼは、後に続くページに記載の特有の切断認識配列を有し得る。
軽鎖を含むさまざまなクロストリジウム毒素断片が、本発明の態様において有用であり得るが、但し、こうした軽鎖断片が、神経伝達物質の放出装置の中心成分を特異的に標的とし、その結果として、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する細胞機構全体の実施に関与できることが条件である。クロストリジウム毒素の軽鎖は、長さが約４２０〜４６０のアミノ酸であり、酵素ドメインを含む。酵素ドメインの酵素活性には、クロストリジウム毒素の軽鎖の全長は必要ないことが研究によって示されている。非限定例として、ＢＴｘ／Ａ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴＴｘ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は、活性に必要ではない。非限定例として、ＢＴｘ／Ａ軽鎖の最後の３２個のアミノ酸（残基４１７〜４４８）は、酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴＴｘ軽鎖の最後の３１個のアミノ酸（残基４２７〜４５７）は、酵素活性に必要ではない。したがって、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸、及び少なくとも４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含み得る。この実施形態の他の態様は、例えば、最大で３５０アミノ酸、最大で３７５アミノ酸、最大で４００アミノ酸、最大で４２５アミノ酸、及び最大で４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含み得る。
適した非細胞傷害性プロテアーゼの追加の例は、ＷＯ２００７／１０６１１５において詳細に説明されており、当該文献は、その参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＳＮＡＰ−２３タンパク質などの非ニューロンＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。１つの実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＳＮＡＰ−２３を切断する能力を有する改変されたボツリヌス毒素Ｌ鎖である。そのような改変されたＬ鎖の例は、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｂａｒｂｉｅｒｉ，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．２３，ｐ９１８０−９１８４，２００９によって説明されている。
１つの実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＢＴｘ／Ａプロテアーゼ、ＢＴｘ／Ｃプロテアーゼ、またはＢＴｘ／Ｅプロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフは、ＳＮＡＰ（例えば、ＳＮＡＰ２５）モチーフである。
別の実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＢＴｘ／Ｂプロテアーゼ、ＢＴｘ／Ｄプロテアーゼ、ＢＴｘ／Ｆプロテアーゼ、もしくはＢＴｘ／Ｇプロテアーゼ、または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）プロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフは、ＶＡＭＰモチーフである。
別の実施形態では、非細胞傷害性プロテアーゼは、ＢＴｘ／Ｃ１プロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフは、シンタキシンモチーフである。
本明細書に記載の操作された融合タンパク質の非細胞傷害性プロテアーゼは、異なる切断部位配列を認識し、その結果として僅かに異なる切断特異性を有する。
Figure 2018525021
追加の例として、下記の認識配列及び切断部位に対する参照がなされる。
Figure 2018525021
Figure 2018525021
Figure 2018525021
標的指向化部分（ＴＭ）は、結合部位と機能的に相互作用することで、本明細書に記載の融合ポリペプチドと標的細胞の表面との物理的な会合を引き起こす任意の化学構造を意味する。本発明との関連では、標的細胞は、侵害受容ニューロンである。ＴＭという用語は、標的細胞に存在する結合部位に結合する能力を有する任意の分子（すなわち、天然起源の分子、または化学的／物理的に修飾されたその変異体）を包含し、当該結合部位は、内部移行（例えば、エンドソーム形成）を生じさせる能力を有する。この内部移行は、受容体介在性エンドサイトーシスとも称される。ＴＭは、エンドソーム膜転位機能を有し得、この場合、ＴＭ成分と転位ドメイン成分とが本発明の薬剤に別々に存在する必要はない。先行説明では全体にわたって特定のＴＭについて記載されている。ＴＭに対する参照は、単に例示にすぎず、本発明は、その変異体及び誘導体をすべて包含し、こうした変異体及び誘導体は、例示のＴＭの基礎的な結合（すなわち、標的指向化）能力を保持する。
本発明によるＴＭには、抗体（例えば、抗体断片）及び結合骨格が含まれ、標的細胞への（例えば、特異的）結合を目的として設計された市販の抗体／断片及び骨格が特に含まれる。
タンパク質骨格は、治療的なモノクローナル抗体及び誘導体の拡大するレパートリーを補完するための新世代の普遍的な結合フレームワークとなっている。こうしたモノクローナル抗体及び誘導体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ分子、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ラクダ抗体（ｃａｍｅｌｉｄ）、ダイアボディ、及びミニボディなどであり、こうしたものをそれぞれ、本発明のＴＭとして用いてよい。骨格系は、新規骨格の創出または既知のタンパク質結合ドメインの改変のいずれかを介して、既知のタンパク質認識ドメインを創出または改変するものである。そのような骨格には、限定はされないが、下記のものが含まれる：
（ｉ）プロテインＡに基づく骨格−アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｎｏｒｄ，Ｋ．ｅｔ ａｌ １９９７“Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ”．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，７７２−７７７）、
（ｉｉ）リポカリンに基づく骨格−アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（Ｓｋｅｒｒａ ２００８“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ−ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｐｏｃｋｅｔ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６７７−８３）、
（ｉｉｉ）フィブロネクチンに基づく骨格−アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）（Ｄｉｎｅｅｎ ｅｔ ａｌ ２００８“Ｔｈｅ Ａｄｎｅｃｔｉｎ ＣＴ−３２２ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ａｎ ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ”．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ８：３５２）、
（ｉｖ）アビマー（ａｖｉｍｅｒ）（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２００５“Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｖｉｍｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ｅｘｏｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎｓ”．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１５５６−６１）、
（ｖ）アンキリンに基づく骨格−ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ ２００６“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒ２ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：３５１６７−７５）、及び
（ｖｉ）センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）骨格−ＣＤＲと類似のループを有するＩｇ ドメインに対する顕著な構造相同性を有するタンパク質フォールドに基づく。Ｉｇドメインは、ヒトタンパク質における共通のモジュールであり、代替の骨格タンパク質として広く適用されている。上記の「骨格」に関する刊行物はそれぞれ、その参照によって（その全体が）本明細書に組み込まれる。
結合骨格は、特定の細胞表面タンパク質、受容体、または糖質基（ｓｕｇａｒ ｇｒｏｕｐ）などの他の細胞表面エピトープとの相互作用を介して特定の細胞型を標的とするために使用することができる。そのような改変された骨格は、本発明のポリペプチドに基づく組換え非細胞傷害性プロテアーゼへと操作付加することができる。
本発明のＴＭは、問題の侵害受容ニューロン標的細胞に結合（好ましくは、特異的に結合）する。好ましくは、「特異的に結合する」という用語は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは、１０７Ｍ−１以上、より好ましくは、１０８Ｍ−１以上、及び最も好ましくは、１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）で、所与のＴＭが標的細胞に結合することを意味する。「特異的に結合する」という用語は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは、１０７Ｍ−１以上、より好ましくは、１０８Ｍ−１以上、及び最も好ましくは、１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）で、例えば、侵害受容器に見られるＡＮＴＸＲ２もしくはＮＧＦＲ、またはＮａｖ１．７イオンチャネル、Ｎａｖ１．８イオンチャネル、及びＮａｖ１．９イオンチャネルといった所与の受容体に所与のＴＭが結合することも意味し得る。
本明細書におけるＴＭに対する参照は、その断片及び変異体を包含し、こうした断片及び変異体は、問題の標的細胞に結合する能力を保持する。例として、変異体は、参照ＴＭ（例えば、ＴＭを定義する、本明細書において示される配列番号のいずれか）と比較して、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、及び最も好ましくは、少なくとも９７％または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、変異体は、１つもしくは複数のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸）、または結合の置換を含み得る。また、例として、断片という用語は、ＴＭに関して使用されるとき、参照ＴＭの少なくとも１０アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基、及び最も好ましくは、少なくとも４０アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。断片という用語は、上述の変異体にも関する。したがって、例として、本発明の断片は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個のアミノ酸を有するペプチド配列含み得、ペプチド配列は、参照ペプチドの対応する（連続）ペプチド配列アミノ酸に対して、少なくとも８０％の配列相同性を有する。
ＴＭが選択標的細胞に結合したかを確認することは日常的なことである。例えば、過剰の非標識ＴＭの存在下で、問題の標的細胞を代表する組織または細胞を標識（例えば、トリチウム標識）ＴＭに曝露するという単純な放射能置換実験を用いてよい。そのような実験では、非特異的な結合と特異的な結合との相対的な割合を評価してよく、それによって、ＴＭが標的細胞に結合したことの確認が可能になる。任意選択で、１つまたは複数の結合アンタゴニストをアッセイに含めてよく、ＴＭの結合損失の観測をアッセイにさらに含めてよい。この型の実験の例は、Ｈｕｌｍｅ，Ｅ．Ｃ．（１９９０），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ，ａ ｂｒｉｅｆ ｏｕｔｌｉｎｅ，ｐｐ．３０３−３１１，Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｅ．Ｃ．Ｈｕｌｍｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにおいて見つけることができる。
本発明との関連では、ペプチドＴＭに対する参照は、そのペプチドアナログを包含するが、但し、アナログが、対応する「参照」ＴＭと同一の受容体に結合することが条件である。
本明細書に記載の融合タンパク質（本明細書ではポリペプチドとも称される）は、クロストリジウム神経毒素の機能性のＨＣ（重鎖）またはＨＣドメイン（ＨＣのＣ末端部分）を欠き得る。１つの実施形態では、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素のＣ末端に位置する最後の５０アミノ酸を欠く。別の実施形態では、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素のＣ末端に位置する最後の１００アミノ酸残基、１５０アミノ酸残基、２００アミノ酸残基、２５０アミノ酸残基、または３００アミノ酸残基を欠く。あるいは、ＨＣの結合活性は、変異誘発によって無効化／または低減してよく、例えば、便宜上ＢＴｘ／Ａに関する例を挙げると、ガングリオシド結合ポケットにおけるアミノ酸残基の１つまたは２つを変異（Ｗ１２６６からＬ、及びＹ１２６７からＦ）させて改変すると、ＨＣ領域の受容体結合機能が失われる。セロタイプＡではないクロストリジウムペプチド成分に対して類似の変異を導入してよく、例えば、構築物は、変異（Ｗ１２６２からＬ、及びＹ１２６３からＦ）を有するボツリヌスＢに基づくか、または変異（Ｗ１２２４からＬ、及びＹ１２２５からＦ）を有するボツリヌスＥに基づく。活性部位の変異であって、ＨＣの受容体結合活性が同様に除去される他の変異は、例えば、ボツリヌスＡ型毒素おけるＹ１２６７Ｓ、及び他のクロストリジウム神経毒素における対応する高度保存残基のものである。こうしたもの及び他の変異の詳細は、Ｒｕｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ（２００４）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３１−６３４）において説明されており、当該文献は、その参照によって本明細書に組み込まれる。
天然のクロストリジウム神経毒素のＨＣペプチドは、約４００〜４４０のアミノ酸残基を含み、それぞれ約２５ｋＤａの２つの機能的に異なるドメイン、すなわち、Ｎ末端領域（一般に、ＨＮペプチドまたはＨＮドメインと称される）及びＣ末端領域（一般に、ＨＣペプチドまたはＨＣドメインと称される）からなる。さらに、Ｃ末端領域（ＨＣ）は、Ｃ末端の１６０〜２００のアミノ酸残基に相当し、その天然の細胞受容体、すなわち、神経筋接合部における神経終末へのクロストリジウム神経毒素の結合を担うことがよく考証されている。したがって、機能性の重鎖ＨＣペプチド（またはドメイン）を欠いており、その結果、天然のクロストリジウム神経毒素が結合する細胞表面受容体への結合能力を有さないクロストリジウム重鎖に対する参照が本明細書を通じてなされ、こうした参照は、そのクロストリジウム重鎖が機能性のＨＣペプチドを単に欠いているにすぎないことを意味する。言い換えれば、Ｈｃペプチド領域は、神経筋接合部における神経終末に対するその天然の結合能力を不活性化するために、部分的もしくは全体的に欠失されるか、または別の形で修飾（例えば、通常の化学的処理もしくはタンパク質分解処理を介するもの）される。
したがって、１つの実施形態では、クロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素のＣ末端ペプチド部分（ＨＣ）の一部を欠き、その結果として、天然のクロストリジウム神経毒素のＨＣの結合機能を欠く。例として、１つの実施形態では、Ｃ末端が延長されたクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素の重鎖のＣ末端の４０アミノ酸残基、またはＣ末端の６０アミノ酸残基、またはＣ末端の８０アミノ酸残基、またはＣ末端の１００アミノ酸残基、またはＣ末端の１２０アミノ酸残基、またはＣ末端の１４０アミノ酸残基、またはＣ末端の１５０アミノ酸残基、またはＣ末端の１６０アミノ酸残基を欠く。別の実施形態では、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素の全Ｃ末端ペプチド部分（ＨＣ）を欠き、その結果として、天然のクロストリジウム神経毒素のＨＣの結合機能を欠く。例として、１つの実施形態では、クロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒素の重鎖のＣ末端の１６５アミノ酸残基、またはＣ末端の１７０アミノ酸残基、またはＣ末端の１７５アミノ酸残基、またはＣ末端の１８０アミノ酸残基、またはＣ末端の１８５アミノ酸残基、またはＣ末端の１９０アミノ酸残基、またはＣ末端の１９５アミノ酸残基を欠く。追加の例として、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、下記のものからなる群から選択されるクロストリジウムＨＣ参照配列を欠く：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１１１〜Ｌ１２９６）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０９８〜Ｅ１２９１）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１１２〜Ｅ１２９１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０９９〜Ｅ１２７６）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１０８６〜Ｋ１２５２）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１０６〜Ｅ１２７４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１０６〜Ｅ１２９７）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（Ｙ１１２８〜Ｄ１３１５）。
転位ドメインは、プロテアーゼが標的細胞に転位することを可能にし、その結果、標的細胞のサイトゾル内でプロテアーゼ活性の機能的発現を生じさせる分子またはタンパク質ドメインである。いずれかの分子（例えば、タンパク質またはペプチド）が本発明の必要な転位機能を有しているかどうかは、多数の通常アッセイのいずれか１つによって確認してよい。
例えば、Ｓｈｏｎｅ Ｃ．（１９８７）は、試験分子を負荷したリポソームを用いるインビトロアッセイについて説明している。必要な転位機能の存在は、リポソームからのＫ＋及び／または標識ＮＡＤの放出によって確認され、こうした放出は、容易に監視され得る［Ｓｈｏｎｅ Ｃ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ；ｖｏｌ．１６７（１）：ｐｐ．１７５−１８０を参照のこと］。
Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ Ｒ．（１９８７）によって追加の例が提供されており、この例では、平面状のリン脂質二重膜を用いる単純なインビトロアッセイについて説明されている。試験分子が膜に負荷され、膜を横切るコンダクタンスの増加によって必要な転位機能が確認される［Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ；ｖｏｌ．２２６，ｎｏ．１：ｐｐ．１１５−１２０を参照のこと］。
膜融合の評価、及びその結果としての、本発明における使用に適した転位ドメインの同定を可能にする追加の方法論は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２２０ ａｎｄ ２２１，Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３によって提供されている。
本発明は、変異転位ドメインも包含するが、但し、変異転位ドメインが必要な転位活性を依然として示すことが条件である。例として、変異体は、参照転位ドメインと比較すると、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有し得る。断片という用語は、転位ドメインに関して使用されるとき、参照転位ドメインの少なくとも２０アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも４０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも８０アミノ酸残基、及び最も好ましくは、少なくとも１００アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転位ドメインの場合、断片は、好ましくは、参照転位ドメイン（例えば、ＨＮドメイン）の少なくとも１００アミノ酸残基、好ましくは、少なくとも１５０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも２００アミノ酸残基、及び最も好ましくは、少なくとも２５０アミノ酸残基を有する。ＴＭ「断片」成分（上で考察）と同様に、本発明の転位「断片」は、参照配列に基づく変異転位ドメインの断片を包含する。
転位ドメインは、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜にイオン透過性ポアを形成する能力を有する。好ましくは、エンドソーム膜内にポアを形成する能力を有するタンパク質分子部分のみの使用が見られる。
転位ドメインは、微生物タンパク質源、具体的には、細菌タンパク質源またはウイルスタンパク質源から得てよい。したがって、１つの実施形態では、転位ドメインは、細菌毒素またはウイルスタンパク質などの酵素の転位ドメインである。
細菌毒素分子のある特定のドメインが、そのようなポアを形成する能力を有することはよく考証されている。ウイルス性に発現する膜融合タンパク質のある特定の転位ドメインが、そのようなポアを形成する能力を有していることも知られている。そのようなドメインを本発明において用いてよい。
転位ドメインは、ＨＮドメイン（またはその機能性成分）などの、クロストリジウム起源のものであり得る。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分とほぼ同等な、クロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部もしくは断片を意味するか、または未変化のＨ鎖におけるその断片に対応するドメインを意味する。この点に関して、ＨＣの細胞結合機能の除去が望まれるべきであり、この除去は、ＨＣまたはＨＣのアミノ酸配列の欠失（ＤＮＡ合成レベル、またはヌクレアーゼ処理もしくはプロテアーゼ処理による合成後レベルにおけるもののいずれか）によって実施してよい。あるいは、ＨＣ機能は、化学的または生物学的な処理によって不活性化してよい。
適した（参照）転位ドメインの例には、下記のものが含まれる：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（４４９〜８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（４４１〜８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２〜８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（４４６〜８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（４２３〜８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（４４０〜８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２〜８６３）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（４５８〜８７９）。
サブセロタイプに応じて軽微な差異が生じ得るため、上記の参照配列は、指針であると考えられるべきである。例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２（その参照によって本明細書に組み込まれる）では、僅かに異なるクロストリジウム配列が引用されている：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４９〜Ｋ８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４２〜Ｓ８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｔ４５０〜Ｎ８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｄ４４６〜Ｎ８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｋ４２３〜Ｋ８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（Ａ４４０〜Ｋ８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（Ｓ４４７〜Ｓ８６３）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（Ｓ４５８〜Ｖ８７９）。
適した転位ドメインの追加の例は、ＷＯ２００７／１０６１１５において詳細に説明されており、当該文献は、その参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明との関連では、転位ドメインを含むさまざまなクロストリジウム毒素ＨＮ領域が本発明の態様において有用であり得るが、但し、こうした活性断片が、細胞内小胞からの標的細胞の細胞質への非細胞傷害性プロテアーゼ（例えば、クロストリジウムＬ鎖）の放出を促進し、その結果として、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する細胞機構全体の実施に関与できることが条件である。クロストリジウム毒素の重鎖に由来するＨＮ領域は、長さが約４１０〜４３０のアミノ酸であり、転位ドメインを含む。転位ドメインの転位活性には、クロストリジウム毒素の重鎖に由来するＨＮ領域の全長は必要ないことが研究によって示されている。したがって、いくつかの実施形態は、例えば、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、及び少なくとも４２５アミノ酸の長さを有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。他の実施形態は、例えば、最大で３５０アミノ酸、最大で３７５アミノ酸、最大で４００アミノ酸、及び最大で４２５アミノ酸の長さを有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。
クロストリジウム・ボツリヌム及びＣ．テタニの毒素産生の遺伝的基礎に関する追加詳細については、我々は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓを参照している。
ＨＮという用語は、天然起源の神経毒素ＨＮ部分と、非天然起源のアミノ酸配列及び／または合成のアミノ酸配列残基を有する改変されたＨＮ部分と、を包含するが、但し、改変されたＨＮ部分が、上述の転位機能を依然として示すことが条件である。
あるいは、転位ドメインは、非クロストリジウム起源のものであり得る。非クロストリジウム起源の転位ドメインの例には、限定はされないが、ジフテリア毒素の転位ドメイン［Ｏ＝Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９，６２０２−６２０６、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６９，２２５２４−２２５３２、及びＬｏｎｄｏｎ，Ｅ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１１２，ｐｐ．２５−５１］、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の外毒素Ａ型の転位ドメイン［Ｐｒｉｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）３１，３５５５−３５５９］、炭疽毒素の転位ドメイン［Ｂｌａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３，８４３７−８４４２］、転位機能を有するさまざまな融合性ペプチドまたは疎水性ペプチド［Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９，１２９１８−１２９２４、及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＰＮＡＳ，８９，ｐｐ．７９３４−７９３８］、ならびに両親媒性ペプチド［Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，ｐｐ．１９８６−１９９２］が含まれる。転位ドメインは、天然起源のタンパク質に存在する転位ドメインを反映し得るか、またはアミノ酸変異を含み得るが、但し、変異が、転位ドメインの転位能力を破壊しないことが条件である。
本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適したウイルス転位ドメインの特定の例には、ウイルス性に発現する膜融合タンパク質のある特定の転位ドメインが含まれる。例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）及びＭｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）では、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのＮ末端領域に由来する多数の融合性ペプチド及び両親媒性ペプチドの転位（すなわち、膜融合及び小胞化）機能について説明されている。ウイルス性に発現する融合タンパク質の中で、所望の転位活性を有する他のものは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合性ペプチドの転位ドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質Ｇの転位ドメイン、ＳＥＲウイルスのＦタンパク質の転位ドメイン、及び泡沫状ウイルスの外被糖タンパク質の転位ドメインである。ウイルス性にコードされるアスパイク（Ａｓｐｉｋｅ）タンパク質は、本発明との関連において特定の用途を有し、こうしたタンパク質は、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質、及びＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質である。
表２（以下のもの）に記載の転位ドメインの使用は、その配列変異体の使用を含む。変異体は、１つまたは複数の保存的な核酸置換及び／または核酸の欠失もしくは挿入を含み得るが、但し、変異体が、必要な転位機能を有することが条件である。変異体は、１つまたは複数のアミノ酸の置換及び／またはアミノ酸の欠失もしくは挿入も含み得るが、但し、変異体が、必要な転位機能を有することが条件である。
Figure 2018525021
本明細書に記載の組成物及び方法のポリペプチドは、転位促進ドメインをさらに含み得る。このドメインは、標的細胞のサイトゾルへの非細胞傷害性プロテアーゼの送達を促進するものであり、例えば、ＷＯ０８／００８８０３及びＷＯ０８／００８８０５において説明されている。こうした文献はそれぞれ、その参照によって本明細書に組み込まれる。
例として、適した転位促進ドメインには、外被を有するウイルスの融合性ペプチドドメインが含まれ、例えば、適した融合性ペプチドドメインには、インフルエンザウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２３個のアミノ酸を有する、Ａ型インフルエンザウイルスの融合性ペプチドドメイン）、アルファウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２６個のアミノ酸を有する、セムリキ森林ウイルスの融合性ペプチドドメイン）、ベジクロウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２１個のアミノ酸を有する、水疱性口内炎ウイルスの融合性ペプチドドメイン）、レスピロウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸を有する、センダイウイルスの融合性ペプチドドメイン）、モルビリウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸を有する、イヌジステンパーウイルスの融合性ペプチドドメイン）、アブラウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸を有する、ニューカッスル病ウイルスの融合性ペプチドドメイン）、ヘニパウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸を有する、ヘンドラウイルスの融合性ペプチドドメイン）、メタニューモウイルスの融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸を有する、ヒトメタニューモウイルスの融合性ペプチドドメイン）、もしくはサル泡沫状ウイルスの融合性ペプチドドメインなどの、スプーマウイルスの融合性ペプチドドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体が含まれる。
追加の例として、転位促進ドメインは、クロストリジウム毒素のＨＮドメイン、またはその断片もしくは変異体を含み得る。より詳細には、クロストリジウム毒素ＨＮ転位促進ドメインは、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２７５アミノ酸の長さを有し得る。この点に関して、クロストリジウム毒素ＨＮ転位促進ドメインは、好ましくは、最大で２００アミノ酸、最大で２２５アミノ酸、最大で２５０アミノ酸、または最大で２７５アミノ酸の長さを有する。特定の例には下記のものが含まれる：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（８７２〜１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（８５９〜１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（８６７〜１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（８６３〜１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（８４６〜１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（８６５〜１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（８６４〜１１０５）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（８８０〜１１２７）。
上記の配列位置は、セロタイプ／サブタイプに応じて幾分か変わり得るものであり、適した（参照）クロストリジウム毒素ＨＮドメインの追加の例には、下記のものが含まれる：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（８７４〜１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（８６１〜１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（８６９〜１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（８６５〜１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（８４８〜１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（８６７〜１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（８６６〜１１０５）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（８８２〜１１２７）。
上記の促進ドメインのいずれかを、本発明における使用に適する、これまでに説明された転位ドメインペプチドのいずれかと組み合わせてよい。したがって、例として、非クロストリジウム促進ドメインは、非クロストリジウム転位ドメインペプチドまたはクロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせてよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＮ転位促進ドメインは、非クロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせてよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＮ促進ドメインは、クロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせてよく、こうしたものの例には、下記のものが含まれる：
ボツリヌスＡ型神経毒素−アミノ酸残基（４４９〜１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒素−アミノ酸残基（４４２〜１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒素−アミノ酸残基（４５０〜１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒素−アミノ酸残基（４４６〜１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒素−アミノ酸残基（４２３〜１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒素−アミノ酸残基（４４０〜１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒素−アミノ酸残基（４４７〜１１０５）
破傷風神経毒素−アミノ酸残基（４５８〜１１２７）。
サブセロタイプに応じて軽微な差異が生じ得るため、上記の参照配列は、指針であると考えられるべきである。
配列相同性
同一性割合を決定するためにさまざまな配列アライメント方法のいずれかを使用することができ、こうした方法には、限定はされないが、網羅的な方法、局所的な方法、及びハイブリッドの方法が含まれ、例えば、セグメントアプローチ方法などである。同一性割合を決定するためのプロトコールは、当業者にとっては日常的な手順である。網羅的な方法では、分子の始まりから終わりまでの配列アライメントが実施され、個々の残基ペアのスコアの合計、及びギャップに対するペナルティーの賦課によって最良のアライメントが決定される。方法の例には、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６７３−４６８０（１９９４）を参照のこと）、及び反復改良（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）（例えば、Ｏｓａｍｕ Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｓ Ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．８２３−８３８（１９９６）を参照のこと）が含まれる。局所的な方法では、入力配列のすべてが共有する保存モチーフの１つまたは複数を同定することによって配列アライメントが実施される。方法の例には限定はされないが、例えば、一致−ボックス（Ｍａｔｃｈ−ｂｏｘ）（例えば、Ｅｒｉｃ Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ ａｎｄ Ｅｒｎｅｓｔ Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：Ａ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ ５０１−５０９（１９９２）を参照のこと）、Ｇｉｂｂｓ サンプリング（Ｇｉｂｂｓ ｓａｍｐｌｉｎｇ）（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｓｕｂｔｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ Ｇｉｂｂｓ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８−２１４（１９９３）を参照のこと）、アライン−Ｍ（Ａｌｉｇｎ−Ｍ）（例えば、Ｉｖｏ Ｖａｎ ＷａＩＩｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｇｎ−Ｍ − Ａ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：１４２８−１４３５（２００４）を参照のこと）が含まれる。
したがって、配列同一性割合は、通常の方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３−１６，１９８６及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９，１９９２を参照のこと。簡潔には、１０のギャップオープニングペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同書）の「ｂｌｏｓｕｍ ６２」スコアリングマトリックスを使用し、アライメントスコアが最適となるように２つのアミノ酸配列のアライメントが実施される。「ｂｌｏｓｕｍ ６２」スコアリングマトリックスは、以下に示される（アミノ酸は、標準的な１文字表記で示される）。
配列同一性の決定を目的とするアライメントスコア
Figure 2018525021
続いて、同一性割合は、下記のように計算される。
Figure 2018525021
実質的に相同性のポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる。こうした変更は、好ましくは、軽微なものであり、すなわち、保存的アミノ酸置換（下記を参照のこと）及びポリペプチドのフォールディングまたは活性に顕著な影響を与えない他の置換、典型的には１〜約３０個のアミノ酸である僅かな欠失、ならびにアミノ末端メチオニン残基などのアミノ末端もしくはカルボキシ末端の僅かな延長、最大約２０〜２５残基の小型のリンカーペプチド、または親和性タグである。
保存的アミノ酸置換
塩基性：
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：
グルタミン
アスパラギン
疎水性：
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型：
グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
２０の標準アミノ酸に加えて、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに非標準アミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブタン酸、イソバリン、及びα−メチルセリンなど）を使用してよい。クロストリジウムポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに、限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を使用してよい。本発明のポリペプチドは、非天然起源のアミノ酸残基も含み得る。
非天然起源のアミノ酸には、限定はされないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシ−プロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチル−スレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ−システイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニル−アラニン、４−アザフェニル−アラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンが含まれる。非天然起源のアミノ酸残基をタンパク質に組み込む方法は、当該技術分野でいくつか知られている。例えば、インビトロ系を用いることができ、ナンセンス変異は、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制される。アミノ酸の合成方法及びｔＲＮＡのアミノアシル化方法は、当該技術分野において知られている。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌のＳ３０抽出物ならびに市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２，１９９１、Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１，１９９１、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：８０６−９，１９９３、及びＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０１４５−９，１９９３を参照のこと。第２の方法では、翻訳は、変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによってアフリカツメガエルの卵母細胞において実施される（Ｔｕｒｃａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１−８，１９９６）。第３の方法では、交換されることになる天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）は含めず、所望の非天然起源のアミノ酸（複数可）（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニルアラニン）を含めて大腸菌細胞の培養が実施される。非天然起源のアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチドに組み込まれる。Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０−６，１９９４を参照のこと。天然起源のアミノ酸残基は、インビトロの化学修飾によって非天然起源種に変換することができる。化学修飾は、部位特異的変異誘発と組み合わせることで、置換範囲をさらに広げることができる（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３９５−４０３，１９９３）。
本発明のポリペプチドのアミノ酸残基の代わりに、限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされないアミノ酸、非天然起源のアミノ酸、及び非天然アミノ酸を使用してよい。
本発明のポリペプチドに必須のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発などの、当該技術分野において知られる手順に従って同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−５，１９８９）。生物学的な相互作用が生じる部位は、物理的な構造解析によっても決定することができ、推定接触部位へのアミノ酸変異導入と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識化などの手法によって決定される。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−１２，１９９２、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２を参照のこと。必須のアミノ酸の独自性は、本発明のポリペプチドの関連成分（例えば、転位成分またはプロテアーゼ成分）との相同性の解析からも推測することができる。
Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−７，１９８８）またはＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−６，１９８９）によって開示されるものなどの、既知の変異誘発方法及びスクリーニング方法を使用し、複数のアミノ酸の置換を実施及び試験することができる。簡潔に記載すると、こうした著者は、ポリペプチドにおける２つ以上の位置の同時無作為化方法、機能性ポリペプチドの選択方法、及びそれらに続いて実施される、それぞれの位置の許容可能な置換のスペクトルを決定するための、変異誘発されたポリペプチドの配列決定方法について開示している。使用することができる他の方法には、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−７，１９９１、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号、Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４６：１４５，１９８６、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が含まれる。
Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−７，１９８８）またはＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−６，１９８９）によって開示されるものなどの、既知の変異誘発方法及びスクリーニング方法を使用し、複数のアミノ酸の置換を実施及び試験することができる。簡潔に記載すると、こうした著者は、ポリペプチドにおける２つ以上の位置の同時無作為化方法、機能性ポリペプチドの選択方法、及びそれらに続いて実施される、それぞれの位置の許容可能な置換のスペクトルを決定するための、変異誘発されたポリペプチドの配列決定方法について開示している。使用することができる他の方法には、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−７，１９９１、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号、Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４６：１４５，１９８６、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が含まれる。
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または他の実施形態の要素の代わりに使用することができる。さらに、本開示のある特定の実施形態と関連する利点が、こうした実施形態と関連して説明されている一方で、他の実施形態もまた、そのような利点を示し得るが、本開示の範囲に含まれるために必ずしも実施形態のすべてがそのような利点を示す必要があるわけではない。
本明細書に記載の技術の実施形態のいくつかは、番号付けされた下記のパラグラフのいずれかに従って定義することができる：
パラグラフ１
（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）前記侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、前記結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて前記侵害受容ニューロンに入る能力を有し、前記侵害受容ニューロンが、前記ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する前記標的指向化部分（ＴＭ）と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記プロテアーゼを前記侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む融合タンパク質であって、ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分が、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む、前記融合タンパク質。
パラグラフ２
プロテアーゼによって前記融合タンパク質をそこで切断することが可能なプロテアーゼ切断部位をさらに含み、前記プロテアーゼ切断部位が、前記融合タンパク質における前記非細胞傷害性プロテアーゼのＣ末端に位置する、パラグラフ１に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３
前記非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む、パラグラフ１またはパラグラフ２に記載の融合タンパク質。
パラグラフ４
前記ＴＬが、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素の転位ドメインを含む、パラグラフ１、パラグラフ２、及びパラグラフ３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ５
前記クロストリジウム神経毒素が、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である、パラグラフ３またはパラグラフ４に記載の融合タンパク質。
パラグラフ６
前記ＴＭが、前記侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ７
前記ＴＭが、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、またはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ８
前記ＰＡが、フーリンによる切断に抵抗性である、パラグラフ７に記載の融合タンパク質。
パラグラフ９
ＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される、パラグラフ７またはパラグラフ８に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１０
前記ＰＡｄ４が、プロテアーゼによる切断に抵抗性である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ１１
前記プロテアーゼが、ＬｙｓＣまたはフーリンである、パラグラフ１０に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１２
（ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含む融合タンパク質であって、前記ＰＡまたはＰＡ断片が、前記侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する、前記融合タンパク質。
パラグラフ１３
前記非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む、パラグラフ１２に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１４
前記クロストリジウム神経毒素が、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である、パラグラフ１３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１５
前記クロストリジウム神経毒素のＬ鎖が、表１から選択される、パラグラフ１２またはパラグラフ１３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１６
前記侵害受容ニューロンに発現した、ＰＡが結合する前記受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ１７
ＰＡに結合する能力を有する前記タンパク質が、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、または炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ１８
ＬＦのＰＡ結合ドメインが、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である、パラグラフ１７に記載の融合タンパク質。
パラグラフ１９
ＥＦのＰＡ結合ドメインが、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である、パラグラフ１７に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２０
（ａ）侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素（こうしたものには、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素が含まれる）と、（ｂ）前記イオンチャネル（例えば、ナトリウムもしくはカルシウム、またはナトリウムとカルシウムとの両方）をそこで発現する前記侵害受容ニューロンの結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と、を含む融合タンパク質。
パラグラフ２１
前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、システインノットモチーフを含む、パラグラフ２０に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２２
前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である、パラグラフ２０またはパラグラフ２１に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２３
前記ＴＭが、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、及び侵害受容ニューロン結合タンパク質からなる群から選択される、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ２４
前記ＰＡまたはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインが、前記侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体と相互作用して結合する、パラグラフ２３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２５
前記ＰＡが、フーリンによる切断に抵抗性である、パラグラフ２３またはパラグラフ２４に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２６
ＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される、パラグラフ２３またはパラグラフ２４に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２７
前記ＰＡｄ４が、プロテアーゼによる切断に抵抗性である、パラグラフ２６に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２８
前記プロテアーゼが、ＬｙｓＣまたはフーリンである、パラグラフ２７に記載の融合タンパク質。
パラグラフ２９
前記侵害受容ニューロン結合タンパク質が、抗体である。パラグラフ２３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３０
前記抗体が、侵害受容ニューロンに存在する神経成長因子受容体、ＡＮＴＸＲ２受容体、またはイオンチャネルタンパク質に特異的に結合する、パラグラフ２９に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３１
前記イオンチャネルタンパク質が、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９から選択される、パラグラフ３０に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３２
（ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素（これは、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素である）と、（ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と、を含む融合タンパク質であって、前記断片が、前記侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する、前記融合タンパク質。
パラグラフ３３
前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、システインノットモチーフを含む、パラグラフ３２に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３４
前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である、パラグラフ３２またはパラグラフ３３に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３５
前記侵害受容ニューロンに発現した前記ＰＡ結合受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、パラグラフ３２、パラグラフ３３、またはパラグラフ３４に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３６
ＰＡに結合する能力を有する前記タンパク質が、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、または炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ３７
ＬＦのＰＡ結合ドメインが、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である、パラグラフ３６に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３８
ＥＦのＰＡ結合ドメインが、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である、パラグラフ３６に記載の融合タンパク質。
パラグラフ３９
（ａ）ＡＢ毒素と、（ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片と、（ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記プロテアーゼを前記侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、を含む融合タンパク質。
パラグラフ４０
前記ＡＢ毒素が、リシン毒素、コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、緑膿菌の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびにジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分から選択される、パラグラフ３９に記載の融合タンパク質。
パラグラフ４１
前記侵害受容ニューロンに発現した前記ＰＡ結合受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、パラグラフ３９またはパラグラフ４０に記載の融合タンパク質。
パラグラフ４２
前記ＰＡ断片が、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインである、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ４３
前記ＴＬが、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、ホロ毒素、または前記ＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように変異導入された、前記ホロ毒素の変異形態である、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質。
パラグラフ４４
先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
パラグラフ４５
パラグラフ４４に記載の核酸を含む、ベクター。
パラグラフ４６
前記ベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子である、パラグラフ４５に記載のベクター。
パラグラフ４７
パラグラフ４４に記載の核酸、またはパラグラフ４５もしくはパラグラフ４６に記載のベクターを含む、細胞。
パラグラフ４８
（ａ）前記融合タンパク質が発現するような条件下での、パラグラフ４４に記載の細胞の培養段階と、（ｂ）前記融合タンパク質の回収段階と、を含む、先行パラグラフのいずれかに記載の融合タンパク質の産生方法。
パラグラフ４９
パラグラフ４８に記載の方法によって産生される、融合タンパク質。
パラグラフ５０
パラグラフ１〜４３のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む、組成物。
パラグラフ５１
それを必要とする対象に対する、先行パラグラフのいずれかに記載の組成物の投与段階を含む、疼痛の治療のための方法。
パラグラフ５２
それを必要とする対象に対する、天然の成熟炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、及び炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、またはそれらの任意の組み合わせの投与段階を含む、疼痛の治療方法。
本明細書に記載の技術の実施形態のいくつかは、番号付けされた下記のパラグラフのいずれかに従って定義することができる：
パラグラフ１
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（Ｐａｄ４）を含む、操作された融合タンパク質。
パラグラフ２
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む、操作された融合タンパク質。
パラグラフ３
侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む、操作された融合タンパク質。
パラグラフ４
侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分または炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む、操作された融合タンパク質。
パラグラフ５
前記分子が、神経成長因子受容体に特異的に結合する抗体、またはＮａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、もしくはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体から選択される、パラグラフ３に記載の操作された融合タンパク質。
パラグラフ６
前記細胞内作用毒素の触媒ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、致死毒素（致死因子）、及び／または浮腫毒素（浮腫因子）から選択される、パラグラフ３、パラグラフ４、またはパラグラフ５に記載の操作された融合タンパク質。
パラグラフ７
天然の防御抗原（ＰＡ）または変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容ニューロンの表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または致死因子（ＬＦ）と組み合わせて含む操作された融合タンパク質であって、前記ｍＰＡのその天然の受容体結合機能が遮断される、前記操作された融合タンパク質。
パラグラフ８
ＰＡまたはｍＰＡが、オリゴマー形態である、先行パラグラフのいずれかに記載の操作された融合タンパク質。
パラグラフ９
前記オリゴマー形態が、前記分子に結合される、パラグラフ８に記載の操作された融合タンパク質。
パラグラフ１０
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（Ｐａｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含む、組成物。
パラグラフ１１
阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質を含む、組成物。
パラグラフ１２
侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した天然の防御抗原（ＰＡ）または変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む操作された融合タンパク質を含む組成物であって、前記ｍＰＡのその天然の受容体結合機能が遮断される、前記組成物。
パラグラフ１３
前記分子が、神経成長因子と、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体と、から選択される、パラグラフ１２に記載の組成物。
パラグラフ１４
前記細胞内作用毒素の触媒ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、致死毒素（致死因子）、及び／または浮腫毒素（浮腫因子）から選択される、パラグラフ１２またはパラグラフ１３に記載の組成物。
パラグラフ１５
天然の防御抗原（ＰＡ）または変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容ニューロンの表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）と組み合わせて含む操作された融合タンパク質を含む組成物であって、前記ｍＰＡのその天然の受容体結合機能が遮断される、前記組成物。
パラグラフ１６
ＰＡまたはｍＰＡが、オリゴマー形態である、パラグラフ１０〜１５のいずれか１つに記載の組成物。
パラグラフ１７
前記オリゴマー形態が、前記分子に結合される、パラグラフ１６に記載の組成物。
パラグラフ１８
医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む、パラグラフ１０〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
パラグラフ１９
それを必要とする対象に対する、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含む疼痛の治療方法であって、前記操作された融合タンパク質が、侵害受容ニューロンに送達され、その結果、前記侵害受容ニューロンにおける細胞内シグナル伝達事象が低減されるか、または前記侵害受容ニューロンからの神経伝達物質の放出が低減される、前記方法。
パラグラフ２０
前記細胞内作用毒素の触媒ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、致死毒素（致死因子）、及び／または浮腫毒素（浮腫因子）から選択される、パラグラフ１９に記載の方法。
パラグラフ２１
それを必要とする対象に対する、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）部分またはその受容体結合ドメイン（ＰＡｄ４）を含む操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含む、疼痛の治療方法。
パラグラフ２２
それを必要とする対象に対する、阻害剤システインノット（ＩＣＫ）毒素（例えば、コノトキシン（ＣＴｘ））と融合した炭疽毒素致死因子（ＬＦｎ）と、防御抗原（ＰＡ）部分とを含む操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効量での投与を含む、疼痛の治療方法。
パラグラフ２３
医薬的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む、パラグラフ１９〜２３に記載の組成物。
パラグラフ２４
それを必要とする対象に対する、侵害受容器の表面受容体またはイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分またはその天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む操作された融合タンパク質の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含む、疼痛の治療方法。
パラグラフ２５
前記分子が、神経成長因子受容体に特異的に結合する抗体と、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９に特異的に結合する抗体と、から選択される、パラグラフ２４に記載の方法。
パラグラフ２６
前記細胞内作用毒素の触媒ドメインが、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ）、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）破傷風毒素（ＴＴｘ）、志賀毒素、リシン毒素、致死毒素（致死因子）、及び／または浮腫毒素（浮腫因子）から選択される、パラグラフ２４またはパラグラフ２５に記載の方法。
パラグラフ２７
それを必要とする対象における疼痛の治療方法であって、天然の防御抗原（ＰＡ）または変異ＰＡ（ｍＰＡ）と、侵害受容器の表面分子を標的とすることができる分子とを、特に、炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）及び／または致死因子（ＬＦ）と組み合わせて含む操作された融合タンパク質の前記対象への投与を含み、前記ｍＰＡのその天然の受容体結合機能が遮断される、前記方法。
パラグラフ２８
前記ＰＡまたはｍＰＡが、オリゴマー形態で投与され、前記オリゴマーＰＡまたはオリゴマーｍＰＡが、タンパク質分解性に活性化したＰＡもしくはｍＰＡ（またはその変異体）から形成されることで、受容体を有する細胞に対する親和性の増加が達成される、パラグラフ１９〜２７のいずれか１つに記載の方法。
パラグラフ２９
前記オリゴマー形態が、投与前に前記分子に結合される、パラグラフ２８に記載の方法。
パラグラフ３０
前記オリゴマー形態が、前記「エフェクター分子」の投与の前、投与と同時、または投与の後に、独立した注射で投与される、パラグラフ２８またはパラグラフ２９に記載の方法。
本明細書に記載の技術は、下記の実施例によってさらに例示されるが、こうした実施例は、いかなる様式においても限定の追加であると解釈されるべきではない。
実施例１
我々は、他のニューロンサブタイプ及びＣＮＳ組織と比較して、侵害受容ニューロンが、主要な炭疽毒素受容体であるＡＮＴＸＲ２を高度かつ特異的に発現することを発見した。炭疽毒素に固有のエンドソーム送達機構を使用することによって、我々は、他の神経学的副作用を引き起こすことなく、疼痛を特異的に遮断することになる積み荷分子を侵害受容器に特異的に送達することができる。
この発見に基づき、我々は、下記の（１）〜（３）を提供する。（１）慢性疼痛の病状における疼痛特異的な遮断及び標的指向化された鎮痛機構。こうした病状には、変形性関節症、痙縮、関節リウマチ、化学療法誘発性のニューロパチー、及び癌性疼痛が含まれる。（２）筋痙縮の治療。疼痛は痙性疾患病状の主要な構成要素である。侵害受容器によって引き起こされる感覚運動反射回路の調節不全は、筋痙縮を進行させる可能性がある。炭疽毒素介在性の侵害受容器のサイレンシングは、疼痛を治療するだけでなく、筋痙縮も低減し得ると我々は仮定する。（３）骨関節炎の病状の治療。関節の疼痛及び破壊は、骨関節疾患及びリウマチ学的疾患の主要な構成要素である。神経系（侵害受容器に特異的な場所）以外では、マクロファージ、骨芽細胞、及び破骨細胞がＡＮＴＸＲ２を高度に発現することを我々は見出した。こうした細胞は、関節に介在する重要な造血細胞である。炭疽毒素及びその送達機構は、神経学的副作用を生じさせることない、侵害受容器を介した関節疼痛の特異的標的化、ならびに関節破壊を媒介するマクロファージ、骨芽細胞、及び破骨細胞の同時標的化に使用することができる。
それに備わったエンドソーム逃避機構及びサイトゾル送達機構を介した、選択積み荷分子タンパク質の侵害受容ニューロンへの特異的な標的指向化に炭疽毒素を使用することができるかを決定するために、いくつかの疾患病状（変形性関節症、筋肉損傷、関節リウマチ、化学療法誘発性のニューロパチー、癌性疼痛）における慢性疼痛、ならびに変形性関節症における関節破壊の鎮静化に炭疽毒素を使用することができるかを我々はさらに試験することになる。
我々の詳細なＦＡＣＳ精製体性感覚ニューロン発現データベース、インサイチュハイブリダイゼーションデータベース、及び組織発現データベースに基づくと、ＡＮＴＸＲ２が侵害受容ニューロンに高度に発現しており、他のニューロンサブタイプと比較してこうしたニューロンに特異的であることを我々は最近発見した。ＡＮＴＸＲ２は、関節破壊における重要な細胞型であるマクロファージ、骨芽細胞、及び破骨細胞にも高度に発現する。この発現によって、変形性関節症における関節破壊を鈍感させるために、炭疽毒素が積み荷をこうした細胞に送達することが潜在的に可能となる。
異なる疾患病状における慢性疼痛または関節破壊を特異的に遮断するために、我々は、炭疽毒素またはその送達機構を利用している。いくつかの用途では、致死因子（ＬＦ（ＭＡＰキナーゼを無効化する））または浮腫因子（ＥＦ（カルシウム依存性アデニル酸シクラーゼ））と共に、受容体結合成分である防御抗原（ＰＡ）からなる天然の炭疽毒素を我々は使用することになる。他の用途では、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）またはリシン（Ｒｃｎ）を含む他の細菌毒素の酵素部分の細胞質への送達を媒介するプラットフォームとして我々は炭疽毒素を使用することになる。
疼痛を鎮静化するための天然の炭疽毒素（ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ）。炭疽菌による皮膚感染症は、無痛の病変を引き起こす。ＡＮＴＸＲ２に対するＰＡの結合は、致死因子（ＬＦ）（ＭＡＰキナーゼを遮断することが知られる）または浮腫因子（ＥＦ）（アデニル酸シクラーゼ）の送達を媒介する。ＭＡＰキナーゼ経路とｃＡＭＰ経路との両方が、侵害受容器の鋭敏化及び慢性疼痛に関与しており、そうしたものを調節することで疼痛が鎮静化する可能性がある。したがって、異なる疾患病状において疼痛の遮断を誘導するために、ＰＡ＋ＬＦ、ＰＡ＋ＥＦ、またはＰＡ＋ＬＦ＋ＥＦという組み合わせで、局所的な皮下注射または間接注射を我々は利用することになる。
疼痛及び関節炎による関節破壊を鎮静化するための、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）またはリシン（Ｒｃｎ）の酵素部分の炭疽毒素介在性のサイトゾルへの送達：受容体結合及びポア形成を行う炭疽毒素サブユニットであるＰＡは、侵害受容ニューロン、マクロファージ、及び破骨細胞を含む、関節におけるＡＮＴＸＲ２＋細胞へと、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）またはリシン（Ｒｃｎ）の酵素ドメインに融合した致死因子（ＬＦｎ）のＰＡ結合ドメインを特異的に送達するために使用されることになる。こうした毒素は、疼痛及び関節破壊を鎮静化するために、骨関節炎または関節リウマチを有する関節に注射されることになる。
マウスモデルでは、我々は、動物モデルにおける疼痛の遮断効力または関節の保護効力を試験するために、上記の炭疽毒素の分子または分子的な組み合わせを皮下または関節に局所的に送達することになる。こうした動物モデルは、変形性関節症（例えば、モノヨードアセテートの注射を介するもの）、筋肉損傷（例えば、心臓毒誘発型の損傷）、関節リウマチ（例えば、Ｋ／ＢｘＮ血清移入関節炎）、化学療法誘発性のニューロパチー（例えば、パクリタキセル）、及び癌性疼痛（例えば、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）細胞モデル）の動物モデルである。
疼痛の行動試験では、機械的及び／または温熱性の痛覚過敏に対する作用がアッセイされることになる。細胞内毒素のニューロンへの送達、及びニューロン活性の遮断を検出するために、一次侵害受容ニューロンに対する電気生理学も我々は実施することになる。関節病理学は、炎症の測定及び組織学的解析によって解析されることになる。
注目すべきことに、我々は、ボツリヌス毒素（ＢＴｘ）の酵素部分を送達するためにもこの炭疽毒素プラットフォームを利用することができる。
図１Ａ及び図１Ｂは、１１の他の神経組織型と比較して、主要な炭疽毒素受容体の受容体発現が後根神経節内に特異的であり、かつ高レベルであることを示す。
図２は、精製したマウス疼痛感受性侵害受容ニューロン（Ｎａｖ１．８−Ｃｒｅ／ＴｄＴｏｍａｔｏ＋）と、別の体性感覚ニューロンサブタイプである自己受容器（Ｐａｒｖ−Ｃｒｅ／ＴｄＴｏｍａｔｏ＋）とで、全トランスクリプトームデータを比較したものである。それらは、関連した細胞型であるものの、自己受容器と比較して、疼痛感受性Ｎａｖ１．８＋侵害受容ニューロンでは、Ａｎｔｘｒ２が高度に濃縮されて発現している。Ａｎｔｘｒ２は、自己受容ニューロンと比較すると、５倍を超える濃縮度で侵害受容器に存在する（Ｐ値＜１０−５）。
まとめると、図１及び図２のこうしたデータは、他のＣＮＳ組織及び自己受容ニューロンと比較して、炭疽毒素の受容体であるＡｎｔｘｒ２が侵害受容ニューロンに高度に濃縮されていることを示している。このことは、他のニューロンサブタイプと比較して疼痛感受性ニューロンを特異的に標的とするためにＡｎｔｘｒ２を利用できることを強く示している。
実施例２−インビトロの効力の評価（１）
我々は、炭疽毒素成分が培養侵害受容器に送達され得るかどうかを決定する実験を実施した。この実験をすることで、ＰＡと操作された融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴＡとの組み合わせの存在下での哺乳類細胞におけるタンパク質合成の阻害と、ＰＡとＥＦとの組み合わせの存在下での哺乳類細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルの増加と、ＰＡとＬＦとの組み合わせの存在下での哺乳類細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達の阻害と、を試験することになる。
ジフテリア毒素（ＤＴＡ）のＡ鎖は、炭疽送達系がニューロンへの毒素の送達に使用することができるという原理を証明するための細胞内酵素毒素として使用される。ＤＴＡは、ＥＦ−２のＡＤＰリボシル化を触媒し、タンパク質合成を阻害する。融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴＡは、ＰＡ介在性の細胞質への転位のアッセイに使用されることが多い。融合タンパク質であるＬＦｎ−ＤＴＡまたはＤＴＡ−ＬＦｎと共に２０ｎＭのＰＡでＣＨＯ−Ｋ１細胞を処理すると、フェムトモル濃度またはピコモル濃度の融合タンパク質でタンパク質合成が完全に停止することが、Ｍｉｌｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｆｅｂ；１５（４）：６６１−６，（１９９５）、及びＬｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１５（１６）：２４５８−２４６６，（２０１４）において以前に示された。
我々の実験については、野生型Ｂ６マウスからＤＲＧニューロンを収集し、約２０００個ニューロン／ウェルの細胞密度で一晩培養した。３Ｈ−ｌｅｕ（４００ｎＭ）の存在下、３７℃で、さまざまな濃度のＰＡ及びＬＦｎ−ＤＴＡで細胞を６時間処理した。放射標識ロイシン（３Ｈ−ｌｅｕ）を使用し、タンパク質合成を測定した。３Ｈ−ｌｅｕを使用することで、新たにタンパク質が合成されれば、その新たなタンパク質に３Ｈ−ｌｅｕが組み込まれることになる。インキュベーション期間の後、Ｆ１２Ｋ培地（ｌｅｕ非含有）でニューロンを洗浄した後、Ｆ１２Ｋ培地（ｌｅｕ非含有）において３Ｈ−ｌｅｕと共にインキュベートしてからＰＢＳで洗浄した。その後、新たに合成されたタンパク質に組み込まれた３Ｈ−ｌｅｕの放射能を測定するためのシンチレーション液に最終的にニューロンを溶解させた。対照実験では、ＰＡは添加したが、ＬＦｎ−ＤＴＡは無添加とした。３Ｈ−ｌｅｕのバックグラウンドの放射能を実験的な放射能から指し引き、この指し引いたデータを未処理のニューロンのものに基準化した。ＰＡ単独でニューロンを処理すると、有意なタンパク質合成阻害は観測されなかった（図３及び図４）。それ故に、ＰＡ単独ではニューロンにおけるタンパク質合成に影響を与えない。しかしながら、ＰＡ及びＬＦｎ−ＤＴＡは、培養ニューロンにおけるタンパク質合成をナノモル濃度で強力に阻害する（図５及び図６）。
実施例３−インビトロの効力の評価（２）
我々は、既知のｅＤＲＧ神経細胞モデルにおいて、開示の操作された融合タンパク質のインビトロの効力をさらに評価するための実験を実施することになる。
サブスタンスＰの放出阻害及びＳＮＡＰ−２５の切断に対するアッセイは、以前に報告されている（Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，３４８４６−３４８５２）。簡潔に記載すると、１５日齢の胎仔のスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットまたは野生型Ｂ６マウスから後根神経節ニューロンを収集する。ニューロンを解離させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートした２４ウェルプレートに対して、１ｘ１０６細胞／ウェルの密度で解離ニューロンを播種する。播種の１日後に、１０μＭのシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシドで細胞を４８時間処理する。５％の熱非働化ウシ胎仔血清、５ｍＭのＬ−グルタミン、０．６％のＤ−グルコース、２％のＢ２７サプリメント、及び１００ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓマウス神経成長因子（ＮＧＦ）またはラット神経成長因子（ＮＧＦ）を添加したダルベッコ最小必須培地において細胞を維持する。９５％空気／５％ＣＯ２、３７℃で培養物を２週間維持した後、試験材料を添加する。
酵素結合免疫吸着測定法によってｅＤＲＧからのサブスタンスＰの放出をアッセイする。簡潔に記載すると、低カリウム平衡塩溶液（ＢＳＳ：５ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、０．４４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭのＣａＣｌ２）でｅＤＲＧ細胞を２回洗浄する。１ｍｌの低カリウムＢＳＳと共に各ウェルを５分間インキュベートすることによって基礎試料を得る。この緩衝液を除去した後、１ｍｌの高カリウム緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌを含めて改変し、ＮａＣｌで等張性の平衡を保った上記のＢＳＳ）で５分間インキュベートすることによって、放出が生じるように細胞を刺激する。サブスタンスＰのアッセイを実施する前に、試料をすべて取り出して氷上の試験管に移す。２５０μｌの２Ｍ酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸を添加して細胞を溶解させ、遠心蒸発させ、５００μｌのアッセイ緩衝液で再懸濁することによって全細胞可溶化物を調製する。希釈した試料のサブスタンスＰ含量をアッセイする。製造者の説明書に従い、サブスタンスＰ酵素免疫アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙまたはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、サブスタンスＰの免疫反応性を測定する。サブスタンスＰは、平行して実施作成するサブスタンスＰの標準曲線に対するｐｇ／ｍｌで示される。
標準的なプロトコール（Ｎｏｖｅｘ）を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる分析を実施する。１２％のトリス／グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）でＳＮＡＰ−２５タンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に転写する。切断されたＳＮＡＰ−２５及び未変化のＳＮＡＰ−２５を認識するモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１）で膜を探索する。ペルオキシダーゼ複合型の二次抗体及び化学発光検出システムを使用し、特異的な結合を可視化する。デンシトメトリーでのスキャン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＳＩ，ＩｍａｇｅＱｕａｎｔデータ解析ソフトウェア）によってＳＮＡＰ−２５の切断を定量化する。（切断ＳＮＡＰ−２５／（切断ＳＮＡＰ−２５＋未変化ＳＮＡＰ−２５））ｘ１００という式に従ってＳＮＡＰ−２５の切断パーセントを計算する。
実施例４−インビボの効力の評価
ラットの後足の足底内に皮下注射を実施した後、カプサイシン誘発型の急性の機械的アロディニアをタンパク質が阻止する能力を評価する。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメントによる一連の１０ｇの刺激（１０回の刺激ｘ３回の試験）に反応して試験動物が足を引っ込める頻度（ＰＷＦ％）を評価する。この評価を、試験に供す前、試験タンパク質での皮下処理後かつカプサイシン処理前、及び試験タンパク質注射後かつカプサイシン負荷後（１５分時点及び３０分時点の反応の平均）に実施する。カプサイシンの負荷は、１０μｌの０．３％溶液を注射することによって達成する。試料の希釈液は、０．５％のＢＳＡ／生理食塩水で調製する。
ラットにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発型の機械的（接触性）アロディニアを試験タンパク質が阻止する能力を評価する。ストレプトゾトシンを注射（腹腔内または静脈内）することで膵臓のβ細胞を破壊し、これによってインスリンの産生を減少させ、代謝ストレス（高血糖及び高脂血症）を併発させることによって、ラットにおいてＳＴＺ誘発型の機械的アロディニアを達成する。したがって、ＳＴＺは、Ｉ型糖尿病を誘発する。さらに、ＳＴＺ処理は、ニューロパチーを進行性に発症させ、これは、糖尿病（末梢性糖尿病性ニューロパチー）を有するヒトにおいて観測される徴候を反映し得る痛覚過敏及びアロディニアを伴う慢性疼痛のモデルとして役立つ。
６５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを含むクエン酸緩衝液で雄性スプラーグドーリーラット（２５０〜３００ｇ）を処理（静脈内）し、血中のグルコース及び脂質を毎週測定することでモデルの準備状況を定義する。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式のフィラメントによる一定時間にわたる一連の刺激に反応して足を引っ込める閾値（Ｐａｗ Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＰＷＴ）を測定する。２回の連続した試験データ（１週間間隔を空けたもの）でＰＷＴが６ｇの基準を下回ると、アロディニアが確立されると言われる。この時点で、生理食塩水群（負の効力対照）、ガバペンチン群（正の効力対照）、または試験群のいずれかにラットを無作為化する。単回の注射として試験材料（２０〜２５μｌ）を皮下注射し、処理の１日後にＰＷＴを測定し、それに加えて、その後の２週間にわたってＰＷＴを定期的に測定する。
配列リスト
配列番号１、ＰＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５２８０６
Figure 2018525021
配列番号２ ジフテリア毒素 ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿００３８５０２６６
Figure 2018525021
配列番号３ 緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＴｘ） ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２４９８３９
Figure 2018525021
配列番号４ ボツリヌス毒素 ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１３８６７３８
Figure 2018525021
配列番号５ 破傷風毒素 ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０２３４３９７１９
Figure 2018525021
配列番号６ 浮腫因子 ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５２８１８
Figure 2018525021
配列番号７ 致死因子 ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５２８０３
Figure 2018525021
配列番号８ ω−コノトキシンＭ ＶＩＩ Ａ ＮＣＢＩ参照配列：ＡＤＢ９３０８１
Figure 2018525021
配列番号９ μ−コノトキシン Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５４７２．１
Figure 2018525021
配列番号１０ δ−コノトキシン ＮＣＢＩ番号：ＡＫＤ４３１８５
Figure 2018525021
配列番号１１、志賀毒素 Ａ部分
Figure 2018525021
配列番号１２、志賀毒素 Ｂ部分
Figure 2018525021
外毒素Ａ Ａ部分及びＢ部分
配列番号１３
Figure 2018525021
コレラ毒素
配列番号１４、コレラ毒素、Ａ１成分
Figure 2018525021
配列番号１５、コレラ毒素、Ａ２成分
Figure 2018525021
配列番号１６、コレラ毒素、Ｂ成分
Figure 2018525021
配列番号１７、破傷風の触媒鎖（Ｌ鎖配列）
Figure 2018525021
リシン毒素
配列番号１８、リシン毒素、Ａ成分
Figure 2018525021
配列番号１９、リシン毒素、Ｂ成分
Figure 2018525021
配列番号２０、ＢＴｘ／Ａ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ａ アミノ酸１〜４４８
Figure 2018525021
配列番号２１、ＢＴｘ／Ａ軽鎖 アミノ酸１〜４３０
Figure 2018525021
配列番号２２、ＢＴｘ／Ｂ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｂ アミノ酸１〜４４１
Figure 2018525021
配列番号２３、ＢＴｘ／Ｂ アミノ酸１〜４３７
Figure 2018525021
配列番号２４、ＢＴｘ／Ｃ１軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｃ１ アミノ酸１〜４４９
Figure 2018525021
配列番号２５、ＢＴｘ／Ｄ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｄ アミノ酸１〜４４２
Figure 2018525021
配列番号２６、ＢＴｘ／Ｅ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｅ アミノ酸１〜４２２
Figure 2018525021
配列番号２７、ＢＴｘ／Ｆ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｆ アミノ酸１〜４３６
Figure 2018525021
配列番号２８、ＢＴｘ／Ｇ軽鎖（天然）：ＢＴｘ／Ｇ アミノ酸１〜４４２
Figure 2018525021
配列番号２９、ＢＴｘ／Ａ（軽鎖及び重鎖転位ドメイン）アミノ酸１〜８７２
Figure 2018525021
配列番号３０、ＢＴｘ／Ａ、（軽鎖及び重鎖転位ドメイン）アミノ酸１〜８４２
Figure 2018525021
配列番号３１、ＢＴｘ／Ｂ（軽鎖及び重鎖転位ドメイン）アミノ酸１〜８６３
Figure 2018525021
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質、または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合した炭疽菌防御抗原（ＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。
別の態様では、疼痛の治療方法が本明細書に記載され、当該方法は、それを必要とする対象に対する、操作された融合タンパク質、または操作された融合タンパク質を含む組成物の、有効かつ疼痛を低減する量での投与を含み、当該操作された融合タンパク質は、侵害受容器の表面受容体または侵害受容器のイオンチャネル型受容体を特異的に標的とする能力を有する分子と融合しており、その天然の受容体結合機能が遮断されるように改変された変異炭疽菌防御抗原（ｍＰＡ）部分と、細胞内作用毒素の触媒ドメインに融合した炭疽菌致死因子ドメイン（ＬＦｎ）と、を含む。ＡＮＴＸＲ２は、ＰＡの天然の受容体である。
ポリペプチドを含む本明細書に記載の態様のいずれかの実施形態の１つでは、ポリペプチドは、例えば、１個または複数個のアミノ酸を含むペプチドに１つの部分を付加することによって修飾することができる。１つの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１つまたは複数の部分分子（ｍｏｉｅｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含み得、例えば、ペプチド当たり１つもしくは複数の部分分子、ペプチド当たり２つ以上の部分分子、ペプチド当たり５つ以上の部分分子、ペプチド当たり１０個以上の部分分子、またはペプチド当たりにそれを超える数の部分分子を含み得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、本明細書に記載のポリペプチドは、１つまたは複数の修飾及び／または部分を含み得、例えば、１つの型の修飾、２つの型の修飾，３つの型の修飾、またはそれを超える数の型の修飾を含み得る。修飾及び／または部分の例には、限定はされないが、ＰＥＧ化、グリコシル化、ＨＥＳ化、ＥＬＰ化、脂質修飾、アセチル化、アミド化、エンドキャッピング修飾、シアノ基、リン酸化、アルブミン、及び環化が含まれる。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、エンドキャッピング修飾には、Ｎ末端のアセチル化、Ｎ末端のアシル化、及びＮ末端のホルミル化が含まれ得る。本明細書に記載のすべての態様の実施形態のいくつかでは、エンドキャッピング修飾には、Ｃ末端のアミド化、アルコール部分、アルデヒド部分、エステル部分、及びチオエステル部分のＣ末端への導入が含まれ得る。ポリペプチドの半減期は、例えば、ＰＥＧまたはアルブミンといた部分の付加によって増加させることができる。

Claims (52)

  1. （ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、
    （ｂ）前記侵害受容ニューロンに存在する結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）であって、前記結合部位が、エンドサイトーシスを受けることでエンドソームに取り込まれて前記侵害受容ニューロンに入る能力を有し、前記侵害受容ニューロンが、前記ＳＮＡＲＥタンパク質を発現する、前記標的指向化部分（ＴＭ）と、
    （ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記プロテアーゼを前記侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と
    を含む融合タンパク質であって、
    ただし、（ａ）部分、（ｂ）部分、及び（ｃ）部分が、異種性起源のものであるか、または少なくとも１つの異種性部分もしくは異種性ドメインを含む、前記融合タンパク質。
  2. プロテアーゼによって前記融合タンパク質をそこで切断することが可能なプロテアーゼ切断部位をさらに含み、前記プロテアーゼ切断部位が、前記融合タンパク質における前記非細胞傷害性プロテアーゼのＣ末端に位置する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記ＴＬが、クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素の転位ドメインを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  5. 前記クロストリジウム神経毒素が、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である、請求項３に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＴＭが、前記侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体に結合する、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＴＭが、炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、またはＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、またはＡＮＴＸＲ２への結合活性を保持するそのＰＡ断片である、請求項５または請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. ＰＡが、フーリンによる切断に抵抗性である、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. ＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＰＡｄ４が、プロテアーゼによる切断に抵抗性である、請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記プロテアーゼが、ＬｙｓＣまたはフーリンである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. （ａ）侵害受容ニューロンにおけるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力を有する非細胞傷害性プロテアーゼと、
    （ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と
    を含む融合タンパク質であって、
    前記ＰＡまたはＰＡ断片が、前記侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する、前記融合タンパク質。
  13. 前記非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖または非クロストリジウムのボツリヌス様毒素に由来するＬ鎖を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記クロストリジウム神経毒素が、ボツリヌス神経毒素（ＢＴｘ）または破傷風神経毒素（ＴＴｘ）である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記クロストリジウム神経毒素のＬ鎖が、表１から選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  16. 前記侵害受容ニューロンに発現した、ＰＡが結合する前記受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  17. ＰＡに結合する能力を有する前記タンパク質が、
    （ｉ）炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、または
    （ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）
    である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  18. ＬＦのＰＡ結合ドメインが、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. ＥＦのＰＡ結合ドメインが、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  20. （ａ）侵害受容ニューロンにおけるイオンチャネルを遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素（こうしたものには、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素が含まれる）と、
    （ｂ）前記イオンチャネル（例えば、ナトリウムもしくはカルシウム、またはナトリウムとカルシウムとの両方）をそこで発現する前記侵害受容ニューロンの結合部位に結合する能力を有する標的指向化部分（ＴＭ）と
    を含む、融合タンパク質。
  21. 前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、システインノットモチーフを含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. 前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  23. 前記ＴＭが、
    （ｉ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、
    （ｉｉ）ＰＡのＣ末端受容体結合ドメイン、
    （ｉｉｉ）侵害受容ニューロン結合タンパク質
    からなる群から選択される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  24. 前記ＰＡまたはＰＡのＣ末端受容体結合ドメインが、前記侵害受容ニューロンに発現したＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）受容体と相互作用して結合する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
  25. 前記ＰＡが、フーリンによる切断に抵抗性の変異ＰＡである、請求項２３または請求項２４に記載の融合タンパク質。
  26. ＰＡの前記Ｃ末端受容体結合ドメインが、ＰＡ６３、ＰＡｄ３−ｄ４、ＰＡｄ２−ｄ４、及びＰＡｄ４からなる群から選択される、請求項２３または請求項２４に記載の融合タンパク質。
  27. 前記ＰＡｄ４が、プロテアーゼによる切断に抵抗性である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. 前記プロテアーゼが、ＬｙｓＣまたはフーリンである、請求項２７に記載の融合タンパク質。
  29. 前記侵害受容ニューロン結合タンパク質が、抗体である。請求項２３に記載の融合タンパク質。
  30. 前記抗体が、侵害受容ニューロンに存在する神経成長因子受容体、ＡＮＴＸＲ２受容体、またはイオンチャネルタンパク質に特異的に結合する、請求項２９に記載の融合タンパク質。
  31. 前記イオンチャネルタンパク質が、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９から選択される、請求項３０に記載の融合タンパク質。
  32. （ａ）侵害受容ニューロンにおけるナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネル、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルとの両方を遮断する能力を有するジスルフィド含有ペプチド毒素（これは、システイン−ノットモチーフを有するチャネル遮断毒素である）と、
    （ｂ）炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片に結合する能力を有するタンパク質と
    を含む融合タンパク質であって、
    前記断片が、前記侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する、前記融合タンパク質。
  33. 前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、システインノットモチーフを含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  34. 前記ジスルフィド含有ペプチド毒素が、コノトキシン、アガトキシン、デルタ−パルトキシン、フエントトキシン、またはＰｒｏＴｘ ＩＩ毒素である、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  35. 前記侵害受容ニューロンに発現した前記ＰＡ結合受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  36. ＰＡに結合する能力を有する前記タンパク質が、
    （ｉ）炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、または
    （ｉｉ）炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）
    である、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  37. ＬＦのＰＡ結合ドメインが、ＬＦのＮ末端ドメイン（ＬＦＰＡＢＤまたはＬＦｎと略される）である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
  38. ＥＦのＰＡ結合ドメインが、ＥＦのＮ末端ドメイン（ＥＦＰＡＢＤまたはＥＦｎと略される）である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
  39. （ａ）ＡＢ毒素と、
    （ｂ）侵害受容ニューロンに発現した受容体に結合する炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）またはそのＰＡ断片と、
    （ｃ）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って前記プロテアーゼを前記侵害受容ニューロンのサイトゾルに転位させる能力を有する転位ドメイン（ＴＬ）と、
    を含む融合タンパク質。
  40. 前記ＡＢ毒素が、
    （ｉ）リシン毒素、
    （ｉｉ）コレラ毒素のＡ部分及びＢ部分、
    （ｉｉｉ）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素ＡのＡ部分及びＢ部分、
    （ｉｖ）志賀毒素のＡ部分及びＢ部分、ならびに
    （ｖ）ジフテリア毒素のＡ部分及びＢ部分、
    から選択される、請求項３９に記載の融合タンパク質
  41. 前記侵害受容ニューロンに発現した前記ＰＡ結合受容体が、ＡＮＴＸＲ２（ＣＭＧ２）である、請求項３９または請求項４０に記載の融合タンパク質。
  42. 前記ＰＡ断片が、ＰＡのＣ末端受容体結合ドメインである、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  43. 前記ＴＬが、
    （ｉ）クロストリジウム神経毒素の転位ドメイン、
    （ｉｉ）ホロ毒素、または
    （ｉｉｉ）前記ＡＢ毒素の毒素受容体結合機能が無効化するように変異導入された、前記ホロ毒素の変異形態
    である、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  44. 先行請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  45. 請求項４４に記載の核酸を含む、ベクター。
  46. 前記ベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、またはウイルス粒子である、請求項４５に記載のベクター。
  47. 請求項４４に記載の核酸、または請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクターを含む、細胞。
  48. （ａ）前記融合タンパク質が発現するような条件下での、請求項４４に記載の細胞の培養段階と、
    （ｂ）前記融合タンパク質の回収段階と、
    を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質の産生方法。
  49. 請求項４８に記載の方法によって産生される、融合タンパク質。
  50. 請求項１〜４３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
  51. それを必要とする対象に対する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物の投与段階を含む、疼痛の治療のための方法。
  52. それを必要とする対象に対する、天然の成熟炭疽毒素防御抗原（ＰＡ）、及び炭疽毒素浮腫因子（ＥＦ）、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、またはそれらの任意の組み合わせの投与段階を含む、疼痛の治療方法。
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