CN108350039A - 用于治疗疼痛的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗疼痛的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108350039A
CN108350039A CN201680062362.0A CN201680062362A CN108350039A CN 108350039 A CN108350039 A CN 108350039A CN 201680062362 A CN201680062362 A CN 201680062362A CN 108350039 A CN108350039 A CN 108350039A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
toxin
btx
composition
pad4
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680062362.0A
Other languages
English (en)
Inventor
R·约翰·科利尔
艾萨克·肖
布兰德利·L·彭特卢特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College, Massachusetts Institute of Technology filed Critical Harvard College
Publication of CN108350039A publication Critical patent/CN108350039A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/07—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文体现结合并且靶向伤害感受器神经元的工程化融合蛋白，包含这些工程化融合蛋白的组合物，以及用于使用这些工程化融合蛋白或含有所述工程化融合蛋白的组合物治疗疼痛的方法。所述工程化融合蛋白含有来源于蛋白毒素诸如炭疽毒素、肉毒梭状芽孢杆菌毒素家族、含二硫化物的毒素和AB组分型毒素的结构域。

Description

用于治疗疼痛的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2015年8月27日提交的美国临时申请号62/210,610的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子版形式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2016年8月26日创建的所述ASCII拷贝名为002806-084951-PCT_SL.txt且大小为165,499字节。
发明领域
我们描述用于治疗疼痛的新颖组合物和方法。
发明背景
慢性疾病病状包括骨关节炎、类风湿性关节炎、肌肉痉挛和癌症的疼痛是主要的社会经济负担，极少有效的治疗可用于这类疼痛。
目前慢性疼痛疗法诸如类罂粟碱大多数是无效的或具有由作用于其他神经元亚型所致的重要脱靶效应诸如上瘾。
伤害感受器感觉神经元介导有害/伤害性刺激的检测，并且其异常激活产生慢性疼痛。这些神经元在肌肉痉挛方面调节异常，其可导致过度活跃的感觉运动反射，并且还使神经分布于骨关节病状中受影响的关节以介导疼痛。
发明概述
本发明提供用于治疗疼痛的新颖组合物和方法。本发明至少部分地基于我们发现感受疼痛的伤害感受器神经元特异性表达高水平的ANTXR2(还称为CMG2)，即炭疽毒素的受体，而这种受体大致上不被其他神经元亚型表达。通过使用炭疽毒素所固有的内体递送机制，我们可以将分子货物(molecular cargo)特异性递送到伤害感受器中，从而将导致疼痛特异性阻断而不引起其他神经学副作用。例如，分子货物可为细胞内作用毒素，其抑制或阻断体内细胞信号传导途径或者抑制或阻断突触神经递质的释放。
因此，在一个方面中，我们提供一种融合蛋白，其包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)，和(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)，或PA的C末端受体结合结构域，其中(a)部分和(b)部分连接或融合在一起。术语“融合蛋白”可与本文的术语“嵌合蛋白”和术语“工程化融合蛋白”互换使用。
在一个实施方案中，BTx或TTx包含BTx或TTx酶部分和易位肽或结构域。
在一个实施方案中，BTx部分或易位肽/结构域选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个的BTx轻链和重链结构域。反斜杠之后是字母(/A、/B、/C等)表示肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)科内的各种血清型。
在一个实施方案中，BTx或TTx酶部分或易位肽/结构域选自表1中所提供的Btx或TTx毒素的酶部分和易位结构域。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中PA或其PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。换句话讲，这里的融合蛋白裂解SNARE蛋白。
在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶包含梭状芽孢杆菌神经毒素L链。在一个实施方案中，梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)。
在一个实施方案中，BTx选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个。
在一个实施方案中，梭状芽孢杆菌神经毒素L链选自表1中所提供的梭状芽孢杆菌神经毒素的L链。在一个实施方案中，梭状芽孢杆菌神经毒素L链选自SEQ.ID.NO:20-28。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的离子通道；以及(b)靶向部分(TM)，其能够结合所述伤害感受器神经元上的结合位点，其中所述伤害感受器神经元在其中表达所述离子通道(例如，钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者)。换句话讲，这里的含二硫化物的肽毒素阻断伤害感受器神经元中的离子通道，并且TM结合伤害感受器神经元上的结合位点。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段的蛋白，所述炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。换句话讲，这里的含二硫化物的肽毒素阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或两种类型的通道，并且(b)部分为结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段的蛋白质，所述炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。
在一个实施方案中，本文所述的融合蛋白所包含的含二硫化物的肽毒素包含半胱氨酸结基序。
在一个实施方案中，本文所述的融合蛋白所包含的含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素(conotoxin)、漏斗网蛛毒素(agatoxin)、δ-岩沙海葵毒素(delta paulutoxin)、虎纹捕鸟蛛毒素(huwentotoxin)或ProTx II毒素。
在一个实施方案中，在伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
在一个实施方案中，PA或PA的C末端受体结合结构域结合在伤害感受器神经元上表达的ANTXR2(CMG2)受体。
在一个实施方案中，TM选自由以下组成的组：(i)炭疽毒素保护性抗原(PA)；(ii)PA的C末端受体结合结构域；以及(iii)伤害感受器神经元结合蛋白。
在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的突变体PA。
在一个实施方案中，PA的C末端受体结合结构域为PA63或PAd4。
在一个实施方案中，结合ANTXR2的PAd4、PA或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域是修饰的或突变的。
在一个实施方案中，结合ANTXR2的PAd4、PA或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域耐蛋白酶诸如Lys C裂解。
在一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。
在一个实施方案中，抗体特异性结合伤害感受器神经元上存在的神经生长因子(NGF)受体、ANTXR2受体或离子通道蛋白。
在一个实施方案中，离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
在一个实施方案中，能够结合PA的蛋白质为炭疽毒素致死因子(LF)或炭疽毒素水肿因子(EF)。换句话讲，这里的蛋白质结合PA并且是LF或EF。
在一个实施方案中，LF的PA结合结构域为LF的N末端结构域(缩写为LFPABD或LFn)。
在一个实施方案中，EF的PA结合结构域为EF的N末端结构域(缩写为EFPABD或EFn)。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)AB毒素；(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段，其中PA或其片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体；以及(c)易位结构域(TL)，其能够将毒素(蛋白酶)从内体内易位跨过内体膜并进入伤害感受器神经元的细胞溶质。换句话讲，TL将毒素易位到伤害感受器神经元的细胞溶质中。
在一个实施方案中，AB毒素选自蓖麻毒素(Ricin toxin)、霍乱毒素(Choleratoxin)A部分和B部分；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素(Shiga toxin)A部分和B部分；以及白喉毒素(Diphtheria toxin)A部分和B部分。
在一个实施方案中，在伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
在一个实施方案中，PA片段为PA的C末端受体结合结构域。
在一个实施方案中，TL为来源于梭状芽孢杆菌神经毒素的易位结构域，或是海参毒素(holotoxin)；或是被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变体形式。
在另一个方面中，本文提供一种包含肉毒神经毒素(BTx)部分的融合蛋白，所述BTx部分包含BTx的N末端酶结构域(LC或L链)和中间成孔/易位结构域(HN)，所述BTx部分连接炭疽毒素保护性抗原(PA)的C末端受体结合结构域。炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域可为例如PAd4结构域。
在一个实施方案中，融合蛋白还包含BTx部分与炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域或PAd4结构域之间的接头肽。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)部分的肉毒神经毒素N末端酶结构域，和(b)炭疽毒素致死因子(LFn)的N末端结构域，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子(EFn)的N末端结构域，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式，其中(a)部分在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者连接(b)部分。
在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，融合蛋白可以还包含定义对应于BTx HN结构域的N末端部分的区带(belt)的氨基酸序列，其中BTx的HN位于BTx部分的C末端侧。所述区带的存在使L链稳定。
在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链和HN结构域、基本上由其组成或由其组成，L链与HN结构域之间的S-S桥不减少。
在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链但无HN结构域、基本上由其组成或由其组成，L链和对应于BTx HN结构域的N末端部分的区带(如果存在的话)中的Cys残基可突变成Ala、Ser或Thr。
在一个实施方案中，对于包含BTx L部分和LFn或EFn结构域的融合蛋白，融合蛋白还包含BTx L部分与LFn或EFn结构域之间的接头肽。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含炭疽毒素保护性抗原(PA)、炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)或伤害感受器神经元结合蛋白，其连接含二硫化物的肽毒素。在一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为抑制剂半胱氨酸结毒素。
在一个实施方案中，融合蛋白还包含PA、PAd4或伤害感受器结合蛋白与含二硫化物的肽毒素(例如，抑制剂半胱胺酸结毒素)之间的接头肽。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含含二硫化物的肽毒素，所述含二硫化物的肽毒素在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者可操作地连接或者在一个或多个位点化学交联炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式。
在毒素融合LFn或EFn中所述的任何融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白还包含LFn与毒素之间或EFn与毒素之间的接头肽。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含与接头肽融合的AB毒素，所述接头肽连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或已被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变体形式。
在包括AB毒素的任何融合蛋白的一个实施方案中，AB毒素选自蓖麻毒素、霍乱毒素A部分和B部分、铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分、志贺毒素A部分和B部分以及白喉毒素A部分和B部分。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含来自梭状芽孢杆菌神经毒素或非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素的N末端酶结构域(链A)连同易位/成孔结构域，其连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。梭状芽孢杆菌神经毒素的实例为破伤风神经毒素(在科学文献中经常缩写为TTx或TeNT)。
在一个实施方案中，融合蛋白还包含TTx部分与PAd4结构域之间的接头肽。
在描述为具有接头的任何融合蛋白的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。
在描述为具有接头的任何融合蛋白的一个实施方案中，接头肽可在人类血清中稳定至少1分钟。
在描述为具有接头的任何融合蛋白的一个实施方案中，接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
在描述为具有接头的任何融合蛋白的一个实施方案中，接头肽不包含Lys和/或Arg。
在描述为包括BTx部分的任何融合蛋白的一个实施方案中，BTx部分选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G中任一个的BTx轻链和重链结构域。例如，BTx轻链和重链结构域选自本文所述的SEQ ID NO:29-31或表1。明确地预期还可以使用非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素。
在描述为包括PAd4结构域的任何融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白包含串联的2-10个PAd4结构域。
在描述为包括PAd4结构域和BTx部分的任何融合蛋白的一个实施方案中，将来自PA的N末端侧相邻于天然PAd4结构域的约1-60个连续氨基酸进一步并入到BTx部分与PAd4之间。
在描述为包括PAd4结构域和AB毒素的任何融合蛋白的一个实施方案中，将来自PA的N末端侧相邻于天然PAd4结构域的约1-60个连续氨基酸进一步并入到AB毒素与PAd4之间。
在描述为包括PAd4结构域(例如，PAd4、PA或PA的C末端受体结合结构域)的任何融合蛋白的一个实施方案中，PAd4结构域中在位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替，其中编号是指在减去SEQ.ID.NO:1中29aa信号肽之后SEQ ID NO:1的编号。
在描述为包括PAd4结构域(例如，PA或PA的C末端受体结合结构域)的任何融合蛋白的一个实施方案中，PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个已被例如Arg或His代替。
在描述为包括整个PA蛋白的任何融合蛋白的一个实施方案中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基164RKKR167(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的PA的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶氨基酸序列代替。在一个实施方案中，耐弗林蛋白酶氨基酸序列为SSSR(SEQ ID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)。
在描述为包括PAd4结构域的任何融合蛋白的一个实施方案中，PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
在本文所述的任何融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的N末端还包含至少一个D-氨基酸。
在包括所有或部分BTx L链和H链的任何融合蛋白的一个实施方案中，对应于BTx的与BTx的H链的L链接点的残基已被裂解。
在包括伤害感受器神经元结合蛋白的任何融合蛋白的一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。在一个实施方案中，抗体特异性结合NGF受体或伤害感受器神经元上存在的离子通道蛋白。在一个实施方案中，离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含前述段落中所述的融合蛋白中的任一个。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在所述的任何组合物的一个实施方案中，组合物还包含天然炭疽毒素保护性抗原(PA)。在一个实施方案中，PA为低聚物PA。在一个实施方案中，低聚物PA结合融合蛋白。
在另一个方面中，本文提供一种核酸，其编码本文所述的融合蛋白中任一个。
在另一个方面中，本文提供一种载体，其包含前述段落中所述的核酸。例如，载体为质粒、噬菌体或病毒载体。例如，质粒为细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)中用于重组蛋白表达的表达质粒。在另一个方面中，本文提供一种病毒粒子，其包含有包含前述段落中所述的核酸的载体。在另一个方面中，本文提供一种病毒粒子，其包含前述段落中所述的核酸。
在另一个方面中，本文提供一种细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。例如，携带包含编码本文所述的融合蛋白的核酸的质粒的大肠杆菌(E.coli)。例如，针对核酸中所编码的融合蛋白的重组蛋白质表达。在另一个方面中，本文提供一种细胞，其包含病毒粒子，所述病毒粒子包含有包含前述段落中所述的核酸的载体。在另一个方面中，本文提供一种细胞，其包含病毒粒子，所述病毒粒子包含前述段落中所述的核酸。
在另一个方面中，本文提供一种产生融合蛋白的方法，所述方法包括在使得融合蛋白被表达的条件下培养以上本文所述的细胞，以及回收所述融合蛋白。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其通过前述段落中所述的方法产生。
在一个实施方案中，本文所述的融合蛋白中任一个或者通过本文所述的方法所产生的融合蛋白是糖基化的。在另一个实施方案中，本文所述的融合蛋白中任一个或者通过本文所述的方法所产生的融合蛋白是非糖基化的。
在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为原核细胞诸如细菌。在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为细菌细胞。在一个实施方案中，细菌为大肠杆菌(Escherichia coli、E.Coli)。在另一个实施方案中，细菌为减毒炭疽杆菌(Bacillus anthracis)菌株例如CDC 684。在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为酵母细胞。在一个实施方案中，酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，酵母细胞为糖基化缺陷的。
在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，酵母细胞为糖基化和蛋白酶缺陷的。
在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞为COS细胞、CHO细胞或NSO细胞。
在一个实施方案中，本文提供本文所述的融合蛋白中任一个用于治疗疼痛的用途。
在一个实施方案中，本文提供本文所述的融合蛋白中任一个用于制造用于治疗疼痛的药物的用途。
在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(PAd4)。
在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含与梭状芽孢杆菌神经毒素的L链和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。在一个实施方案中，此融合蛋白可以还包括梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的区带，所述区带为H链的N末端区段。在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含与细胞内作用毒素(例如，AB型毒素)和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。
在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含：已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。ANTXR2为PA的天然受体。换句话讲，所述分子特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体。
在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含：炭疽保护性抗原(PA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。ANTXR2为PA的天然受体。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，PA可被进一步工程化成增强与一种或多种受体的结合。换句话讲，所述分子特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体。
在一个实施方案中，能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子或者特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子选自特异性结合NGF受体的抗体或抗体模拟物或者特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体或抗体模拟物。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道的分子可被进一步工程化成增强与一种或多种受体的结合。
在一个实施方案中，其中细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、炭疽致死毒素(致死因子，LF)和/或炭疽水肿毒素(水肿因子，EF)。
在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含：天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)，其中mPA已被修饰(例如，以化学方式)或突变以便阻断其天然受体结合功能；以及可以靶向伤害感受器神经元表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽致死因子(LF)组合的形式。
在前述段落中任一项的工程化融合蛋白的一个实施方案中，PA或mPA是以共价或非共价低聚物形式。在一个实施方案中，低聚物形式例如共价或非共价地结合分子。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(PAd4)。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含：已被改变成阻断其天然受体结合功能的工程化突变体炭疽保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含：炭疽保护性抗原(PA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。ANTXR2为PA的天然受体。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，PA可被进一步工程化成增强与一种或多种受体的结合。
在一个实施方案中，能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道的分子选自NGF以及特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道的分子可被进一步工程化成增强与一种或多种受体的结合。
在另一个实施方案中，细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、炭疽致死毒素(致死因子，LF)和/或炭疽水肿毒素(水肿因子，EF)。
在另一个方面中，本文提供一种组合物，其包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含：天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)，其中mPA已被修饰(例如，以化学方式)或突变以便阻断其天然受体结合功能；以及可以靶向伤害感受器神经元表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)组合的形式。
在一个实施方案中，PA或mPA是以低聚物形式。在一个实施方案中，低聚物形式结合所述分子。
在一个实施方案中，包含融合蛋白的组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一个方面中，本文提供一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含如本文所述的融合蛋白的组合物。
在另一个方面中，本文提供一种治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
在另一个方面中，本文提供一种用于治疗神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛的方法，其包括通过真皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射来向有需要的受试者外周地施用包含如本文所述的融合蛋白的组合物。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症的方法，其包括通过硬膜外注射、鞘内输注或脑室内输注到有需要的受试者的中枢神经系统中来施用包含如本文所述的融合蛋白的组合物。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含融合细胞内作用毒素催化结构域的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(PAd4)，其中工程化融合蛋白被递送到伤害感受器神经元并且导致伤害感受器神经元中细胞内信号传导事件减少或从伤害感受器神经元的神经递质释放减少。
在一个实施方案中，细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、炭疽致死毒素(致死因子)和/或炭疽水肿毒素(水肿因子)。
在一些方面中，前述段落中所述的任何组合物或包含前述段落中所述的融合蛋白的任何组合物用于治疗疼痛。治疗疼痛可包括施用前述段落中所述的不同组合物中多于一种(即数种)。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(Pad4)。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子(LFn)。可替代地，治疗疼痛通过向有需要的受试者施用有效量的组合物来执行，所述组合物包含：包含与梭状芽孢杆菌神经毒素的L链和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)的工程化融合蛋白；或包含与细胞内作用毒素(例如，AB型毒素)和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)的工程化融合蛋白。在一个实施方案中，包含梭状芽孢杆菌神经毒素的L链的融合蛋白可以还包含梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的区带，所述区带为H链的N末端区段。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的已被改变成阻断其天然受体结合功能的工程化突变体炭疽保护性抗原(mPA)部分，所述工程化突变体炭疽保护性抗原(mPA)部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。
在一个实施方案中，分子选自特异性结合NGF受体的抗体以及特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体。
在另一个实施方案中，细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、炭疽致死毒素(致死因子)和/或炭疽水肿毒素(水肿因子)。
在另一个方面中，本文描述一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，其包括向所述受试者施用工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)，其中mPA已被修饰(例如，以化学方式)或突变以便阻断其天然受体结合功能；以及可以靶向伤害感受器表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽致死因子(LF)组合的形式。
在一个实施方案中，PA或mPA以低聚物形式施用，其中低聚物PA或mPA由蛋白水解激活PA或mPA(或其突变体)形成以实现对带有受体的细胞的亲合力增加。在一个实施方案中，低聚物形式在施用之前结合所述分子。
在一个实施方案中，组合物在施用包含在药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中的炭疽保护性抗原(PA)的组合物之前、同时或之后单独施用。
在一个实施方案中，施用通过鞘内输注或脑室内输注或通过硬膜外注射到中枢神经系统中，或者通过使用皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射的外周施用来执行。
在另一个实施方案中，疼痛选自糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛、其他全身性疼痛病症、神经疼痛、关节疼痛、皮肤疼痛、内脏疼痛、膀胱疼痛和肌肉疼痛。
在另一个方面中，本文提供一种制造药物组合物的方法，所述药物组合物包含前述段落中所述的融合蛋白中一种或多种和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一个方面中，本文提供一种前述段落中所述的融合蛋白，其用于制造用于治疗疼痛的药物。在一个实施方案中，融合蛋白与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂配制。
在另一个方面中，本文提供一种前述段落中所述的融合蛋白，其用于治疗疼痛。在一个实施方案中，融合蛋白与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂配制。
附图简述
图1A-1B展示相较于其他神经系统组织，炭疽毒素受体在背根神经节中特异性表达。(图1A)11种神经组织类型的表达谱数据，显示Antxr2转录表达仅存在于发现伤害感受器神经元的背根神经节组织中。(图1B)Antxr2的原位杂交图像，显示强烈表达在背根神经节中但不在周围组织或脊髓中。
图2展示相较于本体感受器感觉神经元(大点和箭头)，Antxr2高度富集于伤害感受器神经元中。火山图(P值相对于差值倍数变化)显示Antxr2在伤害感受器感觉疼痛的神经元中相较于本体感受器神经元的强富集。
图3显示单独保护性抗原(PA)不抑制神经元中的蛋白质合成。
图4显示单独PA不抑制神经元中的蛋白质合成。
图5显示神经元中通过融合蛋白LFn-DTX的蛋白质合成抑制取决于PA的存在，且LFn-DTX能够在皮摩尔浓度下在伤害感受器神经元中细胞内阻断蛋白质合成。
图6显示PA和融合蛋白LFn-DTX抑制神经元中的蛋白质合成。
图7A显示使用BoTX蛋白质的各种结构域和不同PA来源蛋白的BoTX-PA融合蛋白的实施方案的分子构建。PA来源蛋白为Pad4结构域或PA，其耐蛋白酶诸如弗林蛋白酶裂解。
图7B显示使用TTX蛋白质的各种结构域和不同PA来源蛋白的TTX-PA融合蛋白的实施方案的分子构建。PA来源蛋白为Pad4结构域或PA，其耐蛋白酶诸如弗林蛋白酶裂解。
图8A显示包含BoTX和PA结合结构域LFn或EFn的融合蛋白的实施方案的分子构建。融合蛋白使用各种BoTX血清型的轻链/催化结构域与两种PA结合蛋白LF和EF的PA结合结构域制成。这些BoTX-PA结合融合蛋白将与天然PA蛋白结合用于治疗疼痛。
图8B显示包含TTX或其他细胞内作用毒素和PA结合结构域LFn或EFn的融合蛋白的实施方案的分子构建。这些融合蛋白使用TTX的轻链/催化结构域或各种其他细胞内作用毒素与两种PA结合蛋白LF和EF的PA结合结构域制成。
图9显示包含小的含二硫化物的毒素或抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素和PA来源蛋白的融合蛋白的实施方案的分子构建。PA来源蛋白为Pad4结构域或PA，其耐蛋白酶诸如弗林蛋白酶。
发明详述
缩写：ANTXR2(CMG2)＝炭疽毒素的细胞表面受体；PA＝炭疽毒素保护性抗原，83kDa；PA63＝来源于弗林蛋白酶裂解的PA的活性63kDa片段，自组装成环形七聚物或八聚物以形成受体结合的前孔(前孔)，PA63前孔结合至多三个或四个EF、LF、LFn或EFn，形成复合物，所述复合物然后被内吞；PAd1＝PA的LF/EF结合组分或片段；PAd2＝PA的膜易位组分或片段，炭疽来源的易位结构域或肽；PAd3＝PA的低聚反应组分或片段；PAd4＝PA与ANTXR1和ANTXR2受体的宿主细胞受体结合结构域，PA的天然受体；PA弗林蛋白酶-＝具有修饰或突变弗林蛋白酶识别位点的耐弗林蛋白酶PA，不能多聚化和易位，不结合LFn或EFn但仍可以结合宿主受体；ICK＝抑制剂半胱氨酸结；LFn＝炭疽毒素致死因子的N末端PA结合结构域，“炭疽毒素易位肽”；EFn＝炭疽毒素水肿因子的N末端PA结合结构域，还称为“炭疽易位信号肽”；LF＝炭疽致死毒素(致死因子)；EF＝炭疽水肿毒素(水肿因子)；mPA＝已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽保护性抗原部分；Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9＝离子通道蛋白；DTx＝包括毒素的A和B组分的白喉毒素，DTA＝仅毒素的A组分(酶组分)的白喉毒素，所述组分为细胞内作用毒素；PE或PTx＝铜绿假单胞菌外毒素A；BTx或BoTX或BoNT＝肉毒毒素；TTx＝破伤风毒素；CTx＝芋螺毒素；CNT＝梭状芽孢杆菌神经毒素家族；LC或L＝梭状芽孢杆菌神经毒素家族的神经毒素成员的50kDa轻链，L用作锌依赖性内肽酶；HC＝重链(HC＝HN+HC)，含有两个功能性结构域，每个约50kDa；HN＝HC的N末端一半，为梭状芽孢杆菌神经毒素家族的神经毒素成员的易位结构域。已知HN在脂双层中形成离子通道。HC＝HC的C末端一半，为梭状芽孢杆菌神经毒素家族的神经毒素成员的受体结合结构域；LHN＝L+HN。
除非本文另外定义，否则结合本申请使用的科学术语和技术术语将具有由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应了解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求限定。分子生物学中常见术语的定义可见于：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第19版,Merck Sharp&Dohme Corp.出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编),The Encyclopedia ofMolecular Cell Biology and Molecular Medicine,Blackwell Science Ltd.出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann,Elsevier出版,2006；Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编),Taylor&FrancisLimited,2014(ISBN 0815345305,9780815345305)；Lewin's Genes XI,Jones&BartlettPublishers出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385)；Current Protocols in Protein Science(CPPS),JohnE.Coligan(编),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe,(编)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735,9780471142737)，所述参考文献的内容以引用方式整体并入本文。
在本申请通篇所引用的所有专利和其他出版物(包括文献参考、颁布的专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)都出于描述和公开例如此类出版物中所述的可能结合本文所述的技术使用的方法的目的以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅因它们的公开内容在本申请的提交日期之前而加以提供。就此而言，任何事物都不应解释为认可由于先前发明或因为任何其他原因而使发明者无权先于所述公开。所有关于日期的陈述或关于这些文档的内容的表述都是基于可为申请人所用的信息且不构成关于这些文档的日期或内容的正确性的任何认可。
本公开的实施方案的描述不意图是详尽的或将本公开限于所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方案和实施例，但如熟习相关技术的技术人员所将认识到，在本公开的范围内，各种等效修改是可能的。例如，当以给定顺序呈现方法步骤或功能时，替代实施方案可以不同顺序执行功能，或者功能可以大致上同时执行。本文所提供的本公开的教导可适当时适用于其他程序或方法。可组合本文所述的各种实施方案来提供另外的实施方案。如有必要，本公开的多个方面可被修改，以采用以上参考文献和申请的组合物、功能和概念从而提供本公开的又另外的实施方案。此外，由于生物学功能等效考虑，可对蛋白质结构进行一些变化，而不以种类或量影响生物学或化学作用。可根据详细描述对本公开进行这些和其他变化。所有此类修改均意图包括在所附权利要求的范围内。
我们已经识别出一种新颖的治疗疼痛的方式，其利用感受疼痛的伤害感受器特异性递送平息疼痛的分子。
由炭疽杆菌(炭疽热的致病物)引起的皮肤病灶在特征上无痛。我们发现，感受疼痛的伤害感受神经元特异性表达高水平的ANTXR2(炭疽毒素的受体)，同时这种受体不被其他神经元亚型表达或大致上不被其他神经元亚型表达。炭疽毒素受体还被涉及关节重建的造血谱系细胞(巨噬细胞、破骨细胞、成骨细胞)表达。不受理论的束缚，我们认为炭疽毒素在通过伤害感受器感觉神经元上的ANTXR2起作用而感染期间使疼痛沉默，并且其还可用于靶向涉及关节重建的免疫细胞。
我们先前已经描述了一种靶向递送抗原(美国专利申请公布号20030202989)和蛋白质(WO2012096926)的系统，其使用不同的基于炭疽毒素的递送系统，包括结合其天然靶受体的炭疽受体已被消融的系统(美国专利申请公布号20150044210)。在这些系统中，开发了炭疽毒素的成孔能力以允许试剂进入到细胞中。炭疽毒素的受体结合部分被消融以允许根据使用者需要来工程化细胞结合特异性。
简而言之，炭疽毒素的受体结合组分(称为保护性抗原(PA))结合ANTXR2，被内吞并且随后将炭疽致死因子(LF)、或炭疽水肿因子(EF)或两者易位跨过内体膜到细胞溶质中。如本文所述，发明人惊奇地发现，在所有神经组织中主要的炭疽毒素受体ANTXR2在伤害感受神经元内的表达中具有高特异性，即炭疽毒素通过结合ANTXR2被优先地靶向伤害感受神经元。这种优先结合天然炭疽毒素的发现允许使用炭疽毒素和其特异性靶向伤害感受神经元的细胞溶质递送机制以产生高度特异性和有效的疼痛阻滞。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，不需要受体结合修饰，因为靶神经元表达炭疽系统天然结合的受体。在实施方案中任一项的一些方面中，通过使用另外的配体-受体相互作用，特异性可增加并且副作用可减少，这与炭疽毒素-ANTXR2相互作用一致。这里我们将炭疽毒素用作特异性阻断慢性疼痛、使肌肉痉挛沉默并且靶向和预防骨关节炎的疼痛和关节破坏的平台。本文所述的方法和组合物在利用炭疽毒素的受体结合部分直接递送到具体细胞型方面与早期炭疽-毒素递送系统不同，而不是仅使用毒素的成孔活性允许通过与任何天然炭疽毒素结合活性无关的手段使试剂进入到所靶向的细胞中。
慢性疼痛是社会中主要的社会经济学负担，极少靶向治疗可用于这类疼痛。伤害感受器感觉神经元介导有毒/伤害性刺激的检测，导致疼痛感和避开行为。在炎症期间或在神经损伤之后伤害感受器的持续激活引起慢性疼痛。我们提供蛋白质性毒素产生靶向分子实体以治疗疼痛的用途。
我们发现，炭疽毒素受体ANTXR2在伤害感受器上高度表达并且相较于其他神经元亚型，特异于这些神经元。这种发现表明，我们可以将炭疽毒素的保护性抗原(PA)或其受体结合结构域(PAd4)用作细胞特异性决定子以用于产生杀伤伤害感受器或以其他方式阻断其向中枢神经系统(CNS)发射信号的能力的构建体。
这种惊奇的策略的优点为靶向外周感受疼痛的神经元相较于其他疼痛治疗的特异性，其他疼痛治疗经常有对其他神经元亚型的脱靶效应。
我们描述工程化细胞内作用毒素诸如炭疽毒素、含二硫化物的肽毒素诸如抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素、AB型毒素诸如白喉毒素(DT)和SNARE靶向性毒素诸如破伤风毒素(TTx)和/或肉毒毒素(BTx)以用作靶向止痛药。在一些实施方案中，这些毒素依赖于这些毒素的细胞内酶活性向伤害感受器神经元中的PA介导的递送。
可用于工程化融合(嵌合)蛋白的模块化构建的毒素和其组分、部分和片段
炭疽毒素
炭疽毒素为细菌的毒性菌株(炭疽杆菌)分泌的三种蛋白质组分的三聚复合物。这三种蛋白质组分为保护性抗原(PA)、水肿因子(EF)和致死因子(LF)。PA为介导特异性受体靶向和结合的83kDa蛋白质。在结合其受体肿瘤内皮标志物-8(TEM8或“ANTRX1”)或毛细管形态发生蛋白2(CMG2或“ANTXR2”)时，PA83由弗林蛋白酶或其他弗林蛋白酶类蛋白酶蛋白水解激活，去除N末端段(PA20)并且留下结合受体的其余段(PA63)。这样激活PA，使其能够多聚化以形成结合多达4个EF/LF分子的七聚物/八聚物。PA63自发地多聚化以形成环形七聚或八聚“前孔”，其含有能够以高nM亲和力结合LF或EF的结合位点。LF和EF(各自约90kDa)具有同源的约260个残基N末端结构域，所述结构域结合前孔；LF和EF的酶部分是C末端的。所得复合物通过内吞并且在低pH内体下被内化，PA63前孔改变构象，插入到膜中并且将结合的货物分子(LF/EF)转运到细胞溶质，在细胞溶质中货物分子再折叠并且催化其相应反应。LF为锌依赖性内肽酶，其催化某些有丝分裂素激活的蛋白激酶激酶(MAP激酶/ERK激酶；还称为MAP激酶激酶)的水解(裂解)，并且这样引起许多细胞信号传导途径的破坏，从而最终引起细胞死亡。EF为钙调素和钙依赖性腺苷酸环化酶，其将cAMP增加至细胞中不平常的水平。细胞内cAMP的变化影响膜渗透性并且可以导致水肿。在巨噬细胞和中性粒细胞中，另外的影响是ATP储备的消耗，ATP储备为吞没(engulfment)过程所需的。这是可在炭疽毒素的情况下发生的可能组合的清单：PA+LF引起致死活性；EF+PA引起水肿；EF+LF对细胞无毒性作用；以及PA+LF+EF引起受影响细胞的致死活性和水肿。LF由N末端PA结合结构域(本文缩写为“LFPABD”或“LFn”)和C末端蛋白水解组分组成。LF通过裂解有丝分裂素激活的蛋白(MAP)激酶激酶来起作用。EF由N末端PA结合结构域(本文缩写为“EFPABD”或“EFn”)、中央酶组分和C末端钙调素结合组分组成。EF为钙依赖性腺苷酸环化酶，其升高细胞cAMP水平。MAP激酶和cAMP信号传导均已发现在介导伤害感受器信号传导中为关键的。
PA具有分布在四个结构上不同的结构域的四个主要功能：LF/EF结合组分(PAd1)、膜易位组分(PAd2)、低聚反应组分(PAd3)和宿主细胞受体结合组分(PAd4)。
如本文所用，“炭疽毒素保护性抗原”或“PA”是指以低聚物形式特异性并且选择性结合ANTXR2受体，随后在细胞膜中形成孔并且易位货物毒素的多肽。PA的序列在本领域中是已知的，例如，(NCBI基因ID号：3361714(SEQ ID NO:1；在N末端29个氨基酸残基肽序列为信号肽：MKKRKVLIPLMALSTILVSSTGNLEVIQA(SEQ ID NO:34)(NCBI参考序列：NP_052806；UNIPROT P13423)。氨基酸残基的编号可参考具有信号肽的SEQ.ID.NO:1。可替代地，氨基酸残基的编号可参考不具有信号肽的PA序列。PA结合宿主细胞表面ANTXR2受体并且通过弗林蛋白酶家族蛋白酶裂解成63kDa PA形式(PA63)，其自组装成环形七聚物或八聚物以形成受体结合前孔。PA63前孔结合多达三个或四个分子的例如炭疽致死因子，形成复合物，所述复合物然后被内吞。在内体的酸化时，保护性抗原前孔经历构象重排以形成跨膜的、离子传导性的孔，所述孔将炭疽致死因子和/或炭疽水肿因子从内体易位到细胞溶质。LFn(炭疽致死因子的N末端结构域)对孔具有纳摩尔结合亲和力，并且这种结构域(或对应EF结构域，EFn)可单独用于化学部分的易位。
弗林蛋白酶家族蛋白酶裂解位点为164RKKR167，并且在167RS168之间发生裂解，氨基酸残基编号参考减去29个氨基酸信号肽的SEQ.ID.NO:1。为了去除弗林蛋白酶位点以得到耐弗林蛋白酶的PA，可用SSSR(SEQ ID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)(以消除所有碱性残基)代替RKKR(减去SEQ ID NO:1中29aa信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167)。去除弗林蛋白酶裂解位点以产生耐弗林蛋白酶的PA(PA弗林蛋白酶-)将防止多聚化和易位。
如本文所用，“炭疽毒素水肿因子”或“EF”是指钙调素依赖性和Ca2+依赖性腺苷酰环化酶，其升高细胞内cAMP的水平。EF的序列是已知的，例如NCBI基因ID：3361726；SEQ IDNO:6。
如本文所用，“炭疽毒素致死因子”或“LF”是指裂解MAP激酶家族的大部分成员的金属蛋白酶。LF的序列是已知的，例如NCBI基因ID：3361711；SEQ ID NO:7。对于EF和LF的进一步讨论，参考例如Leppla,79PNAS,3162(1982)；Duesbery等人,280 Science 734(1998)；Vitale等人,248Biochem.Biophys.Res.Commn.706(1998)；其中每个均以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“炭疽易位信号肽”或“炭疽毒素易位肽”是指当被多肽所包含和/或连接多肽时使所述多肽结合PA或mPA(任选地低聚物复合物中的PA或mPA)并且被成熟PA/mPA易位到靶细胞的细胞质的炭疽来源的结构域或肽。在一些实施方案中，炭疽毒素易位肽可为LFn(例如，SEQ ID NO:7的氨基酸34-267、34-293或34-297，全长LF具有其N末端信号肽)、EFn(例如，SEQ.ID.NO:6的氨基酸59-277或34-290)或其变体。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，模拟LFn或EFn的小的带正电的肽区段可用于通过PA或mPA孔使货物分子易位。这些模拟物可由至少一个非天然的氨基酸组成并且更详细地描述于例如临时专利公布WO 2012/096926；美国专利号：9079952以及美国专利申请公布号：US 2013/0336974和US 2015/0267186，其中每个均以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“PAd4”或“保护性抗原结构域4”是指识别并且结合宿主细胞细胞受体(例如ANTXR1和/或ANTXR2)的PA的结构域。PAd4可包含从SEQ ID NO:1的约氨基酸621至约氨基酸764的序列(PAd4序列包括信号肽)。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，PAd4可包含SEQ ID NO:1的氨基酸621-764，其为具有信号肽的PA的氨基酸序列。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，PAd4可包含SEQ ID NO:1的氨基酸596-735。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4可包含SEQ ID NO:1的氨基酸625-764。在本文所述的所有方面的另一个实施方案中，PAd4可包含SEQ ID NO:1的氨基酸616-764。在本文所述的所有方面的另一个实施方案中，PAd4可包含SEQ ID NO:1的氨基酸609-764。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4包含RFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:35)。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4基本上由RFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:36)组成。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4包含FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:37)。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4基本上由FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:38)组成。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4包含GLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:39)。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，PAd4基本上由GLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:40)组成。
在本文所述的融合蛋白的所有方面的一个实施方案中，PAd4通过接头肽融合或接合另一蛋白质或毒素。接头肽的实例包括：FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:41)、VEIEDTE(SEQ ID NO:42)、KDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:43)、STEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:44)和VGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:45)。
连接PAd4的N末端的接头肽的实例显示如下，其中接头肽序列以粗体显示：
FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:46)
VEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:47)
KDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:48)
STEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:49)
VGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG(SEQ ID NO:50)
SNARE靶向性毒素(包括BTx和TTx)
肉毒神经毒素(BTx，还缩写为BoTX或BoNT)引起肉毒中度，其特征在于由神经肌肉接点处乙酰胆碱释放的抑制所致的弛缓性瘫痪下降。梭状芽孢杆菌属细菌产生七种肉毒神经毒素血清型(A–G)。此外，来自非梭状芽孢杆菌属大米魏斯氏菌(Weissella oryzae)SG25T的肉毒类神经毒素最近已被发现(Nature Scientific Repo.Rts|6:30257|DOI:10.1038/srep30257)。BTx与破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)产生的破伤风神经毒素(TTx)组成梭状芽孢杆菌神经毒素(CNT)家族。TTx表现出与BTx(尤其是BTx/B)的高度序列和结构同源性，并且为破伤风(其特征在于痉挛性瘫痪)的致病物。尽管临床表现不同，但是基本的作用模式(抑制神经传递)是所有CNT共同的。通过CNT抑制神经递质释放由特异性裂解构成胞吐过程的一组蛋白质SNARE蛋白(可溶性NSF连接蛋白受体)引起。SNARE蛋白中一种或多种的裂解引起囊泡内容物释放到细胞外环境中的阻断。
这些SNARE靶向性毒素共有类似基本的CNT结构。CNT被合成为约150kDa的单链多肽(海参毒素)并且随后被裂解以形成双链分子，所述双链分子由通过单个二硫键连接的轻链(LC)和重链(HC)构成。50-kDa LC起到锌依赖性内肽酶的作用。重链含有两个功能结构域，每个为约50kDa。N末端一半(HN)为易位结构域，已知其在脂双层中形成离子通道，并且C末端一半(HC)为神经节苷酯和蛋白质结合结构域，其在结合靶细胞膜和毒素分子内化到胆碱能神经元中起关键作用。三个功能结构域结构上不同并且以线性方式排列，使得LC结构域与HC结构域之间无接触。总体而言，BTx和TTx共有约35％序列同一性。BTx催化LC结构域共有多达36％序列同一性[2]，并且BTx/B和TTx的LC结构域具有高于50％同一性。(参见综述K.Turton等人的“Botulinum and tetanus neurotoxins:structure,function andtherapeutic utility”,Trends in Biochemistry,2002,27:552-558)。合适于裂解海参毒素以形成双链毒素的蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。
BTx(细菌肉毒梭状芽孢杆菌所产生的神经毒性蛋白)表达为大的、单个多肽分子，其具有三个不同的结构域：50kDa蛋白水解N末端端部(LC)、位于中间的50kDa易位结构域(HN)和50kDa宿主细胞受体结合C末端端部(HC)。对于要起作用的毒素，首先必须将其蛋白水解裂解以产生由轻链(LC)和重链(HC＝HN+HC)组成的双链蛋白，所述轻链和所述重链通过单个二硫键保持在一起。蛋白水解激活是重要的，因为在受体结合和通过内吞而内化之后，内体的随后激活被认为造成蛋白质的构象变化，引起HN结构域向内体膜中的插入，形成易位孔和LC向细胞质中的递送，其中二硫键被还原并且LC被释放。LC为具有高特异性底物特异性的锌依赖性蛋白酶。有多种BTx血清型(A至G)和亚血清型(每个给定血清型多达12种)。血清型基于中和抗体中和肉毒神经毒素的能力。至今已识别出肉毒神经毒素的7种血清型，标记为A至G(BTx/A至BTx/G)。随着下一代测序的出现，已经识别出在血清型内有BoNT的亚型，这些被定义为在蛋白质水平下与其他毒素的序列差异>2.5％的毒素。至今在七种血清型中识别出BoNT的高于40种亚型。不同的血清型具有不同的底物特异性：BTx/A和BTx/E裂解SNAP-25，血清型/B、/D、/F和/G裂解小突触泡蛋白/VAMP。BTx/C裂解SNAP-25和突触融合蛋白1A。这些底物为SNARE(SNAP(可溶性NSF连接蛋白)受体)蛋白，其在突触前神经末梢的神经递质释放起关键作用并且对于从所有真核细胞的囊泡分泌是关键的。
BTx的三个结构域(LC、HN、HC)在功能上和结构上均不同，并且本领域中已定义每种亚血清型的每个结构域的边界。(参见综述K.Turton等人的“Botulinum and tetanusneurotoxins:structure,function and therapeutic utility”,Trends inBiochemistry,2002,27:552-558；此文献参考以引用的方式整体并入本文)。每个50kDa结构域可以例如在嵌合蛋白中彼此独立地起作用。HN结构域具有绕在LC周围的“区带”区，这样被认为表现为假抑制剂并且在LC易位期间具有伴侣蛋白功能。各种血清型的BTx的HN的区带区或TTx的区带区显示于表1中。
肉毒神经毒素序列的衍生
对于不具有所公布结构的BTx和TTx分子，使用结构同源性建模模型LOOPP(可在loopp机构网站获得)来基于BTx/A1获得预测结构(3BTA.pdb)。由此，以及通过ClustalOmega的所有BTx亚血清型的序列比对，有可能确定结构域之间的转变点。至今所识别的BTx血清型和亚型的Clustal BTx序列比对提供在本文档的结尾。
LHN＝肉毒神经毒素催化结构域(LC)+易位结构域(HN)
每种亚血清型的LHN结构域是本领域中已知的，例如，L HN/A1(残基1-872)和LHN/B1(残基1-859)。
LC或L＝肉毒神经毒素催化结构域(50kDa，pI约6.3-8.1)
每种亚血清型的LC结构域先前已在US 2007/0166332(据此以引用的方式整体并入)中识别，例如，LC/A1(残基1-448)和LC/B1(残基1-441)，并且概述于以下表1中。
表1
上文所识别的参考序列应认为是指导，因为可能根据亚血清型发生稍微变化。通过举例的方式，US 2007/0166332(据此以引用的方式整体并入)引用稍微不同的梭状芽孢杆菌序列：
LC(具有针对SNARE的催化或酶活性)：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K448
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K441
C1型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K449
D型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-R445
E型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-R422
F型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K439
G型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K446
破伤风神经毒素：氨基酸残基M1-A457
HN结构域：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基A449-K871
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基A442-S858
C1型肉毒神经毒素：氨基酸残基T450-N866
D型肉毒神经毒素：氨基酸残基D446-N862
E型肉毒神经毒素：氨基酸残基K423-K845
F型肉毒神经毒素：氨基酸残基A440-K864
G型肉毒神经毒素：氨基酸残基S447-S863
破伤风神经毒素：氨基酸残基S458-V879
抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素
如本文所用，“抑制剂半胱氨酸结毒素”或“ICK毒素”是指包含半胱氨酸结基序并且调节受体和/或离子通道靶标的活性的毒素。抑制剂半胱氨酸结(ICK)为含有三个二硫桥键的蛋白质结构基序。两个二硫化物连同它们之间的多肽的节段形成环，第三二硫键(连接序列中的第3和第6个半胱氨酸)穿过所述环，形成结(因此别名为结肽(knottin))。所述基序为无脊椎动物毒素诸如来自蛛形动物和软体动物的毒素中共有的。所述基序还存在于植物中存在的一些抑制剂蛋白中，但是所述植物和动物基序被认为是趋同进化的产物。ICK基序为非常稳定的蛋白质结构，其耐热变形和蛋白水解。毒液的ICK肽组分靶向电压门控离子通道，但是所述家族的成员还充当抗菌剂和溶血剂。植物ICK蛋白经常为蛋白酶抑制剂。ICK毒素通常存在于例如鸡心螺、蜘蛛和蝎子的毒液中。在一些实施方案中，ICK毒素为含二硫化物的肽毒素。这些含二硫化物的肽毒素具有30-70之间个氨基酸残基。在本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，ICK毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
虎纹捕鸟蛛毒素为来自中国捕鸟蛛(Chinese bird spider)的7种类型的ICK毒素(HWTX-1、HWTX-III、HWTX-IV、HWTX-X、HWTX-II、HWTX-VII、HWTX-VIII)，其作用于电压门控钙通道。
δ-岩沙海葵毒素由来自蜘蛛的4种类型的ICK毒素(IT1、IT2、IT3、IT4)组成，其作用于电压门控钠通道。
芋螺毒素为来自鸡心螺的小的、10-30个残基肽ICK毒素，其作用于电压门控钙和钠通道。已知这些毒素中的一些细胞外起作用以调节离子通道的活性。实例为W-芋螺毒素GVIA和W-芋螺毒素MVIIC。
如本文所用，“芋螺毒素”是指由海洋鸡心螺(例如芋螺属)产生的毒素。一些芋螺毒素可以调节离子通道活性。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，芋螺毒素可为离子通道调节剂。芋螺毒素的非限制性实例可包括δ-芋螺毒素(例如NCBI ID:AKD43185；SEQID NO:10；进一步讨论参见例如Leipold等人FEBS Letters 2005 579:3881-4，其以引用的方式整体并入本文)，已知其阻断电压依赖性钠通道；μ-芋螺毒素(例如Swiss-Prot ID:P15472.1；SEQ ID NO:9；进一步讨论参见例如Li和Tomaselli.Toxicol.2004 44:117-122；其以引用的方式整体并入本文)，其也阻断电压依赖性钠通道；或ω-芋螺毒素M VII A(例如NCBI ID:ADB93081；SEQ ID NO:8；进一步讨论参见例如Nielsen等人MolecularRecognition 2000 13:55-70，其以引用的方式整体并入本文)(例如ziconotide)，已知其阻断N型电压依赖性钙通道。ICK毒素的另外非限制性实例包括例如诗马毒素(psalmotoxin)-1、β-TRTX-Tp2a和印防己毒素(purotoxin)-1并且在文献中有所描述(参见例如，美国专利公布20120277166、20120220539、20120087969、20050214903和20050143560；Craik等人Toxicon 2001 39:43-60；Zhu等人FASEB Journal 2003 17:1765-7；Daly和Craik.Current Opinion in Chemical Biology 2011 15:362-368；Grishin.European Journal of Biochemistry 1999 264:276-280；Liang等人Toxicon2004 43:575-585；Kolmar FEBS Journal 2008 275:2684-2690；Saez等人Toxins 2010 2:2851-2871；Vetter等人Amino Acids 2011 40:15-28；Alewood等人Australian Journalof Chemistry 2003 56:769-774；King.Expert Opinion on Biological Therapy 201111:1469-1484；King等人Toxicon 2008 52:264-276；Herzig等人Nucl.Acids Res 2010；Szeto等人FEBS Letters 2000 470:203-299；以及Bergeron和Bingham.Toxins 2012 4:1082-1119；每个文献均以引用的方式整体并入本文)。
以下为来自ICK毒素的半胱氨酸结的实例，所述半胱氨酸结可以连接PAd4、mPA、PA弗林蛋白酶-、LFn、EFn或其他伤害感受器结合蛋白等以用于递送到伤害感受器神经元。
W-芋螺毒素GVIA：CKSXGSSCSXTSYNCCRSCNXYTKRCY(SEQ ID NO:51)(修饰：X＝Hyp，二硫桥键在1-16、8-19、15-26之间，Tyr-27＝C末端酰胺)
W-芋螺毒素MVIIC：CKGKGAPCRKTMYDCCSGSCGRRGKC(SEQ ID NO:52)(修饰：二硫桥键在1-16、8-20、15-26之间，Cys-26＝C末端酰胺)
W-漏斗网蛛毒素IVA：KKKCIAKDYGRCKWGGTPCCRGRGCICSIMGTNCECKPRLIMEGLGLA(SEQ ID NO:53)(修饰：二硫桥键在4-20、12-25、19-36、27-34之间)
W-漏斗网蛛毒素TK：EDNCIAEDYGKCTWGGTKCCRGRPCRCSMIGTNCECTPRLIMEGLSFA(SEQID NO:54)(修饰：二硫桥键在4-20、12-25、19-36、27-34之间)
虎纹捕鸟蛛毒素IV：ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQI(SEQ ID NO:55)(修饰：二硫桥键：2-17、9-24、16-31)(修饰：Ile-35＝C末端酰胺)
ProTx II：YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW(SEQ ID NO:56)(修饰：二硫桥键：2-16、9-21、15-25)
AB毒素
AB毒素为许多致病菌所分泌的两组分蛋白质复合物。它们由于其组分而称为AB毒素：“A”组分通常为“活性”部分，并且“B”组分通常为“结合”部分。“A”亚单元具有酶活性，其中发现了催化结构域或活性被发现，并且在膜结合转运“B”亚单元的构象变化之后被转移至宿主细胞。在某些梭状芽孢杆菌属所产生的毒素中为二元外毒素。这些蛋白质由两种独立多肽组成，所述多肽对应于A/B亚单元部分。酶组分(A)通过低聚物结合/易位蛋白(B)所产生的内体进入细胞，并且通过单体G-肌动蛋白的ADP核糖基化防止肌动蛋白聚合。
二元毒素家族的“A”组分的实例包括产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)ι毒素Ia、肉毒梭状芽孢杆菌C2毒素CI和艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)ADP-核糖基转移酶。其他同源蛋白质存在于螺旋形梭状芽孢杆菌(Clostridium spiroforme)。
二元毒素家族的“B”组分(又称结合或转运组分)的实例包括本文所述的炭疽杆菌保护性抗原(PA)蛋白。
白喉毒素(DT)也是AB毒素。其通过真核延伸因子2的磷酸化抑制宿主细胞中的蛋白质合成，真核延伸因子2为蛋白质合成的基本组分。铜绿假单胞菌的外毒素A为靶向真核延伸因子2的AB毒素的另一个实例。
工程化融合嵌合蛋白
BTx/TTx-PAd4/PA融合蛋白
本文涵盖一种BTx或TTx，其融合PAd4以允许通过PAd4结合将TTx或一个或另一个BTx的作用重引导至伤害感受器。此涵盖其中受体结合结构域被炭疽PA的受体代替的BTx。在此构建体中，我们用仍然可以结合受体ANTXR2的PA的C末端受体结合结构域(PAd4或PA63)或任何PA片段代替BTx的C末端结合域。BTx轻链(酶部分涵盖在L链中)和易位结构域(HN)连接PA的受体结合结构域。(参见图7A)PA的C末端受体结合结构域(例如PAd4)将构建体/融合蛋白与伤害感受器上的ANTXR2受体结合并且介导向内体的运输，此时BTx成孔结构域(HN)插入到膜中并且介导BTx L链向细胞溶质的易位，在细胞溶质中其裂解SNARE并且阻断神经递质释放。PA将靶向其受体ANTXR2(CMG2)，并且肉毒毒素HN结构域将引发成孔、易位和酶部分以阻断突触功能。在一些实施方案中，这种策略需要肉毒或破伤风毒素在细胞外和细胞内均起作用。在一些实施方案中，这种策略需要毒素被Lys-C酶预激活。这种方法可以类似于破伤风毒素的重链和轻链结构域中的易位结构域来应用。(参见图7B)。合适于裂解接点的其他蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。
因此，在一个方面中，工程化融合蛋白包含(a)PAd4和(b)BTx或TTx，其中PAd4与BTx或TTx融合或连接。BTx或TTx为SNARE靶向性蛋白酶。在一个实施方案中，工程化融合蛋白包含(a)PAd4和(b)SNARE靶向性蛋白酶，其中PAd4与SNARE靶向性蛋白酶融合或连接。在工程化融合蛋白的一个实施方案中，用PA代替PAd4结构域。在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式。在另一个方面中，我们提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)PAd4和(b)SNARE靶向性蛋白酶，其中PAd4与SNARE靶向性蛋白酶融合或连接。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)PAd4和(b)BTx或TTx，其中PAd4与BTx或TTx融合或连接。在组合物的另一个实施方案中，工程化融合蛋白的PAd4结构域包括PA而不是PAd4。在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式。在本文所述的融合多肽组合物中任一种的另一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4或PA用肽接头与TTx、BTx或SNARE靶向性蛋白酶连接。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4或PA可代替BTx或TTx神经毒素的天然受体结合结构域，或融合BTx或TTx神经毒素之一的其中天然受体结合功能已通过突变消融的形式。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶包含完整的蛋白(即海参毒素)，其中天然受体结合功能已通过突变消融。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶基本上由完整的蛋白(即海参毒素)组成，其中天然受体结合功能已通过突变消融。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶由完整的蛋白(即海参毒素)组成，其中天然受体结合功能已通过突变消融。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶包含蛋白质的仅一部分而不是海参毒素(例如海参毒素蛋白的一个或两个结构域)，基本上由上述组成或由上述组成。例如，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶元素可基本上由TTx、BTx或SNARE靶向性蛋白酶的LC和HN(LHN)组成。
在另一个方面中，本文描述一种融合蛋白，其包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)部分，其包含N末端酶结构域(LC)；以及(b)BTx的中间成孔/易位结构域(HN)；以及(c)炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中(a)部分-(c)部分连接在一起，例如通过如本文所述的接头肽连接在一起。换句话讲，BTx的L HN通过接头肽融合PA的PAd4结构域，其中PAd4为炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域。在融合蛋白的一个实施方案中，包括PA而不是PAd4。在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式。在另一个方面中，本文描述一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)部分，其包含N末端酶结构域(LC)；以及(b)BTx的中间成孔/易位结构域(HN)；以及(c)炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中(a)部分-(c)部分连接在一起。在一个实施方案中，组合物在融合蛋白中包括PA代替PAd4结构域。在另一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式。在本文所述的所有方面的另一个实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，BTx部分选自以下梭状芽孢杆菌BTx血清型中任一种的BTx轻链(LC)和重链(HC)结构域：BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素。
在另一个方面中，本文描述一种融合蛋白，其包含：(a)破伤风神经毒素(TTx)的N末端酶结构域(LC)；(b)TTx的易位/成孔结构域(HN)；以及(c)炭疽毒素保护性抗原(PAd4结构域)的C末端受体结合结构域，其中融合蛋白的(a)部分-(c)部分连接在一起，例如，通过本文所述的接头肽可操作地连接在一起。换句话讲，TTx的LHN通过接头肽融合PA的PAd4结构域，其中PAd4为炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域。在另一个实施方案中，本文所述一种融合蛋白，其包含：(a)破伤风神经毒素(TTx)的N末端酶结构域(LC)；(b)TTx的易位/成孔结构域(HN)；以及(c)炭疽毒素保护性抗原(PAd4结构域)的C末端受体结合结构域，其中融合蛋白的(a)部分-(c)部分连接在一起，例如，通过本文所述的接头肽可操作地连接在一起。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，对应于TTx的轻链与TTx的重链之间的接点的氨基酸残基已被裂解。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，对应于与BTx(包括血清型)的HC或与TTx的LC接点的氨基酸残基已被裂解。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，对应于与BTx(包括血清型)的HN或与TTx的LC接点的氨基酸残基已被裂解。裂解通过蛋白酶进行，蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。
在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，BTx部分包含BTx或TTx酶部分和易位肽/结构域。在一个实施方案中，酶部分和易位肽/结构域通过接头肽连接。在包括BTx部分(其包含BTx或TTx酶部分和易位肽/结构域)的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，酶部分和易位肽/结构域通过用蛋白酶(例如Lys-C)裂解来分离。在包括BTx部分(其包含通过接头肽连接的BTx或TTx酶部分和易位肽/结构域)的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，酶部分和易位肽/结构域通过例如用蛋白酶(例如Lys-C)裂解来分离。裂解起激活融合蛋白中的酶部分和易位肽/结构域的作用。
在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链和HN结构域、基本上由其组成或由其组成，L链与HN结构域之间的S-S桥不减少。在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链但无HN结构域、基本上由其组成或由其组成，在海参毒素中L链和对应于BTx HN结构域的N末端部分的区带(如果存在的话)中的Cys残基可改变成Ala、Ser或Thr。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的N末端还包含至少一个D-氨基酸。N末端中的D-氨基酸用于降低融合蛋白的潜在免疫原性。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4用肽接头与LHN连接。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在一个实施方案中，将来自PA的N末端侧相邻于天然PAd4结构域的约1-60个连续氨基酸进一步并入到融合蛋白的酶/成孔结构域与受体结合PAd4融合配偶体。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的C末端，并且LHN位于融合蛋白的N末端。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的N末端。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的N末端和C末端，其中LHN(LC和HN)夹在两个PAd4结构域之间。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，融合蛋白中有多于一个PAd4结构域，例如两个至十个PAd4结构域、一个至五个PAd4结构域或两个至五个PAd4结构域。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，其中存在多个PAd4结构域，所述多个PAd4结构域串联排列。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，所述多个PAd4结构域通过肽接头连接。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。
BTx/TTx-LFn/EFn融合蛋白
当组合地使用时，天然PA和融合蛋白(其包含融合TTx的催化结构域或BTx的多种形式/血清型中一个或另一个的催化结构域的LFn)可涉及通过神经递质破坏伤害感受器神经元中的细胞内信号传导或阻断突触传递。(参见图8A和8B)这些构建体使用催化结构域的蛋白水解活性裂解SNARE蛋白，从而阻断神经递质释放而不杀伤伤害感受器或旁邻(bystander)细胞。TTx或者毒素的BTx或CNT家族的各种形式/血清型中一种或另一种为SNARE靶向性蛋白酶。因此，在一个方面中，工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)SNARE靶向性蛋白酶。在一个实施方案中，工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)TTx或BTx。在本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，LFn用接头肽与TTx、BTx或SNARE靶向性蛋白酶连接。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)TTx或BTx。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)SNARE靶向性蛋白酶。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，融合蛋白组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn用接头肽与TTx、BTx或SNARE靶向性蛋白酶连接。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的C末端。在本文所述的工程化融合蛋白的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端和C末端，其中TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶夹在两个LFn之间。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，包括EFn而不是LFn。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶包含完整的蛋白(即海参毒素)。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶基本上由完整的蛋白(即海参毒素)组成。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶由完整的蛋白(即海参毒素)组成。含有海参毒素的融合蛋白需要通过蛋白水解裂解来激活。合适于激活海参毒素的蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。合适于裂解接点的蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶包含蛋白质的仅一部分而不是海参毒素(例如海参毒素的结构域)，基本上由上述组成或由上述组成。例如，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶可基本上由TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶的LC或LC和HN(LHN)组成。例如，TTx或BTx或SNARE靶向性蛋白酶可以基本上由LC加位于海参毒素的N末端的区带区段组成，所述区带区段存在于L链与HN链之间。在所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，BTx选自以下血清型中任一种的BTx轻链(LC)和重链(HC)结构域：BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素。在所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，BTx选自表1的BTx轻链(LC)和重链(HC)结构域，作为非限制性实例，参见SEQ.ID.NO:29-31。
因此，在一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)的酶部分或破伤风神经毒素(TTx)的酶部分；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)；或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)。BTx的酶部分位于肉毒神经毒素海参毒素的N末端。在一个实施方案中，本文提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)的酶部分或破伤风神经毒素(TTx)的酶部分；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)；或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中PA或PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。在一个实施方案中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其PA片段的蛋白，其中PA或PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在如本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶包含梭状芽孢杆菌神经毒素L链(LC)或非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素L链。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，梭状芽孢杆菌神经毒素L链(LC)或非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素L链为酶部分。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶选自由以下任一种的BTx轻链结构域组成的组：BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G、第一非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素和TTx。例如，非细胞毒性蛋白酶可选自由以下组成的组：BTx/A LC(a.a.1-448)、BTx/B LC(a.a.1-441)、BTx/C LC(a.a.1-449)、BTx/D LC(a.a.1-442)、BTx/E LC(a.a.1-422)、BTx/F LC(a.a.1-436)和BTx/G LC(a.a.1-442)。例如，BTx轻链可选自本文所述的SEQ ID NO:20-28或表1。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，梭状芽孢杆菌神经毒素为BTx或TTx。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，在伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，能够结合PA的蛋白质为：(i)炭疽毒素致死因子(LF)；或(ii)炭疽毒素水肿因子(EF)。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LF的PA结合结构域为LF的N末端结构域(缩写为LFPABD或LFn)。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，EF的PA结合结构域为EF的N末端结构域(缩写为EFPABD或EFn)。
在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn和EFn为结合PA63的低聚物形式(炭疽PA的蛋白水解激活形式)的结构域。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，酶结构域为本文所述的BTx或TTx的LC。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，酶结构域在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端连接LFn或EFn。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn通过肽接头与BTx或TTx的酶结构域或LC连接。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的N末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的C末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的N末端和C末端，其中BTx或TTx的N末端酶结构域或LC夹在两个LFn或EFn之间。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，融合蛋白可以还包含定义对应于BTxHN结构域的N末端部分的区带的氨基酸序列，其中HN结构域位于BTx的C末端侧。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，其中融合蛋白包含BTx或TTx的L和HN，例如氨基酸1-872(SEQ.ID.NO:29)，对应于与BTx的HN的LC接点的氨基酸残基已被裂解。合适于裂解接点的蛋白酶包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链和HN结构域、基本上由其组成或由其组成，L链与HN结构域之间的S-S桥不减少。在包括BTx部分的融合蛋白中任一种的一个实施方案中，其中BTx部分包含BTx的L链但无HN结构域、基本上由其组成或由其组成，在海参毒素中L链和对应于BTx HN结构域的N末端部分的区带(如果存在的话)中的Cys残基已改变成Ala、Ser或Thr。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的N末端还包含至少一个D-氨基酸。D-氨基酸可以通过分选酶(Sortase)反应加入并且更详细地描述于以下中，例如，国际专利公布WO 2012/096926；美国专利号：9079952和美国专利申请公布号：US 2013/0336974和US 2015/0267186，每个文献均以引用的方式整体并入本文。
在包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，这些融合蛋白与非融合PA一起使用，或与第二融合蛋白一起使用，所述第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将毒素引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。换句话讲，在一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与单独的非融合PA多肽向受试者共同施用以治疗疼痛。在另一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与第二融合蛋白向受试者共同施用以治疗疼痛。第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将含有毒素的第一融合蛋白引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。在第二融合蛋白的一些实施方案中，PA为变体(mPA)，其为不结合如本文所述的ANTXR2受体的修饰或突变形式。
然后，在一个方面中，本文提供一种组合物，其包含：
(I)第一融合蛋白，其包含(a)肉毒神经毒素(BTx)部分的肉毒神经毒素N末端酶结构域(酶结构域)或破伤风神经毒素(TTx)部分(酶结构域)；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)；以及
(II)第二蛋白，其包含(c)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段和任选地(d)伤害感受器神经元结合蛋白，
其中(a)部分和(b)部分通过肽接头接合，并且其中当(d)部分存在时，(c)部分和(d)部分也通过肽接头接合。在所述的组合物的一个实施方案中，当第二蛋白为融合蛋白时，PA为PA的突变变体mPA。
在本文所述的毒素蛋白、毒素融合蛋白或融合蛋白组合物中任一种的一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在包含接头肽的组合物的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。能够结合LFn或EFn的PA片段的非限制性实例为PA63。在一个实施方案中，PA为蛋白低聚物PA。在一个实施方案中，PA为天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在本文所述的组合物的一个实施方案中，PA为低聚物PA，其可结合融合蛋白。在一个实施方案中，此组合物可用于治疗疼痛诸如神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛以及糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症。在另一个实施方案中，此组合物可用于制造用于治疗疼痛的药物。
AB毒素-LFn/EFn融合蛋白
以组合形式的天然PA和融合蛋白LFn-DT可以使用白喉毒素(DT)的催化结构域(又称“A”组分或“A”部分)引导至伤害感受器神经元以阻断蛋白质合成。DT为AB型毒素。因此，在一个方面中，工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)DT。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)DT。在融合蛋白的一个实施方案中，LFn用肽接头连接DT。在融合蛋白的一个实施方案中，DT包含SEQ.ID.NO:2中存在的A部分和B部分。在一个实施方案中，DT为DTA，其包含SEQ ID NO:2中存在的A部分(活性的催化/酶结构域)。DTA氨基酸序列包括白喉毒素的残基1-193。在包含LFn的工程化融合蛋白的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端。在包含LFn的工程化融合蛋白的另一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的C末端。在包含LFn的工程化融合蛋白的另一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端和C末端，其中DT夹在两个LFn之间。在另一个实施方案中，用EFn代替LFn。因此，在一个实施方案中，工程化融合蛋白包含(a)EFn和(b)DT。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)EFn和(b)DT。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一些实施方案中，其他细胞内作用毒素(诸如植物毒素、蓖麻毒素或含二硫化物的肽毒素诸如ICK毒素)的催化结构域可代替DT融合LFn，得到工程化融合蛋白诸如LFn-PE(PTx)、LFn-芋螺毒素、LFn-蓖麻、LFn-霍乱毒素、LFn-漏斗网蛛毒素、LFn-δ-岩沙海葵毒素、LFn-虎纹捕鸟蛛毒素、LFn-蝎子长链毒素和/或LFn-志贺毒素。因此，在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn与另一种毒素连接，所述另一种毒素为细胞内作用毒素。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，细胞内作用毒素选自由以下组成的组：蓖麻毒素、PE、芋螺毒素、霍乱毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素、志贺毒素、蝎子长链毒素和蝎子短链毒素。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn用肽接头连接另一种毒素。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，LFn与不是来源于炭疽毒素的至少一种其他毒素连接。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，LFn连接AB毒素的A组分或活性、催化或酶结构域，例如，PE的氨基酸残基364-613之间的A组分残基，所述A部分残基为DT的1-193。
在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的C末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn位于融合蛋白的N末端和C末端，其中细胞内作用毒素夹在两个LFn之间。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，包括EFn而不是LFn。例如，这样提供一种工程化融合蛋白诸如EFn-PE(PTx)、EFn-芋螺毒素、EFn-蓖麻毒素、EFn-霍乱毒素、EFn-漏斗网蛛毒素、EFn-δ-岩沙海葵毒素、EFn-虎纹捕鸟蛛毒素或EFn-志贺毒素。
在包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白的一些实施方案中，这些融合蛋白与非融合或单独PA一起使用，或与第二融合蛋白一起使用以治疗疼痛。换句话讲，在一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF多肽的本文所述的融合蛋白与PA向受试者共同施用以治疗疼痛。在另一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与第二融合蛋白向受试者共同施用以治疗疼痛。第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将含有毒素的第一融合蛋白引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。在第二融合蛋白的一些实施方案中，PA为天然PA的突变变体(mPA)，其为不结合如本文所述的ANTXR2受体的形式。
在一个方面中，本文提供一种组合物，其包含：
(I)第一融合蛋白，其包含(a)DT、细胞内作用毒素、ICK毒素或含二硫化物的肽毒素；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)；以及
(II)第二蛋白，其包含(c)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段和任选地(d)伤害感受器神经元结合蛋白，
其中(a)部分和(b)部分通过肽接头接合，并且
其中当(d)存在时，(c)部分和(d)部分也通过肽接头接合。在所述的组合物的一个实施方案中，当第二蛋白为融合蛋白时，PA为PA的突变变体mPA。
在组合物的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。能够结合LFn或EFn的PA片段的非限制性实例为PA63。在包括PA蛋白的本文所述的组合物的一个实施方案中，PA蛋白为低聚物PA。在另一个实施方案中，PA为天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在另一个实施方案中，低聚物PA结合融合蛋白。
在一个实施方案中，包括毒素和/或毒素融合物的本文所述的组合物可用于治疗疼痛诸如神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛、糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症。在另一个实施方案中，这些组合物可用于制造用于治疗疼痛的药物。
AB毒素-PAd4/PA融合蛋白
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含与接头肽融合的AB毒素，然后接头肽连接PA的PAd4结构域，其中PAd4为炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域，其中融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或已被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变形式。在融合蛋白的一个实施方案中，使用PA而不是PAd4结构域。在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式(PA弗林蛋白酶-)。
在一个实施方案中，本文提供一种组合物，其包含与接头肽融合的AB毒素，所述接头肽可操作地连接PA的PAd4结构域，其中Pad4为炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域，其中融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或已被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变形式。在融合蛋白的一个实施方案中，使用PA而不是PAd4结构域。在一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解的变体PA突变形式(PA弗林蛋白酶-)。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)AB毒素；(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其PA片段，其中PA或片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体；以及(c)易位结构域(TL)，其能够将蛋白酶从内体内易位跨过内体膜并进入伤害感受器神经元的细胞溶质。
在一个实施方案中，本文提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)AB毒素；(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其PA片段，其中PA或片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体；以及(c)易位结构域(TL)，其能够将毒素(蛋白酶)从内体内易位跨过内体膜并进入伤害感受器神经元的细胞溶质。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，AB毒素选自蓖麻毒素；霍乱毒素A部分和B部分；铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素A部分和B部分；以及白喉毒素A部分和B部分。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，在伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA片段为PA的C末端受体结合结构域，例如PA63、PAd2和PAd4，或者作为非限制性实例PAd4。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA的C末端受体结合结构域包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:35-40的结构域、基本上由其组成或由其组成。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:35-40的结构域、基本上由其组成或由其组成。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA的C末端受体结合结构域包含涉及膜插入和七聚化的PAd2。在一个实施方案中，PAd2位于PA的残基259-487(SEQ.ID.NO:1)。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA的C末端受体结合结构域包含涉及宿主细胞受体结合的PAd4。在一个实施方案中，PAd4位于PA的残基595-735(SEQ.ID.NO:1)。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PA的C末端受体结合结构域包含PA的PAd2和PAd4结构域、由其组成或基本上由其组成。例如，PA的C末端受体结合结构域包含PA(SEQ.ID.NO:1)的残基259-487和488-735、由其组成或基本上由其组成。可替代地，PA的C末端受体结合结构域包含PA(SEQ.ID.NO:1)的残基259-487和488-764、由其组成或基本上由其组成。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4或PA片段用肽接头与AB毒素连接。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，将来自N末端侧相邻于天然PAd4结构域的近似约1-60个连续氨基酸并入到AB毒素与PAd4之间。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的C末端，并且AB毒素位于融合蛋白的C末端。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的N末端。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，PAd4位于融合蛋白的N末端和C末端，其中AB毒素夹在两个PAd4结构域之间。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，融合蛋白中有以串联形式的多于一个PAd4结构域，例如2-10个PAd4结构域、1-5个PAd4结构域或2-5个PAd4结构域。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，其中存在多个PAd4结构域，所述多个PAd4结构域串联排列。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，所述多个PAd4结构域通过肽接头连接。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TL(易位结构域；海参毒素；或海参毒素的突变形式)夹在AB毒素与PAd4或PA片段之间。
在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，AB毒素选自蓖麻毒素；霍乱毒素A部分和B部分；铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素A部分和B部分；以及白喉毒素A部分和B部分。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，TL为梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域；海参毒素；或被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变形式。在本文所述的融合蛋白或组合物的一些实施方案中，易位结构域来源于BTx或TTx，例如，如表1中所公开的BTx或TTx的HN(梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域)，或者易位结构域来源于炭疽毒素例如LFn或EFn或者本文所述的聚阳离子序列。在本文所述的融合蛋白或组合物的一些实施方案中，海参毒素或海参毒素的突变形式选自蓖麻毒素、霍乱毒素、PE；志贺毒素、DT；以及蝎子长链或短链毒素。在本文所述的融合蛋白或组合物的一些实施方案中，海参毒素或海参毒素的突变形式为PA、mPA或PA弗林蛋白酶-，例如，对于完整的PA蛋白，包含氨基酸残基RKKR(减去SEQ ID NO:1中的29aa信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167)的弗林蛋白酶裂解位点被耐弗林蛋白酶氨基酸序列诸如SSSR(SEQ ID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)代替。
在包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白的一些实施方案中，这些容和蛋白可与非融合或单独的PA一起使用，或者与第二融合蛋白一起使用，所述第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将毒素引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。换句话讲，在一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与单独PA向受试者共同施用以治疗疼痛。在另一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与第二融合蛋白向受试者共同施用以治疗疼痛。在此类情况下，第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将含有毒素的第一融合蛋白引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。在第二融合蛋白的一些实施方案中，PA为变体、修饰(例如，以化学方式)或突变形式(mPA)，其为不结合如本文所述的ANTXR2受体。
在一个方面中，本文提供一种组合物，其包含：
(I)第一融合蛋白，其包含(a)AB毒素和(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)；以及
(II)第二蛋白，其包含：(c)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及任选地(d)伤害感受器神经元结合蛋白，其中(a)部分和(b)部分通过肽接头接合，并且其中当(d)部分存在时，(c)部分和(d)部分也通过肽接头接合。在所述的组合物的一个实施方案中，当第二蛋白为融合蛋白时，PA为PA的突变变体mPA。
在组合物的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。能够结合LFn或EFn的PA片段的实例为PA63。在本文所述的任一种组合物的一个实施方案中，PA为蛋白低聚物PA。在本文所述的任一种组合物的一个实施方案中，PA为天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在一个实施方案中，PA为低聚物PA。在一个实施方案中，低聚物PA结合融合蛋白。在一个实施方案中，此组合物可用于治疗疼痛诸如神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛以及糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症。在另一个实施方案中，此组合物可用于制造用于治疗疼痛的药物。
ICK毒素-PAd4/PA融合蛋白
本文还描述炭疽毒素组分与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))的工程化。因为已知一些ICK毒素调节离子通道的活性，所以它们已经用于治疗疼痛，但是对除伤害感受器之外的细胞型的作用妨碍了全身性治疗。如果这些毒素融合(或以其他方式修饰)PAd4或天然PA，那么它们可以特异性靶向伤害感受器。(参见图9)因此，在一个方面中，工程化融合蛋白包含：(a)PAd4或天然PA或其受体结合片段；以及(b)ICK毒素。在另一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含：(a)PAd4或天然PA或其受体结合片段；以及(b)ICK毒素。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在PAd4或天然PA或其受体结合片段可通过接头肽融合ICK毒素。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。
ICK毒素-LFn/EFn融合蛋白
因此，ICK毒素可融合LFn或EFn或者含有LFn或EFn的融合蛋白，然后其可用于与PA或者PA的修饰(例如，以化学方式)或突变形式组合以特异性影响伤害感受器。因此，在一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含(a)LFn和(b)ICK毒素。在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含(a)EFn和(b)ICK毒素。在另一个方面中，本文提供一种工程化融合蛋白，其包含(a)ICK毒素和(b)伤害感受器神经元结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)LFn和(b)ICK毒素。在另一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)EFn和(b)ICK毒素。在另一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)ICK毒素和(b)伤害感受器神经元结合蛋白。伤害感受器神经元结合蛋白帮助将ICK毒素特异性引导至伤害感受器神经元。类似地，LFn或EFn，连同PA或PA的变体形式或其受体结合片段，帮助将毒素直接递送到伤害感受器神经元并且到细胞溶质中。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn、EFn或伤害感受器神经元结合蛋白通过肽接头融合ICK毒素。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn、EFn或伤害感受器神经元结合蛋白位于融合蛋白的N末端。在本文所述的工程化融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn、EFn或伤害感受器神经元结合蛋白位于融合蛋白的C末端。在另一个实施方案中，LFn、EFn或伤害感受器神经元结合蛋白位于融合蛋白的N末端和C末端，其中ICK毒素夹在LFn、EFn或伤害感受器神经元结合蛋白之间。
含二硫化物的肽毒素-LFn/EFn融合蛋白
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)。在一个实施方案中，提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素在N末端、或在C末端或在N末端和C末端连接或者在一个或多个位点化学交联LFn或EFn。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素连接LFn或EFn。LFn为结合PA63的低聚物形式(炭疽PA的蛋白水解激活形式)的炭疽毒素致死因子的结构域。EFn为结合PA63的低聚物形式的炭疽毒素水肿因子的结构域。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为抑制剂半胱氨酸结毒素(ICK)毒素。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，(a)部分用接头肽与(b)部分融合。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的N末端。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的C末端。在融合蛋白或组合物的另一个实施方案中，LFn或EFn位于融合蛋白的N末端和C末端，其中含二硫化物的肽毒素夹在两个LFn或EFn之间。
在一个方面中，本文描述一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中所述片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体。在一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠和钙通道两者。在一个实施方案中，提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中PA片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，含二硫化物的肽毒素可包含半胱氨酸结基序。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，含二硫化物的肽毒素可为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，在伤害感受器神经元上表达的PA结合受体可为ANTXR2(CMG2)。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，能够结合PA的蛋白质可为：(i)炭疽毒素致死因子(LF)；或(ii)炭疽毒素水肿因子(EF)。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和组合物中，LF的PA结合结构域为LF的N末端结构域(缩写为LFPABD或LFn)。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和组合物中，EF的PA结合结构域为EF的N末端结构域(缩写为EFPABD或EFn)。
在包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白的一些实施方案中，这些融合蛋白与非融合PA一起使用或施用，或者与第二融合蛋白一起使用或施用，所述第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将毒素引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。换句话讲，在一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与为融合或天然PA向受试者共同施用以治疗疼痛。在另一个实施方案中，将包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白与第二融合蛋白向受试者共同施用以治疗疼痛。第二融合蛋白包含：(a)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及(b)伤害感受器神经元结合蛋白，其中PA或PA片段融合伤害感受器神经元结合蛋白，并且伤害感受器神经元结合蛋白将含有毒素的第一融合蛋白引导至伤害感受器神经元以治疗疼痛。在第二融合蛋白的一些实施方案中，PA为修饰(例如，以化学方式)或突变的变体形式(mPA)，其为不结合如本文所述的ANTXR2受体。
在一个方面中，本文描述一种组合物，其包含：
(I)第一融合蛋白，其包含(a)含二硫化物的肽毒素和(b)(i)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)或(b)(ii)炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)；以及
(II)第二蛋白，其包含：(c)能够结合LFn或EFn的PA或PA片段；以及任选地(d)伤害感受器神经元结合蛋白，其中(a)部分和(b)部分通过肽接头接合，并且其中(c)部分和(d)部分也通过肽接头接合。在所述的组合物的一个实施方案中，当第二蛋白为融合蛋白时，PA为PA的突变变体mPA。在本文所述的所有方面的一个实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。能够结合LFn或EFn的PA片段的非限制性实例为PA63。在本文所述的组合物的一个实施方案中，PA为蛋白低聚物PA。在本文所述的组合物的一个实施方案中，PA为天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在本文所述的组合物的一个实施方案中，PA为低聚物PA，其可结合融合蛋白。在一个实施方案中，此类组合物可用于治疗疼痛诸如神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛以及糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症。在另一个实施方案中，此组合物可用于制造用于治疗疼痛的药物。
含二硫化物的肽毒素-PAd4/PA融合蛋白
在一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)(i)炭疽毒素保护性抗原(PA)或(b)(ii)炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)；或(b)(iii)伤害感受器神经元结合蛋白。(参见图9)在一个实施方案中，提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素；以及(b)(i)炭疽毒素保护性抗原(PA)，或(b)(ii)炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)，或(b)(iii)伤害感受器神经元结合蛋白。在融合蛋白或组合物的一个实施方案中，(a)部分用接头肽融合(b)部分。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素位于融合蛋白的N末端。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素位于融合蛋白的C末端。在另一个实施方案中，PA、PAd4或伤害感受器神经元结合蛋白位于融合蛋白的N末端和C末端，使得含二硫化物的肽毒素被两个PA、PAd4或伤害感受器神经元结合蛋白夹住。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为抑制剂半胱氨酸结毒素(ICK)毒素。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II(PE)毒素。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，融合蛋白包含接头肽，所述接头肽在PA、PAd4或伤害感受器结合蛋白与抑制剂半胱氨酸结毒素之间。
在另一个方面中，本文提供一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者；以及(b)靶向性部分(TM)，其能够结合伤害感受器神经元上的结合位点，其中伤害感受器神经元表达钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者。在一个实施方案中，含二硫化物的肽毒素为具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠和钙通道两者。在另一个实施方案中，本文提供一种包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者；以及(b)靶向性部分(TM)，其能够结合伤害感受器神经元上的结合位点，其中伤害感受器神经元在其中表达钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的组合物可以还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，含二硫化物的肽毒素可包含半胱氨酸结基序。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，含二硫化物的肽毒素可为例如芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，TM可选自例如由以下所组成的组：(i)炭疽毒素保护性抗原(PA)；(ii)PA的C末端受体结合结构域；或(iii)其PA片段，例如PAd4；或(iv)伤害感受器神经元结合蛋白。
在所述的融合蛋白或组合物中每一种的一个实施方案中，TM(PA或PA的C末端受体结合结构域、或PA片段、或伤害感受器神经元结合蛋白)可结合在伤害感受器神经元上表达的ANTXR2(CMG2)受体。在一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为特异性结合ANTXR2受体的抗体。在一个实施方案中，抗体为可结合ANTXR2受体的抗体片段。在另一个实施方案中，抗体特异性结合NGF受体或伤害感受器神经元上存在的离子通道蛋白。在一些实施方案中，离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和实施方案中，PA可为如本文所述并且本领域中已知的耐弗林蛋白酶裂解的突变PA。例如，包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解可由耐弗林蛋白酶氨基酸序列诸如SSSR(SEQ ID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)代替。RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和组合物中，PA的C末端受体结合结构域可为例如PA63或PAd4。
在所述的融合蛋白或组合物的所有上文方面和组合物中，PAd4、PA或PA的C末端受体结合结构域可被修饰或突变成例如耐蛋白酶裂解。例如，在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个可被例如Arg或His代替。换句话讲，在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的PA的PAd4结构域中的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个可被例如Arg或His代替。PAd4、PA或PA的C末端受体结合结构域可以耐受的蛋白酶的其他实例为但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。
(mPA-伤害感受器结合蛋白)融合蛋白
本文进一步描述将mPA(变体修饰(例如，以化学方式)或突变PA)工程化，以便阻断其天然受体结合功能(如例如美国专利申请公开号20150044210中所述，所述专利以引用的方式整体并入本文)，从而与可以特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道的分子融合。因此，在一个方面中，工程化融合蛋白包含(a)工程化mPA和(b)伤害感受器结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含(a)工程化mPA和(b)伤害感受器结合蛋白。作为实例，伤害感受器结合蛋白可为：非PA蛋白，其能够结合伤害感受器上的ANTRAX受体；或抗体，其结合伤害感受器的细胞表面上的受体或离子通道或伤害感受器的细胞表面上受体的蛋白质配体。作为所述的工程化融合蛋白的实例，mPA可融合靶向并且结合NGF受体的NGF，或者mPA可融合特异性结合Nav1.7通道的抗体或抗体片段，Nav1.7通道在伤害感受器上产生钠离子孔。Nav1.7通常以高水平在两种类型的神经元中表达，即在背根神经节(DRG)和三叉神经节的伤害感受(疼痛)神经元和交感神经节神经元，所述神经元为自主(不随意)神经系统的一部分。当包含融合伤害感受器结合蛋白的mPA的此类融合蛋白结合包含LFn或EFn或者EF或LF的另一种融合蛋白使用(例如，LFn融合BTx、或LFn融合TTx、或EFn融合BTx、或EFn融合TTx)时，并且当第一融合蛋白与第二融合蛋白之间发生mPA/LFn或EFn相互作用时，所述毒素通过融合蛋白的伤害感受器结合蛋白特异性引导至伤害感受器，并且毒素通过mPA/LFn或EFn相互作用进入细胞溶质。
本文还提供天然PA或突变PA(mPA，表示修饰(例如，以化学方式)或突变的变体PA，其天然受体结合功能已被阻断)，所述天然PA或突变PA与LF或EF组合与可以靶向伤害感受器表面分子的分子融合。在一些实施方案中，包含融合伤害感受器结合蛋白的mPA的融合蛋白结合LF或EF特异性地使用。已显示MAP激酶和其信号传导途径对于在小鼠模型中的慢性疼痛发展来说是重要的。LF特异性抑制MAP激酶信号传导。在一个实施方案中，与LF组合的PA或mPA可用于特异性靶向伤害感受器中的MAP激酶信号传导以阻断疼痛。EF激活腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶也与疼痛发展有关。也可以通过使用与EF组合的PA或mPA靶向腺苷酸环化酶。
Nav1.8和Nav1.9也可以用作针对如本文所述的融合蛋白的伤害感受器结合蛋白的靶受体。在本文所述的工程化融合蛋白的其他实施方案中，融合蛋白的伤害感受器结合蛋白部分结合Nav1.8或Nav1.9。
在包含LFn或EFn或者LF或EF的本文所述的融合蛋白或组合物的实施方案和包含PA或PA片段的本文所述的融合蛋白或组合物的实施方案中任一项中，由蛋白水解激活PA(例如，PA63)或mPA形成的PA的低聚物形式可以取代单体PA以增加对带有受体的细胞的活性。毒素效应物部分可以在施用之前结合PA低聚物形式，或者分开注射。
在另一个方面中，本文描述一种工程化融合蛋白，其包含：
第一结构域，其包含选自由以下组成的组的多肽：
i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；或
ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及
第二结构域，其包含选自由以下组成的组的多肽：
iii)抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))，其任选地与炭疽毒素易位肽融合；
iv)细胞内作用毒素催化结构域，其任选地与炭疽毒素易位肽融合；或
v)炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在一个实施方案中，第一结构域和第二结构域与接头肽一起融合。在一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在另一个实施方案中，接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
在另一个实施方案中，融合蛋白的第一结构域充当融合蛋白的靶向性部分(TM)。靶向性部分起到通过富集于伤害感受器上的细胞表面标志物将毒素引导至伤害感受器神经元的作用。非限制性实例包括但不限于在伤害感受器的表面上表达的丰富的ANTXR2受体、NGF受体和/或Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9离子通道。在一个实施方案中，靶向性部分为能够结合伤害感受器神经元上的结合位点的部分，所述结合位点能够经历内吞以并入到伤害感受器神经元内的内体中，并且其中伤害感受器神经元表达SNARE蛋白，SNARE蛋白随后被第二结构域的毒素蛋白水解裂解。在另一个实施方案中，靶向性部分为能够结合伤害感受器神经元上的结合位点的部分，其中伤害感受器神经元表达钠或钙或钠和钙两者离子通道(例如，Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9离子通道)，或表达ANTXR2受体或NGF受体。因此，在一个实施方案中，伤害感受器神经元上的结合位点为ANTXR2受体、NGF受体、Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9离子通道。
能够特异性结合伤害感受器表面受体(诸如ANTXR2)或离子通道受体的分子可为例如多核苷酸(例如适体)、多肽、抗体或其抗原结合片段或亲和体(affibody)。亲和体为工程化成模仿单克隆抗体以高亲和力结合大量靶蛋白或肽的小蛋白，并且因此为抗体模拟物家族的成员。在一些实施方案中，所述分子可为抗体试剂，例如抗体、单克隆抗体和/或其抗原结合部分。伤害感受器表面受体和/或伤害感受器离子通道受体为本领域中已知的并且描述于例如Gohar.Modulator 2005 19:9-13；Bennaroch.Neurology 2015 10；Simon等人The Nociceptive Membrane.Academic Press 2011；每个参考文献均以引用的方式整体并入本文。伤害感受器表面受体和/或伤害感受器离子通道受体的非限制性实例包括例如NGF受体(NGFR)(例如NCBI基因ID：4804)、Nav1.7(例如NCBI基因ID：6335)、Nav1.8(例如NCBI基因ID：6336)或Nav1.9(例如NCBI基因ID：11280)。如通过序列参考数字在本文和说明书通篇所提到的所有数据库序列均以引用的方式整体并入本文。数据库参考数字和序列如在本申请的提交日数据库中所阐述。在涉及能够特异性靶向伤害感受器表面受体的分子的任何方面的一个实施方案中，分子可为特异性结合NGF受体的抗体试剂或特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体试剂。在任何此类方面的一些实施方案中，为了减少脱靶效应，能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的多种分子可存在于相同融合蛋白和/或组合物中。组合物还可以包含具有不同靶向性部分的两种、三种或更多种融合蛋白。
在涉及PA多肽的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，希望以PA的成孔能力为目标而不使用PA的特异性结合ANTXR2的能力。因此，在涉及PA多肽的任何方面的一个实施方案中，组合物可包含已被改变成阻断其天然ANTXR2结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合。通过非限制性实例，PA的PAd4结构域可被删除和/或改变成阻断受体结合功能。通过进一步非限制性实例，mPA可包含N682A和/或D683A(相对于在去除在aa 1-29残基处的信号肽之后的序列SEQ ID NO:1)(参见例如，Rosovitz MJ等人2003.Alanine-scanning mutations indomain 4 of anthrax toxin protective antigen(PAd4)reveal residues importantfor binding to cellular receptor and to a neutralizing monoclonalantibody.J.Biol.Chem.278:30936-30944；其以引用方式整体并入本文)。改变多肽序列和/或工程化蛋白质以包含所需突变的各种方法为本领域中已知的，并且其实例描述于本文别处。
在本文所述的工程化融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白的第二结构域为融合蛋白的毒素效应物部分。取决于毒素蛋白，毒素效应物部分起破坏伤害感受器上细胞信号传导的作用并且/或者阻断从伤害感受器的神经递质释放或杀伤伤害感受器。毒素效应物部分可为靶向囊泡上一个或多个SNARE蛋白(例如，BTx和TTx)、MAP激酶(EF和LF)等的非细胞毒性蛋白酶。
如本文所述，发明人已经发现，炭疽保护性抗原可以选择性靶向伤害感受器神经元，与它们结合并且形成能够膜转运的孔。通过将炭疽毒素保护性抗原和适当毒素偶联(物理上或功能上)，伤害感受器神经元可被杀伤和/或丧失能力或者疼痛信号可被阻断。此类组合物可用于例如通过使伤害感受器神经元中的细胞信号传导或突触传递丧失能力来例如治疗疼痛而对神经系统的其余部分大致上没有脱靶效应。此外，使用此系统实现疼痛治疗而没有物质滥用的衰弱性副作用。
在某些方面中，本文所述的融合蛋白可包含毒素。如本文所用，“毒素”是指生物体所产生的化合物，所述生物体在呈现有所述毒素的宿主细胞中造成或起始有毒、有毒害或有害的影响的发展。此类有害的条件可包括关键细胞功能的抑制、细胞新陈代谢的抑制和/或细胞死亡。
在涉及毒素的本文所述的所有方面的一些实施方案中，毒素可为抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素，例如芋螺毒素(CTx)。
在涉及毒素的本文所述的所有方面的一些实施方案中，毒素可为细胞内作用毒素和/或细胞内作用毒素催化结构域。合适的细菌毒素可包括具有针对例如SNARE蛋白的蛋白水解活性以防止神经递质释放的毒素或对神经元具有细胞毒性的毒素。合适毒素的非限制性实例可包括细菌毒素诸如像白喉毒素(DTx)(例如NCBI基因ID：2650491；SEQ ID NO:2)；铜绿假单胞菌外毒素A(PTx或PE)(例如NCBI基因ID：877850；SEQ ID NO:3)；肉毒毒素(BTx)(例如NCBI基因ID：5398487；SEQ ID NO:4)；破伤风毒素(TTx)(例如NCBI基因ID：17583237；SEQ ID NO:5)；志贺毒素(例如志贺氏菌(Shigella)Stx(例如，GenBank登录号CAC05622和CAC05623)Stx-1(例如GenBank登录号32400300和32400299)和/或Stx-2(例如GenBank登录号161511882和161511883)；炭疽致死毒素(致死因子)和/或炭疽水肿毒素(水肿因子)。合适毒素的进一步非限制性实例为蓖麻毒素(例如NCBI基因ID：8287993)。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，毒素可为炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，多种毒素可存在于如本文所述的相同融合蛋白和/或组合物中。
在一些实施方案中，效应物部分包括其中包含易位结构域(TL)的毒素。在一个实施方案中，TL能够将融合蛋白从内体易位跨过内体膜并进入伤害感受器神经元的细胞溶质。在一些实施方案中，TL为炭疽易位信号肽(LFn或EFn)(本文也称为炭疽毒素易位肽)、BTx(包括血清型)的HN结构域或TTx的HN结构域、或者聚阳离子序列诸KKK、KKKKKK(SEQ IDNO:59)、KKKKKKKK(SEQ ID NO:60)、HHH、HHHHHH(SEQ ID NO:61)、HHHHHHHH(SEQ ID NO:62)、RRR、RRRRRR(SEQ ID NO:63)或RRRRRRRR(SEQ ID NO:64)。参见美国专利临时公布号：US 2003/0202989，其以引用的方式整体并入本文。在其他实施方案中，TL为梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域HN，其来源于梭状芽孢杆菌神经毒素(CNT)家族成员蛋白。此包括BTx血清型、TTx和新近发现的非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，毒素可与炭疽毒素易位肽融合例如使PA和/或mPA识别毒素并且将毒素转运到伤害感受器细胞中。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，易位结构域可为聚阳离子序列。此类序列在本领域中有所讨论；参见例如Blanke,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,第8437-8442页,1996和美国专利申请公布号：US 2003/0202989，每个参考文献均以引用的方式整体并入本文。聚阳离子序列可包含至少2个阳离子氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸。在针对易位功能采用聚阳离子序列的本文所述的所有方面的一些实施方案中，聚阳离子序列可包含至少约3个、约6个或约8个阳离子氨基酸。在针对易位功能采用聚阳离子序列的本文所述的所有方面的一些实施方案中，聚阳离子序列可包含序列KKK、KKKKKK(SEQ ID NO:59)或KKKKKKKK(SEQ ID NO:60)。在针对易位功能采用聚阳离子序列的本文所述的所有方面的一些实施方案中，聚阳离子序列可包含序列HHH、HHHHHH(SEQ ID NO:61)或HHHHHHHH(SEQ IDNO:62)。在针对易位功能采用聚阳离子序列的本文所述的所有方面的一些实施方案中，聚阳离子序列可包含序列RRR、RRRRRR(SEQ ID NO:63)或RRRRRRRR(SEQ ID NO:64)。
在如本文所述的毒素融合蛋白的一些实施方案中，第一融合蛋白结构域包含炭疽毒素保护性抗原(PA)部分，并且第二融合蛋白结构域包含炭疽毒素易位肽，所述炭疽毒素易位肽与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合。在第一融合蛋白结构域的其他实施方案中，用梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域(HN)或聚阳离子序列代替炭疽毒素易位肽。
在如本文所述的毒素融合蛋白的一些实施方案中，第一结构域包含已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；并且第二结构域包含炭疽毒素易位肽，其与细胞内作用毒素催化结构域融合。在第一融合蛋白结构域的其他实施方案中，用梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域(HN)或聚阳离子序列代替炭疽毒素易位肽。
在如本文所述的毒素融合蛋白的一些实施方案中，第一结构域包含：i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；或ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；并且第二结构域包含炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在另一个方面中，本文描述一种工程化融合蛋白，其包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(Pad4)。
为了形成功能性孔，PA和/或mPA必须低聚化。因此，在涉及PA多肽的本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，PA或mPA可以呈低聚物形式。在涉及PA多肽的本文所述的方面中任一项的一些实施方案中，PA或mPA可以在向受试者施用之前和/或在与伤害感受器细胞接触之前呈低聚物形式。
接头
接头可用于连接如本文所述的多肽的两个或更多个结构域或部分。接头分子(“接头”)可为肽(其由一个至多个氨基酸组成)或非肽分子。可用于本文所述的多肽中的肽接头分子的实例包括富含甘氨酸的肽接头(参见例如US 5,908,626)，其中多于一半的氨基酸残基为甘氨酸。优选地，此类富含甘氨酸的肽接头由约20个或更少的氨基酸组成。
接头分子也可以包括非肽或部分肽分子。例如，肽可以使用熟知的交联分子诸如戊二醛或EDC(Pierce,Rockford,Illinois)连接肽或其他分子。
在本文所述的融合蛋白的一些实施方案中，各种结构域和部分TM、TL、PAd4、PA片段、LF、LFn、EF、EFn、mPA、各种类型的毒素(BTx包括各种血清型、TTx、AB毒素、蓖麻毒素、霍乱毒素、PE、志贺毒素、DT、芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素)等用接头肽在相应融合蛋白中接合在一起。接头肽的实例包括但不限于：FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:65)；VEIEDTE(SEQ ID NO:66)；KDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:67)；STEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:68)；EVKQENRLLNESES(SEQ ID NO:69)；和VGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTE(SEQ ID NO:70)。
柔性接头一般由小的、非极性或极性残基诸如Gly、Ser和Thr构成。在包括接头的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。在包括接头的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，接头为长度在1与25个残基之间的柔性多肽。柔性肽接头的常见实例包括(GGS)n，其中n＝1至8；或(Gly4Ser)n重复，其中n＝1-8(SEQ IDNO:57)，优选地，n＝3、4、5或6，即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n指示基序重复的数目。例如，柔性接头为(GGS)2，GGSGGS(SEQ ID NO:58)。
在包括接头的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，接头肽长1-20个氨基酸。在一个实施方案中，接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。在一个实施方案中，接头肽不包含Lys和/或Arg。
在包括接头和PAd4的融合蛋白的一个实施方案中，附接到PAd4的N末端的接头的长度小于20个氨基酸并且由至少三种氨基酸Gly、Ser和Ala构成。
在包括接头和PAd4的融合蛋白的一个实施方案中，附接到PAd4的N末端的接头的长度小于20个氨基酸并且由至少四种氨基酸Gly、Ser、Thr和Ala构成。
在包括接头的融合蛋白的一个实施方案中，接头在人类血清中稳定至少1分钟并且长度小于20个氨基酸。
双功能交联分子为具有两个不同反应性位点的接头分子。例如，双功能接头分子的反应性位点之一可以与肽上的官能团反应以形成共价键联，并且另一个反应性位点可以与另一个分子上的官能团反应以形成共价键联。将分子交联的一般方法已被综述(参见例如Means和Feeney,Bioconjugate Chem.,1:2-12(1990))。
同型双功能交联剂分子具有化学上相同的两个反应性位点。同型双功能交联剂分子的实例包括但不限于：戊二醛；N,N'-双(3-马来酰亚胺基-丙酰基-2-羟基-l,3-丙二醇(硫氢基特异性同型双功能交联剂)；某些N-琥珀酰亚胺酯(例如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)以及可溶性双磺酸和其盐(参见例如Pierce Chemicals,Rockford,Illinois；Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,Missouri)。
优选地，双功能交联剂分子为异型双功能接头分子，其意指所述接头具有至少两个不同的反应性位点，每个反应性位点单独连接肽或另一个分子。使用此类异型双功能接头允许将每个反应性位点以化学方式分开并且逐步添加(媒介物结合)到选择的肽序列。可用于本发明的异型双功能接头分子包括但不限于间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(参见Green等人,Cell,28:477-487(1982)；Palker等人,Proc.Natl.Acad.Sci(USA),84:2479-2483(1987))；间马来酰亚胺基-苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯；马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；以及3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(参见例如，Carlos等人,Biochem.J.,173:723-737(1978)；Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,Missouri)。
PAd4结构域-在本文所述的包含PAd4结构域的融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白包含以串联形式的约2-10个PAd4结构域、或以串联形式的1-5个PAd4结构域、或2-5个PAd4结构域等。在融合蛋白的一个实施方案中，将来自PA的N末端侧相邻于天然PAd4结构域的近似1-60个连续的氨基酸进一步并入到毒素部分(例如，BTx部分、TTx部分、含二硫化物的肽毒素部分、AB毒素部分等)与PAd4结构域之间。
在本文所述的包含PAd4结构域的融合蛋白或包含PAd4结构域的组合物的一个实施方案中，融合蛋白还包含PA的结构域2(PAd2)。PAd2结构域可存在于PA序列(SEQ.ID.NO:1)的氨基酸残基259-487处。在本文所述的融合蛋白或组合物的一个实施方案中，融合蛋白包含PA的PAd2和PAd4结构域、由其组成或基本上由其组成。例如，融合蛋白包含PA(SEQ.ID.NO:1)的残基259-487和488-764、由其组成或基本上由其组成。
在本文所述的包含PAd4结构域的融合蛋白或包含PAd4结构域的组合物的一个实施方案中，融合蛋白还包含完整PA的变体形式，在所述变体形式中弗林蛋白酶裂解位点已经通过突变(M)消融，使得PA耐蛋白水解激活并且因此不低聚化。
在如本文所述的包含结合ANTXR2的PA、或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域的融合蛋白，或者如本文所述的包含包括结合ANTXR2的PA或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域的融合蛋白的组合物的一个实施方案中，结合ANTXR2的PA或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域(PA来源的蛋白质)的修饰的或突变的。
在一个实施方案中，结合ANTXR2的PAd4、PA或其PA片段、或PA的C末端受体结合结构域耐蛋白酶诸如Lys C裂解。PA可以耐受的蛋白酶的其他实例包括但不限于赖氨酰肽酶、胰蛋白酶、肠激酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C。
在描述为包括PAd4结构域的任何融合蛋白的一个实施方案中，PAd4结构域中在位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替，其中编号是指在减去SEQ.ID.NO:1中29aa信号肽之后SEQ IDNO:1的编号。这包括PA的任何C末端受体结合结构域。
在描述为包括PAd4结构域的任何融合蛋白的一个实施方案中，PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个已被例如Arg或His代替。
在一个实施方案中，PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置630、742和/或748的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
PA在包含PA结构域的本文所述的融合蛋白或包含此类融合蛋白的组合物的一个实施方案中，PA为耐弗林蛋白酶裂解(PA弗林蛋白酶-)或突变成阻断其天然受体结合功能的PA的变体或突变形式(mPA)。在一个实施方案中，包含氨基酸残基RKKR的PA弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替。RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。在一个实施方案中，耐弗林蛋白酶氨基酸序列为SSSR(SEQ IDNO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)。在一个实施方案中，PA具有阻断PA的受体结合功能的一个或两个突变，N711A和/或D712A；氨基酸编号根据SEQ ID NO:1，完整的PA包括29个残基信号肽。在没有29个残基信号肽的情况下编号的PA序列中，两个突变为N682A/D683A。
在包含PA的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，PA被修饰或突变成例如耐蛋白酶(诸如Lys-C或弗林蛋白酶)裂解。例如，PA的PAd4结构域中在位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730的Lys残基中的一个或多个可被Arg或His代替。(去除N末端29aa信号肽之后的SEQ ID NO:1)(此序列为具有29aa信号肽的P13423)。换句话讲，在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的PA的PAd4结构域中的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个可被例如Arg或His代替。
在本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白在融合蛋白的N末端还包含至少一个D-氨基酸。
在本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白是糖基化的。
在本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，融合蛋白是非糖基化的。
工程化融合蛋白的产生
本文所述的各种多肽(例如，融合多肽或者第一或第二多肽)可以从天然来源纯化并且/或者使用本领域中已知的任何方法重组地产生。例如，本文所述的工程化融合蛋白可以通过本领域中已知的重组分子克隆来产生。作为非限制性实例，PA可以从炭疽杆菌(B.anthracis)的史特内菌株(Sterne strain)纯化或通过其他已知手段合成。在炭疽杆菌中，PA的基因位于称为pXO1的质粒上(Milne等人,1994,J.of Biol.Chem.269(32):20607-20612；其以引用的方式整体并入本文)。重组表达的方法为本领域中熟知的。在一些实施方案中，PA63可以取代全长PA。PA63片段可以通过阴离子交换色谱法从胰蛋白酶处理的PA纯化(Milne等人,1994,增刊)。PA编码基因已被克隆并测序(Vodkin等人,1983,Cell 34:693-697；其以引用的方式整体并入本文)并且可以用于获得纯化的PA多肽。
两个多肽部分的融合通过重组DNA技术或使用分选酶反应(参见例如WO2012096926、WO2013177231、WO2014088928；美国专利号：9079952；以及美国专利申请公布号：US 2013/0336974和US 2015/0267186，每个专利均以引用的方式整体并入本文)，或者本领域中已知的化学连接/生化结合的其他方法来实现。
重组DNA和分子生物学技术可用于产生所述的工程化融合蛋白。克隆编码相应蛋白质结构域和部分例如TM、TL、PAd4、PA片段、LF、LFn、EF、EFn、mPA、各种类型的毒素(BTx、TTx、AB毒素、蓖麻毒素、霍乱毒素、PE、志贺毒素、DT、芋螺毒素和漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素)等的cDNA区段和序列的过程、编码各种肽接头的DNA序列的产生、不同cDNA序列的连接、针对各种工程化融合蛋白的表达载体(例如，质粒、噬菌体、噬菌粒或病毒载体)的构建以及各种重组工程化融合蛋白的蛋白质表达和纯化可以通过诸如以下所述的常规重组分子生物技术和蛋白质生化技术执行：Lewin's GenesXI,Jones&Bartlett Publishers出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385)；Current Protocols in Protein Science(CPPS),JohnE.Coligan(编),John Wiley and Sons,Inc.,2005，所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。
工程化融合蛋白和肽接头可以通过本领域中已知的用于融合蛋白的合成的任何方法，特别是通过化学合成或通过重组表达技术来产生。
本发明的工程化融合蛋白可以通过本领域中已知的用于重组蛋白的表达和纯化的任何方法来产生。
工程化融合蛋白的重组表达需要构建含有编码本文所述的工程化融合蛋白的多核苷酸的表达载体。为了蛋白质纯化或者识别或定位表达系统中的工程化融合蛋白或在蛋白质纯化过程期间，多核苷酸可以包含编码另外的氨基酸的序列。一旦获得了编码工程化融合蛋白的多核苷酸，便可通过使用本领域中熟知的技术的重组DNA技术产生用于产生融合蛋白的载体。因此，本文描述了用于通过表达含有融合蛋白编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可以使用本领域中的技术人员熟知的方法来构建含有蛋白质编码序列和适当转录和转译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制载体，其包含可操作地连接启动子的编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的融合蛋白。因此，本发明包括宿主细胞，所述宿主细胞含有可操作地连接异源启动子的编码融合蛋白的多核苷酸。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的融合蛋白。此类宿主表达系统代表可以借以产生并随后纯化目的编码序列的媒介物，而且还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的融合蛋白的细胞。这些系统包括但不限于微生物，如用含有融合蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的原核细菌(例如，减毒炭疽杆菌菌株、大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有融合蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有融合蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)TMV)感染或用含有融合蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘疮病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。细菌细胞诸如大肠杆菌和减毒炭疽杆菌菌株尤其可用于本文所述的融合蛋白的表达。
在细菌系统中，许多表达载体可以根据所表达的融合蛋白的预期用途来有利地选择。例如，当待产生大量此类蛋白质以便产生融合蛋白的药物组合物时，指导表达高水平的易于纯化的融合蛋白产物的载体可为合乎需要的。此类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,EMBO J.,2:1791(1983))，其中融合蛋白编码序列可个别地与lacZ编码区框内连接到载体中，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,NucleicAcids Res.,13:3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster,J.Biol.Chem.,24:5503-5509(1989))；等等。pGEX载体也可以用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来讲，此类融合蛋白是可溶性的，且可易于通过吸附及结合于基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从溶解细胞纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以便可从GST部分释放克隆的靶基因产物。可替代地，pET表达载体可用于产生组氨酸标记重组蛋白，其中组氨酸标记的重组蛋白可以通过镍柱来亲和纯化。Holliger,P.(2002)Meth.Mol.Biol.,178:349-57中描述了巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中重组蛋白的表达并且据此以引用的方式并入。工程化含有炭疽的融合蛋白和含有BTx或TTx的融合蛋白的重组表达和纯化的实例为本领域中已知的，并且更详细地描述于例如国际专利公布WO 2012/096926和WO 2015/166242；美国专利号：9079952、9234011、9243301以及美国专利临时公布号：US 2013/0336974、US 2015/0267186、US 2015/0044210，每个专利均以引用的方式整体并入本文。
在昆虫系统中，使用加洲苜蓿夜蛾核多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)作为表达外来基因的载体。病毒生长于草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞中。可将融合蛋白编码序列个别地克隆至病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
以下描述了藻类莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中异源蛋白的大规模表达：Griesbeck C.等人2006 Mol.Biotechnol.34:213-33；Manuell AL等人2007 PlantBiotechnol J.Eprint；Franklin SE和Mayfield SP,2005,Expert Opin Biol Ther.Feb；5(2):225-35；Mayfield SP和Franklin SE,2005Vaccine Mar 7；23(15):1828-32；以及Fuhrmann M.2004,Methods Mol Med.94:191-5。外来异源编码序列通过同源重组插入到细胞核、叶绿体和线粒体的基因组中。可以使用携带最多用途的叶绿体可选择标志物氨基糖苷腺嘌呤基转移酶(aadA)(其赋予壮观霉素或链霉素抗性)的叶绿体表达载体p64在叶绿体中表达外来蛋白质。生物射弹基因枪方法用于将载体引入藻类中。在其进入叶绿体时，外来DNA从基因枪粒子释放并且通过同源重组整合到叶绿体基因组中。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，融合蛋白的编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中将产生活的且能够在受感染宿主中表达融合蛋白的重组病毒。参见例如Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:355-359(1984)。也可以需要具体起始信号来有效翻译插入的融合蛋白编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保全部插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然来源与合成来源均可。可通过包括适当转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见Bittner等人,Methods in Enzymol.,153:51-544(1987))。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需具体方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能对蛋白质功能而言是重要的。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征且特异性机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白质进行正确的修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、NSO、293、3T3、W138和尤其乳癌细胞系诸如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系诸如CRL7030和Hs578Bst。
对于重组蛋白的长期高产量产生，稳定表达是优选的。例如，可以将稳定表达融合蛋白的细胞系工程化。可以用受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标志物转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外来DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成聚集点(foci)，所述聚集点转而可以进行克隆并扩增成细胞系。这种方法可以有利地用于将表达融合蛋白的细胞系工程化。此类工程化细胞系可能特别适用于筛选和评价与融合蛋白直接或间接相互作用的化合物。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell,11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell,22:817(1980))基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。同样，可以使用抗代谢物耐性作为以下基因的选择基础：dhfr，其赋予耐甲氨蝶呤性(Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:357(1980)；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981))；gpt，其赋予耐霉酚酸性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981))；neo，其赋予耐氨基糖苷G-418性(Wu和Wu,Biotherapy,3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:573-596(1993)；Mulligan,Science,260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.,62:191-217(1993)；Can,1993,TIBTECH 11(5):155-215))；以及hygro，其赋予耐潮霉素性(Santerre等人,Gene,30:147(1984))。可按常规应用重组DNA技术领域中通常已知的方法来选择需要的重组克隆，并且此类方法描述于例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编(JohnWiley&Sons,NY 1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(Stockton Press,NY 1990)；以及Current Protocols in Human Genetics,Dracopoli等人编(John Wiley&Sons,NY 1994),第12和13章；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.,150:1(1981)，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
本文所述的工程化融合蛋白的表达水平可以通过载体扩增来增加(综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(AcademicPress,New York,1987))。当表达融合蛋白的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平增加将使标志物基因的拷贝数增加。因为扩增的区域与编码本文所述的工程化融合蛋白的核酸序列相关联，所以工程化融合蛋白的产生将同样增加(Crouse等人,Mol.Cell.Biol.,3:257(1983))。
宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染，编码第一融合蛋白的第一载体和编码第二融合蛋白的第二载体。两个载体可以含有相同的可选择标志物，从而使得融合多肽能同等地表达。可替代地，可以使用编码并且能够表达两种融合多肽的单个载体。将编码两种融合多肽的双顺反子表达盒插入到表达载体中(Proudfoot,Nature,322:52(1986)；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:2197(1980))。
一旦通过动物产生或重组表达了本发明的融合蛋白，那么所述融合蛋白就可以通过本领域中已知用于蛋白质纯化的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(尤其是通过特定抗原对蛋白质A的亲和力)和分级柱色谱)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，本文所述的工程化融合蛋白可融合本文所述本领域中另外已知的异源多肽序列以有助于纯化。
出于亲和纯化的目的，使用亲和色谱法的相关基质，诸如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴结合的树脂。许多此类基质可以呈“试剂盒”形式获得，诸如可与组氨酸标记的融合蛋白一起使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统标签同样可有助于检测表达的重组融合蛋白。此类标签的实例包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，其通常为可用于特异性抗体的短肽序列。对其而言特异性单克隆抗体易于获得的熟知表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶裂解位点，诸如针对因子Xa或凝血酶的裂解位点，其允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白。然后可通过后续色谱分离使释放的蛋白质与融合结构域分离。
因此，在一个实施方案中，本文涵盖一种核酸序列，其编码本文所述的融合蛋白中的任一种。
在一个实施方案中，本文提供一种包含核酸序列的载体，所述核酸序列编码本文所述的融合蛋白中的任一种。例如，所述载体可为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体或病毒粒子。这些载体是本领域中已知的。在一个实施方案中，本文提供一种包含核酸序列的质粒，所述核酸序列编码本文所述的融合蛋白中的任一种。例如，质粒为细菌质粒。在所述的载体的一个实施方案中，载体为表达载体。例如，质粒(载体)为细菌例如大肠杆菌中用于重组蛋白表达的表达质粒。在所述的表达载体的一个实施方案中，表达载体为细菌表达载体。在所述的表达载体的一个实施方案中，表达载体为原核表达载体。在所述的表达载体的一个实施方案中，表达载体为真核表达载体。在所述的表达载体的一个实施方案中，表达载体为哺乳动物表达载体。在一个实施方案中，表达载体为酵母表达载体。
在另一个实施方案中，本文提供一种包含载体的病毒粒子，所述载体包含前述段落中所述的核酸。在另一个方面中，本文提供一种病毒粒子，其包含前述段落中所述的核酸。
在一个实施方案中，本文提供一种细胞，其包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列或者包含有编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的载体。细胞可为细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞等。例如，携带包含编码本文所述的融合蛋白的核酸的质粒的大肠杆菌。例如，针对核酸中所编码的融合蛋白的重组蛋白质表达。
在另一个方面中，本文提供一种包含病毒粒子的细胞，所述病毒粒子包含有包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的载体。在另一个方面中，本文提供一种包含质粒的细胞，所述质粒包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列。在另一个方面中，本文提供一种包含病毒粒子的细胞，所述病毒粒子包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列。
在一个实施方案中，本文提供一种产生本文所述的融合蛋白中任一种的方法，其包括(a)培养细胞，所述细胞包含：编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列；或包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的载体(例如，质粒)；或包含载体的病毒粒子，所述载体包含编码所述的融合蛋白中任一种的核酸序列；或包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的病毒粒子，其中所述培养是在使得所述的融合蛋白被表达的条件下执行；以及(b)去除融合蛋白。
在一个实施方案中，本文提供一种通过本文所述的方法产生的融合蛋白，具体来说，所述方法包括(a)培养细胞，所述细胞包含：编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列；或包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的载体(例如，质粒)；或包含载体的病毒粒子，所述载体包含编码所述的融合蛋白中任一种的核酸序列；或包含编码本文所述的融合蛋白中任一种的核酸序列的病毒粒子，其中所述培养是在使得所述的融合蛋白被表达的条件下执行；以及(b)去除融合蛋白。
在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为原核细胞诸如细菌。在针对产生融合蛋白所述的方法的一个实施方案中，细胞为细菌细胞。在一个实施方案中，细菌为大肠杆菌(Escherichia coli、E.Coli)。在另一个实施方案中，细菌为减毒炭疽杆菌菌株(例如CDC 684)。
在产生本文所述的融合蛋白的方法的一个实施方案中，细胞为酵母细胞。在一个实施方案中，酵母为酿酒酵母。在一个实施方案中，酵母为糖基化缺陷细胞。
在产生本文所述的融合蛋白的方法的一个实施方案中，酵母为糖基化和蛋白酶缺陷的。在一个实施方案中，蛋白酶为弗林蛋白酶或弗林蛋白酶类蛋白酶。
在产生本文所述的融合蛋白的方法的一个实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞为COS细胞、CHO细胞或NSO细胞。
组合物
在一个方面中，本文描述一种组合物，其包含如本文所述的至少一种工程化融合蛋白。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在一些方面中，前述段落中所述的任何组合物或包含前述段落中所述的融合蛋白的任何组合物用于治疗疼痛。治疗疼痛可包括施用前述段落中所述的不同组合物中多于一种(即数种)。例如，包含有包含LFn、LF、EFn或EF的融合蛋白并且融合蛋白中存在伤害感受器受体结合蛋白的组合物，所述组合物优选与包含PA、PA片段、含有PAd4的PA片段或PA的PA的C末端受体结合结构域组合使用。
在一些实施方案中，组合物可包含两种或更多种不同的工程化融合蛋白，例如，具有不懂的第一和/或第二结构域的融合蛋白。此类蛋白质混合物可以例如减少脱靶效应并且/或者提供抑制伤害感受器的多种机制以增加功效。在一些实施方案中，所述两种或更多种不同的工程化融合蛋白可以呈低聚物形式，使得低聚物复合物包含至少两种不同的工程化融合蛋白。在一些实施方案中，第一工程化融合蛋白具有第一结构域，其包含炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；并且第二工程化融合蛋白具有第一结构域，其包含被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，所述部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合。在一些实施方案中，如本文所述的组合物还可包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
当多肽包含炭疽毒素易位肽时，所述易位肽可使多肽被存在的PA和/或mPA结合并且易位跨过膜。因此，PA和/或mPA以及待易位的多肽(例如毒素)可呈单独的多肽存在。那么在一个方面中，本文描述一种组合物，其包含：
(I)第一多肽，其选自由以下组成的组：
a)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；以及任选地
b)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及
(II)第二多肽，其选自由以下组成的组：
c)炭疽易位信号肽，其与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合；
d)炭疽易位信号肽，其与细胞内作用毒素催化结构域融合；和/或
e)炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在此类组合物的一个实施方案中，第一多肽包含炭疽毒素保护性抗原(PA)部分，并且第二多肽包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素易位肽。
在此类组合物的另一个实施方案中，第一多肽包含已改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合，并且第二多肽包含与细胞内作用毒素催化结构域融合的炭疽毒素易位肽。在第二多肽的其他实施方案中，用梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域(HN)或聚阳离子序列代替炭疽毒素易位肽。
在此类组合物的另一个实施方案中，第一多肽包含：i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；或ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；并且第二多肽包含炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在包含第一和第二多肽的此类组合物的另一个实施方案中，PA或mPA呈低聚物形式。在包含第一和第二多肽的此类组合物的另一个实施方案中，组合物包含i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分和ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，所述部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合。在一个实施方案中，i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分和ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，所述部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合，两种不同的第一多肽呈低聚物形式，使得低聚物复合物包含两种多肽。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，组合物还包含天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在一个实施方案中，PA为蛋白低聚物PA。在另一个实施方案中，低聚物PA结合融合蛋白。
在包含本文所述的含LFn、LF、EF或EFn的融合蛋白的组合物中任一种的一个实施方案中，组合物还包含天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。在一个实施方案中，PA为蛋白低聚物PA。在另一个实施方案中，低聚物PA结合融合蛋白。
用于疼痛治疗的工程化融合蛋白和组合物的用途
单独或以组合形式使用的包含本文所述的融合蛋白的任何组合物可用于治疗疼痛。类似地，本文所述的任何融合蛋白可用于治疗疼痛。此外，设想到所述组合物的各种组合或所述工程化融合蛋白的各种组合将用于治疗疼痛。本文所述的融合蛋白和组合物可以选择性地结合伤害感受器并且递送杀伤和/或抑制伤害感受器细胞的毒素。在一些实施方案中，其他神经元不受本文所述的融合蛋白和/或组合物影响。
在另一个方面中，本文提供一种制造药物组合物的方法，所述药物组合物包含前述段落中所述的融合蛋白中一种或多种和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一个方面中，本文提供一种前述段落中所述的融合蛋白，其用于制造用于治疗疼痛的药物。在一个实施方案中，融合蛋白与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂配制。
在另一个方面中，本文提供一种前述段落中所述的融合蛋白，其用于治疗疼痛。在一个实施方案中，融合蛋白与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂配制。
因此，在一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的如本文所述的组合物。可以同时或依次施用多于一种组合物。例如，包含有包含LFn、LF、EFn或EF的融合蛋白并且融合蛋白中存在伤害感受器受体结合蛋白的组合物，所述组合物优选与包含PA、PA片段、含有PAd4的PA片段或PA的PA的C末端受体结合结构域组合使用。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)，和(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)，或PA的C末端受体结合结构域，其中(a)部分和(b)部分连接或融合在一起。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中PA或其PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合安白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的离子通道；以及(b)靶向部分(TM)，其能够结合所述伤害感受器神经元上的结合位点，其中所述伤害感受器神经元在其中表达所述离子通道。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)含二硫化物的肽毒素，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段的蛋白蛋白质，所述炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段结合在所述伤害感受器神经元上表达的受体。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)AB毒素；(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段，其中PA或其片段结合在伤害感受器神经元上表达的受体；以及(c)易位结构域(TL)，其能够将毒素(蛋白酶)从内体内易位跨过内体膜并进入伤害感受器神经元的细胞溶质。
在另一个方面中，本文提供一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含肉毒神经毒素(BTx)部分，所述BTx部分包含BTx的N末端酶结构域(LC或L链)和中间成孔/易位结构域(HN)，所述BTx部分连接炭疽毒素保护性抗原(PA)的C末端受体结合结构域。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含：(a)肉毒神经毒素(BTx)部分的肉毒神经毒素N末端酶结构域，和(b)炭疽毒素致死因子(LFn)的N末端结构域，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子(EFn)的N末端结构域，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式，其中(a)部分在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者连接(b)部分。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含炭疽毒素保护性抗原(PA)、炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)或伤害感受器神经元结合蛋白，其连接含二硫化物的肽毒素。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含含二硫化物的肽毒素，所述含二硫化物的肽毒素在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者可操作地连接或者在一个或多个位点化学交联炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含与接头肽融合的AB毒素，所述接头肽连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或已被修饰(例如，以化学方式)或突变成使AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的突变形式。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的融合蛋白或者包含所述融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含来自梭状芽孢杆菌神经毒素或非肉毒梭状芽孢杆菌毒素的N末端酶结构域(链A)连同易位/成孔结构域，其连接炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白或者包含所述工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含：天然保护性抗原(PA)或突变PA(mPA)，其中mPA已被修饰(例如，以化学方式)或突变以便阻断其天然受体结合功能；以及可以靶向伤害感受器神经元表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽致死因子(LF)组合的形式。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子融合的炭疽保护性抗原(PA)部分和融合细胞内作用毒素催化结构域的炭疽致死因子结构域(LFn)；或包含工程化融合蛋白的组合物。ANTXR2为PA的天然受体。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽保护性抗原(mPA)部分，所述突变炭疽保护性抗原(mPA)部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或伤害感受器离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域；或包含工程化融合蛋白的组合物。ANTXR2为PA的天然受体。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白或者包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(PAd4)。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白或者包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白或者包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含与梭状芽孢杆菌神经毒素L链和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。在一个实施方案中，此融合蛋白可以还包括梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的区带，所述区带为H链的N末端区段。
可以根据本文所述的方法治疗的疼痛的非限制性实例可包括：慢性疼痛；慢性神经性疼痛；糖尿病痛性神经病变(PDN)、带状疱疹后遗神经痛(PHN)；三叉神经痛(TN)；炎性疼痛；神经性疼痛；离子通道病；原发性红斑性肢痛(PE)；阵发性剧痛症(PEPD)；脊髓损伤疼痛；多发性硬化症疼痛；幻肢疼痛；中风后疼痛；慢性背痛；骨关节炎疼痛；癌症相关联的疼痛；HIV相关联的疼痛；慢性炎性疼痛；中枢神经病变；周围神经病变；痛性感觉缺失；痛觉过敏(hyperalgesia)；痛觉过度(hyperpathia)；感觉异常；心理性疼痛；背痛；爆发痛(breakthrough pain)；红斑性肢痛；神经压迫和/或卡压[例如，腕管综合征综合征、踝管综合征、尺神经卡压、压迫神经根病变、神经根腰痛、脊神经根病损(spinal root lesion)、脊神经根压迫、腰椎管狭窄症、坐骨神经压迫和/或肋间神经痛]；神经炎；化疗导致的疼痛；慢性酒精中毒(酒精性多神经病变)；类风湿性关节炎疼痛；与烧伤相关联的疼痛；脑炎疼痛；骨折疼痛；神经炎疼痛；自身免疫疾病疼痛；手术后疼痛；牙痛；与细菌感染相关联的疼痛，例如细菌感染或病毒感染；与放疗相关联的疼痛；与痛风和肠易激综合征相关联的疼痛；外伤(诸如撕裂、切口、烧伤、异物或子弹和/或榴霰弹伤害、脊髓损伤、臂丛神经损伤、神经挤压和/或卡压)导致的疼痛；神经切断；内脏痛(诸如肾或输尿管绞痛、肠易激综合征、心绞痛或心脏疼痛、心律失常、痛经、间质性膀胱炎、直肠疼痛、与腹泻相关联的疼痛、阑尾炎、胆囊炎和胰腺炎)；尿毒症疼痛；与甲状腺功能减退相关联的疼痛；与维生素缺乏相关联的疼痛；头痛性疼痛(例如，紧张性头痛、偏头痛性头痛和丛集性头痛)；特发性疼痛(例如，三叉神经痛、复杂性区域疼痛综合征[例如I型复杂性区域疼痛综合征和/或II型复杂性区域疼痛综合征]、异常性疼痛或纤维肌痛)；呼吸疼痛(例如，与哮喘相关联的疼痛、哮喘的气道高反应性、慢性咳嗽，例如在哮喘和/或慢性阻塞性肺病中)；纤维肌痛；激素疗法疼痛；甲状腺功能减退疼痛；癫痫性疼痛；共济失调；周期性麻痹；急性瘙痒和/慢性瘙痒疼痛。
在一个实施方案中，待通过使用本文所述的组合物中任一种治疗的疼痛选自糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛和其他全身性疼痛病症。
在一个实施方案中，待通过使用本文所述的组合物中任一种治疗的疼痛选自神经、关节、皮肤、内脏、膀胱和肌肉疼痛。
在一个实施方案中，待施用的组合物包含第一多肽(或融合蛋白)和第二多肽(或融合蛋白)，并且第一多肽在施用之前结合第二多肽。
在另一个方面中，本文描述一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的第一组合物，其包含：
a)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分；和/或
b)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及
c)第二组合物，其包含：
(i)炭疽毒素易位信号肽，其与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合；
(ii)炭疽毒素易位肽，其与细胞内作用毒素催化结构域融合；和/或
(iii)炭疽毒素水肿因子(EF)和/或炭疽毒素致死因子(LF)。
在涉及治疗疼痛的方法的方面中任一项中，施用可以通过鞘内输注或脑室内输注或硬膜外注射到中枢神经系统中，或者通过使用皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射的外周施用来执行。
因此，在一个实施方案中，本文描述一种用于治疗神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛的方法，其包括通过真皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射来向有需要的受试者外周地施用有效的、疼痛减轻量的如本文所述的组合物。
在另一个实施方案中，本文描述一种用于治疗糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症的方法，其包括通过硬膜外注射、鞘内输注或脑室内输注到有需要的受试者的中枢神经系统中来施用有效的、疼痛减轻量的如本文所述的组合物。
在治疗本文所述的方法中任一种的一个实施方案中，有效的、疼痛减轻量的如本文所述的组合物在施用包含在药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中的炭疽保护性抗原(PA)的组合物之前、同时或之后单独施用。
在本文所述的治疗疼痛的方法的一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
在本文所述的一个方面的一个实施方案中，在所述方面中PA为用于疼痛治疗所施用的融合蛋白的一部分或组合物的一部分，PA或mPA以低聚物形式施用。在一个实施方案中，低聚物PA或mPA由蛋白水解激活PA或mPA(或其突变体)形成以实现对带有受体的细胞的亲合力增加。通过非限制性实例，PA可以用胰蛋白酶处理以切割然后在离子交换柱上分开两个片段(例如PA63和PA20)。PA63将洗脱为低聚物(例如七聚物)并且如果保持pH高于约pH8.0，那么将保持蛋白水解激活前孔状态。低聚物和/或蛋白水解激活PA的制备在本领域中有所描述，例如Milne等人,JBC 269:20607-20612,1994；其以引用的方式整体并入本文。
在涉及施用第一和第二组合物的方面的一个实施方案中，第一组合物包含i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分和ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，所述突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合。在另一个实施方案中，所述实施方案包括施用第一组合物，所述第一组合物包含i)炭疽毒素保护性抗原(PA)部分和ii)已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分，所述突变炭疽毒素保护性抗原(mPA)部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合，两种不同的第一多肽呈低聚物形式，使得低聚物复合物包含两种多肽。在一个实施方案中，第一组合物在施用第二组合物之前、同时或之后以单独注射的形式施用。
本文所述的组合物和方法可以向患有或诊断为患有疼痛的受试者施用。因此，本文所述的方法涵盖向受试者施用有效量的本文所述的组合物以缓解疼痛。如本文所用，“缓解疼痛”为改善与疼痛相关联的任何病状或症状。与等效未治疗对照相比，如通过任何标准技术所测量，此类减轻为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％。用于向受试者施用本文所述的组合物的多种手段为本领域的技术人员已知的。此类方法可包括但不限于口服、肠胃外、静脉内的、肌肉内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、肺部、皮肤、局部、注射或瘤内施用。施用可为局部或全身性的。
如本文所述的术语“有效量”是指缓解疾病或病症的至少一种或多种症状所需的组合物的量，并且涉及足以提供所需效应的药理学组合物的量。因此术语“治疗有效量”是指当向典型受试者施用时提供特定止痛效应的组合物的量。在各种语境下，如本文所述的有效量同样包括足以延缓疾病症状的发展、改变症状疾病的时程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不可行的。但是，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验方法确定。
可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定有效量、毒性和治疗功效，所述标准药物程序例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。所述剂量可以根据所采用的剂型和使用的施用途径而改变。毒性效应与治疗效应之间的剂量比为治疗指数并且可表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物和方法为优选的。最初可从细胞培养物测定评估治疗有效剂量。同样，在动物模型中可配制剂量以获得包括如在细胞培养物中或在适当动物模型中所确定的IC50(即，获得症状的半数最大抑制的活性成分浓度)的循环血浆浓度范围。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。可以通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。可以由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗效果。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，本文所述的技术涉及如本文所述并且任选地与药学上可接受的载剂组合的药物组合物。药学上可接受的载剂和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载剂和稀释剂的使用为本领域中熟知的。可用作药学上可接受的载剂的物质的一些非限制性实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基磺酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原质的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，诸如乙醇；以及(23)药物制剂中所采用的其他无毒相容物质。制剂中还可以存在润湿剂、着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。术语诸如“赋形剂”、“载剂”、“药学上可接受的载剂”等在本文可互换使用。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，载剂抑制活性药剂例如如本文所述的组合物的降解。
在涉及药物组合物的本文所述的任何方面的一个实施方案中，药物组合物可为肠胃外剂型。因为肠胃外剂型的施用通常绕过患者对抗污染物的天然防御，所以肠胃外剂型优选为无菌的并且能够在向患者施用之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于易于注射的溶液、易于溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒介物的干燥产物、易于注射的混悬液和乳液。此外，可以制备控制释放肠胃外剂型以用于患者的施用，包括但不限于型剂型和剂量倾卸。
可用于提供肠胃外剂型的合适媒介物为本领域的技术人员熟知的。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，诸如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒介物，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，诸如但不限于玉米油、棉子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苯甲酯。还可以将改变或修改如本文所公开的组合物的药学上可接受的盐的溶解度的化合物并入到本公开的肠胃外剂型中，包括常规和控制释放肠胃外剂型。
常规剂型一般提供从制剂的快速或立即药物释放。根据药物的药理学和药代动力学，常规剂型的使用可引起患者血液和其他组织中药物浓度的大波动。这些波动可影响许多参数，诸如剂量频率、起效、功效持续时间、治疗血液水平的维持、毒性、副作用等。有利的是，控制释放制剂可用于控制药物起效、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和峰值血液水平。尤其是，控制释放或延长释放剂型或制剂可用于确保实现药物的最大有效性同时维持潜在的不良影响和安全性考虑，上述可能由药物给药不足(即，低于最小治疗水平)以及药物的毒性水平过量引起。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，组合物可以呈持续释放制剂的形式施用。
控制释放药物产品的共同目标在于改进药物疗法超过其非控制释放对应物所实现的药物疗法。理想情况下，在医学治疗中使用最佳设计的控制释放制备物的特征在于采用最少量原料药在最少量的时间内治愈或控制病状。控制释放制剂的优点包括：1)药物活性延长；2)剂量频率减小；3)患者顺从性增加；4)使用较少的总药量；5)局部或全身性副作用减少；6)使药物累积最小化；7)血液水平波动减少；8)治疗功效改进；9)药物活性的增强或损失减少；以及10)疾病或病状的控制速度改进。Kim,Cherng-ju,Controlled ReleaseDosage Form Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000)。
大部分控制释放制剂被设计成初始释放迅速产生所需治疗效果的量的药物(活性成分)，并且逐渐和连续地释放其他量的药物以便在一段较长时间段内保持这种治疗或预防效果的水平。为了在体内保持这种恒定水平的药物，必须从所述剂型以将会替换从所述体内代谢和排出的药物的量的速率释放所述药物。活性成分的控制释放可以通过各种条件刺激，所述条件包括但不限于pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水和其他生理条件或化合物。
多种已知控制释放或延长释放剂型、制剂和装置可以适于与本公开的盐和化合物一起使用。实例包括但不限于美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；以及6,365,185B1中所述的那些；所述专利中的每个均以引用的方式并入本文。这些剂型可用于使用例如不同比例的羟甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透性系统(诸如(Alza Corporation,Mountain View,Calif.USA))或其组合提供所需释放特性以提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放。
本文所述的方法还可包括向受试者施用第二药剂和/或治疗例如作为组合疗法的一部分。第二药剂和/或治疗的非限制性实例可包括止痛剂、抗炎剂和治疗疼痛和/或引起疼痛的病状的其他药物。
在涉及施用有效剂量的组合物的本文所述的任何方面的一个实施方案中，有效剂量的如本文所述的组合物可向患者施用一次。在另一个实施方案中，有效剂量的组合物可向患者重复施用。对于全身性施用，受试者可被施用治疗量的如本文所述的组合物，诸如像0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。
在涉及施用用于治疗疼痛的组合物的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，在初始治疗方案之后，可以基于较低频率施用治疗。例如，在每双周治疗持续三个月之后，治疗可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长时间。根据本文所述的方法的治疗可减小病状的标志物或症状的水平，例如减轻疼痛至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
可以由医师确定如本文所述的组合物的剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗效果。至于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常对受试者进行监测以确定治疗提供治疗益处的时间，并且确定是增加还是减小剂量；增加还是减小施用频率；是中止治疗、恢复治疗还是对治疗方案做出其他改变。给药排程可以根据许多临床因素(诸如受试者对组合物的敏感性)来从每周一次变化至每天。所需剂量或量的激活可以一次性施用或分成亚剂量(例如2-4个亚剂量)并且在一段时间内例如在全天以适当间隔或其他适当排程进行施用。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，施用可为长期的，例如，在数周或数月的一段时间内施用一个或多个剂量和/或治疗。给药和/或治疗排程的实例为在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间的一段时间内每天、每天两次、每天三次或每天四次或更多次施用。可以在一段时间内，诸如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟时期内施用组合物。
根据本文所述的方法，施用如本文所述的组合物的剂量范围取决于例如活性成分的形式、其效能以及本文所述的病状的症状、标志物或指示物需要减小的程度例如针对疼痛所需的减小百分比。剂量不应太大而引起不良的副作用。一般来讲，剂量将随着患者的年龄、病状和性别而变化且可由本领域的技术人员确定。如果有任何并发症，那么剂量同样可由个别医师调整。
组合物在例如治疗本文所述的病状或者诱导如本文所述的应答(例如疼痛减轻)中的功效可由熟练的临床医生确定。但是，如果以有益的方式改变了本文所述的病状的征象或症状中的一种或多种，其他临床上接受的症状被改进或甚至改善，或者在根据本文所述的方法治疗之后诱导所需应答例如至少10％，那么认为治疗为如本文所使用的术语“有效治疗”。功效可以例如通过测量根据本文所述的方法所治疗的病状的标志物、指示物、症状和/或发生率或者其他可测量的适当参数来评估。功效还可以通过如通过住院所评估个体不再恶化或者需要医疗干预(即，疾病的进展停止)来测量。测量这些指示物的方法为本领域的技术人员已知的和/或为本文所述的。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人类或动物)疾病的任何治疗并且包括：(1)抑制疾病，例如，预防症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如，引起疾病消退。治疗疾病的有效量意指当向有需要的受试者施用时，足以导致针对所述疾病的有效治疗(如本文所定义的术语)的量。药剂的功效可以通过评估病状或所需应答的身体指示物来确定。通过测量此类参数中任何一个或参数的任何组合来监测施用和/或治疗的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。可以在本文所述的病状的动物模型中评估功效，例如疼痛的小鼠模型的治疗。当使用实验动物模型时，当观察到标志物的统计学上显著的变化(例如受影响区域中刺激的应答或避开)时，治疗的功效为明显的。
为方便起见，说明书、实施例和随附权利要求书中所用的一些术语和短语的含义提供如下。除非另行指出或从上下文暗示，否则下列术语和短语包括以下所提供的含义。提供定义是为了有助于描述特定实施方案，并且不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求限制。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果本领域中术语的使用与本文所提供的其定义之间存在明显差异，那么应以说明书内所提供的定义为准。
定义
为了方便起见，在此集中了本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。
如本文所用，术语“能够”当与动词一起使用时涵盖或意指对应动词的动作。例如，“能够阻断”同样意指阻断，“能够裂解”同样意指裂解，“能够结合”同样意指结合，“能够易位”同样意指易位，并且“能够特异性靶向……”同样意指特异性靶向。
如本文所用，“伤害感受器神经元结合蛋白”或“伤害感受器结合蛋白”当结合本文所述的融合蛋白使用时是指能够结合伤害感受器神经元上的结合位点的多肽靶向性部分(TM)，其中相互作用导致经历内吞的神经元的结合位点并入到伤害感受器神经元内的内体中。在一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为结合在伤害感受器神经元的细胞表面上表达的受体或离子通道(例如，神经生长因子受体、或ANTXR2、或Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9离子通道蛋白)的抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为伤害感受器神经元的细胞表面受体的配体，例如，神经生长因子受体的神经生长因子配体。在一个实施方案中，伤害感受器神经元结合蛋白为能够结合其受体ANTXR2的PA、或PA的变体形式、或其PA片段。在一个实施方案中，TM靶标结合在伤害感受器神经元上表达的ANTXR2(CMG2)受体。
在一个实施方案中，能够结合或者结合其受体的PA的变体形式耐弗林蛋白酶和弗林蛋白酶类蛋白酶。在一个实施方案中，PA的变体形式在弗林蛋白酶裂解位点处被修饰(例如，以化学方式)或突变。在一些实施方案中，PA弗林蛋白酶-在弗林蛋白酶裂解位点164RKKR167处被突变成氨基酸残基SSSR(SEQ ID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)。氨基酸编号参考在N末端不具有29个残基信号肽的PA多肽。在一个实施方案中，能够结合其受体的其PA片段为PA63(通过全长PA蛋白的弗林蛋白酶裂解产生的片段)和PAd4(全长天然PA的C末端受体结合部分)。在一个实施方案中，能够结合其受体的其PA片段为PAd4加天然PA中PAd4结构域N末端的至少1-60个连续氨基酸残基，意指估计PAd4序列加另外的上游序列为PA的C末端受体结合区段。
术语“减少”、“减轻”、“降低”或“抑制”在本文所有均用于意指减少统计上显著的量。在一些实施方案中，“减轻”、“降低”、或“减少”、或“抑制”通常意指与参考水平(例如不存在给定治疗的情况下)相比减少至少10％并且可包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“减轻”或“抑制”不涵盖与参考水平相比完全抑制或减轻。“完全抑制”为与参考水平相比100％抑制。减少可优选地降至被认为就不具有给定病症的个体而言在正常范围内的水平。
术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活”在本文所有均意指增加统计上显著的量。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活”可以意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达并包括100％增加、或在10-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍增加、或在2倍与10倍之间的任何增加或更大。在标志物或症状的语境下，“增加”为此类水平的统计学上显著的增加。
如本文所用，“受试者”意指人类或动物。通常动物为脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猕猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家畜和野生动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫物种(例如，家猫)、犬物种(例如，狗、狐狸、狼)、鸟物种(例如，雏鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和大麻哈鱼)。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者为哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除人类之外的哺乳动物可以有利地用作表示疼痛的动物模型的受试者。受试者可为雄性或雌性。
受试者可为先前诊断有或识别为罹患或患有需要治疗的病状(例如疼痛)，或者与此类病状相关的一种或多种并发症，并任选已经历过对疼痛或与疼痛相关的一种或多种并发症的治疗的受试者。可替代地，受试者还可为先前未诊断为患有疼痛或与疼痛相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可为表现出疼痛或与疼痛相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的受试者或未表现出风险因素的受试者。
针对特定病状的“需要治疗的受试者”可为患有所述病状、诊断为患有所述病状、或处于发展所述病状的风险的受试者。
如本文所述，“工程化”是指通过人手部来操纵的方面。例如，当通过人手部所操纵的多肽序列和/或编码核酸序列不同于其天然表现出的多肽序列时，认为融合多肽为“工程化”的。如同常见实践，并且本领域技术人员应了解，工程化多核苷酸和/或多肽的子代和拷贝通常仍被称为“工程化”的，即使对先前实体执行实际操纵也是如此。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换用于指定通过α-氨基与相邻残基的羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括修饰氨基酸(例如，磷酸化氨基酸、糖化氨基酸、糖基化氨基酸等)和氨基酸类似物，不管其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”常用于指相对大的多肽，而属于“肽”常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用有重叠。当指代基因产物和其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述的片段和其他等效物、变体、片段、和类似物。
在本文所述的所有方面的一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽或其部分(例如，结构域))可为本文所述的序列的变体。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，变体为保守取代变体。如在本文指代的“变体”为大致上与天然或参考多肽同源，但其氨基酸序列由于缺失、插入或取代中的一种或多种而不同于天然或参考多肽的氨基酸序列的多肽。编码多肽的DNA序列涵盖这样的序列，当与天然或参考DNA序列相比时其包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是其编码保留了相对于参考蛋白的相对生物活性(例如，野生型参考蛋白的至少50％)的变体蛋白或其片段。至于氨基酸序列，技术人员将认识到在被编码的序列中改变单个氨基酸或小百分比(即，5％或更小，例如，4％或更小、或3％或更小、或1％或更小)的氨基酸的针对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变体”，其中改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。预期一些变化可潜在地改进相对活性，是的变体(不管是否为保守的)具有多于100％的野生型活性，例如110％、125％、150％、175％、200％、500％、1000％或更多。
给定氨基酸可以被具有类似生理化学特征的残基代替，例如，用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基(诸如用Ile、Val、Leu或Ala取代另一个)，或用一个极性残基取代另一个极性残基(诸如在Lys与Arg；Glu与Asp；或Gln与Asn之间)。其他此类保守取代(例如，具有类似疏水性特征的整个区域的取代)为已知的。包含保守氨基酸取代的多肽可以在本文所述的测定中任一种中进行测试以确认天然或参考多肽的所需活性得以保留。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。此类保守修饰变体附加于并且不排除与本公开一致的多态变体、种间同源物和等位基因。通常为彼此的保守取代包括：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
通常还可用丝氨酸取代不涉及维持多肽正确构象的任何半胱氨酸残基，以改进分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反地，可以向多肽添加半胱氨酸键以改进其稳定性或促进低聚化。
在涉及施用多肽的本文所述的任何方面的一个实施方案中，向受试者施用的多肽可包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一个实施方案中，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在受试者中的半衰期。在一个实施方案中，多肽可通过将其缀合或融合另一多肽或多肽结构域(诸如，通过非限制性实例，转铁蛋白(WO06096515A2)、白蛋白(Yeh等人,1992)、生长激素(US2003104578AA)；纤维素(Levy和Shoseyov,2002)和/或Fc片段(Ashkenazi和Chamow,1997))来修饰。前述段落中的参考文献均以引用的方式整体并入本文。
在涉及多肽的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，如本文所述的多肽可包含至少一个肽键代替。单个肽键或多个肽键，例如2个键、3个键、4个键、5个键、或6个或更多个键、或所有肽键均可被代替。如本文所述的分离肽可包含一种类型的肽键代替或多种类型的肽键代替，例如2种类型、3种类型、4种类型、5种类型或更多种类型的肽键代替。肽键代替的非限制性实例包括脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲、三氟乙胺、邻(氨基烷基)-苯乙酸、对(氨基烷基)-苯乙酸、间(氨基烷基)-苯乙酸、硫代酰胺、四唑、硼酸酯、烯属基团和其衍生物。
在涉及多肽的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，如本文所述的多肽可包含常存在于活有机体所产生的多肽和/或蛋白质中的天然存在的氨基酸，例如Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Glu(E)、Lys(K)、Arg(R)和His(H)。在涉及多肽的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，如本文所述的多肽可包含替代氨基酸。替代氨基酸的非限制性实例包括D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐；马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰基苯基丙氨酸、对氨基苯基丙氨酸、对氟苯基丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和叔丁基甘氨酸)、二氨基丁酸、7-羟基-四氢异喹啉羧酸、萘基丙氨酸、联苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、氨基-异丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、四氢异喹啉羧酸、哌可酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、环己基甘氨酸、脱氢亮氨酸、2,2-二乙基甘氨酸、1-氨基-l-环戊烷羧酸、1-氨基-l-环己烷羧酸、氨基-苯甲酸、氨基-萘甲酸、γ-氨基丁酸、二氟苯基丙氨酸、哌啶甲酸、α-氨基丁酸、噻吩基-丙氨酸、叔丁基甘氨酸、三氟缬氨酸；六氟亮氨酸；氟化类似物；叠氮化物修饰的氨基酸；炔烃修饰的氨基酸；氰基修饰的氨基酸；以及其衍生物。
在涉及多肽的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，多肽可以例如通过将一部分添加到构成所述肽的氨基酸中的一个或多个来修饰。在一个实施方案中，如本文所述的多肽可包含一个或多个部分分子，例如每个肽1个或多个部分分子、每个肽2个或多个部分分子、每个肽5个或多个部分分子、每个肽10个或多个部分分子或每个肽更多个部分分子。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的多肽可包含一种或多种类型的修饰和/或部分，例如1种类型的修饰、2种类型的修饰、3种类型的修饰或更多种类型的修饰。修饰和/或部分的非限制性实例包括聚乙二醇化；糖基化；HES化；ELP化；脂化；乙酰化；酰胺化；封端(end-capping)修饰；氰基；磷酸化；白蛋白和环化。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，封端修饰可包括N末端乙酰化、N末端酰化和N末端甲酰化。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，封端修饰可包括C末端酰胺化，即进入C末端醇、醛、酯和硫酯部分。多肽的半衰期可以通过添加部分例如PEG或白蛋白来增加。
在涉及施用多肽(或施用编码多肽的核酸)的本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，所施用或编码的多肽可为本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”为根据本文以下所述的测定保留至少50％的野生型参考多肽活性的肽的片段或区段。功能片段可包含本文所公开的序列的保守或非保守取代。
原始氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的许多技术中任一种来完成。氨基酸取代可以例如在特定位置通过合成在编码待改变的氨基酸的核苷酸序列中含有密码子变化的寡核苷酸来引入，其侧接允许接合原始序列片段的限制位点。在接合之后，所得重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，寡核苷酸定向位点特异性诱变程序可用于提供具有根据所需取代、缺失或插入改变的特定密码子的改变核苷酸序列。用于进行此类改变的技术包括Walder等人(Gene 42:133,1986)；Bauer等人(Gene37:73,1985)；Craik(BioTechniques,1985年1月,12-19)；Smith等人(GeneticEngineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)；以及美国专利号4,518,584和4,737,462中所公开的技术，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，如本文所述的多肽可为化学合成的，并且突变可以作为化学合成过程的一部分并入。
如本文所使用，“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或其抗原特异性抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scfv、双功能抗体)，不管它们是来源于天然产生抗体的任何物种还是通过重组DNA技术产生；不管是分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌。
如本文所述，“抗原”为在抗体药剂上通过结合位点结合的分子。通常，抗原通过抗体配体结合并且能够升高体内抗体应答。抗原可为多肽、蛋白质、核酸或其他分子或其部分。术语“抗原决定簇”是指表位或者通过抗原结合分子并且更具体地说通过分子的抗原结合位点所识别的抗原。
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白免疫结构域序列并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可包含抗体或者包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，抗体试剂可包含单克隆抗体或者包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(参见例如deWildt等人,Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；其以引用的方式整体并入本文))以及完全抗体。抗体可具有结构特征IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型和组合)。抗体可来自任何来源，包括小鼠、兔子、猪、大鼠和灵长类动物(人类和非人类灵长类动物)以及灵长类化抗体。抗体还包括微抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
VH和VL区可进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，其间散布着较保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。框架区和CDR的范围已经被精确定义(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH出版号91-3242和Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；所述参考文献以引用的方式整体并入本文)。各VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序由氨基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”可在本文互换使用并且用于指代全长抗体的保留特异性结合目标靶标的能力的一个或多个片段。涵盖在术语全长抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括通过二硫桥键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH或VL结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546；其以引用的方式整体并入本文)；以及(vi)保留特异性抗原结合功能性的分离的互补决定区(CDR)。如本文所用，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或粒子之间的化学相互作用，其中第一实体以大于其结合不是靶标的第三实体的特异性和亲和力结合第二靶实体。在本文所述的所有方面的一些实施方案中，特异性结合可以指第一实体对第二靶实体的亲和力，其比对第三非靶实体的亲和力大至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更大。
此外，并且如本文所述，抗体可针对在人类中的疗法被进一步优化以降低潜在的免疫原性同时维持功能活性。就这一点而言，功能活性意指能够显示一种或多种已知的与如本文所述的重组抗体或其抗体药剂相关联的功能活性的多肽。此类功能活性包括例如结合靶分子的能力。
如本文所述，术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选为聚合物分子。核酸可为单链或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一个核酸链。可替代地，其可为不是来源于任何双链DNA的单链核酸。在一个方面中，核酸可为DNA。在另一个方面中，核酸可为RNA。合适的核酸分子为DNA，包括基因组DNA或cDNA。其他合适的核酸分子为RNA，包括mRNA。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目标为逆转、缓解、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症相关联的病状(例如疼痛)的进展或严重程度。术语“治疗”包括降低或缓解与疼痛相关联的病状、疾病或病症的至少一个不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，那么治疗大体为“有效”。可替代地，如果疾病的进展减小或停止，那么治疗为“有效”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改进，而且还包括与在不进行治疗的情况下所预期到的相比，使症状的进展或恶化中止或至少减慢。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或是不可检测。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的减轻(包括姑息性治疗)。
如本文所用，术语“医药组合物”是指与药学上可接受的载剂例如制药工业中常用的载剂组合的活性药剂。本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“施用”是指通过使得药剂至少部分递送于期望位点的方法或途径将如本文公开的化合物放置于受试者中。包含本文所公开的化合物的药物组合物可通过导致受试者的有效治疗的任何适当途径来施用。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且一般意指两个标准偏差(2SD)较大差异。
除在操作实施例中以外，或当另外指示时，本文使用的表示成分或反应条件的量的所有数值都应被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。术语“约”在与百分比关联使用时可意指±1％。
如本文中所用，术语“包括(comprising/comprises)”是在提到组合物、方法和所述方法或组合物所必不可少的其相应组分时使用的，并且可以包括未指定的元素，无论所述元素是否必不可少。
术语“由…组成”是指如本文所述的组合物、方法和其相应组分不包括实施方案的描述中未描述的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由…组成”是指那些要素是既定实施方案所需的。所述术语允许存在不实质上影响所述实施方案的基本特和新颖或功能特征的要素。
除非上下文另外清楚地指示，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或”意图包括“和”。尽管在实施或测试本公开时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述适合的方法和材料。缩写“e.g.”源于拉丁语例如(exempli gratia)并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
如本文所用，融合蛋白中所包括的蛋白酶活性涵盖能够裂解真核细胞中胞吐融合器的一种或多种蛋白质的所有非细胞毒性蛋白酶。蛋白酶优选为细菌蛋白酶(或其片段)。更优选地，细菌蛋白酶选自梭状芽孢杆菌属或奈瑟氏球菌属/链球菌属(例如，梭状芽孢杆菌L链或优选来自淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)的奈瑟氏球菌IgA蛋白酶)。非细胞毒性蛋白酶的另一实例包括蝎子毒液蛋白酶(诸如来自巴西锯齿幽灵蝎(Brazilian scorpion Tityus serrulatus)的那些)或蛋白酶antarease。
蛋白酶活性还涵盖变体非细胞毒性蛋白酶(即，天然存在的蛋白酶分子的变体)的活性，只要变体蛋白酶仍显示必需的蛋白酶活性即可。通过举例的方式，变体可与参考蛋白酶序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、并且最优选至少95％或至少98％氨基酸序列同源性。因此，术语变体包括内肽酶活性增强(或降低)的非细胞毒性蛋白酶，此处特别提及的是BTx/A突变体Q161A、E54A和K165L的Kcat/Km增加，参见Ahmed,S.A.(2008)Protein J.DOI 10.1007/s10930-007-9118-8，其以引用方式并入本文。术语片段当关于蛋白酶使用时通常意指具有参考蛋白酶的至少150、优选至少200、更优选至少250、并且最优选至少300个氨基酸残基的肽。与TM‘片段’组分(上文讨论的)一样，本发明的蛋白酶‘片段’涵盖基于参考序列的变体蛋白酶的片段。
在本文所述的方面中任一项的一个实施方案中，融合蛋白中所包括的蛋白酶活性显示丝氨酸或金属蛋白酶活性(例如，内肽酶活性)。在一个实施方案中，蛋白酶特异于SNARE蛋白(例如，SNAP-25、小突触泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白)。
特别提及的是神经毒素的蛋白酶结构域，例如细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此，本文所述的各种方面涵盖天然存在的神经毒素结构域以及此类天然存在的神经毒素的重组制备型式的用途。
示例性神经毒素由梭状芽孢杆菌产生，并且术语梭状芽孢杆菌神经毒素涵盖由破伤风芽孢杆菌(C.tetani,TTx)产生的神经毒素、和由肉毒梭状芽孢杆菌(BTx)血清型A-G产生的神经毒素、以及由巴氏梭状芽孢杆菌(C.baratii)和丁酸梭状芽孢杆菌(C.butyricum)所产生的紧密相关的BTx类神经毒素。上文提及的缩写在本说明书通篇使用。例如，命名BTx/A表示神经毒素来源为BTx(血清型A)。对应命名应用于其他BTx血清型。
BTx为已知最强力的毒素，根据血清型，其对于小鼠的半数致死剂量(LD50)的范围为0.5至5ng/kg。BTx吸附于胃肠道中，并且在进入体循环之后，结合至胆碱能神经末梢的突触前膜并阻止其神经递质乙酰胆碱的释放。BTx/B、BTx/D、BTx/F和BTx/G裂解小突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BTx/C、BTx/A和BTx/E裂解25kDa的突触小体相关蛋白(SNAP-25)；并且BTx/C裂解突触融合蛋白。
BTx共享共用结构，即约150kDa的双链蛋白，其由通过单个二硫键共价接合到约50kDa的轻链(L链)的约100kDa的重链(H链)组成。H链由两个结构域组成，每个结构域约50kDa。C末端结构域(HC)为高亲和力神经元结合所需的，而N末端结构域(HN)被提出涉及膜易位。L链为导致底物SNARE蛋白裂解的锌依赖性金属蛋白酶。
术语L链片段为神经毒素的L链的组分，所述片段显示金属蛋白酶活性并且能够蛋白水解裂解涉及细胞胞吐作用的囊泡和/或血浆膜相关蛋白。
合适蛋白酶(参考)序列的实例包括：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-448)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-440)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-441)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-445)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-422)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-439)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(1-441)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(1-457)
IgA蛋白酶-氨基酸残基(1-959)Pohlner,J.等人(1987).Nature 325,第458-462页,其以引用的方式并入本文。
在具有非细胞毒素蛋白酶的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，非细胞毒素蛋白酶可为IgA蛋白酶或本文所述的Antarease。在具有非细胞毒素蛋白酶的本文所述的融合蛋白的一个实施方案中，非细胞毒素蛋白酶可具有以下页面中所述的独特裂解识别序列。
多种包含轻链的梭状芽孢杆菌毒素片段可用于本发明的方面中，条件是这些轻链片段可特异性靶向神经递质释放器的核心组分，且因此参与执行梭状芽孢杆菌毒素借以蛋白水解裂解底物的总体细胞机制。梭状芽孢杆菌毒素的轻链长约420-460个氨基酸且包含酶促结构域。研究已显示酶促结构域的酶促活性未必需要梭状芽孢杆菌毒素轻链的全长。作为一个非限制性实例，BTx/A轻链的前八个氨基酸不为酶促活性所需。作为另一非限制性实例，TTx轻链的前八个氨基酸不为酶促活性所需。同样，轻链的羧基末端不为活性所必需。作为一个非限制性实例，BTx/A轻链的最后32个氨基酸(残基417-448)不为酶促活性所需。作为另一个非限制性实例，TTx轻链的最后31个氨基酸(残基427-457)不为酶促活性所需。因此，此实施方案的方面可包括包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少450个氨基酸的酶促结构域的梭状芽孢杆菌毒素轻链。此实施方案的其他方面可包括包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸和至多450个氨基酸的酶促结构域的梭状芽孢杆菌毒素轻链。
合适的非细胞毒性蛋白酶的另外实例详细描述于WO 2007/106115中，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶裂解非神经元SNARE蛋白诸如SNAP-23蛋白。在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶为能够裂解SNAP-23的修饰肉毒毒素L链。此一修饰L链的一个实例描述于Chen及Barbieri,PNAS,第106卷,第23期,第9180-9184页,2009。
在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶为BTx/A、BTx/C或BTx/E蛋白酶，且优选的SNARE基序为SNAP(例如SNAP 25)基序。
在另一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶为BTx/B、BTx/D、BTx/F或BTx/G、或破伤风神经毒素(TTx)蛋白酶，且优选的SNARE基序为VAMP基序。
在另一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶为BTx/C1蛋白酶，且优选的SNARE基序为突触融合蛋白基序。
本文所述的工程化融合蛋白的非细胞毒性蛋白酶识别不同裂解位点序列，且因此具有略微不同的裂解特异性。
通过进一步举例，参考以下识别序列和裂解位点：
靶向性部分(TM)意指功能上与结合位点相互作用以在如本文所述的融合多肽与靶细胞表面之间引起物质缔合的任何化学结构。在本发明的上下文中，靶细胞为伤害感受器神经元。术语TM涵盖能够结合靶细胞上的结合位点的任何分子(即天然存在的分子、或其化学/物理修饰变体)，所述结合位点能够内化(例如内体形成)，也称为受体介导的内吞。TM可具有没提膜易位功能，在这种情况下分开的TM和易位结构域组分不必存在于本发明的药剂中。在前述描述通篇，已描述了具体的TM。对TM提及仅为示例性的，并且本发明涵盖其保留例示TM的基本结合(即靶向)能力的所有变体和衍生物。
根据本发明的TM包括抗体(例如抗体片段)和结合支架；尤其是出于结合(例如特异性地)靶细胞的目的所设计的可商购的抗体/片段和支架。
蛋白质支架表示补充治疗性单克隆抗体和衍生物诸如scFv、Fab分子、dAb(单结构域抗体)、骆驼抗体、双功能抗体和微型抗体的扩展库的新一代通用框架，所述单克隆抗体和衍生物可用作本发明的TM。支架系统通过新颖支架的产生或已知蛋白质结合结构域的修饰产生或修饰已知蛋白质识别结构域。此类支架包括但不限于：
(i)基于蛋白质A的支架，即亲和抗体(Nord,K.等人1997“Binding proteinsselected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptordomain”.Nat Biotechnol 15,772–777)；
(ii)基于脂质运载蛋白(lipocalin)的支架，即抗运载蛋白(anticalin)(Skerra2008“Alternative binding proteins:anticalins-harnessing the structuralplasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel bindingactivities”.FEBS J.275:2677-83)；
(iii)基于纤粘蛋白的支架，即adnectin(Dineen等人2008“The Adnectin CT-322is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumour burden in anorthotropic mouse model of pancreatic cancer”.BMC Cancer 8:352)；
(iv)高亲和性多聚体(avimer)(Silverman等人2005“Multivalent avimerproteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”.NatBiotechnol 23:1556-61)；
(v)基于锚蛋白的支架，即锚蛋白重复蛋白(darpin)(Zahnd等人2006“Selectionand characterization of Her2binding-designed ankyrin repeat proteins”.J BiolChem.281:35167-75)；以及
(vi)centyrin支架，其基于蛋白质折叠，所述蛋白质折叠与类似于CDR的具有Ig结构域具有显著的结构同源性。Ig结构域为人类蛋白质中的常见模块并且已广泛应用为替代的支架蛋白。上文‘支架’出版物中的每一个均以引用的方式(整体)并入本文。
结合支架可用于经由与具体细胞表面蛋白、受体、或其他细胞表面表位诸如糖基团相互作用来靶向特定细胞型。此类修饰支架可被工程化到本发明的基于重组非细胞毒性蛋白酶的多肽。
本发明的TM结合(优选特异性结合)到所讨论的伤害感受器神经元靶细胞。术语“特异性结合”优选意指既定TM以106M-1或更大、优选107M-1或更大、更优选108M-1或更大、并且最优选109M-1或更大的结合亲和力(Ka)结合靶细胞。术语“特异性结合”还可意指既定TM以106M-1或更大、优选107M-1或更大、更优选108M-1或更大、并且最优选109M-1或更大的结合亲和力(Ka)结合既定受体，例如伤害感受器上存在的ANTXR2、或NGFR、或Nav1.7、1.8和1.9离子通道。
本说明书中对TM的提及涵盖保留结合所讨论的靶细胞的能力的片段和其变体。通过举例的方式，变体可与参考TM(例如本说明书中所呈现的定义TM的任何SEQ ID NO)具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、并且最优选至少97％或至少99％氨基酸序列同源性。因此，变体可包括氨基酸的一个或多个类似物(例如非天然氨基酸)或取代键联。同样，通过举例的方式，术语片段当关于TM使用时意指具有参考TM的至少十、优选至少二十、更优选至少三十、并且最优选至少四十个氨基酸残基。术语片段还涉及上文提及的变体。因此，通过举例的方式，本发明的片段可包含具有至少10、20、30或40个氨基酸的肽序列，其中所述肽序列与参考序列的对应肽序列(连续)氨基酸相比具有至少80％序列同源性。
确认TM结合所选择的靶细胞是常规的。例如，可采用简单的放射性代替实验，在所述实验中将代表所讨论的靶细胞的组织或细胞在过量未标记TM存在下暴露于标记(例如氚化)TM。在此一实验中，可评估非特异性和特异性结合的相关比例，从而使得确认TM结合靶细胞。任选地，评估可包括一种或多种结合拮抗剂，并且评估可还包括观察TM结合的损失。这类实验的实例可见于Hulme,E.C.(1990),Receptor-binding studies,a briefoutline,第303-311页,Receptor biochemistry,A Practical Approach,E.C.Hulme编,Oxford University Press。
在本发明的上下文中，对肽TM的提及涵盖其肽类似物，只要所述类似物结合与对应‘参考’TM相同的受体即可。
本文所述的融合蛋白(本文还称为多肽)可缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素的功能HC(重链)或HC结构域(HC的C末端部分)。在一个实施方案中，多肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素海参毒素的最后50个C末端氨基酸。在另一个实施方案中，多肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素海参毒素的最后100、150、200、250或300个C末端氨基酸残基。可替代地，HC结合活性可通过诱变而不起作用/减小，通过举例的方式，为方便起见参考BTx/A，神经节苷酯结合袋中一个或两个氨基酸残基突变(W1266突变成L并且Y1267突变成F)的修饰使HC区损失其受体结合功能。可对非血清型A梭状芽孢杆菌肽组分进行类似的突变，例如基于具有突变的B型肉毒(W1262突变成L并且Y1263突变成F)或E型肉毒(W1224突变成L并且Y1225突变成F)的构建体。活性位点的其他突变实现HC受体结合活性的相同消融，例如A性肉毒毒素中的Y1267S和其他梭状芽孢杆菌神经毒素中的对应高保守残基。这种突变和其他突变的细节描述于Rummel等人(2004)(Molecular Microbiol.51:631-634)，其以引用的方式并入本文。
天然梭状芽孢杆菌神经毒素的HC肽包含大约400-440个氨基酸残基，并且由各自大约25kDa的两个功能不同的结构域组成，即N末端区(通常称为HN肽或结构域)和C末端区(通常称为HC肽或结构域)。此外，已充分显示，由C末端160-200个氨基酸残基组成的C末端区(HC)导致梭状芽孢杆菌神经毒素结合其天然细胞受体，即在神经肌肉接点处的神经末梢。因此，本说明书通篇对梭状芽孢杆菌重链缺乏功能重链HC肽(或结构域)使得重链不能结合天然梭状芽孢杆菌神经毒素所结合的细胞表面受体的提及意指梭状芽孢杆菌重链只是缺乏功能HC肽。换句话讲，Hc肽区部分或完全缺失或以其他方式被修饰(例如通过常规的化学或蛋白水解处理)以使其对神经肌肉接点处的神经末梢的天然结合能力失活。
因此，在一个实施方案中，梭状芽孢杆菌HN肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素的C末端肽部分(HC)的一部分，且因此缺乏天然梭状芽孢杆菌神经毒素的HC结合功能。通过举例的方式，在一个实施方案中，C末端延长梭状芽孢杆菌HN肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素重链的C末端40个氨基酸残基、或C末端60个氨基酸残基、或C末端80个氨基酸残基、或C末端100个氨基酸残基、或C末端120个氨基酸残基、或C末端140个氨基酸残基、或C末端150个氨基酸残基、或C末端160个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭状芽孢杆菌HN肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素的整个C末端肽部分(HC)，且因此缺乏天然梭状芽孢杆菌神经毒素的HC结合功能。通过举例的方式，在一个实施方案中，梭状芽孢杆菌HN肽缺乏梭状芽孢杆菌神经毒素重链的C末端165个氨基酸残基、或C末端170个氨基酸残基、或C末端175个氨基酸残基、或C末端180个氨基酸残基、或C末端185个氨基酸残基、或C末端190个氨基酸残基、或C末端195个氨基酸残基。通过进一步举例，本发明的梭状芽孢杆菌HN肽缺乏选自由以下组成的组的梭状芽孢杆菌HC参考序列：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)。
易位结构域为使蛋白酶能够易位到靶细胞，使得蛋白酶活性的功能表达发生在靶细胞的细胞溶质中的分子或蛋白质结构域。可通过许多常规测定中的任一种确认任何分子(例如蛋白质或肽)是否具有本发明的必需的易位功能。
例如，Shone C.(1987)描述采用脂质体的体外测定，其用测试分子进行攻击。必需的易位功能的存在通过从K+和/或NAD的脂质体的释放得到确认，其易于监测[例如ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem；第167(1)卷:第175-180页]。
Blaustein R.(1987)提供另一实例，其描述采用平面磷脂双层膜的简单体外测定。所述膜用测试分子攻击，并且通过跨所述膜的传导性增加来确认必需的易位功能[参见Blaustein(1987)FEBS Letts；第226卷,第1期:第115-120页]。
Methods in Enzymology第220和221卷,Membrane Fusion Techniques,部分A和B,Academic Press 1993提供合适用于本发明的实现膜融合的评估并因此实现易位结构域的鉴别的另外方法。
本发明还涵盖变体易位结构域，只要变体结构域仍显示必需的易位活性即可。通过举例的方式，变体可与参考易位结构域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、并且最优选至少95％或至少98％氨基酸序列同源性。术语片段当关于易位结构域使用时意指具有参考易位结构域的至少20、优选至少40、更优选至少80、并且最优选至少100个氨基酸残基的肽。就梭状芽孢杆菌易位结构域而言，片段优选具有参考易位结构域(例如HN结构域)的至少100、优选至少150、更优选至少200、并且更优选至少250个氨基酸残基。与TM‘片段’组分(上文讨论的)一样，本发明的易位‘片段’涵盖基于参考序列的变体易位结构域的片段。
易位结构域优选能够在低pH的条件下在脂质膜中形成离子可透过的孔。优选地，已发现仅使用蛋白质分子的那些部分能够在内体膜内成孔。
易位结构域可获自微生物蛋白质源，特别是喜欢或病毒蛋白质源。因此，在一个实施方案中，易位结构域为酶诸如细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域。
充分显示，细菌毒素分子的某些结构域能够形成此类孔。还已知，病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域能够形成此类孔。此类结构域可用于本发明。
易位结构域可为梭状芽孢杆菌来源，诸如HN结构域(或其功能组分)。HN意指大约等效于H链的氨基末端一半的梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的部分或片段，或对应于完成H链中所述片段的结构域。就这一点而言，应为所需的是去除HC细胞结合功能，这可通过删除HC或HC氨基酸序列来进行(以DNA合成水平、或以通过核酸酶或蛋白酶处理的合成后水平)。可替代地，HC功能可通过化学或生物处理来失活。
合适(参考)易位结构域的实例包括：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(449-871)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(441-858)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(442-866)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(446-862)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(423-845)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(440-864)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
上文所识别的参考序列应认为是指导，因为可能根据亚血清型发生稍微变化。通过举例的方式，US 2007/0166332(据此以引用的方式并入)引用稍微不同的梭状芽孢杆菌序列：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)
合适的易位结构域的另外实例详细描述于WO 2007/106115中，其以引用的方式整体并入本文。
在本发明的上下文中，多种包含易位结构域的梭状芽孢杆菌毒素HN区可用于本发明的方面中，条件是这些活性片段可促进非细胞毒性蛋白酶(例如梭状芽孢杆菌L链)从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中，并因此参与执行梭状芽孢杆菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭状芽孢杆菌毒素重链的HN区长大约410-430个氨基酸且包含易位结构域。研究已显示易位结构域的易位活性未必需要梭状芽孢杆菌毒素重链的HN区的全长。因此，实施方案可包括包含长度为例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸的易位结构域的梭状芽孢杆菌毒素HN区。其他施方案可包括包含长度为例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸的易位结构域的梭状芽孢杆菌毒素HN区。
对于肉毒梭状芽孢杆菌和破伤风芽孢杆菌中毒素产生的遗传基础的进一步细节，我们参考Henderson等人(1997),The Clostridia:Molecular Biology andPathogenesis,Academic press。
术语HN涵盖天然存在的神经毒素HN部分以及具有不是天然存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸残基的修饰HN部分，只要修饰HN部分仍显示上文所提及的易位功能即可。
可替代地，易位结构域可为非梭状芽孢杆菌来源。非梭状芽孢杆菌易位结构域来源的实例包括但不限于：白喉毒素的易位结构域[O＝Keefe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89,6202-6206；Silverman等人,J.Biol.Chem.(1993)269,22524-22532；和London,E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.,1112,第25-51页]；A型铜绿假单胞菌外毒素的易位结构域[Prior等人Biochemistry(1992)31,3555-3559]；炭疽毒素的易位结构域[Blanke等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]；多种具有易位功能的促融合或疏水性肽[Plank等人J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924；和Wagner等人(1992)PNAS,89,第7934-7938页]；以及两亲性肽[Murata等人(1992)Biochem.,31,第1986-1992页]。易位结构域可反映天然存在的蛋白质中存在的易位结构域，或可包括氨基酸变型，只要所述变型不破坏易位结构域的易位能力。
合适用于本文所述的化合物和方法的病毒易位结构域的特定实例包括病毒表达膜融合蛋白的某些易位结构域。例如，Wagner等人(1992)和Murata等人(1992)描述了来源于流感病毒血凝素的N末端区的许多促融合和两亲性肽的易位(即膜融合和囊泡形成)功能。已知具有所需易位活性的其他病毒表达膜融合蛋白为：赛姆利基森林病毒(SemlikiForest Virus,SFV)促融合肽的易位结构域；水泡性口炎病毒(vesicular stomatitisvirus,VSV)糖蛋白G的易位结构域；SER病毒F蛋白的易位结构域；和泡沫病毒(Foamyvirus)包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白特定应用于本发明的情境中，例如SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
表2(下文)中所列出的易位结构域的使用包括其序列变体的使用。变体可包含一个或多个保守核酸取代和/或核酸缺失或插入，条件是变体具有必需的易位功能。变体还可包含一个或多个氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，只要变体具有必需的易位功能即可。
表2
本文所述的组合物和方法的多肽还可包含易位促进结构域。此结构域促进将非细胞毒性蛋白酶递送到靶细胞的细胞溶质中，并且描述于例如WO 08/008803和WO 08/008805中，所述每个专利均以引用的方式并入本文。
通过举例的方式，合适的易位促进结构域包括有包膜病毒促融合肽结构域，例如，合适的促融合肽结构域包括流感病毒促融合肽结构域(例如具有23个氨基酸的A型流感病毒促融合肽结构域)、甲病毒(alphavirus)促融合肽结构域(例如具有26个氨基酸的赛姆利基森林病毒促融合肽结构域)、水泡性病毒促融合肽结构域(例如具有21个氨基酸的水泡性口炎病毒促融合肽结构域)、呼吸道病毒(respirovirus)促融合肽结构域(例如具有25个氨基酸的仙台病毒(Sendai virus)促融合肽结构域)、麻疹病毒(morbiliivirus)促融合肽结构域(例如具有25个氨基酸的犬瘟热病毒(Canine distemper virus)促融合肽结构域)、禽腮腺炎病毒(avulavirus)促融合肽结构域(例如具有25个氨基酸的新城疫病毒(Newcastledisease virus)促融合肽结构域)、亨尼病毒(henipavirus)促融合肽结构域(例如具有25个氨基酸的亨德拉病毒(Hendra virus)促融合肽结构域)、偏肺病毒(metapneumovirus)促融合肽结构域(例如具有25个氨基酸的人偏肺病毒促融合肽结构域)或泡沫病毒(spumavirus)促融合肽结构域诸如猴泡沫病毒(simian foamy virus)促融合肽结构域；或其片段或变体。
通过进一步举例，易位促进结构域可包含梭状芽孢杆菌毒素HN结构域或其片段或变体。更详细地说，梭状芽孢杆菌毒素HN易位促进结构域可长至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸。就这一点而言，梭状芽孢杆菌毒素HN易位促进结构域优选长至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或至多275个氨基酸。具体实例包括：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)
上文序列位置可根据血清型/亚型而有些变化，并且合适(参考)梭状芽孢杆菌毒素HN结构域的进一步实例包括：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)
任何上文所述的促进结构域均可与先前所述的合适用于本发明的易位结构域肽组合。因此，通过举例的方式，非梭状芽孢杆菌促进结构域可与非梭状芽孢杆菌易位结构域肽或与梭状芽孢杆菌易位结构域肽组合。可替代地，梭状芽孢杆菌毒素HN易位促进结构域可与非梭状芽孢杆菌易位结构域肽组合。可替代地，梭状芽孢杆菌毒素HN促进结构域可与梭状芽孢杆菌易位结构域肽组合，其实例包括：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
上文所识别的参考序列应认为是指导，因为可能根据亚血清型发生稍微变化。
序列同源性
多种序列比对方法中的任一者可用于确定一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如像区段逼近方法。确定一致性百分比的方案为本领域技术人员的技能范围内可获得的常规程序。全局方法从分子的开始到结尾比对序列且通过将个别残基对的计分相加并通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTALW，参见例如Julie D.Thompson等,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity ofProgressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvement inAccuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement asAssessed by Reference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴别由全部输入序列所共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如火柴盒法(Match-box)，参见例如Eric Depiereux和ErnestFeytmans,Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the SimultaneousAlignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；吉布斯取样法(Gibbs sampling)，参见例如C.E.Lawrence等,Detecting Subtle Sequence Signals:AGibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等,Align-M–A New Algorithm for MultipleAlignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，序列一致性百分比通过常规方法确定。参见例如Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992。简而言之，如下文所示，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1和Henikoff和Henikoff(出处同上)的“blosum 62”计分矩阵对两个氨基酸序列进行比对以优化比对计分(通过标准一字母代码指示氨基酸)。
用于确定序列一致性的比对计分
然后如下计算一致性百分比：
大致上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选具有一种次要性质，即并不显著影响多肽的折叠或活性的保守氨基酸取代(参见下文)和其他取代；通常具有1个至约30个氨基酸的小缺失；以及小氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、具有至多约20-25个残基的小接头肽或亲核标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)也可取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不通过遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可取代梭状芽孢杆菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲撑-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高-半胱氨酸、硝基-谷酰胺、高谷酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。许多方法为本领域中已知用于将非天然存在的氨基酸残基并入到蛋白质中。例如，可采用体外系统，其中无义突变使用化学氨基酰化抑制剂tRNA来抑制。用于合成氨基酸并且氨基酰化tRNA的方法为本领域中已知的。含有无义突变的质粒的转录和转译在包含大肠杆菌S30提取物和可商购的酶和其他试剂的无细胞系统中进行。蛋白质通过色谱法纯化。参见例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10145-9,1993)。在第二种方法中，转译通过突变mRNA和化学氨基酰化抑制剂tRNA的显微注射在爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中进行(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，将大肠杆菌细胞在待代替的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)不存在下并且在所需非天然存在的氨基酸(例如，2-哌氮杂苯丙氨酸、3-哌氮杂苯丙氨酸、4-哌氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)存在下培养。将非天然存在的氨基酸并入到多肽中代替其天然对应物。参见Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可通过体外化学修饰来转化成非天然存在的物种。化学修饰可与定点诱变组合以进一步扩展取代范围(Wynn和Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不通过遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可取代本发明多肽的氨基酸残基。
在本发明多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的程序来鉴别，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science 244:1081-5,1989)。也可以结合假定接触位点氨基酸的突变，通过如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术进行确定，来对结构进行物理学分析，从而确定生物学相互作用的位点。参见例如de Vos等人,Science255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBSLett.309:59-64,1992。必需氨基酸的鉴别还可从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性的分析进行推断。
可使用已知的诱变和筛选方法制备并测试多个氨基酸取代，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)中所公开的方法。简而言之，这些作者公开用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置，选择功能多肽，然后对诱变多肽进行测序以确定每个位置可容许取代的范围。其他可使用的方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公布WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
可使用已知的诱变和筛选方法制备并测试多个氨基酸取代，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)中所公开的方法。简而言之，这些作者公开用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置，选择功能多肽，然后对诱变多肽进行测序以确定每个位置可容许取代的范围。其他可使用的方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公布WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
前述实施方案中任一项的具体要素可组合或取代其他实施方案中的要素。此外，这些实施方案上下文中已经描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可表现出此类有点，并且不必所有实施方案均必须表现出此类优点以属于本公开的范围。
本文所述的技术的一些实施方案可根据以下编号的段落中任一项来定义：
1.一种融合蛋白，其包含：(i)肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)，和(ii)炭疽毒素保护性抗原(PA)，或PA的C末端受体结合结构域，其中(a)部分和(b)部分连接或融合在一起。
2.如段落1所述的融合蛋白，其中所述BTx或TTx包含BTx或TTx酶部分和易位信号。
3.如段落2所述的融合蛋白，其中所述BTx酶部分或易位信号选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个的BTx轻链和重链结构域。
4.如段落2所述的融合蛋白，其中所述BTx或TTx酶部分或易位信号选自表1所示的代表性LC酶部分或HN易位肽。
5.如段落2-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述(a)部分和(b)部分或者所述酶部分和易位肽通过接头肽连接。
6.如段落5所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
7.如段落5或6所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
8.如段落5-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
9.如段落5-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
10.如段落1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述PA的C末端受体结合结构域包含PAd4结构域、PAd2和PAd4结构域或PA63。
11.如段落1-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域耐蛋白酶裂解。
12.如段落1-11中任一项所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域耐弗林蛋白裂解、或Lys C裂解、或两者。
13.一种融合蛋白，其包含：(a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，其中所述PA或片段结合所述伤害感受器神经元上表达的受体。
14.如段落13所述的融合蛋白，其中所述非细胞毒性蛋白酶包含梭状芽孢杆菌神经毒素L链。
15.如段落14所述的融合蛋白，其中所述梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)。
16.如段落14或15所述的融合蛋白，其中所述梭状芽孢杆菌神经毒素L链选自表1。
17.如段落13-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
18.如段落13-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述能够结合PA的蛋白为炭疽毒素致死因子(LF)或炭疽毒素水肿因子(EF)。
19.如段落18所述的融合蛋白，其中LF的PA结合结构域为LF的N末端结构域(缩写为LFPABD或LFn)。
20.如段落18所述的融合蛋白，其中EF的PA结合结构域为EF的N末端结构域(缩写为EFPABD或EFn)。
21.一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素(这些包括具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素)，其能够阻断伤害感受器神经元中的离子通道；以及(b)靶向部分(TM)，其能够结合所述伤害感受器神经元上的结合位点，其中所述伤害感受器神经元在其中表达所述离子通道(例如，钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者)；
22.如段落21所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素包含半胱氨酸结基序。
23.如段落21或22所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
24.根据段落21、22或23所述的融合蛋白，其中所述TM选自由以下组成的组：炭疽毒素保护性抗原(PA)；PA的C末端受体结合结构域；以及伤害感受器神经元结合蛋白。
25.根据段落24所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域与所述伤害感受器神经元上表达的ANTXR2(CMG2)受体相互作用并结合。
26.根据段落24或25所述的融合蛋白，其中所述PA为耐弗林蛋白酶裂解的突变体或变体PA。
27.根据段落24、25或26所述的融合蛋白，其中所述PA的C末端受体结合结构域为PA63或PAd4，或者包含PAd2和PAd4结构域。
28.根据段落27所述的融合蛋白，其中所述PAd4耐蛋白酶裂解。
29.根据段落28所述的融合蛋白，其中所述蛋白酶为弗林蛋白酶或Lys C。
30.如段落24-29中任一项所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。
31.如段落30所述的融合蛋白，其中所述抗体特异性结合伤害感受器神经元上存在的神经生长因子受体、所述ANTXR2受体或离子通道蛋白。
32.如段落31所述的融合蛋白，其中所述离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
33.一种融合蛋白，其包含：(a)含二硫化物的肽毒素(这是具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素)，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者；以及(b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA片段的蛋白，其中所述片段结合所述伤害感受器神经元上表达的受体。
34.如段落33所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素包含半胱氨酸结基序。
35.如段落33或34所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
36.如段落33、34或35所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
37.如段落33-37中任一项所述的融合蛋白，其中所述能够结合PA的蛋白为：炭疽毒素致死因子(LF)；或炭疽毒素水肿因子(EF)。
38.一种融合蛋白，其包含：(a)AB毒素；(b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段，其中所述PA或片段结合伤害感受器神经元上表达的受体；以及(c)易位结构域(TL)，其能够将蛋白酶从内体内易位跨过内体膜并进入所述伤害感受器神经元的细胞溶质。
39.如段落38所述的融合蛋白，其中所述AB毒素选自蓖麻毒素、霍乱毒素A部分和B部分；铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素A部分和B部分；以及白喉毒素A部分和B部分。
40.如段落38或39所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
41.如段落38、30或40所述的融合蛋白，其中所述PA片段为PA的C末端受体结合结构域。
42.如段落38-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述TL为梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域；海参毒素；或使所述AB毒素的所述毒素受体结合功能不起作用的海参毒素的变体形式。
43.一种核酸，其编码根据前述段落中任一项的融合蛋白。
44.一种载体，其包含段落43所述的核酸。
45.如段落44所述的载体，其中所述载体为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体或病毒粒子。
46.一种细胞，其包含段落43所述的核酸或段落44或45所述的载体。
47.一种产生如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：将段落46所述的细胞培养于使得所述融合蛋白被表达的条件中；并且回收所述融合蛋白。
48.一种融合蛋白，其通过段落47所述的方法产生。
49.一种组合物，其包含段落中任一项所述的融合蛋白。
50.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述段落中任一项所述的组合物。
51.一种治疗疼痛的方法，其包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
52.一种包含肉毒神经毒素(BTx)部分的融合蛋白，所述肉毒神经毒素(BTx)部分包含所述BTx的N末端酶结构域(L链)和中间成孔/易位结构域(HN)，所述BTx连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。
53.如段落52所述的融合蛋白，其还包含在所述BTx部分与所述PAd4结构域之间的接头肽。
54.如段落53所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
55.如段落53或54所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
56.如段落53-55中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
57.如段落53-56中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
58.如段落52-57中任一项所述的融合蛋白，其中所述BTx酶部分选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和第一非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个的BTx轻链和重链结构域。
59.如段落52-58中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含串联的2-10个PAd4结构域。
60.如段落52-59中任一项所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个连续氨基酸进一步并入到所述BTx部分与所述PAd4之间。
61.如段落52-60中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723和729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
62.如段落52-61中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
63.如段落52-63中任一项所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
64.如段落63所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR(SEQID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)。
65.如段落52-64中任一项所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(编号为减去SEQ.ID.NO:1的29aa信号肽之后的编号)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
66.如段落52-65中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
67.如段落52-66中任一项所述的融合蛋白，其中对应于所述BTx的L链与所述BTx的HN链之间的接点的残基已被裂解。
68.一种组合物，其包含段落52-67中任一项所述的融合蛋白。
69.如段落68所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
70.一种融合蛋白，其包含：肉毒神经毒素(BTx)部分的肉毒神经毒素N末端酶结构域(BTx的L链)，和炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA蛋白水解激活形式，酶结构域，其中(a)部分在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者连接(b)部分。
71.如段落70所述的融合蛋白，其还包含确定对应于所述BTxHN结构域的N末端部分的区带的氨基酸序列，所述BTx HN结构域位于所述BTx部分的C末端侧，并且所述区带连接所述L链。
72.如段落71所述的融合蛋白，其中对应于与所述BTx HN结构域的所述区带的L链接点的残基已被裂解。
73.如段落71或72所述的融合蛋白，其中所述BTx L链和对应于所述BTx HN结构域的N末端部分的所述区带中的Cys残基已改变成Ala、Ser或Thr。
74.如段落70-73中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
75.如段落70-73中任一项所述的融合蛋白，其还包含在所述BTx L部分与所述LFn或EFn结构域之间的接头肽。
76.如段落75所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
77.如段落75或76所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
78.如段落75-78中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
79.如段落75-79中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys或Arg。
80.一种组合物，其包含段落70-79的所述融合蛋白中的任一种。
81.如权利要求80所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
82.如段落80或81所述的组合物和天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。
83.如段落82所述的组合物，其中所述PA蛋白为低聚物PA。
84.如段落83所述的组合物，其中所述低聚物PA结合所述融合蛋白。
85.如段落80-84中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
86.一种融合蛋白，其包含：炭疽毒素保护性抗原(PA)；炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)；或伤害感受器神经元结合蛋白，其连接含二硫化物的肽毒素。
87.如段落86所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为抑制剂半胱氨酸结毒素。
88.如段落86或87所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
89.如段落86、87或88所述的融合蛋白，其还包含在所述PA、PAd4或伤害感受器结合蛋白与所述抑制剂半胱氨酸结毒素之间的接头肽。
90.如段落89所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
91.如段落89或90所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
92.如前述段落89-91中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
93.如前述段落89-92中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含串联的2-10个PAd4结构域。
94.如前述段落89-93中任一项所述的融合蛋白，其中PAd4或PA中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
95.如段落94所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
96.如前述段落89-95中任一项所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基164RKKR167的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
97.如段落96所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
98.如前述段落89-97中任一项所述的融合蛋白，其中PAd4或PA中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
99.如前述段落89-98中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
100.如前述段落89-89中任一项所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。
101.如段落100所述的融合蛋白，其中所述抗体特异性结合伤害感受器神经元上存在的神经生长因子受体或离子通道蛋白。
102.如段落101所述的融合蛋白，其中所述离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
103.一种组合物，其包含段落86-102中任一项所述的融合蛋白。
104.如权利要求103所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
105.一种融合蛋白，其包含含二硫化物的肽毒素，所述含二硫化物的肽毒素在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者可操作地连接或者在一个或多个位点化学交联炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式。
106.如段落105所述的融合蛋白，其还包含在所述LFn与所述毒素之间或所述EFn与所述毒素之间的接头肽。
107.如段落106所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
108.如段落106或107所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
109.如段落106、107或108所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
110.一种组合物，其包含权利要求段落105-109中任一项所述的融合蛋白。
111.如段落110所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
112.如段落110或111所述的组合物，其还包含天然炭疽毒素保护性抗原(PA)。
113.如段落112所述的组合物，其中所述PA呈低聚物PA的形式。
114.如段落113所述的组合物，其中所述低聚物PA结合所述融合蛋白。
115.如段落110-114中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
116.一种融合蛋白，其包含与接头肽融合的AB毒素，所述接头肽可操作地连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中所述融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或使所述AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的所述海参毒素的突变体形式。
117.如段落116所述的融合蛋白，其中所述AB毒素选自蓖麻毒素、霍乱毒素A部分和B部分；铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素A部分和B部分；以及白喉毒素A部分和B部分。
118.如段落116或117所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
119.如前述段落116-118中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
120.如段落116-119中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
121.如段落116-120中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和Arg。
122.如前述段落116-121中任一项所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个连续氨基酸进一步并入到所述AB毒素与所述PAd4之间。
123.如前述段落116-122中任一项所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ IDNO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
124.如段落116-123中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
125.如段落116-124中任一项所述的融合蛋白，其包含串联的2-10个PAd4结构域。
126.如前述段落116-125中任一项所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ IDNO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、701、713、719、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
127.如前述段落116-126中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个可被例如Arg或His代替。
128.如前述段落116-127中任一项所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
129.如段落128所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
130.一种组合物，其包含段落114-129中任一项所述的融合蛋白。
131.如段落130所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
132.一种融合蛋白，其包含来自破伤风神经毒素(TTx)的N末端酶结构域(链A)连同易位/成孔结构域，所述破伤风神经毒素(TTx)可操作地连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。
133.如段落132所述的融合蛋白，其还包含在所述TTx部分与所述PAd4结构域之间的接头肽。
134.如段落133所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
135.如段落133或134所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
136.如段落133、134或135所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
137.如前述段落133-136中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys或Arg。
138.如段落132-137中任一项所述的融合蛋白，其包含串联的2至10个PAd4结构域。
139.如段落132-138中任一项所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个氨基连续氨基酸进一步并入到所述BTx部分与所述PAd4之间。
140.如段落132-139中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ IDNO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、701、713、719、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
141.如段落132-140中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个可被例如Arg或His代替。
142.如段落132-141中任一项所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
143.如段落142所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
144.如段落132-143中任一项所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ IDNO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
145.如段落132-144中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
146.如段落132-145中任一项所述的融合蛋白，其中对应于TTx轻链与TTx重链的接点的残基已被裂解。
147.一种组合物，其包含段落132-146中任一项所述的融合蛋白。
148.如段落147所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
149.一种核酸，其编码段落52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白中的任一种。
150.一种载体，其包含段落149所述的核酸。
151.如段落150所述的载体，其中所述载体为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒粒子或病毒载体。
152.一种细胞，其包含段落149所述的核酸或段落150或151所述的载体。
153.一种产生如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：(i)将段落152所述的细胞培养于使得所述融合蛋白被表达的条件中；并且(ii)回收所述融合蛋白。
154.一种融合蛋白，其通过段落153所述的方法产生。
155.如段落1-42、52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白，其为糖基化的。
156.如段落1-42、52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白，其为非糖基化的。
157.如段落153所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞。
158.如段落157所述的方法，其中所述细菌细胞为大肠杆菌。
159.如段落153所述的方法，其中所述细胞为酵母细胞。
160.如段落159所述的方法，其中所述酵母为酿酒酵母。
161.如段落159所述的方法，其中所述酵母为糖基化缺陷细胞。
162.如段落159所述的方法，其中所述酵母为糖基化和蛋白酶缺陷的。
163.如段落153所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
164.如段落163所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为COS细胞、CHO细胞或NSO细胞。
165.前述段落任一项的融合蛋白用于治疗疼痛的用途。
166.前述段落任一项的融合蛋白用于制造用于治疗疼痛的药物的用途。
167.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用选自段落49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
168.如段落167所述的方法，其中所述施用通过鞘内输注或脑室内输注或通过硬膜外注射到中枢神经系统中，或者通过使用皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射的外周施用来执行。
169.如段落168所述的方法，其中所述疼痛选自糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛和其他全身性疼痛病症。
170.一种用于治疗神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛的方法，其包括通过真皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射来向有需要的受试者外周地施用选自段落49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
171.一种用于治疗糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症的方法，其包括通过硬膜外注射、鞘内输注或脑室内输注到有需要的受试者的中枢神经系统中来施用选自段落49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
172.如段落167-171中任一项所述的方法，其中如权利要求80-85和110-115中所述的组合物在施用包含在药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中的炭疽保护性抗原(PA)的组合物之前、同时或之后单独施用。
173.一种治疗疼痛的方法，其包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
174.一种制造用于治疗疼痛的药物组合物的方法，其中所述药物组合物包含前述段落中所述的融合蛋白中一种或多种和药学上可接受的载剂或赋形剂。
175.一种工程化融合蛋白，其包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(Pad4)。
176.一种工程化融合蛋白，其包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。
177.一种工程化融合蛋白，其包含：炭疽保护性抗原(PA)部分或已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变炭疽保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。
178.一种工程化融合蛋白，其包含：炭疽保护性抗原(PA)部分或炭疽保护性抗原(mPA)部分，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。
179.如段落177或178所述的工程化融合蛋白，其中所述分子选自特异性结合神经生长因子受体的抗体或特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体。
180.如前述段落中任一项所述的工程化融合蛋白，其中所述细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、致死毒素(致死因子)和/或水肿毒素(水肿因子)。
181.一种工程化融合蛋白，其包含：天然保护性抗原(PA)或修饰(例如，以化学方式)或突变体PA(mPA)，其中所述mPA天然受体结合功能被阻断；以及可靶向伤害感受器神经元表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)和/或致死因子(LF)组合的形式。
182.如前述段落中任一项所述的工程化融合蛋白，其中PA或mPA呈低聚物形式。
183.如段落182所述的工程化融合蛋白，其中所述低聚物形式结合所述分子。
184.一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(Pad4)。
185.一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子结构域(LFn)。
186.一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含：天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)，其与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒性催化结构域，其中所述mPA已被修饰(例如，以化学方式)或突变使得所述PA天然受体结合功能被阻断。
187.如段落186所述的组合物，其中所述分子选自神经生长因子和特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体。
188.如段落186或187所述的组合物，其中所述细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、致死毒素(致死因子)和/或水肿毒素(水肿因子)。
189.一种包含工程化融合蛋白的组合物，所述工程化融合蛋白包含：天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)；和能够靶向伤害感受器神经元表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)组合的形式，其中所述mPA被修饰(例如，以化学方式)或突变使得PA天然受体结合功能被阻断。
190.如前述段落中任一项所述的组合物，其中PA或mPA呈低聚物形式。
191.如段落190所述的组合物，其中所述低聚物形式结合所述分子。
192.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
193.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含融合细胞内作用毒素催化结构域的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(PAd4)，其中工程化融合蛋白被递送到伤害感受器神经元并且导致伤害感受器神经元中细胞内信号传导事件减少或从伤害感受器神经元的神经递质释放减少。
194.如段落193所述的方法，其中所述细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、致死毒素(致死因子)和/或水肿毒素(水肿因子)。
195.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))融合的炭疽毒素保护性抗原(PA)部分或其受体结合结构域(Pad4)。
196.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含与抑制剂半胱氨酸结(ICK)毒素(例如，芋螺毒素(CTx))和保护性抗原(PA)部分融合的炭疽毒素致死因子(LFn)。
197.如前述段落中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
198.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效的、疼痛减轻量的工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含：炭疽保护性抗原(PA)部分已被改变成阻断其天然受体结合功能的突变体炭疽保护性抗原(mPA)部分，所述突变体炭疽保护性抗原(mPA)部分与能够特异性靶向伤害感受器表面受体或离子通道受体的分子融合；以及炭疽致死因子结构域(LFn)，其融合细胞内作用毒素催化结构域。
199.如段落198所述的方法，其中所述分子选自特异性结合神经生长因子受体的抗体和特异性结合Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9的抗体。
200.如段落198或199所述的方法，其中所述细胞内作用毒素催化结构域选自白喉毒素(DTx)、铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)、肉毒毒素(BTx)、破伤风毒素(TTx)、志贺毒素、蓖麻毒素、致死毒素(致死因子)和/或水肿毒素(水肿因子)。
201.一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，其包括向所述受试者施用工程化融合蛋白，所述工程化融合蛋白包含：天然保护性抗原(PA)或突变体PA(mPA)；和能够靶向伤害感受器表面分子的分子，尤其是以与炭疽毒素水肿因子(EF)和/或致死因子(LF)组合的形式，其中所述mPA被修饰(例如，以化学方式)或突变使得PA天然受体结合功能被阻断。
202.如前述段落中任一项所述的方法，其中所述PA或mPA以低聚物形式施用，其中低聚物PA或mPA由蛋白水解激活PA或mPA(或其突变体)形成以实现对带有受体的细胞的亲合力增加。
203.如段落202所述的方法，其中所述低聚物形式在施用之前结合所述分子。
204.如段落202或203所述的方法，其中所述低聚物形式在施用“效应分子”之前、同时或之后(LF)以单独注射的形式施用。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，所述实施例不应解释为进一步限制。
实施例
实施例1
我们发现，相较于其他神经元亚型和CNS组织，主要的炭疽毒素受体ANTXR2被伤害感受器神经元高度并且特异性表达。通过使用炭疽毒素所固有的内体递送机制，我们可以将分子货物特异性递送到伤害感受器中，从而将导致疼痛特异性阻断而不引起其他神经学副作用。
基于这个发现，我们提供：(1)在慢性疼痛病状中，疼痛特异性阻滞和靶向镇痛机制。这些病状包括骨关节炎、痉挛、类风湿性关节炎、化疗诱导的神经病变和癌症疼痛。(2)肌肉痉挛的治疗。疼痛为痉挛病病状的主要组成部分。由伤害感受器引发的感觉运动反射回路的调节异常可引发肌肉痉挛。我们假设炭疽毒素介导的伤害感受器沉默不仅可治疗疼痛还可减少肌肉痉挛。(3)骨关节炎病状的治疗。关节疼痛和破坏为骨关节疾病和风湿性疾病的主要组成部分。在神经系统(其中其特异于伤害感受器)之外，我们发现，ANTXR2由巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞高度表达，这些细胞为介导关节的关键造血细胞。炭疽毒素和其递送机制可用于通过伤害感受器特异性靶向关节疼痛而无神经学副作用，以及同时靶向介导关节破坏的巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞。
为了确定炭疽毒素是否可用于通过其固有的内体逃逸和细胞溶质递送机制将所选的分子货物蛋白特异性靶向到伤害感受器神经元中。我们将进一步测试炭疽毒素是否可用于沉默若干疾病病状(骨关节炎、肌肉损伤、类风湿性关节炎、化疗诱导的神经病变、癌症疼痛)的慢性疼痛以及骨关节炎的关节破坏。
基于我们详细的FACS纯化躯体感觉神经元表达数据库、原位杂交数据库和组织表达数据库，我们最近发现，ANTXR2在伤害感受器神经元中被高度表达，并且相较于其他神经元亚型特异于这些神经元。ANTXR2还在巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞中高度表达，这些细胞为关节破坏的关键细胞型。这种表达可能允许炭疽毒素将货物递送到这些细胞中以减缓骨关节炎的关节破坏。
我们利用炭疽毒素或其递送机制来特异性阻断不同疾病病状的慢性疼痛或关节破坏。在一些应用中，我们将使用天然炭疽毒素，其由保护性抗原(PA)(受体结合组分)连同致死因子(LF，其沉默MAP激酶)或水肿因子(EF，钙依赖性腺苷酸环化酶)组成。在其他应用中，我们将使用炭疽毒素作为介导其他细菌毒素(包括白喉毒素(DTA)或蓖麻(Rcn))的酶部分的细胞质递送的平台。
天然炭疽毒素(PA、LF、EF)沉默疼痛。炭疽皮肤感染引起无痛的病灶。结合ANTXR2的PA介导致死因子(LF)(已知其阻断MAP激酶)或水肿因子(EF)(其为腺苷酸环化酶)的递送。MAP激酶和cAMP通路介导伤害感受器敏化和慢性疼痛，并且其调节可沉默疼痛。因此，我们将利用组合PA+LF、PA+EF或PA+LF+EF的局部皮下或关节注射以诱导不同疾病病状的疼痛阻滞。
炭疽毒素介导白喉毒素(DTA)或蓖麻(Rcn)的酶部分的细胞溶质递送以沉默疼痛和炭疽关节破坏：PA(炭疽毒素的受体结合和成孔亚单元)将用于将融合白喉毒素(DTA)或蓖麻(Rcn)的致死因子(LFn)的PA结合结构域特异性递送到关节的ANTXR2+细胞中，包括伤害感受器神经元、巨噬细胞和破骨细胞。这些毒素将注射到骨关节炎或类风湿性关节炎关节中以沉默疼痛和关节破坏。
在小鼠模型中，我们将向关节中局部皮下递送上文炭疽毒素分子或分子组合以测试以下动物模型中疼痛阻滞或关节保护的功效：骨关节炎(例如，通过碘乙酸盐注射)、肌肉注射(例如，心脏毒素诱导的损伤)、类风湿性关节炎(例如，K/BxN血清输入性关节炎)、化疗诱导的神经病变(例如，紫杉醇)和癌症疼痛(例如，欧利希(Ehrlich)细胞模型)。
疼痛行为测试将测定对机械和/或热痛觉过敏的作用。我们还将对初级伤害感受器神经元执行电生理学以检测细胞内毒素向神经元中的递送和神经元活性阻断。还通过炎症和组织学分析的测量分析关节病变。
值得注意的是，我们还可利用炭疽毒素平台递送肉毒毒素(BTx)的酶部分。
图1A和1B描绘背根神经节内相较于11种其他神经组织类型对于主要炭疽毒素受体的受体的特异性和高水平表达。
图2在纯化小鼠感受疼痛的伤害感受器神经元(Nav1.8-Cre/TdTomato+)与另一种躯体感觉神经元亚型本体感受器(Parv-Cre/TdTomato+)之间比较全转录组数据。尽管它们为相关的细胞型，但是感受疼痛的Nav1.8+伤害感受器神经元显示相较于本体感受器高度富集的Antxr2表达。Antxr2在伤害感受器中的富集>5倍在本体感受器神经元中的富集(P值<10-5)。
综上所述，图1和2的这些数据显示，炭疽毒素的受体相较于其他CNS组织和本体感受器神经元高度富集于伤害感受器神经元中。这强烈地指示，Antxr2可用于与其他神经元亚型相对,特异性靶向感受疼痛的神经元。
实施例2--体外功效的评估(1)
我们进行实验以确定炭疽毒素组分是否可在培养物中递送到伤害感受器。这可测试在组合PA和工程化融合蛋白LFn-DTA存在下哺乳动物细胞中蛋白质合成的抑制，测试在PA和EF的组合存在下哺乳动物细胞中细胞内cAMP水平的增加，以及测试在组合PA和LF存在下哺乳动物细胞中MAPK信号传导的抑制。
白喉毒素(DTA)A链用作细胞内酶毒素以用于原理的论证，即炭疽递送系统可用于将毒素递送到神经元中。DTA催化EF-2的ADP核糖基化并且抑制蛋白质合成。融合蛋白LFn-DTA常用于测定向细胞质中的PA介导的易位。先前示出于Milne等人Mol.Microbiol.Feb；15(4):661-6,(1995)和Liao等人Chem.Bio.Chem.,15(16):2458–2466,(2014)，用20nM PA连同融合蛋白LFn-DTA或DTA-LFn处理的CHO-K1在飞摩尔或皮摩尔融合蛋白浓度下完全阻止蛋白质合成。
对于我们的实验，从野生型B6小鼠收获DRG神经元并在约2000个神经元/孔的细胞密度下培养隔夜。将细胞在3H-leu(400nM)存在下用不同浓度的PA和LFn-DTA在37℃下处理6hr。使用放射性标记的亮氨酸(3H-leu)测量蛋白质合成，新合成的蛋白质将3H-leu并入到新蛋白质中。在孵育期之后，将神经元用F12K培养基(无leu)洗涤，然后在F12K培养基(无leu)中与3H-leu一起孵育，接着用PBS洗涤，然后最后在闪烁液中进行细胞溶解，以用于测量新合成的蛋白质中并入的3H-leu放射性。用PA但不添加LFn-DTA来执行对照实验。从实验放射性中减去背景3H-leu放射性，并且将减去的数据归一化成未处理神经元的数据。当单独用PA处理神经元时，未观察到蛋白质合成的显著抑制(图3和4)。因此，单独PA不影响神经元中的蛋白质合成。但是，PA和LFn-DTA可能在纳摩尔浓度下在培养的神经元中抑制蛋白质合成。(图5和6)。
序列表
SEQ ID NO:1,PA,NCBI参考序列：NP_052806
SEQ ID NO:2白喉毒素NCBI参考序列：WP_003850266
SEQ ID NO:3铜绿假单胞菌外毒素A(PTx)NCBI参考序列：NP_249839
SEQ ID NO:4肉毒毒素NCBI参考序列：YP_001386738
SEQ ID NO:5破伤风毒素NCBI参考序列：WP_023439719
SEQ ID NO:6水肿因子NCBI参考序列：NP_052818
SEQ ID NO:7致死因子NCBI参考序列：NP_052803
SEQ ID NO:8ω-芋螺毒素M VII A NCBI参考序列：ADB93081
1 MKLTCVVIVA VLLLTACQLI TADDSRGTQK HRALRSTTKL SMSTRCKGKG AKCSRLMYDC
61 CTGSCRSGKC G
SEQ ID NO:9μ-芋螺毒素Swiss-Prot:P15472.1
1ACSGRGSRCP PQCCMGLRCG RGNPQKCIGA HEDV
SEQ ID NO:10δ-芋螺毒素NCBI ID:AKD43185
1 LNKRCAGIGS FCGLPGLVDC CSGRCFIVCL P
SEQ ID NO:11，志贺毒素A部分
KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
SEQ ID NO:12，志贺毒素B部分：
TPDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR
外毒素A，A部分和B部分
SEQ ID NO:13
AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
霍乱毒素
SEQ ID NO:14，霍乱毒素，A1组分
NDDKLYRADSRPPDEIKQSGGLMPRGQSEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRHDDGYVSTSISLRSAHLVGQTILSGHSTYYLYVLATAPNMFNVNDVLGAYSPHPDEQEVSALGGIPYSQIYGWYRVHFGVLDEQLHRNRGYRDRYYSNLDIAPAADGYGLAGFPPEHRAWREEPWIHHAPPGCGNAPRSS
SEQ ID NO:15，霍乱毒素，A2组分MSNTCDEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDEL
SEQ ID NO:16，霍乱毒素，B组分
TPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPSSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEA
KVEKLCTWNNKTPHAIAAISMAN
SEQ ID NO:17，破伤风的催化链(L链序列)
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRT
蓖麻毒素
SEQ ID NO:18，蓖麻毒素，A组分
IFPKQYPIINFTTAGATVQSYTNFIRAVRGRLTTGADVRHEIPVLPNRVGLPINQRFILVELSNHAELSVTLALDVTNAYVVGYRAGNSAYFFHPDNQEDAEAITHLFTDVQNRYTFAFGGNYDRLEQLAGNLRENIELGNGPLEEAISALYYYSTGGTQLPTLARSFIICIQMISEAARFQYIEGEMRTRIRYNRRSAPDPSVITLENSWGRLSTAIQESNQGAFASPIQLQRRNGSKFSVYDVSILIPIIALMVYRCAPPPSSQF
SEQ ID NO:19，蓖麻毒素，B组分
ADVCMDPEPIVRIVGRNGLCVDVRDGRFHNGNAIQLWPCKSNTDANQLWTLKRDNTIRSNGKCLTTYGYSPGVYVMIYDCNTAATDATRWQIWDNGTIINPRSSLVLAATSGNSGTTLTVQTNIYAVSQGWLPTNNTQPFVTTIVGLYGLCLQANSGQVWIEDCSSEKAEQQWALYADGSIRPQQNRDNCLTSDSNIRETVVKILSCGPASSGQRWMFKNDGTILNLYSGLVLDVRASDPSLKQIILYPLHGDPNQIWLPLF
SEQ ID NO:20，BTx-A轻链(天然)：BTx-A氨基酸1-448
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK
SEQ ID NO:21，BTx-A轻链氨基酸1-430
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLC
SEQ ID NO:22，BTx-B轻链(天然)：BTx-B氨基酸1-441
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVK
SEQ ID NO:23，BTx-B氨基酸1-437
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMC
SEQ ID NO:24，BTx-C1轻链(天然)：BoN/T-C1氨基酸1-449
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNK
SEQ ID NO:25，BTx-D轻链(天然)：BoN/T-D氨基酸1-442
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTK
SEQ ID NO:26，BTx-E轻链(天然)：BTx-E氨基酸1-422
MPTINSFNYNDPVNNRTILYIKPGGCQQFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTIPQDFLPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDQEKDKFLKIVTKIFNRINDNLSGRILLEELSKANPYLGNDNTPDGDFIINDASAVPIQFSNGSQSILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFKDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIR
SEQ ID NO:27，BTx-F轻链(天然)：BTx-F氨基酸1-436
MPVAINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYEFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRK
SEQ ID NO:28，BTx-G轻链(天然)：BTx-G氨基酸1-442
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYK
SEQ ID NO:29，BTx-A(轻链和重链易位结构域)氨基酸1-872
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKN
SEQ ID NO:30，BTx-A(轻链和重链易位结构域)氨基酸1-842
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVN
SEQ ID NO:31，BTx-B(轻链和重链易位结构域)氨基酸1-863
序列表
<110> 哈佛大学校长及研究员协会（PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE）
麻省理工学院（MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY）
<120>用于治疗疼痛的组合物和方法
<130> 002806-084951-PCT
<140>
<141>
<150> 62/210,610
<151> 2015-08-27
<160> 148
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 764
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 1
Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile
1 5 10 15
Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu Val Lys
20 25 30
Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gly Leu
35 40 45
Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro Met Val Val
50 55 60
Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu
65 70 75 80
Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile Trp Ser Gly
85 90 95
Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala
100 105 110
Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val Ile Asn Lys
115 120 125
Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg Leu Tyr Gln
130 135 140
Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys Gly Leu Asp
145 150 155 160
Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser
165 170 175
Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser Ser Asn Ser
180 185 190
Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp
195 200 205
Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp
210 215 220
Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser
245 250 255
Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr
275 280 285
Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu
290 295 300
Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys
305 310 315 320
Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala
325 330 335
Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly
340 345 350
Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser
355 360 365
Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala
370 375 380
Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr
385 390 395 400
Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys
405 410 415
Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln
420 425 430
Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile
435 440 445
Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn
450 455 460
Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp
465 470 475 480
Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly
485 490 495
Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln
500 505 510
Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn
515 520 525
Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu
530 535 540
Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe
545 550 555 560
Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile
565 570 575
Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys
580 585 590
Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp
595 600 605
Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg
610 615 620
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
625 630 635 640
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
645 650 655
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
660 665 670
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
675 680 685
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
690 695 700
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
705 710 715 720
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
725 730 735
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
740 745 750
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
755 760
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 2
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 3
<211> 638
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 3
Met His Leu Thr Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu
20 25 30
Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val
35 40 45
Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly
50 55 60
Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu
85 90 95
Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr
100 105 110
Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val
115 120 125
Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu
130 135 140
Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile
145 150 155 160
Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe
165 170 175
Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile
180 185 190
Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg
195 200 205
Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu
210 215 220
Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn
225 230 235 240
Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn
245 250 255
Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg
260 265 270
Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln
275 280 285
Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg
290 295 300
Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val
305 310 315 320
Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val
325 330 335
Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu
340 345 350
Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala
355 360 365
Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu
370 375 380
Ala Gly Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala
385 390 395 400
Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu
405 410 415
Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Ile
420 425 430
Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu
435 440 445
Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr
450 455 460
His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val
465 470 475 480
Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile
485 490 495
Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro
500 505 510
Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val
515 520 525
Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala
530 535 540
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu
545 550 555 560
Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg
565 570 575
Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile
580 585 590
Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp
595 600 605
Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp
610 615 620
Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
625 630 635
<210> 4
<211> 1296
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 4
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 5
<211> 1315
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 5
Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser
50 55 60
Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn
85 90 95
Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile
100 105 110
Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Pro
130 135 140
Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe
145 150 155 160
Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu
165 170 175
Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser
180 185 190
Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Ile Pro Thr Phe Asp Asn
195 200 205
Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe
210 215 220
Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys
245 250 255
Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys
275 280 285
Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn
290 295 300
Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser
325 330 335
Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn
340 345 350
Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn
355 360 365
Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys
370 375 380
Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe
385 390 395 400
Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met
405 410 415
Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val
420 425 430
Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile
435 440 445
Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly
450 455 460
Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu
465 470 475 480
Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Thr Val Ser Tyr
485 490 495
Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile
500 505 510
Ile Leu Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg
515 520 525
Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Lys Tyr Lys Ser
530 535 540
Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile
545 550 555 560
Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile
565 570 575
Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile
580 585 590
Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln
595 600 605
Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr
610 615 620
Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser
625 630 635 640
Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly
645 650 655
Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu
660 665 670
Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu
675 680 685
Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile
690 695 700
Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys
705 710 715 720
Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys
725 730 735
Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile
740 745 750
Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys
755 760 765
Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu
770 775 780
Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser
785 790 795 800
Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln
805 810 815
Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile
820 825 830
Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu
835 840 845
Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser
850 855 860
Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile
865 870 875 880
Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile
885 890 895
Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala
900 905 910
Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn
915 920 925
Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn
930 935 940
Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys
945 950 955 960
Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile
965 970 975
Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser
980 985 990
Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala
995 1000 1005
Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Ser Asp Leu Ser Asp Lys Phe
1010 1015 1020
Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn
1025 1030 1035
Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn
1055 1060 1065
Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr
1070 1075 1080
Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro
1085 1090 1095
Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe
1100 1105 1110
Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr
1115 1120 1125
Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys
1130 1135 1140
Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr
1145 1150 1155
Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Ser Gly Leu
1160 1165 1170
Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser
1175 1180 1185
Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn
1190 1195 1200
Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe
1205 1210 1215
Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly
1220 1225 1230
Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu
1235 1240 1245
Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala
1250 1255 1260
Ser Leu Gly Leu Val Gly Ile Arg Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp
1265 1270 1275
Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His
1280 1285 1290
Leu Lys Asp Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr
1295 1300 1305
Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp
1310 1315
<210> 6
<211> 800
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 6
Met Thr Arg Asn Lys Phe Ile Pro Asn Lys Phe Ser Ile Ile Ser Phe
1 5 10 15
Ser Val Leu Leu Phe Ala Ile Ser Ser Ser Gln Ala Ile Glu Val Asn
20 25 30
Ala Met Asn Glu His Tyr Thr Glu Ser Asp Ile Lys Arg Asn His Lys
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Lys Thr Glu Lys Glu Lys Phe Lys Asp Ser Ile Asn
50 55 60
Asn Leu Val Lys Thr Glu Phe Thr Asn Glu Thr Leu Asp Lys Ile Gln
65 70 75 80
Gln Thr Gln Asp Leu Leu Lys Lys Ile Pro Lys Asp Val Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Ser Glu Leu Gly Gly Glu Ile Tyr Phe Thr Asp Ile Asp Leu Val
100 105 110
Glu His Lys Glu Leu Gln Asp Leu Ser Glu Glu Glu Lys Asn Ser Met
115 120 125
Asn Ser Arg Gly Glu Lys Val Pro Phe Ala Ser Arg Phe Val Phe Glu
130 135 140
Lys Lys Arg Glu Thr Pro Lys Leu Ile Ile Asn Ile Lys Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Ile Asn Ser Glu Gln Ser Lys Glu Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Gly
165 170 175
Ile Ser Leu Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Ser Leu Asp Pro Glu Phe
180 185 190
Leu Asn Leu Ile Lys Ser Leu Ser Asp Asp Ser Asp Ser Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Phe Ser Gln Lys Phe Lys Glu Lys Leu Glu Leu Asn Asn Lys Ser
210 215 220
Ile Asp Ile Asn Phe Ile Lys Glu Asn Leu Thr Glu Phe Gln His Ala
225 230 235 240
Phe Ser Leu Ala Phe Ser Tyr Tyr Phe Ala Pro Asp His Arg Thr Val
245 250 255
Leu Glu Leu Tyr Ala Pro Asp Met Phe Glu Tyr Met Asn Lys Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Phe Glu Lys Ile Ser Glu Ser Leu Lys Lys Glu Gly Val
275 280 285
Glu Lys Asp Arg Ile Asp Val Leu Lys Gly Glu Lys Ala Leu Lys Ala
290 295 300
Ser Gly Leu Val Pro Glu His Ala Asp Ala Phe Lys Lys Ile Ala Arg
305 310 315 320
Glu Leu Asn Thr Tyr Ile Leu Phe Arg Pro Val Asn Lys Leu Ala Thr
325 330 335
Asn Leu Ile Lys Ser Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Asn Val His Gly
340 345 350
Lys Ser Ser Asp Trp Gly Pro Val Ala Gly Tyr Ile Pro Phe Asp Gln
355 360 365
Asp Leu Ser Lys Lys His Gly Gln Gln Leu Ala Val Glu Lys Gly Asn
370 375 380
Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Thr Glu His Glu Gly Glu Ile Gly Lys
385 390 395 400
Ile Pro Leu Lys Leu Asp His Leu Arg Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn
405 410 415
Gly Ile Ile Leu Lys Gly Lys Lys Glu Ile Asp Asn Gly Lys Lys Tyr
420 425 430
Tyr Leu Leu Glu Ser Asn Asn Gln Val Tyr Glu Phe Arg Ile Ser Asp
435 440 445
Glu Asn Asn Glu Val Gln Tyr Lys Thr Lys Glu Gly Lys Ile Thr Val
450 455 460
Leu Gly Glu Lys Phe Asn Trp Arg Asn Ile Glu Val Met Ala Lys Asn
465 470 475 480
Val Glu Gly Val Leu Lys Pro Leu Thr Ala Asp Tyr Asp Leu Phe Ala
485 490 495
Leu Ala Pro Ser Leu Thr Glu Ile Lys Lys Gln Ile Pro Gln Lys Glu
500 505 510
Trp Asp Lys Val Val Asn Thr Pro Asn Ser Leu Glu Lys Gln Lys Gly
515 520 525
Val Thr Asn Leu Leu Ile Lys Tyr Gly Ile Glu Arg Lys Pro Asp Ser
530 535 540
Thr Lys Gly Thr Leu Ser Asn Trp Gln Lys Gln Met Leu Asp Arg Leu
545 550 555 560
Asn Glu Ala Val Lys Tyr Thr Gly Tyr Thr Gly Gly Asp Val Val Asn
565 570 575
His Gly Thr Glu Gln Asp Asn Glu Glu Phe Pro Glu Lys Asp Asn Glu
580 585 590
Ile Phe Ile Ile Asn Pro Glu Gly Glu Phe Ile Leu Thr Lys Asn Trp
595 600 605
Glu Met Thr Gly Arg Phe Ile Glu Lys Asn Ile Thr Gly Lys Asp Tyr
610 615 620
Leu Tyr Tyr Phe Asn Arg Ser Tyr Asn Lys Ile Ala Pro Gly Asn Lys
625 630 635 640
Ala Tyr Ile Glu Trp Thr Asp Pro Ile Thr Lys Ala Lys Ile Asn Thr
645 650 655
Ile Pro Thr Ser Ala Glu Phe Ile Lys Asn Leu Ser Ser Ile Arg Arg
660 665 670
Ser Ser Asn Val Gly Val Tyr Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Glu Phe
675 680 685
Ala Lys Lys Glu Ser Val Lys Lys Ile Ala Gly Tyr Leu Ser Asp Tyr
690 695 700
Tyr Asn Ser Ala Asn His Ile Phe Ser Gln Glu Lys Lys Arg Lys Ile
705 710 715 720
Ser Ile Phe Arg Gly Ile Gln Ala Tyr Asn Glu Ile Glu Asn Val Leu
725 730 735
Lys Ser Lys Gln Ile Ala Pro Glu Tyr Lys Asn Tyr Phe Gln Tyr Leu
740 745 750
Lys Glu Arg Ile Thr Asn Gln Val Gln Leu Leu Leu Thr His Gln Lys
755 760 765
Ser Asn Ile Glu Phe Lys Leu Leu Tyr Lys Gln Leu Asn Phe Thr Glu
770 775 780
Asn Glu Thr Asp Asn Phe Glu Val Phe Gln Lys Ile Ile Asp Glu Lys
785 790 795 800
<210> 7
<211> 809
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 7
Met Asn Ile Lys Lys Glu Phe Ile Lys Val Ile Ser Met Ser Cys Leu
1 5 10 15
Val Thr Ala Ile Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Ile Pro Leu Val Gln
20 25 30
Gly Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Lys Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Thr
50 55 60
Gln Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys Ile Glu
65 70 75 80
Val Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu Lys Leu Leu
85 90 95
Glu Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys Ala Ile Gly Gly
100 105 110
Lys Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys His Ile Ser Leu Glu
115 120 125
Ala Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asp
130 135 140
Ala Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro
145 150 155 160
Val Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys
165 170 175
Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile
180 185 190
Leu Ser Lys Ile Asn Gln Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn
195 200 205
Thr Ile Lys Asn Ala Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr
210 215 220
Asn Gln Leu Lys Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu
225 230 235 240
Gln Asn Ser Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr
245 250 255
Tyr Ile Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu
260 265 270
Ala Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Ser
275 280 285
Leu Glu Glu Leu Lys Asp Gln Arg Met Leu Ser Arg Tyr Glu Lys Trp
290 295 300
Glu Lys Ile Lys Gln His Tyr Gln His Trp Ser Asp Ser Leu Ser Glu
305 310 315 320
Glu Gly Arg Gly Leu Leu Lys Lys Leu Gln Ile Pro Ile Glu Pro Lys
325 330 335
Lys Asp Asp Ile Ile His Ser Leu Ser Gln Glu Glu Lys Glu Leu Leu
340 345 350
Lys Arg Ile Gln Ile Asp Ser Ser Asp Phe Leu Ser Thr Glu Glu Lys
355 360 365
Glu Phe Leu Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ile Arg Asp Ser Leu Ser Glu
370 375 380
Glu Glu Lys Glu Leu Leu Asn Arg Ile Gln Val Asp Ser Ser Asn Pro
385 390 395 400
Leu Ser Glu Lys Glu Lys Glu Phe Leu Lys Lys Leu Lys Leu Asp Ile
405 410 415
Gln Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Arg Leu Gln Asp Thr Gly Gly Leu Ile
420 425 430
Asp Ser Pro Ser Ile Asn Leu Asp Val Arg Lys Gln Tyr Lys Arg Asp
435 440 445
Ile Gln Asn Ile Asp Ala Leu Leu His Gln Ser Ile Gly Ser Thr Leu
450 455 460
Tyr Asn Lys Ile Tyr Leu Tyr Glu Asn Met Asn Ile Asn Asn Leu Thr
465 470 475 480
Ala Thr Leu Gly Ala Asp Leu Val Asp Ser Thr Asp Asn Thr Lys Ile
485 490 495
Asn Arg Gly Ile Phe Asn Glu Phe Lys Lys Asn Phe Lys Tyr Ser Ile
500 505 510
Ser Ser Asn Tyr Met Ile Val Asp Ile Asn Glu Arg Pro Ala Leu Asp
515 520 525
Asn Glu Arg Leu Lys Trp Arg Ile Gln Leu Ser Pro Asp Thr Arg Ala
530 535 540
Gly Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Leu Ile Leu Gln Arg Asn Ile Gly Leu
545 550 555 560
Glu Ile Lys Asp Val Gln Ile Ile Lys Gln Ser Glu Lys Glu Tyr Ile
565 570 575
Arg Ile Asp Ala Lys Val Val Pro Lys Ser Lys Ile Asp Thr Lys Ile
580 585 590
Gln Glu Ala Gln Leu Asn Ile Asn Gln Glu Trp Asn Lys Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Pro Lys Tyr Thr Lys Leu Ile Thr Phe Asn Val His Asn Arg Tyr
610 615 620
Ala Ser Asn Ile Val Glu Ser Ala Tyr Leu Ile Leu Asn Glu Trp Lys
625 630 635 640
Asn Asn Ile Gln Ser Asp Leu Ile Lys Lys Val Thr Asn Tyr Leu Val
645 650 655
Asp Gly Asn Gly Arg Phe Val Phe Thr Asp Ile Thr Leu Pro Asn Ile
660 665 670
Ala Glu Gln Tyr Thr His Gln Asp Glu Ile Tyr Glu Gln Val His Ser
675 680 685
Lys Gly Leu Tyr Val Pro Glu Ser Arg Ser Ile Leu Leu His Gly Pro
690 695 700
Ser Lys Gly Val Glu Leu Arg Asn Asp Ser Glu Gly Phe Ile His Glu
705 710 715 720
Phe Gly His Ala Val Asp Asp Tyr Ala Gly Tyr Leu Leu Asp Lys Asn
725 730 735
Gln Ser Asp Leu Val Thr Asn Ser Lys Lys Phe Ile Asp Ile Phe Lys
740 745 750
Glu Glu Gly Ser Asn Leu Thr Ser Tyr Gly Arg Thr Asn Glu Ala Glu
755 760 765
Phe Phe Ala Glu Ala Phe Arg Leu Met His Ser Thr Asp His Ala Glu
770 775 780
Arg Leu Lys Val Gln Lys Asn Ala Pro Lys Thr Phe Gln Phe Ile Asn
785 790 795 800
Asp Gln Ile Lys Phe Ile Ile Asn Ser
805
<210> 8
<211> 71
<212> PRT
<213> 僧袍芋螺（Conus magus）
<400> 8
Met Lys Leu Thr Cys Val Val Ile Val Ala Val Leu Leu Leu Thr Ala
1 5 10 15
Cys Gln Leu Ile Thr Ala Asp Asp Ser Arg Gly Thr Gln Lys His Arg
20 25 30
Ala Leu Arg Ser Thr Thr Lys Leu Ser Met Ser Thr Arg Cys Lys Gly
35 40 45
Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys Thr Gly Ser
50 55 60
Cys Arg Ser Gly Lys Cys Gly
65 70
<210> 9
<211> 34
<212> PRT
<213> 杀手芋螺（Conus geographus）
<400> 9
Ala Cys Ser Gly Arg Gly Ser Arg Cys Pro Pro Gln Cys Cys Met Gly
1 5 10 15
Leu Arg Cys Gly Arg Gly Asn Pro Gln Lys Cys Ile Gly Ala His Glu
20 25 30
Asp Val
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 黑星芋螺（Conus eburneus）
<400> 10
Leu Asn Lys Arg Cys Ala Gly Ile Gly Ser Phe Cys Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
Leu Val Asp Cys Cys Ser Gly Arg Cys Phe Ile Val Cys Leu Pro
20 25 30
<210> 11
<211> 293
<212> PRT
<213> 痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）
<400> 11
Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn
35 40 45
Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe
50 55 60
Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly
65 70 75 80
Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser
85 90 95
His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser
100 105 110
Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met
115 120 125
Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser
130 135 140
His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg
145 150 155 160
Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg
165 170 175
Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met
180 185 190
Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser
195 200 205
Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile
210 215 220
Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu
225 230 235 240
Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu
245 250 255
Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His
260 265 270
Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg
275 280 285
Arg Thr Ile Ser Ser
290
<210> 12
<211> 69
<212> PRT
<213> 痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）
<400> 12
Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp
1 5 10 15
Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn
20 25 30
Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met
35 40 45
Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His Asn Gly Gly Gly Phe Ser
50 55 60
Glu Val Ile Phe Arg
65
<210> 13
<211> 613
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 13
Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp
370 375 380
Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe
385 390 395 400
Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
405 410 415
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg
420 425 430
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
435 440 445
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
450 455 460
Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
465 470 475 480
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly
485 490 495
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
500 505 510
Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
515 520 525
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
530 535 540
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
545 550 555 560
Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg
565 570 575
Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln
580 585 590
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
595 600 605
Arg Glu Asp Leu Lys
610
<210> 14
<211> 194
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）
<400> 14
Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile
1 5 10 15
Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr Phe Asp
20 25 30
Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr
35 40 45
Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ser Ile
50 55 60
Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser Gly His
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn
85 90 95
Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu Gln Glu
100 105 110
Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr
115 120 125
Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn Arg Gly
130 135 140
Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala Ala Asp
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp Arg Glu
165 170 175
Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala Pro Arg
180 185 190
Ser Ser
<210> 15
<211> 46
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）
<400> 15
Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe
1 5 10 15
Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu
35 40 45
<210> 16
<211> 103
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）
<400> 16
Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala
20 25 30
Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe
35 40 45
Gln Val Glu Val Pro Ser Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala
50 55 60
Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala
65 70 75 80
Lys Val Glu Lys Leu Cys Thr Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile
85 90 95
Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn
100
<210> 17
<211> 456
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 17
Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser
50 55 60
Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn
85 90 95
Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile
100 105 110
Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro
130 135 140
Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe
145 150 155 160
Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu
165 170 175
Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser
180 185 190
Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn
195 200 205
Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe
210 215 220
Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys
245 250 255
Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys
275 280 285
Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn
290 295 300
Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser
325 330 335
Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn
340 345 350
Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn
355 360 365
Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys
370 375 380
Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe
385 390 395 400
Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met
405 410 415
Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val
420 425 430
Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile
435 440 445
Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr
450 455
<210> 18
<211> 267
<212> PRT
<213> 蓖麻（Ricinus communis）
<400> 18
Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr Ala Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg Gly Arg Leu
20 25 30
Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu Pro Asn Arg
35 40 45
Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu Leu Ser Asn
50 55 60
His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr
65 70 75 80
Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro Asp
85 90 95
Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val Gln
100 105 110
Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu Gln
115 120 125
Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro Leu
130 135 140
Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Gln
145 150 155 160
Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln Met Ile Ser
165 170 175
Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Thr Arg Ile
180 185 190
Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile Thr Leu Glu
195 200 205
Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser Asn Gln Gly
210 215 220
Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly Ser Lys Phe
225 230 235 240
Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Met Val
245 250 255
Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe
260 265
<210> 19
<211> 262
<212> PRT
<213> 蓖麻（Ricinus communis）
<400> 19
Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg
1 5 10 15
Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn
20 25 30
Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu
35 40 45
Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu
50 55 60
Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys
65 70 75 80
Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly
85 90 95
Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly
100 105 110
Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser
115 120 125
Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile
130 135 140
Val Gly Leu Tyr Gly Leu Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Gln Val Trp
145 150 155 160
Ile Glu Asp Cys Ser Ser Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr
165 170 175
Ala Asp Gly Ser Ile Arg Pro Gln Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr
180 185 190
Ser Asp Ser Asn Ile Arg Glu Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Gly Gln Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile
210 215 220
Leu Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Val Leu Asp Val Arg Ala Ser Asp Pro
225 230 235 240
Ser Leu Lys Gln Ile Ile Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gln
245 250 255
Ile Trp Leu Pro Leu Phe
260
<210> 20
<211> 448
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 20
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
<210> 21
<211> 430
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 21
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys
420 425 430
<210> 22
<211> 441
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 22
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys
435 440
<210> 23
<211> 437
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 23
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys
435
<210> 24
<211> 449
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 24
Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn
1 5 10 15
Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu
20 25 30
Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp
35 40 45
Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val
50 55 60
Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp
65 70 75 80
Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg
85 90 95
Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp
115 120 125
Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn
130 135 140
Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly
145 150 155 160
Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr
165 170 175
Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile
180 185 190
Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp
195 200 205
Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile
210 215 220
Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile
245 250 255
Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala
260 265 270
Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr
275 280 285
Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu
290 295 300
Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser
325 330 335
Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn
355 360 365
Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr
370 375 380
Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn
385 390 395 400
Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser
405 410 415
Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu
420 425 430
Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn
435 440 445
Lys
<210> 25
<211> 442
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 25
Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp
1 5 10 15
Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr
20 25 30
Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro
50 55 60
Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp
65 70 75 80
Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg
85 90 95
Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val
100 105 110
Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp
115 120 125
Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly
130 135 140
Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly
145 150 155 160
Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly
165 170 175
Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu
180 185 190
Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn
195 200 205
Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val
210 215 220
Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly
245 250 255
Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr
260 265 270
Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln
275 280 285
Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu
290 295 300
Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp
305 310 315 320
Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn
325 330 335
Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser
340 345 350
Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn
355 360 365
Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe
370 375 380
Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn
385 390 395 400
Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu
405 410 415
Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu
420 425 430
Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys
435 440
<210> 26
<211> 422
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 26
Met Pro Thr Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asn Arg
1 5 10 15
Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Gln Phe Tyr Lys Ser
20 25 30
Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Pro Gln Asp Phe Leu Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Lys
65 70 75 80
Asp Lys Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asp
85 90 95
Asn Leu Ser Gly Arg Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro
100 105 110
Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Gly Asp Phe Ile Ile Asn Asp
115 120 125
Ala Ser Ala Val Pro Ile Gln Phe Ser Asn Gly Ser Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His
165 170 175
Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe
180 185 190
Arg Phe Lys Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu
195 200 205
Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala
210 215 220
Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu
225 230 235 240
Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr
260 265 270
Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys
275 280 285
Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu
290 295 300
Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn
305 310 315 320
Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu
325 330 335
Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile
340 345 350
Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile
355 360 365
Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe
370 375 380
Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr
385 390 395 400
Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val
405 410 415
Ser Val Lys Gly Ile Arg
420
<210> 27
<211> 436
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 27
Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp
1 5 10 15
Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr
65 70 75 80
Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys
85 90 95
Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser
100 105 110
Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe
115 120 125
Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn
130 135 140
Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro
145 150 155 160
Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro
165 170 175
Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile
180 185 190
Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly
195 200 205
Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser
210 215 220
Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg
225 230 235 240
Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met
245 250 255
Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly
260 265 270
Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn
275 280 285
Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val
290 295 300
Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe
305 310 315 320
Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val
325 330 335
Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr
340 345 350
Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr
355 360 365
Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp
370 375 380
Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn
385 390 395 400
Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile
405 410 415
Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val
420 425 430
Ile Pro Arg Lys
435
<210> 28
<211> 442
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任何氨基酸
<400> 28
Met Pro Val Asn Ile Lys Xaa Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn
1 5 10 15
Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
35 40 45
Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly
50 55 60
Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys
65 70 75 80
Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile
100 105 110
Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys
115 120 125
Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln
130 135 140
Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile
165 170 175
Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met
180 185 190
Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe
245 250 255
Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile
275 280 285
Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn
290 295 300
Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys
325 330 335
Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met
340 345 350
Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr
355 360 365
Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys
370 375 380
Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala
385 390 395 400
Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn
405 410 415
Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg
420 425 430
Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys
435 440
<210> 29
<211> 872
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 29
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn
865 870
<210> 30
<211> 842
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 30
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn
835 840
<210> 31
<211> 863
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 31
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp
435 440 445
Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser
450 455 460
Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn
465 470 475 480
Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr
500 505 510
Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys
515 520 525
Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln
530 535 540
Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp
545 550 555 560
Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp
565 570 575
Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly
580 585 590
Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser
595 600 605
Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile
610 615 620
Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu
625 630 635 640
Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro
645 650 655
Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile
660 665 670
Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys
675 680 685
Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp
690 695 700
Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr
705 710 715 720
Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr
725 730 735
Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp
740 745 750
Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile
755 760 765
Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met
770 775 780
Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn
785 790 795 800
Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr
805 810 815
Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu
820 825 830
Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile
835 840 845
Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn
850 855 860
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 32
Ser Ser Ser Arg
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 33
Ser Ser Ser Ser
1
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 34
Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile
1 5 10 15
Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala
20 25
<210> 35
<211> 141
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 35
Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser
1 5 10 15
Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly
20 25 30
Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr
35 40 45
Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp
50 55 60
Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr
65 70 75 80
Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser
85 90 95
Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys
115 120 125
Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
130 135 140
<210> 36
<211> 141
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 36
Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser
1 5 10 15
Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly
20 25 30
Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr
35 40 45
Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp
50 55 60
Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr
65 70 75 80
Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser
85 90 95
Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys
115 120 125
Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
130 135 140
<210> 37
<211> 140
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 37
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
35 40 45
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
50 55 60
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
85 90 95
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
100 105 110
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
115 120 125
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
130 135 140
<210> 38
<211> 140
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 38
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
35 40 45
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
50 55 60
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
85 90 95
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
100 105 110
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
115 120 125
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
130 135 140
<210> 39
<211> 85
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 39
Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser
1 5 10 15
Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn
20 25 30
Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val
35 40 45
Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly
50 55 60
Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys
65 70 75 80
Gly Tyr Glu Ile Gly
85
<210> 40
<211> 85
<212> PRT
<213> 炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
<400> 40
Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser
1 5 10 15
Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn
20 25 30
Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val
35 40 45
Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly
50 55 60
Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys
65 70 75 80
Gly Tyr Glu Ile Gly
85
<210> 41
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
35 40 45
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
50 55
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 42
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
1 5
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 43
Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp
1 5 10 15
Thr Glu
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 44
Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile
1 5 10 15
Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
20 25
<210> 45
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile
1 5 10 15
Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg
20 25 30
Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
35 40 45
<210> 46
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
35 40 45
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
50 55 60
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
65 70 75 80
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
85 90 95
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
100 105 110
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
115 120 125
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
130 135 140
<210> 47
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 47
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
1 5 10 15
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
20 25 30
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
35 40 45
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
50 55 60
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
65 70 75 80
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
85 90
<210> 48
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp
1 5 10 15
Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn
20 25 30
Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys
35 40 45
Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu
65 70 75 80
Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser
85 90 95
Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
100
<210> 49
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile
1 5 10 15
Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu
20 25 30
Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln
35 40 45
Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro
50 55 60
Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr
65 70 75 80
Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr
85 90 95
Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile
100 105 110
Gly
<210> 50
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile
1 5 10 15
Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg
20 25 30
Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu
35 40 45
Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu
50 55 60
Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala
85 90 95
Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr
100 105 110
Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr
115 120 125
Glu Ile Gly
130
<210> 51
<211> 27
<212> PRT
<213> 芋螺种（Conus sp.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Hyp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Hyp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Hyp
<400> 51
Cys Lys Ser Xaa Gly Ser Ser Cys Ser Xaa Thr Ser Tyr Asn Cys Cys
1 5 10 15
Arg Ser Cys Asn Xaa Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr
20 25
<210> 52
<211> 26
<212> PRT
<213> 芋螺种（Conus sp.）
<400> 52
Cys Lys Gly Lys Gly Ala Pro Cys Arg Lys Thr Met Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Ser Gly Ser Cys Gly Arg Arg Gly Lys Cys
20 25
<210> 53
<211> 48
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：ω-Agatoxin IVA多肽
<400> 53
Lys Lys Lys Cys Ile Ala Lys Asp Tyr Gly Arg Cys Lys Trp Gly Gly
1 5 10 15
Thr Pro Cys Cys Arg Gly Arg Gly Cys Ile Cys Ser Ile Met Gly Thr
20 25 30
Asn Cys Glu Cys Lys Pro Arg Leu Ile Met Glu Gly Leu Gly Leu Ala
35 40 45
<210> 54
<211> 48
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：ω-Agatoxin TK多肽
<400> 54
Glu Asp Asn Cys Ile Ala Glu Asp Tyr Gly Lys Cys Thr Trp Gly Gly
1 5 10 15
Thr Lys Cys Cys Arg Gly Arg Pro Cys Arg Cys Ser Met Ile Gly Thr
20 25 30
Asn Cys Glu Cys Thr Pro Arg Leu Ile Met Glu Gly Leu Ser Phe Ala
35 40 45
<210> 55
<211> 35
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：中国捕鸟蛛多肽
<400> 55
Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp Gln Cys
1 5 10 15
Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Gln Ile
35
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 56
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Glu Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Gly Met Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Lys Lys Leu Trp
20 25 30
<210> 57
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> 此序列可涵盖1-8 'Gly Gly Ser'重复单元，其中一些位置可不存在
<220>
<223> 参见如关于取代和优选实施方案的详细描述所提交的说明书
<400> 57
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 59
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 61
His His His His His His
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 62
His His His His His His His His
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 63
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 65
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
1 5 10 15
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
35 40 45
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
50 55
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
1 5
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 67
Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp
1 5 10 15
Thr Glu
<210> 68
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile
1 5 10 15
Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
20 25
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 69
Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile
1 5 10 15
Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg
20 25 30
Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu
35 40 45
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 71
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 72
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 73
Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 74
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
1 5
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 75
Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 76
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 77
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 78
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Ile
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 79
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：IgA蛋白酶肽
<400> 80
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：Antarease肽
<400> 81
Ile Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 82
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 83
Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 84
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 85
Phe Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 86
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 87
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Ile
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 88
Glu Ala Asn Lys Ala Thr Lys
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 89
Glu Ala Asn Lys His Ala Thr
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 90
Glu Ala Asn Lys His Ala Asn
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 91
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 92
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr
1 5
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 93
Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 94
Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 95
Ala Asn Gln Arg Ala Ile Lys
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 96
Ala Asn Gln Arg Ala His Gln
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 97
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 98
Lys Thr Lys Lys Ala Val Lys
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 99
Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 100
Glu Thr Lys Arg Ala Met Lys
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 101
Asp Thr Lys Lys Ala Val Arg
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 102
Asp Thr Lys Lys Ala Leu Lys
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 103
Asp Thr Lys Lys Ala Met Lys
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 104
Glu Ser Lys Lys Ala Val Lys
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 105
Glu Thr Lys Lys Ala Met Lys
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 106
Glu Thr Lys Lys Ala Val Lys
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 107
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 108
Gln Ile Gln Lys Ile Thr Glu
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 109
Gln Ile Asp Arg Ile Val Glu
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 110
Gln Phe Asp Arg Ile Met Asp
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 111
Gln Phe Asp Arg Ile Met Glu
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 112
Gln Leu Asp Arg Ile His Asp
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 113
Gln Ile Asp Arg Ile Met Asp
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 114
Gln Val Asp Arg Ile Gln Gln
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 115
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 116
Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu
1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 117
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 118
Gln Ala Ser Gln Phe Glu Ser
1 5
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 119
Gly Ala Ser Gln Gly Glu Thr
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 120
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gln
1 5
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 121
Gln Ala Ser Gln Phe Glu Ala
1 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 122
Gly Ala Ser Gln Phe Gln Gln
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 123
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 124
Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 125
Arg Asp Gln Lys Ile Ser Glu
1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 126
Lys Asp Gln Lys Leu Ala Glu
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 127
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 128
Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 129
Glu Arg Asp Gln Lys Ile Ser
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 130
Glu Arg Asp Gln Ala Leu Ser
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 131
Glu Lys Asp Gln Lys Leu Ala
1 5
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 132
Glu Ser Ser Ala Ala Lys Ile
1 5
<210> 133
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 133
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Ile
1 5
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 134
Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu
1 5
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
<400> 135
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu
1 5
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 136
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr
1 5
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 137
Gly Ala Ser Gln Gly Glu Thr
1 5
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 138
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gln
1 5
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 139
Gln Ala Ser Gln Phe Glu Ala
1 5
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 140
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser
1 5
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 141
Gln Ala Ser Gln Phe Glu Ser
1 5
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 142
Gly Ala Ser Gln Phe Gln Gln
1 5
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridium tetani）
<400> 143
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：IgA蛋白酶肽
<400> 144
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知的描述：Antarease肽
<400> 145
Ile Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
1 5
<210> 146
<211> 23
<212> PRT
<213> 流感病毒（Influenza virus）
<400> 146
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly
20
<210> 147
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 此序列可涵盖1-8 'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元，其中一些位置可不存在
<220>
<223> 参见如关于取代和优选实施方案的详细描述所提交的说明书
<400> 147
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 148
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (174)

1.一种融合蛋白，其包含：
a)肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)，以及
b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或PA的C末端受体结合结构域，
其中(a)部分和(b)部分连接或融合在一起。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述BTx或TTx包含BTx或TTx酶部分和易位信号。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述BTx酶部分或易位信号选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个的BTx轻链和重链结构域。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述BTx或TTx酶部分或易位信号选自表1所示的代表性LC酶部分或HN易位肽。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述(a)部分和(b)部分或者所述酶部分和易位肽通过接头肽连接。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
9.如权利要求6或7所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述PA的C末端受体结合结构域包含PAd4结构域、PAd2和PAd4结构域或PA63。
11.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域耐蛋白酶裂解。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域耐弗林蛋白裂解、或Lys C裂解、或两者。
13.一种融合蛋白，其包含：
a)非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够裂解伤害感受器神经元中的SNARE蛋白；以及
b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，
其中所述PA或片段结合所述伤害感受器神经元上表达的受体。
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述非细胞毒性蛋白酶包含梭状芽孢杆菌神经毒素L链。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒神经毒素(BTx)或破伤风神经毒素(TTx)。
16.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述梭状芽孢杆菌神经毒素L链选自表1。
17.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
18.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述能够结合PA的蛋白为：
i)炭疽毒素致死因子(LF)；或
ii)炭疽毒素水肿因子(EF)。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中LF的PA结合结构域为LF的N末端结构域(缩写为LFPABD或LFn)。
20.如权利要求18所述的融合蛋白，其中EF的PA结合结构域为EF的N末端结构域(缩写为EFPABD或EFn)。
21.一种融合蛋白，其包含：
a)含二硫化物的肽毒素(这些包括具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素)，其能够阻断伤害感受器神经元中的离子通道；以及
b)靶向部分(TM)，其能够结合所述伤害感受器神经元上的结合位点，其中所述伤害感受器神经元在其中表达所述离子通道(例如，钠通道、或钙通道、或钠通道和钙通道两者)；
22.如权利要求21所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素包含半胱氨酸结基序。
23.如权利要求21所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
24.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述TM选自由以下组成的组：
i)炭疽毒素保护性抗原(PA)；
ii)PA的C末端受体结合结构域；
iii)伤害感受器神经元结合蛋白。
25.根据权利要求24所述的融合蛋白，其中所述PA或所述PA的C末端受体结合结构域与所述伤害感受器神经元上表达的ANTXR2(CMG2)受体相互作用并结合。
26.根据权利要求24或25所述的融合蛋白，其中所述PA为耐弗林蛋白酶裂解的突变体或变体PA。
27.根据权利要求24或25所述的融合蛋白，其中所述PA的C末端受体结合结构域为PA63或PAd4，或者包含PAd2和PAd4结构域。
28.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述PAd4耐蛋白酶裂解。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述蛋白酶为弗林蛋白酶或Lys C。
30.如权利要求24所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。
31.如权利要求30所述的融合蛋白，其中所述抗体特异性结合伤害感受器神经元上存在的神经生长因子受体、所述ANTXR2受体或离子通道蛋白。
32.如权利要求31所述的融合蛋白，其中所述离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
33.一种融合蛋白，其包含：
a)含二硫化物的肽毒素(这是具有半胱氨酸结基序的通道阻断毒素)，其能够阻断伤害感受器神经元中的钠通道、或钙通道、或钠和钙通道两者；以及
b)能够结合炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段的蛋白，
其中所述片段结合所述伤害感受器神经元上表达的受体。
34.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素包含半胱氨酸结基序。
35.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
36.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
37.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述能够结合PA的蛋白为：
i)炭疽毒素致死因子(LF)；或
ii)炭疽毒素水肿因子(EF)。
38.一种融合蛋白，其包含：
a)AB毒素；
b)炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段，其中所述PA或片段结合所述伤害感受器神经元上表达的受体；以及
c)易位结构域(TL)，其能够将所述蛋白酶从内体内易位跨过内体膜并进入所述伤害感受器神经元的细胞溶质。
39.如权利要求38所述的融合蛋白，其中所述AB毒素选自
i)蓖麻毒素，
ii)霍乱毒素A部分和B部分；
iii)铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；
iv)志贺毒素A部分和B部分；以及
v)白喉毒素A部分和B部分。
40.如权利要求38或39所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元上表达的PA结合受体为ANTXR2(CMG2)。
41.如权利要求38所述的融合蛋白，其中所述PA片段为PA的C末端受体结合结构域。
42.如权利要求38所述的融合蛋白，其中所述TL为
i)梭状芽孢杆菌神经毒素易位结构域；
ii)海参毒素；或
iii)海参毒素的变体形式，其使所述AB毒素的毒素受体结合功能不起作用。
43.一种核酸，其编码根据前述权利要求中任一项的融合蛋白。
44.一种载体，其包含权利要求43所述的核酸。
45.如权利要求44所述的载体，其中所述载体为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体或病毒粒子。
46.一种细胞，其包含权利要求43所述的核酸或权利要求44或45所述的载体。
47.一种产生前述权利要求中任一项所述的融合蛋白的方法，包括：
a)在使得所述融合蛋白被表达的条件下培养权利要求46所述的细胞；以及
b)回收所述融合蛋白。
48.一种融合蛋白，其通过权利要求47所述的方法产生。
49.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的融合蛋白。
50.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的组合物。
51.一种治疗疼痛的方法，其包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
52.一种包含肉毒神经毒素(BTx)部分的融合蛋白，所述肉毒神经毒素(BTx)部分包含所述BTx的N末端酶结构域(L链)和中间成孔/易位结构域(HN)，所述BTx连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。
53.如权利要求52所述的融合蛋白，其还包含在所述BTx部分与所述PAd4结构域之间的接头肽。
54.如权利要求53所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
55.如权利要求54所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
56.如权利要求53所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
57.如权利要求54或55所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
58.如权利要求52所述的融合蛋白，其中所述BTx部分选自BTx/A、BTx/B、BTx/C、BTx/D、BTx/E、BTx/F、BTx/G和第一非肉毒梭状芽孢杆菌类毒素中任一个的BTx轻链和重链结构域。
59.如权利要求52所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含串联的2-10个PAd4结构域。
60.如权利要求52所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个连续氨基酸进一步并入到所述BTx部分与所述PAd4之间。
61.如权利要求52所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723和729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
62.如权利要求52所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
63.如权利要求52所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
64.如权利要求63所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR(SEQID NO:32)或SSSS(SEQ ID NO:33)。
65.如权利要求52所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(编号为减去SEQ.ID.NO:1的29aa信号肽之后的编号)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
66.如权利要求52所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
67.如权利要求52所述的融合蛋白，其中对应于所述BTx的L链与所述BTx的HN链之间的接点的残基已被裂解。
68.一种组合物，其包含权利要求52-67中任一项所述的融合蛋白。
69.如权利要求68所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
70.一种融合蛋白，其包含：
a)肉毒神经毒素(BTx)部分的肉毒神经毒素N末端酶结构域(BTx的L链)，以及
b)炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式，酶结构域，
其中(a)部分在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者连接(b)部分。
71.如权利要求70所述的融合蛋白，其还包含确定对应于所述BTx HN结构域的N末端部分的区带的氨基酸序列，所述BTx HN结构域位于所述BTx部分的C末端侧，并且所述区带连接所述L链。
72.如权利要求71所述的融合蛋白，其中对应于与所述BTx HN结构域的所述区带的L链接点的残基已被裂解。
73.如权利要求71所述的融合蛋白，其中所述BTx L链和对应于所述BTx HN结构域的N末端部分的所述区带中的Cys残基已改变成Ala、Ser或Thr。
74.如权利要求70所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
75.如权利要求70所述的融合蛋白，其还包含在所述BTx L部分与所述LFn或EFn结构域之间的接头肽。
76.如权利要求75所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
77.如权利要求75所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
78.如权利要求75所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
79.如权利要求75所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys或Arg。
80.一种组合物，其包含权利要求70-79的所述融合蛋白中的任一种。
81.如权利要求80所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
82.如权利要求80或81所述的组合物和天然炭疽毒素保护性抗原(PA)蛋白。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述PA蛋白为低聚物PA。
84.如权利要求83所述的组合物，其中所述低聚物PA结合所述融合蛋白。
85.如权利要求80-84中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
86.一种融合蛋白，其包含：
a)炭疽毒素保护性抗原(PA)；炭疽毒素保护性抗原C末端受体结合结构域(PAd4)；或伤害感受器神经元结合蛋白，其连接
b)含二硫化物的肽毒素。
87.如权利要求86所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为抑制剂半胱氨酸结毒素。
88.如权利要求86所述的融合蛋白，其中所述含二硫化物的肽毒素为芋螺毒素、漏斗网蛛毒素、δ-岩沙海葵毒素、虎纹捕鸟蛛毒素或ProTx II毒素。
89.如权利要求86所述的融合蛋白，其还包含在所述PA、PAd4或伤害感受器结合蛋白与所述抑制剂半胱氨酸结毒素之间的接头肽。
90.如权利要求89所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
91.如权利要求89所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
92.如权利要求89所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
93.如权利要求86所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含串联的2-10个PAd4结构域。
94.如权利要求86所述的融合蛋白，其中PAd4或PA中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、703、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
95.如权利要求94所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
96.如权利要求86所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基164RKKR167的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
97.如权利要求96所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
98.如权利要求86所述的融合蛋白，其中PAd4或PA中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
99.如权利要求86所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
100.如权利要求86所述的融合蛋白，其中所述伤害感受器神经元结合蛋白为抗体。
101.如权利要求100所述的融合蛋白，其中所述抗体特异性结合伤害感受器神经元上存在的神经生长因子受体或离子通道蛋白。
102.如权利要求101所述的融合蛋白，其中所述离子通道蛋白选自Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9。
103.一种组合物，其包含权利要求86-102中任一项所述的融合蛋白。
104.如权利要求103所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
105.一种融合蛋白，其包含含二硫化物的肽毒素，所述含二硫化物的肽毒素在N末端、或在C末端、或在N末端和C末端两者可操作地连接或者在一个或多个位点化学交联炭疽毒素致死因子的N末端结构域(LFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式；或炭疽毒素水肿因子的N末端结构域(EFn)，所述结构域结合PA63的低聚物形式，即炭疽PA的蛋白水解激活形式。
106.如权利要求105所述的融合蛋白，其还包含在所述LFn与所述毒素之间或所述EFn与所述毒素之间的接头肽。
107.如权利要求106所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
108.如权利要求107所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
109.如权利要求107所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和/或Arg。
110.一种组合物，其包含权利要求105-109中任一项所述的融合蛋白。
111.如权利要求110所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
112.如权利要求110或111所述的组合物，其还包含天然炭疽毒素保护性抗原(PA)。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述PA呈低聚物PA的形式。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述低聚物PA结合所述融合蛋白。
115.如权利要求110-112中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
116.一种融合蛋白，其包含与接头肽融合的AB毒素，所述接头肽可操作地连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)，其中所述融合蛋白还包含易位结构域、海参毒素或使所述AB毒素的毒素受体结合功能不起作用的所述海参毒素的突变体形式。
117.如权利要求116所述的融合蛋白，其中所述AB毒素选自蓖麻毒素、霍乱毒素A部分和B部分；铜绿假单胞菌外毒素A的A部分和B部分；志贺毒素A部分和B部分；以及白喉毒素A部分和B部分。
118.如权利要求116或117所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
119.如权利要求116所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
120.如权利要求116-119中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
121.如权利要求116-120中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys和Arg。
122.如权利要求116所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个连续氨基酸进一步并入到所述AB毒素与所述PAd4之间。
123.如权利要求116所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
124.如权利要求116-121中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
125.如权利要求116-124中任一项所述的融合蛋白，其包含串联的2-10个PAd4结构域。
126.如权利要求116所述的融合蛋白，其中PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、701、713、719、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)(PAd4)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
127.如权利要求116所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
128.如权利要求116所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
129.如权利要求128所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
130.一种组合物，其包含权利要求114-129中任一项所述的融合蛋白。
131.如权利要求130所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
132.一种融合蛋白，其包含来自破伤风神经毒素(TTx)的N末端酶结构域(链A)连同易位/成孔结构域，所述破伤风神经毒素(TTx)可操作地连接炭疽毒素保护性抗原的C末端受体结合结构域(PAd4结构域)。
133.如权利要求132所述的融合蛋白，其还包含在所述TTx部分与所述PAd4结构域之间的接头肽。
134.如权利要求133所述的融合蛋白，其中所述接头肽的长度为1-20个氨基酸。
135.如权利要求134所述的融合蛋白，其中所述接头肽在人类血清中稳定至少1分钟。
136.如权利要求134所述的融合蛋白，其中所述接头肽包含至少一个Gly或Ser氨基酸。
137.如权利要求134所述的融合蛋白，其中所述接头肽不包含Lys或Arg。
138.如权利要求132-137中任一项所述的融合蛋白，其包含串联的2至10个PAd4结构域。
139.如权利要求132所述的融合蛋白，其中将来自所述N末端侧相邻于所述天然PAd4结构域的1-60个连续氨基酸进一步并入到所述BTx部分与所述PAd4之间。
140.如权利要求132所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置594、613、633、637、653、673、679、680、684、695、701、713、719、722、723、729和730(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Lys残基中的一个或多个已被Arg或His代替。
141.如权利要求132所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ.ID.NO:1中的位置623、642、662、666、682、702、708、709、713、724、732、751、752、758和759的Lys残基中的一个或多个、多达并且包括每一个已被Arg或His代替。
142.如权利要求132所述的融合蛋白，其包含完整的PA蛋白，其中包含氨基酸残基RKKR的弗林蛋白酶裂解位点已被耐弗林蛋白酶的氨基酸序列代替，其中RKKR为减去SEQ ID NO:1中的29个氨基酸信号肽的SEQ ID NO:1的残基164-167。
143.如权利要求142所述的融合蛋白，其中所述耐弗林蛋白酶的氨基酸序列为SSSR或SSSS。
144.如权利要求132所述的融合蛋白，其中所述PAd4结构域中在SEQ ID NO:1的位置601、713、719(减去SEQ.ID.NO:1中的29aa信号肽)的Asn残基中的一个或多个已被Asp代替。
145.如权利要求132-144中任一项所述的融合蛋白，其在所述融合蛋白的N末端还包含至少一个D氨基酸。
146.如权利要求132-145中任一项所述的融合蛋白，其中对应于TTx轻链与TTx重链的接点的残基已被裂解。
147.一种组合物，其包含权利要求132-146中任一项所述的融合蛋白。
148.如权利要求147所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
149.一种核酸，其编码权利要求52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白中的任一种。
150.一种载体，其包含权利要求149所述的核酸。
151.如权利要求150所述的载体，其中所述载体为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒粒子或病毒载体。
152.一种细胞，其包含权利要求149所述的核酸或权利要求150或151所述的载体。
153.一种产生前述权利要求中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)在使得所述融合蛋白被表达的条件下培养权利要求152所述的细胞；以及
b)回收所述融合蛋白。
154.一种融合蛋白，其通过权利要求153所述的方法产生。
155.如权利要求1-42、52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白，其为糖基化的。
156.如权利要求1-42、52-67、70-79、86-102、105-109、116-129和132-146中任一项所述的融合蛋白，其为非糖基化的。
157.如权利要求153所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述细菌细胞为大肠杆菌。
159.如权利要求153所述的方法，其中所述细胞为酵母细胞。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述酵母为酿酒酵母。
161.如权利要求159所述的方法，其中所述酵母为糖基化缺陷细胞。
162.如权利要求159所述的方法，其中所述酵母为糖基化和蛋白酶缺陷的。
163.如权利要求153所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为COS细胞、CHO细胞或NSO细胞。
165.前述权利要求任一项的融合蛋白用于治疗疼痛的用途。
166.前述权利要求任一项的融合蛋白用于制造用于治疗疼痛的药物的用途。
167.一种用于治疗疼痛的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用选自权利要求49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述施用通过鞘内输注或脑室内输注或通过硬膜外注射到中枢神经系统中，或者通过使用皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射的外周施用来执行。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述疼痛选自糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛和其他全身性疼痛病症。
170.一种用于治疗神经、关节、皮肤、内脏、膀胱或肌肉疼痛的方法，其包括通过真皮内注射、皮下注射、肌内注射、神经内注射或关节内注射来向有需要的受试者外周地施用选自权利要求49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
171.一种用于治疗糖尿病神经性疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛或其他全身性疼痛病症的方法，其包括通过硬膜外注射、鞘内输注或脑室内输注到有需要的受试者的中枢神经系统中来施用选自权利要求49、68-69、80-85、103-104、110-115、130-131和147-148的组合物。
172.如权利要求167-171中任一项所述的方法，其中权利要求80-85和110-115中所述的组合物在施用包含在药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中的炭疽保护性抗原(PA)的组合物之前、同时或之后单独施用。
173.一种治疗疼痛的方法，其包括向有需要的受试者施用天然成熟炭疽毒素保护性抗原(PA)和炭疽毒素水肿因子(EF)、炭疽毒素致死因子(LF)或其任何组合。
174.一种制造用于治疗疼痛的药物组合物的方法，其中所述药物组合物包含前述段落中所述的融合蛋白中一种或多种和药学上可接受的载剂或赋形剂。
CN201680062362.0A 2015-08-27 2016-08-26 用于治疗疼痛的组合物和方法 Pending CN108350039A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562210610P 2015-08-27 2015-08-27
US62/210,610 2015-08-27
PCT/US2016/049099 WO2017035507A1 (en) 2015-08-27 2016-08-26 Compositions and methods for treatment of pain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108350039A true CN108350039A (zh) 2018-07-31

Family

ID=58101095

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680062362.0A Pending CN108350039A (zh) 2015-08-27 2016-08-26 用于治疗疼痛的组合物和方法
CN201680062855.4A Pending CN108602861A (zh) 2015-08-27 2016-08-26 用于治疗疼痛的组合物和方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680062855.4A Pending CN108602861A (zh) 2015-08-27 2016-08-26 用于治疗疼痛的组合物和方法

Country Status (11)

Country Link
US (4) US11753633B2 (zh)
EP (2) EP3341392A4 (zh)
JP (2) JP2018530315A (zh)
KR (2) KR20180050679A (zh)
CN (2) CN108350039A (zh)
AU (2) AU2016310521A1 (zh)
BR (2) BR112018003782A2 (zh)
CA (2) CA2994560A1 (zh)
EA (1) EA201890587A1 (zh)
MX (1) MX2018002183A (zh)
WO (2) WO2017035508A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113396159A (zh) * 2018-12-06 2021-09-14 Mj细胞生物股份有限公司 人抗antxr嵌合抗原受体及其用途

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201718627A (zh) * 2015-06-11 2017-06-01 梅茲製藥有限兩合公司 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
EP3341392A4 (en) 2015-08-27 2019-01-23 President and Fellows of Harvard College COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PAIN
GB201607901D0 (en) * 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
DK3481852T3 (da) * 2016-07-08 2023-02-27 Childrens Medical Center Hidtil ukendt botulinum-neurotoksin og dets derivater
JP2021500871A (ja) * 2017-09-29 2021-01-14 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション ニューロトキシン様トキシンおよびそれらの使用
BR112020006827A2 (pt) 2018-01-29 2020-10-06 Ipsen Biopharm Limited neurotoxinas botulínicas clivando snare não neuronal
EP3752128A1 (de) * 2018-02-16 2020-12-23 Bontana Therapies Gmbh Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung
JP2021525514A (ja) * 2018-05-30 2021-09-27 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロントＴｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ 受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法及びキット
WO2021150581A2 (en) * 2020-01-21 2021-07-29 Trustees Of Dartmouth College Immunologically optimized botulinum toxin light chain variants
JP2023522534A (ja) * 2020-02-03 2023-05-31 プレマス バイオテック プライベート リミテッド 発現が困難なタンパク質を発現させるための、組換え発現プラットフォーム、構築物、および方法
WO2021173916A1 (en) * 2020-02-27 2021-09-02 President And Fellows Of Harvard College Nociceptor neurons control cancer immunosurveillance
KR20240051355A (ko) * 2022-10-12 2024-04-22 주식회사 알케미어 보툴리눔 독소의 경쇄 변이체

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1371424A (zh) * 1999-08-25 2002-09-25 阿勒根销售公司 可活化的重组神经毒素
US20130336974A1 (en) * 2011-01-10 2013-12-19 President And Fellows Of Harvard College Method for delivering agents into cells using bacterial toxins
CN103649317A (zh) * 2011-05-16 2014-03-19 辛它可辛有限公司 治疗性融合蛋白

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
WO1997023236A1 (en) 1995-12-13 1997-07-03 President And Fellows Of Harvard College Use of toxin peptides and/or affinity handles for the delivering compounds into cells
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
AUPP627498A0 (en) 1998-10-02 1998-10-22 University Of Queensland, The Novel peptides - i
US6767896B1 (en) 1999-01-29 2004-07-27 Cognetix, Inc. Conotoxin peptides
DE60016256T2 (de) * 1999-09-24 2005-12-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mutierte Anthraxtoxin Schutz-Antigenproteinen spezifisch für Zellen, die hohe Zelloberflächenmetalloproteinasen- oder Plasminogenaktivator-Rezeptoren-Menge enthalten
CA2396529A1 (en) 1999-12-30 2001-07-12 University Of Utah Research Foundation O-superfamily conotoxin peptides
AU2003237528A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
DE102004043009A1 (de) 2004-09-06 2006-03-23 Toxogen Gmbh Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen
WO2006096515A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin fusion proteins
DK2154151T3 (da) 2005-09-19 2011-09-05 Allergan Inc Clostridiumtoksinaktiverbare clostridiumtoksiner
US20120087969A1 (en) 2005-11-08 2012-04-12 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Mu-Conotoxin Peptides and Use Thereof as a Local Anesthetic
EP2001902B1 (en) 2006-03-14 2013-03-27 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
GB0610867D0 (en) 2006-06-01 2006-07-12 Syntaxin Ltd Treatment of pain
EP2038298A2 (en) 2006-07-11 2009-03-25 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells
EP2038299A2 (en) 2006-07-11 2009-03-25 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells
US9284358B2 (en) 2006-07-18 2016-03-15 University Of Utah Research Foundation Conotoxin peptides
EP2817341A4 (en) 2012-02-23 2015-12-02 Harvard College MODIFIED MICROBIAL TOXIN RECEPTOR FOR ADMINISTERING AGENTS IN CELLS
CA2874436A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Translocation of non-natural chemical entities through anthrax protective antigen pore
US20140056870A1 (en) * 2012-08-27 2014-02-27 Allergan, Inc. Fusion proteins
WO2014088928A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for making targeted protein toxins by sortase-mediated protein ligation
GB201407525D0 (en) 2014-04-29 2014-06-11 Syntaxin Ltd Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins
EP3341392A4 (en) 2015-08-27 2019-01-23 President and Fellows of Harvard College COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PAIN

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1371424A (zh) * 1999-08-25 2002-09-25 阿勒根销售公司 可活化的重组神经毒素
US20130336974A1 (en) * 2011-01-10 2013-12-19 President And Fellows Of Harvard College Method for delivering agents into cells using bacterial toxins
CN103649317A (zh) * 2011-05-16 2014-03-19 辛它可辛有限公司 治疗性融合蛋白

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113396159A (zh) * 2018-12-06 2021-09-14 Mj细胞生物股份有限公司 人抗antxr嵌合抗原受体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018003782A2 (pt) 2018-09-25
EA201890587A1 (ru) 2018-09-28
US10704035B2 (en) 2020-07-07
BR112018003794A2 (pt) 2018-09-25
CN108602861A (zh) 2018-09-28
EP3341391A1 (en) 2018-07-04
WO2017035508A1 (en) 2017-03-02
KR20180050679A (ko) 2018-05-15
US20180244731A1 (en) 2018-08-30
US11753633B2 (en) 2023-09-12
JP2018525021A (ja) 2018-09-06
EP3341392A4 (en) 2019-01-23
MX2018002183A (es) 2018-05-28
EP3341392A1 (en) 2018-07-04
US20180251740A1 (en) 2018-09-06
CA2994560A1 (en) 2017-03-02
US11104892B2 (en) 2021-08-31
US20200362325A1 (en) 2020-11-19
CA2994729A1 (en) 2017-03-02
AU2016312685A1 (en) 2018-03-01
KR20180070563A (ko) 2018-06-26
JP2018530315A (ja) 2018-10-18
EP3341391A4 (en) 2019-03-06
WO2017035507A1 (en) 2017-03-02
AU2016310521A1 (en) 2018-03-01
US20220033795A1 (en) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108350039A (zh) 用于治疗疼痛的组合物和方法
AU2022203264B2 (en) A novel botulinum neurotoxin and its derivatives
US20200255481A1 (en) Neurotoxin-like toxin and uses thereof
CN103602650B (zh) 通过使用单链多肽融合蛋白进行疼痛的治疗
WO2007106799A2 (en) Multivalent clostridial toxins
US20240158773A1 (en) Engineered botulinum neurotoxin a protease domain with improved efficacy
US20240082369A1 (en) Improved receptor-binding domain of botulinum neurotoxin a and uses thereof
WO2024073664A2 (en) Modified bont/a2 receptor-binding domains
EA041568B1 (ru) Новый ботулинический нейротоксин и его производные

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180731

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication