CN113396159A

CN113396159A - 人抗antxr嵌合抗原受体及其用途

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Publication number: CN113396159A
Application number: CN201980091396.6A
Authority: CN
Inventors: 李景美; 全承铉; 李百胜; 李润; 李永罐
Original assignee: Mj Cell Biology Co ltd
Current assignee: Mj Cell Biology Co ltd
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2021-09-14
Also published as: EP3892630A1; EP3892630A4; WO2020116686A1; JP7209091B2; US20220372084A1; WO2020117004A1; JP2022511885A

Abstract

本发明涉及具有特异性靶向炭疽毒素受体(ANTXR)的配体的嵌合抗原受体，更具体地，涉及：编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含特异性结合炭疽毒素受体1(ANTXR1)或炭疽毒素受体2(ANTXR2)的配体PA63；包含编码嵌合抗原受体的核酸的载体；和包含所述载体的重组细胞；用于预防或治疗实体癌的包含所述重组细胞的药物组合物；和治疗方法。实体癌可根据本发明使用抗ANTXR嵌合抗原受体(CAR)‑T细胞来治疗，并且由于向抗癌药物给药对其无效的实体癌患者，特别是胰腺癌患者施用嵌合抗原受体(CAR)‑T细胞，因此药物施用受到限制，并且高效且安全的定制实体癌预防或治疗是可能的。

Description

人抗ANTXR嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明涉及包含特异性靶向炭疽毒素受体(ANTXR)的配体的嵌合抗原受体，更具体地，涉及编码嵌合抗原受体(其包含特异性结合炭疽毒素受体1(ANTXR1)或炭疽毒素受体2(ANTXR2)的PA63配体)的核酸、包含编码嵌合抗原受体的核酸的载体、包含所述载体的重组细胞、包含所述重组细胞的用于预防或治疗实体癌的药物组合物以及使用所述组合物治疗实体癌的方法。

背景技术

炭疽毒素受体(ANTXR)包括炭疽毒素受体1(ANTXR1)和炭疽毒素受体2(ANTXR2)，其已知的配体包括炭疽细菌分泌的炭疽毒素。炭疽毒素由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)分泌，炭疽杆菌是革兰阳性细菌，包含三种毒素蛋白，即保护性抗原(PA，83kDa)、致死因子(LF，90kDa)和水肿因子(EF，89kDa)(Morton,N.(2001)New Engl.J.Med.345:1621-1626)。其中，PA与细胞表面的炭疽毒素受体(ANTXR)结合，其中氨基末端20kDa(PA20)被弗林蛋白酶切割的63kDa蛋白质(PA63)形成七聚体，然后与LF结合(Collier,R.J(2003)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.19:45-70)。

ANTXR1是细胞外基质蛋白，也被称为“TEM8(肿瘤内皮标志物8)”。ANTXR1是在各种肿瘤的内皮中表达的I型跨膜蛋白，已被发现在肿瘤血管生成过程中活跃表达(St.Croix等人，(2000)Sciences 289:1197)，并且还已知其通过肿瘤的血管内皮细胞中的细胞外基质蛋白参与细胞的粘附和迁移(Bradely等人，(2001)Nature 414:228-229；Nanda等人，(2004)Curr.Opin.Oncol.16:44-49)。因为ANTXR1作为细胞外配体的受体，其一直是治疗血管生成的靶点(Carson-Walter,EB等人，(2001)Cancer Res 61:6649)。然而，ANTXR1对胰腺癌组织的影响尚未有报道。ANTXR2又称“CMG2(毛细血管形态发生基因2)”，并且已知其参与血管生成。另外，已知ANTXR2参与几种类型细胞(包括上皮细胞和内皮细胞)的粘附和运动(Lin Ye等人，(2014)INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 45:1565-1573)。

尽管在癌症的检测、预防和治疗方面已经取得了进展，但一般来说成功的治疗策略还没有实现。癌症治疗的各种形式的不良事件源于治疗癌症的常规方法，包括化学疗法和放射疗法。因此，由于严重的毒性相关副作用，这些方法的实用性有限。使用治疗性抗体的免疫疗法由于较差的药代动力学特征、血清蛋白酶对抗体的快速去除、肾小球中的过滤、对肿瘤部位的有限渗透以及肿瘤细胞上靶抗原的表达水平而导致有限的成功。

近年来，利用经遗传修饰的细胞疗法作为癌症的新型量子免疫基因疗法受到了极大的关注。这种疗法包括引入一种编码对癌细胞表面抗原具有特异性，并且能够将细胞活化成T细胞或NK细胞的嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子，在体外增殖所获得的转基因细胞，以及注射该转基因细胞。与抗体药物相比，这种疗法被认为在更长的时间内具有更强效的抗癌作用，因此有望在临床上有效。

在这种技术背景下，作为开发用于治疗实体癌的新型嵌合抗原受体的广泛努力的结果，本发明人发现ANTXR1和ANTXR2在正常组织中表达非常少，但仅在胰腺癌组织中特异性表达，并发现特异性靶向ANTXR1和ANTXR2的PA63配体。基于这一发现完成了本发明。

背景技术中公开的信息仅仅是为了更好地理解本发明的背景而提供的，因此其可能不包括形成对本领域技术人员来说已经显而易见的现有技术的信息。

发明内容

本发明的一个目的是提供编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外结合结构域识别炭疽毒素受体(ANTXR)。

本发明的另一个目的是提供包含编码嵌合抗原受体的核酸的载体、包含所述载体的重组细胞、包含所述重组细胞的用于预防或治疗实体癌的药物组合物以及使用所述药物组合物治疗实体癌的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外结合结构域识别炭疽毒素受体(ANTXR)。

本发明还提供了包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体。

本发明还提供了包含所述载体的重组细胞。

本发明还提供了包含所述重组细胞的用于预防或治疗实体癌的药物组合物。

本发明还提供了预防或治疗实体癌的方法，其包括向受试者施用所述重组细胞。

本发明还提供了重组细胞用于预防或治疗实体癌的用途。

本发明还提供了所述重组细胞在制备用于预防或治疗实体癌的治疗剂方面的用途。

附图说明

图1显示了六个主要选择的基因在正常组织中的蛋白表达水平。A显示ANTXR1(炭疽毒素受体1)的蛋白表达水平，B显示ANTXR2(炭疽毒素受体2)的蛋白表达水平，C显示TMC5(跨膜通道样5)的蛋白表达水平，D显示CLDN18(紧密连接蛋白-18)的蛋白表达水平，E显示MUC13(粘蛋白13)的蛋白表达水平，F显示MMP14(基质金属蛋白酶14)的蛋白表达水平。

图2显示了通过实时RT-PCR(RT-PCR)分析的外周血单核细胞(PBMC)和原发性胰腺癌组织中的ANTXR1和ANTXR2 mRNA的表达水平。PBMC用作阴性对照，PANC-1用作阳性对照，#101、#103、#105、#106、#107、#108、#109和#110用作2期胰腺癌组织，#102用作3期胰腺癌组织。

图3显示了通过RT-PCR(实时RT-PCR)分析的正常细胞(HEK-293细胞)、MDA-MB 231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、Capan2、PANC1、Mia-PaCa2、SNU-213、SNU-324、SNU-2466、SNU-2469、SNU-2485和SNU-2543)中的ANTXR1和ANTXR2 mRNA的表达水平。

图4显示了使用流式细胞术分析的正常细胞(HEK-293细胞)、MDA-MB-231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、PANC1、SNU-213、SNU-2466)的细胞表面上ANTXR1和ANTXR2蛋白的表达水平。

图5显示了在用缀合有FITC(其在作为ANTXR1和ANTXR2的配体的PA63中显示出荧光)的试剂处理后，已被发现ANTXR1和ANTXR2 mRNA的表达显著增加的HUVEC细胞(正常细胞)、MDA-MB 231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、Capan2、PANC1、Mia-PaCa2、SNU-213、SNU-324、SNU-2466、SNU-2469、SNU-2485和SNU-2543)中的通过流式细胞术分析的细胞表面蛋白ANTXR1和ANTXR2的表达水平。

图6是显示对本发明的ANTXR1或ANTXR2特异的CAR的设计的载体图谱。

图6A显示了CAR，其包含作为细胞外结合结构域的PA63配体、源自CD8α的跨膜结构域、G4S1(GGGGS)接头、作为主要信号传导结构域的CD3ζ链以及作为共刺激信号传导结构域的CD28和CD137。图6B显示了CAR，所述CAR包含PA63配体与受体结合所必需的结构域4或包含结构域4的片段(作为细胞外结合结构域的)、源自CD8α的铰链区和跨膜区、CD3ζ链(作为初级信号结构域)以及CD28和CD137(作为共刺激信号结构域)。

图7显示了通过流式细胞术分析的由CAR至细胞毒性T细胞克隆中的转导产生的表达。

图8显示了常规NYESO-1CTL和CAR-T细胞，前者识别NYESO-1抗原并表现出活性，后者能够通过向其引入CAR而同时靶向NYESO-1和ANTXR1或ANTXR2。

图9显示了使用流式细胞术分析的包含D4的CAR-T细胞对胰腺癌细胞系(PANC-1，AsPC1)的抗癌细胞毒性和活性，其中“仅T细胞”表示阴性对照，“PMA/离子霉素”表示阳性对照。

图10显示了包含D4或D4+D4的CAR-T细胞对胰腺癌细胞系(AsPC1、PANC-1、Mia-PaCa2)的抗癌细胞毒性和活性。

图11是显示包含D4的CAR-T细胞对胰腺癌细胞系(PANC-1)的抗癌细胞毒性的图。

图12显示了使用从PBMC分离的T细胞产生的CAR-T细胞对黑色素瘤(526-mel)、胰腺癌(PANC-1、Mia-PaCa2)和乳腺癌细胞系(SK-BR3、MDA-231、ZR-571)的抗癌细胞毒性和活性。

图13是显示使用从PBMC分离的T细胞产生的CAR-T细胞对胰腺癌细胞系(PANC-1_RFP)的细胞毒性的图。

图14是显示将使用从PBMC分离的T细胞产生的CAR-T细胞应用于表达ANTXR的胰腺癌动物模型的结果的图表。

本发明的详细描述和优选实施方案

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。一般来说，本文使用的术语在本领域中是公知的，并且是通常使用的。

作为开发用于治疗实体癌的新型嵌合抗原受体的广泛努力的结果，本发明人发现ANTXR1和ANTXR2在正常组织中表达非常少，并且仅在胰腺癌组织中特异性表达。在本发明的实施方案中，使用微阵列方法分析从胰腺癌患者分离的癌组织和IPMN组织以及正常胰腺组织中的基因变化，并选择6种在胰腺癌组织中显示表达增加的基因(表1)。在六个初步选择的基因中，只有ANTXR1和ANTXR2满足所有要求，即mRNA的表达量应满足“正常组织<IPMN组织<胰腺导管腺癌(PDAC)组织”的关系，表达的蛋白质应存在于细胞表面，并且基因在正常组织中应很少表达。此外，根据本发明，鉴定了特异性靶向ANTXR1和ANTXR2的PA63配体，并且开发了对ANTXR1或ANTXR2特异的CAR，所述CAR被工程化成包含PA63配体与受体结合所必需的结构域4或含结构域4的片段(作为细胞外结合结构域)、源自CD8α的铰链区和跨膜结构域、CD3ζ链(作为初级信号传导结构域)以及CD28和CD137(作为共刺激信号传导结构域)。

因此，一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外结合结构域识别炭疽毒素受体(ANTXR)。

如本文中所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指重组多肽构建体，其被工程化成将靶细胞和细胞内信号传导靶向免疫效应细胞。CAR是与T细胞受体激活的胞内结构域组合以产生嵌合蛋白的分子，该嵌合蛋白对靶抗原(例如，肿瘤抗原)具有基于抗体的特异性，并对其具有特异性的抗肿瘤细胞免疫活性。如本文所用，术语“嵌合体”是指由源自不同来源的不同蛋白质部分或DNA组成的生物体。CAR至少包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

如本文中所用，术语“细胞外结合结构域”是指CAR的一部分，其具有特异性结合目标靶抗原的能力。细胞外结合结构域可包括任何蛋白质、多肽、寡肽或肽，所述蛋白质、多肽、寡肽或肽保持特异性识别生物分子(例如，细胞表面受体、肿瘤蛋白质、脂质、多糖、其他细胞表面靶分子或其组分)并与其结合的能力。结合结构域包括任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的用于结合目标生物分子的对应物。

如本文中所用，术语“特异性结合”是指分子与另一个分子的结合亲和力大于背景结合的亲和力。例如，当细胞外结合结构域以约10⁵M^-1或Ka(即具有以1/M为单位的特异性结合相互作用的平衡解离常数)或更高的亲和力与靶分子结合或缔合时，其特异性地与其结合。或者，亲和力可被定义为具有以M为单位(例如，10^-5M至10^-13M或更小)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。

根据本发明的胞外结合结构域和CAR的亲和力可通过常规技术容易地测量，所述常规技术为诸如使用竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或标记配体进行的结合、缔合或取代分析，或者表面等离子体共振装置，诸如Biacore T100(可从Biacore,Inc.,Piscataway,New Jersey,USA购得)，或光学生物传感器，诸如EPIC系统和EnSpire(分别可从Corning和Perkin Elmer购得)。

在本发明中，细胞外结合结构域可以识别ANTXR。识别ANTXR的细胞外结合结构域可以是特异性结合ANTXR的抗体、适体或配体，但不限于此。

在本发明中，配体可以是PA63配体或其片段。

PA63配体可由SEQ ID NO:1的氨基酸序列代表。

另外，所述片段可以是PA63配体的结构域4或包含所述结构域4的片段。

包含PA63配体的结构域4的片段可由SEQ ID NO:2的氨基酸序列代表。

在本发明中，D1是PA63配体的结构域1，D2是PA63配体的结构域2，D3是PA63配体的结构域3，D4是PA63配体的结构域4。D1+D4被定义为PA63配体的结构域1和结构域4的组合，D2+D4被定义为PA63配体的结构域2和结构域4的组合，D3+D4被定义为PA63配体的结构域3和结构域4的组合，D4+D4被定义为PA63配体的结构域4和结构域4的组合，D1+D2+D4被定义为PA63配体的结构域1、结构域2和结构域4的组合，D2+D3+D4被定义为PA63配体的结构域2、结构域3和结构域4的组合，D1+D3+D4被定义为PA63配体的结构域1、结构域3和结构域4的组合，D4+D4+D1被定义为PA63配体的结构域4、结构域4和结构域1的组合，D4+D4+D2被定义为PA63配体的结构域4、结构域4和结构域2的组合，D4+D4+D3被定义为PA63配体的结构域4、结构域4和结构域3的组合，D4+D4+D1+D2被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域1和结构域2的组合，D4+D4+D1+D3被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域1和结构域3的组合，D4+D4+D2+D3被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域2和结构域3的组合，D4+D4+D4被定义为PA63配体的结构域4、结构域4和结构域4的组合，D4+D4+D4+D1被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域4和结构域1的组合，D4+D4+D4+D2被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域4和结构域2的组合，D4+D4+D4+D3被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域4和结构域3的组合，D4+D4+D4+D4被定义为PA63配体的结构域4、结构域4、结构域4和结构域4的组合。

包含PA63配体的结构域4的片段可选自D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4、D1+D3+D4、D4+D4+D1、D4+D4+D2、D4+D4+D3、D4+D4+D1+D2、D4+D4+D1+D3、D4+D4+D2+D3、D4+D4+D4、D4+D4+D4+D1、D4+D4+D4+D2、D4+D4+D4+D3和D4+D4+D4+D4。

包含PA63配体的结构域4的片段可选自SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在本发明的实施方案中，引入D4的CAR-T细胞或引入D4+D4的CAR-T细胞具有比包含PA63配体的CAR-T细胞更好的细胞毒性作用。

如本文中所用，术语“PA63”是指保护性抗原(PA，83kDa)的截短的63kDa部分，所述保护性抗原是炭疽毒素蛋白。炭疽毒素是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)分泌的，炭疽杆菌是革兰阳性菌。

一般来说，已知炭疽的致病性由毒素产生能力和荚膜形成决定。影响炭疽毒素产生能力的蛋白质包括保护性抗原(PA)、水肿因子(EF)和致死因子(LF)。这些都没有单独表现出毒性，但保护性抗原和水肿因子结合在一起形成水肿毒素(EdTx)，保护性抗原和致死因子结合在一起形成致死毒素(LeTx)。

PA与传染性细胞系诸如巨噬细胞表面上的受体蛋白(炭疽毒素受体)结合，然后被弗林蛋白酶家族蛋白酶切割成PA20(20kDa)和PA63(63kDa)。众所周知，其中，PA63变成为七聚体，与LF或EF结合，并作为毒素输送通道，将其输送到细胞中。

这种复合物通过内吞机制进入细胞。当内体的pH值降低时，PA63七聚体在结构上发生变化，内体膜上形成孔。结果，LF或EF被释放到细胞质中，从而变得有毒(JiangJ.Atomic structure of anthrax protective antigen pore elucidates toxintranslocation.Nature.2015)。

在本发明的实施方案中，构建了引入编码D4的核酸的CAR和引入编码D4+D4的核酸的CAR，并确定了通过将CAR引入T细胞而产生的CAR-T细胞是否表现出治疗胰腺癌的功效。引入了编码D4或D4+D4的核酸的CAR-T细胞具有比引入了编码PA63配体的核酸的CAR-T细胞更好的治疗胰腺癌的功效。

因此，对于本领域技术人员来说显而易见的是，通过引入编码D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4、D1+D3+D4、D4+D4+D1、D4+D4+D2、D4+D4+D3、D4+D4+D1+D2、D4+D4+D1+D3、D4+D4+D2+D3、D4+D4+D4、D4+D4+D4+D1、D4+D4+D4+D2、D4+D4+D4+D3或D4+D4+D4+D4的核酸构建CAR的所有情况均可表现出与其相同或相似的效果。

在本发明中，ANTXR可以是ARTXR1(炭疽毒素受体1)或ARTXR2(炭疽毒素受体2)。

如本文中所用，术语“ANTXR1(炭疽毒素受体1)”是指细胞外基质蛋白，也称为“TEM8(肿瘤内皮标志物8)”。其特异性核酸序列可从NCBI(NCBI参考序列:NM_032208.2)看到。

如本文中所用，术语“ANTXR2(炭疽毒素受体2)”意指参与血管生成的蛋白质，也称为“CMG2(毛细血管形态发生基因2)”。其特异性核酸序列可从NCBI(NCBI参考序列:NM_058172.5)看到。

另外，在本发明中，ANTXR1和ANTXR2与PA63配体的亲和力为170至780Pm的Kd，这远高于用于ROR1、EGFR和Her2/neu的抗体的亲和力(1nM的Kd)，所述抗体是先前开发的CAR-T细胞疗法(Karl A.(2010)Nature precedings 5221:1；Heather M.S.(2005)Curr.Opin.Microbiol.8:106-112)。

如本文中所用，术语“跨膜结构域”是指CAR的一部分，所述部分将细胞外结合结构域与细胞内信号传导结构域融合并将CAR固定到免疫效应细胞的质膜上。跨膜结构域可源自天然、合成、半合成或重组来源。在本发明中，跨膜结构域选自下组，包括T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154，但不限于此。

另外，跨膜结构域可通过接头附接至细胞外结合结构域。例如，接头可以是长度为2至10个氨基酸的短寡肽接头或多肽接头，并且优选是甘氨酸(G)-丝氨酸(S)双联体，但不限于此。在本发明中，CAR可包含G4S1(GGGGS)(由SEQ ID NO:10的氨基酸序列表示)作为接头。

CAR的结合结构域之后通常是至少一个“铰链结构域”。如本文中所用，术语“铰链结构域”是指CAR的一部分，所述部分与效应细胞表面间隔开，并在抗原结合结构域的定位中起关键作用，以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化。CAR通常在细胞外结合结构域与跨膜结构域之间包含至少一个铰链结构域。铰链结构域可源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或经修饰的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。术语“经修饰的铰链区”是指(a)天然存在的铰链区，其中至多30％的氨基酸被修饰(例如，至多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸被取代或删除)，(b)天然存在的铰链区的一部分，其具有至少10个氨基酸(例如，至少12个、13个、14个或15个氨基酸)的长度，其中至多30％的氨基酸被修饰(例如，至多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸被取代或删除)，或(c)天然存在的铰链区的一部分，包括核心铰链区(长度为4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，或至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸)。在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的至少一个半胱氨酸残基可以被至少一种其它类型的氨基酸残基(例如，至少一个丝氨酸残基)取代。经修饰的免疫球蛋白铰链区可以可选地或另外地具有被另一个氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。铰链结构域可包括源自1型膜蛋白(诸如CD8α、CD4、CD28和CD7)的细胞外区域的铰链区，并且可以是来自这些分子的野生型铰链区或来自其中的经修饰的铰链区。

在本发明中，由接头结合的跨膜结构域可由SEQ ID NO:11的核酸序列(源自CD8α)编码，但不限于此。

在本发明中，包含铰链结构域的跨膜结构域可由SEQ ID NO:15的核酸序列(源自CD8α)编码，但不限于此。

如本文中所用，术语“细胞内信号传导结构域”是指CAR的一部分，所述部分参与效应细胞功能，诸如活化，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，或者将CAR结合靶抗原的信息有效递送至免疫效应细胞中，以诱导由抗原结合CAR的细胞外结合结构域引起的其它细胞反应。效应子功能是指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性，可以是包括细胞因子分泌的活性，或者可以促进这种活性。因此，细胞内信号传导结构域意指传递效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质的一部分。

已知仅由T细胞受体生成的信号不能充分活化T细胞，因此进一步需要共刺激信号。因此，T细胞活化由两个不同的细胞内信号传导结构域介导。例如，T细胞活化由初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域介导，所述初级信号传导结构域通过T细胞受体启动抗原依赖性初级活化，所述共刺激信号传导结构域以不依赖于抗原的方式作用以提供次级信号。因此，在本发明中，细胞内信号传导结构域可包括“初级信号传导结构域”和“共刺激信号传导结构域”。

如本文中所用，术语“初级信号传导结构域”是指以刺激或抑制方式调节T细胞受体复合物的初步活化的信号传导结构域。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可包含被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级信号传导结构域的ITAM可选自下组，包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，但不限于此。

在本发明中，初级信号传导结构域可以是CD3ζ，由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的核酸序列编码，但不限于此。

如本文中所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除Fc受体外的细胞表面分子，其在结合抗原受体或抗原时提供T淋巴细胞的高效活化和功能所需的次级信号。在本发明中，共刺激信号传导结构域选自OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)，但不限于此。

在本发明中，共刺激信号传导结构域可以是由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17的核酸序列编码的CD28和由SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核酸序列编码的CD137，但不限于此。

在设计根据本发明的CAR时，编码信号肽的核酸可以插入在PA63配体或其片段的前面。信号肽可以是GM-CSF、CD8α信号肽等，但GM-CSF最常用于CAR工程，并且GM-CSF在本发明的实施方案中用作信号肽。

另一方面，本发明涉及包含编码嵌合抗原受体的核酸的载体。

如本文中所用，术语“载体”是指能够转移或运输另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，并且例如被插入到载体核酸分子中。载体可包括指导细胞中自主复制的序列，或者可以包括足以实现整合到宿主细胞DNA中的序列。载体可选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体，但不限于此。载体优选为pMSCV载体，其为逆转录病毒载体，但不限于此。

另一方面，本发明涉及包含载体的重组细胞。

如本文中所用，术语“重组细胞”是指经遗传修饰以表达本发明的CAR用于治疗癌症等的细胞。术语“遗传修饰的”是指以DNA或RNA的形式将外源遗传物质添加到细胞的总遗传物质中。

在本发明中，细胞可以是T细胞或NK细胞。因此，包含含有编码根据本发明的CAR的核酸的载体的重组细胞是CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞)或CAR-NK细胞(嵌合抗原受体天然杀伤细胞)。

在本发明中，T细胞选自下组，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和从外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞。

优选地，该细胞可以是人CD8+T细胞，并且本发明实施例中使用的细胞可以是NYESO-1T细胞，但不限于此。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗实体癌的包含重组细胞的药物组合物。

另一方面，本发明涉及预防或治疗实体癌的方法，其包括向受试者施用重组细胞。

另一方面，本发明涉及重组细胞用于预防或治疗实体癌的用途。

另一方面，本发明涉及重组细胞用于制备用于预防或治疗实体癌的治疗剂中的用途。

如本文中所用，术语“预防”是指通过施用本发明的组合物抑制或延迟实体癌进展的任何作用，术语“治疗”是指抑制实体癌的发作或减轻或消除实体癌的症状。

在本发明的一个实施方案中，发现了CAR-T细胞对胰腺癌细胞的抗癌细胞毒性，但本发明不限于此。

对于本领域技术人员显而易见的是，根据PA63的细胞毒性作用机制，根据本发明的PA63配体的结构域4或包含结构域4的片段不仅可以特异性结合胰腺癌细胞或组织，而且还可以特异性结合表达ANTXR的其它癌细胞或组织，并且包含根据本发明的PA63配体的结构域4或包含结构域4的片段的含CAR细胞对表达ANTXR的癌症具有细胞毒性作用。

在本发明的一个实施方案中，证实了包含具有PA63配体的结构域4的片段的CAR-T细胞的细胞毒性作用优于包含PA63配体的CAR-T细胞的所述作用。

如本文中所用，术语“实体癌”是指由血管或结缔组织组成并因此具有预定硬度和形状的肿瘤，并且是例如胰腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌等，但不限于此。

在本发明中，实体癌可以是表达ANTXR(炭疽毒素受体)的胰腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌，但不限于此，ANTXR包括ANTXR1或ANTXR2。

如本文中所用，术语“胰腺癌”是指由胰腺中形成的癌细胞组成的肿瘤。一般来说，起源于胰管细胞的胰腺导管癌约占胰腺癌的90％。超过85％的胰管细胞在K-ras基因中具有点突变，所述K-ras基因在胰腺癌发生时被激活(Li等人(2004)Lancet 363:1049-1057；Xiong(2004)Cancer Chem Pharm 54:S69-77)。对于胰腺癌的早期治疗，需要了解胰腺的癌前病变和癌症的进展，并根据癌症的分期或大小来判断预后。已知的代表性胰腺癌前病变包括胰腺上皮内瘤形成(PanIN)、导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillarymucinous neoplasm)(IPMN)、黏液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm)(MCN)等(Hruban RH,(2001)Am.J.Surg.Pathol.25:579-586；Ottenhof NA,(2009)Arch.Pathol.Lab.Med.133:375-381；Sipos B.,(2009)Pancreatology 9:45-54)。特别地，由于各种医学诊断成像系统分辨率的提高和健康检查频率的增加，最近发现IPMN的频率越来越高。IPMN引起了极大的兴趣，因为其是胰腺癌的祖细胞病变(progenitor lesion)，其中良性肿瘤可能逐渐发展为恶性肿瘤，并且伴随这种病变的胰腺癌的频率很高，甚至出现在远离病变的区域。

用于预防或治疗实体癌的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。

如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”是指不损害所施用的化合物的生物活性或性质且不刺激生物体的载体或稀释剂。配制成液体溶液的组合物的药学上可接受的载体是无菌的和生物相容的，其实例包括盐水、无菌水、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油及其一种或多种的混合物。如有必要，可加入其它普通添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，通过进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，该组合物可以被配制成可注射溶液，诸如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

根据本发明的药物组合物可以是各种口服或肠胃外制剂中的任一种。在这方面，药物组合物可以使用普通稀释剂或赋形剂(诸如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来配制。口服施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。这种固体制剂通过将至少一种化合物与至少一种赋形剂(诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)混合来制备。除了简单的赋形剂之外，还可使用润滑剂诸如硬脂酸镁或滑石。口服施用的液体制剂可以包括悬浮液、口服液、乳液、糖浆等。除了诸如水或液体石蜡等简单的稀释剂之外，还可将各种赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂掺入液体制剂中。另外，肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干剂、栓剂等。有用的非水溶剂和悬浮溶剂包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的酯(诸如油酸乙酯)。栓剂的基本成分包括Witepsol、聚乙二醇(macrogol)、Tween 61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。

合适的药学上可接受的载体和制剂在Remington's Pharmaceutical Science(第19版，1995)中进行详细描述。

本发明的组合物可以口服或肠胃外施用，肠胃外施用可以是静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用等。口服施用后，蛋白质或肽被消化。因此，口服组合物可包被有活性药物，或者可被配制成防止活性药物在胃中降解。另外，可使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置来施用该组合物。

用于预防或治疗实体癌的药物组合物的合适剂量可以根据诸如配制方法、施用方法以及患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应性等因素而变化。熟练的医生可以很容易地确定和开出对所需治疗或预防有效的剂量。

本发明的组合物可以作为单一治疗剂施用或与另一种治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂顺序或同时施用。

在下文中，将参考实施例来更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，显然这些实施例仅仅是为了说明本发明而提供的，并且不应该被解释为限制本发明的范围。

实施例1:对实体癌特异的基因的鉴定

为了鉴定对实体癌特异的基因，使用与胰腺癌相关的组织作为实体癌。制备从总共104名胰腺癌患者(包括3名1期胰腺癌患者、89名3期胰腺癌患者和12名4期胰腺癌患者)中分离的胰腺癌组织。然后，使用微阵列分析癌症组织、IPMN组织和正常胰腺组织中的基因变化，并选择6种显示在胰腺癌组织中表达增加的基因(表1)。

[表1]

从六个初步选择的基因中进一步选择满足以下所有三个要求的基因。

1)mRNA表达水平满足“正常组织<IPMN组织<胰腺癌(PDAC)组织”的基因

2)表达的蛋白质存在于细胞表面上的基因

3)在正常组织中几乎不表达的基因

图1显示正常组织中6个初步选择的基因的蛋白质表达水平，其中A显示ANTXR1(炭疽毒素受体1)的蛋白质表达水平，B显示ANTXR2(炭疽毒素受体2)的蛋白质表达水平，C显示TMC5(跨膜通道样5)的蛋白质表达水平，D显示CLDN18(紧密连接蛋白-18)的蛋白质表达水平，E显示MUC13(黏蛋白13)的蛋白质表达水平，F显示MMP14(基质金属蛋白酶14)的蛋白质表达水平。

所有六个初步选择的基因都在细胞表面表达，并满足上述要求1)和2)。然而，从图1中可以看出，除去ANTXR1和ANTXR2之外，还有四个基因也在正常组织中表达，因此ANTXR1和ANTXR2是唯一满足所有三个要求的基因(图1)。

为了进一步检测ANTXR1和ANTXR2的实际表达，使用外周血单核细胞(PBMC)、原发性胰腺癌组织和胰腺癌细胞系进行实时RT-PCR(RT-PCR)。PBMC被用作阴性对照，PANC-1被用作阳性对照。具体而言，使用Trizol/氯仿提取总RNA。在mRNA扩增后，使用逆转录酶产生cDNA。加入表2的引物，用实时RT-PCR检测ANTXR1和ANTXR2的mRNA表达量。使用StepONEplus实时PCR系统(Applied Biosystems)和iTaq通用SYBR Green Supermix(Bio-rad)进行分析。cDNA的浓度为0.5μg/μl，以10pM的浓度使用每种引物。在40个循环中，分别在95℃变性15分钟和在60℃退火/延伸60秒。

[表2]

结果显示，在原发性胰腺癌组织中，ANTXR1和ANTXR2 mRNA的表达显著增加(图2)。另外，对HUVEC细胞(正常细胞)、MDA-MB 231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、Capan2、PANC1、Mia-PaCa2、SNU-213、SNU-324、SNU-2466、SNU-2469、SNU-2485、SNU-2543)的分析结果显示，ANTXR1和ANTXR2 mRNA在胰腺癌细胞系中的表达增加。特别是，在SNU-2466和SNU-2469中，ANTXR1 mRNA表达显著增加，并且在AsPC1中，ANTXR2 mRNA表达显著增加(图3)。

另外，使用流式细胞术分析正常细胞(HUVEC细胞)、MDA-MB-231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、PANC1、SNU-213、SNU-2466)的细胞表面上ANTXR1和ANTXR2蛋白的表达水平的结果显示ANTXR1和ANTXR2蛋白的表达增加(图4)。

另外，在用在作为ANTXR1和ANTXR2的配体的PA63中显示荧光的与FITC缀合的试剂处理后，使用流式细胞术在发现ANTXR1和ANTXR2 mRNA表达显著增加的正常细胞(HUVEC细胞)、MDA-MB 231细胞和胰腺癌细胞系(AsPC1、Capan2、PANC1、Mia-PaCa2、SNU-213、SNU-324、SNU-2466、SNU-2469、SNU-2485和SNU-2543)中再次间接检测到细胞表面蛋白ANTXR1和ANTXR2的表达水平，并且PA63与ANTXR1和ANTXR2的结合也被检测到(图5)。

实施例2：ANTXR特异性CAR的设计和构建

针对ANTXR1或ANTXR2的CAR被设计成包括细胞外结合结构域、源自CD8α的跨膜结构域、G4S1(GGGGS)接头或铰链区、CD3ζ链的初级信号传导结构域以及作为共刺激信号传导结构域的CD28和CD137。

设计了以PA63配体作为细胞胞外结合结构域的CAR，产生如图6A所示的载体。

另外，与D4、D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4或D1+D3+D4一起引入的CAR被设计成包括对于作为细胞外结合结构域的PA63配体的受体结合是必需的D4，然后将其在图6B所示的载体的PA63位点处引入以产生载体。另外，CAR被设计成包含编码在D4、D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4或D1+D3+D4前面的信号肽的核酸。

信号肽具有短的氨基酸序列，并在将合成的蛋白质转运到ER中起关键作用。当蛋白质到达ER时，信号肽被去除，蛋白质通过载体转运到高尔基复合体。然后，要在细胞膜上而不是细胞内细胞器上表达的蛋白质必须被运送到目的地。在这个实例中，GM-CSF被用作将合成的蛋白质转运到目的地的信号肽。

将编码copGFP的核酸引入图6B的载体来检测CAR的表达，但当实际使用CAR作为治疗剂时，这可以省略。

表3显示了产生包含PA63配体的CAR所需的序列，表4显示了产生包含PA63配体的片段的CAR所需的序列。

[表3]

[表4]

编码PA63配体的结构域1至结构域4的核酸如下表5所示。

[表5]

通过PCR扩增CAR的信号肽、细胞外结合结构域(D4、D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4或D1+D3+D4)、跨膜结构域(CD8跨膜及铰链)和细胞内信号传导结构域(CD3、CD134、CD28)，并使用DNA连接酶将其插入TA克隆载体。

将TA克隆载体连接并插入病毒载体(pMSCV，pCDH 521a)以表达融合蛋白。使用用于引入CAR的慢病毒载体生产病毒，并且在293FT细胞(5X10⁶)中以约90％或更高的效率诱导该慢病毒载体，所述293FT细胞是包装细胞。在诱导慢病毒载体的第四天，产生慢病毒，回收悬浮细胞培养基并使用超离心机以20,000rpm浓缩2小时，将浓缩的慢病毒转导到293FT细胞中，并使用流式细胞仪测定浓度。结果表明，以3.4X 10⁹IU/ml的高产率获得了引入了CAR基因的慢病毒。

实施例3：CAR-T细胞的培养

将用实施例2中产生的PA63配体、D4、D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4或D1+D3+D4引入的含有CAR的慢病毒以100MOI的浓度转导至从CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分离的细胞毒性T细胞克隆中，以产生CAR-T细胞。

使用流式细胞术发现以约47.9％的效率诱导表达，并且使用Aria分选仪仅选择其中诱导CAR表达的细胞。起先体外扩增这些细胞的快速扩增方案(REP)以增加CAR细胞的数量，并且观察到纯CAR-T在REP的第10天增殖至约98％的分布(图7)。

本实施例中使用的CTL是NYESO-1CTL(MD Anderson Cancer Center(USA))。图8显示了常规NYESO-1CTL和CAR-T细胞，前者识别NYESO-1抗原并表现出活性，后者能够通过将CAR引入NYESO-1CTL同时靶向NYESO-1和ANTXR1或ANTXR2。图左侧被NYESO-1CTL靶向的癌细胞类型包括恶性黑色素瘤和滑膜细胞肉瘤。NYESO-1CTL能够抑制肿瘤进展或诱导肿瘤缩小。

另外，利用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或分离自外周血单核细胞(PBMC)的T细胞诱导CAR后，可产生CAR-T细胞。

实施例4：CAR-T细胞的抗癌细胞毒性的证实

实施例4-1：对胰腺癌细胞系的细胞毒性的确认

为了证实在实施例3中产生的引入了含D4的CAR的T细胞对胰腺癌细胞系(PANC-1和AsPC1)的抗癌细胞毒性，用引入了含D4的CAR的T细胞处理每个胰腺癌细胞系。

将胰腺癌细胞系以1x10⁵个细胞/孔接种到96孔板(圆底)中，用1x10⁵个细胞/孔的未引入CAR、含D4的CAR-T和含D4+D4的CAR-T的每种T细胞培养6小时，然后用高尔基体停止处理以抑制细胞因子的释放。6小时后，进行固定和透化以进行细胞内染色，并使用CD107a和IFNγ抗体对细胞进行染色。然后，使用流式细胞术鉴定能够间接检测颗粒释放的CD107a和能够检测CAR-T细胞活性的IFNγ。

结果表明，未引入CAR的T细胞不显示针对胰腺癌细胞系的抗癌细胞毒性或活性，但CAR-T细胞表现出针对胰腺癌细胞系的抗癌细胞毒性和活性(图9)。在图9中，“仅T细胞”(阴性对照)为未引入CAR的T细胞，PMA/IONO(阳性对照)用PMA/离子霉素处理，所述PMA/离子霉素具有将细胞外离子(Ca²⁺等)引入细胞的功能，并且当用其处理T细胞时，可以诱导细胞的过度活性。其可用作确定T细胞活性程度的指标。

因此，可以检测含有PA63配体的CAR-T细胞作为治疗胰腺癌的治疗剂的有效性。

实施例4-2：对黑色素瘤细胞系和胰腺癌细胞系的抗癌细胞毒性

为了证实在实施例3中产生的引入了含D4的CAR的T细胞和引入了含D4+D4的CAR的T细胞的抗癌细胞毒性，分别用这些细胞处理胰腺癌细胞系和黑色素瘤细胞系。

将胰腺癌细胞系和黑色素瘤细胞系分别以1x10⁵个细胞/孔接种到96孔板(圆底)中，与1×10⁵个细胞/孔的野生型细胞(未用CAR引入的T细胞)、空载体对照(表达不包含D4或D4+D4的载体的T细胞)、含D4的CAR-T和含D4+D4的CAR-T一起培养6小时，然后用高尔基体停止处理以抑制细胞因子的释放。6小时后，进行固定和透化以进行细胞内染色，然后使用CD107a和IFNγ抗体对细胞进行染色。然后，使用流式细胞术鉴定能够间接检测颗粒释放的CD107a和能够检测CAR-T细胞活性的IFNγ。未引入CAR的NYESO-1CTL用作对照。

NYESO-1CTL靶向黑色素瘤细胞系(526-mel)，因此表现出针对黑色素瘤细胞系的抗癌细胞毒性和活性，而无论本发明CAR是否存在(图10)。

对胰腺癌细胞系(AsPC1、PANC-1、Mia-PaCa2)的抗癌细胞毒性的检测结果表明，野生型和空载体对照T细胞未表现出针对胰腺癌细胞系的抗癌细胞毒性或活性，但引入了含D4的CAR的T细胞和引入了含D4+D4的CAR的T细胞表现出针对胰腺癌细胞系的抗癌细胞毒性和活性(图10)。

另外，将引入了实施例2中产生的含D4、D1+D4、D2+D4、D3+D4或D1+D2+D3+D4的CAR的慢病毒以100的MOI的浓度转导至NYESO-1T细胞克隆中，以产生每种慢病毒的CAR-T细胞。

通过离心将1×10⁶个细胞的PANC-1(胰腺癌细胞系)收集在1.5mL的管中，用50μLFBS释放所述细胞，将其与50μL Cr⁵¹混合，然后在37℃的培养箱中染色1小时。

然后，将Cr⁵¹染色的PANC-1细胞系以1x10⁵个细胞/孔接种在96孔板(圆底)中，然后以效应细胞(CAR-T):靶细胞(PANC-1)＝5(5x10⁵):1、10(1x10⁶):1、20(2x10⁶):1或40(4x10⁶):1的比例与载体对照(表达不含D4或每个结构域的载体的T细胞)、含D4的CAR-T和含D1+D4、D2+D4、D3+D4或D1+D2+D3+D4的CAR-T一起培养4小时，然后收集每个孔中的培养基，并使用γ计数器检测Cr⁵¹的释放。结果表明，除含D1+D4的CAR-T外，所有CAR-T均表现出优异的细胞毒性，其中仅含D4的CAR-T表现出最强的细胞毒性作用(图11)。

实施例5：用分离自PBMC的T细胞产生的CAR-T细胞对胰腺癌和乳腺癌的抗癌细胞毒性的检测

将引入了实施例2中生产的含D4的CAR的慢病毒转导至从三个健康供体分离的PBMC中以产生CAR-T细胞。为了检测引入了含D4的CAR的T细胞的抗癌细胞毒性，用CAR-T细胞处理黑色素瘤、胰腺癌和乳腺癌细胞系中的每一种。

将黑色素瘤、胰腺癌和乳腺癌细胞系以1x10⁵个细胞/孔接种在96孔板(圆底)中，然后用1x10⁵个细胞/孔的NT(未转导的)或CAR(含D4的CAR-T)培养24小时。在这种情况下，进行高尔基体终止治疗以抑制细胞因子的释放。24小时后，进行固定和透化以进行细胞内染色，然后使用IFNγ抗体对细胞进行染色。然后，使用流式细胞术分析用于检测CAR-T细胞活性的IFNγ。使用不表达ANTXR1和ANTXR2的黑色素瘤(526-mel)和乳腺癌细胞系(SK-BR3)作为对照。

不表达ANTXR1和ANTXR2的黑色素瘤(526-mel)和乳腺癌(SK-BR3)细胞系未被靶向，因此无论是否根据该实施例引入CAR，都未观察到针对526-mel和SK-BR3细胞系的抗癌活性(图12)。

同时，观察到针对据报道表达ANTXR1或ANTXR2的胰腺癌细胞系(PANC-1、Mia-PaCa2)和乳腺癌细胞系(MDA-231、ZR-571)的抗癌细胞毒性。结果表明，NT(非转导的)T细胞未表现出抗癌细胞毒性和活性，而引入了含D4的CAR的T细胞表现出针对胰腺癌和乳腺癌细胞系的抗癌细胞毒性和活性(图12)。因此，含有PA63配体的CAR-T细胞表现出针对表达ANTXR1或ANTXR2的癌细胞的优异毒性。因此，预期CAR-T细胞将在表达ANTXR1和ANTXR2的所有形式的癌症中表现出抗癌作用。

实施例6：用分离自PBMC的T细胞产生的CAR-T细胞针对胰腺癌的细胞毒性的检测

将通过引入RFP基因(以在胰腺癌细胞系PANC-1中显示荧光)产生的细胞系(表达红色荧光蛋白(RFP)的PANC-1细胞系；PANC-1_RFP)以1x10⁴个细胞/孔接种到24孔板的每个孔中，然后以效应细胞(CAR-T):靶细胞(PANC-1)＝5(5x10⁴):1、10(1x10⁵):1、20(2x10⁵):1或40(4x10⁵):1的比例与用来自健康供体的PBMC产生的NT(非转导的)T细胞或CAR(含D4的CAR-T)共培养48小时。收集保留在24孔板中的胰腺癌细胞系(PANC-1_RFP)，并使用流式细胞术计数RFP阳性细胞。

结果表明，针对胰腺癌细胞系(PANC-1_RFP)的细胞毒性在约50％(5:1)至约90％(40:1)被检测到(图13)。

实施例7：利用CAR-T细胞的动物模型

在以1x10⁷个细胞/100μL的量将胰腺癌细胞系(Mia-PaCa2)皮下注射到免疫缺陷型小鼠(Balb/c裸鼠，雌性，5周龄)中后25天，以1x10⁷个细胞/300μL的浓度静脉内注射PBS、用来自健康供体的PBMC产生的NT(非转导的)、仅GFP(空载体)和CAR(含D4的CAR-T)。细胞注射后约4周，与对照组(仅PBS、NT和GFP)相比，含D4的CAR-T表现出约80％的肿瘤体积减小。这表明CAR-T即使在使用表达ANTXR1或ANTXR2的实体癌的动物模型中也表现出优异的功效(图14)。

工业适用性

实体癌可以使用根据本发明的抗ANTXR嵌合抗原受体(CAR)-T细胞来治疗，并且实体癌的高效且安全的定制预防或治疗是可能的，同时通过向实体癌患者，特别是抗癌药物对其无效的胰腺癌患者施用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞，限制了药物施用。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域技术人员将会理解，提供该描述是为了阐述用于说明目的的优选实施方案，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

无序列文本

附上电子文件。

序列表

<110> MJ细胞生物股份有限公司

<120> 人抗ANTXR嵌合抗原受体及其用途

<130> 0165-PA-013CN

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PA63 配体

<400> 1

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile

1 5 10 15

Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys

20 25 30

Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly

35 40 45

Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp

50 55 60

Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His

85 90 95

Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr

100 105 110

Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr

115 120 125

Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala

130 135 140

Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser

145 150 155 160

Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu

165 170 175

Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg

180 185 190

Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr

195 200 205

Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu

210 215 220

Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro

225 230 235 240

Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala

245 250 255

Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe

260 265 270

Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val

275 280 285

Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly Arg Val Arg Val

290 295 300

Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr

305 310 315 320

Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg

325 330 335

Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro

340 345 350

Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu

355 360 365

Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp

370 375 380

Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala

385 390 395 400

Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu

405 410 415

Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp

420 425 430

Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala

435 440 445

His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile

450 455 460

Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu

465 470 475 480

Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu

485 490 495

Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys

500 505 510

Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys

515 520 525

Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser

530 535 540

Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe

545 550 555 560

Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

565

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D4

<400> 2

Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val

1 5 10 15

Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu

20 25 30

Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile

35 40 45

Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg

50 55 60

Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe

65 70 75 80

Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn

85 90 95

Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile

100 105 110

Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys

115 120 125

Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

130 135 140

<210> 3

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D1+D4

<400> 3

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile

1 5 10 15

Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys

20 25 30

Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly

35 40 45

Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp

50 55 60

Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Phe His Tyr Asp Arg

85 90 95

Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His

100 105 110

Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp

115 120 125

Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp

130 135 140

Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys

165 170 175

Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val

180 185 190

Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu

195 200 205

Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser

210 215 220

Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

225 230

<210> 4

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D2+D4

<400> 4

Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn

1 5 10 15

Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser

20 25 30

Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn

35 40 45

Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala

50 55 60

Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly

100 105 110

Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly

115 120 125

Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser

130 135 140

Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met

165 170 175

Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu

180 185 190

Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn

195 200 205

Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro

210 215 220

Gln Ile Gln Glu Thr Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly

225 230 235 240

Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser

245 250 255

Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile

260 265 270

Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu

275 280 285

Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln

290 295 300

Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro

305 310 315 320

Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr

325 330 335

Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr

340 345 350

Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile

355 360 365

Gly

<210> 5

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D3+D4

<400> 5

Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg

1 5 10 15

Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro

20 25 30

Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu

35 40 45

Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp

50 55 60

Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu

85 90 95

Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp

100 105 110

Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala

115 120 125

His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile

130 135 140

Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu

145 150 155 160

Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu

165 170 175

Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys

180 185 190

Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys

195 200 205

Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser

210 215 220

Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe

225 230 235 240

Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

245

<210> 6

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D4+D4

<400> 6

Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val

1 5 10 15

Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu

20 25 30

Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile

35 40 45

Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg

50 55 60

Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe

65 70 75 80

Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn

85 90 95

Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile

100 105 110

Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys

115 120 125

Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly Phe His Tyr Asp

130 135 140

Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala

145 150 155 160

His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile

165 170 175

Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu

180 185 190

Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu

195 200 205

Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys

210 215 220

Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys

225 230 235 240

Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser

245 250 255

Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe

260 265 270

Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

275 280

<210> 7

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D1+D2+D4

<400> 7

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile

1 5 10 15

Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys

20 25 30

Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly

35 40 45

Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp

50 55 60

Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His

85 90 95

Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr

100 105 110

Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr

115 120 125

Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala

130 135 140

Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser

145 150 155 160

Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu

165 170 175

Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg

180 185 190

Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr

195 200 205

Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu

210 215 220

Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro

225 230 235 240

Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala

245 250 255

Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe

260 265 270

Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val

275 280 285

Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly Arg Val Arg Val

290 295 300

Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr

305 310 315 320

Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val

325 330 335

Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu

340 345 350

Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile

355 360 365

Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg

370 375 380

Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe

385 390 395 400

Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn

405 410 415

Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile

420 425 430

Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys

435 440 445

Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

450 455 460

<210> 8

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D2+D3+D4

<400> 8

Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn

1 5 10 15

Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser

20 25 30

Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn

35 40 45

Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala

50 55 60

Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly

100 105 110

Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly

115 120 125

Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser

130 135 140

Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met

165 170 175

Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu

180 185 190

Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn

195 200 205

Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro

210 215 220

Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu

225 230 235 240

Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu

245 250 255

Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala

260 265 270

Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp

275 280 285

Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile

290 295 300

Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu

305 310 315 320

Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys

325 330 335

Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser

340 345 350

Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly

355 360 365

Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr

370 375 380

Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp

385 390 395 400

Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr

405 410 415

Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser

420 425 430

Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr

435 440 445

Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys

450 455 460

Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

465 470 475

<210> 9

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D1+D3+D4

<400> 9

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile

1 5 10 15

Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys

20 25 30

Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly

35 40 45

Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp

50 55 60

Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Thr Ala Arg Ile Ile

85 90 95

Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val

100 105 110

Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys

115 120 125

Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu

130 135 140

Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln

145 150 155 160

Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr

165 170 175

Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn

180 185 190

Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala

195 200 205

Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile

210 215 220

Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg

225 230 235 240

Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu

245 250 255

Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu

260 265 270

Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys

275 280 285

Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala

290 295 300

Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr

305 310 315 320

Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr

325 330 335

Glu Ile Gly

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 连接子

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 11

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 跨膜结构域

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcacc 198

<210> 12

<211> 341

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 初级信号传导结构域

<400> 12

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct a 341

<210> 13

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 共刺激信号传导结构域

<400> 13

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 14

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 共刺激信号传导结构域

<400> 14

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 15

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 跨膜结构域

<400> 15

ttcgtgcctg tgttcctgcc tgccaagcct accacaacac ccgctcctag acctccaaca 60

ccagctccaa caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc cagaagcttg tagacctgct 120

gctggcggag ccgtgcatac aagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 180

cctctggctg gaacatgtgg cgttctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaac 240

caccggaac 249

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 初级信号传导结构域

<400> 16

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 17

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 共刺激信号传导结构域

<400> 17

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 18

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 共刺激信号传导结构域

<400> 18

cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60

atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120

gaagaaggag gatgtgaact g 141

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 信号肽

<400> 19

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc t 51

<210> 20

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D1

<400> 20

agtacaagtg ctggacctac ggttccagac cgtgacaatg atggaatccc tgattcatta 60

gaggtagaag gatatacggt tgatgtcaaa aataaaagaa cttttctttc accatggatt 120

tctaatattc atgaaaagaa aggattaacc aaatataaat catctcctga aaaatggagc 180

acggcttctg atccgtacag tgatttcgaa aaggttacag gacggattga taagaatgta 240

tcaccagagg caagacaccc ccttgtg 267

<210> 21

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D2

<400> 21

gcagcttatc cgattgtaca tgtagatatg gagaatatta ttctctcaaa aaatgaggat 60

caatccacac agaatactga tagtcaaacg agaacaataa gtaaaaatac ttctacaagt 120

aggacacata ctagtgaagt acatggaaat gcagaagtgc atgcgtcgtt ctttgatatt 180

ggtgggagtg tatctgcagg atttagtaat tcgaattcaa gtacggtcgc aattgatcat 240

tcactatctc tagcagggga aagaacttgg gctgaaacaa tgggtttaaa taccgctgat 300

acagcaagat taaatgccaa tattagatat gtaaatactg ggacggctcc aatctacaac 360

gtgttaccaa cgacttcgtt agtgttagga aaaaatcaaa cactcgcgac aattaaagct 420

aaggaaaacc aattaagtca aatacttgca cctaataatt attatccttc taaaaacttg 480

gcgccaatcg cattaaatgc acaagacgat ttcagttcta ctccaattac aatgaattac 540

aatcaatttc ttgagttaga aaaaacgaaa caattaagat tagatacgga tcaagtatat 600

gggaatatag caacatacaa ttttgaaaat ggaagagtga gggtggatac aggctcgaac 660

tggagtgaag tgttaccgca aattcaagaa aca 693

<210> 22

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D3

<400> 22

actgcacgta tcatttttaa tggaaaagat ttaaatctgg tagaaaggcg gatagcggcg 60

gttaatccta gtgatccatt agaaacgact aaaccggata tgacattaaa agaagccctt 120

aaaatagcat ttggatttaa cgaaccgaat ggaaacttac aatatcaagg gaaagacata 180

accgaatttg attttaattt cgatcaacaa acatctcaaa atatcaagaa tcagttagcg 240

gaattaaacg taactaacat atatactgta ttagataaaa tcaaattaaa tgcaaaaatg 300

aatattttaa taagagataa acgt 324

<210> 23

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> D4

<400> 23

tttcattatg atagaaataa catagcagtt ggggctgatg agtcagtagt taaggaggct 60

catagagaag taattaattc gtcaacagag ggattattgt taaatattga taaggatata 120

agaaaaatat tatcaggtta tattgtagaa attgaagata ctgaagggct taaagaagtt 180

ataaatgaca gatatgatat gttgaatatt tctagtttac ggcaagatgg aaaaacattt 240

atagatttta aaaaatataa tgataaatta ccgttatata taagtaatcc caattataag 300

gtaaatgtat atgctgttac taaagaaaac actattatta atcctagtga gaatggggat 360

actagtacca acgggatcaa gaaaatttta atcttttcta aaaaaggcta tgagatagga 420

420

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 24

tgctgcacca ctggaatgaa atc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 25

ctcctcctgg cagaactttc tgg 23

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 26

ctttcattgt gttttcttct caagcaac 28

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 27

gttttcaagc ctcctgcttt ctgaat 26

Claims

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，

其中所述细胞外结合结构域识别炭疽毒素受体(ANTXR)。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中识别ANTXR的所述细胞外结合结构域是特异性结合ANTXR的抗体、适体或配体。

3.根据权利要求2所述的核酸，其中所述配体是PA63配体或其片段。

4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述PA63配体由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。

5.根据权利要求3所述的核酸，其中所述片段是所述PA63配体的结构域4或包含所述PA63配体的结构域4的片段。

6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述PA63配体的结构域4由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示。

7.根据权利要求5所述的核酸，其中包含所述PA63配体的结构域4的所述片段选自包含D1+D4、D2+D4、D3+D4、D4+D4、D1+D2+D4、D2+D3+D4、D1+D3+D4、D4+D4+D1、D4+D4+D2、D4+D4+D3、D4+D4+D1+D2、D4+D4+D1+D3、D4+D4+D2+D3、D4+D4+D4、D4+D4+D4+D1、D4+D4+D4+D2、D4+D4+D4+D3和D4+D4+D4+D4的组。

8.根据权利要求7所述的核酸，其中包含所述PA63配体结构域4的片段选自包含SEQ IDNO:2至SEQ ID NO:9的氨基酸序列的组。

9.根据权利要求1所述的核酸，其中所述ANTXR是ARTXR1(炭疽毒素受体1)或ARTXR2(炭疽毒素受体2)。

10.根据权利要求1所述的核酸，其中所述跨膜结构域选自下组，包括T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

11.根据权利要求1所述的核酸，其中所述细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。

12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述初级信号传导结构域选自下组，包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

13.根据权利要求11所述的核酸，其中所述共刺激信号传导结构域选自下组，包括OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。

14.一种载体，其包含编码根据权利要求1至13中任一项的嵌合抗原受体的核酸。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体选自包含DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体的组。

16.一种重组细胞，其包含根据权利要求14的载体。

17.根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。

18.根据权利要求17所述的重组细胞，其中所述T细胞选自包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和从外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞的组。

19.一种用于预防或治疗表达ANTXR(炭疽毒素受体)的实体癌的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求16的重组细胞。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述实体癌选自下组，包括胰腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。