CN116615445A

CN116615445A - Prame特异性t细胞受体及其用途

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Publication number: CN116615445A
Application number: CN202180078646.XA
Authority: CN
Inventors: 卡里娜·韦纳; 朱利亚·隆吉诺蒂
Original assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Current assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2023-08-18
Also published as: WO2022063966A1; AU2021348239A9; MX2023003372A; KR20230111187A; US20230340065A1; IL301543A; EP4217380A1; CA3193353A1; AU2021348239A1; JP2023542230A; BR112023005318A2

Abstract

本发明涉及能够与包含氨基酸序列LYVDSLFFL的多肽或其部分或其HLA‑A结合形式结合的T细胞受体(TCR)。本发明还涉及编码所述TCR的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。本发明还涉及用于获得所述TCR的方法以及包含所述TCR、所述核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物和诊断组合物。本发明还涉及用于诊断、检测、预防和/或治疗癌症的此类药物和诊断组合物。此外，本发明涉及所述TCR、核酸分子或所述载体用于产生修饰的淋巴细胞的用途。

Description

PRAME特异性T细胞受体及其用途

本发明涉及能够与包含氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的多肽或其部分或其HLA-A结合形式结合的T细胞受体(TCR)。本发明还涉及编码所述TCR的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。本发明还涉及用于获得所述TCR的方法以及包含所述TCR、所述核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物和诊断组合物。本发明还涉及用于诊断、检测、预防和/或治疗癌症的此类药物和诊断组合物。此外，本发明涉及所述TCR、核酸分子或所述载体用于产生修饰的淋巴细胞的用途。

T淋巴细胞(或T细胞)构成了细胞介导的免疫系统的一部分，在根除病原体中起主要作用。T细胞在胸腺中发育并在其表面表达T细胞受体分子，这些分子允许识别有核细胞上表达的主要组织相容性复合体(MHC)分子上呈递的肽(抗原呈递)。病原体的抗原，即由MHC分子呈递的外来抗原，会引起强大的T细胞应答，而自身抗原通常不会导致T细胞应答，因为在此类T细胞的发育过程中胸腺中自身抗原特异性T细胞的负选择。因此，免疫系统可以区分呈递外来抗原或自身抗原的有核细胞，并通过有效的细胞因子释放和T细胞的细胞毒性机制特异性靶向并根除受感染的细胞。

免疫系统的力量已被认为是未来癌症治疗的有前途的工具。在过去的十年中，研究已经开始通过使用过继细胞转移(ACT)来利用T细胞的独特特性，ACT涉及离体扩增的供体来源淋巴细胞的施用。ACT是治疗癌症的一个有吸引力的概念，因为它不需要患者的免疫能力，并且转移的淋巴细胞的特异性可以靶向未突变且因此免疫原性差的肿瘤抗原，这些抗原通常无法有效触发自体T细胞应答。尽管ACT已被证明是一种用于治疗各种类型癌症的有前途方法，但由于需要对每位患者的肿瘤特异性T细胞进行定制分离和表征，因此阻碍了其作为临床治疗的广泛应用——这个过程既困难又耗时，还常常无法产生高亲和力的T细胞(Xue等人,Clin Exp Immunol.2005February；139(2):167-172；Schmitt等人,Hum GeneTher.2009November；20(11):1240-1248)。

将肿瘤抗原特异性T细胞受体(TCR)遗传转移到原代T细胞中可以克服ACT的一些当前局限性，因为它允许快速产生具有明确抗原特异性的肿瘤反应性T淋巴细胞，即使在免疫功能低下的患者中也是如此。然而，鉴定携带特异性识别肿瘤抗原并在体内表现出期望抗肿瘤作用的TCR的合适T细胞克隆仍然是正在进行的研究课题。考虑到2012年全球有约1410万新发癌症病例，并且目前癌症占全世界所有人类死亡的约14.6％，因此迫切需要新颖有效的治疗方案。本发明的目的是满足上述需求。

PRAME是在多种肿瘤(优选黑色素瘤)中表达的肿瘤相关抗原。此外，PRAME已被描述为转移(例如葡萄膜黑色素瘤)的独立生物标志物(Fiedl等人,Clin Cancer Res2016March；22(5):1234-1242)和DLBCL的预后标志物(Mitsuhashi等人,Hematology 2014,1/2014)。其不在除睾丸外的正常组织中表达。这种表达模式类似于其它癌症睾丸(CT)抗原，例如MAGE、BAGE和GAGE。然而，与这些其它CT抗原不同，该基因也在急性白血病中表达。编码的蛋白质充当视黄酸受体的阻遏物，并可能通过该功能赋予癌症细胞生长优势。可变剪接导致多个转录本变体。还发现三阴性乳腺癌症中的PRAME过表达可通过诱导上皮向间质转化来促进癌症细胞运动(Al-Khadairi等人,Journal of Translational Medicine2019；17:9)。PRAME缺失已在慢性淋巴细胞白血病中被报道，然而，这在功能上并不相关，因为该基因不在B细胞中表达，并且缺失是生理性免疫球蛋白轻链重排的结果。

考虑到2012年全球有约1410万新发癌症病例，并且目前癌症占全世界所有人类死亡的约14.6％，因此迫切需要新颖有效的治疗方案。

因此，本发明的技术问题是符合上述目的。该技术问题已通过如本文所述、实施例中说明和权利要求中定义的手段和方法解决。

本发明涉及一种T细胞受体(TCR)，其能够与以下结合

包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或由其组成的多肽，其中不超过4个氨基酸被替换，或

所述多肽的部分，或

所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式，

其中所述TCR包含：

(A)CDR3，

(Aa)具有包含与SEQ ID NO:12至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)或优选100％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链，和/或

(Ab)具有包含与SEQ ID NO:14至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同或优选100％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链，

或

(B)CDR3，

(Ba)具有包含与SEQ ID NO:40至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)或优选100％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链，和/或

(Bb)具有包含与SEQ ID NO:42至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同或优选100％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链。

正如在本发明的上下文中令人惊奇地发现的，PRAME肽的部分，即包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2；PRAME_301-309)的氨基酸序列或由其组成且其中不超过4个氨基酸被替换的多肽，由细胞通过人白细胞抗原A类(HLA-A)呈递并被如本文所述和提供的TCR有效识别。包含本发明的TCR的细胞与所述多肽的结合导致显著的IFN-gamma(IFN-γ)分泌以及用本发明的TCR转导的T细胞对装载有此类多肽的细胞的有效杀伤。如本文进一步所述和提供的，包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2；PRAME_301-309)的氨基酸序列或由其组成且其中不超过4个氨基酸被替换的多肽在本文中也被称为“PRAME_L-L-肽”。

如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”包括所有语法形式的天然TCR以及TCR变体、片段和构建体。因此，该术语包括包含TCRα和β链的异二聚体以及多聚体和单链构建体；任选地包含另外的结构域和/或部分。

根据本发明，在其天然形式下，TCR作为T细胞表面上几个蛋白质的复合体存在。T细胞受体由两条(独立的)蛋白质链组成，它们由独立的T细胞受体alpha和beta(TCRα和TCRβ)基因产生，分别称为alpha(α-)和beta(β-)链。TCR的每条链都具有一个N末端免疫球蛋白样(Ig)可变(V)结构域/区域、一个Ig恒定样(C)结构域/区域、将链锚定在质膜中的跨膜/跨细胞膜区域和C末端的短细胞质尾部。

根据本发明，抗原特异性由α链和β链的可变区赋予。TCRα链和β链的可变结构域都包含三个高变或互补决定区(CDR1α/β、CDR2α/β和CDR3α/β)，其由框架(FR)区围绕。CDR3是抗原识别和特异性(即识别特定抗原并与之相互作用的能力)的主要决定区，而CDR1和CDR2主要与呈递抗原肽的MHC分子相互作用。

天然TCR识别与抗原呈递细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子结合(“在其上呈递/展示”)的抗原肽。在MHC分子上呈递的抗原肽在本文中也被称为“肽:MHC复合体”或“肽:HLA(-A)复合体”。有两种不同类别的MHC分子：MHC I和MHC II，它们呈递来自不同细胞区室的肽。MHC I类分子在整个人体所有有核细胞的表面上表达，并将肽或蛋白质片段从细胞内区室展示给细胞毒性T细胞。在人类中，MHC也被称为人白细胞抗原(HLA)。MHC I类有主要三种类型：HLA-A、HLA-B和HLA-C。一旦TCR与其特定的肽:MHC(例如，肽:HLA-A)复合体结合，T细胞就会被激活并发挥生物效应功能。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明描述和提供的TCR特异性结合它们的抗原靶标，即包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或由其组成且其中不超过4个氨基酸被替换的多肽(PRAME_L-L-肽)，或所述多肽的部分，或所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式。如本文所用的术语“特异性(地)结合”通常表示与随机的、无关的非靶标抗原相比，TCR通过其抗原结合位点更容易结合其预期的抗原靶标。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可替代地导致信号的启动，例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等。通常，在本文中和根据本发明，如本文所用的“特异性结合”是指由高于10^-5M或10^-6M的半数最大IFN-γ分泌(EC₅₀)确定的功能亲和力。优选地，在本发明的上下文中，当结合亲和力为约10^-11至10^-8M(EC₅₀)，优选约10^-11至10^-9M时，结合被认为是特异性的。

如本文所示，在本发明的上下文中描述和提供的TCR识别如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分，特别是当通过HLA-A分子(即以其各自的HLA-A结合形式)呈递在细胞上时。当抗原肽与HLA-A分子(其可以存在于抗原呈递细胞如树突细胞或肿瘤细胞的表面上，或者可以通过例如包被到珠或板上来固定)形成复合体时，称其以“HLA-A结合形式”存在。在本发明的上下文中，这样的HLA-A分子可以是任何(亚)等位基因类型并且特别地包括由等位基因HLA-A*24或HLA-A*02编码的HLA-A分子。因此，当通过HLA-A*24或HLA-A*02分子呈递在细胞上，即为其各自的HLA-A*24或HLA-A*02结合形式时，本文所述和提供的TCR特别结合如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分。在具体的实施方案中，HLA-A*24是HLA-A*24:02编码的分子，和/或HLA-A*02是HLA-A*02:17编码的分子。因此，当通过HLA-A*24:02或HLA-A*02:17分子呈递在细胞上，即为其各自的HLA-A*24:02或HLA-A*02:17结合形式时，本文所述和提供的TCR特别结合如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分。在优选的具体实施方案中，当通过HLA-A*24:02分子呈递在细胞上，即为其各自的HLA-A*24:02结合形式时，本文所述和提供的TCR特别结合如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分。

根据本发明，如本文在氨基酸序列上下文中使用的，术语“相似”意味着，与相应的SEQ ID NO的氨基酸序列相比，给定的氨基酸序列包含相同的氨基酸或仅保守或高度保守的替换。如本文所用，“保守”替换是指在下表I中列为“示例性替换”的替换。如本文所用，“高度保守”替换是指如下表I中“优选替换”标题下所示的替换。

表I氨基酸替换

原始	示例性替换	优选替换
			Ala(A)	val；leu；ile	Val
Arg(R)	lys；gln；asn	lys
			Asn(N)	gln；his；asp，lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q)	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gln	asp
Gly(G)	ala	ala
			His(H)	asn；gln；lys；arg	arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；	leu
			Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；	ile
Lys(K)	arg；gin；asn	arg
			Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
			Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
			Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	Phe
Val(V)	ile；1eu；met；phe；ala；	leu

如本文所用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认定义的氨基酸，例如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(GIn或Q)；谷氨酸(GIu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。一般而言，氨基酸可分为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷的侧链(例如Asp、GIu)；带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷的极性侧链(例如，Asn、Cys、Gin、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。

当根据本发明使用时，术语“位置”是指氨基酸在本文描述的氨基酸序列中的位置。本文中的术语“相应的”还包括位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量决定。

两个或更多个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)之间的同一性水平可以通过本领域已知的方法容易地确定，例如通过BLAST分析。一般而言，在本发明的上下文中，如果要通过例如序列比较进行比较的两个序列(例如，多核苷酸序列或氨基酸序列)的同一性不同，则术语“同一性”可以涉及较短序列以及较长序列的与所述较短序列相匹配的那部分。因此，当被比较的序列不具有相同长度时，同一性程度可优选指较短序列中与较长序列中核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比或较长序列中与较短序列中核苷酸序列相同的核苷酸的百分比。在这种情况下，本领域技术人员很容易确定较长序列的与较短序列匹配的那部分。此外，如本文所用，核酸序列或氨基酸序列的同一性水平可涉及相应序列的全长并且优选成对评估，其中每个空位计数为一个错配。这些用于序列比较的定义(例如，“同一性”值的建立)适用于本文描述和公开的所有序列。

此外，如本文所用的术语“同一性”意味着相应序列之间存在功能和/或结构等价性。与本文所述的特定核酸/氨基酸序列具有给定同一性水平的核酸/氨基酸序列可以代表这些序列的衍生物/变体，其优选地具有相同的生物学功能。它们可以是自然发生的变异，例如来自其它变种、物种等的序列，或者是突变，并且所述突变可以是自然形成的，或可以是故意诱变产生的。此外，变异可以是合成产生的序列。变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。

如本文所用，与序列(例如氨基酸或核酸序列)的“差异”可以包括例如缺失、替换、添加、插入和/或重组。术语“添加”是指向给定序列的末端或开始部分添加核酸残基/氨基酸，而“插入”是指在给定序列内插入核酸残基/氨基酸。术语“缺失”是指缺失或移除给定序列中的核酸残基或氨基酸残基。术语“替换”是指更换给定序列中的核酸残基/氨基酸残基。同样，除非另有说明，否则此处使用的这些定义经过必要的必要修改后适用于本文提供和描述的所有序列。

在本发明的一个实施方案中，在包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或由其组成且其中不超过4个氨基酸被替换且本发明的TCR与之(特异性)结合的多肽中，位置2Y和8F未被替换。在本发明的另一个实施方案中，位置6L仅具有保守取代或优选高度保守替换，或甚至更优选未被替换。在本发明的具体实施方案中，所述多肽(PRAME_L-L-肽)在位置2Y、6L和8F没有替换(相对于SEQ ID NO:2)。在本发明的更具体的实施方案中，所述多肽(PRAME_L-L-肽)在位置2Y、5S、6L、7F和8F没有替换(相对于SEQ ID NO:2)。

除非另有明确说明，否则术语“多肽”在本文中与术语“蛋白质”或“肽”等同地使用。蛋白质(包括其片段，优选生物活性片段，和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含一个或多个通过共价肽键彼此偶联的氨基酸(产生氨基酸链)。如本文所用的术语“多肽”描述了一组通常包含多于15个氨基酸的分子。多肽可以进一步形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。此类多聚体的相应高级结构因此称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。异多聚体的一个实例是抗体分子，其天然存在的形式由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等实现。这样的修饰在本领域中是众所周知的。

如本文所用，在多肽的上下文中，术语(给定多肽的)“部分”是指此类多肽的连续部分，其中此类多肽的N-末端和/或C-末端部分可被缺失。优选地，如本文所用，“部分”包含所述多肽的至少5个、更优选6至7个、最优选至少8个连续氨基酸。根据本发明，这样的“部分”优选是“功能部分”，即它仍然被如本文所述和提供的TCR通过(特异性)结合识别并且优选地诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的TCR与如本文所述和进一步具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分或其如本文所述和具体说明的HLA-A结合形式的结合诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌。在一个实施方案中，在本文中并根据本发明，包含本发明的TCR的此类细胞在与如本文所述和进一步具体说明的PRAME_L-L-肽(或其部分，或其如本文所述和具体说明的HLA-A结合形式)结合之后的IFN-γ分泌水平与不包含所述TCR的对照细胞相比或与包含结合无关肽(即不是如本文所述和进一步具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分的肽)的所述TCR的细胞相比为至少3倍高，优选至少5倍、10倍或20倍高。在本发明的上下文中，并且也如本文所描述和示例的，IFN-γ的测量可以通过本领域已知的任何合适的方法来进行，例如ELISA。例如，对于此类测定(例如，ELISA)，PRAME_L-L-肽(和作为对照的无关肽)的浓度可以为约10^-5M，并且包含TCR的细胞与靶标(PRAME_L-L-肽或其部分，单独或其如本文所述和具体说明的HLA-A结合形式)的比率可以为约1:2。包含如本文所述和提供的TCR的细胞可以已天然地或优选地通过转导、转染或任何其它合适的将核酸分子稳定插入细胞的方法接受了编码此类TCR的核酸分子。包含所述TCR的合适细胞是本领域已知的，并且还在本文中进一步描述和提供为“宿主细胞”。呈递如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽或其部分的合适的靶标细胞优选地是编码HLA-A分子的细胞，以能够通过HLA-A分子以其HLA-A结合形式呈递如本文所述和具体说明的所述PRAME_L-L-肽或其部分。在本文中并且根据本发明，如本文所述，HLA-A的具体实例包括HLA-A*24(例如，HLA-A*24:02)和HLA-A*02(例如，HLA-A*02:17)。

根据本发明，如本文所述和提供的TCR(例如天然TCR)优选以高功能亲和力结合其抗原靶标(即PRAME_L-L-肽或其部分，或优选其HLA-A结合形式，例如，由抗原呈递细胞呈递在HLA-A*24(例如，HLA-A*24:02)或HLA-A*02(例如，HLA-A*02:17)编码的分子上，优选由抗原呈递细胞呈递在HLA-A*24:02编码的分子上)。术语“功能亲和力”是指TCR表达细胞(特别是如本文所述的表达天然TCR的T细胞)在体外对给定浓度的配体有响应的能力，并且被认为与TCR表达细胞的体内效应能力相关。根据定义，具有高功能亲和力的TCR表达细胞在体外测试中对非常低的抗原剂量有响应，而具有较低功能亲和力的此类细胞在产生类似于高亲和力TCR表达细胞的免疫应答之前需要更高量的抗原。因此，功能亲和力可被视为TCR表达细胞激活阈值的定量决定因素。它是通过将此类细胞在体外暴露于不同量的同源抗原来确定的。具有高功能亲和力的TCR表达细胞对低抗原剂量有响应。

例如，如果TCR表达细胞在与装载有约10^-5至约10^-11M(即约0.05ng/mL至约5ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL或5ng/mL)的低浓度PRAME肽(具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PRAME肽的分子量)的表达抗原阴性HLA-A(例如HLA-A*24(例如HLA-A*24:02)或HLA-A*02(例如，HLA-A*02:17))的靶标细胞共培养之后分泌约200pg/mL或更多(例如200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5000pg/mL或更多、7000pg/mL或更多、10000pg/mL或更多、或20000pg/mL或更多)的干扰素γ(IFN-γ)，则所述TCR表达细胞通常被认为以“高”功能亲和力与其抗原靶标结合。因此，本发明的TCR是具有高功能亲和力的TCR，其导致小于10^-5M的半数最大相对IFN-γ分泌(EC50值)，如通过IFN-γ免疫测定所测量的。优选地，所引起的半数最大相对IFN-γ分泌(EC50值)小于10^-6M，如通过IFN-γ免疫测定所测量的(参见图4和实施例4)。

细胞因子释放，例如IFN-γ分泌，可以通过本领域已知以及本文以其它方式举例说明的任何方式测量，或者例如使用体外测定法，其中源自HLA-A*24:02或HLA-A*02:17供体的LCL分别用ivtRNA转染或转导以分别表达例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列或无关肽并且与表达待研究的TCR的富含CD8⁺和/或非富含CD8⁺的PBMC一起孵育，或在体外测定中使用外部装载有根据SEQ ID NO:2的PRAME肽或无关肽的T2细胞，并随后与表达待研究的TCR的富含CD8⁺和/或非富含CD8⁺的PBMC一起孵育。

在本发明的一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(A)的CDR3的TCR进一步包含相应的CDR1和/或CDR2亚区。在本发明的一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(A)的CDR3的TCR进一步包含

(Aa1)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链CDR2，和/或

(Ab1)包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链CDR2。

在本发明的另一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(B)的CDR3的TCR进一步包含相应的CDR1和/或CDR2亚区。在本发明的一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(B)的CDR3的TCR进一步包含

(Ba1)包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRα链CDR2，和/或

(Bb1)包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成的TCRβ链CDR2。

在本发明的一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(A)的CDR3的TCR包含

(Aa2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:16至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置47至51至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置69至75至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置109至123至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，

和/或

(Ab2)TCRβ链可变区，其

包含与SEQ ID NO:18至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置46至50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置68至73至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置110至122至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的另一个实施方案中，本文所述和提供的包含根据(B)的CDR3的TCR包含

(Ba2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:44至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置45至49至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置67至73至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置107至121至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，

和/或

(Bb2)TCRβ链可变区，

包含与SEQ ID NO:46至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置44至49至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置67至71至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置108至122至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的TCR还包含(i)TCRα链恒定区，和/或(ii)TCRβ链恒定区。在一个实施方案中，TCRα恒定区和/或TCRβ链恒定区可以是鼠的(murC)，例如分别为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26，最小鼠源化的(mmC)，例如分别为SEQID NO:29和SEQ ID NO:30，或人的(huC)，例如如本文所述，例如分别为SEQ ID NO:28和SEQID NO:29。在一个实施方案中，TCRα恒定区和/或TCRβ链恒定区可以包含一个或多个半胱氨酸残基，其更换例如丝氨酸或苏氨酸残基，使得TCRα恒定区可以与TCRβ链恒定区建立一个或多个半胱氨酸桥，反之亦然，如例如Boulter(2003),Protein Engineering16,9:707-711，特别是第708页的表I中描述的。在一个实施方案中，根据本发明，TCRα链恒定区可以包含与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，根据本发明，TCRβ链恒定区可以包含与SEQ ID NO:28至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的包含根据(A)的CDR3的TCR包含

(Aa3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置47至51至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置69至75至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置109至123至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，

和/或

(Ab3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:22至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置46至50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置68至73至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置110至122至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的另一个实施方案中，如本文所述和提供的包含根据(B)的CDR3的TCR包含(Ba3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:48至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置45至49至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置67至73至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置107至121至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，

和/或

(Bb3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置44至49至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置67至71至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置108至122至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同(优选相同)的氨基酸序列或由其组成。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的TCR包含

(A)至少一个TCRα链或其亚区，其根据如本文(Aa)下所述的CDR3α链、如本文(Aa1)下所述的CDR1/2α链、如(Aa2)下所述的TCR可变α链或如(Aa3)下所述的TCRα链，和至少一个TCRβ链或其亚区，其根据如本文(Ab)下所述的CDR3β链、如本文(Ab1)下所述的CDR1/2β链、如(Ab2)下所述的TCR可变β链或如(Ab3)下所述的TCRβ链，其彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体，或

(B)至少一个TCRα链或其亚区，其根据如本文(Ba)下所述的CDR3α链、如本文(Ba1)下所述的CDR1/2α链、如(Ba2)下所述的TCR可变α链或如(Ba3)下所述的TCRα链，和至少一个TCRβ链或其亚区，其根据如本文(Bb)下所述的CDR3β链、如本文(Bb1)下所述的CDR1/2β链、如(Bb2)下所述的TCR可变β链或如(Bb3)下所述的TCRβ链，其彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体。

根据本发明，如本文所述和提供的TCR可以是任何种类的TCR。在本发明的一个实施方案中，TCR可以选自由天然TCR、TCR变体、TCR片段和TCR构建体组成的组。在本发明的优选实施方案中，TCR是水溶性的。

根据本发明，所有TCR变体优选是本发明TCR的功能变体。如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本TCR、其可变区或其抗原结合区具有实质性或显著序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白质，并且具有其生物学活性，即与本发明的亲本TCR所针对具有抗原特异性的抗原靶标特异性结合的能力，其特异性结合程度与本文公开并在所附实施例中评估的TCR相似、相同或甚至更高。本发明还包括TCR序列变体。

如本文所用的术语“TCR变体”包括本文公开的TCR的“序列变体”，即基本上包含如上所述的本发明TCR(也称为“亲本”TCR)的氨基酸序列但与“亲本”TCR氨基酸序列相比包含至少一个氨基酸修饰(即替换、缺失或插入)的变体，前提是变体优选保留本发明“亲本”TCR的抗原特异性。本发明的TCR序列变体通常通过将适当的核苷酸变化引入编码“亲本”TCR的核酸中或通过肽合成来制备。通常，上述氨基酸修饰可以引入或存在于TCR的可变区或恒定区中，并且可以用于调节诸如结合强度和特异性、翻译后加工(例如糖基化)、热力学稳定性、溶解度、表面表达或TCR装配的特性。

如本文所用的术语“TCR”还包括TCR构建体。术语“构建体”包括包含本发明TCR的至少一个抗原结合结构域的蛋白质或多肽，但不一定具有天然TCR的基本结构(即并入形成异二聚体的TCRα链和TCRβ链中的可变结构域)。TCR构建体和片段通常通过基因工程的常规方法获得，并且通常被人工构建以包含额外的功能性蛋白质或多肽结构域。根据前述，设想本发明的TCR构建体和片段包含如本文别处所公开的至少一个CDR3α和/或至少一个CDR3β。本文进一步设想了包含至少一个CDR1α、CDR2α、CDR1β、CDR2β、α链可变区、β链可变区、α链和/或β链或其组合，任选地与如本文所示例的其它蛋白质结构域或部分组合的构建体和片段。设想本文提供的TCR构建体和片段能够与上述本发明TCR特异性结合相同的抗原靶标并在所附实施例中进行了评估。

本发明的TCR包括异二聚体和多聚体，其中至少一个TCRα链可变区或TCRα链和至少一个TCRβ链可变区彼此共价连接以形成TCR异二聚体或多聚体。本发明中使用的“多聚体”描述了不同亚基或功能实体的分子，而异二聚体仅包含两个功能实体。在其最简单的形式中，根据本发明的多价TCR构建体包含两个或三个或四个或更多个TCR的多聚体，它们彼此缔合(例如共价或以其它方式连接)，优选地通过接头分子。在本文中，“共价连接”是指共享电子对的两个分子之间的化学键，描述了原子键之间的稳定平衡。

根据本发明，合适的接头可以具有球体，优选均匀的珠，更优选聚苯乙烯珠，最优选生物相容性聚苯乙烯珠。这样的TCR构建体也可以包括在本发明TCR和珠中，所述珠具有并入珠中的预定义荧光染料。合适的接头分子包括但不限于多价连接分子，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和extravidin，它们各自具有四个生物素结合位点。因此，生物素化的TCR可以形成为具有多个TCR结合位点的多聚体。多聚体中TCR的数量将取决于与用于构成多聚体的接头分子数量相关的TCR数量，以及是否存在任何其它生物素化分子。示例性多聚体是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体或更高阶的多聚体TCR构建体。本发明的多聚体可以还包含其它功能实体，例如标签或药物或(固体)载体。

根据本发明，TCR异二聚体或多聚体还涉及融合蛋白或多肽，包含至少一个TCRα链、TCRα链可变区或CDR3α和/或至少一个TCRβ链、TCRβ链可变区或CDR3β；以及另外的一种或多种融合组分。其可以是至少一个如本文定义的TCRα链和/或至少一个如本文定义的TCRβ链和/或针对淋巴细胞表面上的抗原或表位的抗体或单链抗体片段(scFv)，并且TCRα链和TCRβ链还彼此连接且融合(任选地通过接头)至所述抗体或scFv。有用的组分包括Fc受体；Fc结构域(源自IgA、IgD、IgG、IgE和IgM)；细胞因子(如IL-2或IL-15)；毒素；抗体或其抗原结合片段(例如抗CD3、抗CD28、抗CD5、抗CD16或抗CD56抗体或其抗原结合片段)；CD247(CD3-ζ)、CD28、CD137、CD134结构域；或其任何组合。

根据本发明可用作融合组分的示例性抗体片段包括全长抗体的片段，例如(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或“r IgG”(“半抗体”)；修饰的抗体片段，例如scFv、di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联di-scFv、串联tri-scFv、微型抗体、多抗体如三抗体或四抗体，以及单结构域抗体如纳米抗体或仅包含一个可变结构域(可以是VHH、VH或VL)的单可变结构域抗体。

本发明的TCR构建体可以与一个或多个抗体或抗体片段融合，产生单价、二价和多价/多重价构建体，并因此产生仅特异性结合一种靶标抗原的单特异性构建体以及通过不同的抗原结合位点特异结合超过一种，例如两种、三种或更多种靶标抗原的双特异性和多特异性/多重特异性构建体。

任选地，可以在本发明的TCR构建体的一个或多个结构域或区域之间引入接头，即在TCRα链CDR3、TCRα链可变区和/或TCRα链，TCRβ链CDR3、TCRβ链可变区和/或TCRβ链，和/或本文所述的一种或多种融合组分之间。接头在本领域中是已知的并且尤其由Chen等人,AdvDrug Deliv Rev.2013Oct.15；65(10):1357-1369进行了综述。通常，接头包括柔性接头、可切割接头和刚性接头，并将根据构建体的类型和预期用途/应用进行选择。例如，对于治疗应用，非免疫原性柔性接头通常是优选的，以确保一定程度的柔性或结构域之间的相互作用，同时降低不良免疫原性反应的风险。此类接头通常由小的非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸组成，并且包括由Gly和Ser残基的片段组成的“GS”接头。

根据本发明设想的特别有用的TCR构建体是包含以下的那些：至少一个如本文定义的TCRα链、TCRα链可变区或CDR3α，至少一个如本文定义的TCRβ链、TCRβ链可变区或CDR3β，其任选地彼此连接并融合(任选地通过接头)至针对淋巴细胞表面上的抗原或表位的至少一个抗体或抗体片段(例如单链抗体片段(scFv))。被抗体或抗体片段(例如scFv)识别的有用抗原靶标包括CD3、CD28、CD5、CD16和CD56。所述构建体通常可以具有任何结构，只要“TCR部分”(即TCRα和β链或其可变区或CDR3)保留其识别本文定义的抗原靶标的能力，并且“抗体部分”结合期望的表面抗原或表位，从而将相应的淋巴细胞募集并靶向至靶细胞即可。此类构建体可以有利地用作将展示抗原靶标的抗原呈递细胞(例如肿瘤细胞)和淋巴细胞(例如细胞毒性T细胞或NK细胞)连接在一起的“衔接子”。此类融合蛋白的一个实例是根据双特异性T细胞接合器原理设计的构建体，其由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成，位于约55千道尔顿(kD)的单肽链上。因此，本发明的TCR构建体可以包含至少一个如本文所述的TCR抗原结合结构域(例如彼此融合的TCR可变α和可变β链)，其连接到期望结合特异性的scFv(或其它结合结构域)，例如CD3或CD56。scFv(或其它结合结构域)结合T细胞(例如通过CD3受体)或结合CD56以用于NK细胞激活，另一个通过在肿瘤细胞上特异性表达的抗原靶标结合肿瘤细胞。本文还设想了三抗体，包含至少一个如本文所述的TCR抗原结合结构域、scFv(或其它结合结构域)和另一个结构域，例如用于将构建体靶向至体内的作用部位(例如Fc结构域)。

本发明的TCR可以以“分离的”或“基本上纯的”形式提供。本文使用的“分离的”或“基本上纯的”意味着TCR已被鉴定为从其生产环境的组分中分离和/或回收，因此“分离的”TCR不含或基本上不含来自其生产环境的可能干扰其治疗或诊断用途的其它污染物组分。污染物组分可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。因此，“分离的”TCR将通过用于获得TCR的方法来制备，该方法在引起所述TCR表达的条件下孵育宿主细胞，并纯化所述TCR，从而包含至少一个去除或基本上去除这些污染物组分的纯化步骤。上述定义经过必要的修改同样适用于“分离的”多核苷酸/核酸。

本发明的TCR可以以可溶形式提供。可溶性TCR可用作诊断工具，以及将治疗剂或效应细胞特异性靶向例如表达由可溶性TCR识别的抗原靶标的癌细胞的载体或“衔接子”。可溶性TCR(sTCR)通常是包含TCRα和/或β链或其可变区或CDR的片段或构建体，并且任选地通过二硫键稳定或通过合适的接头分子共价连接，例如如上文在本发明的TCR构建体的上下文中所述。它们通常不包括例如跨膜区域。在一些情况下，可以在多肽序列中引入氨基酸修饰以增强分子的溶解度，和/或纠正α和β链的折叠和配对(如果需要)，特别是当在不提供上述特征的重组宿主中产生时。例如，当使用大肠杆菌作为生产宿主细胞时，TCRα和β链的折叠和配对通常在体外完成。因此，根据本发明的TCR可以例如包含额外的半胱氨酸残基，如本文别处所述。在本发明的优选实施方案中，TCR是水溶性的。

除了额外的半胱氨酸桥，其它有用的修饰包括，例如，添加亮氨酸拉链和/或核糖体跳跃序列，例如如Walseng等人,(2015),PLoS ONE 10(4):e0119559中所述的来自小核糖核酸病毒的序列2A，以增加TCRα和/或β链的折叠、表达和/或配对。

本发明的TCR可以进一步包括如下所述的一种或多种修饰。下面描述的修饰通常是共价修饰并且可以使用本领域已知的标准技术来完成。在一些情况下，可能需要对TCR进行氨基酸修饰以促进所述修饰的引入。

根据本发明，如本文所述和提供的TCR可以进一步包含一种或多种融合组分，例如选自以下的那些：Fc受体；Fc结构域，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM；细胞因子，包括IL-2或IL-15；毒素；抗体或其抗原结合片段，包括抗-CD3、抗-CD28、抗-CDS、抗-CD16或抗-CD56抗体或其抗原结合片段；和CD247(CD3-ζ)、CD28、CD137、CD134结构域或其组合；任选地还包含至少一个接头。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的TCR包含

(A)至少一个TCRα链或其亚区，其根据如本文(Aa)下所述的CDR3α链、如本文(Aa1)下所述的CDR1/2α链、如(Aa2)下所述的TCR可变α链或如(Aa3)下所述的TCRα链，和至少一个TCRβ链或其亚区，其根据如本文(Ab)下所述的CDR3β链、如本文(Ab1)下所述的CDR1/2β链、如(Ab2)下所述的TCR可变β链或如(Ab3)下所述的TCRβ链，其任选地彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体，或

(B)至少一个TCRα链或其亚区，其根据如本文(Ba)下所述的CDR3α链、如本文(Ba1)下所述的CDR1/2α链、如(Ba2)下所述的TCR可变α链或如(Ba3)下所述的TCRα链，和至少一个TCRβ链或其亚区，其根据如本文(Bb)下所述的CDR3β链、如本文(Bb1)下所述的CDR1/2β链、如(Bb2)下所述的TCR可变β链或如(Bb3)下所述的TCRβ链，其任选地彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体，

其中TCR还包含针对淋巴细胞表面上的抗原(例如CD3、CD28、CD5、CD16或CD56)或表位的抗体或单链抗体片段(scFv)，

其中TCRα链或其亚区和TCRβ链或其亚区彼此连接并融合(任选地通过接头)至所述抗体或scFv。

如本文所用的术语“表位”是指抗原上的位点，识别分子(例如本文所述和提供的TCR)与其结合。优选地，表位是分子上的位点，识别分子(优选TCR或抗体)将针对其产生和/或TCR或抗体将与其结合。例如，表位可以被识别分子识别，特别优选地被TCR或定义表位的抗体识别。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含被识别表位的表位。线性表位通常在独特的序列中包含至少3个，更通常至少5个，例如约8至约10个氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述和提供的TCR可以进一步包含至少一种分子标志物。

本发明的TCR，特别是(可溶性)TCR，可以用至少一种分子标志物标记。有用的分子标志物是本领域已知的并且可以使用常规方法任选地通过各种长度的接头与TCR或TCR变体偶联。

一般来说，不同的标志物分为不同的类别，取决于检测它们的测定法——以下实例包括但不限于：同位素标志物，其可以是放射性或重同位素，例如放射性同位素或放射性核素(例如<3>H、<14>、<15>N、<35>S、<89>Zr、<90>Y、<99>Tc、<111>In、<125>I、<131>I)；磁性标志物(例如磁性颗粒)；氧化还原活性部分；光学染料(包括但不限于发色团、磷光体和荧光团)，例如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)，化学发光基团，以及荧光团，其可以是“小分子”荧光团或蛋白质荧光团的；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶；生物素化基团；或被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等。当TCR、TCR变体或特别是可溶性TCR构建体(例如包含至少一个TCRα和/或TCRβ链的那些，如本文所述)旨在用于诊断用途时，特别考虑用分子标志物进行标记。

本发明的TCR，特别是可溶性TCR，可以通过附接其它功能部分进行修饰，例如用于降低免疫原性、增加流体动力学大小(溶液中的大小)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。

根据本发明使用的示例性功能部分包括与人体内其它蛋白质(例如血清白蛋白、免疫球蛋白Fc区或新生儿Fc受体(FcRn))结合的肽或蛋白质结构域，不同长度的多肽链(例如XTEN技术或)，非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，例如聚乙二醇(聚乙二醇化)、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物，或碳水化合物的共聚物，例如羟乙基淀粉(例如/>)或聚唾液酸(例如/>技术)。

其它有用的功能部分包括“自杀”或“安全开关”，其可用于关闭患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞。一个实例是Gargett和Brown Front Pharmacol.2014；5:235描述的诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)“安全开关”。简而言之，通过众所周知的方法修饰效应宿主细胞以表达胱天蛋白酶9结构域，其二聚化依赖于小分子二聚化剂药物如AP1903/CIP，并导致在经修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡。该系统例如在EP2173869(A2)中有所描述。其它“自杀”“安全开关”的实例在本领域中是已知的，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、CD20的表达和随后使用抗CD20抗体或myc标签的消耗(Kieback等人,Proc Natl Acad SciU S A.2008Jan 15；105(2):623-8)。本发明的TCR也可以通过引入诱导型的所谓的“开关”(如例如在WO2019175209A1中描述的)来修饰，其中本发明TCR的经修饰的α和β链仅在与小的二聚化剂药物相互作用时二聚，随后产生仅在二聚化剂药物存在下在细胞表面上表达的功能性TCR。

本文还设想了具有改变的糖基化模式的TCR。如本领域已知的，糖基化模式可取决于氨基酸序列(例如，下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)和/或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接到天冬酰胺残基的侧链。向结合分子添加N-连接的糖基化位点通过改变氨基酸序列以使得其包含一个或多个选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)的三肽序列方便地实现。O-连接的糖基化位点可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或被其替换来引入。

TCR糖基化的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。根据使用的偶联模式，糖可以被附接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。

类似地，去糖基化(即去除结合分子上存在的碳水化合物部分)可以以化学方式实现，例如通过将TCR暴露于三氟甲磺酸，或通过使用内切和外切糖苷酶以酶促方式实现。

还可以想到将药物(例如小分子化合物)添加至TCR，特别本发明的可溶性TCR。可以通过共价键或非共价相互作用(例如通过静电力)实现连接。可以使用本领域已知的各种接头以形成药物缀合物。

本公开的TCR，特别是可溶性TCR，可以被修饰以引入额外的结构域，其有助于识别、追踪、纯化和/或分离相应的分子(标签)。此类标签的非限制性实例包括被称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签及其变体(例如Strep II-标签)、His-标签、CD20、Her2/neu标签、myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血凝素)-标签或GFP-标签的肽基序。

表位标签是可以并入本公开的TCR中的有用标签的实例。表位标签是短氨基酸片段，其允许结合特定抗体，因此能够识别和跟踪可溶性TCR或宿主细胞在患者体内或培养的(宿主)细胞内的结合和移动。可以使用多种不同的技术来实现对表位标签的检测，从而检测标记的TCR。此类技术的实例包括：免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微镜、ELISA、免疫印迹(“Western”)和亲和层析。表位标签例如可以具有6至15个氨基酸，特别是9至11个氨基酸的长度。也可以在本发明的TCR中包含超过一种表位标签。

通过在对所述标签具有特异性的结合分子(抗体)存在的情况下培养细胞，标签可以进一步用于刺激和扩增携带本发明TCR的宿主细胞。

本发明还涉及编码如本文所述和提供的TCR的核酸。在本发明的具体实施方案中，此类核酸分子可以包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中的任一者的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列，或与SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一者的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。

如本文所用，除非另有具体定义，否则术语“核酸”或“核酸分子”与“寡核苷酸”、“核酸链”等同义使用，是指包含一个、两个或更多个核苷酸的聚合物，例如单链或双链。

通常，如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”应同义解释。通常，核酸分子尤其可以包括DNA分子(例如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA分子(例如dsRNA、ssRNA、mRNAivtRNA)、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖-寡核苷酸或PNA分子。此外，术语“核酸分子”可以指DNA或RNA或其杂交体或其本领域已知的任何修饰(修饰的实例参见例如US 5525711、US 471 1955、US 5792608或EP 302175)。多核苷酸序列可以是单链或双链的、线性的或环状的、天然的或合成的，并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、mRNA、反义RNA、核酶RNA或编码此类RNA的DNA或chimeroplasts(Gamper,Nucleic Acids Research,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是载体、质粒或病毒DNA或RNA的形式。本文还描述了与上述核酸分子互补的核酸分子和能够与本文所述的核酸分子杂交的核酸分子。本文所述的核酸分子也可以是本发明上下文中的核酸分子的片段。特别地，这样的片段是功能性片段。这样的功能性片段的实例是可以用作引物的核酸分子。

本发明还涉及包含如本文所述和提供的核酸分子的载体。

特别地，如本文所用的术语“载体”指质粒、粘粒、病毒、噬菌体以及基因工程中常用的其它载体。在本发明的一个实施方案中，载体适用于转化、转导和/或转染如本文所述的宿主细胞，例如原核细胞(例如(真细胞)细菌、古细菌)、真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞)真菌细胞、酵母等。本发明上下文中的细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细胞。优选地，宿主细胞是真核细胞，例如人类细胞。合适的宿主细胞的具体实例尤其可以包括类淋巴母细胞系、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞(优选自体CD8+细胞)、CD4+T细胞(优选自体CD4+细胞)、T记忆干细胞(T_SCM)、自然杀伤(NK)细胞(例如，经修饰以重组表达CD3(包括CD3γ、CD3δ、CD3ε)，也如WO2016/116601中所述和提供)、自然杀伤T(NKT)细胞和γ/δ-T细胞。在本发明的一个实施方案中，所述载体适合用于宿主细胞的稳定转化。

因此，在本发明的一方面，所提供的载体是表达载体。通常，表达载体已在文献中广泛描述。通常，它们可以不仅包含选择标志物基因和确保在所选宿主中复制的复制起点，而且还包含启动子，并且在大多数情况下还包含转录终止信号。在启动子和终止信号之间优选存在至少一个限制性位点或多接头，其能够插入期望表达的核酸序列/分子。应当理解，本文提供的载体是通过利用现有技术中已知的已经包含适合在本发明的上下文中使用的启动子的表达载体产生的。核酸构建体优选以这样的方式插入到该载体中，所得到的载体仅包含一个适合在本发明的上下文中使用的启动子。本领域技术人员知道如何将这种插入付诸实践。例如，启动子可以在连接之前从核酸构建体或表达载体中切除。在本发明的一个实施方案中，载体能够整合到宿主细胞基因组中。载体可以是适合于相应宿主细胞的任何载体，优选表达载体。在本发明的上下文中，优选的载体包括本领域已知的慢病毒和逆转录病毒载体。

除了复制起点、选择标志物和限制酶切割位点之外，表达载体通常还包括可操作地连接到待表达的异源多核苷酸的一个或多个调控序列。

术语“调控序列”是指在特定宿主生物体或宿主细胞中表达可操作地连接的(异源)多核苷酸编码序列所必需的核酸序列，并因此包括转录和翻译调控序列。通常，在原核生物中表达异源多核苷酸序列所需的调控序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。在真核生物中，通常需要启动子、聚腺苷酸化信号、增强子和任选的剪接信号。此外，还可以将特定的起始和分泌信号引入载体中以便允许感兴趣的多肽分泌到培养基中。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中，特别是在同一多核苷酸分子上时，该核酸被“可操作性地连接”。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时，它与异源基因的编码序列可操作地连接。启动子通常位于编码目的多肽的基因的上游并调节所述基因的表达。

用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。如前所述，表达载体可以还包括复制起点和选择性标志物。

根据本发明，逆转录病毒载体和慢病毒载体特别有用。合适的表达载体的实例包括病毒载体，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如MP71载体或逆转录病毒SIN载体；和慢病毒载体或慢病毒SIN载体。包含编码本发明的TCR的多核苷酸的病毒载体例如能够感染淋巴细胞，设想其随后表达异源TCR。合适的表达载体的另一个实例是睡美人(SB)转座子转座酶DNA质粒系统，SB DNA质粒。本发明的核酸和/或特别是表达构建体也可以通过瞬时RNA转染转移到细胞中。

目前使用的用于天然TCR表达的病毒载体通常将一个载体中的TCR-α链基因和TCR-β链基因与内部核糖体进入位点(IRES)序列或源自猪捷申病毒的2A肽序列连接起来，从而导致在被转导细胞内在病毒启动子的控制下表达单个信使RNA(mRNA)分子。

本发明还涉及包含如本文所述和提供的TCR、如本文所述和提供的核酸分子或如本文所述和提供的载体的宿主细胞。根据本发明可以使用多种宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖可以是或已经/已经是本文所述的多核苷酸或载体的受体和/或表达(和任选地分泌)本发明的TCR的细胞。除非另有明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示TCR的来源。术语“宿主细胞”还包括宿主细胞系。一般而言，术语“宿主细胞”包括原核细胞或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如小鼠、大鼠、猕猴或人类细胞。因此，本发明尤其提供了包含多核苷酸或载体的宿主细胞，例如表达载体，其包含编码如本文所述的TCR或TCR构建体的核苷酸序列。可以使用本领域已知的常规方法(例如通过转染、转化等)将本发明的多核苷酸和/或载体引入宿主细胞。

“转染”是故意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶标细胞的过程。一个实例是RNA转染，即将RNA(例如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜上打开瞬时孔或“洞”，以允许摄取物质。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生脂质体，脂质体与细胞膜融合并将其货物沉积在内部来进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。

“转化”用于描述将核酸分子或多核苷酸(包括载体)非病毒转移至细菌以及非动物真核细胞(包括植物细胞)。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的遗传改变，这是由于通过细胞膜从其周围环境中直接摄取并随后掺入外源遗传物质(核酸分子)而引起的。转化可以通过人工手段实现。要发生转化，细胞或细菌必须处于感受态状态，这可以是对诸如饥饿和细胞密度的环境条件的限时反应。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、细菌原生质体与完整细胞的融合、显微注射和电穿孔。用于植物转化的技术包括农杆菌介导的转移(例如通过根癌土壤杆菌(A.tumefaciens))、快速推进的钨或金微弹、电穿孔、显微注射和聚乙二醇介导的摄取。

根据本发明，为了表达本发明的TCR，可以选择调节被插入的多核苷酸序列的表达和/或根据需要修饰和加工基因产物(即RNA和/或蛋白质)的宿主细胞。基因产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于TCR的功能可以是很重要的。不同的宿主细胞对基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保产物的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当处理基因产物的初始转录本、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。

根据本发明，包含如本文所述和提供的TCR、如本文所述和提供的核酸分子或如本文所述和提供的载体的宿主细胞可以是适合稳定表达如本文所述和提供的TCR的任何细胞。优选地，此类宿主细胞能够在其表面上呈递此类TCR，从而允许所述TCR(特异性)结合如本文所述和具体说明的PRAME_L-L-肽(或其部分，或其HLA-A结合形式，如本文所述和具体说明的)。

根据本发明的宿主细胞可以是用于表达本发明的可溶性TCR并且优选能够表达大量重组蛋白的“生产宿主细胞”。根据前述，可想到的表达系统(即包含如上所述的表达载体的宿主细胞)包括微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用重组病毒表达载体(例如杆状病毒(baculovirus))感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。携带重组表达构建体的哺乳动物表达系统包含源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子，巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(MIEP)启动子)通常是优选的。合适的哺乳动物宿主细胞可以选自已知的细胞系(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)，然而，也可以想到使用淋巴细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞。

可用作“生产宿主细胞”的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，包括DHFR minus CHO细胞，例如DG44和DUXBI 1、NSO、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、HEK293(人肾)和SP2(小鼠骨髓瘤)细胞。其它示例性宿主细胞系包括但不限于HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、P3×63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT(牛内皮细胞)和RAJI(人淋巴细胞)。宿主细胞系通常可从商业服务、美国组织培养物保藏中心(ATCC)或已发表的文献中获得。非哺乳动物细胞如细菌、酵母、昆虫或植物细胞也容易获得，并且也可以用作如上所述的“生产宿主细胞”。示例性的细菌宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，沙门菌(Salmonella)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)。其它宿主细胞包括酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。昆虫细胞包括但不限于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。

根据前述内容，本发明还提供了一种用于产生和获得如本文所述的TCR的方法，包括以下步骤：(a)在引起所述TCR表达的条件下孵育宿主细胞(即生产宿主细胞)，和(b)纯化所述TCR。

使携带表达载体的宿主细胞在适于产生本文提供的TCR(特别是如本文别处所述的α链和/或β链)的条件下生长，并测定α和/或β链蛋白质合成。对于双链TCR的表达，编码α链和β链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个分子。一旦表达了本发明的TCR，其可以通过本领域已知的任何纯化方法纯化，例如通过层析(例如离子交换层析(例如羟基磷灰石层析)、亲和层析，特别是蛋白A、蛋白G或凝集素亲和层析、尺寸柱层析)、离心、差异溶解度、疏水相互作用层析，或任何其它用于纯化蛋白质的标准技术。技术人员将能够根据待回收的TCR的个体特征容易地选择合适的纯化方法。

在本发明的上下文中描述和提供的宿主细胞也可以是包含本发明的核苷酸序列、载体或TCR的“效应宿主细胞”。使用常规方法修饰所述效应宿主细胞以包含编码本发明TCR的核酸序列，并且设想表达本文所述的TCR，特别是在细胞表面上。为了本发明的目的，“表达本发明TCR的修饰的宿主细胞”通常指(效应或生产)宿主细胞，其经处理或改变以表达根据本发明的TCR，例如通过如所附实施例中所述的RNA转染。还设想了其它修饰或转染或转导方法，例如本文别处描述的那些。因此，术语“修饰的宿主细胞”包括优选表达本发明的TCR的“转染的”、“转导的”和“基因工程的”宿主细胞。优选地，此类“(修饰的)效应宿主细胞”(特别是“(修饰的)效应淋巴细胞”)能够在TCR与其特异性抗原靶标结合时通过细胞内信号转导介导效应功能。此类效应功能包括例如释放穿孔素(其在靶细胞膜中产生孔洞)、颗粒酶(其为在细胞内起作用以触发细胞凋亡的蛋白酶)、表达Fas配体(其在携带FAS的靶标细胞中激活细胞凋亡)和释放细胞因子，优选Th1/Tc1细胞因子，例如IFN-γ、IL-2和TNF-α。因此，设想了经改造以表达能够识别并结合待治疗的受试者中其抗原靶标的本发明TCR的效应宿主细胞将执行上述效应功能，从而杀死靶(例如癌症)细胞。可以评估靶标细胞的细胞溶解，例如使用CTL荧光杀伤试验(CTL,USA)，其检测在与TCR转染的受体T细胞共培养过程中荧光标记的靶标细胞的消失。

鉴于上文，效应宿主细胞优选表达功能性TCR，即通常包含本文所述的TCRα和β链；以及信号转导亚基CD3γ、δ、ε和ζ(CD3复合体)。此外，可以还希望共受体CD4或CD8的表达。通常，淋巴细胞携带参与抗原结合、受体激活和下游信号传导所需的基因(例如Lck、FYN、CD45和/或Zap70)，T细胞特别适合作为效应宿主细胞。然而，将本发明的TCR表达为“结合结构域”而没有CD3信号转导亚基和/或上述下游信号传导分子的效应宿主细胞(即能够识别本文所述的抗原靶标，但不影响由CD3和/或上述下游信号传导分子介导的功能)也在本文中设想。设想这样的效应细胞能够识别本文所述的抗原靶标，并且任选地能够影响与CD3信号传导和/或上述下游信号传导分子的信号传导无关的其它功能。实例包括NK或NKT细胞，其表达本发明TCR并且能够例如在识别其抗原靶标后释放细胞毒性颗粒。

因此，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞被认为是有用的淋巴细胞效应宿主细胞。此类表达本发明的重组TCR的淋巴细胞在本文中也被称为“修饰的效应淋巴细胞”。然而，本领域技术人员将容易地认识到，通常可以通过本领域已知的重组基因工程方法将导致期望效应功能的TCR信号传导通路的任何组分引入合适的宿主细胞中。效应宿主细胞，特别是淋巴细胞如T细胞可以是自体宿主细胞，其获自待治疗的受试者并且被转化或转导以表达本发明的TCR。通常，TCR的重组表达将通过使用如所附实施例中所述的病毒载体来实现。从患者获得和分离细胞的技术是本领域已知的。

如前所述，本文提供的效应宿主细胞特别设想用于治疗应用。为了提高治疗功效，可能需要对宿主细胞进行进一步的遗传修饰。例如，当使用自体CD8+T细胞作为“效应宿主细胞”时，适当的额外修饰包括内源性TCR、CTLA-4和/或PD-1表达的下调；和/或共刺激分子如CD28、CD134、CD137的扩增。用于实现上述遗传修饰的手段和方法已在本领域中描述。

用于宿主细胞的靶向基因组改造的方法是本领域已知的，并且除了使用siRNA的基因敲低之外，还包括使用所谓的“可编程核酸酶”，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和RNA引导的工程化核酸酶(RGEN)，其源自细菌成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas(CRISPR相关)系统，尤其在Kim&Kim Nature Reviews Genetics15,321-334(2014)中进行了综述。例如，可以使用可编程核酸酶如TALEN来切割编码“不需要的”蛋白质(例如PD-1、CTLA-4或内源性TCR)的DNA区域，从而降低它们的表达。当T细胞用作(效应)宿主细胞时，内源性TCR的下调有利于减少内源性和外源性TCRα/β链的不想要的“错配”。

在本发明的具体实施方案中，此类宿主细胞可以例如选自淋巴细胞，包括但不限于类淋巴母细胞系、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞(优选自体CD8+细胞)、CD4+T细胞(优选自体CD4+细胞)、T记忆干细胞(T_SCM)、自然杀伤(NK)细胞(例如，经修饰以重组表达CD3(包括CD3γ、CD3δ、CD3ε)，也如WO2016/116601中所述和提供))、自然杀伤T(NKT)细胞和γ/δ-T细胞。

本发明还涉及获得如本文所述和提供的TCR的方法，包括在引起所述TCR表达的条件下孵育如本文所述和提供的宿主细胞，并纯化所述TCR。

本发明还涉及药物或诊断组合物，包含以下的一种或多种：

(i)如本文所述和提供的TCR；

(ii)如本文所述和提供的核酸分子；

(iii)如本文所述和提供的载体；和/或

(iv)如本文所述和提供的宿主细胞，和

任选地的药物辅料。

特别地，术语“药物组合物”指适合施用于人类的组合物。然而，适合施用于非人类动物的组合物通常也包括在该术语中。

本发明设想的药物组合物可以还包含一种或多种检查点抑制剂，优选选自由CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂组成的组。所有上述抑制剂都为免疫检查点抑制剂，能够下调免疫应答。细胞毒性淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂是调节性T细胞中组成型表达的蛋白受体，但在常规T细胞中仅在激活后上调。PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂用于抑制程序性死亡配体1(PD-L1)与其受体(程序性细胞死亡蛋白1(PD-1))的缔合。这些细胞表面蛋白的相互作用涉及免疫系统的抑制，并在感染后发生，以限制待命宿主细胞的杀伤并预防自身免疫性疾病。因此，优选将所述检查点抑制剂与根据本发明的药物组合物组合。

根据本发明，如本文所述和提供的药物组合物可以还包含检查点抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述检查点抑制剂可以选自由CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂组成的组。

本发明涵盖的其它检查点抑制剂是LAG3、ICOS、TIM3、VISTA和CEACAM1。LAG3是抗原激活的T细胞上的抑制性受体。ICOS蛋白属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。其形成同二聚体，在细胞间信号传导、免疫应答和细胞增殖调节中发挥重要作用。TIM3或甲型肝炎病毒细胞受体编码属于免疫球蛋白超家族和TIM蛋白家族的蛋白质。CD4阳性T辅助淋巴细胞可以根据其细胞因子分泌模式分为1型(Th1)和2型(Th2)。VISTA或V-Set免疫调节受体编码抑制T细胞应答的免疫调节受体。CEACAM1基因编码属于免疫球蛋白超家族的癌胚抗原(CEA)基因家族的成员。这些检查点抑制剂也可以与药物组合物组合。

药物组合物及其组分(即活性剂和任选的辅料)优选是药学上可接受的，即能够引起期望的治疗效果而不会对接受者造成任何不希望的局部或全身作用。本发明的药学上可接受的组合物例如可以是无菌的。具体而言，术语“药学上可接受的”可以指监管机构或其它普遍认可的药典批准用于动物，更具体地用于人类。

前述活性剂(例如宿主细胞或TCR)优选以治疗有效量存在于药物组合物中。“治疗有效量”是指引发期望治疗效果的活性剂的量。治疗功效和毒性可以通过标准程序来确定，例如在细胞培养物或试验动物中，例如ED₅₀(对50％的群体治疗有效的剂量)和LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)。治疗作用与毒性作用的剂量比即为治疗指数，并且它可表示为ED₅₀/LD₅₀之比。优选表现出大治疗指数的药物组合物。

TCR多核苷酸、载体或宿主细胞的确切剂量将由本领域技术人员使用已知技术确定。合适的剂量提供足够量的本发明的活性剂并且优选地是治疗有效的，即引发期望的治疗效果。

如本领域已知的，出于治疗目的(例如维持缓解对比疾病的急性发作)的调节施用途径、时间和频率、施用制剂的时间和频率、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、疾病状态的严重程度、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应可能是必要的。合适的剂量范围，例如对于本文所述的可溶性TCR，可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来确定并且可以包括ED₅₀。通常，剂量可以在0.1至100000微克之间变化，最高达约2g的总剂量，这取决于施用途径。本发明活性剂的示例性剂量在约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg的范围内。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导。认识到治疗可能需要治疗有效剂量的本发明活性剂的单次施用，或治疗有效剂量的本发明活性剂的多次施用。例如，一些药物组合物可能每3至4天、每周或每两周一次或每月一次施用，这取决于特定组合物的配方、半衰期和清除率。如前所述，药物组合物可以任选地包含一种或多种辅料和/或另外的活性剂。

术语“辅料”包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、保湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。选择合适的辅料来制备本发明的期望药物组合物在技术人员的知识范围内。用于本发明药物组合物的示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适辅料的选择将尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望制剂。

本发明还提供了药物组合物，包含一种或多种上文具体说明的本发明活性剂(例如宿主细胞或TCR构建体)，和一种或多种适合用于治疗和/或预防待治疗疾病的另外的活性剂。适合组合的活性成分的优选实例包括已知的抗癌药物，例如顺铂、美登新衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠光敏素II(sorfimer sodiumphotofrinII)、替莫唑胺(temozolmide)、拓扑替康、三甲曲沙葡萄糖醛酸(trimetreateglucuronate)、澳瑞他汀E(auristatin E)、长春新碱和多柔比星；以及肽类细胞毒素，例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNAase、RNAase等；放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；前体药物，例如抗体导向的酶前体药物；免疫刺激剂，例如IL-2，趋化因子例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等，抗体或其片段例如抗CD3抗体或其片段，补体激活剂、异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。

多种途径适用于施用根据本发明的药物组合物。通常，施用将通过肠胃外方式完成。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

本发明的药物组合物可以配制成多种形式，尤其取决于所使用的活性剂(例如可溶性TCR)，例如呈固体、液体、气体或冻干形式，并且尤其可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、散剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、提取物、酊剂或液体提取物的形式，或为特别适合期望施用方法的形式。Remington'sPharmaceutical Sciences第22版(Ed.Maack Publishing Co,Easton,PA.,2012)指出了本身已知的用于生产药物的方法，并且可以包括例如常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、研磨、乳化、封装、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的宿主细胞或可溶性TCR的药物组合物通常以液体形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

在制备本发明的药物组合物之后，可将它们置于合适的容器中并贴上治疗指定病症的标签。例如，此类标签将包括施用的量、频率和方法。鉴于前述，本发明因此提供了如本文所述的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞，其用作癌症检测、诊断、预后、预防和/或治疗中的药物。

TCR、核酸、载体和/或宿主细胞通常可用于疾病或病症的治疗检测、诊断、预后、预防和/或治疗。所有语法形式的术语“治疗”包括对有此需要的受试者的治疗性或预防性治疗。“治疗性或预防性治疗”包括旨在完全预防临床和/或病理表现的预防性治疗或旨在改善或缓解临床和/或病理表现的治疗性治疗。因此，术语“治疗”还包括改善或预防疾病。

当使用本发明的药物组合物时设想治疗的此类疾病优选是癌症，其选自由以下组成的组：黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌和乳腺腺癌、肉瘤、前列腺癌症、子宫癌症、葡萄膜癌症、葡萄膜黑色素瘤、鳞状头颈癌症、滑膜癌、尤因肉瘤、三阴性乳腺癌症、甲状腺癌症、睾丸癌症、肾癌症、胰腺癌症、卵巢癌症、食道症癌、非小细胞肺癌症、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌症、胃癌症、子宫内膜癌症、结直肠癌症、胆管癌、乳腺癌症、膀胱癌症、骨髓性白血病和急性成淋巴细胞白血病，优选地其中癌症选自由以下组成的组：NSCLC、SCLC、乳腺癌症、卵巢癌症或结直肠癌症、肉瘤或骨肉瘤。

术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文中可互换使用以指代期望治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者通常包括人类、非人类灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。然而，容易理解本文提供的TCR、核酸、载体、宿主细胞和药物组合物尤其设想用于治疗人类受试者，特别是HLA-A2阳性的那些。

对于治疗，本发明的TCR——特别是本发明的可溶性TCR——、核酸、载体(例如病毒载体)或宿主细胞可以直接施用于有此需要的受试者。因此，本发明提供了用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗方法的TCR、核酸、载体或宿主细胞。所述方法可包括以下步骤：(a)提供本发明的(i)TCR、(ii)核酸、(iii)载体、(iv)宿主细胞和/或(v)药物组合物中的一种或多种；和(b)将(i)-(v)中的一种或多种施用于有此需要的受试者。任选地，该方法可以包括另外的癌症治疗步骤，例如辐射，或施用一种或多种抗癌剂。

根据本发明的治疗还可以包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；(b)提供本发明的(i)TCR、(ii)核酸、(ii)载体、(iv)宿主细胞和/或(v)药物组合物中的一种或多种，(c)将步骤(b)的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(a)的淋巴细胞中，从而获得修饰的淋巴细胞，(d)将步骤(c)的修饰的淋巴细胞施施用于有此需要的受试者或患者。步骤(a)中提供的淋巴细胞特别设想为如上文所述的“效应宿主细胞”并且有利地选自T细胞、NK细胞和/或NKT细胞，尤其是CD8⁺T细胞；并且可以在之前的步骤中通过本领域已知的常规方法从受试者的样品——特别是血液样品——中获得。然而，也可以想到使用优选能够表达本发明的TCR并发挥本文所述的期望生物效应功能的其它淋巴细胞。此外，通常选择所述淋巴细胞以与受试者的免疫系统相容，即它们将优选不引发免疫原性应答。例如，可以想到使用“通用受体细胞”，即发挥期望的生物效应功能的可以在体外生长和扩增的普遍相容的淋巴细胞。因此，使用此类细胞将无需在步骤(a)中获取和提供受试者自身的淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过将本文所述的核酸或载体经由电穿孔引入淋巴细胞，或通过用病毒载体感染淋巴细胞来进行，例如如先前在效应宿主细胞的上下文中描述的慢病毒载体或逆转录病毒载体。其它想到的方法包括使用转染试剂，例如脂质体，或瞬时RNA转染。通过例如(逆转录)病毒载体或瞬时RNA转染将抗原特异性TCR基因转移到(原代)T细胞中代表了一种用于生成肿瘤相关抗原特异性T细胞的有前途的工具，这些生成的细胞随后可以重新引入供体，在那里它们特异性地靶向并破坏表达所述抗原的肿瘤细胞。在本发明中，所述肿瘤相关抗原是如本文定义的PRAME，特别是其HLA-A*24或HLA-A*02:17结合形式。

根据本发明的治疗还可以包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；而治疗由以下组成：(b)提供以下中的一种或多种：(i)TCR；(ii)核酸；(iii)载体；(iv)宿主细胞；(v)药物组合物；(c)将步骤(b)的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(a)的淋巴细胞中，从而获得修饰的淋巴细胞，(d)将步骤(c)的修饰淋巴细胞施用于有此需要的受试者或患者。

鉴于上文，本发明的另一个方面因此是如本文别处所述的TCR、核酸序列、载体和/或宿主细胞用于产生修饰的淋巴细胞的用途。用于将例如核酸和载体引入淋巴细胞的手段和方法已在本文别处描述。

本发明还提供了一种诊断组合物，包含如本文所述的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞作为一种或多种诊断剂。通常，所述诊断剂将包含用于检测其与其抗原靶标结合的手段，例如在本发明的TCR构建体的上下文中描述的标记物。关于宿主细胞，例如可以想到使用包含在抗原识别时释放的染料或造影剂(而不是细胞毒性颗粒)的修饰的宿主细胞。

本发明还涉及如本文所述和提供的TCR、如本文所述和提供的核酸分子、如本文所述和提供的载体和/或如本文所述和提供的宿主细胞用于作为药物的用途。

本发明还涉及如本文所述和提供的TCR、如本文所述和提供的核酸分子、如本文所述和提供的载体和/或如本文所述和提供的宿主细胞用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗的用途。在本发明的上下文中，在具体实施例中，癌症可选自由以下组成的组：黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌、乳腺腺癌、肉瘤、前列腺癌症、子宫癌症、葡萄膜癌症、葡萄膜黑色素瘤、鳞状头颈癌症、滑膜癌、尤因肉瘤、三阴性乳腺癌症、甲状腺癌症、睾丸癌症、肾癌症、胰腺癌症、卵巢癌症、食道癌症、非小细胞肺癌症(NSCLC)、小细胞肺癌症(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌症、胃癌症、子宫内膜癌症、结直肠癌症、胆管癌、乳腺癌症、膀胱癌症、骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞癌症、急性髓细胞白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌症、脑癌症、乳腺癌症、肛门癌症、肛管癌症或肛门直肠癌症、眼癌症、肝内胆管癌症、关节癌症、颈部癌症、胆囊癌症或胸膜癌症、鼻癌症、鼻腔癌症或中耳癌症、口腔癌症、阴道癌症、外阴癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞癌症、结肠癌症、食道癌症、宫颈癌症、胃肠道类肿瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌症、肾脏癌症、喉癌症、肝脏癌症、肺癌症、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌症、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌症、卵巢癌症、阴茎癌症、胰腺癌症、腹膜癌症、大网膜癌症和肠系膜癌症、咽癌症、前列腺癌症、直肠癌症、肾癌症、皮肤癌症、小肠癌症、软组织癌症、胃部癌症、睾丸癌症、甲状腺癌症、子宫癌症、输尿管癌症和泌尿膀胱癌症。

根据本发明，在一个实施方案中，癌症的预防和/或治疗可以包括：

提供以下中的一种或多种

(i)如本文所述和提供的TCR，

(ii)如本文所述和提供的核酸分子，

(iii)如本文所述和提供的载体，

(iv)如本文所述和提供的宿主细胞，和

(v)如本文所述和提供的药物组合物；和

将(i)至(v)中的至少一种施用于有此需要的受试者。

根据本发明，在另一个实施方案中，癌症的预防和/或治疗可以包括：

(1)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；

(2)提供以下中的一种或多种

(i)如本文所述和提供的TCR，

(ii)如本文所述和提供的核酸分子，

(iii)如本文所述和提供的载体，

(iv)如本文所述和提供的宿主细胞，和

(v)如本文所述和提供的药物组合物；

(3)将步骤(2)的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(1)的淋巴细胞中，从而获得修饰的淋巴细胞；和

(4)将步骤(3)的修饰淋巴细胞施用于有此需要的受试者或患者。

本发明还涉及一种体外检测受试者体内癌症的存在的方法，包括：

提供受试者的样品，所述样品包含一种或多种细胞；

使所述样品接触

(i)如本文所述和提供的TCR，

(ii)如本文所述和提供的宿主细胞，和/或

(iii)如本文所述和提供的药物组合物，

从而形成复合体；和

检测所述复合体，

其中所述复合体的检出表明所述受试者中癌症的存在。

本发明还涉及如本文所述和提供的TCR、如本文所述和提供的核酸分子和/或如本文所述和提供的载体在产生修饰的淋巴细胞中的用途。

表1：序列

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本发明还可以通过以下项目表征：

1.一种T细胞受体(TCR)，能够与以下结合：

包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的多肽，其中不超过4个氨基酸被替换，或

所述多肽的部分，或

所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式，

其中所述TCR包含：

(A)CDR3，

(Aa)具有包含与SEQ ID NO:12至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链，和/或

(Ab)具有包含与SEQ ID NO:14至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链，

或

(B)CDR3，

(Ba)具有包含与SEQ ID NO:40至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链，和/或

(Bb)具有包含与SEQ ID NO:42至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链。

2.根据项目1所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR还包含

(Aa1)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链CDR2，

和/或

(Ab1)包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链CDR2，

或其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR还包含

(Ba1)包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRα链CDR2，

和/或

(Bbl)包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链CDR1，和/或包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少80％相似的氨基酸序列的TCRβ链CDR2。

3.根据项目1或2所述的TCR，其中所述HLA-A是HLA-A*24或HLA-A*02编码的分子。

4.根据前述项目中任一项所述的TCR，其中所述TCR与所述多肽或其部分或其HLA-A结合形式的结合诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌。

5.根据项目4所述的TCR，其中在与包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列且其中不超过4个氨基酸被替换的多肽、或所述多肽的部分、或所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式结合之后，所述诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌与不包含所述TCR的对照细胞相比为至少5倍高。

6.根据前述项目中任一项所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR包含

(Aa2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:16至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置47至51至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置69至75至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置109至123至少80％相似的氨基酸序列，

和/或

(Ab2)TCRβ链可变区，

包含与SEQ ID NO:18至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置46至50至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置68至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置110至122至少80％相似的氨基酸序列，

或者

其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR包含

(Ba2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:44至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置45至49至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置67至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置107至121至少80％相似的氨基酸序列，

和/或

(Bb2)TCRβ链可变区，

包含与SEQ ID NO:46至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置44至49至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置67至71至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置108至122至少80％相似的氨基酸序列。

7.根据前述项目中任一项所述的TCR，还包含

(i)TCRα链恒定区，和/或

(ii)TCRβ链恒定区。

8.根据前述项目中任一项所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR包含

(Aa3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:20至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置47至51至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置69至75至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置109至123至少80％相似的氨基酸序列，

和/或

(Ab3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:22至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置46至50至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置68至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置110至122至少80％相似的氨基酸序列，

或者

其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR包含

(Ba3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:48至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置45至49至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置67至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置107至121至少80％相似的氨基酸序列，

和/或

(Bb3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:50至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置44至49至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置67至71至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置108至122至少80％相似的氨基酸序列。

9.根据前述项目中任一项所述的TCR，包含

(A)至少一个根据(Aa)、(Aa1)、(Aa2)或(Aa3)的TCRα链或其亚区，和

至少一个根据(Ab)、(Ab1)、(Ab2)或(Ab3)的TCRβ链或其亚区，

彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体，

或者

(B)至少一个根据(Ba)、(Ba1)、(Ba2)或(Ba3)的TCRα链或其亚区，和

至少一个根据(Bb)、(Bb1)、(Bb2)或(Bb3)的TCRβ链或其亚区，

彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体。

10.根据前述项目中任一项所述的TCR，所述TCR选自由天然TCR、TCR变体、TCR片段和TCR构建体组成的组。

11.根据前述项目中任一项所述的TCR，其为水溶性的。

12.根据前述项目中任一项所述的TCR，还包含至少一种分子标志物。

13.一种核酸分子，编码根据前述项目中任一项所述的TCR。

14.根据项目13所述的核酸，包含与SEQ ID NO:、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一者的核酸序列至少80％相同的核酸序列；或与SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中任一者的核酸序列至少80％相同的核酸序列。

15.一种载体，包含根据项目13或14所述的核酸分子。

16.一种宿主细胞，包含根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸分子或根据项目15所述的载体。

17.根据项目16所述的宿主细胞，其选自淋巴细胞，包括但不限于类淋巴母细胞系、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、T记忆干细胞(T_SCM)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和γ/δ-T细胞。

18.一种用于获得根据前述项目中任一项所述的TCR的方法，包括

在引起所述TCR表达的条件下孵育根据项目16或17所述的宿主细胞，和

纯化所述TCR。

19.一种药物或诊断组合物，包含以下中的一种或多种：

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14所述的核酸分子；

(iii)根据项目15所述的载体；和/或

(iv)根据项目16或17所述的宿主细胞，

和，任选地，药物辅料。

20.根据项目19所述的药物组合物，还包含检查点抑制剂。

21.根据项目20所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂选自由CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂组成的组。

22.根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸分子、根据项目15所述的载体和/或根据项目16或17所述的宿主细胞用于作为药物的用途。

23.根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸分子、根据项目15所述的载体和/或根据项目16或17所述的宿主细胞用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗的用途。

24.根据项目23所述的TCR、核酸分子、载体或宿主细胞，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌、乳腺腺癌、肉瘤、前列腺癌症、子宫癌症、葡萄膜癌症、葡萄膜黑色素瘤、鳞状头颈癌症、滑膜癌、尤因肉瘤、三阴性乳腺癌症、甲状腺癌症、睾丸癌症、肾癌症、胰腺癌症、卵巢癌症、食道癌症、非小细胞肺癌症(NSCLC)、小细胞肺癌症(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌症、胃癌症、子宫内膜癌症、结直肠癌症、胆管癌、乳腺癌症、膀胱癌症、骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞癌症、急性髓细胞白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌症、脑癌症、乳腺癌症、肛门癌症、肛管癌症或肛门直肠癌症、眼癌症、肝内胆管癌症、关节癌症、颈部癌症、胆囊癌症或胸膜癌症、鼻癌症、鼻腔癌症或中耳癌症、口腔癌症、阴道癌症、外阴癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞癌症、结肠癌症、食道癌症、宫颈癌症、胃肠道类肿瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌症、肾脏癌症、喉癌症、肝脏癌症、肺癌症、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌症、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌症、卵巢癌症、阴茎癌症、胰腺癌症、腹膜癌症、大网膜癌症和肠系膜癌症、咽癌症、前列腺癌症、直肠癌症、肾癌症、皮肤癌症、小肠癌症、软组织癌症、胃部癌症、睾丸癌症、甲状腺癌症、子宫癌症、输尿管癌症和泌尿膀胱癌症。

25.根据项目23或24使用的所述TCR、核酸、载体和/或宿主细胞，其中癌症的预防和/或治疗包括：

提供以下中的一种或多种

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14所述的核酸分子；

(iii)根据项目15所述的载体；

(iv)根据项目16或17所述的宿主细胞，和

(v)根据项目19至21中任一项所述的药物组合物；和

将(i)至(v)中的至少一种施用于有此需要的受试者。

26.根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸分子、根据项目15所述的载体和/或根据项目16或17所述的宿主细胞，用于根据项目23至25中的任一项所述使用，其中癌症的预防和/或治疗包括：

(1)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；

(2)提供以下中的一种或多种

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14所述的核酸分子；

(iii)根据项目15所述的载体；

(iv)根据项目16或17所述的宿主细胞，和

(v)根据项目19至21中任一项所述的药物组合物；

27.一种体外检测受试者体内癌症的存在的方法，包括：

提供受试者的样品，所述样品包含一种或多种细胞；

使所述样品接触

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目16或17所述的宿主细胞，和/或

(iii)根据项目19至21中任一项所述的药物组合物，

从而形成复合体；和

检测所述复合体，

其中所述复合体的检出表明所述受试者中癌症的存在。

28.根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸分子和/或根据项目15所述的载体用于产生修饰的淋巴细胞的用途。

表征本发明的实施方案在本文中描述、在附图中显示、在实施例中说明并且在权利要求中反映。

必须注意，如本文所用，未用数量词限定的名词包括单数和复数指示对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，提及“方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文描述的方法的等效步骤和方法。

除非另有说明，在一系列元素之前的术语“至少”应被理解为是指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在包括在本发明中。

本文无论何处使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的所有或任意其它组合”的含义。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的20％以内，优选地在10％以内，并且更优选地在5％或2％以内。

贯穿本说明书和所附权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变体将被理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以被术语“包括”或“含有”替代，或者有时当在本文中使用时被术语“具有”替代。

当在本文中使用时，“由……组成”排除权利要求元素中未具体说明的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不会对权利要求的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。

在本文的每个实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个可以用其它两个术语中的任一个代替。

应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。

本说明书全文引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是在上文还是在下文，均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。如果通过引用并入的材料与本说明书相抵触或不一致，本说明书将取代任何此类材料。

附图说明

附图显示了：

图1将表达HLA-A*24:02编码的分子的类淋巴母细胞系(LCL；EBV转化的B细胞)用编码PRAME的ivtRNA或水进行电穿孔，并装载PRAME_301-309肽或无关肽。这些细胞在利用TCRT402-93转基因T细胞或TCR T116-49转基因T细胞的共培养测定中用作靶标。未转导的T细胞用作阴性对照。孵育24小时(h)后，通过标准ELISA评估TCR转基因T细胞的IFN-γ释放。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

图2将表达TCR T402-93或TCR T116-49的CD8⁺T细胞与HLA-A*24阳性PRAME阳性肿瘤细胞系(K562、Mel624.38、CMK、SKHEP1)或HLA-A*24阳性PRAME阴性肿瘤细胞系(Colo678、MCF-7、22RV1)共培养。未转导的CD8⁺T细胞用作阴性对照。用编码PRAME的ivtRNA或水进行电穿孔并装载PRAME_301-309肽或无关肽的HLA-A*24阳性LCL作为内部靶标对照被包括在内。共培养24小时后，通过标准ELISA以[pg/ml]测量IFN-γ释放来评估表达转基因TCR的T细胞的激活。显示的是具有标准偏差的重复值的平均值。这个实验是用两个不同供体进行的。显示的是一个代表性实验。使用三次多项式外推高于4000pg的值。

图3将红色标记的肿瘤细胞系与TCR T402-93转基因T细胞或TCR T116-49转基因T细胞以及未转导的T细胞一起孵育。使用活细胞成像系统监测细胞105小时的时间，以评估TCR转基因T细胞介导的红色标记的肿瘤细胞的杀伤情况。使用IncuCyte软件计算总积分强度(RCU(红色校准单位)×μm²/图像)。每个测量点代表三个技术重复的平均值。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

图4向HLA-A*24阳性LCL装载滴定量(10^-5M至10^-9M)的PRAME_301-309肽，并与表达TCRT402-93或TCR T116-49的CD8⁺T细胞共培养。24小时后进行标准ELISA以评估T细胞的IFN-γ释放。将每个效应细胞样品的最大IFN-γ释放设置为100％。以此为基础，计算出相对IFN-γ释放。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

图5对TCR T402-93和TCR T116-49识别的9聚体PRAME_301-309(LYVDSLFFL)肽进行苏氨酸扫描分析。将PRAME_301-309肽中包含的氨基酸依次用苏氨酸替换(交换的氨基酸以粗体显示)。向HLA-A*24阳性LCL装载修饰肽(10^-5M)并用于与表达TCR T402-93或TCR T116-49的T细胞以及未转导的T细胞共培养，以在孵育24小时后通过标准ELISA评估IFN-γ分泌。显示的是具有标准偏差的重复值的平均值。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

图6使用Expitope工具选择与野生型9聚体PRAME_301-309(LYVDSLFFL)肽相比具有多达三个氨基酸差异的肽。将不匹配的肽装载到HLA-A*24阳性LCL(10^-5M)上，并测试TCRT402-93转基因T细胞或TCR T116-49转基因T细胞的识别。装载有PRAME_301-309的LCL作为内部阳性对照被包括在内。孵育24小时后，使用标准ELISA IFN-γ评估T细胞的激活。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

图7将TCR T116-49转导的T细胞与由52个LCL组成的细胞文库共同培养，这些LCL涵盖德国和美国/欧洲高加索人群中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因。此外，向同样的52个LCL装载PRAME_301-309肽，并在与TCR T116-49转导的T细胞的共培养中进行了测试。孵育24小时后进行标准ELISA以评估T细胞的IFN-γ释放。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

通过以下实施例进一步说明本发明。然而，本文描述的实施例和具体实施方案不得被解释为将本发明限制于此类具体实施方案。

实施例

实施例1：PRAME_301-309特异性HLA-A24限制性TCR的分离

体外预致敏方法用于分离任何期望的HLA限制性和抗原特异性的T细胞克隆。预致敏系统使用HLA-A*24:02阴性健康供体的成熟树突细胞(mDC)作为抗原呈递细胞，并使用自体富含CD8的T细胞作为响应细胞。编码全长人PRAME氨基酸序列的体外转录RNA(ivtRNA)作为特异性抗原的来源。同时，人HLA-A*24:02编码ivtRNA(来自https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/的序列)用作限制性元件的来源并转染到mDC中以根据该专用HLA等位基因建立同种异体预致敏(如WO2007/017201中所述)。电穿孔到mDC后，编码PRAME的ivtRNA被翻译成全长蛋白质，随后由转染的mDC表达的转基因HLA-A*24分子加工并呈递为肽。T细胞与来自同一供体的ivtRNA转染的mDC的体外共培养导致作为相应TCR的来源的抗原特异性T细胞的从头诱导。

使用用编码HLA-A*24:02的ivtRNA和用PRAME ivtRNA转染的mDC的同种异体T细胞预致敏方法是根据以下方案使用同种异体HLA-A*24:02编码的分子的肽呈递完成的：

HLA-A*24:02/PRAME预致敏

单核细胞来源于HLA-A*24:02阴性健康供体，并且根据Jonuleit等人的方案(Jonuleit等人,Eur.J.Immunol.1997,27:3135-3142)使用合适的成熟混合物产生相应的mDC。将mDC同时用20μg编码PRAME的ivtRNA和20μg编码HLA-A*24分子的ivtRNA进行电穿孔。随后将制备的mDC与自体CD8⁺T细胞以1:10的比例在补充有IL-2(50单位/ml)的合适细胞培养基中共培养约14天。随后，使用HLA-A*24:02PRAME_301-309多聚体识别PRAME_301-309特异性T细胞，并使用FACS技术通过单细胞分选分离。在鉴定出识别HLA-A*24分子上的期望PRAME_301-309表位的有前途的T细胞克隆后，通过下一代测序(NGS)分析相应的T细胞受体(TCR)序列。将鉴定的HLA-A*24限制性PRAME_301-309特异性TCR(T402-93和T116-49)表达到受体T细胞中，并进行了关于功能和特异性的表征。

实施例2：抗原特异性的评估

向表达HLA-A*24:02编码的分子的LCL装载浓度为10^-5M的特异性PRAME_301-309肽或无关肽。此外，用编码PRAME的ivtRNA或作为阴性对照的水对相同的HLA-A*24阳性LCL进行电穿孔。使用10000个T细胞和20000个靶标细胞/96孔以1:2的效应细胞与靶标细胞的(E:T)比例将每种靶细胞系与TCR T402-93或TCR T116-49转导的T细胞共培养。未转导的T细胞(UT)作为阴性对照被包括在内。共培养24小时后，通过标准ELISA测定T细胞释放的IFN-γ。

结果：

TCR T402-93转导的T细胞和TCR T116-49转导的T细胞都识别特异性PRAME_301-309肽以及PRAME转染的LCL。需要注意的是，与TCR T402-93转基因T细胞相比，表达TCR T116-49的T细胞在与阳性靶标孵育后显示出更高水平的释放的IFN-γ。没有观察到装载有无关肽和水电穿孔的LCL的识别(图1)。

实施例3：肿瘤细胞识别

T细胞的IFN-γ释放的评估

将用TCR T402-93转导的效应T细胞或TCR T116-49转导的效应T细胞与PRAME阳性肿瘤细胞系(K562、Mel624.38、CMK、SKHEP1)或PRAME阴性肿瘤细胞系(Colo678、MCF-7、22RV1)共培养。在选定的肿瘤细胞系中，CMK和SKHEP1细胞系呈内源性HLA-A*24阳性，而其它五种细胞系呈内源性HLA-A*24阴性。因此，这五个细胞系在用HLA-A*24(K562、Mel624.38、22RV1)转导或用编码HLA-A*24分子的ivtRNA(Colo678和MCF-7)转染后进行测试。未转导的CD8⁺T细胞用作阴性对照。用编码PRAME的ivtRNA或水电穿孔并装载PRAME_301-309肽或无关肽的HLA-A*24阳性LCL作为内部对照被包括在内。T细胞和靶标细胞以1:1的E:T比例(10000E/10000T/96孔)共培养。共培养24小时后，通过标准ELISA以[pg/ml]测量IFN-γ释放来评估表达转基因TCR的T细胞的激活。使用三次多项式外推高于4000pg的值。

结果：

TCR T116-49转导的T细胞显示出对所有测试的PRAME阳性肿瘤细胞的识别，而TCRT402-93转导的T细胞仅在与四个PRAME阳性细胞中的两个(K562和Mel624.38)共培养后才释放高水平的IFN-γ。在与TCR T116-49转导的T细胞共培养中，未观察到任何PRAME阴性细胞的识别。相反，对于表达TCR 402-93的T细胞，观察到对PRAME阴性细胞系(MCF-7)的轻微识别(图2)。

T细胞介导的杀伤的评估

为了评估由TCR转基因T细胞介导的杀伤，选择了两个PRAME阳性肿瘤细胞系(Mel624.38，SKHEP1)和一个PRAME阴性肿瘤细胞系(Colo678)作为靶标细胞。在选定的肿瘤细胞系中，SKHEP1细胞系呈内源性HLA-A*24阳性，而其它三种细胞系呈内源性HLA-A*24阴性。因此，SKHEP1细胞仅用mCherry(红色荧光蛋白)转导，而其它两个细胞系则用与mCherry相连的HLA-A*24转导。在共培养开始前两天，将红色标记的肿瘤细胞接种在96孔平底板中(Mel624.38和SKHEP1 5000个细胞/孔，而Colo678 10000个细胞/孔)。作为内部阳性对照，相同的肿瘤细胞系另外装载了PRAME_301-309肽。在每孔中加入10000个表达TCR T402-93的T细胞或表达TCR T116-49的T细胞后，将共培养板转移至活细胞成像系统(IncuCyte装置)。在105小时的总时间内监测细胞以评估TCR转基因T细胞介导的红色标记的肿瘤细胞的杀伤情况。使用IncuCyte/>软件计算图像中物体的红色荧光强度的总和，其被指定为总积分强度(RCU(红色校准单位)×μm²/图像)。

结果：

两个TCR转导的样品均影响Mel624.38 PRAME阳性细胞系的生长，相比之下，只有TCR T116-49转导的T细胞介导SKHEP1 PRAME阳性细胞系的有效杀伤。两个TCR转导的样品均不影响PRAME阴性肿瘤细胞的扩增。肽装载后的每个靶标细胞系都被TCR转导的T细胞有效杀伤。相反，当未转导的T细胞用作共培养中的效应细胞时，对于所有肿瘤细胞系都观察到生长的靶标细胞(图3)。

实施例4：功能亲和力

实验的目的是测量PRAME_301-309特异性TCR的功能亲和力。功能亲和力是指各个非共价结合相互作用的多重亲和力的累积强度，例如转基因TCR和pMHC复合体之间的相互作用。TCR转基因T细胞群的功能亲和力被测量为与装载有滴定量的PRAME_301-309肽(10^-5M至10^- ⁹M)的HLA-A*24阳性LCL共培养中的半数最大相对IFN-γ释放。T细胞和靶标细胞以1:1的E:T比例(10000E/10000T/96孔)共培养。未转导的CD8⁺T细胞用作内部对照，用于减去由T细胞的内源性TCR介导且与转基因TCR特异性识别无关的反应性。24小时后进行标准ELISA以评估T细胞的IFN-γ释放。将每个效应细胞样品的最大IFN-γ释放设置为100％。以此为基础，计算出相对IFN-γ释放。这个实验是用两个不同的供体进行的。显示的是一个代表性实验。

结果：

与TCR T402-93转导的T细胞相比，TCR T116-49转导的T细胞显示出更高的功能亲和力，表明对靶标肽的更高敏感性(图4)。

实施例5：TCR识别基序(苏氨酸扫描测定)

该实验的目的是评估PRAME_301-309表位内的对于TCR的直接识别或肽与HLA-A*24:02编码的分子的结合重要的关键残基。氨基酸替换扫描用于定义表位序列中的关键氨基酸，每当这些残基被交换为氨基酸苏氨酸时，就会消除TCR的识别。这些“固定”氨基酸可用于定义独特的TCR识别基序。对由TCR T402-93和TCR T116-49识别的9聚体PRAME_301-309肽进行苏氨酸扫描测定。PRAME_301-309肽中包含的氨基酸依次被苏氨酸替换。向HLA-A*24阳性LCL装载修饰肽(10^-5M)以及野生型PRAME_301-309肽，并用于与表达TCR T402-93或TCR T116-49的T细胞共培养。未转导的T细胞用作内部对照。T细胞和靶标细胞以1:1的E:T比例(10000E/10000T/96孔)共培养。为了评估T细胞的IFN-γ分泌，在共培养24小时后进行标准ELISA。

结果：

与TCR T402-93转导的T细胞相比，TCR T116-49转导的T细胞显示出不同的TCR识别基序，具有较少的固定位置(图5)。

实施例6：错配肽的识别

通过使用Expitope工具(/>2.0；Jaravine等人BMC Cancer 2017)进行计算机分析，选择了与野生型9聚体PRAME_301-309表位相比包括多达3个错配的52个肽。将错配肽装载到HLA-A*24阳性LCL(10^-5M)上，并测试TCR T402-93转基因T细胞和TCR T116-49转基因T细胞的识别。装载有野生型PRAME_301-309肽的LCL以及未装载的LCL作为内部对照被包括在内。T细胞和靶标细胞以1∶1的E∶T比例(10000 E/10000T/96孔)共培养。孵育24小时后，使用标准ELISAIFN-γ评估T细胞的激活。

结果：

TCR转基因T细胞样品识别野生型PRAME_301-309肽但不识别未装载的靶标，因此证明了转基因T细胞的功能。TCR T402-93转导的T细胞也被装载有肽#4、#33、#38和#42的靶标细胞激活，而TCR T116-49转导的T细胞在用装载有错配肽#18的LCL刺激后释放IFN-γ(图6和表2)。

表2：T402-93转基因T细胞或TCR T116-49转基因T细胞识别的52个测试肽中的五个错配肽列表

T402-93识别的mm肽

#	肽	错配的数目	基因
				4	YYSDSIFFL	3	XXYLT1
33	LYVDTIGFL	3	GTPBP6
				38	DYVDSLYFC	3	KCNK12
42	LYYDHLGFL	3	CATSPERB

T116-49识别的mm肽

#	肽	错配的数目	基因
				18	DYVGTLFFL	3	FBXO24

肽#4(YYSDSIFFL)显示在SEQ ID NO：52中，肽#33(LYVDTIGFL)显示在SEQ ID NO：53中，肽#38(DYVDSLYFC)显示在SEQ ID NO：54中，肽#42(LYYDHLGFL)显示在SEQ ID NO：55中，并且肽#18(DYVGTLFFL)显示在SEQ ID NO：56中。

实施例7：LCL文库

建立了由52个LCL组成的细胞文库，这些LCL涵盖德国和美国/欧洲高加索人群中最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因。这些人群中超过0.5％的HLA等位基因频率被至少一个细胞系覆盖，频率超过5％的HLA等位基因被至少两个LCL覆盖(HLA-A*11：01除外)。该实验的首要目的是研究TCR 116-49对常见HLA同种异型的潜在靶标抗原非依赖性交叉识别。HLA同种异型交叉识别可以被定义为TCR与同种异体HLA分子相互作用的能力，这些相互作用也被描述为表现出精致的肽和HLA特异性。因此，将52个LCL与表达TCR T116-49的T细胞一起孵育。该实验的其它目的是确定除HLA-A*24:02之外的常见HLA-A亚等位基因，这些亚等位基因能够呈递PRAME_301-309表位并且可以被TCR T116-49转基因T细胞识别(HLA限制性精确分型)。因此，向52个LCL装载PRAME_301-309肽(10^-5M)，随后用作与TCR T116-49转基因T细胞共培养的靶标。孵育24小时后，进行标准ELISA以测量T细胞的IFN-γ释放。

结果：

在与文库中包含的所有装载有PRAME_301-309肽的HLA-A*24:02阳性LCL共培养后，观察到TCR 116-49转导的T细胞的IFN-γ释放。TCR 116-49转基因T细胞在未装载肽以及装载PRAME_301-309肽后轻微识别表达HLA-A*02:02的LCL，表明对HLA-A*02:02等位基因的潜在HLA同种异体交叉识别。表达HLA-A*02:17的两个LCL仅在装载PRAME_301-309肽后才被TCR T116-49转基因T细胞识别，表明PRAME_301-309表位也可呈递在HLA-A*02:17编码的分子上，导致TCRT116-49转基因T细胞的激活。

序列(如果发生冲突，以下序列规则优先于根据WIPO ST.25标准的序列表的序列)：

/>

序列表

<110> 基因医疗免疫疗法有限责任公司

<120> 新的PRAME受体及其用途

<130> MED17180EP

<150> EP20198096.8

<151> 2020-09-24

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

ctctatgtgg actctttatt tttcctt 27

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aaggccctgt acagc 15

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Lys Ala Leu Tyr Ser

1 5

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

gagaaccatc ggtac 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Glu Asn His Arg Tyr

1 5

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

ctgctgaaag gcggcgagca g 21

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Leu Leu Lys Gly Gly Glu Gln

1 5

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

agctacggcg tgaaggac 18

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ser Tyr Gly Val Lys Asp

1 5

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

tgcggcacag ccaatagcgg cggcagcaac tacaagctga ccttc 45

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Cys Gly Thr Ala Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe

1 5 10 15

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

tgcgccatca gcgactacga gggcaccgag gcctttttt 39

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Cys Ala Ile Ser Asp Tyr Glu Gly Thr Glu Ala Phe Phe

1 5 10

<210> 15

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

atggagacac tgctgaaggt gctgtctggc acactgctgt ggcagctgac ctgggtccga 60

tctcagcagc ctgttcagtc tcctcaggcc gtgatcctga gagaaggcga ggacgccgtg 120

atcaactgca gcagctctaa ggccctgtac agcgtgcact ggtacagaca gaagcacggc 180

gaggcccctg tgttcctgat gatcctgctg aaaggcggcg agcagaaggg ccacgagaag 240

atcagcgcca gcttcaacga gaagaagcag cagtccagcc tgtacctgac agccagccag 300

ctgagctaca gcggcaccta cttttgcggc acagccaata gcggcggcag caactacaag 360

ctgaccttcg gcaagggcac cctgctgacc gtgaatccca at 402

<210> 16

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Met Glu Thr Leu Leu Lys Val Leu Ser Gly Thr Leu Leu Trp Gln Leu

1 5 10 15

Thr Trp Val Arg Ser Gln Gln Pro Val Gln Ser Pro Gln Ala Val Ile

20 25 30

Leu Arg Glu Gly Glu Asp Ala Val Ile Asn Cys Ser Ser Ser Lys Ala

35 40 45

Leu Tyr Ser Val His Trp Tyr Arg Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Val

50 55 60

Phe Leu Met Ile Leu Leu Lys Gly Gly Glu Gln Lys Gly His Glu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Ala Ser Phe Asn Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ser Leu Tyr Leu

85 90 95

Thr Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Thr Ala

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu

115 120 125

Leu Thr Val Asn Pro Asn

130

<210> 17

<211> 393

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

atgggcacca gactgttctt ctacgtggcc ctgtgtctgc tgtggacagg ccatgtggat 60

gccggaatca cacagagccc cagacacaaa gtgaccgaga caggcacccc tgtgacactg 120

agatgtcacc agaccgagaa ccatcggtac atgtattggt acagacagga ccccggccac 180

ggcctgagac tgatccacta tagctacggc gtgaaggaca ccgacaaggg cgaagtgtct 240

gacggctaca gcgtgtccag aagcaagacc gaggacttcc tgctgaccct ggaaagcgcc 300

acaagcagcc agaccagcgt gtacttctgc gccatcagcg actacgaggg caccgaggcc 360

ttttttggcc aaggcacaag actgaccgtg gtg 393

<210> 18

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr

1 5 10 15

Gly His Val Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr

20 25 30

Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His

35 40 45

Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser

65 70 75 80

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile

100 105 110

Ser Asp Tyr Glu Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Val

130

<210> 19

<211> 810

<212> DNA

<213> 智人

<400> 19

atggagacac tgctgaaggt gctgtctggc acactgctgt ggcagctgac ctgggtccga 60

tctcagcagc ctgttcagtc tcctcaggcc gtgatcctga gagaaggcga ggacgccgtg 120

atcaactgca gcagctctaa ggccctgtac agcgtgcact ggtacagaca gaagcacggc 180

gaggcccctg tgttcctgat gatcctgctg aaaggcggcg agcagaaggg ccacgagaag 240

atcagcgcca gcttcaacga gaagaagcag cagtccagcc tgtacctgac agccagccag 300

ctgagctaca gcggcaccta cttttgcggc acagccaata gcggcggcag caactacaag 360

ctgaccttcg gcaagggcac cctgctgacc gtgaatccca atatccagaa tccggagccc 420

gccgtatacc agctgaagga ccctagaagc caggacagca ccctgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agatcaacgt gcccaagacc atggaaagcg gcaccttcat caccgacaag 540

acagtgctgg acatgaaggc catggacagc aagtccaacg gcgcaatcgc ctggtccaac 600

cagaccagct tcacatgcca ggacatcttc aaagagacaa acgccacata ccccagcagc 660

gacgtgccct gtgatgccac cctgacagag aagtccttcg agacagacat gaacctgaac 720

ttccagaatc tgtccgtgat gggcctgaga atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaat 780

ctgctgatga ccctgcggct gtggtccagc 810

<210> 20

<211> 270

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Met Glu Thr Leu Leu Lys Val Leu Ser Gly Thr Leu Leu Trp Gln Leu

1 5 10 15

Thr Trp Val Arg Ser Gln Gln Pro Val Gln Ser Pro Gln Ala Val Ile

20 25 30

Leu Arg Glu Gly Glu Asp Ala Val Ile Asn Cys Ser Ser Ser Lys Ala

35 40 45

Leu Tyr Ser Val His Trp Tyr Arg Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Val

50 55 60

Phe Leu Met Ile Leu Leu Lys Gly Gly Glu Gln Lys Gly His Glu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Ala Ser Phe Asn Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ser Leu Tyr Leu

85 90 95

Thr Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Thr Ala

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu

115 120 125

Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln

130 135 140

Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp

145 150 155 160

Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe

165 170 175

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser

180 185 190

Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp

195 200 205

Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys

210 215 220

Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn

225 230 235 240

Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

245 250 255

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265 270

<210> 21

<211> 912

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

atgggcacca gactgttctt ctacgtggcc ctgtgtctgc tgtggacagg ccatgtggat 60

gccggaatca cacagagccc cagacacaaa gtgaccgaga caggcacccc tgtgacactg 120

agatgtcacc agaccgagaa ccatcggtac atgtattggt acagacagga ccccggccac 180

ggcctgagac tgatccacta tagctacggc gtgaaggaca ccgacaaggg cgaagtgtct 240

gacggctaca gcgtgtccag aagcaagacc gaggacttcc tgctgaccct ggaaagcgcc 300

acaagcagcc agaccagcgt gtacttctgc gccatcagcg actacgaggg caccgaggcc 360

ttttttggcc aaggcacaag actgaccgtg gtggaagatc tccggaacgt gaccccccct 420

aaagtgaccc tgttcgaacc cagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa agccaccctc 480

gtgtgcctgg ccagaggctt cttccccgac catgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc 540

aaagaggtgc acagcggagt gtccaccgac cctcaggcct acaaagagag caactacagc 600

tactgcctga gcagcagact gcgggtgtcc gccaccttct ggcacaaccc ccggaaccac 660

ttcagatgcc aggtgcagtt tcacggcctg agcgaagagg acaagtggcc cgaaggctcc 720

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<210> 22

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr

1 5 10 15

Gly His Val Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr

20 25 30

Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His

35 40 45

Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser

65 70 75 80

Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile

100 105 110

Ser Asp Tyr Glu Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

195 200 205

Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

210 215 220

Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser

225 230 235 240

Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

245 250 255

Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala

260 265 270

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

275 280 285

Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser

290 295 300

<210> 23

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

atccagaatc cggagcccgc cgtataccag ctgaaggacc ctagaagcca ggacagcacc 60

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accttcatca ccgacaagac agtgctggac atgaaggcca tggacagcaa gtccaacggc 180

gcaatcgcct ggtccaacca gaccagcttc acatgccagg acatcttcaa agagacaaac 240

gccacatacc ccagcagcga cgtgccctgt gatgccaccc tgacagagaa gtccttcgag 300

acagacatga acctgaactt ccagaatctg tccgtgatgg gcctgagaat cctgctgctg 360

aaggtggccg gcttcaatct gctgatgacc ctgcggctgt ggtccagc 408

<210> 24

<211> 136

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser

1 5 10 15

Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn

20 25 30

Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val

35 40 45

Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp

50 55 60

Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val

100 105 110

Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu

115 120 125

Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

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caggcctaca aagagagcaa ctacagctac tgcctgagca gcagactgcg ggtgtccgcc 240

accttctggc acaacccccg gaaccacttc agatgccagg tgcagtttca cggcctgagc 300

gaagaggaca agtggcccga aggctccccc aagcccgtga cccagaatat ctctgccgag 360

gcctggggca gagccgactg tggaattacc agcgccagct accaccaggg cgtgctgtct 420

gccaccatcc tgtacgagat cctgctgggc aaggccaccc tgtacgccgt gctggtgtct 480

ggcctggtgc tgatggccat ggtcaagaag aagaacagc 519

<210> 26

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu Phe Glu Pro

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Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

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Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

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Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

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Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

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His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro

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Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

1 5 10 15

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

20 25 30

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

35 40 45

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

50 55 60

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

65 70 75 80

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85 90 95

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

100 105 110

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

115 120 125

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 28

<211> 176

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

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Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

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Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

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Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

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Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

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Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

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Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

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Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

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<210> 29

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<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 29

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

1 5 10 15

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

20 25 30

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

35 40 45

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

50 55 60

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

65 70 75 80

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val

85 90 95

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

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Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

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Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

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<212> PRT

<213> 智人

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Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

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Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

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Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

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Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

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Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

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Phe

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 33

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 37

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Ser Val Gly Ile Gly

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<211> 45

<212> DNA

<213> 智人

<400> 39

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<213> 智人

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Cys Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe

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<210> 41

<211> 45

<212> DNA

<213> 智人

<400> 41

tgtgcttgga gcctcggagc cggctacacc gacacacagt atttt 45

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

Cys Ala Trp Ser Leu Gly Ala Gly Tyr Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 43

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gatgtgggca cctacttttg tgctggcgcc ctgcctagag ccggcagcta tcaactgaca 360

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<210> 44

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln

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Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln

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Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser

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Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu

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Ile Gln Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg Leu Thr

65 70 75 80

Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala

85 90 95

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Val Ile Pro Asn

130

<210> 45

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<212> DNA

<213> 智人

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ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300

agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agcctcggag ccggctacac cgacacacag 360

tattttggcc ctggcaccag actgaccgtg ctg 393

<210> 46

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val

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Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

20 25 30

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

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Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

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130

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<212> DNA

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<400> 47

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caagtgatgc agatccctca gtaccagcac gtgcaagaag gcgaggactt caccacctac 120

tgcaacagca gcaccacact gagcaacatc cagtggtaca agcagcggcc tggcggacac 180

cctgtgtttc tgatccagct ggtcaagtcc ggcgaagtga agaagcagaa gcggctgacc 240

ttccagttcg gcgaggccaa gaagaacagc agcctgcaca tcaccgccac acagaccacc 300

gatgtgggca cctacttttg tgctggcgcc ctgcctagag ccggcagcta tcaactgaca 360

ttcggcaagg gcaccaagct gagcgtgatc cccaacatcc agaatccgga gcccgccgta 420

taccagctga aggaccctag aagccaggac agcaccctgt gcctgttcac cgacttcgac 480

agccagatca acgtgcccaa gaccatggaa agcggcacct tcatcaccga caagacagtg 540

ctggacatga aggccatgga cagcaagtcc aacggcgcaa tcgcctggtc caaccagacc 600

agcttcacat gccaggacat cttcaaagag acaaacgcca cataccccag cagcgacgtg 660

ccctgtgatg ccaccctgac agagaagtcc ttcgagacag acatgaacct gaacttccag 720

aatctgtccg tgatgggcct gagaatcctg ctgctgaagg tggccggctt caatctgctg 780

atgaccctgc ggctgtggtc cagc 804

<210> 48

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu Ser Gln

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Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln

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Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser

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Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu

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Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala

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Arg Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser

115 120 125

Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys

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Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp

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Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr

165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly

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Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe

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Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala

210 215 220

Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln

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Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

245 250 255

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 49

atgctgtgtt ctctgctggc tctgctgctg ggcacctttt ttggcgtcag aagccagacc 60

atccaccagt ggcctgctac actggtgcag cctgttggaa gccctctgag cctggaatgt 120

accgtggaag gcaccagcaa tcccaacctg tactggtaca gacaggccgc tggaagagga 180

ctgcagctgc tgttttacag cgtcggcatc ggccagatca gcagcgaggt tccacagaat 240

ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300

agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agcctcggag ccggctacac cgacacacag 360

tattttggcc ctggcaccag actgaccgtg ctggaagatc tccggaacgt gaccccccct 420

aaagtgaccc tgttcgaacc cagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa agccaccctc 480

gtgtgcctgg ccagaggctt cttccccgac catgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc 540

aaagaggtgc acagcggagt gtccaccgac cctcaggcct acaaagagag caactacagc 600

tactgcctga gcagcagact gcgggtgtcc gccaccttct ggcacaaccc ccggaaccac 660

ttcagatgcc aggtgcagtt tcacggcctg agcgaagagg acaagtggcc cgaaggctcc 720

cccaagcccg tgacccagaa tatctctgcc gaggcctggg gcagagccga ctgtggaatt 780

accagcgcca gctaccacca gggcgtgctg tctgccacca tcctgtacga gatcctgctg 840

ggcaaggcca ccctgtacgc cgtgctggtg tctggcctgg tgctgatggc catggtcaag 900

aagaagaaca gc 912

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<211> 304

<212> PRT

<213> 智人

<400> 50

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val

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Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

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Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

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Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn

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Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys

85 90 95

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Leu

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Gly Ala Gly Tyr Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu

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Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu

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Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

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Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

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Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

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Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

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Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser

225 230 235 240

Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

245 250 255

Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala

260 265 270

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

275 280 285

Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser

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<210> 51

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 51

Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser

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Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln

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Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu

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Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg

50 55 60

His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys

65 70 75 80

Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr

85 90 95

Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val

100 105 110

Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser

115 120 125

His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr

130 135 140

Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys

145 150 155 160

Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu

165 170 175

Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe

180 185 190

Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu

195 200 205

Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys

210 215 220

Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val

225 230 235 240

Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu

245 250 255

Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala

260 265 270

Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe

275 280 285

Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp

290 295 300

Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val

305 310 315 320

Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu

325 330 335

Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser

340 345 350

Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro

355 360 365

Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val

370 375 380

Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro

385 390 395 400

Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn

405 410 415

Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly

420 425 430

Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr

435 440 445

Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His

450 455 460

Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val

465 470 475 480

Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr

485 490 495

Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn

500 505

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变肽

<400> 52

Tyr Tyr Ser Asp Ser Ile Phe Phe Leu

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变肽

<400> 53

Leu Tyr Val Asp Thr Ile Gly Phe Leu

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变肽

<400> 54

Asp Tyr Val Asp Ser Leu Tyr Phe Cys

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变肽

<400> 55

Leu Tyr Tyr Asp His Leu Gly Phe Leu

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 突变肽

<400> 56

Asp Tyr Val Gly Thr Leu Phe Phe Leu

1 5

Claims

1.一种T细胞受体(TCR)，能够与以下结合：

所述多肽的部分，或

所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式，

其中所述TCR包含：

(A)CDR3，

或

(B)CDR3，

2.根据权利要求1所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR还包含

和/或

或其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR还包含

和/或

3.根据权利要求1或2所述的TCR，其中所述HLA-A是HLA-A*24或HLA-A*02编码的分子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其中所述TCR与所述多肽或其部分或其HLA-A结合形式的结合诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌。

5.根据权利要求4所述的TCR，其中在与包含根据氨基酸序列LYVDSLFFL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列且其中不超过4个氨基酸被替换的多肽、或所述多肽的部分、或所述多肽或其部分的相应HLA-A结合形式结合之后，所述诱导包含所述TCR的细胞的IFN-γ分泌与不包含所述TCR的对照细胞相比为至少5倍高。

6.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR包含

(Aa2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:16至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:16的位置109至123至少80％相似的氨基酸序列，

和/或

(Ab2)TCRβ链可变区，

包含与SEQ ID NO:18至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:18的位置110至122至少80％相似的氨基酸序列，

或者

其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR包含

(Ba2)TCRα链可变区，

包含与SEQ ID NO:44至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:44的位置107至121至少80％相似的氨基酸序列，和/或

(Bb2)TCRβ链可变区，

包含与SEQ ID NO:46至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:46的位置108至122至少80％相似的氨基酸序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，

其中包含根据(A)的CDR3的所述TCR包含

(Aa3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:20至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置47至51至少80％相似的氨基酸序列，并且包含与SEQ IDNO:20的位置69至75至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:20的位置109至123至少80％相似的氨基酸序列，和/或

(Ab3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:22至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置46至50至少80％相似的氨基酸序列，并且包含与SEQ IDNO:22的位置68至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:22的位置110至122至少80％相似的氨基酸序列，或者

其中包含根据(B)的CDR3的所述TCR包含

(Ba3)TCRα链，

包含与SEQ ID NO:48至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置45至49至少80％相似的氨基酸序列，并且包含与SEQ IDNO:48的位置67至73至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:48的位置107至121至少80％相似的氨基酸序列，和/或

(Bb3)TCRβ链，

包含与SEQ ID NO:50至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置44至49至少80％相似的氨基酸序列，并且包含与SEQ IDNO:50的位置67至71至少80％相似的氨基酸序列，并且

包含与SEQ ID NO:50的位置108至122至少80％相似的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，包含

(A)至少一个根据(Aa)、(Aa1)、(Aa2)或(Aa3)的TCRα链或其亚区，和

至少一个根据(Ab)、(Ab1)、(Ab2)或(Ab3)的TCRβ链或其亚区，

彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体，

或者

(B)至少一个根据(Ba)、(Ba1)、(Ba2)或(Ba3)的TCRα链或其亚区，和

至少一个根据(Bb)、(Bb1)、(Bb2)或(Bb3)的TCRβ链或其亚区，

彼此共价连接形成TCR异二聚体或多聚体。

9.一种核酸分子，编码根据前述权利要求中任一项所述的TCR。

10.根据权利要求9所述的核酸，包含与SEQ ID NO:、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中任一者的核酸序列至少80％相同的核酸序列；或包含与SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中任一者的核酸序列至少80％相同的核酸序列。

11.一种载体，包含根据权利要求9或10所述的核酸分子。

12.一种宿主细胞，包含根据权利要求1至8中任一项所述的TCR、根据权利要求9或10所述的核酸分子或根据权利要求11所述的载体。

13.一种药物或诊断组合物，包含以下的一种或多种：

(i)根据权利要求1至8中任一项所述的TCR；

(ii)根据权利要求9或10所述的核酸分子；

(iii)权利要求11所述的载体；和/或

(iv)根据权利要求12所述的宿主细胞，

和，任选的药物辅料。

14.根据权利要求1至8中任一项所述的TCR、根据权利要求9或10所述的核酸分子、根据权利要求11所述的载体和/或根据权利要求12所述的宿主细胞用于作为药物的用途。

15.根据权利要求1至8中任一项所述的TCR、根据权利要求9或10所述的核酸分子、根据权利要求11所述的载体和/或根据权利要求12所述的宿主细胞用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗的用途。