CN109415409B - Flag标记的cd19-car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)‑T细胞，其被修饰以表达CAR融合蛋白，该融合蛋白从N端到C端包含：(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中scFv具有抗肿瘤抗原CD19的活性，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域；其中该融合蛋白还包含一FLAG标签，该FLAG标签位于scFv的C端。利用CD19‑FLAG CAR‑T细胞替代CD19CAR‑T细胞，输入CAR‑T细胞引起的细胞因子水平(干扰素‑γ，IL‑2和IL‑6)下降。

Description

FLAG标记的CD19-CAR-T细胞
序列表、表格或计算机程序的引用
序列表通过EFS-Web，以ASCII格式的文本文件与说明书同时提交，文件名为“序列表.txt”，创建日期为2017年3月27日，大小为9,6千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，在此通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明涉及一种嵌合抗原受体和表达该嵌合抗原受体的T细胞，可应用于肿瘤的过继免疫基因治疗领域。本发明具体涉及FLAG标记的CD19-CAR-T细胞。
背景技术
免疫治疗逐渐成为一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的武装力量，能够持续性地寻找外来抗原、辨别正常细胞和非正常细胞(癌症或感染细胞)。用CAR对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫疗法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在，像活的药物一样起效。
CAR(嵌合抗原受体)通常包括一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)，通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域和单个胞内激活CD3-ζ结构域。
图1显示了CAR从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)到第三代CAR(具有多个共刺激结构域)的演变，参见Golubovskaya,Wu,癌症,2016Mar 15；8(3)。生成的具有多个共刺激结构域的CAR(第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞可以在对标准疗法无反应的血液恶性肿瘤中产生持久的缓解。然而，CART细胞的使用受到潜在的严重毒性的限制。CART细胞治疗后出现意外器官损伤和死亡的早期病例报告首次突显了这种新治疗的可能危险。CAR T细胞可能通过特异性靶向在正常组织上也表达的肿瘤相关抗原，而潜在地损害这些组织。细胞因子释放综合征(CRS)是由输入的CAR T细胞释放的细胞因子引起的全身性炎症反应，可导致广泛的可逆性器官功能障碍。CRS是最常见的CART细胞引起的毒性类型。(Blood.2016；127(26)：3321-3330)在CRS中，如果不进行治疗，全身性炎症反应可导致死亡(Bonifant等，2016，Mol TherOncolytics 3,16011)。CRS患者经历发烧，低血压，缺氧和神经系统疾病，可能需要积极的医疗支持(Davila等，2014，Sci Transl Med 6,224ra225)。
毒性降低的改进的过继T细胞免疫疗法是需要的，因为减少CRS对于临床非常重要，以减少不良反应。
附图简要说明
图1显示了第一代至第三代CAR的结构。
图2显示了非CD19，CD19和CD19Flag CAR构建体的结构。缩写：L，连接子；H，来自CD28的铰链区；TM，来自CD28的跨膜结构域；F，FLAG表位。
图3显示CD19-FLAG CAR-T细胞表现出与CD19CAR-T细胞相当的扩增。Mock CAR-T细胞，CD19CAR-T细胞和CD19-FLAG CAR-T细胞体外扩增>100倍。图中显示了来自三个独立实验的代表性生长曲线。
图4显示CD19-FLAG CAR-T细胞显示出高转导效率。Mock CAR-T细胞，CD19CAR-T细胞和CD19-FLAG CAR-T细胞在培养的第8天用抗CD3抗体(Y轴)和FLAG表位特异性抗体(X-轴，右栏)或其同种型对照抗体(X-轴，左栏)通过流式细胞术染色。
图5显示CD19-FLAG CAR-T细胞对CD19+癌细胞有高度细胞溶解性。结果显示了T细胞添加后的细胞溶解的定量。左图，Raji细胞，*：与未转导T细胞(NT)和Mock CAR-T细胞相比，CD19或CD19-FLAG CAR-T细胞的p<0.05。右图，HeLa-CD19细胞；*：与未转导T细胞(NT)和Mock CAR-T细胞相比，CD19或CD19-FLAG CAR-T细胞的p<O.0001。中图：HeLa细胞。
图6显示CD19-FLAG CAR-T细胞响应CD19+癌细胞时产生适度水平的IFN-γ和IL-2。A：与内源性CD19+Raji细胞或CD19-K562细胞培养后，未转导T细胞、Mock CAR-T细胞、CD19CAR-T细胞或CD19-FLAG CAR-T细胞产生的IFN-γ；相对K562细胞，Raji细胞的**p＝0.002，*p＝0.008。B：与过表达CD19的HeLa-CD19细胞或CD19-HeLa细胞培养后，相同细胞制剂产生的IFN-γ。相对HeLa细胞，HeLa-CD19细胞的**p<0.0001，*p＝0.0003。C：与内源性CD19+Raji细胞或CD19-K562细胞培养后，细胞制剂产生的IL-2；相对K562细胞，Raji细胞的**p<0.0001，*p＝0.002。D：与过表达CD19的HeLa-CD19细胞或CD19-HeLa细胞培养后，细胞制剂产生的IL-2。相对HeLa细胞，HeLa-CD19细胞的**p<0.0001，*p<0.0001。所有条件重复三次进行。
图7显示相比CD19-CAR-T细胞，CD19-FLAG-CAR-T细胞针对Hela-CD19靶细胞的IL-6分泌减少。*P＝0.005
图8显示第19天瘤内注射CD19CAR-T细胞，第33天瘤内注射CD19-FLAG CAR-T细胞，显著抑制HeLa-CD19肿瘤的生长。*：与未转导T细胞相比，CAR-T细胞的p<0.05，通过Student’s t检验确定，假设方差不等。
图9显示静脉内注射CD19-FLAG CAR-T细胞显著抑制HeLa-CD19肿瘤生长。A：Hela-CD 19异种移植肿瘤的生长曲线，显示每组平均值；*：与未转导T细胞相比，CD19-FLAG CAR-T细胞的p<0.005。B：解剖的异种移植肿瘤的平均重量；*：与未转导T细胞相比，CD19-FLAGCAR-T细胞的p＝0.002。
图10显示用CD19-FLAG CAR-T细胞处理的HeLa-CD19荷瘤小鼠在外周血中含有数量增加的人T细胞。A：外周血白细胞中人T细胞的平均频次；*：与未转导T细胞相比，CD19-FLAG CAR-T细胞的p<0.0001。B：人T细胞中CD8+细胞的平均频次；*：与未转导T细胞相比，CD19-FLAG CAR-T细胞的p＝0.02。
图11显示CD19-FLAG CAR-T细胞显著地阻断Raji异种移植肿瘤的生长并延长存活。A：成像数据的定量。用CD19-FLAG CAR-T细胞处理的小鼠(而非PBS处理的小鼠)在第14天几乎完全不含Raji细胞；*：p＝0.0002。误差线表示均值的标准误差。B：Kaplan-Meier存活曲线显示，CD19-FLAG CAR-T细胞显著延长Raji异种移植模型小鼠的存活；*p＝0.003。
具体实施方式
定义
如本文所用，“过继细胞疗法”(ACT)是使用具有抗肿瘤活性的癌症患者自身T淋巴细胞进行体外扩增，并重新输入患有癌症的患者的治疗。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，衍生自不同与胞外结构域所衍生多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合具体抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的充当传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
如本文所用，FLAG标签、FLAG八肽、或FLAG表位是指可以利用重组DNA技术添加到某一蛋白中的多肽蛋白标签，具有序列为DYKDDDD(SEQ ID NO:1)的基序。其可以融合到蛋白的C端或N端，或插入蛋白内。
如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
说明
本发明人发现，通过在CD19CAR构建体中添加FLAG序列，CD19-FLAG CAR-T细胞比CD19CAR-T细胞产生更少的IFN-γ，IL-2和IL6，这表明CD19-FLAG CAR-T细胞比相应的CD19-CAR-T细胞毒性更小，更安全。因此，本发明人发现了一种具有降低的毒性的改进的过继性T细胞疗法(ACT)。通过在ACT中使用FLAG标记的CAR-T细胞，受试者的细胞因子释放水平降低，因此，与施用CAR中没有FLAG标签的类似CAR-T细胞的受试者相比，其细胞因子释放综合征(CRS)的发生率降低。
本发明涉及用于治疗癌症的过继细胞治疗方法，包括给患有癌症的受试者施用CD19-FLAG CAR-T细胞的步骤，使得受试者相比施用CAR中没有FLAG标签的类似CAR-T细胞的受试者，由于输注CAR T细胞引起的细胞因子释放减少。
本发明还涉及用于治疗癌症的过继细胞治疗方法，包括向患有癌症的受试者施用CD19-FLAG CAR-T细胞的步骤，使得受试者相比施用CAR中没有FLAG标签的类似CAR-T细胞的受试者，细胞因子释放综合征的发生率降低。
本发明提供了的一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序的共刺激结构域，和(iv)激活结构域；其中该融合蛋白还包含一FLAG标签，该FLAG标签位于scFv的C端、scFv的C端、或位于scFv的VH和VL之间。
在一种实施方式中，所述的肿瘤抗原选自下组：CD19、CD20、BCMA、CD22、CD38、CD138、间皮素、VEGFR-2、CD4、CD5、CD30、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD47、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD 133、EGFR、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、10a、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBRl、IL6R、gpl30、Lewis A、Lewis Y、NGFR、MCAM、TNFRl、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、ROR-2、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。优选的肿瘤抗原是CD19、CD20、BCMA、CD22、CD38、和CD 138。
在一种实施方式中，肿瘤抗原是人分化簇19(CD19)，其是由CD19基因编码的蛋白，是在B细胞表面上发现的B-淋巴细胞抗原。
本发明的CAR包含与感兴趣的肿瘤抗原特异性结合的单链可变片段(scFv)。抗体的重链(H链)和轻链(L链)片段通过接头序列连接。例如，接头可以是5-20个氨基酸。scFv的结构可以是从N端到C端的VL-接头-VH或VH-接头-VL。
本发明的CAR包含跨膜的跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然多肽，也可以是人工设计的。衍生自天然多肽的跨膜结构域可获自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3-ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选在合成的跨膜结构域的每个末端包括苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在优选的实施方式中，跨膜结构域衍生自CD28或CD8，其提供良好的受体稳定性。
在本发明中，共刺激结构域选自下组：人CD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX 40(CD137)、DAP10、和GITR(AITR)。
胞内信号转导结构域(激活结构域)是CAR的信号传输部分。在抗原识别后，受体聚集并将信号传递给细胞。最常用的胞内信号转导结构域组件是CD3-zeta(CD3Z或CD3ζ)，其含有3个ITAM。其在抗原结合后将激活信号传递给T细胞。CD3-zeta可能不能提供完全有效的激活信号，可能需要额外的共刺激信号传导。例如，一个或多个共刺激结构域可与CD3-Zeta一起用于传递增殖/存活信号。
该CAR融合蛋白还包含一FLAG标签，其位于scFv的N端、scFv的C端、或位于VH和VL之间。FLAG标签需要位于胞外结构域，而不是胞内结构域。除了FLAG标签外，可以在构造中使用其他标签。然而，FLAG标签是优选的，因为它不会引起免疫原性并且可以降低细胞因子分泌水平。
本发明的CAR可以包含连接至ScFv N端的信号肽，使得CAR在细胞内如T细胞内表达时，新生蛋白被引导至内质网并随后引导至细胞表面(其表达的地方)。信号肽的核心可含有长段疏水性氨基酸，其倾向于形成单个α-螺旋。信号肽可以短的带正电荷的氨基酸段开始，这有助于在易位期间实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端，通常存在一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位期间或易位完成之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。例如，信号肽可以衍生自人CD8或GM-CSF，或其变体，该变体具有1或2个氨基酸突变，条件是信号肽仍然起作用以引起CAR的细胞表面表达。
本发明的CAR可包含间隔序列作为铰链，以将scFv与跨膜结构域连接，并在空间上分割抗原结合结构域和胞内信号转导结构域。柔性间隔物允许结合结构域在不同方向上定向以使其能够与肿瘤抗原结合。间隔序列可以，例如，包含IgG1Fc区，IgG1铰链或CD8茎(CD8stalk)，或其组合。人CD28或CD8茎是优选的。
图2显示了非CD19ScFv-28-CD3ζ、CD19ScFv-28-CD3ζ和CD19ScFv Flag-28-CD3ζ的结构，CM-CSF信号肽、抗CD19scFv和CD28共刺激结构域在构建体中示出。图2中，FLAG标签在抗CD 19scFv之后示出。但是，也可以将FLAG引入scFv的N端，或引入VL和VH之间。
本发明提供了编码上述CAR的核酸。通过常规方法，利用特定CAR的氨基酸序列，可以制备编码CAR的核酸。利用前述各结构域的氨基酸序列的NCBI RefSeq ID或GenBenk登录号，可以获得编码氨基酸序列的碱基序列。本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学方法制备。例如，可以基于碱基序列合成核酸，并且可以通过使用聚合酶链反应(PCR)将从cDNA文库获得的DNA片段融合来制备本发明的核酸。
编码本发明的CAR的核酸可以插入载体中，并且可以将载体导入细胞。例如，可以使用病毒载体如逆转录病毒载体(包括致癌反转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自复制。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自我复制。
例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明的方法可以是通过基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列来选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒来进行。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86、GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高未转导效率的293细胞或293T细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞产生的多种逆转录病毒载体可广泛地从许多公司购得。
本发明提供经修饰以表达上述嵌合抗原受体融合蛋白的T细胞。本发明的CAR-T细胞通过CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞中，其结果是细胞被激活。表达CAR的细胞的激活，可根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放，细胞增殖率的提高，细胞表面分子的变化等类似指标来确认。
经修饰以表达CAR的T细胞可用作疾病的治疗剂。该治疗剂包含表达CAR的T细胞作为活性成分，还可包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。
发明人已经证明，FLAG标记的CD19特异性CAR-T细胞在体外和体内是高度有效的。在体外，CD19-FLAG CAR-T细胞扩增超过100倍，具有>70％的转导效率并且对CD19+而不对CD19-细胞具有高细胞毒性。在体内，CD19-FLAG CAR-T细胞对CD19+实体瘤和CD19+血液肿瘤均表现出实质性的抗肿瘤活性。体内功效与CAR-T细胞扩增，肿瘤细胞凋亡和动物存活率增加有关。这些结果证明了FLAG标记的CD19CAR-T细胞在实体瘤和血液癌症模型中的强大疗效，表明FLAG标记的CAR-T细胞可用于治疗人类恶性肿瘤。
发明人已经发现，尽管CD19-FLAG CAR-T细胞与未标记的CD19CAR-T细胞的体外细胞毒性相当，但相比CD19CAR-T细胞，CD19-FLAG CAR-T细胞产生较少的IFN-γ、IL-2和11-6。该结果表明，在体内，CD19-FLAG CAR-T细胞比CD19CAR-T细胞的毒性低，因为患者中CAR-T细胞引起的高水平细胞因子分泌经常导致细胞因子释放综合征(CRS)。
使用CD19-FLAG CAR-T细胞替代CD19CAR-T细胞可降低细胞因子水平，这在临床上是有利的，因为CRS的发病率降低。CD19-FLAG CAR-T细胞的细胞因子产生减少可以允许多种应用。
CD19-FLAG CAR-T细胞的使用还赋予了其它益处，因为FLAG标签可以在临床中用于施用CAR-T细胞后的成像，或预先用于CAR-T细胞分选，制造或其他应用。重要的是，FLAG标签在灵长类动物中不具有免疫原性(Rodino-Klapac等，2010，Mol Ther 18,109-117)，因此CD19-FLAG CAR-T细胞的使用不会在受试者中由于FLAG标记引起不良免疫反应。
以下实施例进一步说明本发明。下述实施例只是为了说明本发明，而不应被解释为是限制性的。
实施例
材料和方法
实施例1.细胞系
在免疫缺陷小鼠中，利用过表达CD19的宫颈癌HeLa细胞产生新的实体肿瘤异种移植模型。该模型允许我们在实体瘤微环境的背景下，研究血液癌症靶标及其相关抑制因子，例如免疫检查点途径(PD-1、CTLA-4、LAG-3)，血管生成/血管发生，缺氧和Treg细胞。例如，最近显示抑制PD-1增加CAR-T细胞的功效(Devaud等，2013，Clin Cancer Res 19,5636-5646)。
HeLa宫颈癌细胞购自ATCC(Manassas，VA)，并在含有10％FBS(AmCell，山景城，CA)的DMEM(GE医疗保健，芝加哥，IL)中培养。Raji Burkitt’s淋巴瘤细胞和K562细胞(CML白血病)购自ATCC，并在含有10％FBS的RPMI-1640培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中培养。通过Ficoll-Paque(GE医疗保健)的密度沉降分离人外周血单核细胞(PBMC)。HEK293FT细胞获赠自AlStem(里士满，CA)，并在含有10％FBS的DMEM中培养。在我们的实验室中，使用细胞特异性表面标记，通过流式细胞术验证所有细胞系。
实施例2.CAR构建体
将小鼠FMC63抗-CD19scFv(Kochenderfer等(2009)，I.Immunother，32：689-702)插入第二代CAR表达盒中，其含有来自GM-CSF的信号肽，来自CD28的铰链区、跨膜结构域和共刺激结构域，和CD3zeta激活结构域；此CAR在本文中称为CD 19CAR。将FLAG标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO：1)插入CD19CAR的scFv和铰链区之间；此CAR在本文中称为CD19-FLAG CAR。使用对胞内蛋白特异的scFv代替FMC63scFv；此CAR在本文中称为模拟CAR(mockCAR)。
实施例3.编码CAR的慢病毒的产生
合成编码CAR的DNA并将其亚克隆到Syno Biological(中国北京)的第三代慢病毒载体Lenti CMV-MCS-EF1a-puro中。对所有CAR慢病毒构建体进行双向测序以确认CAR序列并用于慢病毒生产。将1000万个生长停滞的HEK293FT细胞(Thermo Fisher)接种到T75烧瓶中并过夜培养，然后使用CalPhos转染试剂盒(Takara，山景城，CA)，以pPACKH1慢病毒载体包装混合物(System Biosciences，Palo Alto，CA)和10μg的各种慢病毒载体进行转染。第二天用新鲜培养基替换培养基，48小时后收集含有慢病毒的培养基。2100g离心30分钟，清除培养基中的细胞碎片。112,000g离心100分钟，收集病毒颗粒，悬浮于AIM V培养基中，等分并在-80℃下冷冻。根据制造商的方案，使用Lenti-X qRT-PCR试剂盒(Takara)和7900HT热循环仪(Thermo Fisher)，通过定量RT-PCR测定病毒制剂的滴度。慢病毒滴度>1×108pfu/ml
实施例4.CAR-T细胞的产生和扩增
将PBMC以1×10 6个细胞/ml悬浮于含有10％FBS和300U/ml IL-2(ThermoFisher)的AIM V-AlbuMAX培养基(Thermo Fisher)中，与相同数量(1：1比例)的CD3/CD28免疫磁珠(Thermo Fisher)混合，并在未处理的24孔板(每孔0.5ml)中培养。在24和48小时，将慢病毒以感染复数(MOI)5加入培养物中，同时加入1μl TransPlus转导增强子(AlStem)。随着T细胞在接下来的两周内增殖，每2-3天对细胞进行计数，向培养物中加入含有300U/mlIL-2的新鲜培养基，使细胞密度保持在1-3×10 6个细胞/ml。
实施例5.流式细胞术
为了检测CAR的表达，将50万个细胞悬浮于100μl缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中，并在冰上与1μl人血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)孵育10分钟。随后加入1μl别藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD3(eBioscience，San Diego，CA)，2μl 7-氨基放线菌素D(7-AAD，BioLegend，San Diego，CA)，以及2μl藻红蛋白(PE)标记的抗FLAG或2μl其同种型对照PE大鼠IgG2a(均来自BioLegend)，将细胞在冰上孵育30分钟。用3ml缓冲液冲洗细胞，然后悬浮在缓冲液中并在FACSCalibur(BD Biosciences)上捕获。首先分析细胞对7-AAD染色的光散射，然后标出(plotted)7-AAD-活门控细胞(live gated cells)，用于CD3染色对FLAG染色或同种型对照染色。对于小鼠肿瘤研究，用1μl APC抗CD3、2μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD8a(eBioscience)、2μl 7-AAD、以及2μl的PE抗FLAG或PE大鼠IgG2a，将100μl血液在室温下染色30分钟。用3.5ml RBC裂解液(150mM NH4Cl、10mM NaHCO3、1mM EDTA pH8)裂解红细胞，然后通过离心收集白细胞，并在收集前用2ml冷缓冲液漂洗。
实施例6.稳定的HeLa-CD19细胞系的产生
为了产生稳定表达人CD19的HeLa细胞，合成编码人CD19开放阅读框的DNA，并通过Syno Biological亚克隆到pCD510慢病毒载体(System Biosciences)中。如上所述制备包含载体的慢病毒。用MOI为5的慢病毒感染HeLa细胞，并在1μg/ml嘌呤霉素存在下培养以产生抗性细胞，本文称为HeLa-CD19。通过流式细胞术用CD19抗体(BioLegend)证实了CD19的表达。
实施例7.实时细胞毒性测定(RTCA)
将贴壁靶细胞(A1847或C30)以每孔1×10 4个细胞接种到96孔E-板(AceaBiosciences，San Diego，CA)中，并使用基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)iCELLigence系统(Acea Biosciences)在培养物中监测过夜。第二天，除去培养基并用含有10％FBS±1×105效应细胞(CAR-T细胞或未转导的T细胞)的AIM V-AlbuMAX培养基替换，重复三次。用RTCA系统再监测E-板中的细胞2-3天，并随时间绘制阻抗。计算细胞溶解为：(无效应细胞的靶细胞阻抗-有效应细胞的靶细胞阻抗)×100/无效应细胞的靶细胞阻抗。对于非贴壁靶细胞(Raji)，首先用抗CD40抗体(Acea Biosciences)包被E-板以结合CD40+Raji细胞。然后每孔接种1×10 4个Raji细胞，并如上所述进行RTCA测定。
实施例8.细胞因子分泌的测定
在U形底96孔板中，用200μl含有10％FBS的AIM V-AlbuMAX培养基，将靶细胞(Raji、KS62、HeLa或HeLa-CDI9)与效应细胞(CAR-T细胞或未转导的T细胞)以1：1的比例(各1×104个细胞)进行培养，重复三次。16小时后，将顶部的150μl培养基转移至V-底96孔板，并以300g离心5分钟以沉淀任何残留的细胞。将顶部的120μl上清液转移到新的96孔板中，并根据制造商的方案用来自Thermo Fisher的试剂盒，通过ELISA分析人IFN-γ和IL-2水平。
实施例9.小鼠肿瘤研究
严格按照动物保护和使用委员会的制度(IACUC)，对6周龄雄性NSG小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，ME)进行饲养和操作。在第0天，用100μl无菌PBS中的2×106HeLa-CD19细胞，对每只小鼠进行皮下注射。在一项研究中，在第19天(5×106个细胞)和第33天(9×106个细胞)，瘤内注射PBS中的CAR-T细胞，并分析肿瘤生长。在另一项研究中，在第8天和第14天(每天1×10 7个细胞)静脉内注射CAR-T细胞。用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并使用公式W2L/2测定肿瘤体积(以mm3计)，其中W是肿瘤宽度，L是肿瘤长度。切除肿瘤并在4％多聚甲醛中固定，然后包埋在石蜡中并通过免疫组织化学染色。静脉内CAR-T细胞研究结束时，收集100μl血液并通过如上所述的流式细胞术用不同抗体染色。对于Raji肿瘤模型，静脉内注射0.1mlPBS中的5×105荧光素酶表达的Raji细胞，并在第二天静脉内注射在0.2ml PBS中的5×10 6个CD19-FLAG CAR-T细胞。在第6天和第14天，用Xenogen IVIS光谱(PerkinElmer，沃尔瑟姆，MA)系统对小鼠成像，并通过测量每秒光子的生物发光来监测肿瘤生长。
实施例10.免疫组织化学(IHC)
将肿瘤组织切片(4μm)在二甲苯中脱蜡两次，持续10分钟，然后在梯度醇中水合并在PBS中漂洗。使用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)在高压锅中进行抗原修复20分钟。将切片冷却，用PBS漂洗，在3％H2O2溶液中孵育10分钟，并用PBS漂洗。将组织切片在山羊血清中孵育20分钟，然后与0.2μg/ml的兔抗裂解半胱天冬酶-3(Asp 175，细胞信号技术，Danvers，MA)或兔IgG(杰克逊免疫研究)4℃孵育过夜。将切片用PBS漂洗，与生物素缀合的山羊抗兔IgG孵育10分钟，用PBS漂洗，与链霉亲和素缀合的过氧化物酶孵育10分钟，并用PBS漂洗。最后，将切片在DAB基质溶液中孵育2-5分钟，浸入自来水中，用苏木精复染，用水冲洗，并在梯度醇和二甲苯中脱水。用甘油安装盖玻片。除注明试剂外，所有试剂均来自MaiXin.BIO(中国福州)。在Motic DMB5-2231PL显微镜上，使用Images Plus 2.0软件(Motic，厦门，中国)获得图像。为了定量裂解半胱天冬酶-3染色，用ImageJ软件(国立卫生研究院)分析来自各个肿瘤的六个随机显微镜视野。将每个图像分成RGB堆栈，然后测量高于任意阈值(80)的蓝色堆栈的区域。
结果
统计分析
用Prism软件(GraphPad，圣地亚哥，CA)分析数据并绘图。通过非配对Student's t检验进行两组之间的比较，并且通过单因素方差分析(one-way ANOV A)和Tukey’s事后分析(Tukey’s post-hoc test)进行三组之间的比较，除非另有说明。
实施例11.CAR构建体
构建人CD19特异性CAR，其包含FMC63鼠单链可变区片段(scFv)；来自人CD28的铰链，跨膜和共刺激结构域；和人CD3ζ的激活结构域(图2)。以相同的方式构建“模拟”CAR(“mock”CAR)，其具有对胞内蛋白特异的scFv，因而不与完整细胞反应(图2)。此外，将8-氨基酸的FLAG表位插入CD19特异性CAR的scFv和铰链区之间。
实施例12.CAR构建体的序列
实验中使用的CD19CAR和CD19-FLAG CAR构建体每个区段的氨基酸序列如下所示。每个区段可以用具有至少95％同一性的氨基酸序列替换。
<人GM-CSF信号肽>SEQ ID NO:2
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
FMC63抗-CD 19scFv ScFv(VL-接头-VH)
<VL>SEQ ID NO:3
Figure BDA0001822000330000111
<接头>SEQ ID NO:4
Figure BDA0001822000330000112
<VH>SEQ ID NO:5
Figure BDA0001822000330000113
在构建体中，在VH之后有三个氨基酸AAA
<Flag标签>如果存在，在VH之后，SEQ ID NO:5
DYKDDDDK
<CD28铰链>SEQ ID NO:6
Figure BDA0001822000330000114
<跨膜结构域TM28>SEQ ID NO:7
Figure BDA0001822000330000115
<共刺激结构域CD28>SEQ ID NO:8
Figure BDA0001822000330000116
<激活结构域CD3-zeta>SEQ ID NO:9
Figure BDA0001822000330000117
CD19-FLAG CAR的序列如SEQ ID NO:10所示，FLAG以加粗下划线显示
Figure BDA0001822000330000121
实施例13.CD19-FLAG CAR-T细胞体外扩增>100倍
将各个CAR的序列转移到慢病毒载体，巨细胞病毒即早期启动子(cytomegalovirus immediate-early promoter)的下游，并通过瞬时转染HEK293FT细胞产生CAR编码慢病毒颗粒。将病毒以MOI 5加入到活化的人T细胞中，然后将其与IL-2一起培养14天。在此期间，CAR-T细胞(Mock，CD19，CD19-FLAG)扩增超过100倍(图3)，表明FLAG标签不影响CAR-T细胞扩增。细胞的流式细胞术分析表明转导效率>70％(图4)。因此，CD19-FLAGCAR-T的体外扩增与CD19-CAR-T细胞类似。
实施例14.CD19-FLAG CAR-T细胞表现出强的CD19依赖性细胞溶解活性
使用两种人细胞系：内源表达CD19的B细胞系Raji和工程化过表达CD19的宫颈癌细胞系HeLa，检测CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞杀伤携带CD19的靶细胞的能力。利用实时细胞分析(RTCA)iCELLigence系统检测细胞溶解，该系统测定单层靶细胞随时间的阻抗；当靶细胞被效应细胞杀死时，阻抗降低。CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞对Raji细胞(图5左)和Hela-CD19+细胞(图5右)均表现出显著的细胞溶解活性，但对CD19-HeLa细胞则未表现出(图5中间)。相反，mock CAR-T细胞和未转导T细胞对任何靶细胞都没有表现出显著的细胞溶解活性，因此，CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞均表现出强的CD19依赖性细胞溶解活性。
实施例15.CD19-FLAG CAR-T细胞响应CD19+肿瘤细胞时分泌的IFN-γ，IL-2和IL-6少于CD19CAR-T细胞
对CAR-T细胞响应CD19+靶细胞时产生IFN-γ和IL-2的能力进行评估。相比与CD19-靶细胞(K562和HeLa)共培养，当与CD19+靶细胞(Raji和HeLa-CD19)共培养时，CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞均产生显著更高水平的IFN-γ(图6A-B)和IL-2(图6C-D)。此外，CD19-FLAG CAR-T细胞产生的IFN-γ和IL-2水平低于CD19CAR-T细胞。与此相反，mock CAR-T细胞和未转导T细胞与任何靶细胞系共培养时，均不产生显著水平的任一细胞因子。结果显示，CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞以CD19依赖性方式分泌IFN-γ和IL-2，且在CD19+细胞中，CD19-FLAG CAR-T产生的IFN-γ和IL-2显著少于CD19CAR-T。
图7显示相比CD19-CAR-T细胞，CD19-FLAG-CAR-T细胞针对Hela-CD19靶细胞的IL-6分泌减少。
实施例16.CD19-FLAG CAR-T和CD19CAR-T细胞在体内抑制CD19+实体瘤
为了测定CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞对体内实体瘤的作用，使用HeLa-CD19细胞系开发了新的异种移植肿瘤模型。在免疫缺陷的NSG小鼠的每侧皮下注射2×10 6个HeLa-CD19细胞，并监测肿瘤的大小36天。注射CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞的肿瘤(平均285mm3)显著小于注射未转导T细胞的对照肿瘤(平均935mm3)。
图8显示了用未转导T细胞处理的肿瘤和第19天用CD19CAR-T细胞以及第33天用CD19-FLAG CAR-T细胞处理的肿瘤的平均生长曲线。结果显示，瘤内注射CD19和CD19-FLAGCAR-T细胞显著抑制HeLa-CD19肿瘤生长。*：与未转导T细胞相比，CAR-T细胞的p<0.05，通过Student’s t检验确定，假设方差不等。
为了表征CD19-FLAG CAR-T细胞在HeLa-CD19实体瘤模型中的作用，进行了早期静脉内应用CD19-FLAG CAR-T细胞的第二项研究。在该研究中，CD19-FLAG CAR-T细胞几乎完全阻断肿瘤生长(图9A-B)，而对小鼠体重没有影响。此外，与来自两个对照组的肿瘤相比，CD19-FLAG组肿瘤的免疫组织化学分析显示，裂解半胱天冬酶-3的量增加(数据未显示)，表明肿瘤细胞被诱导凋亡。
此外，在研究结束时，在CD19-FLAG组中，外周血中人T细胞的频次为32.8±4.9％，而在未转导的T细胞组中仅为3.8±1.2％(图10A)。在人T细胞中，CD19-FLAG组中CD8+细胞与CD8-细胞的比例也高于未转导T细胞组(图10B)。因此，CD19-FLAG CAR-T细胞不仅显著阻断实体瘤生长，而且还在体内扩增以杀死癌细胞。
实施例17.CD19-FLAG CAR-T细胞在体内抑制CD19+血液癌症
为了分析CD19-FLAG CAR-T细胞对体内血液癌症的影响，给NSG小鼠注射荧光素酶+Raji细胞并使用IVIS体内成像。与PBS对照相比，CD19-FLAG细胞显著降低Raji肿瘤细胞负荷(图11A)且显著(p<0.05)延长小鼠的存活(图11B)。CD19-CAR-T细胞的效果类似(未显示)。
应理解，前文描述了本发明的优选实施例，并且可以在其中进行修改而不偏离如权利要求书中所阐述的本发明的范围。
序列表
<110> 普曼生物技术有限公司
湖南远泰生物技术有限公司
<120> FLAG 标记的CD19-CAR-T 细胞
<130> P2018-1562
<150> US 62/317,160
<151> 2016-04-01
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
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1 5 10 15
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
65 70 75 80
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Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
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1 5 10 15
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<210> 6
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 10
<211> 519
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Met Glu Thr Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Glu Thr Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
65 70 75 80
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro
145 150 155 160
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
165 170 175
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
180 185 190
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
195 200 205
Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn
210 215 220
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Glu Thr Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Glu Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Glu
275 280 285
Val Met Glu Thr Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
290 295 300
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
305 310 315 320
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
325 330 335
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
340 345 350
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Glu
355 360 365
Thr Asn Met Glu Thr Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
370 375 380
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
385 390 395 400
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
405 410 415
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Glu Thr Gly Gly
435 440 445
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
450 455 460
Lys Asp Lys Met Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Glu
465 470 475 480
Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
485 490 495
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Glu
500 505 510
Thr Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515

Claims (19)

1.嵌合抗原受体(CAR)-T细胞，其被修饰以表达CAR融合蛋白，所述的融合蛋白从N端至C端包含：
(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中所述的scFv具有抗肿瘤抗原CD19的活性；
(ii)跨膜结构域；
(iii)至少一个共刺激结构域；和
(iv)激活结构域；
其中，所述的融合蛋白还包含一FLAG标签，所述FLAG标签连接至scFv的C端，
并且所述的FLAG标签不会引起免疫原性并且可以降低细胞因子分泌水平，所述的FLAG标签的序列为DYKDDDDK，并且所述的细胞因子包括IFN-γ、IL-2和IL-6。
2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的肿瘤抗原是人分化簇19(CD19)。
3.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的跨膜结构域衍生自CD28或CD8。
4.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的共刺激结构域选自下组：CD28、4-1BB、ICOS-1、CD27、OX-40、DAP10和GITR。
5.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的共刺激结构域是CD28。
6.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的激活结构域是CD3-zeta。
7.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的跨膜结构域为跨膜结构域TM28，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
8.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的融合蛋白包含连接至ScFvN端的信号肽。
9.如权利要求8所述的CAR-T细胞，其中，所述的信号肽衍生自人CD8或GM-CSF。
10.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其中，所述的CAR融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。
11.一种CAR融合蛋白，其中，所述的融合蛋白从N端至C端包含：
(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中所述的scFv具有抗肿瘤抗原CD19的活性；
(ii)跨膜结构域；
(iii)至少一个共刺激结构域；和
(iv)激活结构域；
其中，所述的融合蛋白还包含一FLAG标签，所述FLAG标签连接至scFv的C端，
并且所述的FLAG标签不会引起免疫原性并且可以降低细胞因子分泌水平，所述的FLAG标签的序列为DYKDDDDK，并且所述的细胞因子包括IFN-γ、IL-2和IL-6。
12.一种核酸，其中，所述的核酸编码权利要求11所述的融合蛋白。
13.一种治疗剂，其中，所述的治疗剂包含权利要求1所述的CAR-T细胞作为活性成分。
14.如权利要求13所述的治疗剂，其中，所述的治疗剂还包含药学上可接受的赋形剂。
15.一种权利要求1所述的CAR-T细胞的用途，其中，用于制备一种治疗剂，所述的治疗剂用于治疗癌症的过继细胞治疗方法。
16.如权利要求15所述的用途，其中，所述癌症包括血液瘤和实体瘤。
17.如权利要求15所述的用途，其中，所述的方法包括给患有癌症的受试者施用权利要求1所述的CAR-T细胞的步骤，使得受试者相比施用CAR中没有FLAG标签的类似CAR-T细胞的受试者，由于输注CAR T细胞引起的细胞因子释放减少，其中，所述的细胞因子包括IFN-γ、IL-2和IL-6。
18.如权利要求15所述的用途，其中，所述的方法包括向患有癌症的受试者施用权利要求1所述的CAR-T细胞的步骤，使得受试者相比施用CAR中没有FLAG标签的类似CAR-T细胞的受试者，细胞因子释放综合征的发生率降低。
19.一种FLAG标签的用途，其中，所述FLAG标签用于施用权利要求1所述的CAR-T细胞后的成像，或用于权利要求1所述的CAR-T细胞分选，或用于权利要求1所述的CAR-T细胞制造。
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