TW201636425A

TW201636425A - 治療癌症之方法和組成物

Info

Publication number: TW201636425A
Application number: TW104140317A
Authority: TW
Inventors: 薩德哈克勝古塔; 普拉克許薩姆帕斯; 理查瓊漢斯
Original assignee: 羅傑威廉斯醫院
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2016-10-16
Also published as: EA201791210A1; HK1251862A1; CA2969714A1; EP3227317A1; PH12017501031A1; JP2017537622A; AR102879A1; AU2015355084A1; BR112017011771A2; WO2016089916A1; CN107709353A; EP3227317A4; US9650428B2; KR20180041087A; IL252610A0; SG11201704519YA; UY36418A; MX2017007272A; US20160151490A1; US20180072789A1

Abstract

本發明描述與免疫細胞相關之組成物及方法，該等免疫細胞表現與該IL13受體α-2(IL13Rα2)結合之嵌合抗原受體及O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)蛋白兩者。含有IL13嵌合抗原受體(IL13CAR)或其變異體及MGMT蛋白或其變異體之病毒顆粒係用於轉染免疫細胞(諸如T細胞)，藉以將IL13Rα2標靶活性及對化學治療劑替莫唑胺(temozolomide,TMZ)之抗性兩者授予該等經轉染之細胞。本發明所指述之組成物及方法可用於癌症治療，諸如治療高度惡性神經膠質瘤。

Description

治療癌症之方法和組成物

相關申請案的交互參照

本申請案主張美國臨時專利申請案號62/086,346(2014年12月2日提出申請)之優先權，其以參照方式整體納入本文。

序列表的交互參照

「序列表」係以純文字檔之形式隨附本申請案提出，該檔建立於2015年11月30日，檔名為「0962018010WOseqlist.txt」(69892位元)，其內容以參照方式整體納入本文。

本發明關於治療癌症之方法和組成物。

標靶免疫療法已成為惡性病的治療中具有前景的研究領域，近年來已獲得廣大關注(Carpentier and Meng,2006,Curr Opin Oncol,18(6)：631-636； Wainwright et al.,2012,Exp Opin Emerging Drugs；17(2)：181-202)。最廣為研究的標靶之一係介白素-13受體α2(IL13Rα2)(Thaci et al.,2014,Neuro-Oncol,16(10)：1304-1324)。IL13Rα2係介白素-13(IL13)之誘餌受器，其缺乏遍在IL13Rα1上所存在之傳訊鏈，因此防止任何由IL13所媒介之下游傳訊途徑(Arima et al.,2005,J Biol Chem,280(26)：24915-24922)。IL13Rα2之增加表現已被報導會促進神經膠質瘤及其他腫瘤模型中之腫瘤惡化。IL13Rα2表現係神經膠質瘤惡性程度及病患存活不佳之預後標誌(Brown et al.,2013,PLoS ONE,8(10)：Article ID e77769)。其在MG上之選擇性表現在幾乎二十年前被發現，從那時開始就成為治療標靶(Debinski et al.,1999,Clin Canc Res,5(5)：985-990)。

神經膠母細胞瘤係成人最常見的原發性腦瘤。在美國每年經診斷罹患惡性原發性腦瘤的18,000名病患中，有超過一半為多形性神經膠質母細胞瘤。多形性神經膠質母細胞瘤係退行性、高度細胞性腫瘤，其具有高增生指數、微血管增生及局部壞死。徵候及症狀取決於許多因素(腦中腫瘤之大小、生長速度、位置)，主要表現出頭痛、痙攣、神經性缺乏(neurological deficit)、心智狀態改變。多形性神經膠質母細胞瘤之預後維持不佳。對大部分病患而言，存活時間不到2年。

雖然現行對於神經膠母細胞瘤(GBM)之標準治療已獲得逐漸改善之存活，即手術、放射治療及化學治療的三重療法(Rolle et al.,2010,Neurosurgery Clin of North America,21(1)：201-214；Ashby and Ryken,2006,Neurosurgical focus,20(4)：E3)，但是大多數病患的預後仍維持不佳(Stupp et al,2009,Lancet Oncol,10(5)：459-466；Omuro and DeAngelis,2013,JAMA,310(17)：1842-1850)。治療GBM的主要限制在於腫瘤在腦中的位置，阻礙細胞毒性劑遞送穿越血腦障礙(Ashby and Ryken,2006,Neurosurgical Focus,20(4)：E3)，加上強烈免疫抑制環境(Rolle et al.,2012,Adv Exp Med Biol,746：53-76)及具化療抗性與放療抗性之神經膠質瘤起始細胞(Bao et al,2006,Nature,444(7120)：756-760；Frosina,Mol Canc Res,2009 7(7)：989-999)。因此，新穎策略係經不斷測試以改善病患存活、生活品質及整體結果。

因此，本發明描述更有效治療癌症之組成物及方法，其中該癌症的惡性細胞表現或過度表現IL13Rα2，包括腦癌。

在一態樣中，提供一種嵌合核酸序列，其中該嵌合核酸序列包含：編碼IL13嵌合抗原受體(IL13CAR)之第一核酸，該IL13CAR與IL1Rα2受體(IL13Rα2)結合，及編碼藥物抗性多肽之第二核酸，該藥物抗性多肽係O⁶-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)蛋白。

在一實施態樣中，該IL13CAR包含IL13Rα2之配體。在另一實施態樣中，該配體係IL13。在又另一實施態樣中，該配體係與IL13Rα2結合之IL13片段。在仍另一實施態樣中，該配體係與IL13Rα2選擇性結合之抗體可變結構域或其片段。

在一實施態樣中，該MGMT蛋白包含P140K取代。

在一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含：編碼該IL13CAR之第一核酸序列及編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列。

在一實施態樣中，編碼該IL13CAR之第一核酸序列係位於編碼該MGMT多肽之第二核酸序列之5’端。在一替代性實施態樣中，編碼該IL13CAR之第一核酸序列係位於編碼該MGMT多肽之第二核酸序列之3’端。

在一實施態樣中，編碼該IL13CAR之第一核酸序列自5’至3’方向包含：編碼IL13Rα2配體結構域之核酸序列、編碼跨膜(TM)結構域之核酸序列及編碼細胞質結構域之核酸序列，該細胞質結構域包含CD3 ζ傳訊結構域。在另一實施態樣中，該第一核酸序列另包含編碼絞鏈區之核酸序列，其中該絞鏈區位於該IL13配體結構域與該TM結構域之間。在仍另一實施態樣中，該第一核酸序列另包含編碼CD28共刺激結構域之核酸序列，其中該CD28共刺激結構域係位於該TM結構域與該CD3-ζ鏈之間。在仍另一實施態樣中，該第一核酸序列另包含編碼信號序列之核酸，其中該信號序列係位於該IL13Rα2配體結構域之N端。

在一實施態樣中，該絞鏈結構域係CD8絞鏈結構域。在另一實施態樣中，該CD8絞鏈結構域包含SEQ ID NO：27。

在一實施態樣中，該細胞質結構域另包含一或多種共刺激結構域。在一實施態樣中，該共刺激結構域係CD28共刺激結構域。在另一實施態樣中，該CD28共刺激結構域係位於該TM結構域與該CD3-ζ傳訊結構域之間。

在一實施態樣中，該細胞質結構域另包含一或多種選自OX-40共刺激結構域、HVEM共刺激結構域、41BB共刺激結構域、ICOS共刺激結構域、OX40共刺激結構域及CD27共刺激結構域之共刺激結構域。在一實施態樣中，該額外共刺激結構域係位於CD28共刺激結構域與CD3-ζ傳訊結構域之間。

在一實施態樣中，該信號序列係異源性信號序列。在另一實施態樣中，該信號序列係IL13信號序列或其變異體。在仍另一實施態樣中，該IL13信號序列包含SEQ ID NO：25。在又另一實施態樣中，編碼該信號序列之核酸序列包含SEQ ID NO：9。

在一實施態樣中，該IL13配體結合結構域包含該成熟IL13蛋白(SEQ ID NO：26)。在另一實施態樣中，該IL13配體結合結構域係由該成熟IL13之片段組成，其中該片段以大約和該成熟IL13蛋白(SEQ ID NO：26)相同之親和性與該IL13Rα2蛋白結合。

在一實施態樣中，編碼該IL13配體之核酸序列編碼選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37之多肽。在另一實施態樣中，編碼該成熟IL13多肽之核酸序列包含選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35之核酸序列。

在一實施態樣中，該第一核酸自5’至3’方向包含：編碼該IL13配體結構域之選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35之核酸；包含編碼該TM結構域之SEQ ID NO：14或其變異體之核酸；及包含編碼該CD3-ζ傳訊結構域之SEQ ID NO：18或其變異體之核酸。在另一實施態樣中，該第一核酸另包含編碼該IL13信號序列之SEQ ID NO：9或其變異體，其中該SEQ ID NO：9之序列係位於編碼該IL13配體結構域之核酸序列上游。在另一實施態樣中，該第一核酸另包含編碼該CD8絞鏈結構域之SEQ ID NO：12或其變異體。在仍另一實施態樣中，該第一核酸另包含編碼該CD28共刺激結構域之SEQ ID NO：16或其變異體之核酸。

在一實施態樣中，該第一核酸自5’至3’方向包含：編碼該傳訊結構域之SEQ ID NO：9或其變異體之核酸序列；編碼該IL13配體結構域之選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35之核酸；編碼該CD8絞鏈結構域之SEQ ID NO：12或其變異體之核酸序列；包含編碼該TM結構域之SEQ ID NO：14或其變異體之核酸；編碼該CD28共刺激結構域之SEQ ID NO：16或其變異體之核酸；及編碼該CD3-ζ傳訊結構域之SEQ ID NO：18或其變異體之核酸序列。

在一實施態樣中，編碼該CAR之第一核酸序列另包含編碼該成熟IL13配體與該CD8絞鏈結構域之間的連接子之核酸序列。在另一實施態樣中，編碼該成熟IL13配體與該CD8絞鏈結構域之間的連接子之核酸序列係由SEQ ID NO：11組成。

在一實施態樣中，編碼該CAR之第一核酸序列另包含編碼SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：14之間的連接子之核酸序列。在另一實施態樣中，編碼SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：14之間的連接子之核酸序列係由SEQ ID NO：13組成。

在一實施態樣中，編碼該CAR之第一核酸序列另包含編碼SEQ ID NO：14與SEQ ID NO：16之間的連接子之核酸序列。在另一實施態樣中，編碼SEQ ID NO：14與SEQ ID NO：16之間的連接子之核酸序列係由SEQ ID NO：15組成。

在一實施態樣中，編碼該CAR之第一核酸序列另包含編碼SEQ ID NO：16與SEQ ID NO：18之間的連接子之核酸序列。在另一實施態樣中，編碼SEQ ID NO：16與SEQ ID NO：18之間的連接子之核酸序列係由SEQ ID NO：17組成。

在一實施態樣中，編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列包含P140KMGMT(SEQ ID NO：22)。在另一實施態樣中，編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列包含編碼包含SEQ ID NO：33之蛋白之核酸序列。

在一實施態樣中，編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列包含選自G156A-MGMT(SEQ ID NO：38)、MGMT-2(SEQ ID NO：39)、MGMT-3(SEQ ID NO：40)及MGMT-5(SEQ ID NO：41)之胺基酸序列。在另一實施態樣中，編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列包含編碼包含G156A-MGMT(SEQ ID NO：38)、MGMT-2(SEQ ID NO：39)、MGMT-3(SEQ ID NO：40)及MGMT-5(SEQ ID NO：41)之蛋白的核酸序列。

在一實施態樣中，編碼該MGMT蛋白之第二核酸序列不包含SEQ ID NO：48。在另一實施態樣中，該第二核酸序列編碼不包含SEQ ID NO：49之MGMT蛋白。

在一實施態樣中，該嵌合核酸序列另包含編碼自我切割肽之核酸序列。在另一實施態樣中，編碼該自我切割肽之核酸序列包含SEQ ID NO：21。在仍另一實施態樣中，該自我切割肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。

在一實施態樣中，該嵌合核酸序列另包含Kozak序列。在另一實施態樣中，該Kozak序列包含SEQ ID NO：8。在仍另一實施態樣中，該Kozak序列係位於編碼該IL13CAR及該MGMT蛋白之核酸序列上游。在一實施態樣中，該嵌合核酸序列另包含在該Kozak序列上游之第一限制內核酸酶位點。在另一實施態樣中，在該Kozak序列上游之限制內核酸酶位點係由SEQ ID NO：7組成。在一實施態樣中，該嵌合核酸序列另包含在該編碼IL13CAR及MGMT蛋白之核酸序列下游的第二內核酸酶位點。

在一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含選自SEQ ID NO：1之核苷酸109至1836、SEQ ID NO：2之核苷酸109至1836及SEQ ID NO：3之核苷酸109至1836的核苷酸序列。在一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含選自SEQ ID NO：1之核苷酸13至1836、SEQ ID NO：2之核苷酸13至1836及SEQ ID NO：3之核苷酸13至1836的核苷酸序列。在一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含選自SEQ ID NO：1之核苷酸7至1842、SEQ ID NO：2之核苷酸7至1842及SEQ ID NO：3之核苷酸7至1842的核苷酸序列。在另一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3之核苷酸序列。

在一實施態樣中，該嵌合核酸序列包含編碼SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47之蛋白的核苷酸序列。

在一實施態樣中，該IL13Ra2受體配體係IL-13或其片段之變異體，其以相較於野生型IL13(SEQ ID NO：26)約5倍、10倍或100倍較小之親和性與IL13Rα2結合。在一替代性實施態樣中，該IL13Ra2受體配體係IL13或其片段之變異體，其以相較於野生型IL13(SEQ ID NO：26)約5倍、10倍或100倍較高之親和性與IL13Rα2結合。

在一實施態樣中，該IL13Ra2受體配體與野生型IL-13並不完全相同。在另一實施態樣中，IL13Ra2受體配體與SEQ ID NO：26並不完全相同。

在一實施態樣中，當經IL13-CAR-T轉染之細胞係經化學治療劑處理時，相較於經該化學治療劑處理但不表現該藥物抗性多肽之細胞，P140KMGMT蛋白有效增加試管內及/或活體內表現該藥物抗性多肽之細胞的存活性。

在另一態樣中，提供一種包含編碼如本文所述之IL13CAR及MGMT蛋白之核酸序列的載體。

在一實施態樣中，該載體包含編碼如本文所述之IL13CAR、自我切割肽及MGMT蛋白之單順反子核酸序列。在另一實施態樣中，該自我切割肽包含2A肽。

在一替代性實施態樣中，該載體包含編碼IL13CAR及MGMT蛋白之多順反子嵌合核酸序列。在另一實施態樣中，編碼該IL13CAR及該MGMT蛋白之多順反子嵌合核酸序列另包含位於編碼該IL13CAR之核酸序列與編碼該MGMT蛋白之核酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)。在仍另一實施態樣中，編碼該IL13CAR及該MGMT蛋白之多順反子嵌合核酸序列另包含位於編碼該IL13CAR之核酸序列與編碼該MGMT蛋白之核酸序列之間的啟動子。

在一實施態樣中，該載體係細菌質體載體。在另一實施態樣中，該載體係表現載體。

在一實施態樣中，該載體係病毒載體。在另一實施態樣中，該病毒載體係選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體。

在另一態樣中，提供一種經載體轉染之細胞，該載體包含編碼如本文所述之嵌合抗原受體(CAR)及藥物抗性多狀之嵌合核酸序列。

在一實施態樣中，該細胞係選自T細胞、NK細胞及NKT細胞。

在另一實施態樣中，提供一種重組多肽，該重組多肽自N端至C端方向包含如本文所述之與腫瘤抗原結合之配體、跨膜結構域及細胞質傳訊結構域。

在一實施態樣中，該自N端至C端方向包含與腫瘤抗原結合之配體、跨膜結構域及細胞質傳訊結構域之重組多肽另包含位於該CAR與藥物抗性多肽之間的自我切割肽，在另一實施態樣中，該藥物抗性多肽係位於該CAR之N端。在仍另一實施態樣中，該藥物抗性多肽係位於該CAR之C端。

在另一態樣中，提供一種包含經修飾MGMT多肽之重組多肽，該經修飾MGMT多肽增加暴露至TMZ之細胞的存活性，其中該細胞係經基因修飾以表現如本文所述之CAR且其中該細胞係經投予至經診斷罹患腦癌之病患。

在另一態樣中，提供一種組成物，該組成物包含：編碼如本文所述之CAR之第一核酸及編碼如本文所述之MGMT蛋白之第二核酸。

在一實施態樣中，該第一核酸編碼CAR蛋白，該CAR蛋白包含：如本文所述之IL13配體結構域、如本文所述之TM結構域及如本文所述之包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域。在另一實施態樣中，該第一核酸另編碼位於該CAR蛋白之IL13配體結合結構域上游的信號序列。在仍另一實施態樣中，該第一核酸另編碼如本文所述之絞鏈區，其中該絞鏈區係位於該CAR蛋白之IL13配體結構域與TM結構域之間。在又另一實施態樣中，該第一核酸另編碼CD28共刺激結構域，該CD28共刺激結構域係位於該TM結構域與該CD3-ζ傳訊結構域之間。在仍另一實施態樣中，該第一核酸另編碼額外共刺激結構域。在另一實施態樣中，該第一核酸另包含位於編碼該CAR蛋白之核酸上游的Kozak序列。

在一實施態樣中，該第二核酸編碼MGMT蛋白，該MGMT蛋白具有選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43之胺基酸序列。

在一實施態樣中，該MGMT蛋白不包含SEQ ID NO：49。

在一實施態樣中，該組成物包含嵌合核酸，該嵌合核酸包含該第一核酸及該第二核酸。

在一實施態樣中，該嵌合核酸另包含編碼如本文所述之自我切割連接子肽之核酸，其中該編碼自我切割連接子肽之核酸係位於該第一核酸與該第二核酸之間。

在一實施態樣中，該嵌合核酸另包含如本文所述之內部核糖體進入位點(IRES)，其中該IRES係位於該第一核酸與該第二核酸之間。

在一實施態樣中，該嵌合核酸係雙順反子建構體，該建構體包含在編碼該CAR蛋白之第一核酸上游的第一啟動子及編碼該MGMT蛋白之第二核酸上游之第二啟動子。

在一實施態樣中，該組成物包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼該CAR蛋白之第一核酸，且該第二載體包含編碼該MGMT蛋白之第二核酸。在另一實施態樣中，該第一及第二載體各為質體或表現載體。在又另一實施態樣中，該第一及第二載體各為反轉錄病毒顆粒。

在另一態樣中，提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含：編碼如本文所述之CAR之第一核酸及編碼如本文所述之MGMT蛋白之第二核酸。在一實施態樣中，該第一核酸編碼CAR蛋白，該CAR蛋白包含：如本文所述之IL13配體結構域、如本文所述之TM結構域及如本文所述之包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域。在另一實施態樣中，該第一核酸另編碼位於該CAR蛋白之IL13配體結合結構域上游的信號序列。在仍另一實施態樣中，該第一核酸另編碼如本文所述之絞鏈區，其中該絞鏈區係位於該CAR蛋白之IL13配體結構域與TM結構域之間。在又另一實施態樣中，該第一核酸另編碼CD28共刺激結構域，該CD28共刺激結構域係位於該TM結構域與該CD3-ζ傳訊結構域之間。在仍另一實施態樣中，該第一核酸另編碼額外共刺激結構域。在另一實施態樣中，該第一核酸另包含位於編碼該CAR蛋白之核酸上游的Kozak序列。

在一實施態樣中，該第二核酸編碼MGMT蛋白，該MGMT蛋白具有選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在另一實施態樣中，該MGMT蛋白不是SEQ ID NO：49。

在一實施態樣中，該宿主細胞包含嵌合核酸，該嵌合核酸包含該第一核酸及該第二核酸。

在一實施態樣中，該宿主細胞包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼該CAR蛋白之第一核酸，且該第二載體包含編碼該MGMT蛋白之第二核酸。在另一實施態樣中，該第一及第二載體各為如本文所述之質體或表現載體。在又另一實施態樣中，該第一及第二載體各為如本文所述之反轉錄病毒顆粒。

在另一態樣中，提供一種包含重組多肽之組成物，其中該重組多肽自N端至C端方向包含：如本文所述之信號序列、如本文所述之IL13配體、如本文所述之跨膜結構域、如本文所述之細胞質傳訊結構域、如本文所述之MGMT蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。在另一實施態樣中，該重組多肽另包含如本文所述之絞鏈結構域，其中該絞鏈結構域係位於該IL13配體結構域與該TM結構域之間。在仍另一實施態樣中，該重組多肽另包含如本文所述之自我切割肽，其中該自我切割肽係位於該細胞質傳訊結構域與該MGMT蛋白之間。

在一實施態樣中，該組成物係醫藥組成物。

在另一態樣中，提供一種治療經診斷罹患癌症個體之方法。

在一實施態樣中，該方法包含：自該個體獲得細胞、以一或多種編碼如本文所述之IL13CAR及如本文所述之MGMT蛋白的核酸轉導該細胞、將該細胞維持於其中該核酸係經該細胞表現之條件下、及對該病患投予治療有效數目之表現該等IL13CAR及MGMT蛋白之細胞。

在一實施態樣中，該導入該細胞中包含使用包含編碼該IL13CAR之核酸的第一載體及包含編碼該MGMT蛋白之核酸的第二載體。在另一實施態樣中，該導入該細胞中包含使用包含編碼該IL13CAR及該MGMT蛋白之核酸的載體。

在一實施態樣中，該細胞係經載體轉導，該載體包含如本文所述之IL13CAR-P140KMGMT嵌合建構體。

在一實施態樣中，該個體係哺乳動物。在另一實施態樣中，該哺乳動物係靈長動物、人或小鼠。

在一實施態樣中，該一或多種核酸係使用病毒載體導入該細胞，該病毒載體選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或彼等之組合。

在一實施態樣中，該細胞係T細胞。

在一實施態樣中，該T細胞係使用血漿清除術獲得。

在一實施態樣中，該個體經診斷罹患選自腦癌、乳癌、胰臟癌、頭頸癌、卵巢癌及結直腸癌之癌症。在另一實施態樣中，該癌症已經轉移。

在一實施態樣中，該個體經診斷罹患高度惡性神經膠質瘤。在另一實施態樣中，該個體經診斷罹患多形性神經膠質母細胞瘤(GMB)、退行性星狀細胞瘤或兒童神經膠質瘤。

在一實施態樣中，該腦癌係神經膠母細胞瘤。在另一實施態樣中，該腦癌係高度惡性星狀細胞瘤。

在一實施態樣中，該乳癌係基底樣乳癌。

在一實施態樣中，該方法另包含以一或多種化學治療劑治療該個體。在另一實施態樣中，該方法包含以替莫唑胺(temozolomide,TMZ)治療該個體。

在一實施態樣中，該一或多種化學治療劑係在對該個體投予該經修飾細胞劑量之前、期間及/或之後投予。

在一實施態樣中，該投予係顱內、髓內、皮內、皮下、局部或靜脈內。

在另一態樣中，提供一種用於產製表現如本文所述之IL13CAR-P140KMGMT建構體的細胞之方法，該方法包含：將編碼該IL13CAR-P140KMGMT嵌合蛋白之核酸序列導入該細胞、將該細胞維持於其中該IL13CAR-P140KMGMT嵌合蛋白係經該細胞表現之條件下。

在一實施態樣中，該細胞係哺乳動物細胞。在另一實施態樣中，該哺乳動物細胞係人細胞、靈長動物細胞或小鼠細胞。

在一實施態樣中，該細胞係T細胞。在另一實施態樣中，該細胞係自體細胞或人白血球抗原(HLA)相符細胞。

在一實施態樣中，該細胞係得自一或多個經診斷罹患腦癌或惡性病之個體。

在另一態樣中，提供一種包含該IL13CAR-P140KMGMT建構體之細胞族群。在另一實施態樣中，所提供的是該細胞族群中至少約50%、60%、70%、80%、90%或95%之細胞表現該IL13CAR-P140KMGMT建構體。

在一態樣中，本發明係關於(一或多種)經分離之核酸序列，該經分離之核酸序列編碼(具有；包含；基本上由下列組成；由下列組成)：嵌合抗原受體(CAR)，該CAR包含(基本上由下列組成；由下列組成)：表現一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一些態樣中，該CAR另表現一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種表現建構體，該表現建構體包含(基本上由下列組成；由下列組成)：一或多種編碼CAR之核酸序列，該CAR包含表現一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原(例如，癌抗原結合結構域)之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一些態樣中，該CAR另表現一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，該宿主細胞包含(基本上由下列組成；由下列組成)：含有一或多種編碼CAR之核酸序列的表現建構體，該CAR包含表現一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一些態樣中，該CAR另表現一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種產製表現CAR之細胞的方法，該CAR包含(基本上由下列組成；由下列組成)：包含一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一特定態樣中，該CAR另包含一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種CAR多肽，該CAR多肽包含(具有；基本上由下列組成；由下列組成)：包含一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一特定態樣中，該CAR多肽另包含一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種治療有治療需要之個體的腦癌之方法，該方法包含(基本上由下列組成；由下列組成)：投予一或多種表現CAR之T細胞，該CAR包含表現一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞受體。在一些態樣中，該CAR另表現一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

本發明亦關於包含本文所提供之組成物的醫藥組成物。

上述將可自下列本發明之例示實施態樣更具體的說明而顯見，如隨附圖式所繪示，其中類似標示符號係指不同視圖中的相同部分。圖式不需按比例繪製，而是在說明本發明之實施態樣時加以強調。

圖1A提供IL13 CAR-MGMT核酸建構體之示意圖。

圖1B提供包含IL13CAR之pMFG宿主質體的質體地圖。

圖2A提供IL13.E13KR109K CAR-2A-P140KMGMT之示意圖。

圖2B提供包含IL-13-CAR-2A-P140KMGMT之pMFG宿主質體的質體地圖。

圖3A至3B顯示經含有IL13CAR-2A-P140KMGMT建構體之病毒轉導的PG13細胞，在富集之前(圖3A)及富集之後(圖3B)的FACS分析。圖3C顯示IL13富集細胞中之MGMT過度表現亦藉由細胞溶解物之西方墨點分析測試。

圖4提供顯示經包含IL13CAR-2A-P140KMGMT建構體之反轉錄病毒轉導且暴露至TMZ的T細胞存活性之圖。

圖5A及5B顯示經如本文所述之IL13CAR-2A-MGMT建構體轉染之細胞中的IL2(圖5A)及IFNγ(圖5B)部分。

圖6顯示獲得腫瘤且經投予如本文所述之嵌合性建構體及/或化學治療劑之小鼠的存活性。

圖7A至7B提供IL13CAR-P140KMGMT建構體之嵌合核酸序列(圖7A；SEQ ID NO：1)及胺基酸序列(圖7B；SEQ ID NO：4)。

圖8A至8B提供IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT建構體之嵌合核酸序列(圖8A；SEQ ID NO：2)及胺基酸序列(圖8B；SEQ ID NO：5)。

圖9A至9B提供IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT建構體之嵌合核酸序列(圖9A；SEQ ID NO：3)及胺基酸序列(圖9B；SEQ ID NO：6)。

本文描述(一或多種)嵌合抗原受體(CAR)之產製，該等CAR包含經基因工程化修飾以表現對癌症之一或多種腫瘤抗原的一或多種配體(例如，抗體或其他對細胞表面蛋白之配體)之T細胞受體。具體而言，本文所述之CAR蛋白包括配體結合結構域，該配體結合結構域與癌細胞表面上表現之蛋白結合。較佳地，腫瘤抗原並不表現於非罹病或正常細胞之表面上，或以遠低於其在癌症或其他罹病細胞上之表現量的量表現於非罹病或正常細胞上。經修飾以表現該所產生之CAR的T細胞係藉由該CAR之新特異性而經重新導向，以攻擊表現該CAR所辨識之表面抗原(例如受體)的腫瘤。本文亦顯示該CAR可另包含一或多種可用於治療腦癌之額外劑(例如，克服腦癌細胞對治療之抗藥性的劑)。具體而言，本文所述之組成物及方法係經設計以治療其中的惡性細胞表現IL13α2受體(IL13Rα2)之腦癌。因此，本揭示係利用表現及展示IL13Rα2之配體，諸如細胞介素介白素13(IL13)或與IL13Rα2選擇性結合之抗體的可變結構域之CAR於本文中例示。IL13CAR係與O(6)-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)基因一起表現。在一實施態樣中，MGMT基因係經修飾以編碼授予或增強宿主細胞(例如T細胞)對替莫唑胺(TMZ，一種用於治療腦癌之化學治療劑)之抗性的蛋白。

在一較佳實施態樣中，IL13CAR包含其中位置13(相對於SEQ ID NO：26之編號)之麩胺酸係經突變成為酪胺酸之IL13。在一替代性較佳實施態樣中，IL13之位置13的麩胺酸係經突變成為離胺酸且位置109之精胺酸成為離胺酸(胺基酸位置13及109係相對於例如SEQ ID NO：26)。在一實施態樣中，IL13係經突變以使得位置109之胺基酸從精胺酸改變成離胺酸。

在一較佳實施態樣中，該經修飾之MGMT基因編碼在本文中稱為P140KMGMT(SEQ ID NO：33)之MGMT變異體，其保護IL13CAR-P140KMGMT表現性T細胞免受甲基化藥劑諸如TMZ治療所造成之細胞毒殺作用。

在一實施態樣中，該IL13CAR及P140KMGMT蛋白係自單順反子建構體表現，該單順反子建構體係經轉錄以產生編碼單一蛋白之單一轉錄物，該單一蛋白自N端至C端方向包含：IL13CAR、自我切割肽(2A)及P140KMGMT。在轉譯此融合蛋白之後，該自我切割肽之切割導致主要位於細胞核之P140KMGMT蛋白及IL13CAR，其中該IL13配體結構域係展示於該宿主細胞之表面。然而，應了解該等IL13CAR及P140KMGMT蛋白可自個別核酸表現。舉例來說，編碼該等IL12CAR及P140KMGMT蛋白之核酸可存在於分開載體中，該等分開載體接著經導入相同細胞中，或彼等可經選殖至單一載體為個別單順反子建構體(例如，各具有彼等自己的啟動子)。

在TMZ存在下，經IL13CAR-2A-P140KMGMT建構體轉導之T細胞的存活優於經不表現P140KMGMT之IL13CAR轉導的T細胞(例如，實例6；圖6)。因此，本文中亦揭示編碼CAR及藥物抗性多肽(MGMT蛋白)之核酸序列、一或多種核酸或包含該等核酸之反轉錄病毒載體、經該一或多種載體轉染或轉導之細胞，以及藉由在經基因修飾之T細胞中共表現經修飾之MGMT基因，以增進該經修飾之T細胞經暴露至化學治療劑諸如TMZ時之存活性的方法。

亦設想用於治療經診斷罹患癌症之個體的方法，其中該癌症包括表現IL13Rα2之細胞。舉例來說，腦癌諸如高度惡性神經膠質瘤及基底樣乳癌細胞相對於該相同組織的非罹病或非癌性細胞過度表現該IL13Rα2蛋白。所請求的組成物在當個體係經投予甲基化化學治療劑及經基因修飾之免疫細胞(例如T細胞)兩者時特別有用，該經基因修飾之免疫細胞表現IL13CAR及經修飾之MGMT基因兩者。此方法可減少治療時間且相較於僅以化學治療劑或經基因修飾T細胞治療之個體，可更快且更有效地達成神經膠質瘤消失。因此在一態樣中，本發明係關於(一或多種)經分離之核酸序列，該經分離之核酸序列編碼嵌合抗原受體(CAR)，以用於表現一或多種針對癌症之一或多種腫瘤抗原之配體(例如，抗體)的T細胞。在一些態樣中，該T細胞另表現一或多種可用於治療腦癌之額外劑。

定義

本文所使用之「嵌合抗原受體(CAR)」係指一種包含一或多個胞外癌抗原結合結構域、一或多個跨膜結構域及一或多個用於活化T細胞之細胞質傳訊結構域的分子，且其對於表現癌配體(例如癌抗原)之細胞具有特異性。當導入T細胞中時，CAR重新導向該T細胞之特異性。在一特定態樣中，CAR係表現為單一分子。

如本文中所使用，「癌抗原結合結構域」係指與一或多種由癌細胞所表現之抗原(一或多種癌抗原)結合之結構域。在一特定態樣中，癌抗原結合結構域係與癌抗原特異性(選擇性)結合且不與不是由非癌細胞(例如，正常細胞、健康細胞、野生型細胞)所表現之非特異性標靶結合之結合結構域。

各種癌抗原結合結構域可被使用，且可利用已知方法產製或自商業來源獲得。癌抗原結合結構域可為例如核酸、肽(蛋白)、抗體、有機分子、合成分子及類似物。該等癌抗原結合結構域可為例如衍生自庫(libraries)及/或獲自天然來源。

本文所使用之用語「IL13CAR」包含含有如本文所述或為該領域所熟知之IL13配體的CAR，IL13配體包括但不限於IL13之變異體(包括但不限於IL13之功能性片段(例如可與IL13Rα2結合之IL13的片段))，及其他IL13配體諸如與IL13Rα2選擇性結合之免疫球蛋白結構域。類似地，本文所使用之用語「MGMT」包含野生型MGMT及任何如本文所述或為該領域所熟知之MGMT變異體。

本文所使用之用於劑量或量的用語「治療有效」係指在投予至有需要之個體時，足以導致所欲活性之包含本發明之嵌合受體且另包含藥物抗性多肽之化合物或醫藥組成物(例如包含免疫細胞諸如T淋巴細胞及/或NK細胞之組成物)的量。在本發明之範疇中，用語「治療有效」係指足以延緩藉由本發明之方法所治療之疾患的表徵、停止該疾患之進展、緩解或緩和該疾患至少一種症狀的化合物或醫藥組成物之量。應注意當活性成分之組合係經投予時，該組合之有效量可能包括或不包括各成分單獨投予時之有效量。

與本發明之組成物一起使用之用語「醫藥上可接受」係指該等組成物之分子實體及其他成分為生理上可耐受且當投予至哺乳動物(例如人)通常不會產生非所欲之反應。較佳地，本文中所使用之用語「醫藥上可接受」係指由美國聯邦主管機關或州政府核准，或列於美國藥典或其他公認藥典可供用於哺乳動物及特別是人。

此處之用語「個體」係指任何哺乳動物。在較佳之實施態樣中，該個體係人。

在其他態樣中，該癌抗原結合結構域係抗體之全部或生物活性部分。此處所使用之用語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，即包含與抗原選擇性結合之抗原結合部位之分子。如本文中所使用，「選擇性結合」係指抗體可與樣本中之抗原或其片段結合，且無法與其他分子(例如抗原)實質上結合之能力。免疫球蛋白分子之免疫活性部分之實例包括Fab片段(例如F(ab)、F(ab’)₂)、可變片段(例如單鏈可變 (scFv)、雙scFv、單結構域抗體片段(sdAb)、雙特異性片段(例如雙特異性T細胞接合劑(BiTE))。該等片段可自商業來源及/或藉由產製獲得，例如以酶諸如胃蛋白酶處理抗體。

該抗體可為與一或多種由癌細胞表現之抗原結合(例如選擇性結合)之多株或單株抗體。如本文中所使用，「多株抗體」係來自與特定抗原結合且各自辨識不同表位之抗體集合中的抗體。如本文中所使用，「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指僅包含一種能夠與一或多種抗原之特定表位免疫反應之抗原結合部位物種的抗體分子族群。單株抗體組成物因此通常展示對於特定抗原之單一結合親和性，該特定抗原與其起免疫反應。

多株抗體可如上述藉由以一或多種所欲癌抗原諸如IL13Rα2蛋白之胞外域免疫適當個體來製備。經免疫個體中之抗體力價可藉由標準技術在不同時間監測，諸如使用固定多肽之酶連接免疫吸附測定(ELISA)。若為所欲，可自哺乳動物(例如自組織、血液)分離以癌抗原為目標之抗體分子，且藉由廣為週知之技術進一步純化，諸如進行蛋白A層析以獲得IgG部分。該領域之一般技藝人士將能製備與IL13Rα2蛋白之胞外域選擇性結合之多株抗體。

在免疫後之適當時間，例如當抗體力價為最高時，可自該個體獲得抗體產製細胞，且藉由標準技術用於製備單株抗體，諸如最初由Kohler and Milstein,Nature 256：495-497(1975)描述之雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor et al.,Immunol.Today 4：72(1983))、EBV雜交瘤技術(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))或三源雜交瘤技術。用於產製雜交瘤之技術係廣為週知(一般見Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,(eds.)John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY(1994))。簡言之，永生化細胞系(通常為骨髓瘤)係與來自經上述免疫原免疫之哺乳動物的淋巴細胞(通常為脾細胞)融合，所得雜交瘤細胞之培養上清液係經篩選，以識別出產製與本發明之多肽結合之單株抗體的雜交瘤。

許多用於融合淋巴細胞與永生化細胞系之廣為週知方法中的任一者可被使用，以達產製對抗癌抗原之單株抗體的目的(見例如Current Protocols in Immunology,supra；Galfre et al.,Nature,266：55052(1977)；R.H.Kenneth,in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses,Plenum Publishing Corp.,New York,New York(1980)；and Lerner,Yale J.Biol.Med.54：387-402(1981))。另外，該領域之一般技藝人士將理解該等方法的許多變異亦可被使用。

在製備單株抗體分泌雜交瘤之一替代方法中，藉由用多肽篩選重組組合式免疫球蛋白庫(例如抗體噬菌體展示庫)，以分離與癌抗原結合之免疫球蛋白庫成員，可識別及分離出抗該癌抗原之單株抗體。用於產製及篩選噬菌體展示庫之套組可自市面購得(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄編號27-9400-01；及Stratagene SurfZAP^TM噬菌體展示套組，目錄編號240612)。此外，特別適合用於產製及篩選抗體展示庫之方法及試劑實例可見於例如美國專利第5,223,409號；PCT公開號WO 92/18619；PCT公開號WO 91/17271；PCT公開號WO 92/20791；PCT公開號WO 92/15679；PCT公開號WO 93/01288；PCT公開號WO 92/01047；PCT公開號WO 92/09690；PCT公開號WO 90/02809；Fuchs et al.,Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay et al.,Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85(1992)；Huse et al.,Science 246：1275-1281(1989)；及Griffiths et al.,EMBO J.12：725-734(1993)。

此外，可利用標準重組DNA技術製備之重組抗體，諸如包含人及非人部分二者之嵌合及人化單株抗體，係屬於本發明之範疇。該等嵌合及人化單株抗體可利用該領域已知之重組DNA技術產製。

任何上述之產製多株抗體或單株抗體的例行方法可被輕易應用於產製與IL13Rα2蛋白之胞外域選擇性結合之單株抗體之方法。所得抗體之可變結構域或其片段接著可被用於產製IL13配體結構域，該IL13配體結構域以大約相同於IL13配體結構域(SEQ ID NO：26)結合IL13Rα2蛋白之親和性的親和性與IL13Rα2蛋白結合。

本發明之建構體

本發明至少一部分係基於表現對IL13Rα2具有特異性之CAR的免疫細胞，其中該細胞對化學治療劑諸如TMZ具有抗性。

在某些實施態樣中，本發明提供編碼對腦癌細胞具選擇性之CAR蛋白及藥物抗性多肽兩者的核酸(在本文中亦稱為嵌合核酸序列)。在較佳之實施態樣中，該CAR蛋白係IL13CAR且該藥物抗性多肽係MGMT蛋白，該MGMT蛋白能夠授予TMZ抗性給表現其之細胞。嵌合核酸序列可如本文所述之建構，以編碼IL13CAR蛋白及MGMT藥物抗性蛋白兩者。以下提供對於該IL13CAR蛋白及該MGMT蛋白之結構域或序列區域的說明，及各結構域或區域的非限制性實例。IL13CAR蛋白係一種線性嵌合(融合)蛋白，其自N端至C端方向包含：與罹病細胞諸如腦癌細胞上之IL13R2α選擇性結合之IL13配體結構域、跨膜結構域、及胞內傳訊結構域。在某些實施態樣中，本文所述之IL13CAR蛋白可包含位於該IL13配體結構域之N端的信號結構域，及/或位於該配體結構域與該跨膜結構域之間的絞鏈區。

在某些實施態樣中，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之短肽連接子係包括於該IL13CAR中，以分開該CAR蛋白之區域或結構域(例如信號序列、IL13配體結構域、絞鏈區、跨膜結構域、 CD28共刺激結構域、CD3-ζ傳訊結構域、或額外的共刺激結構域)。應了解該短肽連接子可存在於任二個區域(結構域)之間，且與任二個其他區域(結構域)之間存在或不存在短肽連接子無關。舉例來說，小型肽連接子可存在於CAR中，其中該連接子分開該信號序列(若存在的話)與該IL13配體結構域、該IL13配體結構域與該跨膜結構域、該IL13配體結構域與該絞鏈區(若存在的話)、該絞鏈區(若存在的話)與該跨膜結構域、該跨膜結構域與該CD28共刺激結構域(若存在的話)、該CD28共刺激結構域(若存在的話)與該CD3-ζ傳訊結構域、該跨膜結構域與該CD3 ζ傳訊結構域、及/或該CD3-ζ傳訊結構域與該額外的共刺激結構域(若存在的話)。該等肽連接子可為由包含限制內核酸酶位點或其他特徵之核酸序列所編碼的胺基酸，該其他特徵允許編碼IL13CAR-自我切割肽-MGMT嵌合蛋白之各個區域或各個結構域(若為單順反子建構體)的核酸得以接合。這些結構域及連接子之各者係如下更詳細地說明。

在一態樣中，該癌抗原結合結構域係肽或蛋白(例如，與癌細胞表面上所表現之抗原結合之配體；與癌細胞表面上所表現之受體結合之配體)。在較佳之實施態樣中，該受體係IL132α受體且該CAR係經建構以包含與該IL132α受體選擇性結合之配體。在一特定態樣中，該癌抗原結合結構域係介白素13(IL13)或具有一或多個插入、刪除或點突變之IL-13變異體(例如E13K IL13；R109K IL13；及/或E13Y IL13)。該癌抗原結合結構域可替代性地為抗體之可變結構域其與IL13Rα2選擇性結合之片段，諸如scFv片段。

下表1及2分別提供本文所述之核酸及多肽之摘要，彼等可用於本發明之組成物(例如，嵌合核酸序列)及方法中。在一實施態樣中，本發明包括包含表1所示之核酸序列的任何組合之嵌合核酸序列。在一實施態樣中，本發明包括編碼表2所示之胺基酸序列的任何組合之嵌合核酸序列。

配體

IL13CAR配體(或稱為配體結構域)係與罹病細胞所表現之IL13受體例如IL13Rα2選擇性結合之肽、多肽或蛋白。罹病細胞可為腫瘤細胞或其他癌性或惡性細胞，且由罹病細胞表現之蛋白在本文中選擇性地稱為癌抗原。在一些實施態樣中，癌抗原係一種不會由或很少(少於50%、40%、30%、20%或10%，如mRNA表現分析)由健康組織細胞表現之蛋白。在一實施態樣中，罹病細胞係腦癌細胞諸如神經膠母細胞瘤細胞。在一特定態樣中，癌抗原結合結構域係與IL-13R(例如，IL13Rα2，例如GenBank編號NP_000631；SEQ ID NO：44)結合(例如，特異性或選擇性結合)之抗體的全部或其生物活性部分。在其他態樣中，配體(癌抗原結合結構域)係靶向(結合至；特異性或選擇性結合至)IL-13R(例如，IL13Rα2)之scFv。

各種由癌症(例如腫瘤)細胞表現之抗原係該領域已知。在一態樣中，癌抗原係例如表現在腫瘤表面上之腦腫瘤抗原。在一特定態樣中，腦腫瘤抗原係由高度惡性神經膠質瘤表現(例如神經膠質瘤/惡性腦腫瘤抗原)。高度惡性神經膠質瘤之具體實例包括多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)、退行性星狀細胞瘤及兒童神經膠質瘤。由高度惡性神經膠質瘤之腫瘤細胞所表現之抗原的具體實例包括EGFRvIII、EphA2、Her-2及IL-13R(例如 IL13Rα2)。

在一態樣中，由本發明之方法及所組成物所靶向之癌抗原係IL13受體α-2(IL13Rα2)，其係過度表現於多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)腫瘤上，但很少或不表現於正常腦組織中之GBM相關蛋白(Thaci et al.,Neuro-Onco,16(10)：1304-1312(2014)；Sengupta et al.,Biomed Res Int,2014：952128(2014))。在一態樣中，IL13CAR所表現或包含之配體結構域係與IL13α2受體結合之IL13及/或IL13突變，諸如E13K IL13(SEQ ID NO：36)及/或R109K IL13(SEQ ID NO：37)(Kong et al.,Clin Cancer Res,18(21)：5949-5960(2012))。研究亦發現IL13Rα2蛋白在乳癌包括乳癌轉移(Papageorgis et al.,2015,Breast Canc Res,17：98-112)及頭頸癌(Joshi et al.,2000,Cancer Res,60：1168-1172；Kawakami et al,2003,9：6381-6388)中係經上調，且亦促進胰癌、卵巢癌及結直腸癌之侵犯及轉移(Fujisawa et al.,2009,Int J Cancer,69：8678-8695；Barderas et al.,2012,Cancer Res,72：2780-2790)。因此，本文所述之組成物及方法可用於治療經診斷罹患惡性病之個體之方法中，其中惡性病之種類包括但不限於腦癌、頭頸癌、乳癌、胰癌、卵巢癌及結直腸癌。

該領域之一般技藝人士可產製與IL13Rα2特異性結合之配體。舉例來說，進行例行實驗以產製與IL13Rα2選擇性結合之抗體，諸如經由使用IL13Rα2之胞外域來免疫小鼠或使用噬菌體展示技術。具有所欲選擇性結合活性之抗體的可變結構域接著可被用來生產單鏈可變結構域(scFv)。在一實施態樣中，以和野生型IL13、IL13(E13Y)、IL13(R109K)或IL13(E13K.R109K)相同之親和性與IL13Rα2選擇性結合之scFv，可用來作為如本文所揭示之IL13CAR建構體中之配體。

在一實施態樣中，該IL13CAR具有IL13配體結構域，其包含與SEQ ID NO：26具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之IL13多肽，或其功能性片段，其中：a)SEQ ID NO：26之位置13的胺基酸係麩胺酸；b)SEQ ID NO：26之位置13的胺基酸係酪胺酸；或c)SEQ ID NO：26之位置13的胺基酸係離胺酸且SEQ ID NO：26之位置109的胺基酸係精胺酸。在一實施態樣中，該IL13CAR IL13配體結構域包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：37、或其功能性片段。

本發明之核酸編碼如上述之IL13多肽。在一實施態樣中，編碼該IL13多肽之核酸係選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35。

該IL13CAR可任意選擇地另包含信號(前導)肽，其允許該IL13CAR蛋白在宿主細胞表面上被處理及展示。在一實施態樣中，該信號肽係該配體蛋白之天然發生信號肽。舉例來說，該配體結構域包含包括其信號序列之全長IL13蛋白(信號序列包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列或係由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成)。在一實施態樣中，該信號序列包含與SEQ ID NO：25具有95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列。本發明之核酸編碼該信號肽。在一實施態樣中，編碼該信號肽之核酸係由SEQ ID NO：9組成。

該領域之一般技藝人士了解可使用異源性信號序列，即來自非IL13之分泌性或跨膜蛋白之信號肽。信號肽(信號序列)係膜結合性或分泌性多肽不可或缺之部分，其為多肽之膜轉位所需，且其在膜轉位後或膜轉位期間被處理。信號序列具有約13及36個胺基酸之長度，且含有至少一個胺基端正電性殘基。信號序列之中心係10至15個殘基之強疏水性部分，且係描述於例如Nunnari,j.,et al.,Curr.Opin.Cell Biol.4(1992)573-580及Gilmore,R.,et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.674(1992)27-37。信號肽之一些實例包括但不限於VHCAMP、CD40、CD40L或TNF-R之信號肽。信號肽在整合至目標細胞之細胞膜中時係經切割脫離。亦考慮的是可使用異源性信號序列，諸如IgG樣蛋白之信號序列。

絞鏈區

如本文所揭示之IL13CAR可包含間隔子區(又稱為絞鏈區或絞鏈域)，其係位於該IL13配體結構域(抗原結合結構域)與該跨膜結構域之間。本發明所涵蓋之IL13CAR可包含或不包含絞鏈區。本文所述之CAR 的絞鏈區係肽序列，其通常可彎折到足以允許抗原結合結構域朝向不同方向以促進抗原辨識。如同該領域之技藝人士所了解的，可決定使用其他適當之間隔子。舉例來說，短寡肽或多肽連接子(例如介於2至10個胺基酸長度)可形成該CAR之跨膜結構域與細胞質區之間的鍵接。絞鏈區之實例係來自免疫球蛋白之絞鏈區(例如IgG1之絞鏈區)，包括但不限於來自免疫球蛋白樣蛋白或結構域之絞鏈區、免疫球蛋白之CH2CH3區、及CD3之部分。在一實施態樣中，該絞鏈區包含來自CD8 α鏈之Ig樣結構域。

在一實施態樣中，該絞鏈區包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或係由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成。或者，該絞鏈區包含與SEQ ID NO：27具有95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列或係由與SEQ ID NO：27具有95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列組成。本發明之核酸編碼該絞鏈區。在一實施態樣中，編碼該絞鏈區之核酸包含SEQ ID NO：12。在一實施態樣中，編碼該IL13CAR之核酸包含與SEQ ID NO：12具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之核酸。

跨膜結構域

如本文所述，該CAR包含一或多種跨膜結構域。一般而言，該跨膜結構域係橫跨細胞膜之疏水性區 (例如疏水性α螺旋)。任何各種跨膜結構域皆可使用。適當跨膜結構域之實例包括但不限於CD3(例如CD3-ζ跨膜結構域)或CD28跨膜結構域。該跨膜結構域可衍生自天然或重組來源。當來源係天然時，該結構域可衍生自任何膜結合性或跨膜蛋白。在一態樣中，只要該CAR與目標結合，該跨膜結構域即可傳訊至胞內結構域。本發明中具有特定用途之跨膜結構域可包括例如T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154之至少跨膜區。

在一實施態樣中，該IL13CAR之跨膜結構域包含人CD3 ζ鏈之至少一部分或係由人CD3 ζ鏈之至少一部分組成例如SEQ ID NO：28。在一實施態樣中，該跨膜結構域包含與SEQ ID NO：28具有95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列或係由與SEQ ID NO：28具有95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列組成。本發明之核酸編碼該跨膜結構域。在一實施態樣中，編碼該跨膜結構域之核酸包含SEQ ID NO：14，或與SEQ ID NO：14具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之核酸。

細胞質傳訊結構域

如本文所述，該IL13CAR具有細胞質結構域，其在抗原結合後傳遞活化及/或刺激信號至T細胞 (例如導致T細胞之活化、起始、擴張、留存(persistence)及/或擴增以及對抗腫瘤抗原之T細胞反應(例如細胞毒性所需之信號))。細胞質結構域包含T細胞受體之一或多種傳訊結構域(例如共刺激結構域)及/或一或多種活化結構域，或與T細胞受體有關之一或多種傳訊結構域(例如共刺激結構域)及/或一或多種活化結構域。適當細胞質傳訊結構域之實例包括但不限於CD3-ζ(CD3-zeta)(其包含免疫受體酪胺酸基底活化模體(ITAM))、FcεRIγ、CD28(例如嵌合性CD28)、4-IBB(CD137)、DAP10、OX40(CD134)、CD4、CD27、CD244、誘導性T細胞共刺激子(ICOS)、白血球C端SRC激酶(LCK)、及CD137(例如Sadelain et al.,Cancer Discov,3(4)：388-398(2013)；Lee et al.,Clin Cancer Res,18(10)：2780-2790(2012))。該一或多種這些細胞質結構域之存在可藉由ZAP70、TNF受體相關因子1(TRAF1)、PI3K及生長因子受體結合蛋白2(GRB2)與CAR之細胞質結構域中之元件的相連來起始途徑，導致引發傳訊中間物及基因轉錄。

「共刺激結構域」或「共刺激傳訊結構域」係指包含共刺激分子之胞內結構域之CAR部分。共刺激分子係非抗原受體或Fc受體之細胞表面分子，其提供T淋巴細胞與抗原結合時有效活化及功能所需的第二信號。共刺激結構域經歷構形變化，導致活化信號經由例如CD3-ζ傳訊結構域至細胞。共刺激配體可包括但不限於 CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M 1CB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、與Toll配體受體結合之協同劑或抗體以及與B7-H3特異性結合之配體。在IL13CAR內包括一或多種共刺激結構域可增進表現IL13CAR之T細胞的療效及擴張。在一實施態樣中，共刺激結構域亦包含尤其是與存在T細胞上之共刺激分子特異性結合之抗體，諸如但不限於CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配體。

如該領域之技藝人士所顯而易見的，該IL13CAR可具有任何數量之活化結構域及/或刺激結構域各傳訊結構域係經由肽鍵連接以形成IL13CAR建構體之細胞質結構域。在一態樣中，該IL13CAR具有活化結構域及刺激結構域。在另一態樣中，該IL13CAR具有一、二、三、四、五、等個活化結構域及一、二、三、四、五、等個刺激結構域。

在一實施態樣中，本發明之IL13CAR包含人CD28蛋白及/或人CD3-ζ鏈之傳訊結構域。在一實施態樣中，IL13CAR包含CD28及CD3-ζ鏈傳訊結構域兩者，其中該CD28共刺激結構域係位於該CD3-ζ傳訊結構域之 N端。亦考慮的是其中該CD3-ζ結構域係位於該CD28共刺激結構域之N端之CAR細胞質結構域。如本文所述，該CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO：29之序列。該CD3-ζ傳訊結構域包含SEQ ID NO：30之序列或係由SEQ ID NO：30之序列組成。本發明之核酸編碼該CD28共刺激結構域。在一實施態樣中，編碼該CD28共刺激結構域之核酸係由SEQ ID NO：16組成。本發明之核酸編碼該CD3-ζ傳訊結構域。在一實施態樣中，編碼該CD3-ζ傳訊結構域之核酸係由SEQ ID NO：18組成。這些傳訊結構域中之各者可包含一或多個刪除、插入、或點突變(天然或人工)，其中各結構域之傳訊功能係與不包含該一或多個刪除、插入、或點突變之蛋白的傳訊功能大約相同。

在一實施態樣中，該IL13CAR之細胞質結構域係由包含SEQ ID NO：1之核苷酸673至1140或SEQ ID NO：1之核苷酸673至1143的核酸序列編碼。在另一實施態樣中，該IL13CAR包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸殘基221至376的細胞質結構域。

圖1A說明IL13CAR建構體之一實施態樣，其中該IL13配體係含有E13K及R109K取代之變異體。

藥物抗性多肽

本發明至少部分係關於編碼如上詳述之對腦癌細胞具選擇性之CAR蛋白及藥物抗性多肽兩者之核酸，其中該CAR及該藥物抗性多肽兩者之表現可用於治療癌症。舉例來說，該CAR及藥物抗性多肽可在經投予至個體的細胞中表現，該個體係經化學治療劑及/或增強化學治療劑之細胞毒殺性的藥劑治療。化學治療劑之實例包括經常用於治療惡性神經膠質瘤(例如多形性神經膠質母細胞瘤(GBM))之1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU或卡氮芥(carmustine))、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、及替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)。一些化學治療劑之細胞毒性作用涉及形成O⁶-甲基鳥嘌呤病灶，其可重新排列以形成致死性股內交聯。然而，這些甲基化劑之有效性受限於腫瘤過度表現DNA修復蛋白O⁶-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)，這是一種將細胞毒性O⁶-烷基鳥嘌呤加成物自經處理細胞之DNA移除的蛋白。表現高量MGMT之腫瘤細胞因此部分地或完全地對TMZ化學療法之殺滅作用有抗性。一種防止甲基化劑療效減少之手段係以MGMT抑制劑特別是O⁶-苄基鳥嘌呤治療接受TMZ化學療法之個體。然而，O⁶-苄基鳥嘌呤之投藥因為其對造血細胞的毒性效應而受限。

替莫唑胺(TMZ)係抗神經膠質瘤化學治療藥物，其具有對造血細胞包括T細胞的細胞毒性效應。如FDA所指示且因此為抗神經膠質瘤治療中不可避免的步驟，TMZ之標準劑量藉由甲基化T細胞之DNA而殺死彼等，其作用方式非常類似於TMZ摧毀腫瘤細胞之方式 (Sengupta et al.,Clin Dev Immunol,831090(2012))。然而，研究顯示細胞中過度表現野生型MGMT或表現一或多種MGMT突變(例如G156A；P140K)將授予該細胞對抗甲基化劑諸如TMZ之保護(Woolford et al.,J Gene Med,8(1)：29-31(2006))。因此，由上述核酸編碼之藥物抗性多肽係MGMT或授予對TMZ之抗性的MGMT變異體。這些TMZ抗性變異體包括但不限於P140K-MGMT(SEQ ID NO：33)、P140K-MGMT(SEQ ID NO：43)、G156A-MGMT(SEQ ID NO：38)、MGMT-2(SEQ ID NO：39)、MGMT-3(SEQ ID NO：40)及MGMT-5(SEQ ID NO：41)(Fontes et al.,Mol Cancer Ther,5(1)：121-128)。本文通篇中所指示之MGMT變異體中胺基酸取代的位置(position)(位置(location))(例如P140K及G156A)係基於SEQ ID NO：33之序列的胺基酸位置。MGMT-2變異體具有下列取代：S152H、A154G、Y158H、G160S及L162V。MGMT-3變異體具有下列取代：C150Y、A154G、Y158F、L162P及K165R。MGMT-5變異體具有下列取代：N157T、Y158H及A170S。

特別較佳地用於本文所揭示及使用之建構體的是P140K-MGMT變異體。本發明之核酸編碼該MGMT變異體。在一實施態樣中，編碼P140K-MGMT之核酸係由SEQ ID NO：22組成。亦考慮的是編碼G156A-MGMT(SEQ ID NO：38)、MGMT-2(SEQ ID NO：39)、 MGMT-3(SEQ ID NO：40)或MGMT-5(SEQ ID NO：41)之核酸，彼等之各者可存在於IL13CAR-MGMT建構體中。亦考慮的是包含SEQ ID NO：43(GenBank編號NP_002403，具有P140K點突變)及任何對應G156A-MGMT(SEQ ID NO：38)、MGMT-2(SEQ ID NO：39)、MGMT-3(SEQ ID NO：40)或MGMT-5(SEQ ID NO：41)之突變的點突變之MGMT蛋白序列。

由本文所揭示之嵌合核酸序列編碼之MGMT或其變異體可位於該編碼IL13CAR蛋白之核酸序列之部分的下游或上游。在一實施態樣中，此嵌合核酸序列係單順反子，其中該建構體包含單一啟動子序列以驅動單一轉錄物之轉錄，該單一轉錄物因此係經轉譯成稍後經切割之單一蛋白。使用此單順反子建構體需要位於該等IL13CAR與MGMT蛋白之間的自我切割元件。舉例來說，該嵌合核酸序列表現於宿主細胞中時，最初產生自N端至C端方向包含CAR(例如上述之IL13 CAR)、自我切割肽、及如本文所述之MGMT蛋白或MGMT變異體之單一蛋白。此蛋白接著經切割以產生個別CAR及MGMT蛋白。該CAR蛋白係經處理及展示於該細胞表面上，而該MGMT蛋白可保留於該細胞核內。替代性建構體自N端至C端方向包含MGMT蛋白、自我切割蛋白及CAR。

在一實施態樣中，該等CAR及MGMT多肽部分係經自我切割肽分開。自我切割序列之一實例係2A元件，其包括來自口蹄疫病毒之2A序列。在一例示性實施態樣中，該自我切割序列包含SEQ ID NO：32之序列或係由SEQ ID NO：32之序列組成。

在一替代性實施態樣中，編碼如上述之CAR及如上述之MGMT或其變異體兩者之核酸序列係多順反子，其中其包含經非蛋白編碼序列諸如內部核糖體進入位點(IRES)分開之編碼該CAR之核酸序列及編碼MGMT或其變異體之核酸序列。可使用之IRES序列之實例包括但不限於腦脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、Theiler氏鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)、人鼻病毒(HRV)、柯沙奇病毒(coxsackievirus,CSV)、脊髓灰質炎病毒(POLIO)、A型肝炎病毒(HAV)、C型肝炎病毒(HCV)、及瘟疫病毒(例如豬霍亂病毒(HOCV)及牛病毒性下痢病毒(BVDV))之IRES元件(見例如Le et al.,Virus Genes 12：135-147,1996；及Le et al.,Nuc.Acids Res.25：362-369,1997，各文獻以參照方式整體納入此處)。

多順反子嵌合核酸之替代性實施態樣係其中第二啟動子係位於編碼該IL13CAR之核酸序列與編碼該MGMT或其變異體之核酸序列之間的多順反子嵌合核酸。在此實施態樣中，編碼自我切割肽之核酸序列並不存在。

亦考慮的是編碼該等IL13CAR及MGMT變異體之核酸各自位於個別的核酸載體內。也就是說，亦考慮一種系統或套組，其包含含有編碼如本文所述之IL13CAR的核酸之第一載體以及編碼如本文所述之MGMT蛋白之第二載體。

如該領域之技藝人士所將理解的是，編碼至少該等IL13CAR及MGMT蛋白或彼等之變異體的核酸序列可另包含額外組分，以促進及/或增強該等CAR及/或MGMT於宿主細胞中之表現及功能。舉例來說，該CAR可另包含(一或多種)起始轉譯之序列(例如Kozak序列及/或啟動子序列)以及用於同源重組之序列(反轉錄病毒5’LTR；反轉錄病毒3’LTR)。Kozak序列可用於包含編碼如本文所述之IL13CAR-2A-MGMT建構體的核酸序列之嵌合核酸建構體中。

可用於本發明之嵌合核酸序列係藉由將下列元件以5’至3’之方向接合或連接在一起來產製：Kozak序列、編碼信號序列之核酸、編碼IL13配體之核酸、編碼絞鏈區之核酸、編碼跨膜結構域之核酸、編碼CD28共刺激(傳訊)結構域之核酸、編碼CD3-ζ傳訊結構域之核酸、編碼自我切割肽(例如2A肽)之核酸、以及編碼MGMT蛋白之核酸，以上各者皆如上述說明。該嵌合核酸序列可藉由合成包括及編碼上述元件之單一序列來產製。或者，上述元件各者可使用該領域之技藝人士所熟知之方法個別產製。舉例來說，各元件係使用PCR擴增，其中該PCR係經設計以在各元件之5’及3’端視需要產製限制內核酸酶位點，且該等個別元件係利用適當內核酸酶消化及接合在一起以獲得所欲之建構體。由此方法所產製之IL13CAR-P140KMGMT建構體將有短連接子肽存在於個別元件之間。

舉例來說，可有編碼2、3、4、5或6個胺基酸之核酸位於配體結構域與絞鏈區之間、絞鏈區與跨膜結構域之間、跨膜結構域與CD28共刺激結構域之間、CD28共刺激結構域與CD3-ζ傳訊結構域之間、CD3-ζ傳訊結構域及/或自我切割肽之間。

在一例示性實施態樣中，該IL13CAR在配體與絞鏈結構域之間包含由2個胺基酸脯胺酸-精胺酸所組成之連接子。在絞鏈區與跨膜結構域之間的連接子係麩醯胺酸-離胺酸。在跨膜結構域與CD28共刺激結構域之間的連接子係纈胺酸-蘇胺酸。在CD28共刺激結構域與CD3-ζ傳訊結構域之間的連接子係蘇胺酸-精胺酸。在CD3-ζ傳訊結構域與2A肽之間的連接子係麩醯胺酸-脯胺酸-丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸。所考慮的是上述連接子各者可與他者無關地存在或不存在於該IL13 CAR蛋白中。

因此，用於轉染宿主細胞諸如T細胞且用於抑制或防止表現IL13Rα2且暴露至TMZ之細胞的生長之IL13CAR-P140KMGMT建構體的較佳實施態樣，包括但不限於IL13(WT)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：1之核苷酸序列；SEQ ID NO：4之胺基酸序列)；IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：2之核苷酸序列；SEQ ID NO：5之胺基酸序列)；以及IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：3之核苷酸序列；SEQ ID NO：6之胺基酸序列)。圖2A提供 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT建構體之示意圖。這些IL13CAR-P140KMGMT建構體之額外實施態樣包括但不限於編碼蛋白IL13(WT)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：45)、IL13(E13Y)CAR-PAR140KMGMT(SEQ ID NO：46)、及IL13)E13K.R109K)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：47)之建構體。

該領域之技藝人士將理解的是，編碼如本文所述之信號肽、IL13配體、絞鏈區、跨膜結構域及CD28共刺激結構域、CD3-ζ傳訊結構域、自我切割肽連接子及MGMT蛋白或其變異體的核酸序列之各者可因密碼子簡併而有所不同，但不影響所編碼之蛋白。再者，該等多肽序列亦可諸如透過保守性胺基酸取代而有所不同，但不顯著影響該等經明示說明之蛋白的功能。因此，本文中亦考慮的是本文所述之核苷酸序列各者之變異體，以使本發明之核酸序列包含與SEQ ID NO：1至3、7至24及34至35各者具有至少75%、80%、82%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之序列。類似地，本文中亦考慮且揭示的是與SEQ ID NO：4至6、25至33及36至41及43各者具有至少75%、80%、82%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致性之多肽。

二個核苷酸或胺基酸序列之一致性百分比可藉由排比序列以達最佳比較目的來判定(例如缺口可被導入第一序列之序列中)。接著比較對應位置之核苷酸或胺基酸，且該二個序列之間的一致性百分比取決於該等序列所共享之一致位置的數目(即一致性百分比=一致位置數目/位置總數x 100)。在某些實施態樣中，經排比以供比較目的之胺基酸或核苷酸序列的長度係參考序列長度之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，參考序列例如該些提供於圖7A(SEQ ID NO：1)、7B(SEQ ID NO：4)、8A(SEQ ID NO：2)、8B(SEQ ID NO：5)、9A(SEQ ID NO：3)及9B(SEQ ID NO：6)中之序列。二個序列之實際比較可藉由廣為周知之方法完成，例如使用數學運算法。該數學演算法之較佳非限制性實例係描述於Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：5873-5877(1993)。該演算法被加入BLASTN及BLASTX程式(版本2.2)中，如Schaffer et al.,Nucleic Acids Res.,29：2994-3005(2001)中所述。當利用BLAST及Gapped BLAST程式時，個別程式(例如BLASTN)之預設參數可被使用。在一實施態樣中，所搜尋之資料庫係非冗餘(NR)資料庫，且用於序列比較之參數可設定為：無過濾器；預期數值(Expect value)為10；序列長度(Word Size)為3；矩陣(Matrix)係BLOSUM62；及缺口罰分(Gap Costs)存在(Existence)為11，延長(Extension)為1。在另一實施態樣中，二個多肽或二個多核苷酸之間的一致性百分比係於受到關注之多肽或多核苷酸的全長決定。

用於比較序列之數學演算法的另一較佳非限制性實例係Myers and Miller,CABIOS(1989)之演算法。該演算法係併入ALIGN程式(版本2.0)，其係GCG序列排比套裝軟體(Accelrys,San Diego,California)之一部分。當利用ALIGN程式比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分12、及缺口罰分4。其他序列分析演算法係該領域所知，包括如Torellis and Robotti,Comput.Appl.Biosci.,10：3-5(1994)中所述之ADVANCE及ADAM；及如Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci USA,85：2444-8(1988)中所述之FASTA。

在另一實施態樣中，二個胺基酸序列之間的一致性百分比可利用GCG套裝軟體中之GAP程式完成，使用Blossom 63矩陣或PAM250矩陣任一者，及12、10、8、6或4之缺口加權及2、3或4之長度加權。在又另一實施態樣中，二個核酸序列之間的一致性百分比可利用GCG套裝軟體中之GAP程式完成，使用50之缺口加權及3之長度加權。

多肽之間的類似性通常係藉由保守性胺基酸取代決定。該等取代係指將多肽中之給定胺基酸以具有類似特徵之另一胺基酸取代。保守性取代可能是表型靜默的。通常被視為保守性取代者係在脂族胺基酸Ala、Val、Leu及Ile之間以一個替換另一個；係羥基殘基Ser及Thr 之互相交換；係酸性殘基Asp及Glu之交換；係醯胺殘基Asn及Gln之間的取代；係鹼性殘基Lys及Arg之交換；及芳族殘基Phe及Tyr之間的替換。有關哪一個胺基酸改變可能是表型靜默者之指南可見Bowie et al.,Science 247：1306-1310(1990)。

變異體多肽可在胺基酸序列上有一或多個取代、刪除、插入、倒位、融合及截短之差異或任何上述之組合。另外，變異體多肽可具有完全功能性(例如感染細胞及產生後代病毒之能力)或可缺乏一或多種活性之功能(例如產生後代病毒之能力)。完全功能性變異體通常僅含有保守性變異或在非關鍵殘基或非關鍵區域中之變異。功能性變異體亦可含有導致功能無改變或非顯著改變之類似胺基酸之取代。或者，該等取代可正面地或負面地影響功能至某種程度。非功能性變異體一般而言含有一或多種非保守性胺基酸取代、刪除、插入、倒位、或截短、或在關鍵殘基或關鍵區域之取代、插入、倒位、或刪除。

功能必要性胺基酸可藉由該領域已知之方法識別，諸如定點突變形成或丙胺酸掃描突變形成(Cunningham et al.,Science,244：1081-1085(1989))。該後項程序在各個分子殘基中導入單一丙胺酸突變(每分子一個突變)。所形成之突變分子接著於活體外進行生物活性之測試。影響多肽活性之關鍵位點亦可藉由結構分析加以測定，諸如結晶化、核磁共振、或光親和性標示(見Smith et al.,J.Mol.Biol.,224：899-904 (1992)；及de Vos et al.Science,255：306-312(1992))。

本文另揭示包含實質上純的多肽之組成物，該多肽包含IL13CAR蛋白及P140KMGMT變異體或係由IL13CAR蛋白及P140KMGMT變異體組成，該IL13CAR蛋白如本文所述為SEQ ID NO：4、5或6之胺基酸1至146之序列及與SEQ ID NO：4、5或6之胺基酸1至146之序列具有較佳地至少75%、80%、82%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多肽，且該P140KMGMT變異體如本文所述為SEQ ID NO：1之胺基酸400至606之序列及與SEQ ID NO：1之胺基酸400至606之序列具有較佳地至少75%、80%、82%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多肽，該序列一致性係使用BLAST程式及如本文所述之參數加以測定。在另一實施態樣中，多肽之實例包括包含SEQ ID NOs：4、5及/或6或係由SEQ ID NOs：4、5及/或6組成之實質上純的多肽；以及與SEQ ID NO：4具有較佳地至少75%、80%、82%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列類似性之多肽，該序列類似性係使用BLAST程式及如本文所述之參數加以測定。

在特定態樣中，本發明係關於一種經分離之由SEQ ID NO：1(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合所編碼之多肽。在其他態樣中，本發明係關於一種包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47或彼等之組合之胺基酸序列的多肽(經分離之多肽)。

亦考慮一種CAR多肽，該CAR多肽包含T細胞受體，該T細胞受體包含一或多種針對腦癌之一或多種腫瘤抗原的配體(例如抗體)。在一特定態樣中，該CAR多肽另包含一或多種可用於治療腦癌之額外劑。在其他態樣中，本發明係關於經分離之多肽、其片段、衍生物、及變異體，以及由本文所述之核苷酸序列所編碼之多肽(例如其他變異體)。如本文中所使用，用語「多肽」係指胺基酸之聚合物且不限定特定長度；因此，肽、寡肽及蛋白均包括在多肽之定義中。

該等多肽可利用已知之蛋白合成方法加以合成。在一實施態樣中，該多肽係藉由重組DNA及重組蛋白表現及純化技術來生產。舉例來說，編碼該多肽之核酸分子係經選殖至表現載體，該表現載體係經導入宿主細胞，該多肽係於該宿主細胞中表現，且該所欲蛋白係經純化及調製以供包裝及投予。

如本文中所使用，當多肽實質上不含物質、當多肽係自重組或非重組細胞分離時、或當多肽經化學合成而不含化學前體或其他化學物時，該多肽被稱為「經分離」、「實質上純的」或「實質上純的且經分離」。此外，多肽可與另一通常在細胞中不與之相連的多肽相連(例如呈「融合蛋白」)且仍為「經分離」、「實質上純的」或「實質上純的且經分離」。經分離、實質上純的或實質上純的且經分離之多肽可利用例如本文所述之親和性純化技術，以及其他本文所述且為該領域之技藝人士所知之技術獲得。

本發明之多肽可經純化至均質狀態。然而應了解其中多肽未經純化至均質狀態之製劑亦可使用。關鍵特徵在於該製劑允許該多肽之所欲功能，即使存在有可觀量之其他組分。因此，本發明涵蓋各種程度之純度。在一實施態樣中，用語「實質上不含物質」包括具有少於30%(乾重量計)其他蛋白(即污染蛋白)、少於約20%其他蛋白、少於約10%其他蛋白、少於約5%、或少於約1%其他蛋白之多肽製劑。

當多肽係經重組產製，其亦可實質上不含培養基，意即培養基佔該多肽製劑少於約20%、少於約10%、或少於約5%之體積。用語「實質上不含化學前體或其他化學物」包括其中多肽係與涉及其合成之化學前體或其他化學物分開之多肽製劑。在一實施態樣中，用語「實質上不含化學前體或其他化學物」包括具有少於約30%(乾重量)之化學前體或其他化學物、少於約20%之化學前體或其他化學物、少於約10%之化學前體或其他化學物、或少於約5%之化學前體或其他化學物之多肽製劑。

在一實施態樣中，本發明之多肽包含由SEQ ID NO：1、3及/或5之核酸分子及彼等之互補物及部分所編碼之胺基酸序列。本發明之多肽亦涵蓋與由包含SEQ ID NO：1、3及/或5之核苷酸序列及彼等之互補物及部分的核酸分子所編碼之多肽具有實質上同源性之片段及序列變異體。

核酸表現建構體

本發明之另一態樣關於核酸表現建構體或載體、反轉錄病毒載體及/或反轉錄病毒顆粒及彼等之用途。一般技藝人士已知之重組DNA技術方法係用於設計及產製編碼如本文所詳述之IL13CAR、自我切割肽及MGMT變異體之嵌合核酸序列。該嵌合核酸建構體接著係經轉殖至質體載體，以允許例如定序以證實該建構體之序列。一旦所欲序列係經證實，該嵌合核酸建構體被用於生產反轉錄病毒顆粒以用於轉染哺乳動物細胞。因此，包含如本文所述之SEQ ID NO：1至3之核酸序列及SEQ ID NO：7至24、34及/或34至35之組合的嵌合性建構體係經選殖至該等質體載體以供後續包裝至反轉錄病毒顆粒。在一特定態樣中，該等嵌合建構體及質體載體包含一或多種包含如上述之SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及/或SEQ ID NO：3核酸序列。含有IL13(WT)CAR-P140KMGMT序列(SEQ ID NO：1)、IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT(SEQ ID NO：2)、或IL13 (E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT序列(SEQ ID NO：3)之質體載體係藉由將本文所述片段選殖至pUC57載體接著選殖至pMFG載體如實例1所述產製，然後用於生產反轉錄病毒顆粒(實例2)。

圖1B說明包含IL13CAR建構體之質體載體，其中MGMT基因尚未被導入。圖2B說明含有IL13CAR建構體且在該IL13CAR編碼序列下游亦含有P140KMGMT編碼序列之相同質體骨架。

在一替代性實施態樣中，編碼如本文所述之IL13CAR之核酸係經選殖至第一載體，且編碼如本文所述之MGMT蛋白之核酸係經選殖至第二載體。因此，本發明亦描述包含編碼如本文所述之IL13CAR之核酸的第一載體(質體、表現、病毒、反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒等)以及包含編碼如本文所述之MGMT蛋白之核酸的第二載體(質體、表現、病毒、反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒等)。

適當核酸建構體之實例包括質體(環狀雙股DNA圈環)及病毒載體(反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體)。某些載體可在彼等所被導入之宿主細胞內自主複製(例如具有細菌性複製起點之細菌性載體及附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在被導入宿主細胞時可被整合至該宿主細胞之基因組中，藉以與該宿主基因組一起複製。另外，某些載體、表現載體能引導彼等可操作地連接之核酸的表現。一般來說，重組DNA技術中之表現建構體通常呈質體之形式。然而，本發明意圖包括該等具有相同功能之其他形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺病毒相關病毒)。

本發明之較佳重組表現載體所包含之本發明之核酸分子呈現適合在宿主細胞中表現該核酸分子之形式。這表示該等重組表現載體包括一或多種根據將用於表現之宿主細胞來選擇之調節序列，該調節序列係可操作地連接至將被表現之核酸序列。在重組表現載體內，「可操作地連接」係意圖表示受到關注之核苷酸序列係以允許該核苷酸序列表現之方式與該(等)調節序列連接(例如當該載體被導入宿主細胞中時，於試管內轉錄/轉譯系統中或於該宿主細胞中)。用語「調節序列」係意圖包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。該等調節序列係描述於例如Goeddel,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。調節序列包括該些引導核苷酸序列在許多類型之宿主細胞中組成性表現之調節序列，以及該些引導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表現之調節序列(例如組織特異性調節序列)。

該領域之技藝人士將了解，表現載體之設計可視諸如將被轉形之宿主細胞之選擇及所欲多肽之表現量等因子而定。本發明之表現載體可被導入宿主細胞中，以藉此生產如本文所述之核酸分子所編碼之多肽包括融合多肽。

本發明之重組表現載體可經設計以在原核或真核細胞中表現本發明之多肽，例如細菌細胞諸如大腸桿菌(E.coli)、昆蟲細胞(使用桿狀病毒(baculovirus)表現載體)、酵母菌細胞或哺乳動物細胞(靈長動物(例如人)、鼠(例如小鼠)、貓、犬、嚙齒動物、綿羊、牛細胞)。

生產含有嵌合核酸建構體之反轉錄病毒係經成功地產製，以包含編碼IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT之嵌合核酸序列，如實例1及2所述。實例及說明書中所描述之方法加上該領域之技藝人士所知之方法，可被用於生產含有任何如本文所述之嵌合核酸建構體之反轉錄病毒顆粒。過程中之轉染效率可藉由流式細胞分析測量細胞表面所表現之IL13配體加以監測。經IL13CAR-P140KMGMT建構體轉導之細胞可例如利用螢光激活細胞分選器加以富集。圖3A及3B顯示經IL13(E13K.R109K)CAR-A2-P140KMGMT建構體轉染之PG13細胞的富集。圖3A顯示在經親嗜性反轉錄病毒第一次轉導之後，表現IL13之細胞的相對數目(例如4.0%)。圖3B顯示在富集經親嗜性反轉錄病毒轉導之細胞後，表現IL13之細胞的相對數目(例如96.6%)。細胞溶解物之西方墨點分析可利用例行方法進行，以證實及測量由宿主細胞所表現之P140KMGMT蛋白。如圖3C所示，相較於未經轉導之細胞或經如圖1A至1B所繪示之僅表現IL13CAR建構體的建構體轉導之細胞，富集經IL13CAR-A2-P140KMGMT建構體轉導之細胞過度表現P140KMGMT蛋白。

圖1A及2A提供經選殖至質體載體中之IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT的示意圖，而圖1B及2B則以線性圖顯示側接5’LTR及3’LTR以供整合至宿主細胞基因組中之嵌合體。

本文所述之核酸建構體係經導入宿主哺乳動物細胞中，以授予該細胞腫瘤細胞殺滅功能及抗DNA甲基化劑諸如TMZ之化學治療劑抗性兩者。將核酸導入哺乳動物宿主細胞中係利用例如反轉錄病毒載體完成，例如於實例3中所述。用於過渡性或穩定性轉導哺乳動物細胞之反轉錄病毒載體係該領域所廣為週知且描述於下如彼等用於本發明所述之蛋白表現及治療系統中。

某些實施態樣採用病毒載體以將本文所述之表現系統轉導漿細胞諸如T細胞。病毒載體之實例包括但不限於MFG載體、腺病毒基底載體、腺病毒相關病毒(AAV)基底載體、反轉錄病毒載體、反轉錄病毒-腺病毒載體、及衍生自單純皰疹病毒(HSV)之載體。

一般而言，最簡單之反轉錄病毒載體包含某些5’LTR及3’LTR序列、一或多種受到關注之基因(將於目標細胞中表現者)、一或多種啟動子、及用於包裝RNA之順式作用序列。如本文所述且該領域已知之其他調節序列可被包括。病毒載體一般係經選殖至可經轉染至包裝細胞系諸如真核細胞(例如PG13小鼠纖維母細胞)之質體中，且一般亦包含使質體於細菌中複製之有用序列。某些病毒載體諸如反轉錄病毒載體採用一或多種異源性啟動子、增強子或兩者。某些實施態樣採用「內部」啟動子/增強子，其係位於病毒載體之5’LTR與3’LTR序列之間且係與受到關注之基因可操作地連接。「功能性關係」及「可操作地連接」係指但不限指該基因相對於啟動子及/或增強子係位處正確的位置及方向，以使得當該啟動子及/或增強子係與適當之調節分子接觸時，將致使該基因之表現。可使用任何調節(例如增加、降低)病毒RNA基因組於包裝細胞系中之表現、調節受到關注之選定基因於經感染之目標細胞中之表現、或兩者之增強子/啟動子組合。

啟動子係由DNA序列形成之表現控制元件，其允許RNA聚合酶之結合及轉錄之發生。啟動子係位於受到關注之選定基因(一般在約100至1000bp內)的起始密碼子上游(5’)之非轉譯序列，且控制彼等所可操作地連接之編碼多核苷酸序列的轉錄及轉譯。啟動子可為誘導性或組成性。誘導性啟動子因應培養條件之一些改變，諸如溫度改變，而起始在彼等控制下之DNA的轉錄量增加。

各種啟動子以及用於可操作地連接該啟動子至多核苷酸編碼序列之方法皆為該領域所知。天然啟動子序列及許多異源性啟動子二者皆可被用於引導受到關注之選定基因的表現。某些實施態樣採用異源性啟動子，因為相較於天然啟動子，彼等大抵允許所欲蛋白之較高轉錄及較高產量。

某些病毒載體包含順式作用包裝序列，以促進基因組病毒RNA納入病毒顆粒之中。實例包括psi序列。該等順式作用序列係該領域已知。

病毒載體之產製可利用該領域已知之任何適當基因工程技術完成，包括但不限於限制內核酸酶消化、接合、轉形、質體純化、PCR擴增、及DNA定序之標準技術，例如Sambrook et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1989))、Coffin et al.(Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1997))及"RNA Viruses：A Practical Approach"(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000))中所述。

任何種類之該領域已知之方法可被用於生產基因組包含該病毒載體之RNA副本的適當反轉錄病毒顆粒。其中的一個方法是將病毒載體導入包裝細胞系中，該包裝細胞系根據該病毒載體，將該病毒基因組RNA包裝成具有所欲目標細胞特異性之病毒顆粒。包裝細胞系一般反式(in trans)提供將病毒基因組RNA包裝成病毒顆粒及感染目標細胞所需之病毒蛋白，包括結構性gag蛋白、酶性pal蛋白、及封套糖蛋白。

在某些實施態樣中，包裝細胞系可穩定表現某些必須或所欲之病毒蛋白(例如gag、pol)(見例如美國專利第6,218,181號)。在某些實施態樣中，包裝細胞系可經編碼某些必須或所欲之病毒蛋白(例如gag、pol、糖蛋白)的質體過渡性轉染，包括本文所述之麻疹病毒糖蛋白序列。在一例示性實施態樣中，包裝細胞系穩定表現gag及pol序列，且該細胞系接著經編碼該病毒載體之質體及編碼該糖蛋白之質體轉染。在將所欲質體導入之後，病毒顆粒係經適當收集及處理，諸如進行超離心以形成病毒顆粒之濃縮原液。例示性包裝細胞系包括PG13(ATCC CRL-10686)、293(ATCC CCL X)、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)及Cf2Th(ATCC CRL 1430)細胞系。

宿主細胞

本發明之另一態樣係關於其中已經導入本發明之重組表現載體的宿主細胞。用語「宿主細胞」及「重組宿主細胞」在本文中可互相交換使用。應了解的是，該等用語不僅指述該特定主題細胞但亦指該細胞之後代或潛在後代。由於後繼世代可能因為突變或環境影響而發生某些修飾，因此該後代事實上可能不與親代細胞完全相同，但仍包括在本文所使用之用語之範圍內。

宿主細胞可為任何原核或真核細胞。舉例來說，本發明之核酸分子可於細菌細胞(例如大腸桿菌(E. coli))、昆蟲細胞、酵母菌、或哺乳動物細胞中表現。在一態樣中，該宿主細胞係哺乳動物細胞(靈長動物(例如人)、鼠(例如小鼠)、貓、犬、嚙齒動物、綿羊、牛細胞)。在一特定態樣中，該哺乳動物細胞係免疫細胞。在又另一態樣中，該哺乳動物細胞係T細胞。其他合適之宿主細胞對於該領域之技藝人士係為明顯可知。

為了本文之目的，該T細胞可為任何T細胞，諸如經培養之T細胞，例如初代T細胞，或來自經培養之T細胞系之T細胞，例如Jurkat、SupT1等，或自哺乳動物獲得之T細胞。若自哺乳動物獲得，該T細胞可自數種來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺、或其他組織或液體。T細胞亦可經富集或經純化。T細胞可為人T細胞。T細胞可為自人分離之T細胞。T細胞可為任何種類之T細胞且可為任何發育階段，包括但不限於CD4⁺/CD8⁺雙陽性T細胞、CD4⁺輔助T細胞，例如Th₁及Th₂細胞、CD8⁺ T細胞(例如細胞毒性T細胞)、周邊血液單核細胞(PBMC)、周邊血液白血球(PBL)、腫瘤浸潤細胞、記憶T細胞、初始T細胞(naive T cell)、及類似者。T細胞可為CD8+ T細胞或CD4⁺ T細胞。

在一實施態樣中，用於本發明之組成物及方法中之宿主細胞係NK-92細胞(NK-92細胞系，ATCC編號PTA-6672)。

核酸建構體可經由習用之轉形或轉染技術導入原核或真核細胞。如本文中所使用，用語「感染」、「轉形」、「轉導」及「轉染」係意圖指述各種該領域已知之將外來核酸分子(例如DNA)導入宿主細胞中之技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-葡聚糖媒介之轉染、脂質體轉染、或電穿孔。用於轉形或轉染宿主細胞之適當方法可見於例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2nd Ed.,CSHP,New York(1989)及其他實驗室手冊。

本發明之宿主細胞諸如培養中之原核或真核宿主細胞可被用於生產(表現)一或多種本發明之CAR。因此，本發明另提供使用本發明之宿主細胞生產CAR之方法。在一實施態樣中，該方法包含於適當培養基中培養本發明之宿主細胞(其中已導入編碼本發明之多肽之重組表現載體)，以使該一或多種CAR係經生產(例如表現於該宿主細胞之表面上)。

在穩定轉染哺乳動物細胞方面，已知取決於所使用之表現載體及轉染技術，僅一小部分之細胞可將外來DNA整合至彼等之基因組中。為了識別及選擇這些整合體，通常將編碼可選標誌之基因(例如抗生素抗性)伴隨受到關注之基因一起導入宿主細胞中。較佳之可選標誌包括該些授予對藥物諸如G418、潮黴素、或甲胺喋呤(methotrexate)之抗性的可選標誌。編碼可選標誌之核酸分子可在和本發明之核酸分子所在之相同載體上導入宿主細胞中，或可在不同載體上導入。經該導入核酸分子穩定轉染之細胞可藉由藥物選擇來識別(例如納入該可選標誌基因之細胞將存活，而其他細胞則死亡)。

如本文所例示，所考慮的是表現IL13CAR且對暴露至化學治療劑替莫唑胺(temozolomide)具抗性之免疫細胞，諸如但不限於T細胞。具體而言，在TMZ存在下，本文顯示如上所詳述之經編碼且表現IL13CAR(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6)及P140KMGMT突變(SEQ ID NO：33)之核酸序列轉導的T細胞，相較於表現僅表現IL13之CAR的T細胞具有較高之存活率。因此，在一特定態樣中，本發明係關於表現IL13及/或IL13之變異體(例如SEQ ID NO：4(WT IL13 CAR)、SEQ ID NO：5(IL13E13YCAR)或SEQ ID NO：6(IL13E13K.R109KCR)及/或R109K IL13CAR)及化學保護細胞之MGMT突變(例如P140KMGMT突變(SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SE ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41))的CAR。在一實施態樣中，該細胞係經IL13CAR-A2-MGMT建構體轉導，其中該MGMT蛋白不是野生型MGMT蛋白(SEQ ID NO：49)。

收集及轉染宿主T細胞

經嵌合抗原受體(CAR)工程化以致使高度特異性腫瘤辨識及殺滅的T細胞，在獲得具前景之臨床結果後已受到大量關注(Grupp et al.,2013,N Eng J Med, 368：1509-1518；Porter et al.,2011,N Eng J Med,365：725-733；Sadelain et al.,2009,Curr Opin Immunol,21：215-223)。經CAR基因重新編程之T細胞提供用於對接(docking with)及溶解腫瘤細胞之MHC依賴性機轉。該等經改質之T細胞又名「設計師T細胞(designer T cell)」、「T小體(T-bodies)」或「CAR-T細胞」(Ma et al.,2002,Cancer Chemotherapy & Biological Response Modifiers：Elsevier Science,pp.319-345；Park et al.,2011,Trends Biotech,29：550-557；Ma et al.,2014,Prostate,74：286-296)。

在另一態樣中，本揭示係關於一種產製表現CAR及MGMT蛋白之細胞的方法，該CAR包含T細胞受體，該T細胞受體包含一或多種針對腦癌之一或多種抗原的配體(例如抗體)，該MGMT蛋白增加經編碼該CAR及MGMT蛋白之核酸轉導且經暴露至DNA甲基化劑諸如TMZ之細胞的存活性。在一特定態樣中，本發明係關於一種產製表現CAR之細胞的方法，該CAR具有SEQ ID NO：4(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：5(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：6(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合之胺基酸序列。該方法包含將包含SEQ ID NO：1(IL13(WT)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)或SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)之核酸序列導入該細胞中；以及將該細胞維持在該CAR係經該細胞表現之條件下，藉以產製表現具有SEQ ID NO：4(IL13(WT)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：5(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：6(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合之胺基酸序列的嵌合抗原受體之細胞。

在一特定態樣中，該核酸序列係使用病毒載體(例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或彼等之組合)導入該細胞中。在另一態樣中，該細胞係哺乳動物細胞，諸如哺乳動物T細胞(例如人T細胞或小鼠T細胞)。在一特定態樣中，該細胞係自體細胞或人白血球抗原(HLA)相符細胞。在又另一態樣中，該細胞係得自一或多個具有腦癌之個體(例如高度惡性神經膠質瘤，諸如多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)、退行性星狀細胞瘤或兒童神經膠質瘤)。

因此，一額外態樣係關於表現本發明之至少一種CAR及藥物抗性多肽之重組T細胞。特別較佳之經轉形宿主細胞係基因轉殖T前體細胞或幹細胞，其特徵在於包含本發明之核酸建構體。用於轉形或轉導宿主細胞及/或幹細胞之方法係該領域之技藝人士所廣為週知，且舉例來說包括電穿孔或顯微注射。一種特別較佳之經轉形宿主細胞係病患獨特(patient-unique)T細胞，其為在萃取之後經本發明之核酸建構體轉染。根據本發明，特別是宿主細胞可藉由萃取一或數種細胞獲得，較佳地T細胞特別是CD8⁺-T細胞後續係經一或多種本發明之核酸建構體活體外轉染或轉導，以藉此獲得本發明之宿主細胞。

在擴張及基因修飾之前，T細胞來源係得自個體。用語「個體」係意圖包括可經誘發免疫反應之活有機體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人及其他靈長動物、犬、貓、小鼠、大鼠、及基因轉殖嚙齒動物物種。T細胞可自數種來源獲得，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位之組織、腹水、胸膜滲液、脾臟組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，任何數量之該領域可取得之T細胞系皆可被使用。在本發明之某些態樣中，T細胞可自一單位收集自個體之血液，使用該領域之技藝人士所知之任何數量之技術諸如Ficoll^TM分離獲得。在一較佳之態樣中，來自個體之循環血液中的細胞係藉由血球分離獲得。該血球分離產物一般含有淋巴細胞包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球、及血小板。在一態樣中，藉由血球分離所收集之細胞可經清洗以去除血漿部分且將細胞放置於適當緩衝液或培養基以供進行後續處理步驟。在本發明之一態樣中，細胞係經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗。在一替代性態樣中，該清洗溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多若非所有二價陽離子。在缺乏鈣下之初步活化步驟可導致放大活化。如同該領域之技藝人士將輕易瞭解的，清洗步驟可藉由該領域之技藝人士已知之方法進行，諸如根據製造商指示使用半自動化「流經(flow- through)」離心。在清洗後，細胞可經重懸於各種生物相容性緩衝液，或其他有或無緩衝液之鹽水溶液。或者，血球分離樣本之非所欲組分可經移除且將細胞直接重懸於培養基中。

在一態樣中，T細胞係自周邊血液淋巴細胞分離，其可藉由例如離心通過PERCOLL^TM梯度或藉由逆流離心淘析以溶解紅血球並除盡單核球。T細胞之特定亞群諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及CD45RO+T細胞可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離。該領域之技藝人士將明瞭，多次選擇亦可用於本發明之情況中。在某些態樣中，所欲的是進行選擇程序並且在活化及擴張過程中使用「未經選擇之」細胞。「未經選擇之」細胞亦可經進一步選擇之處理。

藉由陰性選擇來富集T細胞族群，可利用針對陰性選擇細胞所特有之表面標誌之抗體組合來完成。一種方法係經由陰性磁免疫黏附或流式細胞分析之細胞分選及/或選擇，使用針對陰性選擇細胞之細胞表面標誌的單株抗體之雞尾酒進行。舉例來說，要藉由陰性選擇富集CD4+細胞，則單株抗體雞尾酒一般來說包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、及CD8之抗體。在某些態樣中，所欲的是富集或陽性選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、及FoxP3+之調節T細胞。或者，在某些態樣中，T調節細胞係藉由抗C25共軛珠或其他類似選擇方法除盡。

T細胞之活化及表現

不論是在T細胞經基因修飾以表現所欲CAR之前或之後，該等T細胞大致上可使用如例如下列所述之方法進行活化及擴增：美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請案公開號20060121005。

一旦建立該經轉染或轉導之T細胞能夠表現該IL13CAR為表面膜蛋白且具有所欲調節及所欲量，可決定該嵌合受體是否能在宿主細胞中發揮功能以提供所欲之信號誘導。因此，該經轉導之T細胞被重新導入或投予至該個體以在該個體中活化抗腫瘤反應。

醫藥組成物

在又另一態樣中，本發明係關於用於促進如本文所述之經轉導T細胞投予至有需要之個體之醫藥組成物。本發明之經轉導T細胞可與適當載劑或稀釋劑一起製成醫藥組成物或製成適用於活體內投予之植入物，該等載劑或稀釋劑進一步可為醫藥上可接受的。製造該組成物或植入物之手段已於該領域中說明(見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.(1980))。當適當時，該經轉導之T細胞可以平常方式經調製成半固體或液體形式之製劑，諸如膠囊、溶液、注射劑、吸入劑、或氣霧劑，以用於彼等之個別投予途徑。該領域已知之手段可被利用以預防或減少組成物在達到目標組織或器官前的釋放及吸收，或是確保該組成物的定時釋放(timed-release)。然而所欲的是，使用不會讓該等細胞無法表現該嵌合受體之醫藥上可接受之形式。因此，所欲的是該經轉導T細胞可被製成含有平衡鹽溶液較佳地漢氏(Hanks’)平衡鹽溶液或生理鹽水之醫藥組成物。舉例來說，該等組成物可與生理上可接受之載劑或賦形劑一起調製以製備醫藥組成物。該載劑及組成物可為無菌。調製劑應適合投予模式。

適當之醫藥上可接受之載劑包括但不限於水、鹽溶液(例如NaCl)、鹽水、緩衝鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠、植物油、苄醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物諸如乳糖、直鏈澱粉(amylose)或澱粉、葡萄糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、香料油、脂肪酸酯、羥基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等、以及彼等之組合。若為所欲，該等醫藥製劑可與輔助劑一起混合，例如潤滑劑、保存劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、風味劑及/或芳族物質及不會有害地與活性化合物反應之類似物。

需要時，該組成物亦可包含少量之潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。該組成物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調製劑、或粉劑。該組成物可與慣用結合劑及載劑諸如三酸甘油脂被調製成栓劑。口服調製劑可包括標準載劑諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

該組成物可根據例行程序調製為適用於對人類投予之醫藥組成物。舉例來說，用於靜脈投予之組成物通常係無菌等張水性緩衝液之溶液。當需要時，該組成物亦可包括助溶劑及局部麻醉劑以紓解注射部位之疼痛。大抵，該等成份係分開地或混合在一起地提供為單位劑量形式，例如於密封容器諸如顯示活性化合物之量的安瓿或小袋中之冷凍乾燥散劑或無水濃縮物。當該組成物係藉由輸注投予時，其可以包含無菌醫藥級水、鹽水或葡萄糖/水之輸注瓶分配。當該組成物係藉由注射投予時，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿以使該等成份可在投予前混合。

導入該些組成物之方法包括但不限於顱內、髓內、皮內、肌肉內、腹膜內、眼內、靜脈內、皮下、局部、經口及鼻內。其他適當導入方法亦可包括基因療法(如下述)、可充電或可生物降解裝置、粒子加速裝置(「基因槍」)及緩慢釋放聚合裝置。本發明之醫藥組成物亦可作為與其他化合物之組合療法的一部分投予。

以局部施用而言，可採用包含與局部施用相容之載劑且具有動態黏度較佳地大於水之非噴霧形式、黏性至半固體或固體形式。適當調製劑包括但不限於溶液、懸浮液、乳劑、乳膏、軟膏、粉劑、灌腸劑、乳液、溶膠、擦劑、藥膏、氣霧劑等，其若有需要係經滅菌與輔助劑混合，輔助劑例如保存劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑、或用於影響滲透壓之鹽等。該化合物可納入美容調製劑中。在局部施用方面，亦適合的是可噴霧之氣霧製劑，其中該活性成分(較佳地與固體或液體惰性載劑材料組合)係包裝於擠壓瓶或與加壓揮發劑(通常為氣體推進劑，例如加壓空氣)混合。

本文所述之化合物可經調製為中性或鹽形式。醫藥上可接受之鹽包括該些形成具有游離胺基之鹽，諸如該些衍生自鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等之鹽，及該些形成具有游離羧基之鹽，諸如該些衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙基胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。

套組

本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含一或多個裝填本發明之醫藥組成物的一或多種成分之容器。可選地與該(等)容器相關的可為主管機關規範藥品或生物藥品製造、使用或販售之指定形式標示，該標示反映主管機關核准製造、使用或販售以供人類使用。該包裝或套組可標示關於投藥模式、藥物投予序列(例如分開、依序或同時)或類似之資訊。包裝或套組亦可包括提醒病患用藥之手段。包裝或套組可為組合療法之單一單位劑量，或其可為複數個單位劑量。特別是，化合物可分開地或以任何組合混合在一起地存在於單一小瓶或錠劑中。包裝於泡殼包裝或其他分配手段中之化合物係較佳。就本發明之目的而言，單位劑量係意圖表示一種依據各化合物之個別藥效動力學且以FDA核准劑量於標準時程投予之劑量。

治療方法

在另一態樣中，本發明係關於一種治療有治療需要之個體的惡性病之方法，該方法包含投予一或多種表現IL13CAR及MGMT蛋白之T細胞，該IL13CAR包含一或多種針對IL13Rα2蛋白之配體(例如抗體)。在一特定態樣中，本發明係關於一種治療有治療需要之個體的腦癌之方法，該方法包含投予一或多種T細胞，該一或多種T細胞獲得及表現編碼包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37(配體)、SEQ ID NO：28(TM)、SEQ ID NOS：29及30(CD28及CD3-ζ傳訊結構域)及可選地另包含SEQ ID NO：27(絞鏈)之蛋白的核酸序列。在另一實施態樣中，該核酸序列包含SEQ ID NO：1(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合。在一態樣中，該等T細胞係自體T細胞或人白血球抗原 (HLA)相符細胞。在另一態樣中，該腦癌係高度惡性神經膠質瘤諸如高度惡性神經膠質瘤係多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)、退行性星狀細胞瘤或兒童神經膠質瘤。在一實施態樣中，本文所揭示之方法可用於治療與有害IL13Rα2表現有關之癌症。

其他經證實具有過度表現IL13Rα2之細胞的癌症包括但不限於乳癌、胰癌、頭頸癌、卵巢癌及結直腸癌。在另一實施態樣中，該癌症係已經轉移之癌症。因此，亦考慮的是用於治療一或多種這些癌症之方法，該等方法藉由投予一或多種經如上述之一或多種IL13CAR-MGMT建構體轉導之T細胞至個體。

由於T細胞表現CAR及表現突變MGMT，該突變MGMT授予對MGMT過度表現或MGMT變異體(例如P140K)之藥物抗性的保護作用，因此該治療腦癌之方法可進一步包含對個體(腦癌病患)連續或同時投予一或多種化學治療劑。換言之，該經修飾之T細胞係於投予該化學治療劑之前、期間或之後投予。化學治療劑之實例包括替莫唑胺(temozolomide,TMZ)、1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU或卡氮芥(carmustine))、福莫司汀(fotemustine)及羅氮芥(lomustine)。在一特定態樣中，該一或多種T細胞表現包含SEQ ID NO：1(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或其組合之核酸序列，且該一或多種化學治療劑係同時投予至該個體。在一特定態樣中，該個體係哺乳動物諸如人或其他靈長動物，或嚙齒動物諸如小鼠或大鼠。

經編碼及表現IL13CAR-MGMT嵌合體之建構體轉導之T細胞的療效係於以下實例4及實例5中部分說明。實例4顯示經分離之經編碼該IL13CAR-2A-P140KMGMT蛋白之載體轉導之T細胞暴露至TMZ時，相較於經編碼該IL13CAR但未共表現該P140KMGMT蛋白之載體轉導之T細胞具有增加之抗性(增加存活性)(例如見圖5)。因此，所設想的是一種用於增加經諸如本文所述之IL13CAR-MGMT建構體轉導之免疫細胞的存活性之方法。在一例示性實施態樣中，經包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核酸序列的反轉錄病毒轉導之T細胞係經提供，以作為一種用於治療經診斷罹患腦癌且連續或同時接受TMZ治療之個體的方法。

額外研究顯示本文揭示之IL13CAR-MGMT建構體亦可有效改質T細胞，該等T細胞可經投予至個體且可增加個體之存活。如實例5及圖6所示，經U251MG神經膠質瘤細胞注射之小鼠係以TMZ及編碼IL13CAR(但無MGMT)之建構體或IL13CAR-A2-P140KMGMT建構體轉導之T細胞治療。雖然在P140KMGMT不存在下之IL13CAR表現相較於不投予CAR T細胞增加存活性，但投予TMZ加上經編碼IL13CAR-A2-P140KMGMT嵌合體之核酸序列轉導之T細胞的動物具有最高存活率(圖6)。因此，本文考慮的是一種用於治療經診斷罹患腦癌之個體的方法，該方法包含對該個體投予表現如本文所述之IL13CAR-MGMT蛋白之免疫細胞。

T細胞及/或化學治療劑可利用任何適當投予途徑投予至個體。適當投予途徑之實例包括但不限於顱內、髓內、皮內、肌肉內、腹膜內、眼內、靜脈內、皮下、局部、經口及鼻內遞送。

在一態樣中，該方法另包含自該個體獲得一或多種T細胞及導入本發明之嵌合核酸序列，例如包含SEQ ID NO：1(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合的核酸序列至該等T細胞。自個體獲得T細胞之方法係該領域已知且包括例如血漿清除術。在一些態樣中，該等CAR T細胞係於實驗室中生長(擴增)直到彼等之數量達到例如數十億。該經擴增之CAR T細胞族群接著可被輸注至該病患。在輸注之後，該等T細胞在病患體內倍增，且經由彼等之工程化受體的引導，進行辨識及殺滅表面上具有該抗原之癌細胞。

表現本文所述之IL13CAR及突變MGMT的宿主細胞係以治療有效量投予(即足以治療疾病之量，諸如改善與疾病有關之症狀、預防或延緩疾病之發生、及/或亦降低疾病症狀的嚴重性或頻率)。在治療特定個體之病狀或病況上將為治療有效之量將取決於症狀及疾病的嚴重性，且可藉由標準臨床技術決定。此外，可能可選地採用試管內或活體內測定以協助識別最佳劑量範圍。調製劑中將採用之確實劑量亦將取決於投予途徑及疾病或病況之嚴重性，且應根據臨床醫師的判斷及每位病患的情況來決定。有效劑量可由試管內或動物模型測試系統所衍生之劑量反應曲線外插求得。

所欲的是，有效量或足夠數量之該經分離之經轉染或改質T細胞係存在於組成物中，且經導入個體以使得長期、特異性、抗腫瘤反應得以建立，以減小若未進行該治療時將導致之腫瘤大小或消除若未進行該治療時將導致之腫瘤生長或重新生長。所欲的是，經投予至該個體之經改質T細胞之量造成腫瘤大小相較於其中該經改質T細胞不存在但其他皆相同情況中的腫瘤大小減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、或100%。

因此，經投予之經改質T細胞的量應考慮投予途徑，且應使得足夠數量之經轉導T細胞將被導入以達到所欲之治療反應。另外，本文所述之組成物中所包括的各種活性劑之量(例如依所欲接觸的各細胞計算之量或依某個體重計算之量)在不同應用中可有所差異。一般來說，所欲之經改質T細胞之濃度應足以提供該經治療之個體至少約1 x 10⁶至約1 x 10⁹個經轉導T細胞，甚至更為所欲的是約1 x 10⁷至約5 x 10⁸個經轉導T細胞，雖然任何更多(例如高於5 x 10⁸個細胞)或更少(例如低於1 x 10⁷個細胞)之適當量皆可被使用。投藥計畫可根據發展成熟之細胞基底療法建立(見例如Topalian and Rosenberg(1987)Acta Haematol.78 Suppl 1：75-6；美國專利第4,690,915號)或可採用輪替連續輸注策略。

實例 IL13CAR-P140KMGMT用於替莫唑胺(temozolomide)抗藥性神經膠母細胞瘤免疫療法實例1：表現質體建構

編碼IL13(WT)CAR建構體之cDNA、編碼IL13(E13Y)CAR建構體之cDNA及編碼IL13(E13K.R109K)CAR建構體之cDNA係經插入MFG反轉錄病毒載體之BamHI及NotI選殖位點，如圖1A及1B中之IL13(WT)CAR建構體所示，以產製宿主質體IL13(WT)CAR-pMFG、IL13(E13Y)CAR-pMFG及IL13(E13K.R109K)CAR-pMFG質體。(見Kong et al.,(Clin Cancer Res,2012,18(21)：5949-5960))。為了產製具有IL13CAR及P140K.MGMT兩種cDNA序列之單順反子轉錄物，Genscript USA(Piscataway,NJ)合成有5’NotI端及3’EagI端之2A-P140KMGMT片段。該2.3Kb片段係經選殖至pUC57選殖載體以確認該序列。一經確認之後，該片段係經完整轉移(transferred en bloc)至該IL13CAR-pMFG反轉錄病毒載體之3’NotI位點以產製下列各者：IL13(WT)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG、IL13(E13Y)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG、及IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG質體。圖2A及2B顯示IL13(E13K.R109K)CAR及IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140K.MGMT建構體及pMFG質體建構體。

實例2：反轉錄病毒顆粒之產製

含有如實例1所述之編碼IL13(E13K.R109K)CAR及IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT建構體之建構體的MFG反轉錄病毒顆粒係使用「乒乓(ping-pong)」法產製。來自實例1之各宿主質體首先經轉染至phoenix-eco細胞以產製親嗜性(ecotropic)反轉錄病毒。轉染效率係藉由流式細胞分析IL13表現加以測量。培養上清液係經儲存及用於轉導雙嗜性(amphotropic)病毒編碼性小鼠纖維母細胞細胞系PG13(ATCC,Manassas,VA)。測試經轉導之PG13細胞的IL13，且IL13陽性細胞係藉由螢光激活細胞分選器富集(圖3A至3B)。IL13富集細胞中之MGMT過度表現亦藉由細胞溶解物之西方墨點分析測試(圖3C)。

如圖3A及3B所示，經轉導之細胞表現IL13，且經富集以使得約97%之細胞表現IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT建構體。圖3C另顯示相較於未經轉染之細胞或經僅IL13CAR建構體轉染之細胞，經IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT轉染之細胞中P140KMGMT的表現增加。

富集細胞係於組織培養條件下擴增，以收集含有高力價CAR編碼性雙嗜性反轉錄病毒之培養上清液。

實例3：人T細胞之基因修飾

包含根據實例2之方法所產製的IL13(E13K.R109K)CAR及IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT建構體之反轉錄病毒顆粒係用於轉導人T細胞。人PBMC係自血液過濾器丟棄物分離(Rhode Island Blood Center,Providence,RI)。PBMC係於OKT3(10μg/ml)及IL2(3000U/ml)存在下培養36至48h以富集T細胞族群。富集T細胞係於魚精蛋白及IL2存在下，在室溫下於反粘連蛋白(retronectin)包覆板上與含有反轉錄病毒之培養上清液進行離心感染(spinfected)1小時。此步驟在後續24h中重複3次。在經3次感染後，允許細胞在含反轉錄病毒之培養基中生長另外24小時，接著轉移至含有10%胎牛血清、抗生素及IL2之新鮮RPMI-1640培養基中以供未來實驗使用。經IL13(E13K.R109K)CAR(不含P140KMGMT)成功轉導之T細胞以及未經轉導之T細胞係作為對照組用於所有實驗中。大致上，20至25%經含有IL13(E13K.R109K)CAR- 2A-P140KMGMT建構體之反轉錄病毒顆粒轉染之T細胞係呈IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT陽性，如流式細胞分析偵測細胞表面上之IL13所測量(資料未顯示)。IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT之轉導效率係約69.2%，其中未經轉導之T細胞係用來作為對照。

實例4：經轉導T細胞中之替莫唑胺(temozolomide)抗藥性

如上述經IL13(E13K.R109K)CAR(圖1A)或IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT(圖2A)轉導之T細胞係以漸增濃度之替莫唑胺(TMZ；0至1000μM)分開培養48小時。每24小時更換一次培養基並補充新鮮TMZ。經TMZ處理之後，細胞存活性係藉由台盼藍排除原則以及膜聯蛋白V(Annexin V)/7AAD染色方法分析。膜聯蛋白V/7-AAD陰性細胞之頻率係藉由流式細胞分析測量，其結果代表細胞存活性。存活曲線係經建構以外插求出TMZ活性之存活性及濃度。如圖4所示，在暴露至TMZ後，經IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT轉導之T細胞的存活優於經IL13(E13K.R109K)CAR轉導之T細胞。此觀察顯示以P140KMGMT表現性CAR基因修飾T細胞對該經修飾之T細胞提供化學保護作用。

實例5：IL13CAR-2A-P140KMGMT之功能特徵

經轉導細胞之免疫調節功能亦藉由測量當與神經膠質瘤細胞共培養時，由該等經轉導細胞所分泌之細胞介素IL2及IFNγ加以分析。已經IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT反轉錄病毒轉導之T細胞係於正常組織培養條件下(使用RPMI1640培養基含有5%血清及IL2(3000U/ml)及200μM TMZ)，在有或無200μM之TMZ下培養48至72小時。接下來，細胞係與U251MG神經膠質瘤細胞培養72小時(如本文所述之U251MG共培養)。藉由ELISA測試培養上清液之細胞介素分泌。

介白素2(IL2)係T細胞存活及增生之標誌，而干擾素γ(IFNγ)係細胞毒性T細胞功能之標誌。如圖5A及5B所示，經轉導細胞在TMZ存在或不存在下分泌IL2及IFNγ兩者。而且，TMZ之存在不顯著降低該等經轉導細胞分泌任一種細胞介素。TMZ抗性T細胞在暴露至TMZ後能夠維持彼等之正常細胞毒性功能，表示這些基因修飾確實提供這些細胞對TMZ誘導之白血球減少性細胞毒殺作用的抗性。

實例6：IL13CAR-2A-MGMT之活體內療效

IL13E13K.R109K-2A-P140KMGMT建構體之活體內療效係使用如實例2所述而產製之病毒顆粒於小鼠中測試。五十隻無胸腺裸鼠係經皮下注射(左側腹)U251MG神經膠質瘤細胞(40隻小鼠；第I至IV組)或 PBS(10隻小鼠)。在神經膠質瘤植入後四天，3組小鼠(第I、II及III組，10隻小鼠/組)係以TMZ經口治療(64mg/kg/天經口餵食管)共4天。在神經膠質瘤植入後第5天，已接受TMZ經口治療之3組小鼠係經如下治療：第I組：腫瘤內注射IL13E13K.R109KCAR-2A-P140KMGMT建構體(TMZ抗性)；第II組：不含MGMT之IL13 IL13E13K.R109K建構體(TMZ敏感性)；第III組：僅以PBS治療(不注射T細胞)。第IV組不接受T細胞或TMZ治療。監測小鼠之目視腫瘤生長、行為改變、及發病率直到注射T細胞後第90天，此時按照IACUC規定將小鼠犧牲。

依照小鼠實驗之結果所繪製之存活曲線顯示，經IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT T細胞及TMZ治療(第I組)之荷瘤小鼠具有73天之中位存活期且40%的動物存活，相較之下，經不含MGMT之TMZ敏感性IL13(E13K.R109K)CAR T細胞及TMZ治療的第II組動物為61天及14%存活。未接受治療(第IV組)之荷瘤小鼠具有29天之中位存活期。未接受T細胞但僅以TMZ口服治療之第III組荷瘤動物顯示20%存活率，但亦顯示僅36天之較低中位存活時間，此被視為TMZ治療之背景抗腫瘤作用(圖9及10)。此觀察顯示接受3G TMZ抗性CAR之第I組動物藉由CAR免疫療法與TMZ化學療法之協同作用最有效地消除腫瘤。

本文引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之教示係以參照方式整體納入本文。

雖然本發明已藉由彼之例示實施態樣具體顯示及說明，該領域之技藝人士將了解的是，可在其中進行各種形式及細節之改變而不背離該隨附請求項所包含之本發明之範圍。

<110> 羅傑威廉斯醫院(Roger Williams Hospital)

<120> 治療癌症之方法和組成物

<140> TW 104140317

<141> 2015-12-02

<150> US 61/086346

<151> 2014-12-02

<160> 49

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 1

<210> 2

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 2

<210> 3

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 3

<210> 4

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 4

<210> 5

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 5

<210> 6

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 6

<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 7

<210> 8

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 8

<210> 9

<211> 96

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

<210> 10

<211> 342

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

<210> 11

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 11

<210> 12

<211> 135

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

<210> 13

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 13

<210> 14

<211> 69

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

<210> 15

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 15

<210> 16

<211> 132

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

<210> 17

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 17

<210> 18

<211> 330

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

<210> 19

<211> 3

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 20

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 21

<210> 22

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 22

<210> 23

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 23

<210> 24

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 24

<210> 25

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

<210> 26

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

<210> 27

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

<210> 28

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

<210> 29

<211> 44

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 29

<210> 30

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 31

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 32

<210> 33

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 33

<210> 34

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 34

<210> 35

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 35

<210> 36

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 36

<210> 37

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 37

<210> 38

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 38

<210> 39

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 39

<210> 40

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 40

<210> 41

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 41

<210> 42

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 42

<210> 43

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

<210> 44

<211> 380

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

<210> 45

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 45

<210> 46

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 46

<210> 47

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 47

<210> 48

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 48

<210> 49

<211> 207

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

Claims

一種嵌合核酸序列，其包含編碼IL13CAR之第一核酸序列，該IL13CAR包含與IL13α2受體(SEQ ID NO：44)結合之IL13配體結構域，跨膜結構域，包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域；及編碼MGMT多肽之第二核酸序列，該MGMT多肽選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43。
如申請專利範圍第1項之嵌合核酸序列，其中該IL13CAR另包含信號肽。
如申請專利範圍第2項之嵌合核酸序列，其中該IL13CAR另包含絞鏈區。
如申請專利範圍第1項之嵌合核酸序列，其中該細胞質結構域另包含選自CD28、4-1BB(CD137)及OX40(CD134)之共刺激結構域。
如申請專利範圍第4項之嵌合核酸序列，其中該CD28共刺激結構域與SEQ ID NO：29具有至少90%一致性。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其中該CD3-ζ傳訊結構域與SEQ ID NO：30具有至少90%一致性。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其另包含編碼自我切割連接子肽之第三核酸序列。
如申請專利範圍第7項之嵌合核酸序列，其中該第三核酸序列係位於該第一核酸與該第二核酸之間。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其中該第一核酸序列另包含編碼二肽連接子之核酸序列，該二肽連接子係位於該IL13配體結構域與該絞鏈結構域之間、該絞鏈結構域與該跨膜結構域之間、該跨膜結構域與該CD28傳訊結構域之間、或該CD28傳訊結構域與該CD3-ζ傳訊結構域之間。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其另包含編碼位於該CD3-ζ傳訊結構域與該自我切割肽之間的連接子肽之核酸序列。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其中該IL13配體結構域包含與選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及彼等之變異體之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之嵌合核酸序列，其選自SEQ ID NO：1核苷酸109至1839、SEQ ID NO：2核苷酸109至1839及SEQ ID NO：3核苷酸109至1839。
一種核酸序列，其包含SEQ ID NO：1(IL13 CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：2(IL-13(E13Y)CAR-P140KMGMT)、SEQ ID NO：3(IL-13(E13K R109K)CAR-P140KMGMT)或彼等之組合。
一種載體，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項之嵌合核酸序列。
如申請專利範圍第14項之載體，其中該載體係病毒載體。
如申請專利範圍第15項之載體，其中該病毒載體係反轉錄病毒載體。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項之嵌合核酸序列。
如申請專利範圍第17項之宿主細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第18項之宿主細胞，其中該細胞係T細胞。
如申請專利範圍第17至19項中任一項之宿主細胞，其中該細胞係自體細胞或人白血球抗原(HLA)相符細胞。
如申請專利範圍第17至19項中任一項之宿主細胞，其中該細胞係得自一或多個患有腦癌之個體。
一種宿主細胞，其包含編碼IL13CAR之第一核酸序列，該IL13CAR包含與IL13α2受體(SEQ ID NO：44)結合之IL13配體結構域，跨膜結構域，包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域；及編碼MGMT多肽之第二核酸序列，該MGMT多肽選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第17至22項中任一項之宿主細胞。
一種醫藥組成物，其包含編碼IL13CAR之第一核酸序列，該IL13CAR包含與IL13α2受體(SEQ ID NO：44)結合之IL13配體結構域，跨膜結構域，包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域；及編碼MGMT多肽之第二核酸序列，該MGMT多肽選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43。
一種用於產製哺乳動物細胞之方法，該哺乳動物細胞表現IL13CAR蛋白及MGMT蛋白，該方法包含：a)將編碼該IL13CAR蛋白及該MGMT蛋白之核酸序列導入該細胞中，其中該IL13CAR蛋白包含與IL13α2受體(SEQ ID NO：44)結合之IL13配體結構域、跨膜結構域及包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域；及b)使該細胞維持在其中該IL13CAR蛋白及該MGMT蛋白係經該細胞表現之條件下。
如申請專利範圍第25項之方法，其中該核酸序列係經使用病毒載體導入該細胞。
如申請專利範圍第26項之方法，其中該病毒載體係選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體。
一種一或多種免疫細胞於製備供治療個體之腦癌的藥物之用途，其中該一或多種免疫細胞表現由下列編碼之蛋白：以N端至C端方向編碼IL13CAR之第一核酸序列，該IL13CAR包含與IL13α2受體(SEQ ID NO：44)結合之IL13配體結構域，跨膜結構域，及包含CD3-ζ傳訊結構域之細胞質結構域；及編碼MGMT多肽之第二核酸序列，該MGMT多肽選自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：43。
如申請專利範圍第28項之用途，其中該腦癌係高度惡性神經膠質瘤。
如申請專利範圍第28或29項之用途，其中該個體正在接受、曾經接受或將要接受DNA甲基化化學治療劑治療。
如申請專利範圍第30項之用途，其中該DNA甲基化化學治療劑係TMZ。
如申請專利範圍第30項之用途，其中該DNA甲基化化學治療劑係在投予該免疫細胞劑量之前、期間或之後投予。