KR20180041087A - 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
IL13 수용체 α-2(IL13Rα2)에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 O6-메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 단백질을 발현하는 면역 세포에 관한 조성물 및 방법이 기재된다. IL13 키메라 항원 수용체(IL13CAR) 또는 이의 변이체 및 MGMT 단백질 또는 이의 변이체를 함유하는 바이러스 입자는 T 세포와 같은 면역 세포를 형질감염시키기 위해 사용되며, 형질감염된 세포에 IL13Rα2-표적화 활성 및 화학요법제 테모졸로마이드(TMZ)에 대한 내성을 부여한다. 기재된 조성물 및 방법은 고-등급 악성 교종의 치료와 같은 암 치료법에 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 전문이 본원에 참조로 포함된, 2014년 12월 2일에 출원된, 미국 가출원 번호 제62/086,346호에 대한 우선권 이익을 주장한다.
서열 목록에 대한 상호-참조
"서열 목록"은 2015년 11월 30일 생성되고 "0962018010WOseqlist.txt" (69892 바이트)로 명명된, 텍스트 파일 형태로 본 출원과 함께 제출되며, 그 내용은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
표적화 면역요법은 악성종양의 치료에서 유망 연구 분야로 부가되었고 따라서 최근에 많은 관심을 받아왔다(Carpentier and Meng, 2006, Curr Opin Oncol, 18(6):631-636; Wainwright et al., 2012, Exp Opin Emerging Drugs; 17(2):181-202). 가장 광범위하게 연구된 표적 중의 하나는 인터루킨-13 수용체 알파 2 (IL13Rα2)이다(Thaci et al., 2014, Neuro-Oncol, 16(10):1304-1324). IL13Rα2는 편재된 IL13Rα1에 존재하는 신호전달 사슬이 결여된, 인터루킨-13(IL13)에 대한 유인 수용체이며, 따라서 임의의 IL13-매개 하류 신호전달 경로를 막는다(Arima et al., 2005, J Biol Chem, 280(26):24915-24922). IL13Rα2의 증가된 발현은 교종 및 다른 종양 모델에서 종양 진행을 촉진하는 것으로 보고되었다. IL13Rα2 발현은 교종 악성도 등급 및 열악한 환자 생존에 대한 예후 마커이다(Brown et al., 2013, PLoS ONE, 8(10): Article ID e77769). MG에서 그것의 선택적 발현은 약 20년 전에 발견된 이후 계속 치료법의 표적이 되어왔다(Debinski et al., 1999, Clin Canc Res, 5(5):985-990).
교모세포종은 성인에서 가장 흔한 원발성(primary) 뇌암이다. 매해 미국에서 악성 원발성 뇌종양으로 진단된 18,000명 환자 중 절반 이상이 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)을 갖는다. 다형성 교모세포종은 높은 증식 지수, 미세혈관 증식 및 소상괴사를 갖는, 역형성(anaplastic) 고세포성 종양(highly cellular tumor)이다. 징후 및 증상은 여러 요인(크기, 성장률, 뇌 안에서 종양의 국소화(localization))에 의존하고 주로 두통, 발작, 신경학적 결손, 정신 상태의 변화로 나타난다. 다형성 교모세포종 예후는 여전히 암울하다. 생존 시간은 다수 환자에서 2년 미만이다.
외과수술, 방사선요법 및 화학요법의 3중 요법(tripartite regimen)인, 교모세포종(GBM)의 현재 표준 치료에 의한 생존에서의 점진적인 향상에도 불구하고(Rolle et al., 2010, Neurosurgery Clin of North America, 21(1):201-214; Ashby and Ryken, 2006, Neurosurgical focus, 20(4):E3), 대부분의 환자에 대한 예후는 여전히 암울하다(Stupp et al, 2009, Lancet Oncol, 10(5):459-466; Omuro and DeAngelis, 2013, JAMA, 310(17):1842-1850). GBM의 치료에서 주요 한계는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 세포독성제의 전달을 방해하는 뇌 안에서의 종양의 위치(Ashby and Ryken, 2006, Neurosurgical Focus, 20(4):E3), 강한 면역억제 환경과의 혼합(Rolle et al., 2012, Adv Exp Med Biol, 746:53-76), 및 화학- 및 방사선 내성 교종-시원(glioma-initiating) 세포(Bao et al, 2006, Nature, 444(7120):756-760; Frosina, Mol Canc Res, 2009 7(7):989-999)이다. 그 결과, 신규 전략들이 환자 생존, 삶의 질 및 전반적인 결과를 개선하기 위해 지속적으로 테스트되고 있다.
따라서, 뇌암을 포함하는, 악성 세포가 IL13R2를 발현하거나 또는 과발현하는 암의 보다 효과적인 치료를 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에서 기재된다.
일 양태에서, 키메라 핵산 서열이 제공되며, 상기 키메라 핵산 서열은 IL1Rα2 수용체(IL13Rα2)에 결합하는 IL13 키메라 항원 수용체(IL13CAR)를 암호화하는 제1 핵산 및 O6-메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 단백질인 약물-내성 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 IL13CAR은 IL13Rα2에 대한 리간드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 리간드는 IL13이다. 또 다른 구체예에서, 상기 리간드는 IL13Rα2에 결합하는 IL13의 단편이다. 또 다른 구체예에서, 상기 리간드는 IL13Rα2와 선택적으로 결합하는 항체 가변 도메인 또는 그의 단편이다.
일 구체예에서, 상기 MGMT 단백질은 P140K 치환을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 상기 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열의 5'이다. 변경예에서, 상기 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 상기 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열의 3'이다.
일 구체예에서, 상기 IL13CAR를 암호화하는 제1 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다: IL13Rα2 리간드 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 막통과(TM) 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열. 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산 서열은 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 힌지 영역은 IL13 리간드 도메인 및 TM 도메인 사이에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산 서열은 CD28 보조-자극(co-stimulatory) 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 CD28 보조-자극 도메인은 TM 도메인과 CD3-제타 사슬 사이에 위치된다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산 서열은 신호서열을 암호화하는 핵산을 더 포함하며, 상기 신호 서열은 IL13Rα2 리간드 도메인의 N-말단에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다. 다른 구체예에서, 상기 CD8 힌지 도메인은 서열번호 27을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 세포질 도메인은 하나 이상의 보조-자극 도메인을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 보조-자극 도메인은 CD28 보조-자극 도메인이다. 다른 구체예에서, 상기 CD28 보조-자극 도메인은 TM 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 세포질 도메인은 OX-40 보조자극 도메인, HVEM 보조-자극 도메인, 41BB 보조-자극 도메인, ICOS 보조-자극 도메인, OX40 보조-자극 도메인 및 CD27 보조-자극 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 보조-자극 도메인을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 추가적인 보조-자극 도메인은 CD28 보조-자극 도메인과 CD3-제타 신호전달 도메인 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 신호 서열은 이종(heterologous) 신호 서열이다. 다른 구체예에서, 상기 신호 서열은 IL13 신호 서열 또는 이의 변이체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 IL13 신호 서열은 서열번호 25를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 9를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 IL13 리간드 결합 도메인은 성숙 IL13 단백질 (서열번호 26)을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 IL13 리간드 결합 도메인은 성숙 IL13의 단편으로 이루어지며, 상기 단편은 성숙 IL13 단백질 (서열번호 26)이 결합하는 것과 대략 동일한 친화도로 IL13Rα2 단백질에 결합한다.
일 구체예에서, 상기 IL13 리간드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 26, 서열번호 36 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 구체예에서, 상기 성숙 IL13 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 10, 서열번호 34, 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 제1 핵산은 5'에서 3' 방향으로, IL13 리간드 도메인을 암호화하는 서열번호 10, 서열번호 34, 또는 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산, TM 도메인을 암호화하는 서열번호 14 또는 이의 변이체를 포함하는 핵산, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 암호화하는 서열번호 18 또는 이의 변이체를 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 핵산은 IL13 신호 서열을 암호화하는 서열번호 9 또는 이의 변이체를 더 포함하며, 상기 서열번호 9의 서열은 IL13 리간드 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있다. 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 CD8 힌지 도메인을 암호화하는 서열번호 12 또는 이의 변이체를 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 CD28 보조-자극 도메인을 암호화하는 서열번호 16의 핵산 또는 이의 변이체를 더 포함한다.
일 구체예에서, 상기 제1 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 신호전달 도메인을 암호화하는 서열번호 9 또는 이의 변이체의 핵산 서열, IL13 리간드 도메인을 암호화하는 서열번호 10, 서열번호 34, 또는 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산, CD8 힌지 도메인을 암호화하는 서열번호 12 또는 이의 변이체의 핵산 서열, TM 도메인을 암호화하는 서열번호 14 또는 이의 변이체를 포함하는 핵산, CD28 보조-자극 도메인을 암호화하는 서열번호 16 또는 이의 변이체의 핵산 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 암호화하는 서열번호 18 또는 이의 변이체의 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 성숙 IL13 리간드와 CD8 힌지 도메인 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 성숙 IL13 리간드와 CD8 힌지 도메인 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11로 이루어진다.
일 구체예에서, 상기 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 서열번호 12 및 서열번호 14 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 서열번호 12와 서열번호 14 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13으로 이루어진다.
일 구체예에서, 상기 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 서열번호 14와 서열번호 16 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 서열번호 14와 서열번호 16 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15로 이루어진다.
일 구체예에서, 상기 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열은 서열번호 16과 서열번호 18 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 서열번호 16과 서열번호 18 사이의 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17로 이루어진다.
일 구체예에서, 상기 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열은 P140KMGMT (서열번호 22)를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열은 서열번호 33을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열은 G156A-MGMT (서열번호 38), MGMT-2 (서열번호 39), MGMT-3 (서열번호 40) 및 MGMT-5 (서열번호 41)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열은 G156A-MGMT (서열번호 38), MGMT-2 (서열번호 39), MGMT-3 (서열번호 40) 및 MGMT-5 (서열번호 41)을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열은 서열번호 48을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 제2 핵산 서열은 서열번호 49를 포함하지 않는 MGMT 단백질을 암호화한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 자가-절단 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 핵산 서열은 자가-절단 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 21을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 자가-절단 펩티드는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 Kozak 서열을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 Kozak 서열은 서열번호 8을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 Kozak 서열은 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 상류에 위치한다. 일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 Kozak 서열의 상류에 있는 제1 제한 효소(restriction endonuclease) 부위를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 Kozak 서열의 상류의 제한 효소 부위는 서열번호 7로 이루어진다. 일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 하류에 있는 제2 엔도뉴클레아제 부위를 더 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 109 내지 1836, 서열번호 2의 뉴클레오티드 109 내지 1836 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 109 내지 1836으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 13 내지 1836, 서열번호 2의 뉴클레오티드 13 내지 1836 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 13 내지 1836으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 7 내지 1842, 서열번호 2의 뉴클레오티드 7 내지 1842 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 7 내지 1842로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 서열번호 47의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 IL13Rα2 수용체 리간드는 야생형 IL13(서열번호 26)보다 약 5배, 10배 또는 100배 낮은 친화도로 IL13Rα2와 결합하는 IL-13의 변이체 또는 그의 단편이다. 변경예에서, 상기 IL13Rα2 수용체 리간드는 야생형 IL13(서열번호 26)보다 약 5배, 10배 또는 100배 높은 친화도로 IL13Rα2와 결합하는 IL13의 변이체 또는 그의 단편이다.
일 구체예에서, 상기 IL13Rα2 수용체 리간드는 야생형 IL-13과 동일하지 않다. 다른 구체예에서, IL13Rα2 수용체 리간드는 서열번호 26과 동일하지 않다.
일 구체예에서, P140KMGMT 단백질은 IL13-CAR-T로 형질감염된 세포가 화학요법제로 처리될 때 화학요법제로 처리되었으나 약물-내성 폴리펩티드를 발현하지 않는 세포에 비해 약물-내성 폴리펩티드를 발현하는 세포의 인 비트로 및/또는 인 비보 생존력(viability)을 증가시키는데 효과적이다.
일 구체예에서, 상기 IL13Rα2 수용체 리간드는 야생형 IL-13과 동일하지 않다. 다른 구체예에서, IL13Rα2 수용체 리간드는 서열번호 26과 동일하지 않다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 기재된 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 본 명세서에 기재된, IL13CAR, 자가-절단 펩티드, 및 MGMT 단백질을 암호화하는 모노시스트로닉 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 자가-절단 펩티드는 2A 펩티드를 포함한다.
변경예에서, 상기 벡터는 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 폴리시스트로닉 키메라 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서 상기 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 폴리시스트로닉 키메라 핵산 서열은 IL13CAR을 암호화하는 핵산 서열 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치된 내부 리보솜 유입점(IRES)을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 폴리시스트로닉 키메라 핵산 서열은 IL13CAR을 암호화하는 핵산 서열 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치된 프로모터를 더 포함한다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 박테리아 플라스미드 벡터이다. 다른 구체예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된, 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 약물-내성 폴리펩티드를 암호화하는 키메라 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된 세포가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 세포는 T-세포, NK-세포, 및 NKT-세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 종양 항원과 결합하는 리간드, 막통과 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 N-말단에서 C-말단으로 포함하는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
일 구체예에서, 상기 종양 항원과 결합하는 리간드, 막통과 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 N-말단에서 C-말단으로 포함하는 재조합 폴리펩티드는 CAR 및 약물 내성 폴리펩티드 사이에 위치된 자가-절단 펩티드를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 약물 내성 폴리펩티드는 CAR의 N-말단에 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 약물 내성 폴리펩티드는 CAR에 대해의 C-말단에 있다.
다른 양태에서, TMZ에 노출된 세포의 생존력을 증가시키는 변형된 MGMT 폴리펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드가 제공되며, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 CAR을 발현하도록 유전학적으로 변형되고, 상기 세포는 뇌암으로 진단된 환자에 투여된다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 제1 핵산 및 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 제1 핵산은 본 명세서에 기재된 IL13 리간드 도메인, 본 명세서에 기재된 TM 도메인, 및 본 명세서에 기재된 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 CAR 단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 제1 핵산은 CAR 단백질의 IL13 리간드 결합 도메인의 상류에 있는 신호 서열을 더 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 본 명세서에 기재된 힌지 영역을 더 암호화하며, 상기 힌지 영역은 CAR 단백질의 IL13 리간드 도메인과 TM 도메인 사이에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 TM 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인 사이에 위치한 CD28 보조-자극 도메인을 더 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 추가적인 보조-자극 도메인을 더 암호화한다. 다른 구체예에서, 상기 제1 핵산은 CAR 단백질을 암호화하는 핵산의 상류에 Kozak 서열을 더 포함한다.
일 구체예에서, 상기 제2 핵산은 서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 MGMT 단백질을 암호화한다.
일 구체예에서, 상기 MGMT 단백질은 서열번호 49를 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 키메라 핵산을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 본 명세서에 기재된 자가-절단 링커 펩티드를 암호화하는 핵산을 더 포함하며, 상기 자가-절단 링커 펩티드를 암호화하는 핵산은 제1 핵산 및 제2 핵산 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 본 명세서에 기재된 내부 리보솜 유입점(IRES)을 더 포함하며, 상기 IRES는 제1 핵산 및 제2 핵산 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 CAR 단백질을 암호화하는 제1 핵산의 상류에 제1 프로모터 및 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산의 상류에 제2 프로모터를 포함하는 바이시스트로닉 구조체이다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 CAR 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 제1 및 제2 벡터는 각각 플라스미드 또는 발현 벡터이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 및 제2 벡터는 각각 레트로바이러스 입자이다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 제1 핵산 및 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 제1 핵산은 본 명세서에 기재된 IL13 리간드 도메인, 본 명세서에 기재된 TM 도메인 및 본 명세서에 기재된 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 CAR 단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 제1 핵산은 CAR 단백질의 IL13 리간드 결합 도메인의 상류에 있는 신호 서열을 더 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 제1 핵산은 본 명세서에 기재된 힌지 영역을 더 암호화하며, 상기 힌지 영역은 CAR 단백질의 IL13 리간드 도메인과 TM 도메인 사이에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 제1 핵산은 TM 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인 사이에 위치된 CD28 보조-자극 도메인을 더 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 제1 핵산은 추가적인 보조-자극 도메인을 더 암호화한다. 다른 구체예에서, 제1 핵산은 CAR 단백질을 암호화하는 핵산의 하류에 Kozak 서열을 더 포함한다.
일 구체예에서, 제2 핵산은 서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 MGMT 단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 상기 MGMT 단백질은 서열번호 49가 아니다.
일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 키메라 핵산을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 본 명세서에 기재된 자가-절단 링커 펩티드를 암호화하는 핵산을 더 포함하며, 상기 자가-절단 링커 펩티드를 암호화하는 핵산은 제1 핵산 및 제2 핵산 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 본 명세서에 기재된 내부 리보솜 유입점 (IRES)을 더 포함하며, 상기 IRES는 제1 핵산 및 제2 핵산 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 키메라 핵산은 CAR 단백질을 암호화하는 제1 핵산의 상류에 제1 프로모터 및 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산의 상류에 제2 프로모터를 포함하는 디시스트로닉 구조체이다.
일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 CAR 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 제1 및 제2 벡터는 각각 본 명세서에 기재된 플라스미드 또는 발현 벡터이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제1 및 제2 벡터는 각각 본 명세서에 기재된 레트로바이러스 입자이다.
다른 양태에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 재조합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 본 명세서에 기재된 신호 서열, 본 명세서에 기재된 IL13 리간드, 본 명세서에 기재된 막통과 도메인, 본 명세서에 기재된 세포질 신호전달 도메인, 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 힌지 도메인을 더 포함하며, 상기 힌지 도메인은 IL13 리간드 도메인 및 막통과 도메인 사이에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 자가-절단 펩티드를 더 포함하며, 상기 자가-절단 펩티드는 세포질 신호전달 도메인 및 MGMT 단백질 사이에 위치한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물이다.
다른 양태에서, 암으로 진단된 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 세포를 수득하는 단계, 본 명세서에 기재된 IL13CAR 및 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 형질도입하는 단계, 상기 세포를 상기 핵산이 세포에 의해 발현되는 조건 하에 유지시키는 단계, 및 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 발현하는 세포의 치료적으로 유효한 수를 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 세포 내로 도입하는 단계는 IL13CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 세포 내로 도입하는 단계는 IL13CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 사용하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 IL13CAR-P140KMGMT 키메라 구조체를 포함하는 벡터로 형질도입된다.
일 구체예에서 상기 개체는 포유류이다. 다른 구체예에서, 상기 포유류는 영장류, 인간, 또는 마우스이다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 핵산은 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 도입된다.
일 구체예에서, 상기 세포는 T 세포이다.
일 구체예에서, 상기 T 세포는 혈장분리(plasmapheresis)를 사용하여 수득된다.
일 구체예에서, 상기 개체는 뇌암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 난소암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암으로 진단받았다. 다른 구체예에서, 상기 암은 전이되었다.
일 구체예에서, 상기 개체는 고-등급(high-grade) 악성 교종으로 진단받었다. 다른 구체예에서, 상기 개체는 다형성 교모세포종(GMB), 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma) 또는 소아 교종(pediatric glioma)으로 진단받았다.
일 구체예에서, 상기 뇌암은 교모세포종이다. 다른 구체예에서, 상기 뇌암은 고-등급 성상세포종이다.
일 구체예에서, 상기 유방암은 기저양(basal-like) 유방암이다.
일 구체예에서, 상기 방법은 개체를 하나 이상의 화학요법제로 치료하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 개체를 테모졸로마이드 (TMZ)로 치료하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 하나 이상의 화학요법제가 변형된 세포의 투여량을 투여하기 전, 투여하는 동안, 및/또는 투여 후에 개체에게 투여된다.
일 구체예에서, 상기 투여는 두개내, 척수내(intradermally), 피하, 국소, 또는 정맥내이다.
다른 양태에서, IL13CAR-P140KMGMT 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 단계, 상기 IL13CAR-P140KMGMT 키메라 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건 하에 상기 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 IL13CAR-P140KMGMT 구조체를 발현하는 세포를 생산하는 방법이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 세포는 포유류 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 포유류 세포는 인간 세포, 영장류 세포 또는 마우스 세포이다.
일 구체예에서, 상기 세포는 T 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 자가 세포 또는 인간 백혈구 항원(HLA)-매칭된(matched) 세포이다.
일 구체예에서, 상기 세포는 뇌암 또는 악성종양으로 진단된 하나 이상의 개체로부터 수득된다.
다른 양태에서, IL13CAR-P140KMGMT 구조체를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 다른 구체예에서, IL13CAR-P140KMGMT 구조체를 발현하는 상기 세포 집단에서 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 세포가 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 발현하는 T 세포 수용체를 포함하는(T 세포 수용체로 필수적으로 이루어지는, T 세포 수용체로 이루어지는) 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는(키메라 항원을 갖는; 키메라 항원을 포함하는; 키메라 항원으로 필수적으로 이루어지는; 키메라 항원으로 이루어지는) (하나 이상의) 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 CAR은 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질(agent)을 더 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원의 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)(예를 들면, 암 항원-결합 도메인)를 발현하는 T 세포 수용체를 포함하는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는(하나 이상의 핵산 서열로 필수적으로 이루어지는; 하나 이상의 핵산 서열로 이루어지는) 발현 구조체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 CAR은 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원의 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 발현하는 T 세포 수용체를 포함하는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조체를 포함하는(발현 구조체로 필수적으로 이루어지는; 발현구조체로 이루어지는) 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 CAR은 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원의 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는(T 세포 수용체로 필수적으로 이루어지는; T 세포 수용체로 이루어지는) CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 CAR은 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원의 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는(T 세포 수용체를 갖는; T 세포 수용체로 필수적으로 이루어지는; T 세포 수용체로 이루어지는) CAR 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 CAR 폴리펩티드는 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌암의 하나 이상의 종양 항원의 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 발현하는 T 세포 수용체를 포함하는 CAR을 발현하는 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는(단계로 필수적으로 이루어지는; 단계로 이루어지는) 치료를 필요로 하는 개체에서 뇌암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 CAR은 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 발현한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 제공되는 조성물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
전술한 내용은, 같은 참조 번호는 상이한 도면 전반에 걸쳐 동일한 부분을 의미하는 첨부된 도면에 도시된 바와 같이, 하기의 본 발명의 예시적인 구체예의 보다 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 일정한 축척이 아니며, 대신에 본 발명의 구체예를 설명하는데 중점을 두고 있다.
도 1a는 IL13E13K.R109K CAR 핵산 구조체의 개략도를 제공한다.
도 1b는 IL13E13K.R109K CAR을 포함하는 pMFG 숙주 플라스미드의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 2a는 IL13.E13KR109K CAR-2A-P140KMGMT의 개략도를 제공한다.
도 2b는 IL-13-CAR-2A-P140KMGMT를 포함하는 pMFG 숙주 플라스미드의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 3a-3c는 강화 전(도 3a) 및 농축 후(도 3b)의 IL13CAR 구조체 및 IL13CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 함유하는 바이러스로 형질도입된 PG13 세포의 FACS 분석을 나타낸다. 도 3c는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 4는 IL13CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 포함하는 레트로바이러스로 형질도입되고 TMZ에 노출된 T 세포의 생존력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 5a 및 5b는 본 명세서에 기재된 IL13CAR-2A-MGMT 구조체로 형질감염된 세포 내 IL2 (도 5a) 및 IFNγ (도 5b)의 부분을 나타낸다.
도 6은 종양을 보유하고, 본 명세서에 기재된 키메라 구조체 및/또는 화학요법제가 투여된 마우스의 생존력을 나타낸다.
도 7A-7B는 IL13CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 7a; 서열번호 1) 및 아미노산 서열 (도 7b; 서열번호 4)을 제공한다.
도 8a-8b는 IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 8a; 서열번호 2) 및 아미노산 서열 (도 8b; 서열번호 5)을 제공한다.
도 9a-9b는 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 9a; 서열번호 3) 및 아미노산 서열 (도 9b; 서열번호 6)을 제공한다.
도 1a는 IL13E13K.R109K CAR 핵산 구조체의 개략도를 제공한다.
도 1b는 IL13E13K.R109K CAR을 포함하는 pMFG 숙주 플라스미드의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 2a는 IL13.E13KR109K CAR-2A-P140KMGMT의 개략도를 제공한다.
도 2b는 IL-13-CAR-2A-P140KMGMT를 포함하는 pMFG 숙주 플라스미드의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 3a-3c는 강화 전(도 3a) 및 농축 후(도 3b)의 IL13CAR 구조체 및 IL13CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 함유하는 바이러스로 형질도입된 PG13 세포의 FACS 분석을 나타낸다. 도 3c는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 4는 IL13CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 포함하는 레트로바이러스로 형질도입되고 TMZ에 노출된 T 세포의 생존력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 5a 및 5b는 본 명세서에 기재된 IL13CAR-2A-MGMT 구조체로 형질감염된 세포 내 IL2 (도 5a) 및 IFNγ (도 5b)의 부분을 나타낸다.
도 6은 종양을 보유하고, 본 명세서에 기재된 키메라 구조체 및/또는 화학요법제가 투여된 마우스의 생존력을 나타낸다.
도 7A-7B는 IL13CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 7a; 서열번호 1) 및 아미노산 서열 (도 7b; 서열번호 4)을 제공한다.
도 8a-8b는 IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 8a; 서열번호 2) 및 아미노산 서열 (도 8b; 서열번호 5)을 제공한다.
도 9a-9b는 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT 구조체의 키메라 핵산 서열 (도 9a; 서열번호 3) 및 아미노산 서열 (도 9b; 서열번호 6)을 제공한다.
암의 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 리간드(예를 들면, 세포 표면 단백질에 대한 항체 또는 기타 리간드)를 발현하도록 유전공학에 의해 변형된 T 세포 수용체를 포함하는 (하나 이상의) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 생성이 본 명세서에 기재된다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 CAR 단백질은 암 세포의 표면에 발현되는 단백질에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 바람직하게, 상기 종양 항원은 질병에 걸리지 않은 세포 또는 정상 세포의 표면에 발현되지 않거나, 또는 암 또는 다른 질병에 걸린 세포에서 발현되는 수준보다 훨씬 낮은 수준으로 질병에 걸리지 않은 세포 또는 정상 세포에서 발현된다. 결과물인 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포는 CAR에 의해 인식된 표면 항원(예를 들면, 수용체)을 발현하는 종양을 공격하도록 CAR의 신-특이성(neo-specificity)에 의해 리디렉션되며, 또한 CAR이 뇌암을 치료하는 데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질(예를 들면, 치료에 대한 뇌암 세포의 내성을 극복할 수 있는 물질)을 더 포함할 수 있다는 것이 본 명세서에 나타내져 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 악성 세포가 IL13α2 수용체(IL13Rα2)를 발현하는 뇌암을 치료하도록 설계된다. 따라서, 본 개시는 사이토카인 인터루킨 13(IL13) 또는 IL13Rα2와 선택적으로 결합하는 항체의 가변 도메인과 같은, IL13Rα2의 리간드를 발현하고 전시하는 CAR을 사용하여 본 명세서에서 예시화된다. IL13CAR는 O(6)-메틸구아닌-DNA-메틸트랜스퍼라제 (MGMT) 유전자에 의해 발현된다. 일 구체예에서, 상기 MGMT 유전자는 뇌암을 치료하기 위해 사용되는 화학요법제, 테모졸라마이드(TMZ)에 대해 숙주세포(예를 들면, T 세포)의 내성을 부여하거나 향상시키는 단백질을 암호화하도록 변형된다.
일 바람직한 구체예에서, 상기 IL13CAR은 13번째 위치(서열번호 26에 대한 넘버링)에서 글루타메이트가 티로신으로 변경되도록 돌연변이된 IL13을 포함한다. 바람직한 변경예에서, 상기 IL13은 13번째 위치에서 글루타메이트가 라이신으로 변경되고 109번째 위치에서 아르기닌이 라이신으로 변경되도록 돌연변이된다 (아미노산 위치 13 및 109은, 예를 들면, 서열번호 26에 관한 것임). 일 구체예에서, 상기 IL13은 109번째 위치의 아미노산이 아르기닌에서 라이신으로 변경되도록 돌연변이된다.
일 바람직한 구체예에서, 변형된 MGMT 유전자는 TMZ와 같은 메틸화제의 치료에 의해 유발된 세포독성으로부터 IL13CAR-P140KMGMT-발현 T 세포를 보호하는 P140KMGMT (서열번호 33)와 같은 본 명세서에 지칭된 MGMT 변이체를 암호화한다.
일 구체예에서, IL13CAR 및 P140KMGMT 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 IL13CAR, 자가-절단 펩티드 (2A), 및 P140KMGMT을 포함하는 단일 단백질을 암호화하는 단일 전사물을 생산하도록 전사되는 모노시스트로닉 구조체로부터 발현된다. 이 융합 단백질의 번역 후, 자가-절단 펩티드의 분열은 핵 내로 국소화된 P140KMGMT 단백질 및 P140KMGMT 단백질이 핵 및 IL13 리간드 도메인은 숙주 세포의 표면에 전시되는 IL13CAR을 초래한다. 그러나, IL13CAR 및 P140KMGMT 단백질이 개별적인 핵산으로부터 발현될 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들면, IL12CAR 및 P140KMGMT 단백질을 암호화하는 핵산은 분리된 벡터 안에 존재한 다음, 동일한 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 그들은 개별 모노시스트로닉 구조체(예를 들면, 각각 그들 자신의 프로모터를 갖음)와 같은 단일 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
IL13CAR-2A-P140KMGMT 구조체로 형질도입된 T 세포는 TMZ의 존재에서 P140KMGMT를 발현하지 않는 IL13CAR-형질도입된 T 세포와 비교했을 때 더욱 잘 생존하였다(예를 들면, 실시예 6; 도 6). 따라서, CAR 및 약물 내성 폴리펩티드 (MGMT 단백질)를 암호화하는 핵산 서열, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 또는 레트로바이러스 벡터, 하나 이상의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포, 및 변형된 T 세포에서 변형된 MGMT 유전자를 동시 발현(co-expressing) 시킴으로써 TMZ와 같은 화학요법에 노출된 유전학적으로 변형된 T 세포의 생존력을 향상시키는 방법이 본 명세서에 또한 기재된다.
또한 IL13Rα2를 발현하는 세포를 포함하는 암으로 진단된 개체를 치료하는 방법이 계획된다. 예를 들면, 고-등급 악성 교종과 같은 뇌암 및 기저양 유방암 세포는 동일한 조직의 비-질병 또는 비-암성 세포에 비해 IL13Rα2 단백질을 과발현한다. 청구된 조성물은 개체가 메틸화 화학요법제 및 IL13CAR 및 변형된 MGMT 유전자를 발현하는 유전학적으로 변형된 면역 세포(예를 들면, T 세포) 모두를 투여받을 때 특히 유용하다. 이 방법은 화학요법 또는 유전학적으로 변형된 T 세포로 치료되는 경우보다 치료 시간을 줄일 수 있고, 빠르고 효과적으로 교종 퇴치(abolition)를 달성할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 암의 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 리간드(예를 들면, 항체)를 발현하는 T 세포에서 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는 (하나 이상의) 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적 물질을 더 발현한다.
정의
본 명세서에서 사용된 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 하나 이상의 세포외 암 항원-결합 도메인, 하나 이상의 막통과 도메인 및 T-세포 활성화를 위한 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 분자를 의미하며, 암 리간드(예를 들면, 암 항원)를 발현하는 세포에 대한 특이성을 갖는다. T 세포 내로 도입될 때, CAR은 T 세포의 특이성을 리다이렉트한다. 특정 양태에서, CAR은 단일 분자로 발현된다.
본 명세서에서 사용된, "암 항원-결합 도메인"은 암 세포에 의해 발현된 하나 이상의 항원(하나 이상의 암 항원)에 결합하는 도메인을 의미한다. 특정 양태에서, 암 항원-결합 도메인은 특이적으로 (선택적으로) 암 항원과 결합하고 비-암 세포(예를 들면, 정상 세포, 건강한 세포, 야생형 세포)에 의해 발현되지 않는 비-특이적 표적에 결합하지 않는 결합 도메인이다.
다양한 암 항원-결합 도메인은 알려진 방법을 이용하여 사용되고 생산될 수 있으며, 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상기 암 항원-결합 도메인은 예를 들면, 핵산, 펩티드(단백질), 항체, 유기 분자, 합성 분자 등일 수 있다. 그와 같은 암 항원-결합 도메인은 예를 들면, 라이브러리로부터 유래되거나 및/또는 천연 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "IL13CAR"은 IL13의 변이체 (IL13의 기능적 단편(예를 들면, IL13Rα2에 결합할 수 있는 IL13의 단편)을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 및 IL13Rα2와 선택적으로 결합하는 면역글로불린 도메인과 같은 다른 IL13 리간드를 포함하나 이에 한정되지 않는, 본 명세서에 기재되거나 또는 당해 분야에 공지된 IL13 리간드를 포함하는 CAR을 포함한다. 유사하게, 본 명세서에서 사용된 용어 "MGMT"는 본 명세서에 기재되거나 또는 당해 분야에 공지된 야생형 MGMT 및 임의의 MGMT 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 투여량 또는 양에 적용되는 용어 "치료적으로 유효한"은 본 개시의 키메라 수용체를 포함하고 치료를 필요로 하는 개체에 투여시 원하는 활성을 가져오기에 충분한 약물 내성 폴리펩티드를 더 포함하는, 화합물 또는 약학적 조성물(예를 들면, T 림프구 및/또는 NK 세포와 같은 면역 세포를 포함하는 조성물)의 양을 의미한다. 본 명세서에 개시된 문맥 안에서 용어 "치료적으로 유효한"은 본 개시의 방법에 의해 치료되는 질환의 징후를 지연시키거나, 진행을 정지시키거나, 적어도 하나의 증상을 없애거나 또는 완화시키기에 충분한 화합물 또는 약학적 조성물의 양을 의미한다. 유효 성분의 조합이 투여될 때, 조합의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우보다 효과적이었던 각 성분의 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다는 것을 유념한다.
본 명세서에 개시된 조성물과 관련하여 사용되는 "약학적으로 허용가능한"은 포유류(예를 들면, 인간)에 투여될 때 생리학적으로 관용할 수 있고 일반적으로 부작용(untoward reaction)을 낳지 않는, 그러한 조성물의 분자 실체 및 다른 성분을 의미한다. 바람직하게, 본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한"은 포유류, 특히 인간에 사용하기 위해 연방정부 또는 주정부의 관리 기관(regulatory agency)에 의해 승인되거나 또는 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 기타 일반적으로 인식된 약전에 등재된 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체(subject)"는 임의의 포유류를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 상기 개체는 인간이다.
다른 양태에서, 암 항원-결합 도메인은 항체의 전부 또는 항체의 생물학적 활성 부분이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원과 선택적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "선택적으로 결합"은 시료에서 항원 또는 그의 단편에 결합하는 항체의 능력 및 다른 분자 (예를 들면, 항원)에 실질적으로 결합할 수 없는 능력을 의미한다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 Fab 단편 (예를 들면, F(ab), F(ab')2), 가변 단편 (예를 들면, 단일 사슬 가변 (scFv), 디-scFv, 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 이중-특이적 단편 (예를 들면, 이중-특이적 T 세포 관여자(engager) (BiTE))를 포함한다. 그러한 단편들은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있거나 및/또는 예를 들면, 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생산될 수 있다.
항체는 암 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 (예를 들면, 선택적으로 결합하는) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "폴리클로날 항체"는 각각 상이한 에피토프를 확인하는, 특정 항원에 결합하는 항체 집단에서 유래된 항체이다. 본 명세서에서 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 하나 이상의 항원의 특정한 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 하나의 종만을 함유하는 항체 분자의 집단을 의미한다. 따라서 모노클로날 항체 조성물은 통상적으로 그것이 면역반응하는 특정 항원에 대해 단일 결합 친화도를 보인다.
폴리클로날 항체는 하기에 기재된 바와 같이 IL13Rα2 단백질의 세포외 도메인과 같은 하나 이상의 바람직한 암 항원으로 적합한 개체를 면역화하는 것에 의해 제조될 수 있다. 면역화된 개체에서 항체가(antibody titer)는 고정화된 폴리펩티드를 사용하는 효소결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의하는 것과 같은 표준 기법에 의해 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 필요에 따라, 암 항원에 대한 항체 분자는 포유류로부터 (예를 들면, 조직, 혈액으로부터) 단리될 수 있고, IgG 분획을 수득하기 위한 단백질 A 크로마토그래피와 같은, 잘 알려진 기법에 의해 더 정제될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 IL13Rα2 단백질의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 만들 수 있을 것이다.
면역화 후 적절한 시간에, 예를 들면, 항체가가 가장 높을 때, 항체-생산 세포가 개체로부터 수득될 수 있고, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)에 의해 처음 기재된 오리지널 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법 (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983)), EBV-하이브리도마 기법 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)) 또는 토리오마(trioma) 기법과 같은 표준 기법에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 기법은 잘 알려져 있다 (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1994)를 일반적으로 참조한다). 간략하게, 불멸의 세포주 (통상적으로 골수종)는 상기에 기재된 면역원으로 면역화된 포유류 유래의 림프구(통상적으로 비장세포(splenocyte))와 융합되고, 결과로 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상등액은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정하기 위해 스크리닝된다.
림프구와 불멸화된 세포주를 융합하는데 사용되는 임의의 많은 잘 알려진 프로토콜이 암 항원에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 목적에 적용될 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Immunology, supra; Galfre et al., Nature, 266:55052 (1977); R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 및 Lerner, Yale J. Biol. Med. 54:387-402 (1981) 참조). 게다가, 통상의 기술자는 또한 유용할 수 있는 그러한 방법들의 많은 변형이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 일 대체예에서, 암 항원에 대한 모노클로날 항체는 그에 의해 암 항원과 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리하기 위한 폴리펩티드로 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들면, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하는 것에 의해 동정되고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용하는데 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들면, 미국 특허번호 제5,223,409호; PCT 공개번호 제WO 92/18619호; PCT 공개번호 제WO 91/17271호; PCT 공개번호 제WO 92/20791호; PCT 공개번호 제WO 92/15679호; PCT 공개번호 제WO 93/01288호; PCT 공개번호 제WO 92/01047호; PCT 공개번호 제WO 92/09690호; PCT 공개번호 제WO 90/02809호; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); 및 Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에서 발견될 수 있다.
또한, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있는 인간 및 비-인간 부분을 포함하는 키메라 및 인간화 모노클로날 항체와 같은 재조합 항체는 본 발명의 범주 안에 있다. 그와 같은 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당해 분야에서 공지된 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다.
폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 임의의 상기 통상적인 방법이 IL13Rα2 단백질의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 방법에 용이하게 적용될 수 있다. 그리고 나서 그 결과로 생긴 항체의 가변 영역 또는 그의 단편은 IL13 리간드 도메인 (서열번호 26)이 IL13Rα2 단백질에 결합하는 친화도와 거의 동일한 친화도로 IL13Rα2 단백질에 결합하는 IL13 리간드 도메인을 생산하는데 사용될 수 있다.
발명의 구성
본 발명은 IL13Rα2에 특이적인 CAR을 발현하는 면역 세포에 적어도 부분적으로 기초하며, 상기 세포는 TMZ와 같은 화학요법제에 대한 내성이 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 뇌암 세포에 대해 선택적인 CAR 단백질, 및 약물-내성 폴리펩티드 모두를 암호화하는 핵산 (또한 본 명세서에서 키메라 핵산 서열이라 지칭됨)을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 CAR 단백질은 IL13CAR이고 상기 약물 내성 폴리펩티드는 그것을 발현하는 세포에 TMZ-내성을 부여할 수 있는 MGMT 단백질이다. 키메라 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 IL13CAR 단백질 및 MGMT 약물 내성 단백질 둘 다를 암호화하도록 구축될 수 있다. IL13CAR 단백질 및 MGMT 단백질의 도메인 또는 서열 영역의 설명 및 각 도메인 또는 영역의 비-제한 예들이 하기에 제공된다. 상기 IL13CAR 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 뇌암 세포와 같은 질병에 걸린 세포상의 IL13R2α와 선택적으로 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 선형 키메라 (융합) 단백질이다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL13CAR 단백질은 IL13 리간드 도메인의 N-말단에 위치한 신호 도메인 및/또는 리간드 도메인과 막통과 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 짧은 펩티드 링커가 CAR 단백질의 영역 또는 도메인 (예를 들면 신호 서열, IL13 리간드 도메인, 힌지 영역, 막통과 도메인, CD28 보조-자극 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인, 또는 추가적인 보조-자극 도메인)을 분리하기 위해 IL13CAR에 포함된다. 짧은 펩티드 링커는 임의의 다른 두 영역 (도메인) 사이의 짧은 펩티드 링커의 존재 또는 부재와 독립적인 임의의 두 영역 사이에 존재할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들면, 작은 펩티드 링커가 CAR에 존재할 수 있고, 상기 링커는 신호 서열 (존재하는 경우) 및 IL13 리간드 도메인, IL13 리간드 도메인 및 막통과 도메인, IL13 리간드 도메인 및 힌지 영역 (존재하는 경우), 힌지 영역 (존재하는 경우) 및 막통과 도메인, 막통과 도메인 및 CD28 동시-신호전달(co-signaling) 도메인 (존재하는 경우), CD28 동시-신호전달 도메인 (존재하는 경우) 및 CD3-제타 신호전달 도메인, 막통과 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인, 및/또는 CD3-제타 신호전달 도메인 및 추가적인 보조-자극 도메인 (존재하는 경우)을 분리한다. 펩티드 링커는 제한 효소 부위 또는 각각의 영역 또는, 모노시스트로닉 구조체의 경우 IL13CAR-자가-절단 펩티드-MGMT 키메라 단백질의 도메인을 암호화하는 핵산의 접합(ligation)을 허용하는 다른 특징을 함유한 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산일 수 있다. 이들 각각의 도메인 및 링커는 하기에 보다 상세하게 설명된다.
일 양태에서, 암 항원-결합 도메인은 펩티드 또는 단백질 (예를 들면, 암 세포의 표면에 발현되는 항원과 결합하는 리간드; 암 세포의 표면에 발현되는 수용체와 결합하는 리간드)이다. 바람직한 구체예에서, 상기 수용체는 IL132α 수용체이고 상기 CAR은 IL132α 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드를 포함하도록 구축된다. 특정 양태에서, 상기 암 항원-결합 도메인은 인터루킨 13 (IL13) 또는 하나 이상의 삽입, 결실 또는 점 돌연변이 (예를 들면, E13K IL13; R109K IL13; 및/또는 E13Y IL13)를 갖는 IL-13의 변이체이다. 상기 암 항원-결합 도메인은 대안적으로 scFv 단편과 같은, IL13Rα2에 선택적으로 결합하는 항체의 가변 도메인 또는 그의 단편일 수 있다.
하기 표 1 및 2는 각각 본 발명의 조성물, 예를 들면, 키메라 핵산 서열, 및 방법에서 사용될 수 있는 본 명세서에 각각 기재된 핵산 및 폴리펩티드의 요약을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 표 1에서 언급되는 핵산 서열의 임의의 조합을 포함하는 키메라 핵산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 표 2에서 언급되는 아미노산 서열의 임의의 조합을 암호화하는 키메라 핵산 서열을 포함한다.
| 서열번호 | 설명 | 서열번호 1에 대한 뉴클레오티드 위치 |
| 1 | IL13(WT)CAR-P140K 전장 (서열번호 1) | |
| 2 | IL13(E13Y)CAR-P140K 전장 (서열번호 2) | |
| 3 | IL13(E13K.R109K)CAR-P140K 전장 (서열번호 3) | |
| 7 | 제한 효소 부위 | 1-6 |
| 8 | Kozak 서열 | 7-12 |
| 9 | IL13 신호 서열 | 13-108 |
| 10 | 성숙 IL13 | 109-450 |
| 11 | 디펩티드 링커-1 | 451-456 |
| 12 | CD8 힌지 영역 | 457-591 |
| 13 | 디펩티드 링커-2 | 592-597 |
| 14 | CD3 제타 막통과 도메인 | 598-666 |
| 15 | 디펩티드 링커-3 | 667-672 |
| 16 | CD28 보조자극 도메인 | 673-804 |
| 17 | 디펩티드 링커-4 | 805-810 |
| 18 | CD3 제타 신호전달 도메인 | 811-1140 |
| 19 | 정지 코돈 | 1141-1143 |
| 20 | 5 아미노산 링커/제한 부위/리딩 프레임 조정(adjust) | 1144-1158 |
| 21 | 자가-절단 펩티드 | 1159-1212 |
| 22 | P140K MGMT 약물 내성 폴리펩티드 | 1213-1839 |
| 23 | 정지 코돈 | 1840-1842 |
| 24 | 제한 효소 부위 | 1843-1846 |
| 34 | E13Y 변이를 갖는 성숙 IL13 | 109-450 |
| 35 | E13KR109K를 갖는 성숙 IL13 | 109-450 |
| 48 | MGMT 약물 내성 폴리펩티드 (P140) |
| 서열번호 | 설명 | 서열번호 4에 대한 아미노산 위치 |
| 4 | IL13(WT)CAR-P140K 전장 (서열번호 4) | |
| 5 | IL13(E13Y)CAR-P140K 전장 (서열번호 5) | |
| 6 | IL13(E13K.R109K)CAR-P140K 전장 (서열번호 6) | |
| 25 | IL13CAR-P140K - IL13 신호 서열 | 1-32 |
| 26 | IL13CAR-P140K - wt 성숙 IL13 | 33-146 |
| 디펩티드 링커-1 | 147-148 | |
| 27 | IL13CAR-P140K - CD8 힌지 영역 | 149-193 |
| 디펩티드 링커-2 | 194-195 | |
| 28 | IL13CAR-P140K - CD3 제타 막통과 도메인 | 196-218 |
| 디펩티드 링커-3 | 219-220 | |
| 29 | IL13CAR-P140K - CD28 보조자극 도메인 | 221-264 |
| 디펩티드 링커-4 | 265-266 | |
| 30 | IL13CAR-P140K - CD3 제타 신호전달 도메인 | 267-376 |
| 31 | 5 아미노산 링커/리딩 프레임 조정/제한 부위(restriction site) | 377-381 |
| 32 | IL13CAR-P140K - 2A 자가-절단 펩티드 | 382-399 |
| 33 | IL13CAR-P140K - P140K MGMT 약물 내성 단백질 | 400-606 |
| 36 | E13Y 변이를 갖는 성숙 IL13 | 33-146 |
| 37 | E13KR109K를 갖는 성숙 IL13 | 33-146 |
| 38 | G156A-MGMT | |
| 39 | MGMT-2 | |
| 40 | MGMT-3 | |
| 41 | MGMT-5 | |
| 43 | MGMT (GenBank NP_002403-(P140K)) | |
| 44 | IL13Rα2 | |
| 45 | IL13(WT)CAR-P140K 전장 (서열번호 45) | |
| 46 | IL13(E13Y)CAR-P140K 전장 (서열번호 46) | |
| 47 | IL13(E13K.R109K)CAR-P140K 전장 (서열번호 47) | |
| 49 | MGMT P140 |
리간드
IL13CAR 리간드 (대안적으로, 리간드 도메인)는 병에 걸린 세포에 의해 발현되는 IL13 수용체, 예를 들면, IL13Rα2에 선택적으로 결합하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 상기 병에 걸린 세포는 종양 세포 또는 기타 암성 또는 악성 세포일 수 있고, 상기 병에 걸린 세포에 의해 발현되는 단백질은 본 명세서에서 대안적으로 암 항원으로 지칭된다. 일부 구체예에서, 상기 암 항원은 전혀 건강하지 않은 조직 세포 또는 소수의 (mRNA 발현 프로파일링에 의해 결정될 때 50%, 40%, 30% 20% 또는 10% 미만) 건강한 조직 세포에 의해 발현되는 단백질이다. 일 구체예에서, 상기 병에 걸린 세포는 교모세포종 세포와 같은 뇌암 세포이다. 특정 양태에서, 상기 암 항원-결합 도메인은 IL-13R (예를 들면, IL13Rα2, 예를 들면, GenBank Acc. No. NP_000631; 서열번호 44)에 결합하는(예를 들면, 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는) 항체의 전부 또는 생물학적 활성 부분이다. 다른 양태에서, 상기 리간드 (암 항원-결합 도메인)는 IL-13R (예를 들면, IL13Rα2)에 대한 (결합하는; 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는) scFv이다.
암 (예를 들면, 종양) 세포에 의해 발현되는 다양한 항원은 당해 분야에 알려져 있다. 일 양태에서, 상기 암 항원은 뇌 종양 항원으로, 예를 들면, 종양 표면에 발현된다. 특정 양태에서, 상기 뇌 종양 항원은 고-등급 악성 교종에 의해 발현된다 (예를 들면, 교종/악성 뇌 종양 항원). 고-등급 악성 교종의 구체적 예는 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 성상세포종 및 소아 교종을 포함한다. 고-등급 교종의 종양 세포에 의해 발현되는 항원의 구체적 예는 EGFRvIII, EphA2, Her-2 및 IL-13R (예를 들면, IL13Rα2)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 표적화되는 암 항원은 GBM 종양에서 과발현되지만 정상 뇌 조직에서는 최소로 발현되거나 발현되지 않는, 다형성 교모세포종 (GBM)-관련 단백질, IL13 수용체 α-2 (IL13Rα2)이다 (Thaci et al., Neuro - Onco , l6(10):1304-1312 (2014); Sengupta et al., Biomed Res Int , 2014:952128 (2014)). 일 양태에서, 상기 IL13CAR은 IL13 및/또는 IL13α2 수용체에 결합하는 E13K IL13 (서열번호 36) 및/또는 R109K IL13 (서열번호 37)과 같은 IL13 돌연변이체인 리간드 도메인을 발현하거나 또는 함유한다 (Kong et al., Clin 암 Res,18(21) :5949-5960 (2012)). 상기 IL13Rα2 단백질은 또한 유방암 전이를 포함하는 상향조절된 유방암으로 밝혀졌고 (Papageorgis et al., 2015, Breast Canc Res, 17:98-112). 두경부암에서 존재하는 것으로 알려졌으며 (Joshi et al., 2000, Cancer Res, 60:1168-1172; Kawakami et al, 2003, 9:6381-6388), 또한 췌장암, 난소암 및 대장암의 침윤 및 전이를 촉진하는 것으로 입증되었다 (Fujisawa et al., 2009, Int J Cancer, 69:8678-8695; Barderas et al., 2012, Cancer Res, 72:2780-2790). 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 악성 종양으로 진단된 개체를 치료하기 위한 방법에 유용하며, 상기 악성종양의 유형은 뇌암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 난소암 및 대장암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당해 분야의 통상의 기술자는 IL13Rα2에 특이적으로 결합하는 리간드를 생산할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 또는 IL13Rα2의 세포외 도메인으로 마우스의 면역화를 통해서와 같은, 통상적인 실험이 IL13Rα2와 선택적으로 결합하는 항체를 생성하기 위해 행해진다. 그리고 나서 원하는 선택적 결합 활성을 갖는 항체의 가변 도메인이 단일 사슬 가변 도메인 (scFv)을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 야생형 IL13, IL13(E13Y), IL13(R109K) 또는 IL13(E13K.R109K)와 동일한 친화도로 IL13Rα2에 선택적으로 결합하는 scFv가 본 명세서에 개시된 IL13CAR 구축물 내 리간드로서 사용될 수 있다.
일 구체예에서, IL13CAR은 서열번호 26과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 IL13 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 IL13 리간드 도메인을 가지며, 상기에서: a) 서열번호 26의 13번째 위치의 아미노산은 글루타메이트이거나; b) 서열번호 26의 13번째 위치의 아미노산은 티로신이거나; 또는 c) 서열번호 26의 13번째 위치의 아미노산은 라이신이고 서열번호 26의 109번째 위치의 아미노산은 아르기닌이다. 일 구체예에서, IL13CAR IL13 리간드 도메인은 서열번호 26, 서열번호 36 또는 서열번호 37, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
본 개시에 따른 핵산은 상기에 기재된 IL13 폴리펩티드를 암호화한다. 일 구체예에서, IL13 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 10, 서열번호 34 및 서열번호 35으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IL13CAR은 선택적으로 IL13CAR 단백질을 숙주 세포 표면에서 가공되고 전시되도록 허용하는 신호 (리더) 펩티드를 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 신호 펩티드는 리간드 단백질에 대한 천연 신호 펩티드이다. 예를 들면, 상기 리간드 도메인은 그것의 신호 서열 (서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 신호 서열)을 포함하는 전장 IL13 단백질을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 신호 서열은 서열번호 25와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 본 개시에 따른 핵산은 신호 펩티드를 암호화한다. 일 구체예에서, 신호 펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 9로 이루어진다.
당해 분야의 통상의 기술자는 이종(heterologous) 신호 서열-IL13이 아닌 분비된 단백질 또는 막통과 단백질 유래의 신호 펩티드-이 사용될 수 있음을 이해한다. 신호 펩티드 (신호 서열)은 폴리펩티드의 막 전송(membrane translocation)에 필요하며, 막 전송 후 또는 막 전송 중에 가공되는 막-결합 또는 분비된 폴리펩티드의 본질적 부분이다. 신호 서열은 약 13 내지 36개의 아미노산 길이를 가지고 아미노-말단 끝에 적어도 하나의 양성 잔기를 함유한다. 신호 서열의 중심은 10 내지 15 잔기의 강하게 소수성 부분이며, 예를 들면, Nunnari, j., et al., Curr. Opin. Cell Biol. 4 (1992) 573-580 and by Gilmore, R., et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674 (1992) 27-37에 의해 기재된다. 신호 펩티드의 일부 예는 VHCAMP, CD40, CD40L 또는 TNF-R의 신호 펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 신호 펩티드는 표적 세포의 막 내로 통합시 절단된다. IgG-유사 단백질의 것과 같은, 이종 신호 서열이 사용될 수 있다는 것이 또한 고려된다.
힌지 영역
본 명세서에 개시된 IL13CAR은, IL13 리간드 도메인 (항원 결합 도메인) 및 막통과 도메인 사이에 위치하는, 힌지 영역 또는 힌지 도메인이라 또한 지칭되는 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 본 개시에 의해 포함되는 IL13CAR은 힌지 영역을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 현재 기재된 CAR의 힌지 영역은 항원 인식을 용이하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 다른 방향으로 배향되게 하도록 충분히 통상적으로 가요성인 펩티드 서열이다. 당해 분야의 통상의 기술자에 이해되는 바와 같이, 다른 적절한 스페이서가 결정될 수 있다. 예를 들면, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들면, 2 내지 10개의 아미노산 길이가 CAR의 막통과 도메인과 세포질 영역 사이의 연결을 형성할 수 있다. 힌지 영역의 예는 면역글로불린 (예를 들면, IgG1의 힌지 영역) 유래의 힌지영역이며, 면역글로불린-유사 단백질 또는 도메인 유래의 힌지 영역, 면역글로불린의 CH2CH3 영역, 및 CD3의 일부를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 힌지 영역은 CD8 알파 사슬 유래의 Ig-유사 도메인을 포함한다.
IL13CAR의 일 구체예에서, 상기 힌지 영역은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진다. 대안적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 27과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하거나 또는 서열번호 27과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열로 이루어진다. 본 개시에 따른 핵산은 힌지 영역을 암호화한다. 일 구체예에서, 상기 힌지 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 12를 포함한다. 일 구체예에서, IL13CAR를 암호화하는 핵산은 서열번호 12와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 핵산을 포함한다.
막통과
도메인
본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR은 하나 이상의 막통과 도메인을 포함한다. 통상적으로, 막통과 도메인은 막에 걸쳐진 소수성 영역 (예를 들면, 소수성 알파 헬릭스)이다. 임의의 다양한 막통과 도메인이 사용될 수 있다. 적절한 막통과 도메인의 예는 CD3 (예를 들면, CD3-제타 막통과 도메인) 또는 CD28 막통과 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 막통과 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합 또는 막통과 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 막통과 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 대한 신호전달을 가능하게 한다. 본 발명에서 특정 용도의 막통과 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막통과 영역(들)을 적어도 포함할 수 있다.
일 구체예에서, IL13CAR의 막통과 도메인은 인간 CD3 제타 사슬의 일부, 예를 들면, 서열번호 28을 포함하거나 또는 적어도 인간 CD3 제타 사슬의 일부, 예를 들면, 서열번호 28로 이루어진다. 일 구체예에서, 막통과 도메인은 서열번호 28과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하거나 또는 서열번호 28과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 서열로 이루어진다. 본 개시에 따른 핵산은 막통과 도메인을 암호화한다. 일 구체예에서, 상기 막통과 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 핵산을 포함한다.
세포질 신호전달 도메인(들)
본 명세서에 기재된 바와 같이, 항원이 결합된 (예를 들면, T 세포의 활성화, 개시, 확장, 지속 및/또는 증폭, 및 종양 항원에 대한 T 세포 반응 (예를 들면, 세포독성에 요구되는 신호)을 초래) 후 IL13CAR은 T 세포로 활성화 및/또는 자극 신호를 전송하는 세포질 도메인을 갖는다. 세포질 도메인은 하나 이상의 신호전달 도메인 (예를 들면, 보조-자극 도메인) 및/또는 T 세포 수용체의 또는 T 세포 수용체와 연관된 하나 이상의 활성화 도메인을 포함한다. 적절한 세포질 신호전달 도메인의 예는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하는 CD3-ζ (CD3-제타), FcεRIγ, CD28 (예를 들면, 키메라 CD28), 4-IBB (CD137), DAP10, OX40 (CD134), CD4, CD27, CD244, 유도성 T-세포 보조-자극자 (ICOS), 백혈구 C-말단 SRC 키나제 (LCK), 및 CD137의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다 (예를 들면, Sadelain et al., Cancer Discov , 3(4):388-398 (2013); Lee et al., Clin Cancer Res, 18(10):2780-2790 (2012)). 하나 이상의 이들 세포질 도메인의 존재는 신호전달 중간생성물(intermediate) 및 유전자 전사의 촉발을 초래하는, CAR의 세포질 도메인 안의 요소와 ZAP70, TNF 수용체-연관 인자 1 (TRAF1), PI3K 및 성장 인자 수용체-결합 단백질 2 (GRB2)의 결합에 의한 경로를 개시할 수 있다.
"보조-자극 도메인" 또는 "보조-자극 신호전달 도메인"은 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 의미한다. 보조-자극 분자는 항원과 결합시 T 림프구의 유효한 활성화 및 기능에 필요한 제2 신호를 제공하는, 항원 수용체 또는 Fc 수용체와는 다른 세포 표면 분자이다. 보조-자극 도메인은, 예를 들면, CD3-제타 신호전달 도메인을 통해 세포에 활성화 신호를 유도하는 입체형태 변화를 겪는다. 보조-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 접착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M 1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제(agonist) 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. IL13CAR 내로 하나 이상의 보조-자극 도메인의 포함(inclusion)은 IL13CAR을 발현하는 T 세포의 효능 및 확장을 향상시킬 수 있다. 일 구체예에서, 보조-자극 도메인은 또한 그 중에서도, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같으나 이에 한정되지 않는, T 세포에 존재하는 보조자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
당해 분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, IL13CAR은 임의의 수의 활성화 도메인 및/또는 자극 도메인을 가질 수 있다. 각각의 신호전달 도메인은 IL13CAR 구성체의 세포질 도메인을 형성하기 위해 결합된 펩티드를 통해 연결된다. 일 양태에서, IL13CAR은 활성화 도메인 및 자극 도메인을 갖는다. 다른 양태에서, IL13CAR은 1, 2, 3, 4, 5개 등의 활성화 도메인 및 1, 2, 3, 4, 5개 등의 자극 도메인을 갖는다.
일 구체예에서, 본 개시의 IL13CAR은 인간 CD28 단백질의 신호전달 도메인 및/또는 인간 CD3-제타 사슬의 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, IL13CAR은 CD28 및 CD3-제타 사슬 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 CD28 보조-자극 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인의 N-말단에 있다. CD3-제타 도메인이 CD28 보조-자극 도메인의 N-말단인 CAR 세포질 도메인이 또한 고려된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CD28 보조-자극 도메인은 서열번호 29의 서열을 포함한다. CD3-제타 신호전달 도메인은 서열번호 30의 서열을 포함하거나 또는 서열번호 30의 서열로 이루어진다. 본 개시에 따른 핵산은 CD28 보조-자극 도메인을 암호화한다. 일 구체예에서, CD28 보조-자극 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 16으로 이루어진다. 본 개시에 따른 핵산은 CD3-제타 신호전달 도메인을 암호화한다. 일 구체예에서, CD3-제타 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 18로 이루어진다. 각각의 이들 신호전달 도메인은 하나 이상의 결실, 삽입 또는 점 돌연변이 (천연 또는 인공)를 함유할 수 있으며, 상기 각 도메인의 신호전달 기능은 하나 이상의 결실, 삽입 또는 점 돌연변이를 함유하지 않는 단백질의 신호전달 기능과 거의 동일하다.
일 구체예에서, IL13CAR의 세포질 도메인은 서열번호 1의 뉴클레오티드 673-1140, 서열번호 1의 뉴클레오티드 673-1143을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 다른 구체예에서, 상기 IL13CAR은 서열번호 4의 아미노산 잔기 221-376을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
도 1a는 IL13 리간드가 E13K 및 R109K 치환을 함유하는 변이체인 IL13CAR 구조체의 구체예를 도시한다.
약물 내성 폴리펩티드
본 개시는 최소 부분적으로, 상기에서 상세히 설명된 뇌암 세포에 대해 선택적인 CAR 단백질 및 약물-내성 폴리펩티드 모두를 암호화하는 핵산에 관한 것으로, 상기 CAR 및 약물 내성 폴리펩티드의 발현은 암을 치료하는데 유용하다. 예를 들면, CAR 및 약물 내성 폴리펩티드는 화학요법제 및/또는 화학요법제의 세포독성을 향상시키는 작용제로 치료되는 개체에 투여된 세포에 발현될 수 있다. 화학요법제의 예는 악성 교종 (예를 들면, 다형성 교모세포종 (GBM))을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로스우레아 (BCNU 또는 카르무스틴),포테무스틴, 로무스틴 및 테모졸로마이드 (TMZ)를 포함한다. 일부 화학요법제의 세포독성 작용은 치명적인 사슬내(intrastrand) 교차결합을 형성하도록 재배열될 수 있는 O6-메틸구아닌 병변의 형성을 포함한다. 그러나, 이들 메틸화제의 효과는 DNA 수선 단백질, O6-메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제 (MGMT), 치료된 세포의 DNA 유래의 세포독성 O6-알킬구아닌 부가물을 제거하는 단백질의 종양 과발현에 의해 제한된다. 그러므로 높은 수준의 MGMT를 발현하는 종양 세포는 TMZ 화학요법에 의해 살상되는 것에 대해 부분적으로 또는 완전히 내성이다. 메틸화제의 감소된 효능을 막는 일 수단은 MGMT의 저해제, 구체적으로 O6-벤질구아닌으로 TMZ 화학요법을 겪는 개체를 치료하는 것이다. 그러나, O6-벤질구아닌의 투여량은 조혈 세포에 대한 그것의 독성 효과로 인해 제한된다.
테모졸로마이드 (TMZ)는 T 세포를 포함하는 조혈 세포에서 세포독성 효과를 갖는 항-교종 화학요법적 약물이다. FDA에 의해 제시된 TMZ의 표준 투여량, 및 그리하여 항-교종 치료에서 피할 수 없는 단계는 TMZ가 종양 세포를 파괴하는 것과 동일한 방식으로 훨씬 더 그들의 DNA를 메틸화시킴으로써 T 세포를 살상한다 (Sengupta et al., Clin Dev Immunol, 831090 (2012)). 그러나, 세포에서 야생형 MGMT의 과발현 또는 하나 이상의 MGMT 돌연변이체(예를 들면, G156A; P140K)의 과발현이 TMZ와 같은 메틸화제에 대해 세포에 보호를 부여할 것이라는 것이 입증되었다 (Woolford et al., J Gene Med, 8(1):29-31 (2006)). 따라서, 상기-기재된 핵산에 의해 암호화되는 약물 내성 폴리펩티드는 MGMT 또는 TMZ에 대한 내성을 부여하는 MGMT 변이체다. 이들 TMZ 내성 변이체는 P140K-MGMT (서열번호 33), P140K-MGMT (서열번호 43), G156A-MGMT (서열번호 38), MGMT-2 (서열번호 39), MGMT-3 (서열번호 40) 및 MGMT-5 (서열번호 41)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (Fontes et al., Mol Cancer Ther, 5(1):121-128). 전체적으로 기술된 MGMT 변이체에서 아미노산 치환의 지시된 위치(지역) (예를 들면, P140K 및 G156A)은 서열번호 33의 서열에 기초한 아미노산 위치이다. MGMT-2 변이체는 다음의 치환을 갖는다: S152H, A154G, Y158H, G160S 및 L162V. MGMT-3 변이체는 다음의 치환을 갖는다: C150Y, A154G, Y158F, L162P 및 K165R. MGMT-5 변이체는 다음의 치환을 갖는다: N157T, Y158H 및 A170S.
본 명세서에서 개시되고 사용된 구조체에 대해 P140K-MGMT 변이체가 특히 바람직하다. 본 개시에 따른 핵산은 MGMT 변이체를 암호화한다. 일 구체예에서, P140K-MGMT를 암호화하는 핵산은 서열번호 22로 이루어진다. 또한 G156A-MGMT (서열번호 38), MGMT-2 (서열번호 39), MGMT-3 (서열번호 40) 또는 MGMT-5 (서열번호 41)를 암호화하는 핵산이 고려되며, 각각의 핵산은 IL13CAR-MGMT 구조체에 존재할 수 있다. 또한 서열번호 43 (P140K 점 돌연변이를 갖는 GenBank Acc. No. NP_002403)을 포함하는 MGMT 단백질 서열 및 G156A-MGMT (서열번호 38), MGMT-2 (서열번호 39), MGMT-3 (서열번호 40) 또는 MGMT-5 (서열번호 41)의 돌연변이에 해당하는 임의의 점 돌연변이가 고려된다.
본 명세서에 개시된 키메라 핵산 서열에 의해 암호화되는 MGMT 또는 이의 변이체는 IL13CAR 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 부분의 하류 또는 상류에 위치할 수 있다. 일 구체예에서, 이 키메라 핵산 서열은 구조체가 단일 전사물의 전사를 구동하기 위한 프로모터를 포함하는 모노시스트로닉이고, 이 전사물은 차례로 이후에 절단되는 단일 단백질로 번역된다. 이 모노시스트로닉 구조체의 사용은 IL13CAR 및 MGMT 단백질 사이에 위치된 자가-절단 요소를 필요로 한다. 예를 들면, 숙주 세포에서 발현되는 경우, 키메라 핵산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 본 명세서에 개시된 CAR (예를 들면 상기에서 기재된 IL13 CAR), 자가-절단 펩티드, 및 MGMT 단백질 또는 MGMT 변이체를 포함하는 단일 단백질을 초기에 생기게 한다. 그리고 나서 이 단백질은 개별적인 CAR 및 MGMT 단백질을 생산하기 위해 절단된다. CAR 단백질은 세포 표면에서 가공되고 전시되는 반면, MGMT 단백질이 세포 핵 안에서 유지될 수 있다. 대안적 구조체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, MGMT 단백질, 자가-절단 단백질, 및 CAR을 포함한다.
일 구체예에서, CAR 및 MGMT 폴리펩티드 부분은 자가-절단 펩티드에 의해 분리된다. 자가-절단 서열의 일 예시는 구제역 바이러스 유래의 2A 서열을 포함하는 2A 요소(2A element)이다. 예시적 구체예에서, 자가-절단 서열은 서열번호 32의 서열을 포함하거나 또는 서열번호 32의 서열로 이루어진다.
변경예에서, 상기에서 기재된 CAR 및 상기에서 기재된 MGMT 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 폴리시스트로닉이며, 그것은 내부 리보솜 유입점 (IRES)과 같은 비-단백질 코딩 서열에 의해 분리되는, CAR을 암호화하는 핵산 서열 및 MGMT 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 사용될 수 있는 IRES 서열의 예는 뇌척수염 바이러스 (EMCV)의 IRES 요소, 구제역 바이러스 (FMDV), 타일러 뮤라인 뇌척수염 바이러스 (TMEV), 인간 리노바이러스 (HRV), 콕사키바이러스 (CSV), 폴리오바이러스 (POLIO), 헤파티티스 A 바이러스 (HAV), 헤파티티스 C 바이러스 (HCV), 및 페스티바이러스 (예를 들면, 돼지 콜레라 바이러스 (HOCV) 및 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (예를 들면, Le et al., Virus Genes 12:135-147, 1996; and Le et al., Nuc. Acids Res. 25:362-369, 1997를 참조한다, 이들 각각은 전체가 참조로 포함된다).
폴리시스트로닉 키메라 핵산의 변경예는 제2 프로모터가 IL13CAR을 암호화하는 핵산 서열 및 MGMT 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한 것이다. 이 구체예에서, 자가-절단 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 존재하지 않는다.
IL13CAR 및 MGMT 변이체를 암호화하는 핵산은 개별적 핵산 벡터 안에 각각 존재한다는 것이 또한 고려된다. 즉, IL13CAR 본 명세서에 기재된 IL13CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질을 암호화하는 제2 벡터를 포함하는 시스템 또는 키트가 또한 고려된다.
당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 적어도 IL13CAR 및 MGMT 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열들은 숙주 세포에서 CAR 및/또는 MGMT의 발현 및 기능을 용이하게 하거나 및/또는 향상시키는 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, CAR은 번역을 개시하는 (하나 이상의) 서열 (예를 들면, Kozak 서열 및/또는 프로모터 서열) 및 상동 재조합을 위한 서열 (레트로바이러스 5’LTR; 레트로바이러스 3’LTR)을 더 포함할 수 있다. Kozak 서열은 본 명세서에 기재된 IL13CAR-2A-MGMT 구조체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 핵산 구조체에서 사용될 수 있다.
본 개시에 따른 사용을 위한 키메라 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 함께 접합하거나 또는 연결함으로써 생산된다: Kozak 서열, 신호 서열을 암호화하는 핵산, IL13 리간드를 암호화하는 핵산, 힌지 영역을 암호화하는 핵산, 막통과 도메인을 암호화하는 핵산, CD28 보조자극(신호전달) 도메인을 암호화하는 핵산, CD3-제타 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산, 자가-절단 펩티드 (예를 들면, 2A 펩티드)를 암호화하는 핵산, 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산, 이들 각각은 상기에 기재되었다. 키메라 핵산 서열은 상기 요소들을 포함하고 암호화하는 단일 서열을 합성하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 각각의 상기 요소들은 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 개별적으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 각 요소는 PCR을 사용하여 증폭되며, 상기 PCR은 필요에 따라 원하는 구성물(들)을 수득하기 위해 각 요소들의 5' 및 3' 말단에서 제한 효소 부위를 생성하도록 설계되고 개별 요소들이 적절한 엔도뉴클레아제로 분해되고 함께 접합된다. IL13CAR-P140KMGMT 구조체를 생성하는 이러한 방법의 결과로서, 짧은 링커 펩티드가 개별 요소들 사이에 존재한다.
예를 들면, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 암호화하는 핵산은 리간드 도메인 및 힌지 영역 사이, 힌지 영역 및 막통과 도메인 사이, 막통과 도메인 및 CD28 보조-자극 도메인 사이, CD28 보조-자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인 사이, CD3-제타 신호전달 도메인 및/또는 자가-절단 펩티드 사이에 위치할 수 있다.
예시적 구체예에서, IL13CAR은 2개의 아미노산, 프롤린-아르기닌으로 이루어지는 리간드 및 힌지 도메인 사이의 링커를 포함한다. 힌지 영역 및 막통과 도메인 사이의 링커는 글루타민-라이신이다. 막통과 도메인 및 CD28 보조-자극 도메인 사이의 링커는 발린-쓰레오닌이다. CD28 보조-자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인 사이의 링커는 쓰레오닌-아르기닌이다. CD3-제타 신호전달 도메인 및 2A 펩티드 사이의 링커는 글루타민-프롤린-알라닌-알라닌-알라닌이다. 상기에 기재된 각각의 링커들은 다른 것들과 독립적으로 IL13 CAR 단백질 안에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다는 것이 고려된다.
따라서, T-세포와 같은 숙주세포를 형질감염시키는데 사용 및 IL13Rα2를 발현하고 TMZ에 노출된 세포의 성장을 저해하거나 또는 방해하는데 사용하기 위한 IL13CAR-P140KMGMT 구조체의 바람직한 구체예는 IL13(WT)CAR-P140KMGMT (서열번호 1의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 4의 아미노산 서열); IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT (서열번호 2의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 5의 아미노산 서열); 및 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT (서열번호 3의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 6의 아미노산 서열)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 도 2a는 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT 구조체의 개략도를 제공한다. 이 IL13CAR-P140KMGMT 구조체의 추가적 구체예는 단백질 IL13(WT)CAR-P140KMGMT (서열번호 45), IL13(E13Y)CAR-PAR140KMGMT (서열번호 46), 및 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT (서열번호 47)를 암호화하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 신호 펩티드, IL13 리간드, 힌지 영역, 막통과 도메인, 및 CD28 보조-자극 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인, 자가-절단 펩티드 링커 및 MGMT 단백질 또는 이의 변이체에 대해 암호화하는 각각의 핵산 서열은 암호화된 단백질에 영향을 미치는 것 없이 코돈 축퇴성에서 기인하여 다양할 수 있다. 게다가, 폴리펩티드 서열은 또한 예를 들면 보존적 아미노산 치환을 통해 다양할 수 있는 반면, 명시적으로 기재된 단백질의 기능에는 상당한 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 개시의 핵산 서열이 각 서열번호 1-3, 7-24 및 34-35과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한(identical) 서열을 포함하도록 본 명세서에 기재된 각각의 뉴클레오티드 서열의 변이체가 본 명세서에서 또한 고려된다. 유사하게, 각 서열번호 4-6, 25-33 및 36-41 및 43과 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 폴리펩티드가 본 명세서에 고려되고 개시된다.
2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 동일성 백분율(percent identity)은 최적 비교 목적을 위해 서열들을 정렬함으로써 측정될 수 있다 (예를 들면, 갭이 제1 서열의 서열 내에 도입될 수 있다). 그리고 나서 상응 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산들이 비교되며, 두 서열 간의 동일성 백분율은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일 위치의 수 / 총 위치 수 x 100). 특정 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 길이는 참조 서열, 예를 들면, 도 7a (서열번호 1), 7b (서열번호 4), 8a (서열번호 2), 8b (서열번호 5), 9a (서열번호 3) 및 9b (서열번호 6)에서 제공된 그 서열들의 길이의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 두 서열의 실제 비교는 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들면, 수학적 알고리즘을 사용하여, 완성될 수 있다. 그와 같은 수학적 알고리즘의 바람직한 비-제한적 예시는 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)에 기재된다. 그와 같은 알고리즘은 Schaffer et al., Nucleic acids Res., 29:2994-3005 (2001)에서 기재된 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 (버전 2.2)에 통합된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들면, BLASTN)의 디폴트 변수가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 검색된 데이터베이스는 비-중복 (non-redundent, NR) 데이터베이스이고, 서열 비교를 위한 변수는 다음과 같이 설정될 수 있다: 필터 없음; 기대값 10; 단어 크기 3; Matrix는 BLOSUM62; Gap 비용(Cost)은 11의 존재(Existence) 및 1의 확장(Extension)을 갖음. 다른 구체예에서, 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 백분율은 관심대상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전체 길이에 대해 측정된다.
서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직하고, 비-제한적 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘, CABIOS (1989)이다. 그와 같은 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지 (Accelrys, San Diego, California)의 일부인, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔류물 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가적 알고리즘은 당해 분야에 알려져 있고 Torellis and Robotti, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5 (1994)에 기재된 ADVANCE 및 ADAM; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-8 (1988)에 기재된 FASTA를 포함한다.
다른 구체예에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Blossom 63 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 2, 3, 또는 4의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내 GAP 프로그램을 사용하여 완성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 두 핵산 서열의 동일성 백분율은 50의 갭 중량 및 3의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지 내 GAP 프로그램을 사용하여 완성될 수 있다.
폴리펩티드 사이의 유사성은 통상적으로 보존된 아미노산 치환에 의해 결정된다. 그와 같은 치환은 폴리펩티드 내 주어진 아미노산을 유사 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적 치환은 표현형적으로 침묵일 가능성이 있다. 통상적으로 보존적 치환으로 간주되는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu, 및 Ile 중 하나를 다른 것으로 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환; 아마이드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 사이의 대체이다. 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵일 가능성이 있다는 것에 관한 제시가 Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990)에서 알려졌다.
변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합 및 절단 또는 이들 임의의 조합에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 또한, 변이체 폴리펩티드는 완전히 기능적일 수 있거나 (예를 들면, 세포를 감염시키고 자손 바이러스를 생산하는 능력) 또는 하나 이상의 활성 기능을 결여시킬 수 있다 (예를 들면, 자손 바이러스를 생산하는 능력). 완전히 기능적인 변이체는 통상적으로 오직 보존적 변이 또는 비-중요한 잔기 내 또는 비-중요한 영역 내 변이를 함유한다. 또한 기능적 변이체는 또한 기능에 어떠한 변화가 없거나 또는 유의하지 않는 변화를 유발하는 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 치환은 기능에 긍정적 또는 부정적으로 어느정도 영향을 미칠 수 있다. 비-기능적 변이체는 통상적으로 중요한 잔기 또는 중요한 영역에 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환들, 결실들, 삽입들, 역위들, 또는 절단들 또는 치환, 삽입, 역위, 또는 결실을 함유한다.
기능에 필수적인 아미노산은 부위-지정 돌연변이 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이(Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989))와 같은, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 후자의 과정은 분자 내 각각의 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다 (분자 당 1 돌연변이). 그리고 나서 결과로 생성된 돌연변이 분자는 인 비트로에서 생물학적 활성을 위해 테스트된다. 또한 폴리펩티드 활성에 중대한 부위는 크리스탈화, 핵 자기 공명, 또는 광친화성 표지와 같은, 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다 (Smith et al., J. Mol. Biol., 224: 899-904 (1992); 및 de Vos et al. Science, 255: 306-312 (1992)를 참조한다).
또한 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 1-146의 서열 및 바람직하게 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 1-146의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로서 본 명세서에 기재된 IL13CAR 단백질 및 서열번호 1의 아미노산 400-606 및 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 400-606의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로서 본 명세서에 기재된 P140KMGMT 변이체를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시되며, 상기 서열 동일성은 본 명세서에 기재된 BLAST 프로그램 및 변수를 사용하여 측정된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 예는 서열번호 4, 5 및/또는 6을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드; 및 본 명세서에 기재된 BLAST 프로그램 및 변수를 사용하여 측정된, 서열번호 4에 대해 바람직하게 적어도 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 유사성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시는 서열번호 1 (IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 2 (IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 3 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합에 의해 암호화되는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (단리된 폴리펩티드)에 관한 것이다.
뇌암의 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 리간드 (예를 들면, 항체)를 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는 CAR 폴리펩티드가 또한 고려된다. 특정 양태에서, CAR 폴리펩티드는 뇌암을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가적인 물질을 더 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드(예를 들면, 기타 변이체) 및 단리된 폴리펩티드, 및 그의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 의미하나, 구체적 길이를 의미하지는 않는다; 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질은 폴리펩티드의 정의 안에 포함된다.
폴리펩티드는 공지된 단백질 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 재조합 DNA 및 재조합 단백질 발현 및 정제 기법에 의해 생산된다. 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되며, 상기 폴리펩티드는 숙주 세포에서 발현되고, 원하는 단백질은 패키징 및 투여를 위해 정제되고 제제화된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드는 그것이 재조합 또는 비-재조합 세포로부터 단리될 때 물질이 실질적으로 없는 경우, 또는 그것이 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 경우, "단리된(isolated)", "실질적으로 순수한(substantially pure)", 또는 "실질적으로 순수하고 단리된(substantially pure and isolated)"이라 한다. 또한, 폴리펩티드는 세포에서 일반적으로 결합되지 않는 다른 폴리펩티드와 연결될 수 있 고(예를 들면, "융합 단백질"에서), 여전히 "단리된", "실질적으로 순수한", 또는 "실질적으로 순수하고 단리된"다. 단리되거나, 실질적으로 순수하거나, 또는 실질적으로 순수하고 단리된 폴리펩티드는 본 명세서에 기재되고 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 기법 및, 예를 들면 본 명세서에 기재된 친화도 정제 기법을 사용하여 수득될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 동질성으로(homogeniety) 정제될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드가 동질성으로 정제되지 않은 제제(preparation)가 유용하다는 것이 이해된다. 중요한 특징은 상당량의 다른 성분의 존재의 경우에도 제제가 폴리펩티드의 원하는 기능을 허용한다는 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 정도의 순도를 포함한다. 일 구체예에서, 표현 "실질적으로 물질이 없는"은 약 30% 미만 (건조 중량 기준)의 다른 단백질 (즉, 오염 단백질), 약 20% 미만의 다른 단백질, 약 10% 미만의 다른 단백질, 약 5% 미만의 다른 단백질, 또는 약 1% 미만의 다른 단백질을 갖는 폴리펩티드의 제제를 포함한다.
폴리펩티드가 재조합적으로 생산되는 경우, 또한 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있으며, 즉, 배양 배지는 폴리펩티드 제제의 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 나타낸다. 표현 "실질적으로 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 없는"은 그것의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리된 폴리펩티드의 제제를 포함한다. 일 구체예에서, 표현 "실질적으로 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 없는"은 약 30% 미만 (건조 중량 기준)의 화학적 전구체 또는 기타 화학물질, 약 20% 미만의 화학적 전구체 또는 기타 화학물질, 약 10% 미만의 화학적 전구체 또는 기타 화학물질 또는 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 갖는 폴리펩티드의 제제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 3 및/또는 5의 핵산 분자 및 그의 상보물 및 일부에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 3, 및/또는 5의 뉴클레오티드 서열 및 그의 상보물 및 일부를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 실질적 상동성을 갖는 단편 및 서열 변이체를 포함한다.
핵산 발현 구조체
본 개시의 다른 양태는 핵산 발현 구조체 또는 벡터, 레트로바이러스 벡터 및/또는 레트로바이러스 입자 및 그들의 용도와 관련된다. 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술 방법은 본 명세서에 상세하게 기재된 IL13CAR, 자가-절단 펩티드, 및 MGMT 변이체를 암호화하는 키메라 핵산 서열을 설계하고 생산하는데 사용된다. 그리고 나서 키메라 핵산 구조체는 예를 들면 구조체 서열을 확인하기 위한 시퀀싱을 허용하는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 일단 원하는 서열이 확인되면, 키메라 핵산 구조체는 포유류 세포의 형질감염을 위한 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 사용된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 서열번호 1-3의 핵산 서열 및 서열번호 7-24, 34 및/또는 34-35의 조합을 포함하는 키메라 구조체가 레트로바이러스 입자의 후속 패키징을 위해 그와 같은 플라스미드 벡터로 클로닝된다. 특정 양태에서, 키메라 구조체 및 플라스미드 벡터는 상기에서 기재된 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3을 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. IL13(WT)CAR-P140KMGMT 서열 (서열번호 1), IL13(E13Y)CAR-P140KMGMT (서열번호 2), 또는 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 서열 (서열번호 3)을 함유하는 플라스미드 벡터는 레트로바이러스 입자 (실시예 2)를 생산하기 전의 실시예 1에 기재된 바와 같이 본 명세서에 기재된 단편을 pUC57 벡터 내로 그리고 나서 pMFG 벡터 내로 클로닝함으로써 생성되었다.
도 1b는 MGMT유전자가 아직 도입되지 않은 IL13CAR 구조체를 포함하는 플라스미드 벡터를 도시한다. 도 2b는 IL13CAR 구조체를 함유하고 또한 IL13CAR 코딩 서열의 하류에 P140KMGMT 코딩 서열을 함유하는 동일한 플라스미드 백본(backbone)을 도시한다.
변경예에서, 본 명세서에 기재된 IL13CAR을 암호화하는 핵산은 제1 벡터 내로 클로닝되고 본 명세서에 기재된 MGMT를 암호화하는 핵산은 제2 벡터 내로 클로닝된다. 따라서, 본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 IL13CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 (플라스미드, 발현, 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 등) 및 본 명세서에 기재된 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터 (플라스미드, 발현, 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 등)를 기술한다.
적절한 핵산 구조체의 예는 플라스미드 (예를 들면, 원형 이중 가닥 DNA 루프) 및 바이러스 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터)를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들면, 박테리아 복제개시점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유류 벡터). 기타 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 유전체 내로 통합되고, 그에 따라 숙주 유전체와 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터, 발현 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 발현 구조체는 종종 플라스미드의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결함이 있는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같이, 그러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 바람직한 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내 핵산 분자의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 이것은 재조합 발현 벡터가 발현되기 위한 핵산 서열과 작동가능하게 연결된, 발현에 사용되기 위해 숙주세포에 기반하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 안에서, "작동가능하게 연결된"은 관심대상의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예를 들면, 인 비트로 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 숙주 세포에서) 조절 서열(들)과 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열(regulatory sequence)"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그와 같은 조절 서열은 예를 들면, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기재된다. 조절 서열은 많은 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 및 오직 특정 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들면, 조직-특이적 조절 서열)을 지시하는 것을 포함한다 .
발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및 원하는 폴리펩티드의 발현 수준과 같은 요인에 의존할 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 그에 의해 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화되는, 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생산한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포, 예를 들면, E. coli와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바쿨로 바이러스 발현 벡터 이용), 효모 세포 또는 포유류 세포 (영장류 (예를 들면, 인간), 뮤라인 (예를 들면, 마우스), 고양이, 개, 설치류, 양, 소 세포)에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위해 설계될 수 있다.
키메라 핵산 구조체를 함유하는 레트로바이러스 입자의 생산은 실시예 1 및 2에서 기재된 바와 같이 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT를 암호화하는 키메라 핵산 서열을 함유하도록 성공적으로 생성되었다. 실시예 및 명세서 전체에서 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법과 조합한 방법이 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 핵산 구조체를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 사용된다. 과정을 거친 형질감염 효율은 유세포 분석기에 의해 IL13 리간드의 세포 표면 발현을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. IL13CAR-P140KMGMT 구조체로 형질도입된 세포는, 예를 들면, 형광 활성 세포 분류기를 이용하여, 강화될 수 있다. 도 3a 및 3b는 IL13(E13K.R109K)CAR-A2-P140KMGMT 구조체로 형질감염된 PG13 세포의 강화를 보여준다. 도 3a는 동종지향성 레트로바이러스에 의한 제1 형질도입 후 IL13을 발현하는 세포의 상대적 수를 보여준다 (예를 들면, 4.0%). 도 3b는 동종지향성 레트로바이러스로 형질도입된 세포의 강화 후 IL13을 발현하는 세포의 상대적 개수를 보여준다 (예를 들면, 96.6%). 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 숙주 세포에 의한 P140KMGMT 단백질의 발현을 확인하고 측정하는 일반적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 도 3c에서 나타난 바와 같이, IL13CAR-A2-P140KMGMT 구조체로 형질도입된 세포의 강화는 형질도입되지 않은 세포 또는 도 1a-1b에 도시된 IL13CAR 만을 발현하는 구조체로 형질도입된 세포에 비해 P140KMGMT 단백질을 과발현한다.
도 1a 및 2a는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된 IL13(E13K.R109K)CAR-P140KMGMT의 개략도를 제공하는 반면, 도 1b 및 2b는 숙주 세포 유전체 내로 통합을 위해 5' LTR 및 3'LTR에 의해 플랭크된 키메라의 선형 묘사를 보여준다.
본 명세서에 기재된 핵산 구조체는 숙주 포유류 세포 내로 도입되어, 종양 세포 살상 기능 및 TMZ와 같은 DNA 메틸화제인 화학요법 약물에 대한 내성을 세포에 부여한다. 포유류 숙주 세포 내로 핵산의 도입은 예를 들면, 실시예 3에서 기재된 바와 같이, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 완성된다. 포유류 세포를 일시적으로 또는 안정적으로 형질도입하기 위한 레트로바이러스 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 그들이 현재 기재된 단백질 발현 및 치료 시스템에서 사용되기 때문에 기재된다.
특정 구체예는 본 명세서에 기재된 발현 시스템을 갖는 T 세포와 같은 플라스마 세포를 형질도입하는 바이러스 벡터를 이용한다. 바이러스 벡터의 예는, 제한없이, MFG 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV)-기반 벡터, 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스-아데노바이러스 벡터, 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV)로부터 유래된 벡터를 포함한다.
통상적으로, 최소한의 레트로바이러스 벡터는 RNA의 패키징을 위해 특정 5'LTR 및 3'LTR 서열, 하나 이상의 관심대상(표적 세포에서 발현되기 위한) 유전자, 하나 이상의 프로모터, 및 시스-작용 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재되고 당해 분야에서 공지된 기타 조절 서열들이 포함될 수 있다. 바이러스 벡터는 통상적으로 진핵 세포 (예를 들면, PG13 마우스 섬유아세포)와 같은, 패키징 세포주 내로 형질감염될 수 있는 플라스미드 내로 클로닝되고, 또한 통상적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 레트로바이러스 벡터와 같은 특정 바이러스 벡터는 하나 이상의 이종 프로모터, 인핸서, 또는 둘 다를 이용한다. 특정 구체예는 바이러스 벡터의 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 위치된 "내부" 프로모터/인핸서를 이용하고, 관심대상 유전자와 작동가능하게 연결된다. "기능적 관계(functional relationship)" 및 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 조절 분자와 접촉되는 경우 유전자의 발현이 영향을 받도록, 유전자가 프로모터 및/또는 인핸서에 대해 정확한 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 제한 없이 의미한다. 임의의 인핸서/프로모터 조합은 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 유전체의 발현을 조절하거나 (예를 들면, 증가시키는, 감소시키는), 감염된 표적 세포에서 선택된 관심대상 유전자의 발현을 조절하거나, 또는 둘 다 해당하도록 사용될 수 있다.
프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사가 일어나게 하는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 프로모터는 선택된 관심대상 유전자의 시작 코돈의 상류 (5')에 위치하고 (일반적으로 약 100 내지 10000 bp 이내), 그들이 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 조절하는 번역되지않는 서열이다. 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 유도성 프로모터는 온도에서 변화와 같은, 배양 조건의 일부 변화에 반응하여 DNA 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다.
프로모터를 폴리뉴클레오티드 코딩 서열에 작동가능하게 연결하기 위한 방법이 존재하는 것처럼, 다양한 프로모터가 당해 분야에 알려져 있다. 천연(native) 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 모두가 선택된 관심대상 유전자의 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예들은 이종 프로모터를 사용하는데, 왜냐하면 그들이 일반적으로 천연 프로모터에 비해 많은 전사 및 원하는 단백질의 높은 수율을 허용하기 때문이다.
특정 바이러스 벡터는 바이러스 입자 내로 유전체 바이러스 RNA의 결합을 증진시키기 위해 시스-작용 패키징 서열을 함유한다. 예는 psi-서열을 포함한다. 그와 같은 시스-작용 서열은 당해 분야에 알려져 있다.
바이러스 벡터의 생성은, 예를 들면 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) 및 "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000))에서 기재된 제한 효소 분해, 접합, 형질전환, 플라스미드 정제, PCR 증폭, 및 DNA 시퀀싱의 표준 기법들을 제한 없이, 포함하는, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 적절한 유전 공학 기법을 이용하여 완성될 수 있다.
당해 기술 분야에서 공지된 임의의 다양한 방법이 유전체가 바이러스 벡터의 RNA 카피를 포함하는 적절한 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일 방법으로서, 바이러스 벡터는 원하는 표적 세포 특이성을 갖는 바이러스 입자 내로 바이러스 벡터에 기초한 바이러스 유전체 RNA를 패키징하는 패키징 세포주 내로 도입될 수 있다. 패키징 세포주는 구조적 gag 단백질, 효소적 pal 단백질, 및 외피 글리코단백질을 포함하는, 바이러스 유전체 RNA를 바이러스 입자 내로 패키징하고 표적 세포를 감염시키는데 요구되는 인 트랜스(in trans) 바이러스 단백질을 통상적으로 제공한다.
특정 구체예에서, 패키징 세포주는 필수적이거나 또는 원하는 바이러스 단백질 (예를 들면, gag, pol)의 몇몇을 안정적으로 발현할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허번호 제6,218,181호를 참조한다). 특정 구체예에서, 패키징 세포주는 본 명세서에 기재된 홍역 바이러스 글리코단백질 서열을 포함하는, 필수적이거나 또는 원하는 바이러스 단백질 (예를 들면, gag, pol, 글리코단백질)의 몇몇을 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 일 예시적 구체예에서, 패키징 세포주는 안정적으로 gag 및 pol 서열을 발현하고, 상기 세포주는 그리고 나서 바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드 및 글리코단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된다. 원하는 플라스미드의 도입 후, 바이러스 입자는 그에 따라, 예를 들면, 울트라원심분리에 의해 수거되고 가공되어 바이러스 입자의 농축된 스톡을 얻는다. 예시적 패키징 세포주는 PG13 (ATCC CRL-10686), 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포주를 포함한다.
숙주 세포
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포와 관련된다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 그와 같은 용어는 특정 개체 세포 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다는 것이 이해된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그와 같은 자손은 사실 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본 명세서에서 사용된 용어의 범주 안에 여전히 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자는 박테리아 세포 (예를 들면, E. coli), 곤충 세포, 효모, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 일 양태에서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포(영장류 (예를 들면, 인간), 뮤라인 (예를 들면, 마우스), 고양이, 개, 설치류, 양, 소 세포)이다. 특정 양태에서, 상기 포유류 세포는 면역 세포이다. 또 다른 양태에서, 상기 포유류 세포는 T 세포이다. 기타 적절한 숙주 세포는 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백하다.
본 명세서의 목적을 위해, 상기 T 세포는 배양된 T 세포, 예를 들면, 원발성(primary) T 세포, 또는 배양된 T 세포주 유래의 T 세포, 예를 들면, Jurkat, SupT1, 등, 또는 포유 동물 유래의 T 세포와 같은, 임의의 T 세포일 수 있다. 포유류로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 기타 조직 또는 유액(fluid)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 또한 T 세포는 강화되거나 또는 정제될 수 있다. T 세포는 인간 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들면, Th1 및 Th2 세포, CD8+ T 세포 (예를 들면, 세포독성 T 세포), 말초혈액 단핵세포 (PBMC), 말초혈액 백혈구 (PBL), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 미성숙(naive) T 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고 임의의 발달 단계일 수 있다. 상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 숙주 세포는 NK-92 세포 (NK-92 세포주 ATCC 기탁번호 PTA-6672)이다.
핵산 구조체는 통상적 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "감염(infection)", "형질전환(transformation)", "형질도입(transduction)", 및 "형질감염(transfection)"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙틴 또는 전기천공을 포함하는, 숙주 세포 내로 외래성 핵산 분자 (예를 들면, DNA)을 도입하기 위한 다양한 당해분야에서 인정받은(art-recognized) 기법을 의미하는 것으로 의도된다. 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염하기 위한 적절한 방법은 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York (1989) 및 기타 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있다.
배양에서 원핵 또는 진핵 숙주 세포와 같은, 본 발명의 숙주 세포는 본 개시의 하나 이상의 CAR을 생산하는 (발현하는) 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 CAR을 생산하는 방법을 더 제공한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 CAR이 생산되도록 (예를 들면, 숙주 세포의 표면에서 발현되도록) 적절한 배지에서 본 개시의 숙주 세포 (본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 발현벡터가 도입된)를 배양하는 단계를 포함한다.
포유류 세포의 안정한 형질감염을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 오직 세포의 작은 분획만이 그들의 유전체 내로 외래성 DNA를 통합할 수 있다는 것이 알려져 있다. 이러한 인테그랜트(integrant)를 확인하고 선별하기 위해, 선별 마커 (예를 들면, 항생제에 대한 내성을 위한 것)를 암호화하는 유전자가 일반적으로 관심대상의 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선별 마커는 G418, 히그로마이신, 또는 메토트렉세이트와 같은, 약물에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선택적 마커를 암호화하는 핵산 분자는 숙주 세포 내로 본 발명의 핵산 분자와 동일한 벡터 상에 도입될 수 있거나 또는 분리된 벡터 상에 도입될 수 있다. 도입된 핵산 분자로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 동정될 수 있다 (예를 들면, 선별 마커 유전자를 포함한 세포는 생존할 것이나, 다른 세포는 죽을 것이다).
본 명세서에 예시된 바와 같이, IL13CAR을 발현하고 화학요법제 테모졸로마이드에 대한 노출에 내성인 T 세포와 같으나 이에 한정되지 않는 면역 세포가 고려된다. 구체적으로, 상기에서 상세히 설명된 IL13CAR (서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6) 및 P140KMGMT 돌연변이체 (서열번호 33)를 암호화하고 발현하는 핵산 서열로 형질도입된 T 세포는 오직 IL13만을 발현하는 CAR을 발현하는 T 세포에 비해 TMZ의 존재에서 보다 높은 생존율을 갖는다는 것이 본 명세서에 입증된다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 IL13 및/또는 IL13의 변이체 (예를 들면, 서열번호 4 (WT IL13 CAR), 서열번호 5 (IL13E13YCAR) 또는 서열번호 6 (IL13E13K.R109KCR) 및/또는 R109K IL13CAR)을 발현하는 CAR 및 세포를 화학보호하는 MGMT 돌연변이체 (예를 들면, P140KMGMT 돌연변이체 (서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41)에 관한 것이다. 일 구체예에서, 세포는 IL13CAR-A2-MGMT 구조체로 형질도입되며, 상기 MGMT 단백질은 야생형 MGMT 단백질 (서열번호 49)이 아니다.
숙주 T 세포의 수거(harvest) 및 형질감염
매우 특이적 종양 인식 및 살상을 가능하게 하는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된(engineered) T 세포는 유망한 임상 결과 후 상당한 주목을 받았다 (Grupp et al., 2013, N Eng J Med, 368:1509-1518; Porter et al., 2011, N Eng J Med, 365:725-733; Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol, 21:215-223). CAR 유전자에 의한 리프로그래밍 T 세포는 종양 세포를 도킹하고(docking) 용해시키는 MHC-독립적인 작용기전을 제공한다. 그와 같이 변형된 T 세포는 대안적으로 "디자이너 T 세포", "T-바디", 또는 "CAR-T 세포"라 불려져 왔다 (Ma et al., 2002, Cancer Chemotherapy & Biological Response Modifiers: Elsevier Science, pp. 319-345; Park et al., 2011, Trends Biotech, 29:550-557; Ma et al., 2014, Prostate, 74:286-296).
다른 양태에서, 본 개시는 뇌암의 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 리간드 (예를 들면, 항체)를 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는 CAR 및 MGMT 단백질을 발현하는 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이는 CAR 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산으로 도입되고 TMZ와 같은 DNA 메틸화제에 노출된 세포의 생존력을 증가시킨다. 특정 양태에서, 본 개시는 서열번호 4 (IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 5 (IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 6 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 갖는 CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 1 (IL13(WT)CAR-P140KMGMT), 서열번호 2(IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT) 또는 서열번호 3 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT)을 포함하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 단계; 및 CAR이 세포에 의해 발현되는 조건 하에서 세포를 유지하고, 그에 의해 서열번호 4 (IL13(WT)CAR-P140KMGMT), 서열번호 5 (IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 6 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 갖는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 핵산 서열은 바이러스 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 이의 조합)를 사용하여 세포 내로 도입된다. 다른 양태에서, 상기 세포는 포유류 세포, 예를 들면 포유류 T 세포 (예를 들면, 인간 T 세포 또는 마우스 T 세포)이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 자가세포 또는 인간 백혈구 항원-매칭된 세포이다. 또 다른 양태에서, 세포는 뇌암 (예를 들면, 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 성상세포종 또는 소아 교종과 같은 고-등급 악성 교종)을 갖는 하나 이상의 개체로부터 수득된다.
그러므로, 추가적인 양태는 본 개시에 따른 적어도 하나의 CAR 및 약물-내성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 T-세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 형질전환된 숙주 세포는 본 개시에 따른 핵산 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자이식(transgenic) T-전구체 세포 또는 줄기세포이다. 숙주 세포 및/또는 줄기세포의 형질전환 또는 형질도입을 위한 방법이 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 전기천공 또는 미세주입을 포함한다. 특히 바람직한 형질전환된 숙주 세포는 환자-특유의 T-세포이고, 그것은 추출 후 본 개시에 따른 핵산 구조체로 형질감염된다. 본 개시에 따르면, 숙주 세포는 본 개시에 따른 숙주 세포를 수득하기 위해 특히 하나 이상의 세포, 바람직하게 본 개시에 따른 하나 이상의 핵산 구조체로 그 이후 체외(ex vivo ) 형질감염되거나 또는 형질도입된 T-세포, 특히 CD8+-T-세포를 추출하는 것에 의해 수득된다.
확장 및 유전적 변형 이전에, T 세포의 공급원은 개체로부터 수득된다. 용어 "개체(subject)"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들면, 포유류)를 포함하는 것으로 의도된다. 개체의 예는 인간 및 다른 영장류, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 및 유전자이식 설치류 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위 유래 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 여러 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 당해 분야에서 입수가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 개시의 특정 양태에서, T 세포는 FicollTM 분리와 같은, 당업자에게 공지된 기법의 임의의 수를 사용하여 개체로부터 수거된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일 바람직한 양태에서, 개체의 순환 혈액 유래의 세포는 분리반출법(apheresis)에 의해 수득된다. 상기 분리반출법 산물은 통상적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함하는, 림프구를 함유한다. 일 양태에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 플라스마 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 버퍼 및 매질에 세포를 위치시키기 위해 워싱될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 인산 완충 식염수 (PBS)로 워싱된다. 대안적 양태에서, 워싱 용액은 칼슘이 결여되고, 모든 이가 양이온이 존재하지 않는 경우 마그네슘이 결여되거나 또는 많은 것들이 결여될 수 있다. 칼슘의 부재에서 초기 활성화 단계는 극대화된 활성화를 초래할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 이해하는 바와 같이, 워싱 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들면 제조사의 지시에 따른 반-자동화 "플로우-쓰로우(flow-through)" 원심분리기를 사용하는 것에 의해, 완성될 수 있다. 워싱 후, 세포는다양한 생체적합성 버퍼 또는 버퍼를 갖는 또는 버퍼가 없는 기타 염류 용액으로 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 시료의 원하지 않는 성분은 제거될 수 있고, 세포는 배양 배지에 직접적으로 재현탁된다.
일 양태에서, T 세포는 적혈구 세포를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 예를 들면, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심세정 (counterflow centrifugal elutriation)에 의해, 말초혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은, T 세포의 특이적 아집단은 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 더 단리될 수 있다. 당업자는 다중 회차의 선별이 또한 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 특정 양태에서, 선별 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선별되지 않은(unselected)" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선별되지 않은" 세포는 또한 추가 선별 회차에 적용될 수 있다.
음성 선별에 의한 T 세포 집단의 강화는 음성으로 선별된 세포에 특유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 완성될 수 있다. 일 방법은 음성으로 선별된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 관한 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는, 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석기를 통한 세포 분류 및/또는 선별이다. 예를 들면, 음성 선별에 의한 CD4+ 세포를 강화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 양태에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 통상적으로 발현하는 조절 T 세포를 강화하거나 또는 양성 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 양태에서, T 조절 세포는 항-C25 결합된 비드 또는 기타 유사 선별 방법에 의해 고갈된다.
T 세포의 활성화 및 확장
원하는 CAR을 발현하기 위한 T 세포의 유전적 변형 이전 또는 이후, T 세포는 예를 들면, 미국특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7, 175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허출원 공개번호 제20060121005호에서 기재된 방법을 일반적으로 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
일단 형질감염된 또는 형질도입된 T 세포가 IL13CAR을 원하는 조절 및 원하는 수준으로 표면 막 단백질로서 발현할 수 있다는 것이 확립되면, 원하는 신호 도입을 위해 제공하도록 키메라 수용체가 숙주 세포에서 기능적인지 결정될 수 있다. 이어서, 형질도입된 T 세포는 개체에 재도입되거나 또는 투여되어, 개체에서 항-종양 반응을 활성화시킨다.
약학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 개체에 본 명세서에서 기재된 형질도입된 T 세포의 투여를 용이하게 하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 개시에 따른 형질도입된 T 세포는 약학적으로 허용가능할 수 있는, 적절한 담체 또는 희석제와 함께 인 비보 투여를 위한 약학적 조성물로 제조될 수 있으며 적절한 이식물(implant)로 제조될 수 있다. 그러한 조성물 또는 이식물의 수단은 당해 기술 분야에 기재되었다 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)를 참조한다). 적절한 경우, 형질도입된 T 세포는 캡슐, 용액, 주사, 흡입제, 또는 에어로졸과 같은, 반고체 또는 액상 형태의 제제로 그들 각각의 투여 경로를 위한 일반적인 방식으로 조제될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 수단은 조성물의 방출 및 흡수를 그것이 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 막거나 또는 최소화하기 위해 또는 조성물의 지효성-방출을 보장하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 유발하는 약학적으로 허용가능한 제형이 이용된다. 따라서, 바람직하게 형질도입된 T 세포는 평형염류용액, 바람직하게 항크스 평형염류용액 또는 생리식염수를 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약학적 조성물을 제조하기 위해 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 조제될 수 있다. 담체 및 조성물은 멸균될 수 있다. 제제는 투여 방식에 적합하다.
적절한 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 염류용액 (예를 들면, NaCl), 염분, 완충식염수, 알콜, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 검, 식물 오일, 벤질알콜, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 덱스트로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀루로스, 폴리비닐 피롤리돈 등, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약학적 제제는 원하는 경우, 유효성분과 유해하게 반응하지 않는 보조제, 예를 들면, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 버퍼, 착색, 향료 및/또는 방향성 물질 등과 혼합될 수 있다.
조성물은, 원하는 경우, 또한 최소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 액상 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 서방성제제, 또는 분말일 수 있다. 조성물은 전통적 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께, 좌약으로 조제될 수 있다. 경구 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 사카린, 셀루로스, 마그네슘 카르보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 인간에 투여를 위해 조정된 약학적 조성물로서 일반적인 절차에 따라 제제화될 수 있다. 예를 들면, 정맥 투여를 위한 조성물은 통상적으로 멸균 등장성 수성 버퍼 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서 고통을 완화하기 위해 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 투여량 제형으로, 예를 들면, 활성 화합물의 양을 표시하는 앰플 또는 사셰트(sachette)와 같은 밀폐된 용기 내 건조된 동결건조된 분말 또는 무수 농축물과 같이 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 약학적 등급 물, 생리식염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주사 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 염류용액의 앰플이 제공된다.
이 조성물의 도입 방법은 두개내, 척수내, 피내, 근육내, 복강내, 안내, 정맥내, 피하, 국소, 경구 및 비강내를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 적절한 도입 방법은 또한 유전자 치료 (하기에 기재된 바와 같은), 충전식 또는 생분해성 장치, 입자 가속화 장치 ("유전자 총") 및 서방성 고분자 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 다른 화합물과의 조합 치료의 일부로서 투여될 수 있다.
국소 적용을 위해, 비스프레이성 제형, 국소 적용과 양립할 수 있는 담체를 포함하고, 바람직하게 물보다 큰 동점성을 갖는 점성이 있는 반-고체 또는 고체 제형이 이용될 수 있다. 적절한 제제는, 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 관장제, 로션, 졸, 찰제, 고약(salve), 에어로젤 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 원하는 경우 멸균되거나 또는 보조제, 예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제, 버퍼, 또는 삼투압에 영향을 미치는 염과 혼합된다. 화합물은 화장품 제제 내로 혼입될 수 있다. 국소 적용을 위해, 유효성분, 바람직하게 고체 또는 액체 불활성 담체 물질과 조합하여 스퀴즈(squeeze) 병에서 또는 가압 휘발성, 일반적으로 가스 추진제, 예를 들면, 가압 공기와 혼합하여 패키징되는 스프레이성 에어로졸 제제가 또한 적절하다.
본 명세서에 기재된 화합물은 중성 또는 염 제형으로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등에서 유래된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 페릭 하이드록사이드, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등에서 유래된 것과 같은, 유리 카르복실기로 형성된 것들을 포함한다.
키트
본 개시는 또한 본 개시의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 그러한 용기(들)과 연관된 것은 약학적 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 규정된 형태 통지될 수 있으며, 그 통지는 제조기관의 승인, 인간 투여를 위한 판매 용도를 반영한다. 팩 또는 키트는 투여 방식, 약물 투여의 서열 (예를 들면, 개별적으로, 연속적으로 또는 동시에) 등에 관한 정보가 표지될 수 있다. 팩 또는 키트는 또한 환자를 치료를 받도록 상기시키는 수단을 포함할 수 있다. 팩 또는 키트는 조합 치료의 단일 단위 투여량일 수 있으며 또는 다수의 단위 투여량일 수 있다. 특히, 화합물은 분리되거나, 임의의 조합으로 함께 혼합되거나, 단일 바이얼 또는 정제안에서 존재할 수 있다. 블리스터 팩 또는 다른 분배 수단에 모아진 화합물이 바람직하다. 본 발명의 목적을 위해, 단위 투여량은 각 화합물의 개별 약동학에 의존하고 표준 시간 흐름의 FDA 승인된 투여량으로 투여되는 투여량을 의미하는 것으로 의도된다.
치료 방법
다른 양태에서, 본 개시는 IL13Rα2 단백질에 대한 하나 이상의 리간드 (예를 들면, 항체)를 포함하는 IL13CAR, 및 MGMT 단백질을 발현하는 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 개체에서 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 개시는 서열번호 26, 서열번호 36 또는 서열번호 37 (리간드), 서열번호 28 (TM), 서열번호 29 및 30 (CD28 및 CD3-제타 신호전달 도메인)을 포함하고, 및 선택적으로 서열번호 27 (힌지)을 더 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 보유하고 발현하는 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 뇌암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1 (IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 2(IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 3 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합을 포함한다. 일 양태에서, 상기 T 세포는 자가 T 세포 또는 인간 백혈구 항원 (HLA)-매칭된 세포이다. 다른 양태에서, 뇌암은 고-등급 악성 교종이다. 그와 같은 고-등급 악성 교종은 다형성 교모세포종(GBM), 역형성 성상세포종 또는 소아 교종이다. 일 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 유해한 IL13Rα2 발현과 관련된 암을 치료하기 위해 사용된다.
IL13Rα2를 과발현하는 세포를 갖는 것으로 입증되었던 다른 암은 유방암, 췌장암, 두경부암, 난소암 및 대장암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 암은 전이된 것이다. 따라서, 또한 상기에서 기재된 하나 이상의 IL13CAR-MGMT 구조체로 형질도입된 하나 이상의 T 세포를 개체에 투여하는 것에 의한 하나 이상의 이들 암을 치료하는 방법이 고려된다.
T 세포가 CAR을 발현하고 MGMT 과발현 또는 MGMT 돌연변이체 (예를 들면, P140K)의 약물 내성에 대한 보호를 주는 돌연변이 MGMT를 발현하기 때문에, 상기 뇌암을 치료하는 방법은 하나 이상의 화학요법제를 개체 (뇌암 환자)에 연속으로 또는 동시에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다시 말해서, 변형된 T 세포는 화학요법제의 투여 전, 투여 동안, 또는 투여 후 투여된다. 화학요법제의 예는 테모졸로마이드 (TMZ), 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로스우레아 (BCNU 또는 카르무스틴), 포테무스틴 및 로무스틴을 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 T 세포는 서열번호 1(IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 2(IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 3(IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합을 포함하는 핵산 서열을 발현하고, 하나 이상의 화학요법제가 개체에 동시에 투여된다. 특정 양태에서, 개체는 인간 또는 다른 영장류, 또는 마우스 또는 랫트와 같은 설치류와 같은 포유류이다.
IL13CAR-MGMT 키메라를 암호화하고 발현하는 구조체로 형질도입된 T 세포의 효능은 하기 실시예 4 및 5에 의해 부분적으로 설명된다. 실시예 4는 IL13CAR-2A-P140KMGMT 단백질을 암호화하는 벡터로 형질도입된 단리된 T 세포가 TMZ에 노출될 때 P140KMGMT 단백질의 동시-발현이 없는 IL13CAR을 암호화하는 벡터로 형질도입된 T 세포에 비해 증가된 내성 (증가된 생존력)을 갖는다는 것을 보여준다 (예를 들면, 도 5 참조). 따라서, 본 명세서에 기재된 것과 같은 IL13CAR-MGMT 구조체로 형질도입된 면역 세포의 생존력을 증가하는 방법이 예상된다. 예시적 구체예에서, T 세포 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스로 형질도입된 T 세포가 TMZ로 치료를 연속적으로 또는 동시에 받는 뇌암으로 진단된 환자를 치료하는 방법인 경우 제공된다.
추가적인 연구는 본 명세서에 개시된 IL13CAR-MGMT 구조체가 개체에 투여될 수 있고 개체의 생존을 증가시킬 수 있는 T 세포를 변형시키는데 효과적이라는 것을 보여준다. 실시예 5에 의해 나타나고 도 6에서 도시되는 바와 같이, U251MG 교종 세포로 주입된 마우스는 TMZ 및 IL13CAR (MGMT 없음) 또는 IL13CAR-A2-P140KMGMT 구조체를 암호화하는 구조체로 형질도입된 T 세포로 처리되었다. P140KMGMT의 부재에서 IL13CAR의 발현은 CAR T 세포 미투여에 비해 생존을 증가시킨 반면, IL13CAR-A2-P140KMGMT 키메라를 암호화하는 핵산 서열로 형질도입된 T 세포를 갖는 TMZ가 투여되었던 동물은 가장 높은 생존율을 갖는다 (도 6). 따라서, 본 명세서에 기재된 IL13CAR-MGMT 단백질을 발현하는 면역 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌암으로 진단된 개체를 치료하는 방법이 본 명세서에서 고려된다.
T 세포 및/또는 화학요법제는 임의의 적절한 투여경로를 이용하여 개체에 투여될 수 있다. 적절한 투여경로의 예는 두개내, 척수내, 피내, 근육내, 복강내, 안내, 정맥내, 피하, 국소, 경구 및 비강내 전달을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 상기 방법은 개체로부터 하나 이상의 T 세포를 수득하는 단계 및 본 발명의 키메라 핵산 서열, 예를 들면, 서열번호 1 (IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 2 (IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 3 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT) 또는 이의 조합을 포함하는 핵산 서열을 T 세포 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 개체로부터 T 세포를 수득하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면, 혈장반출을 포함한다. 일부 양태에서, CAR T 세포는 실험실에서 예를 들면, 수십억 개수가 될 때까지 자란다(확장된다). 그리고 나서 CAR T 세포의 확장된 집단은 환자 내로 주입될 수 있다. 주합 후, T 세포는 환자의 몸체 안에서 증식되고 그들의 조작된 수용체의 안내에 의해, 그들의 표면상의 항원을 보유하는 암세포를 인식하고 살상한다.
본 명세서에 기재된 IL13CAR 및 돌연변이 MGMT를 발현하는 숙주세포는 치료적으로 유효한 양 (즉, 질환과 연관된 증상을 완화시키는 것, 질환의 발병을 예방하거나 또는 지연하는 것, 및/또는 또한 질환의 심각도 또는 증상의 빈도를 줄이는 것과 같은, 질환을 치료하기에 충분한 양)으로 투여된다. 특정 개체의 질병 또는 상태의 치료에 치료적으로 효과적으로 되는 양은 질환의 증상 및 심각도에 의존할 것이고, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 인 비트로 또는 인 비보 어세이는 선택적으로 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕는데 이용될 수 있다. 제제에서 이용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 질병의 중증도에 의존할 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적 투여량은 인 비트로 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
바람직하게 유효량 또는 충분한 수의 단리된 형질감염된 또는 변형된 세포는 조성물에 존재하고 개체 내로 도입되어, 그러한 처리 부재에서 다른 결과를 생성하는 것보다 장기간, 특이적, 항-종양 반응이 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장 또는 재성장을 제거하도록 확립된다. 바람직하게, 개체에 투여된 변형된 T 세포의 양은 변형된 T 세포가 존재하지 않는 다른 동일한 조건과 비교했을 때 종양 크기에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 감소를 야기한다.
따라서, 투여되는 변형된 T 세포의 양은 투여 경로를 고려해야 하고 원하는 치료적 반응을 얻기 위해 충분한 수의 형질도입된 T 세포가 도입될 수 있어야 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 조성물에 포함되는 각 작용제의 양은 (예를 들면, 접촉되는 각 세포당 양 또는 특정 체중당 양) 상이한 적용에서 달라질 수 있다. 일반적으로, 변형된 T 세포의 농도는 바람직하게 적어도 약 1×106 내지 약 1×109개의 형질도입된 T 세포, 보다 바람직하게, 약 1×107 내지 약 5×108 형질도입된 T 세포를 치료받는 개체에게 충분히 제공되어야 하나, 임의의 적절한 양은, 예를 들면, 5×108 세포 초과, 또는 예를 들면, 1×107 세포 미만이 이용될 수 있다. 투여 스케줄은 잘-확립된 세포-기반 치료법에 기초될 수 있거나 (예를 들면, Topalian 및 Rosenberg (1987) Acta Haematol. 78 Suppl 1:75-6; 미국 특허번호 제4,690,915호를 참조한다) 또는 대체 지속적 주입 계획이 이용될 수 있다.
실시예
테모졸로마이드-내성 교모세포종 면역요법을 위한 IL13CAR-P140KMGMT
실시예
1: 발현 플라스미드 구축
숙주 플라스미드 IL13(WT)CAR-pMFG, IL13(E13Y)CAR-pMFG, 및 IL13(E13K.R109K)CAR-pMFG 플라스미드를 생성하기 위해, IL13(WT)CAR 구조체에 대해, 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이, IL13(WT)CAR 구조체를 암호화하는 cDNA, IL13(E13Y) CAR 구조체를 암호화하는 cDNA, 및 IL13(E13K.R109K)CAR 구조체를 암호화하는 cDNA를 MFG 레트로바이러스 벡터의 BamHI 및 NotI 클로닝 부위로 삽입하였다 (Kong et al., (Clin Cancer Res, 2012, 18(21):5949-5960)를 참조한다). IL13CAR 및 P140K.MGMT cDNA 서열을 갖는 모노시스트로닉 전사물을 생성하기 위해, 5' NotI 및 3' EagI 말단을 갖는 2A-P140KMGMT 단편을 Genscript USA (Piscataway, NJ)에 의해 합성하였다. 서열 확인을 위해 2.3 Kb 단편을 pUC57 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 일단 확인되면, 그것을 3' NotI 부위에 IL13CAR-pMFG 레트로바이러스 벡터 내로 일괄 이전시켜, 각각의 IL13(WT)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG, IL13(E13Y)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG, 및 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140K.MGMT-pMFG 플라스미드를 생성하였다. 도 2a 및 2b는 IL13(E13K.R109K)CAR 및 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140K.MGMT 구조체 및 pMFG 플라스미드 구조체를 도시한다.
실시예
2: 레트로바이러스 입자의 생산
실시예 1에 기재된 IL13(E13K.R109K)CAR 및 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 암호화하는 구조체를 함유하는 MFG 레트로바이러스 입자를 "핑-퐁(ping-pong)" 방법을 사용함으로써 생성하였다. 실시예 1 유래의 각 숙주 플라스미드를 먼저 피닉스-에코(phoenix-eco) 세포 내로 형질감염시켜, 동족지향성(ecotropic) 레트로바이러스를 생성하였다. 형질감염 효율을 IL13 발현의 유세포 분석으로 측정하였다. 배양 상등액을 저장하고 암포트로픽(amphotropic) 바이러스-암호화 마우스 섬유아세포주 PG13 (ATCC, Manassas, VA)를 형질도입하는 데 사용하였다. 형질도입된 PG13 세포를 IL13에 대해 테스트하였고, IL13 양성 세포를 형광 활성화 세포 분류기로 강화(enrich)시켰다(도 3a-3b). IL13-강화된 세포에서의 MGMT 과발현을 또한 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석으로 테스트하였다(도 3c).
도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 형질도입된 세포는 IL13을 발현하였고, 세포의 약 97%가 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 발현하도록 강화되었다. 도 3c는 또한 형질감염되지 않은 세포 또는 IL13CAR-유일 구조체로 형질감염된 세포에 비해 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT로 형질감염된 세포에서 P140KMGMT의 증가된 발현을 보여준다.
강화된 세포를 조직 배양 조건 하에 확장시켜, 높은 역가의 CAR-암호화 암포트로픽 레트로바이러스가 함유된 배양 상등액을 수거하였다.
실시예 3: 인간 T 세포의 유전적 변형
실시예 2의 방법에 따라 생성된 IL13(E13K.R109K)CAR 및 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 포함하는 레트로바이러스 입자를 인간 T 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 인간 PBMC를 혈액-필터 폐기물로부터 단리하였다(Rhode Island Blood Center, Providence, RI). PBMC를 OKT3(10 μg/ml) 및 IL2(3000 U/ml)의 존재에서 36-48 시간 동안 배양시켜, T 세포 집단을 강화하였다. 강화된 T 세포를 레트로넥틴-코팅된 플레이트에서 실온 1시간 동안 프로타민 및 IL2의 존재 하에 배양 상등액을 함유하는 레트로바이러스로 스핀감염시켰다. 이 단계를 다음 24 시간 내 3차례 반복하였다. 3번의 감염 후, 세포를 다른 24 시간 동안 레트로바이러스-함유 배지에서 자라게 한 다음, 장래 실험을 위해 10% 소태아 혈청, 항생제, 및 IL2를 함유하는 신선한 RPMI-1640 배지로 옮겼다. IL13(E13K.R109K)CAR(P140KMGMT를 포함하지 않음)로 성공적으로 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포를 모든 실험에서 대조군으로 사용하였다. 대략적으로, IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 구조체를 포함하는 레트로바이러스 입자로 형질감염된 T 세포의 20-25%가 세포 표면상의 IL13를 검출하기 위해 유세포 분석기로 측정했을 때 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT에 대해 양성이었다(데이터 미표시). 형질도입된 T 세포를 대조군으로 사용한 경우, IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT에 대한 형질도입 효율은 약 69.2%이었다.
실시예
4: 형질도입된 T 세포에서의
테모졸로마이드
내성
상기에 기재된 IL13(E13K.R109K)CAR(도 1a) 또는 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT(도 2a)로 형질도입된 T 세포를 48시간 동안 테모졸로마이드의 농도를 증가시키면서(TMZ; 0-1000 μM) 별도로 인큐베이션하였다. 배양 배지를 24시간 마다 교환하였고 신선한 TMZ를 보충하였다. TMZ의 처리 후, 세포의 생존력을 트리판 블루 배제 원리, 및 Annexin V/7AAD 염색 방법으로 분석하였다. Annexin V/7-AAD 음성 세포의 빈도를 유세포 분석기로 측정하였고, 그 결과물은 세포 생존력을 나타내었다. 생존력 및 TMZ 활성 농도를 추정하기 위해 생존 곡선을 그렸다. 도 4에서 보여준 바와 같이, TMZ 노출 후 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT로 형질도입된 T 세포가 IL13(E13K.R109K)CAR-형질도입된 T 세포에 비해 보다 잘 생존하였다. 이 관찰은 P140KMGMT-발현 CAR을 갖는 T 세포의 유전적 변형이 변형된 T 세포에 화학보호(chemoprotection)를 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: IL13CAR-2A-P140KMGMT의 기능적 특성
형질도입된 세포의 면역조절 기능을 교종 세포와 동시-배양될 때 형질도입된 세포에 의한 사이토카인 IL2 및 IFNγ의 분비를 측정함으로써 또한 분석하였다. IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT 레트로바이러스로 형질도입된 T 세포를 정상 조직 배양 조건 (5% 혈청 및 IL2 (3000 U/ml) 및 200μM TMZ을 갖는 RPMI1640 배지) 하에서 48-72 시간 동안 200 μM의 TMZ를 넣거나 또는 넣지 않고 배양하였다. 다음으로, 세포를 U251MG 교종 세포와 함께 72시간 동안 배양하였다 (U251MG 공-배양과 관련하여 본 명세서에 기재됨). 배양 상등액을 사이토카인 분비에 대해 ELISA로 테스트하였다.
인터페론-감마(IFNγ)가 세포독성 T 세포의 기능성 마커인 반면, 인터루킨-2 (IL2)은 T 세포 생존력 및 증식에 대한 마커이다. 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, 형질도입된 세포는 TMZ의 부재 또는 존재에서 IL2 및 IFNγ 모두를 분비하였다. 게다가, TMZ의 존재는 형질도입된 세포에 의한 각 사이토카인의 분비를 유의하게 감소시키지 않았다. TMZ에 대한 노출 후 TMZ-내성 T 세포가 그들의 정상 세포독성 기능을 유지할 수 있었으며, 이러한 유전적 변형이 실제로 이들 세포를 TMZ-유도된 백혈구감소증(leukopenic) 세포독성에 대한 내성을 갖도록 한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: IL13CAR-2A-MGMT의 인 비보 효능
IL13E13K.R109K-2A-P140KMGMT 구조체의 인 비보 효능을 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 바이러스 입자를 사용하여 마우스에서 테스트하였다. 50마리의 무흉선(athymic) 누드 마우스를 U251MG 교종 세포(40 마리 마우스; 그룹 I-IV) 또는 PBS(10 마리 마우스)로 피하(왼쪽 측면) 주입하였다. 교종 이식 4일 후, 3 그룹의 마우스(그룹 I, II 및 III, 10 마우스/그룹)를 4일 동안 TMZ로 경구 처리하였다 (경구 섭식에 의한 64 mg/kg/day). 교종 이식 5일 차에, TMZ로 경구 처리되었던 3 그룹의 마우스를 다음과 같이 처리하였다: 그룹 I: IL13E13K.R109KCAR-2A-P140KMGMT 구조체의 종양-내 주입(TMZ-내성); 그룹 II: MGMT를 포함하지 않는 IL13 IL13E13K.R109K 구조체(TMZ 민감); 그룹 III: PBS 단독 처리(T 세포의 비주입). 그룹 IV는 어떠한 T 세포 또는 TMZ 처리도 받지 않았다. IACUC 제한에서 요청한 대로 마우스를 희생시킨 T 세포의 주입 후 90일까지 마우스를 육안 종양 성장, 행동 변화, 및 운동성에 대해 모니터링하였다.
마우스 실험의 결과물로부터 그려진 생존 곡선은 MGMT 및 TMZ가 없는 TMZ-민감한 IL13(E13K.R109K)CAR T 세포로 처리되었던 그룹 II 동물에서의 61일 및 14% 생존과 비교하여 IL13(E13K.R109K)CAR-2A-P140KMGMT T 세포 및 TMZ로 처리된 종양-보유(tumor-bearing) 마우스(그룹 I) 가 73일의 평균 생존을 가지고 40%의 동물이 생존하였다는 것을 보여주었다. 어떠한 처리도 받지 않은 종양-보유 마우스(그룹 IV)는 29일의 평균 생존을 가졌다. T 세포를 받지 않았으나 TMZ를 단독으로 경구 처리된 그룹 III 종양-보유 동물은 20% 생존률을 나타냈으나 단지 36일의 낮은 평균 생존시간을 또한 보여주었으며, 이는 TMZ 처리의 배경 항-종양 효과로 간주되었다 (도 9 & 10). 이 관찰은 3G TMZ-내성 CAR을 받는 그룹 I 동물들이 CAR 면역요법 및 TMZ 화학요법의 상승작용 효과에 의해 종양을 제거하는데 가장 효과적이었다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참조문헌의 교시는 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명은 그의 구체예를 예시하기 위해 참고문헌들에 의해 구체적으로 도시되고 설명되었으나, 형태와 및 세부사항에서 다양한 변형이 첨부된 청구항에 의해 포함된 본 발명의 범주를 벗어나는 것 없이 그 속에서 만들어질 수 있다는 것이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
<110> ROGER WILLIAMS HOSPITAL
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCER
<130> 2017-FPA-8173
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<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1848
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
ggatccgcca ccatgcatcc gctcctcaat cctctcctgt tggcactggg cctcatggcg 60
cttttgttga ccacggtcat tgctctcact tgccttggcg gctttgcctc cccaggccct 120
gtgcctccct ctacagccct cagggagctc attgaggagc tggtcaacat cacccagaac 180
cagaaggctc cgctctgcaa tggcagcatg gtatggagca tcaacctgac agctggcatg 240
tactgtgcag ccctggaatc cctgatcaac gtgtcaggct gcagtgccat cgagaagacc 300
cagaggatgc tgagcggatt ctgcccgcac aaggtctcag ctgggcagtt ttccagcttg 360
catgtccgag acaccaaaat cgaggtggcc cagtttgtaa aggacctgct cttacattta 420
aagaaacttt ttcgcgaggg acagttcaac cctaggaagc ccaccacgac gccagcgccg 480
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 540
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ccaattgctc 600
tgctacctgc tggatggaat cctcttcatc tatggtgtca ttctcactgc cttgttcctg 660
agagtggtta acttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 720
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 780
cgcgacttcg cagcctatcg ctccacgcgt aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 840
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 900
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 960
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1020
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1080
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1140
taacagccag cggccgcaga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag 1200
aatcccggcc ctccatggat ggacaaagat tgcgagatga agcggaccac actggactcc 1260
cccctgggca aactggagct gtctggctgt gaacaggggc tgcacgagat caaactgctg 1320
ggaaagggca ctagcgccgc tgatgctgtg gaagtgccag ctccagctgc tgtgctggga 1380
ggacctgagc cactgatgca gtgcaccgcc tggctgaacg cttacttcca tcagcctgaa 1440
gccatcgagg aatttcccgt gcctgccctg caccatccag tgttccagca ggagagtttt 1500
acaaggcagg tgctgtggaa gctgctgaaa gtggtgaagt tcggggaagt gatttcctac 1560
cagcagctgg ctgctctggc tggaaaccca aaagctgctc gggccgtggg aggagctatg 1620
agaggcaatc cagtgaaaat cctgattccc tgccacaggg tggtgtgtag ctccggagct 1680
gtggggaact attctggggg actggccgtg aaagaatggc tgctggctca cgagggacat 1740
aggctgggaa agcctggcct gggagggtct agtggactgg ctggagcttg gctgaaggga 1800
gctggagcta cctcaggaag cccacctgcc ggccggaatt gacggccg 1848
<210> 2
<211> 1848
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
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<211> 1848
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<211> 606
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 4
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly
195 200 205
Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Val Thr Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Lys Phe Ser Arg Ser Ala
260 265 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
385 390 395 400
Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly
405 410 415
Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu
420 425 430
Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro
435 440 445
Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala Trp
450 455 460
Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val
465 470 475 480
Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln
485 490 495
Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser
500 505 510
Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg Ala
515 520 525
Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile Pro Cys
530 535 540
His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly Gly
545 550 555 560
Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly
565 570 575
Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu Lys
580 585 590
Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
595 600 605
<210> 5
<211> 606
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 5
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly
195 200 205
Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Val Thr Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Lys Phe Ser Arg Ser Ala
260 265 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
385 390 395 400
Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly
405 410 415
Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu
420 425 430
Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro
435 440 445
Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala Trp
450 455 460
Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val
465 470 475 480
Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln
485 490 495
Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser
500 505 510
Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg Ala
515 520 525
Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile Pro Cys
530 535 540
His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly Gly
545 550 555 560
Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly
565 570 575
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Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
595 600 605
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<211> 606
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
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50 55 60
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
385 390 395 400
Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly
405 410 415
Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu
420 425 430
Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro
435 440 445
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450 455 460
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Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser
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Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg Ala
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Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile Pro Cys
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Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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tccccaggcc ctgtgcctcc ctctacagcc ctcagggagc tcattgagga gctggtcaac 60
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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cctagg 6
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 13
caattg 6
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc atctatggtg tcattctcac tgccttgttc 60
ctgagagtg 69
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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gttaac 6
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 60
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 17
acgcgt 6
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
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<211> 3
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
taa 3
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 20
cagccagcgg ccgca 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 21
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 22
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<211> 3
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
<400> 23
tga 3
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<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 24
cggccg 6
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
<210> 26
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
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1 5 10 15
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20 25 30
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Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
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Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
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100 105 110
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<211> 45
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
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1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
<210> 28
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
20
<210> 29
<211> 44
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
1 5 10 15
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
20 25 30
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
1 5 10 15
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
20 25 30
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
35 40 45
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
50 55 60
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
65 70 75 80
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
85 90 95
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Gln Pro Ala Ala Ala
1 5
<210> 32
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 32
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1 5 10 15
Gly Pro
<210> 33
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 33
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys
20 25 30
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala
50 55 60
Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro
65 70 75 80
Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg
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Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile
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Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg
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Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile Pro
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Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu
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Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
195 200 205
<210> 34
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 34
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<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 35
tccccaggcc ctgtgcctcc ctctacagcc ctcaggaagc tcattgagga gctggtcaac 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 36
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 37
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100 105 110
Phe Asn
<210> 38
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 38
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys
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Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala
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<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 39
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys
20 25 30
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala
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100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Cys His Arg Val Val Cys Ser His Gly Gly Val Gly Asn His Ser Ser
145 150 155 160
Gly Val Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu
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Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
195 200 205
<210> 40
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 40
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
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Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile
100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Cys His Arg Val Val Tyr Ser Ser Gly Gly Val Gly Asn Phe Ser Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ala Val Arg Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu
180 185 190
Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
195 200 205
<210> 41
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 41
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys
20 25 30
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala
50 55 60
Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro
65 70 75 80
Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg
85 90 95
Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile
100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Thr His Ser Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ser His Glu Gly His Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu
180 185 190
Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
195 200 205
<210> 42
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 42
ccatgg 6
<210> 43
<211> 238
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Leu Gly Gln Pro Ala Pro Leu Glu Arg Phe Ala Ser Arg Arg Pro
1 5 10 15
Gln Val Leu Ala Val Arg Thr Val Cys Asp Leu Val Leu Gly Lys Met
20 25 30
Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly
35 40 45
Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu
50 55 60
Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala Trp
85 90 95
Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val
100 105 110
Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln
115 120 125
Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser
130 135 140
Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile Pro Cys
165 170 175
His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly Gly
180 185 190
Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly
195 200 205
Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu Lys
210 215 220
Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
225 230 235
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<211> 380
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr
370 375 380
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 45
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly
195 200 205
Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Val Thr Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Lys Phe Ser Arg Ser Ala
260 265 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro
385 390 395 400
Trp Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro
405 410 415
Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile
420 425 430
Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro
435 440 445
Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr
450 455 460
Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe
465 470 475 480
Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr
485 490 495
Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val
500 505 510
Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala
515 520 525
Arg Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile
530 535 540
Pro Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser
545 550 555 560
Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg
565 570 575
Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp
580 585 590
Leu Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
595 600 605
<210> 46
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 46
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly
195 200 205
Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Val Thr Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Lys Phe Ser Arg Ser Ala
260 265 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro
385 390 395 400
Trp Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro
405 410 415
Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile
420 425 430
Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro
435 440 445
Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr
450 455 460
Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe
465 470 475 480
Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr
485 490 495
Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val
500 505 510
Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala
515 520 525
Arg Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile
530 535 540
Pro Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser
545 550 555 560
Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg
565 570 575
Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp
580 585 590
Leu Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
595 600 605
<210> 47
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 47
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Lys Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Lys Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly
195 200 205
Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Val Thr Phe Trp Val Arg
210 215 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225 230 235 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
245 250 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Lys Phe Ser Arg Ser Ala
260 265 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
325 330 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
340 345 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
355 360 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Pro Ala Ala Ala Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro
385 390 395 400
Trp Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro
405 410 415
Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile
420 425 430
Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro
435 440 445
Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr
450 455 460
Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe
465 470 475 480
Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr
485 490 495
Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val
500 505 510
Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala
515 520 525
Arg Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Lys Ile Leu Ile
530 535 540
Pro Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser
545 550 555 560
Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg
565 570 575
Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp
580 585 590
Leu Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
595 600 605
<210> 48
<211> 621
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 48
atggacaaag attgcgagat gaagcggacc acactggact cccccctggg caaactggag 60
ctgtctggct gtgaacaggg gctgcacgag atcaaactgc tgggaaaggg cactagcgcc 120
gctgatgctg tggaagtgcc agctccagct gctgtgctgg gaggacctga gccactgatg 180
cagtgcaccg cctggctgaa cgcttacttc catcagcctg aagccatcga ggaatttccc 240
gtgcctgccc tgcaccatcc agtgttccag caggagagtt ttacaaggca ggtgctgtgg 300
aagctgctga aagtggtgaa gttcggggaa gtgatttcct accagcagct ggctgctctg 360
gctggaaacc caaaagctgc tcgggccgtg ggaggagcta tgagaggcaa tccagtgcca 420
atcctgattc cctgccacag ggtggtgtgt agctccggag ctgtggggaa ctattctggg 480
ggactggccg tgaaagaatg gctgctggct cacgagggac ataggctggg aaagcctggc 540
ctgggagggt ctagtggact ggctggagct tggctgaagg gagctggagc tacctcagga 600
agcccacctg ccggccggaa t 621
<210> 49
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys
20 25 30
Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala
50 55 60
Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro
65 70 75 80
Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg
85 90 95
Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile
100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Val Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Cys His Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu
165 170 175
Gly Lys Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu
180 185 190
Lys Gly Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn
195 200 205
Claims (32)
- IL13α2 수용체(서열번호 44)에 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열;을 포함하는 키메라 핵산 서열. - 청구항 1에 있어서,
상기 IL13CAR은 신호 펩티드를 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 IL13CAR은 힌지 영역을 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포질 도메인은 CD28, 4-1BB (CD137) 및 OX40 (CD134)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보조-자극(co-stimulatory) 도메인을 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 4에 있어서,
상기 CD28 보조-자극 도메인은 서열번호 29와 적어도 90% 동일한 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD3-제타 신호전달 도메인은 서열번호 30과 적어도 90% 동일한 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
자가-절단 링커 펩티드를 암호화하는 제3 핵산 서열을 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 7에 있어서,
상기 제3 핵산 서열은 상기 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 위치하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 핵산은 상기 IL13 리간드 도메인과 힌지 도메인 사이, 상기 힌지 도메인과 막통과 도메인 사이, 상기 막통과 도메인과 CD28 신호전달 도메인 사이, 또는 상기 CD28 신호전달 도메인과 CD3-제타 신호전달 도메인 사이에 위치한 디펩티드 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CD3-제타 신호전달 도메인과 자가-절단 펩티드 사이의 링커 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL13 리간드 도메인은 서열번호 26, 서열번호 36, 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 이의 변이체를 포함하는 것인 키메라 핵산 서열. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 뉴클레오티드 109 내지 1839, 서열번호 2의 뉴클레오티드 109 내지 1839, 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 109 내지 1839로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키메라 핵산 서열. - 서열번호 1 (IL13 CAR-P140KMGMT), 서열번호 2 (IL-13(E13Y) CAR-P140KMGMT), 서열번호 3 (IL-13(E13K R109K) CAR-P140KMGMT), 또는 이의 조합을 포함하는 핵산 서열.
- 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 키메라 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 청구항 14에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터인 벡터. - 청구항 15에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 벡터. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 키메라 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포.
- 청구항 17에 있어서,
상기 세포는 포유류 세포인 숙주 세포. - 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
상기 세포는 T 세포인 숙주 세포. - 청구항 17 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 자가 세포 또는 인간 백혈구 항원(HLA)-매칭된 세포인 숙주 세포. - 청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 뇌암을 갖는 하나 이상의 개체로부터 수득된 것인 숙주 세포. - IL13α2 수용체(서열번호 44)에 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열;을 포함하는 숙주 세포. - 청구항 17 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물.
- IL13α2 수용체(서열번호 44)에 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 IL13CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열;을 포함하는 약학적 조성물. - a) IL13CAR 단백질 및 MGMT 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 상기 IL13CAR 단백질은 IL13α2 수용체(서열번호 44)에 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함함; 및
b) 상기 IL13CAR 단백질 및 상기 MGMT 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건 하에 상기 세포를 유지시키는 단계;를 포함하는 IL13CAR 단백질 및 MGMT 단백질을 발현하는 포유류 세포를 생산하는 방법. - 청구항 25에 있어서,
상기 핵산 서열은 바이러스 벡터를 사용하여 상기 세포 내로 도입되는 것인 방법. - 청구항 26에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - IL13α2 수용체(서열번호 44)에 결합하는 IL13 리간드 도메인, 막통과 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 IL13CAR을 N-말단에서 C-말단 방향으로 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
서열번호 33, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 MGMT 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열;에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 하나 이상의 면역 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체의 뇌암을 치료하는 방법. - 청구항 28에 있어서,
상기 뇌암은 고등급(high-grade) 악성 교종인 방법. - 청구항 28 또는 청구항 29에 있어서,
상기 개체는 DNA-메틸화 화학요법제로 치료를 받는 중이거나, 치료를 받은 적이 있거나, 또는 치료를 받을 예정인 방법. - 청구항 30에 있어서,
상기 DNA-메틸화 화학요법제는 TMZ인 방법. - 청구항 30 또는 청구항 31에 있어서,
상기 DNA-메틸화 화학요법제는 면역 세포의 투여량을 투여하기 전, 투여하는 동안, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
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