KR20210007998A - 포스포리파제 a2 수용체 키메라 자가항체 수용체 t 세포의 조성물 및 방법 - Google Patents

포스포리파제 a2 수용체 키메라 자가항체 수용체 t 세포의 조성물 및 방법 Download PDF

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조나단 호건
에이미 에스. 페인
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

본 발명은 항-포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항체-기반 B 세포 수용체에 특이적인 적어도 하나의 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 포함하는 조성물, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 CAAR을 포함하는 재조합 T 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 PLA2R-CAAR을 발현하는, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 유전적으로 변형된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 여기서, 발현된 CAAR은 PLA2R 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법을 포함한다.

Description

포스포리파제 A2 수용체 키메라 자가항체 수용체 T 세포의 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2018년 5월 2일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/665,863에 대한 우선권에 대한 권리가 있고, 상기 특허 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 배경
막성 신장병증(membranous nephropathy: MN)은 성인 신장 증후군의 가장 일반적인 주요 원인 중 하나이다 (사례의 최대 ⅓). 막성 신장병증 사례 중 약 15-25%는 약물, 감염, 종양, 또는 면역 질환에 의해 유발되는 속발성 막성 신장병증이다. 막성 신장병증 사례 중 나머지 75-85%는 특발성이며, 이는 또한 원발성 막성 신장병증으로도 불린다. MN은 사구체에서의 면역 복합체 형성에 의해 유발된다. 면역 복합체는 항체의, 족세포 상의 항원에의 결합에 의해 형성된다. 면역 복합체는 사구체 상피 세포의 보체 매개 용해 및 모세혈관벽을 손상시키는 프로테아제 및 산화제의 방출을 유발하는 활성인자로서 작용한다. 면역억제 치료를 받지 않은 원발성 막성 신장병증 환자 중 최대 40%에서는 투석 또는 신장 이식이 요구되는 신장 질환이 발생한다.
M형 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)는 원발성 막성 신장병증에서 주요 자가항원으로서 기술되고 있다. PLA2R에 대한 자가항원은 원발성 막성 신장병증 사례의 70-80%에서 존재하고, 이는 천연 신장에서 및 신장 이식 후, 둘 모두에서의 원발성 막성 신장병증의 진단 및 그의 치료 모니터링에 사용될 수 있다.
현행 가이드라인은 중증의 원발성 막성 신장병증의 치료를 위한 제1선의 요법으로서 알킬화제 또는 칼시뉴린 억제제를 이용한 치료를 제안하고 있다. 항-CD20 항체인 리툭시맙 또한 유망한 것으로 밝혀졌고, MN 치료용으로 평가 중에 있다. 그러나, 이러한 치료들은 혈청 항-PLA2R 항체를 생산하는 자가반응성 B 세포에 대한 특이성이 없기 때문에, 생명을 위협하는 감염의 위험과 연관이 있을 수 있다. 게다가, 단백뇨 관해를 달성한 환자에서 재발이 발생할 수 있고, 질환은 신장 이식 후에 재발할 수 있다. 중요하게, 재발은 보통 검출가능한 항-PLA2R 자가항체의 재발과 연관이 있는 바, 따라서, 이는 질환 발병기전에서 상기 항체의 역할을 추가로 뒷받침한다.
당업계에서는 원발성 막성 신장병증을 위한 더욱 구체적이고, 효과적인 치료를 달성하는 것이 절실히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 다루고 있다.
본 발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, CAAR은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 분자(costimulatory molecule)의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 CAAR 중 어느 하나를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR); 및 (b) DAP12를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나, 본원에 개시된 CAAR 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 대상체에게 유효량의, 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩하는 것을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에게 유효량의, 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩함으로써, 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 대상체에게 유효량의, (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) DAP12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함으로써 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 대상체에게 유효량의, (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) DAP12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함으로써, 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
본원에 상세하게 기술된 본 발명의 상기 측면 또는 임의의 다른 측면의 다양한 실시양태에서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편은 (a) CysR 또는 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1 및 C형 렉틴 도메인 2를 포함하는 세포외 도메인; 및 (b) CysR 또는 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편은 (a) 시스테인이 풍부한 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, 및 C형 렉틴 도메인 1을 포함하는 세포외 도메인, (c) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인, (d) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, C형 렉틴 도메인 3, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인, (e) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인, 또는 (f) 시스테인이 풍부한 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, PLA2R 세포외 도메인은 서열번호: 8 또는 서열번호: 15 또는 서열번호: 47 또는 서열번호: 60 또는 서열번호: 50 또는 서열번호: 62 또는 서열번호: 52 또는 서열번호: 54 또는 서열번호: 56 또는 서열번호: 58을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8 알파 쇄 막관통 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인은 서열번호: 20을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인은 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, CAAR은 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열번호: 10 또는 서열번호: 42 또는 서열번호: 64를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열번호: 서열번호: 43 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, CAAR은 GS 링커를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, GS 링커는 서열번호: 68을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, GS 링커는 서열번호: 69를 포함한다.
특정 실시양태에서, 공동자극 분자의 세포내 도메인은 4-1BB를 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 22 또는 서열번호: 66을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 세포내 도메인은 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 서열번호: 24 또는 서열번호: 72를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인은 서열번호: 23 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 11, 17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 12, 18, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, CAAR은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 RNA 벡터이다.
특정 실시양태에서, 세포는 CAAR을 발현하고, B 세포 상의 자가항체-기반 BCR에 대해 높은 친화성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 세포는 CAAR을 발현하고, 자가항체를 발현하는 B 세포의 사멸을 유도한다. 특정 실시양태에서, 세포는 CAAR을 발현하고, 건강한 세포에 대하여 제한된 독성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 세포는 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포, 자연 킬러 세포, 시토카인 유도 킬러 세포, 그의 세포주, T 기억 줄기 세포, 만능성 줄기로부터 유래된 T 세포 및 다른 효과기 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 자가항체 매개 신장 질환은 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, 변형된 T 세포는 B 세포를 표적화한다.
특정 실시양태에서, KIR은 KIRS2 또는 KIR2DS2이다.
특정 실시양태에서, 벡터는 CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독시 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 이제 도면에는 바람직한 실시양태를 제시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 실시양태들의 정확한 정렬 및 수단에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 천연 PLA2R 분자의 개략도를 보여주는 도해이다. N 말단 시스테인이 풍부한 (CysR) 도메인 (리신 B형 렉틴 도메인)은 환자 혈청 항체에 의해 인식되는 면역우세 에피토프이다. 비환원 조건하에서, 혈청 항체 인식은 처음 3개의 C형 렉틴 도메인s (CTLD)에 의존하는 것으로 보고되었다. 시스테인이 풍부한 도메인 이외에도, C형 렉틴 도메인 1 및 7에 대한 혈청 항체 면역반응성 또한 보고되었다. 상업적 노부스(Novus) 모노클로날 항체 (mAb) 및 폴리클로날 시그마(Sigma) 항체는 CTLD2 도메인에 결합한다.
도 2a-2g는 본 발명에 기술된 다양한 PLA2R CAAR 구축물을 도시한 개략도 다이어그램 시리즈이다. 본 도면 및 전역에서 약어: ECD: 세포외 도메인; TMD: 막관통 도메인; BBZ: 세포질 탠덤 41BB (CD137) 및 CD3-제타 신호전달 도메인; CysR = 시스테인이 풍부한 도메인; FNII = 피브로넥틴 II형 도메인; CTLD = C형 렉틴 도메인. 모든 구축물은 CD8 막관통 도메인 및 BBZ 세포질 도메인을 이용하고, 하기와 같이 그의 세포외 조성에서 상이하다: 도 2a는 그의 세포외 도메인이 PLA2R CysR 도메인, 이어서, CD8 힌지 도메인으로 구성된 것인 구축물 4025.C (또는 구축물 C)를 도시한 것이다. 도 2b는 CysR, FNII, 및 CTLD1 도메인, 이어서, CD8 힌지 도메인으로 구성된 구축물 4026.CF1 (또는 구축물 CF1)을 도시한 것이다. 도 2c는 CysR, FNII, CTLD1, 및 CTLD2 도메인, 이어서, CD8 힌지 도메인으로 구성된 구축물 4027.CF12를 도시한 것이다. 도 2d는 CysR, FNII, CTLD1, CTLD2, 및 CTLD3 도메인, 이어서, CD8 힌지 (4028.CF123) 또는 GS 링커 (CF123)로 구성된 구축물 4028.CF123 (또는 구축물 CF123)을 도시한 것이다. 도 2e는 CysR, FNII, CTLD1, CTLD2, CTLD3, 및 CTLD7 도메인, 이어서, GS 링커로 구성된 구축물 CF1237을 도시한 것이다. 도 2f는 CysR, FNII, CTLD1, 및 CTLD7 도메인, 이어서, GS 링커로 구성된 구축물 CF17을 도시한 것이다. 도 2g는 CysR, CTLD1, 및 CTLD7 도메인, 이어서, GS 링커로 구성된 구축물 C17을 도시한 것이다.
도 3a는 4028.CF123 CAAR을 포함하는 플라스미드 지도의 일부를 보여주는 도해이다. 도 3b는 본 발명에 기술된 CAAR 구축물의 조성을 구별 짓는 표이다.
도 4는 주르카트(Jurkat) NFAT-GFP 세포 상의 PLA2R CAAR의 서브세트 (4027.CF12 및 4028.CF123)의 표면 발현을 보여주는 유세포 분석법 플롯 시리즈이다. 상이한 PLA2R 렌티바이러스 구축물이 형질도입된 주르카트 NFAT-GFP 세포에 의한 PLA2R CAAR 발현을, PLA2R CTLD2 도메인에 특이적인 상업적 노부스 모노클로날 항체 (mAb)를 이용하여 측정하였다. CTLD2 도메인을 포함하지 않고, 따라서, 사용된 mAb에 의해서는 검출불가능한 4025.C를 보유하는 T 세포, 또는 비형질도입된 주르카트 NFAT-GFP 세포가 아닌, 구축물 4027.CF12 또는 4028.CF123을 발현하는 주르카트 T 세포는 CAAR의 검출가능한 표면 발현을 나타내었다.
도 5는 이소타입 대조군 (상단, 음성 대조군) 또는 PMA + 이오노마이신 (하단, 양성 대조군)을 이용한 PLA2R CAAR T 세포 활성화에 대한 음성 및 양성 대조군을 보여주는 유세포 분석법 플롯 시리즈이다.
도 6은 주르카트 NFAT-GFP 세포에 의한 GFP 발현으로서 측정된, PLA2R CTLD2 도메인에 대해 특이적인 플레이트-결합된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 의한 4027.CF12 및 4028.CF123 PLA2R CAAR T 세포의 활성화 (6 h 활성화)를 보여주는 유세포 분석법 플롯 시리즈이다. 항-PLA2R 모노클로날 항체 (mAb) 또는 폴리클로날 항-PLA2R 항체 (Ab)에의 노출시, 예상대로, CTLD2 도메인을 함유하지 않는 구축물 4025.C에서는 T 세포 활성화에 대한 어떤 증거도 관찰되지 않고, 비형질도입된 세포에서도 그러하다. 폴리클로날 항-PLA2R Ab가 아닌, 모노클로날 항-PLA2R mAb에 의한, PLA2R CAAR의 가교 결합에 대한 특이적인 T 세포 활성화가 관찰된다.
도 7a-7b는 PLA2R MN 환자 IgG가 형질도입된 주르카트 NFAT-GFP 및 1차 인간 T 세포 상의 PLA2R CAAR 발현을 검출한다는 것을 도시한 플롯 시리즈이다. 유세포 분석법 플롯은 평가된 모든 구축물 (4025.C, 4026.CF1, 4027.CF12, 4028.CF123, C, CF1, CF123, CF1237, CF17, C17)에 대한 주르카트 NFAT-GFP 세포 (도 7a) 및 1차 인간 T 세포 (도 7b) 상에서의 강건한 PLA2R CAAR 표면 발현을 입증한다. MN 환자 IgG, 이어서, APC-접합된 항-인간 IgG와 인큐베이션시킴으로써 상이한 PLA2R 렌티바이러스 구축물이 형질도입된 주르카트 NFAT-GFP 및 1차 인간 T 세포에 의한 PLA2R CAAR의 발현 (72h)을 검출하였다.
도 8은 플레이트-결합된 MN 환자 IgG가 PLA2R CAAR 형질도입된 주르카트-NFAT-GFP 세포를 활성화시킨다는 것을 도시한 플롯 시리즈이다. 유세포 분석법 플롯은 주르카트 NFAT-GFP 세포에 의한 GFP 발현으로서 측정된, MN 환자 IgG에 의한 PLA2R CAAR T 세포의 활성화 (6 h 활성화)를 보여주는 것이다. 평가된 모든 PLA2R CAAR T 세포 (4025.C, 4026.CF1, 4027.CF12, 4028.CF123, C, CF1, CF123, CF1237, CF17, C17)는 플레이트-결합된 항-PLA2R IgG에 의한 가교 결합 후 신호를 전달하였다.
도 9는 플레이트-결합된 MN 환자 IgG가 PLA2R CAAR-형질도입된 1차 인간 T 세포로부터의 IFN-γ 분비를 자극한다는 것을 도시한 그래프 세트이다. 5x104개의 1차 인간 T 세포를 10 ㎍/ml의 MN 환자 IgG 또는 대조군 인간 IgG로 코팅된 96-웰 플레이트에서 24h 동안 배양하였다. 이어서, ELISA에 의해 IFN-γ를 검출하기 위해 배양 상청액을 수거하였다. IFNγ 생산은 모든 배양 상청액에서 검출가능하였고, 비형질도입된 T 세포 또는 대조군 (Ctrl) 인간 IgG로 자극받은 PLA2R CAAR T 세포 대비 상승되어 있었다.
상세한 설명
본 발명은 항-포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) B 세포 수용체 (BCR)에 특이적인 키메라 자가항체 수용체 (CAAR), CAAR을 포함하는 조성물, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 CAAR을 포함하는 재조합 T 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 PLA2R-CAAR을 발현하는, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 유전적으로 변형된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 여기서, 발현된 CAAR은 PLA2R 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 일반적으로 자가항원 (예컨대, PLA2R)의 표적화와 연관된 자가항체 매개 신장 질환을 치료하기 위한, CAAR을 발현하도록 조작된 세포, 예컨대, T 세포의 용도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포, 예컨대, 본 발명의 CAAR을 발현하는 T 세포는 항-PLA2R BCR 발현 세포에 특이적으로 결합하고, 그를 사멸시키지만, 정상적인 BCR 발현 세포에는 결합하지 않고, 사멸시키지 않는다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나, 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및/또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술된다. 본 발명을 설명하고, 청구하는 데 있어서, 하기 용어는 정의가 제공되는 경우, 그가 정의되는 방법에 따라 사용될 것이다.
또한, 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 목적이며, 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다.
본원에서 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 하나 또는 1개 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들자면, "요소(an element)"는 하나의 요소 및 1개 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 양, 시간의 지속기간 등과 같은 측정가능한 값을 나타내는 경우, "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 일부 경우에, ±5%, 일부 경우에, ±1%, 일부 경우에, ±0.1%의 변동을 포함하는 것으로 하며, 그와 같은 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적합하다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있으며, 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서 항체는, 항체가, 예를 들어, 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv) 및 인간화 항체를 포함한, 인접 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (문헌 [Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; [Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]; [Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [Bird et al., 1988, Science 242:423-426]).
본원에서 사용되는 용어 "고 친화도"는 표적 분자에의 한 분자의 결합 또는 상호작용 또는 끌어당김에 있어서 높은 특이성을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 결합 분자는 예컨대, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바, 표적 분자에 대하여 100 nM, 50 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM보다 더 강력한 친화도를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역능이 있는 세포의 활성화, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 실제로 모든 단백질 또는 펩티드를 비롯한, 임의의 거대분자라도 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래할 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 임의의 DNA라도 이에 따라 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 추가로, 당업자는 항원이 단지 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 이러한 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 다양한 조합으로 정렬된다는 것이 용이하게 자명하다. 게다가, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성으로 생성될 수 있거나, 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있음이 용이하게 자명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 체액을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"자가항원"이란, 자가면역 반응의 생산, 예컨대, 자가항체의 생산을 자극시키는 내인성 항원을 의미한다. 자가항원은 또한 자가면역 발생을 초래할 수 있는 세포 매개 또는 항체 매개 면역 반응의 표적인, 정상 조직으로부터의 자가항원 또는 항원 또한 포함한다. 자가항원의 예로는 PLA2R, 및 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "제한된 독성"은, 건강한 세포, 비-종양 세포, 비-이환된 세포, 비-표적 세포 또는 이러한 세포의 집단에 대해 시험관내 또는 생체내에서 실질적으로 부정적인 생물학적 효과, 항-종양 효과, 또는 실질적으로 부정적인 생리학적 증상이 없음을 나타내는 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및/또는 항체를 지칭한다.
"자가항체"는 자가항원에 특이적인 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "자가면역 질환"은 자가항원에 대한 항체 매개 자가면역 반응으로부터 초래되는 장애 또는 병태로서 정의된다. 자가면역 질환은 자가항원 또는 자가항원들이 부적절하게 생산되고/거나, 과도하게 생산되는, 자가항체 생산을 초래한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "자가유래"는 추후에 개체에게 재-도입하고자 하는 동일 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것으로 한다.
"동종이계"란, 동일 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
"이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
"키메라 자가항체 수용체" 또는 "CAAR"은 세포, 예컨대, T 세포 또는 임의의 다른 효과기 세포 타입, 예컨대, 세포 매개 세포독성을 가능하게 하는 효과기 세포 타입 상에서 발현되는 조작된 수용체를 지칭한다. CAAR은 자가항체 및/또는 BCR, 예컨대, 병원성 자가항체 및/또는 BCR에 특이적인 항원 또는 그의 단편을 포함한다. CAAR은 임의로 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 신호전달 도메인 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 실질적인 영향을 미치지 않거나, 또는 실질적으로 변경시키지 않는 아미노산 변형을 가리키는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 예컨대, 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발과 같은, 당업계에 공지된 표준 기술들에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 CAAR의 세포외 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄 또는 전하를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 변경된 CAAR은 본원에 기술된 기능 검정법을 사용하여 자가항체에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
"공동자극 리간드"는, 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, T 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, 펩티드가 부하된 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공된 주요 신호 이외에도, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 (예컨대, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 증식과 같이, T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"코딩하는"이란, 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열을 갖는 생물학적 프로세스의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유 특성 및 그로부터 야기되는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다면, 단백질을 코딩하는 것이다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 것으로서, 그의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열과 동일하고, 보통 서열 목록에 제공되어 있는 코딩 가닥 및 비-코딩 가닥, 둘 모두 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 및 다른 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는 데 효과적인, 본원에 기술된 바와 같은 화합물, 작용제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 당업계에 적합한 임의의 수단에 의해 결정되는 바와 같은 바이러스 감염의 억제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "효과기 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"이란, 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 그 내부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나, 그 외부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 발현시키고자 하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 예컨대, 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예컨대, 네이키드 또는 리포솜에 함유), 레트로트랜스포존 (예컨대, 피기백, 슬리핑 뷰티), 및 바이러스 (예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 당업계에 공지된 것들 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "상동성"이란, 두 중합체 분자 사이, 예컨대, 두 핵산 분자, 예컨대, 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자 사이, 또는 두 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예컨대, 두 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 이때 이들은 그 위치에서 상동성인 것이다. 두 서열 간의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치 개수의 직접 함수이다; 예컨대, 두 서열에서 위치의 절반 (예컨대, 10개 서브유닛 길이의 중합체에서 5개 위치)이 상동성이라면, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예컨대, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성이라면, 두 서열은 90% 상동성이다.
본원에서 사용되는 바, "동일성"은 두 중합체 분자 사이, 특히, 두 아미노산 분자 사이, 예컨대, 두 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우; 예컨대, 두 폴리펩티드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유된다면, 이때 이들은 그 위치에서 동일한 것이다. 동일성 또는 두 아미노산 서열이 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도는 종종 퍼센트로서 표현된다. 두 아미노산 서열 간의 동일성은 매칭 또는 동일 위치 개수의 직접 함수이다; 예컨대, 두 서열의 위치 절반 (예컨대, 10개 아미노산 길이의 중합체에서 5개 위치)이 동일하다면, 두 서열은 50% 동일하고; 위치의 90% (예컨대, 10개 중 9개)가 매칭되거나 동일하다면, 두 아미노산 서열은 90% 동일하다.
본원에서 사용되는 바, "교육 자료(instructional material)"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는 데 사용될 수 있는 발행물, 기록물, 다이어그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육 자료는, 예를 들어, 본 발명의 핵산, 펩티드, 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나, 핵산, 펩티드, 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 탑재될 수 있다. 대안적으로, 교육 자료는 교육 자료 및 화합물이 수용자에 의해 협조적으로 사용될 수 있도록 하는 의도로 용기와는 별도로 탑재될 수 있다.
"세포내 도메인"은 세포 내부에 있는 분자의 부분 또는 영역을 지칭한다.
용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포내 도메인의 임의의 전장의 또는 말단절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
"단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나, 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어, 숙주 세포와 같이, 비-천연 환경에서 존재할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 가리키고, "C"는 시토신을 가리키며, "G"는 구아노신을 가리키고, "T"는 티미딘을 가리키며, "U"는 우리딘을 가리킨다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 측퇴성 버전이며, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특한 것이며; 이들은 숙주 세포의 DNA에 상당량의 유전 정보를 전달할 수 있으며, 이로써, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중의 하나가 된다. HIV, SIV, 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 이종 핵산 서열을 발현시키는, 조절 서열과 이종 핵산 서열 간의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되어 있는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 동일한 리딩 프레임에서 인접해 있고, 필요에 따라 두 단백질 코딩 영역을 결합시킨다.
면역원성 조성물의 "비경구적" 투여는, 예컨대, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "형질 세포"는 항체를 생산 및 분비할 수 있는 백혈구 타입을 지칭한다. 형질 세포는 또한 플라스모사이트, 플라스마사이트, 또는 효과기 B 세포로도 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이들 세포는 항원 수용체로서 세포 표면 상에 μ 쇄를 발현하는, B 세포 분화가 가능한 B 세포 전구체 또는 B 세포 분화 조기 단계의 B 세포; 전사 프로세스가 변화되고, IgM 생산이 막-타입 IgM에서 분비형 IgM으로 변경된 B 세포; 부류 전환이 완료되고, IgG, IgA, 및 IgM을 분비하는 성숙한 B 세포; 및 분화 최종 단계의 B 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "포스포리파제 A2 수용체" 또는 "M형 포스포리파제 A2 수용체" (PLA2R)는 상호교환적으로 사용되고, 이는 원발성 막성 신장병증 (MN)에서 신장 사구체에서 발현되는 주요 표적 항원을 지칭한다 (문헌 [Beck et al. 2009 N Engl J Med; 361: 11-21]). 항-PLA2R 자가항체는 주로 IgG4 서브부류의 것이지만, 서브부류 IgG1, IgG2, 및 IgG3 또한 나타낸다. PLA2R의 유전적 변이체 또한 MN과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Stanescu et al. 2011 N Engl J Med; 364(7):616-26]).
본원에서 사용되는 바, PLA2R 단편은 단축형 또는 말단절단된 PLA2R 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단 말단절단부 및/또는 또한 내부 결실부를 가질 수 있다. 단편의 예로는 PLA2R의 C형 렉틴 도메인 ("CTLD")을 포함하는 단편이 있다. 한 실시양태에서, PLA2R 단편은 인간 PLA2R (유니프로트KB(UniProtKB), Q13018)의 아미노산 잔기 21-1397인, PLA2R의 외부 도메인, 또는 아미노산 잔기 21-1397의 임의의 더 짧은 부분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 추가로, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환 가능하다. 당업자는 핵산은 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반 지식을 갖는다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 통상의 클로닝 기술 및 PCR™ 등을 사용한, 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용가능한 임의의 수단에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 본원에 개시된 임의의 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성 또는 상동성을 갖는 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "펩티드," "폴리펩티드," 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두 아미노산을 함유하여야 하며, 단백질의 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 대해서는 어떠한 제한도 두지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 단쇄, 및 당업계에서 일반적으로 여러 타입이 있는 단백질이라고 하는, 더욱 긴 장쇄, 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 다른 것들 중에서도 특히, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 상동성을 갖는 것으로 간주된다.
용어 "염증유발성 시토카인"은 염증 또는 염증 반응을 촉진시키는 시토카인 또는 인자를 지칭한다. 염증유발성 시토카인의 예로는 케모카인 (CCL, CXCL, CX3CL, XCL), 인터류킨 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL10 및 IL-15), 인터페론 (IFNγ), 및 종양 괴사 인자 (TNFα 및 TNFβ)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적인 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에서, 상기 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며, 또 다른 경우에, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 생성물의 발현을 위해 필요한 다른 제어 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적인 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우, 유전자 생성물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우, 유전자 생성물이 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재하는 경우에만 실질적으로 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는, 유전자를 코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우, 유전자 생성물이 세포가 프로모터에 상응하는 조직 타입의 세포인 경우에만 실질적으로 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전송에서 중요한 역할을 하는 각종 신호 전달 분자들 간의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 받아서 세포의 막을 가로질러 신호를 전송할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
"신호전달 도메인"은 활성화 신호에 반응하여 특이 단백질을 동원하고, 그와 상호작용하는 분자의 부분 또는 영역을 지칭한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예컨대, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 타입을 함유하지 않는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 보통은 그의 자연 발생적 상태에서 그와 회합되어 있는 다른 세포 타입과는 분리되어 있는 세포를 지칭한다. 일부 경우에서, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 또 다른 경우에, 상기 용어는 간단하게는 자연적으로 그의 자연 발생적 상태에서 결합되는 그와 회합되어 있는 세포와는 분리된 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않은 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 차도, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나, 도입되는 프로세스를 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
"막관통 도메인"은 지질 이중층 막에 걸쳐 있는 분자의 부분 또는 영역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "전사 제어하에" 또는 "작동적으로 연결된"이라는 어구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 전사의 개시를 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재하는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양쪽성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같은, 세포로의 핵산의 전달을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "특이적으로 결합한다"라는 용어는 샘플에 존재하는 동족 결합 파트너 (예컨대, T 세포 상에 존재하는 자극 및/또는 공동자극 분자) 단백질을 인식하고, 그와 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나, 결합하지 않는 항체, 또는 리간드를 의미한다.
"자극"이라는 용어는 자극 분자 (예컨대, TCR/CD3 복합체)를 그의 동족 리간드와 결합시켜, 예컨대, 제한 없이, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 이벤트를 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 인식 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
"자극 분자"는 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "자극 리간드"는 항원 제시 세포 (예컨대, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재하는 경우, T 세포 상의 동족 결합 파트너 (본원에서 "자극 분자"로 지칭)와 특이적으로 결합하여, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도, 펩티드가 부하된 MHC 클래스 I 분자, 항-CD3 항체, 과작동제 항-CD28 항체, 및 과작동제 항-CD2 항체를 포함한다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 비유연적인 제한으로서 해석되지 않아야 함을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 기술하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 상관 없이 적용된다.
설명
키메라 자가항체 수용체 ( CAAR )
본 발명은 부분적으로는, 활성화 및 자가항체 분비 후에 자가항체 매개 신장 질환을 유발할 수 있는, 자가항체-기반 B 세포 수용체를 발현하는 B 세포를 표적화하는 데 키메라 자가항체 수용체가 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 본 발명은 항-포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) B 세포 수용체 (BCR)에 특이적인 키메라 자가항체 수용체 (CAAR), CAAR을 포함하는 조성물, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 CAAR을 포함하는 재조합 T 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 PLA2R-CAAR을 발현하는, 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, 유전적으로 변형된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 여기서, 발현된 CAAR은 PLA2R 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법을 포함한다.
본 발명은 자가항체 매개 신장 질환을 치료하기 위한 기술을 포함한다. 특히, 궁극적으로는 자가항체를 생산하고, 그의 세포 표면 상에 자가항체를 제시하는 B 세포를 표적화하는 기술이 이들 B 세포를 치료적 개입을 위한 질환 특이적 표적으로서 마킹한다. 그러므로, 본 발명은 항원 특이적 (예컨대, PLA2R) 키메라 자가항체 수용체 (또는 CAAR)를 사용하여 질환 유발 B 세포를 표적화함으로써 자가항체 매개 신장 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고, 사멸시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 감염으로부터 보호되는 유익한 B 세포 및 항체는 무손상 상태 그대로 남겨 두면서, 오직 특이적인 항-PLA2R BCR 발현 B 세포만이 사멸된다.
한 측면에서, 본 발명은 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
자가항원 모이어티
한 실시양태에서, 본 발명의 CAAR은 다르게는 자가항원으로도 지칭되는 자가항체 결합 도메인 또는 그의 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 자가항원 선택은 표적화하고자 하는 자가항체 또는 BCR 타입 (예컨대, 항-PLA2R)에 의존한다. 예를 들어, 자가항원은 그가 특정 자가항체 매개 신장 질환 상태, 예컨대, 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증과 연관된, 표적 세포, 예컨대, BCR 발현 B 세포 상의 BCR 또는 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다.
일부 경우에서, 자가항체 결합 도메인은 CAAR이 최종적으로 사용되게 되는 동일 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서의 사용을 위해, CAAR의 자가항체 결합 도메인이 인간 BCR 또는 자가항체에 결합하는 인간 자가항원 (또는 그의 단편)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
한 예시적인 실시양태에서, 유전적으로 조작된 키메라 자가항체 수용체는 대상체에서 항-PLA2R BCR, 예컨대, B 세포 상의 항-PLA2R BCR에 결합하는 PLA2R 또는 그의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, CAAR은 PLA2R의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 N-말단 시스테인이 풍부한 도메인 (리신 B형 렉틴 도메인), 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, C형 렉틴 도메인 3, C형 렉틴 도메인 7, 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 서열번호: 1에 의해 코딩되는, 면역우세 에피토프, N-말단 시스테인이 풍부한 (CysR) 도메인 (리신 B형 렉틴 도메인), 서열번호: 3에 의해 코딩되는, 피브로넥틴 II형 도메인, 서열번호: 5에 의해 코딩되는, C형 렉틴 도메인 1, 및 서열번호: 7에 의해 코딩되는, C형 렉틴 도메인 2를 포함한다. 상기 PLA2R의 세포외 도메인은 본원에서 구축물 4027.CF12로 지정된 구축물의 세포외 도메인이고, 서열번호: 8에 의해 코딩되고, 여기서, 면역우세 에피토프, N-말단 시스테인이 풍부한 도메인과 피브로넥틴 II형 도메인 사이의 링커는 서열번호: 2에 의해 코딩되고, 피브로넥틴 II형 도메인과 C형 렉틴 도메인 1 사이의 링커는 서열번호: 4에 의해 코딩되고, C형 렉틴 도메인 1과 C형 렉틴 도메인 2 사이의 링커는 서열번호: 6에 의해 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 구축물 4027.CF12의 세포외 도메인 및 추가로, 서열번호: 14에 의해 코딩되는 C형 렉틴 도메인 3을 포함한다. 상기 후자의 PLA2R의 세포외 도메인은 본원에서 구축물 4028.CF123으로 지정된 구축물의 세포외 도메인이고, 서열번호: 15에 의해 코딩되고, 여기서, 면역우세 에피토프, N-말단 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형, C형 렉틴 도메인 1 및 C형 렉틴 도메인 2 사이의 링커는 본원에서 상기 구축물 4027.CF12에 대하여 열거된 것 (서열번호: 2, 4 및 6)과 동일하고, 추가로, C형 렉틴 도메인 2와 C형 렉틴 도메인 3 사이의 링커는 서열번호: 13에 의해 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인을 포함하는, 본원에서 구축물 C로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 시스테인이 풍부한 도메인은 서열번호: 49를 포함하고, 이는 서열번호: 47에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스테인이 풍부한 도메인은 서열번호: 1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, 및 C형 렉틴 도메인 1을 포함하는, 본원에서 구축물 CF1로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 51을 포함하고, 서열번호: 50에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는, 본원에서 구축물 CF123으로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 53을 포함하고, 서열번호: 52에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, C형 렉틴 도메인 3, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는, 본원에서 구축물 CF1237로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 55를 포함하고, 서열번호: 54에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는, 본원에서 구축물 CF17로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 57을 포함하고, 서열번호: 56에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는, 본원에서 구축물 C17로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 59를 포함하고, 서열번호: 58에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인을 포함하는, 본원에서 구축물 4025.C로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 61을 포함하고, 서열번호: 60에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1을 포함하는, 본원에서 구축물 4026.CF1로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 40을 포함하고, 서열번호: 39에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 2를 포함하는, 본원에서 구축물 4027.CF12로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 70을 포함하고, 서열번호: 8에 의해 코딩될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PLA2R의 세포외 도메인은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는, 본원에서 구축물 4028.CF123으로 지칭되는 구축물의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 71을 포함하고, 서열번호: 15에 의해 코딩될 수 있다.
자가항원 또는 그의 단편의 허용되는 변이는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 자가항원 또는 그의 단편은 서열번호: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 70 또는 71에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가항원 또는 그의 단편은 서열번호: 8, 15, 47, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 또는 62에 기재된 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
막관통 도메인
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 PLA2R CAAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, PLA2R CAAR은 자연적으로 PLA2R CAAR 중의 도메인들 중 하나와 회합된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하지 못하도록 선택되거나, 또는 아미노산 치환에 의해 변형된다.
막관통 도메인은 천연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연 공급원인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 막관통 도메인은 합성 막관통 도메인일 수 있고, 이러한 경우, 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 주로 포함할 것이다. 한 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 2 내지 10개의 아미노산 길이인 짧은 올리고 또는 폴리펩티드 링커가 PLA2R CAAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿이 특히 적합한 링커를 제공한다.
일부 경우에서, 힌지 (예컨대, CD8 또는 인간 Ig (면역글로불린) 힌지), 또는글리신-세린 (GS) 링커를 비롯한, 막관통 도메인 앞의 다양한 스페이서 도메인 또한 사용될 수 있다.
힌지 및/또는 막관통 도메인의 예로는 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR), OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 힌지 및/또는 막관통 도메인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 막관통 도메인, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, CD8 알파 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 알파 막관통 도메인은 아미노산 서열
Figure pct00001
를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 알파 막관통 도메인은 뉴클레오티드 서열
Figure pct00002
에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서 막관통 도메인은 서열번호: 19와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 20과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 힌지 도메인, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, CD8 알파 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 아미노산 서열
Figure pct00003
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 아미노산 서열
Figure pct00004
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열번호: 10의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 뉴클레오티드 서열
Figure pct00005
에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 뉴클레오티드 서열
Figure pct00006
에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 막관통 도메인 및 힌지 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열번호: 43 또는 서열번호: 44와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 42 또는 서열번호: 64와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 글리신 세린 (GS) 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 GS 링커 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, GS 링커는 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00007
에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, GS 링커는 아미노산 서열:
Figure pct00008
를 포함한다. 당업자는 CAAR 구축물에서 사용하기에 적절할 때, 적절한 링커 서열을 선택할 수 있을 것이다.
공동자극 분자의 세포내 도메인
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 본 발명의 PLA2R CAAR의 공동자극 분자의 세포내 도메인은 PLA2R CAAR이 위치하는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중의 적어도 하나의 활성화를 담당하는 세포질 도메인이다.
T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 시토카인의 분비를 비롯한, 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, "공동자극 분자의 세포내 도메인"이라는 용어는 효과기 기능 신호를 전달하고, 특수한 기능을 수행하도록 세포를 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자의 전체 세포내 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 공동자극 분자의 세포내 도메인의 말단절단된 부분이 사용될 정도로, 상기 말단절단된 부분은 그가 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 도메인 대신 사용될 수 있다.
공동자극 분자의 세포내 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 담당하는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 본원에 기술된 다른 공동자극 분자, 그의 임의의 유도체, 변이체, 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 가진 공동자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 그의 임의 조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 공동자극 신호전달 도메인으로서 주로 4-1BB (CD137)로 예시되지만, 른 공동자극 도메인도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
한 실시양태에서, 공동자극 분자의 세포내 도메인의 핵산 서열은 공동자극 분자 4-1BB (CD137로도 공지되고, 지칭) 세포내 도메인을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00009
을 코딩한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 4-1BB 세포내 도메인을 코딩하는 핵산 서열은
Figure pct00010
를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 4-1BB 세포내 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 66을 포함한다. 인간 세포내 4-1BB 도메인은 그의 원래의 리간드를 필요로 하지 않으면서, 세포외 자가항원, 예컨대, PLA2R, 또는 그의 단편에의 결합시, 공동자극 세포내 신호전달을 제공한다.
일부 실시양태에서, 공동자극 분자의 세포내 도메인은 서열번호: 21과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 22 또는 서열번호: 66과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
TCR 단독으로 그를 통해 생성되는 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공동자극 신호 또한 필요하다는 것은 잘 인지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2가지 별개의 종류에 의해 매개된다고 말할 수 있다: TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하도록 항원-비의존적 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열).
신호전달 도메인
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 신호전달 도메인을 포함한다. 1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특별히 사용되는 1차 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 본 발명의 CAAR에서 신호전달 분자는 CD3-제타로부터 유래된 신호전달 도메인을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
한 실시양태에서, CAAR의 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 자체를 또는 본 발명의 CAAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, CAAR의 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR은 CD3-제타 신호전달 도메인 자체를 또는 본 발명의 PLA2R CAAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함한다. 예를 들어, PLA2R CAAR은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3 제타 쇄 부분은 인간 T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄 이소폼 3 세포내 도메인 (인간 CD247)이다. 인간 세포내 CD3 제타 도메인은 HLA 제한 없이, 세포외 자가항원, 예컨대, PLA2R 또는 그의 단편에의 결합시 자극 세포내 신호전달을 제공한다.
한 실시양태에서, 신호전달 도메인의 핵산 서열은 CD3 제타 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인의 핵산 서열은
Figure pct00011
을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인의 핵산 서열은
Figure pct00012
을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은
Figure pct00013
를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD3 제타 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호: 74를 포함한다.
일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 서열번호: 23 또는 서열번호: 45와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 74와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
다른 도메인
일부 실시양태에서, PLA2R CAAR 및 PLA2R CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 T 세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄 신호 펩티드를 포함한다. 인간 CD8 알파 신호 펩티드는 수용체의 T 세포 표면으로의 전좌를 담당한다.
한 실시양태에서, PLA2R CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 펩티드 링커의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R CAAR은 펩티드 링커를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, PLA2R CAAR의 세포내 신호전달 도메인 내의 세포질 신호전달 서열은 무작위 또는 지정된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 도메인들 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿이 특히 적합한 링커이다.
일부 실시양태에서, CAAR은 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 패밀리 단백질로부터의 막관통 도메인 및/또는 세포질 (세포내) 도메인을 포함한다. KIR 유전자 패밀리는 적어도 15개의 유전자 유전자좌 (KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3) 및 염색체 19 (19q13.4)에 위치하는 백혈구 수용체 복합체 (LRC)의 100-200 Kb 영역 내에서 코딩되는 2개의 위유전자(pseudogene) (KIR2DP1 및 KIR3DP1)를 갖는다. LRC는 독특한 Ig 유사 세포외 도메인과 함께, 다른 세포 표면 분자를 코딩하는 유전자를 함유하는 면역 유전자로 빠르게 진화하는 큰, 1 Mb의, 조질한 클러스터를 구성한다. 추가로, 연장된 LRC는 막관통 어댑터 분자 DAP10 및 DAP12를 코딩하는 유전자를 함유한다. 따라서, KIR 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인을 포함하는 본 발명의 CAAR을 포함하는 세포는 또한 DAP10 또는 DAP12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, KIR은 KIRS2 또는 KIR2DS2이다.
특정 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 11, 17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 12, 18, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
CAAR 서열의 허용되는 변이는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 12, 및 18, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 또는 40에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAAR은 서열번호: 11, 17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 또는 39에 기재된 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
PLA2R CAAR을 포함하는 벡터
일부 실시양태에서, CAR의 발현이 인간 신장 인자 1 알파 프로모터에 의해 조절되는 제3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 플라스미드가 사용될 수 있다. 이는 숙주 T 세포에서 안정적으로 (영구적으로) CAR을 발현시킨다. 대안적인 접근법으로서, 코딩 mRNA를 숙주 세포에 전기천공시킬 수 있으며, 이는 바이러스에 의해 형질도입된 T 세포와 동일한 치료 효과를 달성하지만, 영구적이지 않은데, 그 이유는 mRNA가 세포 분열로 희석되어 버리기 때문이다.
한 측면에서, 본 발명은 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 인간 PLA2R 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 및 임의로, 막관통 도메인, 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 CAAR을 코딩하는 핵산 서열 중 임의의 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 레트로트랜스포존 (예컨대, 피기백, 슬리핑 뷰티), 부위 지정 삽입 벡터 (예컨대 CRISPR, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN), 또는 자살 발현 벡터, 또는 당업계에 공지된 다른 벡터를 포함한다.
본원에 개시된 모든 구축물은 제3세대 렌티바이러스 벡터 플라스미드, 다른 바이러스 벡터, 또는 인간 세포에서의 사용에 대해 승인받은 RNA와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 RNA 벡터이다.
PLA2R CAAR의 발현은 서열분석에 의해 확인될 수 있다. 전장 CAAR 단백질의 발현은 면역블롯, 면역조직화학법, 유세포 분석법 또는 당업계에 널리 공지되고, 이용가능한 다른 기술을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 CAAR을 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 것들을 포함한 벡터는, 이들이 딸 세포에서 트랜스진 및 그의 증식의 장기간 동안의 안정적인 통합을 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는, 이들이 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서, 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터를 능가하는 추가의 잇점을 갖는다. 이들은 또한 이것이 도입되는 대상체에서 낮은 면역원성을 초래한다는 추가의 이점을 갖는다.
간략하게 요약하면, CAAR을 코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드의 발현은 전형적으로, CAAR 폴리펩티드 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 프로모터 (예컨대, EF1알파 프로모터)에 작동가능하게 연결시키고, 구축물을 발현 벡터에 도입시킴으로써 달성된다. 벡터는 일반적으로 포유동물 세포에서 복제할 수 있고/거나, 또한 포유동물의 세포 게놈으로 통합할 수 있는 것이다. 전형적인 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절을 위해 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.
핵산은 임의 개수의 상이한 타입의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 관심의 대상이 되는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY]에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 통상의 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상이 선별가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
추가의 프로모터 요소, 예컨대, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30-110 bp 상류 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 출발 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 나타났다. 프로모터 요소 간의 스페이싱은 빈번히, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 이동되는 경우, 프로모터 기능이 보존되도록 가요성을 띤다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 간의 스페이싱은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들이 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다.
프로모터의 예는 전초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 시미안 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 연장 인자-1α 프로모터 뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 제한 없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열 또한 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요구되는 경우에는 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 작동시킬 수 있거나, 발현이 요구되지 않는 경우에는 발현을 작동시키지 않는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라키클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 세포외 리간드에 대한 반응으로 활성화된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 합성 수용체에의 세포외 리간드 결합에 의해 활성화된다 (그리고, CAAR의 발현이 조절된다). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 합성 수용체, 예컨대, 합성 Notch 수용체 (즉, "synNotch")는, 그가 그의 리간드에 결합하였을 때, CAAR을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 프로모터를 활성화시키는 결합 유발 전사 스위치로서 사용될 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 상기 시스템은 면역 세포가 (예컨대, CAAR의 결합 대상이 되는) BCR 또는 자가항체에 반응성을 띠도록 하기 위해서는 (예컨대, synNotch의 결합 대상이 되는) 리간드의 존재를 필요로 할 수 있다. 분자 회로에서 특정 신호전달 결과를 생성하기 위한 특정 조합 요건을 통해 논리 게이트가 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Roybal et al., 2016 Cell 164(4):770-9]를 참조한다.
키메라 수용체의 발현, 또는 그 발현의 조절을 위한 다른 시스템의 예로는 문헌 [Wu et al. (2015) Science 350: aab4077]; [Fedorov et al. (2014) Cancer Journal 20:160-165]; [Kloss et al. (2013) Nature Biotechnology 31: 71-75]; [Sakemura et al. (2016) Cancer Immunol. Res. 4:658-668]; [Hill et al. (2018) Nature Chemical Biology 14:112-117]; [Di Stasi et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-1683]; [Budde et al. (2013) PLoS One 8: e82742]; [Wei et al. (2012) Nature 488: 384-388; Ma et al. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113: E450-458]; [Rodgers et al. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113: E459-468]; [Kudo et al. (2014) Cancer Res. 74: 93-103], 및 [Chen et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 8531-8536]에 기술되어 있는 것을 포함한다.
CAAR 폴리펩티드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선별을 촉진시키기 위해 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 또 다른 측면에서, 선별가능한 마커는 별도의 DNA 조작 상에 보유되어 있고, 동시-형질감염 과정에서 사용될 수 있다. 선별가능한 마커 및 리포터 유전자, 둘 모두 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 적절한 조절 서열에 플랭크될 수 있다. 유용한 선별가능한 마커는 예를 들어, neo 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나, 또는 그에 의해 발현되지 않고, 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예컨대, 효소 활성에 의해 명백해지는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적합한 시간에 평가된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템이 널리 알려져 있고, 이는 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역이 리포터 유전자에 연결되어 프로모터 구동의 전사를 조정할 수 있는 능력에 대해 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
유전자를 세포에 도입 및 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 포유류, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미량주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY]를 참조한다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. RNA 벡터는 RNA 프로모터 및/RNA 전사체의 생산을 위한 다른 관련 도메인을 갖는 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를, 포유동물, 예컨대, 인간 세포에 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 수두바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함한 지질계 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예컨대, 인공 막 소포체)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용이 숙주 세포로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재하거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 회합된 결합 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 미셀에 함유되거나 미셀과 복합체를 형성하거나, 다르게 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생적 또는 합성 지질일 수 있는 지방질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 소적 뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대, 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 시그마 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 입수할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K 라보라토리즈(K & K Laboratories: 미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 입수할 수 있으며; 콜레스테롤 ("Choi")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 입수할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.: 미국 알라바마주 버밍엄)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 이것이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 동봉된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단층 및 다층 지질 비히클을 포함하는 일반 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 다공질 구조를 가짐을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁되는 경우, 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조의 형성 전에 자가-재배열을 겪으며, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (문헌 [Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10]). 그러나, 정상 소포체 구조와는 다른 구조를 용액 중에 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취할 수 있거나, 단지 지질 분자의 비균일 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
CAAR의 임의의 도메인 및/또는 단편, 및 프로모터는 PCR, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 증폭된 합성 유전자 단편일 수 있다.
CAAR을 포함하는 세포
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 PLA2R 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 PLA2R CAAR을 발현한다. 본 실시양태에서, 세포는 B 세포 상에, 또는 드물게는, 그의 B 세포 수용체를 하향조절시키지 않는, 형질 세포로 분화된 B 세포 상의 PLA2R 자가항체-기반 B 세포 수용체 (BCR)에 대해 높은 친화성을 갖는다. 그 결과, 유전적으로 변형된 세포는 항-PLA2R B 세포의 직접적인 사멸, 또는 PLA2R 자가항체를 발현하는 형질 세포의 간접적 사멸을 유도할 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 Fc 수용체에 결합된 항체에 대해 낮은 친화성을 갖는다.
한 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 T 세포, 예컨대, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포, 자연 킬러 세포, 시토카인 유도 킬러 세포, 그의 세포주, T 기억 줄기 세포, 또는 다른 T 효과기 세포이다. T 세포가 건강한 세포에 대해서는 제한된 독성을 갖고, 자가항체를 발현하는 세포에 대해서는 특이성을 갖는 것 또한 유용하다. 이러한 특이성은 자가항체에 대해 특이적이지 않은 현행 요법에서 만연한 오프-타겟 독성을 방지하거나 감소시킨다. 한 실시양태에서 T 세포는 건강한 세포에 대해 제한된 독성을 갖는다. 한 실시양태에서, T 세포는 자가유래 세포이다. 또 다른 실시양태에서, T 세포는 동종이계 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 시험관내에서 분화된 만능성 줄기 세포로부터 유래된 유전적으로 변형된 면역 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포, 예컨대, 1차 세포, 1차 T 세포로부터 유래된 확장된 T 세포, 시험관내에서 분화된 줄기 세포로부터 유래된 T 세포, T 세포주, 예컨대, 주르카트 세포, T 세포의 다른 공급원, 그의 조합, 및 다른 효과기 세포를 포함한다. 예를 들어, NFAT 반응 요소에 이어서, GFP를 갖는 형질도입된 주르카트 세포주는 PLA2R 특이적 B 세포를 검출 및 단리시키고, 종합적이고 비편향적인 방식으로 PLA2R 특이적 항체 레퍼토리를 클로닝하는 데 사용될 수 있다. 상호작용 B 및 주르카트 세포는 GFP 양성 더블릿 또는 다량체로서 검출되고, 유세포 분석법에 의해 분류될 수 있다. B 세포 수용체 코딩 유전자의 발현 클로닝은 자가항체 매개 신장 질환, 예컨대, 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증에서 자가면역 및 자가항체가 어떻게 발생하는지에 관한 추가 정보를 제공할 것이다.
CAAR이 자가항체 및 혈청, 예를 들어, 원발성 막성 신장병증 혈청에 특이적으로 결합할 수 있는 기능적 능력은 플레이트-결합된 자가항체에의 결합에 의한 CAAR의 활성화에 의존하는 주르카트 수용체 세포주 (그에 대한 반응으로 활성화된 세포는 안에 함유되어 있는 NFAT-GFP 리포터 구축물에 기인하여 녹색 형광을 발생시킨다)에서 평가될 수 있다. 상기 방법은 기능성 결합 능력에 대하여 유용하고, 신뢰가능한 정성적 측정법이다. 세포 표면 상의 자가항원의 적절한 프로세싱 또한 중요하고, 모노클로날 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 추가로, 주요 질환 에피토프에 기초한 PLA2R의 말단절단부 또한 유용하고, 본원에 포함된다. 상이한 길이의 힌지 영역 또는 GS를 이용하는 버전도 유용하다. 안전과 관련하여, 형질도입된 세포 사이의 또는 족세포에 대한 가능한 동종친화성 및 이종친화성 상호작용 및 활성화 (예컨대, PLA2R - PLA2R)을 방지 또는 감소시키는 것이 바람직하다.
CAAR의 효능 및 안전성에 관한 추가 평가는 예를 들어, 하기와 같이 수행될 수 있다:
구축물을 인간 세포, 예컨대, 293T/17에 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 상기 언급된 세포외 도메인, 도메인 사이의 링커, 또는 CAAR에 포함된 다른 구조에 대하여 특이적인, 모노클로날 항체 (IgG 또는 ScFv) 또는 PLA2R MN 환자로부터의 혈청 항체를 이용하여 표면 발현을 검출할 수 있다. 결합은 특이적인 2차 항체로 확인하고, 유세포 분석법에 의해 정량화할 수 있다.
임의의 이소타입의 인간 항-PLA2R 항체의 막 발현 구축물 생산이 상이한 PLA2R-CAAR을 시험하기 위한 표적 세포로서의 역할을 할 수 있다. 추가의 표적 세포주는 필요에 따라, 세포주 (예컨대, Nalm6 또는 K562 세포)의 표면 상의 인간 모노클로날 항체 발현에 의해 생산될 수 있다.
자가면역 질환
본 발명은 또한 자가항체 매개 신장 질환과 관련하여 자가항체 발현 세포와 연관된 장애 또는 자가면역 질환을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 자가항체 발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAAR을 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다. 자가항체 매개 신장 질환의 비제한적인 예로 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증을 포함한다.
치료 방법에서, 대상체로부터 단리된 T 세포는 적절한 CAAR을 발현하도록 변형되고, 생체외에서 확장된 후, 동일한 대상체 내로 재주입될 수 있다 (예컨대, T 세포는 자가유래 T 세포이다). 일부 실시양태에서, T 세포는 원래의 T 세포 공여자와 다른 대상체 내로 재주입될 수 있다 (예컨대, T 세포는 동종이계 T 세포이다). 변형된 T 세포는 표적 세포, 예컨대, 항-PLA2R B 세포 또는 PLA2R 자가항체 생산 B 세포 또는 형질 세포를 인식하고, 활성화되어, 자가면역 표적 세포를 사멸시킨다.
자가면역 질환 환자, 예를 들어, 원발성 막성 신장병증 환자에서 재발이 또한 일어날 수 있다. 리툭시맙으로 치료받은 환자에서, 재발은 동일한 자가항체 B 세포 클론의 지속에 의해 매개될 수 있는 반면, 관해는 상기 클론의 소실과 연관이 있다. PLA2R CAAR T 세포를 주입함으로써, 자가면역 세포는 고갈되어, 가능하게는 PLA2R CAAR T 세포의 장수에 기인하여 장기간의 관해가 유도되고/거나, 자가항원 반응성 클론은 재출현하지 않는다.
시험관내에서, 계내에서, 또는 생체내에서 PLA2R CAAR 발현 세포를 모니터링하기 위해, PLA2R CAAR 세포는 검출가능한 마커를 추가로 발현할 수 있다. PLA2R CAAR이 표적에 결합할 때, 검출가능한 마커는 활성화되고, 발현되며, 이는 예컨대, 유세포 분석법과 같은, 당업계에 공지된 검정법에 의해 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, PLA2R CAAR은 PLA2R CAAR 발현 세포를 검출 및 정량화하기 위해 NFAT 반응 요소 및 검출가능한 마커, 예컨대, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 포함한다.
T 세포의 공급원
확장 및 유전자 변형 이전에, T 세포 (예컨대, 자가유래 또는 동종이계 T 세포)가 대상체로부터 수득된다. 대상체의 예로는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 피부, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 개수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, T 세포는 예컨대, 피콜(Ficoll)™ 분리와 같은 당업자에게 알려져 있는 다수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출에 의해 수득된다. 분리반출 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포, 및 혈소판을 함유한다. 한 실시양태에서, 분리반출에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱 단계에 적절한 완충제 또는 매질에 배치할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로 세척된다. 대안적 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘이 결핍되고, 마그네슘이 결핍될 수 있거나, 전부는 아니지만, 다수의 2가 양이온이 결핍될 수 있다. 다시, 놀랍게도, 칼슘의 부재하에서의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 야기한다. 당업계의 통상의 숙련가들이 쉽게 인지하는 바와 같이, 세척 단계는 제조자의 지침에 따라 반자동화 "병류" 원심분리 (예를 들어, 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 박스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 헤모네틱스 셀 세이버(Haemonetics Cell Saver) 5)를 사용함으로써와 같이 당업계에 공지된 방법으로 달성될 수 있다. 세척 후, 세포를, 예를 들어, Ca-비함유, Mg-비함유 PBS, 플라스마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충제를 포함하거나, 또는 포함하지 않는 다른 염수 용액과 같은 각종 생체적합성 완충제에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, T 세포는 적혈구 세포를 용해시키고, 예를 들어, 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 세정에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와, 원하는 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 단리된다. 한 실시양태에서, 기간은 약 30분이다. 추가 실시양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상 및 그 사이의 모든 정수 값에 이른다. 추가 실시양태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 추가의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 한 바람직한 실시양태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병을 앓는 환자로부터의 T 세포의 단리를 위해, 예컨대, 24시간과 같은 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용이 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 보다 긴 인큐베이션 시간은 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는 데 있어서와 같이, 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 적은 임의의 상황에서 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축시키거나, 연장시킴으로써 T 세포는 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있게 되고/거나, 비드 대 T 세포의 비 (본원에 추가로 기술된 바와 같이)를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시시 또는 프로세스 동안의 다른 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시시 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 수 라운드의 선택이 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 실시양태에서, 선택 과정을 실시하고 활성화 및 확장 프로세스에서 "비선택된" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가의 선택에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유동세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축화시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLADR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62L+, GITR+, 및 FoxP3+을 발현하는 조절 T 세포를 농축화시키거나, 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시양태에서, T 조절 세포는 항-C25 접합 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다. 다른 실시양태에서, T 세포의 하위집단, 예컨대, 제한 없이, 하나 이상의 표면에 마커에 대하여 양성이거나, 또는 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대, CD28+, CD8+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포가 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예컨대, 비드와 같은 입자)의 농도는 변할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의적으로 감소시키는 것이 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것이) 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 20억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 실시양태에서, 10억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 개의 세포/ml 초과가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 또는 5,000만 개의 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 또는 1억 개의 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 2,500만 개 또는 1억 5,000만 개의 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용함으로써 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 증가시킬 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용으로 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를, 또는 다수의 종양 세포가 존재하는 샘플 (예컨대, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 상기 세포 집단은 치료 가치가 있을 수 있고, 수득하기에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용함으로써, 보통은 더 약한 CD28 발현을 보이는 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선택할 수 있다.
관련 실시양태에서, 더 낮은 저농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예컨대, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의적으로 희석시킴으로써, 입자와 세포 간의 상호작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합되는 높은 양의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 높은 수준의 CD28을 발현하며, 더 효율적으로 포획된다. 한 실시양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 X 106개/ml이다. 다른 실시양태에서, 사용되는 농도는 약 1 X 105개/ml 내지 1 X 106개/ml, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 기간 동안 회전기 상에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 공지되어 있고, 이러한 맥락에서 유용하지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는, 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하고, 이어서, 세포를 분당 1° 속도로 -80℃로 동결시키고, 기체상의 액체 질소 저장 탱크에서 보관한다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 비제어식으로 동결시키는 것 이외에도 다른 제어식 동결 방법이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 저온보존된 세포를 본원에 기술된 바와 같이 해동시키고, 세척하고, 본 발명의 방법을 사용한 활성화 이전에 실온에서 1시간 동안 휴지시킨다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시점 이전의 시점에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출 생성물의 수집이 본 발명과 관련하여 고려된다. 따라서, 확장시키고자 하는 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있으며, T 세포와 같은 원하는 세포는 본원에 기술된 것과 같은 T 세포 요법으로부터 이익을 얻는 임의의 다수의 질환 또는 병태를 위한 T 세포 요법에서 추후에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 한 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출은 질환이 발병돌 위험은 있지만, 아직 질환이 발병되지는 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해지며, 관심 세포가 추후 사용을 위해 단리되고 동결된다. 특정 실시양태에서, T 세포는 확장되고, 동결되며, 추후에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 실시양태에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대, 캄파트(CAMPATH), 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 조사와 같은 작용제로의 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 다수의 관련 치료 방식 이전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출로부터 단리된다. 이들 약물은 예를 들어, 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하거나 (시클로스포린 및 FK506), 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제시킨다 (라파마이신) (문헌 [Liu et al., Cell 66:807-815, 1991]; [Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991]; [Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993]). 또 다른 실시양태에서, 세포는 B-세포 제거 요법, 예컨대, 리툭산 이전에 단리되고, 상기 요법 이후에 치료를 위해 추후 사용을 위하여 동결될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, T 세포는 치료 후 바로 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 치료, 특히, 면역계를 손상시키는 약물로의 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안 치료 직후, 수득되는 T 세포의 품질이 최적이거나, 생체외에서 확장할 수 있는 이들의 능력이 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 유사하게, 본원에 기술된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 확장에 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복 시기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정 실시양태에서, 고정화 (예를 들어, GM-CSF로의 고정화) 및 컨디셔닝 요법이 특정 세포 타입의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 대상체에서, 특히, 요법 후 정의된 시간 창 동안 조건을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 타입은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장된다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장된다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대, 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성인자 (예컨대, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하는 데 적절한 조건하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예로는 9.3, B-T3, XR-CD28 (다이아클론(Diaclone): 프랑스 브장송)을 포함하며, 당업계에 일반적으로 공지된 다른 방법에서와 같이 사용될 수 있다 (문헌 [Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; [Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; [Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
특정 실시양태에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재할 수 있거나, 또는 표면에 커플링되어 있을 수 있다. 표면에 커플링되어 있는 경우, 작용제는 동일한 표면에 (즉, "시스" 형태로) 또는 별도의 표면에 (즉, "트랜스" 형태로) 커플링되어 있을 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되어 있고, 다른 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되어 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나, 표면에 커플링되어 있다. 특정 실시양태에서, 두 작용제 모두 용액 중에 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 작용제는 용액 형태로 존재한 후, 이어서, 표면, 예컨대, Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 제제에 결합되는 다른 결합제에 가교결합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
한 실시양태에서, 두 제제가 동일 비드, 즉 "시스," 또는 별도의 비드, 즉, "트랜스" 중의 어느 하나로 비드 상에 고정화된다. 예를 들자면, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 이들 두 작용제 모두 등가의 분자량으로 동일 비드에 공동-고정화된다. 한 실시양태에서,CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합되는 각 항체는 1:1 비로 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합되는 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장에 비해 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 한 특정 실시양태에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장에 비해 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 실시양태에서, 비드에 결합되는 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 한 측면에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉, CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 비드에 결합되는 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1 초과이다. 한 특정 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:100 CD3:CD28 비로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:75 CD3:CD28 비로 사용된다. 추가 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:50 CD3:CD28 비로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:30 CD3:CD28 비로 사용된다. 한 바람직한 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:10 CD3:CD28 비로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 1:3 CD3:CD28 비로 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합되는 항체는 3:1 CD3:CD28 비로 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 당업계의 통상의 숙련가들이 용이하게 인지할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포 대비 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 단지 몇 개의 세포에만 결합할 수 있는 반면, 보다 큰 비드는 다수에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값에 이르며, 추가 실시양태에서, 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하며, T 세포를 자극하는 데에도 또한 사용될 수 있다. T 세포 자극을 초래하는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 한 바람직한 비는 T 세포당 적어도 1:1 입자이다. 한 실시양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 한 특정 실시양태에서, 바람직한 입자:세포의 비는 1:5이다. 추가 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 첫날에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자가 1:1 내지 1:10 (첨가일에의 세포 계수에 기초하여)의 최종 비로 매일 또는 격일로 그 후 최대 10일 동안 세포에 첨가된다. 한 특정 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 첫날에 1:1이고, 자극 3일 및 5일째에 1:5로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 첫날에 1:1, 및 3일 및 5일째에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 첫날에 2:1이고, 자극 3일 및 5일째에 1:10으로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 첫날에 1:1, 및 3일 및 5일째에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 당업자는 다른 여러 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기와 타입에 의존하여 변할 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, T 세포와 같은 세포를 작용제-코팅된 비드와 조합한 후, 이어서, 비드와 세포를 분리한 후, 배양한다. 대안적 실시양태에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가 실시양태에서, 비드 및 세포를 먼저 자기력과 같은 힘을 가하여 농축시켜, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시킴으로써, 세포 자극을 유도한다.
예를 들자면, 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)를 T 세포와 접촉되게 함으로써 세포 표면 단백질을 라이게이션시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109개의 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 예를 들어 (칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온이 없는) PBS 중에서 조합한다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 인지할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플 중에 매우 드물게 존재할 수 있으며, 샘플의 0.01%만을 포함하거나, 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 개수가 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 실시양태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합된 부피를 유의적으로 감소 (즉, 세포의 농도를 증가)시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 약 20억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 1억 개의 세포/ml 초과가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 또는 5,000만 개의 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 또는 1억 개의 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 2,500만 개 또는 1억 5,000만 개의 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용으로 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 상기 세포 집단은 치료 가치가 있을 수 있고, 특정 실시양태에서, 수득하기에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용함으로써, 보통은 더 약한 CD28 발현을 보이는 CD8+ T 세포를 더욱 효율적으로 선택할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 혼합물을 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간 정수 값 동안 배양할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물을 21일간 배양할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비드 및 T 세포를 약 8일간 함께 배양한다. 또 다른 실시양태에서, 비드 및 T 세포를 2-3일간 함께 배양한다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 수회 사이클의 자극이 또한 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청 (예컨대, 우태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당업자에게 알려진 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함한, 증식 및 생존능에 필수적인 인자들을 함유할 수 있는 적절한 배지 (예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-비보(X-vivo) 15, (론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산 나트륨, 및 비타민이 첨가되거나, 또는 무혈청 또는 적당량의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장과 확장에 충분한 양의 시토카인(들)으로 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보 15, 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신은, 단지 실험 배양물에만 포함되며, 대상체에 주입하고자 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포를 성장을 뒷받침하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37℃) 및 대기 (예컨대, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지시킨다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 분리반출된 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 (TH, CD4+)를 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8-9일째 이전에는 TH 세포로 주로 이루어진 T 세포의 집단을 생산하는 반면, 약 8-9일째 이후에는, T 세포의 집단은 점점 더 많은 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, TC 세포 또는 TH 세포로 주로 구성된 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원 특이적 서브세트를 단리한다면, 이 서브세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유리할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 다른 표현형 마커는 세포 확장 프로세스의 과정 동안 상당히, 그러나 대부분, 재현성 있게 달라진다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T 세포 생성물을 특정 목적에 맞게 적합화시킬 수 있는 능력을 가능하게 한다.
치료 적용
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 대상체에게 유효량의, 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 대상체에게 유효량의, CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 PLA2R 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 자가항체 매개 신장 질환은 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증, 예컨대, 항-PLA2R 자가항체 및/또는 BCR에 의해 매개되거나, 또는 다르게는 그와 연관된 원발성 막성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
임의의 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, CAAR 변형된 T 세포에 의해 유도되는 항-자가항체 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 변형된 T 세포는 B 세포를 표적화한다. 예를 들어, 자가항체 발현 B 세포는 인접한 자가항체 발현 세포에 대해 이전에 반응한 CAAR-재지시 T 세포에 의한 간접 파괴에 민감할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 T 세포는 완전한 인간 CAAR에 의해 변형된다. 한 실시양태에서, 완전한 인간 CAAR 유전적으로 변형된 T 세포는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료법을 위한 백신의 한 유형으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화와 관련하여, 하기 중 적어도 하나가 세포를 포유동물에게 투여하기 이전에 시험관내에서 일어날 수 있다: i) 세포의 확장, ii) CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입, iii) 세포의 냉동보존.
생체외 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 하기에서 더욱 충분하게 논의된다. 간략하면, 세포를 포유동물 (예컨대, 인간)로부터 단리시키고, 본원에 개시된 CAAR을 발현하는 벡터로 유전적으로 변형 (즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염)시킨다. CAAR 변형된 세포를 포유동물 수용자에게 투여하여 치료상의 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAAR 변형된 세포는 수용자에 대해 자가유래인 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 대해 동종이계, 동계 또는 이종일 수 있다.
본 발명의 세포에 적용될 수 있는 조혈 줄기 및 선조 세포의 생체외 확장을 위한 방법이 미국 특허 번호 5,199,942 (이 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 다른 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 따라서, 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 간략하면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 포유동물로부터 말초 혈액 수확물 또는 골수 체외이식물로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포를 수집하고; (2) 이러한 세포를 생체외에서 확장시키는 것을 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기술된 세포 성장 인자 이외에도, 예컨대, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자들이 세포의 배양 및 확장에 사용될 수 있다.
생체외 면역화 측면에서 세포 기반 백신을 사용하는 것 이외에도, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 활성화??, 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 유발되는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 PLA2R CAAR 변형된 T 세포는 자가항체의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포는 자가항체의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태 발병 위험이 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 자가항체 (PLA2R)의 발현과 연관된 자가면역 신장 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, 본 발명의 CAAR 변형된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 자가면역 신장 질환, 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 CAAR 변형된 T 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하면, 본 발명의 약학 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 표적 세포 집단을 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대, 중성 완충처리된 염수, 포스페이트 완충처리된 염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만닛톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 산화방지제; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한 측면에서 정맥내 투여용으로 제제화된 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 (또는 예방)하고자 하는 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 비록 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 타입 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"면역학적 유효량," "항-BCR 유효량," "자가면역 질환 억제 유효량," 또는 "치료량"이 명시될 때, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태에 있어서의 개별 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 T 세포를 포함하는 약학 조성물은, 본 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 104 내지 109개의 세포/kg 체중, 일부 경우에, 105 내지 106개의 세포/kg 체중인 투여량으로 투여될 수 있다고 할 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조). 특정 환자를 위한 최적의 투여량 및 치료 요법은 질환 징후에 대해 환자를 모니터링하고, 이에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야의 숙련가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 활성화된 T 세포가 대상체에게 투여된다. 투여에 이어서, 혈액을 재채혈하거나, 분리반출을 수행하고, 본원에 기술된 방법을 사용하여 T 세포를 활성화시키고, 그로부터 확장시킨 후, 환자에게 다시 재주입한다. 이 프로세스는 몇 주마다 다회 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 상기 다중 채혈/다중 재주입 프로토콜을 이용함으로써 T 세포의 특정 집단을 선택할 수 있다.
투여되는 본 발명의 세포는 요법을 받는 대상체와 관련하여 자가유래, 동종이계 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 세포의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함한 임의의 편리한 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 진피내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 진피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. T 세포의 조성물은 림프절, 또는 다른 병생리학적 활성 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 본원에 기술된 방법, 또는 T 세포가 치료 수준으로 확장되는 당업계에 공지된 다른 방법들을 사용하여 활성화되고, 확장된 세포는 작용제, 예컨대, 면역억제제, 예컨대, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대, 캄파트(CAMPATH), 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 시톡산, 플루다라빈, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인, 및 조사를 이용하는 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 개수의 관련 치료 방식과 함께 (예컨대, 그 이전에, 동시에 또는 그 이후에) 환자에게 투여된다. 이들 약물은 예를 들어, 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하거나 (시클로스포린 및 FK506), 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제시킨다 (라파마이신) (문헌 [Liu et al., Cell 66:807-815, 1991]; [Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991]; [Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993]). 추가 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 예컨대, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용한 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 캄파트와 함께 (예컨대, 그 이전에, 동시에 또는 그 이후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 작용제, 예컨대, 리툭산과 같은 B-세포 제거 요법 후에 투여된다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 보체 매개 세포독성의 위험을 감소시키기 위해 보체 억제제와, 또는 요법 이전에 항-PLA2R 항체 농도를 감소시키기 위해, 항체 항-FcRn, IVIg, 또는 혈장분리반출과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 가벼운 림프구고갈 요법 (예컨대, 저용량 플루다라빈 또는 시톡산)이 본 발명의 T 세포를 이용하는 치료 이전에 수행될 수 있다.
환자에게 투여하고자 하는 상기 치료의 투여량은 치료되는 병태의 정확한 성질 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 크기조정은 당업계에서 받아들여지는 관례에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 캄파트에 대한 용량은, 일반적으로 성인 환자의 경우, 1 내지 약 100 mg의 범위로, 일반적으로, 1 내지 30일 기간 동안 매일 투여될 것이다. 비록 일부 경우에 1일당 최대 40 mg인 더 큰 용량이 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 1일 용량은 1일당 1 내지 10 mg이다 (미국 특허 번호 6,120,766에 기술).
실험적 실시예
본 발명은 하기 실험적 실시예를 참고로 하여 추가로 상세히 기술된다. 이러한 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 자명해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 당업계의 통상의 숙련가는, 상기 설명 및 하기 예시적 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 사용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 믿어진다. 따라서, 하기 실험 실시예는 구체적으로 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내며, 어느 방식으로든 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이제, 본원에 개시된 실험의 실행에 사용되는 물질 및 방법이 기술된다.
- CAAR 구축물
A) PLA2R - CAAR 구축물 4027.CF12에 포함된 도메인
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
B) PLA2R - CAAR 구축물 4028.CF123에 포함된 도메인
시스테인이 풍부한 ( CysR ) 도메인 (리신 B 타입 렉틴 도메인) (서열번호: 1)
리신 B 타입 렉틴 도메인과 피브로넥틴 II형 도메인 사이의 링커 (서열번호: 2)
피브로넥틴 II형 도메인 (서열번호: 3)
피브로넥틴 II형 도메인과 C형 렉틴 도메인 1 사이의 링커 (서열번호: 4)
C형 렉틴 1 도메인 (서열번호: 5)
C형 렉틴 도메인 1과 C형 렉틴 도메인 2 사이의 링커 (서열번호: 6)
C형 렉틴 도메인 2 (서열번호: 7)
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
- HIV-1 기반 자가-불활성화 렌티바이러스 제조
293T 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000과의 복합체 중 pTRPE-관심 유전자, 패키징 플라스미드 pGAG-Pol 및 외피 플라스미드 pCI VSVg의 혼합물로 전면생장률 90%로 형질감염시켰다. 24 내지 48시간 경과 후 상청액을 함유하는 렌티바이러스를 수거하고 0.45 ㎛ 폴리에테르술폰 (PES) 막을 통해 여과하고, 4℃에서 24시간 동안 12,000xg로 농축시키고, -80℃에서 보관하였다.
- 1차 인간 T 세포의 자극, 형질도입, 및 확장
1차 인간 T 세포를, 5% HSAB, 2.6% 보충제, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타맥스를 포함하는 CTS 옵트마이저(CTS OpTmizer) T 세포 확장 SFM 중에 배양하였다. 벌크 T 세포 (CD4+ 및 CD8+)를 3:1의 비드:세포 비로 항-CD3 및 항-CD28 비드로 자극시켰다. 배양 배지를 100 IU/ml 인터류킨 2로 보충하였다. 자극 후 24시간째, 106개의 T 세포를 CAAR로 형질도입시키거나, 또는 모의 형질도입시켰다. 8-12일 동안 T 세포 확장을 모니터링하였다. 원발성 막성 신장병증 환자의 혈장으로부터 정제된 IgG 및 이소타입 대조군 항체를 이용한 유세포 분석법에 의해 CAAR 구축물의 세포 표면 발현을 입증하였다.
- NFAT - GFP 주르카트 T 세포를 이용하여 리포터 검정법
주르카트 세포를 RPMI1640, HEPES 10 mM, 및 10% FBS를 이용하여 완전 습윤화된 환경에서 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. CAAR-표적 상호작용에 의한 신호 전달을 시험하기 위해, CAAR 결합 및 PLC감마 및 IP3 매개 세포내 칼슘 방출 후 GFP 발현을 촉진시키면서, NFAT 반응 요소하에 제어된 GFP의 안정적인 발현에 대하여 선택된 (G418) 주르카트 수용체 세포주에서 CAAR 구축물을 발현시켰다. 주르카트 세포를 다중 감염도 3으로 CAAR 렌티바이러스로 형질도입시키고, >72시간 후, 항-PLA2R 모노클로날 항체 (노부스 바이오로지컬즈(Novus Biologicals)®) 및 원발성 막성 신장병증 환자의 혈장으로부터 정제된 IgG를 이용하여 유세포 분석법에 의해 CAAR 구축물의 발현을 입증하였다. CAAR-표적 상호작용의 특징화를 위해, CAAR 주르카트 세포를 하기와 같이 플레이트-결합된 항-PLA2R 모노클로날과 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 유세포 분석법에 의해 GFP 발현을 입증하였다.
- 자극
100만 개의 주르카트-NFAT-GFP 세포를 PLA2R CAAR 구축물 C, CF1, CF123, CF1237, CD17, C17, 4025.C, 4026.CF1, 4027.CF12, 4028.CF123을 코딩하는 각 렌티바이러스로 형질도입시키고, 비형질도입된 주르카트 세포는 음성 대조군으로서 사용하였다. 형질도입된 세포 및 비형질도입된 세포를 100 ㎕ 세포 배양 배지 중 2x105개의 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
자극 조건은 하기와 같았다:
- 노부스 모노클로날 항체 (mAb) 항-PLA2R 0.5 ㎍/웰 또는 1 ㎍/웰;
클론 12-6-5
- 시그마 폴리클로날 항체 항-PLA2R 0.5 ㎍/웰;
- 노부스 mAb 항-PLA2R에 대한 이소타입 항체 (0.5 ㎍/염색)
- 배지 단독 (비자극)
- PMA/이오노마이신 (최대 활성화).
또는 형질도입된 세포 및 비형질도입된 세포를 100 ㎕ 세포 배양 배지 중 5x104개의 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
세포 및 항체를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 6 h 종료시, 세포를 유세포 분석법에 의해 T 세포 활성화의 인디케이터로서 NFAT-GFP의 발현에 대하여 조사하였다.
- 시험관내 IFNγ 시토카인 검정법
PLA2R CAAR 또는 모의 형질도입된 1차 인간 T 세포를 10 ㎍/ml의, 원발성 막성 신장병증 환자의 혈장으로부터 정제된 IgG 또는 대조군 인간 IgG로 코팅된 96-웰 플레이트 중 5x104개/웰로 24 h 동안 배양하였다. 이어서, 배양 상청액을 ELISA에 의한 IFN-γ 검출을 위해 수거하였다.
- CAAR T 세포의 생체내 효능 시험
생체내 효능을 시험하기 위해, 인간 PLA2R을 표적화하는 항-PLA2R BCR 발현 세포, 예를 들어, 하이브리도마 세포 또는 인간 세포주를 생성한다. PLA2R BCR 발현 세포를, 방아벌레 녹색 또는 방아벌레 적색 루시페라제 및 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. PLA2R 특이적 표적 세포에 대한 CAAR-T 세포의 효능을 시험하기 위해, BCR 발현 세포에 대한 FcγR 매개 독성을 최소화하기 위해 2일 동안 매일 마우스를 600 mg/kg 정맥내 면역글로불린으로 전처리한 후, 대략 2x105개의 항-PLA2R 세포를 NSG 마우스 (6-8주령) 내로 정맥내로 주사한다. 4-5일 후, PLA2R CAAR T 세포 (대략 107개의 세포/마우스)를 정맥내로 주사한다. 주사 후 매 2-3일마다 생체발광 및/또는 혈청 자가항체를 정량화하여 CAAR T 세포 효능을 모니터링한다.
이제, 본 실험들의 결과를 기술한다.
실시예 1:
PLA2R의 4개의 도메인을 나타내는 4개의 PLA2R 구축물을 CAAR 발현 시스템으로 클로닝하였다 (4025.C, 4026.CF1, 구축물 4027.CF12 및 4028.CF123). 본 발명에서 특히 관심의 대상이 되는 PLA2R의 세포외 도메인의 일반 개략도는 도 1에 도시되어 있다. N 말단 도메인은 환자 혈청 항체에 의해 인식되는 면역우세 에피토프이다. CysR 및 CTLD3 도메인은 상호작용하여 고리 유사 구조를 형성하며, 이는 면역우세 에피토프를 더욱 잘 제공할 수 있는 바; 이에 CysR부터 CTLD3 도메인까지 포함하는 구축물을 생성하였다. 시스테인이 풍부한 도메인 이외에도, C형 렉틴 도메인 1 및 7에 대한 혈청 항체 면역반응성 또한 보고되었다.
PLA2R CAAR 구축물은 도 2a-2g에 도시되어 있다. 모든 구축물은 CD8 막관통 도메인 및 BBZ 세포질 도메인을 이용하고, 그의 세포외 조성에서 상이하다.
구축물 4025.C는 시스테인이 풍부한 세포외 도메인, CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인으로 구성되었다(도 2a, 서열번호: 37 & 38).
구축물 4026.CF1은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, 및 C형 렉틴 1 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 4026.CF1은 또한 CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하였다 (도 2b, 서열번호: 39 & 40).
구축물 4027.CF12는 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, C형 렉틴 1 도메인, 및 C형 렉틴 2 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 4027.CF12는 또한 CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하였다 (도 2c, 서열번호: 11 & 12).
구축물 4028.CF123은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, C형 렉틴 1 도메인, C형 렉틴 2 도메인, 및 C형 렉틴 3 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 4028.CF123은 또한 CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하였다 (도 2d, 서열번호: 17 & 18). PLA2R CAAR 구축물 4028.CF123의 상세한 지도가 도 3a에 제시되어 있다.
CAAR 분자가 기능성인지 여부를 시험하기 위해, 하기 실험을 수행하였다:
100만 개의 주르카트-NFAT-GFP 세포를 4025.C, 4027.CF12, 4028.CF123을 코딩하는 각 렌티바이러스로 형질도입시키고, 비형질도입된 주르카트 세포는 음성 대조군으로서 사용하였다. 형질도입된 세포 및 비형질도입된 세포를 100 ul 세포 배양 배지 중 2x105개의 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 도 4는 PLA2R CAAR 발현을 보여주는 것이다. PE에 접합된 가용성 항-PLA2R 모노클로날 항체로 염색함으로써, 상이한 PLA2R 렌티바이러스 구축물로 형질도입된 주르카트 NFAT-GFP 세포에 의한 PLA2R CAAR의 발현을 측정하였다. CTLD2 도메인을 포함하지 않고, 따라서, 사용된 mAb에 의해서는 검출불가능한 구축물 4025.C를 보유하는 T 세포가 아닌, 구축물 4027.CF12 또는 4028.CF123을 보유하는 주르카트 T 세포는 CAAR의 검출가능한 표면 발현을 나타내었다.
도 5 및 6은 명시된 구축물로 형질도입된 주르카트 세포의 GFP 발현에 의해 T 세포 활성화를 보여주는 것이다. 음성 및 양성 대조군은 도 5에 제시되어 있다. 시험 샘플은 도 6에 제시되어 있다.
세포 및 항체를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 6 h 종료시, 세포를 T 세포 활성화의 인디케이터로서 NFAT-GFP의 발현에 대하여 조사하였다.
도 5는 이소타입 대조군 (상단, 음성 대조군) 또는 PMA + 이오노마이신 (하단, 양성 대조군)을 이용한 PLA2R CAAR T 세포 활성화에 대한 음성 및 양성 대조군을 도시한 것이다.
도 6은 주르카트 NFAT-GFP 세포에 의한 GFP 발현으로서 측정된, 특정 항체에 의한 PLA2R CAAR T 세포의 활성화 (6 h 활성화)를 도시한 것이다. 모노클로날 항-PLA2R Mab 또는 폴리클로날 항-PLA2R Ab에의 노출시, 구축물 4025.C 및 비형질도입된 세포에서는 T 세포 활성화에 대한 어떤 증거도 관찰되지 않는다. 구축물 4027.CF12 및 4028.CF123 사용시, 폴리클로날 항-PLA2R Ab가 아닌, 모노클로날 항-PLA2R Ab에 의한, 가교 결합에 대한 반응으로 특이적인 T 세포 활성화가 관찰된다.
실시예 2:
본원에서 추가로 6개의 PLA2R CAAR 구축물을 디자인하고, 생성하였다. 구축물 C는 시스테인이 풍부한 도메인, CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인으로 구성되었다(도 2a, 서열번호: 25 & 26).
구축물 CF1은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, 및 C형 렉틴 1 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 CF1은 또한 CD8 힌지 영역, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하였다 (도 2b, 서열번호: 27 & 28).
구축물 CF123은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, C형 렉틴 1 도메인, C형 렉틴 2 도메인, 및 C형 렉틴 3 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 CF123에는 또한 GS 링커, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인도 포함되었다 (도 2c, 서열번호: 29 & 30).
구축물 CF1237은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, C형 렉틴 1 도메인, C형 렉틴 2 도메인, C형 렉틴 3 도메인 및 C형 렉틴 7 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 CF1237에는 또한 GS 링커, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인도 포함되었다 (도 2d, 서열번호: 31 & 32).
구축물 CF17은 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II 도메인, C형 렉틴 1 도메인, 및 C형 렉틴 7 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 CF17은 또한 GS 링커, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인도 포함하였다 (도 7e, 서열번호: 33 & 34).
구축물 C17은 시스테인이 풍부한 도메인, C형 렉틴 1 도메인, 및 C형 렉틴 7 도메인을 포함하는 세포외 도메인으로 구성되었다. 구축물 C17은 또한 GS 링커, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인도 포함하였다 (도 7f, 서열번호: 35 & 36).
다양한 PLA2R CAAR 구축물을 주르카트 세포 및 1차 인간 T 세포 내로 형질도입하였다. MN 환자 IgG, 이어서, APC-표지된 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여, 유세포 분석법에 의해 PLA2R CAAR의 표면 발현을 평가하였다. 비형질도입된 대조군 세포를 제외한, 형질도입된 주르카트 (도 7a) 및 1차 인간 T 세포 (도 7b) 모두 CAAR 구축물의 검출가능한 표면 발현을 나타내었다.
항-PLA2R B 세포의 표면을 모방하는 플레이트-결합된 항-PLA2R IgG가 CAAR T 세포 활성화를 일으킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 5x104개의 주르카트 NFAT-GFP 수용체 세포를 10 ㎍/ml의 MN 환자 IgG 또는 대조군 인간 IgG로 코팅된 96-웰 플레이트에서 6 h 동안 배양하였다. 이어서, 유세포 분석법 분석을 위해 세포를 수거하였다. 대조군 인간 IgG가 아닌, MN 환자 IgG가 10개의 구축물 각각의 것으로 형질도입된 주르카트 세포를 활성화시켰다 (도 8). MN 환자 IgG 또는 대조군 인간 IgG에의 노출시, 비형질도입된 주르카트 세포에서는 T 세포 활성화에 대한 어떤 증거도 관찰되지 않았다 (도 8). 상기 연구는 CAAR 신호전달이 표적과의 조우시에 활성화된다는 것을 시사한다.
1차 인간 PLA2R CAAR T 세포가 플레이트-결합된 항-PLA2R IgG에 의해 활성화될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, PLA2R CAAR T 세포를 24 h 동안 플레이트-결합된 MN 환자 IgG 또는 대조군 인간 IgG에 노출시켰다. 배양 상청액의 ELISA에 의해 IFN-γ 분비를 측정하였다. 대조군 인간 IgG와 비교하였을 때, MN 환자 IgG는 현저히 더 높은 IFN-γ 생산을 자극시켰고, 이는 표적 결합 후, 1차 인간 CAAR T 세포 활성화를 반영하는 것이다 (도 9).
본원에서 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 공개문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 발명이 구체적인 실시양태를 참조로 하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 실시양태 및 변형은 본 발명의 참된 정신 및 범주로 벗어남 없이 당업자에 의해 고안될 수 있다는 것은 자명하다. 첨부된 청구범위는 상기 실시양태 및 등가의 변형, 그 모두를 포함한다는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania Gill, Saar Payne, Aimee Hogan, Jonathan Wang, Baomei <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF PHOSPHOLIPASE A2 RECEPTOR CHIMERIC AUTOANTIBODY RECEPTOR T CELLS <130> 046483-7207WO1(02014) <150> 62/665,863 <151> 2018-05-02 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CysR (Ricin B type lectin) domain <400> 1 aagggcatct tcgtgatcca gagcgagagc ctgaagaagt gcatccaggc cggcaagagc 60 gtgctgaccc tggaaaattg caagcaggcc aacaagcaca tgctgtggaa atgggtgtcc 120 aaccacggcc tgttcaacat cggcggctct ggatgtctgg gcctgaattt ctctgcccct 180 gagcagcctc tgagcctgta cgagtgtgat agcaccctgg tgtccctgag atggcggtgc 240 aaccggaaga tgatcacagg ccctctgcag tactctgtgc aggtcgccca cgacaatacc 300 gtggtggcca gcagaaagta catccacaag tggatcagct acggcagcgg cggaggcgac 360 atctgtgaat ac 372 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 2 ctgcacaagg atctgcacac catcaagggc aac 33 <210> 3 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin type-2 domain <400> 3 acccacggaa tgccctgcat gttcccgttt cagtacaacc accagtggca ccacgagtgc 60 accagagaag gcagagagga cgacctgctt tggtgcgcca caaccagcag atacgagcgg 120 gatgagaagt ggggcttctg ccctgat 147 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 4 cctacctctg ccgaagtggg ctgcgatacc atctgggaga aagacctg 48 <210> 5 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-type lectin domain 1 <400> 5 aacagccaca tctgctacca gttcaacctg ctgtccagcc tgtcttggag cgaggcccac 60 agcagctgtc aaatgcaagg cggcacactg ctgagcatca ccgacgagac agaggaaaac 120 ttcatccgcg agcacatgag cagcaagacc gtggaagtgt ggatgggact gaaccagctg 180 gatgagcatg ccggatggca gtggagtgat ggcacccctc tgaactacct gaactggtcc 240 cctgaagtga acttcgagcc cttcgtggaa gatcactgcg gcaccttcag cagcttcatg 300 cccagcgctt ggagaagcag agactgcgag agcaccctgc cttacatctg caag 354 <210> 6 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 6 aagtacctga 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aggccctgag aagctgccag gccgataata gcgccctgat cgacatcaca 1140 agcctggccg aggtggaatt tctggtcact ctgctgggcg acgagaacgc ctctgagaca 1200 tggatcggcc tgtccagcaa caagatcccc gtgtccttcg agtggtccaa cgacagcagc 1260 gtgatcttca ccaactggca caccctggaa cctcacatct tccccaacag atcccagctg 1320 tgtgtgtccg ccgagcagtc tgaaggccac tggaaagtga agaactgcga ggaacggctg 1380 ttctacatct gtaaa 1395 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 9 aaggccggcc acgtgctgtc cgatgccgag agtggatgtc aatccgga 48 <210> 10 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge domain <400> 10 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gt 132 <210> 11 <211> 2232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLA2R-CAAR Construct 4027.CF12 <400> 11 atgctgctga gccctagcct gctgctgctc ctgcttcttg gagcccctag aggatgtgcc 60 ggatctgaag gtgttgccgc cgctctgaca cccgagagac tgctggaatg gcaggacaag 120 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tcgagccctt cgtggaagat cactgcggca ccttcagcag cttcatgccc 1020 agcgcttgga gaagcagaga ctgcgagagc accctgcctt acatctgcaa gaagtacctg 1080 aaccacatcg accacgagat cgtggaaaag gacgcctgga agtactacgc cacacactgc 1140 gagcctggct ggaaccccta caaccggaac tgctacaagc tgcagaaaga ggaaaagacc 1200 tggcacgagg ccctgagaag ctgccaggcc gataatagcg ccctgatcga catcacaagc 1260 ctggccgagg tggaatttct ggtcactctg ctgggcgacg agaacgcctc tgagacatgg 1320 atcggcctgt ccagcaacaa gatccccgtg tccttcgagt ggtccaacga cagcagcgtg 1380 atcttcacca actggcacac cctggaacct cacatcttcc ccaacagatc ccagctgtgt 1440 gtgtccgccg agcagtctga aggccactgg aaagtgaaga actgcgagga acggctgttc 1500 tacatctgta aaaaggccgg ccacgtgctg tccgatgccg agagtggatg tcaatccgga 1560 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 1620 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 1680 gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1740 ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1800 aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1860 tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1920 gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1980 gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 2040 agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 2100 gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 2160 taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 2220 ccccctcgct aa 2232 <210> 12 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLA2R-CAAR Construct 4027.CF12 <400> 12 Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Cys Ala Gly Ser Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu 35 40 45 Ser Leu Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu 50 55 60 Asn Cys Lys Gln Ala Asn Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn 65 70 75 80 His Gly Leu Phe Asn 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cggcggctgc 1740 gtggcaatga gaggcagaca tcctctcggc agatgggaag tgaagcactg tcggcacttc 1800 aaggccatgt ctctgtgc 1818 <210> 16 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 16 aagcagcccg tggaaaatca agagaaggcc gagtacgagg aacgctggcc ttttcaccct 60 tgctacctgt ccgga 75 <210> 17 <211> 2682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLA2R-CAAR Construct 4028.CF123 <400> 17 atgctgctga gccctagcct gctgctgctc ctgcttcttg gagcccctag aggatgtgcc 60 ggatctgaag gtgttgccgc cgctctgaca cccgagagac tgctggaatg gcaggacaag 120 ggcatcttcg tgatccagag cgagagcctg aagaagtgca tccaggccgg caagagcgtg 180 ctgaccctgg aaaattgcaa gcaggccaac aagcacatgc tgtggaaatg ggtgtccaac 240 cacggcctgt tcaacatcgg cggctctgga tgtctgggcc tgaatttctc tgcccctgag 300 cagcctctga gcctgtacga gtgtgatagc accctggtgt ccctgagatg gcggtgcaac 360 cggaagatga tcacaggccc tctgcagtac tctgtgcagg tcgcccacga caataccgtg 420 gtggccagca gaaagtacat ccacaagtgg atcagctacg gcagcggcgg aggcgacatc 480 tgtgaatacc tgcacaagga tctgcacacc atcaagggca acacccacgg aatgccctgc 540 atgttcccgt ttcagtacaa ccaccagtgg caccacgagt gcaccagaga aggcagagag 600 gacgacctgc tttggtgcgc cacaaccagc agatacgagc gggatgagaa gtggggcttc 660 tgccctgatc ctacctctgc cgaagtgggc tgcgatacca tctgggagaa agacctgaac 720 agccacatct gctaccagtt caacctgctg tccagcctgt cttggagcga ggcccacagc 780 agctgtcaaa tgcaaggcgg cacactgctg agcatcaccg acgagacaga ggaaaacttc 840 atccgcgagc acatgagcag caagaccgtg gaagtgtgga tgggactgaa ccagctggat 900 gagcatgccg gatggcagtg gagtgatggc acccctctga actacctgaa ctggtcccct 960 gaagtgaact tcgagccctt cgtggaagat cactgcggca ccttcagcag cttcatgccc 1020 agcgcttgga gaagcagaga ctgcgagagc accctgcctt acatctgcaa gaagtacctg 1080 aaccacatcg accacgagat cgtggaaaag gacgcctgga agtactacgc cacacactgc 1140 gagcctggct ggaaccccta caaccggaac tgctacaagc tgcagaaaga ggaaaagacc 1200 tggcacgagg ccctgagaag ctgccaggcc gataatagcg ccctgatcga catcacaagc 1260 ctggccgagg tggaatttct ggtcactctg ctgggcgacg agaacgcctc tgagacatgg 1320 atcggcctgt ccagcaacaa gatccccgtg tccttcgagt ggtccaacga cagcagcgtg 1380 atcttcacca actggcacac cctggaacct cacatcttcc ccaacagatc ccagctgtgt 1440 gtgtccgccg agcagtctga aggccactgg aaagtgaaga actgcgagga acggctgttc 1500 tacatctgta aaaaggccgg ccacgtgctg tccgatgccg agagtggatg tcaagaaggc 1560 tgggagagac acggcggctt ttgctacaag atcgacaccg tgctgcggag cttcgatcag 1620 gccagcagcg gctactattg ccctcctgct ctggtcacca tcaccaacag attcgagcag 1680 gccttcatca ccagcctgat cagcagcgtc gtgaagatga aggacagcta cttctggatc 1740 gccctgcagg accagaacga caccggcgag tacacatgga agcccgtggg acagaaaccc 1800 gagcctgtgc agtacaccca ctggaacaca caccagccta gatactccgg cggctgcgtg 1860 gcaatgagag gcagacatcc tctcggcaga tgggaagtga agcactgtcg gcacttcaag 1920 gccatgtctc tgtgcaagca gcccgtggaa aatcaagaga aggccgagta cgaggaacgc 1980 tggccttttc acccttgcta cctgtccgga accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 2040 ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 2100 gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 2160 cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 2220 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 2280 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 2340 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 2400 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 2460 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 2520 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 2580 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 2640 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 2682 <210> 18 <211> 893 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLA2R-CAAR Construct 4028.CF123 <400> 18 Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Cys Ala Gly Ser Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu 35 40 45 Ser Leu Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu 50 55 60 Asn Cys Lys Gln Ala Asn Lys His 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ctgcgagagc accctgcctt acatctgcaa gaagtacctg 1080 aaccacatcg accacgagat cgtggaaaag gacgcctgga agtactacgc cacacactgc 1140 gagtccggaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 1200 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 1260 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1320 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1380 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1440 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1500 agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1560 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1620 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1680 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1740 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1800 caggccctgc cccctcgcta a 1821 <210> 40 <211> 606 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gagcagtaaa acagtggagg tgtggatggg 900 cctcaatcag ctggatgaac acgctggctg gcagtggtct gatggaacgc cgctcaacta 960 tctgaattgg agcccagagg taaattttga gccatttgtt gaagatcact gtggaacatt 1020 tagttcattt atgccaagtg cctggaggag tcgggattgt gagtccacct tgccatatat 1080 atgtaaaaaa tatctaaacc acattgatca tgaaatagtt gaaaaagatg cgtggaaata 1140 ttatgctacc cactgtgagc ctggctggaa tccctacaat cgtaattgct acaaacttca 1200 gaaagaagaa aagacctggc atgaggctct gcgttcttgt caggctgata acagtgcatt 1260 aatagacata acctcattag cagaggtgga gtttcttgta accctccttg gagatgaaaa 1320 tgcatcagaa acatggattg gtttgagcag caataaaatt ccagtttcct ttgaatggtc 1380 taatgactct tcagtcatct ttactaattg gcacacactt gagccccaca tttttccaaa 1440 tagaagccag ctgtgtgtct cagcagagca gtctgaggga cactggaaag tcaaaaattg 1500 tgaagaaaga cttttttaca tttgtaaaaa agcaggccat gtcctctctg atgctgaatc 1560 aggatgtcaa gagggatggg agagacatgg tggattctgt tacaaaattg acacagtcct 1620 tcgaagcttt gaccaagctt ccagcggtta ttactgtcct cctgcacttg taaccattac 1680 aaacaggttt gaacaggctt ttattaccag 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gacactgata gtcattgtgg ccatttgcac 4260 actttccttc tgcatataca agcataacgg tggcttcttc aggagacttg cagggtttcg 4320 gaatccttac tatcctgcaa ccaactttag tacagtatat ttagaagaaa atattctcat 4380 ttctgatctt gagaagagtg accaataata atgaggtcag agaatgccac agacaccagg 4440 g 4441 <210> 42 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha hinge domain <400> 42 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 43 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha hinge domain <400> 43 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 44 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha hinge domain <400> 44 Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Arg 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ctttctatca ccgacgagac tgaggaaaat 720 tttatccgcg agcacatgtc aagcaagaca gttgaggttt ggatggggct caatcaactg 780 gacgaacacg cagggtggca gtggtccgat ggcactccgc tcaactacct taactggagc 840 ccagaggtga actttgagcc gtttgtcgaa gatcactgtg gtacttttag ctccttcatg 900 ccgtccgcat ggagaagtcg cgactgcgag tcaaccctcc cttacatctg taagaaatac 960 ctcaaccaca tagatcacga aatcgtagag gtcaatacgt ccgacatgta cccaatgcca 1020 aatacgttgg aatatgggaa taggacatac aagataatta acgcaaatat gacgtggtat 1080 gccgcaatca aaacgtgcct catgcacaag gcacagctcg tgtcaattac ggaccagtac 1140 caccaatcat ttctcacagt cgttcttaat cgattgggtt atgcacactg gataggcttg 1200 ttcacgacgg acaatggttt gaactttgac tggtccgatg gaactaaaag ttctttcact 1260 ttttggaagg atgaggagtc ctccttgctc ggggactgcg tcttcgcaga ttcaaacggg 1320 cgctggcact caacggcatg tgagtccttc ctgcagggag ctatatgcca tgtgccacca 1380 gaaacacgcc agtctgagca ccctgagttg 1410 <210> 57 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CysR-FNII-CTLD1 7 <400> 57 Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu Lys Lys 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cgatgaacat gcaggatggc agtggagtga cggaacgcca 660 ctgaactacc tgaattggag cccagaggtg aatttcgagc ctttcgtaga ggaccattgc 720 ggtacttttt catcttttat gcccagcgca tggagatccc gagattgtga aagcacgctg 780 ccctatattt gtaaaaagta cctgaaccac atagatcatg agatagttga ggtaaataca 840 agtgatatgt accccatgcc gaacacactc gagtacggaa atagaaccta caagataatc 900 aacgctaaca tgacctggta cgcggccatt aagacctgcc tcatgcacaa ggctcaactc 960 gtcagtatta ctgaccaata tcaccagtca tttctcaccg tcgtgttgaa tcgcctcggt 1020 tacgcccact ggatcggttt gtttacaacg gacaatggac tcaatttcga ttggtcagac 1080 ggaaccaaat ctagttttac cttctggaaa gacgaggaat caagcctgct tggggactgc 1140 gtatttgcgg actctaatgg ccgatggcat agtacagcgt gtgagagctt tttgcagggg 1200 gcgatttgtc atgttccgcc ggaaacccgc caaagcgagc atccagaatt g 1251 <210> 59 <211> 417 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CysR-CTLD1 7 <400> 59 Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu Lys Lys Cys Ile Gln 1 5 10 15 Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys Lys Gln Ala Asn Lys 20 25 30 His Met Leu Trp Lys 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aacaagcaca tgctgtggaa atgggtgtcc 120 aaccacggcc tgttcaacat cggcggctct ggatgtctgg gcctgaattt ctctgcccct 180 gagcagcctc tgagcctgta cgagtgtgat agcaccctgg tgtccctgag atggcggtgc 240 aaccggaaga tgatcacagg ccctctgcag tactctgtgc aggtcgccca cgacaatacc 300 gtggtggcca gcagaaagta catccacaag tggatcagct acggcagcgg cggaggcgac 360 atctgtgaat acctgcacaa ggatctg 387 <210> 61 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CysR <400> 61 Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu Lys Lys Cys Ile Gln 1 5 10 15 Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys Lys Gln Ala Asn Lys 20 25 30 His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly Leu Phe Asn Ile Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala Pro Glu Gln Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser Leu Arg Trp Arg Cys 65 70 75 80 Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr Ser Val Gln Val Ala 85 90 95 His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr Ile His Lys Trp Ile 100 105 110 Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu Tyr 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Arg Trp Arg Cys 65 70 75 80 Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr Ser Val Gln Val Ala 85 90 95 His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr Ile His Lys Trp Ile 100 105 110 Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu Tyr Leu His Lys Asp 115 120 125 Leu His Thr Ile Lys Gly Asn Thr His Gly Met Pro Cys Met Phe Pro 130 135 140 Phe Gln Tyr Asn His Gln Trp His His Glu Cys Thr Arg Glu Gly Arg 145 150 155 160 Glu Asp Asp Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Arg Tyr Glu Arg Asp 165 170 175 Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser Ala Glu Val Gly Cys 180 185 190 Asp Thr Ile Trp Glu Lys Asp Leu Asn Ser His Ile Cys Tyr Gln Phe 195 200 205 Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala His Ser Ser Cys Gln 210 215 220 Met Gln Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asp Glu Thr Glu Glu Asn 225 230 235 240 Phe Ile Arg Glu His Met Ser Ser Lys Thr Val Glu Val Trp Met Gly 245 250 255 Leu Asn Gln Leu Asp Glu His Ala Gly Trp Gln Trp Ser Asp Gly Thr 260 265 270 Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Ser Pro Glu Val Asn Phe Glu Pro Phe 275 280 285 Val Glu Asp His Cys Gly Thr Phe Ser Ser Phe Met Pro Ser Ala Trp 290 295 300 Arg Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Asn His Ile Asp His Glu Ile Val Glu Lys Asp Ala Trp Lys Tyr 325 330 335 Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro Tyr Asn Arg Asn Cys 340 345 350 Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Glu Lys Thr Trp His Glu Ala Leu Arg Ser 355 360 365 Cys Gln Ala Asp Asn Ser Ala Leu Ile Asp Ile Thr Ser Leu Ala Glu 370 375 380 Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu Asn Ala Ser Glu Thr 385 390 395 400 Trp Ile Gly Leu Ser Ser Asn Lys Ile Pro Val Ser Phe Glu Trp Ser 405 410 415 Asn Asp Ser Ser Val Ile Phe Thr Asn Trp His Thr Leu Glu Pro His 420 425 430 Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser Ala Glu Gln Ser Glu 435 440 445 Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Arg Leu Phe Tyr Ile Cys 450 455 460 Lys Lys Ala Gly His Val Leu Ser Asp Ala Glu Ser Gly Cys Gln Glu 465 470 475 480 Gly Trp Glu Arg His Gly Gly Phe Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu 485 490 495 Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu 500 505 510 Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile 515 520 525 Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp Ser Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln 530 535 540 Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys Pro Val Gly Gln Lys 545 550 555 560 Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His Trp Asn Thr His Gln Pro Arg Tyr 565 570 575 Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg Gly Arg His Pro Leu Gly Arg Trp 580 585 590 Glu Val Lys His Cys Arg His Phe Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln 595 600 605 Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Trp Pro Phe 610 615 620 His Pro Cys Tyr Leu 625 <210> 72 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta intracellular domain <400> 72 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (69)

  1. 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 CAAR은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 분자(costimulatory molecule)의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편이
    (a) CysR 또는 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1 및 C형 렉틴 도메인 2를 포함하는 세포외 도메인; 및
    (b) CysR 또는 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서,
    PLA2R 세포외 도메인 (a)가 서열번호: 8을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    PLA2R 세포외 도메인 (b)가 서열번호: 15를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편이
    (a) 시스테인이 풍부한 도메인을 포함하는 세포외 도메인,
    (b) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, 및 C형 렉틴 도메인 1을 포함하는 세포외 도메인,
    (c) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인,
    (d) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, C형 렉틴 도메인 3, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인,
    (e) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인, 및
    (f) 시스테인이 풍부한 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서,
    PLA2R 세포외 도메인 (a)가 서열번호: 47 또는 서열번호: 60을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (b)가 서열번호: 50 또는 서열번호: 62를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (c)가 서열번호: 52를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (d)가 서열번호: 54를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (e)가 서열번호: 56을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    PLA2R 세포외 도메인 (f)가 서열번호: 58을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 CD8 알파 쇄 막관통 도메인을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인이 서열번호: 20을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인이 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 힌지(hinge) 도메인을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 힌지 도메인이 서열번호: 10 또는 서열번호: 42 또는 서열번호: 64를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제9항에 있어서, 힌지 도메인이 서열번호: 서열번호: 43 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 GS 링커를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, GS 링커가 서열번호: 68을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제11항에 있어서, GS 링커가 서열번호: 69를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 분자의 세포내 도메인이 4-1BB를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 4-1BB 세포내 도메인이 서열번호: 22 또는 서열번호: 66을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  17. 제15항에 있어서, 4-1BB 세포내 도메인이 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, CD3 제타 신호전달 도메인이 서열번호: 24 또는 서열번호: 72를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  20. 제18항에 있어서, CD3 제타 신호전달 도메인이 서열번호: 23 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 서열번호: 11, 17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 서열번호: 12, 18, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector).
  25. 제24항에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것인 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 벡터가 RNA 벡터인 것인 벡터.
  27. 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR).
  28. 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR).
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편이
    (a) 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1 및 C형 렉틴 도메인 2를 포함하는 세포외 도메인; 및
    (b) 리신 B형 렉틴 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 CAAR.
  30. 제29항에 있어서,
    PLA2R 세포외 도메인 (a)가 서열번호: 8을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
    PLA2R 세포외 도메인 (b)가 서열번호: 15를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, PLA2R 자가항원 또는 그의 단편이
    (a) 시스테인이 풍부한 도메인을 포함하는 세포외 도메인,
    (b) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, 및 C형 렉틴 도메인 1을 포함하는 세포외 도메인,
    (c) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, 및 C형 렉틴 도메인 3을 포함하는 세포외 도메인,
    (d) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, C형 렉틴 도메인 2, C형 렉틴 도메인 3, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인,
    (e) 시스테인이 풍부한 도메인, 피브로넥틴 II형 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인, 및
    (f) 시스테인이 풍부한 도메인, C형 렉틴 도메인 1, 및 C형 렉틴 도메인 7을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 CAAR.
  32. 제31항에 있어서,
    PLA2R 세포외 도메인 (a)가 서열번호: 49 또는 서열번호: 61을 포함하거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (b)가 서열번호: 51 또는 서열번호: 63의 아미노산 서열을 포함하거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (c)가 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하거나,
    PLA2R 세포외 도메인 (d)가 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    PLA2R 세포외 도메인 (e)가 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    PLA2R 세포외 도메인 (f)가 서열번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 CD8 알파 쇄 막관통 도메인을 포함하는 것인 CAAR.
  34. 제33항에 있어서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인이 서열번호: 20을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  35. 제33항에 있어서, CD8 알파 쇄 막관통 도메인이 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 CAAR.
  37. 제36항에 있어서, 힌지 도메인이 서열번호: 10 또는 서열번호: 42 또는 서열번호: 64를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  38. 제36항에 있어서, 힌지 도메인이 서열번호: 서열번호: 43 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  39. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 GS 링커를 추가로 포함하는 것인 CAAR.
  40. 제39항에 있어서, GS 링커가 서열번호: 68을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  41. 제39항에 있어서, GS 링커가 서열번호: 69를 포함하는 것인 CAAR.
  42. 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 분자의 세포내 도메인이 4-1BB를 포함하는 것인 CAAR.
  43. 제42항에 있어서, 4-1BB 세포내 도메인이 서열번호: 22 또는 서열번호: 66을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  44. 제42항에 있어서, 4-1BB 세포내 도메인이 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  45. 제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 CAAR.
  46. 제45항에 있어서, CD3 제타 신호전달 도메인이 서열번호: 24 또는 서열번호: 72를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  47. 제45항에 있어서, CD3 제타 신호전달 도메인이 서열번호: 23 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  48. 제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 서열번호: 11, 17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 CAAR.
  49. 제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 서열번호: 12, 18, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 및 40으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAAR.
  50. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, CAAR이 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 것인 CAAR.
  51. 제27항 내지 제50항 중 어느 한 항의 CAAR을 포함하는 유전적으로 변형된 세포.
  52. 제51항에 있어서, 세포가 CAAR을 발현하고, B 세포 상의 자가항체-기반 BCR에 대해 높은 친화성을 갖는 것인 세포.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 세포가 CAAR을 발현하고, 자가항체를 발현하는 B 세포의 사멸을 유도하는 것인 세포.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CAAR을 발현하고, 건강한 세포에 대해 제한된 독성을 갖는 것인 세포.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포, 자연 킬러 세포, 시토카인 유도 킬러 세포, 그의 세포주, T 기억 줄기 세포, 만능성 줄기로부터 유래된 T 세포 및 다른 효과기(effector) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  56. (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR); 및 (b) DAP12를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포.
  57. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제50항 중 어느 한 항의 CAAR, 또는 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 세포, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  58. 대상체에게 유효량의, 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로, 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩함으로써, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법.
  59. 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에게 유효량의, 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편, 및 임의로 막관통 도메인, 공동자극 분자의 세포내 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 코딩함으로써, 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 자가항체 매개 신장 질환이 사구체 질환 및 원발성 막성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 것인 방법.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 T 세포가 B 세포를 표적화하는 것인 방법.
  63. 대상체에게 유효량의, (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) DAP12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함으로써, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가항체 매개 신장 질환을 치료하는 방법.
  64. 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에게 유효량의, (a) 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R) 자가항원 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인, 킬러 면역글로불린 유사 수용체 (KIR) 막관통 도메인 및 KIR 세포질 도메인을 포함하는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) DAP12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 투여함으로써, 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 단계를 포함하는, 자가항체 매개 신장 질환의 위험이 있거나, 또는 이러한 질환을 앓고 있는 대상체에서 사구체 손상을 예방 또는 감소시키는 방법.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드인 것인 방법.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 변형된 세포가 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 세포인 것인 방법.
  67. 제23항에 있어서, 제50항에 있어서, 제56항에 있어서, 또는 제63항 또는 제64항에 있어서, KIR이 KIRS2 또는 KIR2DS2인 것인, 폴리뉴클레오티드, CAAR, 유전적으로 변형된 세포, 또는 방법.
  68. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
  69. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 CAAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 세포.
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