CN114514247A - Car-cd123载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体(CAR)分子，从N‑末端到C‑末端包含：a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域b)抗原结合结构域，c)间隔子结构域，d)跨膜结构域，和e)胞质结构域，优选地，其中CAR是CD123特异性CAR(CD123CAR)且抗原结合结构域包含来自单克隆抗‑CD123抗体的VL和/或VH，更优选地，抗原结合结构域包含特异性结合至CD123的单链可变片段(scFv)。

Description

CAR-CD123载体及其用途
技术领域
本发明涉及产生新型嵌合抗原受体(CAR)-CD123载体，其用于治疗CD123+肿瘤，例如急性髓系白血病(AML)[1]、B-淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)[2]、骨髓增生异常综合征[3]和毛细胞白血病[4]。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是一种异质性克隆性疾病，其特征在于异常未成熟原始细胞(blast)的积累。尽管对白血病生物学的理解有所进展，但标准的前期化疗AML治疗仍然没有改变。目前的诱导治疗-也称为缓解诱导治疗-旨在清除血液和骨髓的未成熟原始细胞并实现完全缓解。这种治疗通常给予1周以上，几乎70％的年轻成年患者可以产生初步完全缓解。然而，43％的患者最终会复发，18％的患者在一线诱导治疗中从未达到完全缓解[5]。使用遗传修饰以表达CAR的T细胞的免疫疗法代表了AML的创新方法。
在过去的几年中，人们将极大的兴趣集中于鉴定由AML细胞和白血病干细胞(LSC)优先表达的表面分子，以选择性地靶向肿瘤群体，同时避免影响造血干/祖细胞(HSPC)的正常对应物[6]。
CD123是一种360个氨基酸的糖蛋白，也称为白细胞介素-3受体(IL-3Rα)的跨膜α亚基。CD123与CD131共同形成高亲和力IL-3R。在与IL-3结合后，IL-3R促进细胞增殖和存活[7]。
CD123的基础表达在HSPC、单核细胞、树突状细胞(DC)的亚群(称为浆细胞样DC-pDC[8]和内皮细胞[7][9])中低至可忽略不计。与HSPC上的低表达相反，AML原始细胞广泛过度表达CD123[10][11]。此外，AML细胞上的CD123过表达与凋亡抗性、更高的增殖潜力和不良预后有关[11][12][13]。
值得注意的是，CD123不仅被AML原始细胞选择性过表达，也被静息的AML LSC群选择性过表达，其已被证明是化疗耐药性的主要参与者之一[14]。CD123在正常HSC和LSC上的差异表达使CD123成为AML治疗的有吸引力的靶点。
此外，CD123可用于在MDS高危患者中标示MDS干细胞，以及CDl23阳性群体在生物学上不同于正常的造血干细胞[3]。
已经发展了几种靶向CD123的基于抗体的疗法[15][16][14]。迄今为止，CD123靶向疗法已被证明是安全的，没有报道对造血产生重大不良影响。其抗人白血病活性仍在研究中。
替代性的AML治疗方法利用表达CAR的T细胞，其以不依赖MHC的方式将T细胞特异性重定向到CD123[16]。CAR T细胞具有在人体中增殖并持续存在多年的潜能，从而建立长期的肿瘤免疫。第一代CAR由来自单克隆抗体(例如抗-CD123)的单链可变片段(scFv)融合至典型结构scFv-间隔子-CD3z中的CD3ζ信号转导结构域组成。除了刚刚描述的结构外，第二代CAR还具有一个共刺激内结构域(例如CD28或41BB)，其帮助a)完成T激活和b)通过促进IL2分泌来避免细胞凋亡。
使用具有抗-CD123-CD28ζCAR和抗-CD123-41BBζCAR T细胞的第二代CAR-T细胞的临床前研究已在体外和体内证明了有效的白血病杀伤能力，但在其对健康CD123+细胞的骨髓清除作用方面产生了不一致的结果[17][18]。针对CD123-导向的CAR T细胞疗法的多项I期试验(ClinicalTrials.gov编号NCT03796390、NCT02937103、NCT03114670、NCT03672851)目前正在进行中，以验证效果和安全性。
显然，抗-CD123 CAR T技术在治疗AML和其他CD123+肿瘤方面具有巨大潜力。虽然将至少一个共刺激结构域纳入CAR结构的好处已得到充分证实，但scFv和胞外间隔子结构域、T细胞亚群的选择和制造过程仍然是一个重点研究领域。
仍然需要鉴定用于治疗CD123+肿瘤的CAR T载体。
此外，对移植有正常人类造血细胞的小鼠进行CD123重定向T细胞治疗导致严重的骨髓清除，这引起了对可能接受此类疗法治疗的AML患者产生血液学毒性的担忧。
因此，仍然需要一种不会对患者产生毒性作用的有效CAR疗法。
发明详述
发明人设想在CAR.CD123方法中纳入一种新的自杀基因，可以在不损害白血病控制的情况下最小化这种旁观者毒性(bystander toxicity)，从而增加抗白血病CAR T细胞或CAR先天细胞免疫疗法的治疗窗口。综上所述，本发明提供了一种新型的第二代CAR-CD123。
更具体地说，发明人构建了CAR-CD123结构(图1)：ΔCD19-2A-CAR-CD123-ΔCD34.CD8.41BB.CD3ζ(表1：OPBG-242载体)逆转录病毒载体。
发明人已经设计了双顺反子载体(bicistronic vector)，允许同时表达两种转基因，即ΔCD19和CARCD123(ΔCD19-2A-CAR-CD123-ΔCD34.CD8.41BB.CD3ζ)。克隆性逆转录病毒生产者细胞系产生特征为高滴度的逆转录病毒上清液(使用PCR分析上清液中的载体存在)。
ΔCD19代表连接至跨膜部分的人CD19胞外结构域。它具有三重功能以帮助：
1)通过临床级微珠选择遗传修饰的细胞；
2)遗传修饰细胞的表型表征；
3)作为可诱导自杀基因，其可被FDA/EMA批准的抗-CD19 bite抗体(如博纳吐单抗)靶向。
CAR分子是基于人抗原CD123特异性单克隆抗体7G3融合VK-VL区的单链，与CD8跨膜结构域及其内结构域、4.1BB共刺激结构域和CD3ζ胞质结构域同在框内，用于抗原接合后的激活剂信号的转导。通过使用2A序列，CAR构建体被克隆到在逆转录病毒载体中包含ΔCD19序列的基因盒之后。
因此，ΔCD19-2A-CAR-CD123-ΔCD34.CD8.41BB.CD3ζ的功能性和结构性组分(在ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ之后)表达和活性总结于表1，并列于以下：
·5’LTR-载体5’末端处的逆转录病毒长末端重复序列(作为启动子序列发挥作用)
·ψ-逆转录病毒衣壳化信号(psi；将RNA包装为病毒粒子颗粒所必需的)
·SA-剪接受体位点
·ΔCD19由优化的CD19标志物的人(胞外和跨膜)结构域组成
·2A-编码来自明脉扁刺蛾病毒的合成性20氨基酸肽，其作为ΔCD19蛋白和CAR蛋白之间的可裂解接头发挥作用
·信号肽-短氨基酸序列，以允许将分泌蛋白从内质网正确转运至细胞膜。
·ΔCD34由衍生自人CD34的短肽组成，有助于在转导后检测CAR+细胞
CAR-CAR分子基于按其位置顺序指示的以下元件：单克隆抗体7G3的融合VL(k)-VH区的单链，对人抗原CD123具有特异性，与ΔCD34结构域、CD8结构域(间隔子、TM、CD8Cyt)、4.1BB共刺激结构域和CD3ζ胞质结构域同在框内。
3’LTR-载体3’末端处的逆转录病毒长末端重复序列(作为终止子/多聚腺苷酸化序列发挥作用)
表1.OPBG-242质粒的功能性元件
Figure BDA0003485540890000041
Figure BDA0003485540890000051
载体ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ的相同性：
通过组合用于载体构建体各个组分的DNA序列文件来组装参考电子载体序列。由于逆转录病毒基因组是基于RNA的，因此对用于转染(逆转录病毒产物制备的初始步骤)进293VEC细胞系的质粒DNA进行序列分析。发明人对整体OPBG-242载体进行了双向测序。使用SnapGene软件组装测序运行。与理论参考电子序列相比，没有鉴定到错配的碱基。
根据本发明，现提供第二代新型CD123-特异性嵌合抗原受体(ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ)。特别地，提供以下临床级第二代CAR CD123SFG逆转录病毒载体：
ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ
(ΔCD19-2A-CAR-CD123-ΔCD34.CD8.41BB.CD3ζ)构成：
·ΔCD19由优化的CD19标志物的人(胞外和跨膜)结构域组成；
·2A肽-编码来自明脉扁刺蛾病毒的合成性20氨基酸肽，其作为ΔCD19蛋白质和CAR蛋白质之间的可裂解接头发挥作用；
·来自7G3杂交瘤的单链可变片段(scFv)，
·只有16个氨基酸(aa)的可追踪标志物CD34衍生表位(ΔCD34)(作为可追踪标志物)，用于通过FACS(荧光激活细胞分选)系统快速鉴定和/或通过基因修饰细胞的细胞分选机系统(Cell Sorter System)选择。
·间隔子由CD8区代表，以避免免疫原性IgG4 Fc区域。
·来自CD8的跨膜结构域的跨膜结构域，以改进分子稳定性
·CD8胞质部分的小部分，以促进信号从单链到4.1BB-CD3ζ链(4.1BB-ζ)
共刺激结构域被添加至ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ载体：4-1BB融合至CD3-ζ链。
在ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ中，可追踪标志物的天然核苷酸序列、共刺激结构域和CD3-ζ链被修饰以获得密码子优化以改进高效的蛋白质表达。
表2：CD123 CAR之间的比较。该表显示了在已知CD123 CAR和本发明的一个目的(逆转录病毒OPBG)之间的差异。
Figure BDA0003485540890000061
在本文中本发明人报道了关于逆转录病毒功能抗-CD123 CAR以转导不同亚群的有力证据：T细胞(图2)、NK细胞(图4)和γδ T细胞(图6)。
他们清楚地表明基因修饰的CAR.CD123 T-细胞(图8)、CAR.CD123 NK细胞(图9)、CAR.CD123 γδ T细胞(图11)在体外模型和体内模型中(详细描述于图14)对白血病细胞系(THP-1)的有力杀伤活性。
此外，在本文中本发明人证明，具有抗-hCD19-CD3+bite抗体的ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ(CD123.CAR)T-细胞(图15)或CAR.CD123 NK细胞(图16)治疗后，ΔCD19作为诱导型自杀基因发挥作用。需要注意的是，CD123.CAR T(图15C-D)和CD123.CAR NK细胞(图16B和16E)对阴性对照不敏感，即bite抗-CD19B-Gal+抗体。
因此，CD123 CAR NK细胞中自杀基因ΔCD19的特异性是通过在体外模型中只有存在CD3(T细胞)的情况下抗-hCD19-CD3+bite才是有活性的这一事实证明的(图16C和16F)。
在本发明CAR中引入两个共表达标志物(ΔCD34和ΔCD19)(图1)允许本发明人通过考虑双通道(即基于使用单克隆抗体比CD34和/或CD19的细胞荧光广度分析(cytofluorimetric analysis))研究遗传修饰细胞。这与自杀基因方法特别相关。实际上，如果在抗-hCD19-CD3+bite暴露后，抗-CD19抗体被用于检测CAR.CD123细胞，可能会遇到与bite接合CAR.CD123修饰细胞上的CD19相关的掩蔽效应。然而，以ΔCD34为代表的双标志物的纳入对于分析在用抗-hCD19-CD3+bite治疗之后的残留遗传修饰细胞表现了很大的优势。
在接受ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT细胞的NSG小鼠中，也有体内证实自杀基因活性的数据(图17)。如图17A所示，在存在IL2给药(1000U/小鼠，每周两次)的情况下，小鼠接受大量ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT细胞(10x106/topo三次连续输注)，以模拟遗传修饰细胞高度扩增的最坏的情况。30天后，当小鼠开始显示忍受痛苦的临床症状时，发明人进行放血以评估ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT细胞的扩增水平(图17B)。然后，连续五天用bite抗-hCD19-CD3治疗小鼠(1ug/天)。在第40天，发明人进行了放血以评估治疗后残留的ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT细胞的水平。如图17C所示，bite抗-hCD19-CD3治疗后，ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT残余的量可以忽略不计。
因此，本发明的一个目的是CD123嵌合抗原受体分子，从N-末端到C-末端，其包含或由以下组成：
a)ΔCD19胞外和跨膜结构域，例如：
Figure BDA0003485540890000081
Figure BDA0003485540890000082
(智人(Homosapiens)CD19分子(CD19)，转录变体1、mRNA公开于NCBI，具有以下登录号：核苷酸NM_001178098.2和蛋白质编号：NP_001171569.1)；
b)2A肽-衍生自明脉扁刺蛾病毒的合成性20氨基酸肽，例如RGRGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：2)；
c)信号肽，例如MEFGLSWLFLVAILKGVQCSR(SEQ ID NO：3)(IgG H链的智人(Homosapiens)mRNA公开于NCBI，具有以下登录号，核苷酸编号：AB776838.1和蛋白质编号：BAN63131.1)，其在框内与：
d)抗CD123单链抗体结构域，来自7G3杂交瘤，包含或由7G3 VL(K)序列组成：
Figure BDA0003485540890000083
Figure BDA0003485540890000084
并通过第二接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：27))连接至7G3 VH序列：
Figure BDA0003485540890000085
Figure BDA0003485540890000086
所述7G3VL(K)和VH序列通过第三接头SAGS(SEQ ID NO：28))被连接至：
e)可追踪标志物，由ΔCD34：ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO：6)组成(用于CD34抗原的智人(Homo sapiens)CD34基因公开于NCBI，具有以下登录号：核苷酸编号：AB238231.1和蛋白质编号：BAE46748.1)；
f)间隔子，由CD8α的胞外部分(铰链)：
PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：7)组成(智人(Homosapiens)T-细胞表面糖蛋白CD8α链公开于NCBI，具有如下登录号：核苷酸编号：NM_001145873.1，以及于NM_001768.6，和蛋白质编号：NP_001139345，以及于NP_001759.3)
g)由CD8TM组成的跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：8)(智人(Homo sapiens)CD8a分子(CD8A)转录变体1，mRNA公开于NCBI，具有以下登录号：核苷酸NM_001145873.1，以及于NM_001768.6，和蛋白质编号：NP_001139345，以及于NP_001759.3)
h)由CD8a cyt组成的胞质结构域：LYCNHRNRRRVCKCPR(SEQ ID NO：9)(智人(Homosapiens)CD8a分子(CD8A)转录变体1，mRNA公开于NCBI，具有以下登录号：核苷酸编号NM_001768.6和蛋白质编号：NP_001759.3)，通过短接头VD连接至：
i)共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：10)(人受体蛋白4-1BB mRNA：核苷酸编号：U03397.1和蛋白质编号：AAA53133.1)；
j)以及CD3-ζ链：
Figure BDA0003485540890000091
Figure BDA0003485540890000092
(人T细胞受体ζ-链mRNA，完全cds公开于NCBI，具有以下登录号：核苷酸编号：J04132.1和蛋白质编号：AAA60394.1)
根据本发明的优选实施方式ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ嵌合抗原受体分子为：
Figure BDA0003485540890000093
Figure BDA0003485540890000101
即，该序列，同此也称为ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ。
本发明还提供了编码上述CD123嵌合抗原受体的核苷酸序列。
根据本发明的实施方式，核苷酸序列为：
Figure BDA0003485540890000102
Figure BDA0003485540890000111
Figure BDA0003485540890000121
即，该核苷酸序列，其编码也称为ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ的序列，包含以下序列：
ΔCD19
Figure BDA0003485540890000122
Figure BDA0003485540890000131
2A肽
Figure BDA0003485540890000132
信号肽
Figure BDA0003485540890000133
VL(7G3)
Figure BDA0003485540890000134
弯曲(Flex)
Figure BDA0003485540890000135
VH(7G3)
Figure BDA0003485540890000136
Figure BDA0003485540890000141
连接(Link)(BamH1限制性位点和连接(connection)序列)
Figure BDA0003485540890000142
ΔCD34
Figure BDA0003485540890000143
间隔子(通过使用抗-CD34 Ab改善识别)
Figure BDA0003485540890000144
间隔子(CD8a)胞外
Figure BDA0003485540890000145
CD8a(TM)跨膜
Figure BDA0003485540890000146
CD8a胞质的(CD8a cyt)
Figure BDA0003485540890000147
连接(connection)的连接(link)
Figure BDA0003485540890000148
4-1BB序列(共刺激信号转导结构域)
Figure BDA0003485540890000149
CD3ζ链
Figure BDA0003485540890000151
Figure BDA0003485540890000152
(核苷酸编号：J04132.1)
因此，本发明的一个目的是嵌合抗原受体(CAR)分子，从N-末端到C-末端包含：
a)人CD19(ΔCD19)的胞外结构域和跨膜结构域，
b)抗原结合结构域，
c)间隔子结构域，
d)跨膜结构域，
e)胞质结构域，
本发明还包括包含上述元件a)-e)中的至少一个的CAR分子。本发明还包括其中所述元件以任意顺序存在的CAR分子。
优选地，CAR分子是CD123特异性CAR(CD123 CAR)分子，且抗原结合结构域包含来自单克隆的抗-CD123抗体的VL(或VK)和/或VH，更优选地，抗原结合结构域包含特异性结合至CD123的单链可变片段(scFv)。
优选地，抗原结合结构域包含或由以下序列组成：与7G3 VK序列：
Figure BDA0003485540890000153
Figure BDA0003485540890000154
具有至少80％相同性的序列，和/或与7G3VH序列：
Figure BDA0003485540890000155
Figure BDA0003485540890000156
具有至少80％相同性的序列，所述VL和/或VK和/或VH任选地被人源化，其中所述VL(或VK)和VH优选地被第一接头分隔开，更优选地所述scFv包含或由以下序列组成：包含或由SEQ ID NO：4组成的VK和包含或由SEQID NO：5组成的VH，更优选地scFv包含或由SEQ ID NO：30组成。
优选地，上述抗原结合结构域可以包含以上公开的序列的抗原结合片段，例如，VH和VL序列中所包含的CDR中的至少一个。
所述第一接头优选包含或由序列GGGSGGGG(SEQ ID NO：27)组成。
优选地，本发明的CAR分子进一步包括可追踪标志物。
所述可追踪标志物优选被包含在抗原结合结构域和间隔子结构域之间，优选所述所述抗原结合结构域和所述可追踪标志物被第二接头分隔。
优选地，所述可追踪标志物包含或由以下序列组成：CD34衍生表位(ΔCD34)，或衍生自鼠Ig CH2CH3区域间隔子(UNIPROTKB：P01861)的肽，其为：
Figure BDA0003485540890000161
Figure BDA0003485540890000162
或衍生自神经生长因子受体(NGFR)的肽，其为：
Figure BDA0003485540890000163
优选地，所述可追踪标志物包含或由与SEQ ID NO：6
(ELPTQGTFSNVSTNVS)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含或由SEQ ID NO：6组成。
优选地，人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：1
Figure BDA0003485540890000164
Figure BDA0003485540890000171
Figure BDA0003485540890000172
具有至少80％相同性的序列或其功能性片段、衍生物和变体组成。
优选地，人CD19的胞外结构域和跨膜结构域包含或由SEQ ID NO：1组成。
优选地，间隔子结构域包含或由CD8α链或CD28的胞外区域或铰链CH2-CH3或铰链CH3组成，优选其包含或由以下序列组成：与SEQ ID NO：7具有至少80％相同性的序列，或由与SEQ ID NO：7的氨基酸12-42(对应于SEQ ID NO：31(IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD))具有至少80％相同性的序列，和/或由与SEQ IDNO：7的氨基酸1-11(对应于SEQ ID NO：32(PAPRPPTPAPT))具有至少80％相同性的序列，或由与SEQ ID NO：7，或与IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：35)或与
Figure BDA0003485540890000173
Figure BDA0003485540890000174
或与
Figure BDA0003485540890000175
Figure BDA0003485540890000176
具有至少80％相同性的序列。更优选地，间隔子结构域包含或由SEQ ID NO：7组成。
优选地，跨膜结构域包含或由选自下组的蛋白质的跨膜结构域组成：CD8、T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD15，优选其包含CD8或CD28的跨膜结构域，更优选跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：8(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT)或与FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ IDNO：37)具有至少80％相同性的序列组成。更优选该跨膜结构域包含或由SEQ ID NO：8组成。
优选地，胞质结构域包含或由以下组成：
a)CD8a胞质部分的区域和
b)4-1BB共刺激结构域(共刺激信号转导结构域CD137)或其CD28胞质序列或OX40序列和
c)CD3-ζ链。
优选地，所述胞质结构域包含CD8a胞质部分的区域和/或4-1BB共刺激结构域和/或CD3-ζ链。更优选地，胞质结构域包含CD8a胞质部分的区域和4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ链。
优选地，所述胞质结构域包含CD8a胞质的和4-1BB共刺激结构域之间的接头。
优选地，CD8a胞质部分包含或由与SEQ ID NO：9
(LYCNHRNRRRVCKCPR)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQID NO：9。
优选地，共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)包含或由与SEQ ID NO：10(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：10。
优选地，CD28胞质的序列包含或由与
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：38)具有至少80％相同性的序列组成。
优选地，OX40序列包含或由与
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：39)具有至少80％相同性的序列组成。
优选地，CD3-ζ链包含或由与SEQ ID NO：11
Figure BDA0003485540890000181
Figure BDA0003485540890000182
具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：11。
优选地，编码CD8a胞质的和共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)之间接头的序列由6个核苷酸组成。更优选地，其包含或由两个氨基酸的接头组成，优选VD。
在本发明中所包括的CAR分子进一步包含
-可裂解接头，优选2A肽或IRES，和/或
-信号肽和/或
-第二接头，和/或
-可追踪标志物，
以任何顺序。
优选地，如前述权利要求中任一项所述的CAR分子进一步包含位于人CD19的所述胞外结构域和跨膜结构域以及抗原结合结构域之间的：
-可裂解接头，优选2A肽或IRES，和/或
-信号肽。
优选地所述可裂解接头为2A肽，包含或由与SEQ ID NO：2(RGRGRGSLLTCGDVEENPGP)具有至少80％相同性的序列组成，更优选地，其包含或由SEQ ID NO：2组成；或包含DxExNPGP(SEQ ID NO：40)的核心序列基序的2A自裂解肽，优选地，包含或由与AEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQID NO：41)；ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：42)；
QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：43)或与VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ IDNO：44)具有至少80％相同性的序列组成的肽。
优选地，所述信号肽包含或由与SEQ ID NO：3
(MEFGLSWLFLVAILKGVQCSR)具有至少80％相同性的序列组成，更优选地其包含或由SEQ ID NO：3组成；或其包含或由与MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：45)具有至少80％相同性的序列组成。
优选地，在抗原结合结构域和间隔子结构域之间有：
-第二接头和/或
-可追踪标志物。
优选地，所述CAR分子从N-末端至C-末端存在上述可裂解接头、信号肽和第一接头，以及第二接头和可追踪标志物。
优选地，抗原结合结构域和可追踪标志物之间的第二接头包含或由SAGS(SEQ IDNO：28)组成。
优选地，编码以下中的至少一种的序列经密码子优化：人CD19的胞外结构域和跨膜结构域、可追踪标志物、间隔子结构域、跨膜结构域和共刺激结构域。
优选地，根据本发明的CAR分子从N-末端至C-末端包含或由以下组成：
a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，
b)可裂解接头，
c)信号肽，
d)抗原结合结构域，
e)可追踪标志物，
f)间隔子结构域，
g)跨膜结构域，
h)胞质结构域。
在优选实施方式中，如上定义的CAR分子从N-末端至C-末端包含或由以下组成：
a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，如上定义，
b)可裂解接头，如上定义
c)信号肽，如上定义
d)抗原结合结构域，如上定义
e)可追踪标志物，如上定义
f)间隔子结构域，如上定义
g)跨膜结构域，如上定义
h)胞质结构域，如上定义
优选地，CAR分子包含或由与SEQ ID NO：12
Figure BDA0003485540890000201
Figure BDA0003485540890000211
Figure BDA0003485540890000212
具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选其包含或由SEQ IDNO：12组成。
本发明的另一个目的是根据前述权利要求中任一项所述的编码嵌合抗原受体分子的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子优选操作性地连接至表达控制序列。优选地所述分子包含与一个以下序列具有至少80％相同性的至少一个序列：SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26，
甚至更优选地所述分子包含或由与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的序列组成，更优选地所述分子包含或由SEQ ID NO：29组成。
本发明的另一目的为一种载体，其包括如上定义的分离的核酸分子，优选表达载体，更优选载体包含控制所述CAR的表达的外源性启动子，优选所述载体为DNA、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
本发明的另一目的为一种经工程改造的的免疫细胞，优选T细胞，更优选α/β或γ/δT细胞、或NK细胞、或NK-T细胞或其组合，甚至更优选人来源的，包含所述如上定义的载体，或如上定义的分离的核酸分子，或表达(优选在细胞表面)至少一个如上定义的CAR分子。本发明的另一个目的为一种药物组合物，其包含如上定义的分离的核酸分子或如上定义的载体或如上定义的细胞与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
本发明的另一个目的为如上定义的CAR分子，如上定义的分离的核酸分子，如上定义的载体，如上定义的细胞或如上定义的用于医药用途的药物组合物，优选用于CD123+癌症的治疗，更优选用于急性髓系白血病或B-淋巴白血病、母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)、骨髓增生异常综合征或毛细胞白血病，或用于造血干细胞移植之前、之后或期间的治疗。
本发明的另一个目的是人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，优选如上定义的，用于医药用途，优选用作所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域遗传修饰的细胞中的死亡诱导剂，优选在所述细胞暴露于结合转导细胞上人CD19的胞外和跨膜结构域的至少一种试剂之后。
优选所述结合人CD19的胞外和跨膜结构域的试剂是抗体、小分子、多肽、核酸或其组合，更优选为单克隆抗体。更优选所述结合人CD19的胞外和跨膜结构域的试剂是抗-CD19抗体，包括(双特异性T-细胞接合剂)bite抗体，例如博纳吐单抗。
优选地，所述抗体的活性不依赖于ADCC的作用机制。在本发明的上下文中，遗传修饰细胞的清除优选通过不基于ADCC的机制进行。
优选抗体为接合ΔCD19和CD3以激活ΔCD19+细胞中的细胞毒性的双特异性抗体。
优选遗传修饰细胞是转导细胞，例如免疫细胞或干细胞，其包含编码人CD19胞外结构域和跨膜结构域的核酸，和编码一个或多个治疗性基因产物的核酸。
优选治疗性基因产物为经工程改造的受体，更优选为T细胞受体、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子受体、归巢受体或趋化因子受体，优选所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
优选地，编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码治疗性基因产物的核酸是相同的核酸分子，优选所述核酸分子为载体，更优选其为病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
优选编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸位于核酸分子的N-末端，优选其位于CAR分子的N-末端。
优选CAR是根据本发明的CAR。
本发明的另一目的为一种包含转导细胞的组合物，例如免疫细胞或干细胞，其包含编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码一种或多种治疗性基因产物的核酸，优选所述治疗性基因产物是经工程改造的受体，更优选其为T细胞受体、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子受体、归巢受体或趋化因子受体，优选地所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
优选地，编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码治疗性基因产物的核酸是相同的核酸分子，优选所述核酸分子为载体，更优选其为病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
本发明的另一目的为一种诱导表达人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的转导细胞死亡的方法，其包括提供有效量的至少一种结合所述转导细胞上人CD19的所述胞外结构域和跨膜结构域的试剂，所述试剂优选为抗体、小分子、多肽、核酸或其组合，更优选单克隆抗体，更优选抗-CD19抗体，其包括bite抗体，例如博纳吐单抗。
优选地，细胞进一步表达经工程改造的受体，优选T细胞受体或CAR，更优选所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
优选CAR是根据本发明的CAR。
本发明的另一目的为一种载体，其包含编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的序列和编码经工程改造的受体的序列。
优选地，编码人CD19的所述胞外结构域和跨膜结构域的所述载体的序列和编码所述经工程改造的受体的载体的序列在所述载体上被可裂解接头(优选如上定义的)分隔开。优选地，编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的载体的序列是编码经工程改造的受体的载体序列的上游。
优选所述经工程改造的受体为CAR，更优选根据本发明的CAR。
在本发明的上下文中，人CD19的胞外结构域和跨膜结构域包含或由具有与SEQ IDNO：1
Figure BDA0003485540890000241
Figure BDA0003485540890000242
至少80％相同性的序列或其功能性片段、衍生物及其变体组成，更优选人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由SEQ ID NO：1组成。
优选地，本发明的方法在患有医学病症的个体体内发生，并且该个体已经被提供了针对医学病症的包含多个转导细胞的治疗，优选地，所述医学病症为癌症。优选地，一旦来自治疗的一种或多种不良事件发生，所述试剂即被提供给个体。
本发明的另一目的是一种减少个体的细胞治疗毒性风险的方法，其包括修饰细胞治疗的细胞，以表达人CD19的胞外和跨膜结构域的步骤。
优选所述治疗是针对癌症的。
优选所述细胞治疗包含靶向抗原的经工程改造的受体。
本发明的另一个目的是人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，尤其是如上定义的，用于医药用途，优选用作所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域遗传修饰的细胞中的死亡诱导剂，优选在所述细胞暴露于抗-CD19抗体(包括bite抗体，例如博纳吐单抗)之后。
在本发明的上下文中，优选抗体的活性不依赖于ADCC作用机制和/或遗传修饰细胞的清除优选是通过不基于ADCC的机制进行的。
优选抗体为接合ΔCD19和CD3以激活ΔCD19+细胞中的细胞毒性的双特异性抗体。
由所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域遗传修饰的细胞可以是包含和/或和/或转化和/或转导和/或表达本发明的CAR分子的细胞，例如，CAR-T细胞或CAR-NK细胞或如上定义的细胞，
接头的选择取决于克隆策略(限制性酶的插入)。
优选地，上述核酸被整合到细胞的基因组中。
CAR-细胞可以是同种异体细胞或自体细胞和/或与对象匹配的HLA。
在本发明的上下文中，癌症或肿瘤优选表达CD123。
优选所述多核苷酸是在内源性启动子的控制下。
优选人CD19的胞外和跨膜结构域是通过包含或由与SEQ ID NO：13具有至少80％相同性的序列组成的序列编码的，优选地通过包含或由SEQ ID NO：13组成的序列。
本发明的另一个目的为病毒颗粒，其包含如上定义的分离的核酸分子或如上定义的载体。
抗原结合结构域优选为嵌合抗原结合结构域。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)可包含经工程改造为特异性结合至CD123蛋白质或其片段的抗体或抗体片段。一方面，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化CD123抗体或其抗体片段。优选地，CAR的抗原结合结构域包含含有scFv(优选人CD123 scFv)的人CD123抗体片段。
优选地，CAR的抗原结合结构域包含来自7G3杂交瘤的抗CD123单链抗体结构域，优选包含或由7G3 VL(或VK)序列和7G3 VH序列组成，优选通过接头连接。
一方面，CAR123结合结构域包含scFv部分，提供于SEQ ID NO：30
Figure BDA0003485540890000251
在本发明的上下文中，人CD19的元件”胞外结构域和跨膜结构域”可以是如上定义的，或其可以是来自智人(Homo sapiens)CD19分子(CD19)的其他转录变体(例如，那些来自NCBI中公开的变体，具有以下登录号NM_001770和NP_001761.3(同种型2)、XM_017023893.1和XP_016879382.1(同种型X2)、XM_011545981.2和XP_011544283.1(同种型X3))的ΔCD19胞外和跨膜结构域。
在本发明的上下文中，可裂解接头，可以是如上定义的2A肽或其可以是2A自裂解肽，具有DxExNPGP(SEQ ID NO：40)的核心序列基序，优选选自下组的肽：T2A(衍生自明脉扁刺蛾病毒2)：AEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：41)(核苷酸编号：AF062037.1和蛋白质编号：YP_009665206.1)；P2A(衍生自猪捷申病毒-1 2A)：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：42)(核苷酸编号：AB038528.1和蛋白质编号：BAB32828.1)；E2A(衍生自马鼻炎A病毒)：QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：43)(核苷酸编号：NC_039209.1和蛋白质编号：YP_009513027.1)和F2A(衍生自口蹄疫病毒)：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：44)(核苷酸编号：AY593825.1和蛋白质编号：AAT01768.1)。优选地，其使用了修饰的多核苷酸T2ARGRGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：2)(核苷酸编号：AF062037.1和蛋白质编号：YP_009665206.1)。
其他用于CAR构建体的标准信号肽可用于代替上述信号肽，包括衍生自特征为高表达的蛋白质的不同信号肽，例如CD8a信号肽
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：45)(核苷酸编号：NM_001768；和蛋白质编号：NP_001759.3)。
其他可追踪标志物可用于代替以上公开的可追踪标志物，例如衍生自鼠IgCH2CH3区域间隔子(UNIPROTKB：P01861)：
Figure BDA0003485540890000261
Figure BDA0003485540890000262
的肽或衍生自
NGFR：
Figure BDA0003485540890000263
Figure BDA0003485540890000271
Figure BDA0003485540890000272
(核苷酸编号：AK313654.1和蛋白质编号：BAG36408.1)的肽。
其他间隔子结构域(或序列)可以用于代替以上公开的间隔子序列，例如选自下组的间隔子结构域：来自膜结合蛋白的茎序列(stalk sequence)，包括以下例子：CD28茎：CD28：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：35)(核苷酸编号：AJ517504.1和蛋白质编号：CAD57003.1)；铰链CH2-CH3
(UNIPROTKB：P01861)：
Figure BDA0003485540890000273
Figure BDA0003485540890000274
铰链CH3
(UNIPROTKB：P01861)：
Figure BDA0003485540890000275
Figure BDA0003485540890000276
优选CD8茎：
Figure BDA0003485540890000277
(核苷酸编号：M12828.1和蛋白质编号：AAB04637.1)。
其他跨膜结构域可用于代替以上公开的那些，例如CD28TM：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：37)(核苷酸编号：J02988.1和蛋白质编号：AAA60581.1)。
以上共刺激信号转导结构域可以是包含或由CD28胞质序列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：38)(核苷酸编号：AF222341.1和蛋白质编号：AAF33792.1)或CD137(4-1BB)序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQID NO：10)(核苷酸编号：U03397.1和蛋白质编号：AAA53133.1)或OX40序列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：39)(核苷酸编号：NM_003327.3和蛋白质编号：NP_003318.1)组成的肽。
本文公开的CAR的结构域是相连的且在同一阅读框内，以形成单融合蛋白。
在本发明的上下文中，免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、NKT细胞、iNKT细胞、B细胞、调节T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或间充质基质细胞。
本发明的细胞(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)可以被工程改造以表达CAR，其中表达CAR的细胞(例如，″CAR-T″或表达CAR的NK细胞)表现出抗肿瘤特性。一方面，用CAR转化细胞，且至少部分CAR被表达在细胞表面。在一些实施方式中，细胞(例如免疫细胞，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，经工程改造的免疫细胞，例如T细胞，更优选α/β或γ/δT细胞，或NK细胞或NK-T细胞或其组合)用编码CAR的病毒载体转导。在一些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这种实施方式中，细胞可以稳定表达CAR。在另一个实施方式中，用编码CAR的核酸，例如mRNA、cDNA、DNA转染细胞(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一些这种实施方式中，细胞可以瞬时表达CAR。优选地，CAR的CD123结合结构域，例如CAR的人或人源化CD123结合结构域是scFv抗体片段。一方面，这种抗体片段的功能在于它们保留了等效的结合亲和力，例如，它们以与具有相同重链和轻链可变区的IgG抗体相当的功效结合相同的抗原。一方面，这种抗体片段在提供生物学反应中发挥功能，包括但不限于免疫反应的激活、源自其靶抗原的信号转导抑制、激酶活性的抑制等，如本领域技术人员所理解的。本发明的抗体可以被纳入嵌合抗原受体(CAR)。一方面，本发明的CAR的部分，CD123结合结构域(例如人源化或人CD123结合结构域)由转基因编码，其序列已经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指发现编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中存在偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如至少在美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
“CD123”是指已知可在白血病前体细胞上检测到的抗原决定簇。人和鼠的氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD123的氨基酸序列可以在登录号NP_002174.1中找到，人CD123的编码核苷酸序列可以在登录号NM_002183.4中找到。一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD 123蛋白的胞外结构域内的抗原。一方面，CD123蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或替代的“CAR”是指至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域(本文也称为“胞内信号转导结构域”)的重组多肽构建体，其包含衍生自本文定义的刺激分子的功能性信号转导结构域。一方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。一方面，胞内信号转导结构域还包含衍生自至少一种如下定义的共刺激分子的一个或多个功能性信号转导结构域。一方面，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。一方面，CAR包含含有抗原识别结构域、跨膜结构域和胞质信号转导结构域的嵌合融合蛋白，胞质信号转导结构域包含衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域。一方面，CAR包含含有抗原识别结构域、跨膜结构域和胞质信号转导结构域的嵌合融合蛋白，胞质信号转导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域。一方面，CAR包含含有抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域的嵌合融合蛋白，胞内信号转导结构域包含两个衍生自一种或多种共刺激分子的功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域。一方面，CAR包含含有胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域的嵌合融合蛋白，胞内信号转导结构域包含至少两个衍生自一种或多种共刺激分子的功能性信号转导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号转导结构域。一方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。一方面，CAR进一步包含位于胞外抗原识别结构域的N-末端的前导序列，其中，在CAR的细胞加工和定位至细胞膜期间，该前导序列任选地从抗原识别结构域(例如scFv)裂解下来。如本文所用，术语胞内(的)、胞质(的)和细胞质(的)可互换使用。术语“信号转导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传输信息以通过确定的信号转导通路通过产生第二信使或通过响应此类信使而作为效应物发挥作用来调控细胞活性。如本文所用，术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其与抗原特异性结合，例如非共价地、可逆地和以特定方式结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，且可以是源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。例如，天然存在的IgG抗体是四聚体，其包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链(其中L链可以由κ或λ链组成)[20]通过二硫键相互连接。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。在本发明的上下文中，术语VL也包括VK。VH和VL区可进一步细分为超变区，称作互补决定区(CDR)，其间插更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体和嵌合抗体。抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。术语“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少一个部分，并且指完整抗体的抗原结合结构域(例如抗原决定性可变区域)，其使该抗体片段足以识别和特异性结合靶标，例如抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、单链或“scFv”抗体片段、线性抗体、单域抗体例如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域，和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了它衍生自的完整抗体的特异性。除非另有说明，如本文所用，scFv可以具有任意顺序的VK或VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL(或VK)-接头-VH或可以包含VH-接头-VL(或VK)。包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR组合物部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，包括，例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等，1999，于：《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等，1989，于：《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港，纽约)[21，22]。一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。如本文所用，术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如，由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应理解为表示通过合成编码该抗体的DNA分子产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列具有使用本领域中可获得的和众所周知的重组或合成的DNA或氨基酸序列技术获得的DNA或氨基酸序列。本文所用的术语″抗原″或″Ag″定义为引起免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。
如本文所用的短语“与CD123的表达相关的疾病”包括但不限于与CD123的表达相关的疾病或与表达CD123的细胞相关的病症，包括例如，增殖性疾病，例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症，例如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD123的细胞相关的非癌相关适应症。一方面，与CD123表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症包括但不限于AML、骨髓增生异常综合征、ALL、毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤等。与CD123表达相关的其他疾病包括但不限于，例如，非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD123表达相关的增殖性疾病。也可以包括与CD123表达相关的非癌相关适应症。
在本发明中，本发明的CAR中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本领域技术人员已知的功能测定测试改变的CAR结合CD123的能力。
如本文所用术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其提供一种或多种第一胞质信号转导序列(primary cytoplasmic signaling sequence)，在T细胞信号转导通路的至少某些方面以刺激方式调控TCR复合物的第一激活(primary activation)。一方面，第一信号由，例如，TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合引发，并导致T细胞反应的介导，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的第一胞质信号转导序列(也称为“第一信号转导结构域”)可以包含称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或IT AM的信号转导基序。在本发明中特别使用的含有第一胞质信号转导序列的IT AM的例子包括但不限于衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)和CD66d的那些。在本发明的特定CAR分子中，本发明的任何一种或多种CAR分子中的胞内信号转导结构域包含胞内信号转导序列，例如CD3-ζ的第一信号转导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的第一信号转导序列是人序列(SEQ ID NO：11)，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等)的等效残基。在一个实施方式中，胞内信号转导结构域可以包含第一胞内信号转导结构域。示例性的第一胞内信号转导结构域包括衍生自负责第一刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方式中，胞内信号转导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号转导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，第一胞内信号转导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，而共刺激胞内信号转导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。第一胞内信号转导结构域可以包含信号转导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或IT AM。含有第一胞质信号转导序列的IT AM的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRα、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d、DAP10和DAP12的那些。
本文所用的“ζ”或替代性的“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是，例如，定义为以NCBI登录号J04132.1提供的蛋白质，或来自非人物种(如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等)的等效残基，“ζ刺激结构域”或替代性的“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激域”被定义为来自ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以在功能上传输T细胞激活所需的初始信号。“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，是高效的免疫反应所需的。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD1 la/CD18)和4-1BB(CD137)。共刺激胞内信号转导结构域可以是衍生自共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。此类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3，以及特异性结合CD83的配体等。胞内信号转导结构域可以包括其衍生的分子的整体胞内部分，或整体天然胞内信号转导结构域，或其功能片段。本文所用的“4-1BB”是指TNFR超家族的成员，具有，例如以NCBI号AAA53133.1提供的氨基酸序列，或来自非人物种，例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等效残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是人序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等)的等效残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO：10提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等)的等效残基。“编码”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，在具有确定的核苷酸(例如rRNA、tRNA和mRNA)序列或确定的氨基酸序列的生物过程中作为合成其他多聚物和大分子的模板，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与该基因、cDNA或RNA相对应的mRNA在细胞或其他生物系统中转录和翻译产生了蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码了蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此之间为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。就编码蛋白质的核苷酸序列在某些版本中可能包含一个或多个内含子来说，编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可以包括内含子。术语“载体”或“转移载体”指的是其包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应理解为进一步包括促进核酸转移到细胞内的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体，逆转录病毒载体、慢病毒载体等。“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，其中包含操作性地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件，其它用于表达的元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域所有已知的载体，包括纳入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺体相关病毒)。本文所用的术语“同源”或“相同性”是指两个多聚分子之间的亚基序列的相同性，例如，两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子，或两个多肽分子之间。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中各个的位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置上是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，在长度为10个亚基的多聚物中的5个位置)是同源的，那么这两个序列的同源性为50％；如果90％的位置(例如，10个中的9个)，是匹配或同源的，那么这两个序列的同源性为90％。
如本文所用“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，它能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的示例。
“慢病毒载体”是衍生自至少部分慢病毒基因组的载体，尤其包括如Milone等人[23]提供的自失活慢病毒载体(self-inactivating lentiviral vector)。可用于临床的慢病毒载体的其他例子包括但不限于，例如牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的
Figure BDA0003485540890000341
基因递送技术、Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的且本领域技术人员已知的。
语“可操作地连接”或替代性的“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可以是彼此连续的，例如，在需要加入两个蛋白质编码区的情况下，其在同一阅读框中。术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选择的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代[24][25][26]。如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指两条短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，包括很多类型。“多肽”(如上结构域、标志物、肽、接头)包括例如生物学活性片段或功能性片段，基本同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。如本文所用术语“启动子”定义为被细胞的合成机制识别或引入合成机制的DNA序列，需要其以起始多核苷酸序列的特异性转录。如本文所用，术语“启动子/调控序列”是指基因产物的表达所需的可操作地连接至启动子/调控序列的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。在用于scFv情况下，“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(例如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成的肽接头，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方式中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SEQ ID NO：27)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。
WO2012/138475中所述的接头也包含在本发明的范围内，通过引用全文纳入本文。
连接VL(或VK)和VH序列的接头优选选自下组：富含脯氨酸的刚性接头，例如小鼠IgG3上铰链区(mlgG3UFI)：PKPSTPPGSS(SEQ ID NO：46)、(mlgG3UH)2：PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS(SEQ ID NO：47)，或富含甘氨酸的柔性接头，例如(G4S)2接头：GGGGSGGGG(SEQ ID NO：48)、(G4S)4接头：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：49)、G4SG2接头GGGGSGG(SEQ ID NO：50)或G3SG4接头：GGGSGGGG(SEQ ID NO：27)，优选GGGSGGGG(SEQ IDNO：27)。本文所用术语“转染(的)”或“转化(的)”或“转导(的)”指将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染(的)”或“转化(的)”或“转导(的)”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞及其后代。该细胞包括经工程改造的免疫细胞，优选T细胞，更优选α/β或γ/δT细胞，或NK细胞或NK-T细胞或其组合。如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因表达数小时、数天或数周，其中表达的时间短于如果整合到基因组或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子中的基因的表达时间。如本文所用，短语“在转录控制下”或“操作性地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以通过RNA聚合酶和多核苷酸的表达控制转录的起始。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体或其抗原结合片段，或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合伴侣(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白，但该抗体、其抗原结合片段或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各数值。例如，应当认为诸如1至6的范围描述已具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各数字，如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，诸如95-99％相同性的范围，包括一些具有95％、96％、97％、98％或99％相同性的，且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％相同性的子范围。这普遍适用，与范围广度无关。术语至少80％相同性，包括具有80％、81％、82、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％99％或100％相同性的那些。
本发明还包括衍生自上述序列的核酸和氨基酸序列，例如：功能性片段、突变体、衍生物、类似物和与上述序列具有至少70％相同性百分比的序列。
本文公开的结构域、肽、分子、标志物、区域、部分、序列和链包括其功能性衍生物、片段、变体、由相应直向同源(orthologous)或同源基因编码的相应蛋白质、功能性突变体、功能性片段或类似物、同种型。
术语多核苷酸和多肽还包括其衍生物和功能性片段。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成多核苷酸。
在本发明的上下文中，如上定义的基因/蛋白质优选地通过由它们的NCBI基因ID和Gen Bank登录号定义的序列来表征。本文中的术语基因还包括其相应的直向同源或同源基因、同种型、变体、等位基因变体、功能性衍生物、功能片段。表述“蛋白质”旨在还包括由其相应直向同源或同源基因编码的相应蛋白质、功能突变体、功能性衍生物、功能性片段或类似物、同种型。
在本发明的上下文中，术语“多肽”或“蛋白质”包括：
i.全蛋白质、其等位基因变体和直向同源物；
ii.任何合成的、重组的或蛋白水解的功能性片段；
iii.任何功能性等效物，例如合成的或重组的功能性类似物。
对于“功能性”，它旨在维持其活性。例如，人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的功能性片段、衍生物或变体应保持其作为自杀基因的活性或在表达人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的转导细胞中诱导死亡的活性。
如本文所用，名称“功能性衍生物”或“功能性变体”在序列的功能性衍生物(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的上下文中表示与其原始序列基本相似的保留(功能或结构的)生物学活性的分子。该功能性衍生物或等效物可以是天然衍生物或可以合成制备。此类衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，条件是蛋白质的生物学活性是保守的。这同样适用于可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的核酸序列的衍生物，条件是通常保持该序列的生物学活性。当涉及蛋白质序列时，取代氨基酸通常具有与被取代氨基酸相似的化学物理特性。相似的化学物理特性包括电荷相似性、体积、疏水性、亲水性等。术语“功能性衍生物”旨在包括本发明主题的“片段”、“区段”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”。在一个实施方式中，上述衍生物、变体或片段是“抗原衍生物、变体或片段”(例如，其具有诱导/引发针对亲本抗原的免疫应答的能力)。
因此，术语“变体”在本文中是指在结构和生物学活性上与本发明的蛋白质或核酸基本相似的蛋白质或核酸分子，例如但不限于保留亲本蛋白质的所有生物学活性的变体。
本发明的功能性衍生物可以化学合成或通过重组DNA技术生产。所有这些方法是本领域熟知的。
如本文所用，“化学衍生物”意在涵盖通常不属于本发明主题的其他化学部分。此类部分可以影响衍生物的物理化学特征(例如溶解度、吸收、半衰期、毒性降低等)。此类部分在《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(1980)中举例说明。将这些化学-物理部分与多肽或核酸序列偶联的方法是本领域熟知的。本文所用的“片段”表示这样的多肽，其具有优选至少10个氨基酸，更优选地至少15个、至少17个氨基酸或至少20个氨基酸，甚至更优选地至少25个氨基酸或至少37或40个氨基酸，并且更优选至少50、或100、或150或200或250或300或350或400或450或500个氨基酸的长度。
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ(CAR.CD123-T)逆转录病毒载体的设计
CAR.CD123的表达盒以卡通显示。双顺反子载体由两个转基因构成，即ΔCD19和CARCD123。ΔCD19由CD19标志物的(胞外和跨膜)结构域构成。它通过2A肽连接至CARCD123。
CD123的scFv与CD8a间隔子-跨膜结构域和以4-1BB为代表的共刺激结构域以及信号转导结构域CD3-ζ链(ζ)被克隆在框内。作为可追踪标志物，加入ΔCD34。
图2.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ在T细胞上稳定表达。(A-B)在体外培养长时间(长达25天)扩增后，通过流式细胞术分析由CAR.CD123遗传修饰的T细胞上的ΔCD34(A)或ΔCD19表达(B)，观察到T细胞表面CAR.CD123的稳定表达。直方图(A-B)代表了8个HD的平均值+标准差(SD)，监测其随时间推移(在第+3天和第+25天)的CAR表达。(C)逆转录病毒转导后CAR.CD123在T细胞中高效表达。显示了代表性供体非转导(NT)T细胞(C，上图)和转导后(C，下图)的图。CAR表达通过使用抗-CD34(PE)和CD19(FITC)mAb与抗-CD3(BV421)组合评估。
图3：T细胞随时间倍数扩增。每周计数未转导的T细胞(NT-T)或由ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的T细胞(CAR.CD123-T)以监测细胞扩增。每个点是来自三个供体的T细胞的平均数±SD。
图4：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ在NK细胞上稳定表达。(A-B)在体外培养长时间(长达25天)扩增后，由CAR.CD123遗传修饰的NK细胞上的ΔCD34(A)或ΔCD19(B)的表达的流式细胞术分析。直方图代表监测CAR表达的8个HD+SD的平均值。(C)逆转录病毒转导后CAR.CD123在NK细胞中高效表达。显示了代表性供体非转导(NT)NK细胞(C，上图)和转导后(C，下图)的图。CAR表达通过使用抗-CD34(PE)和CD19(FITC)mAb与抗-CD56(BUV395)组合评估。
图5：先天细胞随时间倍数扩增。每周计数未转导的先天细胞(NT-先天细胞)或由ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的先天细胞(CAR.CD123-先天细胞)以监测细胞扩增。每个点是来自三个供体的先天细胞的平均数±SD。
图6：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ在γδ T细胞上稳定表达。用CAR.CD123对遗传修饰的γδ T细胞上的ΔCD34或ΔCD19表达进行流式细胞术分析。第一个图显示，代表性样品由不存在αβ T细胞的纯γδ T细胞群代表。通过使用抗-TCRαβ(FITC)进行免疫表型分析，逆转录病毒转导后，抗-TCR-γδ PE.CAR.CD123在γδ T细胞中高效表达。显示了代表性供体非转导(NT)γδ T细胞(上图)和转导后(下图)的图。CAR表达通过使用抗-CD34(PE)和CD19(FITC)mAb与抗-CD3(APC)组合评估。
图7：CAR.CD123-T细胞的长期抗肿瘤活性。三种CD123+细胞系(THP1、MOLM13、OCIAML3)和CD123-细胞(KARPAS 299)已经与未转导的T细胞(NT-T)或经ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的T细胞(CAR.CD123-T)共培养。直方图显示了以1∶1的比率与NT-T(浅灰色)或CAR.CD123-T细胞(黑色柱)共培养5天后残留肿瘤细胞的百分比。该实验设三重复进行，T细胞来自三个供体。结果表示为生物学重复的平均值±SD。**p-值≤0.01；***p-值≤0.001；ns＝不显著。
图8：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞的长期抗肿瘤活性。三种CD123+细胞系(THP1、MOLM13、OCI AML3)和CD123-细胞(KARPAS 299)已经与来自相同供体(n＝8)的未转导的T细胞(NT-T)或经ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的T细胞(CAR.CD123-T)共培养。使用6天的长期共培养试验评估抗肿瘤活性。NT-T(浅灰色柱)和CAR.CD123-T(黑色柱)以效应物：靶标(E：T)为1∶1的比率共同孵育。直方图显示了以1∶1的比率与NT-T或CAR.CD123-T细胞共培养6天后残留肿瘤细胞的百分比。来自8个供体的数据表示为平均值±SD。**p-值≤0.01；***p-值≤0.001；ns＝不显著。
图9：ACD19-2A-CAR.CD123-ACD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞的长期抗肿瘤活性。三种CD123+细胞系(THP1、MOLM13、OCI AML3)和CD123-细胞(KARPAS 299)已经与未转导的NK细胞(NT-NK)或经NK遗传修饰的(CAR.CD123-NK)共培养。直方图显示了以1∶1的比率与NT-NK(浅灰色)或CAR.CD123-NK细胞(黑色柱)共培养6天后残留肿瘤细胞的百分比。来自8个供者的数据表示为平均值±SD。**p-值≤0.01；***p-值≤0.001；ns＝不显著。
图10：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζγδ T细胞的长期抗肿瘤活性。三种CD123+细胞系(THP1、MOLM3、OCI AML3)和CD123-细胞(KARPAS 299)已经与未修饰的(NT-γδ)或未经ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的γδ T细胞(CAR.CD123-γδ)以E∶T比率1∶1共培养6天。单个供体的直方图显示了与NT-γδ(浅灰色)或CAR.CD123-γδ(黑色柱)共培养6天后残留肿瘤细胞(CD123+或CD123-)的百分比。
图11.急性髓系白血病患者骨髓细胞上CD123表达的流式细胞术分析。该图显示了原发性人骨髓(BM)急性髓系白血病(AML)患者在诊断时(AML#1、AML#2)CD123的表面表达。使用抗-CD123(BV421)、CD34(BB770)和CD38(PeCy7)进行CD123表达的流式细胞术分析。
图12健康供体的骨髓细胞上CD123表达的流式细胞术分析。该图显示了在原代人骨髓(BM)健康供体(HD)样品上的CD123的表面低/可忽略不计的表达。使用抗-CD123(BV421)、CD34(BB770)和CD38(PeCy7)进行CD123表达的流式细胞术分析。
图13.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ细胞的肿瘤脱靶效应(off-tumour on-target effect)可忽略不计。直方图显示了不同实验组中集落形成单位(CFU)的数量比较。从健康供体(HD)的BM中纯化的CD34+细胞与未修饰的T和NK(NT-T、NT-NK)细胞以及修饰的T和NK细胞(CAR.CD123-T、CAR.CD123-NK)以效应物∶靶标为1∶1的比率共培养。共培养试验以生物学三次重复铺板，14天后进行造血集落评分。(A)BFU-E的绝对计数评分；
(B)GM-CFU的绝对计数评分。来自2个供者的数据表示为平均值±SD。
图14.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ细胞的体内模型在T细胞和NK细胞中均表现出活性。(A)卡通显示了全身输注THP-1-FF-Luc.GFP细胞(0.01x106个细胞/小鼠)的异种移植免疫缺陷小鼠模型。在肿瘤建立时(第3天)，小鼠被静脉输注(第+3天和第+7天)。(B)经治疗的NSG小鼠从第3天到第61天的体内生物发光成像的时间过程。(C)接受两次连续过继转移：NT-T(红线；4只小鼠)、CAR.CD1213-T(黑线；4只小鼠)、NT-NK(绿线；4只小鼠)和CAR.CD123-NK(蓝线；4只小鼠)治疗的白血病小鼠的80天总生存(OS)概率。(D)接受两次连续过继转移：NT-T、CAR.CD123-T、NT-NK和CAR.CD1123-NK细胞治疗的白血病小鼠80天总生存率的统计分析。
图15.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞中的CD19自杀基因活性的体外模型。CD19选择性接合抗-hCD19-CD3 bite抗体后ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞的流式细胞术分析。来自示例性供体的T细胞由ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰。(A-B)ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞通过Ab CD34-PE(A)和Ab CD19-FITC(B)表征CAR表达。
ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞暴露于一剂10ng/ml的阴性对照(即Ab CD19-β Gal bite)或一剂10ng/ml抗-hCD19-CD3 bite24小时。(C-D)ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞不受阴性对照(即Ab CD19-β Gal bite接合)影响，如CD34(C)和CD19(D)的流式细胞术分析所示。(E-F)ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞在第一个评估的时间点(24小时)由抗-hCD19-CD3 bite接合选择性消除，如CD34(E)和CD19(F)的流式细胞仪分析所示。
图16.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞中的CD19自杀基因活性的体外模型。在CD3+T细胞存在的情况下，CD19选择性接合抗-hCD19-CD3 bite抗体后，ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞的流式细胞术分析。(A-C)来自示例性供体的NK细胞由ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰。
ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞通过Ab CD56 PE-Cy7和AbCD19-FITC(A)表征CAR表达。在没有CD3+T细胞的情况下(对照阴性实验条件)，ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞暴露于一剂10ng/ml阴性对照(即Ab CD19-β Galbite(B))或一剂10ng/ml抗-hCD19-CD3bite(C)24小时。(D-F)来自示例性供体的NK细胞由ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰。ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞通过Ab CD56 PE-Cy7和Ab CD19-FITC(D)表征CAR表达。在存在CD3+T细胞的情况下，ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞暴露于一剂10ng/ml阴性对照(即Ab CD19-β Gal bite(E))或一剂10ng/ml抗-hCD19-CD3 bite(F)24小时。在CD3+T细胞存在的情况下，通过抗-hCD19-CD3 bite接合，ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζNK细胞被选择性消除。
图17.ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞中的CD19自杀基因活性的体内模型。(A)卡通显示了全身输注ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞(CAR.CD123-T细胞；剂量：10x106/小鼠)的异种移植免疫缺陷小鼠模型。在第0天(I剂量)、第4天(II剂量)和第8天(III剂量)，静脉输注效应细胞，同时皮下给予IL2(每周两次；1000U/小鼠)。第一次给药后30天，当T细胞在体内显示出显著扩增时，NSG小鼠连续5天接受抗-hCD19-CD3 bite(5μg/小鼠)治疗。(B-C)在NSG小鼠的一个示例性放血中，抗-hCD19-CD3bite给药之前(B)和之后(C)的ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζT细胞的FACS分析。CD19表达分析显示在抗-hCD19-CD3 bite给药之前(B)和之后(C)的CAR+细胞(CD3+CD19+)。
材料和方法
CAR-CD123质粒的设计(构建体)
设计了临床级“第二”代逆转录病毒双顺反子载体SFG，允许同时表达两个转基因，即ΔCD19和盒式(cassette)抗-CD123单链可变片段(scFv)，衍生自IgG(7G3)的类的鼠抗体，通过密码子优化的人CD8间隔子跨膜结构域连接至密码子优化的信号转导共刺激结构域4-1BB(CD137)和CD3-ζ(图1)。
特别地，ΔCD19代表连接至跨膜部分的人CD19的胞外结构域。特异性针对CD123-的单链可变片段(scFv)-是免疫球蛋白轻链(VL)可变区的114个氨基酸(aa)通过8个氨基酸的弯曲(nex)(短接头肽)连接至免疫球蛋白重链(VH)的118个氨基酸的融合蛋白。
特别地，scFv 7G3与密码子优化的CD34衍生的16个氨基酸的表位(作为可追踪标志物)克隆在框内，通过42个氨基酸的间隔子(作为间隔子的11个氨基酸加上密码子优化的CD8胞外结构域的31个氨基酸)连接以结合密码子优化的21个氨基酸的人CD8-跨膜结构域(CD8aTM)。针对SFG：ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ(CAR.CD123-T)逆转录病毒载体的信号通过共刺激分子：4-1BB胞内结构域(42个氨基)从CD123scFv 7G3的胞外部分运至CD3-ζ链的胞内部分(113个氨基)。
eGFP-萤火虫-荧光素酶细胞系的产生。
编码eGFP-萤火虫-荧光素酶(eGFP-FFLuc)的逆转录病毒载体被用于选择实验，以标记CD123阳性(CD123+)或CD123阴性(CD123-)的肿瘤细胞：
CD123+：
-急性单核细胞白血病细胞系THP-1
-急性髓系白血病细胞系MOLM-13
-急性髓系白血病细胞系OCI-AML-3
CD123-：
-非霍奇金淋巴瘤(NHL)Karpas 299
细胞系。
急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞获得自LGC Standards-ATCC。急性髓系白血病细胞系MOLM-13和OCI-AML-3获得自DSMZ。非霍奇金淋巴瘤(NHL)Karpas 299获得自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。
THP-1、MOLM-13和Karpas 299细胞系用RPMI 1640培养基培养维持。OCI-AML-3用IMDM培养维持。细胞系补充有10％胎牛血清(FBS，海克隆公司(Hyclone)，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，宾夕法尼亚州匹兹堡)和2mM GlutaMax(英杰公司(Invitrogen)，美国加利福尼亚州)。细胞维持在37℃下含有5％CO2的湿润气氛中。定期测试所有细胞系的支原体和靶抗原CD123的表面表达。所有细胞系均已在认证实验室″BMRGenomics s.r.l.″中通过STR分析进行验证。
逆转录病毒上清
通过将293T与MoMLV gag/pol表达质粒PeqPam3(-env)、RD114env表达质粒RDF和SFG载体以分别2∶3∶3的比率共转染，总计10μg DNA，生产瞬时逆转录病毒上清液。使用GeneJuice试剂(卡巴开公司(Calbiochem))促进转染。转染后2天和3天收集上清液，过滤(使用0.45-mm过滤器)、急冻，并以5-ml等分试样储存在-80℃[27]。
效应细胞的分离、产生和转导。
根据OPBG的机构审查委员会(Institutional Review Board)(IRB)制定的规则(伦理委员会的批准N°969/2015prot.N° 669LB)，在获得经签署的知情同意书后，使用淋巴细胞分离培养基(Eurobio；法国)从健康供体(OPBG医院，意大利罗马)获得的外周血(PB)或血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。在重组人白细胞介素-7(IL7，10ng/ml；R&D；USA)[28]和重组人白细胞介素-15(IL15，5ng/ml；R&D)[29][30]的组合存在的情况下，用固定化的OKT3(1μg/ml，e-生命科学有限公司(e-Bioscience Inc.；San Diego)，美国加利福尼亚州)和抗-CD28(1μg/ml，BD生物科学公司(BD Biosciences)，欧洲)抗体活化T淋巴细胞。在预先包被有重组人RetroNectin(宝生物有限公司(Takara-Bio.Inc)；日本)的24孔板中，在第3天使用特异性的逆转录病毒上清液和特异性的上述细胞因子，转导激活的T细胞。在转导后的第5天，T细胞在含有45％RPMI 1640和45％克里克培养基(西格玛奥德里奇公司；美国)，补充有10％FBS和2mM Glutamax的“CTL完全培养基”中扩增，每周补充两次特定上述细胞因子[31]。。
NK或γδ-T细胞的分离、产生和转导。
通过密度梯度技术(Ficool-Histopaque(Eurobio；法国))从健康供体的血沉棕黄层或白细胞单采(1eukapheresis)中分离外周血单核细胞(PBMC)；健康供体已经根据OPBG的机构审查委员会制定的规则签署了书面知情同意书(伦理委员会批准N_969/2015prot.N_669LB)。CD56+CD3-NK细胞，用NK分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec，Inc.)，美国加利福尼亚州圣地亚哥)分离，并用NK细胞激活/扩增试剂盒(美天旎生物技术有限公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)和重组人白细胞介素2(IL2，500U/ml；R&D；美国)或重组白细胞介素15(IL15 10U/ml；R&D；美国)扩增。在预先包被有重组人RetroNectin(宝生物有限公司；日本)的24孔板中，使用逆转录病毒上清液转导激活的NK细胞。富集的NK细胞在GMP合规的培养基(NK MACS美天旎生物技术有限公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)中培养。
在
Figure BDA0003485540890000451
细胞冷冻保存培养基(西格玛奥德里奇公司)中冷冻保存后，从αβ和CD19耗竭的供体获得γδ-T细胞，并在使用激活/扩增试剂盒(美天旎生物技术有限公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)激活后在NK MACS培养基中扩增，如上所述。
患者详情
对于体外研究，在诊断时从2名患有急性髓系白血病(AML)的儿科患者中收集了原代BM样品。此外，从一位HD供体(OPBG医院，意大利罗马)收集了BM样品。签署的知情同意书是根据OPBG的机构审查委员会(IRB)制定的规则获得的(伦理委员会批准N°969/2015prot.N° 669LB)
表型分析
使用了以下mAb：CD3、CD123、CD45、CD56、CD34、CD19(均来自BD Pharmigen，美国)。使用抗-CD34 Ab(R&D，USA)或皮尔斯重组生物素化蛋白L[32](赛默飞世尔科技公司，美国)评估CAR.CD123在T细胞上的表达。用BD LSRFortessa X-20和Diva软件(BD生物科学公司)分析样品。对于每个样品，最少分析了20,000个事件。
倍数扩增
使用台盼蓝方法通过计数室每周计数一次细胞。
体外抗白血病活性
对于共培养实验，效应T淋巴细胞和白血病细胞系被接种在24孔板中。在37℃下孵育5天后，收集肿瘤细胞和T细胞并通过FACS分析。
骨髓CD34+细胞的正选
CD34+细胞是从健康供体的骨髓样品中分离出来的。首先，CD34+细胞被CD34微珠(美天旎生物技术有限公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥)磁性标记。用抗-CD34(PE)进行流式细胞术分析以评估CD34阳性部分(CD34+)的纯度。
集落形成单位(CFU)试验
CD34+与未修饰的T和NK细胞以及由
ΔCD19-2A-CAR.CD123-ΔCD34-CD8.4.1BB-ζ遗传修饰的T或NK细胞以E∶T比率为1∶1共培养。孵育4小时后，CD34+被接种到MethoCult GF H4434培养基中。按照制造商关于CFU试验的说明，细胞以500个细胞/培养皿的密度接种。每个细胞共培养组被接种在3个复孔中，且培养物在37℃、5％CO2和20％O2的湿润气氛中保持。培养14天后，确定CFU的数量和类型。
CAR-123细胞凋亡的诱导
针对人CD19和人CD3的双特异性抗体(抗-hCD19-CD3[Aurogene，目录号：BIMAB-HCD19CD3)以指定浓度添加到NT或CAR.CD123T细胞中和与未修饰的T细胞和CAR.CD123-NK细胞共培养的条件下。通过活细胞的FACS分析在72小时时评估经遗传修饰的CAR+细胞的消除。
体内异种白血病模型
NOD/SCID IL-2Rγ无效(NSG)异种移植小鼠被输注THP-1细胞，以在体内评估CAR-转导的NK或T细胞的抗肿瘤作用。小鼠实验按照伦理国际、欧盟和国家要求进行，并获得意大利卫生部批准(N°88/2016-PR)。用萤火虫荧光素酶标记的THP-1细胞(THP-1FF-Luc)(0.01x106)接种NGS小鼠(5周龄；美国杰克逊实验室)。在第-3天和第7天，小鼠被通过静脉注射两剂10x106 NT-NK或CAR.CD123-NK和5x106 NT-T或CAR.CD123 T细胞，并每周经历生物发光成像(IVIS系统(IVIS System)，铂金埃尔默公司(Perkin Elmer)，美国)。如前所述进行光子/秒的信号定量。
CAR.CD123-T细胞中针对人CD19和人CD3的双特异性抗体在体内诱导细胞凋亡。
在CAR.CD123 T细胞的体内模型中评估了针对人CD19和人CD3(抗-hCD19-CD3)的双特异性抗体的活性。NGS小鼠全身(静脉)输注3剂20×106的NT或CAR.CD123 T细胞与IL-2(1000U)的组合。在T细胞扩增后，小鼠每天接受输注抗-hCD19-CD3治疗，连续5天。在治疗前后定期采集小鼠血液进行FACS分析，并通过抗-人-CD19(FITC)监测CAR.CD123 T细胞的扩增。
统计分析
使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行统计学评估。产生p-值＜0.05的组之间的差异被认为是显著的。使用Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠生存数据，并使用对数秩(Log-rank)(Mantel-Cox)测试测量统计学显著差异。没有价值的样品被排除在分析之外。仅在肿瘤植入后但在T或NK细胞输注之前死亡的动物被排除在外。在体内研究期间，既没有进行随机化，也没有进行盲法。然而，在对照或遗传修饰的T(NK)细胞输注之前，基于对照组和治疗组的肿瘤信号对小鼠进行匹配。为了比较肿瘤随时间的生长情况，以盲法收集生物发光信号强度。对生物发光信号强度进行对数转换，然后使用两个样品的t检验进行比较。
结果
与已知的CAR-CD123(表2)相比，根据本发明的上述CAR.CD123-4.1BB-ζ序列提供了意想不到的优势，例如：
引入ΔCD19作为可选择标志物和诱导型自杀基因(图1)；
此外，发明人证明了在T细胞和先天细胞(NK细胞或和γ/δT细胞)中均高水平的稳定CAR-CD123表达(图2、4和6)。
与对照非转导(NT)T-细胞(图3)或NK细胞(图5)相比，ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ逆转录病毒载体在遗传修饰的细胞中没有诱导任何显著的增殖变化，证明该构建体在abT、NK和gdT细胞的细胞平台中没有毒性或自相毁灭活性(fratricide activity)。
本文所述的体外结果表明，根据本发明修饰的多克隆ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζT细胞/NK细胞或γ/δT细胞，在与CAR-CD123 T细胞(图8)、NK细胞(图9)和γ/δT细胞(图10)的长期共培养中能够非常高效地消除CD123+肿瘤(图7)。
更具体地，通过SFG逆转录病毒载体获得的上清液能够高效地转导激活的T细胞(图2)、NK细胞(图4)或γ/δT细胞(图6)，并具有非常高的转导水平。此外，逆转录病毒载体的表达在T细胞(图2A-B)或NK细胞(图4A-B)中随时间稳定，不会干扰细胞扩增(图3和5)。在构建体中引入CD34衍生表位作为可追踪标志物，在γ/δT细胞(γ/δCD3+CD34+)中，在体外模型(图2C、图4C和图6)中，可以轻松地追踪遗传修饰的T细胞(α/β CD3+CD34+)、NK细胞(CD56+CD34+)。AML异种移植小鼠的体内模型证实了CAR-CD123效力的体外结果(图14)。FACS分析证实，相对于衍生自健康供体骨髓的祖细胞(图12)，只有来自AML患者的白血病干细胞表达高水平的CD123(图11)。此外，通过进行集落形成单位的绝对计数(图13)，我们证实了本发明特征在于CAR-CD123具有靶向白血病细胞的高度特异性，对衍生自健康供体骨髓的造血干细胞具有可忽略不计的肿瘤脱靶效应。
此外，我们在体外模型中证明了对于CAR-CD123 T细胞(图15)和CAR-CD123 NK细胞(图16)诱导CD19自杀基因活性的功效。应注意，CAR-CD123 NK细胞只能在T细胞存在的情况下(图16D-F)通过抗-bCD19-CD3 bite治疗消除，证明了该方法的高特异性和选择性。如FACS分析所示，通过分析用抗-hCD19-CD3 bite给药治疗小鼠之前和之后的循环CAR.CD123T细胞(CD3+CD19)(图17BC)，自杀基因活性也在体内模型中得到证实(图17A)。
本发明还公开以下项：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)分子，从N-末端到C-末端包含：
a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，
b)抗原结合结构域，
c)间隔子结构域，
d)跨膜结构域，
e)胞质结构域，
优选地，其中CAR是CD123特异性CAR(CD123 CAR)且抗原结合结构域包含来自单克隆抗-CD123抗体的VH和/或VL，更优选地，抗原结合结构域包含特异性结合至CD123的单链可变片段(scFv)。
2.如项1所述的CAR分子，其中所述人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由与SEQ IDNO：1
Figure BDA0003485540890000491
Figure BDA0003485540890000492
具有至少80％相同性的序列组成，优选其包含或由SEQ ID NO：1组成。
3.如项1或2所述的CAR分子，其中所述抗原结合结构域包含与7G3 VL序列：
Figure BDA0003485540890000493
Figure BDA0003485540890000494
具有至少80％相同性的序列，所述VH和/或VL可选地被人源化，其中所述VH和VL优选被第一接头分隔开，更优选所述scFv包含含有SEQ ID NO：4的VL和含有SEQ ID NO：5的VH。
4.如前述项中任一项所述的CAR分子，其中间隔子包含CD8α链的胞外区域，优选其包含或由与SEQ ID NO：7的氨基酸12-42(IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD)具有至少80％相同性的序列组成，和/或间隔子包含或由与SEQ ID NO：7的氨基酸1-11(PAPRPPTPAPT)具有至少80％相同性的序列组成，更优选间隔子包含SEQ ID NO：7。
5.如前述项中任一项所述的CAR分子，其中所述跨膜结构域包含选自下组的蛋白质的跨膜结构域：CD8、T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD15，优选其包含CD8的跨膜结构域，更优选其包含或由与SEQ ID NO：8(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选其包含SEQ ID NO：8。
6.如前述项中任一项所述的CAR分子，其中所述胞质结构域包含CD8a胞质部分、4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ链的区域，优选地，所述胞质结构域包含CD8a胞质和4-1BB共刺激结构域之间的接头，更优选地：
-所述CD8a胞质包含或由与SEQ ID NO：9(LYCNHRNRRRVCKCPR)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：9，和/或
-所述共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)包含或由与SEQ ID NO：10(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：10，和/或
-所述CD3-ζ链包含或由与SEQ ID NO：11
Figure BDA0003485540890000501
Figure BDA0003485540890000502
具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选其包含SEQ ID NO：11，和/或
-编码CD8a胞质的和共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)之间接头的序列由6个核苷酸组成。
7.如前述项中任一项所述的CAR分子进一步包含：
i.在人CD19的胞外结构域和跨膜结构域与抗原结合结构域之间：
-可裂解接头，优选2A肽或IRES，和/或
-信号肽和/或
-接头，和/或
ii.在抗原结合结构域和间隔子结构域之间。
-接头和/或
-可追踪标志物，
优选地：
-所述2A肽包含或由与SEQ ID NO：2(RGRGRGSLLTCGDVEENPGP)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：2，和/或
-所述信号肽包含或由与SEQ ID NO：51(MEFGLSWLFLVAILKGVQC)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：3，和/或
-所述可追踪标志物包含或由与SEQ ID NO：6(ELPTQGTFSNVSTNVS)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：6。
8.如前述项中任一项所述的CAR分子，其中编码以下中的至少一种的序列经密码子优化：人CD19的胞外结构域和跨膜结构域、可追踪标志物、间隔子结构域、跨膜结构域以及共刺激结构域。
9.如前述项中任一项所述的CAR分子，其中所述分子包含：
从N-末端至C-末端：
a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，如项1-2和8中任一项所定义的，
b)可裂解接头，如项7所定义的，
c)信号肽，如项7所定义的，
d)抗原结合结构域，如项1和3中任一项所定义的，
e)可追踪标志物，如项7-8所定义的。
f)间隔子结构域，如项1和4和8中任一项所定义的
g)跨膜结构域，如项1和5和8中任一项所定义的
h)胞质结构域，如项1和6和8中任一项所定义的，
优选地，CAR分子包含或由与SEQ ID NO：12具有至少80％相同性的序列组成，更优选其包含SEQ ID NO：12的序列。
10.一种编码如前述项中任一项所述的嵌合抗原受体分子的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子优选操作性地连接至表达控制序列，更优选地所述分子包含与以下序列之一具有至少80％相同性的至少一个序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26，
甚至更优选地，所述分子包含或由与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的序列组成。
11.一种载体，其包括如项10所述的分离的核酸分子，优选表达载体，更优选所述载体包括控制所述CAR的表达的外源性启动子，优选所述载体为DNA、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
12.一种工程化改造的免疫细胞，优选T细胞，更优选α/β和γ/δT细胞、或NK细胞、或NK-T细胞或其组合，甚至更优选人来源的，包括所述如项11所述的载体，或项10所述的分离的核酸分子，或如项1-9中任一项所述的在细胞表面表达的CAR。
13.一种药物组合物，其包含如项10所述的分离的核酸分子，或如项11所述的载体，或如项12所述的细胞，与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
14.如项1-9中任一项所述的CAR分子，如项10所述的分离的核酸分子，如项11所述的载体，如项12所述的细胞或如项13所述的药物组合物用于医药用途，优选用于CD123+癌症的治疗，更优选用于急性髓系白血病或B-淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)、骨髓增生异常综合征或毛细胞白血病的治疗，或用于造血干细胞移植之前、之后或期间。
15.人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，如项1-2和8任一项所定义的，用作所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域遗传修饰的细胞中的死亡诱导剂，在所述细胞暴露于抗-CD19抗体(包括bite抗体，例如博纳吐单抗)之后。
参考文献
1.Shi，M.，等，CD123是一种用于白血病诊断和治疗的新型生物标志物(CD123anovel biomaker for diagnosis and treatment of leukemia.)Cardiovasc HematolDisord Drug Targets，2019。
2.Sapienza，M.R.，等，母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤：现有技术和前景(Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm：State of the Art andProspects.)Cancers(Basel)，2019.11(5)。
3.Stevens，B.M.，等，CD123 CAR T细胞用于治疗骨髓增生异常综合征(CD123 CART cells for the treatment of myelodysplastic syndrome.)Exp Hematol，2019.74：p.52-63e3。
4.Salem，D.A.，等，CD43、CD81和CD200在经典与变异毛细胞白血病中的差异表达(Differential Expression of CD43，CD81，and CD200 in Classic Versus VariantHairy Cell Leukemia.)Cytometry B Clin Cytom，2019。
5.Forman，S.J.和J.M.Rowe，成人急性白血病第二次缓解的神话(The myth ofthe second remission of acute leukemia in the adult.)Blood，2013.121(7)：p.1077-82。
6.Majeti，R.，针对人急性髓细胞白血病干细胞的单克隆抗体疗法(Monoclonalantibody therapy directed against human acute myeloid leukemia stem cells.)Oncogene，2011.30(9)：p.1009-19。
7.Korpelainen，E.I.，等，干扰素-γ上调人内皮细胞中的白细胞介素-3(IL-3)受体表达，并与IL-3协同刺激主要组织相容性复合物II类表达和细胞因子产生(Interferon-gamma upregulates interleukin-3(IL-3)receptor expression in human endothelialcells and synergizes with IL-3 in stimulating major histocompatibilitycomplex class II expression and cytokine production.)Blood，1995.86(1)：p.176-82。
8.Li，K.，等，人树突状细胞对补体成分、受体和调节剂的表达(Expression ofcomplement components，receptors and regulators by human dendritic cells.)MolImmunol，2011.48(9-10)：p.1121-7。
9.Taussig，D.C.，等，造血干细胞表达多种髓系标志物：对急性髓系白血病的起源和靶向治疗的影响(Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers：implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia.)Blood，2005.106(13)：p.4086-92。
10.Munoz，L.，等，白细胞介素3受体α链(CD123)在恶性血液肿瘤中广泛表达(Interleukin-3 receptor alpha chain(CD123)is widely expressed in hematologicmalignancies.)Haematologica，2001.86(12)：p.1261-9。
11.Testa，U.，等，IL-3Rα在急性髓系白血病中的表达升高与原始细胞增殖增强、细胞数量增加和预后不良有关(Elevated expression of IL-3Ralpha in acutemyelogenous leukemia is associated with enhanced blast proliferation，increased cellularity，and poor prognosis.)Blood，2002.100(8)：p.2980-8。
12.Graf，M.，等，急性髓系白血病(AML)中造血细胞因子受体的表达和预后价值：对未来治疗策略的影响(Expression and prognostic value of hemopoietic cytokinereceptors in acute myeloid leukemia(AML)：implications for futuretherapeutical strategies.(Eur J Haematol，2004.72(2)：p.89-106。
13.Vergez，F.，等，高水平的CD34+CD38低/-CD123+原始细胞可预测急性髓性白血病的不良后果：西-东急性白血病和血液病组(GOELAMS)研究(High levels of CD34+CD38low/-CD123+blasts are predictive of an adverse outcome in acute myeloidleukemia：a Groupe Ouest-Est des Leucemies Aigues et Maladies du Sang(GOELAMS)study.)Haematologica，2011.96(12)：p.1792-8。
14.Tettamanti，S.，等，用新的CD123-特异性嵌合抗原受体重定向的细胞因子诱导的杀伤细胞靶向急性髓性白血病(Targeting of acute myeloid leukaemia bycytokine-induced killer cells redirected with a novel CD123-specific chimericantigen receptor.)Br J Haematol，2013.161(3)：p.389-401。
15.Smith，B.D.，等，CSL362(抗-IL3Rα/抗-CD123单克隆抗体)在早期复发高风险的CR中的CD123+急性髓系白血病(AML)患者中的第一次用于人体，1期研究(First-in Man，Phase 1Study of CSL362(Anti-IL3Ra/Anti-CD123 Monoclonal Antibody)in Patientswith CD123+Acute Myeloid Leukemia(AML)in CR at High Risk for Early Relapse.)Blood，2014.124(21)：p.120-120。
16.Testa，U.，E.Pelosi和A.Frankel，CD 123是一种膜生物标志物和是恶性血液肿瘤的治疗靶点(CD 123is a membrane biomarker and a therapeutic target inhematologic malignancies.)Biomark Res，2014.2(1)：p.4。
17.Mardiros，A.，等，表达CD123特异性嵌合抗原受体的T细胞表现出特定的细胞溶解效应功能和抗人急性髓系白血病的抗肿瘤作用(T cells expressing CD123-specific chimeric antigen receptors exhibit specific cytolytic effectorfunctions and antitumor effects against human acute myeloid leukemia.)Blood，2013.122(18)：p.3138-48。
18.Gill，S.，等，人急性髓系白血病的临床前靶向和使用嵌合抗原受体修饰的T细胞进行的骨髓清除(Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia andmyeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells.)Blood，2014.123(15)：p.2343-54。
19.Thokala，R.，等，使用睡美人系统重定向T细胞的特异性，通过混合并匹配靶向CD123+肿瘤的VL和VH结构域表达嵌合抗原受体(Redirecting Specificity of T cellsUsing the Sleeping Beauty System to Express Chimeric Antigen Receptors byMix-and-Matching of VL and VH Domains Targeting CD123+Tumors.)PLoS One，2016.11(8)：p.e0159477。
20.Schroeder，H.W.，Jr.和L.Cavacini，免疫球蛋白的结构和功能(Structureand function of immunoglobulins.)J Allergy Clin Immunol，201O.125(2增刊2)：p.S41-52。
21.Huston，J.S.，等，抗体结合位点的蛋白质工程：恢复大肠杆菌产生的抗-地高辛-单链Fv类似物的比活性(Protein engineering of antibody binding sites：recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogueproduced in Escherichia coli.)Proc Natl Acad Sci U S A，1988.85(16)：p.5879-83。
22.Bird，R.E.，等，单链抗原结合蛋白(Single-chain antigen-bindingproteins.)Science，1988.242(4877)：p.423-6。
23.Milone，M.C.，等，含有CD 137信号转导结构域的嵌合受体介导T细胞的存活增强和体内抗白血病功效增加(Chimeric receptors containing CD137 signaltransduction domains mediate enhanced survival of T cells and increasedantileukemic efficacy in vivo.)Mol Ther，2009.17(8)：p.1453-64。
24.Batzer，M.A.，J.E.Carlton和P.L.Deininger，使用在3′-末端带有肌苷的寡核苷酸增强进化PCR(Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosineat the 3′-terminus.)Nucleic Acids Res，1991.19(18)：p.5081.
25.Ohtsuka，E.，等，通过在多义密码子位置插入脱氧肌苷作为杂交探针的脱氧寡核苷酸的替代性方法(An alternative approach to deoxyoligonucleotides ashybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codonpositions.)J Biol Chem，1985.260(5)：p.2605-8。
26.Rossolini，G.M.，等，基于多义序列信息的聚合酶链式反应中脱氧肌苷引物比简并引物的使用(Use ofdeoxyinosine-containing primers vs degenerate primersfor polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information.)MolCell Probes，1994.8(2)：p.91-8。
27.Pule，M.A.，等，一种嵌合T细胞抗原受体，其可增加细胞因子释放并支持原代人T细胞的克隆扩增(A chimeric T cell antigen receptor that augments cytokinerelease and supports clonal expansion of primary human T cells.)Mol Ther，2005.12(5)：p.933-41。
28.Perna，S.K.，等，白细胞介素-7介导肿瘤重定向的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的选择性扩增，而不增强调节T细胞抑制(Interleukin-7 mediates selective expansionof tumor-redirected cytotoxic T lymphocytes(CTLs)without enhancementofregulatory T-cell inhibition.)Clin Cancer Res，2014.20(1)：p.131-9。
29.Perna，S.K.，等，白细胞介素15可缓解CTL从调节T细胞介导的抑制作用：对淋巴瘤过继性T细胞疗法的影响(Interleukin 15provides relief to CTLs fromregulatory T cell-mediated inhibition：implications for adoptive T cell-basedtherapies for lymphoma.)Clin Cancer Res，2013.19(1)：p.106-17。
30.Cieri，N.，等，IL-7和IL-15指引从原初前体生成人记忆干T细胞(IL-7and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naiveprecursors.)Blood，2013.121(4)：p.573-84。
31.Zheng，Z.，N.Chinnasamy和R.A.Morgan，蛋白L：一种通过流式细胞术检测嵌合抗原受体(CAR)表达的新型试剂(Protein L：a novel reagent for the detection ofchimeric antigen receptor(CAR)expression by flow cytometry.)JTransl Med，2012.10：p.29。
32.Klement，M.，等，接头柔性和长度对细胞毒性工程改造的抗体片段功能的影响(Effect of linker flexibility and length on the functionality of a cytotoxicengineered antibody fragment.)J Biotechnol，2015.199：p.90-7。
序列表
<110> 耶稣圣婴儿童医院(Ospedale Pediatrico Bambino Gesu')
<120> CAR-CD123载体及其用途
<130> PCT 143735
<150> EP 19188360.2
<151> 2019-07-25
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 333
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe
325 330
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽
<400> 2
Arg Gly Arg Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号
<400> 3
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ser Arg
20
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7G3 VL
<400> 4
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7G3 VH
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
115
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可追踪标志物
<400> 6
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 7
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
20 25 30
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 869
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ΔCD19-2A-CAR.CD123-4.1BB-ζ CAR
<400> 12
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Arg Gly Arg
325 330 335
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
340 345 350
Pro Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys
355 360 365
Gly Val Gln Cys Ser Arg Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
370 375 380
Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
385 390 395 400
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
405 410 415
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
420 425 430
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
435 440 445
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
450 455 460
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
465 470 475 480
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
500 505 510
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
515 520 525
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
530 535 540
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
545 550 555 560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
565 570 575
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
580 585 590
Thr Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
595 600 605
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly
610 615 620
Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro
625 630 635 640
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
645 650 655
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
660 665 670
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
675 680 685
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
690 695 700
Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Val Asp Lys Arg Gly Arg Lys
705 710 715 720
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
725 730 735
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
740 745 750
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
755 760 765
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
770 775 780
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
785 790 795 800
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
805 810 815
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
820 825 830
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
835 840 845
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
850 855 860
Ala Leu Pro Pro Arg
865
<210> 13
<211> 999
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
atgccaccac ctcgcctgct gttctttctg ctgttcctga cacctatgga ggtgcgacct 60
gaggaaccac tggtcgtgaa ggtcgaggaa ggcgacaatg ccgtgctgca gtgcctgaaa 120
ggcacttctg atgggccaac tcagcagctg acctggtcca gggagtctcc cctgaagcct 180
tttctgaaac tgagcctggg actgccagga ctgggaatcc acatgcgccc tctggctatc 240
tggctgttca tcttcaacgt gagccagcag atgggaggat tctacctgtg ccagccagga 300
ccaccatccg agaaggcctg gcagcctgga tggaccgtca acgtggaggg gtctggagaa 360
ctgtttaggt ggaatgtgag tgacctggga ggactgggat gtgggctgaa gaaccgctcc 420
tctgaaggcc caagttcacc ctcagggaag ctgatgagcc caaaactgta cgtgtgggcc 480
aaagatcggc ccgagatctg ggagggagaa cctccatgcc tgccacctag agacagcctg 540
aatcagagtc tgtcacagga tctgacaatg gcccccgggt ccactctgtg gctgtcttgt 600
ggagtcccac ccgacagcgt gtccagaggc cctctgtcct ggacccacgt gcatcctaag 660
gggccaaaaa gtctgctgtc actggaactg aaggacgatc ggcctgccag agacatgtgg 720
gtcatggaga ctggactgct gctgccacga gcaaccgcac aggatgctgg aaaatactat 780
tgccaccggg gcaatctgac aatgtccttc catctggaga tcactgcaag gcccgtgctg 840
tggcactggc tgctgcgaac cggaggatgg aaggtcagtg ctgtgacact ggcatatctg 900
atcttttgcc tgtgctccct ggtgggcatt ctgcatctgc agagagccct ggtgctgcgg 960
agaaagagaa agagaatgac tgacccaaca agaaggttt 999
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽
<400> 14
cgcggccgcg gccgagggag cctgctgaca tgtggcgatg tggaggaaaa cccaggacca 60
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 15
atggagtttg gactttcttg gttgtttttg gtggcaattc tgaagggtgt ccagtgtagc 60
agg 63
<210> 16
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7G3 VL
<400> 16
gactttgtaa tgacccaatc tccaagctct cttacggtaa cggcaggaga gaaagtcacc 60
atgtcatgta aatccagtca atccctcttg aactcaggca accagaaaaa ttatcttacg 120
tggtatcttc aaaagccggg gcaaccccca aaactcctga tctactgggc atcaaccagg 180
gagtccggcg tccccgaccg ctttacgggt agtggaagtg gaaccgattt tacccttact 240
atcagcagcg tacaagcgga agacttggct gtgtattatt gtcaaaatga ttattcatat 300
ccctatactt tcggtggagg gactaaactt gaaattaaac ga 342
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 弯曲
<400> 17
ggcggaggaa gcggaggtgg gggc 24
<210> 18
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 7G3
<400> 18
gaagtccagt tgcaacaatc tggccctgag ttggtaaagc ccggagcctc tgtgaagatg 60
agttgtaagg cttcagggta tacatttaca gactattata tgaaatgggt caaacaatct 120
cacggtaaat ccttggagtg gattggcgat attatcccga gtaacggtgc cacgttctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggcaacactg acggtagacc gcagcagcag cacggcgtat 240
atgcacctga actcattgac ttcagaggat agtgcagttt actactgtac tcggagtcat 300
ttgctgagag cgagttggtt cgcctattgg ggtcagggca cactcgttac cgta 354
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接
<400> 19
tctgcaggat cc 12
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
gaacttccta ctcaggggac tttctcaaac gttagcacaa acgtaagt 48
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 21
cccgccccaa gaccccccac a 21
<210> 22
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
cccgccccaa gaccccccac acctgcgccg accattgctt ctcaacccct gagtttgaga 60
cccgaggcct gccggccagc tgccggcggg gccgtgcata caagaggact cgatttcgct 120
tgcgac 126
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
atctatatct gggcacctct cgctggcacc tgtggagtcc ttctgctcag cctggttatt 60
act 63
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
ctgtactgta atcaccggaa tcgccgccgc gtttgtaagt gtcccagg 48
<210> 25
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 26
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctag 339
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 27
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 28
Ser Ala Gly Ser
1
<210> 29
<211> 2610
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD123嵌合抗原受体的核苷酸序列
<400> 29
atgccaccac ctcgcctgct gttctttctg ctgttcctga cacctatgga ggtgcgacct 60
gaggaaccac tggtcgtgaa ggtcgaggaa ggcgacaatg ccgtgctgca gtgcctgaaa 120
ggcacttctg atgggccaac tcagcagctg acctggtcca gggagtctcc cctgaagcct 180
tttctgaaac tgagcctggg actgccagga ctgggaatcc acatgcgccc tctggctatc 240
tggctgttca tcttcaacgt gagccagcag atgggaggat tctacctgtg ccagccagga 300
ccaccatccg agaaggcctg gcagcctgga tggaccgtca acgtggaggg gtctggagaa 360
ctgtttaggt ggaatgtgag tgacctggga ggactgggat gtgggctgaa gaaccgctcc 420
tctgaaggcc caagttcacc ctcagggaag ctgatgagcc caaaactgta cgtgtgggcc 480
aaagatcggc ccgagatctg ggagggagaa cctccatgcc tgccacctag agacagcctg 540
aatcagagtc tgtcacagga tctgacaatg gcccccgggt ccactctgtg gctgtcttgt 600
ggagtcccac ccgacagcgt gtccagaggc cctctgtcct ggacccacgt gcatcctaag 660
gggccaaaaa gtctgctgtc actggaactg aaggacgatc ggcctgccag agacatgtgg 720
gtcatggaga ctggactgct gctgccacga gcaaccgcac aggatgctgg aaaatactat 780
tgccaccggg gcaatctgac aatgtccttc catctggaga tcactgcaag gcccgtgctg 840
tggcactggc tgctgcgaac cggaggatgg aaggtcagtg ctgtgacact ggcatatctg 900
atcttttgcc tgtgctccct ggtgggcatt ctgcatctgc agagagccct ggtgctgcgg 960
agaaagagaa agagaatgac tgacccaaca agaaggtttc gcggccgcgg ccgagggagc 1020
ctgctgacat gtggcgatgt ggaggaaaac ccaggaccaa tggagtttgg actttcttgg 1080
ttgtttttgg tggcaattct gaagggtgtc cagtgtagca gggactttgt aatgacccaa 1140
tctccaagct ctcttacggt aacggcagga gagaaagtca ccatgtcatg taaatccagt 1200
caatccctct tgaactcagg caaccagaaa aattatctta cgtggtatct tcaaaagccg 1260
gggcaacccc caaaactcct gatctactgg gcatcaacca gggagtccgg cgtccccgac 1320
cgctttacgg gtagtggaag tggaaccgat tttaccctta ctatcagcag cgtacaagcg 1380
gaagacttgg ctgtgtatta ttgtcaaaat gattattcat atccctatac tttcggtgga 1440
gggactaaac ttgaaattaa acgaggcgga ggaagcggag gtgggggcga agtccagttg 1500
caacaatctg gccctgagtt ggtaaagccc ggagcctctg tgaagatgag ttgtaaggct 1560
tcagggtata catttacaga ctattatatg aaatgggtca aacaatctca cggtaaatcc 1620
ttggagtgga ttggcgatat tatcccgagt aacggtgcca cgttctacaa ccagaagttc 1680
aagggcaagg caacactgac ggtagaccgc agcagcagca cggcgtatat gcacctgaac 1740
tcattgactt cagaggatag tgcagtttac tactgtactc ggagtcattt gctgagagcg 1800
agttggttcg cctattgggg tcagggcaca ctcgttaccg tatctgcagg atccgaactt 1860
cctactcagg ggactttctc aaacgttagc acaaacgtaa gtcccgcccc aagacccccc 1920
acacctgcgc cgaccattgc ttctcaaccc ctgagtttga gacccgaggc ctgccggcca 1980
gctgccggcg gggccgtgca tacaagagga ctcgatttcg cttgcgacat ctatatctgg 2040
gcacctctcg ctggcacctg tggagtcctt ctgctcagcc tggttattac tctgtactgt 2100
aatcaccgga atcgccgccg cgtttgtaag tgtcccaggg tcgacaaacg gggcagaaag 2160
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 2220
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 2280
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 2340
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 2400
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 2460
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 2520
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 2580
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctag 2610
<210> 30
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 30
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Ile Pro Ser
165 170 175
Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser His Leu Leu
210 215 220
Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
<210> 31
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 7的氨基酸12-42
<400> 31
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
20 25 30
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:7的氨基酸1-11
<400> 32
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10
<210> 33
<211> 229
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 33
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 34
<211> 222
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
210 215 220
<210> 35
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链 CH3
<400> 36
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 38
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核心序列基序
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 40
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 41
Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 42
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 43
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 44
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 45
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 46
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 47
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Ser Thr Pro
1 5 10 15
Pro Gly Ser Ser
20
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 51
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys

Claims (34)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)分子，从N-末端到C-末端包含：
a)人CD19(ΔCD19)的胞外结构域和跨膜结构域，
f)抗原结合结构域，
g)间隔子结构域，
h)跨膜结构域，
i)胞质结构域。
2.如权利要求1所述的CAR分子，其中所述CAR分子是CD123特异性CAR(CD123 CAR)分子且所述抗原结合结构域包含来自单克隆抗-CD123抗体的VL(或VK)和/或VH，更优选地，所述抗原结合结构域包含特异性结合至CD123的单链可变片段(scFv)。
3.如权利要求2所述的CAR分子，其中所述抗原结合结构域包含或由以下序列组成：与7G3 VK序列具有至少80％相同性的序列，所述7G3 VK序列为：DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：4)，和/或与7G3 VH序列具有至少80％相同性的序列，所述7G3VH序列为：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTV(SEQ ID NO：5)，所述VL和/或VK和/或VH任选地被人源化，其中所述VL(或VK)和VH优选被第一接头分隔，更优选地所述scFv包含或由以下序列组成：包含或由SEQ ID NO：4组成的VK和包含或由SEQ ID NO：5组成的VH，更优选地所述scFv包含或由SEQ ID NO：30组成。
4.如权利要求1或2或3所述的CAR分子，其进一步包括可追踪标志物。
5.如权利要求4所述的CAR分子，其中所述可追踪标志物被包含在所述抗原结合结构域和所述间隔子结构域之间，优选所述所述抗原结合结构域和所述可追踪标志物被第二接头分隔。
6.如权利要求4或5所述的CAR分子，其中所述可追踪标志物包含或由CD34衍生表位(ΔCD34)组成，其中所述可追踪标志物优选包含或由以下序列组成：与SEQ ID NO：6(ELPTQGTFSNVSTNVS)具有至少80％相同性的序列，或衍生自鼠Ig CH2CH3区域间隔子(UNIPROTKB：P01861)的肽，所述鼠Ig CH2CH3区域间隔子(UNIPROTKB：P01861)为：ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：33)，或衍生自神经生长因子受体(NGFR)的肽，所述神经生长因子受体(NGFR)为：KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(SEQ ID NO：34)。
7.如权利要求4、5或6所述的CAR分子，其中所述可追踪标志物包含或由SEQ ID NO：6组成。
8.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中所述人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由以下序列组成：与SEQ ID NO：1(MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRF)具有至少80％相同性的序列或其功能性片段、衍生物和变体。
9.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中所述人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由SEQ ID NO：1组成。
10.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中所述间隔子结构域包含或由CD8α链的或CD28的胞外区域或铰链CH2-CH3或铰链CH3组成，优选它包含或由以下序列组成：与SEQID NO：7具有至少80％相同性的序列，或与SEQ ID NO：7的氨基酸12-42(IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD)具有至少80％相同性的序列，和/或与对应于SEQ IDNO：32(PAPRPPTPAPT)的SEQ ID NO：7的氨基酸1-11具有至少80％相同性的序列，或与SEQID NO：7、或与IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：35)、或与ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK，(SEQID NO：33)具有至少80％相同性的序列；或与ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID N0：36)具有至少80％相同性的序列，更优选所述间隔子结构域包含或由SEQID NO：7组成。
11.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中所述跨膜结构域包含或由选自下组的蛋白质的跨膜结构域组成：CD8、T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD15，优选其包含CD8或CD28的跨膜结构域，更优选所述跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：8(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT)，或与FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：37)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含或由SEQ ID NO：8组成。
12.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中所述胞质结构域包含或由以下组成：
a)CD8a胞质部分的区域，和
b)4-1BB共刺激结构域(共刺激信号转导结构域CD137)或其OX40序列或CD28胞质序列和
c)CD3-ζ链，
优选所述胞质结构域包含所述CD8a胞质结构域和所述4-1BB共刺激结构域之间的接头，
更优选地：
-所述CD8a胞质部分包含或由与SEQ ID NO：9(LYCNHRNRRRVCKCPR)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：9，和/或
-所述共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)包含或由与SEQ ID NO：10(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选地其包含SEQ ID NO：10，和/或
-所述CD28胞质序列包含或由与RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQID NO：38)具有至少80％相同性的序列组成，和/或
-所述OX40序列包含或由与RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：39)具有至少80％相同性的序列组成，和/或
-所述CD3-ζ链包含或由与SEQ ID NO：11(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*)具有至少80％相同性的序列组成，甚至更优选其包含SEQ ID NO：11，和/或
-编码所述位于CD8a胞质结构域和所述共刺激信号转导结构域CD137(4-1BB)之间的接头的序列由6个核苷酸组成，优选所述接头是VD。
13.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其进一步包含位于所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域以及所述抗原结合结构域之间的：
-可裂解接头，优选2A肽或IRES，和/或
-信号肽，和/或
优选地
-所述可裂解接头为2A肽，其包含或由与SEQ ID NO：2(RGRGRGSLLTCGDVEENPGP)具有至少80％相同性的序列组成，更优选地，其包含或由SEQ ID NO：2组成；或包含DxExNPGP的核心序列基序(SEQ ID NO：40)的2A自裂解肽，优选地，包含或由与AEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQID NO：41)；ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：42)；QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：43)或与VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：44)具有至少80％相同性的序列组成的肽，和/或
-所述信号肽包含或由与SEQ ID NO：3(MEFGLSWLFLVAILKGVQCSR)具有至少80％相同性的序列组成，更优选地其包含或由SEQ ID NO：3组成；或其包含或由与MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：45)具有至少80％相同性的序列组成。
14.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其中编码以下中的至少一种的序列经密码子优化：所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域、所述可追踪标志物、所述间隔子结构域、所述跨膜结构域和所述共刺激结构域，和/或
其中所述分子包括。
15.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，从N-末端到C-末端包含或由以下组成：
i)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，
j)可裂解接头，
k)信号肽，
1)抗原结合结构域，
m)可追踪标志物，
n)间隔子结构域，
o)跨膜结构域，
p)胞质结构域。
16.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其从N-末端到C-末端包含或由以下组成：
a)人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，如权利要求1或8-9或14中任一项所定义的，
b)可裂解接头，如权利要求13所定义的，
c)信号肽，如权利要求13所定义的，
d)抗原结合结构域，如权利要求2-3中任一项所定义的，
e)可追踪标志物，如权利要求4-7或14中任一项所定义的，
f)间隔子结构域，如权利要求10或14中任一项所定义的，
g)跨膜结构域，如权利要求11或14中任一项所定义的，
h)胞质结构域，如权利要求12或14中任一项所定义的。
17.如前述权利要求中任一项所述的CAR分子，其包含或由与SEQ ID NO：12具有至少80％相同性的序列组成，更优选其包含或由SEQ ID NO：12的序列组成。
18.一种编码如前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体分子的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子优选操作性地连接至表达控制序列，更优选地所述分子包含与以下序列之一具有至少80％相同性的至少一个序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26，
甚至更优选地所述分子包含或由与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的序列组成，更优选地所述分子包含或由SEQ ID NO：29组成。
19.一种载体，其包含如权利要求18所述的分离的核酸分子，优选表达载体，更优选所述载体包含控制所述CAR的表达的外源性启动子，优选所述载体为DNA、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
20.一种经工程改造的免疫细胞，优选T细胞，更优选α/β或γ/δ T细胞、或NK细胞、或NK-T细胞或其组合，甚至更优选人来源的，包含如权利要求19所述的载体，或如权利要求18所述的分离的核酸分子，或在细胞表面表达如权利要求1-17中任一项所述的CAR。
21.一种药物组合物，其包含如权利要求18所述的分离的核酸分子，或如权利要求19所述的载体，或如权利要求20所述的细胞，与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
22.如权利要求1-17中任一项所述的CAR分子，如权利要求18所述的分离的核酸分子，如权利要求19所述的载体，如权利要求20所述的细胞或如权利要求21所述的药物组合物用于医药用途，优选用于CD123+癌症的治疗，更优选用于急性髓系白血病或B-淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)、骨髓增生异常综合征或毛细胞白血病的治疗，或用于造血干细胞移植之前、之后或期间的用途。
23.人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，优选如权利要求1或8-9或14中任一项所定义的，用于医药用途，优选用于在用所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域遗传修饰的细胞中作为死亡诱导剂，优选在将所述细胞暴露于结合转导细胞上的所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的至少一种试剂之后，所述试剂优选为抗体、小分子、多肽、核酸或其组合，更优选单克隆抗体、更优选抗-CD19抗体，包括bite抗体，例如博纳吐单抗。
24.用于如权利要求23所述的用途的人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，其中所述遗传修饰的细胞为转导细胞，例如免疫细胞或干细胞，其包含编码所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸，以及编码一种或多种治疗性基因产物的核酸，优选所述治疗性基因产物为经工程改造的受体，更优选其为T细胞受体、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子受体、归巢受体或趋化因子受体，优选地，所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
25.用于如权利要求23所述的用途的所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，其中编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码治疗性基因产物的核酸是相同的核酸分子，优选所述核酸分子是载体，更优选其为病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体，优选编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸位于所述核酸分子的N-端。
26.用于如权利要求23或24所述的用途的人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，其中所述CAR是如权利要求1-17中任一项所述的CAR。
27.一种包含转导细胞的组合物，所述转导细胞例如免疫细胞或干细胞，其包含编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码一种或多种治疗性基因产物的核酸，优选所述治疗性基因产物是经工程改造的受体，更优选其为T细胞受体、嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子受体、归巢受体或趋化因子受体，优选地，所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
28.如权利要求26所述的组合物，其中所述编码人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的核酸和编码治疗性基因产物的核酸是相同的核酸分子，优选所述核酸分子为载体，更优选其为病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
29.一种诱导表达人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的转导细胞死亡的方法，其包括提供有效量的结合所述转导细胞上人CD19的所述胞外结构域和跨膜结构域的至少一种试剂，所述试剂优选为抗体、小分子、多肽、核酸或其组合，更优选单克隆抗体，更优选抗-CD19抗体，其包括bite抗体，例如博纳吐单抗。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞进一步表达经工程改造的受体，优选T细胞受体或CAR，更优选所述经工程改造的受体靶向癌抗原。
31.一种载体，其包含编码所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的序列和编码经工程改造的受体的序列。
32.如权利要求30所述的载体，其中编码所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域的所述载体的序列和编码所述经工程改造的受体的载体的序列在所述载体上被可裂解接头分隔开。
33.如权利要求30-31中任一项所述的载体，其中所述经工程改造的受体是CAR。
34.用于如权利要求23或24或25所述的用途的人CD19的胞外结构域和跨膜结构域，或如权利要求26或27所述的组合物，或如权利要求28或29所述的方法，或如权利要求30-32中任一项所述的载体，其中所述人CD19的胞外结构域和跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：1(MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRF)具有至少80％相同性的序列或其功能性片段、衍生物和变体组成，优选所述人CD19的胞外和跨膜结构域包含或由SEQ ID NO：1组成。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022323756A1 (en) 2021-08-06 2023-12-14 Cimeio Therapeutics Ag Discernible cell surface protein variants for use in cell therapy
CN117430721A (zh) * 2023-10-25 2024-01-23 北京景达生物科技有限公司 Cd123靶向car-nk细胞的制备及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105392887A (zh) * 2013-03-15 2016-03-09 希望之城公司 Cd123特异性嵌合抗原受体重导向性t细胞及其使用方法
CN107074973A (zh) * 2014-07-29 2017-08-18 辉瑞大药厂 用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
CN109971713A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
PL2496698T3 (pl) * 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrócony receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRt) do selekcji transdukowanych komórek T
US9266960B2 (en) 2011-04-08 2016-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant III chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
EP3569253A1 (en) * 2013-06-05 2019-11-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
IL292650B2 (en) * 2014-09-19 2024-04-01 Hope City IL13RA2-targeted chimeric antigen receptor T cells
CA3172801A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Lentigen Technology, Inc. Method to treat cancer with engineered t-cells
TW201709932A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
US11059879B2 (en) * 2015-10-27 2021-07-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof
EP3293199B1 (en) * 2016-09-08 2021-01-13 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Chimeric antigen receptors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105392887A (zh) * 2013-03-15 2016-03-09 希望之城公司 Cd123特异性嵌合抗原受体重导向性t细胞及其使用方法
CN107074973A (zh) * 2014-07-29 2017-08-18 辉瑞大药厂 用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
CN109971713A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIHUA ELIZABETH BUDDE等: "Truncated Cell-Surface CD19 As a Conditional Suicide Switch For Adoptive T Cell Immunotherapy", BLOOD, vol. 122, no. 21, XP086750506, DOI: 10.1182/blood.V122.21.1660.1660 *
XIUQI WU等: "A Fusion Receptor as a Safety Switch, Detection, and Purification Biomarker for Adoptive Transferred T Cells", MOLECULAR THERAPY, vol. 25, no. 10, pages 2275 *

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Publication number Publication date
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