KR102632082B1 - 혈액 악성종양을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(car), 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

혈액 악성종양을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(car), 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 항원에 대한 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이를 부호화하는 폴리 뉴클레오타이드를 제공한다. 본 공개는 또한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 항원과 관련된 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

Description

혈액 악성종양을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR), 조성물 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015 년 2 월 27 일자로 출원 된 미국 가출원 제 62 / 121,842 호로부터 우선권을 주장하는 국제 PCT 출원이며, 그 전체가 본원에 참고로 인용되어있다.
림프구의 일종 인 T 세포는 세포 매개 면역에 중추적 역할을 한다. 그들은 세포 표면의 T세포 수용체 (TCR)의 존재에 의해 B세포 및 자연살해세포 (NK세포)와 같은 다른 림프구와 구별된다. CD4+ T 또는 CD4 T 세포 라고도 하는 보조 T 세포는 표면에 CD4 당단백질 (glycoprotein)을 표현한다. 보조 T 세포 (Helper T cell)는MHC (major histocompatibility complex, 주조직 적합 복합체) class II분자에 의해 제시된 항원 펩타이드에 노출되었을 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들 세포는 급속하게 증식하고 면역 반응을 조절하는사이토카인 (cytokine)을 분비한다. CD8+ T세포 또는 CD8 T세포로도 알려진 세포 독성 T세포 (cytotoxic T cell)는 세포 표면에 CD8 당단백질을 발현한다. CD8 + T 세포는 MHC class I 분자에 의해 제시된 항원 펩타이드에 노출되었을 때 활성화된다. T 세포의 일부인 기억 T 세포는 장기간 지속하다가 그들의 동족 항원에 반응하므로 면역체계에 과거의 감염이나/혹은 종양 세포에 대한 "기억"을 제공한다.
T 세포는 세포표면에 키메라 항원 수용체 (CAR)라고 불리는 특정 수용체를 생산하도록 유전적으로 조작 될 수있다. CAR은 T 세포가 종양 세포의 특정 단백질 (항원)을 인식 할 수있게 해주는 단백질이다. 공학적으로 만들어진 이들 T세포는 그 다음에 수십억개가 될 때까지 실험실에서 배양된다. 그러면 대량증식된 CAR T세포들은 환자에게 주입된다.
지금까지의 임상 실험은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포가 표준화학요법에 내성을 보이는 혈액악성종양에 대해 임상응용의 큰 가능성을 보여 주었다. 가장 주목할 만한 것은 CD19항원에 특이적인 CAR(CD19CAR) T 세포 치료법이 B세포 악성종양을 장기적으로 완화시키는 놀라운 결과를 가져왔다 (Kochenderfer, Wilson et al. 2010, Kalos, Levine et al. 2011, Porter, Levine et al. 2011, Davila, Riviere et al. 2013, Grupp, Frey et al. 2013, Grupp, Kalos et al. 2013, Kalos, Nazimuddin et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Lee, Shah et al. 2013, Park, Riviere et al. 2013, Maude, Frey et al. 2014).
B세포 백혈병과 림프종에 대한 CAR요법의 성공에도 불구하고, T세포 악성종양에 대한 CAR요법의 적용은 아직 잘 확립되지 않았다. T세포 악성종양이 B세포 악성종양과 비교할 때 극적으로 더 나쁜 결과를 낳는 것을 감안하면 (Abramson, Feldman et al. 2014), CAR요법은 이 점에서 임상적 필요성을 더욱 부각시킬 가능성을 갖고 있다.
CD5는 T세포 급성림프성백혈병(T-ALL)의 80% 이상에서 발현된다. 한가지 치료 방법의 선택은 CD5 표면분자를 발현하는 T세포백혈병 또는 T세포림프종 환자를 항 CD5항체(anti-CD5 antibodies)로 치료하는 것이다. 하지만 시도는 제한된 성공을 거두었다.
따라서, T세포 관련 악성종양에 대한 좀 더 효과적이고 안전하며 효율적인 표적화를 가능하게 하는 개선된 키메라항원수용체기반 치료법이 필요하다.
요 약
본 공개는 혈액 악성종양을 표적으로 하는 키메라항원수용체(CARS), 조성물 및 이의 용도를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 수용체(CAR) 폴리펩타이드 (polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드(signal peptide), CD2항원 인식 도메인(CD2 antigen recognition domain), 힌지 영역(hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조 자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD3항원 인식도메인(CD3 antigen recognition domain), 힌지 영역 (hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조 자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(a signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD4항원 인식도메인(CD4 antigen recognition domain), 힌지 영역 (hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조 자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD5항원 인식도메인(CD5 antigen recognition domain), 힌지부위(hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD7항원 인식도메인(CD7 antigen recognition domain), 힌지 영역 (hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD8항원 인식도메인(CD8 antigen recognition domain), 힌지 영역 (hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조 자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 제공한다. 이 폴리펩타이드는 신호펩타이드 (signal peptide), CD52항원 인식도메인(CD52 antigen recognition domain), 힌지 영역 (hinge region), 막통과 도메인(transmembrane domain), 적어도 하나의 보조자극 도메인(co-stimulatory domain), 그리고 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD2에 대해 선택적인 항원인식도메인을 갖고 있는 키메라 항원수 용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화 (encode)한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라항원수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD3에 대해 선택적인 항원인식도메인을 갖고 있는 키메라항원수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD4에 대해 선택적인 항원인식도메인을 갖고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD5에 대해 선택적인 항원 인식 도메인을 갖고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD7에 대해 선택적인 항원인식도메인을 갖고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD8에 대해 선택적인 항원인식도메인을 갖고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 CD52에 대해 선택적인 항원 인식 도메인을 갖고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 부호화한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 위에서 설명된 임의의 키메라항원수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 위에서 설명된 임의의 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52에 대해 선택적인 항원 인식 도메인을 가지고 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 말초혈액세포 또는 제대혈세포를 제공한다; (ii) 상기 폴리뉴클레오타이드를(i) 세포에 도입한다; 및 (iii) (ii)단계의 세포를 확장시킨다; 그리고 상기 공학적으로 처리된 세포를 제공하기 위해 (iii)단계의 세포를 분리한다.
또 다른하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52에 대해 선택적인 항원인식도메인을 가지고 있는 키메라항원수용체(CAR) 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 폴리 뉴클레오타이드(polynucleotide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 태반세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 조혈모세포를 제공한다; (ii) (i)단계의 세포에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입한다; (iii) (ii)단계의 세포를 확장시킨다; 및 (iv) 상기 공학적으로 처리된 세포를 제공하기 위해 (iii)단계의 세포를 분리한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD4 양성 T세포백혈병 또는 CD4 양성 T세포림프종에 대한 항백혈병 또는 항림프종 면역력을 이를 필요로 하는 환자에게 부여하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 이 치료가 필요한 환자에게 CD4 항원인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 치료적으로 유효한 양만큼 투여한다; (ii) 선택적으로, 환자의 T세포백혈병 또는 T세포림프종에 대한 면역력을 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD4 양성 T세포백혈병 또는 CD4 양성 T세포 림프종 세포의 수를 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) CD4 양성 T세포백혈병 또는 CD4 양성 T세포림프종 세포를 CD4 항원 인식도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, CD4 양성 T 세포 백혈병 세포 또는 CD4 양성 T 세포 림프종 세포를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2 항원을 가지고 있는 면역조절세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절세포를 CD2 항원 인식도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD3을 가지고 있는 면역조절세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절 세포를 CD3 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절 세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD4을 가지고 있는 면역조절세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절세포를 CD4 항원 인식도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절 세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD5을 가지고 있는 면역조절세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절 세포를 CD5 항원 인식도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD7을 가지고 있는 면역조절 세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절 세포를 CD7 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절 세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD8을 가지고 있는 면역조절 세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절 세포를 CD8 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절 세포의 수의 감소를 검정한다.
또 다른 하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD52을 가지고 있는 면역조절 세포의 수를 줄이는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 상기 면역조절 세포를 CD52 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시킨다; 및 (ii) 선택적으로, 면역조절 세포의 수의 감소를 검정한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 세포증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 치료적 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 자가면역질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포의 치료적 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 세포 증식성질환의 치료에 사용하기 위한 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식도메인을 가지고 있는 CAR 폴리펩타이드(polypeptide)를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다. 이 사용은 상기 공학적으로 처리된 세포를 그것을 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR들은 전형적으로 세포내 신호전달, 힌지 및/또는 막통과 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 제1세대 CAR들은 세포 내 신호전달 도메인으로서의 CD3z를 포함하는 반면, 제2세대 CAR들은 예를 들어, CD28 또는 4-1BB에서 유래한 단일 보조자극 도메인을 포함한다. 제3세대 CAR들은 CD28, 4-1BB (CD137로도 알려짐) 및 OX-40과 같은 2개 보조 자극 도메인과 임의의 다른 보조 자극 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 가지고 있는 CAR은 발현 카세트의 일부이다. 일부 우선적인 실시양태에서, 발현 유전자 또는 카세트는 부속유전자 또는 태그 또는 그 일부를 포함 할 수있다. 부속 유전자는 caspase9 유전자를 포함하나 이에 국한되지 않는 유도성 자살 유전자 또는 그의 일부 일 수있다. "자살 유전자" 제거 접근법은 유전자 치료의 안전성을 향상시키고 특정 화합물이나 분자에 의해 활성화 될 때만 세포를 사멸시킨다. 일부 실시양태에서, 항원결정기(epitope) 태그는 c-myc 태그, 스트렙트아비딘 결합 단백질(streptavidin-binding peptide, SBP), 잘라버린 EGFR 유전자 (EGFRt) 또는 이들의 일부 또는 조합이다.
도 1. CD4CAR 발현. (A), CD4CAR을 코딩하는 재조합 렌티 바이러스 벡터의 도식적 표현. CD4CAR 발현은 SFFV (비장 포커스 형성 바이러스) 프로모터에 의해 구동된다. 제3세대 CD4CAR는 선도서열, 항 CD4 scFv, 힌지도메인 (H), 막통과도메인 (TM) 및 CD28, 4-1BB (둘다 보조 자극제), 그리고 CD3제타 같은 세포내신호전달도메인들 포함한다. (B), 형웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 위해 293FT세포를GFP (lane 1) 과 CD4CAR (lane 2)의 렌티 바이러스 플라스미드로 형질감염시켰고48 시간 후마우스 항인간 CD3z 항체로도 프로브시켰다. (C), CD4를 발현하는 세포를 표적으로하는 제3세대 키메라 항원수용체 T세포의 구성 요소의 설명.
도 2. CD4CAR T 세포의 생산. (A), 실험 디자인. (B), CB버피코트 세포를 항 CD3 항체와 IL-2로 2 일간 활성화시켰다. 세포를 GFP (중간) 거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입시켰다. 배양 7 일 후, 세포를 바이오틴 (biotin)과 결합한 염소 항마우스 Fab2 또는 IgG항체와 함께 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하고, 이어서 스트렙트아비딘-PE(treptavidin-PE)로 분석하였다. 비형질도입, 표기된 CB 세포는 왼쪽에 표시되어 있다. (C), CD4CAR T세포는 T세포가 확장되는 동안 CD4+ 집단을 소모시킨다. CB 버피코트 세포를 항CD3 항체와 IL-2로 2일동안 활성화시켰다. CB 버피코트는 T세포에 속하는 두 부분 집합인 CD8+ 세포독성 T세포 및 CD4+ 헬퍼 T세포(왼쪽)를 포함한다. 세포를 GFP (중간)거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입시켰다. 3일 세포배양후, 마우스-항인간 CD4 (FITC) 및 CD8 (APC) 항체를 사용한 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 세포를 분석하였다. 비형질도입 PBMC도 표시되었다 (왼쪽). (D), 대부분의 CD4CAR T세포에는 중앙기억과 같은 표현형이 있다. CB 버피코트 세포를 항 CD3항체로 2일간 활성화시켰다. 세포를 CD4CAR 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입시켰다. 6일간 증식후, CD8+세포의 CD62L, CD45RO 및 CD45RA 표현형에 대해 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석했다 (N = 3).
도 3. CD4CAR T세포는 공동배양분석에서 T세포백혈병세포를 제거한다. (A), CD4CAR T세포는 공동배양에서 KARPAS 299 T세포백혈병세포를 제거한다. GFP (중간)거나 또는 CD4CAR (우측) 렌티 바이러스 상청액으로 형질 도입 된 활성화된 CB 버피코트 세포를 KARPAS 299 세포와 2:1의 비율로 배양하였다. 24 시간의 공동배양 후, 세포를 마우스-항인간 CD4 (APC) 및 CD8 (PerCp) 항체로 염색하고 T세포 부분집합에 대해 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다 (N=3). (B) and (C), CD4CAR T세포는 공동 배양에서 원발성 T세포백혈병 세포를 제거한다. GFP (중간)거나 또는 CD4CAR (우측) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입된 활성화된 인간 CB 버피코트 세포를 Sezary증후군 (B) 및 PTCLs (C)에서 얻은 원발성 T세포 백혈병세포와 2:1의 비율로 배양하였다. 24 시간의 공동배양 후,마우스- 항인간 CD4 (FITC) 및 CD8 (APC) 항체를 사용한 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 세포를 분석하였다 (N = 3). 인간의 원시세포는 또한 단독으로 표시되었다 (왼쪽). (D) CD4CAR T세포는 CD4 음성 림프종 세포 (SP53, B 세포 림프종 세포주)를 용해시킬 수 없었다. GFP (중간)거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입된 활성화된 CB 버피코트 세포를 세포막 염료 CMTMR로 미리 염색된 SP53 외투세포림프종(Mantle cell lymphoma)세포와 함께 2 : 1의 비율로 배양하였다. 24 시간의 공동배양 후, 세포를 마우스-항인간 CD3 (PerCp)로 염색한 다음, 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다 (N = 2). CMTMR로 미리 염색 된 SP53 세포를 또한 단독으로 표시하였다 (왼쪽).
도 4. PBMCs에서 파생된 CD4CAR T세포는 고도로 농축된 CD8+ T를 가지고 있으며 특히 CD4를 발현하는 백혈병 세포주를 죽인다. (A), PBMCs에서 파생 된 CD4CAR T세포는 고도로 농축된 CD8+ T세포를 가지고 있다. T 세포, CD8+ 및 CD4+ (왼쪽)를 구성하는 PMBC 버피코트 세포를 항CD3항체 및 IL-2로 2일동안 활성화시킨 다음 GFP (가운데)거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입시켰다. 3일간 배양 후, T세포 부분집합을 위해 세포를 표시하고 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다. 비형질도입 PBMC도 표시되었다 (왼쪽). (B) CD4CAR T세포는 KARPAS299 세포를 특이적으로 죽인다. GFP 대조군이거나 또는 CD4CAR 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입된 PMBC T세포를 CFSE 염색된 KARPAS 299와 각각 2:1, 5:1 및 10 : 1의 비율로 배양하였다. 37°C에서 밤새 인큐베이션 한 후, 염료 7AAD를 첨가하고 나서, 세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다. 음성대조군 세포 (SP53 세포, CMTMR로 염색된 B세포 림프종 세포주)와 표적 세포의 생존을 비교하는 것을 통해 표적 세포의 살상 백분율을 측정한다.
도 5. CD4CAR T세포는 다양한 모드의 생체내에서 항백혈병 효과를 효율적으로 중재한다. NSG 마우스에 준치사량 2.5Gy를 조사하였다. 조사하고 24시간 지난 후, 마우스 피하에 1 x106 (A에서) 거나 또는 0.5 x106 (B 및 C에서) 의 KARPAS 299 세포를 주사하였다. 주사된 마우스를 CD4CAR T세포 또는 대조 T세포의 서로 다른 과정과 스케줄로 치료하였다.각 그룹에 N = 5마우스를 사용하였다. (A), 종양 성장의 가속화를 관찰한 후 제3일째에 저용량 2x106 CD4CAR T 세포를 주사하였고 이어서 제22일째에 고용량 8x106 CD4CAR T세포를 주사하였다. (B), 제3일 및 제10일째에 2가지 고용량 CD4CAR T 세포(8 x106 및 5.5 x106)를 각각 주사하였다. (C), 매 5일마다 저용량 (2.5 x 106) CD4CAR T세포를 반복 주사하여 총 4회 투여하였다. (D), 지정된 CD4CAR T세포 또는 대조군 GFP T세포로 처리된 마우스의 전체 생존 N = 10.
도 6. CD4CAR은 HEK-293 세포의 표면에서 발현된다. HEK-293 세포를 CD4CAR 또는 GFP 대조군 바이러스 상청액으로 6시간 동안 형질도입시켰다. 3 일간의 인큐베이션 후, 세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다.
도 7. 렌티-GFP 과 CD4CAR 바이러스로 형질도입된 활성화된 PMBC 버피코트 세포간의 세포성장을 비교함. 활성화된 PBMC 버피코트 세포를 제0일째에 GFP 대조군이거나 또는 CD4-CAR 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입시켰다. 제1일째에 세포를 세척하고, 제3일과 5일째에 배지를 첨가하였다.
도 8. CD4CAR 구성. (A) 비장 포커스 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터에 의해 구동되는 3 세대 CD4CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터의 도식적 표현. 이 구성은 선도서열, 항CD4 scFv, 힌지 도메인 (H), 막통과(TM) 그리고 신호전달 도메인 CD28, 4-1BB 및 CD3 제타를 함유한다. (B) HEK293FT 세포를 GFP 벡터 대조군 (레인 1) 및 CD4CAR (레인 2) 렌티 바이러스 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후에, 세포를 꺼낸 다음 마우스 항인간 CD3z 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 사용 하였다. (C) CD4 발현 세포를 표적으로하는 제3세대 CAR NK 세포의 도해.
도 9. CD4CAR NK세포의 생산. (A, 상부 패널) FACS에 의해 분류되기 전 NK 세포의 CD4CAR 발현수준 (N = 3); (A, 하부 패널) 공동배양 실험 이전, 분류와 확장 후 NK 세포에서의 CD4CAR 발현 (N = 3).
도 10. CD4CAR NK세포는 공동배양 분석에서 CD4+ 백혈병과 림프종 세포를 제거한다. 공동배양 실험은 작동체 대 표적의 2:1 비율로 24 시간동안 수행되었고 CD56 과 CD4(패널 A 및 B)를 위한 유동세포측정법 (Flow cytometry)에 의해 직접 분석되었다. 각각의 분석은 표적세포 단독 대조 (왼쪽), 그리고 벡터 대조 렌티 바이러스 상청액에 의해 형질도입된 NK 세포와 함께 인큐베이션된 표적 세포(가운데) 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액에 의해 형질도입된 NK세포와 함께 인큐베이션된 표적 세포로 구성되어 있다. 맨 윗줄, 패널A: Karpas 299 (N=3). 중간 줄, 패널A: HL-60 T세포 (N=2). 하단 줄, 패널A: CCRF-CEM 세포 (N=2). CD4CAR NK 세포는 CD4+ T세포 림프종/Sezary증후군 (N=2)과 CD4 발현 소아 T세포 ALL (N=2) 환자에서 유래한 원발성 T세포백혈병 세포를 제거했다. (C) 2:1 과 5:1 E:T 두 가지 비율의 공동배양 분석 결과를 요약하는 막대 그래프.
도 11. 공동배양 특이성 및 용량반응 사멸곡선. CD4CAR NK 세포는 용량에 의존적인 또 특정된 방식으로 CD4를 발현하는 백혈병 세포주를 용해한다. CD4CAR NK 및 벡터 대조 세포를 작동체 대 표적 비율이 1:4, 1:2 및 1:1 조건에서 CFSE로 염색 된 "on-target"(Karpas 299 또는 CCRF-CEM) 세포 및 CMTMR로 염색 된 "off target"MOLT4 세포와 동일한 비율로 각기 배양 하였다. 24 시간 후, 7-AAD 염료를 첨가하고 잔존하는 살아 있는 세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다. CD4CAR NK 세포와의 공동 배양 중 CD4+ Karpas 299 또는 CCRF-CEM 세포 생존을 벡터 대조 NK세포와의 공동 배양 중 과 비교하여 표적 세포의 살상 백분율을 측정하였다.
도 12. CD4CAR NK 세포는 인간 제대혈에서 분리 된 CD4+ T세포를 2:1의 작동체 대 표적 비율로 제거하지만 조혈 줄기세포/선조세포 구획 출력에는 영향을 주지 않는다. (A) 공동 배양 분석은 작동체 대 표적 비율 2:1에서 24시간 동안 수행 한 후, 세포를 마우스 항인간 CD56 및 CD4 항체로 염색하였다. 표적세포를 대조군으로 단독으로 배양하였다 (왼쪽). NK세포를 벡터 대조 (가운데)거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티바이러스 상청액으로 형질도입시키고 인간 제대혈로부터 얻은 CD4+ T세포와 함께 배양하였다. (N = 2) (B) IL-2가 보충 된 NK세포 배지에서 CD4CAR NK 세포를 500 CD34+ 제대혈 세포와 함께 각각 2:1 및 5:1의 공동배양 작동체:표적 비율로 24 시간 동안 배양하였다. 사용한 실험대조군은 단독 CD34+ 세포였고, 비형질도입 NK 세포는 CD34+ CB 세포와 각각 2:1 및 5:1 작동체: 표적 비율로 공동배양하였다. 조혈구획 출력은 제16일째에 적혈구 대집락형성단위 (BFU-E) 및 과립구/단핵구 집락형성단위 (CFU-GM)의 수를 통해 평가하였다. CFU 통계분석은 알파를 0.05로 설정한 이원분산분석 (2-way ANOVA)을 통해 수행되었다.
도 13. CD4CAR NK세포는 생체내에서 항백혈병 효과를 나타낸다. 측정 가능한 종양 형성을 유도하기 위하여 마우스에 준치사량 방사선을 조사하였고 또 루시페레이스 (luciferase)를 발현하는 Karpas 299 세포 (제0일째)를 피내 주사하였다. 제1 일째 그리고 매 5일마다 총 6번, 마우스에게 5 x 106 CD4CAR NK세포 또는 벡터 대조 NK세포를 정맥 내 주사하였다. (A) 제7, 14, 21 일째에, 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하고 IVIS 영상을 시행하였다. (B) CD4CAR NK 주사 마우스에 대해 측정 된 평균 광 강도를 벡터 대조 NK 주사 마우스의 평균 광 강도와 비교하였다. (C) 제1 일째, 그리고 격일로 종양크기면적을 측정하고 두 그룹 간의 평균 종양크기를 비교하였다. (D) 두 그룹 간의 마우스 생존율을 측정하고 비교하였다.
도 14. CD4CAR NK세포는 공동배양 분석에서 CD4 양성 백혈병과 림프종 세포를 제거한다. 제시된 모든 공동배양분석은 작동체 대 표적 비율 5:1로 24시간동안 수행되었으며, 그 후 세포를 마우스 항인간 CD56 및 CD4 항체로 염색하였다. 각각의 분석은 대조 (왼쪽)로 단독으로 배양된 표적세포 뿐만 아니라 표적세포와 함께 배양된 벡터 대조 (가운데)거나 또는 CD4CAR (오른쪽) 렌티 바이러스 상청액으로 형질도입 된NK세포도 포함되어 있다. CD4CAR NK세포는 Karpas 299 백혈병 T세포 (A), HL-60 T세포 (B), 그리고CCRF-CEM 세포 (C)를 제거했다. CD4CAR NK세포는 CD4 발현 T세포 백혈병/Sezary증후군 (E)과 CD4 발현 소아T세포 ALL (F) 환자에서 얻은 T세포 백혈병 세포를 제거했다.
도 15. NK 세포를 벡터 대조거나 또는 CDCAR 렌티바이러스 상청액으로 형질도입하고, 또는 비형질도입 대조를 위해 배양하였다. 인큐베이션 7일 후, 세포를 수확하고, 바이오틴으로 표시된 염소 항마우스 F (Ab ')2 에 이어 스트렙타비딘-PE를 사용한 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석하였다. NK세포는 분류 후 > 85 % CD4CAR+ 였다.
도 16. CD4CAR NK 세포는 CD4-, CD5+ MOLT4 음성 대조군을 용해시키지 않았다. (A) MOLT4세포 면역표현형은 거의 모두가 CD4- 및 CD5+로 확인되었다. (B) CD4CAR NK세포는 벡터 대조 NK세포 종양용해 (상부 패널)와 비교하여 평가할 때, 0시간, 4시간, 8시간 및 24시간 (하단 패널)에서 5:1의 작동체 대 표적 비율로 MOLT4 세포를 용해시키지 않았다. (C) 항CD4 CDCAR NK 항종양 활성은CD4+ Karpas 299 양성 대조를 사용하여5:1의 E:T 비율로 4시간 때 확인되었다.
도 17. CD5CAR의 생성. A. CD5CAR의 DNA 유전자 구성과 번역된 단백질 구성, 그리고 고정된 CD5 scFv 항체와 CD5CAR의 생성과 기능을 보여주는 그림. 5'에서 3'까지의 제3세대 CD5CAR 구조물의 DNA 구성은 선도서열, 항CD5 세포외 ScFv (Anti-CD5 ScFv), 힌지 영역, 막통과 영역 및 이 구조물을 제3세대 CAR로 정의하는 3개의 세포내 신호전달 도메인으로 읽어진다; CD28, 4-1BB 및 CD3ζ. 고정된 CD5 ScFv 항체의 DNA 구성은 세포내 신호전달 도메인이 없는 CD5CAR 구조물과 동일하며, 고정된 CD5 ScFv 항체의 번역된 단백질 산물도 마찬가지이다. 번역된 단백질 구조물은 CD5 표적에 결합 할 항CD5 ScFv, 최적의 결합위치를 감안한 항CD5 ScFv의 적당한 위치선정을 허용하게 하는 힌지 영역, 그리고 막통과 영역을 포함한다. 완전한 CD5CAR 단백질은 또한 두개의 보조 자극 도메인과 CD3제타 사슬의 세포 내 도메인을 포함한다. 이 구조물은 제3세대 CAR: CD28, 4-1BB 및 CD3ζ로 간주된다. B. 웨스턴 블롯 분석은 HEK293 세포에서의 CD5CAR 발현을 보여준다. CD5CAR의 발현을 측정하기 위하여 CD3 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 GFP (음성 대조으로서) 또는 CD5CAR 렌티 바이러스로 48시간동안 형질도입된 HEK293 세포를 사용하였다. 왼쪽 레인, GFP 대조 HEK293 세포, 예상한대로 밴드 없음. 오른쪽 레인은 약 50kDa의 밴드를 보여주는데, 우리가 예상한 분자량은 CD5CAR 구조물을 기반으로 하였다. C. 렌티 바이러스로 형질도입된 CD5CAR T세포의 표면에서의 CD5CAR 발현에 대한 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis). 이 분석은 두번째 렌티 바이러스 형질도입 후 제8일째에 이중 형질도입된 CD5CAR T세포에 대해 실행되었다. 왼쪽: isotype control T세포 집단 (음성 대조군); 염소 항마우스 F(AB')2-PE를 사용한 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 T세포에서 20.53 %를 나타내는 CD5 CAR을 발현하는 형질도입된 T세포.
도 18. CD5CAR T세포 형질도입의 연구 개요. A. 단일 형질도입에 의한 CD5 CAR T세포의 생성 단계. B. 이중 형질도입에 의한 CD5 CAR T세포의 생성 단계. C. T세포에서의 표면 CD5 발현의 하향 조절에 있어서 CD5 CAR 렌티 바이러스를 통한 단일 및 이중 형질 도입의 비교. 렌티 바이러스 형질도입 후 8일 지나고 나서 세포외 CD5 단백질 대 GFP T세포 대조군의 하향 조절을 분석하였다. 단일 형질도입된 CD5CAR T세포는 제6일째 CD5 단백질 발현의 최대 감소와 함께 제8일째까지 세포 표면으로부터 CD5의 완전한 하향조절을 보여주지 않는다. 이중 형질도입된 집단에서, 우리는 제0일째의 24.44 %에서부터 제4일째의 CD5 발현의 거의 완전한 감소까지, 시간이 지남에 따라 CD5+, CD3+ 이중 양성 CD5CAR T세포의 절대 수 감소에 주목한다. 대조적으로, GFP T세포 대조군은 제2일째부터 제8일째까지 95 % 이상의 CD5+, CD3+ 이중 양성 집단을 유지한다.
도 19. 7일 후 고정된 CD5 ScFv 항체의 렌티 바이러스 형질도입 후의 T세포에 있어서 CD5 발현의 하향조절. A. 고정된 CD5 scFv 렌티 바이러스의 형질 도입, 단일 형질 도입을 위한 연구개요. B. 고정 된 CD5 scFv는 T 세포에서의 표면 CD5 발현 양을 하향 조절하거나 감소시킨다. CD5 scFv 단일 형질도입 그리고 7일간 인큐베이션 후 CD5 단백질 발현 (~32%)의 현저한 감소를 보여주는 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis). CD5 발현의 제거는 관찰 되었으나, 7일 후 완전히 제거되지 않았으며, 이중 형질도입된고정된 CD5 scFv 항체에 대한 후속 연구는 현재 완성되고있다.
도 20. CD5CAR 세포는 CD5를 발현하는 T-ALL 세포주를 효과적으로 용해시키고 CD5를 발현하지 않는 T 백혈병 세포주를 용해시키지 않는 다. A. T-ALL 세포주 단독 (왼쪽 열), GFP 벡터 형질도입 T세포 (가운데 행) 와의 공동배양, 그리고 CD5CAR 형질도입 T세포 (오른쪽 행) 와의 공동배양에 대한 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis). 각각의 세포주는 각 행에 보여지고 CD5+ T-ALL 세포주 (CCRF-CEM과 Molt-4)는 맨 위와 중간 행에 있고 CD5 음성 세포주 (KARPAS 299)는 하단 행에 보여진다. KAEPAS 299는 CD5 음성 T 세포 림프종이다. 전부의 공동배양의 인큐베이션 시간은24시간이고 작동체:표적세포 비는5:1이었다. GFP 대조군과 비교한CD5 T ALL 백혈병두 세포주 모두의 세포 용해는GFP 대조군에 비해78 % 이상이었다. B. 이 막대 그래프는 도 20A에서 설명된 GFP T세포 공동배양과 비교했을 때의 CD5CAR T세포에 의해 달성된 T세포 용해를 나타낸다. CD5 음성인 KARPAS 299 와 공동배양한 CD5 CAR T 세포에서 관찰된 용해는 없었다 (n=3 번의 독립적인 실험은 중복하여 행해졌 다).
도 21. CD5CAR 세포는 CD5를 발현하는 환자 표본에서 얻은 T세포 급성 림프모구백혈병 세포를 효과적으로 용해시킨다. A. T-ALL 세포 단독 (왼쪽 열), GFP T-세포 (가운데 행) 와의 공동배양, 그리고 CD5CAR T-세포 (오른쪽 행) 와의 공동배양에 대한 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis). 각각의 환자 세포에는 행이 주어지며 환자의 기밀 유지를 위해 번호가 매겨진다. 전부의 공동배양의 인규베이션 시간은 24 시간이고 작동체:표적 세포 비는 5:1이었다. GFP 대조군과 비교한 T-ALL -1의 세포 용해는 대조군에 비해 71.3 % 이상이었다. 나머지 세포주에서도 똑같은 양성 세포 용해를 보였으나 이 보다는 낮은 수준의 33-47 % 사이였다. 이것은 아래에서 논의되는 각 백혈병 샘플의 CD5 발현과 관련이 있을 가능성이 있다. B. 이 막대 그래프는 도 21A에서 설명된 GFP T세포 공동배양과 비교했을 때의 CD5CAR T세포에 의해 달성된 T세포 용해를 나타낸다. 모든 실험은 중복하여 행해졌다. C. 도 21A에서 분석된 환자 T세포 ALL 샘플의 CD3 및 CD5 발현 수준을 나타내는 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis) 데이터. 우리는 T-ALL 1과 T-ALL 3에 대한 다른 CD5양성을 관찰한다. 4 명의 환자 샘플 T-ALL 세포 집단의 패널에서의 CD5 발현 수준의 유동세포측정법 분석. 유동세포측정법 분석에 의해 평균 형광 강도 (MFI)의 차이를 측정하었다 (도 21C).
도 22. 환자 T-ALL 세포 (T-ALL-8)에 대한 CD5CAR T 세포 살상 능력 분석. 환자의 T-ALL 세포에 대한 CD5CAR T세포 살상 능력을 입증하는 유동세포측정법 분석. 대조군 GFP-T세포와 T-ALL-8 세포의 공동배양은 왼쪽에 보이고 T-ALL 8과 함께 하는 CD5CAR 공동 배양은 오른쪽에 보인다. 우리는 모든 CD5 양성 세포, CD34 양성 (적색 원으로 표시)과 CD34 음성 (녹색 원으로 표시, T 세포) 양쪽 모두의 열성적인 용해에 유의하고 CD5 음성 세포에 대해서는 용해가 보여지지 않는 것에 유의한다. GFP 대조와 비교했을 때 CD5CAR T세포는 최소 93.1% CD5 양성 T-ALL-8 세포를 용해한다. 실험은 중복하여 행해졌다. 추가적으로 CD5CAR T 세포는 본질적으로 T세포 집단 (CD5+ CD34-, 녹색 원으로 표시)을 제거한다.
도 23. CD5CAR T세포는 정상적인 GFP 표시된 T세포를 효과적으로 제거한다.
A, CD5CAR T세포는 정상 T세포를 용량에 의존적인 방식으로 죽인다. CD5CAR T 세포 또는 CD123CAR T 세포 (대조군)를 GFP 표시된 T세포와 함께 작동체 대 표적 비율 0.25:1, 0.5:1 및 1:1로 배양 하였다. 24시간 후, 남아있는 생존 GFP T세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 분석 하였다. T세포가 CD123을 발현하지 않을 때 관련있는 CD5 공동배양에서의 GFP T세포 생존을 대조군 CD123CAR T 세포에서의 GFP T세포 생존과의 비교를 통해 표적 세포의 퍼센트 살상을 측정하였다. B, 공동배양 킬링곡선은 A에서 온 데이터를 기반으로 한다.
도 24. T세포는 CD5CAR 또는 고정된 CD5 scFv T세포와 함께 배양되었을 때 CD5 발현을 유지하였다. A, CD5CAR T세포 또는 고정된 CD5 scFv T세포 그리고 CD123 CAR T세포의 생성을 위한 단계 (대조군). B, 서로 다른 CAR로 형질도입한 T세포에서의 CD5 발현 수준 (2차 형질도입 후 제3일째). 활성화된 T세포를 CD5CAR 또는 고정된 CD5 scFv 그리고 CD123CAR를 발현하는 렌티 바이러스로 형질 감염시켰다. 3 일동안 형질도입 후, CD5 발현을 유동세포측정법 (Flow cytometry)에 의해 분석하였다.
도 25. 정상 T 세포가 CD5CAR 또는 고정된 CD5 scFv T세포 또는 CD123CAR (대조군)과 함께 2일동안 (도 25A) 또는 4일동안 (도 25B) 1 : 1의 비율로 공동배양 되었을 때 CD5 발현을 유지하는지 여부를 결정하기 위해 공동배양 분석을 수행 하였다. CD5CAR T세포 또는 고정된 CD5 scFv T세포 또는 CD123CAR T세포 (대조군)를 GFP 표시된 T세포와 함께 배양하고, 그 다음에 공동배양된 GFP 표시된 T세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)에 의해 CD5 발현과 생존세포에 대해 분석하였다. C (도 25C), CD5CAR- 또는 고정 된 CD5 scFv로 형질도입한 CCRF-CEM 또는 Molt-4 T ALL 세포는 CD5 발현의 하향 조절을 나타내었다. CCRF-CEM 또는 Molt-4 T ALL 세포를 CD5CAR 또는 고정 된 CD5 scFv를 발현하는 렌티 바이러스로 형질 감염시켰다. 두번째 형질도입 후, 형질도입 된 백혈병 세포를 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 CD5 발현에 대해 분석하였다.
도 26. CD5CAR T 세포는 생체내에서 대단한 항백혈병 효과를 나타낸다. NSG 마우스를 준치사로 조사하고, 24시간 후 1 x 106 루시페레이스-발현 CCRF-CEM 세포 (제0일째)를 정맥 내 주사하여 측정 가능한 종양 형성을 유도하였다. 제3일과 4일째에 마우스에게 5 x 106 CD5CAR T 세포 또는 벡터 대조 T세포를 정맥 내 주사했다. 제6일과 7일째에 이들 주사를 반복하였고 마우스 한마리당 합계 2.0 x 107 세포가 주사되었다. A, 제5, 8, 10 및 13일째에 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하여 IVIS 영상을 시행했다. B, CD5CAR T 주사 마우스에 대해 측정 된 평균 광 강도를 벡터 대조 T 주사 마우스의 것과 비교하였다. C, 대조군과 비교하여 CD5CAR T세포로 처리한 마우스에서 죽어버린 종양 세포의 백분율. D, 제15일째에 마우스로부터 말초혈액을 채취하여 백혈병세포의 백분율을 결정하고 벡터 대조 또는 정상 주사 마우스의 것과 비교 하였다.
도 27. CD5 CAR NK세포 (NK-92)는 체외에서 효과적으로 CCRF-CEM T-ALL 세포주를 제거한다. A and B, CD5를 발현하는 T-림프모구 세포주 CCRF-CEM를 지시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 CD5 CAR NK 세포와 24시간동안 공동배양 하였다. NK-CAR 및 표적 세포 집단을 각각 분리하기 위해 CD56 및 CD5를 사용하는 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 표적 집단을 정량화 하였다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK 세포와 비례하여 표현되며, 각 막대 그래프는 N=2 중복 표본에 대한 평균 통계치를 나타낸다. C, CD5CAR NK 세포는 용량에 의존적인 방식으로 CCRF-CEM 세포를 제거한다. 감소된 E:T 비율의 하한을 가진 지시된 E:T (작동체:표적) 세포 비로 CD5를 발현하는 T-림프모구 세포주 CCRF-CEM을 CD5CAR NK 세포와 함께 공동 배양하였다. 포화는 2:1의 E:T 비율로 이루어지며 감소된 비율로 공동배양하면 용량에 의존적인 방식으로 CD5를 제거한다. CCRF-CEM의 완전한 제거는 5:1에서 달성되었다.
도 28. CD5CAR NK 세포는 두개의 CD5+ T-ALL 세포주인 MOLT-4와 Jurkat을 효과적으로 용해시킨다. A, 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 CD5CAR NK 세포를 MOLT-4 세포와 함께 24시간동안 배양하였다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK 세포와 비례하여 표현되며, 각 막대 그래프는 N=2 중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다. B, CD5CAR NK 세포를 Jurkat 세포와 함께 지시 된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 24시간동안 공동배양한다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK세포와 비례하여 표현되며, 각 막대 그래프는 N=2중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다.
도 29. CD5CAR NK 세포는 인간 샘플의 공격적인 CD5+ T-ALL 세포를 효과적으로 제거한다. A, 환자의 T-ALL 세포, T-ALL # 1을 CD5CAR NK 세포와 함께 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 24시간동안 배양하였다. B, 환자의 T-ALL 세포, T-ALL # 2를 CD5CAR NK 세포와 함께 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 24 시간 동안 공동 배양 하였다. T-ALL 환자 샘플을 가리기 위해 세포 cytotracker염료 (CMTMR)를 사용한 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 표적 집단을 게이팅하고 정량화하였다. 데이터는 중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다. 표적 CD5+ CD34+ 세포 집단은 동형 (isotype) 대조군에 대비해 게이팅하였다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK세포 및 각 막대 그래프에 비례하여 표현된다. 왼쪽에서부터 오른쪽까지, 막대 그래프는 각 비율에서의 왼쪽에 있는 CD34+ CD5+ 및 오른쪽에 있는 CD5+ CD34-에 대한 데이터를 보여준다. CD5CAR NK는 저 CD5+ CD34+ 잠재적 종양 줄기세포 집단에 대비해CD5+를 발현하고 고도로 활성을 가진표적 집단에 대한 거의 완전한 용해를 보여준다. 포화는 2:1의 비율로 달성되는 데, 이것은 E:T 비율의 희석 필요성을 의미하고 있다. 도 29c 및 도 29d에 나타낸 바와 같이, 환자 #3 (PTCLs) 및 환자 #4 (Sezary 증후군)에서 유래한 백혈병 세포를 각각 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 24시간동안 CD5CAR NK 세포와 함께 공동배양하였다.
도 30. CD5NK-CAR은 특히 제대혈 T세포를 제거한다T 세포를 제대혈 (UCB) T세포로부터 분리하고 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 24 시간 동안 CD5CAR NK 세포와 함께 공동 배양한다. NK-CAR 및 T세포 집단을 각각 분리하기 위해 CD56 및 CD5를 사용하는 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 표적 집단을 정량화하였다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK세포와 비례하여 표현되며 각 막대 그래프는 중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다.
도 31. CD5CAR NK 세포는 CD5+ 외투세포림프종 및 만성림프구성백혈병을 효과적으로 제거한다. CD5CAR NK 세포는 Jeko 세포 (도 31A) 그리고 외투세포림프종 (도 31B)과 만성림프구성백혈병 환자 (도 31C)의 백혈병 세포와 함께 배양되었다. CD5의 주요 부분집합을 발현하는 외투세포주 림프종에서 파생된 세포주 JeKo를 CD5CAR NK 세포와 함께 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 6시간동안 공동배양하였다. 외투세포림프종 또는 CLL의 경우, 24시간동안 공동배양을 실시하였다. 표적 집단은 도에 설명 된대로 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 게이팅되고 정량화되었다. CD5CAR NK세포는 CD5+ CD19+ 백혈병 집단과 CD5+ CD19- T세포 집단을 특별히 표적으로 한다. 세포 생존은 형질도입된 벡터 대조군 NK 세포와 비례하여 표현되며 각 막대 그래프는 중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다.
도 32. CD5CAR NK세포의 공동배양 연구를 요약한 막대기 그래프.
도 33. CD5CAR NK세포는 생체내에서 강력한 항백혈병 효과를 나타낸다. NSG 마우스를 준치사적으로 조사하였고, 24시간 후 1 x 106 루시페레이스- 발현하는 CCRF-CEM 세포 (제0일째)를 정맥 내 주사하여 측정 가능한 종양 형성을 유도하였다. 제3일 및 4일째에, 마우스에게 5 x 106 CD5CAR NK 세포 또는 벡터 대조 NK 세포를 정맥 내 주사 하였다. 이들 주사를 제6일과 7일째에 반복하고 마우스 한마리당 합계 2.0 x 107 세포를 주사하였다. A, 5 일째에 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하여 IVIS 영상을 얻었다. B, CD5CAR NK 세포로 처리한 마우스에서 종양세포가 대조군에 비해 죽은 백분율.
도 34. CD3CAR의 구성과 표현. A, 렌티 바이러스 벡터에 있어서 CD3CAR의 구성의 도식적 표현. CAR 발현은 SFFV (비장 포커스 형성 바이러스) 프로모터에 의해 구동되고 제3세대 구조물로서, 선도서열, 항CD3scFv, 힌지도메인 (H), 막통과 도메인 (TM), 두개의 보조자극 도메인 CD28 및 4-BB, 그리고 세포내 신호전달 도메인 CD3제타를 포함한다. B, HEK-293FT 세포를 형질도입 48시간 후의 웨스턴 블롯 분석을 위한 GFP (레인 1) 및 CD3CAR (레인 2) 렌티 바이러스 플라스미드로 형질도입하고 마우스 항인간 CD3제타 항체로 검증하였다.
도 35. CD3CAR NK 세포는 시험관내에서 CD3 발현하는 T-ALL 세포주를 제거한다. A, 약 80% CD3을 발현하는 T-림프모구 세포주 Jurkat를 CD3CAR NK세포와 함께 E:T (작동체: 표적) 세포 비율로 6시간 동안 공동배양하였다. B, 분류된 (CCRF-CD3) 또는 분류되지 않은 CCRF-CEM 세포를 CD3CAR NK세포와 함께 24시간 동안 공동배양하였다. NK-CAR 과 표적 세포 집단을 각각 분리하기 위해 CD56 및 CD3을 사용하는 유동세포측정법 (Flow cytometry)으로 표적 집단을 정량화하였다. 세포 생존은 형질도입 된 벡터 대조군 NK세포와 비례하여 표현되며, 각 막대 그래프는 N=2중복 샘플의 평균 통계치를 나타낸다.
도 36. CD3CAR NK세포는 환자 샘플에서 유래한 원발성 CD3+ 백혈병 세포에 대한 강력한 살상능력을 나타낸다. A. SPT-1 (Sezary 증후군) 환자 세포는 CD3 양성이었고 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비율로 CD3CAR NK 세포와 함께 24 시간 동안 배양되었다. NK-CAR세포와 표적세포 집단을 각각 분리하기 위해 CD56 및 CD3을 사용하는 유동세포측정법으로 표적 집단을 정량화하였다. SPT-1이 이종 세포 집단이지만, 광범위한 CD3+를 발현하는 집단은 CD3NK-CAR에 의해 제거된다. B, PT4 (분류되지 않은 PTCLs) 환자 세포는 CD3+ CD7-이며, 표시된 E:T (작동체:표적) 세포 비로 24시간동안 CD3CAR NK세포와 함께 배양되었다. 표적 집단은 도에서 보여진 대로 게이팅하고 정량화했다. PT4 백혈병세포는 CD3+CD7- 형이며 CD3CAR NK 세포에 의해 효과적으로 제거된다. 광범위한 CD3 + 집단은 또한 CD3CAR NK 세포에 의해서 영향을 받는다.
도 37. CD3CAR NK 세포는 예상대로 정상 T세포를 용해시킬 수있다. 정상 T세포를 제대혈로부터 분리하고 GFP를 발현하는 렌티 바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입된 GFP T세포를 사용하여 CD3CAR NK 세포와 공동배양하였다. 공동배양 조건은 2.5% 혈청을 함유 한 NK세포 배지에서 실행하였다. 공동배양을 24 시간 동안 인큐베이션하고 유동세포측정 분석 (Flow cytometry analysis)을 위해 분류하였다. CD3CAR NK세포가 표적 T세포를 용해시키는 능력은 공동배양 후 잔류 CD3+ GFP T 세포의 양을 비교하는 것에 의하여 평가되었다. 중요한 것으로는, 인큐베이션 기간이 증가함에 따라, 표적 CD3+ GFP T세포는 작동체 대 표적 세포 비율 5:1의 투여량에서 80 % 이상의 효율로 용해되는 것으로 나타났다.
도 38. CD3CAR NK 세포는 생체내에서 대단한 항백혈병 효과를 보여준다. A, NSG 마우스를 준치사적으로 조사하였고, 24시간 후 1 x 106 루시페레이스- 발현하는 Jurkat 세포 (제0일째)를 정맥내 주사하여 측정 가능한 종양 형성을 유도하였다. 제3일 및 4일째에, 마우스에게 5 x 106 CD3CAR NK 세포 또는 벡터 대조 NK 세포를 매일 정맥 내 주사 하였다. 이들 주사를 제6일과 7일째에 반복하고 제10일째에 다시 한번 반복하고 마우스 한마리당 합계 2.5 x 107 세포를 주사하였다. (A) 제4일, 7일, 9일 및 13일째에 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하여 IVIS 영상을 얻었다. B, CD3CAR NK가 주사된 마우스에 대해 측정한 평균 광 강도를 벡터 대조 NK세포가 주사된 마우스의 것과 비교 하였다. C, CD3CAR NK 세포로 처리한 마우스에서 종양세포가 대조군에 비해 죽은 백분율.
도 39. T세포 림프종 또는 T세포 백혈병을 표적으로하는 CAR T 또는 NK세포의 생성 단계.
도 40. CD2, CD3, CD5 및 CD7을 표적으로 하기 위해 유전자 당 3쌍의 sgRNA를 CHOPCHOP로 디자인한다. 관심있는 유전자를 표적으로 하기 위해 3쌍의 sgRNA를 CHOPCHOP로 디자인하였다. 이어서 유전자 특정적인 sgRNA를 인간 Cas9를 발현하는 렌티 바이러스 벡터 (Lenti U6-sgRNA-SFFV-Cas9-puro-wpre) 및 E2A 자가절단 링커와 연결된 퓨로 마이신 내성 유전자에 클로닝 하였다. U6-sgRNA 카세트는 Cas9 요소 앞에 있다. sgRNA 및 Cas9puro의 발현은 각각 U6 프로모터 및 SFFV 프로모터에 의해 구동된다.
도 41. CRISPR/Cas9 렌티 바이러스 시스템을 사용한 안정된 CD5-결핍 CCRF-CEM 및 MOLT-4 T세포의 생성. A. 퓨로마이신 (puromycin) 선택 후의 두개 서로 다른 sgRNAs, Lenti-U6-sgCD5a-SFFV-Cas9puro (sgCD5A) 및 Lenti-U6-sgCD5b-SFFV-Cas9puro (sgCD5B)를 사용하여 CRISPR / Cas9 KD를 통해 CCRF-CEM T세포에서 CD5 발현의 손실을 입증하는 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis). 와일드 타입 컨트롤은 가장 왼쪽 산점도 (scatter plot)에서 보인다. sgRNA CD5A를 갖는 CRISPR / Cas9 KD 기술이 CD5 단백질 하향 조절에서 보다 성공적 이었기 때문에,이 집단 (파란색 원 및 화살표로 표시됨)은 도 41B에서의 선별, 정제 및 분석을 위해 선택되었다. B. 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis) 데이터는 scCD5A CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 형질도입된 완전히 정렬된 안정된 CD5 음성 CCRF-CEM 세포의 백분율을 가리킨다. 우리는CCRF sgCD5A T 세포에서CD45 양성, CD5 음성 세포가 > 99% 임을 주목했다. C. 퓨로마이신 (puromycin) 처리 후의 2 개의 다른 sgRNA 서열 (서열 CD5A 및 CD5B, 중간 및 오른쪽 컬럼)을 사용하는 CRISPR / Cas9 KD로 MOLT-4 T 세포에서의 CD5 발현의 손실을 입증하는 유동세포측정법 분석. 와일드 타입 컨트롤은 가장 왼쪽 산점도 (scatter plot)에서 보인다. 프라이머 CD5A를 갖는 CRISPR / Cas9 KD 기술이 CD5 단백질 하향조절에서보다 성공적 이었기 때문에, 이 집단 (파란색 원 및 화살표로 표시됨)은 도 4D에서의 선별, 정제 및 분석을 위해 선택되었다. D. 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis) 데이터는 scCD5A CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 형질도입된 완전히 정렬된 안정된 CD5 음성 MOLT-4 세포의 백분율을 가리킨다. 우리는MOLT-4 sgCD5A T세포에서CD45 양성, CD5 음성 세포 > 99 % 임을 특별히 언급한다.
도 42. CRISPR / Cas9 렌티 바이러스 시스템을 사용한 CCRF-CEM 세포 또는 NK-92 세포에서의 안정된 CD7 손실의 생성 및 세포 분류. sgCD7A (Lenti-U6-sgCD7a-SFFV-Cas9-puro) 및 sgCD7B (Lenti-U6-sgCD7b-SFFV-Cas9-puro)를 사용한 CCRF-CEM (도 42A 및 B) 또는 NK-92 (도 42C 및 D) 에서의 CD7 손실의 백분율은 퓨로마이신 (puromycin) 처리 후의 CD45 와 CD7 항체를 통한 유동세포측정법 분석 (Flow cytometry analysis)에 의해 결정되었다. 도에서의 삽입 값은 분석 중의 양성 및 음성 발현 CD45 또는 CD7의 백분율을 보여주었다. 우측 패널은 sgCD7A 또는 sgCD7D CRISPR 렌티 바이러스를 사용하여 형질도입된된 CD7 음성 세포로부터 제조된 CCRF-CEM (B) 또는 NK-92 세포 (D)에서의 선별된 안정된 CD7 음성 세포의 백분율 순도를 가리켰다.
도 43. CD7CAR NK 7--92 세포는 CD7을 발현하는 T세포 ALL 세포주 T세포를 효과적으로 용해한다. 자가 살생을 피하기 위해, CD7이 결핍된 NK-92 (NK 7-92) 세포를 생성하고 CD7CAR로 형질도입하였다. CD7CAR NK 7--92 세포의 두 가지 형질도입된 제제 인 #A와 #B를 사용하여 그들의 살상능력을 시험했다. A, CCRF-CEM 세포 단독 (왼쪽 칼럼), GFP NK 7- -92 세포 (가운데 칼럼)와의 공동배양, 그리고 CD7CAR-NK-92-세포, #A 및 B#와의 공동배양 (오른쪽 칼럼) 에 대한 유동세포측정법 분석. B, 막대 그래프는 A.에서 얻은 데이터를 기반으로 했다.
도 44. CD3 다중 단백질 복합체. CD3는 단백질 복합체를 포함하고 위의 도에서 설명한대로 4 개의 별개의 사슬로 구성된다. 복합체는 CD3δ 사슬, CD3γ 사슬 및 2 개의 CD3ε 사슬을 포함한다. 이들 사슬은 αβ 사슬을 구성하는 T세포 수용체 (TCR)와 연관된다.
본 공개는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 조성물, 이의 방법 및 제조, 그리고 CAR 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
조성물
키메라 항원 수용체 폴리펩타이드
하나의 실시양태에서, 본 공개는 신호펩타이드, 항원 인식 도메인, 힌지 영역, 막통과 도메인, 최소 하나 이상의 보조 자극 도메인, 그리고 신호전달 도메인을 가지는 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리 펩타이드를 제공한다.
여기에서 사용 된 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드"및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 화합물을 가리킨다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2 개의 아미노산을 포함해야하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함 할 수있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 2 개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 여기서 사용 된 용어는 두가지 사슬을 모두 가리키며, 짧은 사슬은 또한 통상 당 업계에서의 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머를 예를 들어 지칭되며 더 긴 사슬에 대해서는 일반적으로 당 업계에서의 단백질로 지칭되는 데 많은 종류가 거기에 속한다. "폴리펩타이드"는 예를 들어 생물학적으로 활성 단편, 실질적으로 동종의 폴리 펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이합체, 이질이합체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합단백질, 등을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
"신호 펩타이드"는 펩타이드 서열을 포함하는 데 그것은 펩타이드 그리고 임의의 세포 내, 예를 들어 특정 세포소기관 (세포질그물과 같은) 및/또는 세포 표면에 부착된 폴리 펩타이드의 수송과 위치선정을 지시한다.
신호 펩타이드는 임의의 분비된 또는 막통과 단백질의 일종 펩타이드인데 그것은 본 공개의 폴리 펩타이드의 세포막 및 세포 표면으로의 수송을 지시하고, 본 공개의 폴리펩타이드의 정확한 위치선정을 제공한다. 특히, 본 공개의 신호 펩타이드는 본 공개의 폴리펩타이드를 세포막에 지시시키고 그 점에서 폴리펩타이드의 세포 외 부분이 세포 표면 상에 표시되고, 막통과 부분이 원형질 막에 걸쳐 있고, 활성 도메인이 세포질 부분 , 또는 세포의 내부에 있다.
하나의 실시양태에서, 신호 펩타이드는 세포질그물 (ER)를 통과 한 후에 절단되여, 즉 절단 가능한 신호 펩타이드이다. 한 실시양태에서, 신호 펩타이드는 유형 I, II, III 또는 IV의 인간 단백질이다. 한 실시양태에서, 신호 펩타이드는 면역글로불린 중쇄 신호 펩타이드를 포함한다.
"항원 인식 도메인"은 표적의 항원, 수용체, 펩타이드 리간드 또는 단백질 리간드에 대해 선택적인 폴리펩타이드; 또는 표적의 폴리 펩타이드를 포함한다.
표적 특이적 항원 인식 도메인은 표적 항원에 대한 항체 또는 표적 항원에 결합하는 펩타이드 또는 표적 항원에 결합하는 항체에 결합하는 펩타이드 또는 단백질 또는 표적의 수용체에 결합하는 펩타이드 또는 단백질 리간드 (성장 인자, 사이토 카인 또는 호르몬을 포함 하나 이에 한정되지 않음)로부터 유래된 항원 결합 도메인 또는 표적의 펩타이드 또는 단백질 리간드에 결합하는 수용체 (성장 인자 수용체, 사이토 카인 수용체 또는 호르몬 수용체)로부터 유래된 도메인을 가급적 포함한다. 표적에는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52의 임의의 부분을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 표적은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 폴리 펩타이드의 표면 노출된 부분을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 표적은 CD2 (SEQ ID NO. 19)의 세포외 도메인 이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD3 엡실론사슬 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 20)이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD4 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 21)이다. 다른 실시양태에서, 표적은 CD5 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 22)이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD7 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 23)이다.또 다른 실시양태에서, 표적은 CD8 알파사슬 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 24)이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD8 베타 사슬 세포 외 도메인 (SEQ ID NO. 25)이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 CD52 CAMPATH-1 항원(SEQ ID NO. 26)이다.
하나의 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 표적 상대로 (선택적으로) 지시 된 단클론 항체 또는 다클론 항체의 결합 부분 또는 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 단편 항원 결합 단편 (Fab)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFV)을 포함한다. scFV는 짧은 링커펩타이드와 연결된 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다.
또 다른 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 카멜리드 (Camelid) 단일 도메인 항체 또는 이의 일부를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 카멜리드 (Camelid) 단일 도메인 항체는 낙타과 동물에서 발견되는 중쇄 항체 또는 VHH 항체를 포함한다. 카멜리드 (Camelid) (예 : 낙타, 단봉낙타, 라마 및 알파카) 의 VHH 항체 는 카멜리드 (Camelid) 단일사슬 항체의 가변단편을 지칭하며 (Nguyen et al, 2001; Muyldermans, 2001 참조), 또한 카멜리드 (Camelid)의 분리된 VHH 항체 , 카멜리드 (Camelid) 의 재조합 VHH 항체, 또는 카멜리드 (Camelid) 의 합성 VHH 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항원인식 도메인은 그들의 동족 수용체와 결합하는 리간드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항원인식 도메인은 인간화된다.
항원 인식 도메인은 그의 서열 내에 약간의 가변성을 포함 할 수 있으며, 여기서 공개된 표적에 대해 여전히 선택적이다는 것으로 이해된다. 따라서, 항원인식 도메인의 폴리펩타이드가 여기서 공개된 항원 인식 도메인 폴리펩타이드와 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80%, 또는 적어도 70% 동일 할 수 있으며, 여기서 설명된 표적에 대해 여전히 선택적이다는 것이 예상되며 이는 본 공개의 범위 내에있다.
또 다른 실시양태에서, 항원인식 도메인은 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24 또는 SEQ ID NO. 25 또는 SEQ ID NO. 26 에 대해 선택적이다.
힌지 영역은 예를 들어, 키메라 항원 수용체 그리고 적어도 하나의 보조 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 사이에 위치한 서열이다. 힌지 서열은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어 질 수있다. 이러한 힌지 영역은 당 업계에 공지되어있다. 하나의 실시양태에서, 힌지영역은 CD-8 알파, CD28, 4-1BB, OX40, CD3-제타, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 그리고 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서 힌지영역은 CD8 힌지 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
막통과 도메인은 세포막에 걸친 소수성 폴리펩타이드를 포함한다. 특히, 막통과 도메인은 세포막의 한면 (세포 외)에서 세포막의 다른면 (세포 내 또는 세포질)을 통하여 걸쳐있다.
막통과 도메인은 알파 나선 또는 베타 배럴, 또는 이들의 조합의 형태 일 수있다. 막통과 도메인은 다수의 막통과 조각, 각 알파-나선형, 베타 시트, 또는 이들의 조합을 갖는 다원 단백질을 포함 할 수있다.
하나의 실시양태에서, CAR에서의 도메인 중 하나와 자연적으로 관련되는 막통과 도메인이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막통과 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 피하기 위해 막통과 도메인은 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형 될 수있다.
예를 들어, 막통과 도메인은 T세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 및 이들의 조합 물의 막통과 모메인을 포함한다.
예를 들어, 인공적으로 설계된 막통과 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하는 폴리펩타이드이다. 하나의 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막 변이 도메인의 각 말단에서 발견된다.
하나의 실시양태에서, 막통과 도메인은 CD8 막통과 도메인이다. 또 다른 실시 양태에서, 막통과 도메인은 CD28 막통과 도메인이다. 이러한 막 횡단 도메인은 당 업계에 공지되어있다.
신호전달 도메인 및 보조자극 도메인은 면역세포 신호전달 경로의 적어도 일부 면을 자극 또는 활성화시키기 위해 면역세포의 활성화를 제공하는 폴리 펩타이드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 및 이들의 조합 물의 기능 신호전달 도메인의 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 신호전달 도메인은 당 업계에 공지되어있다.
하나의 실시양태에서, CAR 폴리펩타이드는 하나이상의 보조자극 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 보조 자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C), 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D), B7-H3, CD83, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS 및 4-1BB (CD137)에 결합하는 리간드, 이들의 활성 단편, 이들의 기능 유도체, 및 이들의 조합을 포함하는 단백질로부터 유래한 기능 신호전달 도메인이다.
하나의 실시양태에서 CAR 폴리펩타이드는 CD2CAR이고, SEQ ID NO. 10 또는 SEQ ID NO. 11 을 포함한다. 하나의 실시양태에서, CAR 폴리펩타이드는 CD3CAR이고, SEQ ID NO. 12를 포함한다. 하나의 실시양태에서, CAR 폴리펩타이드는 CD4CAR이고, SEQ ID NO. 13 또는 SEQ ID NO. 14를 포함한다. 하나의 실시양태에서, CAR 폴리 펩타이드는 CD5CAR이고, SEQ ID NO. 15를 포함한다.하나의 실시양태에서, CAR 폴리펩타이드는 CD7CAR이고, SEQ ID NO. 17을 포함한다.하나의 실시양태에서, CAR 폴리 펩타이드는 CD52CAR이고, SEQ ID NO. 18을 포함한다.
키메라 항원 수용체를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드
본 공개는 상기 기술된 키메라 항원 수용체 폴리 펩타이드를 부호화하는 폴리 뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. CAR을 부호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 임의의 재래적인 방법에 의해 특정된 CAR의 아미노산 서열로부터 용이하게 제조된다. 아미노산 서열을 부호화하는 염기 서열은 앞서 말한 NCBI RefSeq ID 또는 GenBenk의 가입 번호로부터 각 도메인의 아미노산 서열에 대해 얻을 수 있으며, 본 공개의 핵산은 표준 분자 생물학적 및/또는 화학적 절차를 사용하여 제작될수 있다. 예를 들어, 염기 서열에 기초한 폴리 뉴클레오타이드는 합성 될 수 있고, 중합효소연쇄반응 (PCR)을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 얻은 DNA 단편을 조합하는 것을 통해 본 공개의 폴리뉴클레오타이드를 제조 할 수있다.
하나의 실시양태에서, 여기서 공개된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 발현 또는 클로닝 카세트의 일부이다.
여기서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드의 사슬로서 정의된다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 여기서 사용된 핵산 및 폴리 누클레오티드는 상호 교환 가능하다. 당 업계의 기술자는 핵산이 폴리뉴클레오타이드이고 이것이 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수 분해될 수있다는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수 분해 될 수있다. 여기서 사용 된 폴리뉴클레오타이드는 제한없는 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포유전체로부터의 핵산 서열 클로닝을 포함하는 당 업계에서 이용 가능한 임의의 수단 그리고 합성 수단에 의해 획득된 모든 핵산 서열을 포함 하나 그것에 국한되는 것이 아니다.
하나의 실시양태에서, 폴리 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 2 의 CD2CAR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시 양태에서, 폴리 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 3의 CD3CAR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 5의 CD4CAR 폴리 뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 6의 CD5CAR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 폴리 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 8의 CD7CAR 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 폴리 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO. 9의 CD52CAR 폴리 뉴클레오타이드를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 벡터
상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 클로닝 될 수있다. "벡터"는 격리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 격리된 폴리뉴클레오타이드를 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리 누클레오타이드, 플라스미드, 파지미드, 코스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 벡터가 당 업계에 공지되어 있다. 바이러스는 파지, 파지 유도체를 포함한다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 핵산의 세포로의 전달을 용이하게하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 해석되어야한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노 바이러스벡터, 아데노-관련 바이러스벡터, 레트로 바이러스벡터, 렌티 바이러스벡터 등을 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 통합 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 벡터는 바이러스벡터이다. 하나의 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로 바이러스벡터 또는 렌티 바이러스벡터이다. 하나의 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위해 바이러스로 형질도입된다.
많은 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포로 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어 레트로 바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공하다. 선택된 유전자는 당업계에 공지 된 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로 바이러스 입자로 포장 될 수있다. 이어서, 재조합 바이러스를 분리하여 생체 내 또는 생체 외에서 대상 세포로 전달할 수있다. 다수의 레트로 바이러스 시스템이 당 업계에 공지되어있다. 일부 실시양태에서, 아데노 바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노 바이러스 벡터가 당 업계에 공지되어있다. 하나의 실시양태에서, 렌티 바이러스 벡터가 사용된다.
바이러스 벡터 기술은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등 (2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 그리고 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티 바이러스를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 효소 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 표지자를 포함한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058 및 US, Pat. No. 6,326,193).
키메라 항원 수용체 폴리뉴클레오타이드의 발현은 예를 들어, 적어도 SFFV 또는 인간연장 인자 11α (EF) 프로모터, CAG (CMV 증강인자를 갖는 닭 베타-액틴 프로모터) 프로모터, 인간 연장인자 1α (EF) 프로모터 중에서 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는 표현 벡터를 사용하여 완성된다. 이용된 덜 강하게 /더 낮게 발현하는 프로모터의 예는 시미안 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 프로모터, 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터 및 포스포글리세레이트키나제1 (PGK) 프로모터 또는 그 일부를 포함하나 이에 한정되지 않는 다. 키메라 항원 수용체의 유도성 발현은 예를 들어 TRE3GV (모든 세대 및 되도록 제3세대를 포함하는 Tet- 반응 요소), 유도성 프로모터 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA), 또는 그 일부 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 테트라사이클린 반응 프로모터를 사용하여 달성 될 수있다.
적합한 프로모터의 한 예는 극초기 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수있는 강한 구성성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 성장 인자 -1a (EF-1a) 이다. 예컨대 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴키나아제 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 유전자 프로모터 뿐만 아니라 시미언 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스 (MMTV), 인간면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인 - 바르 (Epstein-Barr ) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이 한정되지 않는 다른 구성성 프로모터 서열이 사용될수 있다. 더 나아가, 본 공개는 구성성 프로모터의 사용에 제한되어서는 안되며, 유도성 프로모터 또한 본 공개의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 그러한 발현이 요구 될 때 작동 가능하게 연결된 폴리 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수있는 분자 스위치를 제공하거나, 발현이 바람직하지 않을 때 발현을 차단할 수있다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오네인 (metalothionine) 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"발현 벡터"는 발현되여야 하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하는 데 발현을위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험 관내 발현 시스템에 의해 공급 될 수있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 통합하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 리포솜에 누출되거나 포함 된) 그리고 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 당 업계에서 공지 된 모든 것들을 포함한다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 증강인자 (enhancer)는 전사개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 비록 최근에 다수 프로모터가 개시 사이트의 하류에 기능적 요소를 포함하는 것도 보여주지만 이들은 개시 사이트의 상류 30-100 bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 융통성을 가지므로, 다른 것과 비례하여 요소가 반전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존되고 티미딘키나아제 (tk) 프로모터에 있어서 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 떨어지기 시작되기 전에 50 bp 간격까지 증가 될 수있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력 적으로 또는 독립적으로 작용할 수있는 것으로 보인다.
CAR 폴리펩타이드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 또는 감염되기를 원하는 경우의 세포집단으로부터의 발현 세포의 동정 및 선택을 용이하게 하기 위하여 선택가능한 표지자 유전자 또는 정보제공유전자 또는 둘 다를 포함하며 다른 면에서 선택 가능한 표지자는 DNA의 갈라진 조각에 적재되어 공동형질감염 절차에 사용될수 있다. 선택가능한 표지자 및 정보제공유전자 모두는 숙주 세포에서 발현할 수 있도록 적절한 조절 서열과 옆쪽에 같이 있을 수 있다. 유용한 선택가능한 표지자는 예를 들어 네오 (neo) 등의 항생제 내성 유전자를 포함한다.
정보제공 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 정보제공전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 발현되지 않고 일부 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 나타나게 되는 발현을 가지는 폴리 펩타이드를 코딩하는 유전자이다. 정보제공 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포에 도입 된 후 적당한 시간에 분석된다. 적합한 정보제공 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시데이스, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 인산분해효소 또는 녹색 형광 단백질 유전자 (예를 들어, Ui-Tei 등, 2000 FEBS Letters 479 : 79-82)를 부호화하는 유전자를 포함 할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 잘 공지되어 있고 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 획득될 수있다. 일반적으로, 정보제공 유전자의 최고 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 구성물이 프로모터로 확인된다. 그러한 프로모터 영역은 정보제공 유전자에 연결될 수 있으며, 프로모터 - 주도 전사를 조절하는 능력을 가진 제제를 평가하는데 사용될 수있다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 당 업계에 공지되어있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어, 포유류, 세균, 효모 또는 곤충 세포 내로 당 업계의 임의의 방법으로 용이하게 도입 될 수있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달 될 수있다.
폴리 뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입시키는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세 주사, 전기 천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 공지되어있다. 예를 들어 보면, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 이다. 폴리 뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입시키기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
해당 폴리 뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로 바이러스 벡터는 인간 세포와 같은 포유류 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티 바이러스, 폭스 바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노 바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래 될 수있다. 예를 들어 보면, 미국 U.S. Pat, Nos. 5,350,674 및 5,585,362 이다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기위한 화학적 수단은 거대분자복합체, 나노 캡슐, 미소구, 비드 및 수중유 유탁액, 미포, 혼합 된 미포 및 리포솜을 포함하는 지질기재 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템을 포함한다. 시험 관 내 및 생체 내 전달 운반체로 사용하기위한 모범적인 콜로이드 시스텀은 리포솜 (예를 들어, 인공막 소포) 이다. 비바이러스성 전달시스템이 사용되는 경우, 모범적인 전달 운반체는 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)에 대해 고려된다. 다른 측면에서, 핵산은 지질과 결합 할 수있다. 지질과 관련된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화 되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되고 리포솜 및 올리고 뉴클레오타이드 둘 다와 결합 된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고 리포솜에 포획 되고 리포솜과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고 지질과 혼합되고 지질과 결합되고 지질 중 현탁액으로서 함유되고 미포과 함께 함유되거나 복합체화되고 또는 그렇지 않으면 지질과 결합 될 수있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터와 관련된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그들은 미포처럼 이중층 구조, 또는 "접어진"구조로 존재할 수있다. 그것들은 또한 어쩌면 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성하면서 단순히 용액에 흩어져있을 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질 일 수있는 지방성 물질이다. 예를 들어, 지질은 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물의 종류뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 방울을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 출처에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO에서 얻을 수있다; 디세틸 포스페이트 ( "DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)에서 얻을 수있다; 콜레스테롤 ( "Choi")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수있다; dimyristyi phosphatidylglycerol ( "DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL) 에서 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에 있는 지질의 원액은 약 -20°C에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발되므로 유일한 용매로 사용된다.
"리포솜"은 밀폐 된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 단일 및 다 층 지질 운반체의 다양한 것을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특징 될 수있다. 다층 리포좀은 수성 매질로 분리 된 다수의 지질 층을 갖는다. 인지질이 과량의 수용액에 부유 할 때 그들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 된 구조가 형성되기 전에 자가 재 배열을 진행하고 지질 이중층 사이에 물과 용해 된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 19 1 Glycobiology 5; 505- 10). 그러나, 정상적인 소낭 구조보다 용액에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미포 구조를 취하거나 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수있다. 또한, 고련된 것은 lipofectamine - 핵산 복합체다.
외인성 폴리 뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하거나 또는 본 공개의 폴리 뉴클레오타이드에 세포를 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서의 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행 할 수있다. 이러한 검정법은 예를 들어, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업계 기술자에 공지 된 "분자 생물학적"검정; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯), 또는 본 공개 범위 내에 있는 물질을 확인 하기 위한 본 공개에서 기술된 분석에 의해 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적"검정을 포함한다.
공학적으로 처리된 세포
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 상기 기술된 키메라항원 수용체 폴리 펩타이드 또는이를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
"공학적으로 처리된 세포"란 유전자, DNA 또는 RNA 서열 또는 단백질 또는 폴리 펩타이드의 첨가 또는 변형에 의해 변형, 형질전환 또는 조작 된 임의의 유기체의 세포를 의미한다. 본 공개의 분리된 세포, 숙주 세포 및 유전적으로 처리된 세포는 키메라 항원 수용체 또는 키메라항원 수용체 복합체를 부호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 NK세포 및 T세포와 같은 분리된 면역 세포를 포함하고, 세포 표면에서의 키메라 수용체를 표현한다. 분리된 숙주 세포 및 공학적으로 처리된 세포는 예를 들어 NK 세포 활성 또는 T 림프구 활성, 암 치료 및 감염병 치료를 위해 사용될 수있다.
여기서 공개된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 세포막 내로 발현 및/또는 통합 할 수있는 임의의 세포를 사용할 수있다.
하나의 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 면역조절 세포를 포함한다. 면역 조절 세포에는 CD4 T세포 (헬퍼 T세포), CD8 T세포 (세포독성 T세포, CTLs), 그리고 기억 T세포 또는 기억줄기세포 T세포와 같은 T세포가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, T세포는 자연살해 T세포 (NK T세포)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 자연살해 세포를 포함한다. 자연살해 세포는 당 업계에 잘 알려져있다. 한 실시 양태에서, 자연살해 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주를 포함한다. NK 세포주의 다른 예는 NKG, YT, NK-YS, HANK-1, YTS 세포 및 NKL 세포를 포함한다.
NK 세포는 GvHD의 위험없이 항종양 효과를 중개하고 T 세포와 비교하여 수명이 짧다. 그래서 암세포를 파괴 한 직후 NK세포가 소진되어 변형된 세포를 제거 할 수있는 CAR 구조물 상의 유도가능한 자살 유전자에 대한 수요를 감소시킬 것이다.
공학적으로 처리된 세포가 CD2CAR, CD3CAR, CD4CAR, CD5CAR, CD7CAR, CD8CAR 및 CD52CAR 중 적어도 2 개를 포함하는 실시 양태가 고려되었다. 예를 들어, 공학적으로 처리된 세포는 CD4 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 (CD4CAR) 및 CD5 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 (CD5CAR)를 포함 할 수있다..
여기에 사용 된 바와 같이, CDXCAR은 CDX 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체를 지칭한다. 여기에 사용 된 바와 같이 CDX는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 중 어느 하나 일 수있다.
CAR을 운반하는 데 사용 된 TCR 결핍 T 세포
하나의 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포, 특히 제공자로부터 획득 된 동종 이형 T세포는 MHC 인식에 관여하는 TCR (T 세포 수용체)의 성분을 불활성화하도록 변형될 수있다. 결과적으로, TCR 결핍 T세포는 이식편 대 숙주질환 (GVHD)을 유발하지 않을 것이다.
T 항원 결핍 T 세포 및 NK 세포
T세포 림프종 또는 T세포 백혈병은 이러한 질병에 대한 유용한 표적이 될 수있는 특정 항원을 발현한다. 예를 들어, T 세포 림프종 또는 백혈병은 CD7, CD2, CD3 및 CD5를 발현한다. 그러나 CD7, CD2, CD3 및 CD5는 또한 CAR T 또는 NK 세포 (CD3 및 CD5는 제외)에서 발현되어 이들 항원을 표적화하는 능력을 상쇄한다. 자가살상은 이들 항원 중 어느 하나를 표적으로하는 CAR로 무장한 T세포 또는 NK세포에서 일어날 수있다. 이것은 이러한 항원을 표적으로하는 CAR의 생성을 어렵게 만든다. 그러므로 T 또는 NK 세포가 CAR을 발현시키는 표적으로 사용될 때 T 또는 NK세포에서의 내인성 항원을 불활성화시킬 필요가있을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포가 다른 공학적으로 처리된 세포에 작용하는 것을 방지하기 위해 세포 표면 폴리펩타이드를 불활성화하도록 공학적으로 처리된 세포를 추가로 변형시킨다. 예를 들어, 공학적으로 처리된 세포의 하나 또는 그 이상의 내인성 CD2, CD3, CD4, CD5 및 CD7 유전자가 녹아웃되거나 불활성화 될 수있다. 바람직한 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 내인성 CD2 및 CD7 유전자 중 적어도 하나가 녹아웃되거나 불활성화 된 자연살해세포이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 내인성 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 및 CD8 유전자 중 적어도 하나가 녹아웃되거나 불활성화 된 T세포이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 공학적으로 처리된 세포는 내인성 CD2 및 CD7 유전자 중 적어도 하나가 녹아웃되거나 불활성화 된 NK세포이다.
하나의 실시양태에서, 특정 항원 인식 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 공학적으로 처리된 세포는 그 항원을 발현하는 유전자가 불활성화되거나 녹아웃 될 것이다. 예를 들어, CD2 CAR을 갖는 T세포는 불활성화되거나 녹아웃된 CD2 항원 유전자를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, CD4 항원 인식 도메인을 갖는 CAR을 가지는 공학적으로 처린된 세포 (예를 들어, NK세포 또는 T세포)는 CD4 항원이 그의 세포 표면 상에 발현되지 않도록 변형 될 것이다. 또 다른 실시양태에서, CD2 항원 인식 도메인을 갖는CAR 및 CD7 항원 인식 도메인을 갖는 또 다른 CAR을 가지는 공학적으로 처리된 세포 (예를 들어, NK세포 또는 T세포)는 CD2 항원 유전자 및 CD7 항원 유전자 모두가 녹아웃되거나 불활성화 될 수있다.
자연살해세포 T세포
CD2 + +
CD4 - +
CD3 - +
CD5 - +
CD7 + +
CD8 - +
표1: 자연살해 세포 및 T세포의 세포표면 항원.
유전자를 녹아웃 또는 불활성화시키는 방법은 당업계에 일반적으로 알려져있다. 예를 들어, 공학적으로 처리된 세포의 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 유전자를 녹아웃 또는 불활성화시키기 위해 CRISPR / Cas9 시스템, ZFNs 그리고 TALE 핵산분해효소 (TALENs) 및 메가핵산분해효소를 사용할수 있다.
세포의 출처
공학적으로 처리된 세포는 말초혈액, 제대혈, 골수, 종양침윤 림프구, 림프절조직 또는 흉선 조직으로부터 획득 될 수있다. 숙주세포는 태반세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 조혈줄기세포를 포함 할 수있다. 세포를 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 그의 유전자삽입 종으로부터 얻을 수있다. 세포를 확립세포주로부터 획득 할 수있다.
상기 세포를 임의의 알려진 수단에 의해 획득할 수있다. 세포는 공학적으로 처리된 세포의 수용자에게 자가, 동계, 동종이계 또는 이종이 될 수 있다.
용어 "자가 (autologous)"는 이후에 개체에게 재 도입될 동일한 개체로부터 파생 된 모든 자료를 의미한다.
용어 "동종이계 (allogeneic)"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래 된 모든 물질을 의미한다. 하나 또는 그 이상의 부위의 유전자 동일하지 않은 경우 둘 또는 그 이상의 개체가 서로 동종이계라고 말하게 된다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 유전적으로 충분히 달라서 항원적으로 상호작용할수 있다.
용어 "이종 (xenogeneic)"은 다른 종의 동물에서 유래 된 이식편을 의미한다.
용어 "동계 (syngeneic)"는 특히 항원 또는 면역학적 반응과 관련하여 극히 가까운 유전적 유사성 또는 동일성을 의미한다. 동계시스템은 예를 들어 장기와 세포 (예: 암세포와 비암성 대응물)가 동일한 개체에서 유래한 모델 및/또는 장기와 세포가 동일한 순계에 속하는 다른 개체 동물에서 유래한 모델을 포함한다.
자살 시스템
본 공개의 공학적으로 처리된 세포는 또한 자살 시스템을 포함 할 수있다. 자살 시스템은 전술 한 바와 같이 공학적으로 처리된 세포가 비활성화되거나 파괴 될 수있는 메커니즘을 제공한다. 이러한 특징은 공학적으로 처리된 세포가 사용되는 모든 치료의 정확한 치료 제어를 가능하게한다. 여기에 사용 된 바와 같이, 자살 시스템은 자살 시스템을 갖는 세포가 불활성화되거나 파괴 될 수있는 메카니즘을 제공한다. 자살 시스템은 당업계에 잘 알려져있다.
하나의 실시양태에서, 자살 시스템은 필요에 따라 함유 세포를 제거하기 위해 약리학 적으로 활성화 될 수있는 유전자를 포함한다. 특정 측면에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 보유하는 숙주에 면역원성이 아니다. 하나의 예에서, 자살 시스템은 CD20이 공학적으로 처리된 세포의 세포 표면 상에 발현되도록하는 유전자를 포함한다. 따라서, 리툭시맵 (rituximab)의 투여는 이 유전자를 포함하는 공학적으로 처리된 세포를 파괴하는데 사용될 수있다.
일부 실시양태에서, 자살 시스템은 항원결정인자 태그를 포함한다. 항원결정인자 태그의 예는 c-myc 태그, 스트렙타비딘-결합 펩타이드 (SBP) 및 절두된 EGFR 유전자 (EGFRt)를 포함한다. 이 실시양태에서, 항원결정인자 태그는 공학적으로 처리된 세포에서 발현된다. 따라서, 항원결정인자 태그에 대한 항체의 투여는 이 유전자를 함유하는 공학적으로 처리된 세포를 파괴하는데 사용될 수있다.
또 다른 실시양태에서, 자살 시스템은 절단된 표피성장인자 수용체가 공학적으로 처리된 세포의 표면 상에 발현되도록하는 유전자를 포함한다. 따라서, cetuximab의 투여는 이 유전자를 포함하는 공학적으로 처리된 세포를 파괴하는데 사용될 수있다.
또 다른 실시 양태에서, 자살 유전자는 카스페이스8유전자, 카스페이스9 유전자, 티미딘키나아제, 시토신 탈아미노효소 (CD) 또는 시토크롬 P450을 포함 할 수있다.
더 나아간 자살 시스템의 예로는 여기에 그 전체가 참고로 인용되는Jones et al. (Jones BS, Lamb LS, Goldman F and Di Stasi A (2014) Improving the safety of cell therapy products by suicide gene transfer. Front. Pharmacol. 5:254. doi: 10.3389/fphar.2014.00254)에 의해 설명된 것들을 포함한다.
CD2CAR
CD2 접착분자는 모든 말초 혈액 T세포 및 자연살해세포에 의해 발현되는 세포 표면 항원이지만 B 림프구에는 나타나지 않는다. CD2의 세포 외 도메인은 동종이합체화를 중개 할 수있는 면역글로블린-유사 도메인을 포함한다. CD58 (LFA-3) 또는 CD48에 의한 CD2의 묶음은 T 세포가 항원 제시 세포에 부착하는 것을 돕고 항원에 대한 T 세포 수용체를 통한 신호 전달을 강화시키는 신호전달경로를 유발한다. CD2 녹아웃 마우스는 정상적인 면역 기능을 나타내며, CD2는 CD28과 같은 다른 T세포 보조자극 수용체와 기능적으로 유사하다고 생각된다.
CD2는 T-ALL, T 세포 림프종/백혈병, 급성전골수성백혈병 (미립상 변이), 전신성비만세포증, 비만세포병, 흉선종 및 급성 골수성림프종 (M0) 및 NK 세포 백혈병에서 발현된다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2 항원에 특이적인 항원 인식 도메인 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 CD2 항원에 특이적인 항원 인식 도메인의 서열의 변이를 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
하나의 실시양태에서, CD2CAR은 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD2CAR은 적어도 2 개의 공동 자극 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD2CAR은 SEQ ID NO. 10 및 SEQ ID NO. 11 을 포함한다.
CD3CAR
CD3는 단백질 복합체로 구성되며 위의 도에서 설명한대로 4개의 사슬로 구성된다. 복합체는 CD3δ 사슬, CD3γ 사슬 및 2 개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 αβ 사슬을 구성하는 T세포 수용체 (TCR)와 결합한다.
TCR/CD3 복합체는 T혈통세포의 유일한 표지자이다개발된 이 복합체에 대한 다양한 단클론 항체가 있다. 그러한 단클론 항체 중 하나는 표면 CD3에 대한 쥐 단일 클론 항체 OKT3이다. CD3은 T 세포 및 T 세포 악성 종양에 대한 공통 표지자이다. CD3 엡실론에 대한 OKT3은 T 세포를 확인하는데 사용되는 일반적인 항체이다. 치료법으로서의 항-CD3 단일클론 항체는 다음을 포함한다: (1) 급성 신장, 심장 또는 간 동종 이식 거부; (2) 이식 전에 기증자 골수에서 T 세포가 고갈 됨; (3) I 형 당뇨병의 새로운 발병. CD3 엡실론 사슬에 대한 CD3는 양성 및 악성 질환에서 T 세포를 확인하는 데 사용되는 가장 특이적인 T 세포 항체이다. CD3은 말초 T세포 림프종의 86 %에서 발견된다.
일부 실시 양태에서, 본 공개는CD3CAR의 생성 방법을 포함한다. 추가의 실시양태에서, CD3CAR은 CD3의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 scFv 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3CAR은 TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 scFv 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR에서 scFv는 CD3와 관련된 αβTCR의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합하는 분자 일 수있다.
CD4CAR
하나의 실시양태에서, 본 공개의 키메라 항원 수용체는 CD4 항원 인식 도메인, CD4CAR을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD4 CAR은 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD4CAR은 적어도 2개의 보조 자극 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD4CAR은 SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14를 포함한다.
CD5CAR
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 CD5에 특이적인 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
하나의 실시양태에서, CD5CAR은 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD5CAR은 적어도 2개의 공동 자극 도메인을 포함한다.
CD7CAR
CD7은 면역글로블린 수퍼패밀리의 구성원인 막통과 단백질이다. 이 단백질은 성숙한 T세포의 표면에 발현된다. 그것은 T세포 계통 세포에서 발현되는 가장 초기의 표면 항원이다.
CD7은 T-ALL에 대한 아주 좋은 표지자이고 T-ALL의 90 % 이상은 CD7을 표현한다. CD7은 또한 NK 림프종, T세포 림프종/백혈병, 만성골수성백혈병, 급성골수성백혈병 및 림프구가 풍부한 흉선종에서도 발현된다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD7 항원에 특이적인 항원 인식 도메인 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이를 발현하는 공학적으로 처리된 세포를 제공한다.
하나의 실시양태에서, CD7CAR은 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, CD7CAR은 적어도 2 개의 보조 자극 도메인을 포함한다.
방법
공학적으로 처리된 세포를 만드는 방법
하나의 실시양태에서, 본 공개는 또한 전술한 공학적으로 처리된 세포의 제조 방법을 제공한다.
이 실시양태에서, 상기 기술된 세포가 획득되거나 분리된다. 세포는 임의의 공지 된 수단에 의해 분리 될 수있다. 세포에는 말초 혈액 세포 또는 제대혈 세포가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 태반세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 조혈줄기세포이다.
상기 기술된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 임의의 공지 된 수단에 의해 말초 혈액세포 또는 제대혈세포로 도입된다. 하나의 예에서, 상기 기술 된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입된다.
상기 기술한 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 공지 된 수단에 의해 태반세포, 배아 줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 조혈 줄기세포로 도입된다. 일례로, 상기 기술 된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드를 바이러스 벡터로 도입한다.
또 다른 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 폴리 뉴클레오타이드는 일과성 RNA-변형 된 "생물분해성 유도체"로서 구성 될 수있다. RNA-변형된 유도체는 T세포 또는 NK세포 내로 일렉트로퍼레이트 될 수있다. 추가의 실시양태에서, 본 공개에 기술 된 키메라 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 폴리 뉴클레오타이드를 바이러스 벡터없이 숙주 유전체에 통합시키는 "잠자는 숲속의 미녀 (Sleeping Beauty)"로도 불리는 트랜스폰슨 시스템 (transponson system)에서 구축 될 수있다.
공학적으로 처리된 세포를 제공하기 위해 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하면 공학적으로 처리된 된 세포는 확장된다. 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드의 공지 된 수단에 의해 확장된다.
본 공개에 따른 분리된 공학적으로 처리된 세포를 제공하기 위해 확장된 세포는 임의의 공지 된 수단에 의해 분리된다.
사용하는 방법
본 공개는 면역조절 세포를 죽이거나, 감소시키거나, 또는 고갈시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 중 적어도 하나를 갖는 세포를 죽이거나, 감소시키거나 또는 고갈시키는 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "감소 된 수"는 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 25 %, 적어도 50 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 99 % 또는 100 %에 의한 감소를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "고갈 (deplete)"은 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100% 에 의한 감소를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절세포를 접촉시키는 것을 통해 CD2를 갖는 면역조절세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD2를 갖는 면역조절 세포의 수의 감소는 당 업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
여기에서 사용 된 바와 같이, 면역조절 세포는 환자내에, 세포 배양중에 있거나 또는 분리 될 수있다.
여기에서 사용 된 바와 같이, "환자"는 포유류를 포함한다. 여기에 언급 된 포유류는 임의의 포유 동물 일 수있다. 여기에서 사용 된 바와 같이, 용어 "포유 동물"은 마우스 및 햄스터와 같은 설치목 포유 동물 그리고 토끼와 같은 토끼목 포유류를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유 동물을 의미한다. 포유류는 고양이과 (고양이)와 개과 (개)를 포함하여 식육목에서 유래할수 있다. 포유 동물은 소과 (소) 와 돼지과 (돼지) 또는 말과 (말) 를 포함한 말목을 포함하는 소목에서 유래할수 있다. 포유 동물은 영장목, 세보이드, 또는 시로이드 (원숭이) 에 속하거나 또는 유인원목 (인류와 유인원) 에 속할수 있다. 바람직하게는, 포유 동물은 인간이다.
특정 실시양태에서, 환자는 0-6 개월, 6-12 개월, 1-5 세, 5-10 세, 5-12 세, 10-15 세, 15-20 세, 13-19 세, 20-25 세, 25-30 세, 20-65 세, 30-35 세, 35-40 세, 40-45 세, 45-50 세, 50-55 세, 55-60 세, 60-65 세, 65-70 세, 70-75 세, 75-80 세, 80-85 세, 85-90 세, 90-95 세 또는 95-100 세의 인간이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 공학적으로 처리된 세포의 "유효량" 및 "치료 적 유효량"이란 용어는 원하는 치료적, 또는 생리학적 효과 또는 결과를 제공하기위한 충분한 양의 공학적으로 처리된 세포를 의미한다. 그러한 효과 또는 결과는 세포 질환의 증상의 감소 또는 개선을 포함한다. 원하지 않은 효과, 예를 들어 부작용은 때로는 원하는 치료 효과와 함께 나타난다. 그러므로, 진료의는 잠재적 위험에 대한 잠재적 편익 사이의 균형을 잡아서 적절한 "유효량"이 무엇인지를 결정한다. 요구된 정확한 양은 대상의 종류, 연령 및 일반적인 상태, 투여 방식 등에 따라 대상마다 다를 것이다. 따라서 정확한 "유효량"을 지정하는 것은 불가능할 수 있다. 그러나, 임의의 개별 사례에서의 적절한 "유효량"은 일상적인 실험만을 사용하여 당업계 기술자에 의해 결정될 수있다. 일반적으로, 공학적으로 처리된 세포는 표적 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양 및 조건하에서 투여된다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절세포를 접촉시키는 것을 통해 CD2를 갖는 면역조절세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD2를 갖는 면역조절세포의 수의 감소는 당업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD3 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절세포를 접촉시키는 것을 통해 CD3를 갖는 면역조절세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD3를 갖는 면역조절세포의 수의 감소는 당업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD4 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절 세포를 접촉시키는 것을 통해 CD4를 갖는 면역조절 세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD4를 갖는 면역조절 세포의 수의 감소는 당 업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD5 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절 세포를 접촉시키는 것을 통해 CD5를 갖는 면역조절 세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD5를 갖는 면역조절 세포의 수의 감소는 당 업계에 공지된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD7 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절 세포를 접촉시키는 것을 통해 CD7를 갖는 면역조절 세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD7를 갖는 면역조절 세포의 수의 감소는 당업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD8 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절 세포를 접촉시키는 것을 통해 CD8를 갖는 면역조절세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD8를 갖는 면역조절 세포의 수의 감소는 당업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD52 항원 인식 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 펩타이드를 발현하는 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 면역조절 세포를 접촉시키는 것을 통해 CD52를 갖는 면역조절 세포의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 선택적으로, CD52를 갖는 면역조절세포의 수의 감소는 당업계에 공지 된 임의의 세포사 분석에 의해 결정될 수있다.
치료방법
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 세포증식성 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 기술 된 공학적으로 처리된 세포의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
세포증식성 질환은 암, 종양성질환 또는 특이적 및 상이한 세포로의 임의의 분화가 없는 제어되지 않은 세포 증식 (예를 들어, 세포 덩어리의 형성)을 수반하는 임의의 질병 중의 하나이다.
세포 증식 성 질환은 또한 악성종양 그리고 골수형성이상증후군 또는 전백혈병 또는 전 림프종과 같은 전암성 상태를 포함한다.
개시된 방법과 관련하여, 암은 급성림프구암, 급성골수성백혈병, 폐포형 횡문근육종, 방광암 (예를 들어, 방광암종), 골암, 뇌암 (예를 들어, 수모세포종), 유방암, 항문암, 항문관 또는 항문직장암, 눈암, 간내담관암, 관절암, 목암, 담낭암, 흉막암, 코암, 비강 또는 중이암, 구강암, 외음부암, 만성림프성백혈병, 만성골수성암, 대장암, 식도암, 자궁경부암, 육종, 위장관카르시노이드종양, 두경부암 (예를 들면 두경부편평세포암종), 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액상종양, 간암, 폐암 (예를 들어, 비소세포폐암종), 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비호지킨 림프종, B만성림프구성백혈병, 털세포백혈병, 급성림프모구백혈병 (ALL), T세포급성림프구성백혈병, 및 버킷 림프종, 림프절외 NK/T 세포 림프종, NK 세포 백혈병/림프종, 이식 후 림프증식성 질환, 난소암, 췌장암, 복막, 그물막, 및 장간막 암, 인두암, 전립샘암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형종양, 위암, 고환암, 갑상선암 및 요관 암을 포함하는 임의의 암이 될수 있다. 바람직하게는, 암은 혈액암 (예컨대, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 만성 림프구성백혈병, 급성림프구성암, 급성골수성백혈병, B-만성림프구성백혈병, 털세포백혈병, 급성림프모구성 백혈병 (ALL), 및 버킷 림프종), 흉선암종, 광범위한 대세포림프종, 외투세포림프종, 작은림프구성림프종 (SLL), 또 만성림프구성백혈병 (CLL), T세포림프종, 또 말초 T세포 림프종이다.
본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52와 관련된 T및 NK세포의 고갈에 의한 급성 장기거부의 치료 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8및 CD52중 적어도 하나와 관련된 T세포 및 NK세포의 고갈에 의한 급성 또는 만성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 치료 방법을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 장기 이식을 받은 또는 장기 이식을 받게 될 환자에게 CD3CAR을 갖는 공학적으로 처리된 세포의 유효량을 투여하는 것을 통해 장기 거부를 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 CD3CAR을 갖는 공학적으로 처리된 세포의 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 통해 GVHD를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 공개는 줄기세포 이식을 위해 생체 내에서 CAR T 또는 NK 세포를 사용하여 제공자 및 숙주 T 또는 NK세포를 고갈 또는 감소시키는 방법을 포함한다. 이것은 골수 줄기세포 이식편을 주입하기 직전에 CAR T 또는 NK세포를 환자에게 투여하는 것을 통해 완성 될 수있다.
본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 중 적어도 하나와 관련된 세포 증식성 질환의 치료를위한 조건형성 또는 가교-이식 전략 또는 독립형 면역요법의 방법을 제공한다.
본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 중 적어도 하나와 관련된 세포 증식성질환의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 및 CD52 중 적어도 하나의 발현과 관련된 비 암관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시 양태에서, 세포 증식성 질병의 치료에 사용하기위한 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 갖는 CAR은 CTLA-4 및 PD1/PD-L1 와 같은 체크포인트 차단제와 결합한다. 이것은 증강된 종양 제거를 일으킬수 있다.
면역 억제적인 미세 환경의 존재는 CAR T/NK 세포의 전체 기능을 제한 할 수 있다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 및 PD1/PD-L1과 같은 체크 포인트 차단제와 CD4CAR의 조합은 증강된 종양 제거를 일으킬수 있다. 현재 체크 포인트 차단제는 CAR T 세포와 결합하여 임상 시험에서 테스트되고 있다.
일부 실시양태에서, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 갖는 CAR은 초기 화학 요법에 대한 반응을 심화, 제거, 감소, 저항 및/또는 연장하기 위한 전략 또는 다른 보조 요법과 결합하는 경우에 사용된다. 질환 상태를 치료 또는 예방하기위한 모든 이용 가능한 보조 치료는 본 공개의 일부로 간주되며 본 공개의 범위 내에 있다.
일부 실시 양태에서, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 또는 CD52 항원 인식 도메인을 갖는 NK세포 CAR은 암 및/또는자가면역질환을 갖는 임의의 포유 동물에게 "기성품"으로 투여된다.
CD3CAR
일부 실시양태에서, CD3 CAR을 보유하는 NK세포는 항암면역을 나타내며, CD3을 발현하는 백혈병/림프종을 죽이는 효력을 발휘한다.
본 공개는 CD3CAR NK 세포를 사용하여 골수, 혈액 및 장기에서의 비정상 또는 악성 T세포를 제거 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD3 양성 악성종양은 전구체 T림프구백혈병/림프종, 성숙 T세포림프종/백혈병, EBV 양성 T세포림프 증식성장애, 성인 T세포백혈병/림프종, 균상식육종/ 세자리 증후군, 원발성 피부 CD30 양성 T세포 림프증식성 장애, 말초 T세포림프종 (달리 명시되지 않음), 혈관면역모세포 T림프종 및 큰세포역형성림프종이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, CD3CAR NK세포는 줄기세포 치료에 적합하지 않거나 많은 집중적인 화학요법 요법에도 불구하고 결코 완화를 달성하지 못한 T 백혈병/림프종 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, CD3CAR NK세포는 골수 이식을위한 조건형성 요법의 구성 요소 또는 골수 이식에 대한 가교로서 사용될 수있다.
CD4CAR
하나의 실시양태에서, CD4CAR을 갖는 공학적으로 처리된 세포는 CAR의 항원 인식 도메인이 그의 상응하는 항원에 결합 할 때 항종양면역성을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, CAR을 포함하는 CD8 T 세포는 CD4를 발현하는 백혈병/림프종 세포를 죽이는 효력을 발휘한다.
본공개는 골수, 혈액 및/또는 장기를 포함하나 이에 한정되지 않는 데서 찾아낸 비정상 또는 악성 T 세포를 제거, 감소, 치료, 예방 또는 삭제하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 악성 CD4 발현 세포는 전구체 T 림프구성백혈병/림프종, 성숙 T 세포림프종 백혈병세포, 예를 들어, T 세포 전림프구성백혈병, EBV 양성 T 세포 림프증식성장애, 성인 T 세포 벽혈병/림프종, 균상식육종/세저리 증후군, 원발성 피부 CD30 양성 T 세포 림프증식성 질환, 말초 T 세포림프종 (달리 명시되지 않음), 혈관면역모 T 세포 림프종 및 역형성큰세포림프종을 가진 환자에 존재한다.
일부 실시양태에서, CD4CAR 세포는 줄기세포 요법에 적합하지 않은 환자 또는 많은 화학 요법에도 불구하고 결코 완화를 달성하지 않은 환자에서의 T-백혈병/림프종 세포를 치료하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, CD4CAR 세포는 CD4 발현하는 급성골수단구성백혈병, 급성단모세포성 백혈병, 단핵구백혈병및 만성급성골수단구성백혈병을 치료하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, CD4CAR T세포는 T세포 배양배지에서 확장될 수 있고, 중앙 기억 T세포 또는 나이브 T세포와 같은 아류는 분리되어 개선된 생착에 사용될 수있다. 이 세포들은 기억 T세포 기능을 유지하고 지지 할 수있어 암의 장기간 통제를 위한 이상적인 후보자가 될 수 있다.
면역억제 미세환경의 존재는 CAR T/NK세포의 전체 기능을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4CAR과 CTLA-4 및 PD1/ PD-L1과 같은 체크포인트 차단제의 결합은 증강된 종양제거를 일으킬수 있다.
일부 실시양태에서, CD4CAR 세포는 초기 화학 요법에 대한 반응을 심화, 제거, 감소, 저항 및/또는 연장하기 위한 전략 또는 다른 보조 요법과 결합하는 경우에 사용된다. 질환 상태를 치료 또는 예방하기위한 모든 이용 가능한 보조 요법은이 공개의 부분으로 간주되며 본 공개 범위 내에있다. 화학요법으로는 CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristie, prednisone), EPOCH (etoposide, vincristine, doxorubicin, cyclophosphamide, prednisone) 또는 다른 여러약물요법이 있다. 바람직한 실시양태에서, CD4CAR 세포는 줄기세포 이식 및/또는 화학 요법 후에 잔류 질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
하나의 실시양태에서, CD4CAR을 포함하는 세포는 CAR의 항원 인식 도메인이 그의 상응하는 항원에 결합 할 때 면역조절세포의 고갈을 나타낸다. 예를 들어, CD4CAR을 포함하는 세포는 적어도 CD8 T세포, NK세포 또는 NK-92세포 중 하나를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. CD4도움세포를 만날 때 그것을 제거시키는 높은 효능을 나타내거나 및/또는 발휘하는 CD4CAR을 갖는 임의의 다른 적합한 세포에 의해 장기 이식 거부가 예방되고 또는 자가면역질환이 통제되거나 완화되는것은 본 공개의 일부분 또는 본 공개의 범위로 간주된다.
CAR T세포에서 관찰 된 CAR 관련 부작용의 지속에 대한 우려는 없다. 일부 실시양태에서, CD4도움T세포와 같은 면역조절 세포를 급속히 고갈시켜 새로운 또는 비기억 CD4도움T세포를 재생할 수있게하거나 허용하도록 CD4CAR NK 세포를 급성 또는 중대한 임상 환경에서 자가면역질환을 가진 환자에게 투여 할 수있다.
본 공개는 CD4CAR 생성하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4CAR은 T세포를 사용하여 생성된다. 또 다른 실시양태에서, CD4CAR은 NK세포 또는 NK-92세포를 사용하여 생성되어, 암 및/또는자가면역질환을 갖는 임의의 포유 동물에게 "기성품"으로 투여된다. 일부 실시 양태에서, 세포를 죽일 수 있는 CD4CAR NK-92 또는 NK세포는 특정 CD4+ T세포 또는 CD4를 발현하는 암세포를 감소시키고, 고갈시키고, 및/또는 예방할 수있다.
일부 실시양태에서, 염소-항-마우스 Fab 항체 또는 그의 일부를 사용하는 유동세포측정법에 의해 CD4CAR의 높은 수준의 발현을 갖는 CD4CAR NK-92 세포를 생성시킬 수있다. 임의의 다른 속을 사용하여 생성 된 임의의 다른 유형의 항체는 본 공개의 일부분으로 간주되며 본 공개의 범위 내에있다.
일부 실시양태에서, CD4CAR NK-92 세포는 줄기세포이식 또는 화학요법 후에 최소의 잔류 질환이 존재할 때 하나의 치료에 사용될 수있다.
일부 실시양태에서, CD4CAR은 발현하는 유전자 또는 카세트의 일부이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 발현하는 유전자 또는 카세트는 CD4CAR 이외에 부속 유전자 또는 항원결정인자 태그 또는 그 일부를 포함 할 수있다. 부속 유전자는 카스페이스9유전자, 티미딘키나아제, 사이토신 디아미나아제 (CD) 또는 시토크롬 P45029를 포함 하나 이에 제한되지 않는 유도성 자살 유전자 또는 그의 일부일 수있다. "자살유전자" 절제 접근법은 유전자 치료의 안전성을 개선시키고 특정 화합물이나 분자에 의해 활성화 될 때만 세포를 죽인다. 일부 실시양태에서, 자살 유전자는 유도가능하고 특정 이합체화의 화학적 유도제 (CID)를 사용하여 활성화된다.
일부 실시양태에서, 부속 태그는 c-myc 태그, 잘린 EGFR 유전자 (EGFRt) 또는 그의 일부 또는 이들의 조합이다. 부속 태그는 비면역원성 선택 도구 또는 표지자를 추적하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD4CAR을 발현하는 숙주 세포는 포유 동물 (예: 인간)에게 하나 또는 그 이상의 추가 치료제와 함께 투여 될 수있다. 이와 관련하여, 숙주세포 또는 CD4CAR을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물은 첫번째로 투여 될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 추가 치료제는 두번째로 투여 될 수 있으며, 또는 그 반대로 투여 될 수있다.
본 공개는 포유동물에게 CD4CAR을 발현하는 숙주 세포의 전형적인 양을 투여하는 것을 그 범위 내에 포함하는데, 그곳은 예를 들어 약 5백만 내지 약 10억 세포의 범위 일 수있다. 위에서 표시된 범위를 벗어나는 모든 하위 범위 및 범위는 본 공개의 일부로 간주되며 본 공개의 범위 내에있다.
바람직한 하나의 실시양태에서, SFFV 프로모터는 CD8 T세포를 CD4 발현 표적 세포로 고쳐향하게 하고 CD4CAR 발현을 유도하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD4 발현 세포와 만날 때 scFv의 세포 외 발현 및 강한 면역 반응의 발휘와 같은 기능적 특성을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD4CAR을 포함하는 세포는 세포독성 T림프구 (CTL) 및 자연살해세포 (NK)를 포함하는 그릅으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, CAR을 갖는 세포는 CD8 T세포, NK세포 및 NK-92세포를 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, CD4CAR은 DNA/핵산 접합체, 펩타이드, 화학물질 및/또는 소분자를 포함하는 약물 접합체와 함께 사용하여 개선 된 효능 및 안전성을 제공할수 있다.
HIV-1 감염의 통제는 항레트로바이러스 요법의 조합을 사용하는 HIV 환자에서 달성될 수 있지만, 중단 후 바이러스 부하가 증가한다. 재발성 HIV-1의 출처 또는 저장소는 기억 CD4 T세포이다. 하나의 실시양태에서, 본 공개의 CD4CAR은 기억 CD4 T세포를 고갈 시키는데 사용되어, HIV 감염에 대해 멸균치유가 완성된다. 또 다른 실시양태에서, CD4CAR은 HIV 바이러스 유입의 차단을 돕는 반면, CD4CAR은 HIV 유입에 필수적인 단백질인 CD4 단백질에 결합한다.
따라서, 본 공개는 CD4 T세포를 고갈시키는 것을 통해 장기이식거부를 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 CD4 항원인식도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 갖는 공학적으로 처리된 세포의 치료적 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
CD5CAR
또 다른 실시양태에서, CD5 항원인식도메인 (CD5CAR)을 갖는 CAR 폴리펩타이드의 투여는 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용된다. 또 다른 실시 양태에서, CD5CAR은 골수이식요법 (BMT) 치료이후의 이식편 대 숙주 질환에 대한 예방방법으로 사용될 수있다. 또 다른 실시양태에서, CD5CAR은 자가면역질환 및 악성종양의 치료에서의 CD5 발현을 변형시키는데 사용될 수있다.
일부 실시 양태에서, CD5에 대해 선택적인 키메라항원 수용체를 갖는 공학적으로 처리된 세포의 공개는 화학요법에 더 이상 반응하지 않거나 최소한의 잔류 질환을 가지며 골수이식에 적합하지않은 환자들을 위한 골수 이식에 대한 가교 역할을 할 수있다. 추가의 실시양태에서, CD5CAR은 CD5 양성 백혈병세포를 제거할수 있고 림프구감소증을 지지하기 위한 골수 줄기세포의 구제가 뒤따른다.
특정 실시양태에서, CD5CAR T 또는 NK세포는 CD5를 발현하는 세포를 표적으로한다. 표적세포는 T세포 림프종 또는 백혈병, 전구체 급성T세포 림프성 백혈병/림프종, B세포 만성림프구성 백혈병/소림프구성 림프종, 외투세포 림프종, CD5 양성 광범위 B 대세포 림프종 및 흉선암종과 같은 암세포이지만 이에 한정되지 않는 다.
하나의 실시양태에서, CD5CAR은 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주 질환 및 자가면역질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 비혈액장애를 치료하는데 사용될 수있다.
공학적으로 처리된거나 변형 된 T세포는 IL-2 및/또는 IL-7 과 IL-15 양쪽의 존재하에 또는 다른 분자를 사용하여 확대 될 수있다.
CAR의 도입은 환자에게 투여하기 전에 시험관내에서 공학적으로 처리된T세포를 확장시기는 것을 통해 CD5의 불활성화 이전 또는 이후에 수행 될 수있다.
특정 실시양태에서, CD5의 불활성화는 다음의 수단 중 하나에 의해 달성 될 수있다:
(1) 힌지 영역을 통해 막통과 도메인에 연결된 T세포 표면에 항CD5 scFv를 발현하는 것. 이것은 CD5 양성 T세포를 CD5 음성 T세포로의 전환으로 귀착한다.
(2). CD5 단백질, 또는 이의 CD5 음성 조절제, 또는 이의 단편 또는 도메인에 특이적으로 결합하는 항CD5 scFv를 발현하는 것.
일부 실시형태에서, CD5에 대한 scFv (단일사슬항체)는 세포내 CD5에 결합하는 단클론 또는 다클론 항체로부터 유도되고, CD5 단백질의 세포표면으로의 운반을 차단한다. 바람직한 실시양태에서, 항CD5 scFv는 ER (세포질그물) 보유 서열 KDEL을 포함한다. 그것이 세포내로 발현되어 ER 또는 골지에 보유 될 때, 항CD5 scFv는 분비경로내에서 CD5를 포획하여, T세포에서의 CD5 적절한 세포표면의 위치선정을 예방한다.
일부 실시양태에서, CD5CAR T세포는 더 나은 치료 결과를 일으키는, CTLA-4 및 PD-1/PD-L1 차단제 또는 IL-2 및 IL12와 같은 사이토카인 또는 FPA008과 같은 콜로니 자극 인자-1 수용체 (CSF1R)와 같은, 이에 한정되지 않는 면역조절약물과 함께 공동 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 본 공개는 항백혈병 또는 항림프종 면역을 부여, 보조, 증가 또는 추진시키는 방법을 제공한다.
CAR을 유효성분으로하는 공학적으로 처리된 세포를 포함하는 치료제는 비록 투여 경로는 제한된것은 아니지만 비경구 투여, 예를 들어 주사 또는 주입에 의해 피내, 근육내, 피하, 복강내, 비강내, 동맥내, 정맥내, 종양내, 또는 수입림프관 내로 투여될수 있다.
본 공개의 임의의 방법은 수술, 방사선, 호르몬요법, 화학요법, 면역요법 또는 이들의 조합과 같은 추가적인 암치료를 개체에게 전달하는 단계를 추가로 포함 할 수있다.
화학요법은 CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristie, prednisone), EPOCH (etoposide, vincristine, doxorubicin, cyclophosphamide, prednisone) 또는 임의의 다른 여러약물 요법을 포함하지만 이에 한정하지 않는 다. 바람직한 실시 양태에서, CD54CAR 세포는 줄기세포 이식 및/또는 화학요법 후에의 잔류질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 공개의 임의의 방법은 MS 환자에 대한 항바이러스요법, cidofovir 및 인터루킨-2, 시타라빈 (ARA-C로도 공지 됨) 또는 나탈리주맙 치료 또는 건선 환자에 대한 efalizumab 치료 또는 PML 환자에 대한 기타 치료를 추가로 포함 할 수있다. 추가의 측면에서, 본 공개의 T세포는 화학요법, 방사선, 사이클로스포린 (methotrexate), 아자티오프린 (azathioprine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 마이코 페놀레이트 (mycophenolate) 및 FK506, 항체 또는 CAMPATH와 같은 면역제거제와 같은 면역억제제, 항CD3항체 또는 다른 항체치료, cytoxin, 플루다라빈 (fludarabine), 사이클로스포린 (cyclosporin), FK506, rapamycin, mycophenolic acid, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 방사선조사와 조합된 요법에 사용될수 있다. 칼슘 의존성 phosphatase calcineurin (cyclosporine 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장인자유도신호전달 (rapamycin)에 중요한 p70S6 키나아제를 억제하는 약물 (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993) 또한 사용될수 있다. 추가의 측면에서, 본 공개의 세포조성물은 골수이식, 플루다라빈 (fludarabine)과 같은 화학요법제제를 사용하는 T세포 절제치료, 외부빔 방사선 (XRT), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체와 함께 연결되어 (예를 들어, 전, 동시 또는 후속) 환자에게 투여된다. 하나의 측면에서, 본 공개의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 제제 (예를 들어 리툭산 (Rituxan))를 사용한 B세포 절제요법 후에 투여된다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 대상은 말초혈액 줄기세포 이식이 뒤따르는 고용량 화학요법을 통한 표준 치료를 경험할 수있다. 특정 실시양태에서, 이식 후에, 대상은 본 공개의 확장된 면역세포의 주입을 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 수술 후에 투여된다.
여기에서 사용되는 용어 "자가면역질환"은 자가면역반응으로부터 기인하는 장애로 정의된다. 자가면역질환은 자기항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역질환의 예로는 Addision 's disease, 탈모 성 대장염, 강직성 척추염, 자기면역성 간염, 크론병, 육아종성 표피박리증, 부고환염, Guillain-Barr 류마티스 관절염, 유육종증, 경화증, 척추 관절 병증, 애디슨병, 원형탈모, 강직척추염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론 병, 당뇨병 (유형 1), 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, Graves 병, 길랑-바레 증후군, 하시모도병, 용혈빈혈, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증근육무력증, 보통천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 사코이드증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액부종 및 악성빈혈, 궤양성 대장염을 포함하나 이에 한정되지 않는 다.
본 공개는 이하에 설명되는 예를 참조하여 더 잘 이해 될 수있다. 다음 예는 본 공개에 청구된 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지에 대한 완전한 공개 및 설명을 당업계 기술자에게 제공하기 위해 제시되며, 순수하게 예시적인 것이며, 본 공개 내용을 제한하고자하는 것은 아니다.
암치료, 억제 또는 예방을 위한 전달시스템의 투여 후, 치료적인 공학적으로 처리된 세포의 효능은 숙련된 진료인에게 잘 공지된 다양한 방법으로 평가될 수있다. 예를 들어, 치료적인 공학적으로 처리된 세포가 암세포 부하를 감소시키거나 암세포 부하에서의 추가적인 증가를 예방하는 것을 관찰함으로써 대상의 암을 치료 또는 억제하는데 보조화학요법과의 연결에 제공되는 치료적인 공학적으로 처리된 세포가 효과적이라는 것을 당업계 기술자는 이해할 것이다. 암세포 부하는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 중합효소연쇄반응분석을 사용하여 특정 암세포 핵산의 존재를 발견하는 것 또는 예를 들어 대상 또는 환자로부터의 샘플 (예를 들어 혈액에 국한되지 않음)에서의 표지자 존재를 발견하기 위한 항체측정법을 사용하는 혈액중 특정 암세포 표지자 식별, 또는 환자의 순환 암세포 항체수준을 측정하는 것에 의해 측정 될 수있다.
이 명세서에서, 양은 범위에 의해 그리고 범위의 상한 및 하한에 의해 정의된다. 각 하한은 각 상한과 결합하여 범위를 정의 할 수 있다. 하한과 상한은 각각 별도의 요소로 가져와야한다.
본 명세서에서 "하나의 실시양태 (one embodiment)", "일 실시양태 (an embodiment)", "하나의 예 (one example)" 또는 "일례 (an example)"는 실시양태 또는 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 실시양태의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다.　 따라서, 본 명세서 전체의 다양한 곳에서 "하나의 실시양태에서 (in one embodiment)", "일 실시양태에서 (in an embodiment)", "하나의 예 (one example)"또는 "일례 (an example)"라는 문구가 출현하는 것은 반드시 동일한 실시양태 또는 예를 모두 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 또는 그 이상의 실시양태 또는 예에서의 임의의 적합한 조합 및/또는 하위조합으로 조합 될 수있다. 또한, 여기에 함께 제공된 도면은 당업계 기술자에게 설명의 목적을 위한 것이며, 도면은 반드시 일정한 비율로 그려지는 것은 아니다.
본 공개에 사용된바와 같이, "포함한다 (comprises)", "포함하고 있다 (comprising)", "포함하다 (includes)", "포함하고 있다 (including)", "가진다 (has)", "가지고있다 (having)" 또는 임의의 다른 이의 변형은 비독점적인 포함을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 요소 리스트를 포함하는 프로세스, 제품 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 한정되는 것은 아니며, 명시적으로 열거되지않은 또는 그러한 프로세스, 제품 또는 장치에 고유한 다른 요소를 포함 할 수있다.
추가로, 달리 명시되지 않는 한, "또는"은 포괄적인 "또는"을 의미하고 배타적 인 "또는"을 의미하지 않는다. 예를 들어 조건 A 또는 B는 다음 중 하나에 의해 만족된다: A는 참 (또는 현재)이고 B는 거짓 (또는 현재 아님)이다, A는 거짓 (또는 현재 아님)이고 B는 참 (또는 현재)이다, 그리고 A와 B는 모두 참 (또는 현재)이다.
또한 여기에 제시된 임의의 예 또는 설명은 그것을 사용한 임의의 용어의 정의에 대한 제한, 한계 또는 표현으로 어떠한 방식으로도 간주되어서는 안된다. 대신에, 이러한 예들 또는 설명들은 하나의 특정 실시양태와 관련하여 설명되고 있다고 간주되어야 하고 단지 예시되는 것만으로 간주되어야한다. 그들 당업계 기술자들은 이들 예 또는 예시를 이용한 임의의 용어가 명세서 내 또는 다른 곳에서 주어질 수도 있고 안될 수도 있는 다른 실시양태들을 포함 할 것이며, 모든 이러한 실시양태들은 그 용어의 범위내에 포함되게 의도된다는 것을 이해할것이다. 그러한 비제한적인 예 및 설명을 나타내는 언어는 "예를 들어 (for example)", "예를 들어 (for instance)", "예를 들어 (e.g.)"및 "하나의 실시양태에서 (in one embodiment)"를 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
이 명세서에서는 여러 구성원을 포함하는 다양한 매개변수 그룹을 설명한다. 매개변수 그룹 내에서 각 구성원은 추가 하위그룹을 만들기 위해 임의의 하나 또는 그 이상의 다른 구성원과 결합 될 수 있다. 예를 들어, 그룹의 멤버가 a, b, c, d 및 e 인 경우, 구체적으로 고려되는 추가 하위그룹은 멤버들 중 임의의 하나, 둘, 셋 또는 넷를 포함하며, 예를 들어 a 및 c; a, d 및 e; b, c, d 및 e; 등 이다.
실례
CD4 특이적 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가진 공학적으로 처리된 T세포를 이용한 인간 T세포 악성종양의 표적화
재료 및 방법
혈액 기증자, 원발성 종양세포 및 세포주
인간 림프종세포 및 말초혈액 단핵세포를 잔류샘플로부터 획득하였다. 제대혈세포는 Stony Brook University Hospital의 기증자로부터 입수했다. SP53 및 KARPAS 299 림프종 세포주는 ATCC (Manassas, VA)로부터 획득하였다.
렌티 바이러스 생산 및 T세포의 형질도입
바이러스 상청액을 생성하기 위해, 293FT 세포를 제조업체마다의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 pMD2G 및 pSPAX 바이러스 패키징 플라스미드, 그리고 pRSC.CD4.3G 거나 또는 GFP 렌티 바이러스 벡터와 함께 동시-형질감염시켰다. 렌티 바이러스 형질도입 전, 제대 또는 말초혈액 단핵 버피코트세포를 300 IU/mL IL-2 및 1μg/mL 항인간 CD3 (Miltenyi Biotec, Germany)의 존재하에 이틀 동안 활성화시켰다.
T 세포 증식
IL-2로 보충 된 T세포 배지 (50% AIM-V, 40% RPMI 1640, 10% FBS 및 1x 페니실린/스트렙토마이신; 전부 Gibco)에서 CAR-형질도입된 T세포를 7일동안 증식시켰다. 세포 수를 매일 계산했고 2 x 106 세포/mL 이하의 T세포 수를 유지하기 위해 2-3 일 간격으로 배지를 첨가하였다.
CAR 면역 표현형
CAR 세포면역표현형의 분석을 위해, 7일간 증식 후, CD4CAR T세포 및 GFP 대조 세포를 CD45RO, CD45RA, CD62L 및 CD8 (전부 BD Biosciences 제품)로 유동세포측정법 분석을 위해 염색하였다.
공동배양 표적세포 절제 측정법
CD4CAR T 세포 또는 GFP T세포 (대조군)를 표적세포와 함께 1 mL T세포 배양 배지에서 2:1, 5:1 및 10:1의 비율 (각각 20만, 50만 또는 100만개의 작동체세포에 10만 표적세포) 24 시간 동안 IL-2없이 인큐베이션하였다. 표적세포는 KARPAS 299 세포 (CD4를 발현하는 역형성큰T세포림프종), CD4+ T세포 백혈병-Sezary 증후군 환자의 백혈병 세포 그리고 CD4+ PTCL 림프종 환자의 세포였다. 음성 대조로서, CD4CAR T세포 및 GFP T세포를 또한 1 mL의 별도 반응에서 동일한 비율로 CD4를 발현하지 않는 SP53 (외투세포림프종) 세포와 함께 인큐베이션하였다. 24 시간의 공동배양 후, 세포를 마우스 항인간 CD8 및 CD4 항체로 염색 하였다. SP53세포와의 실험에서 SP53세포는 T세포와 공동배양하기전에 CMTMR (Life Technologies)로 표지하였고, T세포는 공동배양 인큐베이션 후 마우스 항인간 CD3 (PerCp)로 표지 하였다.
생체내 마우스 이종 모델
Jackson Laboratory의 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ) 를 Stony Brook University IACUC -승인된 프로토콜 하에서 사용 하였다. 마우스는 전부 수컷이었고 8-12주령 사이였다. 맹검없이 3세트의 생체내 실험을 수행하였다. 각 세트에 대해, 10 마리의 마우스에게 준 치사량 (2.5Gy)의 감마선조사를 조사하고 치료그룹 또는 대조군에 무작위로 할당하였다. 24시간 후, 마우스는 7일 이내에 측정 가능한 피하종양을 형성하기 위해 0.5 x106 또는 1.0 x106 KARPAS 299 세포를 한번 피내 주사하였다. 종양크기 면적은 매일 측정되였다. 첫 번째 세트에서는 100만 KARPAS 299 세포 주사 후 3일째에 200만개의 CD4CAR T (5마리 마우스) 또는 2백만 GFP T대조세포 (5마리 마우스)를 정맥내로 (꼬리정맥 주사에 의해) 마우스에게 투여했다. 22일째에 두번째 투여량인 800백만개 세포가 정맥내로 주사되었다. 두번째 세트에서, 10마리의 NSG 마우스를 조사하고 0.5 x 106 KARPAS 299 세포를 주사했다. 제2일째에 8백만개의 CD4CAR T세포 (5마리 마우스) 및 8백만개의 GFP T대조군세포 (5마리 마우스)를 각 마우스에게 한번에 정맥주사하였다. 제10일째에 두번째 투여량인 550만 세포를 정맥내 주사하였다. 세번째 세트에서, 10마리의 NSG 마우스를 조사하고 0.5 x106 KARPAS 299 세포를 주사하였다. 제1일째에, 마우스에게 정맥내로 2.5 x106 CD4CAR T세포 또는 GFP T대조군세포 (그룹마다 5 마리 마우스)를 주사하였다. 정맥내 주사는 매 5일마다 반복되었고 총 4 개의 코스를 거쳤다.
결과
제3세대 CD4CAR의 생성
항CD4 분자의 scFv (단일 사슬 가변 단편) 뉴클레오타이드 서열은 인간화된 단클론 이발리주맙 (ibalizumab)(Hu5A8 또는 TNX-355로도 공지 됨)에서 유래되었다. 이 단클론 항체는 다양한 제1상 또는 2상 임상시험에 사용되였다. CD4CAR을 통한 신호전달을 향상시키기 위해, CD28 및 4-1BB 보조자극제의 세포내 도메인을 CD3제타 신호전달 도메인에 융합시켰다. 또한, 세포 표면에 CD4CAR 분자의 효율적인 발현을 위해 CD8의 선도서열이 도입되었다. 실제로, 항CD4 scFv는 CD8-유래된 힌지(H) 및 막통과영역 (TM) (도 1A)에 의해 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. CD4CAR DNA 분자는 렌티 바이러스 플라스미드로 서브 클로닝되었다. 두개의 공동자극 도메인 (CD28 및 4-1BB)의 존재때문에 CD4CAR은 제3세대 CAR로 간주된다. CD4CAR 발현은 강력한 SFFV (비장 포커스 형성 바이러스) 프로모터 하에서 통제되며 혈액학적 응용에 적합하다.
CD4CAR의 특성
CD4CAR 구성을 확인하기 위해, 형질감염된 293-FT 세포를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 항CD3제타 단클론 항체로 면역블로팅한 결과, CD4CAR CD3제타 융합 단백질에 대한 예상된 크기의 밴드가 나타났다 (도 1b). 예상대로, CD3제타 발현은 GFP 대조벡터 (도 1B)에서 관찰되지 않았다. 생성된 CD4CAR 렌티 바이러스를 HEK293 세포에서의 형질도입 효율에 관하여 scFv (도 6) 에 대한 유동세포측정법을 통해 또한 테스트하었다. 따라서 우리의 생성된 제3세대 CD4CAR이 CD8 힌지 및 막통과 도메인 그리고 CD28 및 4-1BB 보조자극 도메인 (도 1C)을 내포하면서 세포내 말단에 CD3제타 세포내 도메인, 세포외 말단에 scFv를 포함했다는 것을 확인했다. T세포에서의 CD4CAR 발현 및 기능의 전임상 특성 분석을 위해, 인간 T세포를 항CD3 항체 및 IL-2로 활성화시킨 다음, CD4CAR 및 GFP 대조 렌티 바이러스 상청액으로 각각 형질도입시켰다. 그 다음, T세포를 형질도입 후 7일동안 증식시켰다.
제대혈 유래의 CD4CAR T세포는 고도로 풍부한 CD8+ T세포를 가지고 있고 그들 대부분은 면역표현형처럼 중심기억 T세포를 지닌다.
인간 제대혈액 (CB)은 동종이형 T세포 치료의 대체소스이다. 인간의 CB 버피 코트 세포를 활성화시키고 CD4CAR거나 또는 대조 (GFP) 렌티 바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 후, CD4CAR T세포와 GFP T세포를 7일동안 증식시켜서 CD4CAR과 GFP T세포 (도 7) 양쪽에서 관찰된 세포 수가 20 배 증가하였다. 제7일째에, 세포는 T세포 서브세트 (도2A)에 대한 유동세포측정법에 의해 분석되었다. 유동세포측정법 분석은 T세포의 ~54 %가 CD4CAR (도2B)을 발현한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 우리는 CD4CAR 형질도입 후 T세포증식 과정에서의 CD4와 CD8 서브세트를 분석했다. 이전 발견과 일치하게, CD8 세포의 작은 서브세트는 항CD3 및 보조자극 분자에 의한 T세포 활성화동안 CD4를 발현하도록 유도되었다 (도2C). 예상대로, CD4+ T 서브세트는 세포의 ~33% 가 CD4+ (도2C)로 남아있는 GFP 대조군에 비해 CD4CAR 형질도입 후 3일 또는 4일 내에 거의 완전히 고갈되었다. 이들 데이터는 CD4CAR T세포가 T세포 증식동안 시험관내에서 강력한 항CD4 활성을 나타냄을 표시한다.
우리는 또한 각 배양말기에 CD4CAR T세포의 면역표현형을 평가했다. 자극 후 naive T세포는 중심기억 T세포가 되기 위해 CD45RA를 잃고 CD45RO를 획득한다. 3가지 대표적인 실험에서의 유동세포측정법 분석에서 증식된 T세포의 96 %는 CD45RO+, ~83%는 CD62L+, 그리고 ~80%는 CD8+ CD45RO+CD62L+ 인 반면에 4% 미만은 CD45RA+였다 (도2D). CD8+ CD45RO+ CD62L+ 면역표현형은 중심기억과 같은 표현형의 획득과 일치하며, 낮은 CD45RA+ 발현은 naive T세포 상태의 상실을 확증한다.
제대혈에서 유래된 CD4CAR T세포는 역형성큰세포림프종, Sezary증후군 및 비분류PTCL 림프종을 포함한 CD4표현 백혈병/림프종을 특이적으로 죽인다.
CD8+ T세포가 고도로 풍부한 CD4CAR T세포가 생성되었다 (도2C). 이어서, 세포의 항백혈병 기능을 KARPAS 299 세포주를 사용하여 시험관내에서 측정하었다. KARPAS 299 세포주는 CD4를 발현하는 역형성큰T세포림프종 환자의 말초 혈액으로부터 초기에 확립되었다. 세포유전학적 분석은 KARPAS 299 세포가 많은 세포유전학적 이상을 가지고 있음을 이전에 보여주었다. 공동배양 실험동안, CD4CAR 세포는 중대한 백혈병세포 살상 능력을 나타냈다 (도3A). 우선, CB 유래 KARPAS 299 세포를 제거하는 CD4CAR T세포의 능력에 대해 측정하였다. 실제로, 24시간 인큐베이션과 2:1의 낮은 E:T (작동체:표적) 비율에서, CD4CAR 세포는 성공적으로 KARPAS 299 세포를 제거했다. 대조군으로서, 또한 CD4 음성 림프종 세포를 제거하는 CD4CAR T세포의 능력을 측정하였다. SP53 외투세포림프종 세포주는 CD4를 발현하지 않는 인간 B세포 림프종 세포주이다. 유동세포측정법 분석은 CD4CAR T 세포가 SP53 외투세포림프종을 용해 시키거나 제거 할 수 없음을 보여주었다 (도3D). 환자 샘플을 사용하여 연구도 수행했다. 환자1은 표준화학요법에 반응하지 않는 CD4+ T세포 백혈병, Sezary증후군의 공격적 형태를 나타냈다. 환자 2는 불특정 CD4+ PTCL 림프종을 나타냈다. 두 환자 샘플 모두의 유동세포측정법 분석은 강력하고 균일한 CD4 발현을 나타냈고 거의 모든 백혈구 세포는 CD4를 발현했다 (도3B 및 C). 유동세포측정법 분석으로 시각화 한 바와 같이 환자 샘플을 CD4CAR와 함께 24시간동안 공동 배양하면 CD4+ 악성 종양의 신속하고 확실한 제거를 가져왔으며 다시 한번 98%에 가까운 제거가 Sezary 증후군과 PTCL 공존 배양 모두에서 관찰되였고 이전에 보여진 KARPAS의 절제와 일치하였다 (도 3B와 3C). 따라서 우리는 공동배양 분석에서 CD4CAR T세포가 2:1의 낮은 E:T 비율 (도3B 및 3C) 에서도 환자 샘플로부터 직접적으로 얻은 2가지 상이한 유형의 공격적 CD4+ 림프종/백혈병 세포를 효과적으로 제거한다는 것을 보여주었다. 이들 데이터는 CD4가 CD4 양성 T세포 백혈병 및 림프종에 대한 장래성 있는 치료 표적이며, 항CD19 CAR을 통한 B세포 악성종양의 표적화에서의 CD19의 역할과 유사함을 지지한다. 따라서 우리의 환자 샘플 및 CD4CAR 공동배양 검사는 CD4 양성 악성종양을 표적으로하기 위해 CAR을 사용한다는 개념을 확장시킨다.
PBMCs에서 유래 된 CD4CAR T세포는 CD4를 발현하는 종양 세포주를 특이적으로 죽인다.
자가 차용 CAR T요법이 클리닉에서 보편적으로 사용된 이래, 다음으로 PBMCs (말초 혈액 단핵세포) 유래 CD4CAR T세포를 검사했다. PBMC를 활성화시키고 CD4CAR 렌티 바이러스로 형질도입시켰다. CD4 및 CD8 세트는 세포증식 동안 유동세포측정법에 의해 모니터링되었고, 대조 GFP로 형질도입된 세포의 것과 비교되었다. CB (도 4A)에서 유래된 CD4CAR T세포와 비교되었을 때 PBMCs 유래 CD4CAR T세포는 고도로 풍부한 CD8+ T세포를 가졌고 CD4+ 고갈에서의 CD4CAR의 역할을 나타낸다. 이어서KARPAS 299 세포주를 사용하여 PBMC로부터 유래된 CD4CAR세포의 CD4 양성 백혈병/림프종 세포를 제거하는 능력을측정하였다. 제거 분석은 CD4CAR T세포 또는 GFP T세포를 KARPAS 299 세포 및 SP53 외투세포 림프종 세포주 음성 대조군과의 공동 배양을 포함한다. 24시간 후에 반응은 중단되었다: 죽은 세포를 7-AAD (7-aminoactinomycin D)로 염색하고 살아있는 세포를 유동세포측정법으로 분석하였다. CD4CAR T 세포와 함께 밤새 인큐베이션된 KARPAS 299 세포는 각각 2:1, 5:1 및 10:1의 E:T 비에서 38%, 62% 및 85%의 비율로 제거되었다 (도 4B). 이들 데이터를 종합하면, 강력한 투여량-반응 관계를 입증할 수 있다. 표적세포를 GFP 대조 T세포와 함께 인큐베이션하였을 때, KARPAS 299 세포의 사멸은 관찰되지 않았다. 이들 결과는 CD4CAR T세포 제거가 CD4+ 표적화에 특유하다는 것을 보여준다.
CD4CAR T세포는 생체내에서 중요한 항종양 활성을 나타낸다.
생체내 항종양 활성을 평가하기 위해, 우리는 KARPAS 299 세포주를 사용하여 이종 마우스모델을 개발했다. 생체내에서 CD4CAR T세포 효능을 검증하기 위해 여러 다른 설정이 사용되었다. 우리는 우선 단독 저 투여량 NSG 마우스에서 백혈병의 출현을 지연시키는 CD4CAR T세포의 능력을 검사했다. 주사 전에, 수정된 T세포는 유동세포측정법 분석에 의해 실증된 것처럼 CD4CAR을 발현하는 세포의 ~40 에서 50%를 나타냈다. 마우스에 KARPAS 299 세포를 피내 주사로 투여 한 후 저용량 (200 만) CD4CAR T세포를 단독 전신 주사 (정맥내 투여)로 투여하였다. 백혈병 보유 마우스에 대한 단독 저용량의 전신 CD4CAR T세포 투여는 일시적 퇴보를 야기하거나 백혈병 덩어리의 출현을 지연시켰다 (도 5A). 백혈병의 성장이 가속화되기 시작했을 때, 8 x106 CD4CAR T세포를 추가로 투여하면 백혈병 성장이 현저히 저지되었다 (그림 5A).
CD4CAR 항백혈병 활성의 효능을 추가로 검사하기 위해, 비교적 큰 양의 CD4CAR T세포를 2회 투여하였다. 유사하게, 총13.5 x106 CD4CAR T세포의 두번 주사는 CD4CAR의 더 적은 투여량과 비교하여 더욱 두드러진 백혈병 성장 저지를 일으켰으나 결국 백혈병 세포 집단은 회복되었다 (도5B). 마지막으로 우리는 저용량의 CD4CAR T세포 (각 2.5 x 106 세포)의 여러 코스 주사의 효능을 조사했다. 우리는 피하 백혈병을 지닌 마우스에 CD4CAR T세포를 정맥내로 4 또는 5일에 한번씩 총 4회 반복적으로 주사하였다. 4코스의 CD4CAR T세포 투여 후, 4마리의 치료된 마우스 중 하나는 종양이 없었으며 중독 표현이 없는 것으로 나타났다. 복수 투여 량 CD4CAR T세포로 처리된 마우스는 단일 투여 량에 비해 더 획기적인 항백혈병 효과를 나타냈다 (도 5C 및 5A). 더욱이, CD4CAR T세포로 처리한 것은 GFP 형질도입된 대조 T세포 (도 5D)로 처리한 것과 비교하여 KARPAS 299 림프종을 갖는 마우스의 생존을 현저히 연장시켰다.
항CD4 키메라항원 수용체 (CD4CAR) NK 세포는 효율적으로 T세포를 표적으로한다 전임상 모델에서의 악성 종양
방법 및 재료
원발성 종양세포 및 세포주
인간 백혈병세포는 Stony Brook University의 Institutional Review Board에 의해 승인된 프로토콜을 사용하여 잔류 샘플로부터 획득하였다. 또한 프로토콜에 따라 Stony Brook University Hospital의 기증자로부터 제대혈 세포를 얻었다. 모든 기증자로부터 서면 동의를 얻었다. Karpas 299, HL-60, CCRF-CEM, MOLT4 및 NK-92 세포주는 ATCC (Manassas, VA) 로부터 구입하였다. NK-92 세포는 리보뉴클레오시드 및 데 시리보뉴클레오시드가 없고, 2mM L-글루타민, 1.5g/L 중탄산나트륨, 12.5 % 열불활성화된 말 혈청, 12.5% 열불 활성화된 FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 0.2% 이노시톨, 0.02% 엽산, 그리고 50 μM 베타-멀캅토에탄올이 있는, 달리 명시되지 않는한 IL-2 (300IU/mL)로 보충된 알파-MEM라고 정의된 여과된 NK세포 배지에서 배양되였다. Karpas 299, CCRF-CEM 및 MOLT4 세포주를 RPMI, 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Waltham, MA, USA)에서 배양 하였다. HL-60 세포를 IMDM, 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
CAR 구조물 생성
CD4 특이적 CAR (pRSC.SFFV.CD4.3G)은 4-1BB 및 CD3제타 도메인의 상류에 세포내 CD28 도메인을 포함하도록 설계되어, 그것에 의해 구조물을 제3세대 CAR로 만든다.
렌티 바이러스 생산 및 형질도입
바이러스 상청액을 생성하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 pRSC.SFFV.CD4.3G거나 또는 GFP 렌티 바이러스 벡터 대조를 포함하는 pMD2G 및 pSPAX 바이러스 패키징 플라스미드와 함께 293FT 세포를 동시형질감염시켰다. NK세포는 바이러스 상청액으로 형질 도입되기전에 300IU/mL IL-2의 존재하에 최소 2일동안 배양되었다. 형질감염 및 형질도입 절차는 보충 데이터에 자세히 설명되어 있다.
형질도입된 NK세포에 대한 CAR 검출
CAR 발현을 결정하기 위해 형질도입 3일후에NK 세포를 세척하고 FACs 완충액 (DPBS중 0.2% BSA)에 현탁시켰다. 정상 염소 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 사용하여 비특이적 결합을 차단 하였다. 각각의 NK 세포 샘플을 4℃에서 30분동안 Biotin-표지된 다클론 염소 항마우스 F(Ab')2 (1:250, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)로 탐사하였다. 세포를 한번 세척하고 FACs 완충액에 재현탁했다. 그런 다음 세포를 4℃에서 30분동안 PE-표지된 스트렙타비딘 (1:250, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)으로 염색하였다. 세포를 FACs 완충액으로 세척하고, 2% 포르말린에 재현탁시켰다. FACS Calibur 기기 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 유동세포측정법을 수행하고, 결과를 Kaluza 소프트웨어 (Beckman Coulter, Brea, CA)를 사용하여 분석 하였다.
공동배양 분석
CD4CAR 또는 벡터 대조 NK세포를 CD4 발현하는 Karpas 299 세포 (역형성큰세포림프종), HL-60 세포 (급성 전골수성 백혈병), CCRF-CEM 세포 (급성림프구모성백혈병:T-ALL), 인간 제대혈에서 분리 된 CD4+ T세포 또는 원발성 인간 백혈병 세포 (성인 Sezary 증후군 및 소아과 T-ALL)과 함께 2:1 및 5:1의 비율로 (각각 20만 및 50만개의 작동체세포 대 100,000 개의 표적세포) IL-2없이 1mL의 NK세포 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 24시간의 공동배양 후, 남아있는 생존세포를 수확하고 마우스 항인간 CD56 및 CD4 항체로 염색하고, 4℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. CD56+ 단일 양성은 NK세포를 나타냈고, CD4+ 단일 양성은 표적세포를 나타냈다. 모든 세포를 FACs 완충액으로 세척하고, 2% 포르말린에 현탁시키고, 유동세포측정법으로 분석하였다.
세포 독성 분석
CD4CAR 또는 벡터 대조 NK 세포를 작동체:표적 1:1, 1:2 및 1:4 의 비율의 NK-세포 배양 배지 1 mL에서 IL-2없이 온타겟 세포 (CFSE-염색된 Karpas 299 세포 및 CMTMR-염색 CCRF-CEM 세포) 및 오프타겟 CMTR-표지된 MOLT4 세포의 50:50 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 7-AAD (BioLegend, San Diego, CA)로 염색하고, FACS 완충액으로 세척하고, 살아있는 7-AAD 음성 세포를 유동세포측정법으로 분석하였다.
집락형성단위 (CFU) 분석법
CD4CAR NK세포는 IL-2가 보충된 NK세포 배지에서 24시간동안 500 CD34+ CB 세포를 각각 2:1 및 5:1의 작동체: 표적 비로 공동배양하였다. 사용된 대조군은 CD34+ 세포 단독 및 비형질도입된 NK 세포가 CD34+ CB세포와 2:1 및 5:1의 작동체: 표적 비로 공 배양 된 것이다. 조혈구획 출력은 제16일째에 적혈구 버스트형성단위 (BFU-E)의 형성 및 과립구/단구 집락형성단위 (CFU-GM)의 수를 통해 평가하였다. CFU 통계분석은 알파를 0.05로 설정한 2-way ANOVA를 통해 수행되었다.
이종 마우스 모델
수컷 12주령 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcsid Il2rgtm1Wjl/SzJ)를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하여 Stony Brook University IACUC- 승인된 프로토콜하에서 사용하였다. NSG 마우스에게 준치사량 (2.5Gy)의 감마조사를 했다. 24시간 후에, 측정가능한 피하종양을 형성하기 위해 루시페레이스를 발현하도록 안정적으로 형질도입된 0.5 x106 Karpas 299 세포를 마우스에게 피내 주사하였다. 제1일째, Karpas 299 세포 주사 후 24시간에 5 x 106 CD4CAR NK세포 또는 벡터 대조 NK세포 (그룹마다 N=4)를 마우스에게 꼬리정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 정맥내 주사는 매 5일마다 모두 6코스가 반복되었다. 종양크기 면적은 매일 측정되었다. Karpas 299 세포 주사 후 제7, 14, 및 21일째에 마우스에 100 μL RediJect D-Luciferin (Perkin Elmer, Waltham, MA)을 피하 주사하여 IVIS 이미징 (PerkinElmer, Waltham, MA)을 실행했다. Caliper Life Sciences 소프트웨어 (PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 이미지를 분석했다.
통계
이종 모델 샘플 크기는 2-샘플, 양측 등가성 검정력 분석(90% 검정력 및 5% 미만 유의성)을 사용하여 추정했다. Unpaired Student T tests는 종양크기 면적과 광 강도의 유의도를 결정하는 데 사용되었다. Kaplan-Meier 방법을 이용하여 생존곡선을 구축하고 생존의 통계 분석은 P <0.05일 때 유의로 간주하는 log-rank (Mantel-Cox) 검정을 사용하여 수행되었다. GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행했다. unpaired student-test 전에 치료군과 대조군간에 분산 (variance)이 유사하다고 결정되었다.
결과
제3세대 CD4CAR의 생성
항CD4 분자의 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 뉴클레오타이드 서열은 HIV를 위한 임상시험에서 안전성 및 효능이 잘 연구된 인간화 단클론 항체 이발리주맙 (ibaizumab) (Hu5A8 또는 TNX-355)으로부터 유래되었다. 신호전달을 향상시키기 위해 CD4CAR은 CD3제타 신호전달 도메인에 융합 된 CD28 및 4-1BB 도메인으로 설계되어 제3세대 CAR로 되였다. CD19 표적으로 하는 제3세대 CAR T세포는 이전에 임상시험에서 우수한 효능으로 사용되어왔다. NK세포 표면에서 CD4CAR 분자를 효율적으로 발현시키기 위해 강력한 비장 포커스 형성 바이러스 프로모터 (SFFV)를 사용하고 CD8의 선도서열을 구조물에 통합시켰다. 항CD4 scFv는 CD8- 유래 힌지 (H) 및 막통과 영역 (TM)에 의해 세포내 신호전달 도메인으로부터 분리되었다 (도 8A 및 8C). CD4CAR DNA 분자는이어서 렌티 바이러스 플라스미드로 서브클로닝되었다.
CD4CAR의 특성
CD4CAR 구조를 확인하기 위해, HEK293-FT 세포를 CD4CAR 렌티 바이러스 플라스미드 또는 벡터 대조 플라스미드로 형질감염시키고, 48 시간 후에 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하였다. 항CD3제타 단클론 항체로 면역블로팅한 결과, CD4CAR-CD3제타 융합 단백질의 예측된 크기의 밴드가 나타났다 (도 8B). 예상대로, CD3제타 발현은 GFP 벡터 대조 단백질에서 관찰되지 않았다 (도 8B).
CD4CAR NK 세포의 생성
CD4CAR NK 형질도입 효율은 유동세포측정법 (도 9A 상단 패널)에 의해 측정된 대로 15.9 %로 결정되었다. 다음으로, CD4CAR+ NK세포를 더욱 풍부하게하기 위해 형광활성세포분류 (FACS)를 사용했다. 분류 후, 수집된 CD4CARhigh NK세포는 85% 이상의 CD4CAR 양성인 것으로 확인되었다 (도 15). CD4CARhigh 세포의 FACS 수집 후, CD4CAR 발현수준은 최대 10개의 계대의 확장동안 및 냉동보존 후 NK세포에서 75-90 %로 일관되게 안정하게 유지되었다. 실제로, 공동배양 실험의 개시시, 확장된 CD4CARhigh NK세포는 CAR을 85%로 발현시켰다 (도 9A 하부 패널).
CD4CAR NK세포는 역형성큰T세포림프종(Karpas 299), 급성골수성백혈병 (HL-60) 및 T세포급성림프모구성백혈병 (CCRF-CEM)을 포함하는 CD4+ 혈액 암세포를 특이적으로 용해한다.
아래 CD4+ 세포주: Karpas 299, HL-60 및 CCRF-CEM를 사용하여 시험관내에서의 항림프종 활성에 대해 CD4CAR NK세포를 시험하였다. Karpas 299 세포주는 역형성큰T세포림프종이 있는 25세 환자의 말초 혈액으로부터 확립되었다. HL-60 세포주는 급성전골수성백혈병이 있는 36세 환자의 말초 혈액으로부터 확립되었다. CCRF-CEM 세포주는 T세포급성림프모구성백혈병 (T-ALL)이 있는 4세 환자의 말초 혈액으로부터 확립되었다.
24시간 공동배양실험 동안, CD4CAR NK세포는 낮은 작동체세포 대 표적세포 (E:T) 2:1 비 (도10A) 및 표준 5:1 비율 (도 10C)에서 CD4 양성 백혈병/림프종 세포의 심각한 사멸을 보여주었다. 공동배양 세포독성 분석에서, 표적 종양세포는 CD4+, CD56- 면역표현형 (유동세포측정법 차트상에서 청색으로 표시됨)에 의해 식별되었다. 예상대로, 벡터 대조 NK세포는 NK세포에 선천적인 일부 비특이적 종양세포 살상 능력을 나타내지만, 예상 한 바와 같이 CD4CAR NK세포에 비해 CD4+ 종양 세포에 대해 훨씬 덜 효과적이었다. Karpas 299 세포의 단독분석으로 99.1%의 CD4+ 발현을 확인했다 (도1A 상단 패널). 현저하게, 2:1의 E:T 비율에서, CD4CAR NK세포는 벡터 대조 (N=2)와 비교하여 100% Karpas 299 세포를 완전하게 제거하였다 (도 10A 상부 패널 및 10C). 유사하게, HL-60 및 CCRF-CEM 세포의 단독 분석으로 CD4의 각각 99.9% 및 92.1%의 높은 발현을 확인했다 (도 10A 중간 및 하위 패널). 마찬가지로, E:T 비율이 2:1 일 때, CD4CAR NK세포는 벡터 대조 (도10A 및 10C)와 비교하여 HL-60세포의 75% 및 CCRF-CEM세포의 97%를 확고하게 용해시켰다. 이들 데이터를 종합하면, CD4CAR NK세포가 NK세포에 내재하는 비특이적 항종양세포 활성을 보유하는 것 이외에 CD4+ 세포를 특이적으로 강력하게 표적하는 것으로 나타났다.
공동배양연구는 또한 환자 샘플 (도10B 및 10C)을 사용하여 실시되었다. 환자1은 표준화학요법에 반응하지 않는 CD4+ 피부 T세포 림프종의 공격적인 형태인 Sezary증후군을 나타냈다. Sezary증후군은 PTCL의 하위집합이다. 환자1의 백혈병세포는 유동세포측정법 (도10B)을 통해 78.1% CD4+로 평가되었다. 환자2는 CD4+ 소아 T세포 급성림프모구성백혈병 (T-ALL)을 나타냈다. 비슷하게, 환자2의 세포는 유동세포측정법 (도 10B)을 통해 43.7% CD4+로 평가되었다. 2:1의 낮은 E:T 비율에서 24시간의 공동배양 후 CD4CAR NK세포는 환자1의 CD4+ Sezary증후군 세포 58% 및 환자2의 CD4+ T-ALL 세포 78 %를 용해시켰다 (N = 2 ). 더욱이, 5:1의 증가된 E:T 비율에서 CD4CAR NK세포는 환자1의 Sezary 증후군 세포 82%와 환자2의 T-ALL세포 82%를 용해시켰다 (N = 2) (도10C 및도 14). 이들 데이터는 성인 및 소아 CD4+ T세포백혈병 및 림프종 양쪽 모두의 세포주 및 환자샘플 설정에 있어서 투여량에 의존적인 반응 및 효력이 있는 CD4CAR NK세포의 항종양 활성을 강력히 시사한다.
CD4CAR NK세포는 CD4 발현하는 종양세포주를 투여량에 의존적인 방식으로 특이적으로 용해시킨다.
CD4CAR NK 세포는 작동체:표적 비율 1:4, 1:2 및 1:1 (도11)에서 투여량에 의존적인 방식으로 시험관내에서의 CD4+ Karpas 299 및 CCRF-CEM 백혈병세포주를 특이적으로 용해한다. 각 공동배양 E:T 비율에 대해, CD4CAR NK작동체세포 또는 벡터 대조군 NK작동체세포를 동일한 수의 온-타겟 CD4+세포, CFSE염색된 Karpas 299 또는 CFSE염색 CCRF-CEM 그리고 "오프-타겟" CMTMR염색된 CD4-, CD5+ MOLT4 급성림프모구성백혈병세포으로 구성된 종양세포와 함께 인큐베이션하였다. MOLT4세포는 개시세포 수의 변화 및 자발적 표적세포사를 설명하기 위해 포함되었다. 24시간 후, 살아있는 세포를 유동세포측정법으로 분석하였다. CD4CAR NK 공동배양에서의 CD4+ 표적세포 생존을 벡터대조 NK 공동배양의 것과 비교하는 것을 통해 표적세포의 용해퍼센트를 측정하였다. Karpas 299 세포는 작동체 대 표적 비율 1:4, 1:2 및 1:1에서 67%, 95% 및 10 %의 비율로 각각 제거되었다 (도11). 그리고 CCRF-CEM세포는 동일한 E:T 비율에서 각각 39 %, 58 % 및 69 %의 비율로 제거되었다 (도11). 예상대로, CD4CAR NK세포는 유동세포측정법 분석에 의해 <5 % CD4+인 것으로 확인 된 CMTMR-표지된 MOLT4세포를 용해시키지 않았다 (도 16A). 추가 공동배양실험은 CD4CAR NK세포가 0시간, 4시간, 8시간 및 24시간 (도 16B)에 MOLT4 세포를 용해시키지 않는 반면, 초기 4시간에 유동세포측정법에 의해 검출된 대로CD4CAR NK세포가 Karpas 299 세포를 용해시켰음을 확인하였다 (도 16C). 이들 데이터를 종합하면, CD4CAR NK세포 항종양 세포독성은 투여량에 의존적이며 신속한 개시 및 CD4+ 세포에 대한 고도로 특이적임을 나타낸다.
제대혈로부터 분리된 CD4+ T세포를 사용하여 추가적인 공동배양 연구를 수행 하였다. 이들 실험에서, CD4CAR NK세포는 24시간의 공동배양 후 2:1의 작동체:표적 비율로 CD4+ T세포를 완전히 고갈시켰고 나머지 세포는 0.0% CD4+를 가진다. 예상한 대로, 대응하는 벡터 대조 NK세포 (CD56+, CD4-)와 CD4+ 제대혈세포를 공동배양 후, CD4+ 집단은 대부분 손상되지 않았으며 (도12A), 건강한 조직의 CD4+ 집단에 대한 특이적이고 강력한 CD4CAR NK를 매개로 하는 고갈을 추가로 확인했다.
CD4CAR NK세포는 조혈구획에서의 줄기세포의 출력에 영향을 미치지 않는다.
CFU (집락형성단위)검사 분석은, CD4CAR NK세포가 조혈구획의 CD34+ 제대혈 줄기세포 출력에 유의한 영향을 미치지 않음을 밝혔다. 조혈구획 출력은 제0일째 적혈구 전구세포 및 과립구/큰포식세포의 전구세포의 존재에 의해 평가되었고, 제16일째 적혈구 버스트형성단위 (BFU-E)의 수와 과립구/단구 집락형성단위 (CFU-GM)의 수에 의해 확인되었다 (도 12b). 이 발견은 성숙한 T세포 표지자인 CD4의 특이적인 표적화, 조혈줄기세포 및 조기전구세포에 대한 제한된 영향, 그리고 치료 안전성의 척도인 혈통왜곡의 증거가 없는 것과 일치하다.
CD4CAR NK세포는 생체내에서의 현저한 항종양 활성을 나타낸다
CD4CAR NK세포의 생체내에서의 항종양 활성을 평가하기 위해, 우리는 준치사적으로 조사되고 루시페레이스 발현 Karpas 299가 피내 주사된 NSG 를 사용하여 이종 마우스 모델을 개발하고 측정 가능한 종양형성을 유도하였다. 제1일째, Karpas 299 세포 주사 24시간 후, 그리고 그 후에 매 5일마다 총 6코스, 투여 마다 5 x 106 CD4CAR NK세포 또는 벡터 대조 NK 대조세포를 마우스에게 정맥내 주사 하였다. 제7, 14, 및 21일째에 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하여 IVIS 영상을 시행하여 종양의 부담을 측정했다 (도13A). CD4CAR NK 주사 마우스에 대해 측정된 평균 광 강도를 벡터 대조 NK 주사 마우스의 것과 비교하였다 (도13B). 제21일째까지, CD4CAR NK 주사된 마우스는 벡터 대조에 비해 광 강도가 현저히 낮았고 그로 인해 종양 부담이 적었다 (p <0.01). 제1일째 및 그 후 격일로 종양크기 면적을 측정하고 두 그룹간의 평균 종양크기를 비교 하였다 (도 13C). 시작하는 제17일째 (p <0.05)와 계속하는 제19-25일째 (p <0.01)에 CD4CAR NK 주사 마우스의 평균 종양크기가 벡터 대조군 NK 주사 마우스의 것보다 현저히 작았다는 것이Unpaired student T test 분석에서 밝혀졌다. 다음으로, 우리는 두 그룹간의 마우스 생존을 비교했다 (도13D). 모든 CD4CAR NK 주사된 마우스는 지난 30일동안 생존했다. 그러나, 벡터 대조 NK 주사된 마우스의 생존률은 제17일째에 감소하기 시작하여 제23일째에 생존이 없었다. 요약하면, 이들 생체내 데이터는 CD4CAR NK세포가 Karpas 299 주사 NSG 마우스에서의 종양의 부담을 현저히 감소시키고 생존기간을 연장시킨다는 것을 가리킨다.
항CD5 키메라항원 수용체 (CD5CAR) T세포는 CD5 양성 혈액종양을 효과적으로 표적한다
실례
결과
제3세대 CD5CAR의 생성
고정된 CD5 scFv 항체뿐만 아니라 CD5CAR의 구조물은 CD5 발현 세포의 표적화 및 용해 그리고 그들 자신의 CD5CAR T 세포 집단내에서 CD5 발현을 하향조절하는 CD5CAR T세포의 능력의 관점에서 CD5CAR T 세포의 기능 및 기전을 시험하기 위해 고안되었다 (도 17A). CD5CAR 구조물을 확인하기 위해, 생성된 CD5CAR 렌티 바이러스를 HEK293 세포로 형질도입하였다. CD5CAR 또는 GFP렌티 바이러스로 48시간 처리한 후, HEK293 세포에서의 CD5CAR의 발현을 CD5CAR 단백질의 C-말단 영역을 인식하는 CD3제타 항체를 사용한 웨스턴블롯 분석 (도 17B)에 의해 확인하였다. 결과 밴드는 CD5CAR 형질도입된 HEK293 세포에서의 CD5CAR 단백질의 예측 된 크기였지만, GFP 형질도입된 HEK293 세포는 웨스턴 블롯 분석에 의해 임의의 특정 밴드를 나타내지 않았다. 미래 실험을 위한 CD5CAR 단백질의 기능을 평가하기 위해, CD5CAR 렌티 바이러스를 활성화된 인간 T세포로 형질도입하였다. T세포 표면의 CD5CAR 발현은 CD5CAR 단백질의 scFv 영역을 인식하는 염소 항마우스 F(ab’) 항체를 이용한 유동세포측정법으로 평가하였다. 유동세포측정법 분석 결과, isotype 대조군에 비교하여 CD5CAR로 형질도입된 T세포에서 CD5CAR 발현의 약 20%가 관찰되었다 (도17C). 이들 결과는 다음 실험을 위해 우리가 성공적으로 CD5CAR 발현 T세포를 생성했다는 것을 가리킨다.
CAR 치료를 위한 CD5 발현의 하향 조절
CD5CAR T세포 공동배양 및 동물분석에 앞서, CD5CAR T세포의 표면에서의 CD5의 발현은 CD5CAR T집단내에서 자가살상을 피면하기 위해 하향조절된다. CD5의 하향조절은 CAR T세포 집단내에서의 CAR T세포의 자가살생을 방지할것이고, CD5의 하향조절은 T세포의 증가된 살상능력과 관련된다. CAR 자체의 구조물에 관계없이 CD5 발현이 없는 T세포내에서 생산되는 CAR은 슈퍼 기능성 CAR일 수 있다. CD5 CAR T세포의 생성 및 CD5 CAR 렌티 바이러스의 단일 또는 이중 형질도입을 이용한 CD5 하향 조절의 비교에 대한 단계를 도18A 및 B에 보여주었다. 비농축된 CD5 CAR 렌티 바이러스를 가진 단일 형질도입된 CD5CAR T세포는 제8일째까지 세포표면으로부터 CD5 단백질의 완전한 하향조절을 나타내지 않았고 제6일째에 최대 CD5 음성 집단이 46%까지 올라갔다 (도 18C). 이중 형질도입된 집단에서는 형질도입된 T세포의 약 90%가 4일동안 인큐베이션에서 CD5 음성으로 변경되었다. 대조적으로, GFP T세포 대조군은 제2일째부터 8일째까지 95% 이상의 CD5+, CD3+ 이중양성집단을 유지한다 (도 18C).
T세포에서의 CD5 발현의 하향조절은 고정된 CD5CAR scFv 렌티 바이러스의 형질도입에 의해 달성될 수있다.
CD5CAR이 T세포에서의 CD5 발현을 하향조절하는 기전을 추가로 밝히기 위해, 고정된 CD5 scFv (SEQ ID NO. 7)라는 제목의 새로운 구조물이 제조되었다 (도 17A). 이 구조물은 CD5 scFv가 T세포표면에 고정할 수있게 하는, 힌지영역을 통하여 막통과 도메인에 줄지어있는 항CD5 scFv를 포함한다. 고정된 CD5 scFv 폴리펩타이드 (SEQ ID NO. 16)는 기능성 CD5CAR로 관찰된 바와 같이 표적세포 용해없이 CD5 표적에 붙는다. 인큐베이션 제7일째에 T세포에 대한 CD5 발현의 부분적 하향 조절을 갖는, 단일 형질도입 및 유동데이터 분석을 도19A 및 19B에 보여준다. 이것은 단일 형질도입 후 CD5CAR T세포에서 보이는 CD5 발현의 부분적인 하향 조절과 일치한다.
CD5CAR T세포는 T세포 ALL 세포주를 효과적으로 용해시킨다.
CD5CAR T세포의 살상 능력은 도20A 및 20B에서 보여준바와 같이 T세포 ALL 확립한 세포주 CCRF-CEM 및 MOLT-4, 그리고 역형성큰세포백혈병 세포주 KARPAS 299에 대하여 먼저 시험하였다. GFP 대조군과 비교했을 때 두가지 CD5+ 세포주에서 탐욕스러운 살상능력이 보이는 데 두 세포주 모두 75% 이상의 표적세포 용해를 가진다. 0%의 용해가 역형성큰세포주 KARPAS 299에서 관찰되었으며 이는 CD5에 대해 음성이다.
CD5CAR T세포는 인간 샘플에서 얻은 T세포 ALL 세포를 효과적으로 용해시킨다.
환자 샘플 T-ALL 세포를 용해시키는 CD5CAR 능력 또한 복수 환자 샘플을 사용하여 평가하였고, CD5CAR 세포 공동배양을 도21 및 도22에 보여주었다. CD5CAR 세포가 T세포 ALL 세포주를 표적으로 했을 때 보인 CD5 표적세포 용해와 비숫한 T-ALL1 환자 백혈병 세포에 대한 주목할만한 탐욕스러운 세포사멸이 있었지만, 3명의 다른 환자 백혈구세포는 표적세포의 비교적 약한 용해를 보여주었다 (도21a 및 도21b 참조).
환자 백혈병세포에 대한 CD5CAR에 의한 살상 능력은 도21A, 21B 및 21D에 나타낸 바와 같이 CD5 발현의 강도와 상관 관계가 있다. 도21C 및 21D에 나타낸 바와 같이, 유동세포측정법 분석을 통한 T-ALL-1, T-ALL3, T-ALL6 및 T-ALL 7에 대한 CD5 발현이 관찰되었다. CD5 발현은 T-ALL-1 샘플을 제외하고 T-ALL 환자 샘플에서 유의하게 낮았다.
CD5CAR T세포는 특이성 및 강력한 표적세포 살상을 나타낸다.
대조군으로서, CD5CAR T세포를 또한 CD5 음성 백혈병 T세포를 제거하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 역형성큰T세포림프종 세포주는 CD5를 발현하지 않는 세포주이다. 유동세포측정법 분석은 CD5CAR T세포가 도21A의 하부 패널에 나타낸 바와 같이 KARPAS 299 세포를 용해 또는 제거할 수 없음을 보여 주었다.
높은 수준의 CD5 발현을 가진 환자 샘플 (T-ALL-8)은 T-ALL의 최소의 병이 있는 환자에게서 얻어졌다. 공동배양은 CD5CAR로 수행하고 도22에서 보여준 바와 같이 자세하게 분석하였다. CD5+ 정상 T세포, CD5+CD34+ T-ALL 세포 및 CD5-CD34+ T-ALL 세포를 포함한 세 집단 세포를 공동배양 후 유동세포측정법에 의해 평가하였다. CD5CAR은 GFP 대조과 비교했을 때 CD5+세포 집단 전체에 대한 93% 이상의 CD5 양성 세포 용해로 특이성과 강력한 표적세포 용해 능력을 보였다. CD5CAR은 CD5 정상 T세포만큼 효율적으로 백혈병세포를 사멸시켰다. 사멸은 CD5 음성 집단에서 관찰되지 않았다. CD5CAR T세포는 본질적으로 T세포 집단 (CD5+CD34-)을 제거 하였다.
CD5CAR T세포는 정상 T세포를 효과적으로 제거한다.
CD5CAR T세포는 0.25:1, 0.5:1 및 1:1의 낮은 비율 (작동체:표적)에서의 공동배양 분석에서 투여량 의존적인 방식으로 정상 T세포를 효과적으로 제거하는 것을 보여주었다 (도23). CD5CAR T세포 또는 CD123CAR T (대조군) 작동체세포를 GFP 표지된 T세포와 함께 인큐베이션하였다. CD5CAR T 공동배양에서의 GFP T세포 생존을 CD123CAR T 대조군 공동배양에서의 것과 비교하여 표적세포의 퍼센트 살상을 측정하였다. 정상 GFP T세포는 CD5CAR T세포의 투여량-반응 방식으로 제거되었다. CD5 CAR T세포는 작동체 대 표적 비율 1:1에서 GFP T세포 전부를 효과적으로 제거했다 (도23). CD5CAR T세포가 모든 정상 T세포를 효과적으로 제거한 이래, CD5CAR T 치료의 타당성은 영구적이 아닌 일시적으로 제공하는 능력에 달려 있어야 한다. CD5CAR T세포는 조혈세포 이식을 위한 새로운 조건화 요법 또는 "가교"로 사용될 수 있다.
T 세포는 CD5CAR 또는 고정된 CD5 scFv T세포와 함께 배양되었을 때 CD5 발현을 유지하였다.
CD5 특성중 하나는 항체에 의한 결합후의 내재화이다. 결과적으로 표적세포는 표적된 항원을 잃어서 항원 탈출을 일으킬수 있다. 이 현상은 CAR T세포 기반 요법을 사용하는 임상연구에서 실패의 원인으로 보고되었다. 우리는다음으로 공동배양 분석을 사용하여 CD5 양성 T 또는 백혈병세포에서의 CD5 발현에 CD5 CAR 또는 고정된 CD5 scFv T세포가 영향을 미치는 지 아닌지 문제점을 조사한다. CD5CAR T세포 또는 고정된 CD5 scFv T세포 및 CD123 CAR T세포 (대조군)의 생성을 위한 단계를 도24a에 보여주었다. lenti-CD5CAR 또는 고정 된 CD5 scFv 및 CD123CAR 바이러스를 통한 두번째의 T세포 형질도입 후 제3 일째에, 형질도입된 T세포를 유동세포측정법에 의한 CD5의 발현으로 분석하였다. CD5CAR거나 또는 고정된 CD5 scFv 렌티 바이러스로 형질도입된 T세포는 본질적으로 표면 CD5 단백질의 완전한 하향조절을 나타내었다 (도24B). 대조적으로, CD123 CAR 형질도입한 T세포 대조군은 CD5 발현을 유지하였다.
우리는 이어서 형질도입된 CD5CAR 또는 CD5 고정된 scFv 및 CD123CAR T세포를 GFP-표지된 T세포와 1:1 (E:T) 비율로 2 또는 4일동안 공동배양하였다. 도25A 및 B에 나타낸 바와 같이, CD5CAR T세포는 GFP-T세포 전부를 효과적으로 제거하였다. 예상대로, 형질도입된 CD5 고정된 scFv 또는 CD123CAR T세포는 GFP T 세포를 용해시킬 수 없었다. 추가로, GFP T세포는 형질도입된 CD5 고정된 scFv 또는 CD123CAR T 세포와 함께 배양 될 때 여전히 CD5를 발현하였다. 이 연구들은 면역요법을 위한 CD5CAR을 사용할 때 CD5 항원 탈출이 일어날 가망이 없음을 나타냈다.
lenti-CD5CAR 또는 CD5 고정된 scFv 바이러스로 형질도입되었을 때의 T ALL 세포에 있어서 CD5 발현의 하향 조절.
우리는 다음으로 T ALL 세포에 대한 CD5CAR 또는 고정된 CD5CAR 렌티 바이러스의 형질도입이 CD5 발현의 하향조절을 일으키는 지 여부를 시험하였다. CCRF-CEM 및 MOLT-4 T-ALL 세포는 CD5CAR- 또는 고정된 CD5 scFv 렌티 바이러스로 형질도입되었다. CD5CAR 또는 고정된 CD5 scFv는 이들 백혈병세포에서의 표면 CD5 발현 양을 현저하게 하향조절하거나 감소시켰다 (도 25C). 대조적으로, T세포는 이들 세포가 형질도입된 고정된 CD5 scFv T세포와 공동배양하는데 사용되었을 때 CD5 발현을 유지하였다 (도24A 및 B).
CD5CAR T세포는 생체내에서 심각한 항종양 활성을 나타낸다.
환자에서의 치료적 효능 예측인자로서의 CD5CAR T세포 생체내 항종양 활성을 평가하기 위해, 우리는 NSG 마우스에 준치사적으로 (2.0 Gy) 조사하고 1.0 x 106 개의 개똥벌레 루시페레이스 (firefly luciferase)를 발현하는 CCRF-CEM 세포 (CD5+)를 정맥내 주사하여 측정가능한 종양형성을 유도하는 것을 통해 이종이식 마우스 모델을 개발하였다. CCRF-CEM-Luc+ 세포 주사 후 제3일째에 마우스에게 5 x 106 CD5CAR T세포 또는 벡터 대조 T세포를 정맥내 주사하였다. 이들 주사는 제4일, 6일 및 7일째에 반복되었고, 마우스마다 총 20 x 106 T세포가 주사되었다. 제5, 8, 10 및 13일째에, 마우스에게 RediJect D-Luciferin (Perkin-Elmer)을 피하 주사하고 IVIS 영상 (Caliper LifeSciences)을 실시하여 종양부하를 측정하였다 (도 26A). CD5CAR T세포 주사된 마우스에 대해 측정된 평균 광 강도를 벡터 대조 T 주사된 마우스의 것과 비교 하였다 (도26B). Paired T test 분석에서 제13일째까지 대조군에 비하여 CD5CAR T 주사 그룹은 보다 적은 광 강도와 따라서 보다 적은 종양부하를 가져서 두 그룹간에 매우 높은 현저한 차이를 나타냈다 (p <0.0012). 추가 분석 결과, 제5일째에 CD5CAR T세포로 3일전에 처리한 마우스는 대조군 마우스에 비해 종양 부담이 53% 낮았으며, 그 백분율은 제8일째에 95%까지 향상되었다 (도 26C). 제13일째에 치료된 마우스의 종양부담은 배경수준 가까이 유지하였다. 제15일째, CCRF-CEM거나 또는 T세포 (배경 대조군으로 작용 함)를 주사하지 않은 2마리의 마우스를 포함하여 각 마우스로부터 소량의 말초혈액을 추출하고 이식된 CCRF-CEM 세포 (CD5+)의 존재에 대해 유동세포측정법으로 분석하였다. 대조 T세포를 받은 마우스는 28-43% 사이의 CCRF-CEM 종양세포가 있었지만 (도26D), CD5CAR T세포로 처리한 마우스에서의 종양세포의 백분율이 배경수준 (<1%) 가까이 떨어지면서 결과는 완벽하게 영상을 반영했다. 요약하면, 이들 생체내 데이터는 CD5CAR T세포가 벡터 대조 T세포와 비교하여 CCRF-CEM 주사된 NSG 마우스에서 종양부담을 확고하게 줄이고 생존을 연장시킨다는 것을 가리킨다.
항CD5 키메라항원 수용체 (CD5CAR) NK세포는 CD5 양성 혈액종양을 효과적으로 제거한다.
실례
결과
CD5NK-CAR 생성
항CD5 분자는 신호전달을 향상시키기 위해 CD3제타 신호전달 도메인에 융합된 CD28 및 4-1BB 도메인과 함께 결합된 단일사슬 가변단편 (scFv)을 포함하는 모듈식 디자인으로 제3세대 CAR가 되게 한다. NK세포 표면에서의 CD5CAR 분자의 효율적 발현을 위해 강력한 비장포커스형성 바이러스 프로모터 (SFFV)를 사용하고 CD8 선도서열을 구조물에 편입시켰다. 항CD5 scFv는 CD8 유래 힌지 (H) 및 막통과 (TM) 영역을 통해 세포내 신호전달 도메인에 부착된다. 이 CD5CAR 구조물은 이어서 렌티 바이러스 플라스미드에 클로닝되었다.
CD5CAR NK 세포의 생성
CD5CAR의 형질도입 효율은 유동세포측정법 분석에 의해 측정되었다. CD5CAR + NK세포를 풍부하게 하기 위해, 최고 발현 NK세포를 유동세포측정법을 사용하여 수확했다. 분류 후, CD5CARhigh NK의 발현은 시험관내 및 생체내 효능 연구를 위해 확대되었다.
CD5CAR NK세포는 인간 T세포 급성림프모구성백혈병 (T-ALL) 세포주를 효과적으로 제거한다
CD5CAR NK세포를 CCRF-CEM, MOLT-4 및 Jurkat 세포주를 사용하여 시험관내에서의 항T-ALL 활성에 대해 시험하였다. 이들 T-ALL 세포주 전부는 모두 CD5를 높게 발현한다.
공동배양 실험동안, CD5CAR NK세포는 2:1 및 5:1의 낮은 작동체세포 대 표적세포 비율 (E:T)에서 CCRF-CEM의 심각한 사멸을 나타내었다. 이러한 비율에서, CD5CAR NK 세포는 사실상 CCRF-CEM 세포를 제거했다 (도27A). CD5CAR NK세포는 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1 및 5:1의 작동체:표적 비율에서 투여량 의존적인 방식으로 시험관내에서 CCRF-CEM 백혈병세포를 용해시켰다 (도27B 및 27C). 부가된 2개의 T-ALL 세포, MOLT-4 및 Jurkat를 사용하여 CD5NK 세포에 대한 항백혈병 활성을 시험하였다. 이들 두 세포주에 대한 공동배양연구는 CD5CAR NK세포로 수행되었다. CD5CAR NK세포는 2:1의 낮은 작동체:표적 비율에서 MOLT-4 및 Jurkat 세포를 본질적으로 제거했다 (도28A 및 B).
CD5CAR NK세포는 인간 샘플을 사용하여 공격적인 CD5+ T-ALL 세포를 효과적으로 제거한다
공동배양실험은 또한 환자 샘플을 사용하여 수행되었다 (도29A, B). 환자1과 2 모두는 표준화학요법에 반응하지 않는 T-ALL이었다. 환자1 (T-ALL # 1)은 CD5 양성인 T-ALL 세포의 작은 부분집합을 가졌다. 이 환자의 백혈병세포를 CD5CAR NK세포와 함께 공동배양하였다. 세포 세포추적자 염료 (CMTMR)를 사용한 유동세포측정법으로 표적집단을 게이팅하고 정량화하여 환자의 세포를 표지하였다. 표적 CD5+CD34+ 세포집단을 아이소형 (isotype) 대조군에 대비해 게이팅하였다. CD5CAR NK세포는 5:1의 E:T 비율로 CD34+CD5+ 백혈병세포의 약 60%를 용해시켰다. 중요하게는, CD5CAR NK세포는 CD5- 세포집단에 대한 어떠한 활성도 나타내지 않았고 이는 표적항원 에피토프에 대비한 (선택적으로) 특이적이고 지향적인 활성을 의미한다. 환자2는 CD5에 대해 사실상 양성이었고 CD5CAR NK세포와 함께 배양된 T-ALL 집단을 가졌었다. CD5CAR NK세포는 dim CD5+CD34+집단에 대비해 강력한 활성을 가지고 고도로 발현하는 CD5+를 갖는 표적 집단에 대한 거의 완전한 용해를 나타내었다 (도 29B).
CD5CAR NK세포는 인간 샘플을 사용하여 공격적 CD5+ 말초 T세포 림프종 (PTCL) 세포를 효과적으로 제거한다.
환자3은 CD4+ PTCL (분류되지 않은 유형)을, Sezary증후군 환자4는 표준화학요법에 반응하지 않는 공격적인 형태의 PTCL을 나타냈다. 환자3의 림프종세포를 24시간동안 CD5CAR NK세포와 함께 공동배양하였다. 백혈병세포는 CD5+CD7- 양성이며 CD5+CD7-집단은 유동세포측정법으로 게이팅되고 정량화되었다. 표적 CD5+CD7-집단을 분석하고 세포생존을 형질도입된 벡터 대조군 NK세포에 비례하여 표현하였다. CD5CAR NK는 CD5를 발현하는 정상 T세포를 포함한 CD5+집단 전반을 걸친 완전한 용해와 함께 백혈병 CD5+CD7-표적집단의 거의 완전한 용해를 나타냈다 (도 29C).
Sezary 증후군 환자# 4의 백혈병세포는 24 시간 후 2:1 및 5:1의 E:T 비율로 CD5CAR NK세포와 함께 공동배양되었다. CD5CAR NK세포는 Sezary증후군 세포의 90% 이상의 용해로 강력한 항백혈병 활성을 보여주었다 (도 29D). 포화는 백혈병세포가 사실상 제거된 2:1 E:T 비율로 달성되었다.
CD5CAR NK세포는 정상 T세포를 효과적으로 고갈시킨다.
T 세포를 제대혈로부터 분리하고 CD5CAR NK세포와 공동배양하는데 사용하였다. 도30에 나타낸 바와 같이, CD5CAR NK세포는 2:1의 낮은 작동체:표적 비율로 공동배양 24시간 후 T세포를 완전히 고갈시켰다 (도 30). GFP 대조군의 그것과 비교하여, T세포집단은 대부분 손상되지 않았다.
CD5CAR NK세포는 외투세포 림프종 (MCL) 및 만성림프성림프종 (CLL)을 포함하는 CD5+ B세포 악성종양을 효과적으로 용해한다.
추가적인 공동배양연구는 (MCL) 및 CLL 환자의 CD5+ Jeko림프종 세포주 및 림프종 세포를 사용하여 수행되었다. JeKo-1 MCL 세포주는 MCL의 큰 세포 변이를 가진 환자의 말초혈액 단핵 세포로부터 확립되었다. 2:1의 낮은 E:T에서의 공동배양연구에서, CD5CAR NK세포는 약 80% Jeko 세포를 효과적으로 용해시켰다 (도 31A). MCL 환자 샘플에서 분리한 세포도 CD5CAR NK세포와 함께 배양하였다. 표적집단을 게이팅하고, 살아 있는 세포를 유동세포측정법으로 정량화하였다. CD5CAR NK세포는 사실상 CD5+CD19+ 백혈병집단 및 CD5+CD19-T세포 집단을 모두 제거하였다 (도 31B). B세포 CLL 환자의 세포도 CD5CAR NK세포와 함께 공동배양하였다.유동세포측정법으로 백혈병집단을 게이팅하기 위해CD19를 사용하였다. CD5+CD19+ CLL 세포는 CD5CAR NK세포에 의해 사실상 제거되었다 (도 31C). 이들 연구는 CD5CAR NK세포가 CD5를 발현하는 T-ALL, PTCLs 및 B세포림프종을 포함한 백혈병 세포주 및 환자 백혈병 샘플 (도 32)에서 심각한 항종양 활성의 생물학적 특성을 포함한다는 것을 강력하게 제안한다.
CD5CAR NK세포는 생체내에서 강력한 항백혈병 활성을 입증한다.
CD5CAR NK세포, 동물연구를 위한 비슷한 방법을 사용하여 생체내 CD5CAR NK세포의 항종양 활성을 측정하였다. 준치사적으로 조사된 NSG 마우스에게 1.0 x 106 개의 반딧불 루시페레이스를 발현하는 CCRF-CEM 세포를 정맥내 주사하여 측정 가능한 종양형성을 유도 하였다. CCRF-CEM-Luc+ 세포 주사 3일 후 마우스에게 5 x 106 CD5CAR NK 세포 또는 벡터 대조 T세포를 정맥내 주사하였다. 제4일째에 이들 주사를 반복하여 마우스마다 총 10 x 106 T세포가 주사되었다. 제5일째, 마우스에게 RediJect D-Luciferin을 피하 주사하고 IVIS 영상을 시행하여 종양부담을 측정하였다 (도3A). CD5CAR NK세포 주사 마우스에 대해 측정한 평균 광 강도를 벡터 대조 NK세포 주사 마우스의 것과 비교하였다 (도33B). 종양 주사 후 5 일째, 치료된 마우스의 종양부담은 2/3로 낮아졌다. Paired T test 분석은 두그룹간에 매우 높은 의미있는 차이(P=0.0302)를 나타냈다. 이들 생체내 데이터는 CD5CAR NK세포가 벡터 대조 NK세포에 비해 CCRF-CEM 주사된 NSG 마우스에서의 종양부담을 현저히 감소시킨다는 것을 나타낸다.
항CD3 키메라항원 수용체 (CD3CAR) NK세포는 CD3 양성 혈액종양을 효율적으로 용해시킨다
실례
결과
CD3CAR 생성
항CD3 분자는 신호전달을 향상시키기 위해 CD3제타 신호전달 도메인에 융합된 CD28 및 4-1BB 도메인과 함께 결합된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 모듈식 디자인으로 제3세대 CAR가 되게 한다. NK세포 (NK-92) 표면에서의 CD3CAR 분자의 효율적 발현을 위해 강력한 비장포커스형성 바이러스 프로모터 (SFFV)를 사용하고 CD8 선도서열을 구조물에 편입시켰다. 항CD3 scFv는 CD8 유래 힌지 (H) 및 막통과 (TM) 영역을 통해 세포내 신호전달 도메인에 부착된다 (도34A). 이 CD3CAR 구조물을 이어서 렌티 바이러스 플라스미드에 클로닝되었다.
CD3CAR의 특성
CD3CAR 렌티 바이러스 플라스미드 및 벡터 대조 플라스미드로 형질감염된 HEK293-FT 세포에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다항CD3제타 단클론 항체를 사용한 면역블롯은 CD3CAR-CD3제타 융합 단백질 (도34B)에 대한 예측된 크기의 밴드를 나타내지만 벡터 대조 단백질에 대해서는 벤드를 나타내지 않는 다.
NK-92 세포를 사용한 CD3CAR NK세포의 생성
CD3CAR의 형질도입 효율은 유동세포측정법 분석에 의해 측정되었다. CD3CAR NK세포를 풍부하게하기 위해 형광 활성화된 세포정렬 (FACS)를 사용하여 최고 발현 NK 세포를 수확했다. 분류 후, 비교적 높은 CD3CAR 발현을 갖는 NK세포를 획득하였다. 유동세포측정법 정렬 후의 CD3CAR의 발현은 CAR 발현의 약 30%로 후속 NK세포 확장 및 냉동보존에 대해 안정적이였다.
CD3CAR NK세포는 인간 T-ALL 세포주를 효과적으로 용해시킨다
CD3CAR NK세포의 효능을 결정하기 위해 CD3+ T-ALL 세포주, Jurkat 및 CCRF-CEM을 사용하여 공동배양검정을 수행했다. Jurkat 및 CCRF-CEM 세포에서의 CD3 양성 세포는 각각 CD3에 대해 약 80% 및 10% 양성이다. CCRF-CEM 세포주 CD3+세포는 이어서 고도로 발현된 CD3세포에 대해 선별되었으며, 선별된 CCRF-CEM 세포에서의 CD3 발현은 약 50%였다. Jurkat 및 CCRF-CEM 세포와 함께 공동배양하는 동안, CD3CAR NK세포는 중대한 백혈병세포 사멸능력을 나타내었다 (도35). 6시간 인큐베이션 및 2:1의 낮은 E:T 비율에서, CD3CAR NK세포는 60% 이상의 Jurkat세포를 효과적으로 용해시켰다 (도35A). 다음으로 우리는 상대적으로 고도로 발현된 CD3 CCRF-CEM 세포 (선별된)의 사멸 능력을 선별되지 않은 CCRF-CEM 세포의 것과 비교했다. CD3 CAR NK세포는 더 낮은 CD3를 발현하는 정렬되지 않은 CCRF-CEM (도35B) 집단보다 선별된 CCRF-CEM에서의 더 높은 CD3를 발현하는 집단에 대해 보다 효과적인 것으로 보였다.
CD3CAR NK세포는 인간 샘플에서 얻은 CD3+ 백혈구세포를 효과적으로 제거한다
CD3CAR NK세포의 사멸 능력 또한 환자 샘플을 사용하여 시험하였다. 두 환자 샘플의 유동세포측정법 분석은 강력하고 균일한 CD3 발현을 나타냈다. 유동세포측정법에 의해 분석 된 바와 같이, Sezary 증후군 환자 샘플과 CD3CAR T세포의 공동배양은 2:1의 낮은 E:T 비율에서 백혈병세포의 약 80%를 효과적으로 용해시키는 결과를 낳았다 (도 36A). 환자 샘플, 분류되지 않은 PTCLs과 CD3CAR NK세포를 24시간동안 공동배양한 결과, CD3+ 악성 세포가 사실상 제거되었다 (도 36B). CD3CAR NK세포는 또한 광범위한 CD3+ 집단에 영향을 주었다.
CD3CAR NK세포는 정상 T세포를 고갈시킬 수 있다.
GFP 형질도입된 정상 T세포는 CD3CAR NK세포를 공동배양하는데 사용되었다. 도37에 보여준 바와 같이, CD3CAR NK세포는 4시간 또는 24시간 인큐베이션 후 정상 T세포의 상당한 부분을 고갈시켰다.
CD3CAR NK세포는 생체내에서 심각한 항백혈병 활성을 나타낸다
CD3CAR NK세포의 생체내 항종양 효능을 측정하기 위해, 준치사적으로 조사된 NSG 마우스에게 CD3 양성 (~80%) 인 1.0 x 106 개의 반딧불 루시페레이스를 발현하는 Jurkat세포를 정맥내 주사하고, 측정 가능한 종양 형성을 제3 또는 4일째에 발견하였다. Jurkat-Luc+ 세포 주사 3일 후에, 마우스 당 (그룹당 6마리) 5 x 106 CD3CAR NK세포 또는 벡터 대조군 NK세포를 정맥내 주사하였다. 이들 주사는 제3, 6, 7 및 10일째에 반복되어 마우스 당 총 25 x 106 T세포가 주사되었다. 제4, 7, 9 및 13일째에 종양부담을 측정하기 위해 IVIS 영상을 수행하였다 (도38A). 치료된 2 마리의 마우스는 제13일째에 주사과정때문에 죽었다. CD3CAR NK세포 주사 마우스에 대해 측정된 평균 광 강도를 벡터 대조 NK 주사 마우스의 것과 비교하였다 (도38B). 초기 지연기간 후, 종양부담은 치료된 마우스의 경우 9 일째에 거의 2/3로 낮아지고 13 일째에는 13%로 감소했다 (도 38C). Paired T test 분석은 두 그룹간에 고도로 의미있는 차이 (P = 0.0137)를 보였다. 이들 생체내 데이터는 CD3CAR NK세포가 벡터 대조 NK세포와 비교할 때 Jurkat 주사된 NSG 마우스에서의 종양 부담을 현저히 줄이고 생존기간을 연장 시킨다는 것을 보여준다고 우리는 결론을 내렸다.
CRISPR/Cas 핵산분해효소는 T 또는 NK세포에서 발현되는 CD2, CD3, CD5 및 CD7을 표적으로한다.
T 또는 NK세포는 CD2, CD3, CD5 및 CD7과 같은 일부 표면항원을 백혈병 또는 림프종과 공유하는 것으로 보인다. CD2, CD3, CD5 및 CD7은 대부분의 세포 백혈병/림프종에서 발현되기때문에 T 및 NK세포에 대한 우수한 표적이 될 수 있다.
따라서 CD2, CD3, CD5 및 CD7의 표면 항원 중 하나가 표적으로 선택될 때, CAR T 또는 NK 세포 집단내에서 자가살상을 피면하기 위하여 만약 그들이 이 항원을 공유하면 CAR 생성에 사용되는 T 또는 NK세포에서의 이 항원을 삭제하거나 하향 조절해야 한다.
T세포 림프종 또는 T세포 백혈병을 표적으로하는 CAR T 또는 NK 세포의 생성을 위한 단계는 도39에 기재되어있다. 3 쌍의 sgRNA가 CHOPCHOP로 디자인되어 CD2, CD3, CD5 및 CD7을 표적으로 하였다. 이어서 유전자 특이적 sgRNA (도40)를 인간 Cas9 및 E2A 자가절단 링커와 연결된 퓨로 마이신 내성 유전자를 발현하는 렌티 바이러스 벡터 (Lenti U6-sgRNA-SFFV-Cas9-puro-wpre)에 클로닝하였다. U6-sgRNA 카세트는 Cas9 요소 앞에 있다. sgRNA 및 Cas9puro의 발현은 각각 U6 프로모터 및 SFFV 프로모터에 의해 구동된다.
실례
결과
CRISPR/Cas 핵산분해효소는 T세포주에서의 CD5를 표적으로한다.
유전자 특이적 sgRNA를 지닌 렌티 바이러스는 CCRF-CEM 및 MOLT 세포를 형질도입시키는 데 사용되였다. 초기에, CD5 발현의 감소는 두개의 상이한 2개 CDISPR / Cas9 sgRNA 서열을 사용하는 이들 T세포주 모두에서 관찰되었다 (도 41A 및 41C). CD5 발현 상실로 인한 가장 성공적인 집단을 각 세포주를 위해 선택하였고, 이들 세포를 선별하여 정상적으로 확장시켜 순도 99% 이상의 CD45+ 및 CD5-로 확인 하였다 (도41B 및 41D).
CRISPR/Cas 핵산분해효소는 T세포주 및 NK세포에서의 CD7을 표적으로 한다.
유전자 특이적 sgRNA를 지닌 렌티 바이러스는 CCRF-CEM, MOLT세포 및 NK세포를 형질도입시키는 데 사용되었다 (도42). 유동세포측정법 분석은 2개의 상이한 sgRNA를 사용하는 CRISPR/Cas9 접근법에 의한 CCRF-CEM 및 NK-92세포에서의 CD7 발현의 손실을 입증하였다 (도42A 및 42B). 집단 (파란색 원과 화살표로 표시)은 도42B에서 정렬, 확장 및 분석을 위해 선택되었다. 유동세포측정법 분석에 의한 CD5 발현의 상실은 또한 CD7을 표적으로하는 CRISPR/Cas 핵산분해효소에 의한 위에서 기술된 비슷한 접근법을 사용하는 NK-92세포에서도 관찰되었다 (도42C 및 42D). CD7 양성 백혈병세포를 제거하기 위해 선별된 CD7 음성 NK-92세포 (도42D)를 확장시켜 CD7CAR NK세포를 생성하는 데 사용하였다.
CD7CAR NK 7-92세포는 강력한 항백혈병 활성을 가지고 있다
CD7은 NK 및 T-ALL 백혈병세포 모두에서 발현된다. CD7CAR NK-92 집단내에서의 자가살생을 피면하기 위해서는 우선 CD7 발현이 불활성화 되어야 한다. CD7 결핍 NK-92세포 (NK7-92세포)는 (도 42D)에 기술 된 바와 같이 생성되고 확장되었다. 확장된 NK 7-92세포를 CD7CAR을 발현하는 렌티 바이러스로 형질도입시켰다. CD7CAR은 CD3제타 신호전달 도메인에 융합된 CD28 및 4-BB 도메인과 결합한 항CD7 scFV를 포함하여 제3세대 CAR로 만들어진다. CD7을 발현하는 백혈병세포에 대한 CD7CAR NK 7-92세포의 용해능력을 시험하였다. 도43에서 보여준 된 바와 같이, CD7CAR NK 7-92세포는 T-ALL 세포주 CCRF-CEM에 대비해 강력한 항백혈병 활성을 나타내었다. 유동세포측정법에 의해 분석 된 바와 같이, CCRF-CEM세포의 공동배양은 5:1의 E:T 비율에서 약 50%의 백혈병세포를 효과적으로 용해시킨 결과를 낳았다 (도 43A 및 43B).
CD3 중합체단백질 복합체가 도44에 설명되어 있다. 이 복합체는 CD3δ 사슬, CD3γ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 포함한다. 이들 사슬은 αβ사슬을 구성하는 T세포 수용체 (TCR)와 결합한다.
CD3CAR은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)에 사용된다.
CD3CAR은 줄기세포이식 전후에 환자에게 투여된다. 환자의 백혈구 상승 수준을 시험한다.
CD3CAR은 골수이식 전후에 환자에게 투여된다. 환자의 백혈구 상승 수준을 시험한다.
CD3CAR은 조직이식 전후에 환자에게 투여된다. 환자의 백혈구 상승 수준을 시험한다.
장기 이식
CD3CAR은 장기이식 수술전에 장기이식 환자에게 투여된다. 환자의 장기거부 반응을 검사한다. 다음과 같은 조직학적 징후가 측정된다: (1) T세포 침윤, 호산구, 형질세포 및 중성구 침윤, 특히 지시비율 (telltale ratios)에 따른 일부 사례 (2) 이식된 조직유형에 따라 달라지는 조직해부학적 구조의 손상, 및 3) 혈관 손상.
SEQUENCE LISTING <110> iCell Gene Therapeutics, LLC <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs) HEMATOLOGIC MALIGNANCIES, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 2541-2 PCT <150> 62/121,842 <151> 2015-02-27 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatta tgatgacaca gtcgccatca tctctggctg tgtctgcagg agaaaaggtc 120 actatgacct gtaagtccag tcaaagtgtt ttatacagtt caaatcagaa gaactacttg 180 gcctggtacc agcagaaacc agggcagtct cctaaactac tgatctactg ggcatccact 240 agggaatctg gtgtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctgggacaga ttttactctt 300 accatcagca gtgtgcaacc tgaagacctg gcagtttatt actgtcatca atacctctcc 360 tcgcacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggggtggcgg tggctcgggc 420 ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcaa ctgcagcagc ctggggctga gctggtgagg 480 cctgggtctt cagtgaagct gtcctgcaag gcttctggct acaccttcac caggtactgg 540 atacattggg tgaagcagag gcctatacaa 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Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys 465 470 475 480 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 485 490 495 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 500 505 510 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 515 520 525 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 530 535 540 <210> 18 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 18 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 35 40 45 Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His 100 105 110 Ile Ser Arg Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 130 135 140 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr 145 150 155 160 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr 165 170 175 Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly 180 185 190 Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser 195 200 205 Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 210 215 220 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys 325 330 335 Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg 340 345 350 Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp 355 360 365 Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 370 375 380 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 385 390 395 400 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 405 410 415 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 420 425 430 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 435 440 445 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 450 455 460 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 465 470 475 480 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 485 490 495 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 500 505 510 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 515 520 525 Arg <210> 19 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 19 Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp 1 5 10 15 Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp 20 25 30 Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg 35 40 45 Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys 50 55 60 Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys 85 90 95 Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser 100 105 110 Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr 115 120 125 Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe 145 150 155 160 Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro 165 170 175 Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp 180 185 <210> 20 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 20 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 100 <210> 21 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 21 Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys 1 5 10 15 Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn 20 25 30 Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro 35 40 45 Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln 50 55 60 Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp 65 70 75 80 Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu 85 90 95 Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln 100 105 110 Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val 115 120 125 Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr 145 150 155 160 Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val 165 170 175 Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu 180 185 190 Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr 195 200 205 Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys 210 215 220 Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg 225 230 235 240 Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His 245 250 255 Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu 260 265 270 Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn 275 280 285 Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu 290 295 300 Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu 305 310 315 320 Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu 325 330 335 Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln 340 345 350 Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro 355 360 365 Val Gln Pro 370 <210> 22 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 22 Arg Leu Ser Trp Tyr Asp Pro Asp Phe Gln Ala Arg Leu Thr Arg Ser 1 5 10 15 Asn Ser Lys Cys Gln Gly Gln Leu Glu Val Tyr Leu Lys Asp Gly Trp 20 25 30 His Met Val Cys Ser Gln Ser Trp Gly Arg Ser Ser Lys Gln Trp Glu 35 40 45 Asp Pro Ser Gln Ala Ser Lys Val Cys Gln Arg Leu Asn Cys Gly Val 50 55 60 Pro Leu Ser Leu Gly Pro Phe Leu Val Thr Tyr Thr Pro Gln Ser Ser 65 70 75 80 Ile Ile Cys Tyr Gly Gln Leu Gly Ser Phe Ser Asn Cys Ser His Ser 85 90 95 Arg Asn Asp Met Cys His Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu Glu Pro Gln 100 105 110 Lys Thr Thr Pro Pro Thr Thr Arg Pro Pro Pro Thr Thr Thr Pro Glu 115 120 125 Pro Thr Ala Pro Pro Arg Leu Gln Leu Val Ala Gln Ser Gly Gly Gln 130 135 140 His Cys Ala Gly Val Val Glu Phe Tyr Ser Gly Ser Leu Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Asp Lys Thr Gln Asp Leu Glu Asn Phe Leu 165 170 175 Cys Asn Asn Leu Gln Cys Gly Ser Phe Leu Lys His Leu Pro Glu Thr 180 185 190 Glu Ala Gly Arg Ala Gln Asp Pro Gly Glu Pro Arg Glu His Gln Pro 195 200 205 Leu Pro Ile Gln Trp Lys Ile Gln Asn Ser Ser Cys Thr Ser Leu Glu 210 215 220 His Cys Phe Arg Lys Ile Lys Pro Gln Lys Ser Gly Arg Val Leu Ala 225 230 235 240 Leu Leu Cys Ser Gly Phe Gln Pro Lys Val Gln Ser Arg Leu Val Gly 245 250 255 Gly Ser Ser Ile Cys Glu Gly Thr Val Glu Val Arg Gln Gly Ala Gln 260 265 270 Trp Ala Ala Leu Cys Asp Ser Ser Ser Ala Arg Ser Ser Leu Arg Trp 275 280 285 Glu Glu Val Cys Arg Glu Gln Gln Cys Gly Ser Val Asn Ser Tyr Arg 290 295 300 Val Leu Asp Ala Gly Asp Pro Thr Ser Arg Gly Leu Phe Cys Pro His 305 310 315 320 Gln Lys Leu Ser Gln Cys His Glu Leu Trp Glu Arg Asn Ser Tyr Cys 325 330 335 Lys Lys Val Phe Val Thr Cys Gln Asp Pro Asn Pro 340 345 <210> 23 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 Ala Gln Glu Val Gln Gln Ser Pro His Cys Thr Thr Val Pro Val Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly Ile 20 25 30 Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu 35 40 45 Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln 100 105 110 Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala 130 135 140 Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro 145 150 155 <210> 24 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 24 Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly 20 25 30 Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe 35 40 45 Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp 50 55 60 Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr 65 70 75 80 Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala 85 90 95 Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu 100 105 110 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 115 120 125 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 130 135 140 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 145 150 155 160 Asp <210> 25 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln Thr Asn Lys Met Val 1 5 10 15 Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser Asn Met Arg Ile Tyr 20 25 30 Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp Ser His His Glu Phe 35 40 45 Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile His Gly Glu Glu Val 50 55 60 Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala Ser Arg Phe Ile Leu 65 70 75 80 Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Phe Cys Met 85 90 95 Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ser 100 105 110 Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro Thr Lys Lys Ser Thr 115 120 125 Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro Glu Thr Gln Lys Gly 130 135 140 Pro Leu Cys Ser Pro 145 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 gggtcatcac acacaag 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 gatgcccgcc acgcacc 17 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 gccacaaaga ccatcaag 18 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 ggagacttta tatgctg 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 31 ggcgtttggg ggcaaga 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 gtccactatg acaattg 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 33 gccggagctc caagcag 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 34 gggggccttg tcgttgg 17 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 35 gggtaccatc agctatg 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 36 gccagcgcca gaagcag 17 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 37 ggagactgct gcacctc 17 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 38 gccgcatcga cttctca 17

Claims (105)

  1. 신호 펩타이드, 항원 인식 도메인, 힌지 영역, 막통과 도메인, 적어도 하나의 보조 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드를 부호화하는(encoding) 공학적으로 처리된 키메라 항원 수용체 폴리뉴클레오타이드(engineered chimeric antigen receptor polynucleotide)를 포함하는 공학적으로 처리된 세포이며, 항원 인식 도메인은 CD2, CD3, CD4, CD5 및 CD7 항원 인식 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고,
    여기서 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포이거나, 또는 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 NK 세포이며,
    단, 공학적으로 처리된 세포가 항원 인식 도메인의 표적인 내인성 세포 표면 항원을 포함할 때, 항원 인식 도메인이 CD4 항원 인식 도메인인 경우를 제외하고는, 상기 세포는 유전적으로 조작되어 세포 표면 항원을 부호화하는 유전자가 녹아웃되거나 세포 표면 항원이 불활성화되는 것인
    공학적으로 처리된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원 인식 도메인이 CD3 항원 인식 도메인인 공학적으로 처리된 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원 인식 도메인이 CD4 항원 인식 도메인인 공학적으로 처리된 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원 인식 도메인이 CD5 항원 인식 도메인인 공학적으로 처리된 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원 인식 도메인이 CD7 항원 인식 도메인인 공학적으로 처리된 세포.
  6. 하기 단계를 포함하는, CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 양성 T세포백혈병 또는 림프종 세포의 수를 감소시키는 시험관내(in-vitro) 방법이며:
    i. CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 양성 T세포백혈병 또는 림프종 세포를, 신호 펩타이드, CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 항원 인식 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원 인식 도메인, 힌지 영역, 막통과 도메인, 적어도 하나의 보조 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 공학적으로 처리된 세포의 유효량과 접촉시키는 단계; 및
    ii. 선택적으로, CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 양성 T세포백혈병 또는 림프종 세포를 검정하는 단계,
    여기서 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포이거나, 또는 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 NK 세포이며,
    단, 공학적으로 처리된 세포가 항원 인식 도메인의 표적인 세포 표면 항원을 포함할 때, 항원 인식 도메인이 CD4 항원 인식 도메인인 경우를 제외하고는, 상기 세포는 유전적으로 조작되어 세포 표면 항원을 부호화하는 유전자가 삭제되는 것인
    시험관내 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 공학적으로 처리된 세포가 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 자연살해 세포(Natural Killer cell) 및 자연살해 T세포(NKT cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 신호 펩타이드, CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 항원 인식 도메인, 힌지 영역, 막통과 도메인, 적어도 하나의 보조 자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 부호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 공학적으로 처리된 세포를 포함하는, CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 관련 세포증식성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 관련 세포증식성 질환을 치료하기 위한 조성물이며,
    여기서 치료는 조성물을 환자에게 투여하는 단계 및, 선택적으로, 세포증식성 질환과 관련된 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 양성 세포를 검정하는 단계를 포함하며,
    여기서 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포이거나, 또는 공학적으로 처리된 세포는 CD2 또는 CD7 항원 인식 도메인을 포함하는 NK 세포이며,
    단, 공학적으로 처리된 세포가 항원 인식 도메인의 표적인 세포 표면 항원을 포함할 때, 항원 인식 도메인이 CD4 항원 인식 도메인인 경우를 제외하고는, 상기 세포는 유전적으로 조작되어 세포 표면 항원을 부호화하는 유전자가 삭제되며,
    여기서 CD2 또는 CD3 또는 CD4 또는 CD5 또는 CD7 관련 세포증식성 질환은 암 또는 종양성질환이며, 암은 급성림프구암, 급성골수성백혈병, 비호지킨 림프종, B만성림프구성백혈병, 털세포백혈병, 급성림프모구백혈병 (ALL), T세포급성림프구성백혈병, 버킷 림프종, 림프절외 NK/T 세포 림프종, NK 세포 백혈병/림프종, 이식 후 림프증식성 질환, 광범위한 대세포림프종, 외투세포림프종, 작은림프구성림프종 (SLL), 만성림프구성백혈병 (CLL), T세포림프종, T세포 신생물 및 말초 T세포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인
    조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포증식성 질환이 CD4 양성 백혈병 및 CD4 양성 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CD4 관련 세포증식성 질환인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포증식성 질환이 CD4 양성 급성골수성백혈병인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 급성골수성백혈병이 급성골수성백혈병 M4 또는 급성골수성백혈병 M5인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 공학적으로 처리된 세포가 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 자연살해 세포 (Natural Killer cell) 또는 자연살해 T세포 (NKT cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 상기 세포증식성 질환이 CD5 또는 CD7 관련 세포증식성 질환이며, CD5 또는 CD7 관련 세포증식성 질환은 비호지킨 림프종, 광범위한 대세포림프종, 작은림프구성림프종 (SLL), T세포 신생물, 말초 T세포 림프종, 외투세포림프종, T세포 급성림프성백혈병 (T-ALL) 및 만성림프구성백혈병 (CLL)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공학적으로 처리된 세포가 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 자연살해 세포 (Natural Killer cell) 또는 자연살해 T세포 (NKT cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7 및 SEQ ID NO.8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 공학적으로 처리된 세포.
  16. 제8항에 있어서, 화학요법, 방사선, 면역 억제제 및 항바이러스 요법 중 하나 이상이 공학적으로 처리된 세포와 함께 환자에게 투여되는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 펩타이드 아미노 서열이 SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, 및 SEQ ID NO.17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 공학적으로 처리된 세포.
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