ES2923895T3

ES2923895T3 - Receptores de antígeno quimérico (CARS) dirigidos a neoplasisas malignas hematológicas, composiciones y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2923895T3
Application number: ES16756524T
Authority: ES
Inventors: Yupo Ma; Kevin Pinz; Xun Jiang; Masayuki Wada; Kevin Chen
Original assignee: Icell Gene Therapeutics LLC
Current assignee: Icell Gene Therapeutics LLC
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2022-10-03
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: JP2021078514A; IL254141A0; KR20240018680A; TW202143986A; AU2016225012A1; IL254141B; WO2017146767A1; KR102632082B1; AU2016225012B2; EP3261651A4; CA2977106A1; CN114230670A; KR20180002604A; US10273280B2; TW201706295A; PL3261651T3; US20240124547A1; JP7237449B2; WO2016138491A1; US20180066034A1

Abstract

La presente descripción proporciona polipéptidos receptores de antígenos quiméricos que tienen dominios de reconocimiento de antígenos para antígenos CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 y CD52, y polinucleótidos que los codifican. La presente descripción también proporciona células manipuladas que expresan el polinucleótido o polipéptidos. En algunas realizaciones, la descripción proporciona métodos para tratar enfermedades asociadas con los antígenos CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 y CD52. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quimérico (CARS) dirigidos a neoplasisas malignas hematológicas, composiciones y métodos de uso de los mismos

Antecedentes

Las células T, un tipo de linfocito, juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se distinguen de otros linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. Las células T colaboradoras, también llamadas células T CD4+ o células T CD4, expresan glicoproteína CD4 en su superficie. Las células T auxiliares se activan cuando se exponen a antígenos peptídicos presentados por moléculas de clase II del MHC (complejo principal de histocompatibilidad). Una vez activadas, estas células proliferan rápidamente y secretan citocinas que regulan la respuesta inmunitaria. Las células T citotóxicas, también conocidas como células T CD8+ o células T CD8, expresan la glicoproteína CD8 en la superficie celular. Las células T CD8+ se activan cuando se exponen a antígenos peptídicos presentados por moléculas MHC de clase I. Las células T de memoria, un subconjunto de células T, persisten a largo plazo y responden a su antígeno afín, proporcionando así al sistema inmunitario "memoria" contra infecciones pasadas y/o células tumorales.

Las células T se pueden manipular genéticamente para producir receptores especiales en su superficie llamados receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son proteínas que permiten que las células T reconozcan una proteína específica (antígeno) en las células tumorales. Estas células CAR T manipuladas se cultivan luego en el laboratorio hasta que se cuentan por miles de millones. La población expandida de células CAR T luego se infunde en el paciente.

Los ensayos clínicos realizados hasta la fecha han demostrado que los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) son muy prometedores en las neoplasias malignas hematológicas resistentes a las quimioterapias estándar. En particular, las terapias de células T CAR específicas de CD19 (CD19CAR) han tenido resultados notables que incluyen remisiones a largo plazo en tumores malignos de células B (Kochenderfer, Wilson et al. 2010, Kalos, Levine et al. 2011, Porter, Levine et al. 2011, Davila, Riviere et al. 2013, Grupp, Frey et al. 2013, Grupp, Kalos et al. 2013, Kalos, Nazimuddin et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Lee, Shah et al.

2013, Park, Riviére et al. 2013, Maude, Frey et al. 2014).

El documento WO 2013/126712A1 describe composiciones y métodos para generar células T genéticamente modificadas que comprenden CAR que tienen un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, una región coestimuladora y un dominio de señalización CD3 zeta.

A pesar del éxito de la terapia con CAR en la leucemia y el linfoma de células B, la aplicación de la terapia con CAR a las neoplasias malignas de células T aún no está bien establecida. Dado que las neoplasias malignas de células T se asocian con resultados mucho peores en comparación con las neoplasias malignas de células B (Abramson, Feldman et al. 2014), la terapia CAR en este sentido tiene el potencial de abordar aún más una gran necesidad clínica.

CD5 se expresa en más del 80 % de la leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL). Una opción de tratamiento es tratar a pacientes con anticuerpos anti-CD5 como leucemias de células T o linfomas de células T que expresan la molécula de superficie CD5. Sin embargo, los intentos han tenido un éxito limitado.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de terapias basadas en receptores de antígenos quiméricos mejoradas que permitan un direccionamiento más eficaz, seguro y eficiente de las neoplasias malignas asociadas a las células T.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a los receptores de antígenos quiméricos (CAR) dirigidos a tumores neoplasias malignas hematológicas, composiciones y su uso médico, de acuerdo con las reivindicaciones concedidas, y en la que:

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico manipulado, comprendiendo el polipéptido: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno ^cD2, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico manipulado, comprendiendo el polipéptido: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno ^cD3, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico manipulado, comprendiendo el polipéptido: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno c D4, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico manipulado, comprendiendo el polipéptido: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno CD5, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico manipulado, comprendiendo el polipéptido: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno ^cD7, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

En una realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa cualquiera de los polipéptidos receptores de antígenos quiméricos de la invención descritos anteriormente.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa cualquiera de los polinucleótidos del receptor de antígeno quimérico de la invención descritos anteriormente.

La divulgación describe un método para producir una célula manipulada que expresa un polipéptido o polinucleótido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno selectivo para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 o CD52. El método incluye (i) proporcionar células de sangre periférica o células de sangre del cordón umbilical; (ii) introducir el polinucleótido antes mencionado en las células antes mencionadas; (iii) expandir las celdas del paso (ii); y aislar las celdas del paso (iii) para proporcionar dicha celda manipulada.

La divulgación describe un método para producir una célula manipulada que expresa un polipéptido o polinucleótido de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno selectivo para Cd 2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 o CD52. El método incluye (i) proporcionar células placentarias, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o células madre hematopoyéticas; (ii) introducir el polinucleótido antes mencionado en las células del paso (i); (iii) expandir las celdas del paso (ii); y (iv) aislar las células del paso (iii) para proporcionar dicha célula manipulada.

En una realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4 para usar en un método para conferir inmunidad antileucemia o antilinfoma a la leucemia de células T positivas para CD4 o al linfoma de células T positivas para CD4 en un paciente que necesite el mismo. (i) Se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4 en un paciente que necesita la misma; y (ii) opcionalmente, se analiza la inmunidad a la leucemia de células T o al linfoma de células T en el paciente.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4 para usar en un método para reducir el número de células de leucemia de células T positivas para CD4 o células de linfoma de células T positivas para CD4. (i) se ponen en contacto células de leucemia de células T positivas para CD4 o células de linfoma de células T positivas para CD4 con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4; y (ii) opcionalmente, ensayado para células de leucemia de células T positivas para CD4 o células de linfoma de células T positivas para CD4.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2 para usar en un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen un antígeno CD2. (i) Las células inmunorreguladoras se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2; y (ii) opcionalmente, se analiza la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD3 para usar en un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD3. (i) Las células inmunorreguladoras se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD3; y (ii) opcionalmente, se analiza para la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4 para usar en un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD4. (i) Las células inmunorreguladoras se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4; y (ii) opcionalmente, se analiza para la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD5 para usar en un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD5. (i) Las células inmunorreguladoras se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD5; y (ii) opcionalmente, se analiza para la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD7 para usar en un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD7. (i) Las células inmunorreguladoras se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD7; y (ii) opcionalmente, se analiza para la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen un antígeno CD8. El método incluye (i) poner en contacto dichas células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD8; y (ii) opcionalmente, ensayar la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En otra realización, la divulgación proporciona un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD52. El método incluye (i) poner en contacto dichas células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD52; y (ii) opcionalmente, ensayar la reducción en el número de células inmunorreguladoras.

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 para usar en un método para tratar una enfermedad proliferativa celular. (i) Se administra a un paciente que necesita la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7.

En una realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, ^cD5 o ^cD7 para usar en un método para tratar una enfermedad autoinmune. (i) Se administra a un paciente que necesita la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula manipulada que expresa un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7.

En una realización, la divulgación proporciona células manipuladas que expresan un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 para usar en el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular. El uso incluye la administración de dichas células manipuladas a un paciente que necesite las mismas.

Los CAR típicamente incluyen dominios de señalización intracelular, bisagra y/o transmembrana. Los CAR de primera generación incluyen CD3z como un dominio de señalización intracelular, mientras que los CAR de segunda generación incluyen un único dominio coestimulador derivado, por ejemplo, sin limitación, de CD28 o 4-1BB. Los CAR de tercera generación incluyen dos dominios coestimuladores, tales como, sin limitación, CD28, 4-1BB (también conocido como CD137) y OX-40, y cualquier otra molécula coestimuladora.

En algunas realizaciones, CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 es parte de un casete de expresión. En una realización preferida, el gen de expresión o el casete pueden incluir un gen accesorio o una etiqueta o una parte del mismo. El gen accesorio puede ser un gen suicida inducible o una parte del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, el gen de la caspasa 9. El enfoque de ablación del "gen suicida" mejora la seguridad de la terapia génica y mata las células solo cuando son activadas por un compuesto específico o una molécula. En algunas realizaciones, la etiqueta epitópica es una etiqueta c-myc, un péptido de unión a estreptavidina (SBP), un gen EGFR truncado (EGFRt) o una parte o una combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C. Expresión de CD4CAR. (A), Representación esquemática de vectores lentivirales recombinantes que codifican CD4CAR. La expresión de CD4CAR está impulsada por un promotor SFFV (virus formador de focos del bazo). La tercera generación de CD4 CAR contiene una secuencia líder, el anti-CD4scFv, un dominio bisagra (H), un dominio transmembrana (TM) y dominios de señalización intracelular de la siguiente manera: CD28, 4-1BB (ambos coestimuladores) y CD3 zeta. (B), las células 293FT se transfectaron con plásmidos lentivirales para GFP (carril 1) y CD4CAR (carril 2) para análisis de transferencia Western 48 horas después de la transfección y se probaron con anticuerpo anti-CD3z humano de ratón. (C), Ilustración de los componentes de las células T receptoras de antígenos quiméricos de tercera generación que se dirigen a las células que expresan CD4.

Figuras 2A-2D. Producción de células T CD4CAR. (A), diseño experimental. (B), se activaron las células de la capa leucocítica CB durante 2 días con anticuerpo anti-CD3 e IL-2. Se transdujeron las células con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha). Después de 7 días de incubación, se analizaron las células mediante citometría de flujo con anticuerpos de cabra anti-ratón Fab2 o IgG de cabra conjugados con biotina y seguidos de estreptavidina-PE. A la izquierda se muestran células CB marcadas y no transducidas. (C), las células T CD4CAR agotan la población de CD4+ durante la expansión de las células T. Se activaron las células de capa leucocitaria CB durante 2 días con anticuerpo anti-CD3 e IL-2. La capa leucocitaria CB contiene dos subconjuntos de células T, células T citotóxicas CD8 y células T auxiliares CD4+ (izquierda). Se transdujeron las células con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha). Después de 3 días de cultivo, se analizaron las células mediante citometría de flujo con anticuerpos anti-CD4 humano (FITC) y CD8 (APC) de ratón. También se marcaron las PMBC no transducidas (izquierda). (D), la mayoría de las células T CD4CAR tienen un fenotipo similar a la memoria central. Se activaron las células de capa leucocitaria CB 2 días con anticuerpo anti-CD3. Se transdujeron las células con sobrenadante lentiviral CD4CAR. Después de 6 días de expansión, e analizaron las células CD8+ s para los fenotipos CD62L, CD45RO y CD45RA mediante citometría de flujo (N=3).

Figuras 3A-3D. Las células T CD4CAR eliminan las células leucémicas de células T en ensayos de cocultivo. (A), las células T CD4CAR eliminan las células leucémicas de células T KARPAS 299 en cocultivo. Se incubaron las células de la capa leucocitaria CB humana activada transducidas con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha) con células KARPAS 299 en una relación de 2:1. Después de 24 horas de cocultivo, se tiñeron las células con anticuerpos CD4 (APC) y CD8 (PerCp) antihumanos de ratón y se analizaron mediante citometría de flujo para subconjuntos de células T (N=3). (B) y (C), las células T CD4CAR eliminan las células leucémicas de células T primarias en cocultivo. Se incubaron células de capa leucocítica CB humana activada transducidas con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha) con células de leucemia de células T primarias del síndrome de Sezary (B) y PTCL (C) en una relación de 2:1. Después de 24 horas de cocultivo, se analizaron las células mediante citometría de flujo con anticuerpos de ratón anti-CD4 humano (FITC) y CD8 (APC) (N=3). Las células primarias humanas solas también están marcadas (izquierda). (D) Las células T CD4CAR no pudieron generar lisis las células de linfoma negativas para CD4 (SP53, una línea celular de linfoma de células B). Se incubaron células de capa leucocitaria CB humanas activadas transducidas con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha) con células de linfoma de células del manto SP53 que se tiñeron previamente con el colorante de membrana CMTMR, en una relación de 2:1. Después de 24 horas de cocultivo, las células se tiñeron con CD3 antihumano de ratón (PerCp) y luego se analizaron mediante citometría de flujo (N=2). También se marcaron las células SP53 solas, preteñidas con CMTMR (izquierda).

Figuras 4A-4B. Las células T CD4CAR derivadas de PBMC están altamente enriquecidas en T CD8+ y matan específicamente las líneas de células leucémicas que expresan CD4. (A) Las células T CD4CAR derivadas de PBMC están altamente enriquecidas en células T CD8+. Se activaron las células de la capa leucocitaria PMBC que constituyen las células T, CD8+ y CD4+ (izquierda) durante 2 días con anticuerpo anti-CD3 e IL-2, luego se transdujeron con sobrenadante lentiviral GFP (centro) o CD4CAR (derecha). Después de 3 días de cultivo, se marcaron y analizaron las células mediante citometría de flujo para subconjuntos de células T. También se marcaron las PMBC no transducidas (izquierda). (B) Las células T CD4CAR matan específicamente las células KARPAS 299. Se incubaron los linfocitos T PMBC transducidos con control GFP o sobrenadante lentiviral CD4CAR con KARPAS 299 teñido con CFSE en relaciones de 2:1, 5:1 y 10:1, respectivamente. Después de una incubación durante la noche a 37 °C, se añadió el colorante 7AAD y se analizaron las células mediante citometría de flujo. El porcentaje de mortandad de las células diana se mide comparando la supervivencia de las células objetivo en relación con la supervivencia de las células de control negativo (células SP53, una línea celular de linfoma de células B teñida con CMTMR).

Figuras 5A-5D. Las células T CD4CAR median eficazmente los efectos antileucémicos in vivo con diferentes modos. Los ratones NSG recibieron 2.5 Gy para la irradiación subletal. Veinticuatro horas después de la irradiación, se inyectó a los ratones por vía subcutánea 1 * 106 (en A) o 0.5 * 106 (en B y C) Células KARPAS 299. Se trataron los ratones inyectados con diferentes cursos y programas de células T CD4CAR o células T de control. N=5 para cada grupo de ratones inyectados. (A), se inyectó una dosis baja de 2*106 de células T CD4CAR el día 3 seguido de una dosis grande, 8 * 106, de células T CD4CAR el día 22 después de la aceleración observada del crecimiento tumoral. (B), se inyectaron dos dosis grandes de células T CD4CAR, 8 * 106 y 5.5 *106 los días 3 y 10 respectivamente. (C), se inyectó una dosis baja repetida (2.5 * 106) de células T CD4CAR cada 5 días para un total de cuatro administraciones. (D), supervivencia global de ratones tratados con las células T CD4CAR indicadas o células T GFP de control. N=10.

Figura 6. Se expresa CD4CAR en la superficie de las células HEK-293. Se transdujeron las células HEK-293 durante 6 horas con sobrenadante viral de control CD4CAR o GFP. Después de una incubación de 3 días, se analizaron las células mediante citometría de flujo.

Figura 7. Comparación del crecimiento celular entre células de capa leucocítica PMBC activadas transducidas con virus lenti-GFP y CD4CAR. Se transdujeron las células de capa leucocítica PMBC activadas con control GFP o con sobrenadante lentiviral CD4-CAR el Día 0. Se lavaron las células el Día 1 y se añadió el medio los Días 3 y 5.

Figuras 8A-8C. Constructo CD4CAR. (A) Representación esquemática del vector lentiviral que codifica CD4CAR de tercera generación, impulsado por el promotor del virus formador de focos del bazo (SFFV). El constructo contiene una secuencia líder, scFv anti-CD4, dominio bisagra (H), transmembrana (TM) y dominios de señalización CD28, 4-1BB y CD3 zeta. (B) Se transfectaron las células HEK293FT con plásmidos lentivirales de control de vector GFP (carril 1) y CD4CAR (carril 2). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se extrajeron las células y se usaron posteriormente para análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-CD3z humano de ratón. (C) Ilustración de células CAR NK de tercera generación dirigidas a células que expresan CD4.

Figura 9. Producción de células NK CD4CAR. (A, panel superior) Niveles de expresión de CD4CAR en células NK antes de ser clasificados por FACS (N=3); (A, panel inferior) Expresión de CD4CAR en células NK después de la clasificación y expansión, antes de los experimentos de cocultivo (N=3)

Figuras 10A-10C. Células CD4 CAR NK eliminan células de leucemia y linfoma CD4+ en ensayos de cocultivo. Se realizaron los experimentos de cocultivo en una relación de efector a objetivo de 2:1 durante 24 horas y se analizaron directamente mediante citometría de flujo para CD56 y CD4 (paneles A y B). Cada ensayo consiste en células objetivo solas de control (izquierda) y células objetivo incubadas con células NK transducidas con control de vector (centro) o sobrenadante lentiviral CD4CAR (derecha). Fila superior, panel A: Carpas 299 (N=3). Fila central, panel A: Células T HL-60 (N=2). Fila inferior, panel A: Células CCRF-CEM (N=2). Las células NK CD4CAR eliminaron las células primarias de leucemia de células T de un paciente con linfoma de células T CD4+/síndrome de Sezary (N=2) y ALL de células T pediátricas que expresan CD4 (N=2). (C) Gráfico de barras que resume los resultados del ensayo de cocultivo para las relaciones de E: T 2:1 y 5:1.

Figura 11. Especificidad de cocultivo y curva de mortandad de respuesta a la dosis. Las células NK CD4CAR generan lisis líneas de células leucémicas que expresan CD4 de una manera específica y dependiente de la dosis. Se incubaron NK CD4CAR y células de control de vector con una relación igual de células "en el objetivo" teñidas con CFSE (Karpas 299 o CCRF-CEM) y células MOLT4 "fuera del objetivo" teñidas con CMTMR a 1: 4, 1: 2 y relaciones de efector a objetivo de 1:1. Después de 24 horas, se añadió colorante 7-AAD y se analizaron las células vivas restantes mediante citometría de flujo. Se midió el porcentaje de mortandad de células objetivo comparando supervivencia de células Karpas 299 o ^cC^rF-CEM CD4+ en cocultivos de células NK CD4CAR en relación con la de cocultivos de células NK de control de vector.

Figuras 12A-12B. Las células NK CD4CAR eliminan células T CD4+aisladas de sangre de cordón umbilical humano en una relación de efector a objetivo de 2:1, pero no afectan la salida del compartimento de células madre hematopoyéticas/progenitoras. (A) Se realizaron los ensayos de cocultivo se en una relación de efector a objetivo de 2:1 durante 24 horas, después de lo cual, se tiñeron las células con anticuerpos CD56 y CD4 antihumanos de ratón. Se incubaron las células objetivo solas como control (izquierda). Se transdujeron las células NK con control de vector (centro) o sobrenadante lentiviral CD4CAR (derecha) y se incubaron con células T CD4+ obtenidas de sangre de cordón umbilical humano. (N = 2) (B) Se incubaron las células NK CD4CAR en relación efector: objetivo de cocultivo de 2:1 y 5:1 respectivamente con 500 células de sangre de cordón umbilical CD34+ durante 24 horas en medio de células NK suplementado con IL-2. Los controles experimentales utilizados fueron células CD34+ solas, y las células NK no transducidas se cocultivaron en relaciones efector: objetivo respectivas de 2:1 y 5:1 con células CB CD34+. Se evaluó la producción del compartimento hematopoyético mediante la formación de unidades formadoras de estallidos eritroides (BFU-E) y el número de unidades formadoras de colonias de granulocitos/monocitos (CFU-GM) en el Día 16. Se realizó el análisis estadístico de CFU través de ANOVA de 2 vías con un conjunto alfa de 0.05.

Figuras 13A-13D. Las células NK CD4CAR demuestran efectos antileucémicos in vivo. Se irradiaron los ratones NSG de forma subletal y se inyectaron por vía intradérmica con células Karpas 299 que expresan luciferasa (Día 0) para inducir la formación de tumores medibles. En el día 1 y cada 5 días durante un total de 6 cursos, se inyectaron los ratones por vía intravenosa con 5 * 106 células NK CD4CAR o células de control NK de control de vector. (A) En los días 7, 14 y 21, se inyectaron a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a imágenes IVIS. (B) Se comparoó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con NK CD4CAR con la de los ratones inyectados con NK de control de vector. (C) El día 1, y cada dos días después, se midió el área del tamaño del tumor y se comparó el tamaño promedio del tumor entre los dos grupos. (D) Se midió el porcentaje de supervivencia de los ratones y se comparó entre los dos grupos.

Figura 14. Las células CD4 CAR NK eliminan las células de leucemia y linfoma positivas para CD4 en ensayos de cocultivo. Todos los ensayos de cocultivo que se muestran se realizaron en una relación de efector a objetivo de 5:1 durante 24 horas, después de lo cual, se tiñeron las células n con anticuerpos anti-CD56 y CD4 humanos de ratón. Cada ensayo consiste en células NK transducidas con control de vector (centro) o sobrenadante lentiviral CD4CAR (derecha) e incubadas con células objetivo, así como células objetivo incubadas solas como control (izquierda). Las células NK CD4CAR eliminaron las células T leucémicas Karpas 299 (A), las células T HL-60 (B) y las células CCRF-CEM (C). Las células NK CD4CAR eliminaron las células de leucemia de células T primarias de pacientes con leucemia de células T que expresan CD4/síndrome de Sezary (E) y LLA de células T pediátricas que expresan CD4 (F).

Figura 15. Las células NK se transdujeron con control de vector o con sobrenadante lentiviral CDCAR, o se cultivaron para control no transducido. Después de 7 días de incubación, se recogieron y analizaron las células mediante citometría de flujo con F(Ab')2 anti-ratón de cabra marcado con biotina seguido de estreptavidina-PE. Las células NK eran >85 % CD4CAR+ después de clasificar.

Figuras 16A-16C. Las células NK CD4CAR no generaron lisis en control negativo de CD4', CD5+ MOLT4. (A) Se confirmó que el inmunofenotipo de células MOLT4 era casi todo CD4' y CD5+. (B) Las células NK CD4CAR no generaron lisis en las células MOLT4 en una relación de efector a objetivo de 5:1 a las 0 h, 4 h, 8 h y 24 h (panel inferior) según lo evaluado en comparación con la tumorlisis de células NK de control vectorial (panel superior). (C) La actividad antitumoral anti-CD4 NK CDCAR se confirmó a las 4 h con un control positivo CD4+ Karpas 299 con una relación E: T de 5:1.

Figuras 17A-17D. Generación de CD5CAR. A. El constructo del gen de ADN y el constructo de proteína traducida para CD5CAR, y el anticuerpo scFv de CD5 anclado y una caricatura que demuestra la creación y función de CD5CAR. El constructo de ADN del constructo CD5CAR de tercera generación de 5 'a 3' se lee: La secuencia líder, el fragmento variable de cadena única extracelular anti-CD5 (Anti-CD5 ScFv), la región bisagra, la región transmembrana y los tres dominios de señalización intracelular que definen este constructo como un CAR de tercera generación; CD28, 4-1BB y CD3Z. El constructo de ADN del anticuerpo CD5 scFv anclado es el mismo que el constructo CD5CAR sin los dominios de señalización intracelular, al igual que el producto proteico traducido para el anticuerpo anclado CD5 scFv. Los constructos de proteínas traducidas contienen el anti-CD5 ScFv que se unirá al objetivo de CD5, la región bisagra que permite el posicionamiento apropiado del anti-CD5 ScFv para permitir una posición de unión óptima y la región transmembrana. La proteína CD5CAR completa también contiene los dos dominios coestimuladores y un dominio intracelular de la cadena zeta de CD3. Este constructo se considera como un CAR de tercera generación: CD28, 4-1BB y CD3Z. B. El análisis de transferencia Western demuestra la expresión de CD5CAR en células HEK293. Las células HEK293 que se habían transducido con GFP (como control negativo) o lentivirus CD5CAR durante 48 h se usaron para el análisis de transferencia Western usando anticuerpo CD3 para determinar la expresión de CD5CAR. Carril izquierdo, las células HEK293 de control GFP, sin banda como se esperaba. El carril derecho muestra una banda de aproximadamente 50 kDa, el peso molecular que se esperaba con base en el constructo CD5CAR. C. Análisis de citometría de flujo para la expresión de CD5CAR en la superficie de las células T para células T CD5CAR transducidas por lentivirus. Este análisis se realizó en las células T CD5CAR doblemente transducidas el día 8 después de la segunda transducción lentiviral. Izquierda: población de células T de control de isotipo (control negativo); a la derecha, células T transducidas que expresan c D5 CAR que muestran 20,53 % en células T mediante citometría de flujo utilizando F(AB')2-PE anti-ratón de cabra.

Figuras 18A-18C. Esquema de estudio de la transducción de células T CD5CAR. A. Pasos para la generación de células T CD5 CAR por transducción simple. B. Pasos para la generación de células T CD5 CAR por doble transducción. C. Comparaciones de transducciones simples y dobles con lentivirus CD5 CAR en la regulación a la baja de la expresión de CD5 en la superficie de las células T. Se analiza la regulación a la baja de la proteína CD5 extracelular frente al control de células T GFP durante 8 días después de la transducción lentiviral. Las células T CD5CAR transducidas individuales no muestran una regulación a la baja completa de CD5 de la superficie celular en el día 8, con una disminución máxima en la expresión de la proteína CD5 en el día 6. En la población con transducción doble, se observó la disminución en el número absoluto de células T CD5CAR positivas dobles para CD5+ y CD3+ a lo largo del tiempo, del 24,44 % en el día 0 a una reducción casi completa de la expresión de CD5 en el día 4. Por el contrario, el control de células T GFP mantiene una población positiva doble para CD5+, CD3+ por encima del 95 % desde el día 2 hasta el día 8.

Figuras 19A-19B. Regulación a la baja de la expresión de CD5 en células T después de la transducción lentiviral del anticuerpo scFv de CD5 anclado después de 7 días. A. Esquema de estudio para la transducción de lentivirus scFv CD5 anclados, transducción única. B. El scFv de CD5 anclado regula a la baja o reduce la cantidad de expresión de CD5 en la superficie de las células T. Análisis de citometría de flujo que demuestra la disminución significativa en la expresión de la proteína CD5 (~32 %) después de una sola transducción de CD5 scFv y 7 días de incubación. Se observa la eliminación de la expresión de CD5, pero no se completa después de 7 días, y actualmente se está completando un estudio de seguimiento para un anticuerpo scFv CD5 anclado transducido doblemente.

Figuras 20A-20B. Las células CD5CAR generan lisis eficazmente las líneas de células T-ALL que expresan CD5 y no generan lisis una línea de células T leucémicas que no expresa CD5. A. Análisis de citometría de flujo de líneas de células T-ALL solas (columna izquierda), en cocultivo con células T transducidas con vector GFP (fila central) y en cocultivo con células T transducidas con CD5CAR (fila derecha). Cada línea celular se ve en cada fila, las líneas celulares T-ALL CD5+ en las filas superior y media (CCRF-CEM y Molt-4) con la línea celular CD5 negativa en la fila inferior (KARPAS 299). KAEPAS 299 es un linfoma de células T negativas para CD5. El tiempo de incubación para todos los cocultivos fue de 24 horas, con una relación de células efectoras: objetivo de 5:1. La lisis celular en comparación con el control GFP fue superior al 78 % para ambas líneas de células leucémicas T ALL CD5, en comparación con el control GFP. B. Este gráfico de barras indica la lisis de células T lograda por las células T CD5CAR en comparación con el cocultivo de células T GFP descrito en la Fig. 20A. No se observó lisis en cocultivos de células T CAR CD5 con KARPAS 299, que es negativo para CD5 (n=3 experimentos independientes realizados por duplicado).

Figuras 21A-21D. Las células CD5CAR generan lisis eficazmente las células leucémicas linfoblásticas agudas de células T de muestras de pacientes que expresan CD5. A. Análisis de citometría de flujo de células T-ALL solas (columna izquierda), en cocultivo con células T GFP (fila central) y en cocultivo con células T CD5CAR (fila derecha). Las celdas de cada paciente tienen una fila y están numeradas para mantener la confidencialidad del paciente. El tiempo de incubación para todos los cocultivos fue de 24 horas, con una relación de células efectoras: células objetivo de 5:1. La lisis celular en comparación con el control GFP fue superior al 71,3 % para T-ALL-1 en comparación con el control. El resto de las líneas celulares también demostraron lisis celular positiva, pero en menor grado, entre 33-47 %. Esto puede estar relacionado con la expresión de CD5 para cada muestra leucémica, que se analiza a continuación. B. Este gráfico de barras indica la lisis de células T lograda por las células T CD5CAR en comparación con el cocultivo de células T GFP descrito en la Fig. 21A. Todos los experimentos fueron duplicados. C. Datos de análisis de citometría de flujo que demuestran los niveles de expresión de CD3 y CD5 para las muestras de LLA de células T del paciente analizadas en la figura 21A. Se observó una positividad diferente de CD5 para T-ALL 1 y T-ALL 3. D. Análisis de citometría de flujo de los niveles de expresión de CD5 en un panel de cuatro poblaciones de células T-ALL de muestras de pacientes. Se determinó la diferencia de la intensidad fluorescente media (MFI) mediante análisis de citometría de flujo (Fig. 21C).

Figura 22. Análisis de la capacidad de mortandad de células T CD5CAR para las células T-ALL del paciente (T-ALL-8) en detalles. Análisis de citometría de flujo que demuestra la capacidad de mortandad de células T CD5CAR para las células T-ALL del paciente. El cocultivo de células GFP-T de control y células T-ALL-8 se ve a la izquierda, y el cocultivo de CD5CAR con T-ALL 8 se ve a la derecha. Se observó una ávida lisis de todas las células positivas para CD5, tanto positivas para CD34 (encerradas en un círculo rojo) como negativas para CD34 (en un círculo verde, células T), sin observarse lisis para las células negativas para CD5. En comparación con el control GFP, las células T CD5CAR generan lisis como mínimo 93,1 % de las células T-ALL-8 positivas para CD5 en comparación con el control GFP. El experimento se realizó por duplicado. Además, las células T CD5CAR esencialmente eliminan la población de células T (CD5+CD34-, con un círculo verde).

Figuras 23A-23B. Las células T CD5CAR matan eficazmente las células T normales marcadas con GFP. A, las células T CD5CAR matan las células T normales de manera dependiente de la dosis. Se cocultivaron células T CD5CAR o células T CD123CAR (control) con células T marcados con GFP en relaciones de efector a objetivo de 0.25:1, 0.5:1 y 1:1. Después de 24 horas, se analizaron las células T GFP vivas restantes mediante citometría de flujo. Se midió el porcentaje de eliminación de células objetivo comparando la supervivencia de células T GFP en cocultivos de CD5 en relación con la de células T CD123CAR de control, ya que las células T no expresan CD123. B, Curva de destrucción por cocultivo con base en los datos de A.

Figuras 24A-24B. Las células T mantuvieron la expresión de CD5 cuando se cocultivaron con CD5CAR o células T CD5 scFv ancladas. A, Pasos para la generación de células T CD5CAR o células T CD5 scFv ancladas y células T CD123 CAR (control). B, niveles de expresión de CD5 en diferentes células T transducidas con CAR (Día 3 después de 2eda transducción). Se transdujeron las células T activadas con lentivirus que expresan CD5CAR o CD5 scFv y CD123CAR ancladas. Después de 3 días de transducción, se analizó la expresión de CD5 mediante citometría de flujo.

Figuras 25A-25E. Se realizaron ensayos de cocultivo para determinar si las células T normales mantuvieron la expresión de CD5 cuando se cultivaron conjuntamente con CD5CAR o células T CD5 scFv ancladas o CD123CAR (control) durante 2 días (Fig. 25A) o 4 días (Fig. 25B) en una relación de 1:1. Se incubaron las células T CD5CAR o las células T CD5 scFv ancladas o las células T CD123CAR (control) con células T marcadas con GFP y se analizaron las células T marcadas con GFP cocultivadas luego para analizar la expresión de CD5 y las células vivas mediante citometría de flujo. C (Fig. 25C), las células CCRF-Ce M o Molt-4 T ALL transducidas con CD5CAR o CD5 scFv anclado mostraron una regulación a la baja de la expresión de CD5. Se transdujeron células CCRF-CEM o Molt-4 T ALL con lentivirus que expresan CD5CAR o CD5 scFv anclado. Después de la segunda transducción, se analizó la expresión de CD5 en las células leucémicas transducidas mediante citometría de flujo.

Figuras 26A-26D. Las células T CD5CAR demuestran profundos efectos antileucémicos in vivo. Se irradiaron los ratones NSG subletalmente y, después de 24 horas, inyectados por vía intravenosa con 1 * 106 células CCRF-CEM que expresan luciferasa (Día 0) para inducir la formación de tumores medibles. En los días 3 y 4, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 5 * 106 células T CD5CAR o células T de control de vector. Estas inyecciones se repitieron los días 6 y 7, para un total de 2,0 * 107 células por ratón. A, En los días 5, 8, 10 y 13, a los ratones se les inyectó por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a imágenes IVIS. B, Se comparó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con CD5CAR T con la de los ratones inyectados con control de vector. C, Porcentaje de células tumorales muertas en ratones tratados con células T CD5CAR en relación con el control. D, Se extrajo sangre periférica de los ratones el día 15 y se determinaron los porcentajes de células leucémicas y se compararon con los del control de vector o los ratones inyectados normales.

Figuras 27A-27C. Las células NK CD5 CAR (NK-92) eliminan de manera efectiva la línea celular CCRF-CEM T-ALL in vitro. A y B, se cocultivó la línea celular de linfoblastos T CCRF-CEM que expresa CD5 con células NK CD5 CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando CD56 y CD5 para separar la población de células NK-CAR y objetivo, respectivamente. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas con N = 2. C, las células NK CD5CAR eliminan las células CCRF-CEM de forma dependiente de la dosis. Se cocultivó la línea celular de linfoblastos T, CCRF-CEM que expresa CD5 con células NK CD5CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas con el límite inferior de la relación E: T reducido. Se logra la saturación con una relación E: T de 2:1 y el cocultivo en relaciones reducidas da como resultado una forma de eliminación de CD5 dependiente de la dosis. Se logró la eliminación completa de CCRF-CEM en 5:1.

Figuras 28A-28B. Las células NK CD5CAR generan lisis eficazmente dos líneas CD5 T-ALL, MOLT-4 y Jurkat. A, se cocultivaron células NK CD5CAR con células MOLT-4 en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas con N = 2 experimentos. B, Se cocultivaron las células NK CD5CAR con células Jurkat en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas con N = 2 experimentos.

Figuras 29A-29E. Las células NK CD5CAR eliminan eficazmente las células T-ALL CD5 agresivas utilizando muestras humanas. A, Se cocultivaron las células T-ALL del paciente, T-ALL #1 con células NK CD5CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. B, Se cocultivaron las células T-ALL del paciente, T-ALL #2 con células NK CD5CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se seleccionaron y cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando colorante de citotracker celular (CTMMR) para examinar muestras de pacientes con T-ALL. Los datos representan las estadísticas promedio para muestras duplicadas. Se seleccionaron las poblaciones de células CD5+ CD34+ diana frente a un control de isotipo. Se expresa la supervivencia celular s en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras. De izquierda a derecha, el gráfico de barras muestra los datos de CD34+ CD5+ a la izquierda y CD5+cd34-a la derecha, para cada relación. NK CD5CAR muestra una lisis casi completa de la población objetivo de CD5+ de alta expresión con actividad contra la población de células madre tumorales con bajo potencial de CD5+CD34+. Se logra la saturación en una relación de 2:1, lo que significa una necesidad de dilución de las relaciones E: T. Fig. 29C y 29D, se cocultivaron células leucémicas del paciente #3 (PTCL) y del paciente # 4 (síndrome de Sezary) con células NK CD5CAR, respectivamente, en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas.

Figura 30. CD5NK-CAR elimina específicamente las células T de la sangre del cordón umbilical. Se aíslan las células T de células T de sangre de cordón umbilical (UCB) y se cocultivan con linfocitos NK CD5CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando CD56 y CD5 para separar la población de NK-CAR y de células T, respectivamente. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas.

Figuras 31A-31D. Las células NK CD5CAR eliminan eficazmente el linfoma de células del manto CD5+ y la leucemia linfocítica crónica. Se cocultivaron células NK CD5CAR con células Jeko (Fig. 31A) y células leucémicas de pacientes con linfoma de células del manto (Fig. 31B) y leucemia linfocítica crónica (Fig. 31C). Se cocultivo la línea celular derivada del linfoma de la línea celular del manto JeKo que expresa un subconjunto principal de CD5 con células NK CD5CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 6 horas. Para el linfoma de células del manto o CLL, se realizaron cocultivos durante 24 horas. Se seleccionaron y cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo como se ilustra en las figuras. Se dirigen las células NK CD5CAR específicamente a la población de leucemia CD5+ CD19+ y la población de células T CD5+ CD19-. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas.

Figura 32. Gráfico de barras que resume los estudios de cocultivos de células NK CD5CAR.

Figuras 33A-33B. Las células NK CD5CAR demuestran potentes efectos antileucémicos en vivo. Se irradiaron los ratones NSG subletalmente y, después de 24 horas, inyectados por vía intravenosa con 1 * 106 células CCRF-CEM que expresan luciferasa (Día 0) para inducir la formación de tumores medibles. En los días 3 y 4, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 5 * 106 células NK CD5CAR o células NK de control de vector. Estas inyecciones se repitieron los días 6 y 7, para un total de 2,0 * 107 células por ratón. A, en el día 5, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a formación de imágenes IVIS. B, Porcentaje de células tumorales muertas en ratones tratados con células NK CD5CAR en relación con el control.

Figuras 34A-34B. Organización de CD3CAR y su expresión. A, Representación esquemática de la organización de CD3CAR en vectores lentivirales. La expresión de CAR está impulsada por un promotor SFFV (virus formador de focos de bazo) y como 3er constructo de generación contiene una secuencia líder, el anti-CD3scFv, un dominio bisagra (H), un dominio transmembrana (TM), dos dominios coestimuladores de CD28 y 4-BB y el dominio de señalización intracelular de CD3 zeta. B, se transdujeron las células HEK-293FT con plásmidos lentivirales para GFP (carril 1) y CD3CAR (carril 2) para análisis de transferencia Western 48 horas después de la transducción y se sondaron con anticuerpo anti-CD3zeta humano de ratón.

Figuras 35A-35B. Las células NK CD3CAR eliminan las líneas de células T-ALL que expresan CD3 in vitro. A, Se cocultivó la línea celular de linfoblastos T Jurkat que expresa aproximadamente 80 % de c D3 con células NK CD3CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 6 horas. B, Se cocultivaron células clasificadas (CCRF-CD3) o CCRF-CEM no clasificadas (c Cr F-Ce M) con células NK CD3CAR durante 24 horas. Se cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando CD56 y CD3 para separar la población de células NK-CAR y objetivo, respectivamente. Se expresa la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas y cada gráfico de barras representa las estadísticas promedio para muestras duplicadas con N = 2 experimentos.

Figuras 36A-36B. Las células NK CD3CAR muestran una sólida capacidad de causar mortandad de células leucémicas CD3+ primarias de muestras de pacientes. A, las células del paciente SPT-1 (síndrome de Sezary) fueron positivas para CD3 y se cocultivaron con células NK CD3CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando CD56 y CD3 para separar la población de células NK-CAR y objetivo, respectivamente. Mientras que SPT-1 es una población celular heterogénea, la amplia población que expresa CD3+ se eliminar por el CD3NK-CAR. B, las células de paciente PT4 (PTCL sin clasificar) eran CD3+CD7-, y se cocultivaron con células NK CD3CAR en las relaciones de células E: T (efectoras: objetivo) indicadas durante 24 horas. Se cerraron y cuantificaron las poblaciones objetivo como se ve en figura. Se tipifican las células de leucemia PT4 como CD3+CD7- y son efectivamente eliminadas por las células NK CD3CAR. La amplia población de CD3+ también se ve afectada por las células NK CD3CAR.

Figuras 37A-37B. Las células NK CD3CAR pueden generar lisis las células T normales como se esperaba. Se aislaron las células T normales de la sangre del cordón umbilical y se transdujeron con lentivirus que expresaban GFP. Se usaron las células T GFP transducidas para cocultivar con células NK CD3CAR. Se llevaron a cabo las condiciones de cocultivo en medios de células NK con suero al 2.5 %. Se incubaron los cocultivos durante 24 horas y se marcaron para el análisis de citometría de flujo. Se evaluó la capacidad de las células NK CD3CAR para generar lisis las células T diana comparando la cantidad de células T CD3+ GFP residuales después del cocultivo. Es importante destacar que, con un mayor período de incubación, se demostró que las células T CD3+ GFP objetivo generaron lisis con más del 80 % de eficacia a una dosificación de 5:1 en una relación de efector a célula objetivo.

Figuras 38A-38C. Las células NK CD3CAR demuestran profundos efectos antileucémicos in vivo. A, se irradiaron los ratones NSG subletalmente y, después de 24 horas, inyectados por vía intravenosa con 1 * 106 células Jurkat que expresan luciferasa (Día 0) para inducir la formación de tumores medibles. En los días 3 y 4, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 5 * 106 células NK CD3CAR o células NK de control de vector cada día. Estas inyecciones se repitieron los días 6 y 7, y de nuevo el Día 10, para un total de 2.5 * 107 células por ratón. (A) En los días 4, 7, 9 y 13, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a imágenes IVIS. B, Se comparó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con NK CD3CAR con la de los ratones inyectados con células NK de control de vector. C, Porcentaje de células tumorales destruidas en ratones tratados con células NK CD3CAR en relación con el control.

Figura 39. Pasos para la generación de células CAR T o NK dirigidas a linfomas de células T o leucemias de células T.

Figura 40. Se diseñan tres pares de ARNsg por gen con CHOPCHOP para apuntar a CD2, CD3, CD5 y CD7. Se diseñaron tres pares de ARNsg con CHOPCHOP para apuntar al gen de interés. Luego, se clonaron los ARNsg específicos de genes en el vector lentiviral (Lenti U6-ARNsg-SFFV-Cas9-puro-wpre) que expresa un Cas9 humano y genes de resistencia a la puromicina vinculados con un conector autoescindible E2A. El casete U6-ARNsg está frente al elemento Cas9. La expresión de ARNsg y Cas9puro está impulsada por el promotor U6 y el promotor SFFV, respectivamente.

Figuras 41A-41D. Generación de células T CCRF-CEM y MOLT-4 deficientes en CD5 estables utilizando el sistema de lentivirus CRISPR/Cas9. A. Análisis de citometría de flujo que demuestra la pérdida de expresión de CD5 en células T CCRF-CEM con CRISPR/Cas9 KD usando dos ARNsg diferentes, Lenti-u6-sgCD5a-SFFV-Cas9puro (sgCD5A) y Lenti-U6-sgCD5b-SFFV-Cas9puro (sgCD5B) después de la selección de puromicina. El control de tipo salvaje se ve en el diagrama de dispersión más a la izquierda. Debido a que la técnica CRISPR/Cas9 KD con ARNsg CD5A tuvo más éxito en la regulación negativa de la proteína CD5, se seleccionó esta población (indicada por el círculo azul y la flecha) para clasificación, purificación y análisis en la figura 41B. B. Datos de análisis de citometría de flujo que indican el porcentaje de células CCRF-CEM negativas para CD5 estables clasificadas puramente transducidas usando la técnica scCD5A CRISPR/Cas9. Se observó la pureza >99 % de las células T sgCD5A CCRF positivas para CD45 y negativas para CD5. C. Análisis de citometría de flujo que demuestra la pérdida de expresión de CD5 en células T MOLT-4 con CRISPR/Cas9 KD utilizando dos secuencias de ARNsg diferentes (secuencia CD5A y CD5B, columnas central y derecha) después del tratamiento con puromicina. El control de tipo silvestre se ve en el diagrama de dispersión más a la izquierda. Debido a que la técnica CRISPR/Cas9 KD con el cebador CD5A tuvo más éxito en la regulación negativa de la proteína CD5, se seleccionó esta población (indicada por el círculo azul y la flecha) para clasificación, purificación y análisis en la figura 4D. D. Datos de análisis de citometría de flujo que indican el porcentaje de células MOLT-4 negativas para CD5 estables clasificadas puramente transducidas utilizando la técnica scCD5A CRISPR/Cas9. Se observó la pureza >99 % de las células T MOLT-4 sgCD5A positivas para CD45 y negativas para CD5.

Figuras 42A-42D. Generación y clasificación celular de pérdida estable de CD7 en células CCRF-CEM o células NK-92 utilizando el sistema de lentivirus CRISPR/Cas9. Se determinó el porcentaje de pérdida de CD7 en CCRF-CEM (Fig. 42A y B) o NK-92 (Fig. 42C y D) usando sgCD7A (Lenti-U6-sgCD7a-SFFV-Cas9-puro) y sgCD7B (Lenti-U6-sgCD7b -SFFV-Cas9-puro) mediante análisis de citometría de flujo con anticuerpos CD45 y CD7 después del tratamiento con puromicina. Los valores de inserción en las figuras mostraron el porcentaje de positivos y negativos que expresan CD45 o CD7 entre análisis. El panel derecho indicaba el porcentaje de pureza de las células negativas CD7 estables clasificadas en CCRF-CEM (B) o en células NK-92 (D) preparadas a partir de células negativas CD7 transducidas usando lentivirus CRISPR sgCD7A o sgCD7D.

Figuras 43A-43B. Las células CD7CAR NK 7 -92 generan lisis eficazmente las células T de la línea celular ALL de células T que expresan CD7. Para evitar la automortandad, se generaron células NK-92 (NK 7-92) deficientes en CD7 y se transdujeron con CD7CAR.

Se usaron dos preparaciones transducidas de CD7CAR NK 7 -92 células, se usaron #A y #B para probar su capacidad de causar mortandad. A, análisis de citometría de flujo de células CCRF-CEM solas (columna izquierda), en cocultivo con GFP NK 7 -92 células (columna central) y en cocultivo con células CD7CAR-NK-92, #A y B# (columnas de la derecha). B, gráficos de barras con base en datos obtenidos de A.

Figura 44. Complejo proteico multimérico CD3. CD3 incluye un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas distintas, como se describe en la figura anterior. El complejo incluye una cadena CD38, una cadena CD3^yy dos cadenas CD3^e. Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) que se compone de cadenas ap.

Descripción detallada

La divulgación proporciona composiciones de receptores de antígenos quiméricos (CAR), métodos y fabricación de los mismos, y métodos para usar las composiciones de CAR.

Composiciones

Polipéptidos de receptores de antígenos quiméricos

En una realización, la descripción proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización.

Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto que tiene residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece ninguna limitación sobre el número máximo de aminoácidos que puede incluir la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que tenga dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

Un "péptido señal" incluye una secuencia peptídica que dirige el transporte y la localización del péptido y cualquier polipéptido unido dentro de una célula, por ejemplo, a un determinado orgánulo celular (como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular.

El péptido señal es un péptido de cualquier proteína secretada o transmembrana que dirige el transporte del polipéptido de la divulgación a la membrana celular y la superficie celular, y proporciona la localización correcta del polipéptido de la presente divulgación. En particular, el péptido señal de la presente divulgación dirige el polipéptido de la presente divulgación a la membrana celular, en el que se muestra la porción extracelular del polipéptido en la superficie celular, la porción transmembrana se extiende por la membrana plasmática y el dominio activo está en la porción citoplasmática, o interior de la célula.

En una realización, se escinde el péptido señal después de pasar por el retículo endoplásmico (RE), es decir, es un péptido señal escindible. En una realización, el péptido señal es una proteína humana de tipo I, II, III o IV. En una realización, el péptido señal incluye un péptido señal de cadena pesada de inmunoglobulina.

El "dominio de reconocimiento de antígenos" incluye un polipéptido que es selectivo para un antígeno, receptor, ligando peptídico o ligando proteico del objetivo; o un polipéptido del objetivo.

El dominio de reconocimiento de antígeno específico objetivo incluye preferiblemente un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo contra un antígeno del objetivo, o un péptido que se une a un antígeno del objetivo, o un péptido o proteína que se une a un anticuerpo que se une a un antígeno del objetivo, o un péptido o ligando de proteína (que incluye, entre otros, un factor de crecimiento, una citoquina o una hormona) que se une a un receptor en el objetivo, o un dominio derivado de un receptor (que incluye, entre otros, un receptor de factor de crecimiento, un receptor de citoquinas o un receptor hormonal) que se une a un ligando peptídico o proteico en el objetivo. El objetivo incluye CD2, CD3, CD4, CD5 y C^d7. En otra realización, el objetivo incluye cualquier porción de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7. En una realización, el objetivo incluye porciones expuestas en la superficie de los polipéptidos CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

En otra realización, el objetivo es el dominio extracelular de CD2 (SEQ ID NO. 19). En otra realización, el objetivo es el dominio extracelular de la cadena épsilon de CD3 (SEQ ID NO. 20). En otra realización, el objetivo es el dominio extracelular de CD4 (SEQ ID NO. 21). En otra realización, el objetivo es el dominio extracelular de CD5 (SEQ ID NO.

22). En otra realización, el objetivo es el dominio extracelular de CD7 (SEQ ID NO. 23). No forma parte de la invención el dominio extracelular de la cadena alfa CD8 objetivo (SEQ ID NO. 24), el dominio extracelular de la cadena beta CD8 objetivo (SEQ ID NO. 25) y el antígeno objetivo CD52 CAMPATH-1 (SEQ ID NO. 26).

En una realización, el dominio de reconocimiento de antígenos incluye la porción de unión o la región variable de un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra (selectivo para) el objetivo.

En una realización, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye un fragmento de unión a antígeno (Fab). En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígenos incluye un fragmento variable monocatenario (scFV). scFV es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de las inmunoglobulinas, conectadas con un péptido conector corto.

En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye un anticuerpo de dominio único de camélido, o porciones del mismo. En una realización, los anticuerpos de dominio único de camélidos incluyen anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en camélidos o anticuerpos VHH. Un anticuerpo VHH de camélido (por ejemplo, camello, dromedario, llama y alpaca) se refiere a un fragmento variable de un anticuerpo monocatenario de camélido (Ver Nguyen et al, 2001; Muyldermans, 2001), y también incluye un anticuerpo VHH aislado de camélido, un anticuerpo VHH recombinante de camélido, o un anticuerpo VHH sintético de camélido.

En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígenos incluye ligandos que se acoplan a su receptor afín. En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígeno está humanizado.

Se entiende que el dominio de reconocimiento de antígenos puede incluir cierta variabilidad dentro de su secuencia y seguir siendo selectivo para los objetivos descritos en el presente documento. Por lo tanto, se contempla que el polipéptido del dominio de reconocimiento de antígeno puede ser al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 80 % o al menos 70 % idéntico al polipéptido del dominio de reconocimiento de antígeno descrito en el presente documento y seguir siendo selectivo para los objetivos descritos en el documento.

En otra realización, el dominio de reconocimiento de antígeno es selectivo para SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, o SEQ ID NO. 23

La región bisagra es una secuencia posicionada entre, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, el receptor de antígeno quimérico y al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización. La secuencia bisagra se puede obtener incluso, por ejemplo, a partir de cualquier secuencia adecuada de cualquier género, incluyendo el humano o una parte del mismo. Dichas regiones de bisagra son conocidas en la técnica. En una realización, la región bisagra incluye la región bisagra de una proteína humana que incluye CD-8 alfa, CD28, 4-1BB, OX40, CD3-zeta, cadena a o p del receptor de células T, una cadena zeta de C^d3, CD28, CD3^e, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, derivados funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos.

En una realización, la región de bisagra incluye la región de bisagra del CD8a.

En algunas realizaciones, la región bisagra incluye una seleccionada de, pero sin limitarse a, inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgD).

El dominio transmembrana incluye un polipéptido hidrófobo que atraviesa la membrana celular. En particular, el dominio transmembrana se extiende desde un lado de la membrana celular (extracelular) hasta el otro lado de la membrana celular (intracelular o citoplasmático).

El dominio transmembrana puede estar en forma de hélice alfa o barril beta, o combinaciones de los mismos. El dominio transmembrana puede incluir una proteína politópica, que tiene muchos segmentos transmembrana, cada uno alfa-hélice, láminas beta o combinaciones de los mismos.

En una realización, se usa el dominio transmembrana que está asociado naturalmente con uno de los dominios en CAR. En otra realización, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas superficiales de la membrana para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

Por ejemplo, un dominio transmembrana incluye un dominio transmembrana de una cadena a o p del receptor de células T, una cadena zeta CD3, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, derivados funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos.

El dominio transmembrana manipulado artificialmente es un polipéptido que comprende principalmente residuos hidrófobos como la leucina y la valina. En una realización, se encuentra un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo del dominio transmembrana sintético.

En una realización, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de CD8. En otra realización, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de CD28. Dichos dominios transmembrana son conocidos en la técnica.

El dominio de señalización y el dominio coestimulador incluyen polipéptidos que proporcionan la activación de una célula inmunitaria para estimular o activar al menos algún aspecto de la ruta de señalización de la célula inmunitaria.

En una realización, el dominio de señalización incluye el polipéptido de un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma Rlla, FcR beta (Fc Epsilon Rib), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b, proteína activadora de DNAX 10 (DAP10), proteína activadora de DNAX 12 (DAP12), fragmentos activos de las mismas, derivados funcionales de las mismas y combinaciones de las mismas. Dichos dominios de señalización son conocidos en la técnica.

En una realización, el polipéptido CAR incluye además uno o más dominios coestimuladores. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína que incluye OX40, CD27, CD28, CD30, CD40, PD-1, CD2, CD7, CD258, miembro C del Grupo 2 Asesino natural C (N^kG2C), miembro D del Grupo 2 Asesino natural (NKG2D), B7-H3, un ligando que se une a CD83, ICAM-1, LFA-1 (CDl la/CD18), ICOS y 4-1BB (CD137), fragmentos activos de los mismos, derivados funcionales de los mismos, y combinaciones de los mismos.

En una realización, el polipéptido CAR es CD2CAR e incluye SEQ ID NO. 10 o SEQ ID NO. 11. En una realización, el polipéptido CAR es c D3Ca R e incluye SEQ ID .NO. 12 En una realización, el polipéptido CAR es CD4CAR e incluye S^eQ ID NO. 13 o SEQ ID .NO. 14 En una realización, el polipéptido CAR es C^d5^cA ^re incluye SEQ ID NO. 15. En una realización, el polipéptido CAR es CD7CAR e incluye SEQ ID NO. 17. En una realización, el polipéptido CAR es CD52CAR e incluye SEQ ID NO. 18

Polinucleótido que codifica el receptor de antígeno quimérico

La presente divulgación proporciona además un polinucleótido que codifica el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente. El polinucleótido que codifica la c Ar se prepara fácilmente a partir de una secuencia de aminoácidos de la CAR especificada por cualquier método convencional. Se puede obtener una secuencia de bases que codifica una secuencia de aminoácidos a partir de los ID de RefSeq del NCBI o los números de acceso de GenBenk mencionados anteriormente para una secuencia de aminoácidos de cada dominio, y se puede preparar el ácido nucleico de la presente divulgación usando un estándar de biología molecular y/o procedimiento químico. Por ejemplo, con base en la secuencia de bases, se puede sintetizar un polinucleótido y se puede preparar el polinucleótido de la presente descripción combinando fragmentos de ADN que se obtienen de una biblioteca de ADNc usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En una realización, el polinucleótido descrito en el presente documento es parte de un gen o un casete de expresión o clonación.

El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se define como una cadena de nucleótidos. El polinucleótido incluye ADN y ARN. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos como se usan en el presente documento son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Como se usa en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácidos nucleicos que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, pero no se limitan a, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácidos nucleicos de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando la tecnología de clonación ordinaria y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y por medios sintéticos.

En una realización, el polinucleótido incluye el polinucleótido CD2CAR de SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2. En una realización, el polinucleótido incluye el polinucleótido CD3CAR de SEQ ID NO. 3. En una realización, el polinucleótido incluye el polinucleótido CD4CAR de SEQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 5. En una realización, el polinucleótido incluye el polinucleótido CD5CAR de SEQ ID NO. 6. En una realización, el polinucleótido incluye el polinucleótido CD7CAR de SEQ ID NO. 8 El polinucleótido que incluye el polinucleótido CD52CAR de SEQ ID NO. 9 se describe sin formar parte de la invención.

Vector de polinucleótido

El polinucleótido descrito anteriormente se puede clonar en un vector. Un "vector" es una composición de materia que incluye un polinucleótido aislado y que puede usarse para administrar el polinucleótido aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos, fagémidos, cósmidos y virus. Los virus incluyen fagos, derivados de fagos. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido o un virus que se replica de forma autónoma. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales.

En una realización, los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas, vectores de integración y vectores de secuenciación.

En una realización, el vector es un vector viral. En una realización, el vector viral es un vector retroviral o un vector lentiviral. En una realización, la célula manipulada se transduce viralmente para expresar la secuencia de polinucleótidos.

Se han desarrollado varios sistemas con base en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de administración de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales utilizando técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a las células del sujeto in vivo o ex vivo. En la técnica se conocen varios sistemas retrovirales. En algunas realizaciones, se utilizan vectores de adenovirus. Se conocen en la técnica varios vectores de adenovirus. En una realización, se utilizan vectores de lentivirus.

La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al, (2001, Clonación Molecular: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endomicleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, el documento WO 01/96584; el documento WO 01/29058; y la Patente de los Estados Unidos, No. 6,326,193).

La expresión del polinucleótido del receptor de antígeno quimérico se puede lograr usando, por ejemplo, vectores de expresión que incluyen, pero no se limitan a, al menos uno de SFFV o promotor (EF) del factor de elongación humano 11a, promotor (EF) de factor de elongación humano 1a de promotor CAG (promotor de beta-actina de pollo con potenciador de CMV). Los ejemplos de promotores menos fuertes/de menor expresión utilizados pueden incluir, pero sin limitarse a, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor de la ubiquitina C (UBC) y el promotor de fosfoglicerato quinasa 1 (PGK), o una parte del mismo. La expresión inducible del receptor de antígeno quimérico puede lograrse usando, por ejemplo, un promotor sensible a tetraciclina, que incluye, pero no se limita a, TRE3GV (elemento de respuesta Tet, incluyendo todas las generaciones y preferiblemente, la 3ra generación), promotor inducible (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) o una parte o una combinación de los mismos.

Un ejemplo de un promotor adecuado es la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica operativamente unida a la misma. Otro ejemplo de un promotor adecuado es el factor de crecimiento de elongación - 1a (EF-1a). Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitarse a, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de la creatina quinasa. Además, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos, los promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está unida operativamente cuando se desea dicha expresión, o desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión incluye suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula anfitriona o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante,

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Típicamente, estos están ubicados en la región 30-100 pb corriente arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios promotores contienen elementos funcionales corriente abajo del sitio de inicio también. El espacio entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí, en el promotor de la timidina quinasa (tk), el espacio entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb antes de que comience la actividad a disminuir. Según el promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción,

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAR o partes del mismo, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen informador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que expresan de la población de células que se pretende transfectar o infectar a través de vectores virales, en otros aspectos, el marcador seleccionable puede llevarse en una pieza separada de ADN y usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes informadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo.

Los genes indicadores se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen informador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. Se analiza la expresión del gen informador en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse utilizando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, el constructo con la región flanqueante 5' mínima que muestra el mayor nivel de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden unirse a un gen informador y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, se puede introducir el vector fácilmente en una célula anfitriona, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, se puede transferir el vector de expresión a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula huésped es la transfección con fosfato de calcio.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula anfitriona incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en mamíferos, por ejemplo, células humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU., Nos. 5,350,674 y 5,585,362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). En el caso de que se utilice un sistema de administración no viral, un vehículo de administración ejemplar es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula anfitriona (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de unión que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, disperso en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden estar simplemente intercalados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que se encuentran de forma natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Los lípidos adecuados para su uso se pueden obtener de fuentes comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimyristyi fosfatidilcolina ("DMPC") de Sigma, St. Louis, MO; se puede obtener el fosfato de dicetilo ("DCP") de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener el colesterol ("Choi") de Calbiochem-Behring; dimyristyi fosfatidilglicerol ("DMPG") y se pueden obtenerotros lípidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20 °C. Se usa el cloroformo como único solvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol.

"Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos simples y multilaminares formados por la generación de agregados o bicapas lipídicas encerradas. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se autoreorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas. Ghosh et al., 19 1 Glycobiology 5; 505- 10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen estructuras diferentes en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos de lipofectamina-ácido nucleico.

Independientemente del método utilizado para introducir polinucleótidos exógenos en una célula huésped o exponer una célula al polinucleótido de la presente divulgación, para confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula huésped, se pueden realizar una variedad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de "biología molecular" bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (transferencias ELISA y Western) o por ensayos descritos en el presente documento para identificar agentes de la presente invención.

Célula manipulada

En otra realización, la divulgación proporciona una célula manipulada que expresa el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente o el polinucleótido que codifica para el mismo, y descrito anteriormente.

Una "célula manipulada" significa cualquier célula de cualquier organismo que se modifica, transforma o manipula mediante la adición o modificación de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o un polipéptido. Las células aisladas, las células huésped y las células manipuladas genéticamente de la presente divulgación incluyen células inmunitarias aisladas, tales como células NK y células T que contienen las secuencias de ADN o ARN que codifican un receptor de antígeno quimérico o un complejo de receptor de antígeno quimérico y expresan el receptor quimérico en la superficie celular. Las células anfitrionas aisladas y las células manipuladas pueden usarse, por ejemplo, para potenciar la actividad de las células NK o la actividad de los linfocitos T, el tratamiento del cáncer y el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Puede usarse cualquier célula capaz de expresar y/o capaz de integrar el polipéptido receptor de antígeno quimérico, como se describe en el presente documento, en su membrana.

En una realización, la célula manipulada incluye células inmunorreguladoras. Las células inmunorreguladoras incluyen células T, tales como células T CD4 (células T auxiliares), células T CD8 (células T citotóxicas, CTL) y células T de memoria o células T de células madre de memoria. En otra realización, las células T incluyen células T asesinas naturales (células T NK).

En una realización, la célula manipulada incluye células asesinas naturales. Las células asesinas naturales son bien conocidas en la técnica. En una realización, las células asesinas naturales incluyen líneas celulares, tales como las células NK-92. Otros ejemplos de líneas de células NK incluyen NKG, YT, NK-Y^s, HANK-1, células YTS y células NKL.

Las células NK median los efectos antitumorales sin el riesgo de GvHD y tienen una vida corta en relación con las células T. En consecuencia, las células NK se agotarían poco después de destruir las células cancerosas, disminuyendo la necesidad de un gen suicida inducible en los constructos CAR que eliminaría las células manipuladas.

En una realización, la célula manipulada puede incluir más de un tipo de polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito en el presente documento. Se han contemplado realizaciones en las que la célula manipulada incluye al menos dos de un CD2CAR, CD3CAR, CD4CAR, CD5CAR y CD7CAR.

Por ejemplo, la célula manipulada puede incluir un polipéptido receptor de antígeno quimérico CD4 (CD4CAR) y un polipéptido receptor de antígeno quimérico CD5 (CD5CAR).

Como se usa en el presente documento, CDXCAR se refiere a un receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CDX. Como se usa en el presente documento, CDX puede ser uno cualquiera de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

Células T deficientes en TCR utilizadas para transportar CAR

En una realización, las células manipuladas, en particular las células T alogénicas obtenidas de donantes, pueden modificarse para inactivar componentes de TCR (receptor de células T) implicados en el reconocimiento de MHC. Como resultado, las células T deficientes en TCR no provocarían la enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD).

Células T y NK deficientes en antígeno T

Los linfomas de células T o las leucemias de células T expresan antígenos específicos, que pueden representar objetos útiles para estas enfermedades. Por ejemplo, los linfomas o leucemias de células T expresan CD7, CD2, CD3 y CD5. Sin embargo, CD7, CD2, CD3 y CD5 también se expresan en células CAR T o NK (excepto CD3 y CD5), lo que contrarresta su capacidad de dirigirse a estos antígenos. La automortandad podría ocurrir en células T o células Nk armadas con CAR que se dirijan a uno cualquiera de estos antígenos. Esto dificulta la generación de CAR dirigidos a estos antígenos. Por lo tanto, puede ser necesario inactivar un antígeno endógeno en una célula T o NK cuando se utiliza como objetivo para armar CAR.

En otra realización, la célula manipulada se modifica adicionalmente para inactivar el polipéptido de la superficie celular para evitar que las células modificadas actúen sobre otras células modificadas. Por ejemplo, uno o más de los genes endógenos CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7 de las células manipuladas pueden eliminarse o inactivarse. En una realización preferida, la célula manipulada es una célula asesina natural que tiene al menos uno de los genes endógenos CD2 y CD7 desactivado o inactivado.

En otra realización preferida, la célula manipulada es una célula T que tiene al menos uno de los genes endógenos CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7 desactivado o inactivado. En otra realización preferida, la célula manipulada es una célula NK que tiene al menos uno de los genes CD2 y CD7 endógenos desactivado o inactivado.

En una realización, la célula manipulada que expresa un CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno particular tendrá el gen que expresa ese antígeno inactivado o anulado. Por ejemplo, una célula T que tenga un CAR CD2 tendrá un gen del antígeno CD2 inactivado o anulado. En otra realización, se modificará una célula manipulada (por ejemplo, célula NK o célula T) que tiene un CAR con un dominio de reconocimiento de antígeno CD4 para que el antígeno CD4 no se exprese en su superficie celular. En otra realización, una célula modificada (por ejemplo, célula NK o célula T) que tiene un CAR con un dominio de reconocimiento de antígeno CD2 y otro CAR con un dominio de reconocimiento de antígeno CD7 puede tener tanto el gen del antígeno CD2 como el gen del antígeno CD7 anulados o inactivados.

Tabla 1: antígenos de superficie celular de células asesinas naturales y células T; CD8 no es parte de la invención.

Los métodos para anular o inactivar genes son comúnmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, sistema CRISPR/Cas9, se pueden usar la nucleasa con dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas TALE (TALEN) y las meganucleasas para anular o inactivar los genes CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7 de las células modificadas.

Fuentes de células

Las células manipuladas pueden obtenerse de sangre periférica, sangre de cordón umbilical, médula ósea, linfocitos infiltrantes de tumores, tejido de nódulo linfático o tejido del timo. Las células anfitrionas pueden incluir células placentarias, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o células madre hematopoyéticas. Las células pueden obtenerse de seres humanos, monos, chimpancés, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Las células pueden obtenerse a partir de líneas celulares establecidas.

Las células anteriores pueden obtenerse por cualquier medio conocido. Las células pueden ser autólogas, singénicas, alogénicas o xenogénicas para el receptor de las células manipuladas.

El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo que se le va a volver a introducir más tarde en el individuo.

El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se le va a introducir el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente genéticamente para interactuar antigénicamente.

El término "xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término "singénico" se refiere a una similitud o identidad genética extremadamente cercana, especialmente con respecto a antígenos o reacciones inmunológicas. Los sistemas singénicos incluyen, por ejemplo, modelos en los que los órganos y las células (por ejemplo, las células cancerosas y sus contrapartes no cancerosas) provienen del mismo individuo, y/o modelos en los que los órganos y las células provienen de diferentes animales individuales que son de la misma cepa endogámica.

Sistema suicida

Las células manipuladas de la presente divulgación también pueden incluir un sistema suicida. Los sistemas suicidas proporcionan un mecanismo mediante el cual la célula manipulada, como se ha descrito anteriormente, puede desactivarse o destruirse. Tal característica permite un control terapéutico preciso de cualquier tratamiento en el que se utilicen las células manipuladas. Como se usa en el presente documento, un sistema suicida proporciona un mecanismo por el cual la célula que tiene el sistema suicida puede desactivarse o destruirse. Los sistemas suicidas son bien conocidos en la técnica.

En una realización, un sistema suicida incluye un gen que puede activarse farmacológicamente para eliminar las células que lo contienen según se requiera. En aspectos específicos, el gen suicida no es inmunogénico para el huésped que alberga el polinucleótido o la célula. En un ejemplo, el sistema suicida incluye un gen que hace que CD20 se exprese en la superficie celular de la célula manipulada. En consecuencia, la administración de rituximab se puede usar para destruir la célula manipulada que contiene el gen.

En algunas realizaciones, el sistema suicida incluye una etiqueta epitópica. Los ejemplos de etiquetas de epítopos incluyen una etiqueta c-myc, un péptido de unión a estreptavidina (SBP) y un gen EGFR truncado (EGFRt). En esta realización, la etiqueta del epítopo se expresa en la célula manipulada. En consecuencia, puede usarse la administración de un anticuerpo contra la etiqueta del epítopo para destruir la célula manipulada que contiene el gen.

En otra realización, el sistema suicida incluye un gen que hace que se exprese el receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado en la superficie de la célula manipulada. En consecuencia, la administración de cetuximab se puede utilizar para destruir la célula manipulada que contiene el gen.

En otra realización, el gen suicida puede incluir el gen caspace 8, el gen caspasa 9, la timidina quinasa, la citosina desaminasa (CD) o el citocromo P450.

Los ejemplos de otros sistemas suicidas incluyen los descritos por Jones et al. (Jones BS, Lamb LS, Goldman F y Di Stasi A (2014) que mejoran la seguridad de los productos de terapia celular mediante la transferencia de genes suicidas. Front. Pharmacol. 5:254. doi: 10.3389/fphar.2014.00254).

CD2CAR

La molécula de adhesión CD2 es un antígeno de superficie celular expresado por todas las células T de sangre periférica y las células asesinas naturales, pero no en los linfocitos B. El dominio extracelular de CD2 contiene dominios similares a inmunoglobulinas que pueden mediar en la homodimerización. La ligadura de CD2 por CD58 (LFA-3) o CD48 ayuda a las células T a adherirse a las células presentadoras de antígenos y desencadena vías de transducción de señales que mejoran la señalización a través del receptor de células T para el antígeno. Los ratones inactivados para CD2 presentan una función inmunitaria normal, y se cree que el CD2 es funcionalmente similar a otros receptores coestimuladores de células T, tal como el CD28.

CD2 se expresa en T-ALL, linfoma/leucemia de células T, leucemia promielocítica aguda (variante microgranular), mastocitosis sistémica, enfermedad de mastocitos, timoma y linfoma mieloide agudo (M0) y leucemia de células NK.

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno específico para un antígeno CD2 y células manipuladas que lo expresan.

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico que tiene una variante de la secuencia de un dominio de reconocimiento de antígeno específico para un antígeno CD2 y células manipuladas que expresan el mismo.

En una realización, CD2 CAR incluye al menos un dominio coestimulador. En otra realización, el CD2CAR incluye al menos dos dominios coestimuladores.

En una realización, el CD2CAR incluye SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11

CD3CAR

CD3 consiste en un complejo de proteínas y está compuesto por cuatro cadenas distintas, como se describe en la figura anterior. El complejo contiene una cadena CD35, una cadena CD3y y dos cadenas CD3e. Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) que se compone de cadenas ap.

El complejo TCR/CD3 es un marcador único para las células de linaje T. Hay una variedad de anticuerpos monoclonales contra este complejo que se han desarrollado. Uno de tales anticuerpos monoclonales es el anticuerpo monoclonal murino OKT3 contra el CD3 de superficie. CD3 es el marcador común para las células T y las neoplasias malignas de células T. OKT3 contra CD3 epsilon es el anticuerpo común utilizado para identificar células T. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 como tratamientos incluyen: (1) rechazo agudo de aloinjerto renal, cardíaco o hepático; (2) agotamiento de las células T de la médula del donante antes del trasplante; (3) nueva aparición de diabetes tipo I. CD3 contra la cadena épsilon de CD3 es el anticuerpo de células T más específico utilizado para identificar células T en trastornos benignos y malignos. CD3 se encuentra en 86 % de los linfomas de células T periféricas.

En algunas realizaciones, la divulgación incluye un método para generar CD3CAR. En realizaciones adicionales, CD3CAR incluye un anticuerpo scFv que se une específicamente a la proteína de superficie de CD3.

En algunas realizaciones, CD3CAR incluye una molécula scFv, que se une específicamente a los complejos TCR/CD3.

En algunas realizaciones, el scFv en CAR puede ser una molécula que se une específicamente a los dominios extracelulares de apTCR asociados con CD3.

CD4CAR

En una realización, el receptor de antígeno quimérico de la presente divulgación incluye un dominio de reconocimiento de antígeno CD4, CD4CAR.

En una realización, CD4 CAR incluye al menos un dominio coestimulador. En otra realización, el CD4CAR incluye al menos dos dominios coestimuladores.

En una realización, CD4CAR incluye SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14

CD5CAR

En otra realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno específico para CD5 y células manipuladas que lo expresan.

En una realización, el CD5CAR incluye al menos un dominio coestimulador. En otra realización, el CD5CAR incluye al menos dos dominios coestimuladores.

CD7CAR

CD7 es una proteína transmembrana que es miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Esta proteína se expresa en la superficie de las células T maduras. Es el antígeno de superficie más temprano expresado en células de linaje de células T.

CD7 es un marcador muy bueno para T-ALL y más del 90% de T-ALL expresa CD7. CD7 también se expresa en linfoma NK, linfoma/leucemia de células T, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda y timoma rico en linfocitos.

En una realización, la divulgación proporciona un polipéptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno específico para un antígeno CD7 y células manipuladas que lo expresan.

En una realización, el CD7CAR incluye al menos un dominio coestimulador. En otra realización, el CD7CAR incluye al menos dos dominios coestimuladores

Métodos

Método de fabricación de células modificadas

En una realización, la divulgación también proporciona métodos para fabricar las células manipuladas descritas anteriormente.

En esta realización, las células descritas anteriormente se obtienen o aíslan. Se puede aislar las células por cualquier medio conocido. Las células incluyen células de sangre periférica o células de sangre de cordón umbilical. En otra realización, las células son células placentarias, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o células madre hematopoyéticas.

El polinucleótido que codifica el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente se introduce en las células de sangre periférica o células de sangre de cordón umbilical por cualquier medio conocido. En un ejemplo, se introduce el polinucleótido que codifica el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente en la célula por medio de un vector viral.

Se introduce el polinucleótido que codifica el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente en las células placentarias, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o células madre hematopoyéticas por cualquier medio conocido. En un ejemplo, se introduce el polinucleótido que codifica el polipéptido receptor de antígeno quimérico descrito anteriormente en la célula por medio de un vector viral.

En otras realizaciones, se puede construir el polinucleótido receptor de antígeno quimérico como un "derivado biodegradable" modificado con ARN transitorio. Los derivados modificados con ARN pueden someterse a electroporación en una célula T o una célula NK. En una realización adicional, el receptor de antígeno quimérico descrito en el presente documento puede construirse en un sistema de transponson también denominado "Bella Durmiente", que integra el polinucleótido del receptor de antígeno quimérico en el genoma anfitrión sin un vector viral.

Una vez que se introduce el polinucleótido descrito anteriormente en la célula para proporcionar una célula manipulada, las células modificadas se expanden. Las células manipuladas que contienen el polinucleótido descrito anteriormente se expanden por cualquier medio conocido.

Se aíslan las células expandidas por cualquier medio conocido para proporcionar células manipuladas genéticamente de acuerdo con la presente divulgación.

Métodos de uso

La divulgación proporciona métodos para matar, reducir el número o agotar las células inmunorreguladoras. En otra realización, la divulgación proporciona un método para matar, reducir el número o agotar las células que tienen al menos una de CD2, CD3, Cd 4, CD5 y CD7.

Como se usa en el presente documento, "reducir el número de" incluye una reducción de al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 99% o 100%.

Como se usa en el presente documento, "agotar" incluye una reducción de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 99 % o 100 %.

En una realización, la divulgación incluye un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD2 poniendo en contacto las células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de las células manipuladas descritas anteriormente que expresan un péptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD2. Opcionalmente, se puede determinar la reducción en el número de células inmunorreguladoras que tienen CD2 mediante cualquier ensayo de destrucción celular conocido en la técnica.

Como se usa en el presente documento, las células inmunorreguladoras pueden estar en un paciente, en cultivo celular o aisladas.

Como se usa en el presente documento, "paciente" incluye mamíferos. El mamífero al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnivora, incluyendo los felinos (gatos) y los caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluyendo los bovinos (vacas) y los cerdos (porcinos), o del orden Perssodactyla, incluyendo los equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (humanos y simios). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

En ciertas realizaciones, el paciente es un ser humano de 0 a 6 meses, de 6 a 12 meses, de 1 a 5 años, de 5 a 10 años, de 5 a 12 años, de 10 a 15 años, de 15 a 20 años, 13 a 19 años, 20 a 25 años, 25 a 30 años, 20 a 65 años, 30 a 35 años, 35 a 40 años, 40 a 45 años, 45 a 50 años, 50 a 55 años, 55 a 60 años, 60 a 65 años, 65 a 70 años, 70 a 75 años, 75 a 80 años, 80 a 85 años, 85 a 90 años, 90 a 95 años o de 95 a 100 años.

Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" de una célula manipulada, tal como se utilizan en el presente documento, significan una cantidad suficiente de la célula manipulada para proporcionar el efecto o resultado terapéutico o fisiológico deseado. Dicho efecto o resultado incluye la reducción o mejora de los síntomas de la enfermedad celular. Efectos indeseables, por ejemplo, efectos secundarios, a veces se manifiestan junto con el efecto terapéutico deseado; por lo tanto, un profesional sopesa los beneficios potenciales frente a los riesgos potenciales al determinar cuál es una "cantidad efectiva" adecuada. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y condición general del sujeto, modo de administración. Por lo tanto, puede que no sea posible especificar una "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, una "cantidad efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando solo experimentación de rutina. Generalmente, se administran la célula o células manipuladas en una cantidad y bajo condiciones suficientes para reducir la proliferación de células objetivo.

En una realización, la divulgación incluye un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD3 poniendo en contacto las células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de las células manipuladas descritas anteriormente que expresan un péptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD3. Opcionalmente, se puede determinar la reducción en el número de células inmunorreguladoras que tienen CD3 mediante cualquier ensayo de destrucción celular conocido en la técnica.

En una realización, la divulgación incluye un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD4 poniendo en contacto las células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de las células manipuladas descritas anteriormente que expresan un péptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4. Opcionalmente, se puede determinar la reducción en el número de células inmunorreguladoras que tienen CD4 mediante cualquier ensayo de destrucción celular conocido en la técnica.

En una realización, la divulgación incluye un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD5 poniendo en contacto las células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de las células manipuladas descritas anteriormente que expresan un péptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD5. Opcionalmente, se puede determinar la reducción en el número de células inmunorreguladoras que tienen CD5 mediante cualquier ensayo de destrucción celular conocido en la técnica.

En una realización, la divulgación incluye un método para reducir el número de células inmunorreguladoras que tienen CD7 poniendo en contacto las células inmunorreguladoras con una cantidad eficaz de las células manipuladas descritas anteriormente que expresan un péptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD7. Opcionalmente, se puede determinar la reducción en el número de células inmunorreguladoras que tienen CD7 mediante cualquier ensayo de destrucción celular conocido en la técnica.

Células manipuladas para su uso en un método de tratamiento

En otra realización, la divulgación proporciona las células manipuladas descritas anteriormente para su uso en métodos para el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de las células modificadas descritas anteriormente a un paciente que necesita las mismas.

La enfermedad proliferativa celular es cualquiera de cáncer, enfermedad neoplásica o cualquier enfermedad que implique proliferación celular descontrolada (por ejemplo, formación de masa celular) sin ninguna diferenciación de esas células en células especializadas y diferentes.

Las enfermedades proliferativas celulares también incluyen una neoplasia maligna o una afección precancerosa tal como un síndrome de mielodisplasia o una preleucemia o un prelinfoma.

Con respecto a los métodos descritos, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de vejiga), cáncer de huesos, cáncer de cerebro (por ejemplo, meduUoblastoma), cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, tumores líquidos, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de células no pequeñas), linfoma, mesotelioma maligno, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica B, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica aguda de células T y linfoma de Burkitt, linfoma extraganglionar de células NK/T, leucemia/linfoma de células NK, trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, tumores sólidos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de uréter. Preferiblemente, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica (por ejemplo, leucemia o linfoma, incluyendo, pero sin limitarse a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica B, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt, carcinoma tímico, linfoma difuso de células grandes, linfoma de células del manto, linfoma linfocítico pequeño (SLL) y leucemia linfoide crónica (LLC), linfoma de células T y linfoma de células T periféricas.

La divulgación proporciona las células manipuladas descritas anteriormente para su uso en un método para el tratamiento del rechazo agudo de órganos por agotamiento de las células T y NK que están asociadas con CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

En una realización, la divulgación incluye las células modificadas descritas anteriormente para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD) aguda o crónica mediante el agotamiento de las células T y las células NK que están asociadas con al menos uno de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

En una realización, la descripción proporciona una célula manipulada que tiene CD3CAR para usar en un método para prevenir el rechazo de órganos. Se administra una cantidad eficaz de la célula manipulada que tiene CD3CAR a un paciente que se ha sometido a un trasplante de órganos o que se someterá a un trasplante de órganos.

En otra realización, la descripción proporciona una cantidad eficaz de una célula manipulada que tiene CD3CAR para usar en un método para prevenir o tratar la GVHD. Se administra una cantidad eficaz de la célula manipulada a un paciente que necesite la misma.

En una realización, la divulgación incluye células CAR T o NK para su uso en un método para el agotamiento o reducción de células T o NK del donante y del huésped usando células CAR T o NK in vivo para trasplante de células madre. Esto podría lograrse mediante la administración de células CAR T o NK a un paciente inmediatamente antes de la infusión del injerto de células madre de médula ósea.

La divulgación proporciona un método de inmunoterapia como una estrategia de acondicionamiento o puente al trasplante o independiente para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares que están asociadas con al menos uno de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

La divulgación proporciona un método para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares que están asociadas con al menos uno de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

En otra realización, la divulgación proporciona un método para el tratamiento de enfermedades no relacionadas con el cáncer que están asociadas con la expresión de al menos uno de CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7.

En algunas realizaciones, se combina CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígenos CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 para usar en el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular con un bloqueo de puntos de control, tal como CTLA-4 y PD1/PD-L1. Esto puede conducir a una mayor erradicación del tumor.

La presencia de microambientes inmunosupresores puede limitar las funciones completas de las células CAR T/NK. En algunas realizaciones, la combinación de CD4CAR con el bloqueo de puntos de control como CTLA-4 y PD1/PD-L1 puede conducir a una erradicación mejorada del tumor. Actualmente, e está probando el bloqueo de puntos de control s en ensayos clínicos en combinación con células CAR T.

En algunas realizaciones, se usan los CAR que tienen un dominio de reconocimiento de antígenos CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 como una estrategia para profundizar, eliminar, reducir, resistir y/o prolongar las respuestas a la quimioterapia inicial, o cuando se combinan con otras terapias complementarias. Todas las terapias complementarias disponibles para tratar o prevenir la enfermedad se consideran parte de esta divulgación.

En algunas realizaciones, se administran los CAR de células NK que tienen un dominio de reconocimiento de antígenos CD2, CD3, CD4, CD5 o CD7 "listos para usar" a cualquier mamífero con cáncer y/o trastornos autoinmunes.

CD3CAR

En algunas realizaciones, la célula NK que lleva el CAR CD3 exhibe una inmunidad antitumoral y ejerce la eficacia de matar leucemias/linfomas que expresan CD3.

La divulgación proporciona métodos para eliminar o reducir las células T anormales o malignas en la médula ósea, la sangre y los órganos usando células NK CD3CAR. En algunas realizaciones, las neoplasias malignas positivas para CD3 pueden incluir, pero no limitarse a, leucemia/linfoma linfoblástico T precursor, linfomas/leucemias de células T maduras, trastornos linfoproliferativos de células T positivas para EBV, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoide/síndrome de Sezary, trastornos linfoproliferativos cutáneos primarios de células T positivas para CD30, linfoma periférico de células T (no especificado), linfoma angioinmunoblástico de células T y linfoma anaplásico de células grandes.

En algunas realizaciones, se pueden usar las células NK CD3CAR para tratar pacientes con leucemias/linfomas T, que no son elegibles para la terapia con células madre o que nunca lograron una remisión a pesar de muchos regímenes de quimioterapia intensivos. En realizaciones adicionales, se puede usar las células NK CD3CAR como un componente del régimen de acondicionamiento para un trasplante de médula ósea o un puente hacia el trasplante de médula ósea.

CD4CAR

En una realización, la célula manipulada que tiene el CD4CAR exhibe una inmunidad antitumoral cuando el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR se une a su antígeno correspondiente. En una realización preferida, la célula T CD8 que comprende el CAR ejerce la eficacia de matar células de leucemias/linfomas que expresan CD4.

La presente divulgación incluye células modificadas para su uso en métodos para eliminar, reducir, tratar, prevenir o eliminar células T anormales o malignas que se encuentran, incluyendo, pero sin limitarse a, la médula ósea, la sangre y/u los órganos. En algunas realizaciones, las células malignas que expresan CD4 están presentes en pacientes con leucemia/linfoma linfoblástico T precursor, linfomas/leucemias de células T maduras tales como, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de células T, trastornos linfoproliferativos de células T positivas para EBV, leucemia/linfoma de células T del adulto, micosis fungoide/síndrome de Sézary, trastornos linfoproliferativos cutáneos primarios de células T positivas para CD30, linfoma periférico de células T (no especificado), linfoma angioinmunoblástico de células T y linfoma anaplásico de células grandes.

En algunas realizaciones, las células CD4CAR se usan para tratar células T de leucemias/linfomas en pacientes que no son elegibles para terapia con células madre o pacientes que nunca lograron una remisión a pesar de muchos regímenes de quimioterapia.

En algunas realizaciones, se utilizan las células CD4CAR para tratar la leucemia mielomonocítica aguda que expresa CD4, la leucemia monoblástica aguda, la leucemia monocítica y la leucemia mielomonocítica crónica.

En algunas realizaciones, las células T CD4CAR pueden expandirse en el medio de cultivo de células T y las subpoblaciones tales como células T de memoria central o células T vírgenes pueden aislarse y usarse para mejorar el injerto. Estas células pueden persistir y respaldar las funciones de las células T de memoria, lo que las convertiría en candidatas ideales para el control a largo plazo de los cánceres.

La presencia de microambientes inmunosupresores puede limitar las funciones completas de las células CAR T/NK. En algunas realizaciones, la combinación de CD4CAR con el bloqueo de puntos de control como CTLA-4 y PD1/PD-L1 puede conducir a una erradicación mejorada del tumor.

En algunas realizaciones, se usan las células CD4CAR como una estrategia para profundizar, eliminar, reducir, resistir y/o prolongar las respuestas a la quimioterapia inicial, o cuando se combinan con otras terapias complementarias. Todas las terapias complementarias disponibles para tratar o prevenir la enfermedad se consideran parte de esta divulgación. La quimioterapia incluye, pero no se limita a, CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristia, prednisona), EPOCH (etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida, prednisona) o cualquier otro régimen de múltiples medicamentos. En una realización preferida, se utilizan las células CD4CAR para tratar o prevenir una enfermedad residual después de un trasplante de células madre y/o quimioterapia.

En una realización, la célula que incluye el CD4CAR muestra un agotamiento de las células inmunorreguladoras cuando se une el dominio de reconocimiento de antígenos del CAR a su antígeno correspondiente. Por ejemplo, las células que incluyen CD4CAR incluyen, pero no se limitan a, al menos una de las células T CD8, células NK o células NK-92. Se considera parte de esta divulgación cualquier otra célula adecuada que tenga CD4CAR que exhiba y/o ejerza la alta eficacia de eliminación de células auxiliares CD4 cuando las encuentra, por lo que se pueden prevenir los rechazos de trasplantes de órganos o se pueden controlar o aliviar las enfermedades autoinmunes.

No hay preocupación por la persistencia de los efectos secundarios asociados con CAR observados en las células T CAR. En algunas realizaciones, se pueden administrar las células NK CD4CAR a pacientes con trastornos autoinmunes en un entorno clínico agudo o crítico para agotar rápidamente las células inmunorreguladoras tales como las células T auxiliares CD4 y, por lo tanto, habilitar o permitir que se regeneren las células T auxiliares CD4 nuevas o sin memoria.

La divulgación incluye un método para generar CD4CAR. En algunas realizaciones, se genera CD4CAR utilizando células T. En otras realizaciones, se genera CD4CAR usando células NK o células NK-92, de manera que se administran "listas para usar" a cualquier mamífero con cáncer y/o trastornos autoinmunes. En algunas realizaciones, las células NK-92 CD4CAR o NK pueden matar células, reducir, agotar y/o prevenir células T CD4+ particulares o células cancerosas que expresan CD4.

En algunas realizaciones, las células NK-92 CD4CAR pueden generarse con un alto nivel de expresión de CD4CAR mediante citometría de flujo usando anticuerpos Fab anti-ratón de cabra o una parte de los mismos. Se considera parte de esta divulgación cualquier otro tipo de anticuerpo generado utilizando cualquier otro género.

En algunas realizaciones, se pueden utilizar las células NK-92 CD4CAR para una terapia en un momento en que existe una enfermedad residual mínima después de un trasplante de células madre o quimioterapia.

En algunas realizaciones, el CD4CAR es parte de un gen o casete que se expresa. En una realización preferida, el gen de expresión o el casete pueden incluir un gen accesorio o una etiqueta de epítopo o una parte del mismo, además del CD4CAR. El gen accesorio puede ser un gen suicida inducible o una parte del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, el gen de la caspasa 9, la timidina quinasa, la citosina desaminasa (CD) o el citocromo P45029. Los enfoques de ablación del "gen suicida" mejoran la seguridad de la terapia génica y matan las células solo cuando son activadas por un compuesto específico o una molécula. En algunas realizaciones, el gen suicida es inducible y se activa usando un inductor químico de dimerización (CID) específico.

En algunas realizaciones, la etiqueta accesoria es una etiqueta c-myc, un gen EGFR truncado (EGFRt) o una parte o una combinación de los mismos. Se puede utilizar la etiqueta accesoria como herramienta de selección no inmunogénica o para rastrear marcadores.

En algunas realizaciones, se pueden administrar las células huésped que expresan CD4CAR con uno o más agentes terapéuticos adicionales a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). A este respecto, se puede administrar la composición que incluye las células huésped o el vector que comprende CD4CAR en primer lugar, y se pueden administrar el uno o más agentes terapéuticos adicionales en segundo lugar, o viceversa.

La presente divulgación incluye dentro de su alcance administrar una cantidad típica de células huésped que expresan CD4CAR a un mamífero, que por ejemplo puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 millones a aproximadamente de mil millones de células. Se consideran parte de la divulgación todos los subintervalos e intervalos fuera del intervalo indicado anteriormente.

En una realización preferida, se usa un promotor SFFV para redirigir las células T CD8 a las células objetivo que expresan CD4 y para impulsar la expresión de CD4CAR. En algunas realizaciones, CAR incluye características funcionales tales como la expresión extracelular de scFv y el ejercicio de una fuerte respuesta inmune cuando se encuentra con las células que expresan CD4.

En una realización, se selecciona la célula que comprende el CD4CAR de un grupo que incluye un linfocito T citotóxico (CTL) y una célula asesina natural (NK). En una realización preferida, las células que tienen CAR incluyen, pero no se limitan a, células T CD8, células ⁿK y células NK-92.

En algunas realizaciones, se puede usar CD4CAR con conjugados de fármacos, incluyendo conjugados de ADN/ácido nucleico, péptidos, entidades químicas y/o moléculas pequeñas para proporcionar eficacia y seguridad mejoradas.

Se puede lograr el control de la infección por VIH-1 en pacientes con VIH usando una combinación de terapias antirretrovirales, sin embargo, la carga viral aumenta después de la interrupción. La fuente o reservorio del VIH-1 reemergente son las células T CD4 de memoria. En una realización, se usa el CD4CAR de la presente divulgación para agotar las células T CD4 de memoria, por lo que se logra una cura esterilizante para la infección por VIH. En otra realización, el CD4CAR ayuda a bloquear la entrada viral del VIH, mientras que se une el CD4CAR a la proteína CD4, una proteína esencial para la entrada del VIH.

En consecuencia, la divulgación proporciona un método para prevenir los rechazos de trasplantes de órganos mediante la reducción de las células T CD4. El método incluye administrar a un paciente que necesite el mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula manipulada que tiene un polipéptido receptor de antígeno quimérico que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD4.

CD5CAR

En otra realización, se usa la administración de un polipéptido CAR que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno CD5 (CD5CAR) para tratar la artritis reumatoide. En otra realización, se puede usar CD5CAR como profilaxis para la enfermedad de injerto contra huésped después de la terapia de trasplante de médula ósea (BMT). En otra realización, se puede usar CD5CAR para modificar la expresión de CD5 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y neoplasias malignas.

En algunas realizaciones, la divulgación de células manipuladas que tienen un receptor de antígeno quimérico selectivo para CD5 puede actuar como un puente para el trasplante de médula ósea para aquellos pacientes que ya no responden a la quimioterapia o tienen enfermedades residuales mínimas y no son elegibles para el trasplante de médula ósea. En realizaciones adicionales, CD5CAR puede eliminar las células leucémicas positivas para CD5 seguido de rescates del tallo de la médula ósea para apoyar la linfopenia.

En realizaciones particulares, una célula T o NK CD5CAR se dirige se dirige a células que expresan CD5. Las células objetivo pueden ser, pero sin limitarse a, células cancerosas, tales como linfoma de células T o leucemia de células T, leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células T precursoras, leucemia linfocítica crónica de células B/linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes positivas para CD5 y carcinoma tímico.

En una realización, se puede usar CD5CAR para tratar trastornos no hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedades autoinmunes.

Las células T manipuladas o modificadas pueden expandirse en presencia de IL-2 o/y tanto IL-7 como IL-15, o usando otras moléculas.

Se puede realizar la introducción de CAR antes o después de la inactivación de CD5 mediante la expansión de células T manipuladas in vitro antes de la administración a un paciente.

En realizaciones particulares, se puede lograr la inactivación de CD5 por uno de los siguientes medios:

(1) Expresar scFv anti-CD5 en la superficie de las células T unidas a un dominio transmembrana a través de una región bisagra. Esto puede resultar en la conversión de células T positivas para CD5 en células T negativas para CD5.

(2) . Expresar scFv anti-CD5 que se une específicamente a la proteína CD5 o moduladores negativos de CD5 de la misma, o fragmentos o dominios de la misma.

En algunas realizaciones, un scFv (anticuerpo de cadena sencilla) contra CD5 se deriva de un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une a CD5 intracelular y bloquea el transporte de la proteína CD5 a la superficie celular. En una realización preferida, el scFv anti-CD5 incluye una secuencia de retención de ER (retículo endoplásmico), KDEL. Cuando se expresa intracelularmente y se retiene en el ER o Golgi, el scFv anti-CD5 atrapa al CD5 dentro de la vía de secreción, lo que da como resultado la prevención de la ubicación adecuada de la superficie celular de CD5 en una célula T.

En algunas realizaciones, se coadministran las células T CD5CAR con fármacos inmunomoduladores, tal como, pero sin limitarse a, bloqueadores de CTLA-4 y PD-1/PD-L1, o citocinas, tales como IL-2 e IL12 o inhibidores del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R), tales como FPA008, que conducen a mejores resultados terapéuticos.

En otra realización, la descripción proporciona un método para impartir, ayudar, aumentar o potenciar la inmunidad antileucemia o antilinfoma.

El agente terapéutico que incluye la célula manipulada que expresa CAR como ingrediente activo puede administrarse por vía intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, intraarterial, intravenosa, intratumoral o en un vaso linfático aferente, mediante administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, aunque la vía de administración no está limitada.

Cualquier método de la divulgación puede incluir además el paso de administrar al individuo una terapia contra el cáncer adicional, tal como cirugía, radiación, terapia hormonal, quimioterapia, inmunoterapia o una combinación de las mismas.

La quimioterapia incluye, pero no se limita a, CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristie, prednisona), EPOCH (etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida, prednisona) o cualquier otro régimen de múltiples medicamentos. En una realización preferida, se utilizan las células CD54CAR para tratar o prevenir una enfermedad residual después de un trasplante de células madre y/o quimioterapia.

En otra realización, el uso de una célula modificada en cualquier método de la divulgación puede incluir además terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizumab para pacientes con EM o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con leucoencefalopatía multifocal progresiva. En aspectos adicionales, se pueden usar las células T de la divulgación en un régimen de tratamiento en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. También se puede usar medicamentos que inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En otro aspecto, se administran las composiciones celulares de la presente divulgación a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia de ablación de células T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, terapia radiación de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, se administran las composiciones celulares de la presente divulgación después de una terapia de eliminación de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con quimioterapia de dosis alta seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente divulgación. En una realización adicional, se administran las células expandidas antes o después de la cirugía.

El término "enfermedad autoinmune", como se usa en el presente documento, se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un autoantígeno. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addision, alopecia grande, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo 1), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, síndrome de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa y colitis ulcerosa.

La presente divulgación puede comprenderse mejor con referencia a los ejemplos que se exponen a continuación. Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo se fabrican y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en el presente documento, y están destinados a ser puramente ejemplares y no pretenden limitar la divulgación.

Después de la administración del sistema de administración para tratar, inhibir o prevenir un cáncer, se puede evaluar la eficacia de la célula terapéutica manipulada de diversas formas bien conocidas por el médico experto. Por ejemplo, un experto normal en la técnica comprenderá que una célula de ingeniería terapéutica administrada junto con el quimioadyuvante es eficaz para tratar o inhibir un cáncer en un sujeto al observar que la célula de ingeniería terapéutica reduce la carga de células cancerosas o previene un mayor aumento en la carga de células cancerosas. Se pueden medir las cargas de células cancerosas mediante métodos que se conocen en la técnica, por ejemplo, usando ensayos de reacción en cadena de la polimerasa para detectar la presencia de ciertos ácidos nucleicos de células cancerosas o la identificación de ciertos marcadores de células cancerosas en la sangre usando, por ejemplo, un ensayo de anticuerpo para detectar la presencia de los marcadores en una muestra (por ejemplo, pero sin limitarse a, sangre) de un sujeto o paciente, o midiendo el nivel de anticuerpos de células cancerosas circulantes en el paciente.

A lo largo de esta especificación, se definen las cantidades por intervalos y por los límites inferior y superior de los intervalos. Se puede combinar cada límite inferior con cada límite superior para definir un intervalo. Los límites inferior y superior deben tomarse cada uno como un elemento separado.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización", "una realización", "un ejemplo" o "un ejemplo" significa que se incluye un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización o el ejemplo en al menos una realización de las presentes realizaciones. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización", "en una realización", "un ejemplo" o "un ejemplo" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización o ejemplo. Además, las características, estructuras o características particulares pueden combinarse en cualquier combinación y/o subcombinación adecuada en una o más realizaciones o ejemplos. Además, se aprecia que las figuras que se proporcionan aquí tienen fines explicativos para los expertos en la técnica y que los dibujos no están necesariamente dibujados a escala.

Como se usa en el presente documento, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene" o cualquier otra variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva. Por ejemplo, un proceso, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no está necesariamente limitado solo a esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho proceso, artículo o aparato.

Además, a menos que se indique expresamente lo contrario, "o" se refiere a un "o" inclusivo y no a un "o" exclusivo. Por ejemplo, se cumple una condición A o B con cualquiera de los siguientes: A es verdadero (o presente) y B es falso (o no presente), A es falso (o no presente) y B es verdadero (o presente), y tanto A como B son verdaderos (o presentes).

Además, no se deben considerar los ejemplos o ilustraciones proporcionados en el presente documento de ninguna manera como restricciones, límites o definiciones expresas de cualquier término o términos con los que se utilicen. En su lugar, se deben considerar estos ejemplos o ilustraciones como descritos con respecto a una realización particular y como ilustrativos únicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier término o términos con los que se utilicen estos ejemplos o ilustraciones abarcarán otras realizaciones que pueden o no darse con los mismos o en otra parte de la memoria descriptiva y todas esas realizaciones están destinadas a ser incluidas en la presente invención. El lenguaje que designa tales ejemplos e ilustraciones no limitativos incluye, pero no se limita a: "por ejemplo", "por ejemplo", "por ejemplo", y "en una realización".

En esta memoria descriptiva, se describen grupos de diversos parámetros que contienen múltiples miembros. Dentro de un grupo de parámetros, se puede combinar cada miembro con uno o más de los otros miembros para formar subgrupos adicionales. Por ejemplo, si los miembros de un grupo son a, b, c, d y e, los subgrupos adicionales específicamente contemplados incluyen cualquiera, dos, tres o cuatro de los miembros, por ejemplo, a y c; a, d y e; b, c, d ye; etc.

Ejemplos

Orientación de neoplasia malignar de células t humanas utilizando células t modificadas con receptor de antígeno quimérico (car) específico de cd4

Materiales y métodos

Donantes de sangre, células tumorales primarias y líneas celulares

Se obtuvieron células de linfoma humano y células mononucleares de sangre periférica a partir de muestras residuales. Se obtuvieron las células de sangre del cordón umbilical de donantes en el Stony Brook University Hospital. Se obtuvieron las líneas celulares de linfoma SP53 y KARPAS 299 de ATCC (Manassas, VA).

Lentivirus producción y transducción de células T

Para producir sobrenadante viral, se cotransfectaron células 293FT con plásmidos de empaquetamiento viral pMD2G y pSPAX, y con vector lentiviral pRSC.CD4.3G o GFP, utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, c A) según el protocolo del fabricante. Antes de la transducción lentiviral, se activaron células mononucleares de la capa leucocítica del cordón umbilical o de la sangre periférica durante dos días en presencia de 300 UI/mL de IL-2 y 1 |jg/mL de anti-CD3 humano (Miltenyi Biotec, Alemania).

Expansión de células T

Se expandieron las células T transducidas con CAR durante 7 días en medios de células T (50 % AIM-V, 40 % RPMI 1640, 10 % FBS y 1x penicilina/estreptomicina; todo Gibco) complementado con IL-2. Se contaron las células todos los días y se agregaron medios cada 2-3 días para mantener los recuentos de células T por debajo de 2 * 106 células/mL.

Inmunofenotipo CAR

Para el análisis del inmunofenotipo de células CAR, después de 7 días de expansión, se tiñeron las células T CD4CAR y las células de control GFP con CD45RO, CD45RA, CD62L y CD8 (todos de BD Biosciences) para el análisis de citometría de flujo.

Ensayos de ablación de células objetivo de cocultivo

Se incubaron células T CD4CAR o células T GFP (control) con células objetivo en proporciones de 2:1, 5:1 y 10:1 (200,000, 500,000 o 1 millón de células efectoras por 100,000 células objetivo, respectivamente) en 1 mL de células T medio de cultivo, sin IL-2 por 24h. Las células objetivo eran células KARPAS 299 (linfoma anaplásico de células T grandes que expresan CD4), células de leucemia de un paciente con leucemia de células T CD4+ -síndrome de Sezary- y de un paciente con linfoma de PTCL CD4+. Como control negativo, también se incubaron las células T CD4CAR y las células T GFP con células SP53 (linfoma de células del manto), que no expresan CD4, en las mismas relaciones en reacciones separadas de 1 mL. Después de 24 horas de cocultivo, se tiñeron las células s con anticuerpos anti-humanos CD8 y CD4 de ratón. En los experimentos con células SP53, se marcaron las células SP53 con CMTMR (Life Technologies) antes del cocultivo con células T, y se marcaron las células T con CD3 antihumano de ratón (PerCp) después de la incubación del cocultivo.

Modelo xenogénico de ratón in vivo

Se utilizaron ratones NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) del Jackson Laboratory bajo un protocolo aprobado por IACUC de la Stony Brook University Los ratones eran todos machos y tenían entre 8 y 12 semanas de edad. Se realizaron tres conjuntos de experimentos in vivo sin cegamiento. Para cada conjunto, se irradió a 10 ratones con una dosis subletal (2.5 Gy) de radiación gamma y se asignaron al azar al grupo de tratamiento o control. 24 h más tarde, los ratones recibieron una inyección intradérmica de 0.5 x106 o 1.0 x106 células KARPAS 299 para formar un tumor subcutáneo medible en 7 días. Se midió el área del tamaño del tumor cada dos días. En el primer grupo, tres días después de la inyección de 1 millón de células KARPAS 299, se administraron a los ratones por vía intravenosa (mediante inyección en la vena de la cola) 2 millones de células T CD4CAR (5 ratones) o 2 millones de células de control T GFP (5 ratones). Se inyectó una segunda dosis de 8 millones de células por vía intravenosa el Día 22. En el segundo conjunto, se irradiaron y se inyectaron 10 ratones NSG con 0.5 * 106 células KARPAS 299. El día 2, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa un curso de 8 millones de células T CD4CAR (5 ratones) y 8 millones de células T de control GFP (5 ratones). Se inyectó una segunda dosis de 5,5 millones de células por vía intravenosa el Día 10. En el tercer conjunto, se irradiaron e inyectaron 10 ratones NSG con 0.5 x106 células KARPAS 299. El día 1, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 2.5 x106 células T CD4CAR o con células T control GFP (5 ratones por grupo). Se repitieron las inyecciones intravenosas cada 5 días para un total de cuatro ciclos.

Resultados

Generación de la tercera generación de CD4CAR

Se derivó la secuencia de nucleótidos scFv (fragmento variable de cadena única) de la molécula anti-CD4 del ibalizumab monoclonal humanizado (también conocido como Hu5A8 o TNX-355). Este anticuerpo monoclonal se ha utilizado en una variedad de ensayos clínicos de Fase I o II. Para mejorar la transducción de señales a través de CD4CAR, se fusionaron los dominios intracelulares de los coestimuladores CD28 y 4-1BB con el dominio de señalización CD3 zeta. Además, se introdujo la secuencia líder de CD8 para la expresión eficaz de la molécula CD4CAR en la superficie celular. De hecho, el scFv anti-CD4 está vinculado a los dominios de señalización intracelular mediante regiones bisagra (H) y transmembrana (TM) derivadas de CD8 (Figura 1A). Se subclonó la molécula de ADN CD4CAR en un plásmido lentiviral. Debido a la presencia de dos dominios coestimuladores (CD28 y 4-1BB), se considera que CD4CAR es un CAR de tercera generación. La expresión de CD4CAR se controla con un potente promotor s FfV (virus formador de focos de bazo) y es muy adecuada para aplicaciones hematológicas.

Caracterización de CD4CAR

Para verificar el constructo de CD4CAR, se sometieron las células 293-FT transfectadas a análisis de transferencia Western. La inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal anti-CD3zeta mostró bandas del tamaño predicho para la proteína de fusión CD4CAR CD3zeta (Figura 1B). Como se esperaba, no se observó expresión de CD3zeta para el vector de control GFP (Figura 1B). También se analizó la eficiencia de transducción de los lentivirus CD4CAR generados en células HEK293 mediante citometría de flujo para scFv (Figura 6). Por lo tanto, se confirmó que el CD4CAR de tercera generación generado contenía el dominio intracelular CD3zeta en el extremo intracelular y el scFv en el extremo extracelular, lo que implica que todos los demás elementos estaban presentes: Dominios transmembrana y bisagra CD8, y dominios coestimuladores CD28 y 4-1BB (Figura 1C). Para la caracterización preclínica de la expresión y función de CD4CAR en células T, se activaron células T humanas con anticuerpos anti-CD3 e IL-2, luego se transdujeron respectivamente con sobrenadantes lentivirales de control CD4CAR y GFP. A continuación, las células T se expandieron durante 7 días después de la transducción.

Las células T CD4CAR derivadas de la sangre del cordón umbilical están altamente enriquecidas en células T CD8+ y la mayoría de ellas tienen un inmunofenotipo similar a una célula T de memoria central.

La sangre del cordón umbilical humano (CB) es una fuente alternativa para la terapia de células T alogénicas. Se activaron células de capa leucocitaria CB humana y se transdujeron con lentivirus CD4CAR o de control (GFP). Después de la transducción, se expandieron las células T CD4CAR y las células T GFP durante 7 días, observándose un aumento de 20 veces en el recuento de células para las células T CD4CAR y GFP (Figura 7). En el día 7, se analizaron las células mediante citometría de flujo para subconjuntos de células T (Figura 2A). El análisis de citometría de flujo mostró que ~54 % de las células T expresaron el CD4CAR (Figura 2B). Además, se analizaron los subconjuntos CD4 y CD8 durante el curso de la expansión T después de la transducción de CD4CAR. De acuerdo con hallazgos previos, se indujo a un pequeño subconjunto de células CD8 para expresar CD4 durante la activación de las células T con moléculas anti-CD3 y coestimuladoras (Fig. 2C). Como era de esperar, se agotó el subconjunto CD4+T casi por completo dentro de los 3 o 4 días posteriores a la transducción de CD4CAR en comparación con el control GFP, en el que ~33 % de las células permanecieron CD4+ (Figura 2C). Estos datos indican que las células T CD4CAR exhiben una potente actividad anti-CD4 in vitro durante la expansión de las células T.

También se evaluó el inmunofenotipo de las células T CD4CAR al final de cada cultivo. Después de la estimulación, las células T vírgenes pierden CD45RA y ganan CD45RO para convertirse en células T de memoria central. El análisis de citometría de flujo de 3 experimentos representativos mostró que 96 % de las células T expandidas eran CD45RO+, ~83 % eran CD62L+ y ~80 % eran CD8+CD45RO+CD62L, mientras que menos del 4 % eran CD45RA+ (Figura 2D). El inmunofenotipo CD8 CD45RO CD62L es consistente con la adquisición de un fenotipo similar a la memoria central, y la baja expresión de CD45RA confirma la pérdida del estado de células T vírgenes. Las células T CD4CAR derivadas de la sangre del cordón umbilical matan específicamente la leucemia/linfoma que expresa CD4, incluyendo el linfoma anaplásico de células grandes, el síndrome de Sezary y el linfoma PTCL no clasificado.

Se generaron células T CD4CAR altamente enriquecidas en células T CD8 (Figura 2C). A continuación, se probaron las células in vitro para funciones antileucémicas utilizando la línea celular KARPAS 299. Se estableció inicialmente la línea celular KARPAS 299 a partir de la sangre periférica de un paciente con linfoma anaplásico de células T grandes que expresa CD4. El análisis citogenético ha demostrado previamente que las células KARPAS 299 tienen muchas anomalías citogenéticas. Durante los experimentos de cocultivo, las células CD4CAR exhibieron una gran capacidad para matar células leucémicas (Figura 3A). En primer lugar, se analizó la capacidad de las células T CD4CAR derivadas de CB para eliminar las células KARPAS 299. De hecho, a las 24 h de incubación y con una relación E: T (efector: objetivo) baja de 2:1, las células CD4CAR eliminaron con éxito las células KARPA^s299. Como control, también se analizó la capacidad de las células T CD4CAR para extirpar las células de linfoma negativas para CD4. La línea celular de linfoma de células del manto SP53 es una línea celular de linfoma de células B humanas que no expresa CD4. El análisis de citometría de flujo mostró que las células T CD4CAR no pudieron generar lisis o eliminar el linfoma de células del manto SP53 (Figura 3D).

También se realizaron estudios utilizando muestras de pacientes. El paciente 1 presentó una forma agresiva de leucemia de células T CD4+, síndrome de Sezary, que no respondió a la quimioterapia estándar. El paciente 2 se presentó con un linfoma de PTCL+CD4 no especificado. El análisis de citometría de flujo de ambas muestras de pacientes reveló una expresión fuerte y uniforme de CD4, con casi todas las células leucémicas expresando CD4 (Figura 3B y C). Tal como se visualizó mediante el análisis de citometría de flujo, el cocultivo de muestras de pacientes con CD4CAR durante 24 horas dio como resultado una ablación rápida y definitiva de las neoplasias malignas de CD4+ y, una vez más, se observó aproximadamente 98 % de ablación tanto para el síndrome de Sezary como para los cocultivos de PTCL, en consonancia con la ablación de KARPAS mostrada anteriormente (Figura 3B y 3C). Por lo tanto, se mostró que, en un ensayo de cultivo conjunto, las células T CD4CAR eliminan de manera eficiente dos tipos diferentes de células agresivas de linfoma/leucemia CD4+directamente de las muestras de los pacientes, incluso con una relación E: T baja de 2:1 (Figura 3B y 3C). Estos datos respaldan que CD4 es un objetivo terapéutico prometedor para las leucemias y linfomas de células T positivas para CD4, de manera análoga al papel de c D19 en la detección de neoplasias malignar de células B a través de CAR anti-CD 19. Por lo tanto, la muestra de paciente y el ensayo de cocultivo de CD4CAR amplían la noción de usar CAR para detectar neoplasias malignar positivas para CD4.

Las células T CD4CAR derivadas de PBMC matan específicamente la línea celular tumoral que expresa CD4.

Dado que se usó la terapia T CAR adoptiva autóloga comúnmente en la clínica, se analizaron luego las células T CD4CAR derivadas de PBMC (células mononucleares de sangre periférica). Las PBMC se activaron y transdujeron con lentivirus CD4CAR. Se controlaron los conjuntos de CD4 y CD8 mediante citometría de flujo durante la expansión celular y se compararon con los de las células transducidas con GFP de control. Las células T CD4CAR derivadas de PBMC estaban altamente enriquecidas en células T CD8+ como se observa con las células T CD4CAR derivadas de CB (Figura 4A), lo que indica el papel de CD4CAR en el agotamiento de CD4+. Se probaron las células CD4CAR derivadas de PBMC posteriormente en su capacidad para extirpar células de leucemia/linfoma positivas para CD4, utilizando la línea celular KARPAS 299. El ensayo de ablación implicó el cultivo conjunto de células T CD4CAR o células T GFP, con células KARPAS 299 y con el control negativo de la línea celular de linfoma de células del manto SP53. Se detuvieron las reacciones después de 24 horas: se tiñeron las células muertas con 7-AAD (7-aminoactinomicina D) y se analizaron las células vivas mediante citometría de flujo. Se eliminaron las células KARPAS 299 incubadas con células T CD4CAR durante la noche a una tasa del 38 %, 62 % y 85 %, en relaciones E: T de 2:1, 5:1 y 10:1, respectivamente (Figura 4B). Combinados, estos datos demuestran una fuerte relación dosis-respuesta. Cuando se incubaron las células objetivo con células T de control GFP, no se observó mortandad de células KARPAS 299. Estos resultados demuestran que la ablación de células T CD4CAR es específica para el direccionamiento de CD4+. Las células T CD4CAR exhiben una actividad antitumoral significativa in vivo.

En orden para evaluar in vivo actividades antitumorales, se desarrolló un modelo de ratón xenogénico utilizando la línea celular KARPAS 299. Se utilizaron múltiples configuraciones diferentes para probar la eficacia de las células T CD4CAR in vivo. Primero se probó la capacidad de las células T CD4CAR para retrasar la aparición de leucemia en los ratones NSG con una sola dosis baja. Antes de la inyección, las células T modificadas mostraban ~40 a 50 % de células que expresaban CD4CAR, como lo demuestra el análisis de citometría de flujo. Los ratones recibieron inyecciones intradérmicas de células KARPAS 299 y luego una dosis baja (2 millones) de inyección sistémica única (administración intravenosa) de células T CD4CAR. La administración de una sola dosis baja de células CD4CART sistémicas a ratones portadores de leucemia solo provocó una regresión transitoria o retrasó la aparición de una masa leucémica (Figura 5A). Cuando el crecimiento de la leucemia comenzó a acelerarse, un curso adicional de administración de 8 x106 células T CD4CAR detuvieron notablemente el crecimiento leucémico (Figura 5A).

Para probar aún más la eficacia de la actividad antileucémica de CD4CAR, se administraron dos ciclos de dosis relativamente altas de células T CD4CAR. Del mismo modo, dos inyecciones por un total de 13.5 * 106 células T CD4CAR causaron una detención del crecimiento de la leucemia más pronunciada en comparación con una dosis más baja de CD4CAR, pero finalmente se recuperó la población de células leucémicas (Figura 5B). Finalmente, se investigó la eficacia de inyecciones de ciclos múltiples de una dosis baja de células T CD4CAR (cada.,5 x 106 células). Se trataron a los ratones que tenían leucemia subcutánea con inyecciones intravenosas repetidas de células T CD4CAR, una vez cada 4 o 5 días para un total de 4 inyecciones. Después de cuatro cursos de administración de células T CD4CAR, uno de los cuatro ratones tratados estaba libre de tumores y no mostraba apariencia tóxica. Los ratones tratados con dosis múltiples de células T CD4CAR mostraron un efecto antileucémico más significativo en comparación con la dosis única (Figura 5C y 5A). Además, el tratamiento con células T CD4CAR prolongó significativamente la supervivencia de ratones portadores de linfoma KARPAS 299 en comparación con el tratamiento con células T de control transducidas con GFP (Figura 5D).

Las células NK del receptor de antígeno quimérico anti-CD4 (CD4CAR) se dirigen de manera eficiente a las neoplasias malignas de células T en modelos preclínicos

Métodos Materiales

Células tumorales primarias y líneas celulares

Las células de leucemia humana se obtuvieron de muestras residuales en un protocolo aprobado por la Institutional Review Board de Stony Brook University. También se obtuvieron las células de sangre del cordón umbilical bajo protocolo de donantes en el Stony Brook University Hospital. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes. Se obtuvieron las líneas celulares Karpas 299, HL-60, CCRF-CEM, MOLT4 y NK-92 de ATCC (Manassas, VA). Se cultivaron las células NK-92 en medios de células NK filtrados, definidos como alfa-MEM sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos con L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 1.5 g/L, suero de caballo inactivado por calor al 12.5 %, FBS inactivado por calor al 12.5 %, IX Pen/Strep, inositol al 0.2 %, ácido fólico al 0.02 % y betamercaptoetanol 50 pM, complementado con IL-2 (300 UI/mL), a menos que se especifique lo contrario. Se cultivaron las líneas celulares Karpas 299, CCRF-CEM y MOLT4 en RPMI, FBS al 10 %, 1x Pen/Strep (Gibco, Waltham, MA, EE. UU.). Se cultivaron las células HL-60 en IMDM, FBS al 10 %, 1x Pen/Strep (Gibco, Waltham, MA, EE. UU.).

Generación de construcciones CAR

Se diseño el CAR específico de CD4 (pRSC.SFFV.CD4.3G) para contener un dominio intracelular CD28 corriente arriba de los dominios 4-1BB y CD3zeta, lo que convierte a al constructo en un CAR de tercera generación.

Producción y transducción de lentivirus

Para producir sobrenadante viral, se cotransfectaron las células 293FT con plásmidos de empaquetamiento viral pMD2G y pSPAX que contenían control de vector lentiviral pRSC.SFFV.CD4.3G o GFP, utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. Se cultivaron las células NK durante un mínimo de 2 días en presencia de 300 UI/mL de IL-2 antes de la transducción con sobrenadante viral. Se describen con más detalle los procedimientos de transfección y transducción en Datos Complementarios.

Detección de CAR en células NK transducidas

Para determinar la expresión de CAR, se lavaron y suspendieron las células NK en tampón FAC (BSA al 0,2 % en DPBS) 3 días después de la transducción. Se usó IgG de cabra normal (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para bloquear la unión no específica. Se analizó cada muestra de células NK con anti-ratón de cabra policlonal marcado con biotina F(Ab')2 (1:250, Jackson Immuno Research, West Grove, PA) durante 30 minutos a 4°C. Se lavaron una vez y se resuspendieron las células en tampón FAC. A continuación, se tiñeron las células con estreptavidina marcada con PE (1:250, Jackson Immuno Research, West Grove, PA) durante 30 minutos a 4 °C. Se lavaron las células con tampón FAC y se resuspendieron en formalina al 2%. se realizó la citometría de flujo con un instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se analizaron los resultados con el software Kaluza (Beckman Coulter, Brea, CA).

Ensayos de cocultivo

Se incubaron CD4CAR o células NK de control de vector con células Karpas 299 que expresan CD4 (linfoma anaplásico de células T grandes), células HL-60 (leucemia promielocítica aguda), células CCRF-CEM (leucemia linfoblástica aguda de células T: T-TODOS), células TCD4 aisladas de sangre de cordón umbilical humano, o células leucémicas humanas primarias que expresan CD4 (síndrome de Sezary del adulto y T-ALL pediátrica) en relaciones de 2:1 y 5:1 (200,000 y 500,000 células efectoras por 100,000 células objetivo, respectivamente) en 1 mL de medio de cultivo de células N^k, sin IL-2. Después de 24 horas de cocultivo, se recogieron y se tiñeron las células vivas restantes con anticuerpos CD56 y CD4 antihumanos de ratón, y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Células NK denotadas individuales positivas para CD56+, y células objetivo denotadas individuales positivas para CD4. Todas las células se lavaron con tampón ^fA^c, se suspendieron en formalina al 2 % y se analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad

Se incubaron CD4CAR o células NK de control de vector con una mezcla 50:50 de células en el objetivo (células Karpas 299 teñidas con CFSE y células CCRF-CEM teñidas con CMTMR) y células MOLT4 marcados con CMTR fuera del objetivo en relaciones efector: objetivo de 1:1, 1:2 y 1:4 en 1 mL de medio de cultivo de células NK, sin IL-2. Después de 24 horas, se tiñeron las células con 7-AAD (BioLegend, San Diego, CA), se lavaron con tampón FACS y se analizaron las células vivas negativas para 7-AAD mediante citometría de flujo.

Ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC)

Se incubaron las células NK CD4CAR en relaciones de cocultivo efector: objetivo de 2:1 y 5:1 respectivamente con 500 células CB CD34+ durante 24 horas en medio de células NK complementado con IL-2. Los controles utilizados fueron células CD34 solas y células NK no transducidas cocultivadas en relaciones de efector: objetivo de 2:1 y 5:1 con células CB CD34+. Se evaluó la producción del compartimento hematopoyético mediante la formación de unidades formadoras de estallidos eritroides (BFU-E) y el número de unidades formadoras de colonias de granulocitos/monocitos (CFU-GM) en el Día 16. Se realizó el análisis estadístico de CFU través de ANOVA de 2 vías con un conjunto alfa de 0.05.

Modelo de ratón xenogénico

Se compraron ratones NSG macho de 12 semanas de edad (NOD.Cg-Prkdcsid Il2rgtm1Wjl/SzJ) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se usaron bajo un protocolo aprobado por IACUC de la Stony Brook University. Se irradiaron los ratones NSG con una dosis subletal (2.5 Gy) de radiación gamma. Veinticuatro horas más tarde, se les inyectó a los ratones por vía intradérmica 0.5 x106 Células Karpas 299 que habían sido transducidas de forma estable para expresar luciferasa, con el fin de provocar la formación de un tumor subcutáneo medible. El día 1, veinticuatro horas después de la inyección de células Karpas 299, los ratones recibieron una inyección intravenosa a través de la vena de la cola con 5 x 106 células NK CD4CAR o células NK de control de vector (N=4 por grupo). Se repitieron las inyecciones intravenosas cada 5 días durante 6 ciclos en total. Se midió el área del tamaño del tumor cada dos días. Los días 7, 14 y 21 después de la inyección de células Karpas 299, se inyectó a los ratones por vía subcutánea 100 |jL de RediJect D-Luciferin (Perkin Elmer, Waltham, MA) y se sometieron a imágenes IVIS (PerkinElmer, Waltham, MA). Se analizaron las imágenes utilizando el software Caliper Life Sciences (PerkinElmer, Waltham, MA).

Estadísticas

Se calcularon los tamaños de muestra del modelo xenogénico mediante un análisis de potencia de igualdad bilateral de 2 muestras (90 % de potencia y <5 % de significancia). Se usaron pruebas T de Student no apareadas para determinar la importancia del área del tamaño del tumor y la intensidad de la luz. Se construyeron las curvas de supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier y se realizaron los análisis estadísticos de supervivencia utilizando una prueba de intervalo logarítmico (Mantel-Cox) con P <0.05 considerado significativo. Se realizaron los análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism 6. Se determinó que la varianza era similar entre el grupo de tratamiento y el de control antes de la prueba de estudiante no apareada.

Resultados

Generación del CD4CAR de tercera generación

Se derivó la secuencia de nucleótidos del fragmento variable monocatenario (scFv) de la molécula anti-CD4 del anticuerpo monoclonal humanizado ibalizumab (Hu5A8 o TNX-355), cuya seguridad y eficacia han sido bien estudiadas en ensayos clínicos para el VIH. Para mejorar la transducción de señales, se diseñó el CD4CAR con dominios CD28 y 4-1BB fusionados con el dominio de señalización CD3zeta, lo que lo convierte en un CAR de tercera generación. Las células T CAR de tercera generación dirigidas a CD19 se han utilizado previamente en ensayos clínicos, con gran eficacia. Para la expresión eficaz de la molécula CD4CAR en la superficie de las células NK, se utilizó un fuerte promotor de virus formador de focos de bazo (SFFV) y se incorporó en el constructo la secuencia líder de CD8. Se separó el scFv anti-CD4 de los dominios de señalización intracelular mediante regiones bisagra (H) y transmembrana (TM) derivadas de CD8 (Figuras 8A y 8C). Se subclonó posteriormente la molécula de ADN CD4CAR en un plásmido lentiviral.

Caracterización de CD4CAR

Con el fin de validar el constructo CD4CAR, se transfectaron las células HEK293-FTcon el plásmido lentiviral CD4CAR o el plásmido de control de vector y 48 horas más tarde se recolectaron para el análisis de transferencia Western. La inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal anti-CD3zeta mostró bandas del tamaño predicho para la proteína de fusión CD4CAR-CD3zeta (Figura 8B). Como se esperaba, no se observó expresión de CD3zeta para la proteína de control del vector GFP (Figura 8B).

Generación de células NK CD4CAR

Se determinó que la eficiencia de transducción de NK CD4CAR era del 15.9 %, de acuerdo con lo determinado por citometría de flujo (panel superior de la Figura 9A). A continuación, se utilizó la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para enriquecer aún más para células NK CD4CAR+. Después de la clasificación, se confirmó que las células de NK CD4CARalto recogidas eran positivas para CD4CAR en más del 85 % (Figura 15). Después de la recolección FACS de células CD4CARalto, los niveles de expresión de CD4CAR permanecieron consistentemente estables en 75-90 % en células NK durante la expansión de hasta 10 pases y después de la criopreservación. De hecho, al comienzo de los experimentos de cocultivo, las células NK CD4CAR alto ampliadas expresaron CAR al 85 % (panel inferior de la Figura 9A).

Las células NK CD4CAR generan lisis específicamente CD4 células cancerosas de la sangre, incluyendo el linfoma anaplásico de células T grandes (Karpas 299), la leucemia mieloide aguda (HL-60) y la leucemia linfoblástica aguda de células T (CCRF-CEM)

Se analizó la actividad antilinfoma de las células NK CD4CAR in vitro usando las siguientes líneas celulares CD4+: Karpas 299, HL-60 y CCRF-CEM. Se estableció la línea celular Karpas 299 a partir de la sangre periférica de un paciente de 25 años con linfoma anaplásico de células T grandes. Se estableció la línea celular HL-60 a partir de la sangre periférica de un paciente de 36 años con leucemia promielocítica aguda. Se estableció la línea celular CCRF-CEM a partir de la sangre periférica de un paciente de 4 años con leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL).

Durante los experimentos de cocultivo de 24 horas, las células NK CD4CAR mostraron una mortandad profunda de las células de leucemia/linfoma positivas para CD4 en la relación baja de células efectoras a células objetivo (E: T) de 2:1 (Figura 10A) y en la relación estándar de 5:1 (Figura 10C). En ensayos de citotoxicidad de cocultivo, se identificaron las células tumorales objetivo por el inmunofenotipo CD4+, CD56' (marcado en azul en los gráficos de citometría de flujo). Como se esperaba, las células NK de control de vectores mostraron cierta capacidad no específica para causar mortandad de células tumorales que es innata a las células NK, pero como se esperaba, fueron mucho menos efectivas contra células tumorales CD4+ en comparación con las células NK CD4CAR. El análisis de las células Karpas 299 solas confirmó 99,1 % de expresión CD4+ (panel superior de la Figura 1A). Sorprendentemente, con una relación E: T de 2:1, las células NK CD4CAR eliminaron por completo el 100 % de las células Karpas 299 en comparación con el control de vector (N=2) (panel superior de la Figura 10A y 10C). De forma similar, el análisis de células HL-60 y CCRF-CEM solas confirmó una alta expresión de CD4, 99,9 % y 92,1 %, respectivamente (paneles medio e inferior de la Figura 10A). Del mismo modo, en una relación E: T de 2:1, las células NK CD4CAR generaron lisis de forma sólida el 75 % de las células HL-60 y el 97 % de las células CCRF-CEM, en comparación con el control de vector (Figura 10A y 10C). Combinados, estos datos muestran que las células NK CD4CAR se dirigen específica y potentemente a las células CD4+ objetivo además de retener la actividad celular antitumoral no específica intrínseca a las células NK.

Se realizaron también estudios de cocultivo utilizando muestras de pacientes (Figuras 10B y 10C). El paciente 1 presentó el síndrome de Sezary, una forma agresiva de linfoma de células T cutáneo CD4+ que no respondió a la quimioterapia estándar. El síndrome de Sezary es un subconjunto de PTCL. Se evaluó que las células leucémicas del paciente 1 tenían un 78,1 % de CD4+ mediante citometría de flujo (Figura 10B). El paciente 2 presentó una leucemia linfoblástica aguda de células T pediátrica CD4+(LLA-T). Análogamente, se evaluó que las células del Paciente 2 tenían 43,7 % de CD4+ mediante citometría de flujo (Figura 10B). Después de 24 horas de cocultivo a una relación E: T baja de 2:1, las células NK CD4CAR generaron lisis el 58 % de las células del síndrome de Sezary CD4+ del paciente 1 y 78 % de células T-ALL CD4+ del paciente 2 (N=2). Además, con una relación E: T aumentada de 5:1, estándar para los ensayos de cocultivo CAR, las células NK CD4CAR generaron lisis el 82 % de las células del síndrome de Sezary del paciente 1 y el 82 % de las células T-ALL del paciente 2 (N= 2) (Figura 10C y Figura 14). Estos datos sugieren fuertemente una respuesta dependiente de la dosis y una potente actividad antitumoral de las células NK CD4CAR en una línea celular y en un entorno de muestras de pacientes para leucemias y linfomas de células T CD4+ tanto en adultos como en niños.

Las células NK CD4CAR generan lisis específicamente las líneas de células tumorales que expresan CD4 de manera dependiente de la dosis.

Las células NK CD4CAR generan lisis específicamente en líneas celulares leucémicas Karpas 299 y CCRF-CEM CD4+ in vitro de una manera dependiente de la dosis en relaciones efector: objetivo de 1:4, 1:2 y 1:1 (Figura 11). Para cada relación E: T de cocultivo, se incubaron las células efectoras NK CD4CAR o las células efectoras NK de control del vector con células tumorales que estaban compuestas por cantidades iguales de células CD4+ en el objetivo, células de leucemia linfoblástica aguda Karpas 299 teñidas con CFSE o CCRF-CEM teñidas con CFSE, y MOLT4 CD4-, CD5+ teñidas con CMTMR "fuera del objetivo". Se incluyeron las células MOLT4 para tener en cuenta la variación en el número de células iniciales y la muerte espontánea de células objetivo. Después de 24 horas, de analizaron las células vivas por citometría de flujo. Se midió el porcentaje de lisis de las células objetivo comparando la supervivencia de la célula objetivo CD4+en el cocultivo de ⁿK CD4CAR para el control del vector en el cocultivo de NK. Se eliminaron las células Karpas 299 a tasas del 67 %, 95 % y 100 %, en relaciones de efector a objetivo de 1:4, 1:2 y 1:1, respectivamente (Figura 11). Y se eliminaron las células CCRF-CEM a tasas del 39 %, 58 % y 69 % respectivamente con las mismas relaciones E: T (Figura 11). Como era de esperar, las células NK CD4CAR no generaron lisis en las células MOLT4 marcadas con CMTMR, que se confirmó que eran <5 % de CD4 por análisis de citometría de flujo (Figura 16A). Experimentos de cocultivo adicionales confirmaron que las células NK CD4CAR no generaron lisis en las células MOLT4 a las 0 h, 4 h, 8 h y 24 h (Figura 16B), mientras que las células NK CD4CAR generaron lisis en las células Karpas 299 detectadas por citometría de flujo a las 4 h (Figura 16C). Combinados, estos datos indican que la citotoxicidad antitumoral de las células NK CD4CAR es dependiente de la dosis, de inicio rápido y altamente específica para células CD4+.

Se realizaron estudios de cocultivo adicionales utilizando células T CD4+ aisladas de sangre de cordón umbilical. En estos experimentos, las células NK CD4CAR agotaron por completo las células T CD4+ en una relación efector: objetivo de 2:1 después de 24 horas de cocultivo, con células restantes 0,0 % de CD4+. Como era de esperar, después de cocultivo de células de sangre de cordón umbilical CD4+ con células NK de control de vector correspondientes (CD56+, CD4'), la población CD4+ permaneció en gran parte intacta (Figura 12A), lo que confirma aún más el agotamiento de poblaciones CD4+ mediado por NK CD4CAR específico y robusto en tejido sano. Las células NK CD4CAR no afectan la producción de células madre en el compartimento hematopoyético.

El análisis del ensayo CFU (Unidad formadora de colonias) reveló que las células NK CD4CAR no afectaron significativamente la producción de células madre de sangre del cordón umbilical CD34+ del compartimento hematopoyético. Se evaluó el rendimiento del compartimento hematopoyético mediante la presencia de progenitores eritroides y progenitores de granulocitos/macrófagos en el Día 0, determinado por el número de unidades formadoras de estallido eritroide (BFU-E) y el número de unidades formadoras de colonias de granulocitos/monocitos (CFU-GM) en el Día 16 (Figura 12B). Este hallazgo es consistente con la orientación específica de CD4, un marcador de células T maduras, con un impacto limitado en las células madre hematopoyéticas y progenitores tempranos, y sin evidencia de sesgo de linaje, una medida de seguridad terapéutica.

Las células NK CD4CAR exhiben una actividad antitumoral significativa in vivo

Para evaluar la actividad antitumoral in vivo de las células NK CD4CAR, se desarrolló un modelo de ratón xenogénico utilizando ratones NSG irradiados de forma subletal e inyectados por vía intradérmica con células Karpas 299 que expresan luciferasa para inducir la formación de tumores medibles. El día 1, 24 horas después de la inyección de células Karpas 299, y cada 5 días después de un total de 6 ciclos, se inyectaron a los ratones por vía intravenosa 5 x 106 células NK CD4CAR o células NK de control de vector por administración. Los días 7, 14 y 21, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a imágenes IVIS para medir la carga tumoral (Figura 13A). Se comparó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con NK CD4CAR con la de los ratones inyectados con vector de control NK (Figura 13B). Para el día 21, los ratones inyectados con NK CD4CAR tenían una intensidad de luz significativamente menor y, por lo tanto, menos carga tumoral en comparación con el control del vector (p <0.01). El día 1, y cada dos días después, se midió el área del tamaño del tumor y se comparó el tamaño promedio del tumor entre los dos grupos (Figura 13C). El análisis de la prueba T de Student no pareado reveló que el tamaño promedio del tumor de los ratones inyectados con NK CD4CAR era significativamente más pequeño que el de los ratones inyectados con NK de control de vector a partir del día 17 (p <0,05) y continuando los días 19 25 (p <0,01). A continuación, se comparó la supervivencia de los ratones entre los dos grupos (Figura 13D). Todos los ratones inyectados con NK CD4CAR sobrevivieron más allá del día 30. Sin embargo, el porcentaje de supervivencia de los ratones inyectados con NK de control de vector comenzó a disminuir el día 17 sin sobrevivir el día 23. En resumen, estos datos in vivo indican que las células NK CD4CAR reducen significativamente la carga tumoral y prolongan la supervivencia en ratones NSG inyectados con Karpas 299.

Las células T del receptor de antígeno quimérico anti-CD5 (CD5CAR) se orientan de manera eficiente a las neoplasias malignas hematológicas positivas para CD5

Ejemplos

Resultados

Generación de la tercera generación de CD5CAR

El constructo para CD5CAR, así como el anticuerpo CD5 scFv anclado, se diseñaron para probar la función y el mecanismo de las células T CD5CAR en términos de la orientación y la lisis de las células que expresan CD5 y la capacidad de las células T CD5CAR para regular a la baja la expresión de CD5 dentro de su propia población de células T CD5CAR (Fig. 17A). Para confirmar el constructo CD5CAR, se transdujeron los lentivirus CD5CAR generados en células HEK293. Después de 48 h de tratamiento con CD5CAR o GFP-lentivirus, se verificó la expresión de CD5CAR en células HEK293 mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo CD3zeta, que reconoce la región C-terminal de la proteína CD5CAR (Fig. 17B). La banda resultante era el tamaño predicho de la proteína CD5CAR en células HEK293 transducidas con CD5CAR, pero las células HEK293 transducidas con GFP no mostraron ninguna banda específica mediante análisis de transferencia Western. Con el fin de evaluar la función de la proteína CD5CAR para futuros experimentos, se transdujeron lentivirus CD5CAR en células T humanas activadas. Se evaluó la expresión de CD5CAR en la superficie de las células T mediante análisis de citometría de flujo usando anticuerpo F(ab') anti-ratón de cabra, que reconoce la región scFv de la proteína CD5CAR. El análisis de citometría de flujo mostró que aproximadamente el 20 % de la expresión de CD5CAR se observó en células T transducidas con CD5CAR en comparación con el control de isotipo (Fig. 17C). Estos resultados indicaron que se generó con éxito células T de expresión CD5CAR para los siguientes experimentos.

Regulación a la baja de la expresión de CD5 para la terapia con CAR

Antes del cocultivo de células T CD5CAR y los ensayos en animales, se regula a la baja la expresión de CD5 en la superficie de las células T CD5CAR para evitar la automortandad dentro de la población T CD5CAR. La regulación a la baja de CD5 evitará la automortandad de las células T CAR dentro de la población de células T CAR, y la regulación a la baja de CD5 se asocia con una mayor capacidad de causar de mortandad de las células T. Un CAR que se produce dentro de las células T que no tienen expresión de CD5 podría ser un CAR superfuncional, sin importar el constructo del CAR en sí. Los pasos para la generación de células T CAR CD5 y la comparación de la regulación a la baja de CD5 usando transducción simple o doble de lentivirus CAR CD5 se muestran en la Figs. 18A y B. Las células T CD5CAR transducidas con virus CAR CD5 prestados no concentrados no mostraron una regulación a la baja completa de la proteína CD5 de la superficie celular el día 8, con una población negativa para CD5 máxima de hasta el 46 % el día 6 (Fig. 18C). En la población doblemente transducida, aproximadamente el 90% de las células T transducidas se volvieron negativas para CD5 en el día 4 de incubación. Por el contrario, el control de células T GFP mantiene una población positiva doble paraCD5+, CD3+ por encima del 95 % desde el día 2 hasta el día 8 (Fig. 18C).

La regulación a la baja de la expresión de CD5 en las células T puede lograrse mediante la transducción de lentivirus scFv CD5CAR anclados.

Con el fin de dilucidar aún más el mecanismo por el cual CD5CAR regula a la baja la expresión de CD5 en las células T, se creó un nuevo constructo denominado CD5 scFv anclado (SEQ ID NO. 7 (Fig. 17A). Este constructo incluye un scFv anti-CD5 alineado con un dominio transmembrana a través de una región bisagra, que permite que el scFv de CD5 se ancle en la superficie de las células T. El polipéptido CD5 scFv anclado (SEQ ID NO. 16) se une a CD5 objetivo sin lisis de la célula objetivo como se observa con un CD5CAR funcional. En las Fig. 19A y 19B se muestra un único análisis de datos de flujo y transducción, con regulación a la baja parcial de la expresión de CD5 para células T en el día 7 de incubación. Esto es consistente con la regulación a la baja parcial de la expresión de CD5 observada para las células T CD5CAR después de una única transducción.

Los linfocitos T CD5CAR generan lisis eficazmente las líneas celulares ALL de células T de.

Se probó primero la capacidad de causar mortandad de las células T CD5CAR contra las líneas celulares establecidas de células T ALL CCRF-CEM y MOLT-4, y una línea celular leucémica de células grandes anaplásicas KARPAS 299 como se muestra en las Fig. 20^ay 20B. Se observó una ávida capacidad de causar mortandad para las dos líneas de células CD5 en comparación con el control GFP, con una lisis de células objetivo superior al 75 % para ambas líneas. Se observó 0 % de lisis en una línea de células grandes analplásicas KARPAS 299, que es negativa para CD5. Las células T CD5CAR generan lisis eficazmente las células ALL de células T de muestras humanas.

También se evaluó la capacidad de CD5CAR para generar lisis células T-ALL de muestras de pacientes utilizando múltiples muestras de pacientes y se muestran los cocultivos de células CD5CAR en la Fig. 21 y la Fig. 22. Si bien se observó una ávida capacidad de causar mortandad celular para las células leucémicas del paciente T-ALL 1 que fue similar a la lisis de la célula objetivo CD5 observada cuando las células CD5CAR se dirigieron a las líneas celulares ALL de la célula T, otras tres células leucémicas del paciente mostraron una lisis comparativamente más débil de las células objetivo (Fig. 21A. y Fig. 21B.).

La capacidad de causar mortandad por CD5CAR en las células leucémicas del paciente se correlacionó con la intensidad de la expresión de CD5 como se muestra en las Fig. 21A, 21B y 21D. Como se muestra en la Fig. 21C y 21D, se observó la expresión de CD5 para T-ALL-1, T-ALL-3, T-ALL 6 y T-ALL 7 mediante análisis de citometría de flujo. La expresión de CD5 fue significativamente menor para las muestras de pacientes con T-ALL, excepto para la muestra de T-ALL-1.

Las células T CD5CAR exhiben la especificidad y la potente mortandad de células objetivo.

Como control, también se ensayaron las células T CD5CAR en cuanto a su capacidad para extirpar las células T leucémicas negativas para CD5. La línea de linfoma de células T grandes anaplásicas es la línea celular que no expresa CD5. El análisis de citometría de flujo mostró que las células T CD5CAR no pudieron generar lisis o eliminar las células KARPAS 299, como se muestra en la Figura 21A, panel inferior.

Se obtuvo una muestra de paciente (T-ALL-8) con un alto nivel de expresión de CD5 de un paciente con una enfermedad mínima de T-ALL. Se realizó el cocultivo con CD5CAR y se analizó en detalle como se muestra en la Figura 22. Se evaluaron tres poblaciones de células, incluyendo las células T normales CD5, las células T-ALL CD5+ CD34+ y las células T-ALL CD5-CD34+, mediante citometría de flujo después del cocultivo. CD5CAR exhibió la especificidad y la potente capacidad de lisis de células objetivo con > 93 % de lisis de células positivas para CD5 para todas las poblaciones de células CD5+ en comparación con el control GFP. El CD5CAR eliminó las células leucémicas de manera tan eficiente como las células T normales CD5. No se observó mortandad en la población negativa para CD5. Las células T CD5CAR esencialmente eliminaron la población de células T (CD5+ CD34-).

Las células T CD5CAR eliminan eficazmente las células T normales.

Las células T CD5CAR demostraron una eliminación eficaz de las células T normales de forma dependiente de la dosis en un ensayo de cocultivo en relaciones bajas (efector: objetivo) de 0.25:1, 0.5:1 y 1:1 (Fig. 23). Se incubaron células T CD5CAR o células efectoras T CD123CAR (control) con células T marcados con GFP. Se midió el porcentaje de mortandad de células objetivo comparando la supervivencia de las células T GFP en el cocultivo de T CD5CAR con respecto al cocultivo de control de T CD123CAR. Se eliminaron las células T GFP normales de forma dosisrespuesta para las células T CD5CAR. Las células T CD5CAR eliminaron eficazmente todas las células T GFP en una relación de efector a objetivo de 1:1 (Fig. 23). Dado que las células T CD5CAR eliminaron de manera efectiva todas las células T normales, la viabilidad de la terapia T CD5CAR debería depender de la capacidad de proporcionar de forma transitoria en lugar de permanente. Se podrían usar las células T CD5CAR como un nuevo régimen de acondicionamiento o un "puente" para el trasplante de células hematopoyéticas.

Las células T mantuvieron la expresión de CD5 cuando se cocultivaron con CD5CAR o células T CD5 scFv ancladas.

Una de las propiedades de CD5 es su internalización después de unirse a un anticuerpo. Como resultado, las células objetivo pierden un antígeno objetivo, lo que puede provocar un escape del antígeno. Este fenómeno se ha informado como una causa de falla en los estudios clínicos que utilizan terapias con base en células T CAR. A continuación, se investigó el problema de si las células T CD5 CAR o CD5 scFv ancladas afectan la expresión de CD5 en células T positivas para CD5 o leucémicas mediante un ensayo de cocultivo. Se muestran los pasos para la generación de células T CD5CAR o células T CD5 scFv ancladas y células T CD123 CAR (control) en la Fig. 24A. Después de la segunda transducción de células T con lenti-CD5CAR o virus CD5 scFv y CD123CAR anclados en el día 3, e analizaron las células T transducidas s con la expresión de CD5 mediante citometría de flujo. Las células T transducidas con lentivirus CD5CAR o CD5 scFv anclados mostraron una regulación a la baja esencialmente completa de la proteína CD5 de superficie (Fig. 24B). Por el contrario, el control de células T transducidas con CAR CD123 mantuvo la expresión de CD5.

A continuación, se cocultivaron células T CD5CAR o scFv ancladas en CD5 y CD123CAR transducidas con células T marcados con GFP en una relación de 1:1 (E: T) durante 2 o 4 días. Como se muestra en las Fig. 25A y B, las células T CD5CAR eliminaron eficazmente todas las células T GFP-. Como se esperaba, las células T scFv o CD123CAR ancladas a CD5 transducidas no pudieron generar lisis las células T GFP. Además, las células T GFP todavía expresaban CD5 cuando se cocultivaban con células T scFv o CD123CAR ancladas a CD5 transducidas. Estos estudios indican que es poco probable que se produzca un escape del antígeno CD5 cuando se emplea CD5CAR para la inmunoterapia.

Regulación a la baja de la expresión de CD5 en las células T ALL cuando se transdujeron con virus lenti-CD5CAR o scFv anclados a CD5.

A continuación, se probó si la transducción de lentivirus CD5CAR o CD5CAR anclados en células T ALL da como resultado la regulación a la baja de la expresión de CD5. Se transdujeron células CCRF-CEM y MOLT-4 T-ALL con lentivirus CD5CAR o CD5 scFv anclados. CD5CAR o CD5 scFv anclado disminuyeron significativamente o redujeron la cantidad de expresión de CD5 superficial en estas células leucémicas (Fig. 25C). Por el contrario, las células T mantuvieron la expresión de CD5 cuando estas células se usaron para cocultivar con células T CD5 scFv ancladas transducidas (Fig. 24A y B).

Las células T CD5CAR exhiben una profunda actividad antitumoral in vivo.

Para evaluar la actividad antitumoral in vivo de las células T CD5CAR como predictor de su eficacia terapéutica en pacientes, se desarrolló un modelo de ratón de xenoinjerto utilizando ratones NSG irradiados subletalmente (2.0 Gy) e inyectados por vía intravenosa con 1.0 x 106 células CCRF-CEM (CD5+) que expresan luciferasa de luciérnaga para inducir la formación de tumores medibles. El día 3 días después de la inyección de células CCRF-CEM-Luc+, se inyectaron los ratones por vía intravenosa con 5 x 106 células T CD5CAR o células T de control de vector. Se repitieron estas inyecciones los días 4, 6 y 7, para un total de 20 * 106 células T por ratón. Los días 5, 8, 10 y 13, se inyectaron a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin (Perkin-Elmer) y se sometieron a imágenes IVIS (Caliper LifeSciences) para medir la carga tumoral (Fig. 26A). Se comparó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con células T CD5CAR con la de los ratones inyectados con control de vector (Fig. 26B). El análisis de la prueba T pareada reveló una diferencia muy significativa entre los dos grupos en el día 13 con menos intensidad de luz y, por lo tanto, menos carga tumoral en el grupo al que se inyectó T CD5CAR en comparación con el control (p <0.0012). Un análisis adicional mostró que para el Día 5, los ratones tratados con células T CD5CAR solo 3 días antes tenían una carga tumoral 53 % menor en comparación con los ratones de control, y ese porcentaje mejoró hasta 95 % para el Día 8 (Fig. 26C). Se mantuvo la carga tumoral cerca de los niveles de fondo para los ratones tratados hasta el Día 13. El Día 15, se extrajo una pequeña cantidad de sangre periférica de cada ratón, incluyendo 2 ratones a los que no se les inyectó CCRF-CEM marchito o células T (para que sirvieran como controles de fondo), y se analizó mediante citometría de flujo para detectar la presencia de células CCRF-CEM trasplantadas (CD5+). Los resultados reflejaron perfectamente la formación de imágenes, ya que se redujo el porcentaje de células tumorales en los ratones tratados con células T CD5CAR a niveles cercanos al fondo (<1 %), mientras que los ratones que recibieron células T de control tenían entre 28-43 % de células tumorales CCRF-CEM (Fig. 26D). En resumen, estos datos in vivo indican que las células T CD5CAR reducen considerablemente la carga tumoral y prolongan la supervivencia en ratones NSG inyectados con CCRF-CEM en comparación con las células T de control del vector.

Las células NK del receptor de antígeno quimérico anti-CD5 (CD5CAR) eliminan de manera eficiente las neoplasias malignas hematológicas positivas para CD5.

Ejemplos

Resultados

Generación del CD5NK-CAR

La molécula anti-CD5 es un diseño modular que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) junto con los dominios CD28 y 4-1BB fusionados con el dominio de señalización CD3zeta para mejorar la transducción de señales, lo que lo convierte en un CAR de tercera generación. Se usó un fuerte promotor de virus formador de focos de bazo (SFFV) para la expresión eficaz de la molécula CD5CAR en la superficie de las células NK y se incorporó la secuencia líder de CD8 en el constructo. Se une el scFv anti-CD5 a los dominios de señalización intracelular a través de regiones bisagra (H) y transmembrana (TM) derivadas de CD8. Se clonó este constructo de CD5CAR luego en un plásmido lentiviral.

Generación de células NK CD5CAR

Se determinó la eficiencia de transducción del CD5CAR mediante análisis de citometría de flujo. Para enriquecer las células NK CD5CAR+, se recogieron las células NK de mayor expresión mediante citometría de flujo. Después de la clasificación, se amplió la expresión de NK CD5CARalto para estudios de eficacia in vitro e vivo.

Las células NK CD5CAR eliminan eficazmente las líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de células T humanas (T-ALL)

Se analizó la actividad anti-T-ALL de las células NK CD5CAR in vitro utilizando líneas celulares CCRF-CEM, MOLT-4 y Jurkat. Todas estas líneas de células T-ALL expresaron altamente CD5.

Durante los experimentos de cocultivo, las células NK CD5CAR demostraron una mortandad profunda de CCRF-CEM en una relación baja de células efectoras a células objetivo (E: T) de 2:1 y 5:1. En estas relaciones, las células NK CD5CAR virtualmente eliminaron las células CCRF-CEM (Fig. 27A). Células NK CD5CAR generaron lisis en células leucémicas CCRF-CEM in vitro de una manera dependiente de la dosis en relaciones efector: objetivo de 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1 y 5:1 (Fig. 27B y 27C). Se usaron dos células T-ALL adicionales, MOLT-4 y Jurkat para probar la actividad antileucémica de las células CD5NK. Se realizaron estudios de cocultivo de estas dos líneas celulares con células NK CD5CAR. Las células NK CD5CAR eliminaron esencialmente las células MOLT-4 y Jurkat en una relación baja de efector: objetivo de 2:1 (Fig. 28A y B). Las células NK CD5CAR eliminan eficazmente las células T-ALL CD5+ agresivas utilizando muestras humanas

Se realizaron también experimentos de cocultivo usando muestras de pacientes (Fig. 29A, B). Tanto el paciente 1 como el 2 tenían T-ALL que no respondieron a la quimioterapia estándar. El paciente 1 (T-ALL #1) tenía un pequeño subconjunto de células T-ALL positivas para CD5. Se cocultivaron las células leucémicas de este paciente con células NK CD5CAR. Se seleccionaron y cuantificaron las poblaciones objetivo con citometría de flujo utilizando colorante de citotracker celular (CTMMR) para marcar las células del paciente. Se seleccionaron las poblaciones de células CD5+ CD34+ diana frente a un control de isotipo. Las células NK CD5CAR generaron lisis en aproximadamente 60 % de las células leucémicas CD34+ CD5+ en una relación E: T de 5:1. Es importante destacar que las células NK CD5CAR no mostraron ninguna actividad contra las poblaciones de células CD5, lo que implica una actividad específica y dirigida contra (selectivo para) los epítopos del antígeno objetivo. El paciente 2 tenía una población de T-ALL, que era virtualmente positiva para CD5 y cocultivada con células NK CD5CAR. Las células NK CD5CAR mostraron una lisis casi completa de la población objetivo de CD5+ de alta expresión con una potente actividad contra la población débil de CD5+ CD34+ (Fig. 29B).

Las células NK CD5CAR eliminan eficazmente las células agresivas de linfoma de células T periféricas CD5+ (PTCL) utilizando muestras humanas.

El paciente 3 presentó un PTCL CD4+ (tipo no clasificado) y el paciente 4 presentó el síndrome de Sezary, una forma agresiva de PTCL que no respondió a una quimioterapia estándar. Se cocultivaron las células de linfoma del paciente 3 con células NK CD5CAR durante 24 horas. Las células leucémicas eran positiva para CD5+ CD7 y se controló y cuantificó la población de CD5+ CD7 mediante citometría de flujo. Se analizó la población CD5+ CD7 objetivo y se expresó la supervivencia celular en relación con las células NK de control de vector transducidas. NK CD5CAR mostró una lisis casi completa de la población objetivo de CD5+ CD7 leucémica, con una lisis completa en toda la población de CD5+, incluyendo las células T normales que expresan CD5 (Fig. 29C).

Se cocultivaron células leucémicas del paciente #4 con síndrome de Sezary con células NK CD5CAR en relaciones E: T de 2:1 y 5:1 después de 24 horas. Las células NK CD5CAR demostraron una potente acidez antileucémica con más del 90 % de lisis de las células del síndrome de Sezary (Fig. 29D). La saturación se logró en una relación E: T de 2:1 donde se eliminaron las células leucémicas virtualmente.

Las células NK CD5CAR agotan efectivamente las células T normales.

Se aislaron las células T de la sangre del cordón umbilical y se usaron para cocultivar con células NK CD5CAR. Como se muestra en la Fig. 30, las células NK CD5CAR agotaron completamente las células T a una relación efector: objetivo baja de 2:1 después de 24 horas de cocultivo (Fig. 30). En comparación con la del control GFP, la población de células T permaneció prácticamente intacta.

Las células NK CD5CAR generan lisis eficazmente las neoplasias malignas de células B CD5, incluyendo el linfoma de células del manto (MCL) y el linfoma linfocítico crónico (CLL).

Se realizaron estudios de cocultivo adicionales con la línea celular de linfoma Jeko CD5+ y células de linfoma de pacientes con (MCL) y CLL. Se estableció la línea celular JeKo-1 MCL a partir de células mononucleares de sangre periférica de un paciente con una variante de células grandes de MCL. En estudios de cocultivo a una E: T baja de 2:1, las células NK CD5CAR generaron lisis eficazmente aproximadamente 80 % de las células Jeko (Fig. 31A). También se cocultivaron las células aisladas de muestras de un paciente con MCL con células NK CD5CAR. De bloquearon las poblaciones objetivo y se cuantificaron las células vivas mediante citometría de flujo. Las células NK CD5CAR prácticamente eliminaron ambas poblaciones, que eran la población de leucemia CD5+CD19+ y la población de células T CD5+ CD19 (Fig. 31B). También se cocultivaron las células de un paciente con CLL de células B con células NK CD5CAR. CD19 se usó para seleccionar la población leucémica con citometría de flujo. Las células CD5+CD19+CLL fueron virtualmente eliminadas por las células NK CD5CAR (Fig. 31C). Estos estudios sugieren fuertemente que las células NK CD5CAR incluyen una propiedad biológica de actividad antitumoral profunda en líneas celulares leucémicas y muestras leucémicas de pacientes (Fig. 32), incluyendo para T-ALL, PTCL y linfomas de células B que expresan CD5.

Las células NK CD5CAR demuestran una potente actividad antileucémica in vivo.

Una estrategia similar para las células T CD5CAR, se emplearon estudios en animales para determinar la actividad antitumoral in vivo de las células NK CD5CAR. Se les inyectó a ratones NSG irradiados subletalmente por vía intravenosa 1.0 x 106 células CCRF-CEM que expresan luciferasa de luciérnaga para inducir la formación de tumores medibles. 3 días después de la inyección de células CCRF-CEM-Luc+, se les inyectó a los ratones por vía intravenosa 5 x 106 células NK CD5CAR o células T de control de vector. Se repitieron estas inyecciones el día 4 para un total de 10 x 106 células T por ratón. El día 5, se inyectó a los ratones por vía subcutánea RediJect D-Luciferin y se sometieron a imágenes IVIS para medir la carga tumoral (Fig. 33A). Se comparó la intensidad de luz media medida para los ratones inyectados con células NK CD5CAR con la de los ratones inyectados con células NK de control de vector (Fig. 33B). La carga tumoral fue dos tercios menor para los ratones tratados el día 5 después de la inyección del tumor. El análisis de la prueba T pareada reveló una diferencia muy significativa (P = 0.0302) entre los dos grupos. Estos datos in vivo indican que las células NK CD5CAR reducen significativamente la carga tumoral en ratones NSG inyectados con CCRF-CEM de manera rápida en comparación con las células NK de control de vector.

Las células NK del receptor de antígeno quimérico anti-CD3 (CD3CAR) generan lisis eficazmente las neoplasias malignas hematológicas positivas para CD3

Ejemplos

Resultados

Generación del CD3CAR

La molécula anti-CD3 es un diseño modular que comprende un fragmento variable de cadena única (scFv) junto con los dominios CD28 y 4-1BB fusionados con el dominio de señalización CD3zeta para mejorar la transducción de señales, lo que lo convierte en un CAR de tercera generación. Se usó un fuerte promotor de virus formador de focos de bazo (SFFV) para la expresión eficaz de la molécula CD3CAR en la superficie de la célula NK (NK-92) y se incorporó la secuencia líder de CD8 en el constructo. El scFv anti-CD3 se une a los dominios de señalización intracelular a través de regiones bisagra (H) y transmembrana (TM) derivadas de CD8 (Fig. 34A). Se clonó este constructo de CD3CAR luego en un plásmido lentiviral.

Caracterización de CD3CAR

Se realizó el análisis de transferencia Western en células HEK293-FT transfectadas con plásmido lentiviral CD3CAR y plásmido de control de vector. Las inmunotransferencias con anticuerpo monoclonal anti-CD3zeta muestran bandas del tamaño predicho para la proteína de fusión CD3CAR-CD3zeta (Fig. 34B) frente a ninguna banda para la proteína de control del vector.

Generación de células NK CD3CAR usando células NK-92

Se determinó la eficiencia de transducción del CD3CAR mediante análisis de citometría de flujo. Para enriquecer las células NK CD3CAR, se recolectaron las células NK de mayor expresión mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Después de la clasificación, se obtuvieron células NK con una expresión relativamente alta de CD3CAR. La expresión de CD3CAR después de la clasificación por citometría de flujo fue estable en torno al 30 % de la expresión de CAR para la posterior expansión y crioconservación de células NK.

Las células NK CD3CAR generan lisis eficazmente las líneas celulares T-ALL humanas

Para determinar la eficacia de las células NK CD3CAR, se llevaron a cabo ensayos de cocultivo utilizando líneas celulares CD3+ T-ALL, Jurkat y CCRF-CEM. Las células positivas para CD3 en células Jurkat y CCRF-CEM son aproximadamente 80 % y 10 % positivas para CD3, respectivamente. A continuación, se clasificaron las células CD3 de la línea celular CCRF-CEM para células CD3 altamente expresadas, y la expresión de CD3 en células CCRF-CEM clasificadas fue de aproximadamente 50 %. Durante el cocultivo con células Jurkat y CCRF-CEM, las células NK CD3CAR demostraron una gran capacidad para causar mortandad de células leucémicas (Fig. 35). A las 6 horas de incubación y a una relación E: T baja de 2:1, las células NK CD3CAR generaron lisis eficazmente más del 60 % de las células Jurkat (Fig. 35A). A continuación, se comparó la capacidad de causar mortandad de las células CD3 CCRF-CEM relativamente altamente expresadas (clasificadas) con la de las células CCRF-CEM no clasificadas. Las células CD3 CAR NK parecían ser más eficaces contra una población que expresaba más CD3 en CCRF-CEM clasificado que una población CCRF-CEM no clasificada que expresaba menos c D3 (Fig. 35B).

Las células NK CD3CAR eliminan eficazmente las células leucémicas CD3 de muestras humanas

También se probó la capacidad de causar mortandad de las células NK CD3CAR utilizando muestras de pacientes. El análisis de citometría de flujo de ambas muestras de pacientes reveló una expresión fuerte y uniforme de CD3. Tal como se analizó mediante citometría de flujo, el cocultivo de muestras de pacientes con síndrome de Sezary con células T CD3CAR resultó efectivamente en la lisis de aproximadamente 80 % de las células leucémicas con una relación E: T baja de 2:1 (Fig. 36A). El cocultivo de muestras de pacientes, PTCL no clasificados con células NK CD3CAR durante 24 horas dio como resultado una extirpación virtual de células malignas CD3+ (Fig. 36B). Las células NK CD3CAR también afectaron a la amplia población de CD3+.

Las células NK CD3CAR pueden agotar las células T normales.

Se usaron células T normales transducidas con GFP para cocultivar células NK CD3CAR. Como se muestra en la Figura 37, las células NK CD3CAR agotaron una porción sustancial de las células T normales después de una incubación de 4 o 24 horas.

Las células NK CD3CAR exhiben una profunda actividad antileucémica en vivo

Para determinar la eficacia antitumoral en vivo de células NK CD3CAR, se inyectaron ratones NSG irradiados subletalmente por vía intravenosa con 1.0 x 106 células Jurkat que expresan luciferasa de luciérnaga, que son positivas para CD3 (~80 %), y se detectó formación de tumores mensurables el Día 3 o 4. Tres días después de la inyección de células Jurkat-Luc+, se inyectó a los ratones por vía intravenosa 5 x 106 células NK CD3CAR o células NK de control de vector por ratón, 6 por grupo. Estas inyecciones se repitieron los días 3, 6, 7 y 10 para un total de 25 x 106 células T por ratón. En los días 4, 7, 9 y 13, los ratones se sometieron a imágenes IVIS para medir la carga tumoral (Fig. 38A). Dos ratones tratados murieron debido al procedimiento de inyección el día 13. Se comparó la intensidad de luz promedio medida para los ratones inyectados con células NK CD3CAR con la de los ratones inyectados con NK de control de vector (Fig. 38B). Después de un período de retraso inicial, se redujo la carga tumoral a aproximadamente dos tercios menos para los ratones tratados el día 9 y solo 13 % el día 13 (Fig. 38C). El análisis de la prueba T pareada reveló una diferencia altamente significativa (P = 0.0137) entre los dos grupos. Se concluyó que estos datos in vivo demuestran que las células NK CD3CAR reducen significativamente la carga tumoral y prolongan la supervivencia en ratones NSG inyectados con Jurkat en comparación con las células NK de control de vector.

Las nucleasas CRISPR/Cas se dirigen a CD2, CD3, CD5 y CD7 expresados en células T o NK.

Las células T o NK parecen compartir algunos de los antígenos de superficie, tales como CD2, CD3, CD5 y CD7 con leucemia o linfoma. CD2, CD3, CD5 y CD7 podrían ser buenos objetivos para las células T y NK, ya que se expresan en la mayoría de las leucemias/linfomas de células T.

Por lo tanto, cuando uno de los antígenos de superficie, CD2, CD3, CD5 y CD7, se selecciona como objetivo, este antígeno es necesario para eliminar o regular a la baja las células T o NK utilizadas para generar CAR si comparten este antígeno, para evitar la automortandad dentro de la población de células CAR T o NK.

Se describen los pasos para la generación de células T CAR o NK dirigidas a linfomas de células T o leucemia de células T en la Figura 39. Se diseñaron tres pares de ARNsg con CHOPCHOP para orientarse a CD2, CD3, CD5 y CD7. Luego, se clonaron los ARNsg específicos de genes (Fig. 40) en el vector lentiviral (Lenti U6-ARNsg-SFFV-Cas9-puro-wpre) que expresa un Cas9 humano y genes de resistencia a la puromicina unidos con un enlazador de autoescisión E2A. El casete U6-ARNsg está frente al elemento Cas9. La expresión de ARNsg y Cas9puro está impulsada por el promotor U6 y el promotor SFFV, respectivamente.

Ejemplos

Resultados

Se dirigen las nucleasas CRISPR/Cas a CD5 en líneas de células T.

Se usaron los lentivirus que portaban ARNsg específicos de genes para transducir células CCRF-CEM y MOLT. Inicialmente, se observó la pérdida de la expresión de CD5 en ambas líneas de células T utilizando dos secuencias de ARNsg CDISPR/Cas9 diferentes (Fig. 41A y 41C). Se eligió la población más exitosa en términos de pérdida de expresión de CD5 para cada línea celular, y se clasificaron estas células, se expandieron normalmente y se encontró que tenían una pureza >99 % CD45+ y CD5-(Fig. 41B y 41D).

Se dirigen las nucleasas CRISPR/Cas a CD7 en líneas de células T y células NK.

Se usaron lentivirus que portaban ARNsg específicos de genes para transducir CCRF-CEM, células MOLT y células NK (Fig. 42). El análisis de citometría de flujo demostró la pérdida de la expresión de CD7 en células CCRF-CEM y NK-92 con el enfoque CRISPR/Cas9 utilizando dos ARNsg diferentes (Fig. 42A y 42B). Se selecciono la población (indicada por el círculo azul y la flecha) para clasificación, expansión y análisis en la figura 42B. También se observó la pérdida de expresión de CD5 por análisis de citometría de flujo en células NK-92 utilizando un enfoque similar al descrito anteriormente con nucleasas CRISPR/Cas dirigidas a CD7 (Fig. 42C y 42D). Las células NK-92 negativas para CD7 clasificadas (Fig. 42D)) se expandieron y utilizaron para generar células NK CD7CAR para eliminar las células leucémicas positivas para CD7.

Células CD7CAR NK 7 -92 tienen una fuerte actividad antileucémica

CD7 se expresa tanto en células leucémicas NK como en T-ALL. Para evitar la automortandad dentro de la población de CD7CAR NK-92, primero se debe inactivar la expresión de CD7. Se generaron células NK-92 deficientes en CD7 (célulasNK7 -92) como se describe en (Fig. 42D) y se expandieron. Se transdujeron células NK 7 -92 ampliada con lentivirus que expresan un CD7CAR. CD7CAR incluye un scFV anti-CD7 junto con dominios CD28 y 4-BB fusionados con el dominio de señalización CD3zeta, lo que lo convierte en un CAR de tercera generación. Se usaron células CD7CAR NK 7 -92 para ensayar su capacidad de lisis de células leucémicas que expresan CD7. Como se muestra en la Fig. 43, las células CD7CAR NK 7'-92 mostraron una potente actividad antileucémica contra una línea celular T-ALL, CCRF-CEM. Tal como se analizó mediante citometría de flujo, el cocultivo de células CCRF-CEM resultó efectivamente en la lisis de aproximadamente el 50 % de las células leucémicas en una relación E: T de 5:1 (Fig. 43A y 43B).

El complejo de proteína multimérica CD3 se aclara en la Fig. 44. El complejo incluye una cadena CD38, una cadena CD3y y dos cadenas CD3^e. Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) que se compone de cadenas ap.

Se utiliza CD3CAR para la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula manipulada que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que CAR comprende: un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización; y en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula T o una célula NK:

- en el que, CAR se dirige a CD2, y en el que el CD2 endógeno de la célula se elimina o inactiva, y opcionalmente en el que uno o más de CD3, CD4, CD5 y CD7 endógenos en la célula se eliminan o inactivan adicionalmente;

- en el que, CAR se dirige a CD3, y en el que el CD3 endógeno de la célula se elimina o inactiva, y opcionalmente en el que uno o más de CD2, CD4, CD5 y CD7 endógenos en la célula se eliminan o inactivan adicionalmente;

- en el que, CAR se dirige a CD4, y en el que el CD4 endógeno de la célula se elimina o inactiva, y opcionalmente en el que uno o más de CD2, CD3, CD5 y CD7 endógenos en la célula se eliminan o inactivan adicionalmente;

- en el que, CAR se dirige a CD5, y en el que el CD5 endógeno de la célula se elimina o inactiva, y opcionalmente en el que uno o más de CD2, CD3, CD4 y CD7 endógenos en la célula se eliminan o inactivan adicionalmente;

- en el que, CAR se dirige a CD7, y en el que el CD7 endógeno de la célula se anula o inactiva y, opcionalmente, en el que uno o más de los CD2, CD3, CD4 y CD5 endógenos de la célula se anulan o inactivan adicionalmente.

2. La célula manipulada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la célula manipulada es una célula T que comprende el dominio de reconocimiento del antígeno CD4 para usar en un método para reducir el número de células de leucemia de células T positivas para CD4 o células de linfoma de células T positivas para CD4 adecuadas para ponerse en contacto con células de leucemia de células T positivas para CD4 o células de linfoma de células T positivas para CD4.

3. La célula manipulada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la célula manipulada es una célula T que comprende el dominio de reconocimiento del antígeno CD4 o CD5 para usar en un método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociadas a CD4 o CD5 en un paciente que necesita el mismo.

4. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 o CD5 en un paciente que necesita el mismo de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la enfermedad proliferativa de células es una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4.

5. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para usar en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 o CD5 en un paciente que necesita el mismo de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 se selecciona del grupo que consiste en leucemia positiva para CD4 y linfoma positivo CD4.

6. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha enfermedad proliferativa celular es leucemia mieloide aguda positiva para CD4.

7. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa celular asociada a ^cD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicha leucemia mieloide aguda celular es leucemia mieloide aguda M4 o leucemia mieloide aguda M5.

8. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 o CD5 en un paciente que necesita el mismo de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la enfermedad proliferativa de células es una enfermedad proliferativa de células asociada a CD5.

9. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociada a CD4 o CD5 en un paciente que necesite el mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la enfermedad proliferativa de células asociada a CD5 se selecciona del grupo que consiste en carcinoma tímico, linfoma de no Hodgkin, linfoma difuso de células grandes, linfoma linfocítico pequeño (SLL), neoplasias de células T, linfoma de células T periféricas, linfoma de células del manto, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) y leucemia linfoide crónica (CLL).

10. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa celular asociada a CD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el polinucleótido comprende S^eQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 5

11. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociadas a CD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el método comprende además la administración junto con uno o más de quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores y terapia antiviral.

12. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa celular asociada a CD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el polinucleótido comprende SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7.

13. La célula manipulada que comprende un polinucleótido para su uso en el método de tratamiento de una enfermedad proliferativa de células asociadas a CD4 o CD5 de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el método comprende además la administración junto con uno o más de quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores y terapia antiviral.