CN103889452B - 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法 - Google Patents

对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域；用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。

Description

对T细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使 用方法
发明领域
本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域；用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。
发明背景
在多种临床背景中常常想要选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织不受损害是癌症疗法的首要目标。一种办法是选择性诱导针对肿瘤的免疫应答，其触发免疫效应细胞（诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)）攻击及随后破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fc域介导的效应器机制来激活。在此方面，能够结合癌细胞上的表面抗原及活化T细胞受体(TCR)复合物中的不变组分的双特异性抗体在最近几年已变得感兴趣。双特异性抗体对其靶物二者的同时结合迫使癌细胞和T细胞之间的暂时相互作用，引起细胞毒性T细胞活化和随后肿瘤细胞裂解。
已开发出数种双特异性抗体型式并调查了它们对T细胞介导的癌症免疫疗法的适宜性。其中，所谓的BiTE（双特异性T细胞衔接物(engager)）分子已进行非常好地表征，而且早就在临床中显示出一些有希望的结果（综述见Nagorsen and Exp CellRes317,1255-1260(2011)）。BiTE是串联scFv分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其它双特异性型式包括双抗体（Holliger et al.,Prot Eng9,299-305(1996)）及其衍生物，诸如串联双抗体（Kipriyanov et al.,J Mol Biol293,41-66(1999)）。一项最近的进展是所谓的DART（双重亲和力重新靶向）分子，其基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥（Moore et al.,Blood117,4542-51(2011)）。所谓的triomab（其为完整杂合小鼠/大鼠IgG分子且目前亦在临床试验中评估）代表尺寸更大的型式（综述见Seimetz et al.,Cancer Treat Rev36,458-467(2010)）。
然而，至今已知的为T细胞介导的癌症免疫疗法开发的双特异性抗体具有涉及它们功效、毒性和适用性的重大缺点。小构建物（诸如例如BiTE分子），虽然能够有效交联效应器和靶细胞，但是具有非常短的血清半衰期，从而要求通过连续输注对患者施用它们。另一方面，IgG样形式，虽然具有长半衰期的极大好处，但是受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。这种免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体对于成功治疗剂开发的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战仍然是以临床充足的数量和纯度生产双特异性抗体构建物。具有不同特异性的抗体重和轻链在共表达时的错配降低正确装配的构建物的产率且导致许多无功能的副产物。
鉴于与目前可获得的用于T细胞介导的癌症免疫疗法的双特异性抗体有关的难点和缺点，仍然存在对此类分子的新颖的改进型式的需要。现在已经用本发明的新双特异性抗体克服了这些缺点。由于错配副产物的量减少（这显示聚集比本领域已知的双特异性抗体片段少），能容易地以升高的产率生成新双特异性抗体。使用交换办法，能在不需要生成常规(common)轻链的情况下迫使正确的LC联合。另外，新双特异性抗体具有与许多常规双特异性抗体片段相比更高的分子量，如此防止过度肾清除且导致改进体内半衰期。新双特异性抗体是完全功能性的且具有与相应常规双特异性抗体相当或改进的结合和活性。
本发明提供设计用于T细胞活化和重新定向的双特异性抗原结合分子，其组合了良好的功效和生产能力与较低毒性和有利的药动学特性。
发明概述
本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域。
本发明的抗体特异性结合肿瘤细胞的表面上的肿瘤抗原且同时结合T细胞活化性抗原。由此，所述双特异性抗体能够在肿瘤部位特异性引发免疫应答，随后导致靶细胞凋亡。
一方面，提供特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二Fab片段包含至少一个对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fc域。
特别地，本发明涉及如下的双特异性抗体，其中T细胞活化性抗原为CD3T细胞共同受体(CD3)靶抗原。
一方面，提供特异性结合CD3T细胞共同受体(CD3)抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二Fab片段包含至少一个对CD3T细胞共同受体(CD3)特异性的抗原结合位点，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fc域。在一个实施方案中，所述第一和第二Fab片段经由肽接头连接。优选地，所述肽接头为(G4S)2接头。
在一个实施方案中，所述抗体另外包含第三Fab片段。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点。在一个实施方案中，所述第三Fab片段连接所述第一Fab片段的轻链或重链的N或C端。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段连接所述第二Fab片段的轻链或重链的N或C端。在一个实施方案中，所述第三Fab片段经由肽接头连接所述第一或第二Fab片段。优选地，所述肽接头为(G4S)2接头。
依照本发明的双特异性抗体至少是二价的，而且可以是三价的或多价的，例如四价的或六价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的（1+1型式），分别有一个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)和T细胞活化性抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的（2+1型式），有两个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)且有一个结合位点靶向T细胞活化性抗原，如下节详述的。在一个优选的实施方案中，所述T细胞活化性抗原为CD3。
在第二个目标中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体。
在第三个目标中，本发明涉及本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。在另一个实施方案中，提供所述双特异性抗体作为药物的用途。优选地，所述用途为用于治疗癌症。
在别的目标中，本发明涉及包含的序列编码本发明的双特异性抗体的重链的核酸序列，包含的序列编码本发明的双特异性抗体的轻链的核酸序列，包含本发明的核酸序列的表达载体和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养所述宿主细胞，使得所述抗体生成。
附图简述
图1：本发明的例示性双特异性抗体型式的示意图。a)Fab-Crossfab分子C端，b)Fab-Crossfab分子N端，c)(Fab)2-Crossfab分子C端，d)(Fab)2-Crossfab分子N端，e)Fab-Crossfab-Fab分子。
图2：hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)生成和纯化的分析：SDS-Page：4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：a)1–标志物12（invitrogen），2–非还原的hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)；b)1–标志物12（invitrogen），2–还原的hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)。
图3：Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品）。
图4：hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)生成和纯化的分析：SDS-Page：4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：a)1–标志物12（invitrogen），2–非还原的hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)；b)1–标志物12（invitrogen），2–还原的huFab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)。
图5：hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品）。
图6：hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)生成和纯化的分析。SDS-Page：4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：a)1–标志物12（invitrogen），2–非还原的hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)；b)1–标志物12（invitrogen），2–还原的huFab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)。
图7：hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品）。
图8：鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)生成和纯化的分析。SDS-Page：4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：a)1–标志物12（invitrogen），2–非还原的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)；b)1–标志物12（invitrogen），2–还原的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)。
图9：鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mMNaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品）。
图10：在与人泛T细胞共培养（E:T比例=5:1）并通过不同浓度的hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)（=“Fab-Crossfab”）、hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)（=“Fab-Crossfab-Fab”）、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)（=“(Fab)2-Crossfab”）以及(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”）双特异性分子活化20小时时MDA-MB-435肿瘤细胞的杀死（如通过LDH释放所测量的）。具有二价MCSP靶向的构建体显示了与“(scFv)2”构建体相比相当的细胞毒活性，而具有单价MCSP结合的“Fab-Crossfab”构建体则明显的效力较低。
图11：hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)（=“(Fab)2-Crossfab”）和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”）构建体的比较。所描绘的是在与人泛T细胞共培养（E:T比例=5:1）并通过不同浓度的双特异性构建体及相应IgG活化21小时时来自MDA-MB-435肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab)2-Crossfab”在靶细胞中至少像(scFv)2分子同等好的诱导凋亡。
图12：hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)（=“(Fab)2-Crossfab”）和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”）构建体的比较。所描绘的是在与人PBMC共培养（E:T比例=10:1）并通过不同浓度的双特异性构建体及相应IgG活化26小时时来自MV-3人黑素瘤肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab)2-Crossfab”在靶细胞中至少像(scFv)2分子同等好的诱导凋亡。
图13：由用靶向人MCSP以及鼠CD3的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体（=(Fab)2-CrossFab）活化的原代鼠T细胞所诱导的，来自B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤细胞的LDH释放。效应器对靶细胞的比例为5:1。在37℃，5%CO2温育23.5小时后对该测定法进行分析。所述构建体诱导表达人MCSP之靶细胞的浓度依赖性的、T细胞介导的凋亡。
图14：由用50nM靶向人MCSP以及鼠CD3的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体（=(Fab)2-CrossFab）活化的原代鼠T细胞所诱导的，来自B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤细胞的LDH释放。效应器与靶细胞的比例是5:1。在37℃，5%CO2温育23.5小时后对该测定法进行分析。所述构建体诱导表达人MCSP之靶细胞的T细胞介导之凋亡。在此构建体浓度下只有微弱的T细胞超活化。
图15：在存在（A，B）或缺失（C，D）Colo-38肿瘤细胞的情况下用1nM不同CD3-MCSP双特异性构建体（hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)（=“(Fab)2-Crossfab”）和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”））处理24小时后全血上清液中测量的不同细胞因子水平。将280μl全血加到96孔板的每个孔中并加入30,000个Colo-38细胞，如所指示的。在存在Colo-38肿瘤细胞的情况下在T细胞活化时分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFNγ。此外，在存在靶细胞的情况下在T细胞活化时粒酶B水平也有很大的升高。总的来说，在存在靶细胞的情况下(A和B)，“(scFv)2”构建体与其它双特异性构建体相比稍微更多的提高了TNF和IFNγ以及粒酶B的水平。
在存在（或缺失）靶细胞的情况下在双特异性构建体活化T细胞时没有显著的Th2细胞因子（IL-10和IL-4）分泌。在此测定法中在缺失靶细胞的情况下还有微弱的由“(Fab)2-Crossfab”构建体诱导的IFNγ分泌。
图16：在自脾细胞分离的鼠泛T细胞上晚期活化标志物CD25的表面表达水平。如所指出的（E:T比例为10:1），在存在或缺失B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤靶细胞的情况下将鼠泛T细胞与50nM鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体（=(Fab)2-CrossFab）双特异性构建体（靶向鼠CD3，以及人MCSP）一起温育。所描绘的是70小时后CD8+T细胞上晚期活化标志物CD25的表达水平。CD8+T细胞上经由(Fab)2-CrossFab构建体的CD25上调仅发生在存在靶细胞的情况下。调整至相同摩尔浓度使用的参照IgG不能上调CD25。
图17：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)生成和纯化的分析。SDS-Page：a)3-8%Tris/乙酸盐（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：a)1–HiMark（invitrogen），2–非还原的Fab(CD33)-CrossFab(CD3)；b)4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]）：1–标志物12（invitrogen），2–还原的Fab(CD33)-CrossFab(CD3)。
图18：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品）。
图19：在与人PBMC（E:T比例=10:1）共培养并通过不同浓度CD3-MCSP双特异性构建体（hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，命名为“1+1无Fc”；和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”）参照分子）活化24小时时MV-3肿瘤细胞的杀死（如通过LDH释放所测量的）。该“1+1无Fc”构建体在MV-3靶细胞中以25.4pM的计算EC50诱导凋亡，而“(scFv)2”参照分子的计算EC50则为57pM，显示了“1+1无Fc”分子在EC50方面稍好的效力。
图20：在存在huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞的情况下，在与人PBMC（E:T比例=10:1）共培养，用CD3-MCSP双特异性构建体（分别是hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，命名为“1+1无Fc”；和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)（=“(scFv)2”）参照分子）处理约24小时时，CD4+或CD8+T细胞的活化，如通过CD69上调（A）、CD69阳性细胞各自增加（B）所测定的。总的来说，与CD4+T细胞相比，在CD8+T细胞上CD69中值更高。对两种构建体而言，CD69中值以及CD69阳性细胞百分数均有明显的浓度依赖性增加。
图21：(scFv)2参照分子的图解。
图22：(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)生成和纯化的分析。SDS-Page：4-12%Bis/Tris（NuPage[invitrogen]；考马斯染色）：1–标志物12（invitrogen），2–还原的(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)，3–非还原的(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)。
图23：(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280（Superdex7510/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02%(w/v)NaCl；注入50μg样品（(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)））。
发明详述
I.定义
“框架”或“FR”指除高变区（HVR）残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH（或VL）中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中（H1、H2、H3），且三个在VL中（L1、L2、L3）。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35B(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。术语高变区(HVR)和互补决定区(CDR)在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Healthand Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基编号将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
表1：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等(见下文)提出的编号惯例。
2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统用于任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基（例如，FR残基）在本文中依照Kabat等，见上文编号。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。特别地，术语“抗体”包括本发明的双特异性抗体，其包含至少两种Fab片段但不包含Fc域。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原性决定簇。
术语“单价结合抗原”表示特异性结合抗原的抗体中包含不超过一个抗原。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物（例如小鼠）分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，CDR）对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体（例如非人抗体）的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性（特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合）的。
术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体，其通常通过重组DNA技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性（特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合）的。此类嵌合抗体又称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scFv抗体记载于Huston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-88。另外，抗体片段包含具有VH域或VL域的特征（即能够与VL域或VH域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供全长抗体的抗原结合特性）的单链多肽。
如本文中使用的，“Fab片段”指包含轻链片段（其包含VL域和轻链恒定域(CL)）及VH域和重链第一恒定域(CH1)的抗体片段。本发明的双特异性抗体至少包含两个Fab片段，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。由于可变区或恒定区任一的交换，所述第二Fab片段也称作“cross-Fab”片段或“xFab”片段或“交换Fab”片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重和轻链的可变区是交换的，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重和轻链的恒定区交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
在一个实施方案中，所述Fab片段是经由肽接头相连接的。“连接”表示Fab片段是通过肽键相连接的，或是直接的或是经由一个或多个肽接头。
如本发明内所使用的，术语“肽接头”指具有氨基酸序列的肽，其优选是合成起源的。依照本发明的这些肽接头用于将Fab片段之一与另一Fab片段的C或N端连接以形成依照本发明的多特异性抗体。优选地，所述肽接头是具有长度为至少5个氨基酸，优选长度为5-100个，更优选10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，且(x=3，n=3、4、5或6且m=0、1、2或3)或(x=4且n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，优选地x=4且n=2或3，更优选地x=4且n=2。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的部分)。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2(SEQ ID:NO28)。适合于连接Fab片段的其它肽接头是例如(G4S)6-GG(SEQ ID NO:147)、(SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG(SEQID NO:148),、或EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO145和146)。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域（也称作抗体可变区）提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域（分别为VH和VL）一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)（见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007)）。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
术语“抗体的抗原结合位点”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。尤其地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。
本文中术语“Fc域”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。例如，在天然抗体中，Fc域由两个相同的蛋白质片段构成，它们衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定域（在IgG、IgA和IgD同种型中）；IgM和IgE Fc域在每条多肽链中含有三个重链恒定域（CH域2-4）。本发明的双特异性抗体不含Fc域。如本文中使用的，“不含Fc域”表示本发明的双特异性抗体不包含CH2、CH3或CH4域；即恒定重链仅仅由一个或多个CH1域组成。
“亲和力”指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
如本文中使用的，术语“结合”或“特异性结合”表示结合对抗原是选择性的，而且能与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合模块结合特定抗原决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术（例如表面等离振子共振(SPR)技术（在BIAcore仪器上分析）(Liljeblad et al.,Glyco J17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))）来测量。在一个实施方案中，抗体结合无关蛋白质的程度小于抗体对抗原的结合的约10%，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M）的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体结合无关蛋白质的程度小于抗体对T细胞活化性抗原或肿瘤抗原(TA)的结合的约10%，如例如通过免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M）的解离常数(KD)。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体结合在来自不同物种的T细胞活化性抗原或肿瘤抗原(TA)间保守的T细胞活化性抗原或肿瘤抗原(TA)表位。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区（HVR）中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体”指如下的双特异性抗体，其能够以足够亲和力结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原，使得该抗体可用于在表达肿瘤抗原的细胞中或附近介导T细胞介导的免疫应答。在一个具体的实施方案中，T细胞活化性抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)抗原，特别是人或猕猴CD3，最特别是人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化性抗原是CD3的厄普西隆(ε)亚基。在其它实施方案中，T细胞活化性抗原是CD3的阿尔法(α)或贝塔(β)亚基。
在一个实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体能与单克隆抗体H2C（记载于PCT公开文本No.WO2008/119567）竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体能与单克隆抗体V9（记载于Rodrigues et al.,Int J Cancer Suppl7,45-50(1992)及美国专利No.6,054,297）竞争结合CD3的表位。在还有另一个实施方案中，特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体能与单克隆抗体FN18（记载于Nooij et al.,Eur JImmunol19,981-984(1986)）竞争结合CD3的表位。
如本文中使用的，“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化，其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3。
如本文中使用的，“T细胞活化”指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述技术领域中已知的。
如本文中使用的，术语“CD3T细胞共同受体(CD3)”指一种蛋白质复合物，而且由四条不同链构成。在哺乳动物中，该复合物包含一条CD3γ链、一条CD3δ链、和两条CD3ε链。这些链在T淋巴细胞中与称作T细胞受体(TCR)的分子和ζ链联合以生成活化信号。术语“CD3T细胞共同受体(CD3)”包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，诸如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠），除非另有说明，优选来自人来源。该术语涵盖“全长”未加工CD3以及源自细胞中加工的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在一个优选实施方案中，术语CD3T细胞共同受体指人或猕猴CD3，特别是人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化性抗原是CD3的厄普西隆(ε)亚基。在其它实施方案中，T细胞活化性抗原是CD3的阿尔法(α)或贝塔(β)亚基。SEQ ID NO.:103给出人CD3的一种例示性序列。
如本文中使用的，术语“肿瘤抗原(TA)”指肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原，即由肿瘤细胞表达的任何免疫原性表位（例如蛋白质）。该蛋白质可以由非肿瘤细胞表达，但是只在由肿瘤细胞表达时是免疫原性的。或者，该蛋白质可以由肿瘤细胞表达，但是正常细胞不表达。优选地，本发明的抗TA抗体结合TA的胞外域。在一个优选实施方案中，所述肿瘤抗原是人肿瘤抗原。例示性肿瘤抗原包括但不限于黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP,UniProt Q6UVK1,NCBI登录号NP_001888)、成纤维细胞活化蛋白(FAP,Uni Prot Q12884,Q86Z29,Q99998;NCBI登录号NP_004451)、表皮生长因子受体(EGFR,也称作ErbB1和Her1,UniProt P00533;NCBI登录号NP_958439,NP_958440)、癌胚抗原(CEA,也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5或CD66e;UniProt P06731,NCBI登录号NP_004354)和CD33(也称作gp76或唾液酸结合Ig样凝集素3(Siglec-3),UniProt P20138,NCBI登录号NP_001076087,NP_001171079)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个对黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异性的抗原结合位点。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个对CD3特异性的抗原结合位点。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对两种不同抗原特异性，即作为第一抗原的T细胞活化性抗原和作为第二抗原的肿瘤抗原。
如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示抗体具有一个或多个结合位点，每个结合相同抗原的相同表位。
如本文中使用的，术语“双特异性”抗体表示抗体具有至少两个结合位点，每个结合不同抗原或相同抗原的不同表位。
本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体指对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文中提供双特异性抗体，其具有针对肿瘤抗原(TA)和T细胞活化性抗原的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合TA的两种不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位于表达TA的细胞。
如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”、“四价”、和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体至少是“二价”的，而且可以是“三价”的或“多价”的（例如“四价”或“六价”）。
本发明的抗体具有两个或更多个结合位点且是双特异性的。就是说，该抗体可以是双特异性的，即使在有超过两个结合位点的情况中（即该抗体是三价或多价的）。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
“没有实质性交叉反应性”意指分子（例如，抗体）不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原（例如与靶抗原密切相关的抗原），特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10%至少于约5%的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以以选自由少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、或0.1%组成的组的量结合所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2%、1%、或0.5%，且最优选地少于约0.2%或0.1%与实际靶抗原不同的抗原。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳）或层析（例如，离子交换或反相HPLC）测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”的核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链（或其片段）的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸（三字母代码：ala，单字母代码：A）、精氨酸（arg，R）、天冬酰胺（asn，N）、天冬氨酸（asp，D）、半胱氨酸（cys，C）、谷氨酰胺（gln，Q）、谷氨酸（glu，E）、甘氨酸（gly，G）、组氨酸（his，H）、异亮氨酸（ile，I）、亮氨酸（leu，L）、赖氨酸（lys，K）、甲硫氨酸（met，M）、苯丙氨酸（phe，F）、脯氨酸（pro，P）、丝氨酸（ser，S）、苏氨酸（thr，T）、色氨酸（trp，W）、酪氨酸（tyr，Y）、和缬氨酸（val，V）。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传代的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“裸抗体”指未与异源模块（例如细胞毒性模块）或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子（包括但不限于细胞毒剂）缀合的抗体。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素）；化学治疗剂或药物（例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂）；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。
术语“药物配制剂”指处于如下的制剂，其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
在用于本文时，“治疗/处理”（及其语法变型）指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物（例如，牛、绵羊、猫、犬、和马）、灵长类（例如，人和非人灵长类诸如猴）、家兔、和啮齿类（例如，小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
药剂（例如药物配制剂）的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
如本文中使用的，术语“癌症”指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺（NSCL）癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃的癌症、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、何杰金氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统（CNS）新生物、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于包含对T细胞活化性抗原特异性的第一抗原结合位点和对肿瘤抗原(TA)特异性的第二抗原结合位点的双特异性抗体。本发明的抗体可用于例如治疗癌症。
A.例示性的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体
本发明涉及组合T细胞活化性抗原结合位点与靶向肿瘤抗原(TA)的第二抗原结合位点的双特异性抗体。本发明的抗体特异性结合肿瘤细胞表面上的肿瘤抗原且同时结合细胞毒性T淋巴细胞表面上的抗原。优选地，所述抗原为CD3T细胞共同受体(CD3)抗原。所述双特异性抗体能够在肿瘤部位特异性引发免疫应答，随后导致靶细胞凋亡。
在一个特别的依照本发明的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体能够同时结合肿瘤细胞抗原和活化性T细胞抗原。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体能够通过同时结合肿瘤细胞抗原和活化性T细胞抗原来交联T细胞和肿瘤细胞。在一个甚至更加特别的实施方案中，此类同时结合导致肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致T细胞活化。在其它实施方案中，此类同时结合导致T淋巴细胞（特别是细胞毒性T淋巴细胞）的选自下组的细胞应答：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应器分子释放，细胞毒性活性，和活化标志物表达。在一个实施方案中，在没有同时结合靶细胞抗原的情况下T细胞活化性双特异性抗体对活化性T细胞抗原的结合不导致T细胞活化。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体能够将T细胞的细胞毒性活性重新导向靶细胞。在一个特别的实施方案中，所述重新导向不依赖靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，依照本发明任何实施方案的T细胞为细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
在一个实施方案中，提供特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域。
一方面，提供特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二Fab片段包含至少一个对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fc域。
在一个特别的实施方案中，T细胞活化性抗原为CD3T细胞共同受体(CD3)抗原，特别是人或猕猴CD3，最特别地是人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化性抗原为CD3的ε亚基。在其它实施方案中，T细胞活化性抗原为CD3的α或β亚基。
一方面，提供特异性结合CD3T细胞共同受体(CD3)抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二Fab片段包含至少一个对CD3T细胞共同受体(CD3)特异性的抗原结合位点，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fc域。
在一个实施方案中，第一和第二Fab片段经由肽接头连接。优选地，所述肽接头为具有长度为至少5个，优选5至100个，更优选10至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，且(x=3，n=3，4，5或6，且m=0，1，2或3)或(x=4，n=2，3，4或5且m=0，1，2或3），优选地x=4且n=2或3，更优选x=4，n=2。在一个实施方案中，所述肽接头为(G4S)2。使用肽接头来连接第一和第二Fab片段。
在一个实施方案中，第一Fab片段连接第二Fab片段的C或N端。
在一个实施方案中，第一Fab片段连接第二Fab片段的N端。当第一Fab片段连接第二Fab片段的N端时，根据交换的是第二Fab片段的重和轻链的可变还是恒定域，可能是不同的双特异性抗体分子。
在一个实施方案中，第二Fab片段的可变域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(VHVL)）且第一Fab片段的重或轻链的C端连接至第二Fab片段的VLCH1链的N端。优选地，第一Fab片段的重链的C端连接至第二Fab片段的VLCH1链的N端。如此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第一Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的重链（其经由肽接头(VHCH1-接头-VLCH1)连接至第二Fab片段的VLCH1链）和第二Fab片段的VHCL链。
在另一个实施方案中，第二Fab片段的恒定域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(CLCH1)）且第一Fab片段的重或轻链的C端连接至第二Fab片段的VHCL链的N端。优选地，第一Fab片段的重链的C端连接至第二Fab片段的VHCL链的N端。如此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第一Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的重链（其经由肽接头连接至第二Fab片段的VHCL链）(VHCH1-接头-VHCL)和第二Fab片段的VLCH1链。
在一个实施方案中，第一Fab片段连接至第二Fab片段的C端。当第一Fab片段连接至第二Fab片段的C端时，根据交换的是第二Fab片段的重和轻链的可变还是恒定域，可能是不同的双特异性抗体分子。
在一个实施方案中，第二Fab片段的可变域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(VHVL)）且第二Fab片段的CH1域连接至第一Fab片段的重或轻链的N端。优选地，第二Fab片段的CH1域连接至第一Fab片段的重链的N端。如此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第一Fab片段的轻链(VLCL)，第二Fab片段的VLCH1链（其经由肽接头连接至第一Fab片段的重链）(VLCH1-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VHCL链。
在另一个实施方案中，第二Fab片段的恒定域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(CLCH1)）且第二Fab片段的CL域连接至第一Fab片段的重或轻链的N端。优选地，第二Fab片段的CL域连接至第一Fab片段的重链的N端。如此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第一Fab片段的轻链(VLCL)，第二Fab片段的VHCL链（其经由肽接头连接至第一Fab片段的重链）(VLCH1-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VLCH1链。
依照本发明的双特异性抗体至少是二价的，而且可以是三价的或多价的，例如四价的或六价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的（1+1型式），分别有一个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)和T细胞活化性抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的（2+1型式），有两个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)且有一个结合位点靶向T细胞活化性抗原，如下节详述的。
在一个实施方案中，所述抗体另外包含第三Fab片段。在一个实施方案中，所述第三Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点。在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点是与第一Fab片段的抗原结合位点对相同肿瘤抗原特异性的。
在一个实施方案中，第三Fab片段连接至第一Fab片段的N或C端。在一个实施方案中，第三Fab片段经由肽接头连接至第一Fab片段。优选地，所述肽接头为(G4S)2接头。
在一个实施方案中，第三Fab片段连接至第一Fab片段的轻链或重链的N或C端。根据第一Fab片段的哪个末端连接至第二Fab片段（如上文详述的），第三Fab片段连接在第一片段的对立（游离）末端上。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头从N端到C端方向以下述次序连接：Fab片段3-接头-Fab片段1-接头-Fab片段2，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在这个实施方案中，第三Fab片段的C端连接至第一Fab片段的N端。如上文详述的，Fab片段可以经由重或轻链彼此连接。在一个实施方案中，第三Fab片段的重链的C端经由肽接头连接至第一Fab片段的重链的N端；且第一Fab片段的C端连接至第二Fab片段的N端，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。根据交换的是第二Fab片段的重和轻链的可变还是恒定域，可能是不同的双特异性抗体分子。
在一个实施方案中，第二Fab片段的可变域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(VHVL)且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VHCH1-接头-VHCH1-接头-VLCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第三片段的重链（其连接至第一Fab片段的重链，后者自身经由肽接头连接至第二Fab片段的VLCH1链）(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VLCH1)和第二Fab片段的VHCL链。
在一个实施方案中，第二Fab片段的恒定域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(CLCH1)）且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VHCH1-接头-VHCH1-接头-VHCL。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第三片段的重链（其连接至第一Fab片段的重链，后者自身经由肽接头连接至第二Fab片段的VHCL链）(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VHCL)和第二Fab片段的VLCH1链。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头从N端到C端方向以下述次序连接：Fab片段2-接头-Fab片段1-接头-Fab片段3，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在这个实施方案中，第三Fab片段的N端连接至第一Fab片段的C端。如上文详述的，Fab片段可以是经由重或轻链彼此连接的。在一个实施方案中，第三Fab片段的重链的N端经由肽接头连接至第一Fab片段的重链的C端；且第一Fab片段的N端连接至第二Fab片段的C端，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。根据交换的是第二Fab片段的重和轻链的可变还是恒定域，可能是不同的双特异性抗体分子。
在一个实施方案中，第二Fab片段的可变域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(VHVL)）且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VLCH1-接头-VHCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第二Fab片段的VLCH1链（其连接至第一片段的重链，后者自身经由肽接头连接至第一Fab片段的重链）(VLCH1-接头-VHCH1-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VHCL链。
在一个实施方案中，第二Fab片段的恒定域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(CLCH1)）且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VHCL-接头-VHCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第二Fab片段的VHCL链（其连接至第一片段的重链，后者自身经由肽接头连接至第一Fab片段的重链）(VHCL-接头-VHCH1-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VLCH1链。
在另一个实施方案中，第三Fab片段连接至第二Fab片段的轻链或重链的N或C端。在一个实施方案中，第三Fab片段经由肽接头连接至第二Fab片段。优选地，所述肽接头为(G4S)2接头。如上文详述的，Fab片段可以经由重或轻链彼此连接。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头从N端到C端方向以下述次序连接：Fab片段1-接头-Fab片段2-接头-Fab片段3，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，第三Fab片段的N端连接至第二Fab片段的C端。
在另一个实施方案中，第三Fab片段的重链的C端经由肽接头连接至第二Fab片段的N端；且第一Fab片段的N端连接至第二Fab片段的C端，其中第二Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
根据交换的是第二Fab片段的重和轻链的可变还是恒定域，可能是不同的双特异性抗体分子。
在一个实施方案中，第二Fab片段的可变域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(VHVL)）且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VHCH1-接头-VLCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第三片段的重链（其连接至第二Fab片段的VLCH1链的N端，且所述VLCH1链的C端经由肽接头连接至第一Fab片段的重链的N端）(VHCH1-接头-VLCH1-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VHCL链。
在一个实施方案中，第二Fab片段的恒定域是交换的（即第二Fab片段为CrossFab(CLCH1)）且三个Fab片段的链从N端到C端方向以下述次序连接：VHCH1-接头-VHCL-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含四条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，第一Fab片段的轻链(VLCL)，第三片段的重链（其连接至第二Fab片段的VHCL链的N端，且所述VHCL链的C端经由肽接头连接至第一Fab片段的重链的N端）(VHCH1-接头-VHCL-接头-VHCH1)和第二Fab片段的VLCH1链。
在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点与第一Fab片段的抗原结合位点是对相同肿瘤抗原特异性的，且本发明的双特异性抗体包含经由肽接头以下述次序（或是从N端到C端方向或是从C端到N端方向）连接的三个Fab片段：Fab(TA)-接头-Fab(TA)-接头-xFab(T细胞活化性抗原)，其中Fab(TA)表示具有对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点的Fab片段，而xFab(T细胞活化性抗原)表示具有对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点与第一Fab片段的抗原结合位点是对相同肿瘤抗原特异性的，且本发明的双特异性抗体包含经由肽接头以下述次序（或是从N端到C端方向或是从C端到N端方向）连接的三个Fab片段：Fab(TA)-接头-xFab(T细胞活化性抗原)-接头-Fab(TA)，其中Fab(TA)表示具有对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点的Fab片段，而xFab(T细胞活化性抗原)表示具有对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含能与单克隆抗体V9竞争结合CD3表位的抗原结合模块。参见例如Rodigues et al.，Int J Cancer Suppl7(1992），45-50；US6,054,297，通过述及完整收入本文。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含能与单克隆抗体FN18竞争结合CD3表位的抗原结合模块。参见Nooij et al.，Eur J Immunol19(1986），981-984，通过述及完整收入本文。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含能与单克隆抗体CH2527(序列ID157和158)或其亲和力成熟变体竞争结合CD3表位的抗原结合模块。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段，其中重链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.10或SEQ ID.NO.32，CDR2SEQ ID.NO.11或SEQ ID.NO.33，和CDR3SEQ ID.NO.12或SEQ ID.NO.34；且其中轻链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.7或SEQID.NO.29，CDR2SEQ ID.NO.8或SEQ ID.NO.30，和CDR3SEQ ID.NO.9或SEQ ID.NO.31。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段，其中重链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.10，CDR2SEQ ID.NO.11，和CDR3SEQ ID.NO.12；且其中轻链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.7，CDR2SEQ ID.NO.8和CDR3SEQ ID.NO.9。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段，其中重链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.32，CDR2SEQ ID.NO.33，和CDR3SEQ ID.NO.34；且其中轻链可变区包含CDR1SEQ ID.NO.29，CDR2SEQ ID.NO.30，和CDR3SEQ ID.NO.31。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.20或SEQ ID.NO.36至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；其中轻链可变区序列与SEQ ID.NO.19或SEQ ID.NO.35至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID.NO.20；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID.NO.19或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID.NO.36；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQID.NO.35或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID.NO.158；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQID.NO.157或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.158至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；其中轻链可变区序列与SEQ ID.NO.157至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQID.NO.158的亲和力成熟变体且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.157的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.158和/或SEQ ID.NO.157的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22或SEQ ID.NO.38或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22或SEQ ID.NO38），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21或SEQ ID.NO.37。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21或SEQ ID.NO.37），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在还有另一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，所述重链包含的重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22或SEQ ID.NO.38；且所述轻链包含的轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21或SEQID.NO.37。
在还有另一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，所述重链包含的重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22；且所述轻链包含的轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21。
在还有另一个具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（所述重链包含的重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.22；且所述轻链包含的轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.21），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.35和可变重链SEQ ID NO.36，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.38的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.37的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.35和可变重链SEQ ID NO.36，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.38的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.37的轻链恒定区），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.157和可变重链SEQ ID NO.158，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.157或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ IDNO.158或其亲和力成熟变体，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQID.NO.158和/或SEQ ID.NO.157的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.157和可变重链SEQ ID NO.158，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.157或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ IDNO.158或其亲和力成熟变体，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.22的重链恒定区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO.21的轻链恒定区），和对肿瘤抗原(TA)特异性的第一Fab片段的重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.158和/或SEQ ID.NO.157的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，肿瘤抗原选自下组：黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。在一个优选的实施方案中，肿瘤抗原为MCSP。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个对黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异性的抗原结合位点。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体M4-3ML2(序列ID161和162)或其亲和力成熟变体竞争结合MCSP表位的抗原结合模块。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中可变重链包含CDR1SEQ ID.NO.4，CDR2SEQ ID.NO.5，CDR3SEQ ID.NO.6；且可变轻链包含CDR1SEQ ID.NO.1，CDR2SEQ ID.NO.2，和CDR3SEQ ID.NO.3。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.14至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；且轻链可变区与SEQ ID.NO.13至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.161至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；且轻链可变区与SEQ ID.NO.162至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链（其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第二抗体的轻链和重链（其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.15），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQID NO.15。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.14；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQID NO.13，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.13和可变重链SEQ ID NO.14。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.161；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQID NO.162，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.161和可变重链SEQ ID NO.162。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.158和可变重链SEQ ID NO.157；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.161和可变重链SEQ IDNO.162。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.158或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ IDNO.157或其亲和力成熟变体；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.157，SEQ ID.NO.158，SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162中一项或多项的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中可变重链包含CDR1SEQ ID.NO.4，CDR2SEQ ID.NO.5，CDR3SEQ ID.NO.6；且可变轻链包含CDR1SEQ ID.NO.1，CDR2SEQ ID.NO.2，和CDR3SEQ ID.NO.3。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.14至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；且轻链可变区与SEQ ID.NO.13至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.161至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同；且轻链可变区与SEQ ID.NO.162至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链（其中所述重链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列），和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合MCSP的第二抗体的轻链和重链（其中所述轻链包含的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.15），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链，和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.15。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.14；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.13，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.161；且轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO.162，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，其包含特异性结合MCSP的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体，且其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO.16；且轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.13和可变重链SEQ ID NO.14），和对MCSP特异性的第三Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.13和可变重链SEQ ID NO.14）。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162和可变重链SEQ IDNO.161），和对MCSP特异性的第三Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162和可变重链SEQ ID NO.161）。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.19和可变重链SEQ ID NO.20；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体），和对MCSP特异性的第三Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体）。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.161和/或SEQID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.157和可变重链SEQ ID NO.158；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162和可变重链SEQ IDNO.161），和对MCSP特异性的第三Fab片段的轻链和重链（其包含可变轻链SEQ ID NO.162和可变重链SEQ ID NO.161）。
在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含特异性结合CD3的第二Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.157和可变重链SEQ ID NO.158；和对MCSP特异性的第一Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体；和对MCSP特异性的第三Fab片段的轻链和重链，其包含可变轻链SEQ ID NO.162或其亲和力成熟变体和可变重链SEQ ID NO.161或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.161和/或SEQID.NO.162的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在还有另一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一种或多种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.25，SEQ IDNO.26，SEQ ID NO.27。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个对表皮生长因子受体(EGFR)特异性的抗原结合位点。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体GA201竞争结合EGFR表位的抗原结合模块。参见PCT公开文本WO2006/082515，通过述及完整收入本文。在一个实施方案中，对EGFR特异性的抗原结合位点包含重链CDR1SEQ ID NO.68，重链CDR2SEQ ID NO.69，重链CDR3SEQ IDNO.70，轻链CDR1SEQ ID NO.71，轻链CDR2SEQ ID NO.72，和轻链CDR3SEQ ID NO.73。在又一个实施方案中，对EGFR特异性的抗原结合位点包含与SEQ ID NO.74至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.75至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段（其包含对EGFR特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.74至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.75至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段（其包含对EGFR特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.74至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.75至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性的抗原结合位点。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体3F2竞争结合FAP表位的抗原结合模块。参见欧洲专利申请No.EP10172842.6，通过述及完整收入本文。在一个实施方案中，对FAP特异性的抗原结合位点包含重链CDR1SEQ ID NO.76，重链CDR2SEQ ID NO.77，重链CDR3SEQ IDNO.78，轻链CDR1SEQ ID NO.79，轻链CDR2SEQ ID NO.80，和轻链CDR3SEQ ID NO.81。在又一个实施方案中，对FAP特异性的抗原结合位点包含与SEQ ID NO.82至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.83至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段（其包含对FAP特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.82至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.83至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段（其包含对FAP特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.82至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.83至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个对癌胚抗原(CEA)特异性的抗原结合位点。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体CH1A1A竞争结合CEA表位的抗原结合模块。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体CH1A1A克隆98/99(CH1A1(98/99))竞争结合CEA表位的抗原结合模块。参见PCT专利申请No.PCT/EP2010/062527，通过述及完整收入本文。在一个实施方案中，对CEA特异性的抗原结合位点包含重链CDR1SEQ ID NO.84，重链CDR2SEQ ID NO.85，重链CDR3SEQ ID NO.86，轻链CDR1SEQ ID NO.87，轻链CDR2SEQ ID NO.88，和轻链CDR3SEQ ID NO.89。在又一个实施方案中，对CEA特异性的抗原结合位点包含与SEQ ID NO.90或SEQ ID NO.159至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.91或SEQ IDNO.160至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CEA的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO.159的亲和力成熟变体；且轻链可变区包含SEQ IDNO.160的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段（其包含对CEA特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.90至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.91至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段（其包含对CEA特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.159至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.160至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体），和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链（其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列）。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CEA的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO.159的亲和力成熟变体，且轻链可变区包含SEQ IDNO.160的亲和力成熟变体；和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链，其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，其包含对CEA特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.90或SEQ ID NO.159至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.91或SEQ ID NO:160至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体；和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链，其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQ ID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，其包含对CEA特异性的抗原结合位点，其中重链可变区包含SEQ ID NO.159的亲和力成熟变体，且轻链可变区包含SEQ ID NO.160的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意味着SEQID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1，2，3或4个氨基酸独立地是交换的。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含至少一个对CD33特异性的抗原结合位点。在一个实施方案中，对CD33特异性的抗原结合位点包含重链CDR1SEQ IDNO.92，重链CDR2SEQ ID NO.93，重链CDR3SEQ ID NO.94，轻链CDR1SEQ ID NO.95，轻链CDR2SEQ ID NO.96，和轻链CDR3SEQ ID NO.97。在又一个实施方案中，对CD33特异性的抗原结合位点包含与SEQ ID NO.98至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.99至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。
在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，其包含对CD33特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.98至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO.99至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体；和对CD3特异性的第二Fab片段的轻链和重链，其包含一种或多种本文所述任何实施方案中限定的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列的至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.100，SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列的至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQID NO.151，SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153。
在还有另一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一种或多种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.100，SEQ ID NO.101，SEQ ID NO.151，SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153。
在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体为人源化抗体，如下文详述的。
在本发明的另一个实施方案中，双特异性抗体为人抗体，如下文详述的。
在第二个目标中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体。
在第三个目标中，本发明涉及本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。在另一个实施方案中，提供双特异性抗体作为药物的用途。优选地，所述用途为用于治疗癌症。
在别的目标中，本发明涉及包含编码本发明双特异性抗体重链的序列的核酸序列，包含编码本发明双特异性抗体轻链的序列的核酸序列，包含本发明核酸序列的表达载体和包含本发明载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45，SEQ ID NO.46，SEQ ID NO.47，SEQ ID NO.48，SEQ IDNO.49，SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.52，SEQ ID NO.53，SEQ ID NO.54，SEQ IDNO.55，SEQ ID NO.56，SEQ ID NO.57，SEQ ID NO.58，SEQ ID NO.59，SEQ ID NO.60，SEQ IDNO.61，SEQ ID NO.62，SEQ ID NO.63，SEQ ID NO.64，SEQ ID NO.65，SEQ ID NO.66，和SEQID NO.67。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.107，SEQ ID NO.108，SEQ ID NO.109，SEQ ID NO.110，SEQ ID NO.111，和SEQID NO.112。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.113，SEQ ID NO.114，SEQ ID NO.115，SEQ ID NO.116，SEQ ID NO.117，SEQ IDNO.118，SEQ ID NO.119，和SEQ ID NO.120。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.121，SEQ ID NO.122，SEQ ID NO.123，SEQ ID NO.124，SEQ ID NO.125，SEQ IDNO.126，SEQ ID NO.127，和SEQ ID NO.128。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.129，SEQ ID NO.130，SEQ ID NO.131，SEQ ID NO.132，SEQ ID NO.133，SEQ IDNO.134，SEQ ID NO.135，和SEQ ID NO.136。
在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体包含由与选自下组的序列至少约80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO.105，SEQ ID NO.106，SEQ ID NO.137，SEQ ID NO.138，SEQ ID NO.139，SEQ IDNO.140，SEQ ID NO.141，SEQ ID NO.142，SEQ ID NO.143，SEQ ID NO.144，SEQ ID NO.154，SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.156。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的双特异性抗体可单一地或组合地并入下文1-5节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定T细胞活化性双特异性抗体对靶抗原的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估T细胞活化性双特异性抗体对不同受体或靶抗原的结合。
在某些实施方案中，本文中提供的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M）的解离常数(KD)。
依照一个实施方案，KD是使用表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(ka或kon)和解离速率(kd或koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH7.2中20nM抗抗原抗体（Fab形式）于25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
2.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的双特异性抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区（例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区）和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR（或其部分）自非人抗体衍生，而FR（或其部分）自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体（例如衍生HVR残基的抗体）的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988);Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)（描述了SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)（描述了“重修表面”）；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)（描述了“FR改组”）；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer83:252-260(2000)（描述了FR改组的“引导选择”方法）。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区（见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993)）；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区（见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993)）；人成熟的（体细胞突变的）框架区或人种系框架区（见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)）；和通过筛选FR文库衍生的框架区（见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)）。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的双特异性抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术）。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系（见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)）。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826（其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体）和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)（其描述了人-人杂交瘤）的。人杂交瘤技术（Trioma技术）也记载于Vollmers和Brandlein,Histologyand Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的双特异性抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods inMolecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks和Bradbury,于Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以（例如自人）克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
5.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的双特异性抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善双特异性抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码双特异性抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备双特异性抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合或降低的免疫原性。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Asp,Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu;Asn Glu
Cys(C) Ser;Ala Ser
Gln(Q) Asn;Glu Asn
Glu(E) Asp;Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val;Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变（例如改善）（例如升高的亲和力、降低的免疫原性）和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性（例如结合亲和力）。
可以对HVR做出变化（例如，替代），例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基（见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)），和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法（例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变）将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基（例如，一次4-6个残基）随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化（例如，保守替代，如本文中提供的），其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将一个残基或一组靶残基（例如，带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu）鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸（例如，丙氨酸或多丙氨酸）替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶（例如对于ADEPT）或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
Fc域变体的。
b)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的双特异性抗体，例如，“thioMAb”，其中双特异性抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于双特异性抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205（Kabat编号方式）和重链的A118（EU编号方式）。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
c)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的双特异性抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于双特异性抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了双特异性抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相肽合成)或重组生成来获得本发明的T细胞活化性双特异性抗体，。对于重组生成，分离一种或多种编码所述T细胞活化性双特异性抗体(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有T细胞活化性双特异性抗体(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中（在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中）克隆编码T细胞活化性双特异性抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如在单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的T细胞活化性双特异性抗体(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且若两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，连同内含子-A)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔-球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，诸如复制起点和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌T细胞活化性双特异性抗原结合分子，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明T细胞活化性双特异性抗体或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长中的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗体的短蛋白序列的DNA纳入T细胞活化性双特异性抗体(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明T细胞活化性双特异性抗体(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何种类能工程化改造以生成本发明的T细胞活化性双特异性抗体或其片段的细胞系统。适用于复制T细胞活化性双特异性抗体及支持其表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的T细胞活化性双特异性抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，特别是在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中与细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)，和Li等,Nat Biotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,J Gen Virol36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)的)、MRC5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,ProcNatl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域诸如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的T细胞活化性双特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适合于T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码T细胞活化性双特异性抗体的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收T细胞活化性双特异性抗体。
T细胞活化性双特异性抗体的组分彼此遗传融合。T细胞活化性双特异性抗体可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法确定接头的组成和长度，并可以测试功效。T细胞活化性双特异性抗体不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还可包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合物的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗体的一个或多个抗原结合模块至少包含能够结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区能形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分及自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,a laboratory manual”,Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区用于本发明的T细胞活化性双特异性抗体。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区可以是鼠、灵长类或人起源的。如果T细胞活化性抗体意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988);Queen等,Proc Natl Acad Sci USA86,10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Jones等,Nature321,522-525(1986);Morrison等,ProcNatl Acad Sci81,6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv Immunol44,65-92(1988);Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun31(3),169-217(1994);Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接);Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”);Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”);和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分及自其衍生(参见例如Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005))。还可以通过分离自人衍生的噬菌体展示库选择的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods inMolecular Biology178,1-37(O’Brien等编,人Press,Totowa,NJ,2001);和McCafferty等,Nature348,552-554;Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中，将本发明的双特异性抗体工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变域，例如与V9抗体竞争对CD3的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”于Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体(例如V9抗体)和测试其与第一经抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的T细胞活化性双特异性抗体，所述技术诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，可以使用T细胞活化性双特异性抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的T细胞活化性双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以连续使用蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离T细胞活化性双特异性抗体，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定T细胞活化性双特异性抗体的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的双特异性抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的双特异性抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定分别与特定抗TA抗体或对T细胞活化性抗原特异性的抗体竞争对肿瘤抗原(TA)或T细胞活化性抗原的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与特定抗TA抗体或对T细胞活化性抗原特异性的抗体所结合表位相同的表位（例如线性或构象表位）。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体的测定法。生物学活性可包括例如靶细胞的裂解或凋亡的诱导。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的双特异性抗体测试此类生物学活性。用于检测细胞裂解（例如通过测量LDH释放）或凋亡（例如使用TUNEL测定法）的测定法是本领域公知的。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素（例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段）、或放射性同位素缀合的本文中的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱（见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1）；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF（MMAE和MMAF）（见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物（见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993);及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998)）；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)（见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美国专利No.6,630,579）；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的双特异性抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的双特异性抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像（又称为磁共振成像，mri）用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成双特异性抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的（例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体可用于检测生物学样品中T细胞活化性抗原和/或肿瘤抗原(TA)的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中T细胞活化性抗原3和/或肿瘤抗原(TA)的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体结合T细胞活化性抗原和/或肿瘤抗原(TA)的条件下使生物学样品与本文中描述的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体接触，并检测是否在结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体与T细胞活化性抗原和/或肿瘤抗原(TA)之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体来选择适合用结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体治疗的受试者，例如其中肿瘤抗原(TA)是一种用于选择患者的生物标志。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症。
在某些实施方案中，提供了经标记的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块（诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物），及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶（美国专利No.4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶（其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联）、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类双特异性抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(,Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。
在一个方面，提供了作为药物使用的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在又一些方面，提供了在治疗癌症中使用的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症的个体的方法中使用的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，所述治疗包括对个体施用有效量的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在又一方面，本发明提供了结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有癌症的个体施用有效量的结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以在疗法中单独或与其它药剂组合使用本发明的双特异性抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的双特异性抗体。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用（其中两种或更多种治疗剂包含在相同配制剂或分开的配制剂中），和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或辅助剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的双特异性抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的双特异性抗体（和任何别的治疗剂）。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的双特异性抗体会以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。双特异性抗体无需但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以本文所述相同的剂量和给药途径使用，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验/临床确定为合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量会取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予双特异性抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对双特异性抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg（例如0.1mg/kg-10mg/kg）的双特异性抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次分开的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗通常会持续直至出现病症得到期望的抑制为止。双特异性抗体以一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或它们的任意组合）的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周(例如使得患者得到约2-约20剂，或例如约6剂双特异性抗体)。可给予初始较高的加载剂量，接着给予较低的一或多剂。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体或在结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口（例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二（或第三）容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
实施例1：Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)的制备
将所得重链和轻链可变区DNA序列亚克隆入各自接受者哺乳动物表达载体中，符合预插入的恒定重链或恒定轻链的框架。抗体表达由MPSV启动子驱动且在CDS的3’末端携带合成polyA信号序列。此外，各个载体都包含EBV OriP序列。
使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生所述分子。通过磷酸钙方法转染指数生长中的HEK293-EBNA细胞。或者，用聚乙撑亚胺转染悬浮液中生长的HEK293-EBNA细胞。用相应的表达载体以1:1:1的比例（“载体CH1-VH–CK-VH”：“载体轻链”：“载体轻链CH1-VL”）转染细胞。
对于使用磷酸钙的转染，细胞在T烧瓶中使用补充有10%(v/v)FCS的DMEM培养基作为贴壁单层培养物进行培养，并在它们达到50%至80%汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1.5x107个细胞接种于25ml补充有FCS（终浓度10%v/v）的DMEM培养基中，然后将细胞在具有5%CO2气氛的培养箱中于37℃放置过夜。对于待转染的每个T150烧瓶，通过将以相应比例分配的94μg总质粒载体DNA、终体积469μl的水和469μl的1M CaCl2溶液混合来制备DNA、CaCl2和水的溶液。在此溶液中加入938μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4的pH7.05的溶液，立即混合10秒并室温放置20秒。将悬浮液用10ml补充有2%(v/v)FCS的DMEM稀释，并加入T150，替换现有的培养基。然后加入另外的13ml转染培养基。将细胞于37℃、5%CO2温育约17至20小时，然后用25ml DMEM、10%FCS替换培养基。在培养基替换后约7天，通过210xg离心15分钟收获条件化培养液，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%(w/v)的叠氮化钠，并4℃保存。
对于使用聚乙撑亚胺的转染，将HEK293EBNA细胞无血清悬浮培养于CD CHO培养基中。对于500ml烧瓶生产，在转染前24小时接种4x108个HEK293EBNA细胞。为了进行转染，将细胞210xg离心5分钟，用预热的20mlCD CHO培养基替换上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终200μg DNA的量。加入540μl PEI后，将溶液漩涡震动15秒并随后室温温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml烧瓶并在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育时间后加入160ml F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天加入1mM丙戊酸(valporic acid)和7%Feed1(Lonza)。7天后通过210xg离心15分钟收集培养物上清液供纯化用，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并加入终浓度0.01%w/v的叠氮化钠，并4℃保存。
利用蛋白A和蛋白G亲和层析通过亲和层析及随后通过大小排阻层析步骤从细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到与HiTrap蛋白G HP柱（CV=5ml，GE Healthcare）偶联的HiTrap蛋白A HP柱（CV=5ml，GE Healthcare）上，每个柱子已用30ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5清洗两个柱子来去除未结合的蛋白质。随后另外必需的洗涤步骤是用至少8个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5只清洗HiTrap蛋白G HP柱。用7个柱体积的8.8mM甲酸pH3.0通过逐步梯度将靶蛋白从HiTrap蛋白G HP柱上洗脱。加入1/10的0.5M磷酸钠pH8.0中和蛋白质溶液。浓缩靶蛋白并过滤，然后加载到用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸的pH6.7的溶液平衡的HiLoad Superdex200柱（GE Healthcare）上。
利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过测量280nm的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过存在和缺失还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)下的SDS-PAGE并用考马斯（SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen）染色来分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书（4-12%Tris-乙酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris）使用预制凝胶系统（Invitrogen，USA）。利用Superdex20010/300GL分析性大小排阻柱（GEHealthcare，Sweden）在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3的pH7.3的运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量。
例示性Fab-Crossfab分子（由三条链组成：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)=SEQ IDNO:25，VLCL(MCSP)=SEQ ID NO:17和VHCL(CD3V9)=SEQ ID NO:23；具有图1a中所示的取向）的产生和纯化分析如图2和3中所示。此分子进一步称作Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)或huFab(MCSP)-Crossfab(CD3)。
实施例2：Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)和Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)的制备
将所得重链和轻链可变区DNA序列亚克隆入各自接受者哺乳动物表达载体中，符合预插入的恒定重链或恒定轻链的框架。抗体表达由MPSV启动子驱动且在CDS的3’末端携带合成polyA信号序列。此外，每个载体都包含EBV OriP序列。
使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生所述分子。通过磷酸钙方法转染指数生长中的HEK293-EBNA细胞。或者，用聚乙撑亚胺转染悬浮液中生长的HEK293-EBNA细胞。用相应的表达载体以1:2:1的比例（“载体CH1-VH–CH1-VH–CK-VH”：“载体轻链”：“载体轻链CH1-VL”）转染细胞。
对于使用磷酸钙的转染，细胞在T烧瓶中使用补充有10%(v/v)FCS的DMEM培养基作为贴壁单层培养物进行培养，并在它们达到50%至80%汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1.5x107个细胞接种于25ml补充有FCS（终浓度10%v/v）的DMEM培养基中，然后将细胞在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃放置过夜。对于待转染的每个T150烧瓶，通过将以相应比例分配的94μg总质粒载体DNA、终体积469μl的水和469μl的1MCaCl2溶液混合来制备DNA、CaCl2和水的溶液。在此溶液中加入938μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mMNa2HPO4的pH7.05的溶液，立即混合10秒并室温放置20秒。将悬浮液用10ml补充有2%(v/v)FCS的DMEM稀释，并加入T150，替换现有的培养基。然后加入另外的13ml转染培养基。将细胞于37℃、5%CO2温育约17至20小时，然后用25ml DMEM、10%FCS替换培养基。在培养基替换后约7天，通过210xg离心15分钟收获条件化培养基，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%(w/v)的叠氮化钠，并4℃保存。对于使用聚乙撑亚胺的转染，将HEK293EBNA细胞无血清悬浮培养于CD CHO培养基中。对于500ml摇瓶生产，在转染前24小时接种4x108个HEK293EBNA细胞。为了进行转染，将细胞210xg离心5分钟，用预热的20ml CD CHO培养基替换上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终200μg DNA的量。加入540μl PEI后，将溶液漩涡震动15秒并随后室温温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶中并在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育时间后加入160ml F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天加入1mM丙戊酸和7%Feed1(Lonza)。7天后通过210xg离心15分钟收集培养物上清液供纯化用，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%w/v的叠氮化钠，并4℃保存。
利用蛋白A和蛋白G亲和层析通过亲和层析及随后通过大小排阻层析步骤从细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。
对于亲和层析而言，将上清液加载到与HiTrap蛋白G HP柱（CV=5ml，GEHealthcare）偶联的HiTrap蛋白A HP柱）CV=5ml，GE Healthcare（上，每个柱子已用30ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5清洗两个柱子来去除未结合的蛋白质。随后另外必需的清洗步骤是用至少8个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5只清洗HiTrap蛋白G HP柱。用7个柱体积的8.8mM甲酸pH3.0通过逐步梯度将靶蛋白从HiTrap蛋白G HP柱上洗脱。加入1/10的0.5M磷酸钠pH8.0中和蛋白质溶液。浓缩靶蛋白并过滤，然后加载到用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸的pH6.7的溶液平衡的HiLoad Superdex200柱（GE Healthcare）上。
利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过测量280nm的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过存在和缺失还原剂（5mM1,4-二硫苏糖醇）下的SDS-PAGE并用考马斯（SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen）染色来分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书（4-12%Tris-乙酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris）使用预制凝胶系统（Invitrogen，USA）。利用Superdex20010/300GL分析性大小排阻柱（GEHealthcare，Sweden）在2mM MOPS，150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3的pH7.3的运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量并与现有技术的抗体片段(scFv)2进行比较（结果见下表）。
HMW=高分子量；LMW=低分子量
例示性Fab-Fab-Crossfab分子（由四条链组成：VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)=SEQ ID NO:26，两条VLCL(MCSP)链=SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD3V9)链=SEQ IDNO:23；具有图1c中所示的取向）的产生和纯化的分析如图4和5中所示。此分子进一步称作Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)或hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)。
例示性Fab-Crossfab-Fab分子（由四条链组成：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)-VHCH1(MCSP)=SEQ ID NO:27，两条VLCL(MCSP)链=SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD3V9)链=SEQ IDNO:23；具有图1e中所示的取向）的产生和纯化的分析如图6和7中所示。此分子进一步称作Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)或hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)。
例示性Crossfab-Fab-Fab分子（由四条链组成：VLCH1(CD32C11)-VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)=SEQ ID NO:42，两条VLCL(MCSP)链=SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD32C11)链=SEQ ID NO:43；具有图1d中所示的取向）的产生和纯化的分析如图8和9中所示。此分子进一步称作鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)。
实施例3：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)的制备
将所得重链和轻链可变区DNA序列亚克隆入各自接受者哺乳动物表达载体中，符合预插入的恒定重链或恒定轻链的框架。抗体表达由MPSV启动子驱动且在CDS的3’末端携带合成polyA信号序列。此外，每个载体都包含EBV OriP序列。
使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生所述分子。通过磷酸钙方法转染指数生长中的HEK293-EBNA细胞。或者，用聚乙撑亚胺转染悬浮液中生长的HEK293-EBNA细胞。用相应的表达载体以1:1:1的比例（“载体CH1-VH–CK-VH”：“载体轻链”：“载体轻链CH1-VL”）转染细胞。
对于使用磷酸钙的转染，细胞在T烧瓶中使用补充有10%(v/v)FCS的DMEM培养基作为贴壁单层培养物进行培养，并在它们达到50%至80%汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1.5x107个细胞接种于25ml补充有FCS（终浓度10%v/v）的DMEM培养基中，然后将细胞在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃放置过夜。对于待转染的每个T150烧瓶，通过将以相应比例分配的94μg总质粒载体DNA、终体积469μl的水和469μl的1M CaCl2溶液混合来制备DNA、CaCl2和水的溶液。在此溶液中加入938μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mMNa2HPO4的pH7.05的溶液，立即混合10秒并室温放置20秒。将悬浮液用10ml补充有2%(v/v)FCS的DMEM稀释，并加入T150，替换现有的培养基。然后加入另外的13ml转染培养基。将细胞于37℃、5%CO2温育约17至20小时，然后用25ml DMEM、10%FCS替换培养基。在培养基替换后约7天，通过210xg离心15分钟收获条件化培养基，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%(w/v)的叠氮化钠，并4℃保存。
对于使用聚乙撑亚胺的转染，将HEK293EBNA细胞无血清悬浮培养于CD CHO培养基中。对于500ml摇瓶生产，在转染前24小时接种4x108个HEK293EBNA细胞。为了进行转染，将细胞210xg离心5分钟，用预热的20ml CD CHO培养基替换上清液。将表达载体在20ml CDCHO培养基中混合至最终200μg DNA的量。加入540μl PEI后，将溶液漩涡震动15秒并随后室温温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶中并在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育时间后加入160ml F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天加入1mM丙戊酸和7%Feed1(Lonza)。7天后通过210xg离心15分钟收集培养物上清液供纯化用，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%w/v的叠氮化钠，并4℃保存。
利用蛋白A和蛋白G亲和层析通过亲和层析及随后通过大小排阻层析步骤从细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。
对于亲和层析而言，将上清液加载到与HiTrap蛋白G HP柱（CV=5ml，GEHealthcare）偶联的HiTrap蛋白A HP柱（CV=5ml，GE Healthcare）上，每个柱子已用30ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5清洗两个柱子来去除未结合的蛋白质。随后另外必需的清洗步骤是用至少8个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5只清洗HiTrap蛋白G HP柱。用7个柱体积的8.8mM甲酸pH3.0通过逐步梯度将靶蛋白从HiTrap蛋白G HP柱上洗脱。加入1/10的0.5M磷酸钠pH8.0中和蛋白质溶液。浓缩靶蛋白并过滤，然后加载到用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸的pH6.7的溶液平衡的HiLoad Superdex200柱（GE Healthcare）上。
利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过测量280nm的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过存在和缺失还原剂（5mM1,4-二硫苏糖醇）下的SDS-PAGE并用考马斯（SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen）染色来分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书（4-12%Tris-乙酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris）使用预制凝胶系统（Invitrogen，USA）。利用Superdex20010/300GL分析性大小排阻柱（GEHealthcare，Sweden）在2mM MOPS，150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3的pH7.3的运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量。
例示性Fab-Crossfab分子（由三条链组成：VHCH1(CD33)-VLCH1(CD3V9)=SEQ IDNO:102，VLCL(CD33)=SEQ ID NO:100和VHCL(CD3V9)=SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:101；具有图1a中所示的取向）的产生和纯化的分析如图17和18中所示。此分子进一步称作Fab(CD33)-CrossFab(CD3)或huFab(CD33)-CrossFab(CD3)。
实施例4：参照分子(scFv)2的制备
克隆和产生
将所得重链和轻链可变区DNA序列亚克隆入各自接受者哺乳动物表达载体中。抗体表达由MPSV启动子驱动且在CDS的3’末端携带合成polyA信号序列。此外，每个载体都包含EBV OriP序列。
使用聚乙撑亚胺用哺乳动物表达载体转染HEK293-EBNA细胞产生所述分子。将HEK293EBNA细胞无血清悬浮培养于CD CHO培养基中。对于500ml摇瓶生产，在转染前24小时接种4x108个HEK293EBNA细胞。为了进行转染，将细胞210xg离心5分钟，用预热的20ml CDCHO培养基替换上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终200μg DNA的量。加入540μl PEI后，将溶液漩涡震动15秒并随后室温温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶中并在具有5%CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育时间后加入160ml F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天加入1mM丙戊酸和7%Feed1(Lonza)。7天后通过210xg离心15分钟收集培养物上清液供纯化用，将溶液无菌过滤（0.22μm滤器）并加入终浓度0.01%w/v的叠氮化钠，并4℃保存。
(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3)的纯化
利用固定化金属离子亲和层析(IMAC)通过亲和层析及随后通过大小排阻层析步骤从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质。
在进行第一步纯化之前，用装备有5.000MWCO膜（Sartocon Slice Cassette，Hydrosart；Sartorius）的切向流过滤系统Sarcojet（Sartorius）通过渗滤从上清液中去除干扰成分。将上清液浓缩至210ml并随后稀释于1L20mM磷酸钠、500mM氯化钠pH6.5中。将蛋白质溶液再次浓缩至210ml。此过程重复两次以保证完全的缓冲液替换。
为了进行亲和层析，将渗滤过程的渗余物加载到用25ml20mM磷酸钠、500mM氯化钠、15mM咪唑pH6.5平衡的NiNTA Superflow Cartridge（CV=5mL，Qiagen）上。用至少2个柱体积的20mM磷酸钠、500mM氯化钠、15mM咪唑pH6.5清洗及随后再用3个柱体积的20mM磷酸钠、500mM氯化钠、62.5mM咪唑pH6.5清洗来去除未结合的蛋白质。在两个柱体积的20mM磷酸钠、500mM氯化钠、125mM咪唑pH6.5中洗脱靶蛋白。随后用20mM磷酸钠、500mM氯化钠、250mM咪唑pH6.5清洗柱。
将靶蛋白浓缩，然后加载到用25mM KH2PO4、125mM NaCl、200mM精氨酸pH6.7平衡的HiLoad Superdex75柱（GE Healthcare）上。
产量、第一步纯化后的聚集体含量和最终的单体含量如上表所示。第一步纯化后的聚集体含量的比较指示了Fab-Crossfab构建体与(scFv)2形成对照的卓越稳定性。
(scFv)2的表征
利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过测量280nm的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过存在和缺失还原剂（5mM1,4-二硫苏糖醇）下的SDS-PAGE并用考马斯（SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen）染色来分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书（4-12%Tris-乙酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris）使用预制凝胶系统(Invitrogen,USA)。利用Superdex7510/300GL分析性大小排阻柱（GEHealthcare，Sweden）在2mM MOPS，150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3的pH7.3的运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量。
(scFv)2分子的示意图如图21中所示。
例示性(scFv)2分子（抗MCSP/抗huCD3；由两个单链Fv组成：VL-VH(MCSP)和VH-VL(CD3V9)=SEQ ID NO:149）的产生和纯化的分析如图22和23中所示。此分子进一步称作(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)。
实施例5：从PBMC分离原代人泛T细胞
通过Histopaque密度离心从自当地血库或健康人供体新鲜血液获得的富集淋巴细胞制备物（血沉棕黄层(buffy coats)）制备外周血单个核细胞(PBMC)。
利用泛T细胞分离试剂盒II（Miltenyi Biotec#130-091-156）依照制造商的说明书实施自PBMC富集T细胞。简言之，将细胞团粒在每1千万个细胞40μl冷缓冲液（含0.5%BSA、2mM EDTA的PBS-无菌过滤）中稀释并与每1千万个细胞10μl生物素-抗体混合物一起4℃温育10分钟。
每1千万个细胞加入30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并将混合物于4℃再温育15分钟。
通过加入10-20倍标记体积并随后300g离心10分钟来清洗细胞。将多达1亿个细胞重悬于500μl缓冲液中。
用LS柱（Miltenyi Biotec#130-042-401）依照制造商的说明书实施未标记人泛T细胞的磁分离。对所得的T细胞群体进行自动计数（ViCell）并在37℃、5%CO2在培养箱中保存于AIM-V培养基中直至测定开始（不超过24小时）。
实施例6：从脾细胞分离鼠泛T细胞
从C57BL/6小鼠分离脾，转移入装有MACS缓冲液（PBS+0.5%BSA+2mM EDTA）的GentleMACS C管（Miltenyi Biotech#130-093-237）中并依照制造商的说明书用GentleMACS解离器进行解离以获得单细胞悬浮液。
使细胞悬浮液通过分离前滤器以去除残留的未解离组织颗粒。以400g在4℃离心4分钟后，加入ACK裂解缓冲液以裂解红血球（室温温育5分钟）。将残留的细胞用MACS缓冲液清洗两次，计数并用于分离鼠泛T细胞。用来自Miltenyi Biotec的泛T细胞分离试剂盒（#130-090-861）依照制造商的说明书实施负（磁）选择。对所得的T细胞群体进行自动计数（ViCell）并立即用于进一步的测定法。
实施例7：由交联的靶向T细胞上CD3和肿瘤细胞上MCSP的双特异性构建体介导的再定向T细胞细胞毒性（LDH释放测定法）
通过LDH释放测定法对靶向人或小鼠T细胞上CD3和人肿瘤细胞的双特异性构建体分析它们诱导T细胞介导的靶细胞凋亡的潜力。
简而言之，用细胞解离缓冲液（MCSP对胰蛋白酶敏感）或胰蛋白酶收获靶细胞（人Colo-38，人MDA-MB-435，人黑素瘤MV-3或鼠B16/F10-huMCSPFluc2克隆48细胞，都表达人MCSP）（然后在前一天铺展），清洗并重悬于恰当的细胞培养基中（见不同图的详述）。将每孔20,000–30,000个细胞铺于圆底96孔板中并如所指示的加入各自的抗体稀释液（一式三份）。加入效应器细胞以获得最终5:1（对于人泛T细胞）、10:1（对于人PBMC）的E:T比例。
此外，将1-10μg/ml自菜豆（Phaseolus vulgaris）分离的PHA-M（Sigma#L8902）（一种异凝集素混合物）用作致有丝分裂的刺激物来诱导人或猕猴T细胞活化。对于鼠T细胞，将“用ConA刺激的大鼠T细胞”（BD#354115）的5%溶液用作关于T细胞活化的阳性对照。
为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育实现靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃、5%CO2至少18小时的过夜温育后，用LDH检测试剂盒（Roche AppliedScience，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性 构建体进行的LDH释放测定法
对经过纯化的Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子分析它们在经由两种靶向模块与细胞上各自抗原结合的构建体交联时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导之凋亡的潜力。简而言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞，清洗并重悬于AIM-V培养基（Invitrogen#12055-091）中。将每孔30,000个细胞铺于圆底96孔板中并加入指示浓度的各自抗体稀释液。将所有构建体和对照都调节至相同摩尔浓度。
加入人泛T效应器细胞以获得最终5:1的E:T比例。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M（Sigma#L8902）。为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育测定靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃，5%CO2的20小时过夜温育后，用LDH检测试剂盒（Roche AppliedScience，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
如图10中所描绘的，具有二价MCSP靶向的构建体显示了与(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)构建体相比相当的细胞毒活性，而具有单价MCSP结合的Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)构建体明显效力较小。
用Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MDA-MB-435人黑素瘤 靶细胞进行的LDH释放测定法
对经过纯化的Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子分析它们在经由两种靶向模块与细胞上各自抗原结合的构建体交联时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导之凋亡的潜力。
简而言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞，清洗并重悬于AIM-V培养基（Invitrogen#12055-091）中。将每孔30,000个细胞铺于圆底96孔板中并加入指示浓度的各自抗体稀释液。将所有构建体和对照都调节至相同摩尔浓度。
加入人泛T效应器细胞以获得最终5:1的E:T比例。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用5μg/ml PHA-M（Sigma#L8902）。为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育测定靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃，5%CO2的21小时过夜温育后，用LDH检测试剂盒（Roche AppliedScience，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
如图11中所描绘的，Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)至少像(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子同样好的诱导了靶细胞中的凋亡。
用Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MV-3人黑素瘤靶细胞 进行的LDH释放测定法
对经过纯化的Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子分析它们在经由两种靶向模块与细胞上各自抗原结合的构建体交联时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导之凋亡的潜力。
简而言之，在LDH释放测定法开始前那天用胰蛋白酶收获表达huMCSP的MV-3人黑素瘤靶细胞。清洗细胞并重悬于恰当的细胞培养基中。将每孔30,000个细胞铺于圆底96孔板中。次日，弃上清并加入100μl/孔AIM-V培养基（Invitrogen#12055-091）以及指示浓度的各自抗体稀释液。将所有构建体和对照都调节至相同摩尔浓度。
加入人PBMC效应器细胞以获得最终10:1的E:T比例。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用5μg/ml PHA-M（Sigma#L8902）。为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育测定靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃，5%CO2的26小时过夜温育后，用LDH检测试剂盒（Roche AppliedScience，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
如图12中所描绘的，Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)至少像(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子同样好的诱导了靶细胞中的凋亡。
用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MV-3人黑素瘤靶细胞进行的LDH 释放测定法
如上所述实施LDH释放测定法。图19显示了在与人PBMC共培养（E:T比例=10:1），分别用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子处理约24小时时huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀死。
用鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)双特异性构建体进行的LDH释放测定 法
对经过纯化的靶向鼠CD3以及人MCSP的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)分析它在经由两种靶向模块与细胞上各自抗原结合的构建体交联时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导之凋亡的潜力。
简而言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的B16/F10-huMCSPFluc2克隆48肿瘤靶细胞，清洗并重悬于包括1x NEAA、10mM Hepes、50μm2-b-ME和1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基中。
将每孔20,000个细胞铺于圆底96孔板中并加入指示浓度的各自抗体稀释液。将双特异性构建体和不同IgG对照都调节至相同摩尔浓度。作为鼠T细胞活化的附加对照，使用“用ConA刺激的T细胞”（BD#354115），用测定媒介1:160稀释。
加入自脾细胞（C57BL/6小鼠）分离的鼠泛T效应器细胞以获得最终10:1的E:T比例。为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育测定靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃，5%CO2温育70小时后，用LDH检测试剂盒（Roche Applied Science，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
如图13中所描绘的，双特异性构建体诱导了来自靶细胞的浓度依赖性LDH释放，与阳性对照“用ConA刺激的T细胞”相当。
用鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)双特异性构建体进行的LDH释放测定 法
对经过纯化的靶向鼠CD3以及人MCSP的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)分析它在经由两种靶向模块与细胞上各自抗原结合的构建体交联时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导之凋亡的潜力。
简而言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤靶细胞，清洗并重悬于包括1x NEAA、10mM Hepes、50μm2-b-ME和1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基中。
将每孔20,000个细胞铺于圆底96孔板中并加入终浓度50nM的各自抗体稀释液。将双特异性构建体和不同IgG对照都调节至相同摩尔浓度。
加入自脾细胞（C57BL/6小鼠）分离的鼠泛T效应器细胞以获得最终10:1的E:T比例。为了评估在缺失靶细胞的情况下鼠T细胞的超活化水平，相应用50nM双特异性构建体和T细胞铺了对照孔。
为了标准化，通过将靶细胞与终浓度1%的Triton-X-100一起温育测定靶细胞的最大裂解（=100%）。最小裂解（=0%）指与效应器细胞共温育但没有任何构建体或抗体的靶细胞。
在37℃，5%CO2温育70小时后，用LDH检测试剂盒（Roche Applied Science，#11644793001）依照制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清液中的LDH。
如图14中所描绘的，双特异性构建体诱导了强烈的来自靶细胞的LDH释放。在缺失靶细胞的情况下，与靶细胞共温育的未处理鼠T细胞相比，只有轻微的LDH增加（反映了T细胞的超活化）。对照IgG无一诱导靶细胞的LDH释放。
实施例8：细胞因子释放测定法（CBA分析）
为了评估在存在或缺失靶细胞的情况下在用CD3双特异性构建体活化T细胞时不同细胞因子的从头分泌，从血沉棕黄层(buffy coat)分离人PBMC并将每孔30万个细胞铺于圆底96孔板中。或者，将280μl来自健康供体的全血铺于深孔96孔板的每个孔中。
加入肿瘤靶细胞（例如用于CD3-MCSP双特异性构建体的MDA-MB-435细胞）以获得10:1的最终E/T比例。如所指示的加入双特异性构建体和对照。在37℃，5%CO2温育长达24小时后，将测定平板350g离心5分钟，并将上清液转移至新的深孔96孔板中供随后的分析用。
依照制造商对FACS CantoII的说明书利用下述CBA Flex套组的组合实施CBA分析：人粒酶B（BD560304），人IFN-γFlex套组（BD558269），人TNF Flex套组（BD558273），人IL-10Flex套组（BD558274），人IL-6Flex套组（BD558276），人IL-4Flex套组（BD558272）。
用MCSP-CD3双特异性构建体进行的细胞因子释放测定法
对下述经过纯化的靶向人MCSP和人CD3的双特异性构建体分析它们在存在（A，B）与缺失（C，D）肿瘤靶细胞的情况下诱导T细胞介导之细胞因子从头分泌的能力：Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子。
简而言之，将280μl来自健康供体的全血铺于深孔96孔板的每个孔中。加入30,000个表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以及1nM终浓度的不同双特异性构建体和IgG对照。将细胞在37℃，5%CO2温育24小时，然后350xg离心5分钟。将上清液转移至新的深孔96孔板中供随后的分析用。
依照制造商对FACS CantoII的说明书使用下述CBA Flex套组的组合实施CBA分析：人粒酶B（BD560304），人IFN-γFlex套组（BD558269），人TNF Flex套组（BD558273），人IL-10Flex套组（BD558274），人IL-6Flex套组（BD558276），人IL-4Flex套组（BD558272）。
图15描绘了在存在（A，B）或缺失（C，D）Colo-38肿瘤细胞的情况下用1nM不同CD3-MCSP双特异性构建体（Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)）处理24小时后在上清液中测量的不同细胞因子水平。如所指示的在96孔板的每孔中加入280μl全血和30,000个Colo-38细胞。
在存在Colo-38肿瘤细胞的情况下在T细胞活化时分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFNγ。此外，在存在靶细胞的情况下在T细胞活化时粒酶B的水平有了很大的升高。总的来说，与其它双特异性构建体相比，在存在靶细胞的情况下(A和B)，(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)构建体略多一点的提升了TNF和IFNγ以及粒酶B的水平。
在存在（或缺失）靶细胞的情况下通过双特异性构建体活化T细胞时没有显著的Th2细胞因子（IL-10和IL-4）分泌。
在此测定法中，在缺失靶细胞的情况下还有微弱的Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)构建体诱导的IFNγ分泌。
用MCSP-鼠CD3双特异性构建体进行的细胞因子释放测定法
通过流式细胞术对经过纯化的huMCSP-muCD3靶向双特异性分子如鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)测试它在存在表达人MCSP的肿瘤细胞的情况下上调CD8+T细胞上晚期活化标志物CD25的潜力。
简而言之，用细胞解离缓冲液收获MCSP阳性B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤细胞，计数并检查其存活力。将细胞调整至每毫升RPMI1640培养基（包括1x NEAA，10mMHepes，50μm2-b-ME，1mM丙酮酸钠）中0.3x106个（可存活）细胞，用移液器在圆底96孔板的每个孔中加入100μl此细胞悬浮液（如所指示的）。在含有细胞的孔中加入50μl（经过稀释的）双特异性构建体以获得50nM的终浓度。从脾细胞（C57BL/6小鼠）分离人鼠T效应器细胞并调整至每毫升AIM-V培养基中3x106个（可存活）细胞。将50μl此细胞悬浮液加到测定板的每个孔中（见上文）以获得10:1的最终E:T比例。为了分析，若双特异性构建体只在存在表达huMCSP的靶细胞的情况下才能活化T细胞，则将含有50nM各自双特异性分子以及T效应器但没有靶细胞的孔包括在内。
在37℃，5%CO2温育70小时后，将细胞离心（5分钟，350xg）并用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗两次。
依照供应商的提议实施针对CD8a（大鼠IgG2a；克隆53-6.7；BioLegend#100712）和CD25（大鼠IgG2b；克隆3C7；BD#553075）的表面染色。用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗细胞两次，并用100μl/孔固定缓冲液（BD#554655）在4℃固定15分钟。
离心后，将样品重悬于200μl/孔含0.1%BSA的PBS中，并用FACS CantoII仪器（Software FACS Diva）进行分析。
图16显示了鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体只在存在靶细胞的情况下诱导CD25的上调。
实施例9：在双特异性构建体衔接时原代人T细胞上表面活化标志物的表达
为了检查唯有在存在肿瘤靶细胞的情况下CD3双特异性构建体的结合时T细胞的特异性活化，将原代人PBMC（如上文所述分离）在存在或缺失肿瘤抗原阳性靶细胞的情况下与指示浓度的双特异性构建体一起温育至少24小时。
简而言之，在含有huMCSP阳性靶细胞（MV-3肿瘤细胞）或培养基的平底96孔板的每个孔中加入3x105个原代人PBMC。最终效应器对靶细胞（E:T）比例为10:1。将细胞与指示浓度的CD3-MCSP双特异性构建体（Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，命名为“1+1无Fc”；和(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子，命名为“(scFv)2”）一起在37℃，5%CO2温育指定的温育时间。将效应器细胞针对CD8和早期活化标志物CD69或晚期活化标志物CD25染色并用FACSCantoII进行分析。
图20显示了此实验的结果。
虽然显示和描述了本发明当前优选的实施方案，但是要清楚地理解，本发明不限于此而是可以在所附权利要求书的范围内以其它方式多种多样地体现和实施。
序列
虽然显示和描述了本发明当前优选的实施方案，但是要清楚地理解，本发明不限于此而是可以在所述权利要求书的范围内以其它方式多种多样地体现和实施。图例：GA201=EGFR结合物，3F2=FAP结合物，CH1A1A=CEA结合物。
蛋白质序列
DNA序列
虽然显示和描述了本发明当前优选的实施方案，但是要清楚地理解，本发明不限于此而是可以在所述权利要求书的范围内以其它方式多种多样地体现和实施。

Claims (20)

1.一种特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含经由肽接头连接的第一Fab片段和第二Fab片段，其中或是第二Fab重和轻链的可变区是交换的或是第二Fab重和轻链的恒定区是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域使得重链恒定区仅仅由一个或多个CH1域组成，其中所述肽接头为(G4S)2接头。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点；且所述第二Fab片段包含至少一个对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中所述T细胞活化性抗原为CD3 T细胞共同受体(CD3)抗原。
4.权利要求1至3任一项的双特异性抗体，其中所述第二Fab片段的N端连接所述第一Fab片段的C端。
5.权利要求1至4任一项的双特异性抗体，其另外包含第三Fab片段。
6.权利要求5的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点。
7.权利要求5或6的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段连接所述第一Fab片段。
8.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段的C端连接所述第一Fab片段的N端。
9.权利要求5或6的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段连接所述第二Fab片段。
10.权利要求9的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段的N端连接所述第一Fab片段的C端。
11.权利要求5至10任一项的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段是经由肽接头连接的。
12.权利要求1至11任一项的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自下组：黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。
13.权利要求12的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原为MCSP。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1至13任一项的双特异性抗体。
15.权利要求1至13任一项的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
16.权利要求1至13任一项的双特异性抗体，其用作药物。
17.权利要求1至13任一项的双特异性抗体在制备药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
19.一种原核或真核宿主细胞，其包含载体，该载体包含编码权利要求1至13任一项的双特异性抗体的轻链和重链的核酸分子。
20.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求19的宿主细胞，使得该抗体生成。
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