CN113260379B - 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113260379B
CN113260379B CN201980082578.7A CN201980082578A CN113260379B CN 113260379 B CN113260379 B CN 113260379B CN 201980082578 A CN201980082578 A CN 201980082578A CN 113260379 B CN113260379 B CN 113260379B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
val
gly
thr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980082578.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113260379A (zh
Inventor
陈维灶
汪艳平
孝作祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd filed Critical Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202110994153.2A priority Critical patent/CN113603783B/zh
Publication of CN113260379A publication Critical patent/CN113260379A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113260379B publication Critical patent/CN113260379B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/82—Colon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了重组双特异性抗体，其设计成结合靶细胞上的表面抗原和免疫细胞如T细胞上的活化组分。双特异性抗体包含两条多肽链，其含有Fv和Fab作为抗原结合片段以及经修饰的Fc区，以促进异源二聚体形成。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步包含蛋白酶切割位点和/或基序，其将引起抗原结合位点的空间闭塞，使得抗体仅在特定的环境中，例如在肿瘤附近才得以激活。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含经修饰的序列，其赋予对CD3的结合亲和力降低和/或来自不同物种的细胞的CD3的交叉反应性结合。

Description

蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
相关申请的交叉引用
该国际申请要求享有2018年12月21日提交的美国临时专利申请第 62/783,411号和2019年3月7日提交的美国临时专利申请第62/815,132号的优先权。
背景技术
抗体是丙种球蛋白，主要称为免疫球蛋白(Ig)。单体抗体由两条重链和两条轻链组成。多肽链的氨基端末端在氨基酸组成上显示出相当大的变化，并被称为可变(V)结构域/区域，以将它们与相对恒定的(C)结构域/区域区分开。每条轻链具有可变结构域和恒定结构域。每条重链具有四个结构域：可变结构域和恒定结构域1、2和3。抗原结合位点位于Fab(抗原结合片段)区中，该区域包括轻链可变结构域(VL)，重链可变结构域(VH)，轻链恒定结构域(CL) 和重链恒定结构域1(CH1)。轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)的组合称为Fv(可变片段)区。抗体的Fc(可结晶片段)区包括重链恒定结构域2和3 (CH2和CH3)。
每个可变结构域含有三个高变环，称为互补决定区(CDR)，均匀分布在四个可变程度较低的框架(FR)区之间。正是CDR提供了抗体表面上的特异性抗原识别位点，并且这些区域的高度可变性使抗体能够识别几乎无限数量的抗原。重链和轻链通过非共价相互作用和共价链间二硫键的组合而保持在一起，从而形成两侧对称的结构。铰链区是第一和第二恒定结构域(CH1和CH2) 之间的重链区域，并通过二硫键保持在一起。该柔性铰链区允许两个抗原结合位点之间的距离发生变化。
在各种临床环境如癌症疗法中，经常期望选择性破坏单个靶细胞或特定靶细胞类型。实现此目的的一种方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，例如通过使免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。在这方面，近年来，设计成结合靶细胞上表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的激活不变组分的双特异性抗体已成为人们关注的问题。此类抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，从而引起细胞毒性T细胞的活化和随后靶细胞的裂解。因此，免疫应答重新定向至靶细胞，并且与正常MHC限制的CTL活化一样，不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性。
随着基因和蛋白质工程技术的最新发展，双特异性抗体(BsAb)如BiTE 已经出现，显示出有希望的应用。BiTE(双特异性T细胞衔接器)是一种融合蛋白类型，其具有两个单链抗体可变片段(scFv)，其中一个靶向CD3，另一个靶向肿瘤抗原，并通过(G4S)3多肽接头接合。在不存在Fc的情况下，这些抗体不能用蛋白A和G纯化，并且体内半衰期短。因此，在临床使用中需要连续输注。而且，单链形式的双特异性抗体(scFv)及其变体具有容易聚集的问题。
还存在其他双特异性抗体技术。Roche CrossMab含有Fc，并因此具有比 BiTE长得多的体内半衰期。CrossMab使用突起-进入-凹洞(knob-in-hole)技术进行Fc异源二聚化，但其无法产生100％异源二聚体抗体。在CrossMab中，使用野生型IgG1 Fc和铰链，其使CrossMab能够结合所有表达Fc受体(FcR)的细胞，如巨噬细胞。结果，T细胞将不仅杀伤癌细胞，而且会杀伤表达FcR 的细胞，从而导致称为淋巴细胞减少症的副作用。
来自Xencor Inc.和Synimmune GMBH的双特异性抗体包含分别与Fc多肽的N端和C端连接的两个抗原结合结构域。N端和C端处两个结合位点之间的长距离不利于诱导免疫突触，如在自然细胞毒性T细胞识别过程中形成的突触。
Amgen开发的蛋白酶可激活的双特异性蛋白质(美国专利申请公开号 2017/0247476)使用两个scFv作为抗原结合片段，CD3ε结构域以掩蔽CD3结合， CH1-CL用于异源二聚化，以及野生型IgG Fc或具有异源二聚体变化(如突起- 进入-凹洞突变)的Fc以延长半衰期。但是，使用scFv可能导致蛋白质的聚集和不稳定。尽管CH1-CL已用作异源二聚化支架来生成双特异性抗体或多价融合蛋白，但需要VH-VL和CH1-CL界面之间的协同以实现相互稳定。据报道，在不存在VH-VL的情况下，CH1-CL不足以产生异源二聚体产物。此外，具有当前已知的异源二聚化改变的Fc不能完全形成异源二聚体。
由Roche开发的蛋白酶激活的T细胞双特异性分子(国际申请公开号 WO2017/162587)基于上述CrossMab平台，并使用独特型特异性scFv作为掩蔽部分来阻断CD3抗体的结合。该设计继承了与上述CrossMab平台和scFv片段相关的缺点。
国际申请号PCT/US18/43232公开了靶向FLT3和CD3两者的双特异性抗体，其中双特异性抗体包括与抗FLT3抗体的Fab融合的抗CD3抗体的单链可变片段(scFv)。但是，对于CD3和FLT3的结合结构域未被掩蔽，且未掺入蛋白酶敏感的多肽接头。
具有改善的药代动力学性质的双特异性抗体将是理想的，以消除对连续给药的需要。但是，较长的半衰期可能导致T细胞活化时间延长或定位不良，从而导致不良副作用。因此，本领域需要如下双特异性抗体形式，其具有相当长的半衰期，但是在疾病微环境中例如在肿瘤附近被特异性激活。
发明概述
本发明提供了重组双特异性抗体，其设计成结合靶细胞上的表面抗原和免疫细胞如T细胞上的激活组分。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含作为抗原结合片段的Fv和Fab和经修饰的Fc区，其导致包括100％异源二聚体的最终产物的优异性能，高产率，高稳定性，低聚集倾向和延长的半衰期。在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体还可以包含蛋白酶切割位点和/或基序，其将引起抗原结合位点的空间闭塞，使得抗体仅在特定的环境中(例如，在肿瘤附近)被激活。
在一个实施方案中，本发明提供了重组双特异性抗体，其包含
(i)第一多肽，其从N至C端包含第一轻链可变结构域，人轻链恒定区(CL)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
(ii)第二多肽，其从N至C端包含第一重链可变结构域，人重链恒定区1 (CH1)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；和
(iii)通过第一接头与第一轻链可变结构域连接的第二轻链可变结构域，以及通过第二接头与第一重链可变结构域连接的第二重链可变结构域；或
通过第一接头与第一多肽的CH3的C端连接的第二轻链可变结构域，以及通过第二接头与第二多肽的CH3的C端连接的第二重链可变结构域，
其中第一轻链可变结构域和第一重链可变结构域赋予对第一抗原的结合特异性，第二轻链可变结构域和第二重链可变结构域赋予对第二抗原的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体进一步包含异源二聚化基序或长柔性基序，其中异源二聚化基序或长柔性基序经由一个或多个接头连接至第二轻链可变结构域和第二轻链可变区的N端。
在一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体进一步包含赋予对T细胞上CD3降低的结合亲和力的经修饰的序列。在另一个实施方案中，本文公开的重组双特异性抗体具有对CD3的交叉反应性结合，例如对人和食蟹猴 CD3的结合。
本发明还提供了编码本文公开的重组双特异性抗体的一个或两个多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明还包括包含上述多核苷酸的表达载体。在又一个实施方案中，本发明还包括包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了使用上述多核苷酸或表达载体制备本文公开的重组双特异性抗体的方法。
附图简要说明
图1A显示本发明的蛋白酶可切割的双特异性抗体的一个实施方案的实例的示意图。
图1B显示本发明的蛋白酶可切割的双特异性抗体的另一个实施方案的实例的示意图。
图2A显示在不存在或存在肿瘤相关蛋白酶的情况下，本发明的双特异性抗体的作用机制。星形表示减少或消除Fc同源二聚化的突变。所有未标记的模块具有与图1A-B中相同的含义。
图2B显示本发明的双特异性抗体在循环中(左图)和在肿瘤组织中(右图) 的作用机制。星形表示减少或消除Fc同源二聚化的突变。所有未标记的模块具有与图1A-B中相同的含义。
图3显示能够与EGFR和CD3结合的本发明的双特异性抗体的示意图。不管其分子量如何，将含有抗CD3 VH-CH1序列的抗体多肽链称为重链，将具有抗CD3 VL-CL序列的抗体多肽链称为轻链。星形表示减少或消除Fc同源二聚化的突变。proBiTE：蛋白酶可切割的双特异性T细胞衔接器；HBiTE：H 形双特异性T细胞衔接器；iBiTE：I形双特异性T细胞衔接器。
图4显示双特异性抗体EGFR×CD3 proBiTE的表达和纯化。标准物的分子质量显示在左侧。
图5显示用肿瘤相关蛋白酶切割proBiTE。标准物的分子质量显示在左侧。 uPA和抗EGFR抗体的分离VL结构域由右侧箭头指示。
图6显示proBiTE的尺寸排阻色谱。顶部的箭头表示在PBS(pH7.4)中分子质量标准物的洗脱体积：铁蛋白(440kDa)，醛缩酶(158kDa)和伴清蛋白(75 kDa)。
图7显示如通过流式细胞术所测量的，双特异性抗体对细胞表面相关的 EGFR和CD3的结合亲和力。MFI，平均荧光强度。
图8显示如通过流式细胞术所测量的，proBiTE与细胞表面EGFR和CD3 的结合。每幅图中左侧的描图(tracing)代表参考细胞，其仅与二抗(FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育。每幅图右侧的描图代表实验组，其中首先将细胞与浓度为2μg/mL的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图9显示如流式细胞术所测量的，预切割的proBiTE与细胞表面EGFR和 CD3的结合。每幅图中左侧的描图代表参考细胞，其仅与二抗(FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育。每幅图右侧的描图代表实验组，其中首先将细胞与浓度为2μg/mL的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图10显示如通过流式细胞术所测量的，完整和经切割的proBiTE-1与细胞表面EGFR和CD3的结合。
图11显示如通过流式细胞术所测量的，预结合然后切割的proBiTE-1与细胞表面EGFR的结合。每幅图左侧的描图代表参考细胞，其仅与二抗(FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育。每幅图右侧的描图代表实验组，其中在不存在或存在uPA的情况下，首先将细胞与完整或预切割的浓度为2μg/mL 的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图12显示通过流式细胞术表征几种人结肠癌细胞系在细胞表面上的 EGFR表达。
图13显示iBiTE对T细胞的活化。根据制造商的说明，通过Promega T细胞活化生物测定系统评估了在存在EGFR表达细胞的情况下iBiTE激活人T细胞的能力和特异性。
图14显示proBiTE对T细胞的短期活化。根据制造商的说明，通过Promega T细胞活化生物测定系统评估了ProBiTE在与表达EGFR的人结肠癌细胞温育的短时段(5小时)期间活化人T细胞的能力。
图15显示在存在人PBMC的情况下，双特异性抗体对HCT116细胞的杀伤。靶细胞(HCT116)和效应细胞(PBMC)的比率为1:5。温育72小时后拍摄代表性图像。
图16显示在存在人PBMC的情况下，双特异性抗体对HT29细胞的杀伤。靶细胞(HT29)和效应细胞(PBMC)的比率为1:5。温育72小时后拍摄代表性图像。
图17显示在存在人PBMC的情况下，双特异性抗体对用红色萤火虫萤光素酶稳定转染的HT29细胞的杀伤。靶细胞(HT29)和效应细胞(PBMC)的比率为1:5。温育72小时后测量萤光素酶活性。
图18显示proBiTE-1与重组人Fc gamma受体(FcγR)的ELISA结合。
图19显示NOD/SCID小鼠中双特异性抗体的药代动力学。
图20A-B显示移植有人PBMC和结肠癌细胞系HCT116的NOD/SCID小鼠中proBiTE-12的抗肿瘤活性。图20A显示肿瘤组织的宏观外观。图20B显示平均肿瘤重量。
图21显示用uPA对proBiTE-1变体的切割。标准物的分子质量显示在左侧。 uPA和抗EGFR抗体的分离VL结构域由右侧箭头指示。
图22显示proBiTE-1变体的尺寸排阻色谱。顶部的箭头表示在PBS(pH7.4) 中分子质量标准物的洗脱体积：铁蛋白(440kDa)，醛缩酶(158kDa)和伴清蛋白(75kDa)。
图23显示如通过流式细胞术所测量的，proBiTE-1变体与细胞表面EGFR 和CD3的结合。每幅图左侧的描图代表参考细胞，其仅与二抗(FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育。每幅图右侧的描图代表实验组，其中首先将细胞与浓度为2μg/mL的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图24显示在存在人PBMC的情况下，proBiTE-1变体对用红色萤火虫萤光素酶稳定转染的HCT116和HT29细胞的杀伤。靶细胞和效应细胞(PBMC)的比率为1:5。温育72小时后测量萤光素酶活性。
图25显示具有双重抗原结合位点的空间受限进入的蛋白酶可切割的双特异性抗体(dproBiTE)的各种实施方案的实例的示意图。
图26显示dproBiTE的作用机制。所有未标记的模块具有与图25中相同的含义。
图27显示EGFR×CD3 dproBiTE的示意图。不管其分子量如何，将含有抗 CD3 VH-CH1序列的抗体多肽链称为重链，并将具有抗CD3 VL-CL序列的抗体多肽链称为轻链。星形表示减少或消除Fc同源二聚化的突变。
图28A-B显示dproBiTE-HE和dproBiTE-GS的SDS-PAGE的结果。图28A 显示完整的dproBiTE，而图28B显示蛋白酶切割的dproBiTE。标准物的分子质量显示在左侧。
图29显示dproBiTE-HE和dproBiTE-GS的尺寸排阻色谱。顶部的箭头表示在PBS(pH7.4)中分子质量标准物的洗脱体积：铁蛋白(440kDa)，醛缩酶(158 kDa)和伴清蛋白(75kDa)。
图30显示如通过流式细胞术所测量的，dproBiTE-HE和dproBiTE-GS与细胞表面EGFR和CD3的结合。每幅图左侧的描图代表参考细胞，其仅与二抗 (FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育。每幅图右侧的描图代表实验组，其中首先将细胞与浓度为2μg/mL的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图31显示如通过流式细胞术所测量的，所选择的抗EGFR抗体(SMET5 Fab)与细胞表面EGFR的结合。
图32显示通过轻链改组的SMET5 Fab变体的亲和力成熟。
图33显示SMET5变体的SDS-PAGE的结果。
图34显示SMET5变体的尺寸排阻色谱。顶部的箭头表示在PBS(pH7.4) 中分子质量标准物的洗脱体积：铁蛋白(440kDa)，醛缩酶(158kDa)和伴清蛋白(75kDa)。
图35显示SMET5变体与重组人和食蟹猴EGFR的ELISA结合。
图36显示如通过流式细胞术所测量的，SMET5变体与细胞表面EGFR的结合。
图37显示如通过流式细胞术测量的，EGF和SMET5变体竞争结合至细胞表面EGFR。
图38显示NOD/SCID小鼠中SMET5.2 IgG1的药代动力学。
图39显示在移植有人PBMC和A431细胞的NOD/SCID小鼠中SMET5.2 IgG1的抗肿瘤活性。
图40显示具有对CD3交叉反应性结合的蛋白酶可切割或不可切割的双特异性EGFR×CD3抗体的示意图。IgG1 mFc CH3结构域中的星形表示T366L 和Y407H取代。抗CD3 VH结构域中的星形表示V105A和N111.1S取代。
图41显示使用IMGT/V-QUEST对hSP34重链CDR3(HCDR3)序列的分析。上图显示hSP34 HCDR3 V、D和J区的核苷酸序列与最接近的种系人抗体序列的序列比对。下图显示hSP34 HCDR3的氨基酸序列与种系人抗体的氨基酸序列的比对。与相应的种系序列相比，突变的核苷酸和氨基酸序列用下划线标出。
图42显示双特异性EGFR×CD3抗体的表达和纯化。标准物的分子质量显示在左侧。
图43显示用肿瘤相关蛋白酶uPA切割双特异性EGFR×CD3抗体。标准物的分子质量显示在左侧。uPA和抗EGFR抗体的分离VL结构域由右侧箭头指示。
图44显示双特异性EGFR×CD3抗体的尺寸排阻色谱。顶部的箭头表示在 PBS(pH7.4)中分子质量标准物的洗脱体积：铁蛋白(440kDa)，醛缩酶(158 kDa)和伴清蛋白(75kDa)。
图45显示双特异性EGFR×CD3抗体与重组人EGFR(hEGFR)和无关抗原 HER4(hHER4)的ELISA结合。
图46显示ELISA测定法的结果，其证明了双特异性EGFR×CD3抗体与重组人CD3(hCD3)和食蟹猴CD3(cCD3)的交叉反应性结合。
图47显示如通过流式细胞术所测量的，双特异性EGFR×CD3抗体与细胞表面EGFR和CD3的结合。每幅图左侧的描画代表与仅与二抗(FITC缀合的抗人IgG(Fc特异性))一起温育的细胞的结合。每幅图右侧的描画代表实验组中的结合，其中首先将细胞与浓度为2μg/mL的双特异性抗体温育，然后与二抗温育。
图48显示如通过流式细胞术所测量的，不同浓度的双特异性EGFR×CD3 抗体与细胞表面CD3的结合。通过将数据拟合为S型等温线来计算iBiTE-sp 的EC50。
图49显示在存在人PBMC的情况下，双特异性EGFR×CD3抗体对用 Ad5-Luc感染的HCT116和CHO细胞的杀伤。靶细胞和效应细胞(PBMC)的比率为1:2.5。温育48小时后，根据制造商的说明，使用Promega Bright-Glo萤光素酶测定系统测量细胞活力。
图50显示在存在人PBMC的情况下，双特异性EGFR×CD3抗体对HCT116 和HT29细胞的杀伤。靶细胞和效应细胞(PBMC)的比率为1:5。温育48小时后，根据制造商的说明，使用Promega CellTiter
Figure BDA0003113157090000081
AQueous One Solution细胞增殖测定法测量细胞活力。
发明详述
本发明的独特特征
与其他人开发的公开的单价双特异性抗体相比，本发明的双特异性抗体具有以下有利和独特的特征。首先，在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体使用单体人IgG1 Fc(mFc)来延长体内半衰期。另外，本发明的双特异性抗体仅包含两条多肽链，并且使用Fab和Fv两者进行异源二聚化和抗原识别。本发明的mFc在低浓度下作为单体存在，但在高浓度下趋于形成二聚体。因此，当组装本发明双特异性抗体的重链和轻链时，mFc由于高的局部浓度而形成二聚体，并且与来自Fab和Fv的异源二聚化强度的协作下进一步使双特异性抗体稳定化。上述特征的组合导致双特异性抗体的卓越的性能，如100％异源二聚体、高产率、高稳定性和低聚集倾向。
相反，本领域中许多双特异性抗体在产率和同源二聚化方面存在问题。例如，本领域中许多双特异性抗体包含三条或四条多肽链，从而导致抗体的低产率。此外，本领域中许多双特异性抗体在Fc区中使用突起-进入-凹洞技术来防止Fc同源二聚化。然而，突起-进入-凹洞(knob-in-hole)技术不能完全防止Fc同源二聚化；仍然有5-10％的同源二聚体可能引起人中的毒副作用。应当注意，由于使用本文公开的单体Fc(mFc)结构域，可以使本发明的双特异性抗体具有100％异源二聚体。
在本领域中当前双特异性抗体的一些实施方案中，将单链Fv(scFv)(包含轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)的单个多肽链)用作抗原结合结构域。使用scFv的一个问题是它通常会导致双特异性抗体的不稳定。应当注意，本发明的双特异性抗体不包含任何scFv，从而避免了scFv的不稳定性问题。
本发明双特异性抗体的另一个独特特征是使用具有小的分子大小和低或无免疫原性的长柔性基序(例如，G4S基序的重复或天然存在的短的异源二聚肽)通过创建位阻来用于阻断抗原结合位点。在某些微环境中，特定的酶(例如肿瘤相关蛋白酶)可以消除此类位阻。因此，本文公开的双特异性抗体可以配置为在疾病微环境中，例如在肿瘤附近，被特异性激活。相反，本领域中的其他双特异性抗体使用非人抗体结合肽或抗-抗体来创建位阻。非人抗体结合肽可以是高免疫原性的，而抗-抗体由于其相对大的分子大小而可能在双特异性抗体的制备和使用中产生问题。
在一个实施方案中，本发明提供了具有单体Fc(mFc)多肽的双特异性抗体或包含人CH2和CH3结构域的融合分子，其中CH3结构域包含一个或两个氨基酸取代。氨基酸取代显著降低了mFc多肽形成同源二聚体的能力。在一个实施方案中，同源二聚化的减少为40％、50％、60％、70％、80％、90％或 100％。例如，本发明包括包含本发明的双特异性抗体或mFc-融合分子的组合物，其中抗体或mFc-融合分子表现出的Fc-Fc同源二聚化的量小于60％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于 2％或小于1％。此类修饰的CH3结构域的实例包括但不限于SEQ ID NO: 155-171之一。
在一个实施方案中，与包含野生型CH3结构域的多肽相比，包含具有一个或两个氨基酸取代/突变的抗体CH3结构域的Fc多肽有降低的形成同源二聚体的能力。在一个实施方案中，取代在CH3-CH3同源二聚化界面内。在另一个实施方案中，取代/突变也可以在其他可以诱导导致废除CH3-CH3同源二聚化的CH3构象变化的区域中。在一个实施方案中，与包含三个或更多个取代的Fc多肽相比，Fc多肽可以具有更少的免疫原性。
抗体重链是从N至C端由VH-CH1-CH2-CH3片段组成的多肽，并且根据在抗体领域广泛使用的Kabat编号系统对氨基酸位置进行编号。考虑了抗体的Fc部分的各种取代或突变。此类变化基于Kabat的EU编号方案由在野生型抗体重链中该位置处的氨基酸，后面接该位置处取代的氨基酸来命名。例如，当EU位置407处的酪氨酸被甲硫氨酸取代时，其命名为“Y407M”。“Fc”是指天然存在于动物物种(例如人)内的野生型氨基酸序列。种群内个体之间的野生型序列可能略有不同，例如，本领域已知各种免疫球蛋白链的不同的等位基因。
还预期生产含单体Fc的多肽不限于基于IgG1 Fc的那些，还适用于IgG3、 IgG4和其他免疫球蛋白亚类包括IgA、IgE、IgD和IgM的Fc区。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个VH或VL区(在许多情况下重链和轻链可变区)的蛋白质或多肽。因此，术语“抗体”涵盖具有多种形式的分子，包括单链Fv抗体(scFv，其包含通过接头接合的VH和VL区)，Fab， F(ab)2'，Fab'，scFv:Fc抗体等(如Carayannopoulos and Capra,Ch.9 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,3rd ed.,Paul,ed.,Raven Press,New York, 1993,pp.284-286中所述)。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在整个说明书中可以同义使用。
如本文所用，术语抗体的“交叉反应性结合”是指抗体与来自各种物种的相同抗原的结合，例如，与抗原X的交叉反应性结合是指抗体与来自各种物种(如人、猴、小鼠和大鼠等)中的抗原X结合。
在一个实施方案中，本文公开的双特异性抗体具有与CD3的交叉反应性结合，例如与人和食蟹猴CD3的结合，其能够在双特异性抗体的临床前开发中在常用的药理相关物种(如食蟹猴)进行毒理学研究。在另一个实施方案中，可以将氨基酸突变引入抗CD3抗体的轻链和重链中以减少与CD3的结合，从而最小化在与表达抗原的靶细胞衔接之前双特异性抗体对T细胞的定位。对 CD3亲和力降低的双特异性抗体可以潜在地减少体内的不良副作用。这些副作用包括但不限于T细胞的非特异性激活，干扰T细胞的正常免疫应答以及如果双特异性抗体含有Fc，Fc受体(FcR)介导的由其他毒性细胞(如巨噬细胞和 NK细胞)对T细胞的杀伤。
本发明的双特异性抗体，无论是否与其他序列附接，还可以包括对特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，条件是双特异性抗体的活性与未经修饰的抗体相比无显著改变或受损。这些修饰可以提供一些另外的特性，如去除/添加能够进行二硫键键合的氨基酸，增加其生物寿命，改变其分泌特性等。产生氨基酸序列变体的方法对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，并且可以包括，例如，定点诱变或随机诱变。天然存在和非天然存在的氨基酸(例如人工衍生的氨基酸)均可用于产生氨基酸序列变体。
缩写词
如本文所用，“proBiTE”是指蛋白酶可切割的双特异性T细胞衔接器。 proBiTE-1、proBiTE-2和proBiTE-12是proBiTE的三种变体。proBiTE-1含有包含GGGGSLSGRSDNHGGGGS序列(SEQ ID NO:58)的可切割多肽接头(下划线是uPA、matriptase和豆荚蛋白(legumain)的底物)。proBiTE-2含有包含GGGGSGPLGLARKGGGGS序列(SEQ ID NO:59)的可切割接头(下划线是 MMP-7的底物)。将这两类蛋白酶的底物序列在proBiTE-12中组合，从而产生包含GGGGSLSGRSDNHGPLGLARK序列(SEQ ID NO:60)的双可切割接头。
如本文所用，“proBiTE-1s”、“proBiTE-1s1”、“proBiTE-1s2”是三种 proBiTE-1变体。proBiTE-1s含有包含GSLSGRSDNHGGGGS序列(SEQ ID NO: 61)(下划线是uPA，matriptase和豆荚蛋白的底物)的缩短的可切割多肽接头。 proBiTE-1s1包含接头序列GSGSGRSDNHGGGGS(SEQ ID NO:62)。 proBiTE-1s2包含接头序列GSGGSRSDNHGGGGS(SEQ IDNO:63)。
如本文所用，“proBiTE-1s1sp”是指其中抗EGFR抗体SMET5.2的VH和 VL结构域与抗CD3抗体hSP34 Fab的VH和VL结构域的N端融合的双特异性抗体。如本文所用，双特异性抗体“proBiTE-1s1spg”源自proBiTE-1s1sp。
如本文所用，“HBiTE”是指H形双特异性T细胞衔接器；“iBiTE”是指I 形双特异性T细胞衔接器。“iBiTE-sp”是指其中抗EGFR抗体的scFv经由G4S 接头与hSP34的VH-CH1的N端融合的双特异性抗体，因此，与CD3的结合不受该接头的空间限制。如本文所用，“HBiTE-spg”源自proBiTE-1s1spg，其中proBiTE-1s1spg中的蛋白酶可切割的接头被蛋白酶不可切割的接头替代。
如本文所用，“dproBiTE”是指其中抗原结合位点受到柔性基序或异源二聚化基序的空间限制的蛋白酶可切割的双特异性T细胞衔接器。“dproBiTE-HE”和“dproBiTE-GS”是dproBiTE的两种变体。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本文还提供了编码本文所述的双特异性抗体的核酸序列。核酸包括任何类型的单链和双链核酸(例如，DNA、RNA、DNA/RNA杂合体)。此类核酸可以治疗性地使用或者用于产生本发明的双特异性抗体的方法中。
编码本发明双特异性抗体的核酸序列可以是载体的一部分。载体包括核酸载体，如裸露的DNA和质粒，以及本领域通常已知的各种病毒载体和杂合体或嵌合病毒载体(参见例如，Sa Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(1989))。载体可以包含任何合适的启动子和其他调控序列(例如，对于宿主细胞类型而言具有特异性的转录和翻译起始和终止密码子)，以控制编码多肽的核酸序列的表达。启动子可以是与本文所述的核酸序列可操作连接的天然或规范性启动子。启动子的选择和构建，包括各种组成型和可调节型启动子，在普通技术人员的能力范围内。
本发明还涵盖在功能上等同于本文公开的氨基酸或核酸序列的氨基酸或核酸序列。功能上等同的序列是指作为核苷酸或氨基酸的自发或诱导的修饰(例如，取代、缺失和/或插入)的结果的序列。换句话说，功能上等同的序列是与本文公开的氨基酸或核酸序列“基本上一致”或“基本上相同”的序列。如本领域通常理解的，如果两个序列在相应位置包含相同残基，则其通常被认为是“基本上相同”。可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括可在商业计算机程序中获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP，gapped BLAST和PSI-BLAST。除了识别相同的序列外，这些程序和其他类似程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果在相关残基段至少50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多的相应残基是相同的，则认为两个序列基本上相同。相关段可以是完整或全长序列，或其部分序列。
本文还提供了包含上述核酸序列的细胞(例如，分离的宿主细胞)。此类细胞可用作例如治疗剂或用于产生本发明的双特异性抗体。本领域普通技术人员可容易使用任何合适的宿主细胞，包括原核和真核细胞。或者，可以将根据本文所述方法治疗的来自哺乳动物(如人)的细胞用作宿主细胞。将核酸和载体引入分离的宿主细胞中以及体外培养和选择转化宿主细胞的方法是本领域公知的。在一个实施方案中，核酸序列被宿主细胞有效转录和翻译。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性抗体可以通过以下方法产生，所述方法包括：(a)用编码双特异性抗体的核酸或载体转化宿主细胞；(b)在足以表达双特异性抗体的条件下在培养基中培养细胞；和(c)从细胞或培养基中收获双特异性抗体。可以在原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达双特异性抗体，然后根据需要使用众所周知的方法进行收获和纯化(参见例如，Sambrook et al.MolecularCloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Elarbor Laboratory Press(1989))。用于转化、培养和收获由核酸序列表达的多肽的技术是本领域公知的。例如，本领域普通技术人员可以在细菌系统如大肠杆菌，或真菌系统如酵母中容易地表达本发明的双特异性抗体。或者，该双特异性抗体可以在哺乳动物、禽类或植物系统中产生。如果双特异性抗体具有低溶解度，抗体可以以不溶性包涵体的形式表达，并使用本领域通常已知的方法在体外重折叠。
药物组合物和施用方法
本发明的双特异性抗体、核酸分子、载体或宿主细胞可以单独地或与载体(即药学上可接受的载体)组合施用给哺乳动物。药学上可接受的是指不是生物学上或其他方面不期望的材料，即，可以将该材料施用于哺乳动物而不会引起任何不希望的生物学影响或不与包含其的药物组合物中的任何其他组分以有害的方式相互作用。如本领域普通技术人员将众所周知的，选择载体以最小化双特异性抗体或多核苷酸的任何降解并且最小化哺乳动物中任何不利副作用。例如，合适的载体及其配制剂描述于Remington:The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1995)。
上述包含双特异性抗体、多核苷酸、载体或宿主细胞的药物组合物可以根据期望局部还是系统治疗通过任何合适的方式施用(例如，施用于哺乳动物、细胞、组织或肿瘤)。例如，可以局部(例如眼、阴道、直肠、鼻内、经皮等)，口服，通过吸入或肠胃外(包括通过静脉内滴注或皮下、腔内、腹膜内、皮内或肌内注射)施用组合物。鼻内局部施用是指将组合物通过一个或两个鼻孔递送到鼻子和鼻道中。组合物可以通过喷雾机制或液滴机制，或通过核酸或载体的雾化来递送。递送也可以经由插管引导至呼吸系统的任何区域(例如，肺)。或者，施用可以是肿瘤内的，例如局部或静脉注射。
如果要肠胃外施用组合物，则施用通常通过注射进行。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适于在注射前悬浮于液体中的固体形式，或者作为乳剂。另外，肠胃外施用可包括制备缓释或持续释放系统以维持恒定剂量。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体、多核苷酸、载体或宿主细胞可以通过本领域众所周知的多种机制体内和/或离体递送至哺乳动物。如果采用离体方法，则可以根据本领域已知的标准方案从哺乳动物中移出细胞或组织并将其保持在体外。可以经由本领域众所周知的任何基因转移机制将核酸分子或载体引入细胞或组织。然后根据标准方法将转导的细胞输注或同位移植回哺乳动物。
本文公开的双特异性抗体可以用于治疗方法。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以单独使用或与其他抗癌疗法(如化学疗法和放射疗法)组合使用。可以将本发明的双特异性抗体可以直接施用给哺乳动物，或者通过向哺乳动物施用编码双特异性抗体的核酸序列来进行施用，此类核酸序列可以由载体携带。
引起期望效果所需的双特异性抗体、多核苷酸、载体或宿主细胞或其组合物的确切量将因哺乳动物而异，这取决于哺乳动物的物种、年龄、性别、体重和总体状况，所用的特定双特异性抗体、核酸分子、载体或细胞，施用途径以及方案中是否包括其他药物。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。但是，本领域普通技术人员可以使用常规实验确定合适的量。剂量可以变化，并且抗体可以以每天一个或多个(例如，两个或更多，三个或更多，四个或更多，或者五个或更多)剂量施用，持续一或多天。在文献中容易找到选择抗体合适剂量的指南。
本发明还提供了包含双特异性抗体、多核苷酸、载体或宿主细胞或其组合物的试剂盒。试剂盒可以包括单独的容器，其含有合适的载体、稀释剂或赋形剂。试剂盒还可包括佐剂、细胞因子、活性剂、免疫测定试剂、PCR试剂、放射性标记等。另外，试剂盒可以包括有关混合或组合成分和/或施用方法的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供了重组双特异性抗体，其包含
(i)第一多肽，其从N至C端包含第一轻链可变结构域，人轻链恒定区(CL)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
(ii)第二多肽，其从N至C端包含第一重链可变结构域，人重链恒定区1 (CH1)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；和
(iii)通过第一接头与第一轻链可变结构域连接的第二轻链可变结构域，和通过第二接头与第一重链可变结构域连接的第二重链可变结构域，
其中第一轻链可变结构域和第一重链可变结构域赋予对第一抗原的结合特异性，第二轻链可变结构域和第二重链可变结构域赋予对第二抗原的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明提供了重组双特异性抗体，其包含
(i)第一多肽，其从N至C端包含第一轻链可变结构域，人轻链恒定区(CL)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
(ii)第二多肽，其从N至C端包含第一重链可变结构域，人重链恒定区1 (CH1)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；和
(iii)通过第一接头与第一多肽的CH3的C端连接的第二轻链可变结构域，和通过第二接头与第二多肽的CH3的C端连接的第二重链可变结构域，
其中第一轻链可变结构域和第一重链可变结构域赋予对第一抗原的结合特异性，第二轻链可变结构域和第二重链可变结构域赋予对第二抗原的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列衍生自人。或者，重链或轻链可变结构域衍生自非人类物种。在又一个实施方案中，重链或轻链可变结构域可以衍生自人源化抗体。如本文所用，“人源化抗体”是指通过将人抗体与小鼠或大鼠单克隆抗体的一小部分结合而产生的重组抗体的类型。抗体的小鼠或大鼠部分与靶抗原结合，而人的部分则使其不易被身体的免疫系统破坏。本领域普通技术人员可使用本领域的标准技术容易地构建人源化抗体。
在一个实施方案中，设计本发明的双特异性抗体以结合靶细胞上的第一抗原和免疫细胞如T细胞上的第二抗原。靶细胞上的第一抗原的实例包括但不限于EpCAM、HER2、PSMA、gpA33、CD276、EGFR、CEA、CD19、 CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、FLT3和BCMA。免疫细胞上的第二抗原的实例包括但不限于CD3、FcγRI细胞和FcγRIIIa。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的一个或两个人CH3结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代赋予第一和第二多肽之间减少的或消除的同源二聚化。例如，一个或两个CH3的氨基酸T366被D(天冬氨酸)、L(亮氨酸)、W(色氨酸)或N(天冬酰胺)取代。在另一个实施方案中，一个或两个CH3的氨基酸Y407被I(异亮氨酸)、F(苯丙氨酸)、L(亮氨酸)、M(甲硫氨酸)、H(组氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)、 W(色氨酸)、A(丙氨酸)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)取代。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的一个或两个CH3结构域包含SEQ ID NO: 155-171之一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的第一或第二接头包含SEQ ID NO:125、126或127的氨基酸序列。本领域普通技术人员将容易理解，接头需要具有一定程度的长度、柔性和方向性以允许与第一抗原结合的VH和 VL结构域之间的稳定相互作用，并同时有效阻断与第二抗原的结合。
在另一个实施方案中，本发明的特异性抗体的第一或第二接头包含蛋白酶切割位点。例如，蛋白酶切割位点包含SEQ ID NO:58-63之一的氨基酸序列。蛋白酶切割位点的其他实例包括但不限于，对于基质金属蛋白酶(MMP)： PLGLWA (SEQ ID NO:128)、GPLGLWA(SEQ ID NO:129)、GPLGLWAQ(SEQ ID NO:130)、GVPDLGRFQTFE(SEQ ID NO:131)、GVPDVGHFSLFP(SEQ ID NO:132)、GVPDVGEFSLFP(SEQ ID NO:133)、GVPDVGNFSLFP(SEQ IDNO:134)、GVPDVGRFSLFP(SEQ ID NO:135)、GVPDVGHYSLFP(SEQ ID NO:136)、GVPDVGEYSLFP(SEQ ID NO:137)、GVPDVGNYSLFP(SEQ ID NO:138)、GVPDVGRYSLFP(SEQ ID NO:139)；对于尿激酶(uPA)：PRFKIIGG (SEQ ID NO:140)、PRFRIIGG(SEQ ID NO:141)；对于TGFβ：SSRHRRALD (SEQ ID NO:142)；对于纤溶酶原：RKSSIIIRMRDVVL(SEQ ID NO:143)；对于葡激酶：SSSFDKGKYKKGDDA(SEQ ID NO:144)；对于因子Xa：IEGR (SEQ ID NO:145)、IDGR(SEQ IDNO:146)、GGSIDGR(SEQ ID NO:147)；对于人肝胶原：GPLGIAGI(SEQ ID NO:148)；对于人α2M：GPEGLRVG (SEQ ID NO:149)；对于人PZP：YGAGLGVV(SEQ ID NO:150)、AGLGVVER (SEQID NO:151)、AGLGISST(SEQ ID NO:152)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的CH1和CL经由包含与正常人IgG中的铰链序列相比缩短的铰链序列的接头与第一和第二多肽的CH2连接。
在一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体包含多肽，该多肽包含 SEQ IDNO:1-16之一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体包含与SEQID NO:1-16的氨基酸序列之一至少85％、90％、92％、 94％、96％、98％或99％相同的多肽。
在一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体进一步包含异源二聚化基序或长柔性基序，其中异源二聚化基序或长柔性基序经由一个或多个接头连接至第二轻链可变结构域和第二重链可变结构域的N端。在一个实施方案中，此类一个或多个接头包含蛋白酶切割位点。在一个实施方案中，异源二聚化基序包含人HER2跨膜结构域的N端异源二聚化基序或人EGFR跨膜结构域的N端异源二聚化基序。在另一个实施方案中，异源二聚化基序必须具有完全的人序列以使免疫原性最小化(这对于小分子来说是短的)，并且具有足够的异源二聚化强度以确保有效阻断抗原结合活性。本领域普通技术人员将容易地从除EGFR和HER2之外的人蛋白质中识别异源二聚化基序。
在一个实施方案中，长柔性基序包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:153)。本领域普通技术人员将理解长柔性基序必须具有一定程度的长度、柔性和方向性以允许有效中断抗原结合活性。此类柔性基序的其他实例包括但不限于，G4S序列的任何重复或其他非结构化重组多肽如XTEN (Schellenberger et al.,Nature Biotechnology 2009,27:1186-1190)。
在一个实施方案中，包含此类异源二聚化基序或长柔性基序的重组双特异性抗体包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:17-20之一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的重组双特异性抗体包含与SEQ ID NO:17-20的氨基酸序列之一至少85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的多肽。
具有经修饰的与CD3结合的双特异性抗体
在一个实施方案中，重组双特异性抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域包含经修饰的序列，其与由未修饰序列介导的结合亲和力相比，赋予与 CD3降低的结合亲和力。在另一个实施方案中，重组双特异性抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域赋予对人CD3和食蟹猴CD3的结合特异性。在一个实施方案中，此类双特异性抗体包括包含SEQ IDNO:50-57之一的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明还提供了编码上述一种或多种多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明还提供了包含一种或多种上述多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案中，本发明还提供了包含将此类表达载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明还提供了制备本文公开的重组双特异性抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)在其中此类重组双特异性抗体得以表达的条件下，培养包含编码本发明重组双特异性抗体的一种或多种多核苷酸的宿主细胞；和(b)从宿主细胞中回收重组双特异性抗体。
抗EGFR抗体
在一个实施方案中，本发明还提供了分离的抗人EGFR(表皮生长因子受体)抗体，其包含重链和轻链。在一个实施方案中，重链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的互补决定区1(CDR1)，包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的 CDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR3。在一个实施方案中，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:21(VH结构域)。在另一个实施方案中，重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:44(全长重链)。以上序列衍生自命名为SMET5 的抗体。
在另一个实施方案中，抗人EGFR抗体的轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的CDR3。在一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(VL结构域)。在另一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:45(全长轻链)。以上序列衍生自命名为SMET5的抗体。
在另一个实施方案中，抗人EGFR抗体的轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR3。在一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:30(VL结构域)。在另一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:47(全长轻链)。以上序列衍生自命名为SMET5.2的抗体。
在另一个实施方案中，抗人EGFR抗体的轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的CDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR3。在一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:35(VL结构域)。在另一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:49(全长轻链)。以上序列衍生自命名为SMET5.3的抗体。
在另一个实施方案中，抗人EGFR抗体的轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的CDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的CDR3。在一个实施方案中，轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:40(VL结构域)。以上序列衍生自命名为SMET5.4的抗体。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含生理上可接受的载体和治疗有效量的上述任何一种抗人EGFR抗体的组合物。
通过参考以下实施例，将更容易理解整体描述的本发明，所述实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，而无意于限制本发明。
在整个申请中，引用了各种参考文献或出版物。这些参考文献或出版物以其整体在此通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的最新技术水平。
实施例1
材料和方法
细胞、蛋白质、质粒和其他试剂
293free style(293FS)细胞和蛋白A琼脂糖购自ThermoFisher Scientific。HCT116、HT29和SW480结肠癌细胞系购自Sigma。其他细胞系购自ATCC。重组人EGFR、Fcgamma受体(FcγR)和尿激酶(uPA)是Sino Biological的产品，并且重组人MMP-7蛋白酶是Biolegend的产品。通过重叠PCR和连接合成和组装用于哺乳动物表达的pDin1载体。载体含有两个转录单位和促进IgG1或Fc 融合蛋白的克隆的不含内含子的内置人IgG1 Fc基因片段。辣根过氧化物酶 (HRP)缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性)抗体是Sigma的产品。山羊抗人IgG(Fc 特异性)-FITC缀合物购自ThermoFisher Scientific。
EGFR×CD3双特异性抗体的克隆
使用了以下引物：
OKTVLF，(有义)(SEQ ID NO:68)；OKTVLR，(反义)(SEQ ID NO:69)
CKF1，(有义)(SEQ ID NO:70)；CKR1，(反义)(SEQ ID NO:71)
MFCPAF，(有义)(SEQ ID NO:72)；AAAR，(反义)(SEQ ID NO:73)
OKT3VHF，(有义)(SEQ ID NO:74)；OKT3VHR，(反义)(SEQ ID NO:75)
CHMFCF，(有义)(SEQ ID NO:76)；CHMFCR，(反义)(SEQ ID NO:77)
bnIgG20H1，(有义)(SEQ ID NO:78)
12VHF，(有义)(SEQ ID NO:79)；12VHR，(反义)(SEQ ID NO:80)
12VLF，(有义)(SEQ ID NO:81)；12VLR，(反义)(SEQ ID NO:82)
bnIgG20L1，(有义)(SEQ ID NO:83)
CHF，(有义)(SEQ ID NO:84)；CHF1，(有义)(SEQ ID NO:85)；CHF2， (有义)(SEQID NO:86)
H12LR，(反义)(SEQ ID NO:87)
1S1F，(有义)(SEQ ID NO:88)；1S2F，(反义)(SEQ ID NO:89)
HEHR，(反义)(SEQ ID NO:90)；HEHF，(有义)(SEQ ID NO:91)
HEHR1，(反义)(SEQ ID NO:92)；HELR，(反义)(SEQ ID NO:93)
HELF，(有义)(SEQ ID NO:94)；HELR1，(反义)(SEQ ID NO:95)
GSHR，(反义)(SEQ ID NO:96)；GSHF，(有义)(SEQ ID NO:97)
GSLR，(反义)(SEQ ID NO:98)；GSLF:(有义)(SEQ ID NO:99)
iBiTE的克隆
如下克隆iBiTE。为了克隆iBiTE的轻链，分别用引物对 OKTVLF/OKTVLR、CKF1/CKR1和MFCPAF/AAAR，及其编码质粒作为模板对人源化抗CD3抗体OKT3(hOKT3)的VL结构域，人抗体kappa轻链恒定结构域(CK)和单体人IgG1 F c(mFc7.2)-poly A信号序列进行PCR扩增。在不存在引物的情况下，用两个基因片段以相同的摩尔浓度使用重叠PCR，将hOKT3 VL接合到CK基因片段的5’端，进行7个循环，并在存在引物OKTVLF和CKR1 的情况下进行另外的15个循环。以相同的方式，用引物bnIgG20H1和CKR1 通过重叠PCR，将编码前导肽的基因片段(Hleader)融合至hOKT3 VL-CK片段的5’末端。用引物bnIgG20H1和AAAR通过重叠PCR，将Hleader-hOKT3 VL-CK进一步连接至mFc7.2-poly A的5’末端。用XbaI和SalI消化最终的PCR 产物，并将其克隆到pDin1中。
为了克隆iBiTE的重链，分别用引物对OKT3VHF/OKT3VHR和 CHMFCF/CHMFCR，对hOKT3 VH和人IgG1 CH1-mFc7.2基因片段进行PCR 扩增。OKT3VHF引物携带HindIII和SacI限制性位点，其将用于亚克隆。用引物OKT3VHF和CHMFCR通过重叠PCR，将hOKT3 VH基因片段融合至 CH1-mFc7.2的5’末端。用HindIII和EcoRI消化产物，并将其克隆到含有iBiTE 轻链的pDin1构建体中。通过用HindIII和SacI消化先前构建的质粒，获得编码前导肽(Lleader)和抗EGFR scFv的基因片段，然后将其克隆到含有iBiTE全长轻链和部分重链的质粒中，从而导致最终的iBiTE构建体。
HBiTE的克隆
为了克隆HBiTE，分别用引物对12VHF/12VHR和12VLF/12VLR，对抗 EGFR抗体的VH和VL结构域进行PCR扩增。分别用引物对bnIgG20L1/12VHR 和bnIgG20H1/12VLR通过重叠PCR，将PCR产物融合至Lleader和Hleader的3’末端。用XbaI和BamHI消化Hleader-VL基因片段，并将其克隆到iBiTE衍生的载体中，其中HindIII和BamHI限制性位点引入到hOKT3 VL结构域的5’末端。然后，经由HindIII和SacI限制性位点将Lleader-VH基因片段进一步克隆到含有Hleader-VL插入物的构建体中。
proBiTE变体的克隆
通过使用HBiTE作为模板克隆proBiTE变体。为了克隆proBiTE-1、 proBiTE-2和proBiTE-12，用HBiTE作为模板以及分别用引物对CHF/AAAR, CHF1/AAAR和CHF2/AAAR对hOKT3 VL-CK-mFc7.2-poly A基因片段进行 PCR扩增。用BamHI和SalI消化PCR产物，并将其克隆到HBiTE中。
proBiTE-1s的克隆
为了克隆proBiTE-1s，用引物bnIgG20H1和H12LR对Hleader-VL片段进行PCR扩增。用XbaI和BamHI消化PCR产物，并将其克隆到用相同的限制酶线性化的proBiTE-1中。除了使用引物对1S1F/AAAR和1S2F/AAAR进行 hOKT3 VL-CK-mFc7.2-poly A基因片段的PCR扩增外，以与proBiTE-1相同的方式克隆proBiTE-1s1和proBiTE-1s2。
dproBiTE-HE的克隆
为了克隆dproBiTE-HE，分别用引物对bnIgG20L1/HEHR和 HEHF/HEHR1对Lleader和抗EGFR VH结构域进行PCR扩增。然后用引物 bnIgG20L1和HEHR1通过重叠PCR将Lleader基因片段融合至抗EGFR VH的5’末端。用HindIII和SacI消化全长Lleader-抗EGFR VH基因片段，并将其克隆到proBiTE-1s1中。除了使用bnIgG20H1/HELR和HELF/HELR1引物对进行初级扩增，以及使用XbaI和BamHI限制性位点进行克隆外，以相同的方式获得并克隆Hleader-抗EGFR VL基因片段。
dproBiTE-GS的克隆
为了克隆dproBiTE-GS，分别用引物对bnIgG20L1/GSHR和GSHF/HEHR1 对Lleader和抗EGFR VH结构域进行PCR扩增。然后用引物bnIgG20L1和 HEHR1通过重叠PCR将Lleader基因片段融合至抗EGFR VH的5’末端。用 HindIII和SacI消化全长Lleader-抗EGFR VH基因片段，并将其克隆到 proBiTE-1s1中。除了使用bnIgG20H1/GSLR和GSLF/HELR1引物对进行初级扩增，以及使用XbaI和BamHI限制性位点进行克隆外，以相同的方式获得并克隆Hleader-抗EGFR VL基因片段。
蛋白质表达与纯化
如前所述(Chen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:17121-17126)，所有双特异性抗体均在293FS细胞中表达，并根据制造商的说明，使用蛋白A Sepharose 4Fast Flow柱色谱(GE Healthcare)从293FS培养上清液中对其进行纯化。
蛋白酶切割
为了用尿激酶(uPA)进行切割，在15μl PBS(pH7.4)中将5μg抗体与1μg 重组人uPA(Sino Biological)混合，或者不与之混合，并在室温下温育1小时。为了用MMP-7切割，将重组人MMP-7(Biolegend)在测定缓冲液(50mM Tris， 10mM CaCl2，150mM NaCl，0.05％Brij-35，pH7.5)中稀释，并通过添加4- 氨基苯乙酸汞(APMA)至终浓度为1mM对其激活，并将混合物在37℃下温育 30分钟。然后，在20μl测定缓冲液中将4μg抗体与0.5μg激活的MMP-7混合，或者不与之混合，并在37℃下温育1小时。
ELISA
根据标准方案进行ELISA。简而言之，将重组人FcγR(Sino Biological) 以每孔50ng在4℃下在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上包被过夜，并用PBS(pH7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。添加五倍系列稀释的生物素化抗体，并在室温下温育2小时。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤板。通过HRP 缀合的链霉抗生物素蛋白(ThermoFisher Scientific)检测结合的抗体。在室温下用TMB底物(Sigma-Aldrich)进行该测定，并使用酶标仪在450nm处进行监测。通过将数据拟合至Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC50)。
流式细胞术
将约5×105个细胞与抗体在冰上温育1小时。用含有0.1％牛血清白蛋白的PBS(PBSA)洗涤细胞一次，并将其重悬于100μl PBSA中。然后添加1μl 山羊抗人IgG(Fc特异性)-FITC缀合物(Invitrogen)并温育30分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后将其用于流式细胞术分析。
尺寸排阻色谱
用碳酸酐酶(29kDa)，卵清蛋白(44kDa)，伴清蛋白(75kDa)，醛缩酶(158 kDa)和铁蛋白(440kDa)的蛋白质分子质量标准物校准Superdex200 10/300 GL柱(GE Healthcare)。将在PBS(pH7.4)中浓度为1mg mL-1的纯化蛋白质上样到预平衡的柱上，并以0.5mL/min用PBS(pH7.4)洗脱。
T细胞活化测定
将靶细胞以每孔25μl RPMI1640完全培养基中2×104个细胞的密度铺板在96孔板上。将5倍连续稀释的50μl抗体添加到每个孔中。然后以每孔25μl RPMI1640完全培养基中1×105个细胞的密度添加效应细胞(Jurkat NFAT-Luc2，Promega)以使靶细胞:效应细胞的比率为1:5。5小时温育后，根据制造商的说明，使用Promega Bio-Glo萤光素酶测定系统进行测定。
体外杀伤测定
将用红色萤火虫萤光素酶基因稳定转染的靶细胞(2×104)接种在100μl RPMI1640完全培养基中过夜。同时，将从STEMCELL Technologies购买的 2.5×107个冷冻的PBMC复活并接种在含有50U/mL IL-2(Sigma)的10mL RPMI 1640完全培养基中过夜。第二天，将培养基从靶细胞中去除，并添加 50μl RPMI 1640完全培养基中的2×105个PBMC(实际靶标:效应物的比率＝ 1:5，因为靶细胞复制过夜)。然后，将从10nM连续稀释5倍的50μl抗体添加到每个孔中。温育后72小时，根据制造商的说明，通过使用Promega Bio-Glo 萤光素酶测定系统测量细胞的杀伤活性。
小鼠药代动力学测量
在第0天向NOD/SCID小鼠静脉内施用500μg抗体。在第1、3、5、6或7 或8天收集血浆样品，并将其用于抗体血清浓度的测量，所述测量通过ELISA 以使用原始抗体存储生成的标准曲线进行。
体内肿瘤生长抑制
用2×106个HCT116细胞和107个新鲜分离的人PBMC的混合物皮下接种至SCID小鼠的左腹侧对小鼠进行接种。6小时后，对小鼠静脉给药PBS(对照) 或20μg抗体，然后每隔一天给药6剂。治疗两周后，处死小鼠并测量肿瘤重量。使用以下公式计算肿瘤生长抑制率：PBS组的平均重量-抗体治疗组的平均重量/PBS组的平均重量。
实施例2
具有一个抗原结合位点的空间限制进入的蛋白酶可切割双特异性T细胞衔接器 (proBiTE)的合理设计
双特异性T细胞衔接器(BiTE)是一类新的双特异性抗体，其可通过同时结合肿瘤抗原和T细胞表面的CD3分子来引导细胞毒性T细胞杀伤癌细胞。但是，一些肿瘤抗原在正常组织中的表达表现出剂量限制的中靶(on-target)毒性。脱靶毒性，如细胞因子释放综合征也限制了其临床应用。假设可以将旨在提高肿瘤选择性的多种策略组合起来以使此类毒性最小化，并扩大该类双特异性抗体的治疗窗口。这些策略包括优化针对肿瘤抗原和CD3两者的抗体亲和力，引入第二肿瘤特异性以及当Fc包含在BiTE中用于长体内半衰期时将FcR 结合活性最小化。
上述目标中的一些可以通过合理设计双特异性抗体的分子结构来实现。例如，一些蛋白酶在多种肿瘤中高度上调，并且在癌症侵袭和转移中起关键作用。这些蛋白酶在健康组织中的表达及其蛋白水解活性极低。因此，在BiTE 的设计中采用肿瘤相关蛋白酶可以有助于增加肿瘤选择性，从而导致用于癌症疗法的前药的产生。
为了测试这种可能性，设计了在空间上限制一个抗原结合位点进入的一类新的proBiTE，其中第一抗体的VH和VL结构域经由蛋白酶不可切割的多肽接头或蛋白酶可切割的多肽接头融合至第二抗体Fab的VH和VL结构域的N 端。第二抗体Fab进一步经由没有蛋白酶切割位点的多肽接头融合至含有能够降低或消除Fc同源二聚化的突变的人抗体Fc区的N端(图1A)。
在proBiTE的另一个实施方案中，第一抗体的VH和VL结构域经由具有或不具有蛋白酶切割位点的多肽接头融合至含有能够降低或消除Fc同源二聚化的突变的人抗体Fc区的C端。人Fc区经由没有蛋白酶切割位点的多肽接头进一步融合至第二抗体Fab的C端(图1B)。proBiTE对每种抗体均表现出单价结合，并因此在与肿瘤细胞衔接之前，不应当非特异性激活T细胞。
提出proBiTE的作用机制如下：在不存在肿瘤相关蛋白酶的情况下，由于连接两个抗体的多肽接头引起的位阻，proBiTE与一种抗原(抗原1)结合，但与另一种抗原(抗原2)不结合或仅弱结合。在其中蛋白酶表达上调的肿瘤微环境中，蛋白酶对多肽接头的有效切割消除了位阻，从而使proBiTE与另一种抗原(抗原2)结合并发挥其功能。一些肿瘤相关蛋白酶作为活性可溶性蛋白质被分泌到循环中。在proBiTE的一种设计中，肿瘤抗原结合抗体的VH和VL 结构域分别经由蛋白酶不可切割和可切割的多肽接头融合至CD3抗体的Fab 的VH和VL结构域的N端。因为VH-VL和CH1-CL界面之间的协作对于结构域的相互稳定是必需的，所以当抗体由于肿瘤抗原结合抗体的不稳定VH-VL 相互作用而在循环中被切割时，proBiTE的完整性和活性会受到影响(图2B，左图)。然而，在肿瘤组织中，由于VH-VL和抗体-抗原界面之间的协作，与肿瘤抗原结合的proBiTE可以被稳定化，从而导致双特异性抗体保留全部功能，甚至在被蛋白酶切割后(图2B，右图)。因此，假设这种独特的proBiTE 设计可以进一步降低此类双特异性抗体的中靶毒性。
总之，与公开的其他人开发的单价双特异性抗体相比，本发明的双特异性抗体具有使用以下项的独特特征：(i)单体Fc结构域(例如人IgG1 Fc)，以延长体内半衰期，和(ii)仅两条多肽链，并同时采用Fab和Fv两者进行异源二聚化和抗原识别。本文提及的特征的组合导致本发明的双特异性抗体具有优异的性质，如100％异源二聚体、高产率、高稳定性和低聚集倾向。
实施例3
EGFR×CD3双特异性抗体的生成和初步表征
为了提供概念验证并检验上述假设，生成了靶向EGFR和CD3的proBiTE。 EGFR和CD3在此处和下文中用作示例。本领域普通技术人员将认识到，如本文所述，可以容易地采用其他T和非T细胞靶抗原。
在一个实施方案中，抗EGFR抗体的VH和VL结构域分别经由蛋白酶不可切割的(G4S)3接头和蛋白酶可切割的接头融合至抗CD3抗体Fab的VH和 VL结构域的N端。抗CD3Fab进一步融合至含有两个能够降低Fc同源二聚化的氨基酸突变(T366L/Y407H)的单体人IgG1 Fc(mFc7.2)(SEQ ID NO:172)的 N端(图3)。mFc7.2在低浓度(<0.5mg/mL)下以单体形式存在，但在较高浓度下倾向于形成二聚体。因此可以想象，当组装proBiTE的重链和轻链时，由于高的局部浓度，mFc7.2可以形成二聚体并进一步稳定化双特异性抗体。
在一个实施方案中，生成了三种proBiTE变体。proBiTE-1含有由GGGGSLSGRSDNHGGGGS序列(SEQ ID NO:58)(下划线是uPA、matriptase 和豆荚蛋白(legumain)的底物)组成的可切割多肽接头。proBiTE-2含有由 GGGGSGPLGLARKGGGGS序列(SEQ ID NO:59)(下划线是MMP-7的底物) 组成的可切割接头。将这两类蛋白酶的底物序列在proBiTE-12中组合，产生由GGGGSLSGRSDNHGPLGLARK序列(SEQ ID NO:60)组成的双可切割接头。
作为阴性对照，生成了H形BiTE(HBiTE)，其中将可切割的接头替换为不可切割的(G4S)3接头(参见图3)。对于阳性对照，设计了i形BiTE(iBiTE)，其中抗EGFR抗体的scFv经由(G4S)3接头融合至抗CD3抗体的VH-CH1的N端 (图3)。在此构型中，接头在空间上不限制与CD3的结合。
所有双特异性抗体均在瞬时转染的293 free style(293FS)细胞中良好表达，并分泌到培养上清液中。在非还原性SDS-PAGE上，绝大多数纯化的抗体以异源二聚体的形式迁移，其表观分子量(aMW)约为115kDa(图4)。在还原性SDS-PAGE上，iBiTE的两条多肽链充分分开，而其他双特异性抗体的两条多肽链则相互重叠，表观分子量约为70kDa。
proBiTE-1和proBiTE-12被uPA有效切割，从而产生抗EGFR抗体的分离的VL结构域，而其他双特异性抗体对蛋白酶不敏感(图5，左图)。类似地，当与MMP-7温育时，proBiTE-2和proBiTE-12是可切割的，而其他似乎没有在接头位置处被特异性切割(图5，右图)。在还原性SDS-PAGE上观察到几种意想不到的产物，表明抗体中可能存在MMP-7的其他切割位点。尺寸排阻色谱分析表明，绝大多数纯化的双特异性抗体作为单体迁移，其aMW约为120 kDa，与它们的计算分子量(cMW)相似(图6)。
实施例4
双特异性抗体对细胞表面相关的EGFR和CD3的结合亲和力
测量了抗EGFR和抗CD3抗体的单价和二价细胞结合亲和力。单价双特异性抗体iBiTE与表达EGFR的人结肠癌细胞系HCT116(EC50为97nM)和表达CD3的人T细胞系Jurkat(EC50为30nM)结合，表明EGFR和CD3抗体具有中等亲和力(图7)。二价单特异性抗体抗EGFRIgG1和抗CD3 scFv-Fc与HCT116 和Jurkat细胞系的结合更为牢固，其EC50分别为6.9和0.38nM，表明二价结合的高亲合力效应。
接下来，检查具有不同结构和接头组成的双特异性抗体与EGFR和CD3 的结合。在2μg/mL的浓度下，没有双特异性抗体与不表达人EGFR和CD3的 CHO细胞相互作用，而iBiTE与表达EGFR的HCT116和表达CD3的Jurkat细胞两者结合，这表明抗EGFR和抗CD3抗体的特异性结合活性(图8)。相反， HBiTE以及iBiTE与HCT116细胞结合，而未观察到与Jurkat细胞的结合，这表明在所测试的浓度下，抗CD3抗体的结合活性被完全消除。这三种proBiTE 变体对两种细胞系均表现出不同的结合活性，这可能是由于可切割接头的柔性和方向不同所致。
然后检查了预切割的proBiTE-1与EGFR和CD3的结合。结果表明，具有完全开放的抗原结合位点的iBiTE与HCT116和Jurkat细胞的结合不受uPA影响。与iBiTE相比，在2μg/mL的抗体浓度下，被uPA预切割的proBiTE-1表现出对表达EGFR的HCT116细胞的结合降低，而与表达CD3的Jurkat细胞的结合活性得以恢复(图9)。当测试不同的抗体浓度时，在低于200nM的浓度下，proBiTE-1与表达EGFR的HCT116细胞的结合比iBiTE稍好(图10)。通过uPA切割后，proBiTE-1与HCT116细胞的结合减少了约两倍，并与iBiTE的结合相似。相反，proBiTE-1与表达CD3的Jurkat细胞的结合比iBiTE弱约30倍。蛋白酶切割恢复了proBiTE-1与Jurkat细胞的结合活性。
测试了预结合至细胞的proBiTE-1中EGFR抗体的VH和VL结构域是否可以稳定化。如预期的那样，在2μg/mL的浓度下，与完整的proBiTE-1相比，预切割的proBiTE-1与HCT116细胞的结合降低，而预结合至细胞，然后被uPA 切割的proBiTE-1恢复了结合活性(图11)。这些结果与以下假设相吻合，即采用天然不稳定的VH-VL结构域作为肿瘤抗原结合抗体可以进一步降低此类双特异性抗体的中靶毒性。
实施例5
双特异性抗体介导的T细胞活化
通过使用Promega T细胞激活生物测定系统评估在存在EGFR表达细胞的情况下proBiTE活化人T细胞的能力和特异性。在测试的6种靶细胞系中，CHO细胞不表达人EGFR，而A431细胞具有高水平的EGFR表达，并经常用作药物发现的模型人细胞系(图12)。在2μg/mL抗体浓度下，三种人结肠细胞系HCT116、HT29和SW480表达相似水平的EGFR，而在SW620细胞上无法检测到EGFR表达。
在存在EGFR阳性A431细胞的情况下，人T细胞被iBiTE有效活化，EC50为约80pM(图13)。然而，在具有EGFR阴性的CHO细胞的情况下，人T细胞在高浓度下没有或仅被少量活化，表明该双特异性抗体的高特异性。在存在 HCT116细胞的情况下，iBiTE有效活化人T细胞，而HBiTE对T细胞没有影响，这可能由于CD3结合的阻断(图14)。proBiTE-1给予低水平的T细胞活化。出乎意料的是，蛋白酶切割的proBiTE-1在T细胞活化中的效率比完整的 proBiTE-1低，这可能是因为经切割的proBiTE-1中EGFR结合抗体的VH和VL 结构域之间的相互作用变差了。对其CD3结合没有或仅被部分阻断的 proBiTE-2和proBiTE-12的结果显示比proBiTE-1更好的T细胞活化活性。用 HT29细胞观察到相似的结果，除了proBiTE-1无法激活T细胞，而经切割的 proBiTE-1则看到了明显的激活。这与HCT116细胞的结果相对，表明HCT116 细胞可能比HT29细胞表达更高水平的蛋白酶。
实施例6
双特异性抗体介导的人结肠癌细胞系的杀伤
HCT116和HT29细胞是贴壁的和成纤维细胞的，并且在RPMI 1640培养基中以单层生长，而PBMC细胞是圆形的并且在悬浮液中生长。与癌细胞的衔接引起T细胞的聚集和活化，最终导致癌细胞的杀伤。在显微镜下，iBiTE 和proBiTE-12在低至3.2pM的浓度下表现完全杀伤HCT116细胞(图15)。 HBiTE的效力小得多，仅在高浓度下才表现出明显的杀伤。proBiTE-1和 proBiTE-2的杀伤效率相当，并比iBiTE和proBiTE-12低约5倍。HT29细胞获得了相似的结果(图16)。
为了定量细胞杀伤效率，将稳定地转染有红色萤火虫萤光素酶基因的 HT29细胞用作靶细胞。结果显示，iBiTE和proBiTE-12表现出相当有效力的功效，EC50约为6pM(图17)。HBiTE能够在高浓度下杀伤癌细胞，但效力(EC50， 2000pM)比iBiTE低约300倍。在接头中具有蛋白酶切割位点的情况下， proBiTE-1给出约90pM的EC50，比iBiTE的EC50高15倍，这可能是由于在长时间的温育过程中前者的无效率切割和降解所致。预切割的proBiTE-1比完整的proBiTE-1更有效力，但效力仍比iBiTE低几倍，这可能是由于预切割的 proBiTE-1中EGFR结合抗体的VH和VL结构域之间的相互作用变差了。在所测试的浓度下，没有双特异性抗体显著抑制SW620细胞的增殖，表明对HT29 细胞的EGFR表达依赖性杀伤(数据未显示)。
实施例7
双特异性抗体与重组人FcγR的结合
含有Fc的BiTE可以引起表达FcR的细胞的有害的细胞毒性。由于人IgG1 的铰链区直接或间接参与Fc与FcγR的结合，因此假设使用缩短的铰链序列作为抗CD3 Fab与mFc之间的接头可以由于位阻和/或其他机制而导致FcγR结合降低。为了评估proBiTE的此类可能性，将人IgG1铰链序列(DKTHTCPPCP) (SEQ ID NO:64)的一部分(CPPCP(SEQ ID NO:154))用作接头(参见图3)，并将所得的proBiTE-1与抗EGFR IgG1针对与不同FcγR的结合进行比较。前者显示降低的与FcγRIIIA(10倍)和FcγRI(3倍)的相互作用(图18)。如通过ELISA所测定的，抗EGFR IgG1和proBiTE-1均未结合FcγRIIa和FcγRIIb。这些结果表明，与使用常规IgG1 Fc和全长铰链序列的BiTE相比，proBiTE对表达FcγRIIIa 和FcγRI的细胞的毒性较小。
实施例8
移植有人PBMC的NOD/SCID小鼠中肿瘤生长的抑制
为了测试proBiTE如何在体内抑制肿瘤生长，将移植有人PBMC的 NOD/SCID小鼠用作模型。药代动力学分析显示，在几乎所有时间点，iBiTE 和HBiTE的血清浓度均相对高于proBiTE-1和proBiTE-12，其中proBiTE-12显示最快的清除(图19)。与仅具有单个蛋白酶底物序列的proBiTE-1相比，在接头中具有两个不同蛋白酶底物序列的proBiTE-12的水平以更高的速率下降。这些结果表明，引入蛋白酶可切割的接头可以降低循环中双特异性抗体的稳定性。在肿瘤攻击实验中，proBiTE-12有效抑制了动物中HCT116细胞的生长 (图20)。
实施例9
长度和可切割接头组成改变的双特异性抗体变体的生成和表征
为了测试可切割接头的长度和组成的改变是否可以影响双特异性抗体的蛋白酶切割效率、细胞杀伤活性和其他特性，生成了三种proBiTE-1变体。 proBiTE-1s含有由GSLSGRSDNHGGGGS序列(SEQ ID NO:61)(下划线是 uPA、matriptase和豆荚蛋白的底物)组成的缩短的可切割多肽接头。用G残基取代proBiTE-1s的底物序列中的L残基导致第二种变体proBiTE-1s1(接头序列，GSGSGRSDNHGGGGS(SEQ ID NO:62))。proBiTE-1s的底物序列中的 SG残基也可以用GS残基取代，从而导致第三种变体proBiTE-1s2(接头序列，GSGGSRSDNHGGGGS(SEQ ID NO:63))。
发现uBi切割proBiTE-1s和proBiTE-1s1与proBiTE-1一样有效率，而 proBiTE-1s2对蛋白酶不敏感(图21)。这些结果表明，底物序列的第二和第三而不是第一氨基酸残基对于蛋白酶敏感性是关键的。尺寸排阻色谱表明，以上纯化的proBiTE-1变体中的绝大多数作为单体迁移，其aMW约为120kDa，与它们的计算分子量(cMW)相似(图22)。在流式细胞术分析中，所有三种 proBiTE-1变体均显示与表达CD3的Jurkat细胞的结合活性略有降低，而其与表达EGFR的HCT116的相互作用未受到影响(图23)。这些结果表明长度而不是氨基酸残基取代可以对可切割的接头的柔性和方向有影响。
proBiTE-1和proBiTE-1s显示出相似的杀伤效率，表明缩短可切割的接头对抗体功能没有影响(图24)。proBiTE-1s1与proBiTE-1s一样有效率地杀伤 HCT116，但是前者显示用HT29细胞的效率略有降低(2倍)。在这两种情况下，与其他变体相比，proBiTE-1s2的活性均显著降低，这表明底物序列中的SG 残基对蛋白酶的敏感性至关重要，与uPA切割的结果一致(图21)。
实施例10
具有双抗原结合位点的空间受限进入的双特异性抗体的合理设计(dproBiTE)
已经证明了proBiTE的蛋白酶依赖性功能的情况下，设计并评估了具有双抗原结合位点的空间受限进入的dproBiTE。假设将长柔性基序，例如天然存在的短的异源二聚化肽，添加到proBiTE中未受保护的抗原结合位点的N 端，可以导致该抗原结合位点的空间闭塞(图25)。可切割接头的蛋白酶切割将减少或消除空间闭塞，从而导致与抗原的蛋白酶依赖性相互作用(图26)。
实施例11
EGFR×CD3 dproBiTE的生成与表征
为了检验以上假设，生成了两种EGFR×CD3 dproBiTE，命名为 dproBiTE-HE和dproBiTE-GS。dproBiTE-HE携带人HER2跨膜结构域的N端 GXXXG样异源二聚化基序(LTSIISAVVG，(SEQ ID NO:65))和人EGFR跨膜结构域的N端GXXXG样异源二聚化基序(SIATGMVG，(SEQ ID NO:66))，其分别通过由(G4S)3和GGGGSGGGGSGRSDNH(SEQ ID NO:67)(下划线是 uPA、matriptase和豆荚蛋白的突变底物)序列组成的不可切割和可切割的接头融合至proBiTE-1s1中抗EGFR抗体的VH和VL结构域(图27)。在dproBiTE-GS 中，HER2和EGFR异源二聚化基序被(G4S)2序列取代。
两种dproBiTE在瞬时转染的293free style(293FS)细胞中表达良好，并分泌到培养物上清液中。在非还原性SDS-PAGE上，绝大多数纯化的抗体作为异源二聚体迁移，其表观分子量(aMW)约为115kDa(图28A)。在还原性SDS-PAGE上，dproBiTE的两条多肽链相互重叠，表观分子量略大于 proBiTE-1s1的表观分子量。与proBiTE-1s1相似，dproBiTE-HE和dproBiTE-GS 被uPA有效率地切割，从而产生了抗EGFR抗体的分离的VL结构域(图28B)。尺寸排阻色谱显示，绝大多数纯化的双特异性抗体作为单体迁移，其aMW 约为120kDa，与它们的计算分子量(cMW)相似(图29)。在流式细胞术分析中，如所预期的一样，dproBiTE-HE与表达EGFR的HCT116细胞结合的强度比 proBiTE-1s1低，并且它们与表达CD3的Jurkat细胞的结合没有受到影响(图30)。
实施例12
抗EGFR抗体的生成
本实施例描述了生成抗EGFR(表皮生长因子受体)抗体的一个实施方案。
材料和方法
细胞、蛋白质、质粒和其他试剂
293 free style(293FS)细胞和蛋白A琼脂糖购自ThermoFisher Scientific。CHO和A549细胞购自ATCC。重组人和食蟹猴EGFR是Sino Biological的产品。重组人EGF是AcroBiosystems的产品。用于哺乳动物表达的pDin1载体是通过重叠PCR和连接合成并组装的。载体含有两个转录单位和促进IgG1或Fc融合蛋白的克隆的不含内含子的内置人IgG1Fc基因片段。辣根过氧化物酶(HRP) 缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性)抗体和HRP缀合的抗FLAG抗体是Sigma的产品。抗His-PE缀合物购自Miltenyi Biotec。山羊F(ab’)2抗人IgG(γ)-FITC缀合物购自ThermoFisher Scientific。
用于鉴定EGFR抗体的噬菌体展示纯天然人Fab文库的淘选和筛选
根据先前公开的方案(de Haard et al.,J Biol Chem 1999,274:18218-18230)用来自约100个健康个体的外周血B细胞构建了大尺寸(1011)噬菌体展示天然人Fab库。如前所述(Zhu et al.,J Virol 2006,80:891-899)，将该文库用于选择针对与磁珠(DynabeadsM-270 epoxy；DYNAL Inc.)缀合的重组人EGFR的抗体，除了分别在于第一、第二和第三轮淘选中使用5、1和0.1μg的抗原。如所述(Zhu et al.,J Virol 2006,80:891-899)，通过使用单克隆噬菌体ELISA从第三轮生物淘选中鉴定出与抗原结合的克隆。
SMET5的亲和力成熟
对于SMET5的亲和力成熟，构建并淘选了噬菌体展示轻链改组Fab文库，并根据先前报道的方案(Zhu et al.,J Infect Dis 2008,197:846-853)选择了具有更高结合活性的SMET5变体。
SMET5变体的人IgG1的克隆
使用了以下引物：
ER1HF，(有义)(SEQ ID NO:100)；ER1HR，(反义)(SEQ ID NO:101)
ER1LF，(有义)(SEQ ID NO:102)；ER1LR，(反义)(SEQ ID NO:103)
ER12LF1，(有义)(SEQ ID NO:104)；ER12LR1，(反义)(SEQ ID NO:105)
ER12LF2，(有义)(SEQ ID NO:106)；ER13LF，(有义)(SEQ ID NO:107)
bnIgG20H1，(有义)(SEQ ID NO:108)；bnIgG20L1，(有义)(SEQ ID NO:109)。
对于SMET5 IgG1的克隆，用引物ER1HF和ER1HR对SMET5 VH基因片段进行PCR扩增。通过相同摩尔浓度的两个基因片段的重叠PCR进行在不存在引物的情况下的7个循环和在存在引物bnIgG20H1和ER1HR的情况下的15 个另外的循环，将编码前导肽的基因片段(Hleader)与VH融合。用XbaI和SacI 消化重叠PCR产物Hleader-VH，并将其克隆到具有编码人IgG1重链恒定区的内置基因序列的pDin1载体中。用引物ER1LF和ER1LR对SMET5 L链基因片段进行PCR扩增。利用引物bnIgG20L1和ER1LR通过重叠PCR，将编码前导肽的基因片段(Lleader)与L链融合。用HindIII和EcoRI消化重叠PCR产物 Lleader-L，并将其克隆到含有SMET5 IgG1的重链的pDin1构建体中。
对于SMET5.2 IgG1的克隆，分别用引物对ER12LF1/ER12LR1和 ER12LF2/ER1LR对SMET5.2 L链基因片段的N和C端部分PCR扩增。利用引物ER12LF1和ER1LR通过重叠PCR，组装全长的SMET5.2 L链。然后利用引物bnIgG20L1和ER1LR通过重叠PCR，将Lleader基因片段与L链融合。用 HindIII和EcoRI消化重叠PCR产物Lleader-L，并将其克隆到含有SMET5 IgG1的重链的pDin1构建体中。
对于SMET5.3 IgG1的克隆，用引物ER13LF和ER1LR对SMET5.3的L链进行PCR扩增。然后利用引物bnIgG20L1和ER1LR通过重叠PCR，将Lleader基因片段与L链融合。用HindIII和EcoRI消化重叠PCR产物Lleader-L，并将其克隆到含有SMET5 IgG1的重链的pDin1构建体中。
蛋白质表达和纯化
如先前所述(Chen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:17121-17126)，Fab抗体在大肠杆菌HB2151细胞中表达并且IgG1在293FS细胞中表达。根据制造商的方案，通过使用Ni-NTA树脂(Qiagen)从HB2151周质的可溶级分中纯化带His标签的Fab抗体。根据制造商的说明，通过使用蛋白A Sepharose 4 Fast Flow柱色谱(GE Healthcare)从293FS培养上清液中纯化IgG1。
ELISA
根据标准方案进行ELISA。简而言之，将重组人或食蟹猴EGFR以每孔 50ng在4℃下在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上包被过夜，并用PBS(pH7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。添加五倍系列稀释的抗体，并在室温下温育2小时。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤板。分别通过HRP缀合的抗 FLAG标签抗体和HRP缀合的抗人IgG(Fc特异性)抗体检测结合的Fab和IgG1。该测定是在室温下用TMB底物(Sigma-Aldrich)进行的，并使用酶标仪在450 nm处进行监测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC50)。
流式细胞术
为了测量SMET5 Fab与细胞表面EGFR的结合，将约5×105个细胞与100 nM抗体在冰上温育1小时。用含有0.1％牛血清白蛋白的PBS(PBSA)洗涤细胞一次，并将其重悬于200μl PBSA中。然后添加5μl抗His-PE缀合物并温育30 分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后将其用于流式细胞术分析。
为了测量SMET5变体的IgG1与细胞表面EGFR的结合，将约5×105个细胞与2μg mL-1抗体在冰上温育1小时。用PBSA洗涤细胞一次，并将其重悬于 200μl PBSA中。然后添加5μl山羊F(ab’)2抗人IgG(γ)-FITC缀合物并温育30 分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后将其用于流式细胞术分析。
为了测量SMET5.2 IgG1和EGF与细胞表面EGFR的竞争结合，将约5× 105个细胞在不存在或存在处于40μg mL-1的EGF的情况下与处于2μg mL-1的 SMET5.2 IgG1在冰上温育30分钟。用PBSA洗涤细胞一次，并将其重悬于200 μl PBSA中。然后添加4μl山羊F(ab’)2抗人IgG(γ)-FITC缀合物并温育30分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后将其用于流式细胞术分析。
小鼠中的药代动力学测量
在第0天向NOD/SCID小鼠静脉内施用500μg抗体。在第1、3、5和6天收集血浆样品，并将其用于抗体血清浓度的测量，所述测量通过ELISA以使用原始抗体存储生成的标准曲线进行。
体内肿瘤生长抑制
用106个A431细胞皮下接种至SCID小鼠的左腹侧对小鼠进行接种。一旦肿瘤达到100-150mm3的体积，将小鼠随机分为5只小鼠/相等平均肿瘤体积组，并用107个人PBMC静脉内重建。一天后，每3-4天用PBS、0.5mg SMET5.2 IgG1或0.5mg对照抗体对小鼠静脉内给药，达6剂。治疗一个月后，处死小鼠并测量肿瘤重量。使用以下公式计算肿瘤生长抑制率：PBS组的平均重量- 抗体治疗组的平均重量/PBS组的平均重量。
结果和讨论
完全人抗EGFR抗体的选择和亲和力成熟
淘选和筛选大型噬菌体展示天然人Fab文库导致鉴定出三种针对EGFR 的抗体。一种名为SMET5的抗体与表达EGFR的人肺癌细胞系A549显著结合，但不与人EGFR阴性CHO细胞结合，因此表明该抗体具有特异性(图31)。为了改善其亲和力，用SMET5的重链构建了轻链改组Fab文库。淘选和筛选新文库导致鉴定出三种SMET5变体，即SMET5.2、SMET5.3和SMET5.4。在 ELISA中，SMET5.2和SMET5.3显示出对重组人EGFR的结合活性高于 SMET5，而SMET5.4的结合活性略有降低(图32)。
SMET5、SMET5.2和SMET5.3 IgG1的生成和体外表征
为了评估将EGFR抗体开发为候选疗法的潜力，生成了IgG1形式的全长 SMET5、SMET5.2和SMET5.3抗体，其赋予了二价(亲合力)和体内长半衰期。通过使用蛋白A从瞬时转染的293FS细胞培养上清液中表达和纯化IgG1抗体，产率为10-20mg L-1(图33)。尺寸排阻色谱表明，PBS(pH7.4)中绝大多数(> 95％)纯化的IgG1是单体，表观分子量约为150kDa，与它们的计算分子量相当(图34)。在ELISA中，它们显示与人和食蟹猴EGFR的交叉反应性，其中SMET5.2 IgG1具有最高的结合活性(EC50，人EGFR为1.4nM，食蟹猴EGFR 为0.76nM)(图35)。在2μg mL-1的浓度下，SMET5和SMET5.2 IgG1具有与 A549细胞相当的结合，而SMET5.3 IgG1则显示出相对较低的结合活性(图36)。未检测到与CHO细胞的结合，表明IgG1的高特异性。所有IgG1都与EGF有效率地竞争与细胞表面EGFR的结合(图37)。
移植有人PBMC的NOD/SCID小鼠中肿瘤生长的抑制
为了测试抗体可以如何在体内抑制肿瘤生长，将移植有A431细胞和人 PBMC的NOD/SCID小鼠用作模型。药代动力学分析显示，SMET5.2 IgG1从小鼠循环中被缓慢清除(图38)。在肿瘤攻击实验中，抗体显著抑制了动物中 A431细胞的生长(图39)。
实施例13
与CD3的结合亲和力降低的EGFR×CD3双特异性抗体的克隆细胞、蛋白质、质粒和 其他试剂
293 free style(293FS)细胞和蛋白A琼脂糖购自ThermoFisher Scientific。HCT116和HT29结肠癌细胞系购自Sigma。其他细胞系购自ATCC。重组人 EGFR、人CD3(hCD3)、食蟹猴CD3(cCD3)和尿激酶(uPA)是Sino Biological 的产品。通过重叠PCR和连接合成和组装用于哺乳动物表达的pDin1载体。载体含有两个转录单位和促进IgG1或Fc融合蛋白的克隆的不含内含子的内置人IgG1 Fc基因片段。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性) 抗体是Sigma的产品。山羊抗人IgG(Fc特异性)-FITC缀合物购自ThermoFisherScientific。
与CD3的结合亲和力降低的EGFR×CD3双特异性抗体的克隆
使用了以下引物：
SP34HF，(有义)(SEQ ID NO:110)；SP34HR，(反义)(SEQ ID NO:111)
CFCF，(有义)(SEQ ID NO:112)；MFc7.2R1，(反义)(SEQ ID NO:113)
SP34LF，(有义)(SEQ ID NO:114)；SP34LR，(反义)(SEQ ID NO:115)
CFCPAF，(有义)(SEQ ID NO:116)；AAAR，(反义)(SEQ ID NO:117)
bnIgG20H1，(有义)(SEQ ID NO:118)
SFPAF，(有义)(SEQ ID NO:119)
SFF，(有义)(SEQ ID NO:120)；VNFR，(反义)(SEQ ID NO:121)
bnIgG20L1，(有义)(SEQ ID NO:122)
VNFF，(有义)(SEQ ID NO:123)；HSPGF，(反义)(SEQ ID NO:124)
iBiTE-sp的克隆
通过整合DNA技术以化学方式合成人源化SP34(hSP34)抗体scFv基因 (参见美国专利US 8,236,308和US 9,493,563)。为了克隆iBiTE-sp的重链(参见图40)，用合成的hSP34 scFv基因作为模板以及引物SP34HF和SP34HR对 hSP34 VH基因片段进行PCR扩增。用先前构建的质粒iBiTE(美国临时专利申请#62/783,411)作为模板以及引物CFCF和MFc7.2R1，对编码人IgG1 CH1和单体Fc(CH1-mFc7.2)的基因片段进行PCR扩增。通过相同摩尔浓度的两个基因片段的重叠PCR进行在不存在引物的情况下的7个循环和在存在引物SP34HF 和MFc7.2R1的情况下的15个另外的循环，将编码hSP34 VH基因片段与 CH1-mFc7.2的5’末端融合。用SacI和EcoRI消化重叠的产物hSP34 VH-CH1-mFc7.2，并用插入的抗EGFR抗体SMET5.2 scFv将其克隆到iBiTE质粒中。
为了克隆iBiTE-sp的轻链(参见图40)，用合成的hSP34 scFv作为模板以及引物SP34LF和SP34LR，对hSP34 VL基因片段进行PCR扩增。用先前构建的质粒iBiTE作为模板以及引物CFCPAF和AAAR，对编码人抗体CL结构域、单体Fc和poly A信号序列(CL-mFc7.2-polyA)的基因片段进行PCR扩增。然后利用引物bnIgG20H1和SP34LR通过重叠PCR，将编码前导肽的基因片段 (Hleader)与hSP34 VL的5’末端融合。利用引物bnIgG20H1和AAAR通过重叠 PCR，将Hleader-hSP34 VL进一步与CL-mFc7.2-polyA的5’末端连接。用XbaI 和SalI消化产物，并将其克隆到含有hSP34 VH-CH1-mFc7.2的先前的质粒中，从而得到最终的构建体iBiTE-sp。
proBiTE-1s1sp的克隆
用iBiTE-sp作为模板以及引物SFPAF和AAAR，对编码hSP34 VL-CL-mFc7.2-polyA的基因片段进行PCR扩增。用BamHI和SalI消化PCR产物，并将其克隆到先前构建的质粒proBiTE-1s1(美国临时专利申请 #62/783,411)中。然后用iBiTE-sp作为模板以及引物SFF和MFc7.2R1，对编码 hSP34 VH-CH1-mFc7.2的基因片段进行PCR扩增。用SacI和EcoRI消化PCR产物，并将其克隆到含有hSP34 VL-CL-mFc7.2-polyA的先前的质粒中，从而得到最终的构建体proBiTE-1s1sp。
proBiTE-1s1spg的克隆
用proBiTE-1s1sp作为模板以及引物bnIgG20L1和VNFR，对编码前导肽、抗EGFR抗体SMET5.2 VH和hSP34 VH的N端部分的基因片段进行PCR扩增。用proBiTE-1s1sp作为模板以及引物VNFF和MFc7.2R1对编码hSP34 VH的C 端部分和CH1-mFc7.2的另一个基因片段进行PCR扩增。利用引物bnIgG20L1 和MFc7.2R1通过重叠PCR将两个基因片段相互融合。用HindIII和EcoRI消化产物，并将其克隆到proBiTE-1s1sp中，从而得到最终的构建体proBiTE-1s1spg。
HBiBody-spg的克隆
用proBiTE-1s1spg作为模板以及引物HSPGF和AAAR，对编码hSP34 L链、 mFc7.2和polyA信号序列的基因片段进行PCR扩增。用BamHI和SalI消化PCR 产物，并将其克隆到通过BamHI和SalI线性化的proBiTE-1s1spg中。
蛋白质表达和纯化
如先前所述(Chen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:17121-17126)，所有双特异性抗体均在293FS细胞中表达，并根据制造商的说明，使用蛋白A Sepharose 4Fast Flow柱色谱(GE Healthcare)从293FS培养上清液中对其进行纯化。
蛋白酶切割
为了用尿激酶(uPA)进行切割，在15μl PBS(pH7.4)中将5μg抗体与1μg 重组人uPA(Sino Biological)混合，或者不与之混合，并在室温下温育1小时。
ELISA
根据标准方案进行ELISA。简而言之，将重组抗原以每孔100ng在4℃下在CorningEIA/RIA高结合96孔板(Corning Inc.)上包被过夜，并用PBS (pH7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。添加五倍系列稀释的生物素化抗体，并在室温下温育2小时。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤板。通过山羊抗人IgG(Fc 特异性)抗体检测结合的抗体。在室温下用TMB底物(Sigma-Aldrich)进行该测定，并使用酶标仪在450nm处进行监测。通过将数据拟合至S形吸附等温线来计算半数最大结合(EC50)。
流式细胞术
将约5×105个细胞与抗体在冰上温育1小时。用含有0.1％牛血清白蛋白的PBS(PBSA)洗涤细胞一次，并将其重悬于100μl PBSA中。然后添加1μl 山羊抗人IgG(Fc特异性)-FITC缀合物(Invitrogen)并温育30分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后将其用于流式细胞术分析。通过将数据拟合至S形等温线来计算EC50。
尺寸排阻色谱
用碳酸酐酶(29kDa)，卵清蛋白(44kDa)，伴清蛋白(75kDa)，醛缩酶(158 kDa)和铁蛋白(440kDa)的蛋白质分子质量标准物校准Superdex200 10/300 GL柱(GE Healthcare)。将在PBS(pH7.4)中浓度为1mg/mL的纯化蛋白质上样到预平衡的柱上，并以0.5mL/min用PBS(pH7.4)洗脱。
体外杀伤测定
对于使用萤光素酶作为报告基因的测定，将104个靶细胞接种在100μl RPMI 1640完全培养基中过夜。同时，将从STEMCELL Technologies购买的2.5×107个冷冻的人外周血单个核细胞(PBMC)复活并在含有50U/mL IL-2 (Sigma)的10mL RPMI 1640完全培养基中培养过夜。第二天，将培养基从靶细胞中去除，并添加50μl RPMI 1640完全培养基中的5×104个PBMC(实际靶标:效应物的比率＝1:2.5，因为靶细胞复制过夜)。然后，将50μl抗体(从1nM连续稀释5倍)添加到每个孔中。二十四小时后，以100的感染复数(MOI)添加 20μl编码萤光素酶基因的腺病毒(Ad5-Luc)，其有效感染靶细胞但不感染效应细胞。二十四小时后，根据制造商的说明，使用Promega Bright-Glo萤光素酶测定系统测量细胞活力。使用以下公式计算细胞杀伤力：1-(抗体和 Ad5-Luc处理组的平均读数–仅细胞组的平均读数)/(PBS和Ad5-Luc处理组的平均读数–仅细胞组的平均读数)。
对于使用MTS四唑化合物作为报告试剂的测定，将104个靶细胞接种在 100μlRPMI 1640完全培养基中过夜。同时，将从STEMCELL Technologies 购买的2.5×107个冷冻的人外周血单个核细胞(PBMC)复活并在含有50U/mL IL-2(Sigma)的10mL RPMI 1640完全培养基中培养过夜。第二天，将培养基从靶细胞中去除，并添加50μl RPMI 1640完全培养基中的105个PBMC(实际靶标:效应物的比率＝1:5，因为靶细胞复制过夜)。然后，将50μl抗体(从10nM 连续稀释5倍)添加到每个孔中。四十八小时后，将板轻轻摇动，并将重悬的 PBMC与用过的培养基一起除去。用100μl新鲜的RPMI 1640完全培养基将平板的每个孔洗涤一次，以完全去除重悬的PBMC。然后将100μl新鲜的RPMI 1640完全培养基添加到每个孔中，并根据制造商的说明使用Promega CellTiter
Figure BDA0003113157090000391
AQueous One Solution细胞增殖测定法测量细胞活力。使用以下公式计算细胞杀伤：1-(抗体处理组的平均读数–仅培养基组的平均读数)/(PBS处理组的平均读数–仅培养基组的平均读数)。
实施例14
与CD3结合减少的新双特异性EGFR×CD3抗体的设计
为了提供概念验证，此处和下文中使用抗EGFR和抗CD3抗体作为实例。本领域普通技术人员将认识到，如本文所述，可以容易地采用其他T和非T 细胞靶抗原。
已经生成了一系列新的蛋白酶可活化的双特异性EGFR×CD3抗体，其证明了优异的药物相关特性和对表达EGFR的人结肠癌细胞的有效力的T细胞介导的杀伤(美国临时专利申请#62/783,411)。先前发明中使用的抗CD3抗体，人源化OKT3(hOKT3)，不与常用的药理相关物种如小鼠和食蟹猴发生交叉反应。因此，在本发明中，使用工程化人源化SP34(hSP34)设计了新的双特异性EGFR×CD3抗体，所述SP34对人和几种非人灵长类动物如食蟹猴的CD3 分子具有交叉反应性。
生成了称为proBiTE-1s1sp的新的双特异性抗体，其中抗EGFR抗体 SMET5.2的VH和VL结构域分别经由蛋白酶不可切割的(G4S)3接头和蛋白酶可切割的接头GSGSGRSDNHGGGGS(SEQ ID NO:62)(下划线是uPA、 matriptase和豆荚蛋白的底物序列)融合至抗CD3抗体hSP34 Fab的VH和VL结构域的N端。将抗CD3 Fab进一步融合至含有两个能够降低Fc同源二聚化的氨基酸突变(T366L/Y407H)的单体人IgG1 Fc(mFc7.2)的N端(图40)。
在文献中众所周知，T细胞可以通过T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上的肽-MHC复合物的低亲和力结合(在1-90μM的范围内)得到有效地激活。因此可以想象，与TCR/CD3复合物结合的双特异性抗体和与癌症相关的抗原也可能不需要高亲和力即可有效激活T细胞。另外，与CD3的低亲和力结合可以是有利的，因为它将减少可能潜在导致不良副作用的双特异性抗体在T细胞上的定位。这些包括但不限于T细胞的非特异性活化，干扰T细胞的正常免疫应答以及(如果双特异性抗体含有Fc)其他细胞毒性细胞(如巨噬细胞和NK 细胞)的Fc受体(FcR)介导的T细胞杀伤。
在初步实验中，发现hSP34 Fab对表达CD3的Jurkat细胞具有约20nM的亲和力。相信可以进一步降低hSP34的亲和力以扩大双特异性抗体的治疗窗口。使用IMGT/V-QUEST分析hSP34重链CDR3(HCDR3)的接合区，发现与最接近的人抗体种系序列相比，存在三个氨基酸残基突变，一个在V区 (A105V)且两个(S111.1N和Y112.2S)在D区(图41)。假设由于A和V，S和N氨基酸的相似特性，V105和N111.1残基向其种系序列的反向突变可能保留但降低了hSP34的结合亲和力，同时潜在地使人类的免疫原性最小化。为了验证这一假设，通过将V105A和N111.1S取代引入proBiTE-1s1sp构建体，生成了一种新的双特异性抗体，名为proBiTE-1s1spg(图40)。此外，VL的FR2中的两个氨基酸残基也被反向突变为其种系序列(E44Q和F50P，IMGT编号方案)。
已经显示，连接抗EGFR和抗CD3抗体的VH和VL结构域的多肽接头可以通过产生位阻而降低抗CD3抗体的结合活性(美国临时专利申请#62/783,411)。为了测试proBiTE-1s1sp和proBiTE-1s1spg的可能性，设计了对照构建体 iBiTE-sp，其中抗EGFR抗体的scFv经由G4S接头融合至hSP34的VH-CH1的N 端，并因此，与CD3的结合在空间上不受接头的限制(图40)。通过用蛋白酶不可切割的接头(GSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:127))替代proBiTE-1s1spg 中的蛋白酶可切割的接头(GSGSGRSDNHGGGGS(SEQ ID NO:62))生成了另一种构建体，称为HBiTE-spg(图40)。
实施例15
与CD3结合减少的EGFR×CD3双特异性抗体的生成和初步表征
所有双特异性抗体均在瞬时转染的293 free style(293FS)细胞中良好表达，并分泌到培养上清液中。在非还原性SDS-PAGE上，绝大多数纯化的抗体作为异源二聚体迁移，其表观分子量(aMW)约为120kDa(图42)。在还原性 SDS-PAGE上，iBiTE-sp的两条多肽链得以充分分开，而其他双特异性抗体的两条多肽链则相互重叠，表观分子量(aMW)约为60kDa。
proBiTE-1s1sp和proBiTE-1s1spg被uPA有效切割，从而产生了抗EGFR抗体的分离的VL结构域，而其他双特异性抗体对蛋白酶不敏感(图43)。尺寸排阻色谱分析显示，绝大多数纯化的双特异性抗体作为单体迁移，其aMW近似于或略大于其计算分子量(cMW)(图44)。
实施例16
双特异性抗体与CD3的交叉反应性结合
首先测量双特异性抗体与重组人EGFR(hEGFR)和人CD3(hCD3)和食蟹猴CD3(cCD3)的ELISA结合。四种双特异性EGFR×CD3抗体与hEGFR的结合同样良好(图45)。它们都没有与重组人HER4(hHER4)(无关的对照抗原)相互作用。它们还与hCD3(iBiTE-sp、proBiTE-1s1sp、proBiTE-1s1spg和HBiTE-spg 的EC50分别为1.3、1.9、3.4和4.5nM)和cCD3(BiTE-sp、proBiTE-1s1sp、 proBiTE-1s1spg和HBiTE-spg的EC50分别为1.6、2.4、4.5和3.8nM)强结合(图 46)。对照HBiTE(双特异性FLT3×CD3抗体)不与hEGFR、hCD3和cCD3相互作用。这些结果表明双特异性EGFR×CD3抗体的高特异性。
接下来测试具有不同结构和接头组成的双特异性抗体如何结合细胞表面EGFR和CD3。在2μg/mL的浓度下，没有双特异性抗体与不表达人EGFR 和CD3的CHO细胞相互作用，而iBiTE-sp与表达EGFR的HCT116和表达CD3 的Jurkat两种细胞结合，表明抗EGFR和抗CD3抗体的特异性结合活性(图47)。 proBiTE-1s1sp与HCT116细胞以及iBiTE-sp结合，而与Jurkat细胞的结合降低了大约两倍，这表明抗CD3抗体hSP34的结合活性仅受连接抗EGFR和抗CD3 抗体的多肽接头的轻微影响。该结果与先前发明中的发现，即在相同的实验环境中，proBiTE-1s1中抗CD3抗体hOKT3的结合活性被完全废除(美国临时专利申请#62/783,411)相反。
如所预期的，hSP34 HCDR3的V105和N111.1残基向其种系序列的反向突变进一步降低了proBiTE-1s1spg和HBiTE-spg与Jurkat细胞的结合，表明这两个取代确实可以保留但降低hSP34的结合亲和力。当以不同浓度测试双特异性抗体时，iBiTE-sp以25nM的EC50与Jurkat细胞结合(图48)。相比之下， proBiTE-1s1sp的结合亲和力(EC50，105nM)降低了大约四倍。在EC50>500nM 的情况下，proBiTE-1s1spg和HBiTE-spg的结合亲和力进一步降低。
实施例17
双特异性抗体介导的人结肠癌细胞系的杀伤
HCT116和HT29细胞分别是具有KRAS(G13D)和BRAF(V600E)突变的人结肠癌细胞系。它们对使用FDA批准的抗EGFR单克隆抗体CETUXIMAB 的治疗不敏感。因此，对于具有此类突变的结直肠癌的新型治疗策略存在未满足的需求。HCT116和HT29细胞是贴壁的和成纤维细胞的，并在RPMI 1640 培养基中单层生长。
在一个杀伤测定中，将表达EGFR的HCT116和EGFR阴性的CHO细胞(其用编码萤光素酶报告基因的5型腺病毒(Ad5-Luc)感染)用作靶细胞。结果显示，尽管双特异性抗体与表达CD3的Jurkat细胞具有实质上不同的结合(图48)，但它们以约1-3pM的EC50表现出对HCT116细胞的相当有效力的杀伤(图49)。抗EGFR IgG1抗体对HCT116细胞没有影响，并且没有抗体显著抑制CHO细胞的生长。这些结果表明，与CD3的低亲和力结合(>500nM，HBiTE-spg)可以与高亲和力的CD3结合(25nM，iBiTE-sp)一样有效地激活T细胞。
在另一个杀伤测定中，将MTS四唑化合物用作报告试剂。在抗CD3抗体上具有突变的HCDR3和轻链FR2的proBiTE-spg和HBiTE-spg均以相似的效率杀伤HCT116和HT29细胞(图50)。
序列表
<110> 浙江时迈药业有限公司
<120> 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
<130> 11023.1004 PCT
<160> 172
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1重链(SEQ ID NO:1):
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 2
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1轻链(SEQ ID NO:2):
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
130 135 140
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
165 170 175
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
195 200 205
Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
245 250 255
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
260 265 270
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
275 280 285
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
305 310 315 320
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
325 330 335
Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
340 345 350
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
355 360 365
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
370 375 380
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
385 390 395 400
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
405 410 415
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
420 425 430
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
435 440 445
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
450 455 460
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
485 490 495
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
500 505 510
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
515 520 525
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
530 535 540
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
545 550 555 560
Lys
<210> 3
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-2重链(SEQ ID NO:3):
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 4
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-2轻链(SEQ ID NO:4):
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
130 135 140
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
165 170 175
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
195 200 205
Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
245 250 255
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
260 265 270
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
275 280 285
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
305 310 315 320
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
325 330 335
Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
340 345 350
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
355 360 365
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
370 375 380
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
385 390 395 400
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
405 410 415
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
420 425 430
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
435 440 445
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
450 455 460
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
485 490 495
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
500 505 510
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
515 520 525
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
530 535 540
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
545 550 555 560
Lys
<210> 5
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-12重链(SEQ ID NO:5):
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 6
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-12轻链(SEQ ID NO:6):
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Pro Leu Gly Leu Ala
115 120 125
Arg Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
145 150 155 160
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
165 170 175
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
210 215 220
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
245 250 255
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
260 265 270
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
275 280 285
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
305 310 315 320
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
325 330 335
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
340 345 350
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
355 360 365
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
370 375 380
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
385 390 395 400
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
405 410 415
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
420 425 430
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
435 440 445
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
450 455 460
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
465 470 475 480
Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
485 490 495
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
500 505 510
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr
515 520 525
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
530 535 540
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
545 550 555 560
Ser Pro Gly Lys
<210> 7
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iBiTE重链(SEQ ID NO:7):
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Met Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Leu Asp Ser Phe Pro Phe Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Leu Lys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
260 265 270
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
275 280 285
Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
305 310 315 320
Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr
325 330 335
Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
340 345 350
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
355 360 365
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
385 390 395 400
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
405 410 415
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
420 425 430
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
450 455 460
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
595 600 605
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 8
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iBiTE轻链(SEQ ID NO:8):
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
225 230 235 240
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
245 250 255
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
260 265 270
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
275 280 285
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
290 295 300
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
305 310 315 320
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
325 330 335
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
340 345 350
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
355 360 365
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
370 375 380
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp
385 390 395 400
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
405 410 415
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Lys
<210> 9
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBiTE重链(SEQ ID NO:9):
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 10
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBiTE轻链(SEQ ID NO:10):
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
355 360 365
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
370 375 380
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
385 390 395 400
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
405 410 415
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
420 425 430
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
450 455 460
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
485 490 495
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
515 520 525
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
530 535 540
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 11
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s 重链(SEQ ID NO:11):
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 12
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s 轻链(SEQ ID NO:12):
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Leu
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
355 360 365
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
370 375 380
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
385 390 395 400
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
405 410 415
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
420 425 430
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
450 455 460
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
485 490 495
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
515 520 525
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
530 535 540
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 13
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1 重链(SEQ ID NO:13):
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 14
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1 轻链(SEQ ID NO:14):
<400> 14
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
355 360 365
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
370 375 380
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
385 390 395 400
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
405 410 415
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
420 425 430
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
450 455 460
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
485 490 495
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
515 520 525
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
530 535 540
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 15
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s2 重链(SEQ ID NO:15):
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
145 150 155 160
Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
180 185 190
Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
355 360 365
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
370 375 380
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
420 425 430
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
435 440 445
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
485 490 495
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
500 505 510
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
515 520 525
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
530 535 540
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
545 550 555 560
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570 575
Lys
<210> 16
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s2 轻链(SEQ ID NO:16):
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Ser Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
165 170 175
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
245 250 255
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
260 265 270
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
275 280 285
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
290 295 300
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
305 310 315 320
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
325 330 335
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
355 360 365
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
370 375 380
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
385 390 395 400
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
405 410 415
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
420 425 430
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
450 455 460
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
485 490 495
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
515 520 525
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
530 535 540
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 17
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dproBiTE-HE 重链(SEQ ID NO:17):
<400> 17
Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Thr
20 25 30
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
35 40 45
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln
50 55 60
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly
65 70 75 80
Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
100 105 110
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg
115 120 125
Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
180 185 190
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
195 200 205
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys
210 215 220
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu
225 230 235 240
Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
275 280 285
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
290 295 300
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
305 310 315 320
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
325 330 335
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
340 345 350
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
355 360 365
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys
370 375 380
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
385 390 395 400
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
405 410 415
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
420 425 430
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
435 440 445
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
450 455 460
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
465 470 475 480
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
485 490 495
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
500 505 510
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
515 520 525
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
530 535 540
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
545 550 555 560
Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
565 570 575
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
580 585 590
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 18
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dproBiTE-HE 轻链(SEQ ID NO:18):
<400> 18
Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
35 40 45
Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser
165 170 175
Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys
180 185 190
Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser
210 215 220
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
225 230 235 240
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr
245 250 255
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
260 265 270
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
275 280 285
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
290 295 300
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
325 330 335
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
340 345 350
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 19
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dproBiTE-GS 重链(SEQ ID NO:19):
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Thr
20 25 30
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
35 40 45
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln
50 55 60
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly
65 70 75 80
Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
100 105 110
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg
115 120 125
Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
180 185 190
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
195 200 205
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys
210 215 220
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu
225 230 235 240
Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
275 280 285
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
290 295 300
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
305 310 315 320
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
325 330 335
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
340 345 350
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
355 360 365
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys
370 375 380
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
385 390 395 400
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
405 410 415
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
420 425 430
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
435 440 445
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
450 455 460
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
465 470 475 480
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
485 490 495
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
500 505 510
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
515 520 525
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
530 535 540
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
545 550 555 560
Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
565 570 575
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
580 585 590
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 20
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dproBiTE-GS 轻链(SEQ ID NO:20):
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Asp Val Val Met Thr Gln
20 25 30
Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
35 40 45
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu
65 70 75 80
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe Ser Phe Thr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn
130 135 140
His Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
165 170 175
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
180 185 190
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
195 200 205
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile
210 215 220
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
225 230 235 240
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
245 250 255
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
260 265 270
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
275 280 285
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
290 295 300
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
325 330 335
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
340 345 350
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
355 360 365
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
370 375 380
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
385 390 395 400
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
405 410 415
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
420 425 430
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
435 440 445
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
450 455 460
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
465 470 475 480
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
485 490 495
Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
500 505 510
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
515 520 525
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His
530 535 540
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
545 550 555 560
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
565 570 575
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ile Ala Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Gln Thr Val Asp Ser Trp
1 5
<210> 27
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ala Thr Ser
1
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gln Gln Gly His Ile Ala Pro His Thr
1 5
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys
100 105
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Gln Ser Met Ser Arg Trp
1 5
<210> 32
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Ala Thr Ser
1
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe Ser Phe Thr
1 5 10
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Asn Gln Thr Ala Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Met Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Gln Thr Ala Asp Ser Trp
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Ala Ala Ser
1
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Met Phe Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Tyr Asp Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 42
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Ala Ala Ser
1
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Leu Trp Thr
1 5
<210> 44
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 45
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ile Ala Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 46
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 47
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 48
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 49
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Asn Gln Thr Ala Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Met Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 50
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1sp的重链 (SEQ ID NO:50)
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
180 185 190
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
225 230 235 240
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
275 280 285
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
340 345 350
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 51
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1sp的轻链 (SEQ ID NO:51)
<400> 51
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
210 215 220
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
405 410 415
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
420 425 430
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
435 440 445
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
450 455 460
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
465 470 475 480
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
485 490 495
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
500 505 510
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp
515 520 525
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
530 535 540
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
545 550 555 560
Gly Lys
<210> 52
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1spg的重链 (SEQ ID NO:52)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
180 185 190
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Ser
225 230 235 240
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
275 280 285
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
340 345 350
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 53
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> proBiTE-1s1spg的轻链 (SEQ ID NO:53)
<400> 53
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala
145 150 155 160
Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
210 215 220
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
405 410 415
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
420 425 430
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
435 440 445
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
450 455 460
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
465 470 475 480
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
485 490 495
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
500 505 510
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp
515 520 525
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
530 535 540
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
545 550 555 560
Gly Lys
<210> 54
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iBiTE-sp的重链 (SEQ ID NO:54)
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Met Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Leu Asp Ser Phe Pro Phe Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Leu Lys Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
290 295 300
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
340 345 350
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
370 375 380
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
405 410 415
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
420 425 430
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
435 440 445
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
450 455 460
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
595 600 605
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695
<210> 55
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iBiTE-sp的轻链 (SEQ ID NO:55)
<400> 55
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
210 215 220
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
225 230 235 240
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
245 250 255
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
260 265 270
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
275 280 285
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
290 295 300
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
325 330 335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435
<210> 56
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBiTE-spg的重链 (SEQ ID NO:56)
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Val Ala Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
180 185 190
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Ser
225 230 235 240
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
260 265 270
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
275 280 285
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
290 295 300
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
340 345 350
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 57
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBiTE-spg的轻链 (SEQ ID NO:57)
<400> 57
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Met Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val Thr Gln Ser
115 120 125
Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
130 135 140
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn
165 170 175
Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly
180 185 190
Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
355 360 365
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
370 375 380
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
385 390 395 400
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
405 410 415
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
420 425 430
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
435 440 445
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
450 455 460
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu
465 470 475 480
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
485 490 495
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
500 505 510
Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
515 520 525
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
530 535 540
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GGGGSLSGRSDNHGGGGS (SEQ ID NO:58)
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GGGGSGPLGLARKGGGGS (SEQ ID NO:59)
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Arg Lys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GGGGSLSGRSDNHGPLGLARK (SEQ ID NO:60)
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Pro Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Arg Lys
20
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GSLSGRSDNHGGGGS (SEQ ID NO:61)
<400> 61
Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GSGSGRSDNHGGGGS (SEQ ID NO:62)
<400> 62
Gly Ser Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头, GSGGSRSDNHGGGGS (SEQ ID NO:63)
<400> 63
Gly Ser Gly Gly Ser Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链序列 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:64)
<400> 64
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人HER2跨膜结构域的异源二聚化基序
LTSIISAVVG, (SEQ ID NO:65)
<400> 65
Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人EGFR跨膜结构域的异源二聚化基序
SIATGMVG, (SEQ ID NO:66)
<400> 66
Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头GGGGSGGGGSGRSDNH (SEQ ID NO:67)
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
1 5 10 15
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OKTVLF (有义) (SEQ ID NO:68)
<400> 68
ggtgtccact ccgacatcca gatgacccag 30
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OKTVLR (反义) (SEQ ID NO:69)
<400> 69
tgcagccaca gttcgggtta tctgcaactt tg 32
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CKF1 (有义) (SEQ ID NO:70)
<400> 70
cgaactgtgg ctgcacca 18
<210> 71
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CKR1 (反义) (SEQ ID NO:71)
<400> 71
tgctgggcac ggtggacact ctcccctgtt g 31
<210> 72
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MFCPAF (有义) (SEQ ID NO:72)
<400> 72
ccaccgtgcc cagcacc 17
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAAR (反义) (SEQ ID NO:73)
<400> 73
cccgaggtcg acgctctc 18
<210> 74
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3VHF (有义) (SEQ ID NO:74)
<400> 74
gcaagcttat gtgagctcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcac aggtgcagct 60
ggtgcag 67
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3VHR (反义) (SEQ ID NO:75)
<400> 75
gcccttggtg gaggctgagg agactgtgag 30
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHCKF1MFCF (有义) (SEQ ID NO:76)
<400> 76
gcctccacca agggccca 18
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHMFCR (反义) (SEQ ID NO:77)
<400> 77
gatcgaattc ttatttaccc ggagacag 28
<210> 78
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20H1 (有义) (SEQ ID NO:78)
<400> 78
gtgttctaga gccgccacca tggaatggag ctgggtcttt ctcttc 46
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12VHF (有义) (SEQ ID NO:79)
<400> 79
gatgccagat gtgaggtgca gctggtggag 30
<210> 80
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12VHR (反义) (SEQ ID NO:80)
<400> 80
gatcgagctc cctccacctg aggagacggt gaccag 36
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12VLF (有义) (SEQ ID NO:81)
<400> 81
ggtgtccact ccgatgttgt gatgactcag 30
<210> 82
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12VLR (反义) (SEQ ID NO:82)
<400> 82
gatcggatcc ccctccacct ttgagatcca ctttgg 36
<210> 83
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20L1 (有义) (SEQ ID NO:83)
<400> 83
gtgtaagctt accatgggtg tgcccactca ggtcctgggg ttgctg 46
<210> 84
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHF (有义) (SEQ ID NO:84)
<400> 84
gatcggatcc ctgagtggaa ggagcgacaa ccacggcggt ggcggatcag acatccagat 60
gacccag 67
<210> 85
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHF1 (有义) (SEQ ID NO:85)
<400> 85
gatcggatcc ggacctctgg gcctcgctag gaagggcggt ggcggatcag acatccagat 60
gacccag 67
<210> 86
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHF2 (有义) (SEQ ID NO:86)
<400> 86
gatcggatcc ctgagtggaa ggagcgacaa ccacggacct ctgggcctcg ctaggaagga 60
catccagatg acccag 76
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H12LR (反义) (SEQ ID NO:87)
<400> 87
gatcggatcc tttgagatcc actttgg 27
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1S1F (有义) (SEQ ID NO:88)
<400> 88
gatcggatcc gggagtggaa ggagcgacaa ccac 34
<210> 89
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1S2F (反义) (SEQ ID NO:89)
<400> 89
gatcggatcc gggggaagta ggagcgacaa ccacggc 37
<210> 90
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEHR (反义) (SEQ ID NO:90)
<400> 90
acttcccccg ccaccgctgc caccccctcc gccaaccacc gcagagatga tggacgtcag 60
acatctggca tctgtaag 78
<210> 91
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEHF (有义) (SEQ ID NO:91)
<400> 91
agcggtggcg ggggaagtgg cggtggaggg agcgaggtgc agctggtgga g 51
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEHR1 (反义) (SEQ ID NO:92)
<400> 92
gatcgagctc cctccacctg aggagacggt gaccag 36
<210> 93
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HELR (反义) (SEQ ID NO:93)
<400> 93
acttcccccg ccaccgctgc caccccctcc ccccaccatc ccagtggcga tggaggagtg 60
gacacctgta g 71
<210> 94
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HELF (有义) (SEQ ID NO:94)
<400> 94
agcggtggcg ggggaagtgg aaggagcgac aaccacgatg ttgtgatgac tcag 54
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HELR1 (反义) (SEQ ID NO:95)
<400> 95
gatcggatcc tttgagatcc actttgg 27
<210> 96
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSHR (反义) (SEQ ID NO:96)
<400> 96
gctccctcca ccgccacttc ccccgccacc gctgccaccc cctccacatc tggcatctgt 60
aag 63
<210> 97
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSHF (有义) (SEQ ID NO:97)
<400> 97
agtggcggtg gagggagcgg gggcggaggt agtgggggag ggggatcgga ggtgcagctg 60
gtggag 66
<210> 98
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSLR (反义) (SEQ ID NO:98)
<400> 98
gctccctcca ccgccacttc ccccgccacc gctgccaccc cctccggagt ggacacctgt 60
ag 62
<210> 99
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSLF (有义) (SEQ ID NO:99)
<400> 99
agtggcggtg gagggagcgg gggcggaggt agtggaagga gcgacaacca cgatgttgtg 60
atgactcag 69
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER1HF (有义) (SEQ ID NO:100)
<400> 100
ggtgtccact ccgaggtgca gctggtggag 30
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER1HR (反义) (SEQ ID NO:101)
<400> 101
gatcgagctc acggtgacca gggttcc 27
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER1LF (有义) (SEQ ID NO:102)
<400> 102
gatgccagat gtgacatcca gatgacccag 30
<210> 103
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER1LR (反义) (SEQ ID NO:103)
<400> 103
gatcgaattc ttaacactct cccctgttg 29
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER12LF1 (有义) (SEQ ID NO:104)
<400> 104
gatgccagat gtgatgttgt gatgactcag 30
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER12LR1 (反义) (SEQ ID NO:105)
<400> 105
tgtcccagat ccactgcc 18
<210> 106
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER12LF2 (有义) (SEQ ID NO:106)
<400> 106
ggatctggga cagagttcac tctcacaatc ag 32
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ER13LF (有义) (SEQ ID NO:107)
<400> 107
gatgccagat gtgacatcca gttgacccag 30
<210> 108
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20H1 (有义) (SEQ ID NO:108)
<400> 108
gtgttctaga gccgccacca tggaatggag ctgggtcttt ctcttc 46
<210> 109
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20L1 (有义) (SEQ ID NO:109)
<400> 109
gtgtaagctt accatgggtg tgcccactca ggtcctgggg ttgctg 46
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP34HF (有义) (SEQ ID NO:110)
<400> 110
gatcgagctc agaggtgcag ctggtggag 29
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP34HR (反义) (SEQ ID NO:111)
<400> 111
gcccttggtg gaggctgagg agacggtgac 30
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFCF (有义) (SEQ ID NO:112)
<400> 112
gcctccacca agggccca 18
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MFc7.2R1 (反义) (SEQ ID NO:113)
<400> 113
gatcgaattc ttatttaccc ggagacaggg 30
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP34LF (有义) (SEQ ID NO:114)
<400> 114
ggtgtccact ccgaaatagt ggtgacgcag 30
<210> 115
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP34LR (反义) (SEQ ID NO:115)
<400> 115
tgcagccaca gttcgtttga tctccagctt gg 32
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFCPAF (有义) (SEQ ID NO:116)
<400> 116
cgaactgtgg ctgcacca 18
<210> 117
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAAR (反义) (SEQ ID NO:117)
<400> 117
cccgaggtcg acgctctc 18
<210> 118
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20H1 (有义) (SEQ ID NO:118)
<400> 118
gtgttctaga gccgccacca tggaatggag ctgggtcttt ctcttc 46
<210> 119
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SFPAF (有义) (SEQ ID NO:119)
<400> 119
gatcggatcc gggagtggaa ggagcgacaa ccacggcggt ggcggatcag aaatagtggt 60
gacgcag 67
<210> 120
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SFF (有义) (SEQ ID NO:120)
<400> 120
gatcgagctc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc agaggtgcag ctggtggag 59
<210> 121
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VNFR (反义) (SEQ ID NO:121)
<400> 121
cccgaagttt ccgtgtctcg cacagtaata tacggc 36
<210> 122
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bnIgG20L1 (有义) (SEQ ID NO:122)
<400> 122
gtgtaagctt accatgggtg tgcccactca ggtcctgggg ttgctg 46
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VNFF (有义) (SEQ ID NO:123)
<400> 123
cacggaaact tcgggagttc ctacgtgtct tacttc 36
<210> 124
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSPGF (反义) (SEQ ID NO:124)
<400> 124
gatcggatcc gggggatccg gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcag aaatagtggt 60
gacg 64
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头(SEQ ID NO:125)
<400> 125
ggggsggggs ggggs 15
<210> 126
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头(SEQ ID NO:126)
<400> 126
gggssggggs ggggs 15
<210> 127
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头(SEQ ID NO:127)
<400> 127
gsggggsggg gs 12
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:128)
<400> 128
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:129)
<400> 129
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:130)
<400> 130
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln
1 5
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:131)
<400> 131
Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:132)
<400> 132
Gly Val Pro Asp Val Gly His Phe Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:133)
<400> 133
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Phe Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:134)
<400> 134
Gly Val Pro Asp Val Gly Asn Phe Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:135)
<400> 135
Gly Val Pro Asp Val Gly Arg Phe Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:136)
<400> 136
Gly Val Pro Asp Val Gly His Tyr Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:137)
<400> 137
Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:138)
<400> 138
Gly Val Pro Asp Val Gly Asn Tyr Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:139)
<400> 139
Gly Val Pro Asp Val Gly Arg Tyr Ser Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尿激酶(uPA)的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:140)
<400> 140
Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 141
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尿激酶(uPA)的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:141)
<400> 141
Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF-beta的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:142)
<400> 142
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp
1 5
<210> 143
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤溶酶原的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:143)
<400> 143
Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu
1 5 10
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 葡激酶的蛋白酶切割位点: (SEQ ID NO:144)
<400> 144
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala
1 5 10 15
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa的蛋白酶切割位点: (SEQ ID NO:145)
<400> 145
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 146
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:146)
<400> 146
Ile Asp Gly Arg
1
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:147)
<400> 147
Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人肝胶原的蛋白酶切割位点: (SEQ ID NO:148)
<400> 148
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人alpha-2M的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:149)
<400> 149
Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly
1 5
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PZP的蛋白酶切割位点: (SEQ ID NO:150)
<400> 150
Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val
1 5
<210> 151
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PZP的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:151)
<400> 151
Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg
1 5
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PZP的蛋白酶切割位点 (SEQ ID NO:152)
<400> 152
Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr
1 5
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性基序 (SEQ ID NO:153)
<400> 153
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1铰链序列的一部分 (SEQ ID NO:154)
<400> 154
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 155
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:155)
<400> 155
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Asp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Ile Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 156
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:156)
<400> 156
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 157
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:157)
<400> 157
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Leu Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 158
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:158)
<400> 158
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Met Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:159)
<400> 159
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:160)
<400> 160
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:161)
<400> 161
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Asn Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Leu Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 162
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:162)
<400> 162
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 163
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:163)
<400> 163
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Lys Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 164
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:164)
<400> 164
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Ser Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:165)
<400> 165
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Gln Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 166
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:166)
<400> 166
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:167)
<400> 167
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Trp Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:168)
<400> 168
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:169)
<400> 169
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Gly Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:170)
<400> 170
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Asn Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 171
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SEQ ID NO:171)
<400> 171
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 172
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

Claims (21)

1.重组双特异性抗体，其由第一多肽和第二多肽组成，其中
所述第一多肽从N端至C端包含第二轻链可变结构域，第一接头，第一轻链可变结构域，人轻链恒定区(CL)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
所述第二多肽从N端至C端包含第二重链可变结构域，第二接头，第一重链可变结构域，人重链恒定区1(CH1)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
其中所述第一轻链可变结构域和所述第一重链可变结构域赋予对第一抗原的结合特异性，所述第二轻链可变结构域和所述第二重链可变结构域赋予对第二抗原的结合特异性；
其中所述第一或第二接头包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:58-62中任一项所示；
其中所述第一抗原选自CD3，并且所述第二抗原选自EGFR；
其中所述第一多肽的CH3和所述第二多肽的CH3中的一个或两个的氨基酸序列如SEQID NO:156、158和162-170中任一项所示。
2.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述第一或第二接头包含SEQ ID NO:125、126或127的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的重组双特异性抗体，其中所述CH1和CL经由接头与所述第一和第二多肽的所述CH2连接，所述接头包含与正常人IgG中的铰链序列相比缩短的铰链序列。
4.权利要求1-3中任一项的重组双特异性抗体，其进一步包含异源二聚化基序或长柔性基序，其中所述异源二聚化基序或长柔性基序经由一个或多个接头与所述第二轻链可变结构域和所述第二重链可变结构域的N端连接。
5.权利要求4的重组双特异性抗体，其中所述一个或多个接头包含蛋白酶切割位点。
6.权利要求4的重组双特异性抗体，其中所述异源二聚化基序包含人HER2跨膜结构域的N端异源二聚化基序或人EGFR跨膜结构域的N端异源二聚化基序。
7.权利要求4的重组双特异性抗体，其中所述长柔性基序包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
8.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述第一轻链可变结构域和所述第一重链可变结构域包含经修饰的序列，与未经修饰的序列介导的对CD3的结合亲和力相比，所述经修饰的序列赋予降低的对CD3的结合亲和力。
9.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述第一轻链可变结构域和所述第一重链可变结构域赋予对人CD3和食蟹猴CD3的结合特异性。
10.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述第二重链可变结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:22的互补决定区1(CDR1)，氨基酸序列为SEQ ID NO:23的CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:24的CDR3；并且
其中所述第二轻链可变结构域包含：
氨基酸序列为SEQ ID NO:26的CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:27的CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:28的CDR3；
氨基酸序列为SEQ ID NO:31的CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:32的CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:33的CDR3；
氨基酸序列为SEQ ID NO:36的CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:37的CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:38的CDR3；或
氨基酸序列为SEQ ID NO:41的CDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:42的CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:43的CDR3。
11.权利要求10的重组双特异性抗体，其中所述第二重链可变结构域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，
并且其中所述第二轻链可变结构域具有：
SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
12.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括包含SEQ ID NO:1-16之一的氨基酸序列的多肽。
13.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括包含SEQ ID NO:17-20之一的氨基酸序列的多肽。
14.权利要求1的重组双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括包含SEQ ID NO:50-57之一的氨基酸序列的多肽。
15.多核苷酸，其编码权利要求1-14中任一项的重组双特异性抗体的一个或两个多肽。
16.表达载体，其包含权利要求15的多核苷酸。
17.宿主细胞，其包含权利要求16的表达载体。
18.制备权利要求1-14中任一项的重组双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在其中表达所述重组双特异性抗体的条件下培养包含一种或多种编码所述重组双特异性抗体的多核苷酸的宿主细胞；和(b)从所述宿主细胞回收所述重组双特异性抗体。
19.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的重组双特异性抗体和任选的药学上可接受的载体。
20.权利要求1-14中任一项的重组双特异性抗体或权利要求19的药物组合物在制备用于治疗EGFR阳性癌症的药物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述癌症是结肠癌。
CN201980082578.7A 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途 Active CN113260379B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110994153.2A CN113603783B (zh) 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862783411P 2018-12-21 2018-12-21
US62/783,411 2018-12-21
US201962815132P 2019-03-07 2019-03-07
US62/815,132 2019-03-07
PCT/US2019/068063 WO2020132574A1 (en) 2018-12-21 2019-12-20 Protease cleavable bispecific antibodies and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110994153.2A Division CN113603783B (zh) 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113260379A CN113260379A (zh) 2021-08-13
CN113260379B true CN113260379B (zh) 2022-09-02

Family

ID=71101986

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980082578.7A Active CN113260379B (zh) 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
CN202110994153.2A Active CN113603783B (zh) 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110994153.2A Active CN113603783B (zh) 2018-12-21 2019-12-20 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20230357410A1 (zh)
EP (2) EP3897719A4 (zh)
CN (2) CN113260379B (zh)
WO (1) WO2020132574A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
PE20212205A1 (es) 2017-09-08 2021-11-18 Maverick Therapeutics Inc Proteinas de union condicionalmente activadas restringidas
CN113260379B (zh) * 2018-12-21 2022-09-02 浙江时迈药业有限公司 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
US11685780B2 (en) 2019-03-05 2023-06-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Single domain antigen binding domains that bind human Trop2
US20220315909A1 (en) * 2019-06-05 2022-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protease substrate, and polypeptide including protease cleavage sequence
MX2023011777A (es) * 2021-04-06 2023-11-14 Takeda Pharmaceuticals Co Métodos terapéuticos que usan proteínas de unión activadas condicionalmente restringidas.
CA3226100A1 (en) * 2021-07-21 2023-01-26 Phillip S. KIM Linker polypeptides
CN115298222B (zh) * 2021-09-24 2023-07-07 浙江时迈药业有限公司 针对gpc3的抗体及其用途
WO2023045151A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co., Ltd. Antibodies against gpc3 and uses thereof
WO2023183766A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-28 Abcellera Biologics Inc. Anti-cd3 antibodies and t-cell engagers and methods of use
WO2023236099A1 (en) * 2022-06-08 2023-12-14 Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co., Ltd. Antibodies against enpp3 and uses thereof
WO2024039920A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-22 Mbrace Therapeutics, Inc. Cell-free methods of producing antibodies to intracellular targets
CN116724057A (zh) * 2022-11-28 2023-09-08 浙江时迈药业有限公司 蛋白酶可切割的重组双特异性抗体和组合物及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
CN108884170A (zh) * 2016-03-22 2018-11-23 豪夫迈·罗氏有限公司 蛋白酶活化的t细胞双特异性分子

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7595378B2 (en) * 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
PT1735348E (pt) * 2004-03-19 2012-07-24 Imclone Llc Anticorpo anti-receptor do factor de crescimento humano
ES2856451T3 (es) 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
CA2807269A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
RU2013141078A (ru) * 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
KR101681818B1 (ko) * 2011-08-23 2016-12-01 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
ES2846623T3 (es) * 2012-05-22 2021-07-28 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos biespecíficos y métodos de uso de los mismos
AU2014343636A1 (en) 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
EP3164417A1 (en) * 2014-07-01 2017-05-10 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
US20170218091A1 (en) * 2014-07-03 2017-08-03 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
AU2015323313B2 (en) * 2014-09-25 2021-04-01 Amgen Inc. Protease-activatable bispecific proteins
JP6841754B2 (ja) * 2015-05-13 2021-03-10 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
WO2017021913A1 (en) * 2015-08-04 2017-02-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatments and uses and methods thereof
US11505599B2 (en) * 2016-01-14 2022-11-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibodies specific for Foxp3-derived peptides
DK3405490T3 (da) * 2016-01-21 2022-01-10 Pfizer Mono- og bispecifikke antistoffer mod epidermal vækstfaktorreceptor variant iii og cd3 og anvendelser deraf
UA127308C2 (uk) * 2016-03-22 2023-07-19 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
CN107459579B (zh) * 2016-06-01 2021-09-24 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向egfr和cd47双特异性融合蛋白、制备方法及应用
WO2018144784A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Smet Pharmaceutical Inc. MONOMERIC HUMAN IgG1 Fc AND BISPECIFIC ANTIBODIES
CN113260379B (zh) * 2018-12-21 2022-09-02 浙江时迈药业有限公司 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108884170A (zh) * 2016-03-22 2018-11-23 豪夫迈·罗氏有限公司 蛋白酶活化的t细胞双特异性分子
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20230357410A1 (en) 2023-11-09
EP3954707A1 (en) 2022-02-16
WO2020132574A1 (en) 2020-06-25
CN113260379A (zh) 2021-08-13
CN113603783A (zh) 2021-11-05
CN113603783B (zh) 2022-07-12
US20210388118A1 (en) 2021-12-16
EP3897719A4 (en) 2022-11-02
EP3897719A1 (en) 2021-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113260379B (zh) 蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
CN107151269B (zh) 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途
US9481730B2 (en) DR5—FAP bispecific death receptor agonistic antibodies
EP2927321B1 (en) Ch3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
EP1986684A2 (en) Functional antibodies
JP2008512352A (ja) 新規な四価の二重特異性抗体
CN112225812B (zh) 结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物
CA2409991A1 (en) Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
WO2019196309A1 (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
US20230357398A1 (en) Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon
WO2022127066A1 (zh) 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途
JP2024521701A (ja) 抗ｃｄ１３７抗体及びその使用方法
WO2024017281A1 (zh) 多特异性抗体及其用途
EP4219553A1 (en) Anti-tigit antibody and double antibody and their application
CN118546255A (zh) 一种靶向αvβ3和CD47的双功能融合蛋白以及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40054346

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant